JP2000023677A

JP2000023677A - ７回膜貫通型受容体蛋白質ｅｒｇ９

Info

Publication number: JP2000023677A
Application number: JP10199049A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Ono; 剛大野; Hiroshi Ishimaru; 弘石丸; Takehiro Koshio; 岳弘小塩
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2000-01-25

Abstract

(57)【要約】【課題】新規の７回膜貫通型受容体蛋白質、またその
蛋白質をコードするｃＤＮＡ、その蛋白質の発現系、さ
らにその蛋白質の抗体を提供する。【解決手段】マウス肺より、本発明の７回膜貫通型受
容体蛋白質ＥＲＧ９のｃＤＮＡ断片を取得した。そのｃ
ＤＮＡコード領域全長を取得し、そのコードする新規蛋
白質の発現系を作成し、さらにその抗体を作成する。【効果】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９
は、ガン細胞の増殖を制御する医薬品を検索することに
使用が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＲＧ９，それを構成している部分ペプ
チドまたはこれらの塩に関する。また、本発明は、前記
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９，それを構成してい
る部分ペプチドをコードする核酸あるいはその誘導体に
関する。さらに、本発明は、この核酸を用いて遺伝子操
作により７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９を発現させ
る７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の製造方法、及び
それに使用される発現ベクター及び形質転換体に関す
る。

【０００２】また、さらに本発明は、７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＲＧ９を用いて、この蛋白質に対するリガン
ドを決定する方法、この蛋白質との結合を阻害する化合
物をスクリーニングする方法あるいはこの蛋白質に対す
る抗体に関する。本発明では、７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＲＧ９を用いることによってガン細胞の検出、ある
いはガン細胞を含む種々の細胞の増殖や機能を制御する
医薬品を開発することができる。

【０００３】

【従来の技術】ガンは体細胞の無秩序な増殖を病態とす
る疾患である。これまでにガンの発生・進展に関与する
多数の遺伝子が単離され、多段階的にこれらの遺伝子の
異常が蓄積されてくるに従ってガンが発生し、さらに増
悪していくことが証明されてきた。これらのガン遺伝子
の発見やヒトのガンで起こっている遺伝子異常を明らか
にすることは、単にガン化の機構を分子レベルで解明す
るにとどまらず、臨床の場においても遺伝子診断、治療
へつながる重要な知見である（蛋白質核酸酵素、４
２、１７１１ページ）。しかし、こういったガン化のメ
カニズム、増殖能の維持などについてすべてが理解され
ているわけではない。

【０００４】こういったガン遺伝子の中には、チロシン
キナーゼであるもの（Ｆｌｔ―１など）、細胞内のアダ
プター分子（Ｃａｓなど）や低分子量Ｇ蛋白質（Ｒａ
ｓ，Ｒｈｏなど）のように種々のタイプの遺伝子が知ら
れている。そのうちの一つとして、ｍａｓと呼ばれる７
回膜貫通型受容体が知られている（ＹｏｕｎｇＤ．
ら、Ｃｅｌｌ，４５，７１１−７１９（１９８６））。
この遺伝子は当初ヒトの類上皮腫ガンから得られ、のち
にラット（ＹｏｕｎｇＤ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５３３９−５３４２
（１９８８））、マウス（ＭｅｔｚｇｅｒＲ．ら、
ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３５７，２７−３２（１９
９５））から対応する遺伝子が得られ、マウス・ラット
では中枢神経系にこの遺伝子が発現していることが知ら
れている（ＹｏｕｎｇＤ．ら、前掲、Ｍｅｔｚｇｅｒ
Ｒ．ら、前掲、ＭａｒｔｉｎＫ．Ａ．ら、Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｒａｉｎＲｅｓ．６８，
７５−８２（１９９２））。さらに、これらに類似した
遺伝子として、ｍｒｇ（ＭｏｎｎｏｔＣ．ら、Ｍｏ
ｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５，１４７７−１４８７
（１９９１））が報告されている。これらの遺伝子は、
ある種の細胞では生理的条件より高い濃度のアンジオテ
ンシンの反応を伝達するらしい（Ａｎｄｒａｗｉｓら、
Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３０２，３２９−３３４
（１９９１），ＭｏｎｎｏｔＣ．ら、前掲）。

【０００５】一方で、アンジオテンシンなどの７回膜貫
通型受容体のリガンドとして知られているものが細胞の
増殖に関連しているという報告も数多くあり（例えば、
ＢｕｎｋｅｎｂｕｒｇＢ．ら、Ｈｙｐｅｒｔｅ
ｎｓｉｏｎ２０（６）：７４６−７５４（１９９
２）、ＦｒｅｅｍａｎＥＪ．ら、Ｈｙｐｅｒｔ
ｅｎｓｉｏｎ２８（１）：１０４−１０８（１９
９６）、など）、７回膜貫通型受容体が増殖に関連して
いることが示されている。従って、これらの受容体の機
能を変化させるもの、すなわちその受容体と結合して刺
激するものや、受容体と結合して刺激を遮るもの、その
刺激が細胞内に伝達されることを阻害するものを得るこ
とができれば、ガン細胞などの機能や増殖を正や負に制
御し、さらには、７回膜貫通型受容体の機能の不足や過
剰に起因する疾患の治療に役立つ物質を得られることが
予想される。

【０００６】７回膜貫通型受容体においては、多くの場
合、受容体とシグナル分子の関係は１対１対応に対応し
ているのではない。従って、疾患の治療を考えた場合に
はシグナル分子を知ることだけでは不十分である。例え
ば、セロトニンの場合には、セロトニンという単一のシ
グナル分子に対し、イオンチャンネル型受容体という全
く異なるシグナル伝達経路の受容体を含む１４種の受容
体が知られており、さらに、個々の受容体に特異的に結
合する化合物も知られており（１９９６Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ＆ＩｏｎＣｈａｎｎｅｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕ
ｒｅＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ＴｒｅｎｄｓＰｈａ
ｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、１９９６年）、それぞれ異な
る疾患の治療への応用も考えられている。また、例えば
ケモカイン群の場合には、単一のシグナル分子が多数の
受容体と反応すると同時に、単一の受容体が多数のシグ
ナル分子と反応する例も多く知られている（Ｃ．Ａ．Ｐ
ｏｗｅｒら、ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃ
ｉ．１７，２０９−２１３，１９９６年）。

【０００７】従って、仮に単一のシグナル分子がガンな
どの疾患の原因であるとしても、細胞の種類によって異
なる受容体が場合によっては複数存在し、疾患の原因で
ある特定の細胞群の機能を特異的に制御する場合には、
その細胞に作用するシグナル分子の特定よりもその細胞
に発現している受容体を特定することが重要となる。例
えば、白血球に作用するシグナル分子群ケモカイン群の
場合、シグナル分子ＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｏｎＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ＮｏｒｍａｌＴｃｅ
ｌｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｓｅｃｒｅｔｅ
ｄ）に対しては種々の白血球が反応するが、好酸球には
ケモカイン受容体の一つＣＣＲ３が特異的に発現してお
り、好酸球を特異的に制御する方法を検索する際には受
容体ＣＣＲ３が必要となる（Ｈｏｗａｒｄ，Ｏ．Ｍ．
Ｚ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ，１４，４６−５１，１９９６
年）。

【０００８】さらに、これらの受容体の中にはウイルス
の感染の際の受容体として働くものがあることが知られ
ており（たとえば、ＣｈｏｅＨ．ら、Ｃｅｌｌ８
５，１１３５−１１４８，１９９６年）、これらの受
容体に結合する分子がウイルスの感染を防ぐことも知ら
れている（たとえば、ＢｌｅｕｌＣ．Ｃ．ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，３８２，８２９−８３３，１９９６
年）。こういった場合にも、ウイルスの感染する細胞に
発現する受容体を知ることが肝要となる。

【０００９】７回膜貫通型受容体蛋白質に作用する内因
性の物質は様々な受容体に対し様々な物質が知られてい
る。例えば、生理アミンであるグルタミン酸、ドーパミ
ンはそれぞれグルタミン酸受容体群、ドーパミン受容体
群に結合する。また、ペプチドである神経ペプチドＹ，
エンドセリンはそれぞれ神経ペプチドＹ受容体群、エン
ドセリン受容体群に結合する（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．およ
びＳｔｅｖｅＡｒｋｉｎｓｔａｌｌ著、ＴｈｅＧ−
ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｎｋｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒＦ
ａｃｔｓＢｏｏｋ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．、１９９４年）。これらの中には、アンジオテ
ンシンなどのように増殖に作用することが知られている
ものとそうでなものがある。

【００１０】これらの７回膜貫通型受容体蛋白質を活性
化する物質は、天然・非天然を問わず、その物質と７回
膜貫通型受容体蛋白質、受容体を発現している細胞の３
者に依存して様々な細胞内シグナル分子の変動を引き起
こす。そのシグナル分子の変動は、例えば、細胞内ｃＡ
ＭＰ濃度の上昇・下降、イノシトールリン酸濃度の上
昇、細胞内カルシウム濃度の上昇、といった反応があり
（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．およびＳｔｅｖｅＡｒｋｉｎｓ
ｔａｌｌ著、ＴｈｅＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｎｋｅ
ｄｒｅｃｅｐｔｏｒＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，１９９４年）、そ
のそれぞれを測定する方法も開発されている。従って、
これらの反応を測定することにより、特定の物質が特定
の７回膜貫通型受容体蛋白質を活性化するかどうかある
いはその活性化を妨げるかどうかを判断する事ができ
る。このような物質が７回膜貫通型受容体蛋白質と結合
して生じる、増殖・遺伝子発現の変動・化学遊走などの
生理学的な現象を観察する方法も知られており、同じ
く、特定の物質が特定の７回膜貫通型受容体蛋白質を活
性化するかどうかあるいはその活性化を妨げるかどうか
を判断することができる。

