MX2007001543A - Glucoproteina de superficie celular. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a una nueva proteina, denominada INSP201, identificada en la presente como una glucoproteina de superficie celular y al uso de esta proteina y a las secuencias de acido nucleico provenientes del gen de codificacion, en el diagnostico, prevencion y tratamiento de enfermedades.

Description

G UCOPROTEINA DE SUPERFICIE CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a una nueva proteína, denominada INSP201, identificada de aquí en adelante como una glucoproteína de superficie celular, y al uso de esta proteína y a las secuencias de ácido nucleico provenientes del gen de codificación, en el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas aquí son incorporadas totalmente por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El proceso de descubrimiento de fármacos está sufriendo actualmente una revolución fundamental ya que la era de los genómicos funcionales llega a la mayoría de edad. El término "genómicos funcionales" aplica a un procedimiento que utiliza herramientas bioinformáticas para adscribir funciones a las secuencias proteicas de interés. Tales herramientas se están volviendo cada vez más necesarias ya que la velocidad de generación de datos de secuencias está rebasando rápidamente la habilidad de los laboratorios de investigación para asignar funciones a estas secuencias de proteínas . Ref: 179526 Conforme se incrementan las herramientas bioinformáticas en potencia y en precisión, estas herramientas están reemplazando rápidamente a las técnicas convencionales de caracterización bioquímica. Por supuesto, las herramientas bioinformáticas avanzadas utilizadas en la identificación de la presente invención son ahora capaces de producir resultados en los cuales puede ser colocado un alto grado de confianza. Diversas instituciones y organizaciones comerciales están examinando los datos de las secuencias conforme éstos se vuelven disponibles y están siendo realizados descubrimientos significativos en una base continua. No obstante, sigue existiendo una necesidad continua para identificar y caracterizar genes adicionales y los polipéptidos que los codifican, como objetivos para investigación y para descubrimiento de fármacos.

Proteínas secretadas La habilidad para que las células elaboren y secreten proteínas extracelulares es central a muchos procesos biológicos. Las enzimas, factores de crecimiento, proteínas de matriz extracelular y moléculas de señalización son todas secretadas por células. Esto es a través de la fusión de una vesícula secretora con la membrana plasmática.

En la mayoría de los casos, pero no todas, las proteínas son dirigidas al retículo endoplásmico y hacia las vesículas secretoras por un péptido de señal. Los péptidos de señal son secuencias que actúan en posición cis que afectan el transporte de las cadenas polipeptídicas desde el citoplasma hacia un compartimiento enlazado a la membrana, tal como una vesícula secretora. Los polipéptidos que son dirigidos a las vesículas secretoras son ya sea secretadas hacia la matriz extracelular o son retenidos en la membrana plasmática. Los polipéptidos que son retenidos en la membrana plasmática tendrán uno o más dominios transmembranales. Los ejemplos de proteínas secretadas que juegan un papel central en el funcionamiento de una célula son las citocinas, hormonas, proteínas de matriz extracelular (moléculas de adhesión) , proteasas y factores de crecimiento y diferenciación.

La invención está basada en el descubrimiento de que el polipéptido INSP201 es una glucoproteína de superficie celular. En una modalidad del primer aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido el cual: (i) comprende la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No. : 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16 y/o SEQ ID No.: 18; (ii) es un fragmento del mismo que es un miembro de la familia de glucoproteína de superficie celular, o tiene un determinante antigénico en común con los polipéptidos de (i) ; o (iii) como un equivalente funcional de (i) ó (ii) . Preferentemente, el polipéptido de acuerdo a este primer aspecto de la invención comprende la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No.: 12. Una proteína preferida tal comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No . : 8. De acuerdo a una segunda modalidad de este primer aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No . : 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No . : 12, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No.: SEQ ID No.: 16 y/o SEQ ID No . : 18. Preferentemente, un fragmento excluido del alcance de la presente invención es aquel que consiste de los primeros 79 aminoácidos de la SEQ ID No . : 8. Este fragmento ha sido descubierto en la entrada AX884746 de NCBI GenPept y en los siguientes documentos de patente a nombre de Genset: patentes Norteamericana US20050106595, US6822072, Japonesas JP2001269182, JP2002511259 , Europea EP1033401, Internacional WO9953051 y Norteamericana US6783961. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No. : 2 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido del exón 1 de INSP201". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No. : 4 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido del exón 2 de INSP201". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 6 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido del exón 3 de INSP201". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 8 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido del INSP201 de longitud completa". Aunque el Solicitante no desee estar comprometido por esta teoría, se postula que los primeros 21 aminoácidos del polipéptido de INSP201 forman un péptido de señal. El polipéptido del exón 1 de INSP201 sin esta secuencia de señal postulada es indicada en la SEQ ID No.: 10. La secuencia polipeptídica de INSP201 de longitud completa sin esta secuencia de señal postulada es indicada en la SEQ ID No. : 12. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 10 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido maduro del exón de INSP201" . El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 12 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido maduro de INSP201" . En la presente se indica que el polipéptido de INSP201 tiene un número de posibles sitios de N-glucosilación. En consecuencia, las glucoproteínas que comprenden o que consisten del polipéptido INSP201 modificado por N-glucosilación en uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de las posiciones correspondientes a Asnl24, Asnl56, Asnl88, Asn204, Asn220, Asn250, y Asn268 de la SEQ ID No. : 8 son incluidos en los aspectos de la invención. Se predice en la presente que el polipéptido INSP201 contiene una región transmembranal entre los residuos 406-427 inclusive de la SEQ ID No . : 8. En consecuencia, las variantes extracelulares del polipéptido INSP201 son incluidas como aspectos de la invención. Son preferidas tales variantes que incluyen formas extracelulares que comprenden o que consisten de los residuos de aminoácidos 1-405 de la SEQ ID No.: 8 ó 22-405 inclusive de la SEQ ID No.: 8, en sus formas apo y N-glucosilada como se describe en la presente. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 14 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido extracelular de INSP201" . El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 18 es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido extracelular maduro de INSP201" y excluye los aminoácidos que son predichos para formar el péptido de señal del polipéptido INSP201. Las variantes polipeptídicas de este tipo son de utilidad particular en ensayos de selección para ligandos, tales como ligandos secretados que se enlazan al polipéptido INSP201 y a otras proteínas de este tipo. Tales variantes pueden ser también utilizadas para la cuantificación de tales ligandos, por ejemplo, en el diagnóstico de enfermedades en las cuales juegan un papel estos ligandos y este polipéptido. La variante intracelular del polipéptido INSP201 es también incluida como un aspecto de la invención. Esta variante es un polipéptido que consiste de los residuos de aminoácidos 428-518 inclusive de la SEQ ID No . : 8. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 16 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido extracelular INSP201". El término "polipéptidos de INSP201" como se utiliza en la presente, incluye los polipéptidos que comprenden el polipéptido del exón 1 de INSP201, el polipéptido del exón 2 del INSP201, el polipéptido del exón 3 de INSP201, el polipéptido de INSP201 de longitud completa, el polipéptido maduro del exón 1 de INSP201, el polipéptido maduro de INSP201, el polipéptido extracelular de INSP201, el polipéptido extracelular maduro de INSP201 y el polipéptido intracelular de INSP201. Todos estos polipéptidos forman aspectos de la presente invención. Preferentemente, el polipéptido de acuerdo a las modalidades anteriores del primer aspecto de la invención, funciona como una proteína secretada, particularmente como un miembro de la familia de glucoproteína de superficie celular. Las glucoproteínas de superficie celular son de interés significativo para la biología humana, y de este modo para la fisiología y la salud. Por supuesto, la superficie exterior de la membrana celular juega un papel principal en el montaje y mantenimiento de la integridad del tejido. Las superficies externas de las células en desarrollo y diferenciadas, contienen moléculas receptoras que reconocen señales sistémicas, ligandos u hormonas. El enlace o la disociación de los ligandos controla algunas de las funciones diferenciadas de la célula, manteniéndola sintonizada con las necesidades del sistema completo. La superficie externa está también recubierta con glucoproteínas y proteoglicanos. Estos complejos grandes de proteína y polisacáridos proporcionan una matriz específica de tejido dentro de la cual las células de función similar pueden operar conjuntamente como un tejido coherente. En la embriogénesis la clasificación y adhesión entre sí de las células con una función común, es facilitada y probablemente controlada, a través de las especificidades moleculares de las superficies de glucoproteína y proteoglicano de las células. Las cadenas de carbohidrato están N- y 0-glucosídicamente enlazadas a las glucoproteínas que forman estructuras complejas. De hecho, las cadenas de N- y 0- glucano son ensambladas en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi por una secuencia controlada de reacciones de procesamiento de glucosiltransferasa y glucosidasa, sometidas a eventos reguladores específicos (por ejemplo, al nivel de la exploración de genes o localización de la enzima) . Esta regulación compleja da como resultado muchos cientos de estructuras, la gama de las cuales varía entre tipos celulares/tisulares o estado de desarrollo/diferenciación. Existe un interés creciente en enfermedades provocadas por glucosilación defectuosa, y en glucoproteínas terapéuticas producidas a través de la ruta de tecnología de ácido desoxirribonucleico (ADN, por sus siglas en inglés) recombinante. En particular, las células enfermas pueden tener proporciones relativas de estas estructuras que son a menudo característicamente diferentes de las normales, y pueden ser útiles para la evaluación del estado de la enfermedad y para el diagnóstico. El conocimiento de las estructuras de glucoproteína específicas de enfermedades y sus funciones pueden ser utilizadas terapéuticamente, en inmunoterapia, en el bloqueo de la adhesión celular o de la interferencia con otros procesos de enlace o biológicos (Brockhausen I et al., Acta Anat. 1998; 161 (1-4) : 36-78; Bhatia PK y Mukhopadhyay A, Adv Biochem Eng. Biotechnol. 1999: 64-155-201) .

Por ejemplo, la relación entre glucosilación/expresión de glucoproteínas y progresión/malignidad del cáncer (Dennis JW et al., Biochim Biophys Acta. 1999 Diciembre 6; 1473 (1) : 21-34) o enfermedades hereditarias (Dennis JW et al., Bioessays. 1999 Mayo; 21(5) :412-21) han sido estudiadas. Dado que las glucoproteínas son típicamente expresadas como mezclas de glucofor as, han sido desarrolladas diversas tecnologías para obtener materiales glucopeptídicos y glucoproteícos homogéneos para experimentos relevantes para la investigación biológica de las glucoproteínas (Grogan MJ et al., Annu Rev Biochem. 2002; 71:593-634) . Muchas glucoproteínas de la superficie celular son sometidas a proteólisis limitada por proteasas celulares. Este mecanismo de dispersión permite la secreción de los dominios extracelulares que pueden afectar las actividades de enlace de otras proteínas circulantes reconocidas por estas regiones extracelulares. De hecho, la dispersión de los dominios extracelulares, por alteración de las respuestas biológicas a estímulos exógenos, está involucrada en un número de procesos patofisiológicos, tales como inflamación, degeneración celular y apoptosis, y oncogénesis, como se estudia intensamente en los sistemas de receptores citocina/citocina (Mullberg J et al., Eur Cytokine Netw. 2000 Marzo; ll(l):27-38; Arribas J y Merlos-Suarez A Curr Top Dev Biol. 2003; 54:125-44; Dello Sbarba P y Rovida E; Biol. Chem. 2002 enero; 383 (1) : 69-83) . Los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden comprender además un marcador de histidina. Preferentemente, el marcador de histidina es encontrado en el extremo C del polipéptido. Preferentemente, el marcador de histidina comprende 1-10 residuos de histidina (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos). Más preferentemente, el marcador de histidina comprende 6 residuos de histidina. Un "determinante antigénico" de la presente invención puede ser parte de un polipéptido de la presente invención, el cual se enlaza a un sitio de combinación con el anticuerpo o a un receptor de célula T (TCR) . Alternativamente, un "determinante antigénico" puede ser un sitio sobre la superficie de un polipéptido de la presente invención al cual se enlaza una molécula de anticuerpo simple. En general, un antígeno tiene varios o muchos diferentes determinantes antigénicos y reaccionar con anticuerpos de muchas diferentes especificidades. Preferentemente, el anticuerpo es inmunoespecífico para un polipéptido de la invención. Preferentemente, el anticuerpo es inmunoespecífico para un polipéptido de la invención, el cual no es parte de una proteína de fusión. Preferentemente, el anticuerpo es inmunoespecífico para INSP201 o un fragmento del mismo. Los determinantes antigénicos consisten usualmente de agrupamientos superficiales de moléculas, químicamente activas, tales como cadenas de aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Preferentemente, el "determinante antigénico" se refiere a un grupo químico particular sobre un polipéptido de la presente invención que es antigénico, por ejemplo, que promueve una respuesta inmune específica. En un segundo aspecto, la invención proporciona una molécula purificada de ácido nucleico que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención. El término "molécula de ácido nucleico purificada" se refiere preferentemente a una molécula de ácido nucleico de la invención que (1) ha sido separada de al menos aproximadamente 50 por ciento de las proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales es encontrada naturalmente cuando el ácido nucleico total es aislado de las células fuentes, (2) no está enlazada a toda o una porción de un polinucleótido al cual está enlazada la "molécula de ácido nucleico purificada" en la naturaleza, (3) está operablemente enlazada a un polinucleótido al que no está enlazado en la naturaleza, o (4) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia de polinucleótido más grande. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención está sustancialmente libre de cualesquiera otras moléculas de ácido nucleico contaminantes u otros contaminantes que son encontrados en su ambiente natural que podrían interferir con su uso en la producción del polipéptido o su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación. En una modalidad preferida, las moléculas de ADN genómico son específicamente excluidas del alcance de la invención. Preferentemente, el ADN genómico mayor de 10 kbp (pares de kilobases) , 50 kbp, 100 kbp, 150 kbp, 200 kbp, 250 kbp ó 300 kbp son específicamente excluidos del alcance de la invención. Preferentemente, la "molécula purificada de ácido nucleico" consiste de cADN únicamente. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico purificada comprende la secuencia de ácido nucleico como se indica en la SEQ ID No . : 1 (que codifica para el polipéptido del exón 1 de INSP201) ; SEQ ID No.: 3 (que codifica para el polipéptido del exón 2 de INSP201) ; SEQ ID No.: 5 (que codifica para el polipéptido del exón 3 de INSP201) ; SEQ ID No.: 7 (que codifica para el polipéptido de INSP201) ; SEQ ID No.: 9 (que codifica para el polipéptido maduro del exón 1 de INSP201) ; SEQ ID No.: 11 (que codifica para el polipéptido maduro de INSP201) ; SEQ ID No.: 13 (que codifica para el polipéptido extracelular de INSP201) ; SEQ ID No.: 15 (que codifica para el polipéptido intracelular de INSP201) ; o SEQ ID No. : 17 (que codifica para el polipéptido extracelular maduro de INSP201) , o es un equivalente o fragmento redundante de cualquiera de estas secuencias. La invención proporciona además que la molécula purificada de ácido nucleico consiste de la secuencia de ácido nucleico como se indica en la SEQ ID No.: 1 (que codifica para el polipéptido del exón 1 de INSP201) ; SEQ ID No.: 3 (que codifica para el polipéptido del exón 2 de INSP201) ; SEQ ID No.: 5 (que codifica para el polipéptido del exón 3 de INSP201) ; SEQ ID No.: 7 (que codifica para el polipéptido de INSP201) ; SEQ ID No.: 9 (que codifica para el polipéptido maduro del exón 1 de INSP201) ; SEQ ID No.: 11 (que codifica para el polipéptido maduro de INSP201) ; SEQ ID No. : 13 (que codifica para el polipéptido extracelular de INSP201) ; SEQ ID No.: 15 (que codifica para el polipéptido intracelular de INSP201) ; o SEQ ID No.: 17 (que codifica para el polipéptido extracelular maduro de INSP201) , o es un equivalente o fragmento redundante de cualquiera de estas secuencias . En un tercer aspecto, la invención proporciona una molécula purificada de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones de alta exigencia con una molécula de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención. Las condiciones de hibridación de alta exigencia son definidas como incubación toda la noche a 422C en una solución que comprende 50% de formamida, 5XSSC (cloruro de sodio 150 mM, citrato trisódico 15 M, fosfato de sodio 50 mM (pH 7.5), solución Denhardts 5x, 10% de sulfato de dextrano y 20 microgramo/ml de ADN de esperma de salmón, recortado, desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 0. IX SSC aproximadamente 652C. Como se utiliza en la presente, "equivalente funcional" se refiere a una proteína o molécula de ácido nucleico que posee características funcionales o estructurales que son sustancialmente similares a una molécula de polipéptido o de ácido nucleico de la presente invención. Un equivalente funcional de una proteína puede contener modificaciones que dependen de la necesidad de tales modificaciones para la realización de una función específica. El término "equivalente funcional" está destinado a incluir los fragmentos, mutantes, híbridos, variantes, análogos o derivados químicos de una molécula. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o molécula de ácido nucleico que muestra una o más de las actividades funcionales de los polipéptidos de la presente invención. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una molécula de proteína o de ácido nucleico que muestra actividad sustancialmente similar en comparación con INSP201 o fragmentos del mismo en un ensayo adecuado para la medición de la actividad o función biológica. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una molécula de proteína o de ácido nucleico que muestra actividad idéntica o más alta en comparación con INSP201 o fragmentos del mismo, en un ensayo adecuado para la medición de la actividad biológica o la función biológica. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una molécula de proteína o de ácido nucleico que muestra 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% o más actividad en comparación con INSP201 o fragmentos del mismo en un ensayo adecuado para la medición de la actividad o función biológica. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o polipéptido capaz de mostrar una actividad in vivo o in vi tro sustancialmente similares como los polipéptidos de la invención. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o polipéptido capaz de interactuar con otras moléculas celulares o extracelulares de una manera sustancialmente similar a la manera en la cual la porción correspondiente de los polipéptidos de la invención lo haría. Por ejemplo, un "equivalente funcional" sería capaz, en un inmunoensayo, de disminuir el enlace de un anticuerpo al péptido correspondiente (por ejemplo, el péptido, la secuencia de aminoácidos del cual fue modificada para lograr el "equivalente funcional") del polipéptido de la invención o al polipéptido de la invención misma, donde el anticuerpo fue producido contra el péptido correspondiente del polipéptido de la invención. Una concentración equimolar del equivalente funcional disminuirá el enlace anteriormente mencionado del péptido correspondiente por al menos aproximadamente 5%, preferentemente entre aproximadamente 5% y 10%, más preferentemente entre aproximadamente 10% y 25%, aún más preferentemente entre aproximadamente 25% y 50%, y lo más preferentemente entre aproximadamente 40% y 50%. Por ejemplo, los equivalentes funcionales pueden ser completamente funcionales o pueden carecer de función en una o más actividades. De este modo, en la presente invención, las variaciones pueden afectar la función, por ejemplo, de las actividades del polipéptido que reflejan su identidad como una glucoproteína de la superficie celular. Un cuarto aspecto, la invención proporciona un vector tal como un vector de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención. En un quinto aspecto, la invención proporciona una célula hospedera transformada con un vector del cuarto aspecto de la invención. En un sexto aspecto, la invención proporciona un ligando que se enlaza específicamente a los miembros de las familia de glucoproteína de la superficie celular del primer aspecto de la invención. Preferentemente, el ligando inhibe la función de un polipéptido del primer aspecto de la invención que es un miembro de la familia de glucoproteínas de la superficie celular. Los ligandos para un polipéptido de acuerdo a la invención, pueden venir en diversas formas, incluyendo sustratos naturales o modificados, enzimas, receptoras, moléculas orgánicas pequeñas tales como moléculas orgánicas pequeñas naturales o sintéticas de hasta 2000 Da, preferentemente de 800 Da o menos, peptidomiméticos, moléculas inorgánicas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, miméticos y estructurales o funcionales de los anteriormente mencionados . En un séptimo aspecto, la invención proporciona un compuesto que es efectivo para alterar la expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención, o para regular la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención. Tales compuestos pueden ser identificados utilizando los ensayos y métodos de selección descritos en la presente. Un compuesto del séptimo aspecto de la invención puede ya sea incrementar (agonizar) o disminuir (antagonizar) el nivel de expresión del gen o la actividad del polipéptido. De manera importante, la identificación de la función del polipéptido INSP201 permite el diseño de métodos de selección capaces de identificar los compuestos que son efectivos en el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades. Las formas extracelular e intracelular del polipéptido INSP201 es probable que sean de utilidad particular en los métodos de selección de esta naturaleza. Los ligandos y compuestos de acuerdo al sexto y séptimo aspectos de la invención pueden ser identificados utilizando tales métodos. Estos métodos son incluidos como aspectos de la presente invención. Otro aspecto más de la invención radica en el uso de un gen de INSP201 o el polipéptido como un objetivo para la selección de moduladores de fármacos candidatos, particularmente fármacos candidatos activos contra trastornos relacionados a la glucoproteína de la superficie celular. Un aspecto adicional de esta invención radica en métodos de selección de los compuestos para terapia de los trastornos relacionados a la glucoproteína de la superficie celular, que comprenden determinar la habilidad de un compuesto para enlazarse a un gen o polipéptido INSP201 o un fragmento del mismo. Un aspecto adicional de esta invención radica en métodos de selección de compuestos para terapia de trastornos relacionados a glucoproteína de la superficie celular, que comprenden la prueba para la modulación de la actividad de un gen o polipéptido de INSP201, o un fragmento del mismo.

En un octavo aspecto, la invención proporciona un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, o un compuesto del séptimo aspecto de la invención, para el uso en terapia o diagnóstico de enfermedades en las cuales están implicados miembros de la familia de glucoproteína de la superficie celular. Tales enfermedades pueden incluir trastornos proliferativos celulares, incluyendo neoplasma, melanoma, tumores de pulmón, colorrectales, de mama, de páncreas, de cabeza y de cuello y otros tumores sólidos; trastornos mieloproliferativos tales como leucemia, linfoma no Hodgkin, lecucopenia, trombocitopenia, trastorno de angiogénesis, sarcoma de Kaposi; trastornos autoinmunes/inflamatorios, incluyendo alergia, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis, psoriasis e inflamación del tracto respiratorio, asma y rechazo de trasplante de órganos; trastornos cardiovasculares, incluyendo hipertensión, edema, angina, ateroesclerosis, trombosis, sepsis, choque, daño por reperfusión e isquemia, trastornos neurológicos que incluyen enfermedades del sistema nervioso central, enfermedad de Alzheimer, daño cerebral, esclerosis lateral amiotrófica y dolor, trastornos del tracto respiratorio, incluyendo enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis quística, trastornos del desarrollo; trastornos metabólicos que incluyen diabetes melitus, osteoporosis y obesidad, SIDA y enfermedad renal; infecciones que incluyen infección viral, infección bacteriana, infección fúngica e infección parasitaria, y otras condiciones patológicas. Preferentemente, las enfermedades son aquellas en las cuales están implicadas glucoproteínas de la superficie celular. Estas moléculas pueden ser también utilizadas en la fabricación de un medicamento para tratamiento de tales enfermedades. Estas moléculas pueden ser también utilizadas en la anticoncepción o para el tratamiento con trastornos reproductivos incluyendo la infertilidad. Las porciones de la presente invención (por ejemplo, los polipéptidos del primer aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, un vector del cuarto aspecto de la invención, una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, un ligando del sexto aspecto de la invención, un compuesto del séptimo aspecto de la invención, pueden tener utilidad particular en la terapia o diagnóstico de trastornos/enfermedades (los dos términos son utilizados intercambiablemente en la presente) que involucran inflamación, degeneración celular y apoptosis y oncogénesis. En un noveno aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad en un paciente, que comprende evaluar el nivel de expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención o la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención en tejido proveniente del paciente, y comparando el nivel de expresión o actividad a un nivel control, en donde un nivel es diferente al nivel control es indicador de enfermedad. Tal método será llevado a cabo preferentemente in vi tro . Pueden ser utilizados métodos similares para monitorizar el tratamiento terapéutico de la enfermedad en un paciente, en donde la alteración del nivel de expresión o actividad de un polipéptido o molécula de ácido nucleico sobre el periodo de tiempo hacia un nivel control es indicador de la regresión de la enfermedad. Un método preferido para detectar polipéptidos del primer aspecto de la invención comprende los pasos de: (a) poner en contacto un ligando, tal como un anticuerpo, del sexto aspecto de la invención con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar el complejo. Un número de diferentes métodos tales de acuerdo al noveno aspecto de la invención existe, como estará enterado el lector experto, tales como los métodos de hibridación de ácido nucleico con sondas cortas, análisis de mutación puntual, amplificación con reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y métodos que utilizan anticuerpos para detectar niveles de proteínas aberrantes. Pueden ser utilizados métodos similares en una base a corto o largo plazo para permitir que el tratamiento terapéutico de una enfermedad sea monitorizado en un paciente. La invención también proporciona los equipos que son útiles en esos métodos para diagnosticar la enfermedad. En un décimo aspecto, la invención proporciona el uso de un polipéptido del primer aspecto de la invención como una glucoproteína de superficie celular. Los usos adecuados de los polipéptidos de la invención como glucoproteínas de la superficie celular, incluyen el uso como un regulador del crecimiento celular, el metabolismo o diferenciación celulares, el uso como parte de un par receptor/ligando y el uso como un marcador de diagnóstico como una condición fisiológica o patológica. En un décimo primer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, o un compuesto del séptimo aspecto de la invención, en conjunto con un portador farmacéuticamente aceptable.

En un décimo segundo aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspectos de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, o un compuesto del séptimo aspecto de la invención, para el uso en la fabricación de un medicamento para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad incluyendo, pero no limitado a trastornos mieloproliferativos tales como leucemia, linfoma, síndromes mielodisplásticos y carcinoma, neoplasma, melanoma, tumores sólidos, de pulmón, colorrectales, de mama, del páncreas, de cabeza y cuello y otros tumores sólidos, trastornos sanguíneos tales como macroglobulinemia, enfermedad autoinmune y trastornos inflamatorios, incluyendo alergia, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis, psoriasis, esclerosis múltiple e inflamación del tracto respiratorio, asma y rechazo de trasplante de órganos, trastornos de células B, trastornos cardiovasculares, trastornos neurológicos, trastornos del desarrollo, trastornos de la fertilidad, trastornos metabólicos, SIDA, enfermedad renal, infecciones y otras condiciones patológicas . En un décimo tercer aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de una enfermedad en un paciente, que comprende administrarle al paciente un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, o un compuesto del séptimo aspecto de la invención. Para enfermedades en las cuales la expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención, o en el cual la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención, es menor en un paciente enfermo cuando se compara el nivel de expresión o actividad en un paciente saludable, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el ligando o compuesto administrado al paciente debe ser un agonista. De manera contraria, para enfermedades en las cuales la expresión del gen natural o la actividad del polipéptido es más alta en un paciente enfermo cuando se compara al nivel de expresión o actividad en un paciente saludable, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el ligando o el compuesto administrado al paciente debe ser antagonista. Los ejemplos de tales antagonistas incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido, ribozimas y ligandos, tales como anticuerpos. Los polipéptidos de INSP201 son glucoproteínas de superficie celular y de este modo tienen papeles en muchos estados de enfermedad. Los antagonistas de los polipéptidos de INSP201 son de interés particular ya que proporcionan una manera de modular estos estados de enfermedad. En un décimo cuarto aspecto, la invención proporciona animales no humanos transgénicos o suprimidos en un gen, que han sido transformados para expresar niveles más altos, bajos o ausentes de un polipéptido del primer aspecto de la invención. Tales animales transgénicos son modelos muy útiles para el estudio de enfermedades y pueden ser también utilizados en regímenes de selección para la identificación de compuestos que son efectivos en el tratamiento o diagnóstico de tal enfermedad. Un sumario de las técnicas y procedimientos estándares que pueden ser empleados con el fin de utilizar la invención se da más adelante. Se entenderá que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reactivos particulares descritos. Se debe entender también que la terminología utilizada en la presente es para fines de describir las modalidades particulares únicamente y no se pretende que esta terminología deba limitar el alcance de la presente invención. La extensión de la invención está limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones anexas . Las abreviaturas estándares para los nucleótidos y aminoácidos son utilizados en esta especificación.

