TW201621318A - 皮膚黏彈性的標記物及其利用 - Google Patents

Abstract

本發明係以提供用於預測和評價皮膚的黏彈性的新指標為課題。另外，本發明係以提供使用該指標之皮膚的檢查方法為課題。本發明係關於一種皮膚黏彈性的評價方法，係測定皮膚角質層的NGAL的表現量。

Description

皮膚黏彈性的標記物及其利用

本發明係關於皮膚黏彈性的標記物及其利用。

皮膚的健康狀況係使用各種各樣的指標來進行評價。例如，將皮膚的“彈性”感的有無作為健康狀況和老化度的評價指標之一。“彈性”被分為來源於角質層、表皮的彈性與來源於真皮的彈性二種。特別地，來源於真皮的彈性為如果以手指按壓皮膚則存在要推回來的彈力，將如果移開手指則迅速復原的狀態稱為好的彈性，物理上也稱為黏彈性。而皮膚所顯示的該黏彈性也因年齡和紫外線暴露、皮膚暴露於化學物質等而降低。因此，皮膚的彈性也可以成為皮膚老化的指標。

已經開發了將皮膚看做一個彈性體來測定皮膚的黏彈性率，代替“彈性”這樣的感官性評價方法而使用的方法及測定裝置。作為代表性的皮膚黏彈性測定裝置，有CUTOMETER(，商品名)(Courage & Khazaka公司製)。該裝置將皮膚表面引入負壓狀態的探測器開口部，藉由稜鏡測定被引入開口部的皮膚長度，然後 解除吸引，同樣地測定解除時的位移長度(返回)，將該測定結果作為參數求出黏彈性率(參見非專利文獻1)。將使用了此裝置的黏彈性率作為指標，皮膚的老化度的評價、評價化妝料的效果在化妝品業內、與美容相關醫療領域中廣泛普及。

專利文獻1中記載了使用CUTOMETER作為評價進行用於改善皮膚的鬆弛這樣的美容手術時的效果的手段。

非專利文獻2中記載了使用CUTOMETER評價含有葡糖苷醯鞘氨醇(glucosylceramide)的甜菜萃取物對皮膚彈性的影響。如此，認為皮膚黏彈性是用於評價皮膚的健康狀態的重要參數。

但是，利用CUTOMETER的皮膚黏彈性的測定技術為，用於測定的探測器和裝置價格貴，另外在使用時要求熟練。因此，正在謀求更加簡便的方法。

另外，也提出了藉由化學性的分析方法測定皮膚的黏彈性這樣的物理性指標的方法。

專利文獻2中記載了，如果藉由0.15%的次氯酸鈉清洗人的前臂，螢光標記並測定清洗前後的氧化蛋白質，則氧化蛋白質量增加，進而藉由前述CUTOMETER測定前臂部而獲得的物理量R0(最大拉伸寬度)的處理前後的比值增加。而且，同樣地，在專利文獻2提出了基於此結果將氧化蛋白質作為指標來評價皮膚的柔軟性的方法。

進一步，本發明是關於作為屬於脂質運載蛋白家族的蛋白質的嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的發明。NGAL的基因序列和蛋白質的結構公開於專利文獻3中。在本發明中，將公開於此專利文獻3中的NGAL用於發明中。作為NGAL的利用技術，雖然專利文獻4中公開了NGAL可以成為異位性皮膚炎的標記物。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2010-51717號公報

[專利文獻2]日本特開2006-34372號公報

[專利文獻3]日本特表2005-503829號公報

[專利文獻4]日本特表2008-536483號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]皮膚黏彈性測定裝置CUTOMETER MPA580手冊、2007.5修正版、Integral公司

[非專利文獻2]堀未央、米井嘉一等, 《抗老化藥物 (Anti-Aging Medicine)》 , 7 〔11〕 129-142, 2010

本發明係以提供用於預測和評價皮膚的黏彈性的新指標為課題。另外，本發明係以使用該指標之皮膚的檢查方法作為課題。

本發明者在使用前述CUTOMETER測定皮膚的黏彈性，探索與黏彈性的參數具有關聯關係的標記物的過程中，發現了皮膚角質層中的屬於脂質運載蛋白家族的蛋白質之嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(以下稱之為“NGAL”)可以成為黏彈性的指標，完成了本發明。

進一步，發現了NGAL與被測試者的年齡具有高度的關聯，也可以成為老化的指標。

即，本發明的構成如以下所述：

(1)一種皮膚黏彈性之評價方法，係測定皮膚角質層的NGAL的表現量。

(2)一種皮膚黏彈性之評價方法，係包含：採集被測試者的皮膚角質層的採集步驟、測定藉由前述採集步驟所採集的角質層的NGAL的表現量的測定步驟、由藉由前述測定步驟所測定的NGAL的表現量來求出皮膚黏彈性的步驟。

