EA007611B1

EA007611B1 - Белок, имеющий в своей структуре цистиновые узлы

Info

Publication number: EA007611B1
Application number: EA200400813A
Authority: EA
Inventors: Марк Дуглас Дэйвис; Кристофер Бенджамин Фелпс; Ричард Джозеф Фэйган; Кристин Пауэр; Мелани Йорк; Марк Ибберсон
Original assignee: Арес Трейдинг С.А.
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2006-12-29
Also published as: WO2003055911A8; EP1463754A2; JP2005528336A; WO2003055911A3; CN1620466A; IL162592A; KR20040089093A; MXPA04006062A; EP1463754B1; IL162592A0; US20050186663A1; GB0130738D0; CA2470781A1; AU2002353207B2; US7619065B2; ES2306802T3; WO2003055911A2; EA200400813A1; DE60227002D1; AU2002353207A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к новому белку INSP002, идентифицированному в настоящей заявке как секретируемый белок, т.е. как член семейства DAN, относящегося к суперсемейству цитокинов, имеющих в своей структуре цистиновые узлы, и к применению этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты кодирующих генов для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.

Description

Настоящее изобретение относится к новому белку ΙΝ3Ρ002, идентифицированному в настоящей заявке как секретируемый белок, т.е. как член семейства ΌΆΝ, относящегося к суперсемейству цитокинов, имеющих в своей структуре цистиновые узлы, и к применению этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты кодирующего гена для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.

Все цитируемые публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте введены в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин функциональная геномика применяется к способам использования средств биоинформатики для определения функций исследуемых последовательностей белков. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научно-исследовательских лабораторий, занимающихся определением функций этих последовательностей белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных для этих последовательностей.

Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков настоящего изобретения, могут давать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности.

Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, для их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной.

Общее описание секретируемых белков

Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки, является главным фактором во многих биологических процессах. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками посредством слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида. Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембрано-ассоциированный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые нацелены на секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или более трансмембранных доменов. Примерами секретируемых белков, которые играют главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса (адгезивные молекулы), протеазы и факторы роста и дифференцировки.

Факторы роста представляют собой относительно большую группу полипептидов, которые обладают общей способностью индуцировать размножение клеток как ίη νίνο, так и ίη νίΐτο. Факторы роста отличаются от классических эндокринных гормонов, таких как инсулин или гормон роста, по двум своим важным механизмами действия. Во-первых, эндокринные гормоны обычно синтезируются в конкретных железах (таких как поджелудочная железа, в случае инсулина), тогда как факторы роста часто синтезируются в клетках и тканях различных типов. Во-вторых, классические эндокринные гормоны высвобождаются в физиологические жидкости в области их синтеза и переносятся в кровотоке в их ткань-мишень. Важные отличительные свойства факторов роста заключаются в том, что в большинстве случаев они действуют только в тех тканях, в которых они синтезируются (см. Нса1111. 1.К. (1993) Сго\\111 Рас1от8, ОхГог4 ишусгЩу Ргс55. ОхГог4, иК, рр.15-33).

Хотя уровень сходства последовательностей факторов роста невысок, однако, по своему структурному и функциональному сходству, они могут быть подразделены на суперсемейства. Примерами таких суперсемейств являются:

(a) гемопоэтические факторы роста, такие как гормон роста, 1Ь-2, 1Ь-4, О-СЗР и ΟΝΤΡ, каждый из которых имеет структурный мотив в виде пучка из четырех спиралей;

(b) члены семейства, имеющие бета-конформацию типа клеверный лист, такие как 1Ь-1-бета, 1Ь-1альфа, РОР и фактор роста кератиноцитов;

(c) ЕОР-подобные факторы роста, такие как ЕОР и ТОР-альфа, каждый из которых имеет иммуноглобулин-подобный домен; и (4) факторы роста, имеющие в своей структуре цистиновые узлы, такие как ΝΟΡ, ТОР-бета, ΡΌΟΡ и гликопротеиновые гормоны.

Факторы роста являются внеклеточными молекулами, и для осуществления своего биологического действия, они взаимодействуют со специфическими высокоаффинными рецепторами, локализованными на плазматических мембранах клеток-мишеней. Характеризация молекул ряда различных рецепторов факторов роста показала, что они могут быть разделены на определенные семейства: тирозинкиназные рецепторы, ассоциированные с О-белком рецепторы, состоящие из семи трансмембранных доменов, и

- 1 007611 серин/треонинкиназные рецепторы. Тирозинкиназные рецепторы отличаются тем, что они имеют внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, обладающий тирозинкиназной активностью. Серин/треонинкиназные рецепторы факторов роста имеют сходство с тирозинкиназными рецепторами, содержащими внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен. Внутриклеточный домен обладает присущей ему серин/треонинкиназной активностью.

Нарушение регуляции факторов роста приводит к ряду патологических состояний, включая, но, не ограничиваясь ими, онкологические заболевания (Вайисс1 М. е! а1. (2001) Сапсег Век. 8ер. 15; 61(18):6747-54, 1)1ак 8. е! а1. (2001) Ргос. Ыа11. Асаб. 8ск И8А. 8ер.11;98(19):10857-62, 1)|а\ап В. е! а1. (2001) Аог1б 1. Иго1. 19(4):225-33), воспалительные заболевания (ЕюссЫ С. (2001) 1.С1ш.1пуек!. Аид; 108(4):523-6, Нобде 8. е! а1. (2001) Векр1го1оду. 8ер.6(3):205-211, ЕепМск 8.А. е! а1. (2001) 1. Апа!. 8ер. 199(Р! 3):231-40), неврологические заболевания (Соорег Ю. е! а1. (2001) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сг И8А 98(18):10439-44, ЕайпекЮск М. е! а1. (2001) Мо1. Се11. №игокс1 18(2):210-20) и метаболические заболевания (У1скегк М.Н. е! а1. (2001) Епбосппо1оду 142(9):3964-73).

Суперсемейство, имеющее в структуре цистиновые узлы

Типичная структура, наблюдаемая у суперсемейства с цистиновыми узлами, основана на присутствии 6 цистиновых остатков, образующих 3 дисульфидных связи. Две из этих дисульфидных связей образуют кольцеобразную структуру, которая пронизана третьей дисульфидной связью (8ип е! а1. 1995). Домены цистиновый узел часто обнаруживают более чем 6 цистиновых остатков. Дополнительные цистиновые остатки обычно используются для образования других дисульфидных связей в домене цистиновый узел или межцепьевых дисульфидных связей во время димеризации.

Это суперсемейство с цистиновыми узлами подразделяется на подсемейство, которое включает гликопротеиновые гормоны (например, фолликолустимулирующий гормон), белки трансформирующего фактора роста-бета (ТСЕ-бета) (например, белок морфогенеза кости 4), белки, подобные тромбоцитарному фактору роста (РЭСЕ-подобные белки) (например, тромбоцитарный фактор роста А), факторы роста нервных клеток (ΝΟΕ) (например, нейротропный фактор головного мозга) и семейство отобранных методом дифференциального скрининга аберрантных генов в нейробластоме (ΩΛΝ) (например, сегЬегик). Суперсемейство ^ΛN включает Сег1, СегЬегик, Сагоп!е, Эгт/СгетЕп. РВЭС, ^ΛN Эап1е и СеСап1 (Маккадие е! а1., Сепек Эеу. 2000 Маг. 15;14(6):627-44; Маккадие & Ао!!оп, ЕМВО 1. 2000 Арг. 17;19(8):174554).

Предполагается, что члены подсемейства ^ΛN способны модулировать действие членов подсемейства белков ТСЕ-бета (Реагсе е! а1., ^еν.В^о1. 1999 Мау 1;209(1):98-110). Более конкретно, возможно, что члены подсемейства ^ΛN способны модулировать действие белков морфогенеза кости (ВМР) в процессе ее развития.

Было обнаружено, что члены подсемейства ^ΛN действуют как антагонисты белков морфогенеза кости (ВМР), которые являются членами подсемейства ТСЕ-бета, входящего в суперсемейство, имеющее домены цистиновый узел (8!ап1еу е! а1., МесЬ.Эеу. 1998 Ос!, 77(2):173-84; Маккадие е! а1. 2000 (кирга); Маккадие 1. & АоИоп Э, 2002 (кирга)). Мономеры ВМР подвергаются гомо- или гетеродимеризации посредством связывания своих доменов цистиновый узел, после чего они взаимодействуют с рецепторами клеточной поверхности. Считается, что члены подсемейства ^ΛN способны связываться с ВМР посредством их собственных доменов цистиновый узел. Это приводит к предотвращению связывания ВМР с его природным партнером по димеризации, в результате чего, ВМР теряет свою способность взаимодействовать со своим сигнальным рецептором, присутствующим на поверхности клетки. Эксперименты, конкретно направленные на ОАА Сег1 и ЭВМ, показали, что они ингибируют действие ВМР4 (Реагсе е! а1., 1999 (см. выше)).

Более ясное понимание функции сегЬегик было достигнуто в результате исследования на связывание (Р1ссо1о 8. е! а1. №1Шге 1999 ЕеЬ. 25;397(6721):707-10). В первых функциональных исследованиях, проводимых на сегЬегик, использовали белок сегЬегик Хепорик 1аеу1к (сег). Микроинжекция мРНК сегЬегик Хепорик в эмбрионах Хепорик показала, что белок сег индуцирует образование эктопических головок в передней эндодерме организатора Спэманна (Вои^теек!ег е! а1. №1Шге 1996 Аид. 15;382(6592):595601; Вои^теек!ег Т. 1п!., 1. Эеу. Вю1. 200, 145(1 8рес №):251-8). Исследования на связывание, проведенные Р1ссо1о и сотрудниками; показали, что белок сегЬегик Хепорик связывается с белками №ба1, ВМР и Ап! через независимые сайты и ингибирует их действие. Более конкретно, эти исследователи обнаружили, что белок сегЬегик обладает высокоспецифичной аффинностью и ингибирующим действием по отношению к Хпг-1 (члену семейства №ба1), ВМР4 (члену семейства ВМР) и Х\гт1-8 (члену семейства Ап!). В этой работе была установлена взаимосвязь сегЬегик, а, следовательно, и других членов семейства ^ΛN с путями эволюции и дифференцировки тканей.

Склерозтин, кодируемый геном 8О8Т, также является членом подсемейства ^ΛN (Вгитко\у е! а1., 2001, Ат. 1. Нит. Сепе!. 68:577-589). Ген 8О8Т ассоциируется со склеростеозом, т.е. склерозирующей дисплазии кости, наследуемой по аутосомно-рецессивному типу. Фенотип, ассоциируемый со склеростеозом, представляет собой прогрессирующее разрастание склетных костей, которое приводит к гигантизму, деформации лица и к ущемлению седьмого и восьмого черепных нервов (Вгцткоте е! а1. 2001 (см. выше)). Взаимосвязь между склеростеозом и 8О8Т была установлена посредством картирования по го

- 2 007611 мозиготности семей, подверженных указанному заболеванию. Вгитко\у и сотрудники идентифицировали сходство между фенотипом, ассоциированным со склеростеозом, и эффектами, ассоциированными с другими членами подсемейства ΌΑΝ. Аргумент в пользу такой взаимосвязи является еще более убедительным, если предположить, что склеростеоз может быть обусловлен потерей негативного регулятора для члена подсемейства ТОР-бета, а более конкретно, ВМР.

Поэтому, идентификация секретируемых белков и, в частности, факторов роста, таких как члены суперсемейства, имеющие в своей структуре цистиновые узлы, в частности, члены подсемейства ΌΑΝ, является крайне необходимой для лучшего понимания основных путей, которые приводят к развитию приведенных выше патологических состояний и ассоциированных с ними заболеваний, приведенных выше, и для разработки более эффективных методов генотерапии или лекарственной терапии указанных заболеваний.

Описание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении функций белка ΙΝ8Ρ002, действующего как секретируемый белок, в частности, как секретируемый белок подсемейства ΌΑΝ, входящего в суперсемейство, имеющего цистиновые узлы в своей структуре.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, который (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:4 или 8ЕО ΙΌ N0:7;

(ίί) представляет собой ее фрагмент, который обладает функцией секретируемого белка, предпочтительно, функцией члена суперсемейства цитокинов с цистиновыми узлами, более предпочтительно, члена подсемейств ΌΑΝ, или который имеет общую с полипептидом (1) антигенную детерминанту; или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (1) или (ίί).

Предпочтительно, полипептид первого аспекта настоящего изобретения:

(ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:6 или 8Е0 ΙΌ Ν0:8;

(ίί) представляет собой его фрагмент, который обладает функцией секретируемого белка, предпочтительно, функцией члена суперсемейства цитокинов с цистиновыми узлами, более предпочтительно, члена подсемейств ΌΑΝ, либо который имеет общую с полипептидами (ί) антигенную детерминанту; или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).

В соответствии с другим вариантом своего первого аспекта, настоящее изобретение относится к полипептиду, который

ί) состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ Ν0:2, 8Е0 ΙΌ Ν0:4, 8ЕО ΙΌ Ν0:6, 8ЕО ΙΌ Ν0:7 или 8Ер ΙΌ Ν0:8;

(ίί) представляет собой его фрагмент, который обладает функцией секретируемого белка, предпочтительно, функцией члена суперсемейства цитокинов с цистиновыми узлами, более предпочтительно, члена подсемейств ΌΑΝ, или который имеет общую с полипептидом (ί) антигенную детерминанту; или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:2, будет далее называться полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002. Полипептид, имеющий последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:4, будет далее называться полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ002. Полипептид, имеющий последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:6, будет далее называться полипептидом ΙΝ8Ρ002. Первые 22 аминокислоты полипептида экзона 1 ΙΝ8Ρ002 представляют собой сигнальный пептид, а последовательности полипептида ΙΝ8Ρ002 без сигнальной последовательности представлены в 8Е0 ΙΌ Ν0:7 и 8Е0 ΙΌ Ν0:8. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:7, будет далее называться полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:8, будет далее называться полипептидом ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида.

ί) содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ Ν0:14;

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:14, представляет собой вариант полипептида ΙΝ8Ρ002. Он идентичен полипептиду ΙΝ8Ρ002, за исключением того, что по сравнению с полипептидом ΙΝ8Ρ002, содержит две аминокислотные делеции в положениях 107 и 108 и одну аминокислотную замену в положении 110. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:14, далее будет называться вариантом полипептида ΙΝ8Ρ002.

Предпочтительно полипептид первого аспекта настоящего изобретения функционирует как член суперсемейства цитокинов, имеющих в своей структуре цистиновые узлы, предпочтительно как член

- 3 007611 подсемейства ΌΆΝ. Термин цитокин с цистиновыми узлами хорошо известен, и специалист с помощью одного из известных анализов, может легко установить, функционирует ли данный полипептид как член суперсемейства цитокинов, имеющих цистиновые узлы в своей структуре.

В частности, специалист с помощью одного из известных анализов может легко установить, функционирует ли данный полипептид как член подсемейства ΌΆΝ, и является ли он антагонистом членов суперсемейства ТСР-бета, в частности, антагонистом ВМР. Для того чтобы определить, функционирует ли полипептид как антагонист ВМР, в качестве системы для анализа может быть использован эмбрион Хепорик, поскольку некоторые ВМР экспрессируются в эмбрионе Хепорик (Сйаид С. е! а1., 1999, Эсус1ортеп! 126:3347-3357, На\\1еу 8. е! а1., 1995, Сепек Ису. 9:2923-2935, Нетта11-Впуаи1ои, А., апй С. Н. Тйоткеп. 1995, Ису. Сепе!. 17:78-89, 1опек СМ. е! а1., 1992, 10 Иеуе1ортеп! 115:639-647). Сверхэкспрессия сигналов ВМР-2/4-класса или ВМР-7-класса в ранней мезодерме индуцирует вентральные пути, в то время как ингибиторы этих сигналов (такие как Хпг3, Сйогйш или РоШк1айп) индуцируют дорсальные пути. Поэтому действие полипептида на эмбриональное развитие может быть использовано для того, чтобы определить является ли данный полипептид антагонистом ВМР.

Используемый термин полипептид ΙΝ8Ρ002 включает полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002, полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида, полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ002, полипептид ΙΝ8Ρ002 или полипептид ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида, а также полипептиды, состоящие из полипептида экзона 1 ΙΝ8Ρ002, полипептида экзона 1 ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида, полипептида экзона 2 ΙΝ8Ρ002, полипептида ΙΝ8Ρ002, полипептида ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида или варианта полипептида ΙΝ8Ρ002.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид первого аспекта настоящего изобретения.

При этом предпочтительно, чтобы указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержала последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1 (кодирующую полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002), в 8еО ΙΌ ΝΘ:3 (кодирующую полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ002), в 8еО ΙΌ ΝΘ:5 (кодирующую полипептид ΙΝ8Ρ002) или в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:13 (кодирующую вариант полипептида ΙΝ8Ρ002), или представляла собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из этих последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1 (кодирующей полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002), в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:3 (кодирующей полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ002), в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:5 (кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ002) или в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:13 (кодирующей вариант полипептида ΙΝ8Ρ002), или представляющей собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из этих последовательностей.

В соответствии с одним из вариантов этого аспекта настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты не содержит 5'-нетранслируемую область, расположенную выше последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002 и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ002 (нуклеотиды 1-151 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ:5). В соответствии с этим вариантом настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно, содержит нуклеотиды 152-475 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1 или нуклеотиды 152-721 8ЕО ΙΌ ΝΘ:5. Настоящее изобретение, кроме того, относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидов 152-475 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1 или нуклеотидов 152-721 8ЕО ΙΌ ΝΘ:5. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ΙΝ8Ρ002 без 5'-нетранслируемой области (нуклеотиды 152-721 8ЕО ΙΌ ΝΘ:5), представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:11, а нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002 без 5'-нетранслируемой области (нуклеотиды 152-475 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1), представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:12.

В соответствии с другим вариантом этого аспекта настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты не кодирует сигнальный пептид, расположенный в начале полипептида экзона 1 ΙΝ8Ρ002 и полипептида ΙΝ8Ρ002 (нуклеотиды 152-217 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ:5). В соответствии с этим вариантом настоящего изобретения, очищенная молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно, содержит нуклеотиды 218-475 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1 (кодирующие полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида) или нуклеотиды 218-721 8ЕО ΙΌ ΝΘ:5 (кодирующие полипептид ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида). Настоящее изобретение, кроме того, относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидов 218-475 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1 (кодирующих полипептид ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида) или нуклеотидов 218-721 8ЕО ΙΌ ΝΘ:5 кодирующих полипептид ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида). Нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый полипептид ΙΝ8Ρ002 (8ЕО ΙΌ ΝΘ:7), представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:9, а нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ002, представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΘ:10.