【００１１】このように７回膜貫通型受容体蛋白質に作
用する物質の同定方法としては種々の方法が知られてお
り、これらの方法を利用するためには、新規の７回膜貫
通型受容体蛋白質を同定することが肝要である。こうい
った考察に基づくと、ガン細胞を含む種々の細胞の増殖
や機能を制御し、疾患の制御を行うためには、これまで
知られていない７回膜貫通型受容体を取得することが大
きな課題である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、ガン細
胞を含む種々の細胞の増殖や機能を制御し、疾患をコン
トロールする手法はいまだ完成されていない。その最大
の原因は、増殖を制御している受容体蛋白質、特に７回
膜貫通型受容体蛋白質が同定されていない点にある。本
発明の課題は、新規な７回膜貫通型受容体蛋白質、また
その蛋白質をコードするｃＤＮＡ，その蛋白質の発現
系、この蛋白質の応用、さらにその蛋白質の抗体を提供
することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、白血球に
新規７回膜貫通型受容体が存在することを予想し、これ
らが白血球の機能や増殖を制御する医薬品の探索に役立
つと考えた。そこで実際に白血球に発現している新規な
７回膜貫通型受容体蛋白質ｃＤＮＡを取得するために、
ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｉｓｐｌａｙ法（例え
ば、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７，２
７４−２８０，１９９５年）、ＲＤＡ法（Ｌｉｓｉｔｓ
ｙｎ，Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９，９４６−
９５１，１９９３年）、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＰ
ＣＲ法（ＩｎｎｉｓＭ．Ａ．ら、ＰＣＲＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ，ｐｐ３９−５３，１９９０年）など種々の
方法を、種々のヒト組織、白血球、白血病細胞株などを
材料に検討した。特にｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＰＣ
Ｒ法については、実施例３に示すプライマーを一例とす
る２０種以上のプライマーを試験した。

【００１４】このような鋭意努力の結果、マウス由来Ｅ
ＡＥ（実験的アレルギー性脳脊椎炎）発症性自己反応性
Ｔ細胞４Ｒ３１２より、発明者らがＥＲＧファミリーと
名付けた遺伝子ファミリーのｃＤＮＡ断片を複数取得し
た。そののち、そのｃＤＮＡ断片をプローブとしてマウ
ス肺ｃＤＮＡライブラリーより本発明の７回膜貫通型受
容体蛋白質ＥＲＧ９のｃＤＮＡコード領域全長を取得し
た。そして、その配列を他の遺伝子と比較することによ
り、７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９が細胞の増殖に
関連していることを見出した。また、公知の遺伝子デー
タベースのサーチ、および、ゲノミック・サザーン・ハ
イブリダイゼーションにより、ＥＲＧファミリーの遺伝
子がヒトにも存在することを示した。そして、そのｃＤ
ＮＡがコードする新規タンパク質の発現系を作成し、さ
らにその抗体を作成することにより、本発明を完成し
た。

【００１５】すなわち、本発明は配列表配列番号１に記
載のアミノ酸配列を含有する７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＲＧ９に関する。また、配列表配列番号１に記載のア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする核酸、
これら核酸群の中から選ばれる核酸と、宿主細胞中で発
現可能なべクター核酸とを連結してなる組み換えＤＮＡ
体ベクター、これら組み換えＤＮＡ体ベクターにより形
質転換された７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９発現細
胞、これらの細胞を培養し培養細胞の細胞膜表面に配列
表配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプ
チド（７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９）を生成させ
ることを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９
の製造方法に関する。また、本発明は、この７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＲＧ９に対するリガンドのスクリーニ
ング方法、およびＥＲＧ９とリガンドとの結合を阻害す
る化合物のスクリーニング方法に関する。

【００１６】さらに、本発明は、この７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＲＧ９を特異的に認識する抗体に関する。本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９のアミノ酸配
列を配列表配列番号１に示し、それをコードするＤＮＡ
配列を配列表配列番号２に示した。これらの配列をデー
タベース（ＧｅｎＢａｎｋリリース１０３．０，Ｏｃｔ
ｏｂｅｒ，１９９７年）で比較したところ、これらは新
規な配列であった。また、特許配列データベースＤＧＥ
ＮＥ（ＤｅｒｗｅｎｔＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＬｔ
ｄ．，ＭＡＹ３１、１９９８）で比較したところ、
これらは新規な配列であった。

【００１７】また該７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９
の部分ペプチドを免疫原としてそれに対する抗体（抗体
を含有する抗血清も含む）を作製し、この７回膜貫通型
受容体蛋白質ＥＲＧ９の精製法を確立し、本発明を完成
した。以下、本発明を詳細に説明する。配列表におい
て、配列番号１のアミノ酸配列は、本発明の７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＲＧ９のアミノ酸配列である。

【００１８】また、配列番号２の配列は本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の全アミノ酸配列及びそれ
をコードしているｃＤＮＡ配列である。配列表配列番号
３はＥＡＥを発症させる際に用いたペプチドの配列であ
る。配列表配列番号４および５は、メラノーマの増殖に
関与していると考えられる既知の７回膜貫通型受容体蛋
白質の配列をもとにデザインしたｄｅｇｅｎｅｒａｔｉ
ｖｅＰＣＲ法のためのプライマーの配列である。

【００１９】配列表配列番号６および７、８はＥＡＥ発
症性Ｔ細胞４Ｒ３１２より取得されたＥＲＧファミリー
のクローン３種のｃＤＮＡ配列である。配列表配列番号
９、１０は、ＥＲＧ９の発現ベクターを構築する際の遺
伝子増幅に用いた化学合成プライマーの配列である。な
お、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端及び右端は
それぞれアミノ基末端（以下、Ｎ末という）及びカルボ
キシル基末端（以下、Ｃ末という）であり、また塩基配
列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端であ
る。

【００２０】また、表に関しては、表１は本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９と既知の遺伝子とをアミ
ノ酸配列での相同性を比較したものである。Ｇｅｎｅ
ｔｙｘ−Ｍａｃ／ＤＢＶｅｒ．３８．０（Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．）
を用いてＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ（リリース１０３．
０，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９７年）をサーチしたのち、
上位１０種についてＧｅｎｅｔｙｘ−ＭａｃＶｅｒ．
９．０（ＳｏｆｔｗａｒｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてアミノ酸の同一度を計算
させた結果である。表２は本発明の７回膜貫通型受容体
蛋白質ＥＲＧ９と既知の遺伝子とをｃＤＮＡ配列での相
同性を比較したものである。Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ
／ＤＢＶｅｒ．３８．０を用いてＧｅｎＢａｎｋ（リ
リース１０３．０，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９７年）をサ
ーチしたのち、上位２０種についてＧｅｎｅｔｙｘ−Ｍ
ａｃＶｅｒ．９．０を用いてｃＤＮＡ配列の同一度を計
算した結果である。

【００２１】また、本発明で述べられる遺伝子操作に必
要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検
討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組
換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡ
ライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通
常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前
記の通常の実験書としては、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ，１９８９年、Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＭ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを挙げ
ることができる。

【００２２】本発明のポリペプチドは、少なくとも配列
表配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有
するが、自然界で生じることが知られている生物種内変
異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点
変異による変異によって生じる改変体も、配列表配列番
号１のポリペプチドの性質を失わない限り配列表配列番
号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するものとして本発明の新規化合物に含まれ
る。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えばＢｅｎ
ｎｅｔｔらの特許出願（ＷＯ９６／２６４５）などに
詳しく記載されており、これらを参考にして作製するこ
とができ、これらの方法によって改変、置換されたポリ
ペプチドも本発明に含まれる。

【００２３】配列表配列番号１のアミノ酸配列から予想
されることとして、糖鎖が付加される部分がある。Ｎ−
グリコシド結合の共通配列は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔ
ｈｒであることが知られているが、配列番号１で１１番
目のＡｓｎ（Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ）、４８番目のＡ
ｓｎ（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）、２６１番目のＡｓｎ
（Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ）がそれと同等な配列を有し
Ｎ―グリコシド修飾を受けている可能性がある。また、
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結
合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基
が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加され
たタンパク質の方がポリペプチドそのものよりも一般に
生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性
を有していると考えられる。したがって、配列番号１の
配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンやＮ−アセチル−Ｄ−ガラ
クトサミンなどの糖鎖がＮ−グリコシドあるいはＯ−グ
リコシド結合してなるポリペプチドも本発明に含まれ
る。

【００２４】また、実施例４に示すように、本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の天然のｃＤＮＡ断片
はマウス肺より取得された。従って、本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＲＧ９のｍＲＮＡはマウス肺に発現
していることが示された。ｍＲＮＡは、細胞内のメカニ
ズムにより蛋白質へと翻訳されるので、マウス肺におけ
る本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の天然の
ｍＲＮＡの検出は７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の
発現と同等と考えられる。

【００２５】これら配列番号１で表されるアミノ酸配列
を含有する７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９またはそ
の塩、または、その蛋白質の部分ペプチドまたはその塩
は、診断を目的とした抗体の作成や、治療を目的とした
医薬品の検索に有用である配列番号１のアミノ酸配列を
データベース（ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ（リリース１０
３．０，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９７年）で比較したとこ
ろ、これらは新規な配列であった。該アミノ酸配列をＫ
ｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ
酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結
果、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９は細胞
膜通過部分を７つ有する細胞膜蛋白質として、細胞表面
に発現されることが明らかとなった。

【００２６】表１に本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＲＧ９と、上記データベースとの比較で類似度が高い
とされた、これまで知られている７回膜貫通型受容体蛋
白質の配列の相同性の比較を示した。本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＲＧ９は、既知のヒトおよびその他
のほ乳類の７回膜貫通型受容体蛋白質と３５％程度の相
同性を示し、新規なマウス７回膜貫通型受容体蛋白質で
あることが示された（表１）。既知の受容体の種間の相
同性は、例えば、アンジオテンシン受容体Ｉａの場合、
ヒト（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔＥｎｔｒｙＡＧ２Ｒ−
Ｈｕｍａｎ）とラット（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔＥｎｔ
ｒｙＡＣ２２−Ｒａｔ）間で９０％を越える。従っ
て、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９はこれ
までマウス以外の種で知られている受容体蛋白質のマウ
スにおける対応物ではないと考えられる。しかし、ほか
の７回膜貫通型受容体蛋白質との相同性がせいぜい３５
％であり、本発明のペプチドＥＲＧ９が７回膜貫通型受
容体に属する蛋白質であることがこのことからも示され
た。これらの相同性から期待される既知のリガンドとし
ては、例えば、アナフィラトキシン、ケモカイン群やソ
マトスタチン、アンジオテンシン、ブラディキニンなど
の小ペプチドのホルモンなどが挙げられる。