La práctica de la presente invención empleada, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biológica molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia de aquellos que trabajan en el campo. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Los ejemplos de textos particularmente adecuados para la consulta incluyen los siguientes: Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); ADN Cloning, Volumen I y II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y SJ. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames y SJ. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986) ; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London) ; Scopes, (1987) Protein Purification: Principies and Practice, Segunda Edición (Springer Verlag, N.Y.); y Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir y C. C. Blackwell eds. 1986).

Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" incluye cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos uno al otro por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, por ejemplo, isósteros peptídicos. El término se refiere a cadenas cortas (péptidos y oligopéptidos) y a cadenas más largas (proteínas) . El polipéptido de la presente invención puede estar en la forma de una proteína madura o puede ser una pre- , pro-o prepro-proteína que puede ser activada por la escisión de la pre-, pro-, o prepro-porción para producir un polipéptido maduro activo. En tales polipéptidos, la pre-, pro-, o prepro-secuencia puede ser una secuencia guía o secretora, o puede ser una secuencia que es empleada para la purificación de la secuencia oligopeptídica madura. El polipéptido del primer aspecto de la invención puede formar parte de una proteína de fusión. Por ejemplo, es a menudo ventajoso incluir una o más secuencias adicionales de aminoácidos que pueden contener secuencias secretoras o guía, pro-secuencias, secuencias, que ayudan a la purificación, o secuencias que confieren más alta estabilidad de las proteínas, por ejemplo, durante la producción recombinante. Alternativa o adicionalmente, el polipéptido maduro puede ser fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) . Una proteína de fusión del polipéptido del primer aspecto de la invención puede, por ejemplo, comprender una fusión de inmunoglobulina, por ejemplo, una proteína fusionada que comprende todo o el fragmento del INSP201 extracelular (por ejemplo, INSP201-EC) , el cual está fusionado a toda o una porción de la inmunoglobulina. Los métodos para elaboración de proteínas de fusión a la inmunoglobulina son bien conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos en el documento WO 01/03737, por ejemplo. La persona experta en la técnica apreciará que la proteína de fusión resultante de la invención conserva sustancialmente la actividad biológica del polipéptido del primer aspecto de la invención, tal como, por ejemplo, la inhibición de IL-2 que puede ser medida en ensayos in vi tro descritos en el Ejemplo 6, o en un ensayo de cáncer como se describe en el Ejemplo 7, o en modelos animales de enfermedad inflamatoria del intestino, como se describe en el Ejemplo 8. La fusión puede ser directa, o vía un péptido ligador corto, el cual puede ser tan corto como de 1 a 3 residuos de aminoácidos de longitud o más largo, por ejemplo, 5, 7, 9, 11 ó 13 residuos de aminoácidos de longitud. El ligador puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met) , por ejemplo, o una secuencia ligadora de 13 aminoácidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducida entre el polipéptido del primer aspecto de la secuencia de la invención y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante tiene propiedades mejoradas, tal como un tiempo de residencia extendido en los fluidos corporales (vida media) actividad específica incrementada, nivel de expresión incrementado o la purificación de la proteína de fusión es facilitada. En una modalidad preferida, el polipéptido del primer aspecto de la invención es fusionado a la región constante de una molécula de Ig, por ejemplo una porción de Fc de una inmunoglobulina. Preferentemente, ésta es fusionada a regiones de cadena pesada, como los dominios CH2 y CH3 , opcionalmente con la región de bisagra de la IgGl humana, por ejemplo. La parte Fc puede ser por ejemplo mutada con el fin de prevenir actividades no deseadas, tal como el enlace del complemento, enlace a factores Fc, o similares . La generación de proteínas de fusión específicas que comprenden el polipéptido del primer aspecto de la invención, y una porción de una inmunoglobulina se describe en el Ejemplo 11 del documento WO 99/09063, por ejemplo. Otras isoformas de moléculas de IgG son también adecuadas para la generación de proteínas de fusión de acuerdo a la presente invención, tales como las isoformas IgG2 o IgG , u otras clases de Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, hetero- u homomultiméricas . Las proteínas de fusión adicionales del polipéptido del primer aspecto de la invención pueden ser preparadas mediante la fusión de los dominios aislados de otras proteínas que permiten la formación de dímeros, trímeros, etc. Los ejemplos para secuencias de proteínas que permiten la multimerización de los polipéptidos de la invención son dominios aislados de las proteínas tales como hCG (documento Internacional WO 97/30161) , colágeno X (documento Internacional WO 04/33486) , C4BP (documento Internacional WO 04/20639) proteínas Erb (documento Internacional WO 98/02540) , o péptidos enrollados (documento Internacional WO 01/00814) . Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por los genes, modificados ya sea por procesos naturales, tales como mediante procesamiento post-traduccional o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la materia. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar comúnmente presentes en los polipéptidos de la presente invención están la glucosilación, enlace de lípidos, sulfatación, ga ma-carboxilación, por ejemplo, de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación. Otras modificaciones potenciales incluyen acetilación, acilación, amidación, enlace covalente de la flavina, enlace covalente de una porción hemo, enlace covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, enlace covalente de un derivado lipídico, enlace covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, formación de ancla GPI, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, adición mediada por RNA de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier sitio en un polipéptido, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. De hecho, el bloqueo del extremo amino o carboxilo en un polipéptido o ambos, mediante una modificación covalente es común en los polipéptidos de origen natural y sintéticos y tales modificaciones pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención. Las modificaciones que ocurren en un polipéptido, a menudo serán una función de cómo es elaborado el polipéptido. Para los polipéptidos que son elaborados recombinantemente, la naturaleza y el grado de las modificaciones en gran parte serán determinadas por la capacidad de modificación post-traduccional de la célula hospedera particular, y de las señales de modificación que están presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido en cuestión. Por ejemplo, los patrones de glucosilación varían entre diferentes tipos de células hospederas . Los polipéptidos de la presente invención pueden ser preparados de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos aislados de origen natural (por ejemplo, purificados de células del cultivo) , polipéptidos producidos recombinantemente (incluyendo proteínas de fusión) , polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos que son producidos por una combinación de estos métodos (ver por ejemplo, Bray 2003, Nat Rev Drug Discov, 2(7):587-93; Casi y Hilvert 2003, Curr Opin Struct biol, 13(5) :589-94) . Los polipéptidos funcionalmente equivalentes del primer aspecto de la invención pueden ser polipéptidos que son homólogos al polipéptido INSP201. Se dice que dos polipéptidos son "homólogos", como el término se utiliza en la presente, si la secuencia de uno de los polipéptidos tienen un grado suficientemente alto de identidad o similitud a la secuencia del otro polipéptido. "Identidad" indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácidos es idéntico entre las secuencias. "Similitud" indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Los grados de identidad y similitud pueden ser fácilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. , ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M. , y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Los polipéptidos homólogos incluyen por lo tanto variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variantes geográficas dentro de la especie de la cual son derivados los polipéptidos) y mutantes (tales como mutantes que contienen sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos) del polipéptido INSP201. Tales mutantes pueden incluir polipéptidos en los cuales uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácidos conservado o no conservado (preferentemente, un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético. Tales sustituciones típicas están entre Ala, Val, Leu e lie; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; entre los residuos básicos Lys y Arg; o entre los residuos aromáticos Phe y Tyr. Particularmente preferidas son las variantes en las cuales varios, por ejemplo entre 5 y 10, 1 y 5, l y 3, l y 2 o solo 1 aminoácido están sustituidos, suprimidos o agregados en cualquier combinación. Especialmente preferidas son las sustituciones, adiciones o supresiones silenciosas que no alteran las propiedades y actividades de la proteína. También, especialmente preferidas a este respecto son las sustituciones conservadoras. Tales mutantes comprenden también polipéptidos en los cuales uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente. De acuerdo con la presente invención, cualquier sustitución puede ser preferentemente una sustitución "conservadora" o "segura" que es comúnmente definida como una sustitución que introduce aminoácidos que tienen propiedades químicas suficientemente similares (por ejemplo, aminoácidos básicos, positivamente cargados deben ser reemplazados por otro aminoácido básico, positivamente cargado) , con el fin de preservar la estructura y la función biológica de la molécula. La literatura proporciona muchos modelos sobre los cuales puede ser realizada la selección de sustituciones conservadoras de aminoácidos con base en los estudios estadísticos y fisicoquímicos sobre la secuencia y/o estructura de las proteínas (Rogov SI y Nekrasov AN, 2001) .

Los experimentos de diseño de proteínas han mostrado que el uso de subgrupos específicos de aminoácidos pueden producir proteínas plegables y activas, ayudando en la clasificación de sustituciones "sinónimas" de aminoácidos que pueden ser más fácilmente acomodadas en la estructura de la proteína, y que pueden ser utilizadas para detectar homólogos y parálogos funcionales y estructurales (Murphy LR et al, 2000) . Los grupos de aminoácidos sinónimos y los grupos de aminoácidos sinónimos más preferidos son mostrados en la Tabla 1. Las mutaciones no conservadoras, específicas, pueden ser también introducidas en los polipéptidos de la invención con diferentes propósitos. Las mutaciones que reducen la afinidad de la glucoproteína de la superficie celular pueden incrementar su habilidad para ser reutilizadas y recicladas, incrementando potencialmente su potencia terapéutica (Robinson CR, 2002). Los epitopos inmunogénicos eventualmente presentes en los polipéptidos de la invención pueden ser explotados para desarrollar vacunas (Stevanovic S, 2002), o eliminarlos mediante modificación de su secuencia siguiendo métodos conocidos para seleccionar mutaciones para incrementar la estabilidad de las proteínas, y para corregirlas (van den Buró B y Eijsink V. 2002; documentos Internacional WO 00/34317, WO 98/52976) . Los grupos sinónimos, alternativos, preferidos, para derivados de aminoácidos incluidos en los miméticos peptídicos son aquellos definidos en la Tabla 2. Una lista no exhaustiva de derivados de aminoácidos también incluyen el ácido amino-isobutírico (Aib), hidroxiprolina (Hyp), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-C00H, ácido indolin-2carboxílico, 4-difluoro-prolina, ácido L-tiazolidin-4-carboxílico, L-homoprolina, 3 , 4-deshidro-prolina, 3 , -dihidroxi-fenilalanina, ciclohexil-glicina y fenilglicina. Por "derivado de aminoácido" se entiende un aminoácido o entidad química similar a aminoácido diferente de uno de los 20 aminoácidos de origen natural codificados genéticamente. En particular, el derivado de aminoácido puede contener porciones alquilo lineales, ramificadas o cíclicas, sustituidas o no sustituidas, y pueden incluir uno o más heteroátomos. Los derivados de aminoácidos pueden ser elaborados de novo u obtenidos a partir de fuentes comerciales (Calbiochem-Novabiochem Ag, Suiza; Bachem, Estados Unidos) . Diversas metodologías para incorporar derivados de aminoácidos no naturales en proteínas, utilizando un sistema de traducción in vi tro e in vivo, para sondear y/o mejorar la estructura y función de las proteínas, se describen en la literatura (Dougherty DA, 2000) . Las técnicas para la síntesis y el desarrollo de los miméticos peptídicos, así como los miméticos no peptídicos, son también bien conocidos en la técnica (Golebiowski A et al., 2001; Hruby VJ y Balse PM, 2000; Sawyer TK, en "Structure Based Drug Design", editada por Veerapandian P, Marcel Dekker Inc., pg. 557-663, 1997) . Típicamente, una identidad mayor del 30% entre dos polipéptidos es considerada como una indicación de equivalencia funcional. Preferentemente, los polipéptidos funcionalmente equivalentes del primer aspecto de la invención, tienen un grado de identidad secuencial con el polipéptido INSP201, o con fragmentos activos del mismo, de más de 80%. Los polipéptidos más preferidos tienen grados de integridad mayores de 85%, 90%, 95%, 98% Ó 99%, respectivamente . Los polipéptidos funcionalmente equivalentes del primer aspecto de la invención pueden ser también polipéptidos que han sido identificados utilizando una o más técnicas de alineación estructural. Por ejemplo, la tecnología InPharmatica Genome Threader que forma un aspecto de las herramientas de investigación utilizadas para generar la base de datos de investigación Biopendium11 , puede ser utilizada (ver solicitud del PCT WO 01/69507) para identificar los polipéptidos de función actualmente desconocida, los cuales, mientras que tienen baja identidad de secuencia en comparación al polipéptido INSP201 se predice que son miembros de la familia de glucoproteína de la superficie celular, en virtud de compartir homología estructural significativa con la secuencia del polipéptido INSP201. Por "homología estructural significativa" se entiende que Inpharmatica Genome Threader predice dos proteínas que comparten homología estructural con una certidumbre de 10% y superior. El polipéptido del primer aspecto de la invención también incluye fragmentos del polipéptido INSP201 y fragmentos de los equivalentes funcionales del polipéptido INSP201, con la condición de que estos fragmentos sean miembros de la familia de glucoproteína de la superficie celular o que tenga un determinante antigénico en común con el polipéptido INSP201. Como se utiliza en la presente, el término "fragmento" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que parte de, pero no toda de la secuencia de aminoácidos del polipéptido INSP201 o uno de sus equivalentes funcionales. Los fragmentos deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos de la secuencia y dependiendo de la secuencia particular, n preferentemente es 7 ó más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más) . Fragmentos pequeños pueden formar un determinante antigénico . Preferentemente, la longitud mínima de un fragmento de acuerdo a la invención es de 6, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ó 500 aminoácidos.

Preferentemente, la longitud máxima de un fragmento de acuerdo a la invención es de 517, 515, 510, 500, 475, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 ó 50 aminoácidos. Preferentemente, la longitud mínima de una molécula de ácido nucleico que codifica para un fragmento de acuerdo a la invención es de 18, 30, 75, 150, 300, 450, 600, 750, 900, 1050, 1200, 1350, ó 1500 aminoácidos. Preferentemente, la longitud máxima de ácido nucleico que codifica para un fragmento de acuerdo a la invención es de 1551, 1545, 1530, 1500, 1425, 1350, 1200, 1050, 900, 750, 600, 450, 300 ó 150 aminoácidos. Preferentemente, la longitud máxima de un polipéptido de la presente invención es de 518, 520, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 ó 5000 aminoácidos. Preferentemente, la longitud máxima de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención es de 1554, 1560, 1750, 1800, 1950, 2100, 2400, 2700, 3000, 5000, 7500, 10000, 20000, 30000, 50000, 75000 o 100000 ácidos nucleicos. Los fragmentos del polipéptido INSP201 de longitud completa pueden consistir de la combinación de 2 o las 3 secuencias de exón vecinas en las secuencias de polipéptido INSP201, respectivamente. Tales fragmentos pueden ser de "permanencia libre" por ejemplo, no parte de o fusionado a otros aminoácidos o polipéptidos o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman una parte o región. Cuando está comprendido dentro de un polipéptido más grande, el fragmento de la invención lo más preferentemente forma una región continua simple. Por ejemplo, ciertas modalidades preferidas se refieren a un fragmento que tiene una región de pre- y/o pro-polipéptido fusionada al extremo amino del fragmento y/o una región adicional fusionada al extremo carboxilo del fragmento. No obstante, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande simple. Los polipéptidos de la presente invención o sus fragmentos inmunogénicos (que comprenden al menos un determinante antigénico) pueden ser utilizados para generar ligandos, tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, que son ínmunoespecífieos para los -polipéptidos. Tales anticuerpos pueden ser empleados para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos de la invención o para purificar los polipéptidos mediante cromatografía de afinidad. Los anticuerpos pueden ser también empleados como auxiliares de diagnósticos o terapéuticos, entre otras aplicaciones, como será aparente por aquellos expertos en la técnica. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad para los polipéptidos de la invención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a las moléculas intactas así como los fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de enlazarse al determinante antigénico en cuestión. Tales anticuerpos se enlazan de este modo a los polipéptidos del primer aspecto de la invención. Por "afinidad sustancialmente mayor" se entiende que existe un incremento mensurable en la afinidad por un polipéptido de la invención es comparación a la afinidad por proteína secretadas conocidas. Preferentemente, la afinidad es al menos de 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces o mayor para un polipéptido de la invención que para las proteínas secretadas conocidas tales como los miembros de la familia de glucoproteína de superficie celular. Preferentemente, existe un incremento mensurable en la afinidad de un polipéptido de la invención en comparación con las glucoproteínas de la superficie celular conocida. Si son deseados anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado, tal como un ratón, conejo, cabra o caballo puede ser inmunizado con un polipéptido del primer aspecto de la invención. El polipéptido utilizado para inmunizar el animal puede ser derivado mediante tecnología de ADN recombinante o puede ser sintetizado químicamente. Si se desea, el polipéptido puede ser conjugado a una proteína portadora. Los portadores comúnmente utilizados para los cuales pueden ser químicamente acoplados los péptidos, incluyen albúmina sérica bovina, tiroglobulina, y hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura. El polipéptido acoplado es luego utilizado para inmunizar el animal. El suero proveniente del animal inmunizado es recolectado y tratado de acuerdo a los procedimientos conocidos, por ejemplo, mediante cromatografí de inmunoafinidad. Los anticuerpos monoclonales para los polipéptidos del primer aspecto de la invención, pueden ser también fácilmente producidos por una persona experta en la técnica.

La metodología general para elaborar anticuerpos monoclonales utilizando tecnología del hibridoma, es bien conocido (ver por ejemplo, Kohler, G, y Milstein, C, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al, I munology Today 4:72 (1983); Colé et al., 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985) . Los paneles de anticuerpo monoclonales producidos contra los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden ser seleccionados para diversas propiedades, por ejemplo, el isotipo, epitopo, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son particularmente útiles en la purificación de los polipéptidos individuales contra los cuales están dirigidos. Alternativamente, los genes que codifican para los anticuerpos monoclonales de interés pueden ser aislados de hibridomas, por ejemplo, mediante técnicas de PCR conocidas en la materia, y clonados y expresados en vectores apropiados . Los anticuerpos quiméricos, en los cuales están unidas regiones variables no humanas o fusionados a regiones constantes humanas (ver por ejemplo, Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sic. Estados Unidos, 84, 3439 (1987)), pueden ser también de uso. El anticuerpo puede ser modificado para hacerlo menos inmunogénico en un individuo, por ejemplo, mediante humanización (ver Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. I munol, 147, 1709 (1991), Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 88, 34181 (1991); y Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). El término "anticuerpo humanizado" como se utiliza en la presente, se refiere a las moléculas de anticuerpo en las cuales los aminoácidos de CDR y otros aminoácidos seleccionados en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo donador no humano, han sido sustituidas en lugar de los aminoácidos equivalentes en un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado se asemeja de este modo estrechamente a un anticuerpo humano pero tiene la habilidad de enlace del anticuerpo donador. En una modalidad alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo "biespecífico", que es un anticuerpo que tiene dos diferentes dominios de enlace al antígeno, estando dirigido cada dominio contra un epitopo diferente. La tecnología de visualización de fago puede ser utilizada para seleccionar los genes que codifican para los anticuerpos con actividad de enlace hacia los polipéptidos de la invención, ya sea a partir de repertorios de genes V amplificados por PCR de los linfocitos provenientes de humanos seleccionados por poseer los anticuerpos relevantes, o de bibliotecas intactas (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos puede ser también mejorada por revoltura de cadena (Clackson, T. et al., (1991) Nature 352, 624-628). Los anticuerpos generados por las técnicas anteriores, ya sea policlonales o monoclonales, tienen utilidad adicional ya que éstos pueden ser empleados como reactivos en inmunoensayos, radioinmunoensayos (RÍA) o ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) . En estas aplicaciones, los anticuerpos pueden ser marcados con un reactivo analíticamente detectable, tal como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima. Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia un polipéptido de la presente invención son en general producidos en animales (por ejemplo, conejos o ratones) por medio de inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples del polipéptido INSP201 y un adyuvante. Puede ser útil conjugar un polipéptido de la presente invención a una proteína portadora que es inmunogénica en la especie que va a ser inmunizada, tal como la emocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura, suero, albúmina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soya. También, son utilizados agentes de agregación tales como alumbre para mejorar la respuesta inmune. Después de la inmunización, los animales son sangrados y el suero es evaluado para el título del anticuerpo anti-INSP201. Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia un polipéptido de la presente invención son producidos utilizando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Los ejemplos de métodos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los métodos de hibridoma y el método de hibridoma de células B humanas. También son proporcionadas por la invención las líneas celulares de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales reactivos con el polipéptido INSP201. Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser modificados para el uso como agentes terapéuticos. Una modalidad es un anticuerpo "quimérico" en el cual una porción de la cadena pesada (H) y/o ligera (L) es idéntica con u homologa a una secuencia correspondiente a anticuerpos derivados de una especie particular, que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas con u homologas a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otra especie, o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos. También se incluyen los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando éstos muestren la actividad biológica deseada. En otra modalidad más, un anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo "humanizado". En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en éste a partir de una fuente que es no humana. La humanización puede ser realizada, por ejemplo, utilizando métodos descritos en la técnica, mediante la sustitución de al menos una porción de una región de roedor de determinación de la complementariedad, para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano. El término "anticuerpo" o "inmunoglobulina" está destinado a abarcar anticuerpos policlonales y monoclonales.

El anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal reactivo con el antígeno. El término "anticuerpo" está también destinado a abarcar mezclas de más de un anticuerpo reactivo con el antígeno (por ejemplo, un coctel de diferentes tipos de anticuerpos monoclonales reactivos con el antígeno) . El término "anticuerpo" está destinado además a abarcar los anticuerpos enteros, fragmentos biológicamente funcionales de los mismos, anticuerpos de cadena simple, y anticuerpos genéticamente alterados estables, anticuerpos quiméricos que comprenden porciones de más de una especie, anticuerpos bifuncionales, conjugados de anticuerpo, anticuerpos humanizados y humanos. Los fragmentos de anticuerpo biológicamente emocionales, los cuales pueden ser también utilizados son aquellos fragmentos peptídicos derivados de un anticuerpo, que son suficientes para enlazarse al antígeno. El anticuerpo como se utiliza en la presente, se entiende que incluye el anticuerpo completo, así como cualesquiera fragmentos del anticuerpo (por ejemplo, F (ab' ). sub.2 , Fab', Fab, Fv) capaces de enlazarse al epitopo, al antígeno o al f agmento antigénico de interés . Por "anticuerpo purificado" se entiende uno que está suficientemente libre de otras proteínas, carbohidratos y lípidos con los cuales está naturalmente asociado. Tal anticuerpo "se enlaza preferentemente" a los polipéptidos INSP201 de la presente invención (o un fragmento antigénico de los mismos) , por ejemplo, no reconoce sustancialmente y se enlaza a otras moléculas antigénicamente no relacionadas. Un anticuerpo purificado de la invención es preferentemente inmunorreactivo con e inmunoespecífico para INSP201 de especie específica y más preferentemente inmunoespecífico para un INSP201 humano nativo. Por "se enlaza específicamente" se entiende alta avidez y/o alta afinidad de enlace de un anticuerpo a un polipéptido específico, por ejemplo, INSP201. El enlace del anticuerpo a su epitopo sobre este polipéptido específico es preferentemente más fuerte que el enlace del mismo anticuerpo a cualquier otro epitopo. Los anticuerpos que se enlazan específicamente a INSP201 pueden ser capaces de enlazarse a otros polipéptidos a un nivel débil, pero detectable (por ejemplo, 10% o menos del enlace mostrado al polipéptido de interés) . Tal enlace débil, o enlace antecedente, es fácilmente discernible del enlace del anticuerpo específico al compuesto o polipéptido de interés, por ejemplo, mediante el uso de controles apropiados . Preferentemente, la afinidad es de al menos 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces o mayor para un polipéptido de la invención que para otros miembros conocidos de la familia de INSP201. El término "anticuerpos genéticamente alterados" significa los anticuerpos donde la secuencia de aminoácidos ha sido variada de aquella de un anticuerpo nativo. Debido a la relevancia de las técnicas de ADN recombinantes para esta invención, no se necesita estar confinado a las secuencias de aminoácidos encontradas en los anticuerpos naturales; los anticuerpos pueden ser rediseñados para obtener características deseadas. Las posibles variaciones son muchas y van desde el cambio de solo uno hasta uno o unos pocos aminoácidos hasta el rediseño completo de, por ejemplo, la región variable o constante. Los cambios en la región constante, en general, serán realizados con el fin de mejorar o alterar las características, tales como la fijación del complemento, la interacción con membranas y otras funciones efectoras . Los cambios en la región variable serán realizados con el fin de mejorar las características de enlace al antígeno. El término "anticuerpo humanizado" o "inmunoglobulina humanizada" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una estructura humana, al menos una y preferentemente todas la regiones de determinación de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) provenientes de un anticuerpo no humano, y en las cuales alguna región constante presente es sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, al menos aproximadamente 85-90%, preferentemente al menos 95% idéntica. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDRs, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativa. Ver por ejemplo, Queen et al., patentes de los Estados Unidos Nos. 5,5301,101; 5,585,089; 5,693,762; y 6,180,370 (cada de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . "Los anticuerpos completamente humanizados" son moléculas que contienen la región variable y constante de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos completamente humanizados pueden ser utilizados potencialmente para uso terapéutico, donde son requeridos tratamientos repetidos para las enfermedades crónicas y de recaída tales como enfermedades autoinmunes. Un método para la preparación de anticuerpos completamente humanos consiste de la "humanización" del sistema inmune humoral de ratón, por ejemplo, la producción de cepas de ratón capaces de producir Ig humana (Xenomice) , por la introducción de varios locus de inmunoglobulina (Ig) humana dentro de ratones en los cuales han sido inactivados los genes de Ig endógenos. Los locus de Ig son extremadamente complejos en términos de su estructura física y reacomodo de genes y los procesos de expresión requeridos para producir al final una respuesta inmune amplia. La diversidad de anticuerpos principalmente degenerada por el reacomodo combinatorio entre los genes V, D y J diferentes, presentes en los locus de Ig. Estos locus también contienen los elementos reguladores intercalados, los cuales controlan la expresión del anticuerpo, la exclusión alélica, el cambio de clase y la maduración por afinidad. La introducción de los transgenes Ig humano no reacomodados dentro de ratones, ha demostrado que la maquinaria de recombinación de ratones es compatible con genes humanos. Además, los hibridomas que secretan los hu-mAbs específicos del antígeno, de diversos isotipos, pueden ser obtenidos mediante la inmunización de Xenomice con antígeno. Los anticuerpos completamente humanizados y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (Méndez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997); Buggemann et al., Eur. J. Immunol . 21:1323-1326 (1991); Tomizuka et al., Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 97:722-727 (2000) Patente Internacional WO 98/24893. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual la región constante viene de un anticuerpo de una especie (típicamente humana) y la región variable viene de un anticuerpo de otra especie (típicamente roedor) . Por lo tanto, los anticuerpos quiméricos son moléculas de los cuales se derivan diferentes porciones de diferentes especies de animales, tales como aquellas que tienen la región variable derivada de un Mab murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos son principalmente utilizados para reducir la inmunogenicidad en aplicación e incrementar los rendimientos en producción, por ejemplo, donde los Mabs murinos tienen más altos rendimientos a partir de los hibridomas pero más alta inmunogenicidad en humanos, tales que se usan los Mabs quiméricos humanos/murinos . Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly et al., Proc . Nati Acad. Sci . USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 81:6851- 6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125023 (publicada del 14 de Noviembre, 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el 19 de Febrero, 1985) ; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de Marzo, 1986); Neuberger et al., Solicitud del PCT WO 8601533, (publicada el 13 de Marzo, 1986); Kudo et al., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de Junio; 1986); Sahagan et al., J. Immunol . 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., Solicitud de Patente Internacional No. WO8702671 (publicada el 7 de Mayo, 1987); Liu et al., Proc. Nati . Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc . Nati . Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Better et al, Science 240:1041-1043 (1988); Riechmann et al., Nature 332:323-327. y Harlow y Lañe, ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, supra. Estas referencias son completamente incorporadas por referencia en la presente. Como se utiliza en la presente, la frase "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula que comprende una porción del anticuerpo capaz de enlazarse específicamente a un antígeno, un determinante antigénico o un epitopo. Se apreciará que el Fab y el (Fab') 2 y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden ser utilizados para la detección y cuantificación de sus antígenos de acuerdo a los métodos descritos en la molécula, para moléculas de anticuerpo intactas. Tales fragmentos son típicamente conducidos mediante escisión proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Con respecto a los antibióticos mencionados a todo lo largo de la presente, el término "anticuerpo monoclonal" se entiende que incluye los anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanizados, anticuerpos para anticuerpos anti-idiotípicos, (anticuerpo anti-anti-Id) que pueden ser marcados soluble o enlazada, así como fragmentos de los mismos, proporcionados por cualquier técnica conocida, tales como, pero no limitados a, escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para los antígenos, cuyas poblaciones contienen sitios de enlace al epitopo, sustancialmente similares. Los Mabs pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la materia. Ver por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); patente de los Estados Unidos No. 4,376,110; Ausubel et al., eds., Harlow y Lañe ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988.); y Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), los contenidos de cuyas referencias se incorporan completamente por referencia en la presente. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de los mismos. Un hibridoma que produce un mAb de la presente invención puede ser cultivado in vi tro, in si tu o in vivo. La producción de altos títulos de Mabs in vivo o in si tu hace éste el método de producción actualmente preferido. El término "anticuerpo monoclonal" se entiende también que incluye moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')2 que son capaces de enlazarse al antígeno . Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se despejan más claramente de la circulación, y pueden tener menos enlace de tejido no específico que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí . Med. 24:316-325 (1983)). Se dice que un anticuerpo monoclonal es "capaz de enlazarse" a una molécula si éste es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para enlazar por ende la molécula al anticuerpo. Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula, capaz de ser enlazada por un anticuerpo, cuyo antígeno es adicionalmente capaz de inducir que un animal produzca anticuerpos capaces de enlazarse a un epitopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epitopo. La reacción específica referida anteriormente se entiende que indica que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con un epitopo sobre su anticuerpo correspondiente, y no con la pluralidad de otros anticuerpos que pueden ser evocados por otros antígenos. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención, pueden ser utilizados para detectar cuantitativamente o cualitativamente sus antígenos en una muestra, o para detectar la presencia de células que expresan sus antígenos . Esto puede ser logrado por técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo fluorescentemente marcado (ver más adelante) aunado con microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o detención fluorométrica . Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) , útiles en la presente invención pueden ser empleados histológicamente, como en inmunofluorescencia o en microscopía inmunoelectrónica, para la detección in si tu de sus antígenos. La detección in si tu puede ser lograda mediante el retiro de un espécimen histológico de un paciente, y proporcionando el anticuerpo marcado de la presente invención a tal espécimen. El anticuerpo (o el fragmento) es preferentemente proporcionado por la aplicación o por la cobertura del anticuerpo marcado (o el fragmento) a una muestra biológica. A través del uso de tal procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de los antígenos sino también su distribución sobre el tejido examinado. Utilizando la presente invención, aquellos de experiencia ordinaria percibirán fácilmente que una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) pueden ser modificados con el fin de lograr tal detección in si tu . Tales ensayos para los antígenos comprenden típicamente la incubación de una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién cosechadas tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo de tejidos, en presencia de un anticuerpo marcado capaz de identificar los antígenos, y detectar el anticuerpo mediante cualquiera de un número de técnicas bien conocidas en la materia.

