JP5866053B1 - 皮膚粘弾性のマーカー及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
皮膚を一つの弾性体であるとみなして、皮膚の粘弾性率を測定し、「はり」という官能的な評価方法に代えて用いようとする方法及び測定装置が開発されている。代表的な皮膚粘弾性測定装置としてCUTOMETER・キュートメーター(商品名)(Courage & Khazaka社製)がある。この装置は、皮膚表面を陰圧状態のプローブ開口部に引き込み、開口部に引き込まれた皮膚長をプリズムで測定し、次いで吸引を解除し、解除したときの変位長(戻り)を同様に測定し、この測定結果をパラメータとして粘弾性率を求めるものである(非特許文献1参照)。この装置を用いた粘弾性率を指標として、皮膚の老化度の評価や、化粧料の効果を評価することが化粧品業界や、美容関連医療分野において広く普及している。
特許文献1には、皮膚のたるみを改善させるような美容施術を行ったときの効果を評価する手段としてキュートメーターを使用することが記載されている。
非特許文献2は、グルコシルセラミド含有ビート抽出物の皮膚弾力性に及ぼす影響を、キュートメーターを用いて評価したことが記載されている。このように皮膚粘弾性は皮膚の健康状態を評価するための重要なパラメータであると認識されている。
しかし、キュートメーターによる皮膚粘弾性の測定技術は、測定に用いるプローブや装置が高価であり、また使用にあたっては熟練を要する。このため、より簡便な方法が求められている。
特許文献2には、ヒト前腕を0.15%の次亜塩素酸ナトリウムで洗浄し、洗浄前後の酸化タンパク質を蛍光標識して測定すると、酸化タンパク質量が増加し、さらに、前腕部を前記キュートメーターで測定して得られる物理量であるR0(最大引っ張り幅)の処理前後の比が増加することが記載されている。そして、この結果に基づき酸化タンパク質を指標として皮膚の柔軟性を評価する方法が、同じく特許文献2に提案されている。
このヒト皮膚の柔軟性は、上皮細胞層と間質細胞の間に存在する膜状の細胞外マトリックスによって保たれるといわれている。この細胞外マトリックスは基底膜と呼ばれており、IV型コラーゲンやラミニンなどの細胞外タンパク質から構成されている(非特許文献3)。
さらにまた、本発明は皮膚の基底膜タンパク質産生を促進することを課題とする。
さらに、NGALは被験者の年齢と高い相関を有しており、老化の指標ともなりうることを見いだした。また本発明者は、このNGALによって皮膚のハリが回復し、さらには基底膜の構成タンパク質をNGALが増加させることを見いだし、NGALを皮膚粘弾性指標とする有意性を明らかにした。
(1)皮膚角層のNGALの発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法。
(2)被験者の皮膚角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層のNGALの発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたNGALの発現量から皮膚粘弾性を求める工程を含む皮膚粘弾性の評価方法。
(3)皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである(2)に記載の評価方法。
(4)皮膚角層のNGALの発現量を測定することを特徴とする皮膚老化を評価する方法。
Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)は、皮膚角層中に存在するリポカリンファミリーに属するタンパク質である。NGALは、健常人の血中や尿中に存在し、その量は各種の炎症性疾患や細菌感染時に上昇することが知られている。また急性腎機能障害の血中マーカーとされているほか、各種の腫瘍マーカーとしても注目を集めている。本発明においては、特許文献3に開示されたヒトNGALを発明に用いるものである。また特許文献4に開示されているマーカーが皮膚の粘弾性パラメータに変わる指標となる。