【００２７】

【表１】

【００２８】また、配列表配列番号１のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドをコードする本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質の天然のｃＤＮＡ配列については、配列表
配列番号２にアミノ酸配列とともに示した。これらの遺
伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自
然界から分離した、染色体ＤＮＡ，またはｃＤＮＡにお
いて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードす
るアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列
が変異した例はしばしば認められる。また、５’非翻訳
領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列
の規定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列
は変異しやすい。このような変異や遺伝コードの縮重に
よって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。
以下、これらＤＮＡ群を本発明のＤＮＡとよぶ。配列表
配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同等なポ
リペプチドをコードする本発明のＤＮＡは、本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９を製造する上で有用で
ある。

【００２９】配列表配列番号２のＤＮＡ配列をデータベ
ース（ＧｅｎＢａｎｋリリース１０３．０，Ｏｃｔｏｂ
ｅｒ，１９９７年）で比較したところ、これは新規な配
列であった。表２に配列番号２の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＲＧ９のｃＤＮＡ配列とこれまで知られている７
回膜貫通型受容体蛋白質のｃＤＮＡの配列の相同性の比
較を示した。本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ
９のｃＤＮＡは、既知のヒトおよびその他のほ乳類の受
容体と５５％以下の相同性を示し、新規なマウスの７回
膜貫通型受容体蛋白質ｃＤＮＡであることが示された。
既知の受容体ｃＤＮＡの種間の相同性は、例えば、アン
ジオテンシン受容体の場合、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋＥ
ｎｔｒｙＨＳＵ２０８６０）とラット（ＧｅｎＢａｎ
ｋＥｎｔｒｙＳ６７４６５）間で８４％程度であ
る。従って、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ
９はｃＤＮＡ配列からみてもこれまでマウス以外の種で
知られている受容体蛋白質のマウスにおける対応物では
ないと考えられる。また、他の遺伝子との相同性が５５
％以下であるので、他の既知の遺伝子を用いて一般的に
行われているクロスハイブリダイゼーションを用いたス
クリーニングでクローニングすることは困難であると考
えられる。

【００３０】

【表２】

【００３１】実際に、クロスハイブリダイゼーションの
アプローチを用いた例も数多くあるが、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９はクローニングされていな
い（例えば、ＭｏｎｎｏｔＣ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌ．５，１４７７−１４８７（１９９
１））。配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ
は、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９を作成
する上で、また、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｅ
ＲＧ９の詳細な機能を検討する上で有用である。

【００３２】さらに、配列表配列番号２の遺伝子配列の
少なくとも一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１
６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上の核
酸、及びその誘導体、および／または、配列表配列番号
２の遺伝子配列に相補的な遺伝子配列の少なくとも一部
の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、
さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上の核酸、及びその誘導
体、を用いれば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｅ
ＲＧ９のｃＤＮＡクローン、ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ，
ゲノム遺伝子クローンなどを検出することができる。ゲ
ノミック・サザーン・ハイブリダイゼーションによるゲ
ノムＤＮＡの検出の例を実施例１２に示した。必要な核
酸の長さはその配列の特異性、検出しようとしている核
酸との結合の安定性によって異なるが、ＤＮＡを用いて
ＰＣＲによって検出する場合には、Ｔｍ（２本鎖解離温
度）が４５℃以上であることが望ましい。ＰＣＲのよう
にＤＮＡ同志が結合する場合には、一つのＧＣ結合を４
℃とし、一つのＡＴ結合を２℃として合算し、Ｔｍを推
定することができる。

【００３３】従って、ＧＣコンテントが高い場合には１
２ｍｅｒの、一般的な５０％ぐらいのＧＣコンテント領
域で１６ｍｅｒの核酸が必要となる。アーティファクト
の可能性を減らすためには２０ｍｅｒ以上であることが
望ましい。よりＤＮＡとの結合が安定な核酸誘導体を用
いる場合にはさらに短い核酸を用いて検出することが可
能である。例えば、遺伝子診断を目的としてこれらの遺
伝子を調べる方法として、配列表配列番号２およびその
相補鎖の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６
ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上の核酸、
つまりＤＮＡ，ＲＮＡ，及びそれらがメチル化、メチル
フォスフェート化、脱アミノ化、またはチオフォスフェ
ート化された誘導体を用い、ハイブリダイゼーション、
ＰＣＲ等の手法によって行うことがあげられる。

【００３４】同様な方法でヒト、ラット等の他の生物の
本発明の遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニング
ができる。さらに、ヒト、マウスを含めたゲノム上の遺
伝子のクローニングも同様に可能である。従って、その
ようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用いれ
ば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の更に
詳細な機能も明らかにすることが出来る。例えば、近年
の遺伝子操作技術を用いれば、トランスジェニックマウ
ス、ジーンターゲッティングマウス、また、本発明の遺
伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノックア
ウトマウスなどのあらゆる方法を用いることが出来る。
また、本発明の遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺伝
子診断、遺伝子治療への応用も可能である。

【００３５】また、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＲＧ９の更に詳細な機能を明らかにすることを目的と
して、細胞や生体へのアンチセンス核酸の投与も考えら
れる利用法である。本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＲＧ９の過剰な反応（例えばガンなどの細胞の異常増
殖）が病態となっている疾患については、これらアンチ
センス核酸により遺伝子の発現を抑えることによって、
治療を行うことも可能である。また、アンチセンス核酸
を適当なベクターに組み込み、そのベクターを用いるこ
とも可能である。これらアンチセンス核酸の作成例・使
用例についてはＭｕｒｒａｙ，Ｊ．Ａ．Ｈ．編、ＡＮＴ
ＩＳＥＮＳＥＲＮＡＡＮＤＤＮＡ，Ｗｉｌｅｙ−
Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２年、に詳しい。

【００３６】以上のように、配列表配列番号２の遺伝子
配列の少なくとも一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒ
から１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上
の核酸、及びその誘導体、及び配列表配列番号２の遺伝
子配列の相補的な配列の少なくとも一部の遺伝子配列を
有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、さらに望ましく
は２０ｍｅｒ以上の核酸、及びその誘導体は診断、治療
などに有用である。

【００３７】本発明の核酸を含有するベクターとして
は、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２，ｐＵＣ８，ｐＵ
Ｃ１９，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１９（いずれも日本国宝
酒造社製）などが挙げられるが、その他のものであって
も宿主内で複製増殖できるものであればいずれも用いる
ことができる。実施例５にベクターとしてｐＴａｒｇｅ
Ｔを、宿主として大腸菌を用いた例を示した。また本発
明のＤＮＡを含有するファージベクターとしては、例え
ばλｇｔ１０，λｇｔ１１（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）などが挙げられるが、その他のものであっても宿
主内で増殖できるものであれば用いることができる。こ
のようにして、得られたベクターは適当な宿主、例えば
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌、などにカルシウムクロラ
イド法等を用いて導入し、本発明のＤＮＡを含有するベ
クターを保持する形質転換体を作成することができる。
上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒアコ
リＫ１２ＨＢ１０１，ＭＣ１０６１，ＬＥ３９２，
ＪＭ１０９、ＩＮＶαＦ’などが挙げられる。上記バチ
ルス属菌の例としてはバチルスサチリスＭ１１１４等
が挙げられる。また、ファージベクターは、例えば増殖
させた大腸菌にインビトロパッケージング法（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１：２４４２−，
１９７８）を用いて導入することができる。尚、本発
明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の全アミノ酸配
列をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＥＲＧ９を
大腸菌ＩＮＶαＦ’に遺伝子導入した形質転換細胞（実
施例５）Ｅ．ｃｏｌｉ：ＩＮＶαＦ’−ｐＥＲＧ９は、
日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
平成１０年３月１９日に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ―６
３０３として寄託されている。

【００３８】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ
９をコードする塩基配列を有する核酸を含有するベクタ
ーは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９をコ
ードする塩基配列を有する核酸を製造する上で、また、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の核酸を保
持する形質転換体を作成する上で有用である。上記の方
法にて作成した本発明の核酸を用いた７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＲＧ９の発現には、成書によって知られてい
る（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ
ａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，
１９９０；および横田ら、バイオマニュアルシリーズ
４，遺伝子導入と発現・解析法、羊土社、１９９４）、
多数の方法が用いられる。すなわち、分離した７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＲＧ９のアミノ酸配列をコードする
ｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつなぎ、動物細胞、昆
虫細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原核細胞を宿
主として生産させることができる。

【００３９】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ
９を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコードす
る核酸はその５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、
３’末端には翻訳終止コドンを有していてもよい。これ
らの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成核酸
アダプターを用いて付加することもできる。更に該ＤＮ
Ａを発現させるには上流にプロモーターを接続する。ベ
クターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由
来プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλファー
ジなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワ
クシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられ
る。

【００４０】本発明に用いられるプロモーターとして
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが
好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、
宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰ
プロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿
主が原核細胞である場合には、プロモーターとともにリ
ボゾーム結合部位をもつことが好ましい。宿主が動物細
胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レト
ロウィルスのプロモーター、メタルチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーターなどが利用できる。

【００４１】本発明のポリペプチドを発現させる時、配
列表配列番号１のアミノ酸配列と実質的に同等な蛋白質
をコードする核酸のみでもよいが、膜表面への発現を保
証する必要のある場合には、既知シグナルペプチドをコ
ードする核酸をＮ末に付加したり、産生されたポリペプ
チドの検出を容易にするための既知抗原エピトープをコ
ードする核酸を付加することで、特別の機能を付加した
蛋白質を生産させることもできる。このような技術の一
つの例として、Ｃｈｏｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ，８５，１
１３５−１１４８，１９９６年を挙げることができ
る。

【００４２】本発明者らは、実施例５に示したごとく、
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９を発現する発現ベク
ターとして配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを発現ベクターｐＴａｒｇｅＴ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社）につなぎ、本発明のＤＮＡを含む発現ベク
ターを作製した。このようにして構築された７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＲＧ９をコードするＤＮＡを含有する
発現ベクターを用いて、本発明のＤＮＡを含むベクター
を保持する形質転換体を製造する。

【００４３】宿主としては、例えばエシェリヒア属菌、
バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物
細胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ―７、Ｖｅ
ｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ
細胞ＳＦ９などが挙げられる。このようにして得られる
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９をコードす
る塩基配列を有する核酸を含有するベクターは、本発明
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９を産生する上で有
用である。

【００４４】実施例６に示したごとく、上記の発現ベク
ターを遺伝子導入し、７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ
９をＣＨＯ細胞、２９３細胞などで発現させることによ
り、これら発現プラスミドで形質転換された形質転換体
が得られる。これらの形質転換体は本発明の７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＲＧ９を産生する上で有用である。本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９と実質的に同
等な蛋白質をコードする塩基配列を有する核酸を含有す
るベクターを保持した形質転換体を作成し、それぞれ公
知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により
培養することによって、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＲＧ９またはその塩を製造することができる。例
えば実施例６のようにＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎ
ｇを用いたり、また、ＦＡＣＳによって検査することに
より、７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の生産を確認
することができる。