В соответствии с другим вариантом этого аспекта настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты не содержит 5'-нетранслируемую область, расположенную выше последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида ΙΝ8Ρ002 (нуклеотиды 1-68 8ЕО ΙΌ ΝΘ:13). В соответствии с этим вариантом настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно, содержит нуклеотиды или состоит из нуклеотидов 69-719 8ЕО ΙΌ ΝΘ:13. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант полипептида ΙΝ8Ρ002 без 5'-нетранслируемой области

- 4 007611 (нуклеотиды 69-719 ЗЕО ΙΌ N0:13) представлена в ЗЕО ГО N0:15.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному вектором четвертого аспекта настоящего изобретения.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с полипептидом первого аспекта настоящего изобретения, обладающим активностью цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, и который, предпочтительно, ингибирует такую активность. При этом предпочтительно, чтобы лиганд ингибировал функцию полипептида первого аспекта настоящего изобретения, который является членом подсемейства ΌΑΝ цитокинов, имеющих цистиновые узлы в своей структуре. Лиганды для полипептида настоящего изобретения могут образовывать различные формы, включая природные или модифицированные субстраты, ферменты, рецепторы, небольшие органические молекулы, такие как небольшие природные или синтетические органические молекулы, имеющие молекулярную массу до 2000 Да, предпочтительно, 800 Да или менее, пептидомиметики, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, антитела, структурные или функциональные миметики приведенных выше соединений. В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое эффективно модифицирует экспрессию природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или регулирует активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения.

Соединение седьмого аспекта настоящего изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида. Важно отметить, что идентификация функции полипептида ΙΝ8Ρ002 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний.

В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду пятого аспекта настоящего изобретения, или к соединению шестого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики. Эти молекулы могут быть также использованы для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения клеточно-пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний.

В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у человека, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или уровня активности полипептида первого аспекта настоящего изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют ίη νίΐτο. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания.

В соответствии с девятым и десятым аспектами настоящего изобретения расстройством или заболеванием, предпочтительно, является расстройство или заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, предпочтительно, члена подсемейства ΌΑΝ. Заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с аберрантными уровнями лиганда для цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, предпочтительно, для члена подсемейства ΌΑΝ. Так, например, таким заболеванием или расстройством может быть расстройство или заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями члена суперсемейства ТОР-бета. В частности, указанным заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с ΒΜΡ, такое как невропатия, нефропатия, такая как диабетическая нефропатия, рак, заживление ран, фиброз, остеопения, остеопороз, переломы и склеростеоз.

Предпочтительный способ детекции полипептидов первого аспекта настоящего изобретения включает стадии;

(a) контактирования лиганда шестого аспекта настоящего изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.

- 5 007611

Что касается девятого аспекта настоящего изобретения, то каждому специалисту известно, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точечную мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы, в которых используются антитела. Аналогичные методы могут быть использованы в течение коротких или продолжительных промежутков времени, что позволяет наблюдать за терапевтическим лечением заболевания пациента. Настоящее изобретение также относится к набору, который может быть использован в указанных методах диагностики заболевания.

В десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида первого аспекта настоящего изобретения в качестве секретируемого белка. Предпочтительно, настоящее изобретение относится к применению полипептида первого аспекта настоящего изобретения в качестве цитокина, более предпочтительно, в качестве цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, в частности, в качестве члена подсемейства ΌΑΝ цитокинов, имеющих цистиновые узлы в своей структуре.

В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид первого аспекта настоящего изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектор четвертого аспекта настоящего изобретения, или клетку-хозяина пятого аспекта настоящего изобретения, или лиганд шестого аспекта настоящего изобретения, или соединения седьмого аспекта настоящего изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

В двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к клетке-хозяину пятого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду шестого аспекта настоящего изобретения, или к соединению седьмого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для производства лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний.

В тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида первого аспекта настоящего изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектора четвертого аспекта настоящего изобретения, или лиганда шестого аспекта настоящего изобретения, или соединения седьмого аспекта настоящего изобретения.

В соответствии с двенадцатым и тринадцатым аспектами настоящего изобретения заболеванием является, предпочтительно, заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, а предпочтительно, члена подсемейства ΌΑΝ. Таким заболеванием может быть заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями лиганда для цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, а предпочтительно, лиганда для члена подсемейства ΌΑΝ. Так, например, таким заболеванием может быть заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями члена суперсемейства ТС Е-бета. В частности, указанным заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с ВМР, такое как невропатия, нефропатия, такая как диабетическая нефропатия, рак, заживление ран, фиброз, остеопения, остеопороз, переломы и склеростеоз.

Для заболеваний, при которых у пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или при которых активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И, наоборот, для заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или при которых активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.

В четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным или к дефицитным по данному полипептиду животным, которые не являются человеком и которые были трансформированы так, чтобы они экспрессировали более высокие или более низкие уровни или вообще не экспрессировали полипептида первого аспекта настоящего изобретения. Такие трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний, и могут быть также использованы в способах скрининга для идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики такого заболевания.

Краткое описание стандартных способов и методик, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, приводится ниже. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь в целях опи

- 6 007611 сания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.

В данном описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.

Если не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы, стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области.

Более полное описание таких методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы для консультации, приводятся в следующих работах: 8атЬгоок Мо1еси1аг С1ошпд; А ЬаЬога1огу Мапиа1, 8есопб Εάίΐίοη (1989); ΌΝΑ С1ошпд, Уо1итек I аиб II (Ό.Ν С1оуег еб. 1985); О11допис1ео11бе 8уп1йек1к (М.1. Сай еб. 1984); ШсЫс Ас1б НуЬпб|/а1юп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нщфпк ебк. 1984); Тгапкспрйоп апб Тгапк1а1юп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нфщпк ебк. 1984); Ашта1 Се11 СиНиге (Κ.Ι. Егекйпеу еб. 1986); 1ттоЬб|/еб Се11к апб Епхутек (1КЬ Ргекк, 1986); Β. РегЬа1, А Ргасбса1 Сшбе 1о Мо1еси1аг С1ошпд (1984); 1йе Ме1йобк ш Еп/уто1оду кепек (Асабетк Ргекк, 1пс.), екрес1а11у уо1итек 154 & 155; Сепе ТгапкГег Уес1огк Гог Маттайап Се11к (1.Н. Мй1ег апб М.Р. Са1ок ебк. 1987, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу); 1ттипосйет1са1 Мебюбк ш Се11 апб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апб Аа1кег, ебк. 1987, Асабепйс Ргекк, Бопбоп); 8сорек, (1987) Рго1ет Рипйсабоп: Рппс1р1ек апб Ргасбсе, 8есопб Ебйюп (8рппдег Уег1ад, Ν.Υ.); апб НапбЬоок оГ Ехрептеп1а1 1ттипо1оду, Уо1итек 1-1У (Э.М. Аей апб С.С. В1аск\\'е11 ебк. 1986).

Используемый термин полипептид включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами. Этот термин относится к коротким цепям (пептидам или полипептидам) и к более длинным цепям (белкам).

Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка, либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препро-белка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препро-части этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах пре-, про- или препро-последовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность, либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.

Полипептид первого аспекта настоящего изобретения может образовывать часть гибридного белка. Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или более дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, про-последовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, например, к соединению, увеличивающему время полужизни полипептида (например, к полиэтиленгликолю).

Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных специалистам в данной области. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и АЭР-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование СР1-якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование и убихитинизация.

Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбокси-концы. Действительно, блокирование амино- или карбокси-конца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения.

Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев, будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептида, которые получены рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будет определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в амино

- 7 007611 кислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, картины гликозилирования могут варьироваться у различных типов клеток-хозяина.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов.

Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептидам ΙΝ8Ρ002. Два полипептида могут быть определены термином гомологичные, если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин идентичность означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин сходство означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко определена. (СотрЩайопа1 Мо1еси1аг Βίοίοβν. Ьекк, А.М., еб., ОхГогб Ишуегайу Ргекк, Νο\ν Уотк, 1988; Вюсошрийпд. БчГогтаОск апб Сепоте Ргсдеск, 8тйй, И.^., еб., Асабетю Ргекк, №\ν Уотк, 1993; СотрШет Апа1ук1к о! 8ециепсе Пай, Рай 1, Спйш, А.М., апб Спйш, Н.С., ебк., Нитапа Ргекк, №\ν кткеу, 1994; 8ес.|иепсе Апа1ук1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Нещ)е, С., Асабетю Ргекк, 1987; апб 8ециепсе Апа1ук1к Рптет, СпЬккоу, М. апб Пеуегеих, 1., ебк., М 81оскЮп Ргекк, №\ν Уотк, 1991).

Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых они происходят), и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов Ш8Р002. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно, консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между А1а, Уа1, Ьеи и 11е; между Зет и ТНг; между кислотными остатками Акр и С1и; между Акп и С1п; межу основными остатками Ьук и Агд; или между ароматическими остатками Рйе и Туг. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, т.е. от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются молчащие замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков включают группу-заместитель.

Обычно считается, что два полипептида, имеющие более чем 30% идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения имели степень идентичности последовательности полипептида Ш8Р002 или его активных фрагментов, составляющую более 35%. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% или более соответственно.

Функционально эквивалентными полипептидами первого аспекта настоящего изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или более методов сопоставления структур. Так, например, для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности полипептидам Ш8Р002, делается предположение, что они обладают активностью секретированной молекулы, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностями полипептида Ш8Р002, может быть использована технология информационной обработки потока данных для генома (1прйаттайса Сепоте Тйгеабег), которая составляет один из аспектов методов поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Вюрепбшт (см. совместно рассматриваемую заявку на патент Великобритании, РСТ/СВ01/01105). Термин значительная структурная гомология означает, что технология 1прйагтайса Сепоте Тйтеабег позволяет предсказать, с достоверностью 10% и выше, что два белка имеют структурную гомологию.

Полипептиды первого аспекта настоящего изобретения также включают фрагменты полипептидов Ш8Р002 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептидов Ш8Р002, при условии, что эти фрагменты сохраняют активность цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, а предпочтительно, активность члена подсемейства ΟΛΝ, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, либо они имеют антигенную детерминанту, общую для полипептидов Ш8Р002.

Используемый здесь термин фрагмент означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептидов Ш8Р002, либо одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать, по крайней мере п смежных аминокислот последовательности, и в зависимости от конкретной последова

- 8 007611 тельности, η, предпочтительно, равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.

Указанные фрагменты могут присутствовать в свободной форме, т.е. не являться частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или про-полипептидную область, присоединенную к амино-концу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. При этом в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов.

Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие, по крайней мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для специалиста, такие антитела, помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств.

Термин иммуноспецифический означает, что антитела имеют, в основном, более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам известного уровня. Используемый здесь термин антитело означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как ЕаЬ, Е(аЬ')₂ и Εν, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения.

Под понятием значительно более высокая аффинность подразумевается заметно повышенная аффинность к полипептиду настоящего изобретения по сравнению с аффиностью известных секретируемых белков.

При этом, предпочтительно, чтобы аффинность к полипептиду настоящего изобретения, по крайней мере, в 1,5, 2, 5, 10, 100, 10³, 10⁴, 10⁵ или 10⁶ раз превышала аффинность к известным секретируемым белкам, таким как цитокины, имеющие цистиновые узлы в своей структуре, в частности, таким как члены подсемейства ΌΆΝ.

Если желательно использовать поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано полипептидом первого аспекта настоящего изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Затем связанный полипептид может быть использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например, иммуноаффинной хроматографией.

Моноклональные антитела против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения могут быть легко продуцированы любым специалистом. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной техники хорошо известна в данной области (см. например, КоЫег О. & Мййеш, С. №Пиге 256:495-497 (1975); КохЬог е! а1. 1ттипо1оду Тобау 4:72(1983); Со1е е! а1., 77-96, Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1е8 апб Сапсег Тйегару, А1ап К. Ьщк, 1пс. (1985)).

Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, т. е. на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными в данной области, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.

Могут быть также использованы химерные антитела, в которых не-человеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см. например, Ыц е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8а. И8А, 84, 3439 (1987)).

Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их гуманизации, см. 1опе§ е! а1. №!иге, 321, 522 (1986); Уегйоеуеп е! а1. 8аепсе, 239, 1534 (1988); КаЬа! е! а1. 1. 1ттипо1., 147, 1709 (1991); Опееп е! а1. Ргос. ΝηΙί Асаб. 8сг И8А, 86, 10029 (1989); Оогтап е! а1., Ргос. ΝηΙί Асаб. 8а. И8А, 88, 34181 (1991); апб Нобдкоп е! а1, Вю/Тесйпо1оду, 9, 421 (1991)). Используемый термин гуманизованное антитело означает молекулы антитела, в которых аминокислоты СЭК и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но, при этом, оно обладает способностью связываться с донорным антителом.

- 9 007611

В другом альтернативном варианте изобретения, таким антителом может быть биспецифическое антитело, т.е. антитело, имеющее два различных антиген-связывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.

Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами настоящего изобретения, либо из набора ПЦР-амплифицированных У-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки необученных лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (МсСаГГсПу 1. с1 а1. (1990), №Шгс 348, 552-554; Магкк 1. с1 а1. (1992), Вю1сс1то1оду 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также увеличена путем перестановки цепей (С1аск§ои Т. с1 а1. (1991), №1Шгс 352, 624-628) .

Антитела, генерированные описанными выше методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, т. е. они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ЕЬ18А). Для этих целей антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.

Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидные последовательности, представленные в 51У) ГО ΝΘ:2, 51У) ГО ΝΘ:4, 51У) ГО ΝΘ:7, 51У) ГО ΝΘ:6, 51У) ГО ΝΘ:8 и 51У) ГО ΝΘ:14, и функционально эквивалентные полипептиды. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и для целей, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, предпочтительно, содержат, по крайней мере η смежных нуклеотидов в описываемых последовательностях, и в зависимости от конкретной последовательности, η предпочтительно, равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также включают последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов).

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек или выделение из микроорганизма. РНК-молекулы могут быть, в основном, генерированы путем ίη νίΐτο- или ίη νίνο-транскрипции ДНК-последовательностей.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Θдноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью.

Термин молекула нуклеиновой кислоты также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (ΡΝΑ). Используемый термин ΡΝΑ означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий, по крайней мере, из пяти нуклеотидов, и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые, предпочтительно, заканчиваются лизином. Концевой лизин предает данной композиции растворимость. ΡΝΑ могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно, связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и приостанавливают элонгацию транскрипта (ΝΚΚαι Р.Е. с1 а1. (1993), АпНсаоссг Эгид Эск. 8:53-63).

Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид 8Еф ГО ΝΘ:2, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в 8Еф ГО ΝΘ:1 (нуклеотиды 152-475), и представлена в 8Еф ГО ΝΘ:12. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид 8Еф ГО ΝΟ:7, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в 8Еф ГО ΝΘ:1 (нуклеотиды 218-475), и представлена в 8Еф ГО ΝΘ:10. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид 8Еф ГО ΝΘ:4, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в 8Еф ГО ΝΘ:3. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид 8Еф ГО ΝΘ:6, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в 8Еф ГО ΝΘ:5 (нуклеотиды 152-721), и представлена в 8Еф ГО ΝΘ:11. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид 8Еф ГО ΝΘ:8, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в 8Еф ГО ΝΘ:5 (нуклеотиды 218-721), и представлена в 8Еф ГО ΝΘ:9. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид 8Еф ГО ΝΘ:14, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в 8Еф ГО ΝΘ:13 (нуклеотиды 69-719), и представлена в 8Еф ГО ΝΘ:15.

Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид 8Еф ГО ΝΘ:2, 8Еф ГО ΝΘ:4, 8Еф ГО ΝΘ:7, 8Еф ГО ΝΘ:6, 8Еф ГО ΝΘ:8 или 8Еф ГО ΝΘ:14. Такими молекулами нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид 51У) ГО ΝΘ:2, 51У) ГО ΝΘ:4, 51У) ГО ΝΘ:7, 51У) ГО ΝΘ:6, 51У) ГО ΝΘ:8 или 51У) ГО ΝΘ:14,

- 10 007611 могут быть, но не ограничиваются ими, кодирующая последовательность для отдельного зрелого полипептида; кодирующая последовательность для зрелого полипептида вместе с другими кодирующими последовательностями, такими как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препро-полипептидную последовательность; кодирующая последовательность зрелого полипептида с приведенными выше дополнительными кодирующими последовательностями или без них, либо вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и З'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации) и в связывании с рибосомой и обеспечивают стабильность мРНК. Молекулами нуклеиновой кислоты могут также включать вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.

Молекулы нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов первого аспекта настоящего изобретения. Такая молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо указанной молекулой может быть вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, к клеткам или к целым организмам.

Из рассматриваемых вариантов можно отметить варианты, которые отличаются от приведенных выше молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Замены, делеции или инсерции могут быть осуществлены по отношению к одному или более нуклеотидам. Варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также сконструированы методами, в основном, известными в данной области, включая, в зависимости от различных целей, модификацию клонирования, процессинга и/или экспрессии генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки с помощью ПЦР генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т. п.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид первого аспекта настоящего изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным экспрессировать гибридный белок, который будет распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован таким образом, чтобы он содержал сайт расщепления, расположенный между последовательностью полипептида настоящего изобретения и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка.

Молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также антисмысловые молекулы, которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды настоящего изобретения, и поэтому, они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (в результате гибридизации). Антисмысловые молекулы, такие как олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид настоящего изобретения, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и предупреждали ее транскрипцию, в соответствии с методами, хорошо известными специалистам (см. например, Сойеп 1.8., Тгепбк ίη Рйагш. 8ск, 10, 435 (1989), Окапо, 1. Иеигосйет. 56, 560 (1991); О'Соппог, 1. №игосйет 56, 560 (1991); Ьее е! а1. Иис1е1с АсДк Кек 6, 3073 (1979); Соопеу е! а1., 8с1епсе 241, 456 (1988); Иегуап е! а1. 8Депсе 251, 1360 (1991)).

