EA011816B1

EA011816B1 - Белок липокалин

Info

Publication number: EA011816B1
Application number: EA200701918A
Authority: EA
Inventors: Мелани Йорке-Смит; Кристин Пауэр; Урсула Бошерт
Original assignee: Арес Трейдинг С.А.
Priority date: 2005-03-08
Filing date: 2006-03-08
Publication date: 2009-06-30
Also published as: JP4933527B2; CA2599540A1; CN101189257A; UA94221C2; EP1869074A1; AU2006221859B2; NO20075068L; IL185547A0; WO2006095164A1; BRPI0609020A2; JP2008536483A; GB0504767D0; EA200701918A1; US20080254035A1; MX2007010809A; AU2006221859A1; KR20070118614A

Abstract

Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что белок человека, описываемый в нем как белок INSP181, представляет собой липокалин.

Description

Настоящее изобретение относится к новому белку (обозначенному как ΙΝ8Ρ181) и его производным, идентифицированному в настоящей заявке как липокалин, и к применению этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащей гены, кодирующие указанный белок, для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.

Все цитируемые в настоящем описании публикации, патенты и патентные заявки включены в описание посредством ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящее время в области разработки лекарственных средств происходят фундаментальные изменения в связи с приходом эры функциональной геномики. Термин функциональная геномика применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научно-исследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных о последовательностях этих белков.

Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастают, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков по изобретению, позволяют получать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности.

Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной.

Липокалины представляют собой небольшие секретируемые белки, которые, как полагают, вовлекаются в транспортировку небольших гидрофобных молекул. Липокалины характеризуются мультидоменной структурой, включающей домен связывания лиганда, который в типичном случае вовлекается в процесс связывания малых гидрофобных молекул, и консервативный домен связывания с рецептором клеточной поверхности, который в типичном случае вовлекается в процесс связывания предположительного рецептора на клеточной поверхности, который может быть общим более чем для одного липокалина, и открытый конец складчатой структуры, которая формирует макромолекулярный комплекс, вовлекающий, возможно, рецептор клеточной поверхности.

Несмотря на большое разнообразие на уровне последовательности, липокалины характеризуются структурной гомологией: один восьмицепочечный антипараллельный β-цилиндр с присоединенной αспиралью отчетливо формирует характерную складчатую структуру липокалина. Один конец цилиндра открыт для поступления растворителя и содержит сайт связывания лиганда. Совокупность четырех петель соединяющихся цепей придает специфичность процессу связывания лиганда.

Самые близкородственные представители семейства липокалинов отличаются наличием трех характерных мотивов в последовательности. Представители данной группы включают ретинолсвязывающий белок; пурпурин; белок, связывающий ретиноевую кислоту; альфа-2-микроглобин; крупный белок мочи; билинсвязывающий белок; альфа-крустацианин; белок 14, характерный для беременности, беталактоглобин; нейтрофильный липокалин и белок οΙιοϊΌΐά р1ехи§. Липокалины ОиШет классифицируются как таковые, поскольку они содержат два или менее консервативных мотива последовательности, и указанные белки включают одорантсвязывающий белок, белок железы фон Эбнера, пробазин и афродизин.

В связи с вышесказанным идентификация липокалинов чрезвычайно важна в свете возрастающего понимания путей, лежащих в основе развития некоторых болезненных состояний и ассоциированных с ними болезненных состояний, и для разработки более эффективных подходов в генной и/или лекарственной терапии для лечения указанных расстройств.

Изобретение

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что белок человека, называемый в настоящем описании как ΙΝ8Ρ181, представляет собой липокалин.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что полипептиды по настоящему изобретению осуществляют положительную регуляцию Т-хелперных цитокинов 2 (ТЬ2), более конкретно интерлейкина-10 (1Б-10), интерлейкина-4 (1Ь-4) и интерлейкина-5 (1Ь-5). Полипептид ΙΝ8Ρ181 был исследован на его способность воздействовать на секрецию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека (МКПК), стимулированными митогеном - конкавалином А (СопА). Было показано, что данный полипептид стимулирует секрецию 1Б-10, 1Б-4 и 1Б-5 из СопА-стимулированных МКПК человека при тестировании в разведении 1/10 (46,2 мкг в тесте). Не был выявлен эффект на уровне ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α или 1Б-2.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что полипептиды по настоящему изобретению демонстрируют неожиданно ограниченную экспрессию в образцах биопсии кожи, и в особенности в образцах биопсии кожи, взятых при псориазе. В общих чертах, процедура состояла в том, что праймеры, специ

- 1 011816 фичные для ΙΝ8Ρ181, исследовали с использованием набора примерно из 100 образцов нормальной ткани человека и пораженных заболеванием, представляющих первичные клетки и клеточные линии, а также 44 образцов биопсии ободочной кишки и повздошной кишки от индивидуумов с воспалительным заболеванием кишечника и 39 образцов биопсии, взятых из вариантов клинического испытания 1Ь-18-связывающего белка (ГБ18ВР). Полученные результаты показаны в табл. 3 и 4 и проиллюстрированы графически на фиг. 12 и 13. Неожиданно оказалось, что экспрессия ΙΝ8Ρ181 отмечается на низком уровне только в образцах кожи (0,16% от ΟΑΡΌΗ) (табл. 5, фиг. 12) и в образцах биопсии кожи от пациентов с псориазом (положительный ответ в случае 19/39 образцов) (табл. 4, фиг. 13). Результаты, полученные с использованием второй пары праймеров, специфичных для экзона 4/6 (прямой праймер в экзоне 4 и обратный праймер в экзоне 6), подтвердили специфичность эффекта для кожи.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, где указанный полипептид:

(ί) включает аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая представлена в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, 8ЕЦ ΙΌ N0: 6, 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, 8ЕС) ΙΌ N0: 12, 81У) ΙΌ N0: 14, 81У) ΙΌ N0: 16, 8ЕС) ΙΌ N0: 18, 8ЕС) ΙΌ N0: 24, 8ЕС) ΙΌ N0: 66 или 81У) ΙΌ N0: 70;

(ίί) представляет собой фрагмент, который является липокалином или имеет общую антигенную детерминанту с одним или несколькими полипептидами по п.(1); или (ш) представляет собой функциональный эквивалент по п.(1) или (п).

Предпочтительно полипептид по первому аспекту изобретения состоит из аминокислотной последовательности или включает аминокислотную последовательность, которая представлена в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 18 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 24, представляет собой ее фрагмент, который функционирует как липокалин, или имеет общую антигенную детерминанту с таким полипептидом; или является функциональным эквивалентом такого полипептида.

Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, называется далее в тексте как полипептид экзона 1 Ш8Р181. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, называется далее в тексте как полипептид экзона 2 Ш8Р181. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 6, называется далее в тексте как полипептид экзона 3 Ш8Р181. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, называется далее в тексте как полипептид экзона 3 Ш8Р181-8У1. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, называется далее в тексте как полипептид экзона 4 Ш8Р1818У1. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, называется далее в тексте как полипептид экзона 4 Ш8Р181. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 14, называется далее в тексте как полипептид экзона 5 Ш8Р181. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 16, называется далее в тексте как полипептид экзона 6 Ш8Р181.

8ЕЦ ΙΌ N0: 18 получают путем объединения 8ЕЦ ΙΌ N0N0: 2, 4, 6, 12, 14 и 16. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 18, называется далее в тексте как полипептид Ш8Р181.

8ЕЦ ΙΌ N0: 24 получают путем объединения 8ЕЦ ΙΌ N0N0: 2, 4, 8, 10, 14 и 16. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 18, называется далее в тексте как полипептид Ш8Р181-8У1. Белок Ш8Р181-8У1 содержит 25 аминокислотных вставок в стартовом кодоне 4.

Второй клон Ш8Р181-8У1 (Ш8Р181-8У1-полиморф) был идентифицирован при исследовании пула, содержащего кДНК, полученные из слюнной железы, надпочечника, глаза и универсальной эталонной матрицы РНК 81га1адспс. которая содержит кДНК Ш8Р181-8У1. Указанный клон содержит нуклеотидные замещения А275С и 0340Α, которые приводят к аминокислотным замещениям N924 и 01148. Указанные варианты рассматриваются как проявления полиморфизма в последовательности Ш8Р181.

Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 36, называется далее в тексте как полипептид-полиморф N924 экзона 3 Ш8Р181 и включает аминокислотное замещение N924. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 38, называется далее в тексте как полипептид-полиморф N924 экзона 3 Ш8Р181 -8У1 и включает аминокислотное замещение N921.

Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 40, называется далее в тексте как полипептид-полиморф Ш8Р18Ш92Т. 8ЕЦ ΙΌ N0: 40 получают путем объединения 8ЕЦ ΙΌ Х'0\'0: 2, 4, 36, 12, 14 и 16.

Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 44, называется далее в тексте как полипептид-полиморф Ш8Р181-8У1 №2Т. 8ЕЦ ΙΌ N0: 44 получают путем объединения 8ЕС) ΙΌ \'0Х'0: 2, 4, 38, 10, 14 и 16.

Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 56, называется далее в тексте как полипептид-полиморф 01148 экзона 3 Ш8Р181-8У1 и включает аминокислотное замещение 01148.

Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 58, называется далее в тексте как полипептид-полиморф Ш8Р181-8У1 01148. 8ЕЦ ΙΌ N0: 58 получают путем объединения

- 2 011816

8ЕО ΙΌ ΝΟΝΟ: 2, 4, 8, 56, 14 и 16.

Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что полипептид ΙΝ8Ρ181, полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1, полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ, полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 Ν92Τ и полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 01148 могут включать на Ν-конце сигнальный пептид из 20 аминокислот.

Экзон 1 в полипептиде ΙΝ8Ρ181 и в полипептиде IN8Ρ181-8V1 без этой предполагаемой сигнальной последовательности показан в виде 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 20 и далее в тексте называется как зрелый полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ181. Последовательность полипептида ΙΝ8Ρ181 без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 22 и далее в тексте называется как зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181. Последовательность полипептида ΙΝ8Ρ181-8ν1 без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 26 и далее в тексте называется как зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1. Последовательность полипептида-полиморфа ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 42 и далее в тексте называется как зрелый полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ. Последовательность полипептида-полиморфа ΙΝ8Ρ181-8ν1Ν92Τ без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 46 и далее в тексте называется как зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1-Ν92Τ. Последовательность полипептидаполиморфа ΙΝ8Ρ181-8ν1-Ο1148 без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 60 и далее в тексте называется как зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1-Ν92Τ.

Последовательность полипептида, показанная в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 66, называется далее в тексте как полипептид домена липокалина ΙΝ8Ρ181 и включает домен липокалина. Последовательность полипептида, показанная в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 70, называется далее в тексте как полипептид домена липокалина ΙΝ8Ρ181-8ν1 и включает сплайсинг-вариант домена липокалина.

Полипептиды по первому аспекту настоящего изобретения могут дополнительно содержать гистидиновую метку. Такая гистидиновая метка предпочтительно присутствует у С-конца данного полипептида. Предпочтительно такая гистидиновая метка содержит 1-10 гистидиновых остатков (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков). Более предпочтительно указанная гистидиновая метка содержит 6 гистидиновых остатков. Соответственно, предпочтительными полипептидами являются такие полипептиды, которые включают последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 28, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 30, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 32, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 34, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 48, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 50, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 52, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 54, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 62, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 68 и/или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 72.

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 28, называется далее в тексте как полипептид ΙΝ8Ρ181 с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 30, называется далее в тексте как зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181 с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 32, называется далее в тексте как полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1 с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 34, называется далее в тексте как зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1 с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 48, называется далее в тексте как полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 50, называется далее в тексте как зрелый полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 52, называется далее в тексте как полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 Ν92Τ с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 54, называется далее в тексте как зрелый полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 Ν92Τ с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 62, называется далее в тексте как полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 01148 с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 64, называется далее в тексте как зрелый полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 01148 с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 68, называется далее в тексте как полипептид домена липокалина ΙΝ8Ρ181 с гистидиновой меткой и включает домен липокалина с гистидиновой меткой. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш ΝΟ: 72, называется далее в тексте как полипептид домена липокалина ΙΝ8Ρ181-8ν1 с гистидиновой меткой и включает сплайсинг-вариант домена липокалина с гистидиновой меткой.

Термин полипептиды ΙΝ8Ρ181 в контексте настоящего описания обозначает полипептиды, включающие зрелый полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ181, полипептид ΙΝ8Ρ181, зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181, полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1, зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1, полипептид ΙΝ8Ρ181 с гистидиновой меткой, зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181 с гистидиновой меткой, полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1 с гистидиновой меткой, зрелый полипептид ΙΝ8Ρ181-8ν1 с гистидиновой меткой, полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ, зрелый полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ, полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1-Ν92Τ, зрелый полипептидполиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1-Ν92Τ, полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ с гистидиновой меткой, зрелый полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ с гистидиновой меткой, полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 Ν92Τ с гистидиновой меткой, зрелый полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 Ν92Τ с гистидиновой меткой, по

- 3 011816 липептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8ν1 С1148 с гистидиновой меткой, зрелый полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-δνΐ С1148 с гистидиновой меткой, полипептид-полиморф ΙΝ8Ρ181-8νΐ С1148, полипептид домена липокалина ΙΝ8Ρ181 и полипептид домена липокалина ΙΝ8Ρ181-8ν1 и его вариант с гистидиновой меткой.

Полипептиды, включая полипептиды домена липокалина, которые содержат и Ν92Τ, и С1148 полиморфные варианты, также являются аспектами настоящего изобретения.

Полипептиды ΙΝ8Ρ181 и ΙΝ8Ρ181-8ν1 содержат, предположительно, одинаковый сайт гликозилирования по аминокислоте 92 (фиг. 10), который также является местом локализации предполагаемого Ν92Τ полиморфизма. Замещение аспарагина в положении 92 будет препятствовать осуществлению Νгликозилирования. Наличие или отсутствие сахарных фрагментов может оказывать существенное влияние на функционирование полипептидов ΙΝ8Ρ181.

Авторы изобретения отметили наличие дисульфидной связи между цистеиновыми аминокислотными остатками 90 и 181. Полипептиды по настоящему изобретению, в которых указанные цистеиновые остатки связаны дисульфидной связью, включаются в область настоящего изобретения.

Термин липокалин относится к молекуле, содержащей по меньшей мере один домен липокалина.

Предпочтительно термин липокалин относится к молекуле, содержащей домен липокалина, выявляемый с показателем е-значения менее чем 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,0002, 0,00001, 0,000001 или 0,0000001.

Предпочтительно термин липокалин относится к молекуле, спариваемой с НММ, созданным на основе базы данных Ρίат еи1ту, что выявляется с показателем е-значения менее чем 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,0002, 0,00001, 0,000001 или 0,0000001.

Предпочтительно полипептид по любому из указанных выше аспектов настоящего изобретения функционирует как липокалин. Предпочтительно домен липокалина кодируется участком, соответствующим остаткам 41-189 в аминокислотной последовательности ΙΝ8Ρ181. Последовательность домена липокалина показана в виде 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 66.

Другие полипептиды по настоящему изобретению включают фрагменты, которые важны для сохранения активности липокалина, и полипептиды, которые включают домен липокалина или состоят из домена липокалина, как показано на фиг. 14 (например, аминокислотные остатки 25-174, или аминокислотные остатки 26-180, или аминокислотные остатки 33-166) и на фиг. 11 (например, аминокислотные остатки 41-189), а также фрагмент, содержащий цистеиновые остатки, формирующие дисульфидную связь (например, аминокислотные остатки 96-187).

Другой полипептид по настоящему изобретению представляет собой домен липокалина, расположенный между остатками 25 и 181 в ΙΝ8Ρ181. В полипептиде ΤΝ8Ρ181-8ν1 домен липокалина расположен между остатками 25 и 206 и включает последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 70.

Термин функция липокалина используется в контексте настоящего описания для обозначения полипептидов, включающих аминокислотную последовательность или структурные особенности, которые могут быть идентифицированы как консервативные свойства в полипептидах семейства белков липокалинов, так что взаимодействие такого полипептида с его биологическим партнером, по существу, не будет оказывать вредного воздействия в сравнении с функционированием полноразмерного полипептида дикого типа. В частности, авторы относят к таким свойствам наличие цистеиновых остатков в определенных положениях полипептида, что создает возможность образования дисульфидных связей.

Липокалины используются в качестве диагностических и прогностических маркеров при различных болезненных состояниях. Плазменный уровень ΑСΡ отслеживают в ходе беременности и при проведении диагностической и прогностической оценки состояний, включающих химиотерапию рака, дисфункцию почек, инфаркт миокарда, артрит и рассеянный склероз. Ретинолсвязывающий белок (ΚΒΡ) используют в клинической практике в качестве маркера канальцевой реабсорбции в почке, и аро Ό является маркером кистозно-фиброзной мастопатии.

Белок железы фон Эбнера также известен как слезный липокалин, слезный преальбумин или УЕСБ. Аналогично другим липокалинам ΎΈ^Ρ является переносчиком ретинола или других малых гидрофобных соединений. νΈ^Ρ связывает ретинол ίη νίΐτο и, как считается, выполняет антимикробную функцию в глазе частично, поскольку он связывает длинноцепочечные жирные кислоты, которые ингибируют активацию лизоцима (С1а8доте, 1995 Агс11. С1ш. Ехр. Ορίιίαίιηοΐ. 233: 513-522). Данный белок может также инактивировать оболочечные вирусы, способствовать распределению по поверхности липидной пленки в глазе и/или защищать эпителий.

Другой член семейства липокалинов включает белок связывания ретиноевой кислоты в яичках (ΕΚΒΡ), который гомологичен по пространственной структуре ретинолсвязывающему белку в сыворотке крови (№\\сотег еΐ а1. 1990 1. Βίο1. Сйеш. 265: 12876-12879). Считается, что ΕΡΒΡ играет важную роль в созревании спермы и проходит через яички. Было показано, что ΕΚΒΡ связывает большой перечень ретиноидов, включающих ретинол (витамин А), ретиналь, ретинил ацетат, бета-ионон, цис-ретиноиды, бета-каротин, холестерин, терпеноиды, бета-лонилиденацетат, длинноцепочечные сложные эфиры ретинола и ретиноевой кислоты (Ε1ο\\όγ. 1996 Вюсйеш. 1. 318: 1-14) ίη νίνο и/или ίη νίΐτο. Как было показано, ретиноиды выполняют важную роль в процессах клеточной дифференцировки и пролиферации, а также

- 4 011816 в функции зрения, в биологии размножения и в секреции слизи. Обзор материалов, посвященных ретиноидам и их роли в развитии заболеваний и в поддержании гомеостаза, приведен в работе Гудмана (Сообщай, Ό., 1984 N. Εη§1. 1. Меб. 310: 1023-1031).

Синтаза простагландина Ό2, будучи членом семейства липокалинов, вовлекается в синтез простагландина Ό2 в мозге за счет катализа превращения простагландина Н2 в простагландин Ό2. Как и другие липокалины, синтаза ΡΌ2 является переносчиком гидрофобных соединений. Синтаза ΡΌ2 связывает ретинол ίη νίίτο и, как предполагается, выполняет функцию транспортной молекулы для секретируемых ретиноидов, которые циркулируют в различных жидкостях организма, доставляя их к соответствующим внутриклеточным переносчикам. Попадая внутрь клеток, ретиноиды связываются с димеризованным рецептором, выполняя в итоге свою биологическую роль по регуляции разнообразных процессов, таких как морфогенез, дифференцировка и митогенез (Тапака е1 а1., 1997, 1Ь1б).

Другие виды активности, ассоциированные с членами семейства липокалинов, включают антимикробную активность, транспортировку феромонов, активность в качестве модуляторов воспаления, участие в функции обоняния и регуляцию иммунного ответа, а также регуляцию развития нервной системы и антибактериальную активность.

Один из липокалинов, ассоциированных с модуляцией иммунной функции, представляет собой липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (ΝΟΛΕ). ΝΟΑΕ локализован в специфических гранулах в нейтрофилах, будучи как в виде мономеров, так и димеров (Ватйсй е1 а1., 1995 ΕΕΒ8 Ьейега 357: 255-259). ΝΟΆΕ является типичным липокалином по своей способности связывать малые гидрофобные молекулы для транспортировки их через гидрофильные жидкости. Хотя физиологический лиганд для ΝΟΑΕ еще не идентифицирован, было показано, что он связывает бактериальный фактор хемотаксиса ЕМЬР, и это указывает на то, что, предположительно, данная молекула связывает липофильные воспалительные медиаторы (Випдаагб е1 а1., 1994 Вюсйет. Вюрйук. Кек. Сотт. 202: 1468-1475).

Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что описываемые в изобретении полипептиды осуществляют положительную регуляцию Т112. более конкретно интерлейкина-10 (ГЛ-10), интерлейкина-4 (1Ь-4) и интерлейкина-5 (1Ь-5). Кроме того, неожиданно было обнаружено, что полипептиды по настоящему изобретению демонстрируют неожиданно ограниченную экспрессию в образцах биопсии кожи, и в особенности в образцах биопсии кожи, взятых при псориазе.

Иммунные заболевания могут быть разделены на такие, при которых отмечается доминирование Т хелперных клеток 1 (Тй1) или Т хелперных клеток 2 (Тй2). Лекарственные средства могут влиять на Т111/Т112 баланс, что можно использовать для модификации рассматриваемого аутоиммунного заболевания.

В контексте настоящего описания Тй1 заболевание определяется как заболевание, выбранное из болезни Крона, диабета типа I, болезни Хашимото, болезни Грейвса (тироидит), кожного заболевания Тй1 типа, такого как псориаз или гиперкератозный дерматоз, ревматоидного артрита, пролиферативного гломерулонефрита и гломерулонефрита с клубочками полулунной формы, рассеянного склероза, увеита заднего отдела глазного яблока, заживления раны и/или саркоидоза.

Предпочтительно Тй1 заболевание представляет собой псориаз.

Предпочтительно гиперкератозный дерматоз выбирают из псориаза, красного питириаза и/или порокератоза.

В контексте настоящего описания Тй2 заболевание определяется как заболевание, выбранное из аллергических состояний, таких как аллергический ринит, астма, кожного заболевания Тй2 типа, такого как плоский красный лишай, хронического синусита, синдрома Сезари, рака, лучевого кератоза, гепатита С, язвенного колита, мембранозного гломерулонефрита и/или вирусной инфекции.

Предпочтительно Тй2 заболевание выбирают из атопического дерматита, контактного дерматита, контактной аллергии, например, к никелю или золоту, кожной Т-клеточной лимфомы, атопической экземы, острой экземы и/или хронической экземы.

Предпочтительно атопический дерматит представляет собой острый атопический дерматит.

Предпочтительно Тй2 заболевание представляет собой атопический дерматит.

Предпочтительно рак выбирают из кожной Т-клеточной лимфомы, плоскоклеточной карциномы и/или базально-клеточной карциномы.

Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что полипептид по настоящему изобретению, один или как часть белка слияния и/или как фрагмента, может переключать сдвиг Тклеточных цитокинов с Тй1 на Тй2.

В качестве такового полипептид по настоящему изобретению, один или как часть белка слияния и/или его фрагмента, может использоваться для лечения Тй1 заболевания.

Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что антагонист, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, может переключать сдвиг Т-клеточных цитокинов с Тй2 на Тй1.

В качестве такового антагонист, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, может использоваться для лечения Тй2 заболевания. Например, усиленный Тй2 иммунный ответ и образование цитокинов, таких как 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Ь-13, будут действовать в направлении индукции аллергии и астмы (^ос е1 а1. Сшт. Ορίη. А11егду С11п. 1ттипо1. 2005 Арг.; 5 (2): 161-6). В качестве такового

- 5 011816 антагонист, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, может использоваться для лечения астмы и/или аллергии.

Кроме стратегии направленного воздействия на клеточные механизмы при лечении псориаза используют методы терапии, связанные с гуморальной иммуномодуляцией, осуществляемой за счет воздействия на имеющееся в дисбалансе цитокинов доминирование цитокинов типа 1 с повышенным уровнем 1Ь-2, -6, -8, ΤΝΕ-α или ΤΝΕ-γ. Указанная модуляция может быть достигнута путем введения экзогенных дефицитных цитокинов типа 2 с противоположным регулирующим воздействием, таких как 1Ь-4, -10 и -11, для отклонения процесса дифференцировки от продукции Т-клеточных цитокинов типа I к продукции Т-клеточных цитокинов типа II, которое стимулирует эндогенную дифференцировку лимфоцитов типа I до достижения нормального ответа. Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что полипептиды по настоящему изобретению могут функционировать таким образом.

Лекарственные препараты, модулирующие продукцию цитокинов, таких как ГЬ-4 или ГЬ-10, известны в данной области, а введение рекомбинатных цитокинов, таких как ГЬ-4, ГЬ-10 и ГС-11, рассматривается как способ лечения псориаза (ЗеЫеует с1 а1., 1. Еиг. Асаб. Эегта1о1. Уепето1., 2005 1аи.; 19 (1): 1-20).

Например, на начальной фазе испытаний 1Ь с использованием разных доз рекомбинатного !С-4 были получены впечатляющие результаты, указывающие на антипсориатический эффект препарата (ЗсЫеует е1 а1.). 20 человек из 22 пациентов, которым в течение 6 недель проводились еженедельно инъекции [С-4 в 5 разных дозах, завершили испытания, и у 1 пациента отмечались побочные реакции II степени. У 18 пациентов показатель РАИ снизился на 60-80% в течение 6 недель и в течение 6-недельного периода наблюдений не отличался. Отмечалась зависимость улучшения от дозы у больных с псориазом, ассоциированная со снижением инфильтрации кожи и с нормализацией структуры эпидермиса. Такого рода первые результаты испытаний позволяют полагать, что описанный подход путем сдвига иммунного дисбаланса может быть очень удачной стратегией в лечении псориаза, поскольку затрагивает исключительно недавно активированные Т клетки.

В зоне псориатических поражений отмечается относительная недостаточность экспрессии кожного ΣΕ-10. Указанный Τ112 цитокин является мощным ингибитором функций АРС, таких как пролиферация Т клеток. Он также подавляет продукцию цитокина типа I, включая ΣΕΝ-γ или ΤΝΕ-α, и, в этой связи, выполняет необходимую роль в контроле воспалительных ответов кожи.

Можно полагать, что системное введение !С-10. как и в случае других видов традиционной терапии, такой как лечение с использованием производных сложных эфиров фумаровой кислоты, местного введения аналогов витамина Ό3 и УФ-облучение, которые действуют, в числе других, по механизму положительной регуляции эндогенного !Ь-10. будет эффективным при лечении псориаза за счет относительного восстановления баланса цитокинов.

Проведенные исследования показали, что липокалины могут быть полезны для лечения следующих заболеваний: расстройство зрения (например, ночная слепота), расстройства иммунной системы (например, аутоиммунные расстройства), воспалительные состояния, воспалительное заболевание кишечника (ΚΏ), язвенный колит (ИС), болезнь Крона (ΟΌ), проктит, клеточно-пролиферативные расстройства, рак (например, рак молочной железы, кожная Т-клеточная лимфома, плоскоклеточная карцинома и/или базально-клеточная карцинома), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибные инфекции), кожные болезни (например, кожное заболевание, ассоциированное с ΤΗ1, такое как псориаз или гиперкератозный дерматоз; кожное заболевание, ассоциированное с ΤΗ2, такое как атопический дерматит, контактный дерматит, контактная аллергия, например, к никелю или золоту, кожная Т-клеточная лимфома, атопическая экзема, острая экзема и/или хроническая экзема), репродуктивные расстройства (например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункция почки, инфаркт миокарда, артрит, рассеянный склероз, кистозно-фиброзная мастопатия, регуляция развития нервной системы, диабет типа I, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса (тироидит), ревматоидный артрит, пролиферативный и гломерулонефрит с клубочками полулунной формы, увеит заднего отдела глазного яблока, заживление раны и/или саркоидоз, красный питириаз и/или порокератоз, аллергические расстройства, такие как аллергический ринит, астма, красный плоский лишай, хронический синусит, синдром Сезари, лучевой кератоз, гепатит С, язвенный колит, мембранозный гломерулонефрит и/или вирусные инфекции.

Считается, что [Ν8Ρ181 может принадлежать к подсемейству иммунокалинов и что ему присущи все функциональные свойства иммунокалинов, более конкретно свойства гликоделина (см., например, обзор ЬодбЬегд апб ХУейег. ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 2000, 1482 (1-2): 284-97). Члены этого семейства кодируются генным кластером на участке с.|32-34 хромосомы 9 генома ([Ν8Ρ181) человека на участке с.|34. Гликоделин вовлекается в процессы оплодотворения, иммуномодуляции и дифференцировки. Могут быть выявлены три основные изоформы гликоделина (СбА, Сб8 и СбР), придающие специфические функциональные свойства и определяющие важность гликозилирования для проявления биологической активности членов подсемейства иммунокалинов.

В документе ХУО 02/053701 описываются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие липокалин, и полипептиды липокалина (более конкретно - ген ЕР 17 человека), которые могут использоваться для создания на мышах модели мужского бесплодия, для скрининга разрабатываемых лекарственных средств

- 6 011816 и лечения состояний, связанных с бесплодием. В документе ΌΕ19807389 описываются моноклональные антитела против гликоделина А, используемые при лечении рака.

Предпочтительно активность полипептида по настоящему изобретению, одного или в качестве части белка слияния, или его фрагмента, и/или его антагониста, может быть подтверждена с использованием по меньшей мере одного из следующих тестов:

a) на моделях рака кожи, описанных в обзоре Одаширо с соавт. (ОбакЫго с1 а1., Огид П18соуегу Тобау: Мобек 2005; в печати), или

b) на моделях контактного дерматита или атопической экземы, описанных в обзоре Гутермута с соавт. (Си1етш111 е1 а1., Огид Эксоуегу Тобау: Океане Мобек 2005; в печати), или

c) на моделях атопического дерматита, описанных в обзоре Женга и Жу (2йеид апб Ζΐιιι. Сшт. А11егду Любима Кер. 2005 1и1.; 5 (4): 291-7), или

б) на модели мышей Ό6, описанной в работе Джемисона с соавт. (1ат1е8оп е1 а1., №11. 1ттипо1. 2005 Арг.; 6 (4): 403-11), или

е) по процедуре количественного теста, позволяющего определить уровень цитокиновой секреции клетками МКПК, стимулированными Соп А, описанной в примере 5. Более конкретно, активность полипептида по настоящему изобретению, одного или в качестве части белка слияния, или его фрагмента, и/или его антагониста, может быть подтверждена, если выявляется модуляция по меньшей мере одного из следующих цитокинов: 1Ь-4, 1Ь-5 и/или Ι6-10. Предпочтительно модуляции подвергаются два (например, 1Ь-4 и 1Ь-5; 1Ь-4 и Ι6-10; или 1Ь-5 и Ι6-10) или все три цитокина. Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению, один или в качестве части белка слияния или его фрагмента, осуществляет положительную регуляцию одного или нескольких указанных выше цитокинов. Предпочтительно антагонист, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, осуществляет отрицательную регуляцию одного или нескольких указанных выше цитокинов.

Активность полипептидов по настоящему изобретению, например ΙΝ8Ρ181, может быть определена по любому из методов, приведенных в настоящем описании или известных в данной области.

Полипептиды по первому аспекту настоящего изобретения могут дополнительно содержать гистидиновую метку. Такая гистидиновая метка предпочтительно присутствует у С-конца данного полипептида. Предпочтительно такая гистидиновая метка содержит 1-10 гистидиновых остатков (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков). Более предпочтительно указанная гистидиновая метка содержит 6 гистидиновых остатков.

Антигенная детерминанта по изобретению может представлять собой часть полипептида по изобретению, которая связывается с антигенсвязывающим сайтом антитела или с Т-клеточным рецептором (ТСК). Альтернативно, антигенная детерминанта может представлять собой сайт на поверхности полипептида по изобретению, с которым связывается одна молекула антитела. Вообще говоря, антиген имеет несколько или множество различных антигенных детерминант и реагирует с антителами, обладающими множеством различных специфичностей. Такое антитело предпочтительно является иммуноспецифичным к полипептиду по изобретению. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным к полипептиду по изобретению, который не составляет часть гибридного белка. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным к ΙΝ8Ρ181, ΙΝ8Ρ181-δν или к его фрагменту. Антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и могут иметь специфические трехмерные структуры, а также определенный заряд. Предпочтительно термин антигенная детерминанта означает конкретную химическую группу на полипептиде по изобретению, которая является антигенной, то есть вырабатывает специфический иммунный ответ.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по первому аспекту изобретения.

Термин очищенная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно означает молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, которая: (1) отделена по меньшей мере примерно от 50% белков, липидов, углеводов или других соединений, с которыми ассоциируется природная полноразмерная нуклеиновая кислота при ее выделении из клеток-источников; (2) не связана со всеми полинуклеотидами или с их частью, с которыми указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты ассоциируется в природе, (3) функционально присоединена к полинуклеотиду, с которым она не ассоциируется в природе; или (4) не встречается в природе как часть более крупной полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению, по существу, не содержит любой(ых) другой(их) примесной(ых) молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты или других примесей, которые присутствуют в ее природном окружении и могут препятствовать использованию этой нуклеиновой кислоты для продуцирования полипептидов, или ее терапевтическому, диагностическому или профилактическому применению, или применению в целях исследования.

Предпочтительный вариант изобретения, в частности, относится к геномных ДНК, которые не входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительно геномная ДНК, в частности, имеющая размер более чем 10 т.п.н.(тысяч пар нуклеотидов), 50, 100, 150, 200, 250 или 300 т.п.н., не входит в объем изобретения. При этом предпочтительно, если такая очищенная молекула нуклеиновой кислоты состоит

- 7 011816 только из кДНК.

Предпочтительно очищенная молекула нуклеиновой кислоты состоит из или включает последовательность(ти) нуклеиновой кислоты, представленную в 8Ε6 ГО N0: 1 (кодирующей полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ181), 8Ε6 ГО N0: 3 (кодирующей полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ181), 8Ε6 ГО N0: 5 (кодирующей полипептид экзона 3 ΙΝ8Ρ181), 8Ε6 ГО N0: 7 (кодирующей полипептид экзона 3 ΙΝ8Ρ181-§ν1), 8Ε6 ΙΌ N0: 9 (кодирующей полипептид экзона 4 ΙΠ8Ρ181-8ν1), 8Ε6 ГО N0: 11 (кодирующей полипептид экзона 4 [ΉδΡ 181), 8Ε6 ΙΌ N0: 13 (кодирующей полипептид экзона 5 ΙΉ8Ρ181). 8Ε6 ГО N0: 15 (кодирующей полипептид экзона 6 ΙΗ8Ρ181), 8Ε6 ГО N0: 17 (кодирующей полипептид ΙΧ8Ρ181). 8Ε6 ГО N0: 19 (кодирующей зрелый полипептид экзона 1 ΙΉ8Ρ181), 8Ε6 ГО N0: 21 (кодирующей зрелый полипептид ΙΧ8Ρ181). 8Ε6 ГО N0: 23 (кодирующей полипептид ΙΗ8Ρ181-8ν1), 8Ε6 ГО N0: 22 (кодирующей полипептид ΙΗ8Ρ181-8ν1), 8Ε6 ГО N0: 27 (кодирующей полипептид ΙΉ8Ρ181 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ГО N0: 29 (кодирующей зрелый полипептид ΙΗ8Ρ181-8ν1 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ГО N0: 31 (кодирующей полипептид ΙΗ8Ρ181-8ν1 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ГО N0: 33 (кодирующей зрелый полипептид ΙΗ8Ρ181-8ν1 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ГО N0: 35 (кодирующей полипептид-полиморф N927 экзона 3 ΙΉ8Ρ181). 8Ε6 ГО N0: 37 (кодирующей полипептид-полиморф N921 экзона 3 ΙΉ8Ρ181 8У1). 8Ε6 ΙΌ N0: 39 (кодирующей полипептид-полиморф ^^181^927), 8Ε6 ΙΌ N0: 41 (кодирующей зрелый полипептид-полиморф ^^181^921), 8Ε6 ΙΌ N0: 43 (кодирующей полипептид-полиморф ΙΗ8Ρ181-8ν1 N921), 8Ε6 ΙΌ N0: 45 (кодирующей зрелый полипептид-полиморф ΙΉ8Ρ181-8ν 1 N921), 8Ε6 ΙΌ N0: 47 (кодирующей полипептид-полиморф ΙΉ8Ρ181 N921 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ΙΌ N0: 49 (кодирующей зрелый полипептид-полиморф ΙΠ8Ρ181 N921 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ΙΌ N0: 51 (кодирующей полипептид-полиморф ΙΗ8Ρ181-8ν1 N921 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ΙΌ N0: 53 (кодирующей зрелый полипептид-полиморф ΙΗ8Ρ181-8ν1 N921 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ΙΌ N0: 55 (кодирующей полипептид-полиморф 61148 экзона 4 ΙΗ8Ρ181-8ν1), 8Ε6 ΙΌ N0: 57 (кодирующей полипептид-полиморф ΙΗ8Ρ181-8ν1 61148), 8Ε6 ΙΌ N0: 59 (кодирующей зрелый полипептид-полиморф ΙΗ8Ρ181-8ν1 61148), 8Ε6 ΙΌ N0: 61 (кодирующей полипептид-полиморф ΙΗ8Ρ181-8ν1 61148 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ΙΌ N0: 63 (кодирующей зрелый полипептид-полиморф ΙΗ8Ρ181-8ν1 61148 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ΙΌ N0: 65 (альтернативный нуклеотид экзона 2), 8Ε6 ΙΌ N0: 67 (кодирующей полипептид домена липокалина ΙΗ8Ρ181), 8Ε6 ΙΌ N0: 69 (кодирующей полипептид домена липокалина ΙΉ8Ρ181 с гистидиновой меткой), 8Ε6 ΙΌ N0: 71 (кодирующей полипептид домена липокалина ΙΉ8Ρ1818ν1) и/или 8Ε6 ΙΌ N0: 73 (кодирующей полипептид домена липокалина ΙΉ8Ρ181-8ν 1 с гистидиновой меткой).

В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х88С (150 мМ №С1, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х 88С приблизительно при 65°С.

В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной вектором четвертого аспекта настоящего изобретения.

В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с полипептидом по первому аспекту изобретения и который предпочтительно ингибирует способность полипептида по первому аспекту изобретения переносить малые гидрофобные молекулы.

Лиганды для полипептидов по изобретению могут иметь различные формы, включая природные или модифицированные субстраты, ферменты, рецепторы, небольшие органические молекулы, такие как небольшие природные или синтетические органические молекулы размером до 2000 Да, а предпочтительно 800 Да или менее, пептидомиметики, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, антитела и их структурные или функциональные миметики.

Такие соединения могут быть идентифицированы с использованием описанных выше методов анализа и скрининга.

В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным с точки зрения изменения экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или с точки зрения регуляции активности полипептида по первому аспекту изобретения.

Соединение по седьмому аспекту изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида.

Важно отметить, что идентификация функции полипептидов ΙΉ8Ρ181 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. Лиганды и соединения по шестому и седьмому аспектам изобретения могут

- 8 011816 быть идентифицированы с использованием таких способов. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения.