【００４５】このようにして作成した、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９またはその塩を用いて、本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９のリガンドを
決定することができる。そのためには、まず、リガンド
候補である試験化合物を、純化した、または、未精製
の、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９と接触
させ、試験化合物の本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＲＧ９に対する結合もしくはその結合により引き起こ
される反応を測定する。試験化合物の本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＲＧ９に対する結合を測定する場合
には、純化した、または、未精製の本発明の７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＲＧ９と試験化合物を接触させ、複合
体量および／または未結合の試験化合物量を測定する。
複合体量および／または未結合の試験化合物量を測定す
る方法としては、例えば、放射性化合物や色素などを用
いて試験化合物を標識し、複合体と未結合の試験化合物
を分離し、標識を用いて複合体量および／または未結合
の試験化合物量を測定する。この一つの例を実施例７に
示した。

【００４６】受容体と結合する化合物が知られている場
合には、その化合物を標識し、試験化合物が標識化合物
と競合するかどうかをもって、試験化合物の結合を測定
することもできる。これらの方法の例として、浅沼幹人
ら、実験医学１１，２２−２９，１９９３年に挙げられ
ている方法がある。そのほかにも、ＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔ
ｉｌｌａｔｉｏｎＰｒｏｘｉｍｉｔｙＡｓｓａｙ）
のように複合体と未結合の試験化合物を分離せずに測定
する方法もある。

【００４７】一方、試験化合物と本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＥＲＧ９の結合によりひき起こされる反応
を測定する場合には、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＲＧ９の共役しているシグナル伝達系によって様々
な方法が考えられる。このような方法として、例えば唐
木英明ら編、実験医学７，ｐｐ２６−１０９，１９８９
年のように細胞内カルシウムを測定する方法、Ｓａｍｓ
ｏｎ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５，ｐｐ３３６２−
３３６７，１９９６年のようにマイクロフィジオメータ
ーを用いる方法、細胞内ｃＡＭＰの量を測定する方法、
などがある。リガンドとの結合によって引き起こされる
反応を測定する１つの例を実施例８に示した。これらＥ
ＲＧ９蛋白質もしくはその塩、または、その部分ペプチ
ドまたはその塩と試験化合物を接触させるＥＲＧ９蛋白
質に対するリガンドを決定する方法は７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＲＧ９に結合して細胞の反応を制御する、疾
患の治療を行う物質を検索する上で有用である。

【００４８】さらに上記のようにして、リガンド、すな
わち、７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９に作用するも
のを発見した場合には、その作用の変化、すなわち、そ
の活性化を行ったり、活性化を阻害したりする物質を検
索することが可能である。そのことは、（ｉ）７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＲＧ９もしくはその塩またはその部
分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させた場
合と（ｉｉ）７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９もしく
はその塩またはその部分ペプチドもしくはその塩に、リ
ガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行
うことによって行うことができる。その一つの例を実施
例９に示した。この方法は、７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＲＧ９に作用して細胞の反応を制御する、疾患の治療
を行う物質を検索する上で有用である。

【００４９】７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９を特異
的に認識する抗体は実施例１０に示したようにして作製
することができる。抗体を作製するためのペプチドの長
さは特に限定されないが、ＥＲＧ９蛋白質を特徴づけら
れる長さがあればよく、好ましくは６アミノ酸以上、特
に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いればよ
い。このペプチドをそのまま、またはＫＬＨ（ｋｅｙｈ
ｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）やＢＳＡ
（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）といっ
たキャリア蛋白質と架橋した後に必要に応じてアジュバ
ントと共に動物へ接種せしめ、その血清を回収すること
でＥＲＧ９蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗
体）を含む抗血清を得ることができる。また、抗血清よ
り抗体を精製して使用することも可能である。接種する
動物としては、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、
ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツ
ジ、ウサギが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作
製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ること
も可能であるが、この場合にはマウスが好ましい。

【００５０】また、配列番号１に示したアミノ酸の全長
または６残基以上、望ましくは８残基以上のアミノ酸配
列をＧＳＴ（グルタチオンＳ―トランスフェラーゼ）
などと融合させたものを精製して、または未精製のま
ま、抗原として用いることもできる。成書（Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａ
ｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）
に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法な
どにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、
細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても作製す
ることができる。このように作製された抗体は本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９の精製に利用でき
る。

【００５１】また、実施例１０に示したこれらの７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９を特異的に認識する抗体を
用いれば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９
の検出、測定が可能であり、細胞の分化異常を伴う疾
患、例えば悪性腫傷、ウィルス感染などの疾患の診断薬
として使用でき得る。また、実施例６に示すように、こ
の検出、測定には、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎ
ｇ，ＦＡＣＳ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｃｔｉ
ｖａｔｅｄＣｅｌｌＳｏｒｔｅｒ）などを用いるこ
とができる。ＦＡＣＳを用いた臨床診断の例は、例え
ば、天神美夫ら編、フローサイトメトリーハンドブッ
ク、サイエンスフォーラム社、１９８４年、の第４部
フローサイトメトリーの臨床医学への応用、に示されて
いる。これら検出、測定については、Ｗｅｓｔｅｒｎ
Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）に
関してはＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗｅｔａ
ｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ４７１−５１０にその方法の
詳細が、免疫沈降、免疫測定などに関しては、同書ｐｐ
４２１−４７０，ｐｐ５５３−６１２にそれぞれ詳細が
記されている。ＦＡＣＳの際の細胞の染色については、
高津聖志、瀧伸介、免疫研究の基礎技術、羊土社、１９
９５年、ｐｐ１６−６１に、ＦＡＣＳの操作について
は、天神美夫ら編、フローサイトメトリーハンドブッ
ク、サイエンスフォーラム社、１９８４年に詳細が示さ
れている。

【００５２】以上のように、配列表配列番号１で表され
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
ることを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９
またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはその塩
に対する抗体は本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲ
Ｇ９を発現している細胞を同定する上で有用である。

【００５３】

【発明の実施の形態】以下に発明を実施する形態につい
て例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではな
い。

【００５４】

【実施例１】４Ｒ３１２株の樹立ＭＢＰペプチド（配列表配列番号３：ＦＫＮＩＶＴＰＲ
ＴＰＰＰＳ）はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社製４３０Ａ型ペプチド合成機を用いた固相法にて合成
した。このＭＢＰペプチドの濃度が８ｍｇ／ｍｌになる
ように以下のＭＢＰペプチドエマルジョン溶液を作製し
た。まず、完全フロイントアジュバンド（Ｄｉｆｃｏ
社）に結核死菌（青山Ｂ株、日本ビーシージー、国立予
防衛生研究所から入手）を最終濃度４ｍｇ／ｍｌになる
ように加え、アジュバンド溶液とした。さらに、ＭＢＰ
ペプチド溶液９００μｌとこのアジュバンド溶液９００
μｌをガラス注射筒でよく混合し、ＭＢＰペプチドエマ
ルジョン溶液とした。

【００５５】このＭＢＰペプチドエマルジョン溶液を、
ＳＪＬ／Ｊマウス（９週齢、メス；日本チャールスリバ
ーより入手）の両後肢蹠の皮下に２５μｌずつ注入し
た。さらに１μｇのｉｓｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ（科研製薬）溶液を、免疫直後およ
び２日後に尾静脈より２００μｌの生理食塩水溶液とし
て注入した。

【００５６】肉眼での観察により臨床症状的にＥＡＥを
発症しているマウスを選び出し、免疫後６３日目に、腋
窩、鼠径及び膝窩リンパ節を採取した。リンパ節をメス
で細かく切ったのち、シリコン栓を用いて、１５０番の
メッシュでこし、単細胞懸濁液とした。この単細胞懸濁
液を１０μｇ／ｍｌのＭＢＰペプチドを含む培地（５％
ＦＣＳ（ウシ胎児血清；Ｂｉｏｓｅｒｕｍ社より入
手）、Ｃｌｉｃｋ’ｓＥＨＡＡ培地；Ｉｒｖｉｎｅ
ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣａｔ．Ｎｏ．９５８２）で４
ｘ１０⁶個／ｍｌに調製し、２５ｃｍ²のフラスコ（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ社）に１０ｍｌ／フラスコで加え、フラスコ
を立てて培養を開始した。

【００５７】継代用の培地に含まれるＦａｃｔｏｒは以
下のように調製した。ＲＧＦ（ＲａｔＧｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒ）は１０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ
（Ｓｉｇｍａ社）および１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６
４０培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）で１０⁶細胞／ｍｌ
のＳＤラット（チャールスリバー）の脾細胞を４８時間
刺激後、上清を回収し、終濃度が２０ｍｇ／ｍｌになる
ようにα−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄｅを添
加し、ＲＧＦとした。また、ＥＬ４ｓｕｐは、１ｎｇ／
ｍｌのホルボールミリステートアセテート（Ｓｉｇｍａ
社）を含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社；５％Ｆ
ＣＳを含む）で１０⁶個／ｍｌに調製したマウスＥＬ
４．ＩＬ−２細胞（ＡＴＣＣより入手可能。ＡＴＣＣ
ＴＩＢ−１８１）を２４時間刺激後、培養上清を回収
し、ＥＬ４ｓｕｐとした。

【００５８】前記のリンパ節細胞を、培養６日目に継代
培地（Ｃｌｉｃｋ’ｓＥＨＡＡ培地、５％ＦＣＳ、１
５％ＲＧＦ、ＥＬ４ｓｕｐ１％を含む）に培地を交換
後、同じ培地で４ｘ１０⁶個／ｍｌに調製し、２４穴プ
レートに１．２ｍｌ／穴で分注し、５％二酸化炭素雰囲
気中３７℃で培養した。さらに約１週間後、１０μｇ／
ｍｌのＭＢＰペプチドおよび約２ｘ１０⁶個／ｍｌの抗
原提示細胞（ＳＪＬ／Ｊマウスの脾細胞を３０００Ｒで
Ｘ線照射して調製した）の存在下で５％二酸化炭素雰囲
気中３７℃で培養し（抗原刺激）、約１週間後に継代培
地に培地を交換し、さらに５％二酸化炭素雰囲気中３７
℃で約１週間培養した。これを培養の１サイクルとし、
２週間ごとにこの培養サイクルを繰り返した。まきこみ
細胞数は徐々に減らし、最終的には２．５〜５ｘ１０⁵
個／ｍｌで行った。この培養を３サイクル繰り返した
後、限外希釈により個々のクローンに分割した。そのう
ちの１クローンを４Ｒ３１２株と命名した。４Ｒ３１２
株も上記と同様に培養サイクルを繰り返して拡大培養
し、以降の実験に用いた。