Используемый термин гибридизация означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут контактировать друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются: тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или ВЬОТТО); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (8атЬгоок е! а1.

- 11 007611 [см. выше]).

Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного в данной области (8атЬгоок е! а1. [см. выше]). В основном, гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у \Уа111 С.М. и 8.Б. Вегдег (1987; Ме11юб5 Епхуто1. 152:399-407) и К1шше1 А.Е. (1987; МеШобк Епгушок 152:507-511).

Термин жесткость означает условия реакции гибридизации, которые способствуют ассоциации наиболее сходных молекул, но не ассоциации молекул, не обладающих таким сходством. Условия гибридизации высокой жесткости определены как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х 88С (150мМ ЫаС1, 15мМ тринатрийцитрат), 50мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х 88С приблизительно при 65°С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35°С (8атЬгоок е! а1. [см.выше]). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.

В предпочтительных вариантах этого аспекта, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды ΙΝ8Ρ002 (8Еф ГО N0:2, 8Еф ГО N0:4, 8Еф ГО N0:7, 8Еф ГО N0:6, 8Еф ГО N0:8 или 8Еф ГО N0:14), и к молекулам нуклеиновой кислоты, которые, в основном, комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая, по всей своей длине, по крайней мере, на 80% идентична кодирующим последовательностям для 8Еф ГО N0:2 и 8Еф ГО N0:7, представленным в 8Еф ГО N0:1, 8Еф ГО N0:10 и 8Еф ГО N0:12; кодирующей последовательности для 8Еф ГО N0:4, представленной в 8Еф ГО N0:3; кодирующим последовательностям для 8Еф ГО N0:6 и 8Еф ГО N0:8, представленным в 8Еф ГО N0:5, 8Еф ГО N0:9 и 8Еф ГО N0:11; или кодирующим последовательностям для 8Еф ГО N0:14, представленным в 8Еф ГО N0:13 и 8Еф ГО N0:15; либо, чтобы она представляла собой комплементарную им молекулу нуклеиновой кислоты. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по крайней мере на 90%, более предпочтительно по крайней мере на 95%, особенно предпочтительно по крайней мере на 98% или 99% идентичны указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают, в основном, такой же биологической функцией или активностью, что и полипептиды ГО8Р002.

Настоящее изобретение относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, включающему стадии:

(a) контактирования нуклеинового зонда настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (b) детекции любого такого образованного дуплекса.

Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды ГО8Р002, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид.

В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы описанные и обсуждаемые методы, которые приводятся ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и, в основном, доступны в данной области, и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов настоящего изобретения, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Ι, секвеназа (И8 Вюсйет1са1 Согр., С1еуе1апб, ОН), полимераза Тад (Регкш Е1тег), термостабильная полимераза Т7 (Лтегкйат, СЫсадо, 1Ь) или комбинация таких полимераз и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в Е^0N6А8Е АтрШгсаНоп 8у§1ет, и поставляемые 01Ьсо/ВКБ (ОаИйегкЬигд, ΜΌ) . Способ секвенирования может быть, предпочтительно, автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат НатШоп Мюго БаЬ 2200 (НатШоп, Репо. N7), термоячейка РеШег Т11егта1 Сус1ег (РТС200; М1 Еекеагсй, ^а1ейо^п, МА), катализатор АВ1 и ДНК-секвенаторы 373 и 377 ^NА 8ес.|иепсег5 (Регкш Е1тег).

Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептида ГО8Р002, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом с использованием стандартных методик, известных в данной области (см. например, Сштеп! Рго1осо1к ίπ Мо1еси1аг Вю1оду, Аи§цЬе1 е! а1. (ебк). Огеепе РиЬШсЫпд А88ос1а1е8 апб \УПеу 1п1егас1епсе, №\ν Уогк, 1989, 1992). Особенно подходящими являются зонды, содержащие 15, предпочтительно по крайней мере 30, более предпочтительно по край- 12 007611 ней мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена (8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:3, 8ЕО ГО N0:5, 8ЕО ГО N0:9, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:11, 8ЕО ГО N0:12, 8Е0 ГО N0:13 или 8Е0 ГО N0:15). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов специалист может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например отдельных членов семейства, типа и/или подтипа.

Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, т.е. в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет обрезана обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных в данной области методов детекции расположенных выше последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (КАСЕ; см., например, Егойтап е! а1., РNА8 И8А 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, проиллюстрированные Мага1йоп ТМ (С1оп!есй ЬаЬога!ог1ек 1пс.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется сайт-рестрикционной ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров (8агкаг О. (1993) РСК Ме!йобк Аррйс. 2:318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (Тгщйа Т. е! а1. (1988) М.1с1е1с Ас1бк Кек. 16:8186). Другим методом, который может быть использован в данном случае, является ПЦР с захватом, которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (ЕадегкЕот М. е! а1. (1991) РСК Ме!йобк Аррйс. 1, 111119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод Рагкег Ι.Ό. е! а1. (1991) ШсШс Ас1бк Кек. 19:3055-3060). Кроме того, можно использовать ПЦР, гнездовые праймеры и библиотеки Ргото!егЕтбегТМ для прогулки по геномной ДНК (С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон.

При скрининге на полноразмерные ДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека ойдо-б(Т) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'нетранскрибированных регуляторных областей.

В одном из вариантов осуществления изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок, либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением, картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важным звеном в подтверждении корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации, физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. МсКцщск, Мепбейап 1пйегйапсе ίη Мап (имеющейся в настоящее время в 1ойп Норктк ИшуегкИу Ае1сй Мебюа1 ЫЬгагу). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или других методов обнаружения генов. После предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для детекции различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т.п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов с заболеванием.

- 13 007611

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации ίη δΐίυ и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволили получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу.

Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид настоящего изобретения, могут быть также использованы методы отключения гена. Одним из методов, который может быть использован для отключения последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (ΡΝΑί) (Е1ЬазЫг 8.М. с! а1. №11игс 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНК-олигонуклеотиды синтезируют ίη νίίτο и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание этих дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии целевого белка.

Эффективность методов отключения гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), и на РНК-уровне - с помощью методики, основанной на Тас.|Мап.

Векторы настоящего изобретения содержат молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева настоящего изобретения, которые могут быть трансформированы, трансфецированы или трансдуцированы векторами настоящего изобретения, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки-хозяева.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие из них подробно описаны у ЗатЬгоок с! а1. (см. выше) и Есгпапйсх & НосГПсг (1998, сбз. Сспс схргсзвюп 8ув!ст8. Ьыпд па!игс Гог Шс ай оГ схргсзвюп. Асабстк Ргсзз, 8ап Ою^о. Ьопбоп, Воз!оп, №\ν Уогк, 8у4псу, Токуо, Тогоп!о).

Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у 8атЬгоок с! а1. (см. выше). В общих чертах, кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях) и необязательно оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине.

Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусные системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирусы, такие как 8У40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, псевдорабивирусы и ретровирусы, или их комбинации, а также векторы, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные человеческие хромосомы (НАС).

0собенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными зкспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом мозаики табака, ТМУ) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Т1 или рВК322); или клеточные системы животных. Для продуцирования полипептидов настоящего изобретения могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции.

Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид настоящего изобретения, в клетки-хозяева может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство ϋΗνΐδ с! а1. I Ва81с МсШобз ш Мо1сси1аг В1о1оду (1986) и ЗатЬгоок с! а1. [см. выше]. Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная ΌΕΑΕ-декстраном; трасвекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (см. ЗатЬгоок с! а1., 1989, [см. выше], Аи8иЬс1 с! а1. [см. выше],

- 14 007611

Зрес1ог, Оо14тап & Ьет-етаМ, 1998). В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция).

Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид, или лидерную последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду, либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге.

Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и З'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды В1иеЗспр1 (З1га1адепе, Ьа1о11а, СА) или плазмиды рЗрогЙТМ (О1Ьсо ВКЕ) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, КЦВ1ЗСО и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе ЗУ40 или ЕВУ с соответствующим селективным маркером.

Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями, и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под контролем регуляторных последовательностей, т.е. так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, т. е. с сохранением рамки считывания.

Регуляторные последовательности и другие контрольные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт.

Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида, предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора, клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки, успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа.

Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детёнышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (СОЗ), клетки С127, клетки ЗТЗ, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер О2) и ряд других клеточных

- 15 007611 линий.

В бакуловирусной системе материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, йИсг айа, от 1пуЦгодсп. 8ап Ωίοβο СА (набор МахВас). В общих чертах, эти методы известны специалистам и подробно описаны у 8иттегк & 8тйй, Техак Адпси1!ша1 Ехрепшеп! 81аОоп Вийейп № 1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клетки Эгокорййа 82 и клетки 8ройор!ега 8Е9.

В данной области известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в И8 5693506, И8 5659122 и И8 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны 2епк, Рйу!осйеш1к!гу 30, 3861-3863 (1991).

В частности, можно использовать любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты с последующим генерированием из них целых регенерированных растений, которые содержали бы перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, но, не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощных растений.

Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, Е.сой, 8!гер!отусек и ВасШик киЬййк.

Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, 8. сегеу181ае) и клетки АкрегдШик.

Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны в данной области. Примерами являются гены тимидинкиназы (^1§1ег М. е! а1. (1977) Се11 11:223-32) и аденин-фосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Ьо^у I. е! а1. (1980) Се11 22:817-23), которые могут быть использованы в !к- или арП'-клетках соответственно.

Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например, ген дигидрофолатредуктазы (ЭНЕК), который придает резистентность к метотрексату (^1д1ег М. е! а1. (1980) Ргос. №11. Асаб. 8сЕ 77:3567-70); ген пр!, который придает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к С-418 (Со1Ьеге-Сагарт Е. е! а1. (1981) 1. Мо1. Вю1. 150:1-14), и гены а1к или ра!, которые придают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицинацетилтрансферазе соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам.

Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении. Так, например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандема с последовательностью, кодирующей полипептид настоящего изобретения, находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию тандемного гена.

Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид настоящего изобретения, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка, например, сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (ЕАС8) или иммуноанализы (таких как твердофазный иммуноферментный анализ [ЕБ18А] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детекции и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. Нашр!ои К. е! а1. (1990) 8его1од1са1 Ме!йойк, а БаЬогаЮгу Мапиа1, АР8 Ргекк, 8!. Раи1, МК и Маййох Э.Е. е! а1., (1983) 1. Ехр. Мей. 158, 1211-1216).

Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченых зондов для гибридизации или ПЦРзондов для детекции последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды настоящего изобретения, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченного полинуклеотида. Альтернативно, последовательности, кодирующие полипептид настоящего изобретения, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов ίη ν 1(го путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или 8Р6, и меченых нуклеотидов. Эти методики могут быть осуществлены с использованием различных коммерчески доступных наборов (Рйагшааа & Ир) от (Ка1ата/оо, М1); Рготеда (Майкоп XVI) и и.8. В1осйет1са1 Согр., С^е1апй, ОН).

Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения детекции, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или

- 16 007611 хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных, в частности, грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект настоящего изобретения. Такое генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями: для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для генерирования животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов настоящего изобретения.

Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков.

Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть также использованы специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды настоящего изобретения, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков, являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как: гистидин-триптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе ЕЬАО8 удлинение/аффинная очистка (1ттипех Согр., 8еай1е, \УЛ). Для облегчения очистки, между доменом для очистки и полипептидом настоящего изобретения могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (1пу11годеп, 8ап О|едо. СА). Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка, содержащего полипептид настоящего изобретения, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью 1МАС (аффинной хроматографии на иммобилизованном ионе металла, описанной Рога1й 1. е! а1. (1992), Рго1. Ехр. РипГ. 3:263-281), тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов, содержащих гибридные белки, можно найти у Кго11 Ό.Ι. е! а1. (1993; ΌΝΑ Се11 Бю1. 12:441-453).

Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае, клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например, таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть восстановлена для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то перед выделением полипептида клетки должны быть сначала подвергнуты лизису.

Полипептид настоящего изобретения может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из известных методов, применяемых для скрининга лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) уровень экспрессии гена или активность полипептида настоящего изобретения, и поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или регулировать активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения.

Соединения-агонисты или соединения-анатагонисты могут быть выделены, например, из клеток, бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы, либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе Сойдап е! а1., Сштеп! Рго1осо1§ ш 1ттипо1оду 1(2):Сйар1ег 5 (1991).

Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие антагонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом настоящего изобретения, но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом настоящего изобретения и, тем самым, ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может ингибироваться так, чтобы подавлялась нормальная биологическая активность полипептида.

Полипептид настоящего изобретения, который используется в таком методе скрининга, может на

- 17 007611 ходиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе, может присутствовать на клеточной поверхности, либо он может быть локализован внутри клетки. В основном такие методы скрининга предусматривают использование соответствующих клеток или клеточных мембран, экспрессирующих полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию, либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Функциональный ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с контрольными клетками, которые не контактировали с тестируемым соединением. С помощью подходящей системы детекции, такой анализ позволяет определить, может ли тестируемое соединение давать сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного агониста, и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствии тестируемого соединения.

Предпочтительный способ идентификации соединения-агониста или соединения-антагониста по отношению к полипептиду настоящего изобретения включает:

(a) контактирование клетки, экспрессирующей на клеточной поверхности полипептид первого аспекта настоящего изобретения, который ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, и при этом соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом; и (b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом, либо его активации или ингибирования путем измерения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом.

Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста по отношению к полипептиду настоящего изобретения включает:

(a) контактирование клетки, экспрессирующей на клеточной поверхности полипептид, который ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с полипептидом, и при этом соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом; и (b) определение события связывания соединения с полипептидом, либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия соединения с полипептидом, с уровнем сигнала, полученного в отсутствии указанного соединения.

В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут дополнительно включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченного или немеченного лиганда для полипептида.

В другом варианте изобретения способ идентификации агониста или антагониста полипептида настоящего изобретения включает: определение факта ингибирования связывания лиганда с клетками, которые содержат полипептид настоящего изобретения на своей поверхности, или с клеточными мембранами, содержащими такой полипептид, в присутствии соединения-кандидата в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с полипептидом. Считается, что соединение, способное приводить к снижению уровня связывания с лигандом, является агонистом или антагонистом. При этом предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченным.

Более конкретно, способ скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом к полипептиду, включает стадии:

(a) инкубирования меченного лиганда с целой клеткой, экспрессирующей полипептид настоящего изобретения на клеточной поверхности, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид настоящего изобретения;

(b) измерения количества меченного лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной;

(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведение этой смеси до состояния равновесия;

(б) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и (е) сравнения различия в количествах связанного меченного лиганда стадий (Ь) и (б), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (б), считается агонистом или антагонистом.

В вышеописанных анализах может быть установлено, что указанные полипептиды модулируют различные физиологические и патологические процессы дозозависимым способом. Так, например, функциональными эквивалентами полипептидов настоящего изобретения являются полипептиды, которые в приведенных выше анализах обладают той же самой дозозависимой модулирующей активностью. Хотя уровень дозозависимой активности необязательно является идентичным уровню полипептидов настоящего изобретения, однако, предпочтительно, чтобы в данном анализе на активность функциональные эквиваленты обнаруживали в основном такую же аналогичную зависимость от дозы, как и полипептиды настоящего изобретения. В некоторых описанных выше вариантах изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или с помощью анализа на конкуренцию с меченым со

- 18 007611 единением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для детекции на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом.

Могут быть также разработаны анализы для детекции влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей указанный полипептид, в клетках. Так, например, анализ ЕЫ8А может быть разработан так, чтобы можно было измерить секретируемые или клеточноассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами, известными в данной области, и этот анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образования связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением.

Аналитическими способами, которые также входят в объем настоящего изобретения, являются способы, предусматривающие использование генов и полипептидов настоящего изобретения в анализах на сверхэкспрессию или в анализах на исключение. Такие анализы предусматривают манипуляцию с уровнями указанных генов/полипептидов в клетках и оценку влияния этой манипуляции на физиологию клеток, подвергнутых манипуляции. Так, например, такие эксперименты позволяют точно выявить пути передачи сигнала и метаболические пути, в которых участвуют конкретные гены/полипептиды, а также получить информацию относительно идентичности полипептидов, с которыми взаимодействуют исследуемые полипептиды, и найти ключ к разгадке механизмов, с помощью которых регулируются родственные гены и белки.

Другой метод, который может быть использован для скрининга на лекарственные средства, дает возможность осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с нужным полипептидом (см., Международную патентную заявку νθ 84/03564). В этом методе, большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом настоящего изобретения и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование не-нейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными в данной области. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в приведенных выше способах скрининга на лекарственные средства.

Полипептид настоящего изобретения может быть использован для идентификации мембраноассоциированных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной в данной области, такой как анализы на связывание и перекрестное сшивание с лигандом, в которых полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детекцию или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазменный резонанс и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть также использованы для идентификации агонистов и антагонистов указанного полипептида, которые конкурируют с указанным полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны в данной области.

Настоящее изобретение также относится к набору для скрининга, используемому в методах идентификации агонистов, антагонистов, лигандов, рецепторов, субстратов и ферментов, описанных выше.

Настоящее изобретение также относится к агонистам, антагонистам, лигандам, рецепторам, субстратам, ферментам и к другим соединениям, модулирующим активность или антигенность полипептида настоящего изобретения в соответствии с описанными выше механизмами.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение настоящего изобретения в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов, вакцин или в качестве других иммуногенных композиций, подробно описанных ниже.

В соответствии с используемой здесь терминологией, композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение [X], считается в основном не содержащей примесей [здесь, Υ], если по крайней мере 85 мас.% от всего количества Χ+Υ в данной композиции составляет X. Предпочтительно X составляет по крайней мере примерно 90% по общей массе Χ+Υ в данной композиции, более предпочтительно по крайней мере примерно 95, 98 или даже 99 мас.%.

Фармацевтические композиции предпочтительно должны содержать терапевтически эффективное количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, лиганда или соединения настоящего изобретения. Используемый здесь термин терапевтически эффективное количество означает количество тера

- 19 007611 певтического агента, необходимого для лечения, ослабления или профилактики рассматриваемого заболевания или состояния, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализе клеточной культуры, например, опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. Животное-модель может быть также использовано для определения соответствующего интервала концентраций и способа введения. Такая информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку.