Соединения, идентифицированные как агонисты полипептидов по настоящему изобретению, могут использоваться для транспортировки малых гидрофобных молекул, ίη νίίτο или ίη νίνο. Например, соединения-агонисты могут использоваться в качестве компонентов некоторых известных сред для культивирования клеток, для доставки малых гидрофобных молекул в клетки и для защиты их от разрушения ферментами, присутствующими в сыворотке крови.

Антагонисты (например, антитела) ΙΝ8Ρ181, ΙΝ8Ρ181-δν1, полиморфа ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ, полиморфа ΙΝ8Ρ181-δνΐ Ν92Τ и/или полиморфа ΙΝ8Ρ181-Ο1148 могут использоваться при лечении рака, более конкретно рака, поражающего головной мозг, яичники, яичко, селезенку, поджелудочную железу, матку, кровь и/или легкое.

Предпочтительно антагонисты (например, антитела) ΙΝ8Ρ181-δν1, полиморфа ΙΝ8Ρ181-δν1 Ν92Τ или полиморфа ΙΝ8Ρ181-δν1 С1148 (полученные с использованием кДНК слюнной железы, надпочечника и глаза) могут использоваться при лечении рака, в частности рака, поражающего слюнные железы, надпочечник и/или глаз.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению гена или полипептида ΙΝ8Ρ181 в качестве мишени для скрининга кандидатов на лекарственные средства-модуляторы, а в частности лекарственных средств-кандидатов, обладающих активностью, направленной против расстройств, ассоциированных с липокалином.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с липокалином, где указанные способы включают выявление способности указанного соединения связываться с геном, или полипептидом ΙΝ8Ρ181, или с их фрагментами.

Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с липокалином, где указанные способы включают анализ на модуляцию активности гена, или полипептида ΙΝ8Ρ181, или их фрагментов.

В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду по первому аспекту настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту настоящего изобретения, или к вектору по четвертому аспекту настоящего изобретения, или к клетке-хозяину по пятому аспекту настоящего изобретения, или к лиганду по шестому аспекту настоящего изобретения, или к соединению по седьмому аспекту настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики.

Фрагменты соединений по настоящему изобретению могут найти применение в производстве лекарственного средства для лечения некоторых заболеваний, включающих, без ограничения, расстройство зрения (например, ночную слепоту), расстройства иммунной системы (например, аутоиммунные расстройства), воспалительные состояния, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), язвенный колит (ИС), болезнь Крона (СЭ), проктит, клеточно-пролиферативные расстройства, рак (например, рак молочной железы, кожную Т-клеточную лимфому, плоскоклеточную карциному и/или базально-клеточную карциному), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибковые инфекции), эмфизему, кожные болезни (например, кожное заболевание, ассоциированное с ТЫ, такое как псориаз или гиперкератозный дерматоз; кожное заболевание, ассоциированное с Т112. такое как атопический дерматит, контактный дерматит, контактную аллергию, например, к никелю или золоту, кожную Т-клеточную лимфому, атопическую экзему, острую экзему и/или хроническую экзему), репродуктивные расстройства (например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункцию почки, инфаркт миокарда, артрит, кистозно-фиброзную мастопатию, регуляцию развития нервной системы, диабет типа Ι, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса (тироидит), ревматоидный артрит, пролиферативный гломерулонефрит и гломерулонефрит с клубочками полулунной формы, увеит заднего отдела глазного яблока, заживление раны и/или саркоидоз, красный питириаз и/или порокератоз, аллергические расстройства, такие как аллергический ринит, астма, плоский красный лишай, хронический синусит, синдром Сезари, актинический кератоз, гепатит С, язвенный колит, мембранозный гломерулонефрит и/или вирусные инфекции.

Приведенные далее в примерах анализы могут использоваться для идентификации терапевтически активных фрагментов.

В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или оценку активности полипептида по первому аспекту изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют ίη νίίτο. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания.

Более высокая экспрессия липокалинов может быть обнаружена у пациентов с кожными заболева

- 9 011816 ниями, такими как псориаз, в сравнении с пациентами, не имеющими такого заболевания, или у пациентов, которые подвергались воздействию аллергенов. Например, у пациентов, которые подвергались воздействию никеля или золота (контактная аллергия), определяют значительное повышение уровня желатиназы нейтрофилов, ассоциированной с липокалином (ΝΟΑΣ) (Мо11ег е1 а1. Соп1ас1 БегтайШ. 1999 Арг.; 40 (4): 200-4). Положительная регуляция пептидов/полипептидов, таких как ΝΟΑΣ, также выявляется при заживлении раны и может служить объяснением экспрессии этих пептидов/полипептидов при псориазе и заживлении раны (8огеп§еп е1 а1. 1. 1ттипо1. 2003 1ип. 1; 170 (11): 5583-9). Кроме того, выраженная индукция ΝΟΑΣ в эпидермисе наблюдается в случае многих кожных расстройств, характеризующихся разбалансировкой процесса дифференциации эпителия, таких как псориаз, красный питириаз и плоскоклеточная карцинома (Ма11Ьг18 е1 а1. Ехр. Бегта1о1. 2002 Бес.; 11 (6): 584-91). Так, Маллбрис с соавт. (Ма11Ьг18 е1 а1.) делают вывод о том, что ΝΟΑΣ является маркером разбалансировки процесса дифференциации кератиноцитов в коже человека.

Таким образом, суперэкспрессия некоторых полипептидов по настоящему изобретению может коррелировать с прогрессированием заболевания и/или может служить прогностическим показателем его течения.

Считается, что некоторые ткани млекопитающих при заболевании ТЫ типа или при заболевании Т112 типа содержат более высокое число копий гена для белка ΙΝ8Ρ181 и экспрессируют существенно повышенные уровни белка ΙΝ8Ρ181 и мРНК, кодирующей белок ΙΝ8Ρ181, в сравнении с соответствующим, стандартным млекопитающим, то есть с млекопитающим того же вида, но не имеющим заболевания ТЫ типа или заболевания ТЬ2 типа. Повышенные уровни белка ΙΝ8Ρ181 определяются в некоторых жидкостях организма (например, в сыворотке крови, плазме, моче, синовиальной жидкости и спинальной жидкости) и/или в коже млекопитающих, имеющих заболевание ТЫ типа или заболевание Т112 типа, в сравнении с его уровнем в сыворотке/коже млекопитающих того же вида, но не имеющих заболевания ТЫ типа или заболевания Т112 типа. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу, используемому при диагностике заболевания ТЫ типа или заболевания Т112 типа, который включает анализ уровня экспрессии гена, кодирующего белок ΙΝ8Ρ181, или числа копий гена в клетках млекопитающего, в частности в коже или в жидкости организма, и сравнение уровня экспрессии данного гена или числа копий гена со стандартными значениями уровня экспрессии гена или числа копий гена, где повышение уровня экспрессии гена или числа копий гена в сравнении со стандартными значениями является показателем некоторых заболеваний ТЫ типа или заболеваний Т112 типа.

В том случае, когда заболевание ТЫ типа или заболевание Т112 типа уже диагностировано традиционными методами, то настоящее изобретение может использоваться для целей прогноза.

Фраза анализ уровня экспрессии гена, кодирующего белок ΙΝ8Ρ181 относится к качественному или количественному измерению или оценке уровня белка ΙΝ8Ρ181 или уровня мРНК, кодирующей ΙΝ8Ρ181, в первом биологическом образце либо непосредственно (например, путем определения или оценки абсолютного уровня белка или уровня мРНК), либо опосредованно (например, путем сравнения с уровнем белка или уровнем мРНК во втором биологическом образце). Фраза анализ числа копий гена, кодирующего белок ΙΝ8Ρ181 относится к качественному или количественному измерению или оценке числа копий гена, кодирующего ΙΝ8Ρ181, в первом биологическом образце либо непосредственно (например, путем определения или оценки абсолютного числа копий гена), либо опосредованно (например, путем сравнения с числом копий гена, кодирующего белок ΙΝ8Ρ181, во втором биологическом образце).

Предпочтительно уровень белка ΙΝ8Ρ181, уровень мРНК или число копий гена в первом биологическом образце измеряют или оценивают и сравнивают со стандартным значением уровня белка ΙΝ8Ρ181, уровня мРНК или числа копий гена, где стандарт отбирают из второго биологического образца, полученного от индивидуума, не имеющего заболевания ТЫ типа или заболевания Т112 типа. Альтернативно, в том случае, когда данный способ используют как прогностический показатель, и первый, и второй биологические образцы могут быть отобраны от индивидуумов, имеющих заболевание ТЫ типа или заболевание Т112 типа, и могут быть измерены соответствующие значения уровней экспрессии или числа копий для определения прогноза заболевания. Как известно в данной области, когда известно стандартное значение уровня белка ΙΝ8Ρ181, уровня мРНК или числа копий гена, указанное значение может использоваться повторно, в качестве стандарта, для сравнения.

Термин биологический образец означает любой биологический образец, полученный от индивидуума, из клеточной линии, культуры ткани или другого источника, который содержит белок ΙΝ8Ρ181 или соответствующую мРНК, предпочтительно из кожи. Способы получения образцов биопсии из ткани и жидкостей тела млекопитающих известны в данной области. В том случае, когда биологический образец должен включать мРНК, образец биопсии ткани является предпочтительным источником.

Настоящее изобретение используется для выявления заболевания ТЫ типа или заболевания Т112 типа у млекопитающих. В частности, настоящее изобретение используется при диагностике или для прогностической оценки у млекопитающих указанных выше типов ТЫ заболевания или Т112 заболевания. Предпочтительные млекопитающие включают обезьян, пчел, кошек, собак, коров, свиней, лошадей, кроликов и людей. Особенно предпочтительными являются люди.

Один возможный способ детекции полипептидов по первому аспекту изобретения включает стадии:

- 10 011816 (а) контактирования лиганда по шестому аспекту изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (Ь) детекции указанного комплекса.

Что касается девятого аспекта изобретения, то в этой связи следует отметить, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, известные читателю-специалисту, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точковую мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы с использованием антител. Подобные методы могут быть использованы в короткий или продолжительный период времени, что позволяет проводить мониторинг терапевтического лечения заболевания у пациента. Настоящее изобретение также относится к наборам, которые могут быть использованы в указанных методах диагностики заболевания.

В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида по первому аспекту изобретения в качестве липокалина.

Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться для связывания небольших молекул жирных кислот, например, в крови или тканях для модуляции их биологической функции. Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться для транспортировки ретиноидов или стероидов к рецепторам, в частности, в качестве составной части терапии при раке молочной железы, эмфиземе и заболеваниях кожи и играют важную роль в репродуктивном процессе. Другие варианты использования включают модуляцию противовоспалительных ответов, активность в качестве микробного агента либо как усилителя ферментативной функции, либо в качестве самой ферментоподобной молекулы.

Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться благодаря своим противомикробным свойствам. Противомикробная активность может быть измерена ίη νίίΓΟ с использованием культуры клеток или ίη νίνο путем введения молекул по настоящему изобретению в организм животного соответствующей модели. Анализы на выявление противомикробной активности являются специфичными для конкретных микробов и, в основном, известны специалистам в данной области. Например, анализ ίη νίνο на противомикробную активность проводится путем внутрибрюшинной инокуляции мышам патогенных микроорганизмов в соответствующей бульонной среде. Сразу после инокуляции вводят композицию, содержащую данный полипептид, и регистрируют уровень смертности в течение 7 последующих дней. В основном, введение проводят внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным способом или через рот. См., например, работу Ми81ек с1 а1., Апйт1сгоЬ1а1 Адеп18 С11сто111сг. 3: 40, 1973, в которой содержится обсуждение методов анализа противомикробных агентов ίη νίνο и ίη νίίτο.

Активность полипептидов по настоящему изобретению может быть измерена с использованием большого числа методов анализа, которые позволяют определить их способность связывать малые гидрофобные молекулы. Такие методы анализа включают, без ограничения, методы анализа, основанные на определении изменений в интенсивности флуоресценции (Содам еί а1., Еиг. 1. ВюсНет. 65: 71-78, 1976), и равновесный диализ водорастворимых соединений (Наке еί а1., 1. ВюсНет. 79: 373-380, 1976).

Другие варианты использования молекул по настоящему изобретению включают использование их в качестве системы доставки для транспортировки и/или стабилизации малых липофильных молекул. Например, молекулы по настоящему изобретению могут использоваться для микроинкапсулирования малой липофильной молекулы, которая образует активный фармакологический агент, и таким образом защищают данный агент от влияний экстремальных значений рН в кишке от воздействия мощных пищеварительных ферментов и последствий непроницаемости мембран желудочно-кишечного тракта для активного ингредиента. Другие преимущества инкапсулирования фармакологического агента включают предупреждение преждевременной активации агента или защиту его от агрессивной среды желудка.

В последнее время стали использовать складчатую структуру липокалина для создания белков, обладающих специфичностью для неприродных лигандов. Такие сконструированные липокалины могут рассматриваться как миметики антител и получили, в этой связи, название антикалины (см. обзор в работе 8кегта, ВюсЫт Вюрйук Ас1а. 2000 Ос1. 18; 1482 (1-2): 337-50). Соответственно, полипептиды по настоящему изобретению могут найти применение в синтезе антикалинов.

В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид по первому аспекту изобретения, или молекулу нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту изобретения, или вектор по четвертому аспекту изобретения, или клетку-хозяин по пятому аспекту изобретения, или лиганд по шестому аспекту изобретения, или соединение по седьмому аспекту настоящего изобретения, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду по первому аспекту изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору по четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину по пятому аспекту изобретения, или к лиганду по шестому аспекту изобретения, или к соединению по седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы в целях приготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний, включая расстройства зрения (например, ночную слепоту), иммунные системные расстройства (например, аутоиммунные расстройства), воспалительную болезнь кишечника (ΙΒΌ), язвенный колит (ИС), болезнь Крона (СО), проктит, клеточно-пролиферативные расстройства, рак (например, рак

- 11 011816 молочной железы), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибковые инфекции), эмфизему, заболевания кожи, репродуктивные расстройства (например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункцию почки, инфаркт миокарда, артрит, рассеянный склероз, кистозно-фиброзную мастопатию и регуляцию нервной системы.

В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида по первому аспекту изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту изобретения, или вектора по четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина по пятому аспекту изобретения, или лиганда по шестому аспекту изобретения, или соединения по седьмому аспекту изобретения.

Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться сами по себе как компоненты гибридных белков, таких как гибридный белок Ре, и/или в сочетании с одним или несколькими агентами, действующими как отрицательные регуляторы ТЫ. Антагонисты, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, могут использоваться сами по себе или в сочетании с одним или несколькими агентами, действующими как отрицательные регуляторы Т112.

Агенты, действующие как отрицательные регуляторы ТЫ или Т112. известны в данной области и не ограничиваются указанными ниже агентами.

Предпочтительно агент, действующий как отрицательный регулятор ТЫ, выбирают из клеточных иммуномодуляторов, гуморальных иммуномодуляторов, полипептида Т, МусоЬас1етшт уассае, тазаротена, бексаротена, троглитазона, лиарозола, рамбазола, аргинина, оксида азота, циклоспорина, метотрексата, аналогов витамина Ό3, ретиноидов, кортикостероидов, антралина, дегтя, псоралена плюс ИУА (РИУА), куркумина, полиподиума, лейкотомаса, глюкокортикоида, такого как предизон, и/или средств, оказывающих влияние на баланс ТЫ/Т112 (адаптогены), таких как изофлавоны сои, растительные стеролы, стеролины, пробиотики и/или прегненолон.

Предпочтительно клеточный иммуномодулятор выбирают из ΌΑΒ389ΙΕ-2, микофенолята мофетила, УX-497, лефлуномида, эфализумаба, ОКТебт4а, СТЬА4-1д, ΜΕΌΙ 507, ЬРА3Т1Р, даклизумаба, базиликсимаба, такролимуса, пимекролимуса и/или сиролимуса.

Предпочтительно гуморальный иммуномодулятор выбирают из 1Ь-4, 1Ь-10, 1Ь-11, инфликсимаба, этанерцепта, онерцепта и/или адалимумаба.

Предпочтительно агент, действующий как отрицательный регулятор ТР2, выбирают из антагонистов (например, антител) хемокинового рецептора ССК.3 или ССК.4, антагонистов СХСК.4, анти-ТАВС, ингибиторов молекулы адгезии УЪА-4, агонистов РРАВ-γ, циклопентеноновых простагландинов, тиазолодиндионов, 8В203580, 8В239063, ΚΨ167657, аналогов витамина Ό3, глюкокортикоидов, микобактерий, анти-1Е-5/1Е-13/1Ь-9, растворимого 1Ь-4В, ингибиторов СО80/86, лиганда 1СО8, агониста То11-подобного рецептора (ТЬК.)-9, такого как СрС ДНК, СТЬА4-1д, антисмысловых олигонуклеотидов 6АТА3, МусоЬас1етшт ЬасШик Са1тейе-6иетш (ВС6), МусоЬас1етшт уассае, анти-1дЕ, агонистов бета рецептора, кортикостероидов, семян периллы, кверцетина, лютеолина, изофлавонов, глюкокортикоида, такого как предизон, и/или средств, гармонизирующих баланс ТЫ/Т112 (адаптогенов), таких как изофлавоны сои, растительные стеролы, стеролины, пробиотики и/или прегненолон. В случае заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида по первому аспекту изобретения ниже, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И, наоборот, в случае заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида по первому аспекту изобретения выше, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.

Полипептиды ΙΝ8Γ181 представляют собой липокалины, а поэтому они играют определенную роль в развитии многих патологических состояний. Антагонисты полипептидов Ш8Р181 представляют особый интерес, поскольку они позволяют благоприятно воздействовать на динамику патологических состояний.

В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным или к животным, которые являются дефицитными по полипептиду первого аспекта настоящего изобретения и не являются человеком и которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни указанного полипептида или вообще не экспрессируют такого полипептида. Указанные трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики данного заболевания.

Используемый здесь термин функциональный эквивалент означает молекулу белка или нуклеиновой кислоты, обладающую функциональными или структурными свойствами, в основном, аналогичными свойствам молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты по изобретению. Функциональный

- 12 011816 эквивалент белка может содержать модификации, если такие модификации необходимы для осуществления конкретной функции. Термин функциональный эквивалент включает фрагменты, мутанты, гибриды, варианты, аналоги или химические производные молекулы.

Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая любой одной или несколькими функциональными активностями полипептидов по изобретению.

Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая, по существу, аналогична активности ΙΝ8Ρ181 или его фрагментов, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая идентична активности или превышает активность ΙΝ8Ρ181 или его фрагментов, измеренную в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая составляет 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 100% или более от активности ΙΝ8Ρ181 или его фрагментов, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию.

Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть белок или полипептид, обладающий ίη νίνο или ίη νίίτο активностью, которая, по существу, аналогична активности полипептидов по изобретению. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть белок или полипептид, способный взаимодействовать с другими клеточными или внеклеточными молекулами по механизму, который, по существу, аналогичен механизму взаимодействия соответствующей части полипептидов по изобретению. Так, например, в иммуноанализе функциональный эквивалент может способствовать снижению способности к связыванию антитела с соответствующим пептидом (то есть пептидом, имеющим модифицированную аминокислотную последовательность, а поэтому являющимся функциональным эквивалентом) полипептида по изобретению или с самим полипептидом по изобретению, где указанное антитело вырабатывается против соответствующего пептида полипептида по изобретению. Эквимолярная концентрация указанного функционального эквивалента будет снижать уровень вышеупомянутого связывания соответствующего пептида по меньшей мере примерно на 5%, предпочтительно примерно на 5-10%, более предпочтительно примерно на 10-25%, еще более предпочтительно примерно на 25-30% и наиболее предпочтительно примерно на 40-50%.

Так, например, функциональные эквиваленты могут быть полностью функциональными либо у них может отсутствовать одна или несколько активностей. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением модификации могут влиять на функцию, например на активности полипептида, которые подтверждают их идентификацию как домена лиопкалина.

Различные стандартные методы и процедуры, которые могут применяться для осуществления изобретения, систематизированы ниже. При этом следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными методами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология применяется только для описания конкретных вариантов изобретения и эта терминология не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

В настоящем описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.

Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения используются стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области.

Более полное описание указанных методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы в качестве консультации, приводятся в следующих работах: 8атЬгоок, Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 8есопб Εάίίίοη (1989), ΌΝΑ Οοηίη§. Уо1итек I апб II (Ό.Ν. С1огег еб. 1985); Ο1^дοηис1еοΐ^бе 8уп1Нек1к (М.1. Сай еб. 1984); №.1с1ею Ас1б ΗуЬ^^б^ζаί^οη (Β.Ό. Натек & 8.1. Нфщпк ебк. 1984); Тгапкспрбоп апб ТгапккДюп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нфщпк ебк. 1984); Ашта1 Се11 СиНиге (Β..Ι. Егекйиеу еб. 1986); 1ттоЬП|/еб Се11к аиб Εηζутек (1ИБ Ргекк, 1986); Β. РегЬа1, А. Ргасбса1 Сшбе 1о Мо1еси1аг С1оппщ (1984); Ше МеШобк ίη Еп7уто1о§у кепек (Асабетк Ргекк, 1ис.), екрес1а11у νο1итек 154 & 155; Сепе ТгапкГег УесЮгк Гог Маттайап Се11к (1.Н. МШег апб М.Р. Са1ок ебк. 1987, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу); 1тпшпос11еппса1 Мебюбк ίη Се11 апб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апб ^а1кег, ебк. 1987, Асабетю Ргекк, Бопбоп); 8сорек (1987) Рго1еш РипПсабоп: Ргтар1ек апб Ргасбсе, 8есопб ЕбП1оп (8ргшдег Уег1ад, Ν.Υ.); апб НапбЬоок оГ Ехрептеп1а1 Iттииο1οду, Уо1итек 1-1У (Э.М. \Уей апб С.С. В1аск\\'е11 ебк. 1986).

Используемый здесь термин полипептид включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированных пептидными связями, то есть пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам или полипептидам), так и к более длинным цепям (белкам).

Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка, либо он может

- 13 011816 присутствовать в виде пре-, про- или препробелка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препрочасти этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах пре-, про- или препропоследовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.

Полипептид по первому аспекту изобретения может образовывать часть гибридного белка. Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, такому как соединение, увеличивающее время полужизни указанного полипептида (например, к полиэтиленгликолю).

В частности, гибридный белок полипептида может содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей и фрагментов полипептидов по настоящему изобретению. Предпочтительно указанный фрагмент является доменом липокалина, например, представленным в виде 8ЕО ГО N0: 66, 8Е0 ГО N0: 70 или в виде участка аминокислот 25-174, аминокислот 26-180, аминокислот 33166 или аминокислот 41-189 в 8Е0 ГО N0: 18 или участка аминокислот 25-206 в 8Е0 ГО N0: 24.

Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению, содержащий последовательность, которая гомологична по меньшей мере на 85% полипептиду 1Л8Р181, является гибридным белком. Такие гибридные белки могут быть получены путем клонирования полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий последовательность, которая гомологична по меньшей мере на 85% полипептиду 1Л8Р181, в рамке считывания с последовательностями, кодирующими гетерологичную белковую последовательность.

Используемый здесь термин гетерологичный означает любой полипептид, отличающийся от полипептида Ш8Р181 человека. Примеры гетерологичных последовательностей, которые могут содержаться в гибридных белках, на амино- или карбоксиконце, включают внеклеточные домены связанного с мембраной белка, константные области иммуноглобулина (Ес области), домены мультимеризации, домены внеклеточных белков, сигнальные последовательности, экспортные последовательности и последовательности, позволяющие проводить очистку по методу аффинной хроматографии.

Многие из приведенных гетерологичных последовательностей коммерчески доступны в виде плазмид экспрессии, поскольку указанные последовательности обычно включаются в гибридные белки с тем, чтобы получить дополнительные свойства, не нарушив существенно специфической биологической активности слитого с ними белка (Тегре К., 2003, Арр1. МюгоЬю1. Вю!есйпо1., 60: 523-33). Примеры таких дополнительных свойств включают увеличение полужизни в физиологических жидкостях, внеклеточную локализацию или облегчение процедуры очистки за счет наличия тяжа из гистидинов, образующих так называемую гистидиновую метку (беи!/ е! а1. 1989, Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 86: 821-4), или НА метки, эпитопа, полученного из белка гемагглютинина вируса гриппа (^Й8ои е! а1. 1994, Се11, 37: 76778). При необходимости гетерологичная последовательность может быть удалена при протеолитическом расщеплении, например, путем встраивания сайта протеолитического расщепления между белком и гетерологичной последовательностью, с последующей обработкой очищенного гибридного белка соответствующей протеазой. Указанные свойства особенно важны в случае гибридных белков, поскольку облегчают их получение и использование при изготовлении фармацевтических композиций. Так, например, использованный в примерах белок (зрелый полипептид 1Л8Р181; 8Е0 ГО N0: 22) был очищен по процедуре, включающей присоединение гексагистидинового пептида к карбоксиконцу 1Л8Р181. В том случае, когда гибридный белок включает область иммуноглобулина, указанный гибрид может быть получен путем прямого присоединения компонентов или путем их присоединения посредством короткого линкерного пептида, длина которого может составлять по меньшей мере 1-3 аминокислотных остатка или более, например 13 аминокислотных остатков. Указанным линкером может быть, например, трипептид с последовательностью Е-Е-М (С1и-Рйе-Ме!) или линкерная последовательность, состоящая из 13 аминокислот и содержащая последовательность 61и-Рйе-61у-А1а-61у-Ееи-Уа1-Ееи-61у-61у-61п-Рйе-Ме!, встроенную между последовательностью веществ по настоящему изобретению и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как более длительное время его присутствия в физиологических жидкостях (например, увеличенное время полужизни), повышенная удельная активность, повышенный уровень экспрессии или способность указанного гибридного белка легко подвергаться очистке.

В предпочтительном варианте изобретения белок присоединяют к константной области молекулы 1д. Предпочтительно такой белок присоединяют к областям тяжелой цепи, таким как домены СН2 и СН3, например, 1дС1 человека.

Для получения гибридных белков по изобретению могут быть также использованы и другие изоформы 1д, такие как изоформы 1дС2 или 1дС4, и изоформы других классов 1д, таких как, например, 1дМ или 1дА. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, а также гетеро- или гомомультимерными.

- 14 011816

В другом предпочтительном варианте изобретения функциональное производное включает по меньшей мере один фрагмент, присоединенный к одной или нескольким функциональным группам, которые представлены в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительно указанным фрагментом является полиэтиленовый фрагмент (ПЭГ). ПЭГилирование может быть проведено с использованием известных методов, таких как методы, описанные, например, в ν099/55377.

Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ΑΏΡ-рибозилирование.

Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы тема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное связывание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование СΡI-якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование, и убихитинизация.

Модификации могут присутствовать в любой области полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде либо того и другого посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения.

Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будут определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов.

Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептиду ΙΝ8Ρ181. Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином гомологичные, если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин идентичность означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин сходство означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко вычислена (Сοшриΐаΐ^οηа1 ΜοΚαιΕ-ΐΓ Вккду, Ьекк А.М. ей., 0х&гй ишуегАу Ριόκκ, №\у ΥοιΈ 1988; В^^трий^ ΙηίοηηαΙχδ апй Сегюте Ρ^ο^есΐк, 8ιηί11ι Ό.ν. ей., Асайетк Ριόκκ, №\у ΥοιΈ 1993; СотрШег Апа1ук1к οί 8едиегсе ΟπΙπ, ΡηΠ 1, Спйш А.М. & Спйш Н.С., ейк., Нитаиа Ριόκκ, №\у кгкеу, 1994; 8едиегсе Апа1ук1к ίη ΜοΕαιΕίΓ Вккду, νοη Неш_)е, С. Асайетк Ρκκκ, 1987; аг1й 8едиегсе Апа1ук1к ΡΟπ^η &ίόκ1<ον Μ. & Ре^щщих ί. ейк, Μ. 8^4οη Ριόκκ, Ксуу Υογ1« 1991).

Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых эти полипептиды происходят) и мутанты (такие, как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов ΙΝ8Ρ181. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть, остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между А1а, Vа1, Ьеи и Не; между 8ег и ТЬг; между кислотными остатками Акр и С1и; между Акп и С1п; между основными остатками Ьук и Агд или между ароматическими остатками Ρίκ и Туг. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, то есть от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот, или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно

- 15 011816 предпочтительными являются молчащие замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены.

Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков имеют группу-заместитель.

В соответствии с настоящим изобретением любая замена должна быть предпочтительно консервативной или допустимой заменой, которую обычно определяют как замену, вводящую аминокислоты, имеющие аналогичные химические свойства (например, основная положительно заряженная аминокислота должна быть заменена другой основной, положительно заряженной аминокислотой), которые являются достаточными для сохранения структуры и биологической функции данной молекулы.

В литературе описано множество моделей, с помощью которых может быть осуществлен отбор консервативных аминокислотных замен, исходя из статистических и физико-химических исследований последовательности и/или структуры белков (Водоу 8.Ι. и ΝοΚπίδον Α.Ν., 2001). Эксперименты по конструированию белков показали, что использование специфических подпоследовательностей аминокислот позволяет продуцировать белки с соответствующей укладкой и активные белки и классифицировать аминокислотные синонимичные замены, которые могут легко адаптироваться к белковой структуре и которые могут быть использованы для детекции функциональных и структурных гомологов и паралогов (МигрНу Ь.В. с( а1., 2000). Группы синонимичных аминокислот и группы более предпочтительных синонимичных аминокислот представлены в табл. Ι.

В полипептиды по изобретению также могут быть введены в различных целях специфические неконсервативные мутации. Мутации, снижающие аффинность СО24-подобного белка, допускают возможность повторного использования этих полипептидов, а также их применения в других целях, что потенциально повышает их терапевтическую эффективность. (ВоЬтзоп С.В., 2002).

Иммуногенные эпитопы, фактически присутствующие в полипептидах по изобретению, могут быть использованы для разработки вакцин (81:еуапоую 8., 2002), либо они могут быть удалены путем модификации их последовательности известными методами отбора мутаций, повышающих стабильность белка, и их коррекции (уап йеп Вигд В. & Еузшк ν, 2002; \νΟ 02/05146, \νΟ 00/34317 и \νΟ 98/52976).

Предпочтительной альтернативой синонимичным группам для аминокислотных производных, включенных в пептидомиметики, являются группы, определенные в табл. ΙΙ. Неисчерпывающий список аминокислотных производных также включает аминоизомасляную кислоту (А1Ь), гидроксипролин (Нур), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-СΟΟН, индолин-2-карбоновую кислоту, 4-дифторпролин, Ь-тиазолидин4-карбоновую кислоту, Ь-гомопролин, 3,4-дегидропролин, 3,4-дигидроксифенилаланин, циклогексилглицин и фенилглицин.

Термин аминокислотное производное означает аминокислоту, не входящую в 20 кодируемых генетическим кодом природных аминокислот, или химическую молекулу, подобную такой аминокислоте. В частности, такое аминокислотное производное может содержать замещенные или незамещенные молекулы, молекулы с прямой цепью, молекулы с разветвленной цепью или циклоалкильные молекулы, а также может включать 1 или несколько гетероатомов. Указанные аминокислотные производные могут быть получены йе поуо. либо они могут быть взяты из коммерчески доступных источников (Са1ЬюсйетНоуаЬюеНет А.О., 8\\й/ег1апй; ВасНет, И8А).

Различные методы включения неприродных аминокислотных производных в белки с использованием ίη νΐΐΐΌ и ίη νί\Ό систем трансляции для зондирования и/или улучшения структуры и функции белков описаны в литературе (ОондНеПу Ό.Α., 2000). Методы синтеза и получения пептидомиметиков, а также непептидомиметиков также хорошо известны специалистам (0о1еЬ1о^5к1 А. е( а1., 2001; НгиЬу УД. & Ваке Ρ.Μ., 2000; 8а\\уег Τ.Κ. 8йнсШге Вазей Эгид Ие51дп, еййей Ьу Vее^араηй^аη Ρ., Магсе1 Иеккег Шс., рд. 557-663, 1997).

Обычно считается, что два полипептида, имеющих более чем 30%-ную идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы последовательности функционально эквивалентных полипептидов по первому аспекту изобретения были более чем на 70 или на 80% идентичны последовательностям полипептидов ΙΝ8Ρ181 или их активных фрагментов. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 85, 90, 95, 98, 98,5, 99 или 99,5%, соответственно.

Функционально эквивалентными полипептидами по первому аспекту изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или нескольких методов структурного сопоставления первичных последовательностей путем их выравнивания. Так, например, технология информационной обработки потока геномных данных (Шрйагтайса Оепоте Τй^еайе^™), которая составляет один из аспектов способа поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Вюрепйшт, может быть применена (см. \νΟ 01/67507) для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности по сравнению с полипептидами экзона ΙΝ8Ρ181 или полипептидом ΙΝ8Ρ181 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18), высказывается предположение, что они представляют собой липокалины, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с полипептидами экзона ΙΝ8Ρ181, полипептидом ΙΝ8Ρ181, полипептидом ΙΝ8Ρ-8ν1, зрелым полипептидом ΙΝ8Ρ181, зрелым полипептидом ΙΝ8Ρ-8ν1, полипепти

- 16 011816 дом-полиморфом ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ, зрелым полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181, полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181-§ν1 Ν92Τ, зрелым полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181 Ν92Τ, полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181-§ν1Ο1148 или зрелым полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181-§ν1Ο1148.

Термин значительная структурная гомология означает, что технология [прНагтабса Сепоте ТЬгеабег™ позволяет предсказать структурную гомологию двух белков с достоверностью по крайней мере 10%, предпочтительно по крайней мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% и выше. Вероятностное значение по технологии ШрИагтайса Сепоте ТЬгеабег™ вычисляют следующим образом. Вначале проводят серию сравнений в рамках технологии ШрИагтайса Сепоте ТЬгеабег™ с использованием только последовательностей с известной структурой. Некоторые из сравнений проводят между белками, в отношении которых известно, что они являются близкородственными белками (на основании их структуры). Для этого был использован информационный поток по невральной сети, который обработали соответствующим образом с тем, чтобы наилучшим способом провести грань между близкородственными и неродственными вариантами, используя для этого структурную классификацию САТН (\у\у\у.ЬюсЬет.пс1.ас.ик/Ь5т/са1Ь). В результате, данные по невральной сети были ранжированы по баллам от 0 до 1. При этом, поскольку количество близкородственных белков и количество неродственных белков было известно, было возможно распределить результаты анализа невральной сети по пакетам и эмпирически вычислить процент корректных результатов. Аналогично, в случае поисковой базы данных Вюрепбшт, для любого точного предсказания берется балл, взятый из результатов анализа невральной сети, и процент доверительности указывает, насколько успешным было использование IηрЬа^таΐ^са Сепоте ТЬгеабег™ для обработки/анализа исследуемой серии.

Полипептиды по первому аспекту изобретения также включает фрагменты полипептидов ΙΝ8Ρ181 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептидов ΙΝ8Ρ181, при условии, что эти фрагменты являются липокалинами или имеют общую антигенную детерминанту с полипептидом ΙΝ8Ρ181, зрелым полипептидом ΙΝ8Ρ181, полипептидом ΙΝ8Ρ181-§ν1, зрелым полипептидом ΙΝ8Ρ181-§ν1, полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181 Ν92Έ зрелым полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181, полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181-§ν1 И92Т, зрелым полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181 Ν92Έ полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181-§ν^1148, зрелым полипептидом-полиморфом ΙΝ8Ρ181-§ν^114§, доменом липокалина ΙΝ8Ρ181 или доменом липокалина ΙΝ8Ρ181-§ν1.

Примеры фрагментов, которые демонстрируют активность липокалинов, включают такие фрагменты, которые содержат или состоят из домена липокалина, который представлен в виде 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 66, или последовательности (последовательностей), как показано на фиг. 12 (то есть аминокислоты на участке 25-174, аминокислоты на участке 26-180 и/или аминокислоты на участке 33-166 полноразмерных последовательностей ΙΝ8Ρ181), а также фрагмента (фрагментов), которые содержат цистеиновые остатки, образующие дисульфидные связи (то есть аминокислоты на участке 96-187 любой из полноразмерных последовательностей ΙΝ8Ρ181). Предпочтительно дисульфидная связь образуется между цистеиновыми остатками в положениях аминокислот 90 и 181.

Используемый здесь термин фрагмент означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептидов ΙΝ8Ρ181 либо одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать, по крайней мере, п смежных аминокислот данной последовательности, и, в зависимости от конкретной последовательности, указанное число п предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.

Длина фрагментов по настоящему изобретению составляет 1-100 аминокислот, предпочтительно 550, более предпочтительно 7-20 аминокислот.

Длина молекул нуклеиновой кислоты по изобретению составляет предпочтительно 10-1000 нуклеотидов, предпочтительно 50-800 нуклеотидов, предпочтительно 100-600 нуклеотидов, предпочтительно 200-550 нуклеотидов, предпочтительно 300-500 нуклеотидов.

Длина полипептидов по изобретению составляет предпочтительно 5-500 аминокислот, предпочтительно 50-400 аминокислот, предпочтительно 100-300 аминокислот, предпочтительно 150-250 аминокислот.

Фрагменты полноразмерных полипептидов ΙΝ8Ρ181 могут состоять из комбинаций 2 или 3, 4, 5... последовательностей смежных экзонов в последовательностях полипептидов ΙΝ8Ρ181, соответственно.

Указанные экзоны могут быть объединены с другими зрелыми фрагментами по настоящему изобретению. Такие комбинации включают, например, экзоны 1 и 2 и т.д. Указанные фрагменты включаются в объем настоящего изобретения. Фрагменты могут также состоять из комбинаций различных доменов белка ΙΝ8Ρ181. Например, фрагмент может состоять из комбинаций разных доменов липокалина ΙΝ8Ρ181, как было отмечено выше. Указанные фрагменты могут присутствовать в свободной форме, то есть они могут не быть частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фраг

- 17 011816 менту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. Однако в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов.

Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие по крайней мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к таким полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для любого читателя-специалиста, такие антитела, помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств.

Термин иммуноспецифический означает, что данные антитела имеют, в основном, более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам, описанным ранее. Используемый здесь термин антитело означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как ЕаЬ, Е(аЬ')₂ и Εν, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения.

Под понятием значительно более высокая аффинность авторы подразумевают заметно более высокую аффинность к полипептиду по изобретению по сравнению с аффинностью других известных родственных полипептидов, таких как липокалины.

При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду по изобретению по меньшей мере в 1,5, 2, 5, 10, 100, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ раз или более превышала аффинность по сравнению с другими родственными полипептидами, известными из уровня техники.

При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду по изобретению значительно превышала аффинность по отношению к известным липокалинам.

При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду по изобретению значительно превышала аффинность по отношению к природным липокалинам.

Если предпочтительными являются поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизировано полипептидом по первому аспекту изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Такой связанный полипептид может быть затем использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией.

Моноклональные антитела против полипептидов по первому аспекту изобретения могут быть легко получены специалистом в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии хорошо известна специалистам (см., например, КоЫег О. & Μίϊδίβίη, С. №11иге 256: 495-497 (1975); КохЬог еί а1., Ьптипо^ду ТоЬау 4: 72 (1983); Со1е еί а1., 77-96, Мопос1опа1 АгИ^о^ек анЬ Саисег ТЬегару, Акт К. Ь188, Ιηο. (1985)).

Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов по первому аспекту изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, то есть на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.

Могут быть также использованы и химерные антитела, в которых вариабельные области нечеловека соединены или лигированы с константными областями человека (см., например, Ьш еί а1., Ριό^ Νίώ. АсаЬ. 8с1. И8А, 84, 3439 (1987)).

Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их гуманизации (см., .Топсв еί а1., №Шге, 321, 522 (1986); Vе^Ьοеуеη еί а1., Заеме, 239, 1534 (1988); КаЬаί еί а1., 1. Iттиηο1., 147, 1709 (1991); Онеем еί а1., Ριό^ №И. Асаб. 8с1., И8А, 86, 10029 (1989); Оюппап е1 а1., Ρ^οс.Nаί1. АсаЬ. 8ск, И8А, 88, 34181 (1991) аЫ Но0§8оп е1 а1., Вю/ТесЬм^^у, 9, 421 (1991)). Используемый здесь термин гуманизованное антитело означает молекулы антитела, в которых аминокислоты СЭК и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей донорного антитела нечеловека были заменены эквивалентными аминокислотами антитела человека. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с антителом человека, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом.

В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть биспецифическое антитело, то есть антитело, имеющее два различных антигенсвязывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.

Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами

- 18 011816 по изобретению, либо из набора ПЦР-амплифицированных У-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки необученных лимфоцитов может быть использована техника фагового дисплея (МсСайейу 1. е1 а1. (1990), №Щ.1ге 348, 552554; Магкк 1. е1 а1. (1992) Вю1есйпо1о§у 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также повышена путем перестановки цепей (С1асккоп Т. е1 а1. (1991) №11иге 352, 624-628).

Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, то есть они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ЕЫ8А). Для использования в этих целях антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.

Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты по второму и третьему аспектам изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидные последовательности, представленные в 8Еф ΙΌ ΝΟ: 2, 8Еф ГО ΝΟ: 4, 8Еф ГО ΝΟ: 6, 8Еф ГО ΝΟ: 8, 8Еф ГО ΝΟ: 10, 8Еф ГО ΝΟ: 12, 8Еф ГО ΝΟ: 14 и/или 8Еф ГО ΝΟ: 16, 8Еф ГО ΝΟ: 18, 8Еф ГО ΝΟ: 20, 8Еф ГО ΝΟ: 22, 8Еф ГО ΝΟ: 24, 8Еф ГО ΝΟ: 26, 8Еф ГО ΝΟ: 28, 8Еф ГО ΝΟ: 30, 8Еф ГО ΝΟ: 32, 8Еф ГО ΝΟ: 34, 8Еф ГО ΝΟ: 36, 8Еф ГО ΝΟ: 38, 8Еф ГО ΝΟ: 40, 8Еф ГО ΝΟ: 42, 8Еф ГО ΝΟ: 44, 8Еф ГО ΝΟ: 46, 8Еф ГО ΝΟ: 48, 8Еф ГО ΝΟ: 50, 8Еф ГО ΝΟ: 52, 8Еф ГО ΝΟ: 54, 8Еф ГО ΝΟ: 56, 8Еф ГО ΝΟ: 58, 8Еф ГО ΝΟ: 60, 8Еф ГО ΝΟ: 62, 8Еф ГО ΝΟ: 64, 8Еф ГО ΝΟ: 66 или 8Еф ГО ΝΟ: 68 и функционально эквивалентные полипептиды. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и в целях, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению предпочтительно содержат, по крайней мере, п смежных нуклеотидов в описанных здесь последовательностях, где п, в зависимости от конкретной последовательности, предпочтительно равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).

Молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению также являются последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов).

Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек или выделение из соответствующего организма. РНК-молекулы могут быть, в основном, генерированы путем ш νίΙΐΌ- или ш ν^νο-транскрипции ДНК-последовательностей.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью.

Термин молекула нуклеиновой кислоты также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (ΡΝΑ). Используемый здесь термин ΡΝΑ означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по крайней мере из пяти нуклеотидов и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Этот концевой лизин сообщает данной композиции растворимость. ΡΝΑ могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и прекращают элонгацию транскрипта (№е1кеп ΡΈ. е1 а1. (1993) Апйсапсег Эгид Эек. 8: 53-63).

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по изобретению, может быть идентична кодирующей последовательности одной или нескольких описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты.

Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид, представленный в любой из последовательностей 8Еф ГО ΝΟ: 2, 8Еф ГО ΝΟ: 4, 8Еф ГО ΝΟ: 6, 8Еф ГО ΝΟ: 8, 8Еф ГО ΝΟ: 10, 8Еф ГО ΝΟ: 12, 8Еф ГО ΝΟ: 14, 8Еф ГО ΝΟ: 16, 8Еф ГО ΝΟ: 18, 8Еф ГО ΝΟ: 20, 8Еф ГО ΝΟ: 22, 8Еф ГО ΝΟ: 24, 8Еф ГО ΝΟ: 26, 8Еф ГО ΝΟ: 28, 8Еф ГО ΝΟ: 30, 8Еф ГО ΝΟ: 32, 8Еф ГО ΝΟ: 34, 8Еф ГО ΝΟ: 36, 8Еф ГО ΝΟ: 38, 8Еф ГО ΝΟ: 40, 8Еф ГО ΝΟ: 42, 8Еф ГО ΝΟ: 44, 8Еф ГО ΝΟ: 46, 8Еф ГО ΝΟ: 48, 8Еф ГО ΝΟ: 50, 8Еф ГО ΝΟ: 52, 8Еф ГО ΝΟ: 54, 8Еф ГО ΝΟ: 56, 8Еф ГО ΝΟ: 58, 8Еф ГО ΝΟ: 60, 8Еф ГО ΝΟ: 62, 8Еф ГО ΝΟ: 64, 8Еф ГО ΝΟ: 66 или 8Еф ГО ΝΟ: 68, и функционально эквивалентные полипептиды.

Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, но не ограничиваются ими, последовательность, кодирующая только зрелый полипептид; последовательность, кодирующая зрелый полипептид, и дополнительные кодирующие последовательности, такие как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препрополипептидную последовательность; последовательность, кодирующая зрелый полипептид с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями или без них либо вместе с другими дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации), в связывании с рибосомой и в обеспечении стабильности мРНК.

- 19 011816

Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть также вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.

Молекулы нуклеиновой кислоты по второму и третьему аспектам изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов по первому аспекту изобретения. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо такая молекула может представлять собой вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, к клеткам или к целым организмам.

Среди рассматриваемых вариантов имеются варианты, которые отличаются от вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Такие замены, делеции или инсерции могут быть сделаны в одном или нескольких нуклеотидах. Указанные варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.

Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть также сконструированы методами, в основном, известными специалистам, включая, в зависимости от целей применения, модификацию клонирования, процессинг и/или экспрессию генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т. п.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид по первому аспекту изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы полученная комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным осуществление экспрессии гибридного белка, который может распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между последовательностью полипептида по изобретению и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка.

Молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть также антисмысловые молекулы, которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды по изобретению, а поэтому они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (гибридизация). В соответствии с методами, известными среднему специалисту в данной области, такие антисмысловые молекулы, например олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по изобретению, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и, тем самым, предотвращали ее транскрипцию (см., например, Сойеп Σ.8., Τι^^δ ίη Рйагт. 8ск, 10, 435 (1989), Окапо, к №игоскет. 56, 560 (1991); О'Соппог, к №игоскет. 56, 560 (1991); Ьее е! а1., Шскю Ас1бк Век. 6, 3073 (1979); Соопеу е! а1., 8аепсе 241, 456 (1988); Иегуап е! а1., 8аепсе 251, 1360 (1991)).

Используемый здесь термин гибридизация означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут быть подвергнуты контакту друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или ВБОЕГО); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (8атЬгоок е! а1., см. выше).

Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного специалистам (8атЬгоок е! а1., см.выше). В высокой степени гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у \Уа111 С.М. и 8.Ь. Вегдег (1987; МеШобк Епхуто1. 152:399-407) и К1тте1 А.В. (1987; МеШобк Епгуто1. 152: 507-511).

Термин жесткость означает условия реакции гибридизации, которые благоприятствуют ассоциации молекул с большим сходством, но не способствуют ассоциации отличающихся молекул. Условия

- 20 011816 гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х88С (150 мМ ЫаС1, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х 88С приблизительно при 65°С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35°С (8атЬгоок с( а1., см.выше). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.

В предпочтительных вариантах этого аспекта настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ181 (8ЕО ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 8, 8ЕО ГО N0: 10, 8ЕО ГО N0: 12, 8Ер ГО N0: 14, 8ЕО ГО N0: 16, 8ЕО ГО N0: 18, 8ЕО ГО N0: 20, 8ЕО ГО N0: 22, 8ЕО ГО N0: 24, 8ЕО ГО N0: 26, 8ЕО ГО N0: 28, 8ЕО ГО N0: 30, 8ЕО ГО N0: 32, 8ЕО ГО N0: 34, 8ЕО ГО N0: 36, 8ЕО ГО N0: 38, 8ЕО ГО N0: 40, 8ЕО ГО N0: 42, 8ЕО ГО N0: 44, 8ЕО ГО N0: 46, 8ЕО ГО N0: 48, 8ЕО ГО N0: 50, 8ЕО ГО N0: 52, 8ЕО ГО N0: 54, 8ЕО ГО N0: 56, 8ЕО ГО N0: 58, 8ЕО ГО N0: 60, 8Е0 ГО N0: 62, 8Е0 ГО N0: 64, 8Е0 ГО N0: 66 или 8Е0 ГО N0: 68), и молекулам нуклеиновой кислоты, которые, в основном, комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая по всей своей длине по меньшей мере на 80% идентична молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 3, 8Е0 ГО N0: 5, 8Е0 ГО N0: 7, 8ЕО ГО N0: 9, 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 13, 8ЕО ГО N0: 15, 8ЕО ГО N0: 17, 8ЕО ГО N0: 19, 8ЕО ГО N0: 21, 8ЕО ГО N0: 23, 8ЕО ГО N0: 25, 8ЕО ГО N0: 27, 8ЕО ГО N0: 29, 8ЕО ГО N0: 31, 8ЕО ГО

N0: 33, 8ЕО ГО N0: 35, 8ЕО ГО N0: 37, 8ЕО ГО N0: 39, 8ЕО ГО N0: 41, 8ЕО ГО N0: 43, 8ЕО ГО N0: 45,

8ЕО ГО N0: 47, 8ЕО ГО N0: 49, 8ЕО ГО N0: 51, 8ЕО ГО N0: 53, 8ЕО ГО N0: 55, 8ЕО ГО N0: 57, 8ЕО ГО

N0: 59, 8ЕО ГО N0: 61, 8ЕО ГО N0: 63, 8ЕО ГО N0: 65, 8ЕО ГО N0: 67 или 8ЕО ГО N0: 69, либо чтобы молекула нуклеиновой кислоты была комплементарна указанной молекуле. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98, 98,5, 99 или более 99% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают, в основном, такой же биологической функцией или активностью, как и полипептид ГО8Р181, зрелый полипептид ГО8Р181, полипептид ГО8Р181-8УЕ зрелый полипептид ГО8Р181-8УЕ полипептид-полиморф ГО8Р181 N921, зрелый полипептид-полиморф ГО8Р181, полипептид-полиморф ГО8Р181-8У1 N92% зрелый полипептид-полиморф ГО8Р181 N927. полипептид-полиморф ГО8Р181-8У1С1148. зрелый полипептид-полиморф ГО8Р181-8У1С1148 или полипептид домена липокалина ГО8Р181.

Настоящее изобретение относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, включающему стадии: (а) контактирования нуклеинового зонда по изобретению с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (Ь) детекции любого из таких образованных дуплексов.

Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды ГО8Р181, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими эти полипептиды.

В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы методы, описанные и обсуждаемые ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны, и, в основном, доступны специалистам, и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов по изобретению, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, секвеназа (И8 Вюсйетка1 Согр., С1еуе1апб, ОН), полимераза Тад (Регкт Е1тег), термостабильная полимераза Т7 (Атегайат, Сйкадо, 1Ь) или комбинация таких полимераз и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в Е^0NСΑ8Е Атрййсайоп 8уйет и поставляемые С|Ьсо/ВРЕ (ОаййегаЬигд, ΜΌ). Способ секвенирования может быть предпочтительно автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат НатШои Мкго ЬаЬ 2200 (НатШоп, Вейо, N'^1, термоячейка РеЙкг Тйегта1 Сус1ег (РТС200; Μ1 Векеагсй, ^акйотеп, МА), катализатор ΑΒΙ и ДНК-секвенаторы 373 и 377 ^NΑ 8ес.|иепсег5 (Регкт Е1тег).

Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептидов ГО8Р181, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам (см., например, Сштеи! РгоФсоН ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Аи8иЬе1 е( а1. (еб§). Огеепе РиЫксйтд А55ос1а1е5 апб \УПеу 1пкгаскпсе, №\ν Уогк, 1989, 1992). Особенно подходящими

- 21 011816 являются зонды, содержащие по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 30, а более предпочтительно по меньшей мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена (8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 8ЕЦ ΙΌ N0: 5, 8ЕЦ ΙΌ N0: 7, 8ЕЦ ΙΌ N0: 9, 8ЕС ΙΌ N0: 11, 8ЕС ΙΌ N0: 13, 8ЕС ΙΌ N0: 15, 8ЕС ΙΌ N0: 17, 8ЕС ΙΌ N0: 19, 8ЕС ΙΌ N0: 21, 8ЕС ΙΌ N0: 23, 8ЕС ΙΌ N0: 25, 8ЕС ΙΌ N0: 27, 8ЕС ΙΌ N0: 29, 8ЕС ΙΌ N0: 31, 8ЕС ΙΌ N0: 33, 8ЕС ΙΌ N0: 35, 8ЕС ΙΌ N0: 37, 8ЕС ΙΌ N0: 39, 8ЕС ΙΌ N0: 41, 8ЕС ΙΌ N0: 43, 8ЕС ΙΌ N0: 45, 8ЕС ΙΌ N0: 47, 8ЕС ΙΌ N0: 49, 8ЕС ΙΌ N0: 51, 8ЕС ΙΌ N0: 53, 8ЕС ΙΌ N0: 55, 8ЕС ΙΌ N0: 57, 8ЕС ΙΌ N0: 59, 8ЕС ΙΌ N0: 61, 8ЕЦ ΙΌ N0: 63, 8ЕЦ ΙΌ N0: 65, 8ЕЦ ΙΌ N0: 67 и/или 8ЕЦ ΙΌ N0: 69). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов средний специалист в данной области может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например отдельных членов семейства, типа и/или подтипа.

Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, то есть в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет сильно обрезана, обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных методов детекции вышерасположенных последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (ВАСЕ; см., например, Егойтап с1 а1., ΡNΑ8 И8А 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, проиллюстрированные МагаНоп Т.М. (С1оп1се11 ЬаЬогаЮйек Ιηο.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется сайт-рестрикционной ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров (8агкаг 0. (1993) РСВ МеИойк Аррйс. 2: 318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (Тйдйа Т. с1 а1. (1988) ШсЮс АсИк Век. 16: 8186). Другим методом, который может быть использован в данном случае, является ПЦР с захватом, которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (йадегкВот М. е1 а1., (1991) РСВ Мейюйк Аррйс. 1, 111-119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод Рагкег Ю. е1 а1. (1991) ШсШс АсИк Век. 19: 3055-3060. Кроме того, можно использовать ПЦР, гнездовые праймеры и библиотеки Ргото1егЕтйег™ для прогулки по геномной ДНК (С1оп1есй, Ра1о А11о, СА). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон.

При скрининге на полноразмерные ДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека оНдо-й(Т) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'-нетранскрибируемых регуляторных областей.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важной стадией в подтверждение корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе У. МсКикюк, Мепйейап Й111еп1апсе ίη Мап (имеющейся в настоящее время в библиотеке Уэлльского медицинского университета Джона Хопкинса) Цойп Норктк Ишуегкйу \Уе1с11 Мейюа1 Ыйгагу). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или других методов обнаружения генов. После

- 22 011816 предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для детекции различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т.п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов, страдающих заболеванием.

Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации ίη Ан и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволяют получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в данном заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу.

Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид по изобретению, могут быть также использованы методы отключения гена. Одним из методов, который может быть использован для отключения последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (ΚΝΑί) (Е1Ьа§Ыг 8.М. е1 а1., №11иге 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНК-олигонуклеотиды синтезируют ίη νίίΐΌ и вводят в клетку.

Последовательность-специфическое связывание этих дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, что приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии белка-мишени.

Эффективность методов отключения гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), а на РНК-уровне она может быть оценена с помощью методики, основанной на ТацМап.

Векторы по изобретению содержат молекулы нуклеиновой кислоты и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева по изобретению, которые могут быть трансформированы, трансфицированы или трансдуцированы векторами по изобретению, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки-хозяева.

Полипептиды по изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие их них подробно описаны у 8атЬгоок е1 а1. (см. выше) и Регпапйех & НоеГПег (1998, ей§. Сепе ехргекыоп куйепъ. Иапд паГиге Гог 1Не ай оГ ехргекыоп, Αсаάет^с ΡΐΌ55. 8ап Б1едо, Ьопйоп, ВокГоп, №\ν Уогк, 8уйпеу, Токуо, Тогоп(о).

Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у 8атЬгоок еГ а1. (см. выше). В общих чертах кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях) и, необязательно, оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине.

Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусная системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирусы, такие как 8У40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы или их комбинации, а также векторы, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные хромосомы человека (НАС). Предпочтительными примерами векторов, которые могут быть использованы в соответствии с аспектами настоящего изобретения, относящимися к ΙΝ8Ρ181, являются векторы рСΒ4-ΤОΡО-IN§Ρ181, рСΚ4-ΤОΡО-IN§Ρ181-§V1, рВОН^^^^^-бИК, р^ОNΒ221_IN§Ρ181§V1-ΗI§, рЕΑΚ_IN§Ρ181-6ΗI§, рЕΑΚ_IN§Ρ181§V1-6ΗI§, р^Е§Τ12.2_IN§Ρ181-6ΗI§ и р^Е§Τ12.2_IN§Ρ181§V1-6ΗI§.

Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНК-экспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом мозаики табака, ТМУ) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Т1 или рВК.322); или клеточные системы жи

- 23 011816 вотных. Для продуцирования полипептидов по изобретению могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции.

Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по изобретению, в клетки-хозяева может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Όανίδ с1 а1., Ва51с МеЙюШ ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и 8атЬгоок с1 а1. (см. выше). Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная ΌΕΆΕ-декстраном; трасвекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (см., 8атЬгоок е1 а1.,1989 (см. выше), Ли5иЬе1 е1 а1., 1991 (см. выше), 8рес1ог. 6о1йтап & Ьет-гаИ, 1998). В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция).

Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид или лидерная последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду, либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге.

Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды В1ие8спр1 (81га1адепе, Ьа1о11а, СА) или плазмиды р8рой1™ (61Ьсо ВКЕ) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, ΡυΒΙ80Ό и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе 8ν40 или ΕΒν с соответствующим селективным маркером.

Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под контролем регуляторных последовательностей, то есть так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать указанную последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, то есть с сохранением рамки считывания.

Указанные регуляторные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт.

Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки,

- 24 011816 успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа.

Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны специалистам, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детенышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (СО8), клетки С127, клетки 3Т3, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер 02) и ряд других клеточных линий.

В бакуловирусной системе материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, йИег аНа. от Iην^ί^οдеη, 8аη ^^едο СА (набор МахВас). В общих чертах, эти методы известны специалистам и подробно описаны у 8иттегк & 81111111, Техак Адг1си11ига1 Ехрептеи! 8ίаί^οη Ви11е!т № 1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клетки ΟΐΌκορΙιίΗι 82 и клетки 8рοάοрίе^а 8£9.

Специалистам известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в патентах США 5693506, 5659122 и 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны ХспЦ РНуЮсНетШгу 30, 3861-3863 (1991).

В частности, можно использовать любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты с последующим продуцированием из них целых регенерированных растений, которые содержат перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, но не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых, а также овощных растений.

Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, Εχο1ί, 81герЮтусе8 и ВасШик киЬПНк.

Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, 8. сегеуЫае) и клетки АкрегдШик.

Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны специалистам. Примерами являются гены тимидинкиназы (\У1д1ег М. еί а1. (1977) Се11 11: 223-32) и аденинфосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Έο\\ύ I. еί а1. (1980) Се11 22: 817-23), которые могут быть использованы в !к- или арг!'-клетках, соответственно.

Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например ген дигидрофолатредуктазы (ИНРЯ), который сообщает резистентность к метотрексату (^1д1ег М. е! а1. (1980) Ргос. N311. Асай. 8сЕ 77: 3567-70); ген ηρΐ, который сообщает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к 0-418 (ί.'ο^ΐΌ-0;ΐΓ;ιρίη Р. е! а1. (1981) 1. Μο1. Вю1. 150: 1-14), и гены а1к или ра!, которые сообщают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицинацетилтрансферазе, соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам.

Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако, его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении. Так, например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид по изобретению, находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию тандемного гена.

Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по изобретению, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка, например сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (РАС8) или иммуноанализы (такие, как твердофазный иммуноферментный анализ [ЕБ18А] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детекции и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. НатрЮн Я. е! а1. (1990) 8е^ο1οд^са1 Мсаюйк, а ^аЬο^аΐο^у Магшак АР8 Ргекк, 8ΐ. Раи1, МЦ) и Μаааοx И.Е. е! а1., (1983) 1. Ехр. Мей. 158, 1211-1216).

Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченных зондов для гибридизации или ПЦРзондов для детекции последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды по изобретению, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченого полинуклеотида. Альтернативно, последова

- 25 011816 тельности, кодирующие полипептид по изобретению, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы, известные специалистам, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов ίη νίίτο путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или 8Р6, и меченых нуклеотидов. Эти процедуры могут быть проведены с использованием различных коммерчески доступных наборов (Рйаттас1а & Ир)от (Ка1атахоо. М1); Рготеда (Маб18оп XVI) и И.8. Вюсйетка1 Согр. (С1е\^ге1апТ ОН)).

Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения детекции, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.

Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных, а в частности грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект по изобретению. Это генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для генерирования животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов по изобретению.

Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае, если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения и/или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков.

Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть также использованы специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды по изобретению, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков, являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как гистидин-триптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе удлинения/очистки ЕЬАС8 (1ттипех Согр., 8еай1е, νΑ). Для облегчения очистки между доменом для очистки и полипептидом по изобретению могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (Ιην Люден, 8ап Э1едо, СА). Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка, содержащего полипептид по изобретению, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью 1МАС (аффинной хроматографии на иммобилизованном ионе металла, описанной РотаШ 1. еί а1. (1992), Рго1. Ехр. РипГ. 3: 263-281), тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов, содержащих гибридные белки, можно найти у Кго11 Ό.Ι. еί а1. (1993; ΌΝΑ Се11 Вю1. 12: 441-453).

Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например, таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (ЕАС8), или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть восстановлена для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то перед выделением полипептида эти клетки должны быть сначала подвергнуты лизису.

Как указывалось выше, настоящее изобретение также относится к новым мишеням и к способам скрининга на лекарственные средства-кандидаты или другие нужные вещества. Такие методы скрининга включают анализы на связывание и/или функциональные анализы и могут быть осуществлены ίη νίΙΐΌ, в клеточных системах и ίη νί\Ό в организме животного.

В этой связи конкретной целью настоящего изобретения является применение полипептида Ш8Р181 в качестве мишени для скрининга на лекарственные средства-кандидаты, которые могут быть использованы для лечения или профилактики расстройств, ассоциированных с липокалином.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способов отбора биологически активных соединений, где указанные способы включают контактирование соединения-кандидата с геном или полипептидом Ш8Р181 и отбор соединений, которые связываются с указанным геном или полипептидом.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способов отбора биологически активных соединений, где указанные способы включают контактирование соединения-кандидата с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей полипептид Ш8Р181, и отбор соединений, которые связываются с указанным полипептидом Ш8Р181 на поверхности указанных клеток и/или которые модулируют активность полипептида Ш8Р181.

- 26 011816

Термин биологически активное соединение означает любое соединение, обладающее биологической активностью у индивидуума, предпочтительно терапевтической активностью; более предпочтительно соединение, обладающее активностью липокалина, а еще более предпочтительно соединение, которое может быть использовано для лечения Ш8Р181-ассоциированных расстройств или в качестве средства для разработки лекарственных препаратов, предназначенных для лечения расстройств, ассоциированных с липокалином. Биологически активным соединением предпочтительно является соединение, модулирующее активность Ш8Р181.

Вышеописанные способы могут быть осуществлены ίη νίΐτο с применением различных устройств и различных условий, включая использование иммобилизованных реагентов, и эти способы могут также включать дополнительную стадию анализа активности выбранных соединений в модели, такой как животное-модель с расстройством, ассоциированным с липокалином.

Предпочтительными выбранными соединениями являются агонисты Ш8Р181, то есть соединения, которые могут связываться с Ш8Р181 и имитировать активность его эндогенного лиганда.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа отбора биологически активных соединений, где указанный способ включает контактирование ίη νίΐτο тестируемого соединения с полипептидом Ш8Р181 по изобретению и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать активность указанного полипептида Ш8Р181.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа отбора биологически активных соединений, где указанный способ включает контактирование ίη νίΐτο тестируемого соединения с геном Ш8Р181 по изобретению и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать экспрессию указанного гена Ш8Р181, а предпочтительно стимулировать его экспрессию.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу скрининга, отбора или идентификации активных соединений, и в частности соединений, обладающих активностью, направленной на подавление рассеянного склероза или ассоциированных с ним расстройств, где указанный способ включает контактирование тестируемого соединения с рекомбинантной клеткой-хозяином, содержащей репортерную конструкцию, где указанная конструкция содержит репортерный ген, находящийся под контролем промотора гена Ш8Р181, и отбор тестируемых соединений, модулирующих (например, стимулирующих или снижающих, а предпочтительно стимулирующих) экспрессию указанного репортерного гена.

Полипептид по изобретению может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из известных методов, применяемых для поиска лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) экспрессию гена или активность полипептида по изобретению, а поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или регулировать активность полипептида по первому аспекту изобретения.

Соединения-агонисты или соединения-антагонисты могут быть выделены, например, из клеток, бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе Со1щап еΐ а1., СиггеШ РгоЮсоР ίη 1ттипо1о§у 1 (2): СНар1ег 5 (1991).

Связывание с геном или с полипептидом-мишенью служит показателем способности указанного соединения модулировать активность указанной мишени и, тем самым, оказывать влияние на путь, приводящий к развитию у индивидуума расстройства, ассоциированного с липокалином. Детекция связывания может быть осуществлена различными методами, такими как мечение соединения-кандидата, анализ на конкурентное связывание с известным меченым лигандом и т.п. Для проведения анализов на связывание ίη νίΐΐΌ указанные полипептиды могут быть использованы, в основном, в чистой форме, в виде суспензии, в форме, иммобилизованной на носителе, или в форме, экспрессируемой в мембране (в форме интактной клетки, мембранного препарата, липосомы и т.п.).

Модуляция активности включает, но не ограничивается ими, стимуляцию поверхностной экспрессии рецептора Ш8Р181, модуляцию мультимеризации указанного рецептора (например, образование мультимерных комплексов с другими субъединицами) и т.п. Клетками, используемыми в таких анализах, могут быть любые рекомбинантные клетки (то есть любые клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид Ш8Р181) или любые клетки, экспрессирующие эндогенный полипептид Ш8Р181. Примерами таких клеток являются, но не ограничиваются ими, прокариотические клетки (такие, как бактерии) и эукариотические клетки (такие, как клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений и т.п.). Конкретными примерами является клетки Е. со11, РюЫа райопк, Ηаη8еηи1а ро1утогр1а, ЗЫхокассНаготусек ротЬе, дрожжевые клетки К1иууеготусе5 или ЗассБаготусек, клеточные линии млекопитающих (например, клетки Уего, клетки СНО, клетки 3Т3, клетки СОЗ и т.п.), а также первичные и стабилизированные клеточные культуры млекопитающих (например, культуры фибробластов, эмбриональных клеток, эпителиальных клеток, нервных клеток, адипоцитов и т.п.).

Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие анта

- 27 011816 гонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом по изобретению, но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом по изобретению и, тем самым, ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может быть подвергнуто ингибированию, что будет приводить к подавлению нормальной биологической активности такого полипептида.

Полипептид по изобретению, который используется в таком методе скрининга, может находиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе или может присутствовать на клеточной поверхности, либо он может быть локализован внутри клетки. Вообще говоря, в таких процедурах скрининга могут быть использованы соответствующие клетки или клеточные мембраны, экспрессирующие полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Затем функциональный ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с ответом контрольных клеток, которые не контактировали с тестируемым соединением. Такой анализ, проводимый с помощью подходящей системы детекции, позволяет определить, может ли тестируемое соединение давать сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного агониста и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствии тестируемого соединения.

Предпочтительный способ идентификации соединения, являющегося агонистом или антагонистом полипептида по изобретению, включает:

(a) контактирование клетки, экспрессирующей (необязательно на своей поверхности) полипептид по первому аспекту изобретения, где указанный полипептид ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом либо его активации или ингибирования путем измерения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом.

Методы генерирования детектируемых сигналов в анализах описанного здесь типа хорошо известны специалистам. Конкретным примером является совместное введение конструкции, экспрессирующей полипептид по изобретению или его фрагмент, такой как ЬВЭ, присутствующий в виде гибрида с ДНКсвязывающим доменом САЬ4, в клетку вместе с репортерной плазмидой, такой как, например, рЕК-Ьис (81га1адепе Еигоре, Атйегбат, Т1е №!1ег1апб8). Эта конкретная плазмида содержит синтетический промотор с пятью тандемными повторами САЬ4-связывающих сайтов, регулирующих экспрессию гена люциферазы. При введении потенциального лиганда в клетки он будет связываться с гибридом САЬ4-полипептид и индуцировать транскрипцию гена люциферазы. Мониторинг уровня экспрессии гена люциферазы может быть проведен путем детекции его активности на устройстве для считывания интенсивности люминесценции (см., например, Ьейтап е! а1., 1ВС 270, 12953, 1995; Ра^аг е! а1., 1ВС, 277, 39243, 2002).

Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста полипептида по изобретению включает:

(a) контактирование меченого или немеченого соединения с полипептидом, иммобилизованным на любом твердом носителе (например, на сферах, пластинах, матричном носителе, чипе), и детекцию указанного соединения путем определения присутствия метки или самого соединения;

(b) контактирование клетки, экспрессирующей на своей поверхности полипептид, путем его искусственного заякоривания на клеточной мембране или путем конструирования химерного рецептора, ассоциированного со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (c) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом, с уровнем сигнала, вырабатываемого в отсутствие данного соединения.

Так, например, может быть применен такой способ, как ЕКЕТ-детекции лиганда, связанного с полипептидом в присутствии пептидных коактиваторов (№гп5 е! а1., 8аепсе 285, 744, 1999).

Другой предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста полипептида по изобретению включает:

(a) контактирование клетки, экспрессирующей (необязательно на своей поверхности) полипептид, ассоциированный со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодей

- 28 011816 ствия указанного соединения с указанным полипептидом, с уровнем сигнала, вырабатываемого в отсутствие данного соединения.

В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут, кроме того, включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченого или немеченого лиганда для полипептида.

В другом варианте изобретения способ идентификации агониста или антагониста полипептида по изобретению включает определение факта ингибирования связывания лиганда с клетками, которые экспрессируют полипептид по изобретению (и которые, но необязательно, содержат на своей поверхности полипептид по изобретению), или с клеточными мембранами, содержащими такой полипептид, в присутствии соединения-кандидата в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с указанным полипептидом. Считается, что соединение, способствующее снижению уровня связывания с лигандом, является агонистом или антагонистом. При этом предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченым.

Более конкретно, способ скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом полипептида, включает стадии:

(a) инкубирования меченого лиганда с целой клеткой, экспрессирующей на своей поверхности полипептид по изобретению, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид по изобретению;

(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной;

(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведение этой смеси до состояния равновесия;

(Ь) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и (е) сравнения различия в количествах связанного меченого лиганда стадий (Ь) и (Ь), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (Ь), считается агонистом или антагонистом.

Аналогичным образом, настоящее изобретение относится к способу скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом полипептида, который включает стадии:

(a) инкубирования меченого лиганда с полипептидом по изобретению, иммобилизованным на любом твердом носителе или на клеточной поверхности, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид по изобретению;

(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с полипептидом по изобретению, иммобилизованным на любом твердом носителе, или с целой клеткой или с клеточной мембраной;

(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и полипептида, иммобилизованного на твердом носителе, целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведения этой смеси до состояния равновесия;

(Ь) измерения количества меченого лиганда, связанного с иммобилизованным полипептидом, с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и (е) сравнения различия в количествах связанного меченого лиганда стадий (Ь) и (Ь), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (Ь), считается агонистом или антагонистом.

Было обнаружено, что полипептиды ΙΝ8Ρ181 могут также модулировать большое число физиологических и патологических процессов зависимым от дозы образом в вышеописанных анализах. Таким образом, термин функциональные эквиваленты полипептидов по настоящему изобретению включает полипептиды, которые обладают любой из указанных дозозависимых модулирующих активностей в вышеописанных анализах. Хотя степень дозозависимой активности необязательно должна быть идентична активности полипептидов по настоящему изобретению, однако, предпочтительно, чтобы указанные функциональные эквиваленты обладали, по существу, аналогичной дозозависимой активностью, измеренной в данном анализе, по сравнению с активностью полипептидов по настоящему изобретению.

В некоторых описанных выше вариантах настоящего изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или анализы на конкуренцию с меченым соединением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для детекции на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом.

Могут быть также разработаны анализы для детекции влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей указанный полипептид, в клетках. Так, например, может быть разработан такой анализ ЕЬРЗА, который позволяет измерять секретированные или клеточно-ассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами, известными специалистам, и такой анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образо

- 29 011816 вания связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением.

Могут быть также разработаны другие методы для детекции эффекта добавляемых исследуемых соединений на продукцию мРНК, кодирующей данный полипептид в клетке. Например, с помощью известных стандартных процедур можно таким образом адаптировать методику проведения иммуноферментного анализа ЕЫ8А, которая позволит определять уровни секретируемого или ассоциированного с клеткой полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител, что, в свою очередь, можно будет использовать для поиска соединений, способных ингибировать или усиливать продукцию полипептида на основе соответствующим образом обработанных клеток или тканей. Далее может быть проведена оценка образования связанных комплексов между полипептидом и исследуемым соединением.

Методы анализа, охватываемые терминами, которые используются в настоящем изобретении, включают также такие методы, которые вовлекают использование генов и полипептидов по настоящему изобретению в тестах на суперпродукцию или аблацию. Такие тесты вовлекают манипуляцию уровнями указанных генов/полипептидов в клетках и оценку воздействия такой манипуляции на физиологию задействованных при этом клеток. Например, такого рода эксперименты позволяют выявить детали сигнальных и метаболических путей, в которых участвуют конкретные гены/полипептиды, получить информацию, касающуюся природы полипептидов, с которыми взаимодействуют исследуемые полипептиды, и выявить возможные способы влияния на регуляцию родственных генов и белков.

Другой метод, который может быть использован для скрининга лекарственных средств, позволяет осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с представляющим интерес полипептидом (см. международную патентную заявку XVО 84/03564). В этом методе большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом по изобретению и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование ненейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными специалистам. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в вышеупомянутых способах скрининга на лекарственные средства.

Полипептиды по изобретению могут быть использованы для идентификации мембраносвязанных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной специалистам, такой как анализы на связывание и перекрестное связывание с лигандом, в которых данный полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детекцию или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазменный резонанс и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть также использованы для идентификации агонистов и антагонистов указанного полипептида, которые конкурируют с указанным полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны специалистам.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к применению полипептида [Ν8Ρ181 или его фрагмента, где указанным фрагментом предпочтительно является фрагмент, специфичный к гену Ш8Р181, в целях выделения или генерирования агониста или стимулятора полипептида [Ν8Ρ181 для лечения иммуноассоциированного расстройства, где указанный агонист или стимулятор выбран из группы, состоящей из:

1. специфического антитела или его фрагмента, включая:

a) химерное,

b) гуманизованное или

c) полностью антитело человека, а также

2. биспецифического или мультиспецифического антитела,

3. одноцепочечного антитела (например, ксЕу), или

4. однодоменного антитела, или

5. пептидо- или непептидомиметика, происходящего от указанных антител, или

6. антитело-миметика, такого как (а) антикалин или (Ь) связывающая молекула на основе фибронектина (например, тринектин или аднектин).

Получение пептидо- или непептидомиметиков из антител известно специалистам (8агадоу1 е! а1., 1991 & 8агадоу1 е! а1., 1992).

Антикалины также известны специалистам (Уод! е! а1., 2004). Связывающие молекулы на основе фибронектина описаны в патенте США № 6818418 и в УО 2004029224.

Кроме того, тестируемыми соединениями могут быть соединения различного происхождения, природы и состава, такие как любые небольшие молекулы, нуклеиновые кислоты, липиды, пептиды, полипептиды, включая антитела, такие как химерное, гуманизованное или полностью антитело человека или его фрагмент, происходящие от них пептидо- или непептидомиметики, а также биспецифические или

- 30 011816 мультиспецифические антитела, одноцепочечные антитела (например, 5сΡν), однодоменные антитела, антитела-миметики, такие как антикалин или связывающая молекула на основе фибронектина (например, тринектин или аднектин) и т.п., в изолированной форме или в виде их смеси или комбинаций.

Настоящее изобретение также относится к набору для скрининга, используемому в методах идентификации агонистов, антагонистов, лигандов, рецепторов, субстратов и ферментов, описанных выше.

Настоящее изобретение также относится к агонистам, антагонистам, лигандам, рецепторам, субстратам, ферментам и к другим соединениям, модулирующим активность или антигенность полипептида по изобретению в соответствии с описанными выше механизмами.

Как указывалось выше, предполагается, что различные молекулы по изобретению (то есть полипептиды по первому аспекту настоящего изобретения, молекула нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту настоящего изобретения, вектор по четвертому аспекту настоящего изобретения, клетка-хозяин по пятому аспекту настоящего изобретения, лиганд по шестому аспекту настоящего изобретения и соединение по седьмому аспекту настоящего изобретения) могут быть использованы для лечения или диагностики заболеваний. Для оценки эффективности указанных молекул по изобретению для лечения или диагностики заболевания могут быть проведены один или несколько из описанных ниже анализов. Следует отметить, что, хотя некоторые из нижеследующих анализов описаны для тестируемых соединений, являющихся белком/полипептидом, однако, специалист в данной области может легко модифицировать эти анализы для их применения к другим молекулам по изобретению, которые также могут быть использованы в качестве тестируемых соединений.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение по изобретению в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов, в качестве вакцин или в качестве других иммуногенных композиций, подробно описанных ниже.