標準的には、吸引径6ミリで300mbの吸引圧にて5秒間吸引し、その後開放したときの変形する皮膚の変位を解析する。キュートメーターで得ることのできる皮膚粘弾性値の測定パラメータとして、前記したとおり一定の吸引圧及び時間で変形する皮膚の変位を解析して求められる戻り弾性比率(Ur/Uf)が主として評価に用いられる。キュートメーターによる皮膚の変位量の経時的測定の代表的なチャートを図1に示す。図1において、Uf:吸引時の皮膚の伸び(図1のUf1に対応)、Ur:即時的収縮(図1のUr1に対応)、Ua:吸引解放時の皮膚の戻り(図1のUa1に対応)である。皮膚の粘弾性指標として用いられるパラメーターは、R2:吸引時の皮膚の伸びた長さに対する吸引開放時の皮膚の戻り率=皮膚の復元率(R2=Ua/Uf)、R7:吸引時の皮膚の伸びた長さに対する即時的(瞬間的)な収縮率=収縮時の弾性率(R7=Ur/Uf)である。R2は全体の弾力を表しており、完全弾性体で1.00、ヒト皮膚は0.3〜0.5である。R7は戻り弾性比率であり、1に近いほど弾性があり、ヒト皮膚は0.3〜0.5である。
免疫染色の場合には、例えば蛍光免疫染色により測定可能である。NGALの定量は、例えば蛍光強度を、市販の測定装置とソフトウェアで定量することにより行うことができる。
さらにまたNGALは、皮膚基底膜タンパク質の産生促進作用を有しており、皮膚基底膜の機能を向上させる目的の剤としても使用可能である。
A.方法
(1)試験対象
健常者女性45歳〜69歳(37名)
顔面右頬部に測定部位を統一して粘弾性を測定した。測定はキュートメーターMPA580を用いて、付属のプローブを用いて、吸引径6ミリで300mbの吸引圧を5秒間吸引するモードで行った。
・角層採取
被験者の頬部より2.5×2.5cmの角層チェッカー(アサヒテクノラボ社)1枚を用いてストリッピングを行い、角層を採取した。
・角層抽出方法
ガラスビーズとT−PERバッファー(#78510/Thermo SCIETIFIC)500μlの入ったチューブに角層を採取した角層チェッカーを入れ、ビーズ式細胞破砕装置(Tommy)を用い、4600rmp、180秒にて角層タンパクを抽出した。
・角層中総タンパク量の測定
各サンプルのタンパク量はPierce BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific #23225)を用いて測定した。測定には角層サンプルを10μlに reagentA: reagent=50:1で混和した液200μlを加え、60℃30分間インキュベーションしたのち、562nmの吸光度で測定した。同時に精製ウシ血清アルブミンを標準品として検量線を作成し、吸光度の値からタンパク量を算出した。
各サンプルのNGAL発現量は、市販のELISAキット(R&D systems#DY1757)を用い、サンドイッチ ELISA法によって次の基準で測定した。
(1)吸着抗体の固定化
96well plate(COSTAR #3590)にラットNGAL(rat anti−Lipocalin−2 Part 842271)を最終濃度2.0μg/mlになるようにPBS(−)(WAKO #16219321)で希釈したものを100μl/wellで添加し、25℃、酸素/窒素混合雰囲気でインキュベートした。
(2)ブロッキング
蒸留水を用いて10倍に希釈した希釈液(R&D #890803)を300μl/well加え25℃、1時間インキュベートした。
(3)サンプル添加
検量線作製用の遺伝子組み換えNGAL(recombinant human Lipocalin−2 Part 842273)、ヒト角層抽出液(T-PER bufferで2倍希釈)をそれぞれ100μl/wellで加え、25℃で2時間インキュベートした。
(4)検出用抗体反応
biotinylated goat anti−human Lipocalin−2(Part 842272)を終濃度100ng/mlになるように希釈液で希釈した反応液を100μl/well添加し、25℃、2時間インキュベートした。
(5)Streptavidin−HRP反応
Reagent Diluentで200倍に希釈したStreptavidin−HRP(Part 890803)を100μl/well添加し、25℃、20分間インキュベートした。
(6)TMB反応
TMB One Solution(Promega #G7431)を100μl/well添加し、25℃、7.5分間インキュベートした。
(7)反応停止液の添加と吸光度計での測定
0.5NH2SO4(Wako #198−09595)を100μl/well加え、反応を止め、SPECTRA MAX 190(Molecular Devices)を用いて450nm−540nmの吸光度を測定した。
なお手順(2)〜(6)を行う前には洗浄用緩衝液(0.05%Tween20/PBS)を用いてプレートの洗浄を行った
粘弾性とNGALの相関解析
粘弾性及びNGALの測定結果についてピアソンの単相関分析を行い、単相関回帰式と相関係数を求めた。散布図グラフ及び回帰式を図2、3に示す。