【００５９】

【実施例２】４Ｒ３１２株のＥＡＥ発症性の確認４Ｒ３１２株を実施例１に示したように拡大培養し、５
ｘ１０⁶個の抗原刺激後３日目の４Ｒ３１２株をＳＪＬ
／Ｊマウス（８週齢、メス；チャールスリバーより購
入）に尾静脈より注入した。２匹のマウスに注入した。
肉眼による症状観察により、一匹は５日目に一匹は６
日目にＥＡＥの発症が観察された。

【００６０】

【実施例３】マウス由来の新規７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ３３１、ＥＴ３３０，ＥＴ６４断片の取得マウス４Ｒ３１２株は実施例１に示したように拡大培養
し、全体で約１×１０⁷個の細胞を培養して材料とし
て使用した。ピペッティングにより、細胞を懸濁後、１
０００ｒｐｍで１５分の遠心（ＫＳ−８３００型、久保
田製作所、ＲＳ３０００／６型ローター）後、上清を吸
引・廃棄し、ＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅ
ｒｅｄＳａｌｔｓ；大日本製薬（株）製Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．２８−１０３−０５）を３０ｍｌ加え懸濁後、再度
同じ条件で遠心した。以下、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍ
ＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ製）を用い、製造者のプロ
トコル（Ｒｅｖ．４．ＸＶ−０２５−００−０７）１１
〜１４頁に従って（ｓｅｃｏｎｄｃｏｌｕｍｎｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎは行わなかった）、ｍＲＮＡを抽出
した。エタノール沈殿後、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，
１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＭａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃＤｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎｏｆｔｈｅＡｍｏｕｎｔｏｆＤＮＡ
ｏｒＲＮＡに従って定量した。約２μｇのｍＲＮＡを
用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＣｈｏｉｃｅＳｙｓ
ｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）添付の５ｘＦｉ
ｒｓｔｓｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ１０μｌ、
０．１ｍＭＤＴＴ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ社製）５μｌ、ＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮａｓ
ｅ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ社製）１μｌを加え、滅菌
水で全量を５０μｌにし、室温で５分間放置した。その
後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿
後、次のようにｃＤＮＡ合成を行った。

【００６１】ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＣｈｏｉｃｅ
ＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ
（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いてｃ
ＤＮＡ合成を行った。プロトコル１１〜１７頁（Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ１および２）に従い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）
プライマーを用いて２重鎖（ｄｓ）ＤＮＡを合成した。
その後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール
沈殿後、４０μｌの滅菌水に溶解した（これをｃＤＮＡ
サンプルと呼ぶ）。

【００６２】このｃＤＮＡサンプルのうち４μｌを用い
てＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝
酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付の
バッファーを５μｌ，酵素に添付のｄＮＴＰｍｉｘｔ
ｕｒｅ４μｌと配列表の配列番号４に示した合成オリ
ゴヌクレオチドおよび、配列表の配列番号５に示した合
成オリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｐｍｏｌを加
え、最終容量５０μｌとした。

【００６３】この混合物を、ＴａＫａＲａＰＣＲｔ
ｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ４８０を用いて、９５℃
１分、４０℃２分、７２℃３分を５サイクル行ったの
ち、９５℃１分、５０℃２分、７２℃３分を２５サイク
ル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロース
・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日
本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約７０
０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。こ
のバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝
酒造社製）で精製後、ＴＡｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングした。

【００６４】すなわち、ベクターとしてｐＣＲＩＩＶ
ｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲＩ
Ｉという）を用い、ベクターと先のＤＮＡとをそのモル
比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤ
ＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＣ
ＲＩＩを大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔＣｏｍｐｅｔｅｎｔ
ＣｅｌｌｓＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）
を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半
固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置
し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアン
ピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付
け、８時間程度３７℃で震とう培養し、菌体を回収し、
ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い
て添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラ
スミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約７００ｂ
ｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組
み込まれていることを確認し、確認されたクローンにつ
いて、組み込まれているｃＤＮＡの塩基配列決定を行っ
た。

【００６５】挿入ｃＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シーク
エンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調
製はＰＲＩＳＭ，ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＤｙ
ｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製）を用いて行なった。０．５ｍｌ容のマイクロチ
ューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの
０．８ｐｍｏｌ／μｌの−２１Ｍ１３ユニバーサル・プ
ライマー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）および６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエ
ンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラ
ルオイルを重層後、９６℃３０秒、５５℃１５秒および
６０℃４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サ
イクル行ない、４℃で５分間保温した。反応後、８０μ
ｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層
を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行なった。１
００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌
後、室温、１４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行
ない沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄
後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用
サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１
０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０
℃，２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供
した。

【００６６】７５のクローンについてＤＮＡ配列決定を
行ったところ、３個のクローンがそれぞれ配列表配列番
号６、７、８のＤＮＡ配列に対応する配列を有していた
（両端のプライマーの配列を含む）。ＧｅｎＢａｎｋの
データベース（リリース１０３．０，Ｏｃｔｏｂｅｒ，
１９９７年）のサーチの結果、この配列は７回膜貫通型
受容体群と類似していることが判明した（以下、この断
片をＥＴ３３１，ＥＴ３３０，ＥＴ６４断片とよぶ）。
さらにこれらをお互いに比較したところ、お互いに８０
％以上類似しており、遺伝子ファミリーを構成すること
が明らかになった（以下これらの遺伝子から構成される
遺伝子ファミリーをＥＲＧ（ＥＴ３３１−ｒｅｌａｔｅ
ｄｇｅｎｅｓ）と呼ぶ。

【００６７】

【実施例４】新規７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９全
長遺伝子の取得マウス肺由来のｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ社、Ｃａｔ＃ＭＬ１０４６ｂ）からプラークハイブリ
ダイゼーションにてＥＴ３３１断片とハイブリダイズす
るクローンの検索を行った。１０⁶個相当のプラークを
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，
ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅ
ｓｓの２．１０９−１１１，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉ
ｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ λ ｐｌａ
ｑｕｅｓｏｎｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｆｉ
ｌｔｅｒｓに従ってプレートし、出現したプラークをナ
イロンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＮ＋；Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをア
ルカリ処理（１．５ＭＮａＣｌ，０．５ＭＮａＯＨ
を染み込ませた濾紙上に５分間放置）し、次いで中和処
理（１．５ＭＮａＣｌ，０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）を染み込ませた濾紙上に５分間放置）を
２回行い、次に２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳ
Ｃ溶液は０．１５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ｐＨ
７．０；以下ＳＳＣと略す）中で５分間、２度振とう洗
浄し風乾した。その後、ＵＶクロスリンカー（フナコシ
社製、モデルＣＬ−１０００）を用いて、このフィルタ
ーの紫外線照射を１２００×１６０マイクロジュール／
ｃｍ²で行った。このフィルターを用いて放射性同位元
素³²Ｐにて標識されたＥＴ３３１遺伝子断片をプローブ
にしてハイブリダイゼーションを行った。

【００６８】放射性同位元素³²Ｐにて標識されたＥＴ３
３１断片プローブは、以下のように作製した。すなわ
ち、ＥＴ３３１断片が組み込まれたベクターｐＣＲＩＩ
より、制限酵素ＥｃｏＲＩにてベクターより切り出し、
０．８％アガロース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジ
ウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線
下で観察し、約７００ｂｐのバンドをゲルから切り出し
てＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（フナコシ社製）を
用いて精製した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリン
グキット（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉ
ｎｇｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製コードＲＰ
Ｎ１６０７）を用いて標識した。すなわち、ＤＮＡ１０
０ｎｇにプライマー液１０μｌ、５×反応緩衝溶液２０
μｌ及び脱イオン水を加えて全量を８６μｌとして沸騰
水浴を５分間行い、その後、α− ³²Ｐ−ｄＣＴＰ（アマ
ーシャム社製、コードＡＡ０００５）１０μｌ，及び
Ｋｌｅｎｏｗ酵素溶液４μｌを加えて、３７℃で１０分
間水浴し、放射標識したＥＴ３３１断片を合成した。更
にその後、セファデックスカラム（ＱｕｉｃｋＳｐｉ
ｎＣｏｌｕｍｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０：独逸
国ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰
水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。

【００６９】前述の方法にて作成したフィルターを、各
々の成分の最終濃度が６倍濃度のＳＳＣ溶液、５倍濃度
のデンハルト液（和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム、和光純薬社製）、及び１００μ
ｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（Ｓ
ｉｇｍａ社製）を含むハイブリダイゼーション液中に浸
し、６５℃にて２時間振とうしたのち、前述の方法で³²
Ｐ標識されたプローブをハイブリダイゼーション液に添
加し、６５℃にて１６時間振とうし、ハイブリダイゼー
ションを行った。

【００７０】次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含
む、各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸
し、室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温で１５分間
洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーン
を使用して、−８５℃でオートラジオグラフィーを行っ
た。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、
再度プラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニング
を行い、完全に単独のクローンを分離した。

【００７１】単離されたファージクローンのうち６クロ
ーンを以降の遺伝子配列決定に供した。Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＭ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓの２．
７０，の方法に従い、これらのすべてのクローンのファ
ージを約１０⁹ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇ
ｕｎｉｔ）調製し、Ｗｉｚａｒｄｌａｍｂｄａｐ
ｒｅｐｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてファージＤＮＡを
精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様に制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組
み込んだ。これらのクローンのＤＮＡ配列をＤＮＡシー
クエンサーにより解析し、配列表配列番号２にあるＤＮ
Ａ配列を決定した。配列表配列番号２のＤＮＡ配列の１
番目の塩基Ａから１０１４番目の塩基Ａまでの塩基配列
がＥＲＧ９の構造遺伝子（タンパク質をコードしている
ＤＮＡ配列）である。