La muestra biológica puede ser acoplada a un soporte en fase sólida o portador tal como nitrocelulosa, u otro soporte o portador sólido que sea capaz de inmovilizar las células, las partículas celulares o las proteínas solubles. El soporte o portador puede ser luego lavado con amortiguadores solubles, seguido por tratamiento con un anticuerpo marcado de acuerdo con la presente invención, como se anotó anteriormente. El soporte o portador en fase sólida puede ser luego lavado con el amortiguador una segunda vez para eliminar el anticuerpo no enlazado. La cantidad de portador enlazado sobre el soporte o portador sólido puede ser luego detectada por medios convencionales. Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede ser adaptada para la utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como un ensayo de "dos sitios" o "intercalación". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento del anticuerpo) es enlazado a un soporte o portador sólido y se agrega una cantidad del anticuerpo soluble detectablemente marcado, para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado . Los anticuerpos de la invención pueden ser utilizados en conexión con la tecnología de cromatografía de inmunoafinidad. Más específicamente, los anticuerpos pueden ser colocados sobre la superficie de un material dentro de una columna de cromatografía. Después de esto, una composición que va a ser purificada puede hacerse pasar a través de la columna. Si la muestra que va a ser purificada incluye polipéptidos de INSP201 que se enlazan a los anticuerpos, esos polipéptidos de INSP201 serán removidos de la muestra y por ende purificados. Por lo tanto, en resumen, los métodos de diagnóstico pueden ser realizados in vi tro utilizando una muestra celular (por ejemplo, muestra de sangre, biopsia del nodulo linfático o tejido) de un mamífero o puede ser realizada mediante formación de imagen in vivo . Las composiciones que comprenden los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizadas para detectar la presencia de INSP201, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo, ELISA, FACS, etc. Una o más porciones de marcación pueden ser enlazadas a la inmunoglobulina humana o humanizada. Las porciones de marcación ejemplares incluyen colorantes radiopacos, agentes de radiocontraste, moléculas fluorescentes, moléculas marcadas en espín (giro) , enzimas, u otras porciones de marcación de valor diagnóstico, particularmente en técnicas de formación de imagen de resonancia magnética o radiológica. Una preparación de anticuerpo IgG de la presente invención puede ser ventajosamente purificada a partir de un antisuero de la presente invención utilizando purificación por afinidad de proteína G, preferentemente vía la inmunoprecipitación de proteína G. Un antisuero derivado de un animal inmunizado puede ser utilizado para la detección con sensibilidad óptima, vía el análisis de inmunoWestern Blot, inmunoprecipitación y ELISA, de los polipéptidos INSP201. En general, para aplicaciones que se benefician de la reproducibilidad óptima, la estandarización o la precisión, un anticuerpo purificado o fragmento de anticuerpo de la presente invención, capaz de enlazarse específicamente el antígeno objetivo será en general óptimo con relación a una preparación no purificada de la presente invención. Podrá ser apreciado por la persona de experiencia ordinaria en la técnica que un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una afinidad caracterizada por una constante de disociación de hasta 10"12 para un antígeno cognado, puede ser obtenido utilizando técnicas comunes en la materia. Como se describió anteriormente en la presente, la preparación puede comprender ventajosamente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo enlazado a cualquiera de diversos tipos de molécula detectable. Un fragmento de anticuerpo tiene la ventaja de ser más pequeño que un anticuerpo progenitor del cual éste es derivado, mientras que conserva sustancialmente especificidad de enlace idéntica del antígeno objetivo, o especificidad de enlace y afinidad de enlace, como el anticuerpo progenitor. De este modo, un fragmento de anticuerpo, en virtud de ser más pequeño que el anticuerpo progenitor, tendrá por ende en general biodistribución superior, y propiedades de difusión superiores (por ejemplo, sistémicamente in vivo, o en tejidos aislados) que los últimos. Un fragmento de anticuerpo que carece sustancialmente de una región Fc, tal como Fv de cadena simple, un Fab', un Fab y F(ab')2 o un CDR, es ventajosa para aplicaciones que involucran la exposición de la preparación a una molécula capaz de enlazarse específicamente a tal región Fc, y en la cual tal enlace es indeseable. Típicamente, esto puede involucrar un enlace no deseado de la región Fc expuesta a un receptor de Fc cognado, o un componente del complemento que se enlaza a Fc (por ejemplo, el componente Clq complemento, presente en suero) . Los receptores de Fc son mostrados sobre la superficie de los numerosos tipos de células inmunes, incluyendo: APCs profesionales, tales como células dendríticas; linfocitos B; y granulocitos tales como neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos, macrófagos y mastocitos. De este modo, la ausencia de una región Fc del fragmento de anticuerpo puede ser particularmente ventajosa para evitar una activación de célula inmune mediada por el receptor de Fc, no deseada, o una cascada del complemento mediada por componentes del complemento, particularmente cuando se administra la preparación in vivo a un individuo. Un F(ab')2 es un fragmento de una molécula de anticuerpo que contiene una porción divalente de enlace al antígeno, de una molécula de anticuerpo. Una preparación F(ab')2 de la presente invención puede ser convenientemente obtenida utilizando métodos estándares en la técnica mediante tratamiento de una preparación de anticuerpo de la presente invención, tal como un antisuero de la presente invención, con la enzima pepsina. El producto F(ab')2 resultante es una partícula 5S. Un Fab o Fab' es un fragmento de una molécula de anticuerpo que contiene una porción monovalente de enlace al antígeno, de un anticuerpo. La CDR puede ser generada, por ejemplo, como se describe en la patente Europea EP0585939 o como se describe por Strandberg et al. (Protein Eng. 2001 Enero; 14 (1) : 67-74) . La CDR de acuerdo a la invención puede ser una CDR modificada, la cual tiene efecto mejorado sobre la modulación del polipéptido INSP201. Un ejemplo para los métodos de modificación de los péptidos activos se describe por Sawa et al. 1999 (J. Med. Chem. 42, 3289-3299). Una preparación de Fab' de la presente invención puede ser convenientemente obtenida utilizando métodos estándares en la técnica mediante tratamiento de una preparación de anticuerpo de la presente invención, tal como un antisuero de la presente invención, con la enzima pepsina, seguido por reducción del F(ab')2 resultante. Tal reducción puede ser efectuada utilizando un agente reductor de tiol, y utilizando opcionalmente un grupo bloqueador para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de los enlaces disulfuro. Tal tratamiento genera dos Fab's monovalentes de 3.5S y un fragmento Fc . Una preparación Fab puede ser convenientemente obtenida utilizando métodos estándares mediante tratamiento de una preparación de anticuerpo de la presente invención, tal como un antisuero de la presente invención, con la enzima papaína para producir la cadena ligera intacta, y una porción de la cadena pesada compuesta de los dominios variables C1. Una guía amplia para generar un fragmento de anticuerpo por tratamiento enzimático de un anticuerpo, es proporcionada en la literatura de la técnica (por ejemplo, referirse a: Goldenber, patentes de los Estados Unidos Nos. 4,036,945 y 4,331,647; Porter RR. , 1959. Biochem J. 73:119-126) . Un Fb de cadena simple (también denominado en la técnica "scFv") es una molécula de cadena simple que incluye la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, enlazadas por un ligador polipeptídico adecuado . Un F(ab')2, Fab', Fab, o Fv de cadena simple o preparación de CDR de la presente invención puede ser obtenido utilizando técnicas recombinantes. La obtención de un fragmento de anticuerpo recombinante es efectuada mediante el aislamiento del mARN de linfocitos B de animales inmunizados con el antígeno objetivo, generando el cADN a partir del mRNA vía RT-PCR, y utilizando el cADN para construir una biblioteca de visualización de vago del fragmento de anticuerpo. Los linfocitos B pueden ser convenientemente aislados del bazo, o alternativamente, de la sangre, de la médula ósea, o de los nodulos linfáticos del animal inmunizado. Se apreciará que la metodología anteriormente descrita puede ser utilizada para obtener una preparación de fragmentos de anticuerpos monoclonales de la presente invención que tienen esencialmente cualquier afinidad y/o especificidad de enlace al antígeno objetivo, deseada. Tal preparación puede ser utilizada en diversas aplicaciones que se benefician de un reactivo capaz de enlazarse al antígeno objetivo, con tales características de enlace al antígeno objetivo definidas. Ya que un Fab' es esencialmente similarmente en la escritura a un Fab, una preparación de la presente invención que comprende un Fab' puede ser empleada esencialmente intercambiablemente con una que comprende un Fab, donde tal Fab' y Fab comprenden esencialmente las mismas regiones variables de cadena pesada y ligera. Para aplicaciones, como será usualmente el caso, el beneficio de la preparación de la presente invención que comprende un anticuerpo capaz de enlazarse al antígeno objetivo con afinidad máxima, una preparación de F(ab')2 de la presente invención puede ser superior a una preparación de Fab, Fab' o scFv de la presente invención, debido al enlace divalente de un F(ab')2 al antígeno objetivo, con relación al enlace monovalente de tal fragmento de anticuerpo monovalente. Como se mencionó anteriormente en la presente, dependiendo de la aplicación y el propósito, la preparación del anticuerpo del fragmento de anticuerpo puede originarse de cualquiera de las especies de mamíferos. Una preparación de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención que se origina de una especie deseada, puede ser derivado del suero del animal de tal especie inmunizada con el antígeno objetivo. La preparación de la presente invención de un anticuerpo humano o humanizado o fragmento de anticuerpo puede ser preferible para aplicaciones que involucran la administración de la preparación a un individuo. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano o humanizado tenderá en general a ser óptimamente tolerado inmunológicamente, y por lo tanto mostrará una vida media in vivo óptima en un humano, y por lo tanto mostrará efectividad óptima. La guía adicional respecto a la producción y explotación de anticuerpos humanos o humanizados es proporcionada más adelante en la presente. La preparación puede ser utilizada per se o ésta puede ser formulada con un ingrediente activo en una composición farmacéutica. De este modo, de acuerdo a la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y, un ingrediente activo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. Los métodos de formulación del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención como un ingrediente activo en una composición farmacéutica y los métodos de explotar tal composición farmacéutica, son descritos más adelante en la presente. Preferentemente, la administración del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo es efectuada mediante la administración de la composición farmacéutica de la presente invención que comprende el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de la presente invención como un ingrediente activo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo es preferentemente administrado para alcanzar un nivel suficiente de fragmento del anticuerpo enlazado al antígeno objetivo para lograr así una regulación deseada de la actividad bioquímica. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica, tal como un médico, más preferentemente un médico especializado en la enfermedad, poseerá la experiencia requerida para determinar un protocolo terapéutico adecuado, incluyendo una ruta adecuada de administración, y una dosis adecuada del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo, para tratar de manera efectiva la enfermedad de acuerdo a las enseñanzas de la presente invención. Como se describió anteriormente en la presente, el antígeno objetivo (por ejemplo, INSP201) , que es un polipéptido, puede ser obtenido de diversas formas. Preferentemente, el antígeno objetivo es obtenido por medio de metodología de síntesis química orgánica. El antígeno objetivo puede ser químicamente sintetizado utilizando, por ejemplo, técnicas estándares en fase sólida. Tales técnicas incluyen la síntesis en fase sólida exclusiva, métodos de síntesis en fase sólida parcial, condensación de fragmentos, síntesis de solución clásica. Los procedimientos de síntesis de polipéptidos en fase sólida son bien conocidos en la técnica [por ejemplo, referirse a Stewart et al., en Solid Phase Peptide Synthesis", 2a. ed. , Pierce Chemical Company, (1984)]. Un polipéptido sintético puede ser purificado mediante un procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución, preparativa, tal como se describe por Creighton T. [Proteins, structures and molecular principies, W. H. Freeman and Co. N.Y. (1983)] y su secuencia de aminoácidos puede ser confirmada por medio de procedimientos estándares de secuenciamiento de aminoácidos. Como se describió anteriormente en la presente, la preparación es preferentemente derivada por inmunización de un mamífero con el antígeno objetivo. La generación de la preparación in vivo puede ser ventajosamente efectuada por inyección repetida del antígeno objetivo dentro de un mamífero en presencia de adyuvante de acuerdo a un esquema que dispara la producción del anticuerpo en el suero. En casos donde el antígeno objetivo es demasiado pequeño para promover una respuesta inmunogénica adecuada [denominado como un "hapteno" en la técnica) , el hapteno puede ser acoplado a un portador antigénicamente neutro, tal como la hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura (KLH) o albúmina sérica [por ejemplo, albúmina sérica bovina (BSA)] portadores (por ejemplo, referencia a las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,189,178 y 5,239,078). El acoplamiento de un hapteno a un portador puede ser efectuado utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el acoplamiento directo de grupos amino puede ser efectuado y opcionalmente seguido por reducción del enlace imino formado. Alternativamente, el portador puede ser acoplado utilizando agentes de condensación tales como diciciohexilcarbodiimida u otros agentes de deshidratación tipo carbodiimida. Los compuestos enlazadores pueden ser también utilizados para efectuar el acoplamiento; los enlazadores homobifuncionales y heterobifuncionales son disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, III. El complejo in unogénico resultante puede entonces ser inyectado dentro de sujetos mamíferos adecuados tales como vacas, ovejas, ratones, conejos y similares. Después de la generación in vivo de un anticuerpo, su título en suero en el mamífero hospedero puede ser fácilmente medido utilizando procedimientos de inmunoensayo que son bien conocidos en la técnica. Como se describió anteriormente en la presente, la preparación puede comprender ventajosamente un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo. Los anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpo son anticuerpos quiméricos manipulados por ingeniería genética o fragmentos de anticuerpo que tienen porciones-preferentemente mínimas-derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos en los cuales las regiones de determinación de la complementariedad de un anticuerpo humano (anticuerpo del recipiente) son reemplazadas por residuos provenientes de una región de determinación de la complementariedad de una especie no humana (anticuerpo del donador) tal como un ratón, rata o conejo que tiene la funcionalidad deseada. En algunos casos, los residuos de la estructura Fv del anticuerpo humano son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden también comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo de recipiente ni en la región de determinación de la complementariedad, importada, o las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos de uno y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones de determinación de la complementariedad corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano y todas, o sustancialmente todas las regiones estructurales corresponden a aquellas de una secuencia de consenso humana relevante. Los anticuerpos humanizados también incluyen óptimamente al menos una porción de una región constante de anticuerpo, tal como una región Fc, típicamente derivada de un anticuerpo humano (ver por ejemplo, Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechman et al., 1988. Nature 332:323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. "Struct. Biol. 2:593:596). Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos o fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en éste a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son a menudo denominados como residuos importados que son típicamente tomados de un dominio variable importado. La humanización puede ser esencialmente realizada como se describe (ver por ejemplo: Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988. Science 239:1534-1536; patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) mediante la sustitución de regiones humanas de determinación de la complementariedad, con las regiones de determinación de la complementariedad de roedor, correspondientes. En consecuencia, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente proveniente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados pueden ser típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la región de determinación de la complementariedad, y posiblemente algunos residuos estructurales están sustituidos por residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Los anticuerpos humanos o los fragmentos de anticuerpos humanos pueden ser también producidos utilizando diversas técnicas conocidas en la materia, incluyendo bibliotecas de visualización de fagos [ver por ejemplo, Hoogenboom y Winter, 1991. J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Colé et al., "Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy", Alan R. Liss, pp. 77 (1985); Boerner et al., 1991. J. Immunol . 147:86-95). Los anticuerpos humanizados pueden también ser elaborados mediante la introducción de secuencias que codifican para los locus de inmunoglobulina humana dentro de animales transgénicos, por ejemplo, dentro de ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos, han sido parcial o completamente inactivados. Después del reto antigénico, es observada la producción de anticuerpo humano en tales animales que se asemeja estrechamente a aquella observada en humanos en todos aspectos, incluyendo el reacomodo de genes, el ensamblaje de la cadena, y el repertorio de anticuerpos. Una guía amplia para practicar tal procedimiento, es proporcionada en la literatura de la técnica (por ejemplo, referirse a las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 6,625,126, 5,633,425, y 5,661,06; Marks et al., 1992. Bio/Technology 10:779-783; Lonberg et al., 1994. Nature 368:856-859; Morrison, 1994. Nature 368:812-13; Fishwild et al., 1996. Nature Biotechnology 14:485-51; Neuberger, 1996. Nature Biotechnology 14:826; Lonberg y Huszar, 1995. Intern. Rev. Immunol. 13:64-93).