(3)如(2)所述的評價方法，其中，採集皮膚的角質層的步驟為利用膠帶剝離法進行者。

(4)一種皮膚老化之評價方法，係測定皮膚角質層的NGAL的表現量。

依據本發明的方法，因為能夠基於作為生物化學性的標記物的皮膚角質層中的NGAL的測定結果獲得作為物理性的指標的皮膚的黏彈性，所以CUTOMETER等專用的測定裝置變得不需要，皮膚黏彈性測定能夠簡化。 另外，皮膚角質層可利用膠帶剝離法而容易地採集，能夠藉由郵寄等簡易的手段進行運送，因此在一個地方進行大量的被測試者的皮膚黏彈性的測定變得可能。另外，能夠將NGAL作為新的老化指標。

第1圖為測定操作CUTOMETER時所獲得的皮膚的變形而得的曲線圖。

第2圖為進行角質層中的NGAL測定值與皮膚黏彈性參數R2的關聯分析的圖。

第3圖為進行角質層中的NGAL測定值與皮膚黏彈性參數R7的關聯分析的圖。

第4圖為進行角質層中的NGAL測定值與年齡的關聯分析的圖。

本發明為關於評價皮膚黏彈性之方法及NGAL之利用的發明，其係測定皮膚角質層的NGAL的表現量。

嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)為從屬於存在於皮膚角質層中的脂質運載蛋白家族的蛋白質。已知NGAL存在於健康人的血液和尿液中，其量在各種炎症性疾病和細菌感染時上升。另外，除了被用作急性腎功能衰竭的血液中標記物，還作為各種腫瘤標記物而受到關注。在本發明中，將專利文獻3所公開的人NGAL用於發明。 另外，專利文獻4所公開的標記物成為替代皮膚的黏彈性參數的指標。

現有技術的利用CUTOMETER的皮膚黏彈性的測定如下所述而進行。

標準地，以吸引徑6毫米，以300mb的吸入壓力進行5秒鐘吸引，之後解析開放時發生變形的皮膚的位移。作為能夠藉由CUTOMETER獲得的皮膚黏彈性值的測定參數，解析如上所述以一定的吸入壓力和時間發生變形的皮膚的位移而求出的返回彈性比率(Ur/Uf)主要用於評價。將利用CUTOMETER獲得的皮膚的位移量隨時間測定的代表性的曲線顯示於第1圖中。在第1圖中，Uf：吸引時皮膚的延伸(對應於第1圖的Uf1)、Ur：即時性收縮(對應於第1圖的Ur1)、Ua：吸引釋放時皮膚的返回(對應於第1圖的Ua1)。用作皮膚的黏彈性指標的參數有，R2：相對於吸引時皮膚延伸長度的吸引開放時皮膚的返回率=皮膚的復原率(R2=Ua/Uf)、R7：相對於吸引時皮膚延伸長度的即時性(瞬間的)收縮率=收縮時的彈性率(R7=Ur/Uf)。R2表示整體的彈力，完全彈性體為1.00，人皮膚為0.3至0.5。R7為返回彈性比率，越接近1則彈性越好，人皮膚為0.3至0.5。

另一方面，在本發明的方法中，測定基因量或蛋白質量作為皮膚角質層試樣中的NGAL的表現量。在此，作為皮膚試樣者，較佳係包含人的表皮角質層的皮膚試樣，作為方法者，採用將黏著性膠帶黏貼於皮膚上，在 將其剝離時，將附著於膠帶上的角質層作為試樣的膠帶剝離法對患者的負擔少而較佳。

在將皮膚試樣中的NGAL作為基因試樣而進行測定時，可舉出例如RT-PCR法等。另外，NGAL基因的定量可藉由實時(real time)RT-PCR進行。作為NGAL蛋白質的測定手段者，可採用例如免疫染色等。用於進行測定的抗NGAL抗體及其標記物可使用市售品。

在免疫染色時，可藉由例如螢光免疫染色進行測定。可藉由例如以市售的測定裝置和軟體來將螢光強度進行定量來進行NGAL的定量。

另外，較佳作為含有上述抗NGAL抗體、其標記物、第2抗體、標記第2抗體等的ELISA試劑盒。進一步，可作為與用於分析的緩衝液等組合而成的檢查試劑盒。

[實施例]

下面舉出實施例來詳細說明本發明，但本發明並不受限於這些實施例。

1. 皮膚黏彈性和NGAL的測定 A. 方法 (1)試驗對象

健康女性45歲至69歲(37名)

(2)使用CUTOMETER的黏彈性測定

在臉部右側臉頰部上統一測定部位來測定黏彈性。測定使用CUTOMETER MPA 580，使用附帶的探測器，以吸引徑6毫米，300mb吸入壓力吸引5秒鐘的模式進行。

B. NGAL的測定 ‧角質層採集

從被測試者的臉頰部使用一片2.5cm×2.5cm的角質層測試片(checker)(朝日化工技術實驗室公司(Asahi Techno Lab)製)進行剝離，採集角質層。

‧角質層萃取方法

向納入了玻璃珠與500μl的T-PER緩衝液(# 78510/Thermo SCIETIFIC)的試管中添加採集了角質層的角質層測試片，使用珠型細胞破碎裝置(Tommy)，以4600rmp、180秒萃取角質層蛋白。