【００７２】

【実施例５】７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９発現ベ
クターの作製実施例４で単離されたＥＲＧ９全長遺伝子を含むプラス
ミドクローンを鋳型としてＥＲＧ９遺伝子のＰＣＲ（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）
を行った。ＰＣＲにはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＴ
ａｑポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を用
いた。このプラスミド溶液１μｌ（ＤＮＡ５ｎｇを含
む）に脱イオン水３７．５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ
０．５μｌと、Ｔａｑポリメラーゼに添付のバッファー
５μｌと、２．５ｍＭｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（宝
酒造社製）４μｌと、配列表配列番号９に示したオリゴ
ヌクレオチド（配列表配列番号２のＤＮＡ配列の１番目
のＡから２１番目のＣの２１塩基配列の５’末端に塩基
Ｇおよび制限酵素ＥｃｏＲＩの酵素配列ＧＡＡＴＴＣと
スペーサー配列ＣＡＣＣとを加えたもの）、および配列
表配列番号１０に示したオリゴヌクレオチド（配列表配
列番号２のＤＮＡ配列の９９４番目のＧから１０１７番
目のＧの２４塩基配列の相補的配列の５’末端に塩基Ｇ
および制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列ＧＡＡＴＴＣを加
えたもの）を、それぞれ２０ピコモルを加え、最終容量
５０μｌとした。

【００７３】この混合物を、ＴａＫａＲａＰＣＲｔ
ｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ４８０を用いて、９４℃
３分、５５℃１分、７２℃２分を１サイクル行ったの
ち、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分を２サイク
ル行い、９４℃３０秒、６５℃１分、７２℃２分を２１
サイクル行って、最後に９４℃３０秒、６５℃１分、７
２℃７分の反応を行った。このＰＣＲ産物の一部を０．
８％アガロース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウム
ブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で
観察し、約１０３０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されているこ
とを確認した。

【００７４】残りのＰＣＲ反応溶液を０．８％アガロー
スゲル上で分離し、目的とする遺伝子産物をゲルから切
り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いて、ＤＮＡの
精製を行った。この精製ＤＮＡをｐＴａｒｇｅＴ（Ｔ
Ｍ）ＭａｍｍａｌｉａｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶ
ｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を
用い、添付のプロトコールに従って、ｐＴａｒｇｅＴ
（ＴＭ）ベクターに組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれた
ｐＴａｒｇｅＴ（ＴＭ）を大腸菌ＩＮＶαＦ’ Ｃｏｍ
ｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）
を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半
固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置
し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアン
ピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付
け、１８時間程度３７℃で振とう培養し、菌体を回収
し、ウイザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を
用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。こ
のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約１
ｋｂｐのＤＮＡが切り出されたクローンについて、組み
込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行い、ＥＲＧ９の
発現ベクター、ｐＥＲＧ９を得た。

【００７５】尚、このプラスミドｐＥＲＧ９を大腸菌Ｉ
ＮＶαＦ’に遺伝子導入した形質転換細胞Ｅ．ｃｏｌ
ｉ：ＩＮＶαＦ’−ｐＥＲＧ９は、日本国通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年３月１９
日に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ―６３０３として寄託さ
れている。

【００７６】

【実施例６】発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現実施例５で作製した発現ベクターを２９３細胞（ＡＴＣ
Ｃ：ＣＲＬ−１５７３）に遺伝子導入した。遺伝子導
入前の細胞の継代は、Ｄｕｌｏｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉ
ｆｉｅｄＭＥＭ（Ｄ−ＭＥＭ液体培地）を用い、１０
％ウシ血清（５６℃２０分間熱処理して非働化した）、
１００分の１量のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｉｎ溶液（大日本製薬（株）Ｃａｔ．Ｎｏ．１
６−７０Ｄ−４９ＤＮ）を加えた。細胞は、５×１０⁴
個／ｍｌから５×１０⁵個／ｍｌの濃度で培地中に植え
付け、３７℃、５％二酸化炭素、湿度１００％で培養
し、コンフルエントになるまで培養した。培地を吸引・
廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液（ＣｏｓｍｏＢｉｏ
Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）処理により、細胞をプレート底面よ
りはがした。前記の培地（血清を含む）を加えて反応を
停止させた。その後、ピペッティングによって細胞を均
一に懸濁し、遠心して（１０００ｒｐｍ１５分；ＫＳ
−８３００型、久保田製作所、ＲＳ３０００／６型ロー
ター）回収し、新しい培地に再度懸濁し継代した。遺
伝子導入は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキット（Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．ＩＶ２７８０−１）を用いリン酸カルシウム
共沈法にて行い（添付のプロトコル６ページ）、本発明
の７回膜貰通型受容体蛋白質ＥＲＧ９をコードするＤＮ
Ａを保持する形質転換体を作成した。ＤＮＡは１００ｍ
ｍディッシュあたり５μｇを用いた。

【００７７】膜画分の調製は、以下のように行った。ｐ
ＥＲＧ９を遺伝子導入した細胞およびｐｃＤＮＡ３プラ
スミドを導入した細胞を２４〜４８時間培養した。その
後、培地はアスピレータで吸引し廃棄し、ＰＢＳ（大日
本製薬（株）Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−１０３−０５）を用
いて細胞を洗浄し、その後１ｍｌ／ディッシュの１．５
ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳを加え、ディッシュからはがし
た。その後、ＰＢＳで２度洗浄し、１ｍｌのｈｙｐｏｔ
ｏｎｉｃｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ
７．４）に懸濁した。この細胞懸濁液をＰｏｌｙｔｒｏ
ｎ（ＫＩＮＥＭＡＴＩＫＡ社製、ＰＴ１０−ＳＫ）で破
砕し、マイクロチューブ用遠心機（トミー精工、ＭＲＸ
−１５０型）で４℃，１３０００ｘｇで１５分間遠心し
た。上清を捨て、さらに２度ｈｙｐｏｔｏｎｉｃｂｕ
ｆｆｅｒを加え懸濁後、同じ条件で遠心し、沈殿物を膜
画分とした。

【００７８】こうして得られた膜画分を用いてウェスタ
ンブロッティング法にて７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲ
Ｇ９の発現を確認した。すなわち、膜画分をＡＣＩジャ
パン社製のＳＤＳ―ＰＡＧＥ用電気泳動槽及びＳＤＳ―
ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエントゲル
５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従ってＳＤ
Ｓ―ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２―メルカプト
エタノール（２―ＭＥ）を加えて５分間の沸騰水浴加熱
処理により還元処理を行った。マーカーとしてはＡｍｅ
ｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量用）を用
い、サンプルバッファ一、泳動バッファーについては添
付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ―ＰＡＧＥ
終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィ
ルター（ＢｉｏＲａｄ社製）に同社製ミニトランスブロ
ットセルにより転写した。

【００７９】このように作製されたフィルターを５％ス
キムミルク、ＴＢＳ―Ｔ（２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ，
１３７ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０）で一時間振とうしてブロッキングした。Ｅ
ＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社）に添付の説明書に従い、一次抗体として実
施例１０に記載した抗ＥＲＧ９抗血清を用い、二次抗体
としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇロバ抗体（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。

【００８０】抗体の反応時間は各々室温で一時間反応さ
せ、各反応間は、ＴＢＳ―Ｔにて１０分間室温で振とう
洗浄する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フ
ィルターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システ
ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、ポ
リ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光さ
せた。分子量マーカーとの比較の結果、約４５ｋＤのバ
ンドが遺伝子導入をしたものについてのみ得られ、遺伝
子導入をしていない細胞には観察されなかった。

【００８１】

【実施例７】リガンドのスクリーニング遺伝子導入を行わない２９３細胞とＥＲＧ９形質転換体
２９３細胞の膜画分を実施例６と同様にして調製した。
膜画分調製液５０μｌもしくはＰＢＳ（大日本製薬
（株）Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−１０３−０５）と放射性標
識された候補化合物ＣＧＳ２１６８０（Ｄｕｐｏｎｔ
ＮＥＮ社、カタログ番号ＮＥＴ−１０２１）５０μ
ｌ（終濃度１００ｎＭ）、ＰＢＳ５０μｌを加え、全
量を１５０μｌとした。混合して候補化合物と７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＲＧ９を接触させ、３７℃で３０分
間保温した後、マイクロチューブ用遠心機（トミー精
工、ＭＲＸ−１５０型）で室温、１５０００ｘｇで１５
分間遠心し、ＥＲＧ９蛋白質と結合した候補化合物と結
合していないものを分離した。その上清を１μｌとり、
１０ｍｌの液体シンチレーター用カクテル（Ｄｕｐｏｎ
ｔＮＥＮ，ＥＣＯＮＯＦＬＵＯＲ−２）に加え、混合
した。その後、ＢｅｃｋｍａｎＬＳ６０００ＬＬ型シ
ンチレーションカウンターを使用して放射活性をカウン
トし、ＥＲＧ９遺伝子導入の有無で得られた放射活性を
比較した。その結果、得られた放射活性はＥＲＧ９遺伝
子導入の有無で差がなかった。

【００８２】

【実施例８】リガンドのスクリーニング実施例６で作製したＥＲＧ９発現２９３細胞を用いた。
ここではｐＥＲＧ９遺伝子導入２日後、種々の細胞濃度
で４００μｇ／ｍｌの濃度のネオマイシン（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｉｎ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ１８１１−０２３）を
含む培地に植え替えた。その後、２週間前後培養し増殖
した細胞をＥＲＧ９発現細胞とした。以上のように作成
した７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９発現細胞を用い
て、細胞増殖の測定を行った。リガンド候補物質として
は、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）投与ラット血清を
用いた。７週令のＷｉｓｔａｒラットを（株）日本生物
材料より購入した。サルモネラミネソタＲＥ５９５由来
ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社製）を日本薬局方生理食塩水に最
終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように懸濁した。懸濁液をソ
ニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ）でソニケートし、透明な
液とした。これを日本薬局方生理食塩水で１０倍に希釈
し、４００μｌ，尾静脈より投与した。投与後約２２時
間後のラットをエーテル麻酔し開腹して心臓より採血し
た。マイクロチューブ用遠心機（トミー精工、ＭＲＸ−
１５０型）で４℃，１３０００ｘｇで１５分間遠心し、
その上清を−２０℃で保存した。これを被検物質溶液と
した。

【００８３】９６穴マイクロプレート（コーニング：カ
タログ番号４３０２４７）にＥＲＧ９発現２９３細胞を
５ｘ１０³細胞／穴で播種した。これにＤ−ＭＥＭで被
検物質溶液を１０倍希釈して加え、終容量を２００μｌ
／穴とした。この状態で細胞を５％二酸化炭素、３７℃
で３日間培養した後、細胞増殖をＭＴＴ kit（ケミコン
社：CT-02）により測定した。その結果、ＬＰＳ投与ラ
ット血清の濃度に依存した細胞増殖が観察された。

