CN102650639B - 特应性皮炎的检查方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供一种进行特应性皮炎检查的方法，该方法不会对使用者造成负担。通过利用胶带剥离法等，无创伤性地采取皮肤角质层，并测定其中含有的HSP27的含量来诊断特应性皮炎。

Description

特应性皮炎的检查方法

技术领域

本发明涉及一种用于诊断特应性皮炎、判定其治疗效果的检查方法。

背景技术

特应性皮炎是一种表现为皮肤炎症或斑疹、湿疹的疾病。特应性皮炎一般被认为是由容易引起特应型支气管哮喘过敏性鼻炎、皮炎荨麻疹的过敏体质(特应性素质)，再加上各种刺激而产生的伴有瘙痒的慢性皮肤疾病。约8成患者是在5岁以前的幼儿时期发病。先前认为到了学龄儿童期就会自然治愈，然而近年来，一直持续到成年的病例、或成年后发病或复发的病例持续增加。其通常是一种难以治愈的疾病，并且在早期阶段可能会被混同为其他皮炎的患者。

特应性皮炎(过敏性皮炎)的治疗方法除了类固醇、抗组织胺剂以及其他药物疗法之外，还有照射UVA(紫外线A波)的PUVA疗法等。

由于特应性皮炎会反复恶化、缓解，因此，难以判定治疗效果或判断治疗进展，期望能够开发出一种新的诊断法。近年来，提出了一种着眼于特应性皮炎患者的皮肤中的各种基因表达的变化或各种免疫相关物质的变化从而进行特应性皮炎诊断的方法。例如，在专利文献1中，提出一种测定人的角质层的白介素1、白介素1的受体或拮抗剂的变化从而进行诊断的方法。在专利文献2中，提出一种测定臂板蛋白(Semaphorin)3A的基因表达从而进行诊断的方法，其中，臂板蛋白3A是抑制神经轴突的伸长的因子。在专利文献3中，通过分析在特应性皮炎患者的皮肤中异常增加或异常减少的蛋白质，确定了23种蛋白质，提出了一种通过分析这些蛋白质的表达或基因变化，从而对特应性皮炎进行诊断的方法。目前各种诊断方法或检查方法仍在探索中。

[现有技术文献]

(专利文献)

专利文献1：日本特开平10-2213400号公报

专利文献2：日本特开2008-107275号公报

专利文献3：国际公开第2007/046463号公报

发明内容

[发明所要解决的问题]

本发明的目的在于提供一种可以准确地对特应性皮炎的诊断或进展进行诊断的检查方法。

[解决问题的技术手段]

本发明人着眼于热休克蛋白中的一种热休克蛋白27(HSP27)，测定健康者的皮肤及特应性皮炎患者的疾患处、非疾患处中的HSP27表达水平，结果发现：与健康者相比，特应性皮炎患者的HSP27表达水平较高，并且，在特应性皮炎患者未显现特应症状的部位中的HSP27表达水平较少。基于这种认识，发现：测定皮肤样本中的HSP27，即可诊断特应性皮炎的诊断或治疗进展等，从而完成了本发明。

也就是说，本发明为如下构成：

(1)一种特应性皮炎的检查方法，其特征在于：测定皮肤样本中的热休克蛋白27，并与事先测定的正常皮肤样本的热休克蛋白27的测定值进行对比。

(2)根据(1)所述的检查方法，其中，皮肤样本为皮肤角质层。

(3)根据(1)或(2)所述的检查方法，其中，皮肤样本是利用剥离操作由人的皮肤而得到的。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的检查方法，其中，热休克蛋白27的测定采用蛋白质印迹法。

[发明的效果]

利用本发明的检查方法，能够正确判定反复恶化、缓解的特应性皮炎的治疗进展、治疗效果等。并且，可以预测发病。而且，也很容易采取检查对象的皮肤样本，可以减少患者的负担，简便地进行检查。

附图说明

图1是将特应性皮炎的症状与人的皮肤中的HSP27的量对应表示的图。表明HSP27随着特应性皮炎的症状的恶化而增加。

具体实施方式

已知HSP对细胞加热产生反应而进行表达，并且已知这种表达是由对于例如细菌感染或炎症、酒精、活性氧、重金属、紫外线、饥饿及低氧等的细胞的各种应激反应而衍生出来的。核内蛋白质热休克转录因子(HSF)通过与DNA上的热休克元件(HSE)结合，作为控制HSP表达的转录因子发挥作用，然而关于因热应力而诱导HSF的详细机制并不十分明确。在与特应性皮炎的关系中，已知HSP60或HSP70、HSP90等高分子HSP会发生变化，然而，却完全不知低分子HSP、即本发明的HSP27也会涉及其中，也没有任何启发性资料。