‧角質層中總蛋白量的測定

各樣品的蛋白量使用皮爾斯BCA蛋白測定試劑盒(Pierce BCA protein Assay Kit)(Thermo Scientific # 23225)來測定。在測定中，向角質層樣品10μl中添加以試劑A：試劑=50：1混合而成的液體200μl，以60℃ 30分鐘孵育之後，以562nm的吸光度進行測定。同時，以精製牛血清白蛋白為標準品作出標準曲線，由吸光度的值計算蛋白量。

‧角質層中NGAL量的測定

各樣品的NGAL表現量，使用市售的ELISA試劑盒(R & D系統# DY1757)，利用夾心(Sandwich)ELISA法藉由以下標準進行測定。

(1)吸附抗體的固定化

向96孔板(COSTAR # 3590)以100μl/孔添加下述液體：以使最終濃度成為2.0μg/ml之方式使用PBS(-)(WAKO # 16219321)稀釋大鼠NGAL(大鼠抗脂質運載蛋白-2部分842271(rat anti-Lipocalin-2 Part 842271))而得之液體；並在25℃、氧/氮混合環境下進行孵育。

(2)阻斷

添加使用蒸餾水稀釋為10倍而成的稀釋液(R & D # 890803)300μl/孔，在25℃下孵育1小時。

(3)樣品添加

分別以100μl/孔添加標準曲線製作用的基因重組NGAL(重組人脂質運載蛋白-2部分842273(recombinant human Lipocalin-2 Part 842273))、人角質層萃取液(以2倍的T-PER緩衝液稀釋)，在25℃下孵育2小時。

(4)檢測用抗體反應

將藉由稀釋液使其最終濃度變為100ng/ml的方式稀釋生物素標記的山羊抗人脂質運載蛋白-2(部分842272)(biotinylated goat anti-human Lipocalin-2(Part 842272))而成的反應液以100μl/孔進行添加，在25℃孵育2小時。

(5)鏈黴親和素-HRP反應

將藉由試劑稀釋劑稀釋為200倍的鏈黴親和素-HRP (部分890803)(Streptavidin-HRP(Part 890803))以100μl/孔進行添加，在25℃下孵育20分鐘。

(6)TMB反應

將TMB單溶液(Promega公司# G7431)以100μl/孔進行添加，在25℃下孵育7.5分鐘。

(7)反應終止液的添加與藉由吸光光度計的測定

以100μl/孔添加0.5N的H₂SO₄(Wako # 198-09595)，使反應停止，使用SPECTRA MAX 190(分子裝置)測定450nm-540nm的吸光度。

另外，在進行步驟(2)至(6)之前使用清洗用緩衝液(0.05%Tween20/PBS)進行板的清洗。

作為角質層中NGAL量，藉由萃取液中的總蛋白量進行校正，以每單位蛋白量的NGAL量進行表示。

C. 結果

黏彈性與NGAL的關聯解析

關於黏彈性和NGAL的測定結果，進行了皮爾遜(Pearson)的單關聯分析，求出單關聯回歸方程式與關聯係數。散點圖和回歸方程式顯示於第2圖、第3圖中。

R2的黏彈性參數與NGAL測定值的關聯係數r=0.319、R7的黏彈性參數與NGAL測定值的關聯係數為r=0.303。由此解析結果，皮膚角質層的NGAL測定結果明顯可代替藉由CUTOMETER所測定的皮膚的黏彈性參數R2、R7。

即，能夠代替皮膚的黏彈性的物理性的測定結果，藉由測定NGAL來評價皮膚的黏彈性。

2. 作為老化指標的NGAL的利用

進行了能不能將NGAL的測定結果作為老化指標而利用的試驗。

與前述1.的試驗同樣地測定97名健康女性的臉頰部的NGAL，為了確認有無與年齡的關聯，關於年齡與NGAL值，進行利用了皮爾遜方法的2元配置的關聯分析。將散點圖、一次回歸方程式、關聯係數顯示於第5圖中。

能夠確定年齡與NGAL值存在負的關聯。另外，如上所述，觀察到皮膚的黏彈性與NGAL中存在正的關聯，所以可知可將NGAL作為老化的指標而利用。

本案代表圖無元件符號及其所代表之意義。

Claims (4)

1. 一種皮膚黏彈性之評價方法，係測定皮膚角質層的NGAL的表現量。
2. 一種皮膚黏彈性之評價方法，係包括：採集被測試者的皮膚角質層的採集步驟、測定藉由前述採集步驟所採集的角質層的NGAL的表現量的測定步驟、由藉由前述測定步驟所測定的NGAL的表現量來求出皮膚黏彈性的步驟。
3. 如申請專利範圍第2項所述的評價方法，其中，採集皮膚角質層的步驟為利用膠帶剝離法進行者。
4. 一種皮膚老化之評價方法，係測定皮膚角質層的NGAL的表現量。