В соответствии с используемой здесь терминологией композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение (X), считается в основном, не содержащей примесей (здесь, Υ), если по крайней мере 85 мас.% от всего количества Χ+Υ в данной композиции составляет X. Предпочтительно X составляет по крайней мере примерно 90%, а более предпочтительно по крайней мере примерно 95, 98, 98,5 или даже 99 мас.% по общей массе Χ+Υ в данной композиции.

Предпочтительно фармацевтические композиции должны содержать терапевтически эффективное количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, лиганда или соединения по изобретению. Используемый здесь термин терапевтически эффективное количество означает количество терапевтического агента, необходимого для лечения, ослабления или предупреждения рассматриваемого заболевания или состояни, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализе клеточной культуры, например опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. С использованием животного-модели могут быть также определены соответствующий интервал концентраций и их способ введения. Полученная информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку.

Точное эффективное количество соединения для введения индивидууму будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, его возраста, веса, пола и режима питания, от времени и частоты введения лекарственного средства, от комбинации(й) лекарственных средств, а также от реактивной чувствительности и толерантности/восприимчивости данного индивидуума к проводимой терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах, эффективная доза может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, а предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для введения терапевтического агента. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что данный носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.

Используемыми здесь фармацевтически приемлемыми солями могут быть, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Веттд1оп'5 Ρйа^тасеиΐ^са1 8с1епсе§ (Маск Ριιό. Со., Ν.Ρ 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в указанных композициях могут присутствовать и вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульги

- 31 011816 рующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т. п. С помощью таких носителей могут быть получены фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т. п. для перорального приема пациентом.

Композиции по изобретению после их приготовления могут быть непосредственно введены индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, а в частности человек.

Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть введены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедулярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное введение (см., например, \¥О 98/20734), а также подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, внутрикишечное, местное, подъязычное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций по изобретению могут быть также использованы аппараты для выстреливания генов или безыгольные шприцы. В основном, терапевтические композиции могут быть приготовлены в виде растворов для инъекций, либо жидких растворов, либо суспензий, или они могут быть получены в виде твердых форм, подходящих для получения растворов или суспензий в жидких носителях перед их инъекцией.

Указанные композиции могут быть непосредственно доставлены, в основном, путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо они могут быть доставлены в интерстициальное пространство ткани. Эти композиции могут быть также введены в пораженный участок. При этом лечение может быть проведено по схеме введения разовой дозы или дробных доз.

Если активность полипептида по изобретению превышает активность, требуемую для лечения конкретного патологического состояния, то в данном случае может быть рассмотрено несколько подходов. Один из таких подходов предусматривает введение индивидууму вышеописанного соединения-ингибитора (антагониста) вместе с фармацевтически приемлемым носителем, где указанный ингибитор вводят в количестве, эффективном для ингибирования функции полипептида, например блокирования связывания с лигандами, субстратами, ферментами или рецепторами, либо для ингибирования вторичного сигнала и, тем самым, эффективном для ослабления симптомов аномального состояния. Такими антагонистами предпочтительно являются антитела. Для минимизации иммуногенности антител, описанных выше, наиболее предпочтительно, чтобы такие антитела были химерными и/или гуманизованными.

В соответствии с другим подходом могут быть введены растворимые формы полипептидов, которые сохраняют аффинность связывания с рассматриваемым лигандом, субстратом, ферментом или рецептором. В основном, такой полипептид может быть введен в виде фрагментов, в которых сохраняются релевантные части.

В альтернативном подходе экспрессия гена, кодирующего данный полипептид, может быть ингибирована методами блокирования экспрессии, такими как использование молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты (описанных выше), которые могут быть генерированы эндогенно или введены отдельно. Модификации экспрессии генов могут быть получены путем конструирования комплементарных последовательностей или антисмысловых молекул (ДНК, РНК или ΡΝΑ) для осуществления регуляции, 5'областей или регуляторных областей (сигнальной последовательности, промоторов, энхансеров и интронов) гена, кодирующего данный полипептид. Аналогичным образом, такое ингибирование может быть осуществлено с использованием методики спаривания оснований с образованием тройной спирали. Спаривание с образованием тройной спирали используется потому, что оно приводит к нарушению способности двойной спирали раскрываться так, чтобы это оказалось достаточным для связывания с полимеразами, факторами транскрипции или регуляторными молекулами. Успехи в клинической терапии, достигнутые за последнее время благодаря использованию ДНК-триплекса, были описаны в литературе (Сее РЕ. е1 а1. (1994): НиЬег В.Е. & Β.Ι. Сагг, Мо1еси1аг апб Iттипо1од^с АрргоасЬек, РиШга ΡιιΝίδΙιίι^ Со., Μΐ. Кксо, ΝΥ). Комплементарная последовательность или антисмысловая молекула могут быть также сконструированы в целях блокирования трансляции мРНК посредством предотвращения связывания транскрипта с рибосомами. Такие олигонуклеотиды могут быть введены или генерированы ш δίΐιι в результате экспрессии ш у1уо.

Кроме того, экспрессия полипептида по изобретению может быть предотвращена с использованием рибозимов, специфичных к мРНК-последовательности, кодирующей этот полипептид. Рибозимы представляют собой каталитически активные РНК, которые могут быть природными или синтетическими (см., например, Иктап Ν. е1 а1., Сигг. Орт. §1гис1. Вю1. (1996) 6 (4), 527-33). Синтетические рибозимы могут быть сконструированы так, чтобы они специфически расщепляли мРНК в выбранных положениях и, тем самым, предотвращали трансляцию мРНК в функциональный полипептид. Рибозимы могут быть синтезированы с использованием природного рибозофосфатного остова и природных оснований, обычно присутствующих в РНК-молекулах. Альтернативно, рибозимы могут быть синтезированы с использованием неприродных остовов, например 2'-О-метил-РНК, в целях защиты от расщепления рибонуклеазой, и эти рибозимы могут содержать модифицированные основания.

Молекулы РНК могут быть модифицированы в целях увеличения внутриклеточной стабильности и времени полужизни. Возможными модификациями являются, но не ограничиваются ими, присоединение фланкирующих последовательностей у 5'- и/или у 3'-концов данной молекулы или использование в ука

- 32 011816 занном остове молекулы фосфортиоата или 2'-0-метила вместо фосфодиэстеразных связей. Эта концепция может рассматриваться и при продуцировании ΡNΑ и может быть применена ко всем указанным молекулам посредством включения нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и бутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и аналогичные модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина, которые не могут легко распознаваться эндогенными эндонуклеазами.

Для лечения аномальных состояний, ассоциированных с недостаточной экспрессией полипептида по изобретению и его активностью, имеется несколько способов. Один из таких способов предусматривает введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения, которое активирует указанный полипептид, то есть соединение-агонист, описанный выше, в целях ослабления симптомов патологического состояния. Альтернативно, терапевтическое количество указанного полипептида в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем может быть введено в целях сохранения соответствующего физиологического равновесия данного полипептида.

Для осуществления эндогенного продуцирования данного полипептида соответствующими клетками индивидуума может быть применена генотерапия. Генотерапию используют для перманентного лечения заболеваний, связанных с аномальным продуцированием данного полипептида, путем замены дефектного гена правильным терапевтическим геном.

Генотерапия по изобретению может быть осуществлена ίη νίνο или ех νίνο. Для генотерапии ех νίνο требуются выделение и очистка клеток, взятых у пациента, введение терапевтического гена и введение генетически модифицированных клеток обратно пациенту. В противоположность этому, генотерапия ίη νίνο не требует выделения и очистки клеток пациентов.

Для введения пациенту обычно используют упакованный терапевтический ген. Носители для доставки генов могут быть невирусными, такими как липосомы, либо они могут представлять собой дефектные по репликации вирусы, такие как аденовирус, описанный Вегкпег К.Ь., Сигг. Το]3. ΜκιόΝο1. Iшшиηο1., 158, 39-66 (1992), или векторы на основе аденоассоциированного вируса (ААУ), описанные Μиζусζка Ν. Сигг. Το]3. ΜχιόΝο1. Iшшиηο1., 158, 97-129 (1992) и в патенте США № 5252479. Так, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по изобретению, может быть сконструирована для экспрессии в дефектном по репликации ретровирусном векторе. Затем эта экспрессионная конструкция может быть выделена и введена в упаковывающую клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, кодирующую указанный полипептид, так, чтобы указанная упаковывающая клетка продуцировала инфекционные вирусные частицы, содержащие нужный ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены индивидууму для конструирования клеток ίη νίνο и экспрессии полипептида ίη νίνο (см. С11ар1ег 20 Семе Легару амй οΙΗγ ΜοΕαιΕίΓ Сег1еис-Ьакей Л^гареикс АрргоасЬек (и цитируемые там ссылки), Нишаη ΜοΚαιΕπ Сег1е11ск (1996), Т. 81гас11аг1 & ААКеай, ΒΙΟ8 8^ηΐίίκ ΡιιΝίκΙκΓκ Ий.).

Другим способом является введение оголенной ДНК, где терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровоток или в мышечную ткань.

В случае, когда полипептидами или молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению являются агенты, вызывающие заболевание, настоящее изобретение относится к способу их использования в целях получения вакцин для вырабатывания антител против указанного агента, вызывающего заболевание.

Вакцины по изобретению могут быть либо профилактическими (то есть предназначенными для профилактики инфекции), либо терапевтическими (то есть предназначенными для лечения заболеваний после инфицирования). Такие вакцины содержат иммунизирующий(е) антиген(ы), иммуноген(ы), полипептид(ы), белок(ки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с описанными выше фармацевтически приемлемыми носителями, где указанным носителем может быть любой носитель, который сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию. Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы (адъюванты). Более того, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид дифтерии, столбняка, холеры, (Н. ΡχΊογι) и другие патогены.

Поскольку полипептиды могут разлагаться в желудке, то вакцины, содержащие полипептиды, предпочтительно вводят парентерально (например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или чрескожной инъекции). Композициями, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данной композиции изотоничность с кровью реципиента, а также водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители.

Вакцинные композиции по изобретению могут быть помещены в емкости для разовых лекарственных форм или для дробных лекарственных форм. Так, например, эти лекарственные формы могут быть помещены в запаянные ампулы и сосуды и могут храниться в замороженном виде, в которые, непосредственно перед их использованием, необходимо добавить лишь стерильный жидкий носитель. Конкретная доза будет зависеть от удельной активности данной вакцины и может быть легко определена путем рутинного экспериментирования.

Генетическая доставка антител, связывающихся с полипептидами по изобретению, может быть

- 33 011816 осуществлена, например, как описано в международной патентной заявке \УО 98/55607.

Для получения вакцинных композиций может быть также использована технология безыгольного впрыскивания (см., например, \\л\л\'.ро\\'бег|ес1.сот).

Ряд подходящих методов вакцинации и систем для доставки вакцин описаны в международной патентной заявке \УО 00/29428.

Настоящее изобретение также относится к использованию молекул нуклеиновой кислоты по изобретению в качестве диагностических реагентов. Детекция мутированной формы гена, представляющей собой молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, которые ассоциируются с дисфункцией, применяется в качестве диагностического средства, которое может облегчать установление диагноза заболевания или восприимчивости к заболеванию, возникающему в результате пониженной экспрессии, сверхэкспрессии или измененной пространственной или временной экспрессии данного гена. Индивидуумы, несущие мутации в данном гене, могут быть идентифицированы на ДНК-уровне различными методами.

Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для диагностики, могут быть получены из клеток данного индивидуума, таких как клетки крови, мочевины, слюны, биоптата ткани или материала, полученного после аутопсии. Геномная ДНК может быть использована непосредственно для детекции, либо перед проведением анализа она может быть амплифицирована ферментативным способом с помощью ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР), амплификации с замещением цепи (8ЦА) или другими методами амплификации (см. 8а1к1 е! а1., Шипе, 324, 163-166 (1986); Ве.) е! а1., Сгй. Иеу. Вюсйет. Мо1ес. Βίο1., 26, 301-334 (1991); Викептеуег е! а1., 1. У1го1. МеШ., 35, 117-126 (1991), Уап Вгип!, 1. Β^ο/ΤесЬиο1οду, 8, 291294 (1990)).

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания у пациента, включающему оценку экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по изобретению, и сравнение полученного уровня экспрессии с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия данного заболевания. Этот способ включает следующие стадии:

a) контактирование образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиново-кислотным зондом в жестких условиях, в результате чего образуется гибридный комплекс между молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению и указанным зондом;

b) контактирование контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и

c) детекцию присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детекция уровней гибридного комплекса в образце, взятого у данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, является признаком наличия данного заболевания.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, включающему следующие стадии:

a) получение образцов тканей от пациента, исследуемого на наличие заболевания;

b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению из указанного образца ткани и

c) установление диагноза заболевания у данного пациента путем обнаружения присутствия мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с данным заболеванием.

Для облегчения детекции молекул нуклеиновой кислоты в описанных выше способах может быть проведена стадия амплификации, например, с помощью ПЦР.

Делеции и инсерции могут быть детектированы по изменению размера амплифицированного продукта по сравнению с нормальным генотипом. Точковые мутации могут быть идентифицированы путем гибридизации амплифицированной ДНК с меченой РНК по изобретению или, альтернативно, с мечеными антисмысловыми ДНК-последовательностями по изобретению. Полностью соответствующие последовательности могут быть дифференцированы от дуплексов с ошибочным спариванием путем гидролиза РНКазой или путем оценки различий в температурах плавления. Присутствие или отсутствие мутации у пациента может быть определено посредством контактирования ДНК с нуклеиново-кислотным зондом, который гибридизуется с ДНК в жестких условиях, в результате чего образуется гибридная двухцепочечная молекула, где указанная гибридная двухцепочечная молекула имеет негибридизованную часть цепи нуклеиново-кислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и установления присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи нуклеиновокислотного зонда как показателя наличия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации в соответствующей части ДНК-цепи.

Такие способы диагностики являются особенно ценными для проведения пренатальных и даже неонатальных тестов.

Точковые мутации и другие отличия последовательностей эталонного гена и мутантных генов могут быть идентифицированы другими, хорошо известными методами, такими как прямое секвенирование ДНК или определение конформационного полиформизма одноцепочечных последовательностей (см. Оп!а е! а1., Сепошкк, 5, 874-879 (1989)). Так, например, секвенирующий праймер может быть использован вместе с двухцепочечным ПЦР-продуктом или с одноцепочечной матричной молекулой, генерированной с помощью модифицированной ПЦР. Определение последовательности осуществляют в со

- 34 011816 ответствии со стандартными процедурами с использованием радиоактивно меченных нуклеотидов или в соответствии с процедурами автоматического секвенирования с использованием флуоресцентных меток. Клонированные ДНК-сегменты могут быть также использованы в качестве зондов для детекции специфических ДНК-сегментов. Чувствительность этого метода значительно повышается при использовании комбинированной ПЦР. Кроме того, точковые мутации и другие модификации последовательностей, такие как полиморфизм, могут быть детектированы, как описано выше, например, с использованием аллель-специфических олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации последовательностей, отличающихся одним нуклеотидом.

Различия в ДНК-последовательностях могут быть также детектированы по изменениям электрофоретической подвижности ДНК-фрагментов в гелях в присутствии или в отсутствие денатурирующих агентов либо путем прямого секвенирования ДНК (например, Муегз е! а1., 8с1епсе (1985) 230: 1242). Изменения в конкретных положениях данных последовательностей могут быть также выявлены либо путем проведения анализов на защиту от нуклеазы, таких как анализ на защиту от РНКазы или 81, либо методом химического расщепления (см. Сойоп е! а1., Ггос. №И. Асай. 8сг И8А (1985) 85: 4397-4401).

Помимо стандартного гель-электрофореза и секвенирования ДНК, мутации, такие как микроделеции, анеуплоидии, транслокации и инверсии, могут быть также детектированы путем проведения анализа ίη 5Йи (см., например, Ке11ег е! а1., ЭХА ГгоЬек, 2пй Ей., 8!оск!оп Ρκ88, №\ν Уогк, КУ., И8А (1993)), то есть ДНК или РНК-последовательности в клетках могут быть проанализированы на мутации, без их выделения и/или иммобилизации на мембране. В настоящее время наиболее широко используемым методом является гибридизация ш Ши с флуоресценцией (ΕΙ8Η), и в литературе уже появилось множество описаний этого метода (см. например, ТгасБиск е! а1., 8с1епсе 250, 559-562 (1990) и Тгазк е! а1., Тгепйз, 6епе!., 7, 149-154 (1991)).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения для проведения эффективного скрининга генетических вариантов, мутаций и полиморфизма может быть создан массив олигонуклеотидных зондов, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению. Технология создания массивов хорошо известна специалистам и находит широкое применение; при этом она может быть использована для решения ряда проблем молекулярной генетики, касающихся экспрессии генов, сцепления генов и генетической изменчивости (см., например, М. СБее е! а1., 8с1епсе (1996) Vо1. 274, рр. 610-613).

В одном из вариантов осуществления изобретения такой массив может быть получен и использован в соответствии с методами, описанными в заявке РСТ \У0 95/11995 (СБее е! а1.); ЬоскБай Ό.ί. е! а1., (1996) N3!. Вю!есБ. 14: 1675-1680); и 8сБепа М. е! а1. (1996) Бгос. N311. Асай. 8с1. 93: 10614-10619). Олигонуклеотидные пары могут быть использованы в количестве от 2 пар до 1 млн пар. Эти олигомеры синтезируют в соответствующих участках на субстрате с использованием оптически направленного химического синтеза. Таким субстратом может быть бумага, неайлон или мембрана другого типа, фильтр, чип, покровное стекло или любой другой твердый носитель. В другом аспекте по изобретению олигонуклеотид может быть синтезирован на поверхности субстрата с использованием процедуры химического связывания и струйного аппарата для нанесения путем разбрызгивания, как описано в заявке РСТ XV0 95/251116 (ВаШезсБетеБег е! а1.). В другом своем аспекте для определения порядка расположения кДНКфрагментов или олигонуклеотидов на поверхности субстрата и связывания этих фрагментов или олигонуклеотидов с поверхностью субстрата могут быть использованы сетчатые массивы, аналогичные массивам для дот (или слот)-блотов, с применением вакуумной системы и процедур термического, УФ-, механического или химического связывания. Массив, такой как массивы, описанные выше, может быть создан вручную или с помощью подходящих устройств (слот-блот или дот-блот-аппарата), материалов (любого твердого носителя) и оборудования (включая роботизированную аппаратуру), и этот массив может содержать 8, 24, 96, 384, 1536 или 6144 олигонуклеотидов или любое другое число от 2 до более чем 1 млн, которое является подходящим для эффективного использования коммерчески доступного оборудования.

Помимо методов, описанных выше, заболевания могут быть диагностированы методами, предусматривающими определение в образце, взятом у индивидуума, аномально низкого или аномально высокого уровня полипептида или мРНК. Для количественной оценки полипептидов пониженный или повышенный уровень экспрессии может быть измерен на РНК-уровне любыми методами, хорошо известными специалистам, например путем амплификации нуклеиновых кислот, например, с помощью ПЦР или ОТПЦР, путем проведения анализов на защиту от РНКазы, Нозерн-блот-анализов и других методов гибридизации.

Аналитические методы, которые могут быть использованы для определения уровней полипептида по изобретению в образце, взятом у хозяина, хорошо известны специалистам и более подробно обсуждаются выше (включая радиоиммуноанализы, анализы на конкурентное связывание, Вестерн-блот-анализ и ЕЫ8А-анализы). В этом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, который включает стадии: (а) контактирования лиганда, описанного выше, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (Ь) детекции указанного комплекса.

Протоколы, такие как ЕЫ8А, РИА и ЕАС8, разработанные для измерения уровней полипептидов, могут быть, кроме того, взяты за основу для определения измененных или аномальных уровней экспрес

- 35 011816 сии полипептида. Нормальные или стандартные значения для экспрессии полипептида получают путем объединения физиологических жидкостей или клеточных экстрактов, взятых у нормальных млекопитающих, предпочтительно у человека, с антителом против данного полипептида в условиях, подходящих для образования комплекса. Количество образованного стандартного комплекса может быть оценено различными методами, такими как фотометрические методы.

Антитела, которые специфически связываются с полипептидом по изобретению, могут быть использованы для диагностики состояний или заболеваний, характеризующихся экспрессией полипептида, или в анализах для наблюдения за пациентами, которым было проведено лечение полипептидами, молекулами нуклеиновой кислоты, лигандами и другими соединениями по изобретению. Антитела, подходящие для использования в диагностических целях, могут быть получены способом, аналогичным способу, описанному выше для терапии.

Диагностические анализы на присутствие полипептида осуществляют методами, предусматривающими использование антитела и метки для детекции полипептида в физиологических жидкостях, экстрактах клеток или тканей человека. При этом могут быть использованы модифицированные или немодифицированные антитела, и эти антитела могут быть помечены путем их ковалентного или нековалентного связывания с репортерной молекулой. При этом могут быть использованы репортерные молекулы широкого ряда, известные специалистам, и некоторые из этих молекул описаны выше.

Количества полипептида, экспрессируемого у индивидуума, в контрольном образце и образце ткани, взятой при биопсии, сравнивают со стандартными величинами. Отклонение величин, полученных для данного индивидуума, от стандартных величин позволяет определить параметры для диагностики заболевания. Диагностический анализ может быть проведен для выявления отсутствия, присутствия и избыточной экспрессии полипептида и для мониторинга регуляции уровней полипептида во время терапевтического лечения. Такие анализы могут быть также проведены для оценки эффективности конкретного курса терапевтического лечения при исследовании животных в клинических испытаниях или для наблюдения за процессом лечения отдельного пациента.

Диагностический набор по изобретению может содержать:

(a) молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению;

(b) полипептид по изобретению или (c) лиганд по изобретению.

В одном из аспектов настоящего изобретения диагностический набор может включать первый контейнер, содержащий нуклеиново-кислотный зонд, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания. Этот набор может, кроме того, включать третий контейнер, содержащий агент для гидролиза негибридизованной РНК.

В альтернативном аспекте настоящего изобретения диагностический набор может содержать массив молекул нуклеиновой кислоты, по меньшей мере одной из которых может быть молекула нуклеиновой кислоты по изобретению.

Для детекции полипептида по изобретению диагностический набор может содержать одно или несколько антител, связывающихся с полипептидом по изобретению, и реагент, используемый для детекции реакции связывания между антителом и полипептидом.

Такие наборы могут быть использованы для диагностики заболевания или восприимчивости к заболеванию, в частности некоторых заболеваний, которые включают, но не ограничиваются ими, расстройства функции зрения, расстройства иммунной системы (например, аутоиммунные расстройства), воспалительные расстройства, воспалительное заболевание кишечника (ГВБ), язвенный колит (ИС), болезнь Крона (СБ), проктит, клеточно-пролиферативные расстройства, рак (например, рак молочной железы), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибковые инфекции), эмфизему, кожные заболевания, репродуктивные расстройства (например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункцию почек, инфаркт миокарда, артрит и рассеянный склероз, кистозно-фиброзную мастопатию и регуляцию развития нервной системы.

Различные аспекты и варианты настоящего изобретения будут более подробно проиллюстрированы, например, в описании, в частности, относящемся к полипептидам ΙΝ8Ρ181.

При этом следует отметить, что в настоящее изобретение могут быть внесены конкретные модификации, не выходящие за рамки объема изобретения.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1. Результаты анализа ΙΝ8Ρ181 с использованием программы ВЬ-Л^Т и доступной базы данных.

Фиг. 2. Сопоставление результатов анализа Гор Ь1ак1 с ΙΝ8Ρ181.

Фиг. 3. Результаты анализа ΙΝ8Ρ181 в рамках методики δίβίκύΡ.

Фиг. 4. Множественное сопоставление последовательности ΙΝ8Ρ181 и родственных последовательностей, содержащих домен липокалина.

Фиг. 5. Последовательность ДНК и белка ΙΝ8Ρ181. Положение и смысловой статус ПЦР-праймеров указаны стрелками.

- 36 011816

Фиг. 6. Сопоставление нуклеотидной последовательности кДНК, клонированной с использованием ΙΝ8Ρ181-ΟΡ3 и ΙΝ8Ρ181-ΟΡ4 ПЦР-праймеров, с предсказанной последовательностью ΙΝ8Ρ181.

Фиг. 7. Сопоставление по аминокислотной последовательности кДНК, клонированной с использованием ΙΝ8Ρ181-ΟΡ3 и ΙΝ8Ρ181-ΟΡ4 ПЦР-праймеров, с предсказанной последовательностью ΙΝ8Ρ181.

Фиг. 8. Анализ нуклеотидной последовательности с проведением трансляции продукта ПЦР ΙΝ8Ρ181, клонированного с использованием ΙΝ8Ρ181-ΟΡ3 и ΙΝ8Ρ181-ΟΡ4 праймеров.

Фиг. 9. Анализ нуклеотидной последовательности с проведением трансляции продукта ПЦР ΙΝ8Ρ181-§ν, клонированного с использованием ΙΝ8Ρ181-ΟΡ3 и ΙΝ8Ρ181-ΟΡ4 праймеров.

Фиг. 10. Результаты анализа ΙΝ8Ρ181 с использованием программы №ШСус. Сайт гликозилирования указан в положении 92.

Фиг. 11. Последовательность продукта трансляции и свойства ΙΝ8Ρ181.

Фиг. 12. Экспрессия ΙΝ8Ρ181 в большинстве тканей человека по данным анализа, проводимого по методу ОТ-ПЦР (Тас.|Маг1).

Фиг. 13. Экспрессия ΙΝ8Ρ181 в биоптатах пораженных заболеванием тканей, взятых из вариантов программы клинического испытания, по результатам анализа по методу ОТ-ПЦР (Тас.|Маг1).

Фиг. 14. Доменный анализ с использованием Поташ Ρ^οΓе55Ο^ Ιηίο гаиои демонстрирующий предсказанный домен липокалина в ΙΝ8Ρ181.

Фиг. 15. Результаты анализа домена липокалина применительно к семейству/остаткам, относящиеся к предсказанной вторичной структуре и положению дисульфидного мостика.

ТаблицаΙ

Аминокислота	Синонимичные группы	Более предпочтительные синонимичные группы
Зег	С1у, А1а, Зег, ТЬг, Рго	ТЬг, Зег
Агд	Азп, Ьуз, С1п, Агд, ΗΪ3	Агд, Ьуз, Нхз
Ьеи	РЬе, Не, Уа1, Ьеи, МеЬ	11е, Уа1, Ьеи, Мер
Рго	С1у, А1а, Зег, ТЬг, Рго	Рго
ТЬг	С1у, А1а, Зег, ТЬг, Рго	ТЬг, Зег
А1а	С1у, ТЬг, Рго, А1а, Зег	СХу_г А1з
Уа1	МеЬ, РЬе, 11е, Ьеи, Уа1	МеЬ, 11е, Уа1, Ьеи
61у	А1а, ТЬг, Рго, Зег, С1у	С1у, А1а
Не	РЬе, 11е, Уа1, Ьеи, МеЬ	11е, Уа1, Ьеи, МеЪ
РЬе	Тгр, РЬе,Туг	Туг, РЬе
Туг	Тгр, РЬе,Туг	РЬе, Туг

Суз	Зег, ТЬг, Суз	Суз
НХЗ	Азп, Ьуз, С1п, Агд, Нхз	Агд, Ьуз, Нхз
С1п	С1и, Азп, Азр, С1п	Азп, С1п
Азп	С1и, Азп, Азр, С1п	Азп, С1п
Ьуз	Азп, Ьуз, С1п, Агд, ΗΪ3	Агд, Ьуз, Нхз
Азр	С1и, Азп, Азр, С1п	Азр, С1и
С1и	С1и, Азп, Азр, С1п	Азр, С1и
МеЬ	РЬе, 11е, Уа1, Ьеи, МеЬ	11е, Уа1, Ьеи, МеЬ
Тгр	Тгр, РЬе,Туг	Тгр

- 37 011816

Таблица II

Аминокислота	Синонимичные группы
Йег	б-Зег, ТЬг, б-ТЬг, алло-ТЬг, Мек, б-Мек, Мек(О), б-Мек(О), Ь-Суз, б-Суз
Агд	б-Агд, Ьуз, б-Ьуз, гомо-Агд, б-гомо-Агд, Мек, 11е, б-Мек, б-11е, Огп, б-Огп
Ьеи	б-Ьеи, Уа1, б-Уа1, АдаА, АдаС, Ьеи, б-Ьеи, Мек, б-Мек
Рго	б-Рго, Ь-1-тиазолидин-4-карбоновая кислота, били Ь-1-оксазолидин-4-карбоновая кислота
ТНг	б-ТЬг, 5ег, б-йег, алло-ТЬг, Мек, б-Мек, Мек(О), б-Мек(О), Уа1, б-Уа1
А1а	б-А1а, С1у, А1Ь, В-А1а, Азр, Ь-Суз, б-Суз
Уа1	б-Уа1, Ьеи, б-Ъеи, Не, б-11е, Мек, б-Мек, АдаА, Ада С
С1у	А1а, б-А1а, Рго, б-Рго, А1Ь, бета-А1а, Азр
Не	б-11е, Уа1, б-Уа1, АдаА, АдаС, Ьеи, б-Ьеи, Мек, б-Мек
РЬе	б-РЬе, Туг, б-ТЬг, Ь-допа, Низ, б-Ηΐε, Тгр, бТгр, транс-3,4- или 5-фенилпролин, АдаА, АдаС, цис-3,4- или 5-фенилпролин, Вра, б-Вра
Туг	б-Туг, РЬе, б-РЬе, Ь-допа, Н1з, б-Н1з
Суз	б-Суз, 5-Ме-Суз, Мек, б-Мек, ТНг, б-ТЬг
С1п	б-С1п, Азп, б-Азп, С1и, б-С1и, Азр, б-Азр
Азп	б-Азп, Азр, Ο-Азр, С1и, б-С1и, С1п, б-С1п
Ьуз	б-Ьуз, Агд, б-Агд, гомо-Агд, б-гомо-Агд, Мек, бМек, 11е, б-11е, Огп, б-Огп
Азр	б-Азр, б-Азп, Азп, С1и, б-С1и, С1п, б-С1п
С1и	б-С1и, б-Азр, Азр, Азп, б-Азп, С1п, б-С1п
Мек	б-Мек, 5-Ме-Суз, Не, б-Пе, Ьеи, б-Ьеи, Уа1, бУа1

Примеры

Пример 1. Ш8Р181.

Используют последовательность полипептида ΕΝ8Ρ181 в качестве вводимой для поиска последовательности с использованием программы βΕ-ΛδΤ в базе данных неизбыточных последовательностей NСВI. На фиг. 1 показаны десять главных спариваемых вариантов, выявленных при поиске по программе ВЕАЗТ На фиг. 2 приведены результаты сопоставительного анализа вводимой для поиска последовательности ΕΝ8Ρ181 в массиве, включающем десять основных вариантов !ор Ь1ак!.

Клонирование кДНК ΞΝ8Ρ181 позволяет осуществить экспрессию белка ΕΝ8Ρ181 в прокариотических или эукариотических системах экспрессии и его последующую очистку с описанием свойств полученного продукта. Так, например, рекомбинантный ΕΝ8Ρ181 может использоваться для создания Ш8Р181-специфичных моноклональных или поликлональных антител, которые далее могут использоваться для целей характеристики ΕΝ8Ρ181. Альтернативно, рекомбинантный ΕΝ8Ρ181 может использоваться в широком перечне скрининг-анализов, включая описанные выше тесты и тесты, приведенные далее, в примере 5.

Пример 2. Клонирование ΞΝ8Ρ181 и Ш8Р1818У.

2.1. Получение матриц кДНК человека.

Первую цепь кДНК получают из образцов суммарной РНК, выделенных из разных тканей человека (С1оп!есН, 8!га!адепе, АтЬюп, Вюсйап [п8111и(е и препараты для внутреннего использования в компании) с использованием Зирегкспр! II или Зирегкспр! III ([пуПгодеп) по инструкции производителя.

В случае 8ирегкспр! II: объединяют в эппендорфовской пробирке на 1,5 мл олиго (дТ)₁₅ праймер (1 мкл при концентрации 500 мкг/мл) (Рготеда), 2 мкг суммарной РНК человека, 1 мкл 10 мМ смеси 6ΝΤΡ (по 10 мМ каждого из дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ при нейтральном рН) и стерильную дистиллированную

- 38 011816 воду в количестве, нужном для доведения до конечного объема 12 мкл, нагревают до 65 °С в течение 5 мин и охлаждают на льду. Содержимое собирают при проведении быстрого центрифугирования и добавляют 4 мкл 5Х специального буфера для получения первой цепи (Е1Г5!-81гапб Ви££ег), 2 мкл 0,1М ДТТ и 1 мкл ингибитора рекомбинантной рибонуклеазы К.№5е0иТ^|Л1 (40 Ед/мкл, йчуйгодеп). Содержимое пробирки осторожно перемешивают и инкубируют при температуре 42°С в течение 2 мин, после чего добавляют 1 мкл (200 Ед) фермента Зирегкспр! II™ и осторожно перемешивают путем пипетирования. Смесь инкубируют при температуре 42°С в течение 50 мин и затем инактивируют нагреванием при 70°С в течение 15 мин. Для удаления РНК, комплементарной к кДНК, добавляют 1 мкл (2 Ед) РНКазы Н Е.со11 Дпуйгодеп) и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 20 мин.

В случае Зирегкспр! III: объединяют в эппендорфовской пробирке на 1,5 мл 1 мкл олиго (дТ)₂₀праймера (50 М, Шуйгодеп), 2 мкг суммарной РНК человека, 1 мкл 10 мМ смеси 6ЖГР (по 10 мМ каждого из дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ при нейтральном рН) и стерильную дистиллированную воду в количестве, нужном для доведения до конечного объема 10 мкл, нагревают до 65°С в течение 5 мин и охлаждают на льду. Для каждой из реакций КТ смесь для синтеза кДНК готовят следующим образом: объединяют в отдельной пробирке 2 мкл 10Х КТ буфера, 4 мкл 25 мМ МдС1₂, 2 мкл 0,1М ДТТ, 1 мкл КЫа8е0иТ™ (40 Ед/мл) и 1 мкл от фермента Зирегаспр! III™ и затем добавляют 10 мкл данной смеси к пробирке, содержащей смесь РНК/праймер. Содержимое пробирки осторожно перемешивают, собирают при проведении быстрого центрифугирования и инкубируют при 50°С в течение 50 мин. Реакцию останавливают путем инкубации при температуре 80°С в течение 5 мин, после чего реакционную смесь охлаждают на льду и собирают при проведении быстрого центрифугирования. Для удаления РНК, комплементарной к кДНК, добавляют 1 мкл (2 Ед) РНКазы Н Е.сой Дпуйгодеп) и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 20 мин.

Конечную реакционную смесь в объеме 21 мкл разбавляют добавлением 179 мкл стерильной воды с доведением общего объема до 200 мкл. Образцы РНК собирают в совокупные пулы, так чтобы каждый из них содержал до пяти разных образцов кДНК. Используют по 5 мкл каждого из пула кДНК в качестве матрицы для ПЦР в конечном объеме реакционной смеси 50 мкл, которая включает 1 мкл каждого из образцов кДН из данного пула. Это будет, в свою очередь, соответствовать 20 нг каждой индивидуальной матрицы кДНК.

2.2. Библиотеки кДНК.

Библиотеки кДНК человека (в векторах бактериофага ламбда) приобретают от 81га1адепе, С1оп!ес1 или Шуйгодеп или создают на базе Института Фармацевтических Исследований (8егопо Рйагтасеи!юа1 Кекеагсй [п8111и1е) в векторах λ 2АР, λ 6Т10, λ 6Т11 или Тпр1Ех2 в соответствии с инструкцией производителя (8!га!адепе или С1оп!ес1). ДНК бактериофага λ выделяют из культур небольших чешуек инфицированного хозяйского штамма Е. сой с использованием системы очистки ДНК Χνί/агб ЬатЬба Ргерк в соответствии с инструкцией производителя (Рготеда, Согрогайоп, Мабйоп XVI).

2.3. Геноспецифическое клонирование праймеров для ПЦР.

Создают две пары ПЦР-праймеров с длиной от 18 до 30 оснований для использования в реакции амплификации предсказанного сб§ ГЫ8Р181 с использованием программного обеспечения Рптег Эе^дпег 8оП\гаге (8с1епййс & Ебиса!юпа1 8ойгаге, Р0 Вох 72045, Пигйат, 27722-2045, И8А). ПЦР-праймеры оптимизируют до показателя Тт, близкого к 55±10°С, с достижением содержания ГЦ пар в диапазоне 40-60%. Отбирают праймеры, которые обладают высокой селективностью для рассматриваемой последовательности (ГЫ8Р181), при наличии небольшого, или вообще в его отсутствие, специфического примирования. Праймеры генерируют таким образом, чтобы образовались две гнездовые пары и при этом праймеры IN8Р181-СР3/IN8Р181-СР4 локализовались с внутренней стороны относительно праймеров IN8Р181-СР1/IN8Р181-СР2.

2.4. ПЦР-амплификация Ш8Р181 на основе матриц кДНК человека.

Создают геноспецифические клонирующие праймеры ГЫ8Р181-СР1 и ГЫ8Р181-СР2 (табл. 1, фиг. 5) для амплификации фрагмента кДНК длиной 540 п.н., содержащего ГЫ8Р181 сб§. Используют пару праймеров в сочетании с панелью из библиотеки кДНК и пулами образцов кДНК в качестве матриц для ПЦР. Данную ПЦР1 проводят в среде с конечным объемом 50 мкл, содержащей буфер 1Х АтрйТад™, 200 мкМ бЖГР, 50 пмоль каждого из клонирующих праймеров, 2,5 Ед Атр1|Тас|™ (АррНеб Вю^уЧепъ) и примерно 20 нг матрицы кДНК из указанной библиотеки или 100 нг матрицы кДНК из соответствующего пула с использованием аппарата для обработки ДНК М1 Кекеагсй ЭХА Епдше, запрограммированного на работу в следующем режиме: 94°С, 2 мин; 40 циклов: 94°С, 1 мин, 55°С, 1 мин и 72°С, 1 мин; и затем 1 цикл при 72°С в течение 7 мин и цикл выдерживания при 4°С.

Затем каждый продукт ПЦР1 используют в качестве матрицы для проведения ПЦР2 с использованием амплифицирующих праймеров ГЫ8Р181-СР3 и ГЫ8Р181-СР4 (табл. 4, фиг. 5-9), созданных для целей амплификации фрагмента кДНК длиной 496 п.н. в продукте IN8Р181-СР1/IN8Р181-СР2. Данную ПЦР2 проводят в среде с конечным объемом 50 мкл, содержащей буфер 1Х АтрНТад™, 200 мкМ 6ЖГР, 50 пмоль каждого из клонирующих праймеров, 2,5 Ед АтрйТад™ (АррНеб Вю^уЧепъ) и 1 мкл продукта

- 39 011816

ПЦР1 с использованием аппарата для обработки ДНК М1 Везеагсй ΌΝΑ Епдше, запрограммированного на работу в следующем режиме: 94°С, 2 мин; 40 циклов: 94°С, 1 мин, 59°С, 1 мин и 72°С, 1 мин; и затем 1 цикл при 72°С в течение 7 мин и цикл выдерживания при 4°С.