Los anticuerpos antagonistas dirigidos a INSP201 enlazada a la membrana, son útiles para el tratamiento de inflamación y/o trastornos autoinmunes. Los anticuerpos agonistas dirigidos a INSP201 enlazado a la membrana son útiles para el tratamiento del cáncer, HIV y/o EBV e infecciones por hepatitis B. La actividad de los anticuerpos dirigidos hacia INSP201 puede ser demostrada por los ensayos y/o modelos de animales como se describen en los Ejemplos 6 al 8. Las moléculas de ácido nucleico preferidas del segundo y tercer aspecto de la invención son aquellas que codifican para una secuencia polipeptídica como se indica en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No . : 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No . : 12, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No.: 16 y SEQ ID No . : 18 y los polipéptidos funcionalmente equivalentes. Estas moléculas de ácido nucleico pueden ser utilizadas en los métodos y aplicaciones descritas en la presente. Las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden preferentemente al menos n nucleótidos consecutivos provenientes de las secuencias descritas en la presente, donde, dependiendo de la secuencia particular, n es 10 o más (por ejemplo, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 ó más) . Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen secuencias que son complementarias a las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente (por ejemplo, para fines de antisentido o sondeo) . Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en la forma de RNA, tales como mRNA, o en la forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, el cADN, ADN sintético o ADN genómico. Tales moléculas de ácido nucleico pueden ser obtenidas mediante la clonación, por técnicas sintéticas químicas o por combinación de las mismas. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante síntesis química utilizando técnicas tales como síntesis química de fosforamidita en fase sólida, a partir de bibliotecas genómicas o de cADN o mediante separación a partir de un organismo. Las moléculas de RNA pueden ser en general generadas mediante la trascripción in vitro o in vivo de las secuencias de ADN. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser de doble hebra o de una sola hebra. El ADN de una sola hebra puede ser la hebra de codificación, también conocida como la hebra en sentido, o ésta puede ser la hebra de no codificación, también denominada como la hebra anti-sentido. El término "molécula de ácido nucleico" también incluye los análogos de ADN y de RNA, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas, y ácidos nucleicos peptídicos (PNA) . El término "PNA" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula antisentido o un agente anti-gen, el cual comprende un oligonucleótido de al menos 5 nucleótidos de longitud enlazado a una cadena principal peptídica de los residuos de aminoácidos, que termina preferentemente en lisina. La lisina terminal confiere solubilidad a la composición. Los PNAs pueden ser pegilados para extender su lapso de vida en una célula, donde éstos se enlazan preferentemente al ADN o al RNA de hebra simple, complementario, y detienen el alargamiento del transcrito (Nielsen, P.E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63). Una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de esta invención puede ser idéntica a la secuencia de codificación de una o más moléculas de ácido nucleico descritas en la presente. Estas moléculas pueden también tener una secuencia diferente la cual, como resultado de la degeneración del código genético, codifica para un polipéptido como se indica en cualquiera de las SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No . : 8, SEQ ID No. : 10, SEQ ID No . : 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No . : 16 y SEQ ID No.: 18. Tales moléculas de ácido nucleico pueden incluir, pero no están limitadas a, la secuencia de codificación para el polipéptido maduro por si mismo; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y secuencias de codificación adicionales, tales como aquellas que codifican para una secuencia guía o secretora, tal como una secuencia pro-, pre- o prepro-polipeptídica; la secuencia de codificación del polipéptido maduro, con o sin la secuencia de codificación adicionales anteriormente mencionadas, junto con secuencias de no codificación adicionales, incluyendo la secuencia 5' y 3' de no codificación, tales como las secuencias transcritas, no traducidas que juegan un papel en la transcripción (incluyendo señales de terminación) , enlace al ribosoma y estabilidad del mRNA. Las moléculas de ácido nucleico pueden también incluir secuencias adicionales que codifican para aminoácidos adicionales, tales como aquellas que proporcionan funcionalidades adicionales. Las moléculas de ácido nucleico del segundo y tercer aspectos de la invención pueden también codificar para los fragmentos o los equivalentes funcionales de los polipéptidos y fragmentos del primer aspecto de la invención. Tal molécula de ácido nucleico puede ser una variante de origen natural tal como una variante alélica de origen natural, o la molécula puede ser una variante que no se sabe que aparezca de manera natural . Tales variantes de origen no natural de la molécula de ácido nucleico pueden ser elaboradas mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a las moléculas de ácido nucleico, células u organismos. Entre las variantes a este respecto, están las variantes que difieren de las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas por sustituciones, supresiones o inserciones de nucléotidos. Las sustituciones, supresiones o inserciones pueden involucrar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en las regiones de codificación o no codificación o ambas. Las alteraciones en las regiones de codificación pueden producir sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos, conservadoras o no conservadoras . Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden también ser manipuladas por ingeniería genética, utilizando métodos en general conocidos en la materia, por una variedad de razones, incluyendo la modificación de la clonación, el procesamiento y/o expresión de producto génico (el polipéptido) . La revoltura de ADN mediante fragmentación aleatoria y reensamblaje por PCR de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos, son incluidas como técnicas que pueden ser utilizadas para manipular por ingeniería genética las secuencias nucleotídicas. La mutagénesis dirigida al sitio puede ser utilizada para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glucosilación, cambiar preferencia de codón, producir variantes de empalme, introducir mutagénesis y así sucesivamente. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido del primer aspecto de la invención pueden ser ligadas a una secuencia heteróloga, de modo que la molécula combinada de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión. Tales moléculas combinadas de ácido nucleico son incluidas dentro del segundo y tercer aspecto de la invención. Por ejemplo, para seleccionar las bibliotecas peptídicas para inhibidores de la actividad del polipéptido, puede ser útil expresar utilizando tal molécula de ácido nucleico combinada, una proteína de fusión que puede ser reconocida por un anticuerpo comercialmente disponible. Una proteína de fusión puede ser también manipulada por ingeniería genética para contener un sitio de escisión localizado entre la secuencia del polipéptido de la invención y la secuencia de una proteína heteróloga, de modo que el polipéptido puede ser escindible y purificado de la proteína heteróloga. Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen las moléculas antisentido que son parcialmente complementarias a las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de la presente invención y que por lo tanto se hibridan a las moléculas de ácido nucleico de codificación (hibridación) . Tales moléculas antisentido, tales como los oligonucleótidos, pueden ser diseñadas para reconocer, para enlazarse específicamente a y para prevenir la transcripción de un ácido nucleico objetivo que codifica para un polipéptido de la invención, como será conocido por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica (ver por ejemplo Cohén; J.S.; Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem. 56, 560 (1991); Lee et al., - Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 256 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991). El término "hibridación" como se utiliza en la presente, se refiere a la asociación de los moléculas de ácido nucleico una con la otra mediante enlace de hidrógeno. Típicamente, una molécula será fijada a un soporte sólido y la otra estará libre en solución. Luego, las dos moléculas pueden ser colocadas en contacto una con la otra bajo condiciones que favorecen el enlace del hidrógeno. Los factores que afectan este enlace incluyen: el tipo y volumen del solvente, la temperatura de reacción; el tiempo de hibridación, la agitación, los agentes para bloquear el enlace no específico de la molécula en fase sólida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO) , la concentración de las moléculas; el uso de los compuestos para incrementar la velocidad de asociación de las moléculas (sulfato de dextrano o polietilenglicol) ; y la exigencia de las condiciones de lavado después de la hibridación (ver Sambrook et al . , [supra] ) . La inhibición de la hibridación de una molécula completamente complementaria a una molécula objetivo puede ser examinada utilizando el ensayo de hibridación, como es conocido en la técnica (ver por ejemplo, Sambrook et al. [supra] ) . Una molécula sustancialmente homologa competirá entonces por e inhibirá el enlace de una molécula completamente homologa a la molécula objetivo, bajo diversas condiciones de exigencia, tal como se muestra en Wahl, G.M. y S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) y Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511). "Exigente" se refiere a las condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de moléculas muy similares sobre la asociación de moléculas que difieren. Las condiciones de hibridación de alta exigencia que son definidas como la incubación toda la noche a 422C en una solución que comprende 50% de formamida, 5XSSC (cloruro de sodio 150 mM; citrato disódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardts 5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramo/ml de ADN de esperma de salmón, recortado, desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 0. IX SSC a aproximadamente a 65aC. Las condiciones de baja exigencia involucran la reacción de hibridación que se lleva a cabo a 352C (ver Sambrook et al. [supra]). Preferentemente, las condiciones utilizadas para la hibridación son aquellas de alta exigencia. Las modalidades preferidas de este aspecto de la invención son las moléculas de ácido nucleico que son al menos 70% idénticas sobre su longitud completa a una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido INSP201 que codifica para el polipéptido INSP201 y las moléculas de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias a tales moléculas de ácido nucleico. Preferentemente, una molécula de ácido nucleico de acuerdo a este aspecto de la invención comprende una región que es al menos 80% idéntica sobre su longitud completa a tales secuencias de codificación o es una molécula de ácido nucleico que es complementaria a éstas. A este respecto, las moléculas de ácido nucleico de al menos 90%, preferentemente al menos 95%, más preferentemente al menos 98%, 99% o más idénticas sobre su longitud completa a las mismas, son particularmente preferidas. Las modalidades preferidas en este aspecto, son las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función biológica o actividad del polipéptido INSP201. La invención también proporciona un proceso para detectar una molécula de ácido nucleico de la invención que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico de acuerdo a la invención con una muestra biológica bajo condiciones de hibridación para formar dúplex; y (b) detectar cualesquiera de tales dúplex que se forman. Como se discute además más adelante en conexión con los ensayos que pueden ser utilizados de acuerdo a la invención, una molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente, puede ser utilizada como una sonda de hibridación para RNA, cADN o ADN genómico, con el fin de aislar los cADNs de longitud completa y los clones genómicos que codifican para el polipéptido INSP201 y para aislar el cADN y los clones genómicos de los genes homólogos u ortólogos que tienen una alta similitud secuencial al gen que codifica para este polipéptido. A este respecto, las siguientes técnicas, entre otras conocidas en la materia, pueden ser utilizadas y son discutidas más adelante para fines de ilustración. Los métodos para secuenciamiento y análisis de ADN son bien conocidos y son en general disponibles en la técnica y pueden, por supuesto ser utilizados para practicar muchas de las modalidades de la invención discutida en la presente. Tales métodos pueden emplear enzimas tales como el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, la secuenasa (US Biochemical Corp, Cleveland, OH) . La polimerasa Taq (Perkin Elmer) , la polimerasa T7 termoestable (Amersham, Chicago, IL) , o combinaciones de polimerasas y exonucleasas de lectura de prueba tales como aquellas encontradas en el Sistema de Amplificación ELONGASE comercializado por Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) . Preferentemente, el proceso de secuenciamiento puede ser automatizado utilizando máquinas tales como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV) , el ciclador térmico Peltier (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) y el catalizador ABI y los secuenciadores de ADN 373 y 377 (Perkin Elmer) . Un método para el aislamiento de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido con una función equivalente a aquella del polipéptido INSP201, es sondear una biblioteca genómica o de cADN con una sonda natural o artificialmente diseñada utilizando procedimientos estándares que son reconocidos en la técnica (ver por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds). Greene Publisihing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992) . Las sondas que comprenden, al menos 15, preferentemente al menos 30, y más preferentemente al menos 50 bases contiguas que corresponden a, o son complementarias a las secuencias de ácido nucleico provenientes del gen de codificación apropiada (SEQ ID No.: 1 , SEQ ID No . : 3 , SEQ ID No . : 5 , SEQ ID No . : 7 , SEQ ID No . : 9, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No . : 13, SEQ ID No.: 15 y SEQ ID No.: 17), son sondas particularmente útiles. Tales sondas pueden ser marcadas con un reactivo analítico detectable para facilitar su identificación. Los reactivos útiles incluyen, pero no están limitados a, radioisótopos, colorantes fluorescentes y enzimas que son capaces de catalizar la formación de un producto detectable. Utilizando estas sondas, la persona de experiencia ordinaria en la técnica será capaz de aislar las copias complementarias de los polinucleótidos de ADN genómico, cADN o RNA que codifican para las proteínas de interés provenientes de humanos, mamíferos u otras fuentes animales, y seleccionando tales fuentes para secuencias relacionadas, por ejemplo, para miembros adicionales de la familia, tipo y/o subtipo. En muchos casos, las secuencias aisladas de cADN estarán incompletas, ya que la región que codifica para el polipéptido será recortada, normalmente en el extremo 5'. Son disponibles diversos métodos para obtener cADN de longitud completa, o para extender los cADNs cortos. Tales secuencias pueden ser extendidas utilizando una secuencia nucleotídica parcial, y empleando diversos métodos conocidos en la técnica para detectar las secuencias corriente arriba (5') tales como los promotores y los elementos reguladores. Por ejemplo, un método que puede ser empleado está basado en el método de la amplificación rápida de los extremos de cADN (RACE; ver por ejemplo, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de esta técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathón1® (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda para cADNs más largos. Una técnica ligeramente diferente, denominada PCR del "sitio de restricción" , utiliza cebadores universales para recuperar la secuencia de ácido nucleico desconocida a un locus conocido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). La PCR inversa puede ser también determinada para amplificar o para extender las secuencias utilizando cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186). Otro método más que puede ser utilizado es la PCR de captura que involucra la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en humano y el ADN cromosómico artificial de levadura (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119) . Otro método más que puede ser utilizado para recuperar secuencias desconocidas es aquel de Parker, J.D. et al. (1991); Nucleic Acides Res. 19:3055-3060). Además, se puede utilizar la PCR, los cebadores anidados, y las bibliotecas PromoterFinder1® para viajar a través del ADN genómico (Clontech, Palo Alto, CA) . Este proceso evita la necesidad para seleccionar bibliotecas y es útil para buscar uniones intrón/exón. Cuando se seleccionan los cADNs de longitud completa, es preferible utilizar bibliotecas que han sido seleccionadas en tamaño para incluir cADNs más grandes. También, las bibliotecas cebadas aleatoriamente son preferibles, ya que éstas contendrán más secuencias que contienen las regiones 5' de los genes. El uso de una biblioteca aleatoriamente cebada, puede ser especialmente preferible para situaciones en las cuales una biblioteca de oligos d(T) no produce un cADN de longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden ser útiles para la extensión de las secuencias hacia las regiones reguladoras 5' no transcritas . En una modalidad de la invención, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser utilizadas para la localización de cromosomas. En esta técnica, una molécula de ácido nucleico está específicamente dirigida a, y puede hibridarse con, un sitio particular sobre un cromosoma humano individual. El mapeo de las secuencias relevantes a los cromosomas de acuerdo a la presente invención es un paso importante en la correlación confirmatoria de esas secuencias con la enfermedad asociada al gen. Una vez que una secuencia ha sido mapeada a un sitio cromosómico preciso, la posición física de las secuencias sobre el cromosoma puede ser correlacionada con los datos del^ mapa genético. Tales datos son encontrados en, por ejemplo, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través Johns Hopkins University Welch Medical Library) . Las relaciones entre genes y enfermedades que han sido mapeadas a la misma región cromosómica, son luego identificadas a través de análisis de enlace (co-herencia de genes físicamente adyacentes) . Esto proporciona información valiosa a los investigadores que buscan genes de enfermedad utilizando clonación posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez que la enfermedad o el síndrome han sido crudamente localizados mediante enlace genético a una región genómica particular, cualquier mapeo de secuencias a esa área puede representar genes asociados o regulatorios para la investigación posterior. La molécula de ácido nucleico puede también ser utilizada para detectar diferencias en el sitio o localización cromosómica debido a translocación, inversión, etc., entre individuos normales, portadores o afectados. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención son también valiosas para la localización de tejidos. Tales técnicas permiten la determinación de patrones de expresión del polipéptido en tejidos por detección de los mRNAs que los codifican. Estas técnicas incluyen técnicas de hibridación in si tu y técnicas de amplificación de nucleótidos, tales como PCR. Los resultados de estos estudios proporcionan una indicación de las funciones normales del polipéptido en el organismo. Además, estudios comparativos del patrón de expresión normal de los mRNAs con aquel de los NAs codificados por un gen mutante, proporcionan introspectivas valiosas del papel de los polipéptidos mutantes en la enfermedad. Tal expresión inapropiada puede ser de una naturaleza temporal, espacial o cuantitativa . Los procedimientos de silenciamiento de genes pueden ser también emprendidos para subregular la expresión endógena de un gen que codifica para un polipéptido de la invención. La interferencia del RNA (RNAi) (Elbashir, SM et al., Nature 2001, 411, 494-498) es un método de silenciamiento de gen post-transcripcional, específico de secuencia que puede ser empleado. Los oligonucleótidos de dsRNA son sintetizados in vi tro e introducidos dentro de una célula. El enlace específico de secuencia de estos oligonucleótidos de dsRNA dispara la degradación del mRNA objetivo, reduciendo o aboliendo la expresión de la proteína objetivo. La eficacia de los procedimientos de silenciamiento de genes, evaluados anteriormente puede ser evaluada a través de la medición de la expresión del polipéptido (por ejemplo, mediante Western Blot) , y al nivel de R?A utilizando metodologías basadas en TaqMan. Los vectores de la presente invención comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención y pueden ser vectores de clonación o de expresión. Las células hospederas de la invención, las cuales pueden ser transformadas, transfectadas o transducidas con los vectores de la invención, pueden ser procarióticas o eucarióticas. Los polipéptidos de la invención pueden ser preparados en forma recombinante mediante expresión de sus moléculas de ácido nucleico o de codificación en vectores contenidos de una célula hospedera. Tales métodos de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la materia y muchos son descritos con detalle por Sambrook et al. (supra) y Fernandez y Hoeffler (1998, eds. "Gene expresión systems: Using nature for the art of expresión". Academic Press, San Diego, Londres, Boston, New York, Sydney, Tokio, Toronto) . En general, cualquier sistema o vector que sea adecuado para mantener, propagar o expresar moléculas de ácido nucleico para producir un polipéptido en el hospedero requerido, pueden ser utilizadas. La secuencia nucleotídica apropiada puede ser insertada dentro de un sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como por ejemplo, aquellas descritas en Sambrook et al. (supra). En general, el gen de codificación puede ser colocado bajo el control de un elemento de control tal como un promotor, sitio de enlace al ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido deseado, es transcrita dentro del RNA en la célula hospedera transformada. Los ejemplos de sistemas de expresión adecuada incluyen por ejemplo, sistemas cromosómicos, episómicos y derivados de virus, incluyendo, por ejemplo, vectores derivados de: plásmidos bacterianos, bacteriófagos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papova virus tales como SV40, virus de la vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus o combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de los elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, incluyendo cósmidos y fagémidos.

Los cromosomas artificiales, humanos (HACs) pueden ser también empleados para distribuir fragmentos grandes de ADN que pueden estar contenidos y expresados en un plásmido. Los vectores pCR4-T0P0, pCR4-TOPO-INSP201, pENTR, pENTR_INSP201EC-6HIS, pEAKl2d-PAC, pDESTl2.2 , pEAKl2d- PAC_INSP201EC-6HIS y pDEST12.2_INSP201EC-6HIS son ejemplos preferidos de vectores adecuados para el uso de acuerdo con los aspectos de esta invención con relación a INSP201. Los sistemas de expresión particularmente adecuados incluyen microorganismos tales como bacterias transformadas i con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN plásmidos o cósmicos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus) ; sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión virales (por ejemplo, el virus mosaico de la coliflor, CaMV; virus mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, los plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Los sistemas de traducción libres de células pueden ser también empleados para producir los polipéptidos de la invención. La introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de la presente invención dentro de las células hospederas puede ser efectuada mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al., (supra). Particularmente, los métodos adecuados incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga de raspado, introducción, balística o infección (ver Sambrook et al., 1989 [supra]; Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman y Leinwald, 1998) . En células eucarióticas, los sistemas de expresión pueden ser ya sea transitorios (por ejemplo, episomales) o permanentes (integración cromosómica) de acuerdo a las necesidades del sistema. La molécula de ácido nucleico de codificación puede o no incluir una secuencia que codifica para una secuencia control, tal como un péptido de señal o secuencia guía, como se desee, por ejemplo, para la secreción del polipéptido traducido hacia el lumen del retículo endoplásmico, hacia el espacio periplásmico o hacia el ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas . Las secuencias guía pueden ser removidas por el hospedero bacteriano en el procesamiento post-traduccional . Además de las secuencias de control, puede ser deseable agregar secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula hospedera. Los ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que provocan que la expresión de un gen sea incrementada o disminuida en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador o a diversas condiciones de temperatura o metabólicas. Las secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector, tales como aumentadores, promotores y las regiones 5' y 3' no traducidas. Estas interactúan con las proteínas celulares del hospedero para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Tales secuencias reguladoras pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector y del hospedero utilizado, cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles pueden ser utilizados. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, los promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido Bluescript (Stratagene, LaJolla, CA) , el plásmido pSport1111 (Gibco BRL) y similares pueden ser utilizados. El promotor de la polihedrina del baculovirus puede ser utilizado en células de insecto. Los promotores o aumentadores derivados de genomas de células vegetales (por ejemplo, genes proteicos de choque térmico, RUBISCO y de almacenamiento) o a partir de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias guías) pueden ser clonados dentro del vector. El sistema celular de mamífero, los promotores provenientes de los genes de mamífero o de los virus de mamífero son preferibles. Si es necesario generar una línea celular que contenga copias múltiples de la secuencia, pueden ser utilizados los vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado . Un vector de expresión es construido de modo que el ácido nucleico particular que codifica para la secuencia, está localizado en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, la colocación y la orientación de la secuencia de codificación con respecto a las secuencias reguladoras que es tal que la secuencia de codificación es transcrita bajo el "control" de las secuencias reguladoras, por ejemplo, la RNA-polimerasa que se enlaza a la molécula de ADN en las secuencias de control, transcribe la secuencia de codificación. En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia de modo que ésta pueda ser acoplada a las secuencias de control con la orientación adecuada; por ejemplo, para mantener la estructura de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ser ligadas a ácido nucleico que codifica para la secuencia, antes de la inserción dentro de un vector. Alternativamente, la secuencia de codificación puede ser clonada directamente dentro de un vector de expresión que ya contiene la secuencia de control y un sitio de restricción apropiado . Para la producción de largo plazo de alto rendimiento de un polipéptido recombinante, la expresión estable es preferida. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente el polipéptido de interés pueden ser transformadas utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable sobre el mismo o sobre un vector separado. Después de la introducción al vector, las células se pueden dejar desarrollar por 1-2 días en un medio enriquecido, antes de que éstas sean cambiadas a medios selectivos. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células establemente transformadas pueden ser proliferados utilizando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo celular. Las líneas celulares de mamífero, disponibles como hospederos para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) incluyendo, pero no limitadas a, células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células renales de mono (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, melanoma de Bowes y de carcinoma hepatocelular humana (por ejemplo, Hep G2) y un número de otras líneas celulares. En los sistemas baculovirales, los materiales para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto son comercialmente disponibles en forma de equipo de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (el equipo "MaxBac") . Estas técnicas son en general conocidas por aquellos expertos en la materia y son descritas completamente en Summers y Smith, Boletín de la Estación Experimental Agrícola de Texas No. 1555 (1987). Las células hospederas particularmente adecuadas para el uso en este sistema, incluyen células de insecto tales como células de drosofila S2 y de Spodoptera Sf9. Existen muchos sistemas de expresión genéticos de cultivo celulares de plantas y de plantas enteras, conocidas en la técnica. Los ejemplos de sistemas de expresión genéticos celulares de plantas, adecuados, incluyen aquellos descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,393,506; 5,659,122 y 5,608,143. Los ejemplos adicionales de expresión genética en cultivo de células vegetales han sido descritos en Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991) . En particular, todas las plantas a partir de las cuales son aislados y cultivados los protoplastos para dar plantas regeneradas enteras pueden ser utilizados, de modo que las plantas enteras son recuperadas, las cuales contienen el gen transferido. Prácticamente todas las plantas pueden ser regeneradas a partir de las células cultivadas o de los tejidos, incluyendo pero no limitadas a todas las especies mayores de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, fruta y otros árboles, legumbres y vegetales. Los ejemplos de células hospederas bacterianas particularmente preferidas incluyen estreptococos, estafilococos, células de E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis . Los ejemplos de células hospederas particularmente adecuadas para la expresión en hongos incluyen células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) y células de Aspergillus. Cualquier número de sistemas de selección son conocidos en la técnica, los cuales pueden ser utilizados para recuperar las líneas celulares transformadas. Los ejemplos incluyen los genes de la timidina-cinasa del virus de herpes simple (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) y de la adenina-fosforribosiltransferasa (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23) que pueden ser empleados en células tk" o aprt-, respectivamente. También, puede ser utilizada la resistencia a antimetabolitos, o antibióticos o a herbicidas como la base para la selección; por ejemplo, la dihidrofolato-reductasa (DHFR) que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, que confiere resistencia a los aminoglocósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. et al., (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) y ais o pat, que confiere resistencia a clorosulfurón y fosfinotricina-acetiltransferasa, respectivamente. Los genes seleccionables adicionales han sido descritos, los ejemplos de los cuales serán claros para aquellos expertos en la técnica. Aunque la presencia o ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés está también presente, su presencia y expresión pueden necesitar ser confirmadas. Por ejemplo, si la secuencia relevante es insertada dentro de una secuencia del gen marcador, las células transformadas que contienen las secuencias apropiadas pueden ser identificadas por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede ser colocado en tándem con una secuencia que codifica para un polipéptido de la invención bajo el control de un promotor simple. La expresión del gen marcador en respuesta a la introducción o selección usualmente indica también la expresión del gen en tándem. Alternativamente, las células hospederas que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención y que expresan el polipéptido, puede ser identificadas por una variedad de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados a, hibridaciones de ADN-ADN o ADN-RNA y bioensayos de proteínas, por ejemplo clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o técnicas de inmunoensayo (tales como el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas [ELISA] y radioinmunoensayo [RÍA] ) , que incluyen tecnologías basadas en membrana, en solución o en chip, para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o de la proteína (ver Hampton, R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN) , y Maddox, D.E. et al. (1983) J. Exp. Med. 158, 1211-1216) . Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden ser utilizados en diversos ensayos de aminoácidos y de ácido nucleico. Los medios para producir la hibridación marcado o las sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas a las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de la presente invención, incluyen la oligomarcación, la pseudotraducción, la marcación en el extremo o la amplificación por PCR utilizando un polinucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias que codifican para el polipéptido de la invención pueden ser clonadas dentro de un vector para la producción de una sonda de mRNA. Tales vectores son conocidos en la técnica, son comercialmente disponibles, y pueden ser utilizados para sintetizar las sondas de RNA in vi tro por la adición de una RNA-polimerasa apropiada tal como T7 , T3 ó SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden ser conducidos utilizando una variedad de equipos comercialmente disponibles (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, MI) ; Promega (Madison Wl) ; y U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH). Las moléculas reporteras y marcadores adecuados, que pueden ser utilizados para facilidad de detección, incluyen radionúclidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención pueden también ser utilizadas para crear animales transgénicos, particularmente animales roedores. Tales animales transgénicos forman un aspecto adicional de la presente invención. Esto puede ser realizado localmente mediante modificación de las células somáticas, o mediante terapia con línea germinal para incorporar modificaciones heredables. Tales animales transgénicos pueden ser particularmente útiles en la generación de modelos animales para moléculas de fármacos efectivas de moduladores de los polipéptidos de la presente invención. El polipéptido puede ser recuperado y purificado a partir de los cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de alta resolución es particularmente útil para la purificación. Las técnicas bien conocidas para el replegamiento de las proteínas pueden ser empleadas para regenerar una conformación activa cuando el polipéptido es desnaturalizado durante el aislamiento y/o la purificación. Las construcciones de vector especializadas pueden se también utilizadas para facilitar la purificación de proteínas, como se desee, al unir las secuencias que codifican para los polipéptidos de la invención a una secuencia nucleotídica que codifica para un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Los ejemplos de tales dominios facilitadotes de la purificación incluyen péptidos quelantes de metales tales como módulos de histidina-triptona que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión-afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seatlle, WA) . La inclusión de las secuencias ligadoras escindibles tales como aquellas específicas para el factor XA o la enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido de la invención, pueden ser utilizadas para facilitar la purificación. Un vector de expresión tal proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene el polipéptido de la invención, fusionado a los diversos residuos de histidina que preceden una tiorredoxina o un sitio de escisión de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación mediante IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, como se describe en Porath, J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) mientras que el sitio de escisión de la tiorredoxina o la enterocinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido de la proteína de fusión. Una discusión de los vectores que contienen proteína de fusión es proporcionada en Kroll, D.J. , et al. (1993; ADN Cell Biol. 12:441-453). Si el polipéptido que va a ser expresado para el uso en los ensayos de selección, en general, se prefiere que éste sea producido en la superficie de la célula hospedera en el cual se expresa. En este caso, las células hospederas pueden ser cosechadas antes del uso en el ensayo de selección, por ejemplo, utilizando técnicas tales como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o técnicas de inmunoafinidad. Si el polipéptido es secretado hacia el medio, el medio puede ser recuperado con el fin de recuperar y purificar el polipéptido expresado. Si el polipéptido es producido intracelularmente, las células deben ser primeramente lisadas antes de que el polipéptido sea recuperado . Como se indicó anteriormente, la presente invención también proporciona los nuevos objetivos y métodos para la selección de candidatos o guías de fármaco. Estos métodos de selección incluyen ensayos de enlace y/o ensayos funcionales, y pueden ser realizados in vitro, en sistemas celulares o animales . A este respecto, un objetivo particular de esta invención radica en el uso de un polipéptido INSP201 como un objetivo para la selección de fármacos candidatos para tratar o prevenir trastornos relacionados a glucoproteínas de la superficie celular. Otro objetivo más de esta invención radica en los métodos para seleccionar compuestos biológicamente activos, dichos métodos comprenden poner en contacto un compuesto candidato con un gen o polipéptido de INSP201, y seleccionar los compuestos que se enlacen al gen o al polipéptido. Otro objetivo adicional de esta invención radica en los métodos para seleccionar compuestos biológicamente activos, el método comprende poner en contacto un compuesto candidato con la célula hospedera o recombinante que expresa un polipéptido INSP201 con un compuesto candidato, y seleccionar los compuestos que se enlazan al polipéptido INSP201 en la superficie de dichas células y/o que modulan la actividad del polipéptido INSP201. Un compuesto "biológicamente activo" • denota cualquier compuesto que tenga actividad biológica en un sujeto, preferentemente actividad terapéutica, más preferentemente un compuesto que tenga actividad de glucoproteína de superficie celular, y además preferentemente un compuesto que pueda ser utilizado para tratar trastornos relacionados a INSP201, o como una guía para desarrollar fármacos para tratar trastornos relacionados a la glucoproteína de la superficie celular. Un compuesto "biológicamente activo" es preferentemente un compuesto que modula la actividad de INSP201. Los métodos anteriores pueden ser conducidos in vi tro, utilizando diversos dispositivos y condiciones, incluyendo con reactivos inmovilizados, y pueden comprender además un paso adicional de evaluar la actividad de los compuestos seleccionados en un modelo de trastorno relacionado a glucoproteína de la superficie celular, tal como un modelo animal . Los compuestos seleccionados preferidos son agonistas de INSP201, por ejemplo, los compuestos que pueden enlazarse a INSP201 e imitar la actividad de un ligando endógeno del mismo. Un objetivo adicional de esta invención radica en un método de seleccionar compuestos biológicamente activos, dicho método comprende poner en poner en contacto in vi tro un compuesto de prueba con un polipéptido INSP201 de acuerdo a la presente invención, y determinar la habilidad de dicho compuesto de prueba para modular la actividad del polipéptido INSP201. Un objetivo adicional de esta invención radica en un método para seleccionar compuestos biológicamente activos, el método comprende poner en contacto in vitro un compuesto de prueba con un gen INSP201 de acuerdo a la presente invención, y determinar la habilidad del compuesto de prueba para modular la expresión del gen INSP201, preferentemente para estimular la expresión del mismo. En otra modalidad más, esta invención se refiere a un método para seleccionar, clasificar o identificar compuestos activos, particularmente compuestos activos en la regulación de la inflamación, la degeneración celular y la apoptosis, y la oncogénesis, el método comprende poner en contacto un compuesto de prueba con una célula hospedera recombinante que comprende una construcción reportera, la construcción reportera comprende un gen reportero bajo el control de un promotor del gen INSP201, y seleccionar los compuestos de prueba que modulan (por ejemplo, estimulan o reducen, preferentemente estimulan) la expresión del gen reportero. El polipéptido de la invención puede ser utilizado para seleccionar bibliotecas de compuestos en cualquiera de una variedad de técnicas de selección de fármacos. Tales compuestos pueden activar (agonizar) o inhibir (antagonizar) el nivel de expresión del gen o la actividad del polipéptido de la invención, y formar un aspecto adicional de la presente invención. Los compuestos preferidos son efectivos para alterar la expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención, o para regular la actividad de un polipéptido del primer aspecto de al invención. Los compuestos agonistas o antagonistas pueden ser aislados de, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, o mezclas de productos naturales. Estos agonistas o antagonistas pueden ser sustratos naturales o modificados, ligandos, enzimas, receptores o miméticos estructurales o funcionales. Para una revisión adecuada de tales técnicas de selección, ver Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Capítulo 5 (1991) . El enlace a un gen o polipéptido objetivo proporciona una indicación respecto a la habilidad del compuesto para modular la actividad de dicho objetivo, y de este modo para afectar una vía que conduce al trastorno relacionado a la glucoproteína de superficie celular en un sujeto. La determinación del enlace puede ser realizada mediante diversas técnicas, tales como mediante marcación del compuesto candidato, por competencia con un ligando de referencia marcado, etc. Para los ensayos de enlace in vi tro, los polipéptidos pueden ser utilizados en forma esencialmente pura, en suspensión, inmovilizados sobre un soporte, o expresados en una membrana (célula intacta, preparación membranal, liposoma, etc.). La modulación de la actividad incluye, sin limitación, la estimulación de la expresión de superficie del receptor de INSP201, la modulación de la multimerización del receptor (por ejemplo, la formación de complejos multiméricos con otras sub-unidades) , etc. Las células utilizadas en los ensayos pueden ser cualquier célula recombinante (por ejemplo, cualquier célula que comprenda un ácido nucleico recombinante que codifique para un polipéptido INSP201) o cualquier célula que exprese un polipéptido INSP201 endógeno.