Точное эффективное количество соединения для введения индивидууму будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, возраста, массы и пола индивидуума, его режима питания и частоты введения лекарственного средства, а также от комбинации(й) лекарственных средств, чувствительности данного индивидуума на реакцию и его переносимость/восприимчивость к данной терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах, эффективная доза может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для введения терапевтического агента. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что этот носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и что данный вводимый носитель не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.

Используемыми фармацевтически приемлемыми солями могут быть, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в РеттдЮп'к Ρйа^тасеи!^са1 8с1епсек (Маск Ριιό. Со., Ν.Ι 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в указанных композициях могут присутствовать и вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т. п. С помощью таких носителей могут быть получены фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т. п., для перорального введения пациенту.

Композиции настоящего изобретения, после их приготовления, могут быть непосредственно введены индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, в частности человек.

Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть введены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедулярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное введение (см. например, XVО 98/10734), а также подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, кишечное, местное, подъязычное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций настоящего изобретения могут быть также использованы «генные ружья» или безигольные шприцы. В основном, терапевтические композиции могут быть приготовлены в виде растворов для инъекций, либо в виде жидких растворов или суспензий, либо они могут быть получены в виде твердых форм, подходящих для получения растворов или суспензий в жидких носителях перед их введением путем инъекции.

Указанные композиции могут быть непосредственно доставлены, в основном, путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо они могут быть доставлены в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в пораженный участок. При этом лечение может быть проведено по схеме введения разовой дозы или дробных доз.

Если активность полипептида настоящего изобретения превышает активность, требуемую для лечения конкретного патологического состояния, то в данном случае может быть рассмотрено несколько подходов. Θдин из таких подходов включает введение индивидууму вышеописанного соединенияингибитора (антагониста) вместе с фармацевтически приемлемым носителем, где указанный ингибитор вводят в количестве, эффективном для ингибирования функции полипептида, например, блокирования связывания с лигандами, субстратами, ферментами или рецепторами, либо ингибирования вторичного сигнала, и, тем самым, эффективном для ослабления симптомов аномального состояния. Такими антагонистами, предпочтительно, являются антитела. Для минимизации иммуногенности антител, описанных выше, наиболее предпочтительно, чтобы такие антитела были химерными и/или гуманизованными.

В соответствии с другим подходом могут быть введены растворимые формы полипептидов, которые сохраняют аффинность связывания с рассматриваемым лигандом, субстратом, ферментом или рецептором. В основном, такой полипептид может быть введен в виде фрагментов, в которых сохраняются

- 20 007611 соответствующие части.

В альтернативном подходе, экспрессия гена, кодирующего полипептид, может быть ингибирована методами блокирования экспрессии, такими как использование молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты (описанных выше), которые могут быть либо эндогенно генерированы, либо введены отдельно. Модификации экспрессии генов могут быть получены путем конструирования комплементарных последовательностей или антисмысловых молекул (ДНК, РНК или ΡΝΑ) для контролирующих элементов, 5'последовательностей или регуляторных последовательностей (сигнальной последовательности, промоторов, энхансеров и интронов) гена, кодирующего полипептид. Аналогичным образом, ингибирование может быть осуществлено с использованием методики спаривания оснований с образованием тройной спирали. Спаривание с образованием тройной спирали используется потому, что оно приводит к нарушению способности двойной спирали раскрываться так, чтобы это оказалось достаточным для связывания с полимеразой, факторами транскрипции или регуляторными молекулами. Успехи в клинической терапии, достигнутые за последнее время благодаря использованию ДНК-триплекса, были описаны в литературе (Сее РЕ. с1 а1. (1994): НиЬег В.Е. & Β.Ι. Сагг, Мо1еси1аг апб Ιιηιηιιηοίοβίο Лрргоае11С5. РиШга Ριώίίδΐιίη^ Со., М1. К18со, ΝΥ). Комплементарная последовательность или антисмысловая молекула могут быть также сконструированы в целях блокирования трансляции мРНК посредством предотвращения связывания транскрипта с рибосомами. Такие олигонуклеотиды могут быть введены или генерированы ίη 511н в результате экспрессии ίη νίνο.

Кроме того, экспрессия полипептида настоящего изобретения может быть предотвращена с использованием рибозимов, специфичных к мРНК-последовательности, кодирующей этот полипептид. Рибозимы представляют собой каталитически активные РНК, которые могут быть природными или синтетическими (см. например, Иктап Ν. е1 а1., Сигг. 0ρίη. Шгиск Βίο1. (1996) 6(4), 527-33). Синтетические рибозимы могут быть сконструированы так, чтобы они специфически расщепляли мРНК в выбранных положениях и, тем самым, предотвращали трансляцию мРНК в функциональный полипептид. Рибозимы могут быть синтезированы с использованием природного рибозофосфатного остова и природных оснований, обычно присутствующих в РНК-молекулах. Альтернативно, рибозимы могут быть синтезированы с использованием неприродных остовов, например, 2'-О-метил-РНК, в целях защиты от расщепления рибонуклеазой, и эти рибозимы могут содержать модифицированные основания.

РНК-молекулы могут быть модифицированы в целях увеличения внутриклеточной стабильности и времени полужизни. Возможными модификациями являются, но не ограничиваются ими, присоединение фланкирующих последовательностей у 5'- и/или у З'-концов молекулы или использование в указанном остове молекулы фосфортиоата или 2'-0-метила вместо фосфодиэстеразных связей. Эта концепция может рассматриваться и при продуцировании ΡΝΑ и может быть применена ко всем указанным молекулам посредством включения нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и бутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и аналогичные модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина, которые не могут легко распознаваться эндогенными эндонуклеазами.

Для лечения аномальных состояний, ассоциированных с недостаточной экспрессией полипептида настоящего изобретения и его активностью, имеется несколько способов. Один из таких способов предусматривает введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения, которое активирует полипептид, т. е. соединение-агонист, описанное выше, в целях ослабления симптомов патологического состояния. Альтернативно, терапевтическое количество указанного полипептида в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем может быть введено в целях сохранения соответствующего физиологического равновесия данного полипептида.

Для осуществления эндогенного продуцирования у индивидуума данного полипептида соответствующими клетками может быть применена генотерапия. Генотерапию используют для перманентного лечения заболеваний, связанных с аномальным продуцированием полипептида, путем замены дефектного гена правильным терапевтическим геном.

Генотерапия настоящего изобретения может быть осуществлена ίη νίνο или ех νίνο. Для генотерапии ех νίνο требуется выделение и очистка клеток, взятых у пациента, введение терапевтического гена и введение генетически модифицированных клеток обратно пациенту. В противоположность этому, генотерапия ίη νίνο не требует выделения и очистки клеток пациента.

Для введения пациенту, терапевтический ген обычно является упакованным. Носители для доставки генов могут быть невирусными, такими как липосомы, либо они могут представлять собой дефектные по репликации вирусы, такие как аденовирус, описанный Вегкпег К.Ь., Сигг. Τορ. МкгоЬюк Iттиηο1., 158, 39-66 (1992) или векторы на основе адено-ассоциированного вируса (ΑΑν), описанные Ми/ус/ка Ν. Сигг. Τορ. МкгоЬюк ^тимк, 158, 97-129 (1992) и в патенте США № 5252479. Так, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид настоящего изобретения, может быть сконструирована для экспрессии в дефектном по репликации ретровирусном векторе. Затем эта экспрессионная конструкция может быть выделена и введена в упаковывающую клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, кодирующую указанный полипептид, так, чтобы указанная упаковывающая клетка продуцировала инфекционные вирусные частицы, содержащие нужный ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены индивидууму для конструирования клеток ίη

- 21 007611 у1уо и экспрессии полипептид т у1уо (см. Сйар!ег 20 Сепе Тйегару апй оШег Мо1еси1аг Сепейс-Ьакей Тйегареийс Арргоасйек (и цитируемые там ссылки), Нитап Мо1еси1аг Сепейск (1996), Т. 8йасйап & А.Р.Кеай, В1О8 Заепййс РиЬйкйегк Ь!й).

Другим способом является введение оголенной ДНК, где терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровоток или в мышечную ткань.

В случае, когда полипептидами или молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения являются агенты, вызывающие заболевание, настоящее изобретение относится к их возможному применению в вакцинах для вырабатывания антител против указанного агента, вызывающего заболевания. Если приведенный выше полипептид или молекула нуклеиновой кислоты должны быть активированы, то разрабатываемая вакцина должна вырабатывать антитела или Т-клетки против указанных агентов (как описано в АО 00/29428).

Вакцины настоящего изобретения могут быть либо профилактическими (т.е. предназначенными для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. предназначенными для лечения заболеваний после инфицирования). Такие вакцины содержат иммунизирующий(е) антиген(ы), иммуноген(ы), полипептид(ы), белок(ки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с описанными выше фармацевтически приемлемыми носителями, которыми может быть любой носитель, который сам по себе не индуцируют вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию. Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы (адъюванты). Кроме того, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид дифтерии, столбняка, холеры, Н. ру1оп и другие патогены.

Поскольку полипептиды могут разрушаться в желудке, то вакцины, содержащие полипептиды, предпочтительно, вводят парентерально (например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или чрескожной инъекции). Композициями, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данной композиции изотоничность с кровью реципиента, а также водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители.

Вакцинные композиции настоящего изобретения могут быть помещены в упаковки для разовых лекарственных форм или для дробных лекарственных форм. Так, например, эти лекарственные формы могут быть помещены в запаянные ампулы и сосуды и могут храниться в замороженном виде, в которые, непосредственно перед их использованием, необходимо лишь добавить стерильный жидкий носитель. Конкретная доза будет зависеть от удельной активности данной вакцины и может быть легко определена путем рутинного экспериментирования.

Доставка антител, связывающихся с полипептидами настоящего изобретения, методами генотерапии может быть осуществлена, например, как описано в Международной патентной заявке АО 98/55607.

Для получения вакцинных композиций может быть также использована технология безигольного впрыскивания (см., например, \\л\лг.ро\\йег|ес1.сот). Ряд подходящих методов вакцинации и систем для доставки вакцин описаны в Международной патентной заявке АО 00/29428.

Настоящее изобретение также относится к применению молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в качестве диагностических реагентов. Детекция мутированной формы гена, характеризующейся существованием молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, которые ассоциируются с дисфункцией, используется в качестве диагностического средства, которое может облегчать установление диагноза заболевания или установления восприимчивости к заболеванию, возникающему в результате пониженной экспрессии, сверхэкспрессии или измененной пространственной или временной экспрессии данного гена. Индивидуумы, несущие мутации в данном гене, могут быть идентифицированы на уровне ДНК рядом методов.

Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для диагностики, могут быть получены из клеток данного индивидуума, таких как клетки крови, мочи, слюны, биоптата ткани или материала, полученного после аутопсии. Геномные ДНК могут быть использованы непосредственно для детекции либо перед проведением анализа они могут быть амплифицированы ферментативно с использованием ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР), амплификации с замещением цепи (8ΌΑ) или другими методами амплификации (см. 8а1к1 е! а1., Ыа!иге, 324, 163-166 (1986); Ве.) е! а1. Сгй. Кеу. Вюсйет. Мо1ес. Вю1., 26, 301-334 (1991); Вйкептеуег е! а1. 1. У1го1. Ме!й., 35, 117-126 (1991), Уап Вгип!, 1. Вю/Тес1то1оду. 8, 291-294 (1990)).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания у пациента, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид настоящего изобретения, и сравнение полученного уровня экспрессии с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия данного заболевания. Этот способ может включать следующие стадии:

а) контактирование образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиновокислотным зондом в жестких условиях, в результате чего образуется гибридный комплекс между молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения и указанным зондом;

- 22 007611

b) контактирование контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и

c) детекцию присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детекция уровней гибридного комплекса в образце данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, является признаком наличия данного заболевания.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, включающему следующие стадии:

a) получения образцов тканей от пациента, исследуемого на наличие заболевания;

b) выделения молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения из указанного образца ткани; и

c) установления диагноза заболевания у данного пациента путем обнаружения присутствия мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с данным заболеванием.

Для облегчения детекции молекулы нуклеиновой кислоты в описанных выше способах, может быть проведена стадия амплификации, например, с помощью ПЦР.

Делеции и инсерции могут быть детектированы по изменению размера амплифицированного продукта по сравнению с нормальным генотипом. Точечная мутация может быть идентифицирована путем гибридизации амплифицированной ДНК с меченой РНК настоящего изобретения, или альтернативно, с меченой антисмысловой ДНК-последовательностью настоящего изобретения. Полностью соответствующие последовательности могут быть дифференцированы от дуплексов с ошибочным спариванием путем гидролиза РНКазой или путем оценки различий в температурах плавления. Присутствие или отсутствие мутации у пациента может быть определено посредством контактирования ДНК с нуклеиновокислотным зондом, который гибридизуется с ДНК в жестких условиях, в результате чего образуется гибридная двухцепочечная молекула, которая имеет негибридизованную часть цепи нуклеиновокислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и установления присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи нуклеиновокислотного зонда как показателя наличия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации в соответствующей области ДНКцепи.

Такие способы диагностики являются особенно ценными для проведения пренатальных и даже неонатальных тестов.

Точечные мутации и другие отличия между последовательностями эталонного гена и мутантных генов могут быть идентифицированы другими хорошо известными методами, такими как прямое секвенирование ДНК или определение конформационного полиформизма одноцепочечных последовательностей (см. Огйа е! а1., Сепоткк, 5, 874-879 (1989)). Так, например, секвенирующий праймер может быть использован вместе двухцепочечным ПЦР-продуктом или с одноцепочечной матричной молекулой, генерированной с помощью модифицированной ПЦР. Определение последовательности осуществляют в соответствии со стандартными методиками с использованием радиоактивно меченых нуклеотидов или в соответствии с методами автоматического секвенирования с использованием флуоресцентных меток. Клонированные ДНК-сегменты могут быть также использованы в качестве зондов для детекции специфических ДНК-сегментов. Чувствительность этого метода значительно повышается при использовании в комбинации с ПЦР. Кроме того, точечные мутации и другие модификации последовательностей, такие как полиморфизм, могут быть детектированы, как описано выше, например, с использованием аллельспецифических олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации последовательностей, отличающихся одним нуклеотидом.

Различия в ДНК-последовательностях могут быть также детектированы по изменениям электрофоретической подвижности ДНК-фрагментов в гелях, в присутствии или в отсутствии денатурирующих агентов, либо путем прямого секвенирования ДНК (например, Муегк е! а1. 8с1епсе (1985) 230:1242). Изменения в конкретных положениях данных последовательностей могут быть также выявлены либо путем проведения анализов на защиту от нуклеазы, таких как анализ на защиту от РНКазы или 81, либо путем химического расщепления (см. Сойоп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А (1985) 85:4397-4401).

Помимо стандартного гель-электрофореза и секвенирования ДНК, мутации, такие как микроделеции, анеуплоидии, транслокации и инверсии, могут быть также детектированы путем проведения анализа 1п кйи (см. например, Ке11ег е! а1. ^NΛ РгоЬек, 2пб Еб., 8!оск!оп Ргекк, Νο\ν Уогк, Ν.Υ., И8А (1993)), т.е. ДНК или РНК-последовательности в клетках могут быть проанализированы на мутации, не прибегая к их выделению и/или иммобилизации на мембране. Гибридизация ΐπ кйи с флуоресценцией (Е18Н) является в настоящее время наиболее широко используемым методом, и множество его описаний уже появилось в литературе (см. например, ТгасНиск е! а1. 8с1епсе 250, 559-562 (1990) и Тгакк е! а1. Тгепбк, Сепе!., 7, 149-154 (1991)).

В другом варианте осуществления изобретения для проведения эффективного скрининга генетических вариантов, мутаций и полиморфизма может быть создан массив олигонуклеотидных зондов, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Технология создания массивов хорошо известна в данной области, находит широкое применение и может быть использована для решения ряда проблем молекулярной генетики, касающихся экспрессии генов, сцепления генов и генетической измен

- 23 007611 чивости (см. например, М. СНее е! а1., 8с1епсе (1996). Уо1. 274, рр.610-613).

В одном из вариантов осуществления изобретения, такой массив может быть получен и использован в соответствии с методами, описанными в заявке РСТ АО 95/11995 (СНее е! а1.); ЬоскНаП Ό.Ι е! а1., (1996). №11. Вю1ес11. 14:1675-1680; и 8сНета М. е! а1. (1996). Ргос. №111. Асаб. 8ск 93:10614-10619. Олигонуклеотидные пары могут быть использованы в количестве от двух пар до одного миллиона пар. Олигомеры синтезируют в соответствующих участках на субстрате с использованием оптически направленного химического синтеза. Таким субстратом может быть бумага, нейлон или мембрана другого типа, фильтр, чип, покровное стекло или любой другой твердый носитель. В другом аспекте настоящего изобретения олигонуклеотид может быть синтезирован на поверхности субстрата с использованием процедуры химического связывания и струйного аппарата для нанесения путем разбрызгивания, как описано в заявке РСТ АО 95/251116 (Ва1бекскете11ег е! а1.). В другом своем аспекте, для определения порядка расположения кДНК-фрагментов или олигонуклеотидов на поверхности субстрата и связывания этих фрагментов или олигонуклеотидов с поверхностью субстрата могут быть использованы сетчатые массивы, аналогичные массивам для дот (или слот)-блотов, с использованием вакуумной системы и методов термического, УФ-, механического или химического связывания. Массив, такой как массивы, описанные выше, может быть создан вручную или с использованием подходящих устройств (слот-блот или дотблот-аппарата), материалов (любого твердого носителя) и оборудования (включая роботизированную аппаратуру), и этот массив может содержать 8, 24, 96, 384, 1536 или 6144 олигонуклеотидов или любое другое число от двух и выше одного миллиона, которое является подходящим для эффективного использования коммерчески доступного оборудования.

Помимо методов, описанных выше, заболевания могут быть диагностированы методами, включающими определение в образце, взятом у индивидуума, аномально низкого или аномально высокого уровня полипептида или мРНК. Для количественной оценки полипептидов, пониженный или повышенный уровень экспрессии может быть измерен на РНК-уровне любыми методами, хорошо известными в данной области, например, путем амплификации нуклеиновых кислот, а именно, с помощью ПЦР или ОТ-ПЦР, путем проведения анализов на защиту от РНКазы, с помощью Нозерн-блот-анализов и другими методами гибридизации.