Берут по 30 мкл каждого из продуктов амплификации, полученных в ПЦР1 и ПЦР2, для визуализации на 0,8% геле агарозы в буфере 1Χ ТАЕ (^йгодеп). Продукты, имеющие примерно ожидаемую молекулярную массу (540 п.н. - для ПЦР1, 496 п.н. - для ПЦР2), выделяют из геля и очищают с использованием системы очистки Χνί/агй Ρί’Κ Игерк ΌΝΑ Ρи^^ί^саΐ^οη 8у8(ет ^отеда^ элюируют в 50 мкл воды и подвергают непосредственному клонированию.

2.5. Субклонирование продуктов ПЦР.

Продукты ПЦР подвергают субклонированию в модифицированном клонирующем векторе топоизомеразы Ι (ρΟΚ4-ΤΟΡΟ) с использованием набора для клонирования ТА от компании ^йгодеп Согрогайоп в условиях, указанных производителем. В общих чертах, процедура обработки состоит в следующем: 4 мкл выделенного из геля и очищенного продукта ПЦР инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре с 1 мкл вектора ТОРО и 1 мкл раствора соли. Затем указанную реакционную смесь используют для трансформации Е. сой штамм ТОР 10 (Iην^ΐ^οдеη) по следующей процедуре: оттаивают на льду аликвоту 50 мкл клеток Οικ 81ю1 ΤΟΡ 10 и добавляют 2 мкл реакционной смеси ТОРО. Далее смесь инкубируют в течение 15 мин на льду, после чего проводят шоковую тепловую обработку путем инкубации при 42°С точно в течение 30 с. Образцы вновь помещают на лед и добавляют 250 мкл теплой (комнатной температуры) среды 8Οί.'. Образцы инкубируют при встряхивании (220 об./мин) в течение 1 ч при 37°С. Далее трансформирующую смесь помещают на чашки с Ь-бульоном (ЕВ), содержащие ампициллин (100 мкг/мл), и инкубируют в течение ночи при 37°С.

2.6. ПЦР колоний.

Колонии инокулируют в 50 мкл стерильной воды с использованием стерильной палочки. Берут аликвоту 10 мкл инокулята для проведения ПЦР в общем объеме реакционной смеси 20 мкл, содержащей буфер 1Χ Αтр1^Τа^™, 200 мкМ йКШ, 20 пмоль праймера Т7, 20 пмоль праймера Т3, 1 Ед Αтр1^Τа^™ (Лррйей Вю8у81етз) с использованием аппарата для обработки ДНК М1 Везеагсй ΌΝΑ Епдше. Проводят цикл обработки в следующем режиме: 94°С, 2 мин; 30 циклов: 94°С, 30 с, 48°С, 30 с и 72°С в течение 1 мин. После этого образцы хранят при 4°С (цикл выдерживания).

Продукты ПЦР наносят для анализа на 1% гель агарозы в 1Χ ТАЕ буфера. Колонии, которые дают продукты ПЦР примерно ожидаемой молекулярной массы (540 п.н. или 496 п.н.+105 п.н., за счет наличия сайта множественного клонирования (МС8)), растят в течение ночи при 37°С в 5 мл Ь-бульона (ЬВ), содержащего ампициллин (100 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об./мин.

2.7. Получение и секвенирование плазмидной ДНК.

Из 5 мл культуры получают плазмидную ДНК М1шргер с использованием роботизированной системы ВюгоЬо! 8000 (01адеп) или набора Χνί/агй Ρ1η8 8ν М1шргер8 ^готеда, номер по каталогу № 1460) в соответствии с инструкцией производителя. Плазмидную ДНК элюируют в 80 мкл стерильной воды. Измеряют концентрацию ДНК с использованием фотометра ЕррепйогГ ВО или фотометра 8ресйатах 190 (Мо1еси1аг Оетюе5). Плазмидную ДНК (200-500 нг) анализируют по процедуре секвенирования ДНК с использованием секвенирующих праймеров Т7 и Т3 (табл. 1) и системного оборудования В1друе Τе^тшаΐο^ 8у81ет ^ррйей Вю8уз1ет8, номер по каталогу № 4390246) в соответствии с инструкцией производителя. Реакции секвенирования проводят с использованием колонок Эуе-Ех (01адеп) или пластин для очистки МоШаде 8ЕО 96 (Мййроге, номер по каталогу № Ό8Κ809624), после чего анализируют на секвенаторе Вюзу81ет8 3700.

При анализе последовательности был идентифицирован клон, амплифицированный из пула, содержащего кДНК, полученную из атеросклеротической бляшки и базофилов, в ПЦР2, который содержит ожидаемую последовательность продукта ПЦР ΙΝ8Ρ181^Ρ3/ΙΝ8Ρ181^Ρ4. Последовательность фрагмента клонированной кДНК показана на фиг. 8. Клонированный продукт ПЦР содержится в плазмиде рСВ4-ΤΟΡΟ-IN8Ρ181.

Идентифицируют второй клон, амплифицированный из пула, содержащего кДНК, полученную из слюнной железы, надпочечника, глаза и универсальной эталонной матричной РНК 8йа1адепе в продукте ПЦР2, который содержит ожидаемый продукт ΙΝ8Ρ181^Ρ3/ΙΝ8Ρ181^Ρ4, но с наличием инсерции из 25 аминокислот на старте экзона 4. Указанная инсерция приводит к аминокислотной замене Ε113ν. Сравнение с последовательностью геномной ДНК выявляет, что данный клон также содержит аминокислотные замены Ν92Τ и 01148, которые могут представлять собой сбои, вызванные проведением ПЦР, хотя на этой стадии не может быть исключено явление полиморфизма. Последовательность фрагмента клонированной ДНК показана на фиг. 9. Клонированный продукт ПЦР содержится в плазмиде рСВ.4ΤΟΡΟ-ΙΝ8Ρ181-8ν1.

- 40 011816

Таблица 1

Праймер	Последовательность (5'-3')
ΊΝ3Ρ181-ΟΡ1	ССС ТСС АСА ААС ССС ССС ТСС ТС
ΙΝ3Ρ181-ΟΡ2	АСС СТС ССС САС АТС ССС САТ С
1Ы5Р181-СРЗ	ССТ ССТ ССС ССТ ТСС сст сс
ΙΝ3Ρ181-ΟΡ4	ΤΑΤ СТТ САА САС ССС ССС ΤΤΤ СТС
Т7	ТАА ТАС САС ТСА СТА ТАС С
ТЗ	АТТ ААС ССТ САС ТАА АСС

Пример 3. Генерирование Са1е\\^гау-совместимой ОРС ΙΝ8₽181, присоединенной к последовательности 6Н1З-метки с сохранением рамки считывания.

ΙΝ8Γ181 клонируют по процедуре гнездовой ПЦР и, в этой связи, инсерция кДНК в клоне рСВ4ТОРО (плазмида рСК4-ТОРО-ШЗР181) утрачивает область в 26 п.н. на 5'-конце и в 21 п.н. на 3'-конце кодирующей последовательности. Включение пропущенных нуклеотидов, 6-Н1З-метки и стоп-кодона, все достигается при встраивании соответствующих нуклеотидов в праймеры, используемые в реакции амплификации по методу ПЦР. Последовательности ПЦР праймеров, которые были использованы для клонирования, показаны в табл. 2.

Таблица 2

Праймер	Последовательность <5'-3')
ΙΝ3Ρ181 МАТ ГР	ССС АСС АТС ССС СТС САС ААА ССС ССС СТС СТС СТС СТС ССС СТТ ССС
ΙΝ5Ρ181 МАТ КР	СТС АТС СТС АТС СТС ССС ТСС ССС АСА ССС АТС ТАТ СТТ САА 6АС ССС
ΙΝ5Ρ181 АТТВ1 ГР	6 ССС АСА АСТ ТТС ТАС ААА ААА ССА ССС ТТС ССС АСС АТС ССС СТС
АТТВ1 РСК КР	ССС САС САС ТТТ СТА САА САА АСС ТСС СТТ ТСА АТС СТС АТС СТС АТС СТС
ΙΝ5Ρ181 ЗУ1 (Τ92Ν) ГР	ССС ТСТ СТА ААС ААА САА АСА ТСА ССС ТСС АТС САА С
ΙΝ5Ρ181 3νΐ (Τ92Ν) КР	СТТ ССА ТСС АСС СТС АТС Т ТТС ТТТ СТТ ТАС АСА ССС
ΙΝ3Ρ1818νΐ (3114С) ГР	ТСС САТ ССС ССС СТС САС 6 ССС ТСС ССС АСС САС САС
ΙΝ3Ρ1813νΐ (51146) КР	СТС СТС СОТ ССС ССА ССС С СТС САС ССС ССС АТС ССА
21 М13 ГР	ССА ССТ ТСТ ААА АСС АСС ССС АСТ
М13 КР	САС САА АСА ССТ АТС АС

рЕАК12 ГР	АСС СТС АСА САС ТСС ТТС АА
рЕАК12 КР	САТ ССА ССТ ССА ССТ СТС АС

Подчеркнутая последовательность = последовательность Козака.

Последовательность, выделенная жирным шрифтом = стоп-кодон.

Последовательность, выделенная курсивом = НЦ-метка.

Используют плазмиду рСВ4-ТОРО-1ЫЗР181 в качестве ПЦР-матрицы для генерирования полноразмерной ОРС, содержащей С-концевую 6НЦ-метку и стоп-кодон. Первая стадия способа Са1е\уау-клонирования включает двустадийную ПЦР-реакцию, в результате которой генерируется полноразмерная ОРС 1ЫЗР181, фланкированная у 5'-конца айВ1 -сайтом рекомбинации и последовательностью Козака, а у 3'-конца - последовательностью, кодирующей 6-гистидиновую (6Н1З) метку с сохранением рамки считывания, стоп-кодоном и айВ2-сайтом рекомбинации (Са1е^ау-совместимая кДНК). Реакционная смесь для первой ПЦР (в конечном объеме 50 мкл) содержит, соответственно, 1 мкл (25 нг) плазмиды РСВ4-ТОРО1ЫЗР181, 4,0 мкл άΝΊΡ (10 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера Р£х, 1 мкл МдЗО₄ (50 мМ), 1,0 мкл каждого геноспецифического праймера (с достижением конечной концентрации 100 мкМ) (ΙΝ8Γ181 МАТ РР и ΙΝ8Γ181 МАТ ВР) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Р1аЕшт Р£х (ΙηνίΐΐΌ^η). ПЦР-реакцию осуществляли в следующем режиме: предварительная стадия денатурации при 95°С в течение 2 мин, затем 30 циклов при 94°С в течение 30 с, 64°С в течение 30 с и 68°С в течение 2 мин; с последующим проведением цикла удлинения при 68°С в течение 5 мин и цикла выдерживания при 4°С. Амплифицированный продукт непосредственно очищали с использованием набора для очистки ДНК РегГесфгер Се1 Арреи^огО и разводили в 50 мкл стерильной воды в соответствии с инструкциями производителя. Используют алик

- 41 011816 воту 2 мкл для визуализации на 1,6% геле агарозы в 1Х ТАЕ буфера для подтверждения того, что данный продукт имеет ожидаемую молекулярную массу (543 п.н.+24 п.н.=567 п.н.)

Реакционная смесь для второй ПЦР (в конечном объеме 50 мкл) содержит 1 мкл разбавленного очищенного ПЦР1-продукта (до конечной концентрации 10 нг), 4,0 мкл ЙХГР (10 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера РГх, 1 мкл Мд8О₄ (50 мМ), 1,0 мкл каждого конвертирующего Са1е\\'ау-праймера (с достижением конечной концентрации 100 пмоль) Щ8Р181 АТТВ1 ЕР и АТТВ1 РСК ВР) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Р1айпит РГх. Вторую ПЦР-реакцию осуществляли в следующем режиме: 95°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами при 94°С, 30 с, 60°С, 30 с, и 68°С, 2 мин; с конечным циклом удлинения при 68°С в течение 5 мин и циклом выдерживания при 4°С. Продукт ПЦР очищали в геле с использованием набора для очистки ДНК РегГесфгер Се1 (ЕррепбогГ) и разводили в 50 мкл стерильной воды в соответствии с инструкциями производителя. 2 мкл аликвоту визуализировали на 1,6% агарозном геле в 1Х ТАЕ-буфере (ПюНгодеп) для подтверждения получения продукта с ожидаемой молекулярной массой (567 п.н.+64 п.н.=631 п.н.).

3.1. Субклонирование Са1е\\'ау-совместимой ОРС ГЛ8Р181-6Н18 во встраивающий Са1е\\'ау-вектор р^ОNВ221.

Вторая стадия процесса Са1е\\'ау-клонирования включает субклонирование Са1е\\'ау-модифицированного ПЦР-продукта во встраивающий Са1е\\'ау-вектор р^ОNВ221 Ц^йгодеп), которое проводили следующим образом: 5 мкл экстрагированного из геля ПЦР2-продукта инкубировали с 1,5 мкл вектора рЭОНВ221 (0,1 мкг/мкл), 2 мкл буфера ВР и 1,5 мкл смеси клоназных ферментов ВР (ЗптЛгодеп) в конечном объеме 10 мкл при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию прекращали добавлением 1 мкл протеиназы К (2 мкг/мл) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту этой реакционной смеси (2 мкл) использовали для трансформации клеток штамма ΌΗ5α Ц^йгодеп), проводимой следующим образом: 50 мкл-аликвоту клеток ΌΗ5α оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси. Смесь инкубировали в течение 30 мин на льду и затем подвергали шоковой тепловой обработке путем инкубации при 42°С точно в течение 30 с. Образцы снова переносили на лед и добавляли 250 мкл теплой среды 8ОС (комнатной температуры). Образцы инкубировали при встряхивании (250 об./мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем смесь для трансформации высевали на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим канамицин (40 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.

Отбирали пять трансформантов и высевали в виде пятна на планшеты с ЬВ-агаром, содержащим канамицин (40 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С. Ложку растущей культуры из чашки с посевом ресуспендировали в 50 мкл воды и кипятили в течение 5 мин для лизиса клеток. Клеточный лизат центрифугировали для удаления клеточных осколков и полученный супернатант использовали в качестве матрицы для ПЦР-скрининга колоний.

Смесь для проведения ПЦР (в конечном объеме 25 мкл) содержала 10 мкл центрифугированного лизата клеток, 2,0 мкл άΝΊΒ (10 мМ), 2,5 мкл Тад-полимеразного буфера, 0,5 мкл праймеров для скрининга (с достижением конечной концентрации 100 пикомоль) (21М13 ЕР и АТТВ1 РСВ ВР) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Тад.

Условия для проведения ПЦР-реакции скрининга были следующими: 95°С в течение 2 мин с последующим проведением 30 циклов при 94°С в течение 30 с; при 60°С в течение 30 с и при 72°С в течение 1 мин; и затем проводят конечную стадию удлинения при 72°С в течение 5 мин и стадию выдерживания при 4°С. ПЦР-продукты наносили на 1,6% гель агарозы для подтверждения ожидаемого размера фрагмента.

Отбирали один положительный клон и минипрепарат плазмидной ДНК выделяли из 5 мл культуры с использованием набора ΡΙ Аргер 8рш М1шргер (Ц|адеп). Плазмидную ДНК (150-200 нг) подвергали секвенированию с использованием праймеров 21М13 и М13Веν с применением системы терминации цепи содержащим краситель набором СЕР Эуе Тегтйийог Сус1е хедиепстд Ршск 8(аг1 кН (Весктап СоиЙег Р/Ν 608120) в соответствии с инструкциями производителей. Последовательности праймеров представлены в табл. 2. Реакционные смеси для секвенирования анализировали с использованием системы анализа ДНК СЕР 2000 ХЬ (Весктап СоиЙег Р/Ν 608450). После подтверждения наличия инсерции в последовательности используют рООНК221_1НЗР181-6Н15> для создания экспрессирующих клонов.

3.2. Субклонирование Са1е\\'ау-совместимой ОРС ΙΝ8Γ181 в экспрессирующие Са1е\\'ау-векторы рЕАК12б и рОЕ8Т12.2.

Затем плазмидную ДНК (2 мкл или приблизительно 150 нг) рООНК221_1НЗР181-6Н15> использовали в реакционной смеси для рекомбинации, содержащей 1,5 мкл вектора рЕАК12б или вектора рЭЕЗТ12.2 (0,1 мкг/мкл), 2 мкл ЬВ-буфера и 1,5 мкл ЬВ-клоназы (ЗптЛгодеп) в конечном объеме 10 мкл.

Реакцию прекращали добавлением 1 мкл протеиназы К (2 мкг/мл) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту этой реакционной смеси (2 мкл) использовали для трансформации клеток штамма ΌΗ5α (1№Йгодеп), проводимой следующим образом: 50 мкл аликвоту клеток ΌΗ5α оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси. Смесь инкубировали в течение 30 мин на льду и затем подвергали шоковой тепловой обработке путем инкубации при 42°С точно в течение 30 с. Образцы снова переносили на лед и добавляли 250 мкл теплой среды 8ОС (комнатной температуры). Образцы инкубировали при

- 42 011816 встряхивании (250 об./мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем смесь для трансформации высевали на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.

Отбирали пять трансформантов и высевали в виде пятна на планшеты с ЬВ-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С. Ложку растущей культуры из чашки с посевом ресуспендировали в 50 мкл воды и кипятили в течение 5 мин для лизиса клеток. Клеточный лизат центрифугировали для удаления клеточных осколков и полученный супернатант использовали в качестве матрицы для ПЦР-скрининга колоний.

Смесь для проведения ПЦР (в конечном объеме 25 мкл) содержала 10 мкл центрифугированного лизата клеток, 2,0 мкл ЙКТТ (10 мМ), 2,5 мкл Тац-полимеразного буфера, 0,5 мкл праймеров для скрининга (с достижением конечной концентрации 100 пмоль) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Тас.|. Клоны рЕΑΚ12ά скринировали с использованием праймеров рЕАК12 ΕΡ и ΙΝ8Ρ181 МАТ ΚΡ и клоны рБЕ8Т12.2 скринировали с использованием праймеров 21М13ΕΡ и ΙΝ8Ρ181 МΑΤ ΚΡ.

Условия для проведения ПЦР-реакции скрининга были следующими: 95°С в течение 2 мин с последующим проведением 30 циклов при 94°С в течение 30 с; при 60°С в течение 30 с и при 72°С в течение 1 мин; и затем проводили конечную стадию удлинения при 72°С в течение 5 мин и стадию выдерживания при 4°С. ПЦР-продукты наносили на 1,6% гель агарозы для подтверждения ожидаемого размера фрагмента.

Отбирали один положительный клон и минипрепарат плазмидной ДНК выделяли из 5 мл культуры с использованием набора О^ргер 8рш М1шргер (01адеп).

Плазмидную ДНК (150-200 нг) в векторе рЕΑΚ 12ά подвергали секвенированию ΌΝΚ с использованием секвенирующих праймеров рЕΑΚ12 ΕΡ и рЕΑΚ12 ΚΡ, как было описано выше. Плазмидную ДНК (150-200 нг) в векторе рБЕ8Т12.2 подвергают секвенированию с использованием секвенирующих праймеров 21М13ΕΡ и М13Кет ΚΡ, как было описано выше.

Результаты анализа подтвердили наличие ожидаемой последовательности рЕΑΚ12ά_IN§Ρ181-6ΗI§ и р^Е§Τ12.2_IN§Ρ181-6ΗI§.

Максипрепарат ДНК получали из 500 мл культуры клона с подтвержденной последовательностью (рЕΑΚ12ά_IN§Ρ181-6ΗI§) с использованием набора для получения ДНК 01адеп Мах1 ргер в соответствии с инструкциями производителя. Плазмидную ДНК ресуспендировали при концентрации 1 мкг/мкл в ТЕ буфере и хранили при -20°С.

Максипрепарат ДНК, не содержащий эндотоксина, получали из 500 мл культуры клона с подтвержденной последовательностью (р^Е§Τ12.2_IN§Ρ181-6ΗI§) с использованием набора ЕпйоЕгее ΡΕίδίπίά Меда (01адеп) в соответствии с инструкциями производителей. Очищенную плазмидную ДНК ресуспендировали в ТЕ-буфере, не содержащем эндотоксина, при конечной концентрации по меньшей мере 3 мкг/мкл и хранили при -20°С.

Пример 4. Генерирование СаГе^ау-совместимой ОΡС ΙΝ8Ρ181§ν1, присоединенной к последовательности 6Ш8-метки с сохранением рамки считывания.

ΙΝ8Ρ181δν1 клонируют по процедуре гнездовой ПЦР и, в этой связи, инсерция кДНК в клоне рСΚ4-ΤОΡО (плазмида рСΚ4-ΤОΡО-IN§Ρ181-§У1) утрачивает область в 26 п.н. на 5'-конце и в 21 п.н. на 3'-конце кодирующей последовательности. Кроме того, указанные две мутации, приводящие к аминокислотным заменам (И92Т и С1148), были выявлены при секвенировании, и это требует коррекции. Включение пропущенных нуклеотидов, 6-НЕ>-метки и стоп-кодона, все достигается при встраивании соотвествующих нуклеотидов в праймеры, используемые в реакции амплификации по методу ПЦР. Проводят сайт-направленный мутагенез для коррекции двух мутаций после генерирования полноразмерно встраивающего клона ΙΝ8Ρ181§ν1.

Используют плазмиду рСΚ4-ΤОΡО-IN§Ρ181-§У1 в качестве ПЦР-матрицы для генерирования полноразмерной ОРС, содержащей С-концевую 6Ш8-метку и стоп-кодон. Первая стадия способа СаГе^ауклонирования включает двустадийную ПЦР-реакцию, в результате которой генерируется полноразмерная ОРС ΙΝ8Ρ1818ν1, фланкированная у 5'-конца аГ1В1-сайтом рекомбинации и последовательностью Козака, а у 3'-конца - последовательностью, кодирующей 6-гистидиновую (6ΗΙ8) метку с сохранением рамки считывания, стоп-кодоном и аГ1В2-сайтом рекомбинации (СаГе^ау-совместимая кДНК). Реакционная смесь для первой ПЦР (в конечном объеме 50 мкл) содержит, соответственно, 1 мкл (25 нг) плазмиды рСΚ4-ΤОΡО-IN§Ρ181-§У 1, 4,0 мкл ά^Ρ (10 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера ΡΓχ, 1 мкл Мд§О₄ (50 мМ), 1,0 мкл каждого геноспецифического праймера (с достижением конечной концентрации 100 пмоль) (ΙΝ8Ρ181 МΑΤ ΕΡ и ΙΝ8Ρ181 МΑΤ ΚΡ) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Ρ1аί^ηит ΡΓχ ([пткгодеп). ПЦР-реакцию осуществляли в следующем режиме: предварительная стадия денатурации при 95°С, 2 мин, затем 30 циклов при 94°С, 30 с, 64°С, 30 с и 68°С, 2 мин; с последующим проведением цикла удлинения при 68°С в течение 5 мин и цикла выдерживания при 4°С. Амплифицированный продукт непосредственно очищали с использованием набора для очистки ДНК Ρе^ΓесГр^ер Се1 (ЕррепйогГ) и разводили в 50 мкл стерильной воды в соответствии с инструкциями производителя. Используют аликвоту 2 мкл для визуализации на 1,6% геле агарозы в 1Х ТАЕ буфера для подтверждения того, что данный продукт имеет ожидаемую молекулярную массу (618 п.н.+24 п.н.=642 п.н.).

Реакционная смесь для второй ПЦР (в конечном объеме 50 мкл) содержит 1 мкл разбавленного

- 43 011816 очищенного ПЦР1-продукта (до конечной концентрации 10 нг), 4,0 мкл άΝΤΓ (10 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера РГх, 1 мкл Мд8О₄ (50 мМ), 1,0 мкл каждого конвертирующего 0а1е^ау-праймера (с достижением конечной концентрации 100 пмоль) (N80181 АТТВ1 РР и АТТВ1 РСЯ ЯР) и 0,5 мкл ДНКполимеразы Р1а1шит РГх. Вторую ПЦР-реакцию осуществляли в следующем режиме: 95°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 2 мин; с конечным циклом удлинения при 68°С в течение 5 мин и циклом выдерживания при 4°С. Продукт ПЦР очищали в геле с использованием набора для очистки ДНК РегГес!ргер 0е1 (Еρρеηάο^Г) и разводили в 50 мкл стерильной воды в соответствии с инструкциями производителя. 2 мкл аликвоту визуализировали на 1,6% агарозном геле в 1Х ТАЕ-буфере (Iην^ί^οдеη) для подтверждения получения продукта с ожидаемой молекулярной массой (642 п.н.+64 п.н.=706 п.н.).

4.1. Субклонирование 0а!е\гау-совместимой ОРС ΙΝ 8Р1818У1-6НΙ8 во встраивающий 0а!е\гаувектор рИОХЯ221.

Вторая стадия процесса 0а!с\\'ау-клонирования включает субклонирование 0а1е^ау-модифицированного ПЦР-продукта во встраивающий 0а!с\\'ау-вектор рИОХЯ221 (^^годеи), которое проводили следующим образом: 5 мкл экстрагированного ПЦР2-продукта инкубировали с 1,5 мкл вектора ρ^ОNЯ221 (0,1 мкг/мкл), 2 мкл буфера ВР и 1,5 мкл смеси клоназных ферментов ВР (Ιηνίίιτ^η) в конечном объеме 10 мкл при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию прекращали добавлением 1 мкл протеиназы К (2 мкг/мл) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту этой реакционной смеси (2 мкл) использовали для трансформации клеток штамма ИН5а (Iην^ί^οдеη), проводимой следующим образом: 50 мкл аликвоту клеток ИН5а оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси. Смесь инкубировали в течение 30 мин на льду и затем подвергали шоковой тепловой обработке путем инкубации при 42°С точно в течение 30 с.

Образцы снова переносили на лед и добавляли 250 мкл теплой среды 8ОС (комнатной температуры). Образцы инкубировали при встряхивании (250 об./мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем смесь для трансформации высевали на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим канамицин (40 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.

Смесь для проведения ПЦР (в конечном объеме 25 мкл) содержала 10 мкл центрифугированного лизата клеток, 2,0 мкл άΝΤΤ (10 мМ), 2,5 мкл Тац-полимеразного буфера, 0,5 мкл праймеров для скрининга (с достижением конечной концентрации 100 пикомоль) (21М13 РР и АТТВ1 РСЯ ЯР) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Тас.|.

Отбирали один положительный клон и минипрепарат плазмидной ДНК выделяли из 5 мл культуры с использованием набора ΟΙ Аргер 8рш М1шргер (0|адег1). Плазмидную ДНК (150-200 нг) подвергали секвенированию с использованием праймеров 21М13 и Μ13Яеν с применением системы терминации цепи содержащим краситель набором СЕО Иуе ТегтшаЮг Сус1е кес.|иег1стд Ошск 8!аг! кй (Весктаг! ί.'οιι1ΝΓ Р/Ν 608120) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности праймеров представлены в табл. 2. Реакционные смеси для секвенирования анализировали с использованием системы анализа ДНК СЕО 2000 ХЬ (Весктаи ί.’οιι1ΝΓ Р/Ν 608450). После подтверждения ожидаемой последовательности используют ρ^ОNЯ221_IN8Р1818V1 (Ν92Έ 01148)-6Н18 в качестве матрицы для проведения сайт-направленного мутагенеза для коррекции двух мутаций.

4.2. Сайт-направленный мутагенез Ш8Р1818У1-6Н18.

Последовательность Ш8Р1818У1, клонированная по методу ПЦР, отличается от предсказанной последовательности Ш8Р1818У1 наличием замещения в двух положениях (А275С и 0340А), которые ведут к аминокислотным мутациям №2Т и 01148. Можно полагать, что эти мутации являются результатом процедуры ПЦР-клонирования, поскольку они не выявляются в геномной ДНК (Се1ега или 0еηЬаηк). Для того, чтобы создать клон ρ^ОNЯ221, содержащий правильную последовательность Ш8Р1818У1, используют клон ρ^ОNЯ221_IN8Р1818У1-(N92Τ, 01148)-6Н18 в качестве матрицы для сайт-направленного мутагенеза.

4.3. Геноспецифические клонирующие праймеры для сайт-направленного мутагенеза Ш8Р1818У1.

Пару ПЦР-праймеров, Ш8Р1818У1 (Т92Ц) РР, Ш8Р1818У1 (Т92Ц) ЯР, Ш8Р1818У1 (81140) РР и Ш8Р1818У1 (81140) ЯР (табл. 2) конструировали таким образом, чтобы оба праймера были восстановлены путем отжига на противоположных цепях последовательности ρ^ОNЯ221_IN8Р1818У1-(N92Τ, 01148)-6Н18, и каждый праймер подвергают отжигу до 15-25 оснований с каждой стороны от мутиро

- 44 011816 ванной аминокислоты. ПЦР-праймеры конструировали с использованием набора в соответствии с инструкциями, приведенными в руководстве производителя по сайт-направленному мутагенезу, РшскСЬапде* Ιί ХЬ (8йа1адепе).

4.4. Сайт-направленный мутагенез ΙΝ8Ρ181δν1.

Первую процедуру сайт-направленного мутагенеза проводили с использованием набора ОшскСЬапде® II ХЬ (81га1адепе) в соответствии с инструкциями производителя. Контрольную реакцию проводили в среде конечного объема 50 мкл, содержащей 1Х реакционный буфер, 10 нг контрольной плазмиды р\У1Ше5спр1 размером 4,5 т.п.н., 125 нг олигонуклеотидного контрольного праймера #1, 125 нг контрольного праймера #2, 1 мкл смеси 6ΝΊΡ и 2,5 Ед ДНК-полимеразы ΡΓυυ 11га НЕ. Реакцию с исследуемым образцом проводили в среде конечного объема 50 мкл, содержащей 1Х реакционный буфер, 10 нг плазмидной ДНК-матрицы (р^ΟNК221_IN8Ρ1818V1-(N92Τ, С1148)-6Н18), 125 нг ΙΝ8Ρ181δν1 (Ί92Ν) ΕΡ, 125 нг ΙΝ8Ρ181δν1 (Т92Х) ΚΡ, 1 мкл смеси 6ΝΊΡ и 2,5 Ед ДНК-полимеразы ΡΓιΟίη НЕ. Цикл термической обработки проводили на аппарате Μι КекеагсЬ ΌΝΑ Епдше, запрограмированном в следующем режиме: 94°С в течение 1 мин; 18 циклов - 95°С в течение 30 с, 60°С в течение 1 мин 30 с и 68°С в течение 3 мин 30 с с последующим проведением цикла удлинения при 68°С в течение 7 мин и цикла выдерживания при 4°С.

Обработку ферментом Эрп I использовали для расщепления метилированной или полуметилированной исходной ДНК-матрицы (плазмида р^ΟNК221_IN8Ρ1818V1-6НI8 в исследуемой реакционной смеси). К продуктам контрольной и исследуемой реакционных смесей, полученных после реакции амплификации, добавляли 1 мкл рестрикционного фермента Ирп I (10 Ед/мл, 81га1адепе). Реакционные смеси осторожно перемешивали и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем каждую из реакционных смесей использовали для трансформации суперкомпетентных клеток ХЬ1-В1ие (8£га1адепе) по следующей процедуре. 50 мкл аликвоту клеток ХЬ1-В1ие оттаивали на льду и добавляли 1 мкл Ирп Ι-обработанной ДНК. Смесь инкубировали в течение 30 мин на льду и затем подвергали шоковой тепловой обработке путем инкубации при 42°С точно в течение 45 с. Затем образцы снова переносили на лед на 2 мин и добавляли 250 мкл предварительно нагретой (42°С) среды ΝΖΥ. Образцы инкубировали при встряхивании (220 об./мин) в течение 1 ч при 37°С. Контрольную трансформирующую смесь затем наносили на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим ампициллин (100 мкг/мл), Х-да1 (80 мкг/мл) и 20 мМ ШТС. Исследуемую трансформирующую смесь с образцом (по 250 мкл на каждом из 2 планшетов) наносили на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим канамицин (40 мкг/мл). Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С.

4.5. Получение и свквенирование плазмидной ДНК.

Отбирали один трансформант и выделяли минипрепарат плазмидной ДНК из 5 мл культуры с использованием набора Р1Аргер 8рт М1шргер (Р1адеп). Плазмидную ДНК (150-200 нг) подвергали секвенированию с помощью праймеров 21М13 и М13Кеу и с использованием системы терминации цепи содержащим краситель набором СЕР Ьуе ТегттаЮг Сус1е 5ес.|иепстд Ршск 81аг1 (Весктап СоиИег Ρ/Ν, 608120) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательность праймера представлена в табл. 2. Реакционные смеси для секвенирования анализировали с использованием системы для анализа ДНК СЕР 2000 ХЬ (Весктап СоиИег Ρ/Ν, 608450). После подтверждения наличия инсерции в последовательности использовали р^ΟNК221_IN8Ρ1818V1-(С1148)-6НI8 в качестве матрицы для проведения второй коррекции (8114С). Вторую процедуру сайт-направленного мутагенеза проводили с использованием указанных выше протокола и условий. В данной процедуре сайт-направленного мутагенеза 2 использовали следующие праймеры: ΙΝ8Ρ181δν1 (8114С) ΕΡ и ΙΝ8Ρ181δν1 (8114С) ΚΡ. Анализ последовательности выявил клон, который содержит ожидаемую последовательность вставки ΙΝ8Ρ181δν1 (р^ΟNК221_IN8Ρ1818V1-6НI8).

4.6. Субклонирование Са(етеау-совместимой ОРС ΙΝ8Ρ181δν1 в экспрессирующие Са1етеау-векторы рЕАК12б и рИЕ8Т12.2.

Плазмидную ДНК (2 мкл или приблизительно 150 нг) р^ΟNК221_IN8Ρ1818V1-6НI8 использовали в реакционной смеси для рекомбинации, содержащей 1,5 мкл вектора рЕАК12б или вектора рИЕ8Т12.2 (0,1 мкг/мкл), 2 мкл ЬК-буфера и 1,5 мкл ЬК-клоназы (1пуйгодеп) в конечном объеме 10 мкл.

Реакцию прекращали добавлением 1 мкл протеиназы К (2 мкг/мл) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту этой реакционной смеси (2 мкл) использовали для трансформации клеток штамма ΌΗ5α (1пуйгодеп), проводимой следующим образом: 50 мкл аликвоту клеток ΌΗ5α оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси. Смесь инкубировали в течение 30 мин на льду и затем подвергали шоковой тепловой обработке путем инкубации при 42°С точно в течение 30 с. Образцы снова переносили на лед и добавляли 250 мкл теплой среды 8ОС (комнатной температуры). Образцы инкубировали при встряхивании (250 об./мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем смесь для трансформации высевали на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.

Отбирали пять трансформантов и высевали в виде пятна на планшеты с ЬВ-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С. Ложку растущей культуры из чашки с посевом ресуспендировали в 50 мкл воды и кипятили в течение 5 мин для лизиса клеток. Клеточный

- 45 011816 лизат центрифугировали для удаления клеточных осколков и полученный супернатант использовали в качестве матрицы для ПЦР-скрининга колоний.

Смесь для проведения ПЦР (в конечном объеме 25 мкл) содержала 10 мкл центрифугированного лизата клеток, 2,0 мкл 6ΝΊΡ (10 мМ), 2,5 мкл Тад-полимеразного буфера, 0,5 мкл праймеров для скрининга (с достижением конечной концентрации 100 пмоль) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Тад. Клоны рЕАК12б скринировали с использованием праймеров рЕАК12 ΕΡ и ΙΝ8Ρ181 МАТ ΚΡ и клоны рЭЕ8Т12.2 скринировали с использованием праймеров 21М13ΕΡ и ΙΝ8Ρ181 МАТ ΚΡ.

Отбирали один положительный клон и минипрепарат плазмидной ДНК выделяли из 5 мл культуры с использованием набора фГАргер 8рш М1шргер (ф1адеп).

Плазмидную ДНК (150-200 нг) в векторе рЕАК 12б подвергали секвенированию ΌΝΚ с использованием секвенирующих праймеров рЕАК12 ΕΡ и рЕАК12 ΚΡ, как было описано выше. Плазмидную ДНК (150-200 нг) в векторе рЭЕ8Т12.2 подвергают секвенированию с использованием секвенирующих праймеров 21М13 ΕΡ и М13К.е\' ΚΡ, как было описано выше.

Результаты анализа подтвердили наличие ожидаемой последовательности ρΕΑК12б_IN8Ρ1818V16ΗΙ8 и ρ^Ε8Т12.2_IN8Ρ1818V1-6ΗI8.

Максипрепарат ДНК получали из 500 мл культуры клона с подтвержденной последовательностью ρΕΑК12б_IN8Ρ181-6ΗI8 с использованием набора для получения ДНК ф1адеп Мах1 ргер в соответствии с инструкциями производителя. Плазмидную ДНК ресуспендировали при концентрации 1 мкг/мкл в ТЕ буфере и хранили при -20°С.

Максипрепарат ДНК, не содержащий эндотоксина, получали из 500 мл культуры клона с подтвержденной последовательностью ρ^Ε8Т12.2_IN8Ρ181-6ΗI8 с использованием набора ЕпбоЕгее ΡΕικιι^ Меда (ф1адеп) в соответствии с инструкциями производителей. Очищенную плазмидную ДНК ресуспендировали в ТЕ-буфере, не содержащем эндотоксина, при конечной концентрации по меньшей мере 3 мкг/мкл и хранили при -20°С.

Пример 5. Методы анализа, подходящие для исследования функции ΙΝ8Ρ181.

Можно полагать, что фрагменты по настоящему изобретению будут особенно полезны при лечении или диагностике расстройств/заболеваний репродуктивной системы и аутоиммунных расстройств/заболеваний. Кроме того, приведенные ниже тесты могут использоваться для анализа приемлемости таких фрагментов за счет наличия полезных биологических эффектов. Следует отметить, что, хотя некоторые из описанных тестов относятся к исследуемому соединению, представляющему собой белок/полипептид, любой специалист в данной области сможет адаптировать их для оценки других фрагментов по настоящему изобретению в качестве такого «исследуемого соединения».

А. Тесты на репродуктивный эффект.

Тест на способность к имплантации клеток 1ЕС-3.

В рамках данного теста была использована 2-камерная система, в которой были созданы условия для проникновения флуоресцентно меченных клеток 1ЕС-3 через пористую мембрану с нанесенным слоем Ма1пде1 из верхней камеры в нижнюю камеру, когда клетки ПЫкауа или ПЫкауа-кондиционированную среду помещали в нижнюю камеру. Количество мигрирующих при этом клеток подсчитывали с использованием счетчика для планшетов. Целью данного метода является идентификация белков, которые повышают проникновение клеток 1ЕС-3, для их использования для улучшения имплантации ш νί\Ό.

Тест со сферами, покрытыми остеопонтином (клетки ПЫкауа).

В рамках данного теста флуоресцирующие сферы, покрытые слоем остеопонтина, служили моделью бластоциста, и клетки ПЫкауа примировали с тем, чтобы адаптировать их к связыванию, путем обработки эстрадиолом. Целью данного метода является идентификация белков, которые повышают способность клеток ПЫкауа связываться с покрытыми остеопонтином сферами, в плане использования их в качестве средства, повышающего рецептивные свойства эндометрии в момент имплантации.

Тест с использованием клеток НиЕ6.