在本发明的检查方法中，测定皮肤样本中的HSP27的基因量或蛋白质量。在此，皮肤样本优选包含人的表皮的皮肤样本，可以通过活组织检查由人的皮肤上采取。在皮肤上粘贴粘性胶带，并剥离粘性胶带时，将附着在胶带上的角质层作为样本，是减少患者负担的一种方法，这种方法通常称为胶带剥离法。

在将皮肤样本中的HSP27作为遗传样本进行测定时，可以采用诸如RT-PCR法等方法。并且，可以通过实时RT-PCR来进行HSP27基因的定量。作为HSP27蛋白质的测定手段，可以采用如免疫染色等方法。可以使用市售品作为抗HSP27抗体及其标记体用于测定。

当进行免疫染色时，可以通过荧光免疫染色等进行测定。HSP27的定量可以通过利用市售的测定装置和软件对荧光强度等进行定量来实现。

并且，在以本发明作为诊断用药时，优选含有上述抗HSP27抗体及其标记体、第二抗体、标记第二抗体等。而且，也可以是组合了用于分析的缓冲液等的检测试剂盒。

本发明人在测定健康者的皮肤中的HSP27时，发现所有健康者的皮肤的值均较低。另一方面，确认了诊断为特应性皮炎的患者的表现为皮炎的部位的皮肤中，与健康者相比，HSP27显著增加。即使是同一患者，其未表现为皮炎的部位的皮肤的HSP27虽然低于患部，但高于健康者。因此，通过观察皮肤、尤其是表皮的HSP27的变化量，即可诊断特应性皮炎的进展、治疗效果及治疗进展等。

[实施例]

以下，通过列举实施例来详细地说明本发明，然而，本发明并不限于这些实施例。

A.方法

(1)皮肤角质层采取方法

对诊断为特应性皮炎的4名女性患者，将其表现为皮炎的颈部皮肤，使用角质测试仪(2.5cm×2.5cm：Asahibiomed公司制造)，进行5张胶带剥离，采取角质层。并且，在从未表现为皮炎症状的上臂部皮肤上，同样地进行了取样。

同样地，从3名健康女性的颈部皮肤、上臂部皮肤上进行取样，作为对照。

(2)皮肤角质层中蛋白质提取方法

向均质化用管中采取1％SDS/PBS(-)200ul，并向其中装入进行了上述胶带剥离的角质层检测工具，通过使用均质用研棒摩擦粘着面，从胶带的角质层中提取出蛋白质。

(3)皮肤角质层蛋白质的定量

利用DC Protein Assay Kit(Bio-Rad制造)，对角质层提取液中所含的蛋白质量进行定量。

(4)利用蛋白质印迹法定量HSP27

使用XP PANTERA Gel(5-20％梯度胶：DRC公司制造)通过SDS-PAGE将1.5μg的角质层蛋白质分离，然后，将蛋白质转录到PVDF膜上，通过StartingBlock Blocking Buffer(Thermo Scientific公司制造)进行了封闭。将一级抗体(Hsp27 Polyclonal Antibody：Stressgen公司制造)稀释1000倍，将二级抗体(Goat anti-mouse IgG：invitrogen公司制造)稀释10000倍，并使其反应，然后，使用ECLplus(BD Bioscience公司制造)，在LAS-4000mini(富士胶片公司制造)中进行检测。利用Science Lab 2004 Multi Gauge(富士胶片公司制造)对所获得的波段的发光强度进行了数字化。将发光信号的强度作为HSP27的相对量进行了评价。

B.结果

将特应性皮炎患者(AD)以及健康者皮肤角质层的HSP27发光强度(AU)测定的结果显示于表1、图1。

[表1]

根据图1可知，健康者的角质层中几乎不存在HSP27，而从特应性皮炎患者的患部皮肤中检测出了HSP27。并且，从特应性皮炎患者的正常皮肤中检测出的HSP27，少于表现为皮炎的部位，但与正常人相比浓度较高。根据以上的结果，确认了通过测定HSP27能够实现特应性皮炎的正确诊断，并成为治疗效果的指标。并且，明确了通过定期性地测定HSP27，可以对未表现为皮炎但携带有过敏疾病的患者或幼儿的特应性皮炎的发病进行预测，从而能够对先前仅限于对症疗法的特应性皮炎进行预防性治疗。

Claims (4)

1.热休克蛋白27用于制备检查特应性皮炎的制剂的用途，其特征在于：测定皮肤样本中的热休克蛋白27，并与事先或同时测定的正常皮肤样本的热休克蛋白27的测定值进行对比。

2.根据权利要求1所述的热休克蛋白用于制备检查特应性皮炎的制剂的用途，其特征在于，皮肤样本为皮肤角质层。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的热休克蛋白用于制备检查特应性皮炎的制剂的用途，其特征在于，皮肤样本是利用剥离操作由从人体皮肤上得到的。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的热休克蛋白用于制备检查特应性皮炎的制剂的用途，其特征在于，热休克蛋白27的测定采用蛋白质印迹法。