Аналитические методы, которые могут быть использованы для определения уровней полипептида настоящего изобретения в образце, взятом у хозяина, хорошо известны специалистам, и подробно обсуждаются выше (включая радиоиммуноанализы, анализы на конкурентное связывание, Вестерн-блотанализ и ЕЫ8А-анализы). В этом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, который включает стадии:

(a) контактирования лиганда, описанного выше, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.

Протоколы, такие как ЕБ18А, РИА и ЕАС8, разработанные для измерения уровней полипептидов, могут быть, кроме того, взяты за основу при определении измененных или аномальных уровней экспрессии полипептида. Нормальные или стандартные значения для экспрессии полипептида получают путем объединения физиологических жидкостей или клеточных экстрактов, взятых у нормальных млекопитающих, предпочтительно, у человека, с антителом против полипептида в условиях, подходящих для образования комплекса. Количество образованного стандартного комплекса может быть оценено различными методами, такими как фотометрические методы.

Антитела, которые специфически связываются с полипептидом настоящего изобретения, могут быть использованы для диагностики состояний или заболеваний, характеризующихся экспрессией полипептида, или в анализах для наблюдения за пациентами, которым было проведено лечение полипептидами, молекулами нуклеиновой кислоты, лигандами и другими соединениями настоящего изобретения. Антитела, подходящие для использования в диагностических целях, могут быть получены способом, аналогичным способу, описанному выше для терапии.

Диагностические анализы на присутствие полипептида осуществляют методами, в которых используют антитело и метку для детекции полипептида в физиологических жидкостях или экстрактах клеток или тканей человека. При этом могут быть использованы модифицированные или немодифицированные антитела, и эти антитела могут быть помечены путем их ковалентного или нековалентного связывания с репортерной молекулой. При этом могут быть использованы репортерные молекулы широкого ряда, известные в данной области, и некоторые из них описаны выше.

Количества полипептида, экспрессируемого у индивидуума, в контрольном и зараженном образцах и образце ткани, взятой при биопсии, сравнивают со стандартными величинами. Отклонение величин, полученных для данного индивидуума, от стандартных величин позволяет определить параметры для диагностики заболевания. Диагностический анализ может быть использован для выявления отсутствия, присутствия и избыточной экспрессии полипептида и для мониторинга регуляции уровней полипептида во время терапевтического лечения. Такие анализы могут быть также использованы для оценки эффективности конкретного курса терапевтического лечения при исследовании животных в клинических испытаниях или для наблюдения за лечением отдельного пациента.

- 24 007611

Диагностический набор настоящего изобретения может содержать:

(a) молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения;

(b) полипептид настоящего изобретения; или (c) лиганд настоящего изобретения.

В одном из аспектов настоящего изобретения, диагностический набор может включать первый контейнер, содержащий нуклеиновокислотный зонд, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания. Этот набор может, кроме того, включать третий контейнер, содержащий агент для расщепления негибридизованной РНК.

В альтернативном аспекте настоящего изобретения, диагностический набор может содержать массив молекул нуклеиновой кислоты, по крайней мере, одной из которых является молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

Для детекции полипептида настоящего изобретения диагностический набор может содержать одно или более антител, связывающихся с полипептидом настоящего изобретения, и реагент, используемый для детекции реакции связывания между антителом и полипептидом.

Такие наборы могут быть использованы для диагностики заболевания или восприимчивости к заболеванию, в частности, для диагностики пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний. Такими заболеванием или расстройством являются, предпочтительно, заболевание или расстройство, ассоциированное с аберрантными уровнями цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, предпочтительно, члена подсемейства ΌΑΝ. Таким заболеванием или расстройством может быть также расстройство или заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями лиганда для цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, предпочтительно, для члена подсемейства ΌΑΝ. Так, например, таким заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с аберрантными уровнями члена суперсемейства ТОР-бета. В частности, указанным заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с ВМР, такое как невропатия, нефропатия, такая как диабетическая нефропатия, рак, заживление ран, фиброз, остеопения, остеопороз, переломы и склеростеоз. Различные аспекты и варианты настоящего изобретения будут более подробно проиллюстрированы на примерах, в частности, для полипептидов ΙΝ3Ρ002.

При этом следует отметить, что в настоящее изобретение могут быть внесены конкретные модификации, не выходящие за объем изобретения.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1 - результаты, полученные с помощью ВЬАЗТ в неизбыточной базе данных NСВI с использованием объединенной полипептидой последовательности ЗЕО ΙΌ NО:2 и ЗЕО ΙΌ NО:4;

фиг. 2 - сопоставление, осуществляемое с помощью программы ВЬАЗТ, объединенной полипептидой последовательности ЗЕО ΙΌ NО:2 и ЗЕО ΙΌ NО:4 с близкородственной последовательностью сегЬегик-родственного белка 1 Ното 8ар1еп8;

фиг. 3 - четыре наилучших соответствия в базах данных Ж'Ш-пг и NСВI-ηΐ ВЬАЗТ, полученных для ΙΝ3Ρ002 26 ноября 2002;

фиг. 4 - сопоставление ΙΝ3Ρ002 с АК095926.1;

фиг. 5 - сопоставление ΙΝ3Ρ002 с [МАСЕ: 4558384;

фиг. 6 - нуклеотидная последовательность ΙΝ3Ρ002 с трансляцией;

фиг. 7 - неполная клонированная последовательность ΙΝ3Ρ002 с трансляцией;

фиг. 8 - карта для неполного ΡСΚ1I-ΤОΡО-INδΡ002;

фиг. 9 - сопоставление предсказанной последовательности ΙΝ3Ρ002 (верхняя строка) с неполной клонированной последовательностью (нижняя строка);

фиг. 10 - нуклеотидная последовательность и трансляция кДНК-вставки в Ийаде: 4558384;

фиг. 11 - сопоставление последовательностей предсказанного ΙΝ3Ρ002 (верхняя строка) с ^АОЕ: 4558384 (ВС025333.1)(нижняя строка);

фиг. 12 - нуклеотидная последовательность и трансляция ΙΝδΡ002ν, генерированного с помощью ПЦР, в Ийаде: 4558384;

фиг. 13 - карта рСЯ4Ь1иηΐ-ΤОΡО-INδΡ002У;

фиг. 14 - сравнение предсказанного ΙΝ3Ρ002 (верхняя строка) с вариантом последовательности ΙΝδΡ002ν (нижняя строка);

фиг. 15 - карта экспрессирующего вектора рЕАК124;

фиг. 16 - карта вектора р^ОNЯ201 Са1е\\'ау;

фиг. 17 - карта рВΑК12ά-INδΡ002-У-6НIδ;

фиг. 18 - последовательность полноразмерного ΙΝ3Ρ002, клонированного из сердца:

фиг. 19 - карта плазмиды рСЯ4Ь1иηΐ-ΤОΡО-INδΡ002Р^, кодирующей полноразмерный ΙΝ3Ρ002, клонированного из сердца.

- 25 007611

Примеры

Пример 1. Сравнение белка ΙΝ8Ρ002 с белками в базе данных последовательностей.

Полипептидную последовательность, происходящую от объединенных последовательностей 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4, которая представляет собой транслированную последовательность следующих друг за другом экзонов ΙΝ8Ρ002, использовали в качестве запрашиваемой последовательности в программе ВЬА8Т для поиска в базе данных неизбыточных последовательностей NСВI. Наилучшие десять соответствий дают последовательности, аннотированные как белки сегЬегиз или сегЬегиз-родственные белки, которые являются членами семейства цитокинов с цистиновыми узлами, и которые сопоставляли с запрашиваемой последовательностью с высокозначимыми величинами Е (2Е^-10-2Е^-06) (фиг. 1). На фиг. 2 показано сопоставление запрашиваемой последовательности ΙΝ8Ρ002 с последовательностью сегЬегизродственного белка 1 Ното зар1епз (Еепд е! а1. 2001).

Полипептидную последовательность, происходящую от объединенных последовательностей 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4, которая представляет собой транслированную последовательность следующих друг за другом экзонов Ш8Р002, вводили в программу 81§па1Р У2.0.Ь2 (\|е1зеп е! а1. 1997 Рго1ет Епд. 1:1-6). С помощью этой программы было предсказано, что указанная полипептидная последовательность имеет сигнальный пептид. Наиболее вероятно, что сайт отщепления сигнального пептида находится между остатками 22 и 23 указанной полипептидной последовательности Ш8Р002, происходящей от объединенных последовательностей 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4.

Нуклеотидная последовательность 8Е0 ГО N0:1, кодирующая экзон 1 полипептида 8Е0 ГО N0:2, содержит 5'-нетранслируемую область (5'ИТК) и белок-кодирующую последовательность (СЭ8). СЭ8 начинается с нуклеотида 152.

Пример 2. Повторение ВЬА8Т-поиска.

ВЬА8Т-поиск в базах данных ЖВ1-пг и NСВI-ηί проводили 26 ноября 2002 с использованием полипептидной последовательности 8Е0 ГО N0:6, происходящей от объединенных последовательностей 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4. Наилучшие четыре соответствия, идентифицированные в результате проведенного поиска, показаны на фиг. 3.

Этот поиск выявил, что полипептид Ш8Р002 идентичен гипотетическому белку ЕБ138067 на аминокислотном уровне и соответствующей нуклеотидной последовательности АК095926, клонированной из сердца и депонированной 16 июля 2002 г. На фиг. 4 показано сопоставление запрашиваемой последовательности Ш8Р002 с белком, происходящем от кДНК-клона АК095926.

Граница сплайсинга экзона 1 и экзона 2, предсказанная для Ш8Р002, была экспериментально подтверждена присутствием АК095926.

450

451 САТСТСТААСССТСТССССТТССТТСАС СТСТТСТСССССС

II I IIIIIIIIII НН ΗΙΙΙΙΙΙΙΙΟ»...>»11111111111 II

10225 САТвТСТААСССТСТбСССТТССТТСАдете,,.САССТСТТСТСССССС

ЭКВОН1 - Эквон2

500

92 СССССТССТСАСССАТАССССТСССАААТСАТСТСТССТТТ6СТСАТТ6С

I I I I II I II111 I 111 I И 11 IIII111 III Н 11 I I IIН I I I I 11 I I I

13670 СССССТССТСАСССАТАССССТСССАААТСАТСТСТССТТТССТСАТТСС

Исследования также показали, что части Ш8Р002 идентичны ГМАСЕ-клону 4558384 (ВС025333.1), депонированному 8 марта 2002 г. На фиг. 5 показано сопоставление частей запрашиваемой последовательности Ш8Р002 с ГМАСЕ-клоном 4558384.

Пример 3. Частичное клонирование кДНК Ш8Р002.

(1) Библиотеки кДНК.

Библиотеки человеческих кДНК (в векторах бактериофага лямбда (λ)) закупали у 81га1адепе или С1оп1есБ или получали в Научно-исследовательском институте фармакологии Сероно в векторах λ /АР или λ СТ10 в соответствии с протоколом производителей (81га1адепе). ДНК бактериофага λ получали из лабораторных культур инфицированного штамма-хозяина Е.соИ с использованием системы очистки ДНК V^ζа^б ЬатЬба Ргерз в соответствии с инструкциями производителей (Рготеда СогрогаЕоп, Маб1зоп VI). Список используемых библиотек и штаммов-хозяев приведен в табл. 1.

(и) ПЦР предполагаемых кДНК, полученных из фаговой библиотеки ДНК.

Неполную кДНК, кодирующую Ш8Р002 (фиг. 6), получали в виде продукта ПЦР-амплификации, состоящего из 159 п.н. (фиг. 7), с использованием геноспецифических клонирующих праймеров (Ш8Р002-СР1 и Ш8Р002-СР2, фиг. 6 и табл. II). ПЦР осуществляли в конечном объеме 50 мкл, содержащем IX буфер АтрНТас|™, 200 мкМ бКГР, 50 пмоль каждого клонирующего праймера, 2,5 единиц Атр1|Тас|™ (Регкт-Е1тег) и 100 нг каждой фаговой библиотеки ДНК с использованием аппарата М1 КезеагсН ОХА Епдте с установленной программой, работающей в следующем режиме; 94°С, 1 мин; 40

- 26 007611 циклов - 94°С, 1 мин, х °С и у мин и 72°С (где х означает наименьшую температуру Тт=5°С, и у=1 мин на т.п.н. продукта); затем 1 цикл - 72°С, 7 мин и цикл выдерживания при 4°С.

Продукты амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1Х буфере ТАЕ (ЫГе ТесНпо1още5) и ПЦР-продукты, мигрирующие в предполагаемой молекулярной массе, выделяли из геля с использованием системы очистки ДНК Αί/агб РСК Ргерк ΌΝΑ РилйсаДоп Зуйет (Рготеда). ПЦРпродукты, элюированые в 50 мкл стерильной воды, либо непосредственно субклонировали, либо хранили при -20°С.

(ш) Геноспецифические клонирующие праймеры для ПЦР.

Пары ПЦР-праймеров, имеющих длину от 18 до 25 нуклеотидов, конструировали для амплификации полноразмерной последовательности предполагаемой кДНК с использованием программы Рптег Эемдпег Зойгаге (Зс1епййс & Ебисайопа1 ЗоГЩаге. РО Вох 72045, ОигНат, N0 27722-2045, ϋδΑ). ПЦРпраймеры оптимизировали так, чтобы Тт была близка к 55±10°С, и содержание ОС составляло 40-60%. Отбирали праймеры, которые обнаруживали высокую селективность для последовательности-мишени ШЗР002 (низкий уровень или отсутствие неспецифического праймирования с другими матрицами).

(ίν) Субклонирование ПЦР-продуктов.

ПЦР-продукты субклонировали в клонирующий вектор, модифицированный топоизомеразой I (рСК11-ТОРО) с использованием набора для клонирования ТОРО ТА, закупленного у 1пуЦгодеп СогрогаНоп (са1. № К4600-01 и К3575-01 соответственно), и с использованием условий, указанных производителем. Вкратце, 4 мкл выделенного из геля ПЦР-продукта, полученного в результате амплификации библиотеки последовательностей почки плода человека (библиотека номер 12), инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с 1 мкл вектора ТОРО и 1 мкл солевого раствора. Затем реакционную смесь трансформировали в штамм ТОР10 Е(со11 (1пуЦгодеп) следующим образом: 50 мкл-аликвоту клеток Опе 81ю1 ТОР10 оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси ТОРО. Смесь инкубировали в течение 15 ч на льду и затем подвергали тепловому шоку путем инкубирования при 42°С в течение точно 30 с. Затем образцы снова помещали на лед и добавляли 250 мкл теплой среды ЗОС (при комнатной температуре). Образцы инкубировали со встряхиванием (220 об/мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем смесь для трансформации высевали на чашки с Ь-бульоном (ЕВ), содержащие ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С. Резистентные к ампициллину колонии, содержащие кДНК-вставки, идентифицировали с помощью ПЦР колоний.

(ν) ПЦР колоний.

Колонии инокулировали в 50 мкл стерильной воды с использованием стерильной зубочистки. Затем 10 мкл-аликвоту инокулята подвергали ПЦР в общем реакционном объеме 20 мкл, как описано выше, за исключением того, что в качестве пар праймеров использовали ЗР6 и Т7. Циклы проводили в следующих условиях: 94°С, 2 мин, 30 циклов при 94°С, 30 с.; 47°С, 30 с. и 72°С, 1 мин; 1 цикл, 72°С, 7 мин. Затем перед проведением анализа образцы выдерживали при 4°С (цикл выдерживания).

Продукты ПЦР-реакции анализировали на 1% агарозных гелях в буфере 1 Х ТАЕ. Колонии, которые давали ПЦР-продукт предполагаемого размера (159 п.н. -кДНК + 187 п.н., что обусловлено присутствием сайта множественного клонирования или МСЗ), культивировали в течение ночи при 37°С в 5 мл Ь-бульона (ЬВ), содержащего ампициллин (100 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об/мин при 37°С.

(νί) Получение и секвенирование плазмидной ДНК.

Минипрепарат плазмидной ДНК получали из 5 мл культур с использованием роботизированной системы 01аргер ТигЬо 9600 (01адеп) или набора Αί/агб Р1ц§ ЗУ М1шргер (Рготеда са1. № 1460) в соответствии с инструкциями производителей. Плазмидную ДНК элюировали в 100 мкл стерильной воды. Концентрацию ДНК измеряли с использованием фотометра Эппендорфа ВО. Затем плазмидную ДНК (200-500 нг) подвергали ДНК-секвенированию с использованием праймера 17 и праймера ЗР6 и с использованием системы ВщЭуе ТегтшаЮг (АрШеб Вюкуйетк са1. № 4390246) в соответствии с инструкциями производителей. Реакционные смеси для секвенирования очищали на колонках с Эуе-Ех (01адеп) или на планшетах для очистки Моп(аде ЗЕО 96 (М1Шроге са1. № ЬЗКЗ09624) и затем анализировали на секвенаторе Аррйеб Вюкуйетк 3700.

(νίί) Идентификация кДНК-библиотек, содержащих ШЗР002.

ПЦР-продукты, полученные с использованием ШЗР002-СР1 и ШЗР002-С’Р2 и мигрирующие при правильном размере (159 п.н.), идентифицировали в библиотеках кДНК коры головного мозга, толстой кишки, легких плода и почек плода (библиотеки 8, 9, 11 и 12). Последовательность ПЦР-продукта, клонированного в вектор рСКН-ТОРО, показана на фиг. 7 и карта плазмиды (плазмида ΙΌ 13422) - на фиг. 8. Неполная клонированная кДНК представляла собой часть экзона 2 ШЗР002, как было показано путем сопоставления предсказанной нуклеотидной последовательности ШЗР002 и клонированной неполной нуклеотидной последовательности на фиг. 9а, и сопоставления предсказанной последовательности белка ШЗР002 и клонированной неполной последовательности белка на фиг. 9Ь.

Пример 4. Генерирование ОКЕ ШЗР002 из 1таде: 4558384.

1таде-клон 4558384 (в плазмиде рОТВ7), выделенный из ретинобластомы, закупали у Кекдеп (Ιπνί(годеп Согр.). Уколочную культуру Е.сой 4558384 засевали путем разбрасывания на ЬВ-чашки, содержащие ампициллин (100 мкг/мл) и культивировали в течение ночи при 37°С. Отдельные резистентные к

- 27 007611 ампициллину моноколонии инокулировали в 5 мл среды ЬВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали со встряхиванием при 220 об/мин в течение ночи при 37°С. Получали минипрепарат плазмидной ДНК, который секвенировали с использованием праймеров 8Р6, Т7, М13Е, 1И8Р002-СР1 и Ш8Р002-СР2, как описано в примере 3(νί).