Целью данного теста является идентификация белков, которые повышают продукцию ΡСΕ2 (маркера децидуализации) клетками НиЕ6, в качестве способа повышения децидуализации на ранней стадии беременности.

Тест на эндометриоз.

Перитонеальный Т№а выполняет свою функцию в эндометрии за счет индукции отторгающихся эндометриальных клеток из матки к прикреплению и пролиферации на мезотелиальных клетках брюшины. В рамках данного теста клетки ΒΕN^ обрабатывали ΊΝΕα, который повышал их способность связывать покрытые фибронектином флуоресцирующие сферы, в качестве теста для оценки адгезивных свойств в процессе эндометриоза. Целью данного теста является идентификация белков, которые снижают или ингибируют способность Т№а стимулировать способность клеток связываться со сферами.

- 46 011816

Тест на циклический АМФ с использованием гранулезных клеток свиньи ГС-410, стабильно трансфицированных ЬЬНВ.

При синдроме поликистоза яичника уровень гипофизарного ЛГ относительно высокий и индуцирует выход андрогена из оболочковых клеток яичника. Авторы применяли данный тест для поиска ингибитора сигнальной функции ЛГ, который мог бы использоваться для снижения действия ЛГ на яичник при синдроме поликистоза яичника. Клеточная линия гранулезных клеток свиньи ГС-410 была подвергнута стабильной трансфекции рецептором ЛГ человека. Лечение с использованием ЛГ приводило к продукции цАМФ.

Тест на циклический АМФ с использованием гранулезных клеток свиньи ГС-410, стабильно трансфицированных 1Е8НВ.

Клеточная линия гранулезных клеток свиньи ГС-410 была подвергнута стабильной трансфекции ФСГ-Р человека. Лечение с использованием ФСГ стимулировало продукцию цАМФ, уровень которого оценивали в данном тесте. Целью исследования является идентификация белков, которые усиливают действие ФСГ в гранулезных клетках.

Тест с использованием клеток гипофиза ЬЬе1аТ2 (мышей).

ЬЬТ2 представляет собой иммортализованную гонадотрофную клеточную линию гипофиза мышей. Стимуляция активином, одним или сочетанием 0пВН+активин, приводит к секреции ФСГ. При этом можно обработать клетки с использованием 0пВН+Вюкстееп белков с тем, чтобы найти белки, действующие вместе с 0пВН в направлении стимуляции продукции ФСГ, либо они могли быть обработаны только Вюксгееп белками с тем, чтобы найти белки, которые могут стимулировать секрецию ФСГ, как один активин.

Тест на экспансию сити1ик.

Может быть разработан с использованием комплексов ооцит-сити1ик для идентификации фрагментов, которые стимулируют экспансию.

Тест на пролиферацию В^РЕ.

Доброкачественная гиперплазия простаты характеризуется ростом эпителия простаты и стромы, которая не сбалансирована апоптозом, что приводит к увеличению размера органа. В^РЕ представляет собой клеточную линию эпителиальных клеток обычной простаты человека, иммортализованную путем обработки НРУ-18, которая используется вместо эпителиальных клеток первичной простаты человека, которые не всегда доступны.

Тест на инвазию клеток фибросаркомы НТ-1080.

Флуоресцентно меченные клетки фибросаркомы человека НТ-1080 растят в верхней камере 2-камерной системы, и проникновение этих клеток в нижнюю камеру через пористую мембрану, покрытую слоем Ма1пде1, может стимулироваться, что определяется количественно. Целью данного теста является идентификация фрагмента, который будет стимулировать такое проникновение.

Тест с использованием первичных клеток гладких мышц матки.

Одним из показателей фиброидного поражения матки является отложение коллагена гладкомышечными клетками матки, которая превращается в лейомиому. Первичные гладкомышечные клетки матки человека стимулируют для продукции коллагена обработкой Т0ЕЬ, который блокирован ВеЬ1£. Целью данного теста является идентификация белков, которые будут ингибировать указанный фиброзный фенотип.

Тест на пролиферацию клеток лейомиомы человека.

Клетки лейомиомы человека используют в качестве модели фиброидной болезни матки в тесте на пролиферацию. Клетки растут очень медленно, но они могут быть стимулированы эстрадиолом и факторами роста. Целью данного теста является идентификация белков, которые будут ингибировать эстрадиолзависимый рост клеток лейомиомы.

Тест на миграцию клеток И937.

Зоны поражения эндометрия секретируют цитокины, которые рекрутируют иммунные клетки в брюшинную полость, которые могут затем вовлекаться в проявление воспалительных симптомов заболевания, обычных для эндометриоза. Было показано, что ВАКТЕ8 продуцируется стромальными клетками эндометрия и присутствуют в перитонеальной жидкости. Используемая в данном тесте И937 представляет собой моноцитарную клеточную линию, являющуюся моделью активированных макрофагов, которая может быть индуцирована обработкой нижнего уровня 2-камерной культуральной системы для миграции из верхней камеры. Если клетки были предварительно обработаны флуоресцентным красителем, то их количество в нижней камере может быть определено. Целью данного теста является идентификация белков, которые будут ингибировать миграцию клеток И937.

Тест с использованием трофобластов 1Е03 человека.

Трофобласт бластоцисты продуцирует НЬА-0, молекулу НЬА-антигенов класса Ι, которые, как считается, важны для предотвращения реакции иммунологического отторжения эмбриона организмом матери. В ходе преэклампсии уровень НЬА-0 низкий или он вообще отсутствует. Клеточная линия трофобластов 1Е0-3 человека продуцирует НЬА-0 и может использоваться для идентификации фрагментов, которые способны повышать продукцию НЬА-0.

Тест на рассеивание первичных клеток яичника крысы.

Уровень продукции эстрадиола культурами клеток из целых яичников, взятых от незрелых крыс или других грызунов, может быть определен количественно после обработки ФСГ и/или ЛГ. Целью дан

- 47 011816 ного теста является идентификация белков, которые будут повышать стимулированный гонадотропином стероидогенез, или белков, которые действуют сами по себе в направлении повышения стероидогенеза указанными культурами.

Тест с использованием мышиных ΐνΕ

В данном тесте может быть оценена функция спермы, определяемая по ее способности оплодотворять ооциты для выявления белков, которые могут стимулировать потенциал спермы в отношении оплодотворения. Такой тест может быть проведен, например, с использованием спермы и ооцитов мыши.

Тест на пролиферацию первичных стромальных клеток простаты человека.

Тест для оценки эпителиального компонента ВРН уже разработан (см. приведенный выше тест с использованием ΚνΡΕ). В данном тесте используют первичные стромальные клетки простаты человека, которые служат в качестве модели пролиферации этих клеток в ходе ВРН. Целью данного теста является идентификация белков, которые будут ингибировать пролиферацию этих клеток.

Тест на пролиферацию гладкомышечных клеток матки человека.

Белки и другие фрагменты могут быть проанализированы для идентификации фрагментов, способных ингибировать пролиферацию первичных гладкомышечных клеток матки человека. Пролиферация гладкомышечных клеток матки человека предшествует развитию опухолей при фиброидном поражении матки.

В. Аутоиммунные тесты.

	Клетки и стимулы	Способ оценки	БИОЛОГИЯ процесса	Целевые заболевания
Т-лимфоциты	Гибель Т клеток Лигкаб, индуцированная Газ-лигандом	Высвобождение ЛДГ	Регуляция гибели Т клеток	Аут ои мму и ные заболевания
МКПК человека,, стимулированные суперантигеном Т58Т	Пролиферация	Модуляция пролиферации Т клеток	Аутоиммунные заболевания
Секреция цитокинов	Модуляция секреции Т клеточных цитокинов	Аутоиммунные заболевания
Т лимфоциты и антигенпрезентирующие клетки	МЬВ. человека и Мыши	Пролиферация	Модуляция пролифера ции Т клеток	Аутоиммунные заболевания
Секреция цитокинов	Модуляция секреции Т клеточных цитокинов	Аутоиммунные заболевания
МКПК человека, стимулированные СопА или РИА	Секреция цитокинов	Модуляция секреции Т клеточных цитокинов	Аутоиммунные заболевания
Моноциты, макрофаги и гранулоциты	МКПК человека, стимулированные ЛПС	Секреция ЦИТОКИНОВ	Модуляция секреции макрофагальных и гранулоцитарных цитокинов	Аутоиммунные заболевания
Моноциты	ΚΑΝΤΕΞиндуцированный поток кальция в ГНР-1	Поток кальция под действием ΓΙίρΚ	Индукция активации моноцитов	Аутоиммунные заболевания
Нейтрофилы	Нейтрофилы человека, стимулированные 1Ь-8	Перестройка цитоскелета	Модуляция миграции нейтрофилов	Аутоиммунные заболевания
0 лимфоциты	В клетки человека, стимулированные козьим противочеловеческим 1дМ антителом и гЫЬ-4	Выживание	Модуляция выжигания В клеток	Аутоиммунные заболевания
В клетки человека, стимулированные козьим яротивочеловеческим 1дМ антителом, гЪ1Ъ-4 и растворимый гЬВАГК	Пролиферация	Модуляция костимуляции В клеток
Клетки микроглии	М-КСФактивированная клеточная линия микроглии	Пролиферация	Модуляция активации клеток микроглии	М3

- 48 011816

Тесты, используемые для оценки ответов Т-лимфоцитов.

Гибель клеток, индуцированная Рак-лигандом.

Данный тест позволяет выявить новые модуляторы гибели клеток, опосредованной рецептором. В рамках этого теста апоптоз Т клеток индуцировали путем стимуляции клеток 1игка! рекомбинантным Рак-лигандом с 6-гистидиновой меткой, объединенным с моноклональным анти-6-Н1к антителом. Гибель клеток оценивали количественно по высвобождению ЛДГ, цитоплазматического фермента, высвобождаемого в культуральной среде при гибели клеток. Было показано, что Т-клетки, которые являются патогенными в случае многих аутоиммунных заболеваний, могут контролировать гибель антигенспецифических Т клеток в терапевтическом режиме их применения.

МБР человека: пролиферация и секреция цитокинов.

Данный тест, проводимый в клетках, позволяет оценить эффект новых белков на пролиферацию лимфоцитов и секрецию цитокинов при стимуляции МКПК, взятыми от другого донора (аллореактивность).

МКПК человека, стимулированные суперантигеном, Τ88Τ.

В рамках данного клеточного теста активация Т-лимфоцитов может осуществляться через ТСК, но с другими потребностями, чем это характерно для Т-клеточного ответа на классические антигены, в частности в том, что касается костимулирующих фрагментов.

МКПК человека, стимулированные сопА или РНА.

Данные клеточные тесты позволяют оценить эффекты новых белков на секрецию цитокинов, индуцированную двумя разными стимулами, воздействующих на разные клетки, по результатам анализа массива сфер с цитокином (СВА) (1Б-2, ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α, 1Б-5, 1Б-4 и 1Б-10).

Тесты, используемые для оценки ответов моноцитов/макрофагов и гранулоцитов.

МКПК человека, стимулированные ЛПС.

Данный клеточный тест позволяет оценить эффекты новых белков на секрецию цитокинов (ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α), индуцированную ЛПС, воздействующим на моноциты/макрофаги и гранулоциты.

Тесты, используемые для оценки ответов нейтрофилов.

Инфильтрация нейтрофилов в ткани зависит от перестройки элементов цитоскелета, ассоциированной со специфическими изменениями в клеточной морфологии указанных клеток. Данный клеточный тест позволяет оценить эффект новых белков на перестройку цитоскелета нейтрофилов человека.

Тесты, используемые для оценки ответов В-лимфоцитов.

Пролиферация В-клеток.

Данный клеточный тест позволяет оценить эффект новых белков на выживание В-клеток.

Костимуляция В-клеток.

Данный клеточный тест позволяет оценить эффект новых белков на костимуляцию В-клеток.

Тесты, используемые для оценки ответов моноцитов и клеток микроглии.

Поток кальция в ТНР-1.

Поток Са⁺² в ТНР-1-клеточном тесте позволяет оценить эффекты новых белков на исследуемую способность запускать внутриклеточное высвобождение кальция (второе мессенджер-событие) из эндоплазматического ретикулума.

Пролиферация клеток микроглии.

Известно, что в процессе пролиферации клеток-предшественников микроглии множество колониестимулирующих факторов, включающих некоторые цитокины, играют ключевые роли. Среди них МКСФ является важнейшим фактором на конечной стадии созревания макрофагов/клеток микроглии, и он не может быть заменен другим фактором. Оценка этого биологического ответа может иметь отношение к способу воздействия на активность клеток микроглии и, в этой связи, дать возможность идентифицировать молекулы, обладающие М8 терапевтическим потенциалом. Любой специалист в данной области способен адаптировать клеточный тест для определения пролиферативного ответа клеточной линии микроглии на М-КСФ.

Другие тесты, которые также могут использоваться, включают тест на оценку модуляции экспрессии цитокинов. В общих чертах, этот тест заключается в том, что определяют эффекты исследуемого белка (или другого исследуемого фрагмента) на секрецию цитокинов, индуцированную конканавалином А, воздействующим на разные мононуклеарные клетки периферической крови человека (11РВМС (чМКПК)), по результатам тестирования массива сфер с цитокином (СВА) на ΙΕ-2, ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α, ΙΕ-5, ББ-4 и ББ-10. С использованием такого теста может быть определен в наибольшей мере ингибированный цитокин, а информацию о заболеваниях, которые коррелируют с таким цитокином, можно найти в литературе.

Пример 5. Эффект БЛ8Р181 на секрецию цитокина СопА-стимулированными МКПК.

5.1. Краткое описание.

В данном тесте оценивают эффект Ш8Р181 на секрецию цитокина мононуклеарными клетками периферической крови человека (11РВМС (чМКПК)), стимулированными митогеном, конкавалином А (СопА). ГЛ8Р181-6Ш8 стимулирует секрецию ГЪ-10, Ш-4 и Ш-5 из СопА-стимулированных МКПК при тестировании в разведении 1/10 (в тесте используют 46,2 мкг). Не отмечается эффекта на уровне ΙΡΝ-γ,

- 49 011816

ЮТ-а или 1Ь-2.

5.2. Материалы и реагенты.

Лейкоцитарная пленка.

ΌΜΉΜ О1ВС0 ВеГ: 21331-020.

Сыворотка человека типа АВ 8ΙΟΜΑ ВеГ:Н1513.

Ь-глутамин О1ВС0 ВеГ: 250030-020.

Пенициллин-стрептомицин С1ВС0 ВеГ: 150070-063.

Фиколл ΡНΑВΜΑСIΑ ВеГ: 17-1440-03.

96-луночный микротитрационный планшет для культивирования клеток С08ТАВ ВеГ: 3596.

Конканавалин Α 8ΙΟΜΑ ВеГ: С0412.

Водорастворимый дексаметазон 8ΙΟΜΑ ВеГ:Э2915.

Набор, содержащий СВА с Т111/Т112 человека и цитокинами, ВесЮп-Эюкиъоп ВеГ: 550749.

РВ8 О1ВС0 ВеГ: 14190-094.

мл стерильного реагента ЕАЬС0^ ВесЮп-Эюкиъоп ВеГ: 2070.

Глицерин ΜΤ^-ΟΚ ВеГ: 1-04092-2500.

96-луночный микротитрационный планшет с коническим дном NυNС ВеГ: 249570.

5.3. Метод.

5.3.1. Очистка МКПК человека от лейкоцитарной пленки.

Лейкоцитарную пленку разводят ΌΜΉΜ 1:2.

Медленно добавляют 25 мл разведенной крови на 15 мл слой фиколла в 50 мл пробирку Фалькона.

Пробирки центрифугируют (2000 об./мин, 20 мин, при комнатной температуре без перерыва).

Интерфазу клеток (кольцо клеток) собирают и клетки промывают 25 мл ΌΜΓΜ, а затем проводят стадию центрифугирования (1200 об./мин, 5 мин). Эту процедуру повторяют 3 раза.

Лейкоцитарная пленка должна давать общее число клеток приблизительно 600х10⁶.

5.3.2. Тест на активность.

В 96-луночный микротитрационный планшет добавляют 80 мкл 1,25х10⁶ клеток/мл, разведенных в ΌΜΓΜ+2,5% сыворотки человека+1% Ь-глутамина+1% пенициллина-стрептомицина.

Добавляют 10 мкл/лунку (одно условие на лунку): А 8902255/1 в РВ8+20% глицерин.

Добавляют 10 мкл/лунку СопА в концентрации 50 мкг/мл (конечная концентрация СопА составляет 5 мкг/мл).

Через 48 ч клеточные супернатанты собирают и цитокины человека измеряют с использованием набора, содержащего СВА с Т111/Т112 человека и цитокинами, ВесЮп-Эюкиъоп.

5.3.3. СВА-анализ.

Смесь сфер с иммобилизованными на них Т111/Т112 человека получают в соответствии с инструкциями поставщиков (набор СВА ВесФп-Эюкткоп ВеГ: 550749) следующим образом.

Определяют число аналитических пробирок, необходимых для проведения эксперимента.

Каждую суспензию сфер для иммобилизации интенсивно встряхивают в течение нескольких секунд, а затем смешивают.

Для каждого анализа в одну пробирку, помеченную как смешанные сферы для иммобилизации, добавляют 10 мкл аликвоту каждой сферы для иммобилизации.

Смесь сфер интенсивно встряхивают.

Получение тест-образцов.

Супернатанты разводят 1:5 аналитическим разбавителем (20 мкл супернатантов+60 мкл аналитического разбавителя).

Разведенные образцы смешивают, а затем переносят в 96-луночный микротитрационный планшет с коническим дном (Мтс).

Процедура анализа с использованием СВА, содержащих Т111/Т112 человека цитокины.

мкл разведенных супернатантов добавляют в 96-луночный микротитрационный планшет с коническим дном (Мшс).

Добавляют 50 мкл смешанных сфер для иммобилизации.

Добавляют 50 мкл реагента для ФЭ-детекции Т111/Т112 человека.

Планшет инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре и защищают от прямого воздействия света.

Центрифугируют при 1500 об./мин в течение 5 мин.

Супернатант осторожно удаляют.

В каждую лунку добавляют 200 мкл промывочного буфера и центрифугируют при 1500 об./мин в течение 5 мин.

Супернатант осторожно удаляют.

- 50 011816

В каждую лунку добавляют 130 мкл промывочного буфера для ресуспендирования осажденных сфер. Образцы анализируют на проточном цитометре.

Данные анализируют с использованием пакета прикладных программ СВА, АсйУйу Ваке и Мюгокой Ехсе1.

Результаты выражают как процент секреции цитокинов по сравнению с уровнем цитокинов, полученным путем СопА-стимуляции (100%), по отношению к уровню цитокинов, секретируемых нестимулированными клетками (0%).

5.4. Результаты.

В одном эксперименте ΙΗ8Ρ181-6ΗΙ8 стимулировал секрецию ГЪ-10 (196%) и ТБ2 цитокинов ГО-4 (257%) и ГО-5 (165%) из СопА-стимулированных МКПК, но не оказывал эффекта на секрецию ГОЛ-у, ТИЕ-а или ГО-2, измеренную в тесте с СВА (табл. 3). Таким образом, настоящее изобретение основано на том выявленном факте, что полипептиды по настоящему изобретению активируют ТБ2 цитокины, более конкретно интерлейкин-10 (ГЬ-10), интерлейкин-4 (ΙΕ-4) и интерлейкин-5 (ΙΕ-5). Кроме того, указанная положительная регуляция специфична для ТБ2 цитокинов, поскольку уровни ТЫ цитокинов (например, ГЕКу, 'ТЫЕ-а или ГО-2) остаются неизменными. Данный специфический профиль экспрессии цитокинов ведет к возможности терапевтического использования полипептидов по настоящему изобретению в заболеваниях ТЫ-типа, а их антагонисты могут использоваться при заболеваниях ТБ2-типа.

Таблица 3 Эффект ΙΜ8Ρ181-6ΗΙ8 на секрецию цитокина СопА-стимулированными МКПК человека

Тест	Протокол исследования	Планшет/ ячейка	Количеств во повторов	% стимуляции	Стандартное откло нение	Концентрация
СЕЬЬ-СВА	σθΝ-ΗΡΒΒ-ΙΓΝ-10-02	МР-9089/С05	1	96,00¾	Ν/Α	.1 разбавление
СЕЬЬ-СВА	СОМ-НРВЬ-1Ш0-Ю-02	МР-9089/С05	1	196,00%	Ν/Α	.1 разбавление
СЕЬЬ-СВА	СОЫ-НРВЬ-1Ь2-Ю-02	МР-9089/С05	1	107,00%	Ν/Α	.1 разбавление
СЕЬЬ-СВА	СОЙ-НРВЬ-1Ь4-10-02	МР-9089/С05	1	257,00%	Ν/Α	.1 разбавление
СЕЬЬ-СВА	СОЫ-НРВЬ-1Ь5-Ю-02	МР-9089/С05	1	165,00%	Ν/Α	.1 разбавление
СЕЬЬ-СВА	СОЫ-НРВЬ-ТЫЕ-Ю-02	МР-9089/С05	1	138,00%	Ν/Α	. 1 разбавление

Пример 6.

6.1. Анализ уровней экспрессии гена ΙΉ8Ρ181 методом ПЦР в масштабе реального времени (Тацтап).

Полноразмерную РНК от каждого образца подвергали обратной транскрипции с использованием системы синтеза первой цепи для КТ-ПЦР 8ирегкспр! ΙΙΙ (Iην^1^одеη, номер по каталогу № 18080-051) в конечном реакционном объеме 20 мкл. 2 мкг полноразмерной РНК объединяли с 50 нг рандомизированных гексамерных праймеров, 10 мМ каждого из йАТТ, й6ТΡ, йСТΡ и йТТΡ и с ^ΕΡС-обработанной водой в объеме 10 мкл. Смесь инкубировали при 65°С в течение 5 мин, а затем охлаждали на льду в течение 1 мин. В отдельной пробирке получали 10 мкл нижеследующей смеси для синтеза кДНК: 2 мкл 10Х КТ-буфера, 4 мкл 25 мМ МдС1₂, 2 мкл 0,1М ОТТ, 1 мкл РНКазы Кпаке0ИТ™ (40 Ед/мкл) и 1 мкл фермента КТ 8ирегкспр!™ ΙΙΙ (200 Ед/мкл). Смесь для синтеза кДНК добавляли к смеси РНК/праймер, слегка помешивали, инкубировали при 25°С в течение 10 мин, а затем при 50°С в течение 50 мин. Затем фермент КТ инактивировали путем инкубирования при 85°С в течение 5 мин. Смесь охлаждали на льду, а затем добавляли 1 мкл РНКазы Н Е. сой (2 Ед/мкл) и смесь инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Смесь охлаждали на льду, а затем разводили 1/250 стерильной водой. Затем разведения реакционной смеси обратной транскриптазы анализировали с помощью ПЦР в реальном времени на аппарате ТацМап (РЕ Вюкук!етк 7700). Праймеры для проведения ПЦР ΙΗ8Ρ181 человека и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (6ΛΡΌΗ) (контроль: гены домашнего хозяйства) конструировали с использованием программы для экспрессии праймеров Ρπιικγ Ехргекк (ΡΕ Вюкук!етк). Прямой праймер был сконструирован в экзоне 1. Обратный праймер был сконструирован в экзоне 2. Указанный праймер не отличался для вариантов анализа ΙΉ8Ρ181 и Ι^Ρ^^νΕ

Последовательности праймеров показаны в табл. 4. Специфичность и оптимальную концентрацию праймера для целей использования в анализе ТацМап определяли путем тестирования праймеров на серии разведений плазмид рΕАК12й-IN8Ρ181-6ΗI8 и рΕАК12й-IN8Ρ1818V1-6ΗI8. Потенциальную примесную геномную ДНК удаляли путем проведения ПЦР-реакций с использованием специфических ин

- 51 011816 тронных САΡ^Η-последовательностей. Отсутствие неспецифической амплификации подтверждали путем проведения анализа ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в 4% агарозном геле для гарантии продуцирования одной полосы с ожидаемой молекулярной массой.

ПЦР в реальном времени с применением соединения 8УВК, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, осуществляли в реакционной смеси в конечном объеме 50 мкл с использованием 25 мкл ПЦР-смеси Мак1ег Μίχ, содержащей 8УВК, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (РЕ ВюкукЮтк) (к которой предварительно была добавлена урацил-Ы-гликозилаза АтрЕгаке (υΝΟ, РЕ Вюкуйетк)), 300 нМ каждого из амплифицирующих праймеров и 5 мкл КТ-ПЦР продукта. Цикл обработки проводили с использованием системы детекции АΒI ΡΚΙ8Μ 7700 (ТадМад), запрограммированной на работу в следующем режиме: 1 цикл при 50°С в течение 2 мин; 1 цикл при 95°С в течение 10 мин; 40 циклов при 95°С в течение 15 с, при 60°С в течение 1 мин. Каждую реакцию проводили в двойном повторе с последующим усреднением полученных результатов.

Таким образом, праймер-специфические области образцов кДНК, подвергнутые обратной транскрипции, амплифицировали и определяли их величины С (пороговое число циклов). Все величины С для каждого образца кДНК были нормализованы по величинам, полученным для гена САΡ^Η (гена домашнего хозяйства) следующим образом. Различие уровней экспрессии гена САΡ^Η и гена ΙΝ8Ρ181 в каждом образце кДНК выражали как разность величин С1, то есть дельта (δ) О=С (САΡ^Η)-Сί (ΙΝ8Ρ181). Результаты для каждого образца выражали как кратную разность числа циклов, необходимых для детектируемой экспрессии гена ΙΝ8Ρ181, по отношению к числу циклов, необходимых для ΟΆΡΟΗ, и вычисляли по формуле кратная разность=2 ’^С|). И, наконец, был определен уровень экспрессии гена ΙΝ8Ρ181 в каждом образце кДНК по отношению к уровню экспрессии гена ΟΆΡΩΗ, где уровень экспрессии САΡ^Η был принят за 100%, путем деления 100 на кратную разность для ΙΝ8Ρ181.

6.2. Результаты.

Праймеры, специфичные для ΙΝ8Ρ181, исследовали с использованием набора примерно из 100 образцов нормальной ткани человека и пораженных заболеванием, представляющих первичные клетки и клеточные линии, а также 44 образцов биопсии из ободочной кишки и повздошной кишки от индивидуумов с воспалительным заболеванием кишечника и 39 образцов биопсии псориаза, взятых из вариантов клинического испытания ΙΕ18ΒΡ. Полученные результаты показаны в табл. 5 и 6 и проиллюстрированы графически на фиг. 12 и 13. Неожиданно оказалось, что экспрессия ΙΝ8Ρ181 отмечается на низком уровне только в образцах кожи (0,16% от ΟΛΡΩΗ) (табл. 5, фиг. 12) и в образцах биопсии кожи от пациентов с псориазом (положительный ответ в случае 19/39 образцов) (табл. 6, фиг. 13). Результаты, полученные с использованием второй пары праймеров, специфичных для экзона 4/6 (прямой праймер в экзоне 4 и обратный праймер в экзоне 6), подтвердили специфичность эффекта для кожи.

Результаты анализа экспрессии продемонстрировали ограниченную экспрессию ΙΝ8Ρ181 в образцах биопсии кожи и в образцах биопсии кожи, пораженной псориазом.

Выявленный специфический характер экспрессии подводит к выводу об участии ΙΝ8Ρ181 в заболеваниях кожи. Предпочтительно указанное заболевание кожи представляет собой заболевание ТЬ1 или ТЬ2 типа. Предпочтительно заболеванием ТЬ1 типа является псориаз.

Неожиданно выявленные свойства, характеризующие полинуклеотиды или соответствующие полипептиды по настоящему изобретению, делает их особенно подходящими для использования при получении лекарственного средства или фармацевтической композиции. В этой связи полинуклеотиды или соответствующие полипептиды по настоящему изобретению демонстрируют неожиданное преимущество ограниченной экспрессии в специфических тканях.

Таблица 4

Последовательности ПЦР-праймера для анализа последовательностей по методу Тас.|Маг1

Праймер	Последовательность (5'-3')
Η-ΙΝ3Ρ181-57Ρ4	ТССССАСААСССТСТССАА
Π-ΙΝ3Ρ181-199Η4	6А6ТССАСАСССАСССТСАС
ЬСАРОН-Е	ССАСССАТСССАААТТСС
ΠΟΑΡϋΗ-Κ	САТСССАТТТССАТТСАТСАСА
Интрон-ЕСАРПН-Г	ССТАСТСССАССССТТТСАТТ
Интрон-ЬСАРОН-К	СТСТССТСССАСТССТСАТТТ

- 52 011816

Таблица 5

Экспрессия Ш8Р181 в основных тканях человека, измеренная в рамках ОТ-ПЦР (ТадМап)

Нормальные ткани человека	С1 ΙϊΰΑΡϋΗ	Показатель СИ для ΕΙΝ3Ρ181	Показатель дельта СЬ	Кратность различий	Относитель но САР ОН (=100%)
876 головной мозг	19,44	35,87	-16,43	88307,33	0,00
577 сердце	20,16	36,81	-16, 65	102847,63	0,00
578 почка	19,41	34, 71	-15,30	40248,46	0,00
579 печень	20,93	37,96	-17,03	133696,30	0,00
580 легкое	21,65	36,46	-14,81	28811,12	0,00
881 плацента	21,71	33,42	-11,71	3345,И	0,03
882 скелетная мышца	15,59	37,22	-21,63	3251044,79	0, 00
583 тонкий кишечник	18,27	35,85	-17,59	196700, 49	0,00
884 селезенка	21,63	35,17	-13,54	11885,82	0, 01
885 вилочковая железа	19,36	33,64	-14,28	19884,13	0,01
586 матка	19,76	38, 67	-18,91	493684,90	0, 00
389 спинной мозг	19,75	35,61	-15,87	59718,96	0,00
890 шейка матки	22,17	34,98	-12,81	7179,00	0,01
391 толстая кишка	19, 67	36,65	-16,99	129964,13	0,00
892 яичник	20,84	37,72	-16,88	120767,86	0,00
893 предстательная железа	19, 80	35,88	-16,08	69164,90	0,00
894 яичко	20,05	35, 80	-15,75	55167,63	0, 00
895 кожа	23,39	32,72	-9, 33	641,93	0,16
8113 поджелудочная железа	21,12	36,18	-15,06	34140,49	0,00
3119 молочная железа	20,28	39, 91	-19,62	806755,23	0, 00
3120 желудок	21, 80	38,54	-16,74	109334,52	0,00
8122 глаз	21,16	37,70	-16,54	95534,29	0,00
3147 мочевой пузырь	19,21	33,69	-14,48	22777,41	0, 00

- 53 011816

Таблица 6

Экспрессия ГЫ8Р181 в биоптатах кожи, пораженной заболеванием, взятых из вариантов клинического испытания, по результатам анализа по процедуре ОТ-ПЦР ^адМай)

Псориаз

Показатель СБ для ЪСАРОН

Показатель СБ для ΡΙΝ3Ρ181

Показатель дельта СБ

Кратность различий

Относительно САР ОН (=100%)

#11 А2872102-2	20,90	34,36	-13,46	11306,74	0,01
#16 А2872103-1	24,39	29,31	-4,92	30,19	3,31
#28 А2872023-1	22,85	38, 42	-15, 57	48690,17	0,00
#36 А2872028-1	25,37	34,04	-8,67	406,67	0,25
#39 А2872025-1	22,41	34,00	-11,59	3089,02	0,03
#59 Е1328972-3	23,46	31,89	-8,44	346,19	0,29
#60 Е1328972-2	21,22	37,35	-16,12	71255,76	0,00
#61 Е1329004	25,11	38,12	-13,00	8203,29	0,01
#63 Е1328973-3	23,15	40,00	-16,85	118472,89	0,00
#64 Е1329003-2	21,05	36,32	-15,27	39647,25	0,00
#66 Е1328974-4	22,28	32,06	-9,78	881,12	0,11
#68 Е1328975-3	22,80	28,83	-6,03	65,14	1,54
#69 Е1328975-4	23,75	39,20	-15,45	44792,00	0,00
#70 Е1329006-1	25,60	36,62	-11,02	2075,71	0,05
#71 Е132В976-3	24,41	32,68	-8,27	308,23	0, 32
#72 Е1328976-4	23, 01	35,38	-12,37	5282,35	0,02
#73 Е1329005-1	23, 67	34,77	-11,10	2193,42	0,05
#74 Е1328977-2	24,00	32,14	-8,14	282,24	0,35
#75 Е1328977-3	21,88	32,04	-10,16	1146,47	0,09
#77 Е1348411-3	23, 19	31,49	-8,30	315,93	0,32
#78 Е1348411-2	23,19	31,63	-8,44	346,92	0,29
#79 Е1348411-1	18,93	35,83	-16,91	122965,58	0,00
#80 Е1348414-2	21,24	29,00	-7,76	216,69	0, 46
#81 Е1348414-1	21,07	40,00	-18,93	500034,81	0,00
#82 Е1348446-1	20,77	28,87	-8,10	274,63	0,36
#83 Е1348415-3	20,77	29,81	-9,04	526,35	0,19
#84 Е1348415-2	18,54	32,15	-13,60	12438,44	0,01
#85 Е1348442-1	19,84	34,46	-14,61	25074,26	0,00

#86 Е1348416-3	21,58	28,59	-7,02	129,48	0,77
#88 Е1348445-1	21,55	39, 17	-17,61	200512,76	0,00
#91 Ξ1317749-2	24,51	32,70	-8,20	293,22	0,34
#95 Е1317719-2	25,37	33, 66	-8,29	312,71	0,32
#96 Е1317719-3	23,52	40, 00	-16,48	91584,99	0,00
#97 Е1317751-2	22,80	35,40	-12,60	6201,23	0, 02
#98 Е1317723-2	25,21	35,90	-10,70	1657,76	0, 06
#99 Е1317723-3	23,86	32,91	-9, 06	532,89	0, 19
#101 Е1317718-2	20,80	30,04	-9,24	606,53	0,16
#102 Е1317718-3	22,86	36,13	-13,27	9887,33	0,01
#103 Е1317750-2	20,94	35,46	-14,52	23478,87	0, 00

- 54 011816

Пример 7. Исследования с использованием микромассивов.

Обычные микромассивы получают по технологии ΑβίΚπΙ ΤесНηο1οд^ез (Αд^1еηΐ ΤесНηο1οд^ез Шс., Ρа1ο Α^, СΑ) в рамках неконтактного процесса синтеза Ш 811и, предусматривающего отпечатывание 60мерных олигонуклеотидных зондов, основание к основанию, на основе цифровых файлов, описывающих последовательность. Это достигается с использованием процедуры распыления, которая позволяет осуществлять доставку чрезвычайно малых точных объемов (пиколитры) химических соединений в зону наносимого пятна. Используемый в реакции метод фосфорамидатной химии делает возможным осуществлять связывание с очень высокой эффективностью, которое поддерживается на каждой стадии синтеза всего полноразмерного олигонуклеотида. Точные количества воспроизводимо осаждаются при распылении. Такое точное конструирование осуществляется без остановки, позволяя поддерживать контакт с боковой поверхностью и не допускать аномалий в свойства поверхностного контакта, что позволяет достичь неизменной однородности наносимого пятна и его способности к последующей обнаруживаемости (НидНез е( а1. (2001) №11. Вю1ес11. Αιοη; 19 (4): 342-7. Профайл экспрессии с использованием микрочипов был выполнен с использованием струйного олигонуклеотидного синтезатора).

Синтез зондов.

Процедуру синтеза осуществляют в соответствии с инструкциями Αд^1еηΐ. В основном, синтез кДНК и последующую амплификацию с использованием полимеразы Т7 цианин-3(5)-СТР-меченого сРНК-зонда проводят с помощью набора Αд^1еηΐ для линейной амплификации РНК с низкой флуоресценцией на основе матрицы суммарной РНК, 5 мкг, в соответствии с протоколом анализа, прилагаемым к набору (версия 2, август 2003г., Αд^1еηΐ, Ва1о Α^, СΑ). Затем кРНК подвергают фрагментированию с использованием плюс-набора для гибридизации Ш 811ы от компании Αд^1еηΐ с последующей гибридизацией в соответствии с прилагаемым протоколом от компании (протокол процессинга 60-мерных олигонуклеотидных микромассивов, версия 4.1, апрель 2004г., Αд^1еηΐ, Ρа1ο Α^, СΑ).

Конструирование чипа с микромассивом.

Помещали 10,536 зондов на создаваемый массив.

Создавали 5557 зондов для специфической детекции секретированных последовательностей, представляющих особый интерес.

Создавали 1000 зондов в качестве негативных контролей.

Создавали 500 зондов в качестве позитивных контролей.

Оставшиеся зонды создавали для получения последовательностей доступного домена, в отношении которых известно, что они либо секретируют растворимые внеклеточные белки, либо относятся к мембраносвязанным белкам с внеклеточным доменом, контактирующими с внеклеточной средой.

Исследования, специфичные для ΙΝ8Ρ181.

ΙΝ8Ρ181 образуется из компонентов отдельных экзонов. Авторы предполагают осуществить профайлинг чипов с использованием зондов, синтезированных на основе 10 нормальных тканей, костного мозга, головного мозга, легкого, яичника, МКПК, плаценты, предстательной железы, селезенки и яичка. Данные по экспрессии будут доступны в порядке их анализа, экзон за экзоном.

Усреднение данных проводят с использованием одностадийного алгоритма Οηе-8ΐер Τикеу ВР^ефЫ Α^ήΛω (Эа1а Αηа1уз^з апй Ведгеззюп: Α 8есопй Соигзе ш 81а11з(1сз, Моз1е11ег апй Τикеу, Лйй^зοη^ез1еу, 1977, рр. 203-209; см. также алгоритм Αίϊутеΐπx ΜΑ85.0). Целью данного метода является установление жесткого критерия для определения среднего значения набора данных. Используемый в данном случае набор данных включает множество значений, относящихся к экспрессии зонда для одного экзона.

Данный обычный массив использовали, исходя из множества причин. Во-первых, он позволяет подтвердить наличие транскрипта и его последовательность. Во-вторых, может быть оценено распределение полипептида ΙΝ8Ρ181 по тканям и, таким образом, прояснена его роль в развитии заболевания. Такой массив может также использоваться в качестве диагностического инструмента для диагностики частоты заболеваемости у пациентов, имеющих симптомы заболевания, с которым коррелирует данный полипептид. Использование экзон-специфических зондов позволяет оценить, в основном, любые вариации в экспрессии сплайсинг-вариантов последовательности данного полипептида в конкретных тканях и при конкретных патологических состояних.