Los ejemplos de tales células incluyen, sin limitación, células procarióticas (tales como bacterias) y células eucarióticas (tales como células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli , Pichia pastoris, Hansenula polimorpha, levaduras de Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces o Saccharomyces, líneas celulares de mamífero (por ejemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) así como cultivos de células de mamífero primarias o establecidas (por ejemplo, producidas a partir de fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los compuestos que van a ser más probablemente buenos antagonistas son moléculas que se enlazan al polipéptido de la invención sin inducir los efectos biológicos del polipéptido después del enlace a éste. Los antagonistas potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se enlazan al polipéptido de la invención y con esto inhiben o extinguen su actividad. De esta manera, el enlace del polipéptido a las moléculas de enlace celular normales puede ser inhibido, tal que la actividad biológica normal del polipéptido es prevenida . El polipéptido de la invención que es empleado en tal técnica de selección puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, llevado sobre una superficie celular o localizado intracelularmente. En general, tales procedimientos de selección pueden involucrar el uso de células apropiadas o membranas celulares que expresan el polipéptido que se ponen en contacto con un compuesto de prueba para observar el enlace, o la estimulación o inhibición de una respuesta funcional . La respuesta funcional de las células puestas en contacto con el compuesto de prueba es luego comparada con las células control que no fueron puestas en contacto con el compuesto de prueba. Tal ensayo puede evaluar si el compuesto de prueba da o no como resultado una señal generada por activación del polipéptido, utilizando un sistema de detección apropiado. Los inhibidores de la activación son en general evaluados en presencia de un agonista conocido y el efecto de la activación por el agonista en presencia del compuesto de prueba es observado . Un método preferido para la identificación de un compuesto agonista o antagonista de un polipéptido de la presente invención comprende: (a) poner en contacto una célula que exprese (opcionalmente sobre la superficie del mismo) el polipéptido de acuerdo al primer aspecto de la invención, estando asociado el polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto hacia el polipéptido, con un compuesto que va a ser seleccionado bajo condiciones que permiten el enlace al polipéptido; y (b) determinar si el compuesto se enlaza a y activa o inhibe el polipéptido al medir el nivel de una señal generada a partir de la interacción del compuesto con el polipéptido. Los métodos para generar las señales detectables en los tipos de ensayos descritos en la presente serán conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un ejemplo particular es la cotransfección de una construcción que expresa un polipéptido de acuerdo a la invención, o un fragmento tal como el LBD, en fusión con el dominio de enlace al ADN de GAL4, dentro de una célula junto con un plásmido reportero, un ejemplo del cual es pFR-Luc (Stratagene Europe, Ámsterdam, Holanda) . Este plásmido particular contiene un promotor sintético con cinco repeticiones en tándem de los sitios de enlace a GAL4 que controlan la expresión del gen de luciferasa. Cuando un ligando potencial es agregado a las células, éste se enlazará a la fusión GAL4-polipéptido e inducirá transcripción del gen de la luciferasa. El nivel de expresión de luciferasa puede ser monitorizado por su actividad utilizando un lector de luminiscencia (ver, por ejemplo, Lehman et al. JBC 270, 12953, 1995; Pawar et al. JBC, 277, 39243, 2002) .

Un método preferido adicional para identificar un agonista o antagonista de un polipéptido de la invención comprende : (a) poner en contacto un compuesto marcado o no marcado con el polipéptido inmovilizado sobre cualquier soporte sólido (por ejemplo, esferas, placas, soporte de matriz, chip) y la detección del compuesto mediante la medición del marcador o la presencia del compuesto mismo; o (b) poner en contacto una célula que expresa sobre la superficie del mismo el polipéptido, por medio del anclaje artificialmente de éste a la membrana celular, o al construir un receptor quimérico que está asociado con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto al polipéptido, con un compuesto que va a ser seleccionado bajo condiciones que permiten el enlace al polipéptido; y (c) determinar si el compuesto se enlaza a y activa o inhibe el polipéptido al comparar el nivel de una señal generada a partir de la interacción del compuesto con el polipéptido, con el nivel de una señal en ausencia del compuesto . Por ejemplo, un método tal como la detección por FRET del ligando enlazado al polipéptido en presencia de coactivadores peptídicos (Norris et al., Science 285, 744, 1999) puede ser utilizado.

Un método preferido adicional para identificar un agonista o antagonista de un polipéptido de la invención comprende : (a) poner en contacto una célula que exprese (opcionalmente sobre la superficie del mismo) el polipéptido, estando asociado el polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto al polipéptido, con un compuesto que va a ser seleccionado bajo condiciones para permitir el enlace al polipéptido; y (b) determinar si el compuesto se enlaza a y activa o inhibe el polipéptido al comparar el nivel de una señal generada a partir de la interacción del compuesto con el polipéptido con el nivel de una señal en ausencia del compuesto. En modalidades preferidas adicionales, los métodos generales que son descritos anteriormente pueden comprender además la conducción de la identificación del agonista o antagonista en presencia del ligando marcado o no marcado para el polipéptido. En otra modalidad del método para identificar el agonista o antagonista de un polipéptido de la presente invención comprende: determinar la inhibición del enlace de un ligando a las células que expresan un polipéptido de la invención (y que opcionalmente tienen un polipéptido de la invención sobre la superficie del mismo) , o a las membranas celulares que contienen tal polipéptido, en presencia de un compuesto candidato bajo condiciones para permitir el enlace al polipéptido, y determinando la cantidad del ligando enlazado al polipéptido. Un compuesto capaz de provocar la reducción del enlace de un ligando se considera que es un agonista o antagonista. Preferentemente el ligando está marcado. Más particularmente, un método de selección de un compuesto antagonista o agonista del polipéptido, comprende los pasos de: (a) incubar un ligando marcado con una célula completa que expresa un polipéptido de acuerdo a la invención, opcionalmente sobre la superficie celular, o una membrana celular que contiene un polipéptido de la invención, (b) medir la cantidad del ligando marcado enlazado a la célula entera o a la membrana celular; (c) agregar un compuesto candidato a una mezcla del ligando marcado y la célula entera o la membrana celular del paso (a) y permitir que la mezcla alcance el equilibrio; (d) medir la cantidad del ligando marcado enlazado a la célula entera o la membrana celular después del paso (c); y (e) comparar la diferencia en el ligando marcado enlazado en el paso (b) y (d) , tal que el compuesto que provoca la reducción en el enlace en el paso (d) es considerado como un agonista o antagonista. Similarmente, se proporciona un método para seleccionar un antagonista o agonista polipéptido que comprende los pasos de: (a) incubar un ligando marcado con un polipéptido de acuerdo a la invención sobre cualquier soporte sólido o la superficie celular, o una membrana celular que contiene un polipéptido de la invención. (b) medir la cantidad del ligando marcado enlazado al polipéptido sobre el soporte sólido, la célula entera o la membrana celular; (c) agregar un compuesto candidato a una mezcla del ligando marcado y el polipéptido inmovilizado sobre el soporte sólido, la célula entera o la membrana celular del paso (a) y permitir que la mezcla alcance el equilibrio; (d) medir la cantidad del ligando marcado enlazado al polipéptido inmovilizado o la célula entera o la membrana celular después del paso (c) ; y (e) comparar la diferencia en el ligando marcado enlazado en el paso (b) y (d) , tal que el compuesto que provoca la reducción en el enlace en el paso (d) es considerado como un agonista o antagonista. El polipéptido INSP201 de la presente invención puede modular el crecimiento y diferenciación celulares. De este modo, la actividad biológica del polipéptido INSP201 puede ser examinada en sistemas que permiten el estudio del crecimiento y diferenciación celulares tales como los ensayos de cultivo de órganos o en sistemas de ensayo en colonias en cultivo de agarosa. La estimulación o inhibición de la proliferación celular puede ser medida mediante una variedad de ensayos . Por ejemplo, para observar la inhibición del crecimiento celular, se puede utilizar un medio sólido o líquido. En un medio sólido, las células que sufren inhibición del crecimiento pueden ser fácilmente seleccionadas del grupo de células objetivo al comparar los tamaños de las colonias formadas. En un medio líquido, la inhibición del crecimiento puede ser seleccionada al medir la turbidez del medio de cultivo o la incorporación de timidina marcada en el ADN. Típicamente, la incorporación de un análogo de nucleósido dentro del ADN recién sintetizado puede ser empleada para medir la proliferación (por ejemplo, el crecimiento de células activas) en una población de células. Por ejemplo, la bromodesoxiuridina (BrdU) puede ser empleada como un reactivo de marcación de ADN y anticuerpos monoclonales de ratón anti-BrdU pueden ser empleados como un reactivo de detección. Este anticuerpo se enlaza únicamente a las células que contienen ADN que ha incorporado bromodesoxiuridina. Puede ser utilizado un número de métodos de detección en conjunto con este ensayo, incluyendo inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, ELISA, y métodos colorimétricos . Los equipos que incluyen bromodesoxiuridina (BrdU) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU son comercialmente disponibles de Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN) . El efecto del polipéptido INSP201 sobre la diferenciación celular puede ser medido al poner en contacto las células madre o células embrionarias con diversas cantidades del polipéptido INSP201 y observando el efecto sobre la diferenciación de las células madre o células embrionarias. Los anticuerpos específicos de tejido y la microscopía pueden ser utilizados para identificar las células resultantes. Se puede encontrar también que el polipéptido INSP201 modula la proliferación y diferenciación celulares del sistema inmune y/o nervioso de una manera dependiente de la dosis en los ensayos anteriormente descritos. De este modo, los "equivalentes funcionales" del polipéptido INSP201 incluyen los polipéptidos que muestran cualquiera de las mismas actividades de regulación del crecimiento y diferenciación, en los ensayos anteriormente descritos de una manera dependiente de la dosis. Aunque el grado de actividad dependiente de la dosis no necesita ser idéntico a aquel del polipéptido INSP201, preferentemente los "equivalentes funcionales" mostrarán dependencia a la dosis sustancialmente similar en un ensayo de actividad dado, en comparación al polipéptido INSP201. En algunas de las modalidades descritas anteriormente, pueden ser utilizados ensayos de enlace simple, en los cuales la adherencia de un compuesto de prueba a una superficie que lleva el polipéptido, es detectada por medio de un marcador directa o indirectamente asociado con el compuesto de prueba, o en un ensayo que involucra la competencia con un competidor marcado. En otra modalidad más, pueden ser utilizados ensayos de selección de fármacos competitivos, en los cuales los anticuerpos neutralizadores que son capaces de enlazarse al polipéptido, compiten específicamente con un compuesto de prueba para el enlace. De esta manera, los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar la presencia de cualquier compuesto de prueba que posea afinidad de enlace específica para el polipéptido. Pueden ser también diseñados los ensayos para detectar el efecto de los compuestos de prueba agregados sobre la producción del m-RNA que codifica para el polipéptido en las células. Por ejemplo, un ELISA puede ser construido el cual mide los niveles secretados o asociados a las células del polipéptido, utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales mediante métodos estándares conocidos en la técnica, y éste puede ser utilizado para buscar los compuestos que pueden inhibir o mejorar la producción del polipéptido a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados. La formación de los complejos de enlace entre el polipéptido y el compuesto que se prueba puede ser entonces medida. Otra técnica más para la selección de fármacos que pueden ser utilizados, proporciona la selección de alto rendimiento de los compuestos que tienen afinidad de enlace adecuada al polipéptido de interés (ver solicitud de patente Internacional WO84/03564) . En este método, números grandes de compuestos de prueba pequeños, diferentes, son sintetizados sobre un sustrato sólido, el cual puede hacerse luego reaccionar con el polipéptido de la invención y lavado. Una manera de inmovilizar el polipéptido es utilizar anticuerpos no neutralizadores. El polipéptido enlazado puede ser luego detectado utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. El polipéptido purificado puede ser también recubierto directamente sobre placas para el uso en las técnicas de selección de fármacos anteriormente mencionadas. Técnicas adicionales de este tipo serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Adessi C. & Soto C. Curr. Med. Chem. 2002, 9(9): 963-78; Strand F.L. Prog. Drug Res., 2003 61: 1-37; Hruby V.J. Nat. Rev. Drug Discov. 2002, 1 (11): 847-58.

El polipéptido de la invención puede ser utilizado para identificar los receptores enlazados a la membrana o solubles, a través de las técnicas de enlace al receptor, estándares que son conocidas en la materia, tales como el enlace del ligando y los ensayos de reticulación en los cuales el polipéptido está marcado con un isótopo radioactivo, es químicamente modificado, o es fusionado a una secuencia peptídica que facilita su detección o purificación, y es incubado con una fuente de receptor putativo (por ejemplo, una composición de células, membranas celulares, sobrenadantes celulares, extractos tisulares, o fluidos corporales) . La eficacia del enlace puede ser medida utilizando técnicas biofísicas tales la resonancia de plasmón superficial y espectroscopia. Los ensayos de enlace pueden ser utilizados para la purificación y clonación del receptor, pero pueden también identificar los agonistas y antagonistas del polipéptido, que compiten con el enlace del polipéptido a su receptor. Los métodos estándares para conducir los ensayos de selección son bien comprendidos en la técnica. En otra modalidad más, esta invención se refiere al uso de un polipéptido INSP201 o fragmento del mismo, mediante el cual el fragmento es preferentemente un fragmento específico del gen INSP201, para el aislamiento o generación de un agonista o estimulador del polipéptido INSP201 para el tratamiento de un trastorno relacionado al sistema inmune, en donde el agonista o el estimulador se selecciona del grupo que consiste de: 1. un anticuerpo específico o fragmento del mismo que incluye: a) un anticuerpo quimérico, b) un anticuerpo humanizado o c) un anticuerpo completamente humano, así como; 2. un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, 3. una cadena simple (por ejemplo scFv) o 4. un anticuerpo de dominio simple, o 5. un mimético peptídico o no peptídico derivado de los anticuerpos o 6. un mimético de anticuerpo tal como a) un anticalin o b) una molécula de enlace basada en la fibronectina (por ejemplo trinectina o adnectina) . La generación de los miméticos peptídicos o no peptídicos de los anticuerpos, es conocida en la técnica (Saragovi et al., 1991 y Saragovi et al., 1992). Las anticalinas son también conocidas en la técnica (Vogt et al., 2004). Las moléculas de enlace basadas en la fibronectina se describen en US6818418 y WO200429224. Además, el compuesto de prueba puede ser de diversos orígenes, naturaleza y composición, tal como cualquier molécula pequeña, ácido nucleico, lípido, péptido, polipéptido que incluye un anticuerpo tal como un anticuerpo quimérico, humanizado o completamente humano, o un fragmento de anticuerpo, mimético peptídico o no peptídico derivado de éste, así como un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, un anticuerpo de cadena simple (por ejemplo scFv) o de dominio simple, o un mimético de anticuerpo tal como una molécula de enlace basada en anticalina o fibronectina (por ejemplo trinectina o adnectina) , etc., en forma aislada o en mezcla o combinaciones. La invención también incluye un equipo de selección útil en los métodos para identificar agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos, enzimas, que son descritos anteriormente. La invención incluye los agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos y enzimas, y otros compuestos que modulan la actividad o antigenicidad del polipéptido de la invención, descubierto por los métodos que son descritos anteriormente. Como se mencionó anteriormente, se considera que las diversas porciones de la invención (por ejemplo los polipéptídos del primer aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, un vector del cuarto aspecto de la invención, una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, un ligando del sexto aspecto de la invención, un compuesto del séptimo aspecto de la invención) pueden ser útiles en terapia o diagnóstico de enfermedades. Para evaluar la utilidad de las porciones de la invención para tratar o diagnosticar una enfermedad, pueden ser llevados a cabo uno o más de los siguientes ensayos. Nótese que aunque algunos de los siguientes ensayos se refieren al compuesto de prueba como una proteína/polipéptido, una persona experta en la técnica será fácilmente capaz de adaptar los siguientes ensayos, de modo que las otras porciones de la invención pueden ser también utilizadas como el "compuesto de prueba" . La invención también proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido, ácido nucleico, ligando o compuesto de la invención en combinación con un portador famacéutico adecuado. Estas composiciones pueden ser adecuadas como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, como vacunas, o como otras composiciones inmunogénicas, como se describe con detalle más adelante. De acuerdo a la terminología utilizada en la presente, una composición que contiene un polipéptido, ácido nucleico, ligando o compuesto [X] es "sustancialmente libre de" impurezas [en la presente, Y] cuando al menos 85% en peso del total X+Y en la composición es X. Preferentemente, X comprende al menos aproximadamente 90% en peso del total de X+Y en la composición, más preferentemente al menos aproximadamente 95%, 98% o incluso 99% en peso. Las composiciones farmacéuticas deben comprender preferentemente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el ligando o el compuesto de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición objetivo, o exhibir un efecto terapéutico preventivo detectable. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal puede ser también utilizado para determinar el intervalo de concentración apropiado y la ruta de administración. Tal información puede ser luego utilizada para determinar las dosis y rutas útiles para la administración en humanos. La cantidad efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la severidad del estado de enfermedad, de la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la o las combinaciones del fármaco, las sensibilidades de la reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede ser determinada mediante experimentación rutinaria y está dentro del juicio del clínico. En general, una dosis efectiva será de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, preferentemente 0.05 mg/kg a 10 mg/kg. Las composiciones pueden ser administradas individualmente a un paciente o pueden ser administradas en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. Una composición farmacéutica puede también contener un portador farmacéuticamente aceptable, para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos tales como liposomas, con la condición de que el portador por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición, y el cual puede ser administrado sin toxicidad indebida . Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácido polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser utilizadas en la presente, por ejemplo, sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión completa de los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mac, Pub. Co., N.H. 1991). Los portadores farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras del pH, y similares, pueden estar presentes en tales composiciones. Tales portadores hacen posible que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y similares, para la ingestión por el paciente. Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos que van a ser tratados pueden ser animales; en particular, sujetos humanos pueden ser tratados. Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención pueden ser administradas mediante cualquier número de rutas que incluyen, pero no están limitadas a, las aplicaciones oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica o transcutánea (por ejemplo, ver WO98/20734) , los medios subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, entéricos, tópicos, sublinguales, intravaginales o rectales. Pueden ser también utilizadas pistolas de genes o hiporrocíos para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la invención, pueden también ser preparadas . La distribución directa de las composiciones será lograda en general por inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o distribuidas al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden también ser administradas dentro de una lesión. El tratamiento de dosis puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiples. Si la actividad del polipéptido de la invención es en exceso en un estado de enfermedades particular, están disponibles varios procedimientos. Un procedimiento comprende administrarle a un sujeto un compuesto inhibidor (antagonista) como se describe anteriormente, junto con un portador farmacéuticamente aceptable en una cantidad efectiva para inhibir la función del polipéptido, tal como mediante el bloqueo del enlace de los ligandos, sustratos, enzimas, receptores, o mediante la inhibición de una segunda señal, y con esto aliviar la condición anormal. Preferentemente, tales antagonistas son anticuerpos. Lo más preferentemente, tales anticuerpos son quiméricos y/o humanizados para reducir al mínimo su inmunogenicidad, como se describió previamente. En otro procedimiento más, las formas solubles del polipéptido que conservan afinidad de enlace para el ligando, sustrato, enzima, receptor, en cuestión, pueden ser administrados. Típicamente, el polipéptido puede ser administrado en la forma de fragmentos que conservan las porciones relevantes. En un procedimiento alternativo, la expresión del gen que codifica para el polipéptido puede ser inhibida utilizando técnicas de bloqueo de la expresión, tales como el uso de moléculas de ácido nucleico antisentido (como se describe anteriormente) , ya sea internamente generadas o separadamente administradas. Las modificaciones de la expresión de los genes pueden ser obtenidas mediante el diseño de secuencias complementarias o moléculas antisentido (ADN, RNA o PNA) al control, 5' o regiones reguladoras (secuencia de señal, promotores, aumentadores e intrones) del gen que codifica para el polipéptido. Similarmente, la inhibición puede ser lograda utilizando la metodología de apareamiento de base de "triple hélice" . El apareamiento de triple hélice es útil debido a que éste provoca la inhibición de la habilidad de la doble hélice para abrirse suficientemente para el enlace de las polimerasas, factores de la transcripción, o moléculas reguladoras. Avances terapéuticos recientes utilizando ADN triples han sido descritos en la literatura (Gee, J.E. et al. (1994) En: Huber, B.E. y B.I. Carr, Molecualr and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY) . La secuencia complementaria o molécula antisentido puede ser también diseñada para bloquear la traducción del mRNA al prevenir que el transcrito se enlace a los ribosomas. Tales oligonucleótidos pueden ser administrados o pueden ser generados in si tu a partir de la expresión in vivo . Además, la expresión del polipéptido de la invención puede ser prevenida mediante el uso de ribozimas específicas a su secuencia de RNA de codificación. Las ribozimas son RNAs catalíticamente activas que pueden ser naturales o sintéticos (ver por ejemplo Usman, N. , et al., Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33). Las ribozimas sintéticas pueden ser diseñadas para escindir específicamente mRNAs en posiciones seleccionadas, con lo cual se previene la traducción de los mRNAs en polipéptido funcional. Las ribozimas pueden ser sintetizadas con una cadena principal de fosfato de ribosa natural, y bases naturales, como son encontradas normalmente en las moléculas de NA. Alternativamente, las ribozimas pueden ser sintetizadas con cadenas principales no naturales, por ejemplo, 2'-0-metil-RNA, para proporcionar protección a partir de la degradación por ribonucleasa y pueden contener bases modificadas. Las moléculas de RNA pueden ser modificadas para incrementar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2'0-metilo en vez de enlaces fosfodiesterasa dentro de la cadena principal de la molécula. Este concepto es inherente en la producción de PNAs y puede ser extendido en todas estas moléculas por la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y butosina, así como acetil-, metil-, tio- y formas similarmente modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina, que no son tan fácilmente reconocidas pro las endonucleasas endógenas. Para tratar condiciones anormales relacionadas a una sub-expresión del polipéptido de la invención y su actividad, están disponibles varios procedimientos. Un procedimiento comprende administrarle a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que activa el polipéptido, por ejemplo un agonista como se describe anteriormente, para aliviar la condición anormal. Alternativamente, una cantidad terapéutica del polipéptido en combinación con un portador farmacéutico adecuado puede ser administrada para restaurar el balance del polipéptido. La terapia génica puede ser empleada para efectuar la producción endógena del polipéptido por las células relevantes en el sujeto. La terapia génica es utilizada para tratar permanentemente la producción inapropiada del polipéptido por reemplazo de un gen defectuoso con un gen terapéutico corregido.

La terapia génica de la presente invención puede ocurrir in vivo o ex vivo . La terapia génica ex vivo requiere el aislamiento y la purificación de células del paciente, la introducción de un gen terapéutico y la introducción de células genéticamente alteradas nuevamente al paciente. En contraste, la terapia génica in vivo no requiere el aislamiento y purificación de las células de un paciente. El gen terapéutico es típicamente "empaquetado" para la administración a un paciente. Los vehículos de distribución de genes pueden ser no virales, tales como liposomas, o virus deficientes en replicación, tales como adenovirus como se describe por Berkner, K.L., en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992) o vectores virales adeno-asociados (AAV) como se describe por Muzyczka, N. , en Curr. Top. Microbiol. Im unol . , 158, 97-129 (1992) y Patente de los Estados Unidos No. 5,252,479. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención puede ser manipulada por ingeniería genética para la expresión en un vector retroviral defectuoso en replicación. Esta construcción de expresión puede ser luego aislada e introducida dentro de una célula de empaquetamiento transducida por un vector plásmido retroviral que contiene el RNA que codifica para el polipéptido, tal que la célula de empaquetamiento produce ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés . Estas células productoras pueden ser administradas a un sujeto para manipular por ingeniería las células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo (ver Capítulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches (y referencias citadas en la presente) en Human Molecular Genetics (1996) , T Strachan y A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd) . Otro procedimiento es la administración de "ADN desnudo" en el cual el gen terapéutico es directamente inyectado dentro de la corriente sanguínea o el tejido muscular. En situaciones en las cuales los polipéptidos o las moléculas ácido nucleico de la invención son agentes promotores de enfermedad, la invención proporciona que éstos puedan ser utilizados en vacunas para producir anticuerpos contra el agente promotor de enfermedad. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden ser ya sea profilácticas (por ejemplo para prevenir la infección) o terapéuticas (por ejemplo para tratar la enfermedad después de la infección) . Tales vacunas comprenden la inmunización de uno o varios agentes, uno o varios inmunógenos, uno o varios polipéptidos, una o varias proteínas o ácido nucleico, usualmente en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables como se describen anteriormente, que incluyen cualquier portador que por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Además, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores ("adyuvantes"). Además, el antígeno o el inmunógeno puede ser conjugado a un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de la difteria, tétanos, cólera, H. Pylori y otros patógenos. Ya que los polipéptidos pueden ser desintegrados en el estómago, las vacunas que comprenden los polipéptidos son preferentemente administradas parenteralmente (por ejemplo, subcutáneas, intramusculares, intravenosas o la inyección intradérmica) . Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles, acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del recipiente, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores o agentes espesantes. Las formulaciones de vacuna de la invención pueden ser presentadas en recipientes de dosis unitaria o de dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas selladas y frascos y pueden ser almacenados en una condición liofilizada que requiere únicamente la adición del portador líquido estéril inmediatamente antes del uso. La dosis dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede ser fácilmente determinada por experimentación rutinaria .

La distribución genética de los anticuerpos que se enlazan a los polipéptidos de acuerdo a la invención puede también ser efectuada, como se describe en la solicitud de Patente Internacional WO98/55607. La tecnología denominada como inyección de chorro (ver, por ejemplo, www.powderject.com) puede ser también útil en la formulación de composiciones de vacuna. Un número de métodos adecuados para la vacunación y sistemas de distribución de vacunas se describen en la solicitud de Patente Internacional WO00/29428. Esta invención también se refiere al uso de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada del gen caracterizada por las moléculas de ácido nucleico de la invención que están asociadas con una disfunción, proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede agregarse a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, o la susceptibilidad de una enfermedad, que resulta de la sub-expresión, sobre-expresión o expresión espacial o temporal alterada del gen. Los individuos que poseen mutaciones en el gen pueden ser detectados al nivel del ADN por una variedad de técnicas. Las moléculas de ácido nucleico para el diagnóstico pueden ser obtenidas a partir de las células de un sujeto, tal como de la sangre, orina, saliva, biopsia de tejido o material de autopsia. El ADN genómico puede ser utilizado directamente para la detección o puede ser amplificado enzimáticamente mediante el uso de PCR, reacción en cadena de ligasa (LCR) , amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) , u otras técnicas de amplificación (ver Saiki et al., Nature, 324, 163-166 (1986); Bej , et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35, 117-126 (1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)) antes del análisis. En una modalidad, este aspecto de la invención proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad en un paciente, que comprende la evaluación del nivel de expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido de acuerdo a la invención, y comparando el nivel de expresión a un nivel control, en donde un nivel que es diferente al nivel control es indicador de la enfermedad. El método puede comprender los pasos de: a) poner en contacto una muestra del tejido del paciente con una sonda de ácido nucleico bajo condiciones estrictas que permiten la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de la invención y la sonda; b) poner en contacto una muestra control con la sonda bajo las mismas condiciones utilizadas en el paso a) ; c) y detectar la presencia de los complejos híbridos en las muestras; en donde la detección de los niveles del complejo híbrido en la muestra del paciente que difieren de los niveles del complejo híbrido en la muestra control, es indicador de la enfermedad . Un aspecto adicional de la invención comprende un método de diagnóstico que comprende los pasos de: a) la obtención de una muestra de tejido de un paciente que es probado para la enfermedad; b) el aislamiento de una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención, a partir de la muestra de tejido; y c) el diagnóstico del paciente para la enfermedad por la detección de la presencia de una mutación en la molécula de ácido nucleico que está asociada con la enfermedad. Para ayudar a la detección de las moléculas de ácido nucleico en los métodos anteriormente descritos, puede ser incluido un paso de amplificación, por ejemplo utilizando PCR. Las supresiones e inserciones pueden ser detectadas mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación al genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden ser identificadas mediante hibridación del ADN amplificado al RNA marcado de la invención o alternativamente, secuencias marcadas de ADN antisentido de la invención. Las secuencias de concordancia perfecta pueden ser distinguidas de los dúplex con mala concordancia con digestión con RNasa o por evaluación de las diferencias en las temperaturas de fusión. La presencia o ausencia de la mutación en el paciente puede ser detectada al poner en contacto el ADN con una sonda de ácido nucleico que se hibrida al ADN bajo condiciones estrictas para formar una molécula híbrida de doble hebra, la molécula híbrida de doble hebra tiene una porción no hibridada de la hebra de la sonda de ácido nucleico en cualquier porción correspondiente a una mutación asociada con la enfermedad; y detectando la presencia o ausencia de una porción no hibridada de la hebra de la sonda, como una indicación de la presencia o ausencia de una mutación asociada a la enfermedad, en la porción correspondiente de la hebra de ADN. Tales diagnósticos son particularmente útiles para la prueba prenatal e incluso neonatal . Las mutaciones puntuales y otras diferencias de secuencia entre el gen de referencia y los genes "mutantes" pueden ser identificadas por otras técnicas bien conocidas, tales como la secuencia de ADN directa o el polimorfismo conformacional de una sola hebra (ver Orita et al., Genomics, 5, 874-879 (1989)). Por ejemplo, puede ser utilizado un cebador de secuenciamiento con el producto de PCR de doble hebra o una molécula plantilla de una sola hebra, generada por una PCR modificada. La determinación de la secuencia es realizada por procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o procedimientos de secuenciamiento automáticos con marcadores fluorescentes. Los segmentos de ADN clonados pueden ser también utilizados como sondas para detectar los segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este método es mejorada en gran medida cuando se combina con la PCR. Además, mutaciones puntuales y otras variaciones de secuencia, tales como polimorfismos, pueden ser detectadas como se describe anteriormente, por ejemplo, a través del uso de oligonucleótidos específicos de alelo para la amplificación por PCR de las secuencias que difieren por nucleótidos simples. Las diferencias en la secuencia de ADN pueden ser también detectadas por alteraciones en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en los geles, con o sin agentes de desnaturalización, o mediante secuenciamiento directo de ADN (por ejemplo, Myers et al., Science (1985) 230: 1242). Los cambios secuenciales en sitios específicos pueden también ser revelados por ensayos de protección de nucleasa, tales como RNasa y protección SI o el método de escisión química (ver Cotton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1985) 85: 4397-4401).