R2の粘弾性パラメータとNGAL測定値の相関係数r=0.319、R7の粘弾性パラメータとNGAL測定値の相関係数はr=0.303であった。この解析結果から皮膚角層のNGAL測定結果は、キュートメーターで測定した皮膚の粘弾性パラメータのR2、R7に代替できることが明らかとなった。
すなわち、皮膚の粘弾性の物理的な測定結果に変えて、NGALを測定することで皮膚の粘弾性を評価できた。
NGALの測定結果を老化指標として利用することができないか試験を行った。
前記1.の試験と同様に健康な女性97名の頬部のNGALを測定し、年齢との相関の有無を確認するため、年齢とNGAL値について、ピアソンの方法による2元配置の相関分析を行った。散布図、一次回帰式、相関係数を図5に示す。
3.コラーゲンゲル収縮試験
皮膚の弾力性に係る皮膚の反応として、コラーゲン線維の収縮を指標として評価することができる。この試験は線維芽細胞を含むコラーゲンゲルは皮膚に弾力性を付与する化合物や組成物に反応してゲル収縮を起こす。NGALがこのコラーゲンゲル収縮を引き起こすことを確認する試験を行った。
(1)試験方法
コラーゲンゲルはブタ皮膚性コラーゲンI溶液(日本ハム社製、#307−31611)を使用した。まず、ヒト線維芽細胞(NHDF cell)を DMEM (Gibco #1996−065)+ 10% FBSで混濁し、600000 cells/mlに調整した後、細胞混濁液:ゲル溶液を1:6になるように混合し、氷冷上で2mlずつ6 well plateに分注した。37℃、CO2雰囲気下で5時間培養した後、ゲルの固化を確認、調整したrecombinant human Lipocalin−2/NGAL protein(rhNGAL;R&D systems #1757−LC−050)を溶解した培地を2ml/wellずつ添加し、培養を継続した。48時間観察した後、培地を除き、PBSにて洗浄した後、10%ホルマリン溶液にて、24時間以上固定した。1% Triton−X 溶液に置換して、ゲル直径の計測を行った。各Wellにおいて、ゲル及びWellの直径を4つの角度から測定し、各Wellの面積当たりに対するゲルの面積を割って収縮率を算出し、3wellの平均値及び標準偏差値を求めた。
コラーゲンゲル収縮の観察画像を図5に示す。また収縮率のデータを図6に示す。なお、データはStudent’s T−testにより対照群に対する統計解析を行い、*p<0.05、**p<0.01の危険率表示を付した。
rhNGALを添加すると、無添加のコントロールと比較して、NGAL添加により、濃度依存的にゲルの収縮率が高くなった。特にNGAL 1ng/ml以上の濃度において有意なゲル収縮が観察された。この結果から、皮膚において、NGALの濃度上昇に対応して皮膚の弾力性が上昇することが予測された。
基底層を構成するヒト表皮角化細胞を用いてNGAL発現の基底膜タンパク質に及ぼす作用を確認した。
(1)予備試験
(1−1)siRNAによるNGAL発現のノックダウン試験
NGALを産生している正常ヒト表皮角化細胞(NHEK細胞;LONZA)を用い、siRNAによるNGAL遺伝子発現の一時的抑制を行い、NGAL発現のノックダウンを試みた。
細胞培養にはEpiLife(登録商標) basal medium with 60 μM calcium(Life Technologies、USA)にHumedia−KG2増殖添加剤(倉敷紡績社製、日本)を添加したものを使用した。NHEK細胞は1×105cells/wellの密度で直径35mmの組織培養ウェルで50%コンフルエントになるまで培養した後、siRNA(Qiagen、USA)を細胞に導入した。なお、siRNAは無血清培地で調整し、100μl培地あたりHiPerFect(登録商標) Transfection Reagent(Qiagen、USA)を用いて、0.5 nMのHs_LCN2_6 FlexiTube siRNA(Qiagen、USA)内でsiRNAを細胞に導入した。またネガティブコントロールとして、All Stars Negative Control siRNA (Qiagen、USA)を用いて同様に操作を行った。導入細胞は、37℃、5%CO2雰囲気の条件下で72時間培養を行った。
各細胞の培養液中のNGAL量は市販のELISAキット(R&D systems#DY1757)を用い、sandwich ELISA法により測定した。
また、siRNAによるNGALノックダウンを確認するため同じく細胞外タンパク質であMMP−9を測定した。MMP−9の測定は、市販のELISAキット(R&D systems、#DY911(MMP−9))を用いて測定し、NGALが選択的に抑制されていることを確認した。