- 55 011816

Перечень последовательностей

Аминокислоты, которые описываются кодонами, идущими через границы экзона, добавлены к 5'-экзону

<110>	АВЕН ΤΚΑϋΙΝΟ 5,А,
<120>	Белок липокалина
<130>	Р040084ИО
<150> <151>	6В0504767.5 2005-03-08

<160>73

<17 0>	ΞβςΚίη, версия 1.02
<210> <211> <212>' <213>	1 111 ДНК Ното зардепз

<400>1 аЬддссс^дд адаааддссс дс^сскдскд скддссс^Ед дсс^дддссЕ ддсдддЕдсс60 садааддсЬс ЬддаададдЕ ассддкасад ссдддсГЕса аЬдсдсадаа д111 <210> 2 <211>37 <212> РКТ <213> Ното зар1епз

МеЬ 1

А1а

Ьеи

01и

Ьуз 5

01у

Рго

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

01 у

Ьеи 15

01 у

Ьеи

А1а

С1у

А1а 20

С1п

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и 25

С1и

Уа1

Рго

Уа1

01п 30

Рго

01 у

РЬе

Азп

А1а

С1 п

Ьуз

<210>3 <211>137 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400>3 дкддаддддс дсЬддсксас сскдсадсЕд дсадссаасс асдсадассЕ ддкскссссд 60 дссдассссс Едаддсксдс ЕсЕсоасЬсс акссддасса дддасддсдд ддасдЕддас 120 5ЕсдТ:дскдЬ ЬсХддаа137

<210>	4
<211>	46
<212>	РКТ
<213>	Ното зар1епз
<400>	4
Уа1 С1и	С1у Агд Тгр Ьеи ТЬг Ьеи	01п Ьеи А1а А1а Азп	Н15 А1а
1	5	10	15

Азр

- 56 011816

Ьеи

УаЬ

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

АЬа

Ьеи

НЬз

Зег 11е Агд

20

25

30

ТЬг

Агд

Азр

СЬу

Азр

УаЬ

Азр

РЬе

УаЬ

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

35

40

45

<210>5 <211>74 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400>5 дддадааддд дЬдЬдЬааад ааасааасаЬ сассдЬссаЬ ссаасссадЬ Ьдсааддсса дбассааддс ЬсаЬ <210> 6 <211>25 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400>6

СЬу СЬи СЬу УаЬ Суз Ьуз С1и ТЬг Азп Не ТЬг УаЬ Ηί3 Рго ТЬг СЬп

1015

Ьеи СЬп СЬу С1п Туг СЬп СЬу Зег РЬе

2025 <210>7 <2ЬЬ>74 <212> ДНК <213> Ногло зарЬепз <400>7 дддадааддд дЬдЬдЬааад ааасааасаЬ сассдЬссаЬ ссаасссадЬ Ьдсааддсса 60 дЬассааддс ЬсаЬ74 <210> 8 <211>25 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 8

61у С1и С1у УаЬ Суз Ьуз СЬи ТЬг Азп 1Ье ТЬг УаЬ НЬз Рго ТЬг СЬп
1	5	10	15
Ьеи СЬп	СЬу СЬп Туг СЬп СЬу Зег Тгр
	20	25
<210>	9
<211>	183
<212>	ДНК
<213>	Ното зарЬепз
<400>	9
ддсаЬддддд ддЕссадддс	сЬдддддасд даддададад	дсаЬсдЬдса	ЕоадсЬддсс	60
сддддЬсЬсс аасадЕсдад	ддсддсадса ЬдсасдЬаЬд	сЬЬсдЬсадс	ассдасЬаса	120
дсаассЬсаЬ ЬсЬЬЬасдЬд	сдсЬЬЬдадд аЬдаЬдадаЬ	сассаассьд	ьдддсдсьдс	180
Ьдд					183
<210>	10
<211>	61
<212>	РЕТ
<213>	Ното зарЬепз

- 57 011816

<400>

10 61у

УЭ1

С1п 5

61у Ьеи 61у

Азр 61у 10

С1у 61и Агд

Н1з

Агд 15

А1а

ΗΪ5 1

61у

Зег

А1а

61 у

Рго

С1у

Зег

Рго

ТЬг

Уа1

61и

С1у

61у

Зег

Мер

ΗΪ3

Уа1

20

25

30

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

35

40

45

С1и

Азр

61 и

11е

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

50

55

60

<210> 11 <211> 108 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400>11

Рсдадддсдд садсардсас дРаРдсРРсд Рсадсассда сРасадсаас сРсаРРсРРР 60 асдРдсдсРР РдаддаРдаР дадаРсасса ассРдРдддР дсРдсРдд108 <210> 12 <211>36 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> 12

61и 1

61у

Зег

Мер 5

Н13

Уа1

Суз

РЬе

Уа1 10

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег 15

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг 20

Уа1

Агд

РЬе

61и

Азр 25

Азр

61и

11е

ТЬг

Азп 30

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1 з

<210>13 <211>96 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400>13 сдадаадааР дсЬддаддас сссаааРддо рдддаадара сРРддадРас дРддадаааР 60

РссассРдса дааадссссд дРсРРсааса радаРд96

<210> <211> <212> <213>

14 32 РКТ Ното зар1епз

<400>14

Агд Агд Мер Ьеи 61и Азр Рго Ьуз Тгр Ьеи С1у Агд Туг Ьеи 61и Туг 15 1015

Уа1 С1и Ьуз РЬе Нин Ьеи С1п Ьуз А1а Рго Уа1 РЬе Азп Не Азр 61у

2530

<210> <211> <212> <213>

15 20 ДНК Ното зариепз

- 58 011816 <400>15 дсссакдбсс сссассскда

<210> <211> <212> <213>	16 5 РКТ Нотс зархепз
<400> Рго Суз 1	16 Рго Рго Рго 5

<210>17 <211>546 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400>17 абддсссСдд адаааддссс дсЕссЕдс+д скддсссббд дссРдддссб ддсдддЬдсс60 садааддсРс ЕддаададдЕ ассддбасад осдддсЬЬса аЬдсдсадаа ддбддадддд120 сдсбддсЬса сссйдсадск ддсадссаас оасдсадасс бддбсбсссс ддссдасссс180 сбдаддсЕсд оРсЕссасЕс сабссддасс адддасддсд дддасдбдда сбЕсдкдсЕд240

ЕЕсСддаадд дадааддддб дбдбааадаа асааасакса ссдЕссаСсс аасссадбЬд300 сааддссадЕ ассааддсСс аСЬсдадддс ддсадсабдс асдбабдсбб сдксадсасс360 дасЬасадса ассбсаССси Гбасдбдсдс ббЪдаддабд акдадабсас саассЕдЕдд420 дбдсбдскдд сдадаадааб дсбддаддас сссааабддс Ьдддаадаба сббддадбас480 дрддадаааб Ессассйдса дааадссссд дСсЬРсааса РадаЬддссс аРдЬссссса540 сссЕда546

<210> <211> <212> <213>

18 181 РКТ Ното заргепз

<400>

18 Ьеи

С1и

Ьуз 5

С1у

Рго Ьеи

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

С1у Ьеи 15

С1у

Ме£ 1

А1а

Ьеи

А1а

С1у

А1а

61п

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

Уа1

Рго

Уа1

С1п

Рго

С1у

20

25

30

РЬе

Азп

А1а

С1п

Ьуз

Уа1

С1и

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

35

40

45

А1а

Азп

Н1з

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьеи

Нлз

Зег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

11е

ТЬг

Уа1

ΗΪ3

85

90

95

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

С1п

С1у

С1п

Туг

С1п

С1у

Зег

РЬе

С1и

С1у

Зег

100

105

110

Меб

ΗΪ3

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

115

120

125

Уа1

Агд

РЬе

С1и

Азр

С1и

11е

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

130

135

140

Агд

Мек

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг

145

150

155

160

- 59 011816

7а1 С1и

Ьуз РЬе Нгз Ьеи С1п Ьуз А1а Рго Уа1

165 170

Рго Суз

Рго Рго Рго

180 <210> <211>

<212>

<213>

ДНК

Ното зарДепз

РЬе Азп Не Азр С1у

175 <400>

садааддсЬс Ьддаададд£ ассддТасад ссдддсйЬса айдсдсадаа д <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Ното зарХепз <400>

С1п Ьуз

А1а Ьеи С1и 61и Уа1 Рго Уа1 С1п Рго

С1у РЬе Азп А1а С1п

Ьуз <210>

<211>

<212>

<213>

486

ДНК

Ното зархепз <400> садааддсЬс сдсХддсЬса сТдаддсЬсд ЬёсЬддаадд сааддссад£ дасЬасадса дЬдсГдсЬдд дкддадаааЬ сссЪда

СддаададдХ сссЬдсадсЕ сЬсСссасйс дадааддддк ассааддсЬс ассЬсаПсЬ сдадаадаай Ьссасскдса ассдд£асад ддсадссаас саЬссддасс дЬдйааадаа аьссдадддс ЪГасдЬдсдс дсЬддаддас дааадссссд ссдддсЬЬса сасдсадасс адддасддсд асааасаЬса ддсадсаЬдс Г£Ьдадда£д сссаааТддс дксСЬсааса айдсдсадаа Ьддйсйсссс дддасдрдда ссдйссаСсс асдйайдсЬй айдадаСсас СдддаадаЬа ьадакддссс ддЬддадддд ддссдасссс сйЪсдЬдсЬд аасссадЬЬд сдйсадсасс саассбдЬдд сЬГддадЬас айдХссссса

120

180

240

300

360

420

480

486 <210>

<211>

<212>

<213>

161

РКТ

Ното заргепз <400>

С1п 1

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и 5

С1и Уа1

Рго Уа1

С1п 10

Рго

С1у

РЬе

Азп

А1а 15

С1п

Ьуз

Уа1

С1и

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

61п

Ьеи

А1а

Азп

ΗΪ3

А1а

20

25

30

Азр

Ьеи

УаХ

5ег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

Н13

Зег

Не

35

40

45

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

50

55

60

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

ΗΪ3

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

65

70

75

80

- 60 011816

С1п

61у

61п Туг

61п 85

61у Зег

РЬе

61и

61у 90

61у Зег

Мек

Н13

Уа1 95

Суз

РЪе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

61и

100

105

но

Азр

61 и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

МеЬ

Ьеи

115

120

125

61и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

61у

Агд

Туг

Ьеи

61и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

130

135

140

ΗΪ3

Ьеи

61п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

11е

Азр

61у

Рго

Суз

Рго

145

150

155

160

Рго <210>23 <211> 618 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400>23 аЬддсссЬдд адаааддссс дсЬссЬдсЬд сСддсссЬСд дссЬдддссЬ ддсдддЬдсс60 садааддсЬс ЬддаададдЬ ассддкасад ссдддсЬЬса аСдсдсадаа ддЬддадддд120 сдсЕддсЕса сссЕдсадсЕ ддсадссаас сасдсадасс ЕддЕсЬсссс ддссдасссс180 сЬдаддсЬсд с1с£ссаскс саЬссддасс адддасддсд дддасдЬдда СРЬсдЬдсГд240

ГЕсЬддаадд дадааддддЬ дЕдЬааадаа асааасакса ссдйссаЬсс аасссадЬЕд300 сааддссадЕ ассааддсСс атддсаГддд ддддЬссадд дсссддддда сддаддадад360 аддсаЕсдЬд саЬсадсЬдд сссддддЬсЬ ссаасад+сд адддсддсад саЬдсасдСа420

ЬдсЬЬсдкса дсассдасЬа садсаассЬс акзсЬЬЬасд СдсдскЬЬда ддаЬдаЬдад480 аСсассаасс ЬдСдддЬдсЬ дсйддсдада адааСдсЬдд аддассссаа акддсЬддда540 адаЬасНдд адЬасдЬдда даааЕЕссас сЬдсадааад ссссддЕс^Е саасайадай 600 ддсссаЬдЬс ссссассс618 <210>24 <211> 206 <212> Р.ЗТ <213> Ното зарТепз

<400>

24 Ьеи С1и

Ьуз 5

61у

Рго

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

61у

Ьеи 15

С1у

МеЬ 1

А1а

Ьеи

А1а

61у

А1а

61п

Ьуз

А1а

Ьеи

61и

Уа1

Рго

Уа1

С1п

Рго

61у

20

25

30

РЬе

Азп

А1а

С1п

Ьуз

ν&1

61и

61у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

35

40

45

А1а

Азп

ΗΪ3

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьеи

Нхз

Зег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

61у

61 у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

61у

61и

61у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

Н1з

85

90

95

Рго

ТЬг

61п

Ьеи

61п

61у

61П

Туг

61п

61у

Зег

Тгр

ΗΪ3

61у

61 у

Уа1

100

105

но

- 61 011816

С1п

С1у

Ьеи С1у 115

Азр С1у

С1у С1и 120

Агд Н1з Агд

А1а

Зег 125

А1а

С1у

Рго

С1у

Зег

Рго

ТЬг

Уа1

С1и

б1у

О1у

Зег

Мек

ΗΪ3

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

130

135

140

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

01 и

Азр

С1и

145

150

155

160

11е

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Мек

Ьеи

С1и

Азр

Рго

165

170

175

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

ΗΪ3

Ьеи

С1п

180

185

190

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

11е

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

195

200

205

<210> <211> <212> <213>

25 558 ДНК Ното зархепз

<400> 25 садааддскс сдскддскса скдаддсксд ккскддаадд сааддссадк аддсаксдкд кдскксдкса аксассаасс адакасккдд ддсссакдкс кддаададдк ссскдсадск скскссаскс дадааддддк ассааддскс саксадскдд дсассдаска кдкдддкдск адкасдкдда ссссассс ассддкасад ддсадссаас сакссддасс дкдкааадаа акддсакддд сссддддкск садсаасскс дскддсдада даааккссас ссдддсккса сасдсадасс адддасддсд асааасакса ддддкссадд ссаасадксд аккскккасд адаакдскдд скдсадааад акдсдсадаа кддксксссс дддасдкдда ссдкссаксс дсскддддда адддсддсад кдсдскккда аддассссаа ссссддкскк ддкддадддд ддссдасссс скксдкдскд аасссадккд сддаддадад сакдсасдка ддакдакдад акддскддда саасакадак

120

180

240

300

360

420

480

540

558 <210> 26 <211> 186 <212> РВТ <213> Ното зарЬепз

<400>

26 А1а

Ьеи

01и 5

61и Уа1

Рго

Уа1

С1л 10

Рго

01у

РЬе

Азп

А1а 15

С1п

О1п 1

Ьуз

Уа1

61и

О1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

01п

Ьеи

А1а

Азп

ΗΪ3

А1а

20

25

30

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

Ηί3

Зег

11е

35

40

45

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

01у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

61у

50

55

60

61и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

61и

ТЬг

Азп

11е

ТЬг

Уа1

НЬз

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

65

70

75

80

С1п

С1у

С1п

Туг

С1п

С1у

Зег

Тгр

ΗΪ3

С1у

Уа1

С1п

С1у

Ьеи

С1у

85

90

95

Азр

С1у

С1и

Агд

Н1з

Агд

А1а

Зег

А1а

С1у

Рго

01у

Зег

Рго

ТЬг

100

105

110

Уа1

С1и

01 у

61 у

Зег

Мек

Ηίε

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

115

120

125

- 62 011816

Азп

Ьеи 130

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд 135

РЬе

С1и

Азр

б!и 140

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Мек

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

145

150

155

160

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

Низ

Ьеи

С1П

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

165

170

175

РЬе

Азп

11е

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

180

185

<210>27 <211>561 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400>27 акддсссЬдд адаааддссс дсЬсскдскд скддсссЬЬд дссЬдддсск ддсдддкдсс60 садааддсЬс ЬддаададдЬ ассддСасад ссдддсНса аЬдсдсадаа ддбддадддд120 сдсбддскса сссбдсадсб ддсадссаас сасдсадасс Ьддбсбсссс ддсЕдасссс180 сбдаддсЬсд сЬсЬссасЬс сабссддасс адддасддсд дддасдЬдда сЬЬсдбдсбд240

ЬЬсЬддаадд дадааддддЪ дЬдЬааадаа асааасабса ссдбссаЬсс аасссадбкд300 сааддссадЬ ассааддсбс аЬЬсдадддс ддсадсакдс асдЬакдсЬЬ сдЬсадсасс360 дасбасадса ассксаПЬсЬ Ъбасдбдсдс ЫЛдаддаЪд аЬдадабсас саассЬдбдд420 дбдсбдсбдд сдадаадааб дсЬддаддас сссаааЬддс бдддаадаба сЬЕддадЬас460 дЬддадаааб Ьссассбдса дааадссссд дбсЬбсааса Падакддссс аОдбссссса540 ссссассаЬс ассаЬсасса ΐ561 <210> 28 <211>187 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> 28

МеГ 1

А1а

Ьеи С1и

Ьуз 5

С1у

Рго

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи 15

С1у

Ьеи

А1а

С1у

А1а

С1п

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

Уа1

Рго

Уа1

С1п

Рго

С1у

20

25

30

РЬе

Азп

А1а

С1п

Ьуз

Уа1

С1и

б1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

35

40

45

А1а

Азп

Низ

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьеи

ΗΪ5

Зег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

СЬу

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

11е

ТЬг

Уа1

Низ

85

90

95

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

31п

С1у

С1п

Туг

С1п

С1у

Зег

РЬе

С1и

31у

С1у

Зег

100

105

110

Ме£

ΗΪ3

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

115

120

125

9а1

Агд

РЬе

С Ей

Азр

С1и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

130

135

140

- 63 011816

Агд 145

Агд

МеЕ

Ьеи

С1и

Азр 150

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у 155

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг 160

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

ΗΪ3

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

Не

Азр

С1у

165

170

175

Рго

Суз

Рго

НЬз

Н13

НЬз

Низ

Н1з

180 185

<210> <211> <212> <213>

29 501 ДНК Ното зар1епз

<400> 29 садааддсЕс сдсЕддсЕса сЕдаддсЕсд ЕЕсΉддаадд сааддссадЕ дасЕасадса дЕдсЕдсЕдд дЕддадаааЕ ссссассаЕс

ЕддаададдЕ сссЕдсадсЕ сЕсЕссасЕс дадааддддк ассааддсЕс ассЕсаЕЕсЕ сдадаадааЕ ЕссассЕдса ассаЕсасса ассддЕасад ддсадссаас сакссддасс дЕдЕааадаа аЕЕсдадддс ЕЕасдЕдсдс дсЕддаддас дааадссссд Е ссдддсЕЕса сасдсадасс адддасддсд асааасаЕса ддсадсаЕдс ЕЕЕдаддаЕд сссаааЕддс дЕсЕЕсааса аЕдсдсадаа ЕддЕсЕсссс дддасдЕдда ссдЕссаЕсс асдЕаЕдсЕЕ аЕдадаЕсас ЕдддаадаЕа ЕадаЕддссс ддЕддадддд ддсЕдасссс сЕЕсдЕдсЕд аасссадЕЕд сдЕсадсасс саассЕдЕдд сЕЕддадЕас аЕдЕссссса

120

180

240

300

360

420

480

501

<210> <211> <212> <213>

30 167 РКТ Ното заргепз

<400> 30

С1п 1

Ьуз

А1.а

Ьеи

С1и 5

С1и

Уа1

Рго Уа1

С1п 10

Рго

С1у

РЬе Азп

А1а 15

С1п

Ьуз

Уа1

СЬи

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

Азп

Н13

А1а

20

25

30

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

Нхз

Зег

11е

35

40

45

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

50

55

60

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

11е

ТЬг

Уа1

Нхз

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

65

70

75

80

С1п

С1у

С1п

Туг

С1п

01у

Зег

РЬе

С1и

С1у

Зег

МеЕ

ΗΪ3

Уа1

Суз

85

90

95

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

С1и

100

105

110

Азр

С1и

11е

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

МеЕ

Ьеи

115

120

125

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

130

135

140

ΗΪ3

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

11е

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

145

150

155

160

Рго Н1з Нлз Нхз Нхз Ηΐ3 ΗΪ5

165

- 64 011816 <210>31 <211>636 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400>31 акддссскдд адаааддссс дсксскдскд скддсссккд дсскдддсск ддсдддкдсс60 садааддскс кддаададдк ассддкасад ссдддсккса акдсдсадаа ддкддадддд120 сдскддскса ссскдсадск ддсадссаас сасдсадасс кддксксссс ддссдасссс180 скдаддсйсд скскссаскс сакссддасс адддасддсд дддасдкдда скксдкдскд240 ккскддаадд дадааддддк дкдкааадаа асааасакса ссдкссаксс аасссадккд300 сааддссадк ассааддскс акддсакддд ддддкссадд дсскддддда сддаддадад360 аддсаксдкд саксадскдд сссддддкск ссаасадксд адддсддсад сакдсасдка420 кдскксдкса дсассдаска садсаасскс аккскккасд кдсдскккда ддакдакдад480 аксассаасс кдкдддкдск дскддсдада адаакдскдд аддассссаа акддскддда540 адакасккдд адкасдкдда даааккссас скдсадааад ссссддкскк саасакадак600 ддсссакдкс ссссасссса ссаксассак сассак636 <210>32 <211> 212 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> 32

Мек 1

А1а

Ьеи 61и

Ьуз 5

61у

Рго

Ьеи Ьеи

Ьеи 10

Ьеи А1а Ьеи

61 у

Ьеи 15

61у

Ьеи

А1а

С1у

А1а

б1п

Ьуз

А1а

Ьеи

61и

С1и

17а 1

Рго

Уа1

61п

Рго

61у

20

25

30

РЬе

Азп

А1а

С1п

Ьуз

7а1

61 и

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

61п

Ьеи

А1а

35

40

45

А1а

Азп

Н15

А1 а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьеи

ΗΪ5

Зег

Пе

Агд

ТЬг

Агд

Азр

61у

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

61у

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

1/а1

ΗΪ5

85

90

95

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

С1п

61у

С1п

Туг

С1п

61у

Зег

Тгр

Н1з

61у

С1у

Уа1

100

105

НО

С1п

С1у

Ьеи

61_у

Азр

С1у

С1и

Агд

Низ

Агд

А1а

Зег

А1а

61у

Рго

115

120

125

С1у

Зег

Рго

ТЬг

Уа1

С1и

С1у

Зег

Мек

ΗΪ3

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

130

135

140

ТЬГ

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

С1и

Азр

С1и

145

150

155

160

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Мек

Ьеи

61и

Азр

Рго

165

170

175

Ьуз

Тгр

Ьеи

61у

Агд

Туг

Ьеи

61 и

Туг

Уа1

61 и

Ьуз

РЬе

Низ

Ьеи

61п

180

185

190

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

Не

Азр

61у

Рго

Суз

Рго

Низ

195

200

205

- 65 011816

ΗΪ3 ΗΪ3 Η13 ΗΪ3

210 <210>33 <211>576 <212> Д4К <213> Ното заргепз <400>33 садааддсЬс ЬддаададдЕ ассддЬасад ссдддсЬЬса аЬдсдсадаа ддЬддадддд60 сдсьддсьса сссЬдсадсь ддсадссаас сасдсадасс ьддьсйсссс ддссдасссс120 скдаддсЪсд сЬсЬссасйс саЬссддасс адддасддсд дддасдбдда сЬЬсдЬдскд160

ЬЬсЬддаадд дадааддддЬ дЬдбааадаа асааасабса ссдЬссабсс аасссадбЬд240 сааддссадб ассааддсбс абддсаЬддд ддддбссадд дссЬддддда сддаддадад300 аддсаЬсдЬд саЬсадсйдд сссддддЬсЬ ссаасадЬсд адддсддсад саЬдсасдЬа360

ЬдсЬЬсдСса дсассдасЬа садсаассЬс аНсНЬасд ЕдсдсЬЕЬда ддаСдайдад420 аЬсассаасс ЬдЬдддЬдсЬ дсЬддсдада адаайдсЬдд аддассссаа аЬддсбддда430 адаИасСбдд адбасдкдда даааНссас сбдсадааад ссссддЬсЫ: саасаЬадак540 ддсссабдбс ссссасссса ссаЬсассаЬ сассаЬ576 <210>34 <211>192 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <400> 34

С1п 1

Ьуз

А1а

Ьей

61и 61и Уа1 5

Рго

Уа1

С1п 10

Рго

С1у

РЬе

Азп

А1а 15

С1п

Ьуз

Уа1

61и

61у

Агд

Тгр

Ьей

ТЬг

Ьей

61П

Ьей

А1а

Азп

Н13

А1а

20

25

30

Азр

Ьей

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьей

Агд

Ьей

А1а

Ьей

ΗΪ3

Зег

Не

35

40

45

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьей

РЬе

Тгр

Ьуз

61у

50

55

60

61и

61у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

Наз

Рго

ТЬг

61п

Ьей

65

70

75

80

С1п

С1у

С1п

Туг

С1п

С1у

Зег

Тгр

ΗΪ5

61у

С1у

Уа1

61п

61у

Ьей

С1у

85

90

95

Азр

61у

С1у

С1и

Агд

ΗΪ3

Агд

А1а

Зег

А1а

С1у

Рго

С1у

Зег

Рго

ТЬг

100

105

110

Уа1

61и

С1у

61у

Зег

Ней

ΗΪ5

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

115

120

125

Азп

Ьей

Не

Ьей

Туг

Уа1

Агд

РЬе

61и

Азр

61и

Не

ТЬг

Азп

Ьей

130

135

140

Тгр

Уа1

Ьей

А1а

Агд

МеЬ

Ьей

61и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьей

61у

145

150

155

160

Агд

Туг

Ьей

С1и

Туг

Уа1

61и

Ьуз

РЬе

ΗΪ3

Ьей

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

165

170

175

РЬе

Азп

Не

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

Н1з

ΗΪ3

Ηί3

ΗΪ3

Ηί3

180

185

190

<210>35

- 66 011816 <211>74 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400>35 дддадааддд дЕдЕдЕааад ааасаассаЕ сассдЕссаЕ ссаасссадЕ Ьдсааддсса 60 дЕассааддс ЕсаЕ74

<210>	36
<211>	25
<212>	РВТ
<213>	Ното зархепз

<4 00>	36
С1у С1и	С1у	Уа1	Суз	Ьуз	С1и	ТЬг	ТЬг	Не ТЬг Уа1 ΗΪ3	Рго ТЬг С1п
1			5					10	15
Ьеи С1п	С1у	61п	Туг	С1п	С1у	Зег	РЬе
		20					25

<210> 37 <211> 74 <212> ДНК

<213>	Ното зариепз
<4 00>	37

дддадааддд дЕдЕдрааад ааасаассаЕ сассд+ссаЕ ссаасссадЕ Едсааддсса 60 дЕассааддс Есаб74

<210> <211> <212> <213>

38 25 РВТ Ното зартепз

<4 00>	38
б1у	С1и	С1у	Уа1	Суз	Ьуз	б1и	ТЬг	ТЬг	Не ТЬг Уа1	Н1з Рго ТЬг С1п
1				5					10	15
Ьеи	С1п	С1у	С1л	Туг	С1п	С1у	Зег	Тгр
			20					25

<210> <211> <212> <213>

39 546 ДНК Ното зар1епз

<400> 39 аЕддсссЕдд садааддсЕс сдсЕддсЕса сЕдаддсЕсд ЕЕс+ддаадд сааддссадЕ дасЕасадса дЕдсЕдсЕдд дЕддадаааЕ сссЕда адаааддссс ЕддаададдЕ ссс+дсадсЕ сЕсЕссасЕс дадааддддЕ ассааддсЕс ассЕсаЕЕсЕ сдадаадааЕ ЕссассЕдса дсЕссЕдсЕд ассддЕасад ддсадссаас саЕссддасс дЕдЕааадаа аЕЕсдадддс ЕЕасдЕдсдс дсЕддаддас дааадссссд

СЕддсссЕЕд ссдддсЕЕса сасдсадасс адддасддсд асаассаЕса ддсадсаЕдс ЕЕЕдаддаЕд сссаааЕддс дЕсЕЕсааса дссЕдддссЕ аЕдсдсадаа ЕддЕсЕсссс дддасдЕдда ссдЕссаЕсс асдЕаЕдсЕЕ акдадаЕсас ЕдддаадаЕа ЕадаЕддссс ддсдддЕдсс ддЕддадддд ддссдасссс сЕЕсдЕдсЕд аасссадЕЕд сдЕсадсасс саассЕдЕдд сЕЕддадЕас аЕдЕссссса

120

180

240

300

360

420

480

540

546

<210> <211> <212> <213>

40 181 РВТ Ното зарЬепз

<400> 40

- 67 011816

МеЕ 1

А1а

Ьеи

С1и

Ьуз 5

С1у

Рго

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи 15

С1у

Ьеи

А1а

С1у

А1а

С1п

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

Уа1

Рго

Уа1

С1п

Рго

С1у

20

25

30

РЬе

Азп

А1а

61п

Ьуз

νβΐ

С1и

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

35

40

45

А1а

Азп

НЬз

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьеи

ΗΪ5

Зег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Не

ТЬг

Уа1

НЬз

85

90

95

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

С1п

С1у

С1п

Туг

С1п

С1у

Зег

РЬе

С1и

С1у

Зег

100

105

110

МеЕ

Ηίε

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

5ег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

115

120

125

Уа1

Агд

РЬе

С1и

Азр

С1и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

130

135

140

Агд

МеЕ

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг

145

150

155

160

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

Н13

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

11е

Азр

С1у

165

170

175

Рго Суз Рго Рго Рго

180 <210> 41 <211> 485 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 41 садааддсЕс сдсЕддсЕса сЕдаддсЕсд ЕЕсЕддаадд сааддссадЕ дасЕасадса дЕдсЕдсЕдд дЕддадаааЕ сссЕд

ЕддаададдЕ сссЕдсадсЕ сЕсЕссасЕс дадааддддЕ ассааддсЕс ассЕсаЕЕсЕ сдадаадааЕ ЕссассЕдса ассддЕасад ддсадссаас саЕссддасс дЕдЕааадаа аЕЕсдадддс ЕЕасдЕдсдс дсЕддаддас дааадссссд ссдддсЕЕса сасдсадасс адддасддсд асаассаЕса ддсадсаЕдс ЕЕЕдаддаЕд сссаааЕддс дЕ сЕЕсааса аЕдсдсадаа ЕддЕсЕсссс дддасдЕдда ссдЕссаЕсс асдЕаЕдсЕЕ аЕдадаЕсас ЕдддаадаЕа ЕадаЕддссс ддЕддадддд ддссдасссс сЕЕсдЕдсЕд аасссадЕЕд сдЕсадсасс саассЕдЕдд сЕЕддадЕас аЕдЕссссса

120

180

240

300

360

420

480

485

<210> <211> <212> <213>

42 161 РРТ Ното зарЬепз

<400>42

С1п Ьуз А1а Ьеи С1и С1и Уа1 Рго Уа1 С1п Рго С1у РЬе Азп А1а С1п 15 1015

Ьуз Уа1 С1и С1у Агд Тгр Ьеи ТЬг Ьеи С1п Ьеи А1а А1а Азп Нхз А1а

2530

- 68 011816

Азр

Ьеи

Уа1 35

Зег

Рго А1а

Азр

Рго 40

Ьеи Агд

Ьеи

А1а

Ьеи 45

Нхз

Зег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

50

55

60

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Не

ТЬг

Уа1

Нхз

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

65

70

75

80

С1п

С1 у

С1п

Туг

С1п

О1у

Зег

РЬе

С1и

С1у

Зег

МеЬ

ΗΪ3

Уа1

Суз

85

90

95

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

С1и

100

105

110

Азр

О1и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Мес

Ьеи

115

120

125

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

01 и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

130

135

140

Нхз

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

11е

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

145

150

155

160

Рго <210>43 <211> 618 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400>43 аСддссскдд адаааддссс дсксссдсйд сСддсссССд дссСдддссС ддсдддкдсс60 садааддсСс СддаададдС ассддСасад ссддасГЕса аЪдсдсадаа ддЪддадддд120 сдсСддсСса сссСдсадсС ддсадссаас сасдсадасс СддСсСсссс ддссдасссс180 сЬдаддсСсд сЬсЬссасСс сакссддасс адддасддсд дддасдСдда сСОсдСдсСд240

ЬСсЬддаадд дадааддддЪ дбдСааадаа асаассаСса ссдСссаксс аасссадЬСд300 сааддссадС ассааддскс аСддсабддд ддддСссадд дссСддддда сддаддадад360 аддсаСсдСд саСсадскдд сссддддЬсС ссаасадСсд адддсддсад сакдсасдЪа420

СдсЕСсдЬса дсассдасСа садсаассСс аЬСсСССасд ЬдсдсСМда ддаСдакдад480 аСсассаасс СдСдддСдсС дскддсдада адааСдсСдд аддассссаа аСддсСддда540 адаСасСЬдд адСасдСдда даааЖссас скдсадааад ссссддСсСС саасаСадаС 600 ддсссаСдСс ссссассс618 <210>44 <211> 206 <212> РКТ <213> Ното зархепз

<4 00>

44 Ьеи

С1и Ьуз 5

01у Рго

Ьеи Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

61у

Ьеи 15

61у

Мес 1

А1а

Ьеи

А1а

01 у

А1а

С1п

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

01и

Уа1

Рго

Уа1

С1п

Рго

О1у

20

25

30

РЬе

Азп

А1а

С1п

Ьуз

Уа1

С1и

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

35

40

45

А1а

Азп

Нхз

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

- 69 011816

Ьеи 65

Низ

Зег

Не Агд ТЬг 70

Агд Азр 61у

61у

Азр 75

Уа1 Азр

РЬе

Уа1

Ьеи 80

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

61и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

61и

ТЬг

Не

ТЬг

Уа1

ΗΪ3

85

90

95

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

С1п

С1у

С1п

туг

61 п

61у

Зег

Тгр

Низ

61у

Уа1

100

105

НО

С1П

С1у

Ьеи

С1у

Азр

61у

61и

Агд

Низ

Агд

А1а

Зег

А1а

61у

Рго

115

120

125

61у

Зег

Рго

ТЬг

Уа1

61и

61у

С1у

Зег

Мер

ΗΪ5

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

130

135

140

ТЬГ

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

61и

Азр

АЗр

61и

145

150

155

160

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Мер

Ьеи

61и

Азр

Рго

165

170

175

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

61и

Туг

Уа1

61и

Ьуз

РЬе

Низ

Ьеи

С1п

180

185

190

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

11е

Азр

61у

Рго

Суз

Рго

195

200

205

<2 Ю> <211> <212> <213>

45 558 ДНК Ното зариепз

<400> 45 садааддсЬс едссддсРса сЬдаддсСсд Пскддаадд сааддссадр аддсаРсдРд ЪдсРРсдРса аТсассаасс адаРасРРдд ддсссаРдРс

РддаададдР сссРдсадсР сРсбссасРс дадааддддр ассааддсРс са^ садсРдд дсассдасЬа рдрдддрдср адРасдРдда ссссассс ассддРасад ддсадссаас сарссддасс дрдрааадаа аРддсаРддд сссддддРсР садсаассРс дсРддсдада даааРРссас ссдддсррса сасдсадасс адддасддсд асаассаРса ддддРссадд ссаасадРсд аРРс£РРасд адааРдсРдд сРдсадааад а1дсдсадаа рддЬсРсссс дддасдрдда ссдРссаРсс дссРддддда адддсддсад РдсдсРРРда аддассссаа ссссддРсРР ддрддадддд ддссдасссс сРРсдРдсРд аасссадРРд сддаддадад саРдсасдРа ддаРдаРдад аРддсРддда саасаРадаР

120

190

240

300

360

420

480

540

558

<210> <211> <212> <213>

46 186 РКТ Ното зариепз

<400> 46

С1п Ьуз 1

А1а

Ьеи

С1и 5

61и

Уа1

Рго

Уа1 61п Рго 61у 10

РЬе

Азп

А1а 15

С1п

Ьуз

Уа1

61и

61_у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

61п

Ьеи

А1а

Азп

ΗΪ3

А1а

20

25

30

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

ΗΪ3

Зег

Не

35

40

45

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

50

55

60

61и

61у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Не

ТЬг

Уа1

ΗΪ5

Рго

ТЬг

61п

Ьеи

65

70

75

80

- 70 011816

СЬп

СЬу СЬп

Туг

СЬп СЬу 85

Зег

Тгр Н13 61у СЬу Уа1 СЬп СЬу Ьеи

СЬу

90

95

Азр

СЬу

СЬи

Агд

НЬз

Агд

АЬа

Зег

АЬа

СЬу

Рго

СЬу

Зег

РГО

ТЬг

100

105

110

УаЬ

СЬи

СЬу

Зег

МеЬ

НЬз

УаЬ

Суз

РЬе

УаЬ

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

115

Ь20

125

Азп

Ьеи

Ые

Ьеи

Туг

УаЬ

Агд

РЬе

СЬи

Азр

СЬи

Ые

ТЬг

Азп

Ьеи

130

135

140

Тгр

УаЬ

Ьеи

АЬа

Агд

МеЬ

Ьеи

СЬи

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

СЬу

145

150

155

160

Агд

Туг

Ьеи

СЬи

Туг

УаЬ

СЬи

Ьуз

РЬе

НЬз

Ьеи

СЬп

Ьуз

АЬа

Рго

УаЬ

165

170

175

РЬе

Азп

Ые

Азр

СЬу

Рго

Суз

Рго

180

185

<210>47 <2Ы>561 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400>47 аЬддсссЬдд адаааддссс дсЬссЬдсЬд сЬддсссЕЬд дссЬдддссЕ ддсдддЬдсс60 садааддсГс ЕддаададдГ ассддЬасад ссдддсЫса айдсдсадаа ддЕддадддд120 сдсЬддсЬса сссЬдсадсЬ ддсадссаас сасдсадасс сддбсбсссс ддсЬдасссс180 сЬдаддсЬсд ссссссасгс саЬссддасс адддасддсд дддасдсдда сЬгсдсдсгд240

ГЬсГддаадд дадааддддЬ дйдЬааадаа асаассаЬса ссдЬссайсс аасссадЬЬд300 сааддссадС ассааддсЬс аЫсдадддс ддсадсаСдс асдЬаЬдсЬЬ сдйсадсасс360 дасЬасадса ассЕсаСЬсЬ ЕЬасдЬдсдс ЬЕЬдаддаЕд аСдадаЕсас саассЬдЬдд420 дЬдсЬдсЬдд сдадаадааЬ дсЬддаддас сссаааЕддс ЬдддаадаЬа сЬЬддадЬас480 дбддадаааЕ ЬссассЬдса дааадссссд дЬсЬЬсааса ЬадаЬддссс аЬдЕссссса540 ссссассаГс ассаЕсасса ΐ561 <210>48 <2Ь1>187 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 48

МеЬ 1

АЬа

Ьеи СЬи

Ьуз 5

СЬу

Рго

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

АЬа

Ьеи

СЬу

Ьеи 15

СЬу

Ьеи

АЬа

С1у

АЬа

СЬп

Ьуз

АЬа

Ьеи

СЬи

УаЬ

Рго

УаЬ

СЬп

Рго

СЬу

20

25

30

РЬе

Азп

АЬа

СЬп

Ьуз

УаЬ

СЬи

СЬу

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

СЬп

Ьеи

АЬа

35

40

45

АЬа

Азп

Низ

А1а

Азр

Ьеи

УаЬ

Зег

Рго

АЬа

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

АЬа

50

55

60

Ьеи

Н1з

Зег

Ые

Агд

ТЬг

Агд

Азр

СЬу

Азр

УаЬ

Азр

РЬе

УаЬ

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

СЬу

СЬи

СЬу

УаЬ

Суз

Ьуз

СЬи

ТЬг

Ые

ТЬг

УаЬ

Низ

85

90

95

- 71 011816

Рго Тйг

С1п

Ьеи С1п 100

61у 61п

Туг

61п 61у 105

Зег

РЬе

61и

С1у 110

61у

Зег

МеЬ

ΗΪ3

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

115

120

125

Уа1

Агд

РЬе

61 и

Азр

61и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

130

135

140

Агд

МеЬ

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

61 у

Агд

Туг

Ьеи

61и

Туг

145

150

155

160

Уа1

С1ц

Ьуз

РЬе

Ηΐε

Ьеи

61 п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

11е

Азр

С1у

165

170

175

Рго

Суз

Рго

Ηΐε

ΗΪ3

Ηΐε

ΗΪ5

180

185

<210>49 <211>501 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400>49 садааддсЬс Ьддаададдк ассддЬасад ссдддсЬЬса аГдсдсадаа ддЪддадддд60 сдсЬддсЬса сссЬдсадсЬ ддсадссаас сасдсадасс СддЬсЬсссс ддсЬдасссс120 сБдаддсЬсд сЬсЬссасЬс саЬссддасс адддасддсд дддасдЬдда скЬсдЬдсЬд180