Последовательность вставки показана на фиг. 10. Сопоставление нуклеотидной последовательности и предполагаемой аминокислотной последовательности, предсказанной, исходя из кДНК 1таде 4558384, с Ш8Р002, показано на фиг. 11. Очевидно, что кДНК 1таде 4558384 представляет собой вариант сплайсинга 1И8Р002. Этот вариант, по сравнению с предсказанной последовательностью 1И8Р002, содержит 87 п.н.-вставку, которая вводит сдвиг рамки считывания и ранний стоп-кодон. Помимо 3'нетранслируемой последовательности, он также содержит А1и-повтор, что указывает на контаминирующее включение геномной ДНК в кДНК. Экзоны 2 и 4 1таде 4558384 эквивалентны экзонам 1 и 2 предсказанного 1И8Р002. Однако 1таде 4558384 вводит дополнительный экзон между экзонами 1 и 2 предсказанного 1И8Р002. Дополнительный экзон кодирует ранний стоп-кодон, что предотвращает трансляцию домена цистиновый узел. Границы сплайсинга в 1таде 4558384 показаны ниже:

500 :

492 6ССТСТССССТТССТТСАС АС.АССССАСТСТСССТАТСТТС

1111 11 ί I I 11 I ί 1111>».. .»>1 1111111 111111 11 I 11 111

10234 СССТСТ6СССТТССТТСАССТС...ТАСАСАССССАСТСТСССТАТСТТС

Экэон2 ЭкаонЗ

550

533 СССААССТАСТСТТСАССТТСТССССТСААССРЛТССТСССАССТСАССС

IIIIIIIIIIII I I I I I I I I I I I I I I I I II 1 IIIIIIIII I I I I I I I I I I

10741 СССА.АССТАСТСТТСАССТТСТССССТСААССААТССТСССАССТСАССС

600 . : .

583 'ГССЦ^ЗТРСТАС СТСТТСТСССССССССССТССТСАСССА ι·|ι 11 I I I !>».. .»>| 1111111111 11111 | I I I I I I I I I I I

10791 ТССИИоТТСТАбСТС...САССТСТТСТСССССССССССТССТСАСССА

Для удаления геномной ДНК в целях генерирования полноразмерной кДНК, кодирующей ОКБ Ш8Р002, рекомендуется использовать ПЦР-стратегию. ПЦР-праймеры были сконструированы для амплификации 5'-конца (выше) и 3'-конца (ниже) последовательности 1И8Р002, которая фланкирует 87 п.н.вставку в клоне 1таде. Обратный праймер для расположенной выше последовательности и прямой праймер для расположенной ниже последовательности содержали комплементарные последовательности у своих 3'- и 5'-концов соответственно для создания перекрывающихся концов так, чтобы ПЦР-продукты от каждой реакции могли смешиваться и подвергаться отжигу, что обеспечивало бы амплификацию полноразмерной кДНК в третьей ПЦР-реакции, проводимой с использованием присоединяемого выше гнездового прямого праймера и присоединяемого ниже гнездового обратного праймера.

Первая ПЦР-реакционная смесь, используемая для амплификации 5'-конца Ш8Р002 (выше от 87 п.н.-вставки), содержала, в конечном объеме 50 мкл, 5 мкл 10Х буфера РГх Р1айпит, 1,5 мкл бИТР (10 мМ), 1 мкл Мд8О₄ (50 мМ), 1,5 мкл Ш8Р002У-5'-Е (10 мкМ), 1,5 мкл 1И8Р002У-5'-К (10 мкМ), 0,75 мкл РГх Р1айпиш и 135 нг плазмидной кДНК 1МАОЕ:4558384. Амплификацию осуществляли в следующих условиях: 1 цикл при 94°С, 2 мин, 30 циклов при 94°С, 15 с и 68°С, 1 мин. и 1 цикл при 68°С, 7 мин. Вторую ПЦР-реакцию амплификации 3'-конца 1И8Р002 (ниже от 87 п.н.-вставки) осуществляли в тех же самых условиях, за исключением того, что в качестве праймеров использовали Ш8Р002У-3'-Е и Ш8Р002У3'-К.

Продукты амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1Х буфере ТАЕ (!п\Пгодеп). ПЦР-продукты, мигрирующие в предполагаемой молекулярной массе (520 п.н. и 448 п.н, для ПЦР 1 и 2 соответственно) выделяли из геля с использованием системы очистки ДНК Юхагб РСК Ргерк ЭИА Рипйсайоп 8ук1ет (Рготеда). ПЦР-продукты элюировали в 50 мкл стерильной воды, и концентрацию ДНК измеряли с использованием фотометра Эппендорфа ВО. Затем 50 нг каждого очищенного ПЦР-продукта использовали в качестве матрицы для гнездовой ПЦР в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл 10Х буфера РГх Р1айпит, 1,5 мкл бИТР (10 мМ), 1 мкл Мд8О₄ (50 мМ), 1,5 мкл Ш8Р002У-5'пе81-Е (10 мкМ), 1,5 мкл Ш8Р002У-3' пезЕК (10 мкМ). Реакционную смесь нагревали при 95°С в течение 3 мин и добавляли 0,75 мкл полимеразы РГх Р1а1тыт. Амплификацию осуществляли в следующих условиях: 1 цикл при 94°С, 2 мин, 30 циклов при 94°С, 15 с, 61°С, 30 с и 68°С 1 мин и 1 цикл 68°С, 7 мин. ПЦРпродукты, мигрирующие в предполагаемой молекулярной массе 719 п.н., выделяли из геля с использованием системы очистки ДНК Αί/агб РСК Ргерк ЭИА Рипйсайоп 8ук1ет и элюировали в 50 мкл стерильной воды. Затем 4 мкл очищенного ПЦР-продукта лигировали в вектор рСК4Ь1ип!-ТОРО, как описано в

- 28 007611 разделе 1.4. Резистентные к ампициллину колонии тестировали на вставки с помощью ПЦР колоний с использованием праймеров Т3 и Т7, как описано в разделе 1.5. Колонии, которые давали ПЦР-продукт ожидаемого размера (719 п.н.+106 п.н., что обусловлено присутствием сайта множественного клонирования или МС8), культивировали в 5 мл БВ-бульона, содержащего ампициллин (100 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об/мин при 37°С. Минипрепарат плазмидной ДНК получали из 5 мл культур и секвенирвоали с использованием праймеров Т3 и Т7, как описано в разделе 1.6. Последовательность одного из полученных клонов и соответствующая плазмидная карта (рСК4Ы1ип1-Т0Р0-ГЫ8Р002У) показаны на фиг. 12 и 13 соответственно. Трансляция клонированной последовательности показала, что ΙΝ8Ρ002ν содержит 2 аминокислотных делеции (Δν107 и ΔΟ108) и одну аминокислотную замену (Р110Ь) по сравнению с предсказанной последовательностью ΙΝ8Ρ002. Сопоставление нуклеотидной и аминокислотной последовательностей предсказанного ΙΝ8Ρ002 и ΙΝ8Ρ002ν проиллюстрировано на фиг. 14.

При сравнении с предсказанным ΙΝ8Ρ002 было выявлено, что на границе сплайсинга между экзонами 1 и 2 используется расположенный выше донорный сайт длиной 6 п.н. Это приводит к делеции двух аминокислот ^а1С1и). Используемый акцептор сплайсинга аналогичен акцептору, используемому в предсказанном ΙΝ8Ρ002, однако за этим акцептором имеются две ошибки, обнаруженные при секвенировании. Это приводит к аминокислотной замене (Рйе Ьеи).

Пример 5. Конструирование плазмиды для экспрессии ΙΝ8Ρ002ν в клетках ΗЕК293/ЕВNΑ.

Клон рСК4Ы1ип!-Т0Р0, содержащий полноразмерную кодирующую последовательность (0КБ) ΙΝ8Ρ002ν, идентифицированную путем секвенирования ДНК (фиг. 13), затем использовали для субклонирования вставки в вектор для экспрессии рЕАК12б в клетках млекопитающего (фиг. 15) с использованием методики клонирования Са!е^ау™ Цпуйгодеп).

(ί) Генерирование Са!е^ау-совместимой 0КБ ΙΝ8Ρ002, присоединенной к последовательностиметке 6ΗΙ8, с сохранением рамки считывания.

Первая стадия способа клонирования Са1е\гау включает двухстадийную ПЦР-реакцию, которая генерирует 0КБ ΙΝ8Ρ002ν, фланкированную у 5'-конца сайтом рекомбинации айВ1 и последовательностью Козака, и у 3'-конца - последовательностью, кодирующей, с сохранением рамки считывания, 6гистидиновую (6ΗΙ8) метку стоп-кодоном и сайтом рекомбинации айВ2 (Са1е\уау-совместимой кДНК). Первая ПЦР-реакционная смесь (в конечном объеме 50 мкл) содержала: 25 нг рСК4Ы1ип!-Т0Р0ΙΝ8Ρ002ν (плазмида 13075 и фиг. 13), 1,5 мкл 6ΝΤΡ (10 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера РГх, 1 мкл Мд80₄ (50 мМ), 0,5 мкл каждого геноспецифического праймера (100 мкМ) (ΙΝ8Ρ002ν ЕХ1 и ΙΝ8Ρ002ν-ΕΧ2) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы РГх Р1а1йшт Цпуйгодеп). ПЦР-реакцию осуществляли с использованием начальной стадии денатурации при 95°С, 2 мин, с последующим проведением 12 циклов при 94°С, 15 с, и 68°С, 30 с. ПЦР-продукты очищали непосредственно из реакционной смеси с использованием системы очистки ДНК Χνί/агб РСК Ргер (Рготеда) в соответствии с инструкциями производителей. Вторая ПЦР-реакционная смесь (в конечном объеме 50 мкл) содержала: 10 мкл очищенного ПЦРпродукта, 1,5 мкл 6ΝΤΓ (5мМ), 1 мкл Мд80₄ (50 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера РГх Р1айпит, 0,5 мкл каждого праймера для конверсии Са1е\гау (100 мкМ) (прямого праймера ССР и обратного праймера ССР) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы РГх Р1а1йшт. Вторую ПЦР-реакцию осуществляли при следующих условиях: 95°С, 1 мин., 4 цикла при 94°С, 15 с; 45°С, 30 с и 68°С, 3,5 мин; 25 циклов при 94°С, 15 с; 55°С, 30 с и 68°С, 3,5 мин. ПЦР-продукты очищали, как описано выше.

(й) Субклонирование Са1е\гау-совместимой 0КБ IN8Р002V во встраивающий вектор ρΩ0ΝΚ201 Са1е\гау и экспрессирующий вектор рЕАК12б.

Вторая стадия способа клонирования Са1е\гау включает субклонирование Са1е\гау-модифицированного ПЦР-продукта во встраивающий вектор ρΌ0ΝΚ201 Са1е\гау Цпуйгодеп, фиг. 16), которое осуществляли следующим образом: 5 мкл очищенного ПЦР-продукта инкубировали с 1,5 мкл вектора ρΌ0ΝΚ201 (0,1 мкг/мкл) , 2 мкл буфера ВР и 1,5 мкл клоназной ферментной смеси ВР (Iпν^ΐ^одеп) при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию прекращали добавлением протеиназы К (2 мкг) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту реакционной смеси (2 мкл) трансформировали в клетки ΌΗ10Β Е.сой путем электропорации с использованием импульсного устройства В юга б Сепе Рикег. Трансформанты высевали на ЬВ-планшеты с канамицином. Плазмидный минипрепарат ДНК (М1ш-ргер) приготавливали из 1-4 полученных колоний с использованием набора ΧνίζηΓά Р1н5 δν М1шргер8 (Рготеда), и затем 1,5 мкл плазмидного элюата использовали в реакционной смеси для рекомбинации, содержащей 1,5 мкл вектора рЕАК12б (фиг. 9) (0,1 мкг/мл), 2 мкл буфера БК и 1,5 мкл клоназы БК (Iην^ί^одеη) в конечном объеме 10 мкл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем реакцию прекращали добавлением протеиназы К (2 мкг) и смесь инкубировали при 37°С в течение еще 10 мин. Аликвоту этой реакционной смеси (1 мкл) использовали для трансформации клеток ЭН 10В Е.сой путем электропорации.

Клоны, содержащие правильную вставку, идентифицировали путем проведения ПЦР колоний, как описано выше, за исключением того, что для ПЦР использовали праймеры рЕАК12б (рЕАК12б Б и рЕАК12б К). Плазмидный минипрепарат ДНК выделяли из клонов, содержащих правильную вставку, с использованием роботизированной системы 01аргер ТигЫо 9600 (Ошдеп) или вручную с использованием набора \νίζ;·ΐΓά Р1н5 δν М1шргер (Рготеда), и последовательность подтверждали с использованием прай

- 29 007611 меров рЕАК124 Р и рЕАК124 К.

Θчищенный в градиенте СкС1 максипрепарат ДНК плазмиды рЕАК12й-1Н8Р002У-6Н18 (плазмида ΙΌ номер 13227, фиг. 17) получали из 500 мл культуры клонов с подтвержденной последовательностью (8атЬтоок, 1. с1 а1., Мо1сси1аг Оонтд: А БаЬогаЮгу Маииа1, 2'¹ сйШоп, 1989, Со14 8рттд НагЬог ЬаЬога1оту Ртсзз), ресуспендировали при концентрации 1 мкг/мл в стерильной воде и хранили при -20°С.

(ΐϊϊ) Конструирование экспрессирующего вектора рЕАК124.

Вектор рЕАК124 представляет собой совместимый с системой клонирования 6а1с\гау вариант вектора рЕАК12 для экспрессии в клетках млекопитающих (закупленного у Ебдс ВюзузЩтз), в котором нужная кДНК экспрессируется под контролем человеческого промотора ЕР1а. Вектор рЕАК124 генерировали, как описано ниже.

рЕАК12 расщепляли рестриктирующими ферментами ΗίηάΙΙΙ и ИоИ, затупляли по концам фрагментом Кленова (№\ν Е^Ипй Вю1аЬз) и дефосфорилировали с использованием щелочной фосфатазы кишечника теленка (КосНс). После дефосфорилирования вектор лигировали с сохранением рамки считывания с затупленным по концам кластером С 6а1с\гау (система конверсии вектора Са1с^ау, ^Игод^, са1 № 11828-019), который содержит сайты рекомбинации АйК, фланкирующие ген ссйВ и ген резистентности к хлорамфениколу и трансформировали в клетки ΌΒ3.1 Е.соН (которые обеспечивают размножение векторов, содержащих ген ссйВ). Минипрепарат ДНК выделяли из нескольких полученных колоний с использованием набора Χνί/агй Р1из 8У М1шргср (Рготсда) и расщепляли ферментами А8с1/ЕсоК1 для идентификации клонов с получением фрагмента длиной 670 п.н., что указывало на то, что этот кластер был встроен в правильной ориентации. Полученная плазмида была обозначена рЕАК12й (фиг. 15).

Пример 6. Экспрессия ГЫ8Р002-8У-6Н18-У1 в клетках млекопитающих (плазмида № 13227) и очистка.

Клетки почек эмбриона человека 293, экспрессирующие ядерный антиген вируса Эпштейна Барра (ΗЕК293-ЕΒNΑ, ^Щодси), поддерживали в суспензии бессывороточной среды Ех-клеток УРКО (посевной материал, поддерживающая среда, 1КН). За 16-20 ч до трансфецирования (день 1), клетки высевали во флаконы с 2х Т225 (50 мл на флакон в среде ЭМЕМ/Е12 (1:1)), содержащие посевную среду с 2% РВ8 (ЖН) при плотности 2х10⁵ клеток/мл. На следующий день (день трансфекции 0) осуществляли трансфекцию с использованием реагента 1с1РЕ1™ (2 мкл/мкг плазмидной ДНК, Ро1уР1из-трансфекция). Для каждого флакона, 113 мкг ДНК (№ 13227) ко-трансфецировали 2,3 мкг СРР (флуоресцентного репортерного гена). Затем смесь для трансфекции добавляли во флаконы с 2х Т225 и инкубировали при 37°С (5% СΘ₂) в течение 6 дней. Для повышения шансов получить большее количество материала, эту процедуру повторяли в еще в двух колбах, в результате чего получали всего 200 мл продукта. Подтверждение позитивной трансфекции проводили путем качественной оценки флуоресценции на день 1 и на день 6 (Ахюусй 10 Ζάδδ).

На 6-й день (день сбора), супернатанты (200 мл) из четырех флаконов объединяли и центрифугировали (4°С, 400 г), затем помещали в сосуд, содержащий уникальный идентификатор.

Θдну аликвоту (500 мкл) оставляли для проведения количественной оценки (ОС) 6хН1з-меченного белка (ОС внутреннего биопроцессинга).

Способ очистки

200 мл образца культуральной среды, содержащего рекомбинантный белок с С-концевой меткой 6ΗΪ8, разводили холодным буфером А (50 мМ NаΗ₂ΡΟ₄; 600мм №С1; 8,7 % (мас/об) глицерина, рН 7,5) до конечного объема 400 мл. Θбразец фильтровали через стерильный фильтр 0,22 мкм (М1Шротс, 500 млфильтровальное устройство) и выдерживали при 4°С в стерильном квадратном 500 мл-сосуде со средой (Nа1дсηс).

Θчистку осуществляли при 4°С на рабочей станции ΫΙδΙΟΝ (Аррйсй ВюзузЩтз), подсоединенной к автоматическому устройству для загрузки образцов (ЪаЬотайс). Процедура очистки состояла из двух последовательных стадий, т.е., сначала проводили металлоаффинную хроматографию на колонке с Рогоз 20 МС (АррБсб ВюзузЩтз), загруженной ионами Νί (4,6х50 мм, 0,83 мл), затем проводили гельфильтрацию на колонке (1,0х10 см) со средой, содержащей сефадекс 6-25 (Атстзйат Рйаттааа).