【００８４】

【実施例９】リガンドと拮抗する物質のスクリーニングＥＲＧ９形質転換２９３細胞を用い形質転換体の細胞増
殖試験を行った。（ｉ）実施例８で作製したＥＲＧ９形
質転換２９３細胞に発現する７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＲＧ９と実施例８に示したＬＰＳ投与ラット血清をリ
ガンドとして用いて実施例８と同様に細胞増殖を測定し
た。さらに、（ｉｉ）実施例８の実験の際に培養液中に
最終濃度１００μＭのＮＥＣＡ（Ｎ−エチルカルボキシ
アミドアデノシン、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて実施例８
と同様に培養を行い細胞増殖を測定した。（ｉ），（ｉ
ｉ）を比較したが、両者に差はなかった。

【００８５】

【実施例１０】ＥＲＧ９蛋白質を認識する抗体の作成配列表配列番号１の３１０番目から３３８番目のペプチ
ドを合成した。その際、キャリアー蛋白質との結合反応
のためにＮ末端にシステイン残基を導入した。そして
Imject Activated Immunogen Conjugation Kit with KL
H and OVA（PIERCE社：７７１０７）を用いてＫＬＨ（K
eyhole limpet hemocianin）、ＯＶＡ（Ovalbumin）と
合成ペプチドをコンジュゲートし、免疫原とした（製造
者のプロトコール、p.3）。これをウサギに免疫し、抗
体価の測定後全血の採血を行い、血清を採取した。これ
をBioRad社製のエコノパック血清IgG精製キットを用い
て、添付の取扱説明書に従って、抗マウスＥＲＧ９蛋白
質ウサギポリクローナル抗体を精製して作製した。

【００８６】

【実施例１１】ヒトにおけるＥＲＧファミリーの検出実施例３でえられたＥＴ３３１,ＥＴ３３０，ＥＴ６４
の配列を用いてｎｒ−ｎｔデータベース（Ｇｅｎｏｍｅ
Ｎｅｔ、１９９８年６月１１日）をＢＬＡＳＴＮプログ
ラムを用いてサーチした。Ｐが１０^-6以下を有意な類似
と見なしたところ、ＥＴ３３１（配列表配列番号６）か
ら既知の遺伝子の他に、ヒトＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅ
ｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ）断片、エントリーＡＦ
００３８２８およびヒトゲノム遺伝子断片エントリーＢ
７４３４８が有意に類似していた。同様にＥＴ３３０
（配列表配列番号７）とヒトゲノム遺伝子断片エントリ
ーＢ７４３４８が、また、ＥＴ６４（配列表配列番号
８）とヒトＥＳＴ（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎ
ｃｅＴａｇ）断片、エントリーＡＦ００３８２８が類
似していた。従って、ヒトゲノム遺伝子断片エントリー
Ｂ７４３４８よりヒトゲノム遺伝子中にＥＲＧファミリ
ーに属する７回膜貫通型受容体の配列が少なくとも一つ
存在することが示された。また、ヒトＥＳＴ（Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ）断片、エント
リーＡＦ００３８２８により少なくとも一つのＥＲＧフ
ァミリーに属する７回膜貫通型受容体がヒト細胞に発現
していることが示された。

【００８７】

【実施例１２】ゲノミック・サザン・ハイブリダイゼー
ションによるヒトＥＲＧファミリーの検出サザンハイブリダイゼーションに用いるフィルターはＣ
ＬＯＮＴＥＣＨ社のＺＯＯ−ＢＬＯＴ（ｃａｔ＃７７５
３−１）を用いた。放射性同位元素³²Ｐにて標識され
たＥＲＧ９遺伝子プローブは以下のように作製した。す
なわち、実施例５で作製した発現ベクターからＥＲＧ９
遺伝子断片を制限酵素、ＥｃｏＲＩにて切り出し、０．
８％アガロース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウム
ブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で
観察し、約１０００ｂｐのバンドをゲルから切り出して
ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（フナコシ社製）を
用いて精製した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリン
グキット（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉ
ｎｇｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製コードＲＰ
Ｎ１６０７）を用いて標識した。すなわち、ＤＮＡ１０
０ｎｇにプライマー液１０μｌ、５×反応緩衝溶液２０
μｌ及び脱イオン水を加えて全量を８６μｌとして沸騰
水浴を５分間行い、その後、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（アマ
ーシャム社製、コードＡＡ０００５）１０μｌ，及び
Ｋｌｅｎｏｗ酵素溶液４μｌを加えて、３７℃で１０分
間水浴し、放射標識したＥＲＧ９断片を合成した。更に
その後、セファデックスカラム（ＱｕｉｃｋＳｐｉｎ
ＣｏｌｕｍｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０：独逸国
ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水
浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。

【００８８】ハイブリダイゼーションの方法はＺＯＯ−
ＢＬＯＴ添付のプロトコールに従った。一晩、ハイブリ
ダイゼーションを行った後、フィルターを０．１％ＳＤ
Ｓを含む、各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶
液に浸し、室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温で１
５分間洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スク
リーンを使用して、−８５℃でオートラジオグラフィー
を行った。その結果、マウスでは少なくとも１２本のバ
ンドが２kbから１０kbの長さの範囲で認められた。ま
た、ヒトでは、約１．８kbと３kb付近にバンドが認めら
れた。他に、ラット、イヌ、ウサギ、サル、ウシ、ニワ
トリ、酵母でもバンドが認められた。

【００８９】

【発明の効果】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲ
Ｇ９は、白血球やガン細胞を含む種々の細胞の増殖や機
能を制御する医薬品を検索することに使用が可能であ
る。

【００９０】

【配列表】 <110> Asahi Chemical Industry Co., Ltd. <120> ７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９ <130> X10-00792 <160> 10 <210> 1 <211> 338 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 1 Met Asp Leu Val Ile Gln Asp Trp Thr Ile Asn Ile Thr Ala Leu Lys 1 5 10 15 Glu Ser Asn Asp Asn Gly Ile Ser Phe Cys Glu Val Val Ser Arg Thr 20 25 30 Met Thr Phe Leu Ser Leu Ile Ile Ala Leu Val Gly Leu Val Gly Asn 35 40 45 Ala Thr Val Leu Trp Phe Leu Gly Phe Gln Met Ser Arg Asn Ala Phe 50 55 60 Ser Val Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Gly Ala Asp Phe Val Phe Met Cys 65 70 75 80 Phe Gln Ile Val His Cys Phe Tyr Ile Ile Leu Asp Ile Tyr Phe Ile 85 90 95 Pro Thr Glu Phe Phe Ser Ser Ser Thr Val Val Leu Asn Phe Ala Tyr 100 105 110 Leu Ser Gly Leu Ser Ile Leu Thr Val Ile Ser Thr Glu Arg Phe Leu 115 120 125 Ser Val Met Trp Pro Ile Trp Tyr Arg Cys Gln Arg Pro Arg His Thr 130 135 140 Ser Ala Val Ile Cys Thr Val Leu Trp Val Leu Ser Leu Val Leu Ser 145 150 155 160 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Cys Gly Phe Leu Tyr Tyr Thr Ser Gly Pro 165 170 175 Gly Leu Cys Lys Thr Phe Asp Leu Ile Thr Thr Val Trp Leu Ile Val 180 185 190 Leu Phe Val Val Leu Leu Gly Ser Ser Leu Ala Leu Val Leu Thr Ile 195 200 205 Phe Cys Gly Leu His Lys Val Pro Val Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile 210 215 220 Val Phe Thr Val Leu Val Phe Leu Ile Phe Gly Leu Pro Tyr Gly Ile 225 230 235 240 Tyr Trp Phe Leu Leu Glu Trp Ile Lys Glu Phe His Asp Asn Lys Pro 245 250 255 Cys Gly Phe Arg Asn Val Thr Val Phe Leu Ser Cys Ile Asn Ser Cys 260 265 270 Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Phe Leu Val Gly Ser Ile Arg His His Arg 275 280 285 Phe Gln Arg Lys Thr Leu Arg Leu Leu Leu Gln Arg Ala Met Gln Asp 290 295 300 Thr Pro Glu Glu Glu Glu Cys Gly Glu Met Gly Ser Ser Gly Arg Pro 305 310 315 320 Arg Glu Ile Lys Thr Val Trp Lys Gly Leu Arg Asp Ala Leu Ile Arg 325 330 335 His Lys