Además de la electroforesis en gel convencional y el secuenciamiento de ADN, las mutaciones tales como las microsupresiones, aneuploidías, translocaciones, inversiones, pueden ser también detectadas mediante análisis in si tu (ver, por ejemplo, Keller et al., ADN Probes, 2a Ed., Stockton Press, Nueva York, N.Y., EUA (1993)), es decir, las secuencias de ADN o RNA en las células pueden ser analizadas para mutaciones sin la necesidad de su aislamiento y/o inmovilización sobre una membrana. La hibridación de fluorescencia in si tu (FISH por sus siglas en ingles) es actualmente el método más comúnmente aplicado y han aparecido numerosas revisiones de FISH (ver, por ejemplo, Trachuck et al., Science, 250, 559-562 (1990), y Trask et al., Trends, Genet., 7, 149-154 (1991)). En otra modalidad más de la invención, un arreglo de sondas oligonucleotídicas que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención pueden ser construidas para conducir la selección eficiente de variantes genéticas, mutaciones y polimorfismos. Métodos de tecnología de arreglos son bien conocidos y tienen en general aplicabilidad que pueden ser utilizados para enfrentar una variedad de cuestiones en la genética molecular, incluyendo la expresión del gen, el enlace genético, y la variabilidad genética (ver por ejemplo: M. Chee et al., Science (1996), Vol. 274, p. 610-613) .

En una modalidad, el arreglo es preparado y utilizado de acuerdo a los métodos descritos en la solicitud del PCT W095/11995 (Chee et al.); Lockhart, D.J. et al. (1996) Nat. Biotech. 14: 1675-1680); y Schena, M. et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. 93: 10614-10619). Los pares de oligonucleótidos pueden ir de dos a más de un millón. Los oligómeros son sintetizados en áreas designadas sobre un sustrato, utilizando un proceso químico dirigido a la luz. El sustrato puede ser papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, chip, portaobjetos de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. En otro aspecto más, un oligonucleótido puede ser sintetizado sobre la superficie del sustrato mediante el uso de un procedimiento de acoplamiento químico y un aparato de aplicación de chorro de tinta, como se describe en la solicitud del PCT W095/25116 (Baldeschweiler et al.). En otro aspecto más, un arreglo en "rejilla" análogo a una transferencia por puntos (o ranura) puede ser utilizado para acomodar y enlazar los fragmentos de cADN o los oligonucleótidos a la superficie de un sustrato utilizando un sistema de vacío, procedimientos de unión térmica, por UV, mecánica o química. Un arreglo, tales como aquellos descritos anteriormente, puede ser producido manualmente o mediante el uso de dispositivos disponibles (aparato de transferencia por ranura o transferencia por puntos) , materiales (cualquier soporte sólido adecuado) , y máquinas (incluyendo instrumentos robóticos) , y puede contener 8, 24, 96, 384, 1536 ó 6144 oligonucleótidos, o cualquier otro número entre dos y más de un millón que se preste al uso eficiente de la instrumentación comercialmente disponible. Además de los métodos discutidos anteriormente, las enfermedades pueden ser diagnosticadas mediante métodos que comprenden la determinación, a partir de una muestra derivada de un sujeto, de un nivel anormalmente disminuido o incrementado de polipéptido o de mRNA. La expresión disminuida o incrementada puede ser medida al nivel del RNA utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos en la materia para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección con RNasa, transferencia de Northern y otros métodos de hibridación. Las técnicas de ensayo que pueden ser utilizadas para determinar los niveles de un polipéptido de la presente invención en una muestra derivada de un hospedero son bien conocidas por aquellos expertos en la materia y son discutidas en cierto detalle anteriormente (incluyendo radioinmunoensayos, ensayos de enlace competitivos, análisis de Western Blot y ensayos de ELISA) . Este aspecto de la invención proporciona un método de diagnóstico que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un ligando como se describe anteriormente con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar el complejo. Los protocolos tales como ELISA, RÍA y FACS para medir los niveles de polipéptido pueden proporcionar además una base para diagnosticar los niveles alterados o anormales de la expresión del polipéptido. Los valores normales o estándares para la expresión del polipéptido son establecidos por la combinación de los fluidos corporales o los extractos celulares tomados de sujetos mamíferos normales, preferentemente humanos, con anticuerpo para el polipéptido bajo condiciones adecuadas para la formación del complejo. La cantidad de formación estándar del complejo puede ser cuantificada mediante diversos métodos, tales como mediante medios fotométricos. Los anticuerpos que se enlazan específicamente a un polipéptido de la invención pueden ser utilizados para el diagnóstico de condiciones o enfermedades caracterizadas por expresión del polipéptido, o en ensayos para monitorizar a los pacientes que son tratados con los polipéptidos, las moléculas de ácido nucleico, ligandos y otros compuestos de la invención. Los anticuerpos útiles para fines de diagnóstico pueden ser preparados de la misma manera que aquellos descritos anteriormente para fines terapéuticos. Los ensayos de diagnóstico para el polipéptido incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar el polipéptido en fluidos corporales humanos o extractos de células o tejidos. Los anticuerpos pueden ser utilizados con o sin modificación, y pueden ser marcados al unirlos, ya sea covalente o no covalentemente, con una molécula reportera. Una amplia variedad de moléculas reporteras conocidas en la técnica pueden ser utilizadas, varias de las cuales se describen anteriormente. Las cantidades del polipéptido expresado en el sujeto, en las muestras control y de la enfermedad provenientes de tejidos de biopsia son comparados con los valores estándares . La desviación entre los valores estándar y del sujeto establece los parámetros para diagnosticar la enfermedad. Los ensayos de diagnóstico pueden ser utilizados para distinguir entre ausencia, presencia y expresión excesiva del polipéptido y para monitorizar la regulación de los niveles de polipéptido durante la invención terapéutica. Tales ensayos pueden también ser utilizados para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios en animales, en pruebas clínicas o en el monitoreo del tratamiento de un paciente individual. Un equipo de diagnóstico de la presente invención puede comprender: (a) una molécula de ácido nucleico de la presente invención; (b) un polipéptido de la presente invención; o (c) un ligando de la presente invención. En un aspecto de la invención, un equipo de diagnóstico puede comprender un primer recipiente que contiene una sonda de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones estrictas con una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención; un segundo recipiente que contiene cebadores útiles para amplificar la molécula de ácido nucleico; e instrucciones para el uso de la sonda y los cebadores para facilitar el diagnóstico de la enfermedad. El equipo puede comprender además un tercer recipiente que mantiene un agente para digerir el RNA no hibridado. En un aspecto alternativo de la invención, un equipo de diagnóstico puede comprender un arreglo de moléculas de ácido nucleico, al menos una de las cuales puede ser una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención. Para detectar el polipéptido de acuerdo a la invención, un equipo de diagnóstico puede comprender uno o más anticuerpos que se enlazan a un polipéptido de acuerdo a la invención; y un reactivo útil para la detección de una reacción de enlace entre el anticuerpo y el polipéptido. Tales equipos serán de uso en el diagnóstico de una enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad en la cual están implicados los miembros de la familia de glucoproteínas de la superficie celular. Tales enfermedades pueden incluir trastornos proliferativos celulares, incluyendo neoplasma, melanoma, tumores de pulmón, colorrectal, de mama, de páncreas, de cabeza y cuello y otros tumores sólidos; trastornos mieloproliferativos, tales como leucemia, linfoma no Hodgkin, leucopenia, trombocitopenia, trastorno de angiogénesis, sarcoma de Kaposi; trastornos autoinmunes/inflamatorios, incluyendo alergia, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis, psoriasis e inflamación del tracto respiratorio, asma, y rechazo de trasplante de órganos; trastornos cardiovasculares; incluyendo hipertensión, edema, angina, ateroesclerosis, trombosis, sepsis, choque, daño por reperfusión, e isquemia; trastornos neurológicos incluyendo enfermedad del sistema nervioso central, enfermedad de Alzheimer, daño cerebral, esclerosis lateral amiotrófica y dolor; trastornos del tracto respiratorio, incluyendo enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis quística; trastornos del desarrollo; trastornos metabólicos incluyendo diabetes mellitus, osteoporosis, y obesidad, SIDA y enfermedad renal; infecciones incluyendo infección viral, infección bacteriana, infección fúngica e infección parasitaria y otras condiciones patológicas. Preferentemente, las enfermedades son aquellas en las cuales los antígenos linfocíticos están implicados. Tales equipos pueden ser también utilizados para la detección de trastornos reproductivos incluyendo la infertilidad.

Diversos aspectos y modalidades de la presente invención serán descritos ahora con más detalle a manera de ejemplo, con referencia particular al polipéptido INSP201. Se apreciará que la modificación del detalle puede ser realizada sin apartarse del alcance de la invención. De acuerdo a la invención, los antagonistas de INSP201 soluble (por ejemplo INSP201-EC) o agonistas de INSP201 enlazado a la membrana (por ejemplo anticuerpos agonistas) pueden ser administrados solos o en combinación con otros diversos regímenes terapéuticos o agentes anticancerosos (por ejemplo régimen de fármacos múltiples) para obtener un efecto aditivo o sinérgico para el tratamiento y/o prevención del cáncer, HIV y/o EBV e infecciones por hepatitis B. El agente anticanceroso se selecciona de los compuestos de platino tales como cisplatino y carboplatino, alcaloides de vincapervinca tales como vinorelbina, vincristina y vinblastina, taxinas tales como docetaxel y paclitaxel, diversos inhibidores de topoisomerasa, IL-2 e interferón a. De acuerdo a la invención, los agonistas de INSP201 soluble (por ejemplo INSP201-EC) o antagonistas de INSP201 enlazado a la membrana (por ejemplo anticuerpos antagonistas) pueden ser administrados solos o en combinación con otros diversos regímenes o agentes terapéuticos (por ejemplo el régimen de fármacos múltiples) para obtener un efecto aditivo o sinérgico para el tratamiento y/o prevención de inflamación y/o enfermedades autoinmunes . El agente anti-inflamatorio se selecciona entre interferón beta, ciclosporina A, tacrolimus y sirolimus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: predicción del sitio de glucosilación para INSP201 utilizando NetNGlyc 1.0. Figura 2: cADN de INSP201 y secuencia de proteína.

La posición de los cebadores de PCR utilizados para la clonación es indicada por flechas. El dominio extracelular predicho es puesto de manifiesto en gris. Figura 3 : Secuencia de nucleótidos con traducción del producto de PCR INSP201EC. Figura 4: Análisis Taqman de INSP201-EC para colección de tejidos mayores (Tabla 2) . Figura 5: Análisis Taqman de INSP201-EC para tejidos comparativos (Tabla 3) . Figura 6: Análisis Taqman de INSP201-EC para diversas biopsias de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (Tabla 7) . Figura 7: Inhibición de INSP201-EC de la secreción de IL- 2 a partir de PBMC estimuladas con ConA. El eje X representa la concentración de AS902132/2 en µg/ml. El eje Y representa el porcentaje de secreción de citocina (IL-2) .

TABLA 1 Aminoácidos Grupo s Sinónimos Grupos Sinónimos Más Preferidos Ser Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Thr, Ser Arg Asn, Lys, Gln, Arg, His Arg, Lys, His Leu Phe, He, Val, Leu, Met He, Val, Leu, Met Pro Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Pro Thr Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Thr, Ser Ala Gly, Thr, Pro, Ala, Ser Gly, Ala Val Met, Phe, He, Leu, Val Met, He, Val, Leu Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Gly, Ala He Phe, He, Val, Leu, Met He, Val, Leu, Met Phe Trp, Phe, Tyr Tyr, Phe Tyr Trp, Phe, Tyr Phe, Tyr Cys Ser, Thr, Cys Cys His Asn, Lys, Gln, Arg, His Arg, Lys, His Gln Glu, Asn, Asp, Gln Asn, Gln Asn Glu, Asn, Asp, Gln Asn, Gln Lys Asn, Lys, Gln, Arg, His Arg, Lys, His Asp Glu, Asn, Asp, Gln Asp, Glu Glu Glu, Asn, Asp, Gln Asp, Glu Met Phe, He, Val, Leu, Met He, Val, Leu, Met Trp Trp, Phe, Tyr trp Tabla 2 Asn D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Lys D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, He, D-Ile, Orn, D-Orn Asp D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Glu D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln Met D-Met, S-Me-Cys, He, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val Ejemplo 1: Identificación y análisis in silico de INSP201 Como se describe anteriormente, se predice que el polipéptido INSP201 funciona como una glucoproteína de la superficie celular. La salida de la señal P-NN para INSP201 muestra que la proteína comprende una secuencia guía que se piensa es escindida entre las posiciones 21 y 22 de la secuencia (Nielsen, H. et al., 1997, Protein Engineering, 10, 1-6; Nielsen, H. , y Krogh, A.: Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, p. 122-130 (1998)). La presencia de una secuencia guía es consistente con la proteína INSP201 que funciona como una proteína secretada . Los resultados de TMHMM para INSP201 indican que el polipéptido contiene un dominio transmembranal entre los residuos 406-428 inclusive. TMHMM es una base de datos que predice los dominios transmembranales con base en las estructuras secundarias conocidas. La Figura 1 muestra los resultados de NetNGlyc (versión 1.0) (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) para INSP201. NetGlyc es un programa basado en un algoritmo de red neural entrenado para identificar la secuencia de consenso para la glucosilación N-enlazada, Asn-Xaa-Ser/Thr (donde Xaa no es Pro) , y el contexto de la secuencia vecina, en un intento para discriminar entre los sequones aceptores y no aceptores. La glucosilación es una modificación post-traduccional importante, y se sabe que influye el plegamiento de las proteínas, la localización y tráfico de las mismas, la solubilidad de las proteínas, la antigenicidad, la actividad biológica y la vida media, así como las interacciones célula-célula. Con base en estos experimentos y en la información de la secuencia de INSP201 proporcionada en la presente, es posible ahora diseñar experimentos para detectar la presencia del transcrito INSP201 a través de una gama de tipos tisulares humanos para determinar su expresión tisular. Además, será posible diseñar los experimentos para detectar la presencia del transcrito INSP201 a través de una gama de tejidos normales y enfermos, con el fin de establecer más particularmente la relevancia de la proteína INSP201 en un contexto patológico.

Al mismo tiempo, la clonación del INSP201 proveniente del ADN genómico humano permitirá la expresión de alto nivel de la proteína INSP201 en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos y su purificación y caracterización subsecuentes. Por ejemplo, INSP201 recombinante puede ser utilizado para generar anticuerpos monoclonales o policlonales específicos de INSP201 que pueden ser luego utilizados en caracterización bioquímica adicional de INSP201. Alternativamente, INSP201 recombinante puede ser utilizado en una amplia variedad de ensayos de selección, incluyendo aquellos descritos anteriormente.

Ejemplo 2 Está en proceso el trabajo para clonar el gen que codifica para el polipéptido INSP201. Éste puede involucrar la preparación de plantillas de cADN humano, por ejemplo, provenientes de una variedad de muestras de RNA total de tejido humano normal (que pueden ser adquiridas de Clontech, Stratagene, A bion, Biochain Institute y preparadas domésticamente) utilizando una enzima tal como la Transcriptasa Inversa RNasa H Superscript II (Invitrogen) . Las bibliotecas de cADN humano (en vectores bacteriófago lambda (?) ) pueden ser adquiridas de Clontech, Invitrogen, o elaboradas domésticamente en vectores ? GT10. Pares de cebadores de PCR específicos pueden ser diseñados para amplificar la secuencia de codificación completa del cADN virtual utilizando el software tal como el software Primer Designer (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, EUA). Los pares de cebadores de PCR específicos pueden ser también diseñados para amplificar la secuencia de ADN de cada exón predicho, utilizando el mismo software. Estos fragmentos aislados de ADN pueden ser ensamblados en el orden deseado utilizando vectores de clonación, las reacciones de PCR y/o reacciones restricción/ligadura de ADN. Los cebadores de PCR fueron optimizados para tener un Tm cercano a 55 + 10°C y un contenido de GC de 40 a 60%. Los cebadores deben ser seleccionados, los cuales tienen alta selectividad para la secuencia objetivo (INSP201) con poca o ninguna cebadura no específica. La PCR puede entonces ser utilizada para amplificar la secuencia génica de interés. Los procedimientos necesarios para la clonación de la secuencia, tales como la sub-clonación de los productos de PCR, la PCR de colonias, la preparación de ADN plásmido y el secuenciamiento, y finalmente la construcción de vectores de expresión de células de mamífero, son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, WO03/055913 ) . Experimentos adicionales pueden ser entonces realizados para determinar la distribución tisular y los niveles de expresión del polipéptido INSP201 in vivo, con base en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas en la presente. Por ejemplo, la presencia de los transcritos para INSP201 puede ser investigada mediante PCR o cADN a partir de tejidos humanos diferentes. El transcrito de INSP201 puede estar presente a niveles muy bajos en las muestras probadas. Por lo tanto, se necesita cuidado extremo en el diseño de experimentos para establecer la presencia de un transcrito en diversos tejidos humanos ya que una pequeña cantidad de contaminación genómica en la preparación del RNA proporcionará un resultado falso positivo. De este modo, todo el RNA debe ser tratado con ADNasa antes de utilizarse para la transcripción inversa. Además, para cada tejido puede ser establecida una reacción control en la cual no fue emprendida la transcripción inversa (control de RT a-ve) . Por ejemplo, 1 µg de RNA total de cada tejido puede ser utilizado para generar el cADN utilizando la transcriptasa inversa Multiscript (ABI) y cebadores hexaméricos aleatorios. Para cada tejido, es establecida una reacción control en la cual todos los constituyentes son agregados, excepto la transcriptasa inversa (control de RT -ve) . Las reacciones de PCR son establecidas para cada tejido sobre las muestras de RNA transcritas inversamente, y los controles de RT negativos. Los cebadores específicos de INSP201 pueden ser fácilmente diseñados con base en la información de secuencia proporcionada en la presente. La presencia de un producto del peso molecular correcto en la muestra transcrita inversamente, junto con la ausencia de un producto en el control RT negativo puede ser tomada como evidencia para la presencia de un trascrito en ese tejido. Cualesquiera bibliotecas de cADN adecuadas pueden ser utilizadas para seleccionar el transcrito de INSP201, no solamente aquellas generadas como se describió anteriormente. El patrón de distribución tisular del polipéptido INSP201 proporcionará información útil en relación a la función de esos polipéptidos. Además, la sobreexpresión o la eliminación de la expresión de los polipéptidos en líneas celulares, puede ser utilizada para determinar el efecto sobre la activación transcripcional del genoma de la célula hospedera. Los socios de dimerización, co-activadores y co-represores del polipéptido INSP201 pueden ser identificados mediante inmunoprecipitación combinada con Western Blot e inmunoprecipitación combinada con espectroscopia de masa.

Ejemplo 3. Clonación del dominio extracelular INSP201 Se predice que INSP201 es una proteína transmembranal de paso simple con un dominio extracelular no anotable (N-terminal) y un dominio intracelular conservado (posiblemente involucrado en la señalización) . Ésta es una predicción de longitud completa para una proteína de 518 aminoácidos (1554 pares de bases) codificada en 3 exones. El dominio extracelular predicho es codificado por los primeros 405 aminoácidos (1215 pares de bases) . Todos excepto los 32 pares de bases del extremo 3 ' del dominio extracelular son codificados en el exon 1 de la predicción. Un par de cebadores de PCR (INSP201-CP1/INSP201-CP2) (Figura 2) fue diseñado para amplificar un producto de 1215 pares de bases que contenía el dominio extracelular predicho completo de la predicción. El cebador de PCR inverso INSP201-CP2 fue de 51 pares de bases de longitud y contenía un traslape de 19 pares de bases con el extremo 3 ' del exón 1, así como los 32 pares de bases del dominio extracelular codificado en el exón 2. Estos cebadores fueron utilizados en la PCR con el ADN genómico como la plantilla. El cebador INSP201-CP2 podría amplificar el exón 1 y simultáneamente agregar los 32 pares de bases del exón 2 sobre el producto de PCR. Los productos de PCR fueron visualizados sobre un gel y una banda del tamaño predicho fue purificada y clonada dentro del vector de clonación pCR4-TOPO. El análisis de la secuencia identificó un clon que contenía la secuencia del dominio extracelular de INSP201. Este clon es el plásmido pCR4-TOPO-INSP201-EC . 3.1 Cebadores de clonación específicos del gen para PCR Un par de cebadores de PCR (INSP201-CP1 e INSP201-CP2, Tabla 3) fueron diseñados para la amplificación de un producto de 1215 pares de bases que contenía la secuencia de codificación predicha del cADN virtual utilizando el Software Primer Designer (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, EUA) . Fueron seleccionados los cebadores los cuales tenían alta selectividad para la secuencia objetivo (INSP201) . 3.2 PCR del dominio extracelular de INSP201 a partir del ADN genómico La mayor parte del dominio extracelular predicho de INSP201 estuvo comprendida de un exón simple y de este modo pudo ser amplificada a partir del ADN genómico. Los 32 pares de bases del dominio extracelular codificado en el exón 2 fueron incluidos en el cebador de PCR inverso INSP201-CP2, el cual también contenía un traslape de 19 pares de bases con el extremo 3' del exón 1. La PCR se realizó utilizando cebadores de clonación específicos del gen INSP201-CP1/INSP201-CP2 y el ADN genómico como la plantilla en un volumen final de 50 µl que contenía IX de amortiguador Platinum® Taq de Alta Fidelidad (HiFi) , sulfato de magnesio 2 mM, dNTPs 200 µM, 0.2 µM de cada cebador de clonación, 1 unidad de la ADN-polimerasa Platinum Taq de Alta Fidelidad (HiFi) (Invitrogen), 100 ng de ADN genómico (Novagen, INc . ) , y ya sea OX, IX o 2X de PCRX solución aumentadora (Invitrogen) . El ciclo fue realizado utilizando una máquina de ADN MJ Research, programada como sigue: 94°C, 2 minutos; 35 ciclos de 94°C, 30 segundos, 68°C, 1 minuto 30 segundos; seguido por 1 ciclo a 68°C por 78 minutos y un ciclo de retención a 4°C. Los productos de amplificación fueron visualizados sobre un gel de agarosa al 0.8% en amortiguador 1 X TAE (Invitrogen) . Los productos de PCR del peso molecular esperado (1215 pares de bases) fueron purificados a partir del gel utilizando el Sistema de Purificación de ADN MinElute (Qiagen) , eluido en 10 µl de amortiguador EB (Tris HCl 10 mM, pH 8.5) y subclonado directamente. 3.3 Subclonación de los productos de PCR El producto de PCR fue subclonado en el vector de clonación modificado con la topoisomerasa I (pCR4-TOPO) utilizando el equipo de clonación TA adquirido de Invitrogen Corporation utilizando las condiciones especificadas por el fabricante. En resumen, 4 µl del producto de PCR purificado en gel fueron incubados por 15 minutos a temperatura ambiente con 1 µl del vector TOPO y 1 µl de la solución salina. La mezcla de reacción fue luego transformada en E. coli cepa TOP10 (Invitrogen) como sigue: una alícuota de 50 µl de las células One Shot TOP10 fue descongelado sobre hielo y se agregaron 2 µl de la reacción TOPO. La mezcla se incubó por 15 minutos sobre hielo y luego se chocó por calor por incubación a 42°C exactamente por 30 segundos. Las muestras fueron devueltas al hielo y se agregaron 250 µl del medio SOC caliente (temperatura ambiente) . Las muestras fueron incubadas con agitación (220 rpm) por 1 hora a 37°C. El volumen total de la mezcla de transformación fue luego sembrado en placa sobre placas de caldo L (LB) que contenían ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron toda la noche a 37°C. 3.4 PCR de las colonias Las colonias fueron inoculadas en 50 µl de agua estéril utilizando un palillo estéril. Una alícuota de 10 µl del inoculo fue luego sometida a PCR en un volumen de reacción total de 20 µl que contenía amortiguador IX AmpliTaq*11*, dNTPs 200 µM, 20 pmoles de cebador T7 , 20 pmoles de cebador T3, y 1 unidad de AmpliTaq"11 (Applied Biosystems) utilizando una máquina de ADN MJ Research. Las condiciones del ciclo fueron como sigue: 94°C, 2 minutos; 30 ciclos de 94°C, 30 segundos, 48°C, 30 segundos y 72°C por 1 minuto 30 segundos. Las muestras fueron mantenidas a 4°C (ciclo de retención) antes del análisis posterior. Los productos de PCR fueron analizados sobre geles de agarosa al 1% sobre amortiguador 1 X TAE. Las colonias que dieron los productos de PCR de aproximadamente el peso molecular esperado (1215 pb + 105 pb debido al sitio de clonación múltiple (MCS) ) fueron desarrollados toda la noche a 37°C en 5 ml de caldo L (LB) que contenía ampicilina (100 µg/ml) , con agitación a 220 rpm. 3.5 Preparación del ADN plásmido y secuenciamiento El ADN plásmido Miniprep fue preparado a partir del cultivo de 5 ml utilizando el sistema robótico Biorobot 8000 (Qiagen) o el equipo Wizard Plus SV Minipreps (Promega catálogo No. 1460) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido fue eluido en 80 µl de agua estéril. La concentración de ADN fue medida utilizando un fotómetro Spectramax 190 (Molecular Devices) . El ADN plásmido (200-500 ng) fue sometido a secuenciamiento de ADN con los cebadores T7 y T3, y los cebadores específicos del gen INSP201-SP1 e INSP201-SP2, utilizando el sistema BigDye Terminator (Applied Biosystems cat. No. 4390246) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La secuencia del cebador se muestra en la Tabla 3. Las reacciones de secuenciamiento fueron purificadas utilizando las columnas Dye-Ex (Qiagen) o las placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore cat. No.