Для проведения первой стадии хроматографии, металлоаффинную колонку регенерировали 30 колоночными объемами раствора ЕЭТА (100 мМ ЕЭТА; 1М №С1; рН 8,0), снова загружали ионы металла путем промывки 15 колоночными объемами 100 мМ раствора Νί8Ο₄, после чего промывали 10 колоночными объемами буфера А, затем промывали 7 колоночными объемами буфера В (50 мМ NаΗ₂ΡΟ₄; 600 мМ №С1; 8,7 % (мас/об) глицерин, 400 мМ имидазол; рН 7,5) и, наконец, уравновешивали 15 колоночными объемами буфера А, содержащего 15 мМ имидазола. Θбразец загружали на аффинную колонку с металлическим Νί партиями по 200 мл. 200 мл образца переносили с помощью устройства для загрузки образцов ЬаЬотайс в 200 мл-петлю для образца и затем загружали на аффинную колонку с металлическим Νί при скорости потока 10 мл/мин. Для загрузки 400 мл образца на колонку процедуру переноса и загрузки повторяли еще раз. По окончании процедуры загрузки колонку промывали 12 колоночными объемами буфера А, затем 28 колоночными объемами буфера А, содержащего 20 мМ имидазола. Во время промывки 20 мМ имидазолом, высвобождаемые примесные белки элюировались с колонки. И нако

- 30 007611 нец, рекомбинантный Н1к-меченый белок элюировали 10 колоночными объемами буфера В при скорости потока 2 мл/мин и элюированный белок собирали в 1,6 мл-фракции.

Для проведения второй стадии хроматографии, гель-фильтрационную колонку с сефадексом С-25 регенерировали 2 мл буфера Ό (1,137 М №С1; 2,7мМ КС1; 1,5 мМ КН₂р0₄; 8 мМ №ьНР0₄; рН 7,2) и затем уравновешивали 4 колонками буфера С (137мМ №С1, 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ КН₂Р0₄; 8 мМ №ьНР0₄; 20% (мас/об) глицерина; рН 7,4). Фракции пиков, элюированные с ^-колонки, автоматически пропускали через многофункциональное устройство для загрузки образцов, подсоединенное к рабочей станции VI8I0N с колонки, загружали в колонку с сефадексом С-25 и затем белок элюировали буфером С при скорости потока 2 мл/мин. Обессоленный образец собирали в 2,2 мл-фракцию. Эту фракцию фильтровали через стерильный центрифужный фильтр 0,22 мкм (М1Шроге), разделяли на аликвоты, замораживали и хранили при -80°С. Аликвоту данного образца анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (в 4-12% геле NиРАСЕ; Хохех) путем проведения Вестерн-блоттинга с использованием анти-Н1к антител.

После электрофореза белки подвергали электрофоретическому переносу из геля на нитроцеллюлозную мембрану при 290 мА в течение 1 ч при 4°С. Мембрану блокировали 5% сухим молоком в буфере Е (137 мМ №С1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ КН₂Р0₄; 8 мМ №₂НРС₄; 0,1 % твина 20, рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре и затем инкубировали со смесью 2 кроличьих поликлональных анти-Н1к антител (С-18 и Н-15, 0,2 мгк/мл каждого; 8ап1а Сгих) в 2,5% сухом молоке в буфере Е в течение ночи при 4°С. После инкубирования в течение еще 1 ч при комнатной температуре, мембрану промывали буфером Е (3х10 мин) и затем инкубировали со вторым ПХ-конъюгированным антикроличьем антителом (ОАК0, НКР 0399), разведенным 1/3000 в буфере Е, содержащем 2,5% сухое молоко, в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки буфером Е (3х10 мин), мембрану проявляли в течение 1 мин с помощью ЕСЬ-набора (Атегкйат Рйагтааа). Затем мембрану экспонировали с пленкой Нурегй1т (Атегкйат Рйагташа), пленку проявляли и снимок вестерн-блота визуально анализировали.

Пример 7. Клонирование полноразмерного ЕЫ8Р002 из сердца.

Полноразмерную кодирующую последовательность ЕЫ8Р002 клонировали из кДНК сердца, как описано ниже.

(ί) Генерирование кДНК-матрицы сердца.

Полноразмерную РНК сердца человека закупали у С1оп!ес1. Качество и концентрацию РНК анализировали с использованием биоанализатора Адйеп! 2100.

Реакционная смесь для синтеза кДНК содержала 1 мкл о1що(бТ)₁₅ праймера (500 мкг/мл, Рготеда са!. № С1101), 2 мкг полноразмерной РНК и 1 мкл б№ГР (10 мМ) в объеме 12 мкл. Полученную смесь нагревали при 65°С в течение 5 мин и затем охлаждали на льду. Затем добавляли следующие реагенты: 4 мкл 5Х буфера для первой цепи, 2 мкл ОТТ (0,1 М), 1 мкл ингибитора рекомбинантной рибонуклеазы КЫАке0и! (40 единиц/мкл, Рготеда, са!.№ 2511) и смесь инкубировали при 42°С в течение 2 ч, после чего добавляли 1 мкл (200 единиц) 8ирегкспр! II (1пуйгодеп са!. № 18064-014). Смесь инкубировали при 42°С в течение 50 мин и затем нагревали при 70°С в течение 15 мин. Для удаления матричной РНК добавляли 1 мкл (2 единицы) РНКазы Н Е.соН Цпуйгодеп, са!. № 18021-014) и реакционную смесь инкубировали еще 20 мин при 37°С. Конечную реакционную смесь разводили 200 мкл стерильной воды и хранили при -80°С.

(ίί) Клонирование полноразмерной кодирующей последовательности ЕЫ8Р002 с помощью ПЦР.

Полноразмерную кодирующую последовательность 1Ы8Р002 клонировали из кДНК сердца человека с помощью ПЦР в 50 мкл реакционной ПЦР-смеси, содержащей 5 мкл кДНК сердца, 5 мкл 10Х буфера РЕх, 1,5 мкл бNТР (10 мМ), 1 мкл Мд80₄ (50 мМ), 1,5 мкл геноспецифического прямого праймера ЕЫ8Р002-ЕЕ-Е (10 мкл), 1,5 мкл геноспецифического обратного праймера 1Х8Р002-ЕЕ-К (10 мкМ) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы РЕх Р1айпцт (1пу1!годеп). Циклы проводили в следующих условиях: 1 цикл при 94°С, 4 мин, 35 циклов при 94°С, 15 с, при 55°С, 30 с, при 68°С, 1 мин и 1 цикл при 68°С, 10 мин, затем цикл выдерживания при 4°С.

Продукты амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1Х буфере ТАЕ Цпуйгодеп) и ПЦР-продукты, мигрирующие в предполагаемой молекулярной массе (589 п.н.), выделяли из геля с использованием набора для экстракции в геле 01адеп М1пЕ1и!е (01адеп). ПЦР-продукты элюировали в 50 мкл 10 мМ Трис-НС1, рН 8,5 и субклонировали в вектор рСК4Ь1ип!-Т0Р0, как описано выше (раздел 1.4). Несколько резистентных к ампициллину колоний подвергали ПЦР-реакции, как описано в разделе 1.5. Колонии, содержащие вставку правильного размера (589 п.н.+106 п.н., что обусловлено присутствием МС8), культивировали в течение ночи при 37°С в 5 мл Ь-бульона (ЕВ), содержащего ампициллин (100 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об/мин при 37°С. Минипрепарат плазмидной ДНК получали из 5 мл культур с использованием роботизированной системы 01аргер ТигЬо 9600 (01адеп) или с использованием набора Χνί/агб Р1ик δν Мнлргер (Рготеда са!. № 1460) в соответствии с инструкциями производителей, и затем 200-500 нг минипрепарата ДНК секвенировали, как описано в разделе 1.6 с использованием праймеров Т3 и Т7 (табл. III). Клонированная последовательность представлена на фиг. 18. Карта полученной плазмиды, рСК4Ь1ип!-Т0Р0-ЕМ8Р002ЕЕ (плазмида ГО № 13514) показана на фиг. 19.

- 31 007611

Таблица Ι

Библиотеки человеческих кДНК

Библиотек а	Источник ткани/клетки	Вектор	Штаммхозяин	Поставщи к	№ в каталоге
1	Головной мозг плода человека	гар II	ХЬ1- В1ие МКГ’	ЗГгаБаде η	936206
2	Яичник человека	СТЮ	БЕЗ 92	С1опГесЬ	НЫ098а
3	Гипофиз человека	СТЮ	БЕ392	С1оп1:ес11	НЫ097а
4	Плацента человека	СТ11	БЕ392	С1опбес11	НЫ075Ь
5	Яички человека	СТ11	БЕ392	СХопбесЬ	НГЮЮЬ
б	Черное вещество человека	СТЮ	БЕ392	Получено авторами
7	Головной мозг плода человека	СТЮ	БЕ392	Получено авторами
8	Кора головного мозга человека	СТЮ	БЕ392	Получено авторами
9	Толстая кишка человека	СТЮ	БЕ392	СХопХесЬ	НЫ034а
10	Головной мозг плода человека	СТЮ	БЕ392	СХопХесЬ	НЫ065а
11	Легкие плода человека	СТЮ	БЕ392	СХопБесЬ	НЫ072а
12	Почки плода человека	СТЮ	БЕ392	СХопбесЬ	НЬ1071а
13	Печень плода человека	СТЮ	ГЕ392	СХопБесЬ	НЫ064а
14	Костный мозг человека	СТЮ	БЕ392	СХопБесЬ	НЫ058а

15	Моноциты периферической крови человека	СТЮ	ГЕ392	СХопХесй	НЫ050а
16	Плацента человека	СТЮ	БЕЗ 92	Получено авторами
17	3Η3Υ3Υ человека	СТЮ	БЕ392	Получено авторами
18	Человеческая клеточная линия и373	СТЮ	БЕ392	Получено авторами
19	Человеческая клеточная линия СГРос-Х	ϋηί гар	ХБ1ВХие МКР’	ЗЬгаЬаде η	936206
20	Сетчатка глаза человека	СТЮ	БЕ392	СХопХесЬ	НЫ132а
21	Мочевой пузырь человека	СТЮ	ГЕ392	Получено авторами
22	Человеческие тромбоциты	υηί гар	ХБ1- ВХие МНЕ'	Получено авторами
23	Человеческая нейробластома Кап+ТЗ	СТЮ	ГЕ392	Получено авторами
24	Гладкая мышца бронхов человека	СТЮ	БЕ392	Получено авторами
25	Гладкая мышца бронхов человека	СТЮ	БЕ392	Получено авторами
26	Тимус человека	СТЮ	БЕ392	СХопХесЬ	НЬ1127а
27	5'-фрагмент селезенки человека	СТ11	ГЕ392	СХопХесН	НЬ1134Ь
28	Моноциты периферической крови человека	СТЮ	БЕ392	СХопЬесЬ	НЫ050а
29	Яички человека	СТЮ	БЕ392	СХопХесЪ	НЫ065а
30	Головной мозг плода человека	СТЮ	ΣΕ392	СХопХесЬ	НЫ065а
31	Черное вещество человека	СТЮ	ЪЕ392	СХопХесН	НЫ093а
32	Плацента человека #11	СТ11	БЕ392	СХопХесЬ	НЫ075а
33	Головной мозг плода человека	СТЮ	ЬЕ392	СХопХесЬ	Сделано по заказу
34	Плацента человека #59	СТЮ	БЕ392	СХопХесЬ	НЬ5014а
35	Гипофиз человека	стю	БЕ392	СХопХесН	НЫ097а
36	Поджелудочная железа человека #63	υηί гар хк	ХЫ- В1ие МКГ'	ЗЬгаХаде η	937208
37	Плацента человека #19	СТ1Х	БЕ392	С1опЬесЬ	НЫ008
38	5'-фрагмент печени человека	СТ11	ΙΕ392	Получено авторами \|	НЬ1115Ь

- 32 007611

39	Матка человека	гарему ХК	ХД1- В1ие МКГ’	3£га£аде η	980207
40	кДНК-библиотека крупных вставок почки человека	ΤτϊρΙΕ х2	ХД1- В1ие	Получено авторами	НЪ5507и

Таблица II

Праймеры для клонирования Ш8Р002

Праймер	Последовательность (5'->3')
1№Р002-СР1	СТС АСС САТ АСС ССТ ССС АА
ШЗР002-СР2	ССТ САС СТС ССА СТС АСА СА
1№Р002У-5 ’-Г	АСС ТСС ААС САА ССС АСТ ССА СТС А
ΙΝ3Ρ002ν-5’-В	ССА ССС ССС ССС ССА САС ААС САА ССС САС АСС СТТ А
ΙΝ3Ρ002ν-3’-Е	АСС СТС ТСС ССТ ТСС ТТС ТСТ ССС ССС ССС ССТ ССТ с
ΙΝ3Ρ002ν-3 ’ -К.	АСТ ССА ССА ССС ССА СТС ТСТ СТА С
ΙΝ3Ρ002ν-5’пезЕ-Г	СТС САС ТСС ТАС ТСА ССТ ТСА С
1МЗР002У-3’пезЕ-К.	АСА ТСА ТСС АСС ТСС АСС ТСТ Т

Таблица III

Праймеры для субклонирования и секвенирования Ш8Р002

Праймер	Последовательность (5'—>3' )
ЗР6	АТТ ТАС СТС АСА СТА ТАС
Т7	ТАА ТАС САС ТСА СТА ТАС СС
ТЗ	АТТ ААС ССТ САС ТАА АСС СА
М13Е	ТСТ ААА АСС АСС ССС АСТ
РЕАК12-Г	ССС АСС ТТС ССА СТТ САТ СТ
РЕАК12-К	САТ ССА ССТ ССА ССТ СТС АС
ΙΝ3Ρ002ν- ЕХ1	ΆΆ. ССА ССС ТТС ССС АСС АТС СТС СТТ ССС САС СТА ТС ·
ΙΝ3Ρ002νΕΧ2	СТС АТС СТС АТС СТС ТСС ТТТ ТСС ССТ ССА СТС АС
ССР Прямой	С ССС АСА АСТ ТТС ТАС ААА ААА ССА ССС ТТС ССС АСС
ССР Обратный	ССС САС САС ТТТ СТА САА САА АСС ТСС СТТ ТСА АТС СТС АТС СТС АТС СТС

Таблица IV

ПЦР-праймеры для клонирования полноразмерного Ш8Р002

Праймер	Последовательность (5'-»3' )
ΙΝ3Ρ002ν-ΕΠ-Γ \	САТ ССТ ССТ ТСС ССА ССТ АТ

1ЫЗР002У-ЕЬ-К

ССА ТСС АСС АТС СТС АСТ ТС

Подчеркнутая последовательность = последовательность Козака

Последовательность, обозначенная жирным шрифтом = стоп-кодон

Последовательность, обозначенная курсивом = метка Н1к

Список последовательностей

Примечание: для аминокислот, кодируемых участком стыка экзон-экзон, аминокислота будет дополнительно приписана 5'-экзону

- 33 007611

8ЕО ΙΌ ΝΟ:1 (ГИ8Р002-нуклеотидная последовательность, экзон 1)

I АААТСССТСС САСССТАТСС А6СА6С0ССС ААСАСАТТАА ААССАССТТТ

АСААСССТСА САТСССАСТС АССАСАСА6С АСССТССАСТ ССТАСТСАСС

101 ТТСАССССАС ТССССАСАСА САСАСАСССА САСАСАСССА СССАСААССА

151 САТССТССТТ ССССАССТАТ ССАСТСТТСТ СТСССТССТТ АСССССОССС

201 ТСССТАСАСС СТСАСССАСС ССТСААСССС АСТСТССТСС АССТСАСТСС

251 ТССССТССАС ССААТСАСАС СТССССТСТС СССССАСССС СССТСССССС

301 АСТССТСССА ССТТСТСССС ТТСССАССТС СААССССТТС ттссссстсс

351 АСАААСССАС ССАССТСССС АТС06СА6СС ТССАСССТСС ССААСАССАС

401 СТОЕСТ6СТС ТСАСТСТССС ССТСААСССТ САССАА6ТСА ТССАССССАТ

451 СТСТААСССТ СТССССТТСС ТТСА6

ЗЕ£) Ю N0:2 (1№Р002“Последовательности белка, экзон 1)

МЬЫЗД8Т1£ СЬЬЗСАЬРТС 5СНРЕРО5РН Ρ05ΜΑΑΑΝ0Τ ИАЬСРСАЬРР

ЬУРАЗАЬСЗИ КАГЬСЬаКАК ОЬСМСКЪОКС ООЕУААУТЪР ΐΝΡΟενίΟΟΜ ιοί ααν₽ίνο _

ЗЕ<2 ΙΌ N0:3 (1№Р002-нуклеотидная последовательность, экзон 2)

6ТСТТСТССС СОССССССТС СТСАСССАТА ССССТСССАА АТСАТСТСТС

СТТТССТСАТ ТССТССТСТС ТСТАСАТССС ТСССТСССАС СССАССССАС

101 ТАСТССТСТС СААСАССТСТ АТСССТССТС ССААСССТТС СССАССССТС

151 СТССТСТС6Т СТСТСАСТСС САОСТСАССС ТССССТССАС С6СТСААСАТ

201 АТССАССАТС СТСАТССАСС ССТСТСАСТС САССССАААА ССАТСА

ЗЕО Ιϋ N0:4 (1ЩЗР002-последовательности белка, экзон 2)

УЕ5НРСС5А1 КЬВЛНЬСГСН С531ЛТРС5П РТРЬУЪСКЯС МРАКККИАРУ

УЬИСЬТСЗЗА 5КККУК13ТИ ЫЕССНСЗРК А

3Εζ) Ю N0:5 (ΙΝ5Ρ002-нуклеотидная последовательность)

АААТСССТСС САСССТАТСС АССАСССССС ААСАСАТТАА ААССАССТТС

АСААСССТСА САТСССАСТС АССАСАСАСС АСССТССАСТ ССТАСТСАСС

201 ТСССТАСАСС СТСА06СА6С ССТСААСССС АСТСТССТСС АССТСАСТСС

351 АСАААСССАС ССАССТСССС АТССССАССС ТССАСССТСС ССААСАССАС

401 СТСССТССТС ТСАСТСТССС ССТСААСССТ САССААСТСА ТССАССССАТ

451 СТСТААСССТ СТССССТТСС ТТСАССТСТТ СТСССССССС СССТССТСАС

501 ССАТАССССТ СССАААТСАТ СТСТССТТТС СТСАТТССТС СТСТСТСТАС

551 АТСССТСССТ СССАССССАС СССАСТАСТС СТОТССААСА 6СТСТАТССС

601 ТССТСССААС ССГГССССАС СССТССТССТ СТССТСТСТС АСТСССАССТ

651 САСССТСССС ТССАССССТС ААСАТАТССА ССАТССТСАТ ССАССССТСТ

701 САСТССАССС СААААССАТС А

8Εζ) Ю N0:6 (1ИЗР002-последовательность белка)