1−1、1−2の試験でNGALが選択的に抑制されていることを確認した後、基底膜タンパク質の産生抑制を確認する。
基底膜タンパク質として、IV型コラーゲン(Collagen type IV)を測定した。
測定は、ウエスタンブロッティング法によった。培養上清を10−kDa Amicon ultra filter (Amicon、USA)を用いて10−kDa以上のタンパク質が含まれるように濃縮を行い、ウエスタンブロッティング用のサンプルとして用いた。調整した培養上清は、7.5% sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide gel electrophoresisで分離し、0.2μm PVDF Trans−Blot Turbo Transfer Packに転写した。
Starting Block Blocking buffer in PBS with Tween−20(Thermo Scientific)を用いて、室温条件で1時間ブロッキングし、次いでblocking bufferで調整した一次抗体で、4℃で振動させながら一晩反応させた。
一次抗体には、anti−Rabbit Collagen type IV antibody(1/1000、 Abcam、USA)を使用した。
次いで、0.1% Tween 20−PBSで5分間(2回)10分間(1回)洗浄した。その後、2次抗体として、HRP−Rabbit−IgG(Invitrogen、Catalog No. 81−1620)を10000倍に希釈し、室温で1時間反応させた。
反応終了後ECL prime Western blotting detection reagent (GE Healthcare、Catalog No.RON2232)を用いて5分間反応させ、ルミノ・イメージアナライザー LAS−4000miniシリーズ(GE Healthcare)で検出した。
(2−1)siRNAによるNGAL遺伝子ノックダウン結果
図7にNGAL産生量の測定結果、図8にMMP−9産生量の測定結果を示す。明らかにsiRNAによってNGAL産生が抑制されることが確認できた。
図9にIV型コラーゲンの測定結果を示す。
いずれの基底膜タンパク質も顕著に産生が抑制されていた。
(3−1)NGAL存在下での細胞培養
NHEK細胞をrhNGAL存在下で48時間培養した。NHEK細胞は、1×105cells/wellの密度で直径35mm組織培養ウェルを用いて、50%コンフルエントになるまで培養した。次いで、rhNGALを無血清培地に溶解させた培養液に交換した。また比較のため、コントロールとして無血清培地のみの培地に交換したものを、同様に培養を行った。なお培養液中のNGAL濃度は0.1、1.0、10ng/mlとした。また培養条件は、37℃、5%CO2雰囲気とした。
培養用終了後、培養上清中の培養上清中のIV型コラーゲンをウエスタンブロッティング法により測定した。なお測定は前記のルミノ・イメージアナライザーで行った。
測定結果を図10に示す。IV型コラーゲンは、NGAL濃度に対応して顕著に増加した。
以上の試験結果から、NGAL濃度の増加は基底膜タンパク質であるIV型コラーゲンを増加させることが明らかとなった。基底膜タンパク質の増加は皮膚の粘弾性改善に関わっており、この点からもNGALを皮膚の粘弾性の指標とすることは有用であることが裏付けられた。
またNGALは濃度依存性の基底膜タンパク質産生促進作用を有することが判明した。したがってNGALは基底膜タンパク質の産生促進剤として利用可能である。
Claims (4)
- 皮膚角層のNGALの発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法。
- 被験者の皮膚角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層のNGALの発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたNGALの発現量から皮膚粘弾性を求める工程を含む皮膚粘弾性の評価方法。
- 皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである請求項2に記載の評価方法。
- 皮膚角層のNGALの発現量を測定することを特徴とする皮膚老化を評価する方法。
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