LSKS09624) analizadas luego sobre un secuenciador Applied Biosystems 3700. El análisis de la secuencia identificó un clon que contenía una concordancia de 100% a la secuencia del dominio extracelular de INPS201 predicha, al nivel de los aminoácidos. La secuencia del fragmento de cADN clonado se muestra en la Figura 3. El producto de PCR clonado está en el plásmido pCR4-TOPO-INSP201-EC. 3.6 Construcción de los vectores de expresión en células de mamífero para INSP201-EC El plásmido pCR4-TOPO-INSP201-EC fue utilizado como la plantilla de PCR para generar los clones de expresión pEAKl2d y pDESTl2.2 que contenían la secuencia ORF de INSP201-EC con una secuencia 3' que codifica para el marcador 6HIS utilizando la metodología de clonación Gateway^ (Invitrogen) . 3.7 Generación del ORF de INSP201-EC compatible con Gateway, fusionado a una secuencia marcadora 6HIS infraestructural . La primera etapa del proceso de clonación Gateway involucra una reacción de PCR de dos pasos que genera la ORF de INSP201-EC flanqueada en el extremo 5' por un sitio de recombinación attBl y la secuencia Kozak, y flanqueado en el extremo 3' por una secuencia que codifica para un marcador de 6 histidinas (6HIS) intraestructural, un codón de detención y el sitio de recombinación attB2 (cADN compatible con Gateway) . La primera reacción de PCR (en un volumen final de 50 µl) contiene respectivamente: 1 µl (30 ng) del plásmido PCR4-TOPO-INSP201-EC, 1.5 µl de dNTPs (10 mM) , 10 µl de amortiguador de polimerasa 10X Pfx, 1 µl de sulfato de magnesio (50 mM) , 0.5 µl de cada uno de los cebadores específicos de genes (100 µM) (INSP201EC-EX1 e INSP201EC-EX2), y 0.5 µl de ADN-polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen). La reacción de PCR fue realizada utilizando un paso de desnaturalización inicial de 95°C por 2 minutos, seguido por 12 ciclos de 94°C por 15 segundos; 55°C por 30 segundos y 68°C por 2 minutos; y un ciclo de retención a 4°C. El producto de amplificación fue directamente purificado utilizando un Sistema de Purificación de ADN Wizard PCR Preps (Promega) y recuperado en 50 µl de agua estéril de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La segunda reacción de PCR (en un volumen final de 50 µl) contenía 10 µl del producto de PCRl purificado, 1.5 µl de dNTPs (10 mM) , 5 µl de amortiguador de polimerasa 10X Pfx, 1 µl de sulfato de magnesio (50 mM) , 0.5 µl de cada cebador de conversión Gateway (100 µM) (GCP delantero y GCP inverso) y 0.5 µl de ADN-polimerasa Platinum Pfx. Las condiciones para la 2a reacción de PCR fueron: 95°c por 1 minuto; 4 ciclos de 94°C, 15 segundos; 50°C, 30 segundos y 68°C por 2 minutos; 25 ciclos de 94°C, 15 segundos; 55°C, 30 segundos y 68°C, 2 minutos; seguido por un ciclo de retención de 4°C, . Una alícuota de 10 µl fue visualizada sobre gel de agarosa al 0.8% en amortiguador 1 X TAE (Invitrogen) con el fin de verificar que el producto fuera del peso molecular esperado (1215 + 70 = 1285 pb) . Los 40 µl restantes fueron cargados sobre un gel de agarosa al 0.8% en gel de amortiguador 1 X TAE y la banda fue purificada utilizando el Sistema de Purificación de ADN Wizard PCR Preps (Promega) y recuperado en 50 µl de agua estéril de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 3.8 Subclonación de la ORF de INSP201-EC compatible con Gateway, dentro del vector de entrada de Gateway pDONR4221 y los vectores de expresión pEAKl2d-PAC y pDEST12.2 La segunda etapa del proceso de clonación Gateway involucra la subclonación del producto de PCR modificado por Gateway dentro del vector de entrada pDON4221 de Gateway (Invitrogen) como sigue: 5 µl del producto purificado de PCR2 fueron incubados con 1.5 µl del vector pDONR221 (0.1 µg/µl) , 2 µl de amortiguador BP y 1.5 µl de la mezcla de enzimas clonasas de BP (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl a temperatura ambiente por 1 hora. La reacción fue detenida por la adición de 1 µl de la proteinasa K (2 µg/µl) y se incubó a 37°C por 10 minutos adicionales. Una alícuota de 1 µl de esta reacción fue utilizada para transformar las células E. coli DH10B mediante electroporación como sigue: una alícuota de 25 µl de las células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) fue descongelada sobre hielo y se agregó 1 µl de la mezcla de reacción BP. La mezcla fue transferida a una cubeta de electroporación de 0.1 cm enfriada, y las células sometidas a electroforesis utilizando un BioRad Gene-Pulser*01 de acuerdo al protocolo recomendado por el fabricante. El medio SOC (0.5 ml) que había sido pre-calentado a temperatura ambiente fue agregado inmediatamente después de la electroporación. La mezcla fue transferida a un tubo de tapa de ajuste a presión de 15 ml, y se incubó, con agitación a 220 rpm por 1 hora a 37°C. Las alícuotas de la mezcla de transformación (10 µl y 50 µl) fueron luego sembradas sobre placas de caldo L (LB) que contenía kanamicina (40 µg/ml) e incubadas toda la noche a 37°C . El ADN miniprep plásmido fue preparado a partir de 5 ml de cultivo de las 8 colonias resultantes utilizando un sistema Qiaprep BioRobot 8000 (Qiagen) . El ADN plásmido (150-200 ng) fue sometido a secuenciamiento de ADN con los cebadores 21M13 y M13Rev, así como con los cebadores de secuenciamiento INSP201-319F-SP1 e INSP201-570F-SP1 específicos del gen, como se describe anteriormente utilizando el sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems cat. No. 4336919) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias cebadoras son mostradas en la Tabla 3. Las reacciones de secuenciamiento fueron purificadas utilizando las placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore cat. No. LSKS09624) luego analizadas sobre un secuenciador Applied Biosystems 3700. El eluido del plásmido (2 µl o aproximadamente 150 ng) proveniente del clon que contenía el inserto INSP201-EC-6HIS (pENTR_INSP201-EC-6HIS) fue luego utilizado en una reacción de recombinación que contenía 1.5 µl ya sea del vector pEAK12d-PAC o el vector pDESTl2.2 (0.1 µg/µl), 2 µl de amortiguador LR y 1.5 µl de clonasa LR (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl . La mezcla se incubó a temperatura ambiente por 1 hora, se detuvo por la adición de 1 µl de la proteinasa K (2 µg/µl) y se incubó a 37°C por 10 minutos adicionales. Una alícuota de 1 µl de esta reacción fue utilizada para transformar las células E. coli DHlOB mediante electroporación como sigue: una alícuota de 25 µl de las células electrocompetentes DHlOB (Invitrogen) fue descongelada sobre hielo y se agregó 1 µl de la mezcla de reacción BP. La mezcla fue transferida a una cubeta de electroporación de 0.1 cm enfriada, y las células sometidas a electroforesis utilizando un BioRad Gene-Pulser™1 de acuerdo al protocolo recomendado por el fabricante. El medio SOC (0.5 ml) que había sido pre-calentado a temperatura ambiente fue agregado inmediatamente después de la electroporación. La mezcla fue transferida a un tubo de tapa de ajuste a presión de 15 ml, y se incubó, con agitación a 220 rpm por 1 hora a 37°C. Las alícuotas de la mezcla de transformación (10 µl y 50 µl) fueron luego sembradas sobre placas de caldo L (LB) que contenía kanamicina (40 µg/ml) e incubadas toda la noche a 37°C. El ADN plámido mini-prep fue preparado a partir de cultivos de 5 ml a partir de las 6 colonias resultantes subclonadas en cada vector utilizando un sistema Qiaprep BioRobot 8000 (Qiagen) . El ADN plásmido (200-500 ng) en el vector pEAKl2d-PAC fue sometido a secuenciamiento de ADN con los cebadores pEAKl2F y pPEAKl2R así como con los cebadores de secuenciamiento INSP201-319F-SP1 e INSP201-570F-SP1 específicos del gen, como se describe anteriormente. El ADN plásmido (200-500 ng) en el vector pDESTl2.2 fue sometido a un secuenciamiento de ADN con los cebadores 21M13 y Ml3Rev así como con los cebadores de secuenciamiento específico del gen descritos anteriormente. Las secuencias cebadoras se muestran en la Tabla 3. El ADN maxi-prep purificado en gradiente de cloruro de cesio fue preparado a partir de un cultivo de 500 ml del clon verificado en secuencia (pEAK12d-PAC_INSP201-EC-6HIS) utilizando el método descrito por Sambrook J. et al., 1989 (en Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press) , el ADN plásmido fue resuspendido a una concentración de 1 µg/µl en agua estéril (o Tris-HCl 10 mM pH 8.5) y almacenado a -20°C. El ADN maxi-prep libre de endotoxina fue preparado a partir de un cultivo de 500 ml del clon verificado en secuencia (pDEST12.2_INSP201-EC-6HIS) utilizando el equipo EndoFree Plasmid Mega (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido purificado fue resuspendido en amortiguador TE libre de endotoxina a una concentración final de al menos 3 µg/µl y almacenado a -20°C.

Tabla 3: Clonación de INSP201 y cebadores de secuenciamiento Cebador Secuencia (5 '-3' ) INSP201-CP1 ATG AAA TCA TTC AGC CGG ATC CTC TTC CTC GTC TTC CTC INSP201-CP2 TGC GCC ACG TGG TCG CCC CAC CAG AGT CAC GCC GGT CTC CTT CAC TCG CTC INSP201EC-EX1 GCA GGC TTC GCC ACC ATG AAA TCA TTC AGC CGG AT INSP201EC-EX2 TG ATG GTG ATG GTG TGC GCC ACG TGG TCG CCC CAC INSP201-319F-SP1 GCT GAC TCA CTC ACÁ ACC TCAA INSP201-570F-SP2 TGA AGT CTC ACÁ GGC AGA AC GCP Delantero G GGG ACÁ AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTC GCC ACC GCP Inverso GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTT TCA ATG GTG ATG GTG ATG GTG PEAK12F GCC AGC TTG GCA CTT GAT GT pEAK12R GAT GGA GGT GGA CGT GTC AG 21M13 TGT AAA ACG ACG GCC AGT M13REV CAG GAA ACÁ GCT ATG ACC T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG G T3 ATT AAC CCT CAC TAA AGG Secuencia subrayada = secuencia Kozak Negritas = Codón de detención Secuencia en cursivas = marcador His Ejemplo 4. Expresión de genómicos funcionales en células de mamífero y purificación del plásmido pEAKl2d-PC_INSP201-EC-6HIS marcado con His, clonado Las células 293 de riñon embrionario humano que expresan el antígeno Nuclear del virus de Epstein-Barr (HEK293-EBNA, Invitrogen) fueron mantenidos en suspensión en medio libre de suero Ex-cell VPRO (reserva de siembra, medio de mantenimiento, JRH) . Las células son inoculadas a lxlO6 células/ml en 250 ml de FEMÉ (DMEM/F-12 de Ham 1:1 HEPES 19 mM, 5 g/1 de glucosa, L-glutamina 7.5 mM, 4 ml/litro de ITS-X) (todos de Invitrogen Life Technologies) medio que es suplementado con 1% de FCS. Para la mezcla de transfección, 500 µg de ADN (pEAKl2d-PAC_INSP201-EC-6HIS) más 10 µg de ADN del gen reportero se diluyen en FCS al 1% en 50 ml de FEMÉ. Luego se agrega 1 ml de PEÍ (1 mg/litro Polysciences, EUA) . Esta mezcla es incubada por 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos la mezcla de transfección es agregada a las células y el cultivo es incubado a 37°C en la incubadora por 90 minutos. Finalmente, el volumen es detenido con los 200 ml remanentes de FEMÉ 1% de FCS que contiene 2.5 ml de Pen-Strep para prevenir la contaminación debido a la no esterilidad del ADN. La confirmación de la transfección positiva fue realizada mediante examen de fluorescencia cualitativo en el día 6 (Axiovert 10 Zeis) . En el día 6 (día de la cosecha) , se centrifugaron 500 ml de sobrenadante (4°C, 400 g) y se colocaron en un recipiente que posee un identificador único. 4.1 Proceso de purificación La muestra de medio de cultivo de 500 ml- que contenía la proteína recombinante con un marcador 6His C-terminal se diluyó con un volumen del amortiguador frío A (NaH2P0 50 mM; cloruro de sodio 600 mM; glicerol a 8.7% (p/v), pH 7.5) hasta un volumen final de 1000 ml . La muestra fue filtrada a través de un filtro estéril de 0.22 µm (Millipore, unidad de filtro de 500 ml) y mantenida a 4°C en una botella de medio cuadrada, estéril de 1 litro (Nalgene) . La purificación fue realizada a 4°C sobre una estación de trabajo VISION (Applied Biosystems) conectada a un cargador de muestras automático (Labomatic) . El procedimiento de purificación fue compuesto de dos pasos secuenciales, cromatografía de afinidad de metal sobre una columna Poros 20 MC (Applied Biosystems) cargada con iones de níquel (10 x 50 mm, 3.93 ml) , seguida por intercambio del amortiguador sobre un medio Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia) de columna de filtración en gel (1.0 x 15 cm) . Para el primer paso de cromatografía la columna de afinidad de metal fue regenerada con 30 volúmenes de columna de solución de EDTA (EDTA 100 mM; cloruro de sodio 1 M; pH 8.0), recargada con iones Ni lavando con 15 volúmenes de columna de una solución de sulfato de níquel 100 mM, lavada con 10 volúmenes de columna de amortiguador A, seguido por 7 volúmenes de columna de amortiguador B (NaH2P0 50 mM; NaCl 600 mM; 8.7% de glicerol (p/v), 400 mM; imidazol, pH 7.5) y finalmente equilibrado con 15 volúmenes de columna de amortiguador A que contiene imidazol 15 mM. La muestra fue transferida, por el cargador de muestras Labomatic, dentro de un bucle de muestra de 200 ml y subsecuentemente cargada sobre una columna de afinidad de metal de Ni a una velocidad de flujo de 20 ml/minuto. El procedimiento de carga fue repetido 5 veces con el fin de transferir la muestra completa (100 ml) sobre la columna de Ni. Subsecuentemente, la columna fue lavada con 12 volúmenes de columna del amortiguador A, seguido por 28 volúmenes de columna del amortiguador A, que contenía imidazol 20 mM. Durante el lavado con imidazol 20 mM, las proteínas contaminantes flojamente adheridas fueron eluidas de la columna. La proteína marcada con His, recombinante, fue finalmente eluida con 10 volúmenes de columna de amortiguador B a una velocidad de flujo de 2 ml/minuto, y la proteína eluida fue recolectada en una fracción de 2.7 ml . Para el segundo paso de cromatografía, la columna de filtración en gel Sephadex G-25 fue regenerada con 2 ml de amortiguador D (cloruro de sodio 1.137 M; KCl 2.7 mM; KH2P04 1.5 mM; Na2HP0 8 mM; pH 7.2 ) y subsecuentemente equilibrada con 4 volúmenes de columna de amortiguador C (NaCl 137 mM; KCl 2.7 mM; KH2P04 1.5 mM; Na2HP04 8 mM; 20% (p/v) de glicerol; pH 7.4). La fracción pico eluida de la columna de Ni fue automáticamente transferida, a través del cargador de muestras integrado sobre el VISION, cargada sobre la columna de Sephadex G-25 y la proteína fue eluida con el amortiguador C a una velocidad de flujo de 2 ml/minuto. La muestra desalada fue recuperada en una fracción de 2.7 ml . La fracción fue filtrada a través de un filtro de centrifugación estéril de 0.22 µm (Millipore), repartida en alícuotas, congelada y almacenada a -80°C. Una alícuota de la muestra fue analizada sobre SDS-PAGE (gel NuPAGE al 4-12%; Novex) mediante tinción con azul de Coomassie y Western Blot con anticuerpos anti-His. 4.2 Tinción con Azul de Coomassie El gel NuPAGE fue teñido en una solución de tinción de azul de coomassie R250 al 0.1% (30% de metanol, 10% de ácido acético) a temperatura ambiente por 1 hora, y subsecuentemente desteñida en metanol al 20%, ácido acético al 7.5% hasta que el fondo estuvo claro y las bandas de proteína estuvieron claramente visibles. 4.3 Western Blot Después de la electroforesis las proteínas fueron electrotransferidas desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa a 290 mA por 1 hora a 4°C. La membrana fue bloqueada con leche en polvo al 5% en amortiguador E (NaCl 137 mM; KCl 2.7 mM; KH2P04 1.5 mM; Na2HP04 8 mM; 0.1% de Tween 20, pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, y subsecuentemente se incubó con una mezcla de 2 anticuerpos policlonales de conejo anti-His (G-18 y H-15, 0.2 µg/ml cada uno; Santa Cruz) en leche en polvo al 2.5% en amortiguador E toda la noche a 4°C. Después de una incubación de 1 hora adicional a temperatura ambiente, la membrana fue lavada con amortiguador E (3 x 10 minutos) , y luego incubada con un anticuerpo secundario conjugado a HRP, anticonejo (DAKO, H P 0399) diluido 1/3000 en amortiguador E que contenía 2.5% de leche en polvo por 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado con amortiguador E (3 x 10 minutos) , la membrana fue revelada con el equipo ECL (Amersham) por 1 minuto. La membrana fue subsecuentemente expuesta a un Hiperfilm (Amersham) , la película fue revelada y la imagen de Western Blot fue visualmente analizada.

Ejemplo 5. Análisis de los niveles de expresión del gen INSP201 mediante análisis TaqMan La PCR en tiempo * real fue llevada utilizando la química de verde SYBR sobre el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM 7700. Los pares de cebadores de PCR fueron diseñados tal que el producto pudiera abarcar un intrón de la secuencia que se analiza. Los niveles de expresión de los productos fueron determinados en un panel de productos de RT-PCR elaborados a partir de muestras de RNA utilizando cebadores aleatorios. El RNA total de cada muestra fue transcrito inversamente utilizando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra Superscript III para RT-PCR (Invitrogen, Cat. No. 10080-051) en un volumen de reacción final de 20 µl. 2 µg del RNA total fueron combinados con 50 ng de cebadores hexaméricos aleatorios, 10 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP y agua tratada con DEPC en un volumen de 10 µl. La mezcla fue incubada a 65°C por 5 minutos y luego enfriada sobre hielo por 1 minuto. La siguiente mezcla de síntesis de 10 µl de cADN fue preparada en un tubo separado: 2 µl de amortiguador 10 X RT, 4 µl de cloruro de magnesio 25 mM, 2 µl de DTT 0.1 M, 1 µl de RnaseOUT^ (40 unidades/µl), y 1 µl de enzima Superscript1111 III RT (200 unidades/µl) . La mezcla de síntesis del cADN fue agregada a la mezcla de RNA/cebador, mezclada suavemente e incubada a 25°C por 10 minutos y luego a 50°C por 50 minutos. La enzima de RT fue luego inactivada mediante incubación a 85°C por 5 minutos. La mezcla fue enfriada sobre hielo y luego se agregó 1 µl de la Rnasa H de E. coli ( 2 unidades/µl) y la mezcla incubada a 37°C por 20 minutos. La mezcla fue enfriada sobre hielo y luego diluida 1/250 con agua estéril. Las diluciones de la reacción de transcriptasa inversa fueron luego sometidas a análisis de PCR en tiempo real sobre un instrumento TaqMan (PE Biosystems 7700) . Los cebadores de PCR Tiempo Real SYBR Green para la INSP201-3C humana y la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa GAPDH (control de mantenimiento doméstico) fueron diseñados utilizando el software Primer Express de PE Biosystems de acuerdo a las secuencias como sigue: INSP201-EC (con un par que abarca el límite entre el exón 1 y el exón 2), Inverso 5 ' -TCGCCCCACCAGAGTCAC-3 ' ; delantero 5'-CCGAGGTGAGGGAGTCAACA-3' ; GAPDH, inverso 5'-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3' ; delantero 5 ' -CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' ; intrón-GAPDH, inverso 5 ' -CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3 ' ; delantero 5 ' -CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3 ' . La especificidad y la concentración óptima del cebador fueron probadas sobre el plásmido pCR4-TOPO-INSP201-EC. La contaminación potencial del ADN genómico fue excluida mediante la realización de reacciones de PCR con cebadores intrónicos GAPDH específicos. La ausencia de la amplificación no específica fue confirmada mediante análisis de los productos de PCR sobre una electroforesis en gel de agarosa al 3.5% para asegurar que fuera producida una banda simple del peso molecular esperado. La PCR en Tiempo Real SYBR Green fue realizada con 5 µl/pozo de los productos de RT, 25 µl/pozo de la mezcla maestra de PCR WYBR Green (PE Biosystem) con la Uracil-N-glucosilasa AmpErase (UNG) (0.5 unidad/pozo) y 20 µl de cebadores 300 nM) . La PCR fue realizada a 50°C por 2 minutos (para la incubación de UNG Amperase para eliminar cualquier uracilo incorporado dentro del cADN) , 95°C por 10 minutos (para la activación de AmpliTaq Gold) y luego corrida por 40 ciclos a 95°C por 15 segundos, 60°C por 1 minuto sobre el Sistema de Detección ABI PRISM 7700. Las muestras de cADN transcritas inversamente fueron de este modo amplificadas y se determinaron sus valores de Ct (umbral de ciclo) . Todos los valores de Ct fueron normalizados al gen de mantenimiento doméstico GAPDH. Una banda de ADN específica simple para INSP201-3C y GAPDH fue observada utilizando un análisis de electroforesis en gel. El principio de la detección en tiempo real utilizando la mezcla maestra de PCR SYBR Green está basada en la detección directa del producto de PCR mediante la medición del incremento en la fluorescencia provocado por el enlace del colorante SYBR Green al ADN de doble hebra. La diferencia en el nivel de expresión entre GAPDH e INSP201-EC en cada muestra de cADN fue expresada como una diferencia en el valor Ct, por ejemplo Delta (d) Ct = Ct (GAPDH) - Ct (INSP201-EC) . Los resultados para cada muestra fueron luego expresados como una diferencia proporcional en el número de ciclos requeridos para la expresión detectable de INSP201-EC con relación a aquella de GAPDH, de acuerdo a la fórmula de Diferencia Proporcional = 2 (-dct) Finalmente, el nivel de expresión de INSP201-EC en cada muestra de cADN fue mostrada con relación al nivel de expresión del gen GAPDH, donde el nivel de expresión de GAPDH = 100%, al dividir 100 entre la Diferencia Proporcional para INSP201-EC. Los resultados son mostrados en las Tablas 4 a la 9.

Tabla 4 Tabla 5 Tabla 6 Tabla 7 Tabla 8 TABLA 9 10 15 20 25 Definiendo un umbral del nivel de expresión de INSP201-EC con relación a la expresión de GAPDH de 0.3, los resultados en la expresión de TaqMan muestran expresión restringida no esperada de INSP163 en un tejido de páncreas (Tabla 4 y Figura 4), un tejido de tumor pulmonar (Tabla 5 y Figura 5) y a altos niveles en diversos tejidos de enfermedades inflamatorias del intestino (Tabla 9 y Figura 6) . No se observa ninguna expresión de INSP201-EC en tejidos pulmonares normales (nivel de expresión de INSP201-EC con relación a GAPDH está por debajo de 0.03). El tumor pulmonar es un carcinoma broncogénico, más específicamente un carcinoma de células escamosas. Este patrón específico de expresión conduce a la conclusión del involucramiento de INSP201-EC en el cáncer de pulmón y enfermedades inflamatorias del intestino. De estas propiedades sorprendentes que caracterizan los oligonucleótidos o los polipéptidos correspondientes de la presente invención los hacen particularmente adecuados para la preparación de un fármaco o composición farmacéutica. Los polinucleótidos o los polipéptidos correspondientes de la presente invención muestran por lo tanto el hallazgo inesperado de una expresión restringida en un tejido pancreático, un tejido de tumor pulmonar y en diversos tejidos de enfermedades inflamatorias del intestino.

Ejemplo 6. Determinación de los niveles de citocina producidos por las PBMC Humanas estimulads con ConA utilizando el Arreglo de Esferas de Citometría (CBA) 6.1 Sumario La meta del estudio es encontrar nuevos moduladores de la secreción de citocina utilizando Células Mononucleares periféricas Humanas (PBMC por sus siglas en ingles) estimuladas con el mitógeno concanavalina A (ConA) . La proteína INSP201-EC inhibe la secreción de IL-2 a partir de las PBMC humanas estimuladas con ConA con una Emax = 80% y un EC50 = 8 µg/ml, no se observa ningún efecto sobre los niveles de IFN-?, TNF-a, IL-4, IL-5 o IL-10. 6.2 Equipos y softwares fotómetro EX de placa de microtitulación de 96 pozos (Labsystem) . Software Graph Pad Prism Software Excel Citómetro de flujo Becton-Dickinson Software de Análisis CBA Campana para cultivo de células Incubadora para cultivo de células Centrífuga Pipetas 6.3 Materiales y Reactivos Piel de buey DMEM GIBCO Ref: 21331-020 Suero humano tipo AB SIGMA Ref: H1513 L-glutamina GIBCO Ref: 250 030-020 Penicilina-estreptomicina GIBCO Ref: 150-070-063 Ficoll PHARMACIA Ref: 17-1440-03 Placa de microtitulación de 96 pozos para cultivo celular COSTAR Ref: 3596 Concanavalina A SIGMA Ref. C0412 Dexametasona soluble en agua SIGMA Ref: D2915 Equipo CBA de Citocina Thl/Th2 Humana Becton-Dickinson Ref: 550749 PBS GIBCO Ref: 14190-094 FALCON 50 ml estéril Becton-Dickinson Ref: 2070 Glicerol MERCK Ref: 1-04092-2500 Placa de microtitulación de 96 pozos de fondo cónico NUNC Ref: 249570 6.4 MÉTODO Purificación de PBMC Humanas provenientes de una piel de buey Se diluye la piel de buey 1 a 2 con DMEM. Se agregan lentamente 25 ml de sangre diluida sobre una capa de 15 ml de Ficoll en un tubo Falcon de 50 ml . Se centrifugan los tubos (2000 rpm, 20 minutos, a TA sin rompimiento) . Se recolecta la interfase (anillo) y se lavan las células con 25 ml de DMEM, seguido por un paso de centrífuga (1200 rpm, 5 minutos). Se repite 3 veces. Una piel de buey podría dar aproximadamente 600 x 106 células totales.

Prueba de Actividad Se agregan 80 µl de 1.25 x 106 células/ml, diluidas en DMEM + 2.5% de suero humano + 1% de L-glutamina + 1% de penicilina-estreptomicina, a una placa de microtitulación de 96 pozos. Se agregan 10 µl por pozo (una condición por pozo) : INSP201-EC en PBS + 20% de glicerol (concentración inicial 50 µg/ml) . Agregar 10 µl por pozo: ConA 50 µg/ml (la concentración final de ConA es de 5 µg/ml) . Después de 48 horas, los sobrenadantes celulares son recolectados y las citocinas humanas medidas mediante el Equipo CBA de Citocina Thl/Th2 Humana Becton-Dickinson.

Análisis de CBA La mezcla de Esferas de Captura Thl/Th2 Humanas es preparada siguiendo las instrucciones del proveedor (CBA Kit Becton-Dickinson Ref: 550749), brevemente: - se determina el número de tubos de ensayo que son requeridos para el experimento . se agita en torbellino vigorosamente cada suspensión de esferas de captura por unos pocos segundos antes del mezclado, - se agrega una alícuota de 10 µl de cada esfera de captura, para cada ensayo que va a ser analizada, dentro de un tubo simple marcado "esferas de captura mixtas", se agita en torbellino la mezcla de Esferas perfectamente .