МЬЬСОЕЗТЬЬ СЬЬЗСАЬРТС 5СКРЕР05РК Ρ03ΗΑΑΑΝ0Τ МАЪСРСАЬРР и/РЛ8МС5Я КАГЫЭД2КАК ОЬСМСКЬОКС ООЕУААУТЬР ШРОЕУЮСМ

- 34 007611

101 εΚΑνΡΓνονΓ 5НРСС5А1Й1. ВМНЬСГСНСЗ 51ЛТРСЗОРТ РЕУССЫЗСМР

151 ΑΚΚΒΗΑΡννΐ, НСЬТС55А5К ЙКУК15ТМЫ ЕССНС5РКА

ЗЕО ΙΌ N0:7 (ΙΝ5Ρ002-последовательности белка без сигнального пептида, экзон 1)

КРЕР05РЯР0 8ΗΑΑΑΝ0ΤΗΑ ЬСРСАЬРРЬУ РА5АЬС5ИКА ΕΚΛΟΚΑΒΟί смбкьокедо ЕУААУТЬРЬН РОЕУГОСМСК χνρκνο

ЗЕО Ю N0:8 (1№Р002-последовательность белка без сигнального пептида)

НРЕРОЗРКРа ЗИАААИОТНА ЬСРСАЪРРЬУ РАЗАЪСЗНКА ЕЬСЬОКАКОЬ

СНСКЬОКСОО ЕУААУТЬР1Л РОЕПОБИСК Αν₽ΕνθνΤ5Β Р6С5А1КЫШ

101 НЬСЕСНСЗЗЬ ΥΙΡΰδϋΡΤΡΙ, УЬСЫЗСМРАК ККИАРУУЬИС ЬТСЗЗАЗКАК

151 νΚΙδΤΜΕΙΕΟ СНСЗРКА

ЗЕО Ю N0:9 (Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность белка ΙΝ3Ρ002 без сигнального пептида-зрелый полипептид ΙΝ3Ρ002)

АССССТОААС СССАСТСТСС ТС6АССТСА6 ТССТбббСТб САСССААТСА САССТбббСТ

СТССССССАС ССССССТССС СССАСТССТС ССАССТТСТС СССТТ666А6 СТССААСССС

121 ТТСТТ666СС Т6САСААА6С САОБСАбСТб 666АТ666СА ббСТБСАбСб Т666САА6АС

181 САССТСССТС СТ6Т6АСТСТ 6СС6СТОААС ССТСАббААб ТбАТССАббб САТСТСТААС

241 бСТСТбСССТ ТССТТСА66Т СТТСТССССС ССССССТОСТ САбССАТАСС ССТСССАААТ

301 САТСТСТССТ ТТССТСАТТС СТССТСТСТС ТАСАТСССТС 6СТС66АССС САССССАСТА

361 СТССТСТССА АСАССТбТАТ 6ССТ6СТС6С АА6С6ТТ666 САССС6ТССТ ССТбТббТБТ

421 СТСАСТСССА ССТСАСССТС СССТСбАСбб СТСААСАТАТ ССАССАТССТ САТССАСССС

461 ТСТСАСТ6СА 6СССАААА6С АТСА

ЗЕО Ю N0:10 (Нуклеотидная последовательность экзона 1, кодирующего белок ΙΝ8Ρ002 без сигнального пептида-экзон 1 зрелого полипептида ΙΝ3Ρ002)

АССССТОААС СССАСТСТСС ТССАССТСАб ТССТбббСТб САСССААТСА 6АССТССССТ

СТССССССАС БОбСССТССС СССАСТССТС ССАССТТСТС СССТТСССАС СТССААСССС

121 ТТСТТССССС ТССАСАААСС САСССА6СТС СССАТССССА СССТССАССС ТССССААСАС

181 САССТСССТС СТСТСАСТСТ СССССТСААС ССТСАССААС ТСАТССАССС САТСТСТААС

241 ССТСТ6СССТ ТССТТСАС

ЗЕО 1И N0:11 (Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ΙΝ3Ρ002 без 5'-нетранслируемой-области)

АТ6СТССТТ ССССАССТАТ ССАСТСТТСТ СТСССТССТТ АСССССССССТ

БССТАСАСС СТСА6БСА66 ССТбААСССС АСТСТССТСС АССТСА6ТССТ

101 ССССТССАС ССААТСАСАС СТССССТСТС СССССАСССС СССТбСССССА

151 СТССТСССА ССТТСТСССС ТТСССАССТС СААССССТТС ТТСССССТССА

201 САААСССАС ССАССТСССС АТССССАССС ТССАСССТСС ССААСАССАСС

251 ТСССТССТб ТСАСТСТОСС ССТСААСССТ САССААСТСА ТССАССССАТС

301 ТСТААСССТ СТОСССТТСС ТТСАССТСТТ СТСССССССС СССТССТСАСС

351 САТАССССТ СС6АААТСАТ СТОТССТТТС СТСАТТССТС СТСТСТСТАСА

401 ТСССТС6СТ СССАССССАС СССАСТАСТС СТСТССААСА ССТСТАТСССТ

451 ССТСССААС С6ТТС66САС СССТССТССТ СТССТСТСТС АСТСОСАССТС

501 АСССТСССС ТССАССССТС ААСАТАТССА ССАТССТСАТ ССАССССТСТС

551 АСТ6СА6СС СААААССАТ6 А

ЗЕО Ю N0:12 (Нуклеотидная последовательность экзона 1, кодируюего белок ΙΝ3Ρ002 без 5'-нетранслируемой области)

АТССТССТТ ССССАССТАТ ССАСТСТТСТ СТСССТССТТ АСССССССССТ

БССТАСАСС СТСАСССАСС ССТбААСССС АСТСТССТСС АССТСАСТССТ

101 ССССТССАС ССААТСАСАС СТССССТСТС СССССАССбб СССТССССССА

- 35 007611

201 САААОССАС ССАССТ666С АТС66САССС ТССАСССТБС ССААСАССАбС

251 ТСССТССТС ТСАСТСТССС 6СТСААСССТ САССААСТОА ТССАСОССАТС

301 ТСТААСССТ СТССССТТСС ТТСАС

3Εζ> Ю N0:13 (Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант полипептида ΙΝ3Ρ002)

СТСОАСТССТ А6ТСАССТТС АЕСССАСТСС С6АСАСАСА6 АСАСбСАОАС АСАС6САССС

АСААОСАСАТ ССТССТТССС САССТАТССА СТСТТСТСТС ССТССТТАСС 6ССССССТСС

121 СТАСАОССТС АСССАССССТ СААССССАОТ СТССТССАСС ТСАБТССТ66 ССТССА6ССА

181 АТСАСАССТС СССТСТ6С6С ССА6СССССС ТССССССАСТ ССТ6ССАССТ ТСТОСССТТС

241 ССАССТССАА 6СССТТСТТС ОСССТССАСА ААСССАБОСА ССТСООСАТС СОСАС6СТСС

301 АбССТСОССА А6АССА66Т6 6СГ6СТ6ТСА СТСТССС6СТ 6ААСССТСАС СААСТСАТСС

361 АббСОАТСТО ТААСССТСТб СССТТС6ТТС ТСТСССО6СС ССбСТбСТСА 6ССАТАСССС

421 ТСС6АААТСА ТСТСТССТТТ ССТСАТТССТ ССТСТСТСТА САТСССТССС ТС6САССССА

481 ССССАСТАСТ ССТЕТССААС АбСТСТАТСС СТССТСССАА бСбТТббССА ССС6ТССТСС

541 ТбТОСТСТСТ САСТббСАСС ТСАСССТССС 6ТССАССС6Т СААОАТАТСС АССАТ6СТСА

601 ТССАбСССТС ТСАСТССАСС ССААААССАТ 6ААСТ6АССА ТСТССАТССб Т6САСССАСА

661 САСбСАССТТ ССАСАААТСА ССССАСАТСб АССААЕАААС АСбТбСАССТ 6САТ6АТ6Т

3Εζ) Ю N0:14 (Вариант полипептида ΙΝ5Ρ002)

МЫХЗД5ТЫ. СЬБЗОАЬРТб ЗСКРЕРЦЗРН ΡΟ&ΗΑΑΑΝΟΓ ЯАБбРСАБРР ЬУРА5А1£$М

КАГЬСЬОКАК ОБСКСКЬОКС ООЕУААУТБР БЯРОЕУЩСМ СКАУРБУЪБН РССЗАИШШ

121 НБСГСНСЗЗБ У1РС30РТРЬ УЪСЫЗСМРАК ККИАРУУБИС ЪТбЗЗАЗКНК УК15ТМЫЕб 161 СНСЗРКА .

ЗЕО Ю N0:15 (Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант полипептида ΙΝ3Ρ002 без 5'-нетранслируемой области)

121

181 241 301 361 421

481 541

АТ6СТССТТ6 6ССА6СТАТС САСТСТТСТ6 ТСАСССАССС СТСААССССА СТСТССТССА ТС66СТСТСС ОСССА6С6ОС ССТ6СССССА АА6СССТТСТ ТСССССТССА САААСССАСС СААОАСОАСС Т6ССТССТ6Т САСТСТ6ССС Т6ТАА6ОСТ6 Т6СССТТССТ ТСТСТССС66 САТСТСТССТ ТТ66ТСАТТС стсстстстс 6ТССТСТ6СА АСАОСТСТАТ СССТ0СТС6С СТСАСТ66СА еСТСАСССТС СССТССАССС Т6ТСАСТССА ССССААААСС А

ТСССТ6СТТА ССС6С6СССТ СССТАСАС6С ССТСАСТССТ ССССТССАСС СААТСАСАСС СТеСТСССАб СТТСТбСССТ ТбббАбСТбб САССТ006СА Т6СССАСССТ ССАСССТСОб

СТСААСССТС АСбААОТСАТ ССАОббСАТб ССС66СТ6СТ СА6ССАТАС6 ССТССОАААТ ТАСАТСССТ6 6СТС66АССС САССССАСТА ААбСОТТОбб САСССбТОбТ ССТСТССТСТ 6Т6ААСАТАТ ССАССАТССТ САТССАббСО

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид с функцией секреторного белка, являющегося членом суперсемейства цитокинов, имеющих в своей структуре цистеиновые узлы, предпочтительно с функцией члена подсемейства ΌΑΝ, где полипептид:

(ί) состоит из или представляет собой аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ю Ν0:6, 8ЕЦ ΙΌ Ν0:8 или 8ЕО ΙΌ Ν0:14;

(ίί) представляет собой фрагмент последовательности (ί) ; или (ίίί) идентичен полипептидам (ί) или (ίί) более чем на 70%.
2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что состоит из 7 или более аминокислотных остатков (например, из 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более) аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ Ν0:6, 8ЕЦ ГО Ν0:8 или 8ЕО ГО Ν0:14.
3. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по п.1 или 2.
4. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п.3, отличающаяся тем, что состоит из или представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕЦ ГО Ν0:5, 8ЕЦ ГО Ν0:9, 8ЕЦ ГО Ν0:11, 8ЕО ГО Ν0:13 или 8ЕО ГО Ν0:15.
5. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты по п.3 или 4 в условиях высокой жесткости.
6. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5.
7. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.6.
8. Антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.1 или 2 и которое предпочтительно ингибирует полипептид с активностью цитокина, имеющего структуру с цистиновыми узлами, предпочтительно полипептид с активностью подсемейства ΌΑΝ по п.1 или 2.
9. Применение полипептида по п.1 или 2 для лечения или диагностики заболевания.
10. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5 для лечения или диагностики заболевания.
11. Применение вектора по п.6 для лечения или диагностики заболевания.
12. Применение антитела по п.8 для лечения или диагностики заболевания.
13. Способ диагностики заболевания у пациента, предусматривающий оценку уровня экспрессии

- 36 007611 природного гена, кодирующего полипептид по п.1 или 2, или оценку активности полипептида по п.1 или 2 в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, отличный от указанного контрольного уровня, свидетельствует о наличии заболевания.
14. Способ по п.13, осуществляемый ш νί!ΐΌ.
15. Способ по п.13 или 14, который предусматривает стадии:

(a) контактирования антитела по п.8 с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса антитело-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.
16. Способ по п.13 или 14, предусматривающий стадии:

a) контактирования образца ткани, взятой у пациента, с нуклеотидным зондом в жестких условиях, при которых возможно образование гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5 и зондом;

b) контактирования контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и

c) обнаружения гибридных комплексов в указанных образцах; причем обнаружение уровней гибридного комплекса в образце пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, свидетельствует о наличии заболевания.
17. Способ по п.13 или 14, предусматривающий:

a) контактирование образца нуклеиновой кислоты из ткани, взятой у пациента, с нуклеотидным праймером в жестких условиях, при которых возможно образование гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5 и праймером;

b) контактирование контрольного образца с указанным праймером в условиях, аналогичных условиям стадии (а);

c) амплификацию образца нуклеиновой кислоты и

й) обнаружение уровня амплифицированной нуклеиновой кислоты в образцах, взятых у пациента, и в контрольных образцах, причем обнаружение уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в образце пациента, которые существенно отличаются от уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в контрольном образце, свидетельствует о наличии заболевания.
18. Способ по п.13 или 14, предусматривающий:

a) получение образца тканей пациента, исследуемого на наличие заболевания;

b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5 из указанного образца ткани и

c) диагностирование заболевания у пациента путем обнаружения мутации в молекуле нуклеиновой кислоты, связанной заболеванием, которая свидетельствует о наличии заболевания.
19. Способ по п.18, дополнительно предусматривающий амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты с образованием продукта амплификации и обнаружение наличия или отсутствия мутации в продукте амплификации.
20. Способ по п.18 или 19, где наличие или отсутствие мутации у пациента определяют путем осуществления контакта указанной молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеотидным зондом, который гибридизуется с указанной молекулой нуклеиновой кислоты в жестких условиях с образованием гибридной двухцепочечной молекулы, где гибридная двухцепочечная молекула имеет негибридизуемую часть цепи нуклеотидного зонда в любой области, соответствующей мутации, связанной с заболеванием; и обнаружение наличия или отсутствия негибридизуемой части цепи зонда, что свидетельствует о наличии или отсутствии связанной с заболеванием мутации.
21. Способ по любому из пп.13-20, где указанное заболевание выбрано из пролиферативного заболевания, аутоиммунного/воспалительного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания, неврологического расстройства, нарушения развития, метаболического расстройства, инфекции или другого патологического состояния.
22. Применение полипептида по п.1 или 2 в качестве секретируемого белка.
23. Применение полипептида по п.1 или 2 в качестве цитокина, предпочтительно в качестве цитокина с цистиновыми узлами, предпочтительно в качестве цитокина подсемейства ΟΛΝ с цистиновыми узлами.
24. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по п.1 или 2.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5.
26. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.6.
27. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по п.8.
28. Композиция вакцины, содержащая полипептид по п.1 или 2.
29. Композиция вакцины, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5.
30. Применение полипептида по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний.

- 37 007611
31. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5 для получения лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний.
32. Применение вектора по п.6 для получения лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний.
33. Применение антитела по п.8 для получения лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний.
34. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.24-27 для получения лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний.
35. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту полипептида по п.1 или 2.
36. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5.
37. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту вектора по п.6.
38. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту антитела по п.8.
39. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту фармацевтической композиции по любому из пп.24-27.
40. Способ по п.35, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда полипептид, вводимый пациенту, является антагонистом.
41. Способ по п.36, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда молекула нуклеиновой кислоты, вводимая пациенту, является антагонистом.
42. Способ по п.37, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда вектор, вводимый пациенту, является антагонистом.
43. Способ по п.38, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда антитело, вводимое пациенту, является антагонистом.
44. Способ по п.39, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда фармацевтическая композиция, вводимая пациенту, является антагонистом.
45. Способ по п.35, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда полипептид, вводимый пациенту, является антагонистом.
46. Способ по п.36, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда молекула нуклеиновой кислоты, вводимая пациенту, является антагонистом.
47. Способ по п.37, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда вектор, вводимый пациенту, является антагонистом.
48. Способ по п.38, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда антитело, вводимое пациенту, является антагонистом.
49. Способ по п.39, отличающийся тем, что в случае, когда при заболевании экспрессия природного гена или активность указанного полипептида у пациента с заболеванием выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, тогда фармацевтическая композиция, вводимая пациенту, является антагонистом.
50. Способ мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, предусматривающий мониторинг уровня экспрессии или активности полипептида по п.1 или 2 в течение определенного пе

- 38 007611 риода времени, при этом изменение указанного уровня экспрессии или активности за определенный период времени по сравнению с контрольным уровнем свидетельствует о регрессии указанного заболевания.
51. Способ мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, предусматривающий мониторинг уровня экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5 в течение определенного периода времени, при этом изменение указанного уровня экспрессии или активности за определенный период времени по сравнению с контрольным уровнем свидетельствует о регрессии указанного заболевания.
52. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, предусматривающий контактирование полипептида по п.1 или 2 с одним или несколькими соединениями, предположительно обладающими аффинностью связывания с указанным полипептидом, и отбор соединения, которое специфически связывается с указанным полипептидом.
53. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, предусматривающий контактирование молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5 с одним или несколькими соединениями, предположительно, обладающими аффинностью связывания с указанной молекулой нуклеиновой кислоты, и отбор соединения, которое специфически связывается с указанной молекулой нуклеиновой кислоты.
54. Набор, применяемый для диагностики заболевания, содержащий первый контейнер с нуклеотидным зондом, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5; второй контейнер с подходящими для амплификации указанными молекулами нуклеиновой кислоты; и инструкции по применению зонда и праймеров для осуществления диагностики заболевания.
55. Набор по п.54, отличающийся тем, что дополнительно содержит третий контейнер с агентом для расщепления негибридизованной РНК.
56. Набор, содержащий массив молекул нуклеиновой кислоты, по крайней мере одна из которых является молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5.
57. Набор, содержащий одно или более антител, который связываются с полипептидом по п.1 или 2; и реагент, используемый для обнаружения реакции связывания между указанным антителом и указанным полипептидом.
58. Трансгенное животное или животное с «нокаутом», не являющееся человеком, трансформированное таким образом, чтобы происходила повышенная или пониженная экспрессия полипептида по п.1 или 2, или экспрессия не происходила вообще.
59. Способ скрининга соединения, эффективного для лечения заболевания, предусматривающий контактирование трансгенного животного, не являющегося человеком, по п.58 с соединениемкандидатом и определение эффективности указанного соединения для лечения заболевания указанного животного.