ЬЬсЬддаадд дадааддддк дЬдЬааадаа асаассайса ссдЬссаЬсс аасссадЬСд240 сааддссадЬ ассааддсЬс аЬЬсдадддс ддсадсаЬдс асдЬаЬдсЬЬ сдЬсадсасс300 дасЬасадса ассЬсаЬСсЬ ЬЬасдЬдсдс ЬЬЬдаддаЬд аЬдадаЬсас саасскдЬдд360 дЬдсЬдсЬдд сдадаадааЬ дсЬддаддас сссаааЬддс ЬдддаадаБа сЬЬддадЬас420 дЬддадаааЬ ЬссассЬдса дааадссссд дксЬЬсааса ЬадаЬддссс аЪдЬссссса480 ссссассаБс ассаЬсасса ί501 <210>50 <211>167 <212> РЕТ <213> Ното заргепз

<400>

50 А1а Ьеи

61и 5

61и

Уа1

Рго

Уа1

61п 10

Рго 01 у

РЬе

Азп

А1а 15

61п

61п 1

Ьуз

Уа1

61и

61у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

61п

Ьеи

А1а

Азп

Ηΐε

А1а

20

25

30

Азр

Ьеи

Уа1

5ег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

Ηΐε

Зег

11е

35

40

45

Агд

ТЬг

Агд

Азр

61у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

61 у

50

55

60

61и

61у

Уа1

Суз

Ьуз

61и

ТЬг

Не

ТЙГ

Уа1

Ηΐε

Рго

ТЬг

61п

Ьеи

65

70

75

80

61п

61у

61п

Туг

61п

61у

Зег

РЬе

61и

61у

С1у

Зег

МеЬ

ΗΪ3

Уа1

Суз

85

90

95

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

61и

100

105

110

Азр

61и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

МеЬ

Ьеи

115

120

125

- 72 011816

С1и

Азр 130

Рго

Ьуз

Тгр Ьеи

С1у 135

Агд Туг Ьеи С1и

Туг Уа1 140

С1и

Ьуз

РЬе

ΗΪ3

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

Не

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

145

150

155

160

Рго

ΗΪ5

ΗΪ3

Н13

Ηί3

ΗΪ3

165 <210>51 <211>636 <212> ДНК <213> Ното зарйепз <400>51 акддсссЕдд адаааддссс дсбссЬдсЬд скддсссЬЬд дссбдддсск ддсдддЬдсс60 садааддсЬс ГддаададдЬ ассддкасад ссдддсББса абдсдсадаа ддЬддадддд120 сдсБддсбса сссбдсадсб ддсадссаас сасдсадасс ЬддЬЫсссс ддссдасссс180 сБдаддсксд сбсБссасРс сабссддасс адддасддсд дддасдбдда сЫсдЬдсБд240

ББсБддаадд дадааддддЬ дбдЪааадаа асаассаЬса ссдЬссаЬсс аасссадЬЬд300 сааддссадб ассааддсЬс аЬддсаЬддд ддддЬссадд дссбддддда сддаддадад360 аддсаЬсдЬд сабсадсРдд сссддддРсС ссаасадЬсд адддсддсад саЬдсасдба420

ЬдсЬЬсдЬса дсассдасба садсаассбс аЬЬсЫЛасд БдсдсББбда ддардабдад480 аБсассаасс Бдкддд-ЬдсБ дсБддсдада адааБдсБдд аддассссаа аБддсТддда540 адабасЬЬдд адСасдбдда даааЫссас сЬдсадааад ссссддЬсЬЬ саасакадаЬ600 ддсссабдбс ссссасссса ссаЬсассаб сассаЪ636 <210>52 <211> 212 <212> РВТ <213> Ното зарЬепз

<4 00>

52 Ьеи С1и Ьуз С1у Рго 5

Ьеи Ьеи

Ьеи Ьеи 10

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи 15

С1у

Меи 1

А1а

Ьеи

А1а

С1у

А1а

С1п

Ьуз

А1а

Ьеи

б!и

С1и

Уа1

Рго

Уа1

С1п

Рго

01у

20

25

30

РЬе

Азп

А1а

С1п

Ьуз

Уа1

С1и

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

35

40

45

А1а

Азп

Н1з

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьеи

Нхз

Зег

11е

Агд

ТЬг

Агд

Азр

б1у

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Не

ТЬг

Уа1

Ηίε

85

90

95

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

С1п

С1у

С1п

Туг

С1п

01 у

Зег

Тгр

ΗΪ5

51у

С1у

Уа1

100

105

НО

С1п

С1у

Ьеи

С1у

Азр

С1у

С1и

Агд

Н1з

Агд

А1а

Зег

А1а

С1у

Рго

115

120

125

С1у

Зег

Рго

ТЬг

Уа1

С1и

С1у

б!у

Зег

МеЬ

ΗΪ3

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

130

135

140

ТЫ

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

О1и

Азр

61и

145

150

155

160

- 73 011816

11е

ТЬг Азп

Ьеи

Тгр 165

Уа1

Ьеи

А1а

Агд Агд 170

МеЬ

Ьеи

С1и

Азр 175

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

Н1з

Ьеи

С1п

180

185

190

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

11е

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

Н1з

Н13

195

200

205

Н13 Нхз Нхз Нхз

210 <210> 53 <211> 576 <212> ДНК <213> Нолю зархепз <400> 53 садааддсЬ о сдсйддсХса сьдаддсйсд ТйсЬддаадд сааддссадЬ аддсаксдЬд ЬдсЬЬсдЬса аЬсассаасс адайасПдд ддсссакдСс

Ьддаададд'Ь ссс-Ьдсадсй сйсйссасСс дадааддддЬ ассааддсЕс сайсадсЬдд дсассдаска йдйддд^дсС адйасдЬдда ссссасссса ассддйасад ддсадссаас саЬссддасс дбдСааадаа абддсайддд сссддддьсъ садсаассйс дсйддсдада даааЬЬссас ссаксассаЬ ссдддсНса сасдсадасс адддасддсд асаассаЬса ддддйссадд ссаасадЬсд аИсНСасд адаакдс£дд стдсадааад сассаь аЬдсдсадаа ЬддЬсЬсссс дддасдкдда ссдТссаЪсс дссЬддддда адддсддсад ЬдсдсНЬда аддассссаа ссссддгсгт ддГддадддд ддссдасссс сПсдйдсЬд аасссадЬЬд сддаддадад са^дсасдйа ддайдайдад айддсЬддда саасагадаг

120

180

240

300

360

420

480

540

576 <210> 54 <211> 192 <212> РКТ <213> Ното зархепз

<400>

54 А1а

Ьеи С1и С1и 5

Уа1

Рго Уа1

С1п 10

Рго

С1у

РЬе

Азп

А1а 15

С1п

С1п 1

Ьуз

Уа1

С1и

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

Азп

Н13

А1а

20

25

30

Азр

Ьеи

Уа1

8ег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

Нхз

Зег

11е

35

40

45

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

С1у Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

50

55

60

С1и

С1у

Уэ1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Не

ТЬг

Уа1

Нхз

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

65

70

75

80

С1п

61у

С1П

Туг

С1п

С1у

Зег

Тгр

Нхз

С1у

Уа1

61п

С1у

Ьеи

С1у

85

90

95

Азр

С1у

С1и

Агд

Н13

Агд

А1а

Зег

А1а

С1у

Рго

С1у

Зег

Рго

ТЬг

100

105

110

Уа1

С1и

С1у

Зег

Мек

Нхз

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

115

120

125

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

С1и

Азр

С1и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

130

135

140

Тгр

Уа1

Ьэи

Ьеи

А1а

Агд

Мек

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

145

150

155

160

- 74 011816

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг 165

Уа1

С1и Ьуз

РЬе

Нпз 170

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго 175

Уа1

РЬе

Азп

Не

Азр

61У

Рго

Суз

Рго

ΗΪ3

НЬз

Н13

ΗΪ3

ΗΪ5

180

185

190

<210> <211> <212> <213>

55 183 ДНК Ното зарпепз

<400> 55 ддсакддддд ддкссададс сддддксксс аасадксдад дсаассксак кскккасдкд Едд скдддддасд даддададад ддсддсадса кдсасдкакд сдскккдадд акдакдадак дсаксдкдса ксадскддсс скксдксадс ассдаскаса сассаасскд кдддкдскдс

120

180

163

<210> <211> <212> <213>

56 61 РКТ Ното зархепз

<400>

56 С1у

Уа1

61п 5

Зег

Ьеи

61у

Азр С1у С1у С1и Агд 10

ΗΪ3

Агд 15

А1а

ΗΪ3 1

С1у

Зег

А1а

С1у

Рго

С1у

Зег

Рго

ТЬг

Уа1

С1и

С1у

Зег

Мек

ΗΪ3

Уа1

20

25

30

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

35

40

45

С1и

Азр

С1и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

50

55

60

<210> <211> <212> <213>

57 618 ДНК Ното заркепз

<400> 57 акддссскдд садааддскс сдскддскса скдаддсксд ккскддаадд сааддссадк аддсаксдкд кдскксдкса аксассаасс адакасккдд ддсссакдкс адаааддссс кддаададдк ссскдсадск скскссаскс дадааддддк ассааддскс саксадскдд дсассдаска кдкдддкдск адкасдкдда ссссассс дсксскдскд ассддкасад ддсадссаас сакссддасс дкдкааадаа акддсакддд сссддддкск садсаасскс дскддсдада даааккссас скддсссккд ссдддсккса сасдсадасс адддасддсд асааасакса ддддкссада ссаасадксд аккскккасд адаакдскдд скдсадааад дсскдддсск акдсдсадаа кддксксссс дддасдкдда ссдкссаксс дсскддддда адддсддсад кдсдскккда аддассссаа ссссддкскк ддсдддкдсс ддкддадддд ддссдасссс скксдкдскд аасссадккд сддаддадад сакдсасдка ддакдакдад акддскддда саасакадак

120

180

240

300

360

420

480

540

600

618

<210> <211> <212> <213>	58 206 РКТ Ното зарЬепз
<400> Мек А1а 1	58 Ьеи 61и Ьуз С1у Рго Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а Ьеи С1у Ьеи С1у 5 10 15

- 75 011816

Ьеи А1а

С1у

А1а 61п 20

Ьуз А1а

Ьеи 61и 25

С1и

Уа1

Рго Уа1

С1п 30

Рго

61 у

РЬе

Азп

А1а

61п

Ьуз

Уа1

61и

С1у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

61п

Ьеи

А1а

35

40

45

А1а

Азп

Н1з

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьеи

Низ

Зег

11е

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

61у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

61и

61у

Уа1

Суз

Ьуя

61и

ТЬг

Азп

Не

ТЫ

Уа1

Низ

85

90

95

Рго

ТЬг

61п

Ьеи

С1п

С1У

61п

Туг

61п

61 у

Зег

Тгр

Низ

61у

С1у

Уа1

100

105

110

61п

Зег

Ьеи

61у

Азр

61у

С1у

С1и

Агд

Низ

Агд

А1а

Зег

А1а

61у

Рго

115

120

125

С1у

Зег

Рго

ТЫ

Уа1

С1и

С1у

61у

Зег

Мек

Низ

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

130

135

140

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

С1и

Азр

61и

145

150

155

160

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Мек

Ьеи

С1и

Азр

Рго

165

170

175

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

61и

Туг

Уа1

61и

Ьуз

РЬе

Низ

Ьеи

С1п

180

185

190

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

Не

Азр

61у

Рго

Суз

Рго

195

200

205

<210> <211> <212> <213>

59 558 ДНК Ното зариепз

<400> 59 садааддскс сдскддскса скдаддсксд ккскддаадд сааддссадк аддсаксдкд кдскксдкса аксассаасс адакасккдд ддсссакдкс кддаададдк ссскдсадск скскссаскс дадааддддк ассааддскс саксадскдд дсассдаска кдкдддкдск адкасдкдда ссссассс ассддкасад ддсадссаас сакссддасс дкдкааадаа акддсакддд сссддддкск садсаасскс дскддсдада даааккссас ссдддсккса сасдсадасс адддасддсд асааасакса ддддкссада ссаасадксд аккскккасд адаакдскдд скдсадааад акдсдсадаа кддксксссс дддасдкдда ссдкссаксс дсскддддда адддсддсад кдсдскккда аддассссаа ссссддкскк ддкддадддд ддссдасссс скксдкдскд аасссадккд сддаддадад сакдсасдка ддакдакдад акддскддда саасакадак

120

180

240

300

360

420

490

540

558

<210> <211> <212> <213>

60 186 РКТ Ното зархепз

<400>60

61п Ьуз А1.а Ьеи 61и С1и Уа1 Рго \7а1 С1п Рго С1у РЬе Азп А1а 61п

1015

Ьуз Уа1 С1и С1у Агд Тгр Ьеи ТЬг Ьеи С1п Ьеи А1а А1а Азп Н1з А1а

2530

- 76 011816

Азр

Ьеи

Уа1 35

Зег

Рго А1а

Азр

Рго Ьеи 40

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи 45

Нхз

Зег

11е

Агд

ТЬг

Агд

Азр

61у

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

61у

50

55

60

С1и

61у

Уа1

Суз

Ьуз

61и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

Нхз

Рго

ТЬг

61п

Ьеи

65

70

75

80

С1п

С1у

С1п

Туг

61п

61у

Зег

Тгр

ΗΪ3

С1у

61у

Уа1

61п

Зег

Ьеи

61у

85

90

95

Азр

61у

61 у

61и

Агд

ΗΪ3

Агд

А1а

Зег

А1а

61у

Рго

61у

Зег

Рго

ТЬг

100

105

110

Уа1

61и

61 у

61у

Зег

МеЬ

Нхз

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

115

120

125

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

61и

Азр

С1и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

130

135

140

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

МеС

Ьеи

61и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

61у

145

150

155

160

Агд

Туг

Ьеи

61и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

Н1з

Ьеи

61п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

165

170

175

РЬе

Азп

Не

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

180 185

<210> <211> <212> <213>

61 636 ДНК Ното зархепз

<400> 61 асддссскдд садааддсСс сдсСддсСса сСдаддсСсд ЬЬсЬддаадд сааддссадС аддсаЬсдСд ЬдсСксдкса аСсассаасс адакасССдд ддсссаСдСс адаааддссс СддаададдС сссСдсадсС сСсЕссасСс дадааддддС ассааддсСс саСсадсСдд дсассдаска СдСдддГдсЬ адСасдСдда ссссасссса дсСсскдсСд ассддСасад ддсадссаас сакссддасс дЪдЬааадаа аЬддсакддд сссддддЬсС садсаассСс дскддсдада даааССссас ссаСсассак сСддсссЕСд ссдддсССса сасдсадасс адддасддсд асааасаСса ддддкссада ссаасадЕсд акксЬСкасд адааЕдсСдд сЬдсадааад сассаС дсскдддссЬ акдсдсадаа ЬддЬсСсссс дддасдкдда ссдСссаСсс дссСддддда адддсддсад ЬдсдсЬЬСда аддассссаа ссссддСсЖ ддсдддкдсс ддкддадддд ддссдасссс сСЬсдСдсЬд аасссадССд сддаддадад сакдсасдСа ддакдаЬдад аСддсЕддда саасаСадаС

120

180

240

300

360

420

480

540

600

636 <210> 62 <211> 212 <212> РКТ <213> Ното заргепз

<400>

62 Ьеи

61и

Ьуз 5

61у

Рго

Ьеи

Ьеи Ьеи 10

А1а

Ьеи

61у

Ьеи 15

61у

МеС 1

А1а

Ьеи

А1а

С1у

А1а

61п

Ьуз

А1а

Ьеи

61и

Уа1

Рго

Уа1

С1п

Рго

61у

2С

25

30

РЬе

Азп

А1а

61п

Ьуз

Уа1

С1и

61у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

61п

Ьеи

А1а

35

40

45

- 77 011816

А1а Азп ΗΪ3

А1а

Азр

Ьеи Уа1 Зег Рго А1а Азр Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьеи

Н13

Зег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

61 у

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

РЬе

Тгр

Ьуз

61 у

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

ΗΪ3

85

90

95

Рго

ТЬг

61п

Ьеи

61п

61у

61п

Туг

61п

61у

Зег

Тгр

ΗΪ3

61у

С1у

Уа1

100

105

но

61п

8ег

Ьеи

61у

Азр

С1у

61у

61и

Агд

ΗΪ3

Агд

А1а

Зег

А1а

61у

Рго

115

120

125

61 у

8ег

Рго

ТЬг

Уа1

61и

61у

Зег

Мер

ΗΪ3

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

130

135

140

ТЬг

Азр

Туг

5ег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

61и

Азр

61и

145

150

155

160

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

МеЁ

Ьеи

61и

Азр

Рго

165

170

175

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

61и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

ΗΪ3

Ьеи

61п

180

185

190

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

Не

Азр

61у

Рго

Суз

Рго

Н13

195

200

205

ΗΪ3 Η13 ΗΪ5 Η13

210 <210> <211>

<212>

<213>

576

ДНК

Ното зар1епз <400> садааддсйс сдсЬддсСса сЁдаддсЬсд ЁРсРддаадд сааддссадС аддсаСсдЕд ЕдсГЁсдЁса аЬсассаасс адаЁасЁЛдд ддсссаЬдЬс

ЬддаададдС сссЬдсадсЁ сЕсЬссасЬс дадааддддр ассааддсЬс саЁсадсСдд дсассдасЬа ЁдЬдддЬдсЁ адСасдГдда ссссасссса ассддкасад ддсадссаас саЬссддасс дйдЬааадаа аЕддсарддд сссддддЬсЬ садсаасоЬс дсЁддсдада даааЬСссас ссаЕсассак ссдддсЁЁса сасдсадасс адддасддсд асааасакса ддддГосада ссаасадРсд аЕЁсЁРЕасд адааЬдсЬдд сЁдсадааад сассаЬ аЬдсдсадаа ЁддЬсСсссс дддасдЁдда ссдСссаЕсс дссгддддда адддсддсад ЕдсдсЬСЕда аддассссаа асссддЬсЬЬ ддЬддадддд ддссдасссс сЁЕсдЬдсЁд аасссадЬЁд сддаддадад саЬдсасдЁа ддаЁдаЕдад аЬддсЬддда саасакадак

120

180

240

300

360

420

480

540

576 <210> 64 <211> 192 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 64

61п 1

Ьуз А1а

Ьеи

61и 5

61и

Уа1

Рго

Уа1

61п ю

Рго

61у

РЬе

Азп

А1а 15

61п

Ьуз

Уа1

С1и

61у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

Азп

Н1з

А1а

20

25

30

Азр

Ьеи

Уа1

8ег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

Н1з

Зег

Не

40 45

- 78 011816

Агд ТЬг Агд Азр 51у С1у Азр Уа1 Азр

РЬе Уа1 Ьеи 60

РЬе

Тгр

Ьуз

61у

50

55

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

НЬз

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

65

70

75

80

С1п

С1у

С1п

Туг

С1п

С1у

Зег

Тгр

НЬз

С1у

Уа1

С1п

Зег

Ьеи

С1у

85

90

95

Азр

С1у

С1и

Агд

ΗΪ3

Агд

А1а

Зег

А1а

С1у

Рго

С1у

Зег

Рго

ТЬг

100

105

110

Уа1

С1и

С1у

Зег

МеЕ

Низ

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

115

120

125

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

РЬе

С1и

Азр

С1и

11е

ТЬг

Азп

Ьеи

130

135

140

Тгр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

МеЕ

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

145

150

155

160

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

НЬз

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

165

170

175

РЬе

Азп

Не

Азр

С1у

Рго

Суз

Рго

Н13

НЬз

Низ

НЬз

180

185

190

<210>	65
<211>	137
Пу 1 А.	ЛГИ/
<213>	Ното зарЬепз
<4 00>	65

дЕддаддддс дсЕдассссс ЕЕсдЕдсЕдЕ дсЕддсЕсас ссЕдсадсЕд дсадссаасс ЕдаддсЕсдс ЕсЕссасЕсс аЕссддасса ЕсЕддаа асдсадассЕ ддЕсЕссссд дддасддсдд ддасдЕддас

120

137 <210> 66 <211> 149 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 66

РЬе 1

Азп А1а

С1п

Ьуз 5

Уа1

61и

С1у

Агд Тгр 10

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи 15

А1а

Азп

НЬз

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

20

25

30

Ьеи

НЬз

Зег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

35

40

45

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

С1и

С1у

Уа1

Суз

Ьуз

С1и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

НЬз

50

55

60

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

С1п

С1у

С1п

Туг

С1п

С1у

Зег

РЬе

С1и

С1у

Зег

65

70

75

80

МеЕ

НЬз

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

85

90

95

- 79 011816

УаЬ

Агд

РЬе

51и Азр 100

Азр

61и

11е

ТЬг Азп 105

Ьеи

Тгр УаЬ

Ьеи 110

Ьеи

АЬа

Агд

Меб

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

СЬу

Агд

Туг

Ьеи

61и

Туг

115

120

125

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

ΗΪ3

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

Не

Азр

СЬу

130

135

140

Рго Суз Рго Рго Рго

145

<210> <21Ь> <212> <213>

67 450 ДНК Ното зарЬепз

<400> 67 ббсаабдсдс дассбддбсб ддсддддасд абсассдбсс абдсасдбаб дабдабдада бддсбдддаа аасабадабд адааддбдда ссссддссда бддасббсдб абссаассса дсббсдбсад бсаасаассб дабасббдда дсссабдбсс ддддсдсбдд сссссбдадд дсбдббсбдд дббдсааддс сассдасбас дбдддбдсбд дбасдбддад сссасссбда сбсасссбдс сбсдсбсбсс аадддадаад садбассаад адсаассбса сбддсдадаа аааббссасс адсбддсадс асбссабссд дддбдбдбаа дсбсаббсда ббсбббасдб даабдсбдда бдсадааадс саассасдса дассадддас адааасааас дддсддсадс дсдсбббдад ддассссааа сссддбсббс

120

180

240

300

360

420

450 <210> 68 <211> 155 <212> РВТ <213> Ното зарЬепз <400> 68

РЬе 1

Азп

АЬа

51 п

Ьуз УаЬ 5

СЬи

СЬу

Агд Тгр Ьеи ТЬг Ьеи 51п Ьеи

А1а

10

15

АЬа

Азп

Н13

А1а

Азр

Ьеи

Уа1

Бег

Рго

АЬа

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

АЬа

20

25

30

Ьеи

Низ

Бег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

СЬу

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

35

40

45

РЬе

Тгр

Ьуз

СЬу

С1и

СЬу

Уа1

Суз

Ьуз

СЬи

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

НЬз

50

55

60

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

51п

С1у

С1п

Туг

СЬп

61у

Бег

РЬе

СЬи

СЬу

Бег

65

70

75

80

Меб

ΗΪ5

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Бег

ТЬг

Азр

Туг

Бег

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Туг

85

90

95

Уа1

Агд

РЬе

С1и

Азр

51и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

АЬа

100

105

110

Агд

Меб

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

СЬу

Агд

Туг

Ьеи

С1и

Туг

115

120

125

Уа1

С1и

Ьуз

РЬе

Н18

Ьеи

С1п

Ьуз

АЬа

Рго

УаЬ

РЬе

Азп

Не

Азр

СЬу

130

135

140

Рго

Суз

Рго

РГО

НЬз

ΗΪ8

Низ

ΗΪ5

ΗΪ3

145

150

155

<210> 69

- 80 011816 <211> 468 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 69 кксаакдсдс дасскддкск ддсддддасд аксассдксс акдсасдкак дакдакдада кддскдддаа аасакадакд адааддкдда ссссддссда кддаскксдк акссаассса дскксдксад ксассаасск дакасккдда дсссакдксс ддддсдскдд ссссскдадд дскдккскдд дккдсааддс сассдаскас дкдддкдскд дкасдкддад сссассскда сксассскдс сксдсксксс аадддадаад садкассаад адсаасскса скддсдадаа аааккссасс сассаксасс адскддсадс аскссаксад дддкдкдкаа дсксакксда ккскккасдк даакдскдда кдсадааадс аксассак саассасдса дассадддас адааасааас дддсддсадс дсдскккдад ддассссааа сссддксккс

120

180

240

300

360

420

68

<210> <211> <212> <213>	70 182 РКТ Ното зартепз
<400> 61и С1и 1	70 Уа1	Рго	Уа1 5	С1П	Рго	61у
Агд	Тгр	Ьеи	ТЬг 20	Ьеи	С1п	Ьеи	А1а
Рго	А1а	Азр 35	Рго	Ьеи	Агд	Ьеи	А1а 40
С1у	С1у 50	Азр	Уа1	Азр	РЬе	Уа1 55	Ьеи
Ьуз 65	С1и	ТЬг	Азп	Не	ТЬг 70	Уа1	Н1з
С1п	С1у	Зег	Тгр	ΗΪ3 85	С1у	01у	Уа1
Агд	ΗΪ3	Агд	А1а 100	Зег	А1а	С1у	Рго
Зег	Мек	ΗΪ5 115	Уа1	Суз	РЬе	Уа1	Зег 120
Туг	Уа1 130	Агд	РЬе	С1и	Азр	Азр 135	С1и
А1а 145	Агд	Агд	Мек	Ьеи	С1и 150	Азр	Рго
Туг	Уа1	С1и	Ьуз	РЬе 165	Н1з	Ьеи	С1п
С1у	Рго	Суз	Рго 180	Рго	Рго

РЬе	Азп 10	А1а	С1п	Ьуз	Уа1	С1и 15	С1у
А1а 25	Азп	Низ	А1а	Азр	Ьеи 30	Уа1	Зег
Ьеи	ΗΪ5	Зег	Пе	Агд 45	ТЬг	Агд	Азр
РЬе	Тгр	Ьуз	С1у 60	С1и	С1у	Уа1	Суз
Рго	ТЬг	С1п 75	Ьеи	С1п	С1у	С1п	Туг 80
С1п	С1у 90	Ьеи	С1у	Азр	С1у	С1у 95	С1и
С1у 105	Зег	Рго	ТЬг	Уа1	С1и 110	С1у	С1у
ТЬг	Азр	Туг	Зег	Азп 125	Ьеи	Не	Ьеи
Не	ТЬг	АЗП	Ьеи 140	Тгр	Уа1	Ьеи	Ьеи
Ьуз	Тгр	Ьеи 155	С1у	Агд	Туг	Ьеи	С1и 160
Ьуз	А1а 170	Рго	Уа1	РЬе	Азп	Не 175	Азр

<210> <211> <212> <213>

71 548 ДНК Ното зарЬепз

<400>71 даададдкас сддкасадсс дддскксаак дсдсадаадд кддаддддсд скддсксасс60 скдсадскдд садссаасса сдсадасскд дкскссссдд ссдассссск даддсксдск120

- 81 011816 сЕссасЕсса дааддддЕдЕ сааддсЕсаЕ ЕсадсЕддсс ассдасЕаса ЕдддЕдсЕдс ЕасдЕддада ссасссда

Ессддассад дЕааадааас ддсаЕддддд сддддЕсЕсс дсаассЕсаЕ Еддсдадаад ааЕЕссассЕ ддасддсддд ааасаЕсасс ддЕссадддс аасадЕсдад ЕсЕЕЕасдЕд ааЕдсЕддад дсадааадсс дасдЕддасЕ дЕссаЕссаа сЕдддддасд ддсддсадса сдсЕЕЕдадд дассссаааЕ ссддЕсЕЕса

ЕсдЕдсЕдЕЕ сссадЕЕдса даддададад ЕдсасдЕаЕд аЕдаЕдадаЕ ддсЕдддаад асаЕадаЕдд сЕддааддда аддссадЕас дсаЕсдЕдса сЕЕсдЕсадс сассаассЕд аЕасЕЕддад сссаЕдЕссс

180

240

300

360

420

480

540

548

<210> <211> <212> <213>

72 183 РКТ Ното зархепз

<400>72

С1а С1и 1

Уа1

Рго Уа1 5

С1п Рго

С1у

РЬе Азп А1а 10

С1п

Ьуз

Уа1

С1и 15

61у

Агд

Тгр

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Ьеи

А1а

Азп

Нхз

А1а

Азр

Ьеи

7а1

Зег

20

25

30

Рго

А1а

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

Нхз

Зег

Не

Агд

ТЬг

Агд

Азр

35

40

45

С1у

Азр

Уа1

Азр

РЬе

Уа1

Ьеи

РЬе

Тгр

Ьуз

С1у

б1и

С1у

Уа1

Суз

50

55

60

Ьуз

01и

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

Уа1

Нхз

Рго

ТЬг

С1п

Ьеи

С1п

01у

С1п

Туг

65

70

75

80

О1п

01у

Зег

Тгр

НХЗ

О1у

Уа1

С1п

61у

Ьеи

С1у

Азр

С1у

С1и

85

90

95

Агд

Н13

Агд

А1а

Зег

А1а

С1у

Рго

61у

Зег

Рго

ТЬг

Уа1

С1и

01 у

О1у

100

105

110

Зег

МеЕ

ΗΪ8

Уа1

Суз

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

115

120

125

Туг

Уа1

Агд

РЬе

С1и

Азр

О1и

Не

ТЬг

Азп

Ьеи

Тгр

Уа1

Ьеи

130

135

140

А1а

Агд

МеЕ

Ьеи

С1и

Азр

Рго

Ьуз

Тгр

Ьеи

С1у

Агд

Туг

Ьеи

С1и

145

150

155

160

Туг

Уа1

61и

Ьуз

РЬе

Нхз

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

РЬе

Азп

Не

Азр

165

170

175

С1у Рго Суз Рго Рго Рго Нхз Нхз Нхз Нхз Нхз Нхз

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид, который:

(ΐ) содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 2; 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 22, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 24, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 66 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 70;

(ίί) представляет собой фрагмент, который является липокалином или имеет общую антигенную детерминанту с одним или несколькими полипептидами (1); или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
2. Полипептид, который является фрагментом по п.1(н), отличающийся тем, что указанный полипептид содержит или состоит из аминокислоты(от) 25-174, аминокислоты(от) 26-180, аминокислоты(от) 33-166 или аминокислоты(от) 41-189 из 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 18 или аминокислоты(от) 25-206 из 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 24 и представляет собой липокалин.
3. Полипептид, который является функциональным эквивалентом по п.1(ш), отличающийся тем, что его последовательность гомологична аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 22, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 24, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 66 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 70, и является липокалином.
4. Полипептид, который является фрагментом или функциональным эквивалентом по п.1 или 2 и аминокислотная последовательность которого характеризуется более чем 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 2; 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 4, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 22, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 24 или 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 66, или с ее активным фрагментом, предпочтительно идентичностью на уровне последовательности более чем 85, 90, 95, 98, 98,5, 99 или 99,5%.
5. Полипептид, который представляет собой функциональный эквивалент по любому из пп.1-3 и отличается тем, что он обладает значительной структурной гомологией с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 2, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 4, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 22, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 24, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 66 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 70.
6. Полипептид, который представляет собой фрагмент по п.1 или 4, и который имеет антигенную детерминанту, общую с полипептидом по п.1 части (ί), и который состоит из 7 или более аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 2; 8ЕР Ш ΝΟ: 4, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 22, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 24, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 66 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 70.
7. Полипептид по пп.1-6, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит аминокислотные замены Ν92Τ и/или 01148.
8. Полипептид по п.6, имеющий последовательность, представленную в 8ЕР Ш ΝΟ: 36, 8 Ер ΙΌ ΝΟ: 38, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 40, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 42, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 44, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 46, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 56, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 58 или 8Ер ΙΌ ΝΟ: 60.
9. Гибридный белок, содержащий полипептид по любому из предшествующих пунктов.
10. Полипептид по пп.1-9, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит гистидиновую метку.
11. Полипептид по п.10, имеющий последовательность, представленную в 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 28, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 30, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 32, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 34, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 48, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 50, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 52, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 54, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 62, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 64, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 68 или 8Ер ΙΌ ΝΟ: 72.
12. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по любому из предшествующих пунктов.
13. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п.12, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 1, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 3, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 5, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 7, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 9, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 11, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 13, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 15, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 17, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 19, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 21, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 23, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 25, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 27, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 29, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 31, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 33, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 35, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 37, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 39, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 41, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 43, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 45, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 49, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 51, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 53, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 55, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 57, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 59, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 61, 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 63, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 65, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 67, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 69, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 71 или 8Ер ΙΌ ΝΟ: 72, или представляет собой ее избыточный эквивалент или фрагмент.
14. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.12 или 13 в условиях высокой жесткости.
15. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14.

- 83 011816
16. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.15.
17. Лиганд, который представляет собой антитело и который специфически связывается с полипептидом по любому из пп.1-11 и предпочтительно модулирует его активность.
18. Применение полипептида по любому из пп.1-11, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14, вектора по п.15, клетки-хозяина по п.16 или лиганда по п.17 для использования в терапии или в диагностике заболевания.
19. Способ ш νίΙΐΌ диагностики заболевания у пациента, включающий оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по любому из пп.1-11, или оценку активности полипептида по любому из пп.1-11 в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия заболевания.
20. Способ по п.19, который включает стадии:

a) контактирования лиганда по п.17 с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и

b) детекции указанного комплекса.
21. Способ по п.19, включающий стадии:

a) контактирования образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиново-кислотным зондом в жестких условиях, способствующих образованию гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14 и указанным зондом;

b) контактирования контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и

c) детекции присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детекция уровней указанного гибридного комплекса в образце, взятом у данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
22. Способ по п.19, включающий:

a) контактирование образца нуклеиновой кислоты из ткани, взятой у пациента, с нуклеиновокислотным праймером в жестких условиях, способствующих образованию гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14 и указанным праймером;

b) контактирование контрольного образца с указанным праймером в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и

c) амплификацию указанного образца нуклеиновой кислоты; и

б) детекцию уровня амплифицированной нуклеиновой кислоты в образцах, взятых у пациента, и в контрольных образцах, где детекция уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты во взятом у пациента образце, которые значительно отличаются от уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
23. Способ по п.19, включающий:

a) получение образца тканей от пациента, обследуемого на наличие заболевания;

b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14 из указанного образца ткани; и

c) установление диагноза заболевания данному пациенту путем детекции присутствия мутации в молекуле нуклеиновой кислоты, где указанная мутация ассоциируется с указанным заболеванием и где присутствие такой мутации указывает на наличие заболевания.
24. Способ по п.23, который, кроме того, включает амплификацию указанной молекулы нуклеиновой кислоты с образованием амплифицированного продукта и детекцию присутствия или отсутствия мутации в указанном амплифицированном продукте.
25. Способ по любому из пп.23 или 24, где присутствие или отсутствие мутации у пациента определяют путем осуществления контакта указанной молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеиновокислотным зондом, который гибридизуется с указанной молекулой нуклеиновой кислоты в жестких условиях с образованием гибридной двухцепочечной молекулы, где указанная гибридная двухцепочечная молекула имеет негибридизованную часть цепи нуклеиново-кислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и детекции присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи указанного зонда как показателя присутствия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации.
26. Способ по любому из пп.19-25, где указанными заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, расстройство зрения (например, ночная слепота), расстройства иммунной системы (например, аутоиммунные расстройства), воспалительные состояния, воспалительное заболевание кишечника (ΚΏ), язвенный колит (ИС), болезнь Крона (СО), проктит, клеточно-пролиферативные расстройства, рак (например, рак молочной железы, кожная Т-клеточная лимфома, плоскоклеточная карцинома и/или базальноклеточная карцинома), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибные инфекции), эмфизема, кожные болезни (например, кожное заболевание, ассоциированное с ТИ1, такое как псориаз или гиперкератозный дерматоз; кожное заболевание, ассоциированное с ТИ2, такое как атопический дерматит, контактный дерматит, контактная аллергия, например, к никелю или золоту, кожная Т-клеточная лимфома, атопическая экзема, острая экзема и/или хроническая экзема), репродуктивные расстройства

- 84 011816 (например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункция почки, инфаркт миокарда, артрит, рассеянный склероз, кистозно-фиброзная мастопатия, регуляция развития нервной системы, диабет типа Ι, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса (тироидит), ревматоидный артрит, пролиферативный гломерулонефрит и гломерулонефрит с клубочками полулунной формы, увеит заднего отдела глазного яблока, заживление раны и/или саркоидоз, красный питириаз и/или порокератоз, аллергические расстройства, такие как аллергический ринит, астма, красный плоский лишай, хронический синусит, синдром Сезари, лучевой кератоз, гепатит С, язвенный колит, мембранозный гломерулонефрит и/или вирусные инфекции.
27. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-11.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14.
29. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.15.
30. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяин по п.16.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая лиганд по п.17.
32. Вакцинная композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-11.
33. Вакцинная композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14.
34. Применение полипептида по любому из пп.1-11, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14, вектора по п.15, клетки-хозяина по п.16, лиганда по п.17 или фармацевтической композиции по любому из пп.27-31, используемых для получения лекарственного средства для лечения определенного заболевания, которыми являются, но не ограничиваются ими, следующие заболевания: расстройство зрения (например, ночная слепота), расстройства иммунной системы (например, аутоиммунные расстройства), воспалительные состояния, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), язвенный колит (иС), болезнь Крона (СО), проктит, клеточно-пролиферативные расстройства, рак (например, рак молочной железы, кожная Т-клеточная лимфома, плоскоклеточная карцинома и/или базально-клеточная карцинома), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибные инфекции), эмфизема, кожные болезни (например, кожное заболевание, ассоциированное с ТЬ1, такое как псориаз или гиперкератозный дерматоз; кожное заболевание, ассоциированное с ТЬ2, такое как атопический дерматит, контактный дерматит, контактная аллергия, например, к никелю или золоту, кожная Т-клеточная лимфома, атопическая экзема, острая экзема и/или хроническая экзема), репродуктивные расстройства (например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункция почки, инфаркт миокарда, артрит, рассеянный склероз, кистозно-фиброзная мастопатия, регуляция развития нервной системы, диабет типа Ι, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса (тироидит), ревматоидный артрит, пролиферативный гломерулонефрит и гломерулонефрит с клубочками полулунной формы, увеит заднего отдела глазного яблока, заживление раны и/или саркоидоз, красный питириаз и/или порокератоз, аллергические расстройства, такие как аллергический ринит, астма, красный плоский лишай, хронический синусит, синдром Сезари, лучевой кератоз, гепатит С, язвенный колит, мембранозный гломерулонефрит и/или вирусные инфекции.
35. Способ мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, включающий мониторинг уровня экспрессии или активности полипептида по любому из пп.1-11 или уровня экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14 в ткани указанного пациента, проводимый в течение определенного периода времени, где изменение указанного уровня экспрессии или активности за определенный промежуток времени по сравнению с контрольным уровнем является показателем рецидива указанного заболевания.