Preparación de las muestras de prueba Se diluyen los sobrenadantes 1:5 utilizando el Diluyente de Ensayo (20 µl de sobrenadantes + 60 µl de Diluyente de Ensayo) . - Se mezcla la dilución de muestra antes de transferir las muestras a una placa de microtitulación de 96 pozos de fondo cónico (Nunc) Procedimiento de Ensayo de CBA de Citocina Thl/Th2 Humana Se agregon 50 µl de los sobrenadantes diluidos a una placa de microtitulación de 96 pozos de fondo cónico (Nunc) . - Agregar 50 µl de las esferas de captura mixtas. Se agrega 50 µl del Reactivo de Detección PE de Thl/Th2 Humano . Se incuba la placa por 3 horas a TA y se protege de la exposición directa a la luz. - Se centrífuga a 1500 rpm por 5 minutos. Se desecha cuidadosamente el sobrenadante. Se agregan 200 µl de Amortiguador de Lavado a cada pozo y se centrífuga a 1500 rpm por 5 minutos. Se desecha cuidadosamente el sobrenadante . - Se agregan 200 µl de Amortiguador de Lavado a cada pozo y se centrífuga a 1500 rpm por 5 minutos. Se desecha cuidadosamente el sobrenadante. Se agregan 130 µl de amortiguador de lavado a cada pozo para resuspender el botón de esferas. - Analizar las muestras en un citómetro de flujo. Los datos son analizados utilizando el software de Aplicación CBA, el software Activity Base y el software Excel . Los resultados son dados en porcentaje de secreción de citocina en comparación al nivel de citocina alcanzado por la estimulación con ConA (100%) versus las células no estimuladas (0%) . 6.5 RESULTADOS - Efecto de la administración de INSP201-EC a PBMC humanas estimuladas con ConA. Los resultados muestran la inhibición de la secreción de IL-2 en presencia de INSP201-EC en una manera de respuesta a la dosis. La inhibición máxima (Emax) alcanzada es de 80% con una EC50 de 8 µg/ml. No se observó efecto sobre los niveles de IFN-?, TNF-a, IL-4, IL-5 o IL-10. La inhibición es por lo tanto específica para IL-2. Considerando la subregulación de IL-2 a partir de células mononucleares periféricas humanas y la expresión de INSP201-Ec en la enfermedad inflamatoria del intestino, el cáncer y en los tejidos pancreáticos, esto es una indicación del involucramiento de INSP201-EC en la inflamación, enfermedades relacionadas a IL-2, cáncer, enfermedades inflamatorias del intestino y/o trastornos pancreáticos. Los agonistas de IL-2 son conocidos. Como por ejemplo, Abbott desarrolló una proteína de fusión de IL-2 para el tratamiento de neoplasma. Amgen desarrolló un agonista de IL-2 para el tratamiento del cáncer. Anticancer Ine desarrolló un agonista de IL-2 (AC-9401) para el tratamiento del tumor pulmonar. AplaGen GMBH desarrolló un agonista de IL-2 (péptidos miméticos de IL-2) para el tratamiento del cáncer. Avectin desarrolló un agonista de IL-2 (avectina) para el tratamiento de tumor de mama. Aventis Pharma desarrolló un agonista de IL-2 para el tratamiento del cáncer. Bayer Corp. desarrolló un agonista de IL-2 (BAY-50-4798) para el tratamiento de la infección por el HIV, carcinoma de células renales y melanoma. El Colegio Baylor de Medicina desarrolló un agonista de IL-2 (vacuna de leucemia que expresa IL-2/CD40L) para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica. Biogen desarrolló un modulador de IL-2 (teceleucina) para el tratamiento del sarcoma, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, cáncer, tumor de colon y tumor renal. Biomira USA desarrolló un agonista de IL-2 (formulación de liposoma, péptido) para el tratamiento de cáncer pulmonar de células no pequeñas, infección por el HIV, tumor pulmonar y tumor renal . Boehringer Ingelheim desarrolló BIWB-2 (vacuna) para el tratamiento de melanoma, neoplasma. Chiron Corp. desarrolló la aldeseucina para el tratamiento de la infección por el HIV, carcinoma de células renales, leucemia, melanoma, linfoma no Hogkin, cáncer, tumor pulmonar, tumor de ovario. Chiron Corp. desarrolló también un PEG-interleucina-2 para el tratamiento de la infección por el HIV y tumor de cabeza y cuello. EMD Lexigen Research desarrolló EMD-273063 (anticuerpo monoclonal-proteína de fusión) para el tratamiento del melanoma y tumor del sistema nervioso. EMD Lexigen Research desarrolló NHS-IL-2 (D20T) (inmunoglobulina conjugada) para el tratamiento del cáncer. Flamel Technologies desarrolló un agonista de IL-2 para el tratamiento del cáncer. Immunex desarrolló un péptido recombinante para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis B, melanoma y cáncer. The Institute of Cáncer Research desarrolló una vacuna para el tratamiento del cáncer. La Universidad McMaster desarrolló una vacuna (terapia génica basada en adenovirus) para el tratamiento de melanoma, tumor de mama y cáncer. La Universidad Medical de Carolina del Sur desarrolló una terapia de vacunación con péptido-GN_CSF/IL-2 para el tratamiento del cáncer. The Nacional Institute of Health desarrolló una terapia génica con IL-2 para el tratamiento de carcinoma de células renales, melanoma y tumor de colon. Pivotal BioSciences desarrolló un agonista de IL-2 (PB-1) para el tratamiento del cáncer. The Scripps Research Institute desarrolló KS-IL-2 (anticuerpo monoclonal-conjugado-proteína de fusión) para el tratamiento de cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer de próstata, tumor de mama, cáncer, tumor cerebral, tumor de ovario, tumor colorrectal y tumor renal. Seragen desarrolló DAB-486-IL-2 (fusión de proteína-toxina) para el tratamiento de la infección por el HIV, neoplasma, artritis reumatoide y diabetes dependiente de insulina. Seragen desarrolló también denileucina-diftitox (fusión de proteína-toxina) para el tratamiento de cáncer pulmonar de células no pequeñas, alopecia, infección por el HIV, leucemia linfocítica crónica, linfoma cutánea de células T, linfoma, psoriasis, artritis reumatoide, linfoma no Hodgkin, enfermedad injerto versus hospedero, tumor de cabeza y cuello, tumor pulmonar y dermatitis. SkyePharma desarrolló un agonista de IL-2 (péptido) para el tratamiento de la infección. El Hospital St Jude Childrens Research desarrolló un agonista de IL-2 (vacuna) para el tratamiento del tumor del sistema nervioso. The State Research Center of Virology and Biotechnology VECTOR desarrolló un agonista de IL-2 (péptido) para el tratamiento del cáncer. Takeda Pharmaceutical desarrolló la celmoleucina para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis B y cáncer. Transgene SA desarolló TG-1024 (terapia génica basada en adenovirus) para el tratamiento del melanoma y tumor sólido. Transgene SA desarrolló TG-1031 y TG-4010 (terapia génica basada en el virus de la viruela) para el tratamiento de cáncer pulmonar de células no pequeñas, tumor de páncreas, tumor de próstata, tumor de mama y tumor de ovario. Cell Therapy desarrolló TG-2001 para el tratamiento de mesotelioma, carcinoma de células renales, sarcoma, melanoma y cáncer de tumor de mama. Transkaryotic Therapies desarrolló IL-2, TKT para el tratamiento de carcinoma de células renales. La Universidad de California desarrollo UCLA para el tratamiento del melanoma, tumor de próstata y tumor de colon. La Universidad de Cincinnati desarrolló una terapia para el virus de la vaccinia para el tratamiento de tumor de cabeza y cuello y cáncer. La Universidad de Pittsburgh desarrolló un agonista de IL-2 (péptido) para el tratamiento de neoplasma. La Universidad de Texas desarrolló INGN-301 para el tratamiento de la infección por el HIV. Valentis/Roche desarrolló IL-2, la terapia con el gen cLipid para el tratamiento de tumor de cabeza y cuello. Valentis desarrolló IL-2/superantígeno B, terapia con el gen cLipid para el tratamiento del melanoma. Valentis desarrolló también VLTS-587 para el tratamiento de tumor pumonar. Vical desarrolló un agonista de IL-2 (terapia génica-plásmido) para el tratamiento del melanoma. Vical desarrolló la leuvectina para el tratamiento de carcinoma de células renales, sarcoma, linfoma, melanoma y tumor de próstata. Virogenetics Corp desarrolló ALVAC-hIL-2 (terapia génica basada en el virus de la viruela) para el tratamiento del cáncer. Yead Research desarrolló un agonista de IL-2 para el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa. Los antagonistas de IL-2 son conocidos. Por ejemplo, Affymax/Aventis desarrolló un antagonista de IL-2 inmunosupresor para el tratamiento de artritis reumatoide, enfermedad autoinmune y enfermedad cardiovascular. Hybritech Inc. desarrolló un anticuerpo monoclonal para el tratamiento del cáncer. Immnunotech desarrolló un anticuerpo monoclonal para el tratamiento de la enfermedad de rechazo del trasplante versus hospedero. Sunesis Pharmaceuticals desarrolló un antagonista de IL-2 para el tratamiento de la enfermedad injerto versus huésped. La función de la interleucina 2, la producción y las aplicaciones clínicas de la misma han sido revisadas por Graffen y Liu (Cytokine 28 (2004), pp. 109-123). Como tal, una enfermedad relacionada a IL-2 es neoplasma, tumor pulmonar, cáncer, tumor de mama, infección por el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , carcinoma de células renales, melanoma, leucemia linfocítica crónica, sarcoma, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, tumor de colon, tumor renal, cáncer pulmonar de células no pequeñas, leucemia, linfoma no Hogkin, tumor de ovario, tumor de cabeza y cuello, tumor del sistema nervioso, infección por el virus de la hepatitis B, tumor de próstata, tumor de cerebro, tumor colorrectal, tumor renal, alopecia, linfoma cutáneo de células T, linfoma, tumor del sistema nervioso, tumor sólido, tumor del páncreas, mesotelioma, anemia, colitis ulcerativa, cáncer gástrico, esclerodermia, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, infección de hepatitis B crónica, hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos mediados por el virus de Epstein-Barr, leucemia mielocítica aguda, melanoma metastático, artritis, leucopenia, trombocitopenia, trastorno de angiogénesis, sarcoma de Kaposi, trastorno pancreático o esclerosis múltiple. Preferentemente, el "cáncer" se selecciona entre cáncer de los sistemas sanguíneo y linfático, cánceres de piel, cánceres del sistema digestivo, cáncer de los sistemas urinarios, cáncer de mama, cáncer de ovario, cánceres ginecológicos, coriocarcinoma, cáncer de pulmón, tumores cerebrales, tumores de huesos, tumor carcinode, cáncer nasofaríngeo, sarcomas retroperitoneales, tumores de tejidos suaves, cáncer de tiroides o cánceres de sitios primarios desconocidos . Preferentemente, los "tumores de los pulmones" o "cáncer pulmonar" como se utiliza intercambiablemente aquí, se seleccionan de tumores primarios benignos o malignos o de las metástasis de cánceres primarios de muchos otros órganos y tejidos. Preferentemente, el cáncer pulmonar se selecciona de tumores pulmonares primarios incluyendo carcinoma broncogénico, carcinoide bronquial, hamartoma condromatoso (benigno) , linfoma solitario, sarcoma (maligno) o linfomas multifocales . Preferentemente, el carcinoma broncogénico se selecciona del carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequeñas no diferenciadas, carcinoma de células grandes no diferenciadas, adenocarcinoma o carcinoma broncoalveolar . Preferentemente, el carcinoma broncogénico es carcinoma de células escamosas o carcinoma pulmonar de células no pequeñas. Preferentemente, el cáncer pulmonar se selecciona de las metástasis de cánceres primarios de la piel, mama, colon, próstata, riñon, tiroides, estómago, cervix, recto, testículos y hueso y de melanoma. "Carcinoide bronquial" o "adenoma bronquial" son términos que pueden ser utilizados intercambiablemente, que pueden ser benignos o malignos, y aparecen igualmente en ambos sexos. Su curso es prolongado, la porción endobronquial del tumor puede obstruir el lumen de los bronquios mayores . Ocurre frecuentemente un sangrado enérgico desde la membrana mucosa de revestimiento. La neumonía recurrente dentro de la misma zona pulmonar y el dolor pleural del recubrimiento localizado son comunes. Las metástasis son no comunes pero pueden ocurrir hacia los nodos linfáticos regionales. Preferentemente, el trastorno pancreático es pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, carcinoma pancreático, incluyendo carcinoma de células acinares o carcinoma pancreático de población células mixtas. Preferentemente, la enfermedad inflamatoria del intestino es la enfermedad Crohn o la colitis ulcerativa.

Preferentemente, la parte extracelular de INSP201 enlazado a la membrana (ya sea glucosilado o no) , fragmentos del mismo, agonistas del mismo o antagonistas de INSP201 enlazado a la membrana, son útiles para el tratamiento de la inflamación, trastorno relacionado a IL-2, y/o enfermedad inflamatoria del intestino, así como el trasplante de órganos sólidos y de médula ósea. Una combinación con la ciclosporina A, tacrolimus o sirolimus puede ser utilizada para trasplante de órganos sólidos y de médula ósea. Preferentemente, los antagonistas de INPS201 enlazada a la membrana son anticuerpos neutralizadores. Preferentemente, un polipéptido de INSP201 que carece del dominio transmembranal es utilizado para el tratamiento de la inflamación, el trastorno relacionado a IL2 o enfermedad inflamatoria del intestino. Preferentemente, el dominio transmembranal abarca de los aminoácidos 406 al 428 de la SEQ ID No.: 8 o de la SEQ ID No. : 24. Preferentemente, los agonistas de INSP201 enlazados a la membrana son utilizados para el tratamiento del cáncer (por ejemplo, cáncer pulmonar, RCC o melanoma) y/o trastornos relacionados a IL-2 tal como el HIV, EBV o infecciones por hepatitis B. Preferentemente, los agonistas de INSP201 enlazado a la membrana son anticuerpos agonistas.

Preferentemente, la parte extracelular de INSP201 enlazado a la membrana consiste o comprende de la SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 22 ó SEQ ID No.: 28. Preferentemente, un fragmento de la parte extracelular de INSP201 enlazado a la membrana consiste o comprende de SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 20 ó SEQ ID No.: 26. Preferentemente, el INSP201 enlazado a la membrana consiste o comprende de la SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 12; SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 30, o una combinación de los exones 1 y exones 2 (por ejemplo, SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 20 o SEQ ID No . : 26 en combinación con la SEQ ID No.: 4) .

Ejemplo 7 - Ensayo para determinar la actividad de IKK2 en células de carcinoma pulmonar de células no pequeñas (A549) El factor a de necrosis tumoral (TNFa) es una citocina pleyotrópica con funciones múltiples, que incluyen la activación celular, diferenciación celular y apoptosis. TNFa ejerce efectos apoptóticos y antipoptóticos de una manera específica del tipo celular. Los efectos antiapoptóticos de TNFa parecen ser mediados por la suprarregulación de la actividad de NF-?B. La activación inducida por TNFa de NF-?ß incrementa la expresión de varias proteínas antiapoptóticas que protegen a las células de la muerte celular. Cuando esta vía es inhibida, TNFa puede inducir potencialmente la muerte celular. La activación de NF-I es mediada por el complejo de IKK. La actividad de INSP201-EC, la fusión del mismo o un anticuerpo dirigido a INSP201 puede ser demostrada por el siguiente ensayo que puede medir la activación de la actividad de IKK2 en células A549, una célula de carcinoma pulmonar humano. Ya que TNFa puede inducir la vía pro- y apoptótica, el bloqueo de la expresión del gen antiapoptótico por la cicloheximida puede conducir a muerte celular. Una vez que las células sufren apoptosis, éstas se desprenden de la superficie de cultivo. Después de la fijación de las células con cristal violeta seguido por lavado, únicamente las células vivas son teñidas y esto podría ser leído a 540 nm. De este modo, esta medida es utilizada para determinar la muerte celular en células A549. Cuando las células A549 son tratadas con TNFa en presencia de cicloheximida, esto da como resultado la apoptosis. Después del pretratamiento de las células con IL-lß o TNFa para inducir la vía de IKK, de este modo, suprarregulan los genes antiapoptóticos, y esto puede proteger a las células de la muerte inducida por el tratamiento con TNFa + cicloheximida. Durante el paso de pretratamiento con IL-lß el bloqueo de la actividad de IKK con un inhibidor específico puede abolir el efecto protector de ILlß sobre la muerte celular mediada por TNFa+cicloheximida. De este modo, esta propiedad de señalización de TNFa es utilizada para monitorizar la actividad IKK en células A549. El inhibidor de IKK puede bloquear el efecto protector mediado por IL-lß dependientemente de la dosis, en células A549, mientras que con EGF no existe efecto protector. El protocolo seguido por el monitoreo de la actividad de IKK es como sigue: 1) Las células A549 son sembradas (50,00 células/pozo) y cultivadas toda la noche. 2) Las células son pretratadas por IL-lß (1 ng/ml) o TNF-a con o sin el compuesto, por ejepplo, INSP201-EC, la porción del mismo o el anticuerpo dirigido a INSP201, en medio libre de suero por toda la noche. El compuesto es un inhibidor específico de la actividad de IKK, 3) Las células son tratadas con TNF-a y cicloheximida por 8 horas, y 4) La muerte celular es monitorizada con cristal violeta.

Ejemplo 8 - Modelos animales La actividad de INSP201-EC, la fusión del mismo o el anticuerpo dirigido a INSP201 pueden ser demostradas en modelos de cáncer como son realizados por Kamb y Lassota (Drug Discovery Today: Disease Models; Vol. 1, No. 1, 2004, pp. 31-36) , en modelos de cáncer pulmonar como es realizado por Láhm y Fischer (Drug Discovery Today: Disease Models; Vol. 1, No. 1, 2004, pp-25-30) o en modelos de enfermedad inflamatoria del intestino como es realizado por Boro y Bruma (Drug Discovery Today: Disease Models; Vol. 1, No. 4, 2004, pp. 437-443) . Además, la actividad de un polipéptido de la presente invención puede ser confirmada en al menos uno de los siguientes ensayos: a. INSP201-EC, la fusión del mismo o el anticuerpo dirigido a INSP201 puede modular la proliferación o la supervivencia de células normales y cancerosas, o b. INSP201-EC, la fusión del mismo o el anticuerpo dirigido a INSP201 puede modular la secreción de IL-2 en el ensayo con ConA (Ejemplo 6) , o c. INSP201-EC, la fusión del mismo o el anticuerpo dirigido a INSP201 puede modular la actividad de IKK2 en células A549, una célula de carcinoma pulmonar humano (Ejemplo 7) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (52)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polipéptido, caracterizado porque: (i) comprende la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No . : 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No . : 10, SEQ ID No . : 12, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 26, SEQ ID No.: 28 y/o SEQ ID No . : 30; (ii) es un fragmento del mismo que es un miembro de una familia de glucoproteína de superficie celular, o tiene un determinante antigénico en común con los polipéptidos de (i); o (iii) es un equivalente funcional de (i) o (ii) .

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 24 y/o SEQ ID No.: 30.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID No. : 2, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No . : 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, SEQ ID No.: 26, SEQ ID No.: 28.

4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No. : 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No . : 8, SEQ ID No . : 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No . : 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 26, SEQ ID No.: 28 y/o SEQ ID No.: 30;

5. Un polipéptido que es un equivalente funcional de acuerdo a la parte (iii) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es homólogo a la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No . : 2 , SEQ ID No . : 4 , SEQ ID No . : 6 , SEQ ID No . : 8 , SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16 ó SEQ ID No. : 18 y es un miembro de la familia de glucoproteína de superficie celular.

6. El polipéptido que es un fragmento o un equivalente funcional como se indica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque tiene más de 80% de identidad secuencial con las secuencias de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. : 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No . : 16 ó SEQ ID No . : 18 o con un fragmento activo de las mismas, preferentemente mayor de 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad secuencial.

7. El polipéptido que es un equivalente funcional como se indica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque muestra homología estructural significativa con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. : 2 , SEQ ID No . : 4 , SEQ ID No . : 6 , SEQ ID No . : 8 , SEQ ID No . : 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No . : 16 ó SEQ ID No. : 18.

8. El polipéptido que es un fragmento como se indica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, y la reivindicación 6, caracterizado porque tiene un determinante antigénico en común con el polipéptido de la parte (i) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3 , que consiste de 7 o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No. : 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No . : 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No . : 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 26, SEQ ID No.: 28 y/o SEQ ID No.: 30.

9. Una molécula purificada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .

10. La molécula purificada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende la secuencia de ácido nucleico como se indica en la SEQ ID No . : 1 , SEQ ID No . : 3 , SEQ ID No . : 5 , SEQ ID No . : 7 , SEQ ID No.: 9, SEQ ID No . : 11, SEQ ID No . : 13, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 19, SEQ ID No.: 21, SEQ ID No.: 23, SEQ ID No.: 25, SEQ ID No.: 27 y/o SEQ ID No.: 29, o es un equivalente redundante o fragmento de los mismos.

11. La molécula purificada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque consiste de la secuencia de ácido nucleico como se indica en la SEQ ID No.: 1, SEQ ID No . : 3, SEQ ID No . : 5, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No . : 11, SEQ ID No . : 13, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No . : 19, SEQ ID No . : 21, SEQ ID No.: 23, SEQ ID No . : 25, SEQ ID No.: 27 y/o SEQ ID No . : 29, o es un equivalente redundante o fragmento de los mismos.

12. La molécula purificada de ácido nucleico, caracterizada porque se hibrida bajo condiciones de alta exigencia con una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Un vector, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

14. Una célula hospedera, caracterizada porque es transformada con un vector de conformidad con la reivindicación 13.

15. Un ligando, caracterizado porque se enlaza específicamente a la glucoproteína de superficie celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

16. Un ligando de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque es un anticuerpo.

17. Un compuesto, caracterizado porque incrementa o disminuye el nivel de expresión o actividad de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

18. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque se enlaza a un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, sin inducir ninguno de los efectos biológicos del polipéptido.

19. El compuesto de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un sustrato natural o modificado, ligando, enzima, receptor o mimético estructural o funcional.

20. Un polipéptido de fusión, caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, fusionado a una secuencia heteróloga de aminoácidos.

21. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la secuencia heteróloga de aminoácidos es un dominio constante de IgG o fragmento del mismo, o un dominio hCG o fragmento del mismo.

22. Un polipéptido de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 8, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, un vector de conformidad con la reivindicación 13 , un ligando de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21, caracterizado porque es para el uso en terapia o diagnóstico de enfermedades .

23. Un método para diagnosticar una enfermedad en un paciente, caracterizado porque comprende la evaluación del nivel de expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la evaluación de la actividad de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el tejido proveniente del paciente, y comparando el nivel de expresión o actividad a un nivel control, en donde el nivel que es diferente al nivel control, es indicador de la enfermedad.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es llevado a cabo in vi tro .

25. El método de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) poner en contacto un ligando de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16 con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar el complejo.

26. El método de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto una muestra de tejido del paciente con una sonda de ácido nucleico bajo condiciones estrictas para permitir la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, y la sonda; b) poner en contacto una muestra control con la sonda bajo las mismas condiciones utilizadas en el paso a) ; y c) detectar la presencia de complejos híbridos en las muestras; en donde la detección de los niveles del complejo híbrido en la muestra del paciente que difieren de los niveles del complejo híbrido en la muestra control, es indicadora de la enfermedad.

27. El método de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto una muestra de ácido nucleico proveniente del tejido del paciente, con un cebador de ácido nucleico bajo condiciones estrictas, que permite la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, y el cebador; b) poner en contacto una muestra control con el cebador bajo las mismas condiciones utilizadas en el paso a) ; y c) amplificar el ácido nucleico muestreado; y d) detectar el nivel de ácido nucleico amplificado proveniente del paciente y las muestras control; en donde la detección de los niveles del ácido nucleico amplificado en la muestra del paciente, que difieren significativamente de los niveles del ácido nucleico amplificado en la muestra control, es indicadora de la enfermedad.

28. El método de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra de tejido de un paciente que es probado para enfermedad; b) aislar una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 de la muestra de tejido; y c) diagnosticar al paciente para la enfermedad al detectar la presencia de una mutación que está asociada con la enfermedad en la molécula de ácido nucleico como una indicación de la enfermedad.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende además la amplificación de la molécula de ácido nucleico para formar un producto amplificado, y detectando la presencia o ausencia de una mutación en el producto amplificado.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28 o la reivindicación 29, caracterizado porque la presencia o ausencia de la mutación en el paciente es detectada al poner en contacto la molécula de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que se hibrida a la molécula de ácido nucleico bajo condiciones estrictas para formar una molécula híbrida de doble hebra, la molécula híbrida de doble hebra tiene una porción no hibridada de la hebra de la sonda de ácido nucleico en cualquier porción correspondiente a una mutación asociada con la enfermedad; y detectando la presencia o ausencia de una porción no hibridada de la hebra de la sonda, como una indicación de la presencia o ausencia de una mutación asociada a la enfermedad.

31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, caracterizado porque la enfermedad incluye, pero no está limitada a inflamación, cáncer, cáncer de colon, enfermedad inflamatoria del intestino, trastorno pancreático y/o enfermedad relacionada a IL-2.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, caracterizado porque la enfermedad incluye una enfermedad en la cual están implicados antígenos linfocíticos .

33. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, como una glucoproteína de superficie celular.

34. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, un vector de conformidad con la reivindicación 13, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14, un ligando de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21.

35. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

36. Un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, un vector de conformidad con la reivindicación 13, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14, un ligando de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizados porque son para el uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de inflamación, cáncer, y enfermedad inflamatoria del intestino, trastorno pancreático y/o trastorno relacionado a IL-2.

37. Un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, un vector de conformidad con la reivindicación 13, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14, un ligando de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizados porque son para el uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en la cual están implicados antígenos linfocíticos .

38. Un método de tratamiento de una enfermedad en un paciente, caracterizado porque comprende administrarle a un paciente un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, un vector de conformidad con la reivindicación 13, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14, un ligando de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las enfermedades en las cuales la expresión del gen natural o la actividad del polipéptido es menor en un paciente enfermo, cuando se comparan niveles de expresión o actividad en un paciente saludable, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector, el ligando, el compuesto o la composición administrada al paciente es un agonista.

40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las enfermedades en las cuales la expresión del gen natural o la actividad del polipéptido es mayor en un paciente enfermo, cuando se comparan niveles de expresión o actividad en un paciente saludable, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector, el ligando, el compuesto o la composición administrada al paciente es un antagonista.

41. El método para monitorizar el tratamiento terapéutico de una enfermedad en un paciente, caracterizado porque comprende el monitoreo en un periodo de tiempo del nivel de expresión o actividad de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 en el tejido del paciente, en donde la alteración del nivel de expresión o actividad sobre el periodo de tiempo hacia un nivel de control, es indicador de la regresión de la enfermedad.

42. Un método para la identificación de un compuesto que es efectivo en el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedad, caracterizado porque comprende poner en contacto un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 , con uno o más compuestos sospechosos de poseer actividad de enlace para la molécula de polipéptido o de ácido nucleico, y la selección de un compuesto que se enlaza específicamente a la molécula de ácido nucleico o el polipéptido.

43. Un equipo útil para diagnosticar la enfermedad, caracterizado porque comprende un primer recipiente que contiene una sonda de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones estrictas con una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, un segundo recipiente que contiene cebadores útiles para amplificar la molécula de ácido nucleico; e instrucciones para utilizar la sonda y los cebadores para facilitar el diagnóstico de la enfermedad.

44. El equipo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque comprende además un tercer recipiente que mantiene un agente para digerir el ácido ribonucleico (RNA) no hibridado.

45. Un equipo, caracterizado porque comprende un arreglo de moléculas de ácido nucleico, al menos una de las cuales es una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

46. Un equipo, caracterizado porque comprende uno o más anticuerpos que se enlazan a un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ; y un reactivo útil para la detección de una reacción de enlace entre el anticuerpo y el polipéptido.

47. Un animal no humano transgénico o suprimido en un gen, caracterizado porque ha sido transformado para expresar niveles más altos, más bajos o ausentes de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

48. Un método para seleccionar un compuesto efectivo para tratar una enfermedad, caracterizado porque se pone en contacto un animal transgénico no humano de conformidad con la reivindicación 47, con un compuesto candidato, y determinando el efecto del compuesto sobre la enfermedad del animal .

49. Un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, un vector de conformidad con la reivindicación 13, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14, un ligando de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21., o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34 caracterizados porque son para el uso en IVF o como un anticonceptivo .

50. Un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, un vector de conformidad con la reivindicación 13, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14, un ligando de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34 caracterizados porque son para el uso en la fabricación de un anticonceptivo.

51. El uso de un polipéptido INSP201 como un objetivo para seleccionar fármacos candidatos para tratar o prevenir un trastorno relacionado a la glucoproteína de superficie celular.

52. Un método para seleccionar compuestos biológicamente activos, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto un compuesto candidato con células hospederas recombinantes que expresan un polipéptido INSP201; (ii) seleccionar los compuestos que se enlazan al polipéptido INSP201 en la superficie de las células y/o que modulan la actividad del polipéptido INSP201.