【００９１】 <210> 2 <211> 1017 <212> DNA <213> Mus Musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(1014) <400> 2 atg gac tta gtc atc caa gac tgg acc att aac att aca gca ctg aaa 48 Met Asp Leu Val Ile Gln Asp Trp Thr Ile Asn Ile Thr Ala Leu Lys 1 5 10 15 gaa agc aat gac aat gga ata tca ttt tgt gaa gtt gtg tct cgt acc 96 Glu Ser Asn Asp Asn Gly Ile Ser Phe Cys Glu Val Val Ser Arg Thr 20 25 30 atg act ttt ctt tcc ctc atc att gcc tta gtt ggg ctg gtt gga aat 144 Met Thr Phe Leu Ser Leu Ile Ile Ala Leu Val Gly Leu Val Gly Asn 35 40 45 gcc aca gtg tta tgg ttt ctg ggc ttc cag atg agc agg aat gcc ttc 192 Ala Thr Val Leu Trp Phe Leu Gly Phe Gln Met Ser Arg Asn Ala Phe 50 55 60 tct gtc tac atc ctc aac ctt gct ggt gct gac ttt gtc ttc atg tgc 240 Ser Val Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Gly Ala Asp Phe Val Phe Met Cys 65 70 75 80 ttt caa att gta cat tgt ttt tat att atc tta gac atc tac ttc atc 288 Phe Gln Ile Val His Cys Phe Tyr Ile Ile Leu Asp Ile Tyr Phe Ile 85 90 95 ccc act gaa ttt ttt tca tct tcc act gtg gtg tta aac ttt gct tac 336 Pro Thr Glu Phe Phe Ser Ser Ser Thr Val Val Leu Asn Phe Ala Tyr 100 105 110 ctt agt ggt ctg agc atc ctc act gtc att agc act gaa cgc ttc cta 384 Leu Ser Gly Leu Ser Ile Leu Thr Val Ile Ser Thr Glu Arg Phe Leu 115 120 125 tct gtc atg tgg ccc atc tgg tac cgc tgc caa cgc cca agg cac aca 432 Ser Val Met Trp Pro Ile Trp Tyr Arg Cys Gln Arg Pro Arg His Thr 130 135 140 tca gct gtc ata tgt acc gtg ctt tgg gtc ttg tcc ctg gtg ttg agc 480 Ser Ala Val Ile Cys Thr Val Leu Trp Val Leu Ser Leu Val Leu Ser 145 150 155 160 ctc ctg gaa gga aag gaa tgt ggc ttc cta tat tac act agt ggc cct 528 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Cys Gly Phe Leu Tyr Tyr Thr Ser Gly Pro 165 170 175 ggt ttg tgt aag aca ttt gat tta atc act act gta tgg tta att gtt 576 Gly Leu Cys Lys Thr Phe Asp Leu Ile Thr Thr Val Trp Leu Ile Val 180 185 190 tta ttt gtg gtt ctc ttg gga tcc agt ctg gcc ttg gtg ctt acc atc 624 Leu Phe Val Val Leu Leu Gly Ser Ser Leu Ala Leu Val Leu Thr Ile 195 200 205 ttc tgt ggc tta cac aag gtt cct gtg acc agg ttg tat gtg acc att 672 Phe Cys Gly Leu His Lys Val Pro Val Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile 210 215 220 gtg ttt aca gtg ctt gtc ttc ctg atc ttt ggt ctg ccc tat ggg atc 720 Val Phe Thr Val Leu Val Phe Leu Ile Phe Gly Leu Pro Tyr Gly Ile 225 230 235 240 tac tgg ttc ctc tta gag tgg att aag gaa ttt cat gat aat aaa cct 768 Tyr Trp Phe Leu Leu Glu Trp Ile Lys Glu Phe His Asp Asn Lys Pro 245 250 255 tgt ggt ttt cgt aac gtg aca gta ttt ctg tcc tgt att aac agc tgt 816 Cys Gly Phe Arg Asn Val Thr Val Phe Leu Ser Cys Ile Asn Ser Cys 260 265 270 gcc aac ccc atc att tac ttc ctt gtt ggc tcc att agg cac cat cgg 864 Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Phe Leu Val Gly Ser Ile Arg His His Arg 275 280 285 ttt caa cgg aag act ctc agg ctt ctt ctg cag aga gcc atg caa gac 912 Phe Gln Arg Lys Thr Leu Arg Leu Leu Leu Gln Arg Ala Met Gln Asp 290 295 300 act cct gag gag gaa gaa tgt gga gag atg ggt tcc tca gga aga cct 960 Thr Pro Glu Glu Glu Glu Cys Gly Glu Met Gly Ser Ser Gly Arg Pro 305 310 315 320 aga gaa ata aaa act gtc tgg aag gga ctg aga gat gct ttg atc agg 1008 Arg Glu Ile Lys Thr Val Trp Lys Gly Leu Arg Asp Ala Leu Ile Arg 325 330 335 cat aaa tag 1017 His Lys

【００９２】 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> マウスにおいてＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）の発症を誘導するモルモット由来 myelin basic protein の部分ペプチド。 <400> 3 Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> １８、２２、２４残基めのｎはイノシン/ｉを示す。メラノーマの増殖に関与していると考えられる既知の７回膜貫通型受容体蛋白質の配列をもとにデザインしたdegenerativeＰＣＲ法のためのプライマー。 <400> 4 atcttaagct tgaacctngc cntngcdgac 30 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ２２、２８残基めのｎはイノシン/ｉを示す。２１残基めのｎはＡまたはＧまたはＣまたはＴを示す。メラノーマの増殖に関与していると考えられる既知の７回膜貫通型受容体蛋白質の配列をもとにデザインしたdegenerativeＰＣＲ法のためのプライマー。 <400> 5 cccaacgaat tcrtagatsa nnggrttnav rca 33

【００９３】 <210> 6 <211> 654 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 6 atcttaagct tgaacctggc cgtggcagac ttcttctatc tgctctgtca catcataaat 60 tccataatgt ttcttctcaa ggttccctca cccaacatta tcttggacca ttgcttttac 120 accatcatga tagttctcta catcacaggc ctgagcatgc tcagcgccat cagcactgag 180 cgctgcctgt ctgtcctgtg ccccatctgg tatcgctgcc accgtccaga acacacatca 240 actgtcatgt gtgctgtgat ctgggtaatg tccctgttga tctctattct caatggatat 300 ttctgtaatt tctctagtcc caaatatgta aataactctg tgtgtcaggc atcagacatc 360 tttatcagaa catacccaat atttttgttt gtactcctct gtctgtccac ccttgctctg 420 ctggccaggt tgttctctgg tgctgggaag aggaaattta ccagattatt cgtgaccatc 480 atgctggcca ttttggtttt tcttctctgt gggttacccc tgggcttctt ctggtttctg 540 tcaccctgga ttgaggatcg tttcattgta ctagattata gacttttttt tgcatcagtt 600 gtcctaactg ttgttaacag ctgcgtcaac cccatcatct acgaattcgt tggg 654 <210> 7 <211> 654 <212> DNA <213> Mus Musculus

【００９４】 <400> 7 atcttaagct tgaacctggc cgtggctgac ttcctcttcc ttctctgtca catcatcagt 60 tccacaatgc ttcttctcaa ggttctccga cccaactgga tcttgtccct ttgctttaac 120 accatcagaa cggttctcta catcacaggc ctgagcatgc tcagcgccat cagcactgag 180 cgctgcctgt ctgtcctgtg ccccatctgg taatgatgcc gtcgccgaga aaacacatca 240 gctgccatgt gtgctgtgat ctgggtcctg tccctgttga tctgcattct gaatagatat 300 ttctgttatt tctctggtcc caaatatgta aatgactctg tgtgtctggt atctatattc 360 ttcattagaa catacccaat gtttttgttt gtcatcctct gtctgtccac actgactctg 420 atggccaggt tgttctgtgg tgctgggaag aggaaattta cccgattatt cgtgaccatc 480 atactgaccg ttttggtttt tcttctgtgt ggtttgcccc tggcattcta ctggttcctg 540 ttatactgga ttaaaggtag tttcagtgta ctacgtaata gactttttca ggcatcactt 600 gtcctaactg ctattaacag ctgcgtcaac cccatgatct acgaattcgt tggg 654 <210> 8 <211> 654 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 8 atcttaagct tgaacctggc cgtggctgac ttcctcttcc ttctctgcca catcataaat 60 tccacagtac ttcttctcaa ggttccccta cccaactgga tcttgttcca ttgctttaac 120 accatcagaa ttgttcttta catcacaggc ctgaacatgc tcagtgccat caacatggag 180 cactgcctgt ctgtcctgtg ccccatctgg tatcactgct gccgcccaga acacacatca 240 actgtcatgt gtgctgtgat ctgggtcctg tccctgttga tctgcattct gaatgaatat 300 ttctgtgatt tctttggtac caaattggta aattactatg tgtgtctggc atcgaacttc 360 tttatgggag catacctgtt gtttctgttt gtagtcctct gtctgtccac cctggctctg 420 ctggccaggt tgttctgtgg tgctgggaat acgaaattta ccagatttca catgaccatc 480 ttgctgaccc ctttgttctt tctcctctgc gggttgccct ttgccatcta atgcttcctg 540 ttattcaaga ttaaggatga tttccatgta ttttatatta acctttttct agcattagaa 600 gtcctgactt ctattaacag ctgtctcaac cccgtgatct acgaattcgt tggg 654

【００９５】 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ＥＲＧ９の発現ベクターを構築する際の遺伝子増幅に用いた化学合成プライマー。配列表配列番号２のＤＮＡ配列の１番目のＡから２１番目のＣの２１塩基配列の５’末端に塩基Ｇおよび制限酵素ＥｃｏＲＩの酵素配列ＧＡＡＴＴＣとスペーサー配列ＣＡＣＣとを加えたもの。 <400> 9 ggaattccac catggactta gtcatccaag ac 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ＥＲＧ９の発現ベクターを構築する際の遺伝子増幅に用いた化学合成プライマー。配列表配列番号２のＤＮＡ配列の９９４番目のＧから１０１７番目のＧの２４塩基配列の相補的配列の５’末端に塩基Ｇおよび制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列ＧＡＡＴＴＣを加えたもの。 <400> 10 ggaattccta tttatgcctg atcaaagcat c 31

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA63 CA04 CA09 CA12 CA20 DA03 DA06 EA03 EA04 GA11 GA18 GA19 HA13 HA14 4B065 AA92Y AA93X AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 BB01 BC01 BC03 BC07 BD01 BD15 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA50 EA28 EA50 FA71 FA72 FA73 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表配列番号１で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＲＧ９またはその塩。
【請求項２】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＲＧ９の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項３】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＲＧ９をコードする塩基配列を有する核酸を含有す
る核酸。
【請求項４】配列表配列番号２で表される塩基配列を
有する請求項３記載の核酸。
【請求項５】配列表配列番号２で表される塩基配列の
うち少なくとも一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒか
ら１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上の
核酸、及びその誘導体。
【請求項６】配列表配列番号２で表される塩基配列に
相補的な配列のうち少なくとも一部の遺伝子配列を有す
る１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２
０ｍｅｒ以上の核酸、及びその誘導体。
【請求項７】請求項４記載の核酸を含有するベクタ
ー。
【請求項８】請求項７記載のベクターを保持する７回
膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９発現形質転換体。
【請求項９】請求項８記載の形質転換体を培養し、形
質転換体の細胞膜に７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９
を生成せしめることを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＲＧ９またはその塩の製造方法。
【請求項１０】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＲＧ９もしくはその塩または請求項２記載の部分
ペプチドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させる
ことを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ９に
対するリガンドの決定方法。
【請求項１１】（ｉ）請求項１記載の７回膜貫通型受
容体蛋白質ＥＲＧ９もしくはその塩または請求項２記載
の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させ
た場合と（ｉｉ）請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＲＧ９もしくはその塩または請求項２記載の部分
ペプチドもしくはその塩に、リガンドおよび試験化合物
を接触させた場合との比較を行うことを特徴とするリガ
ンドと請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＲＧ
９との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法。
【請求項１２】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＲＧ９もしくはその塩または請求項２記載の部分
ペプチドもしくはその塩に対する抗体。