JP2002241399A

JP2002241399A - ７回膜貫通型受容体蛋白質ｅｔ２４０

Info

Publication number: JP2002241399A
Application number: JP35453797A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Ishimaru; 弘石丸; Takeshi Ono; 剛大野; Takehiro Koshio; 岳弘小塩
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 2002-08-28
Also published as: AU1688899A; WO1999033876A1

Abstract

(57)【要約】【課題】新規の７回膜貫通型受容体蛋白質、またその
蛋白質をコードするｃＤＮＡ、その蛋白質の発現系、さ
らにその蛋白質の抗体を提供する。【解決手段】ＥＡＥ発症性自己反応性Ｔ細胞４Ｒ３１
２株より、本発明のマウス由来７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０のｃＤＮＡ断片を取得した。さらにヒト由
来７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０ｃＤＮＡコード
領域全長を取得し、そのコードする新規蛋白質の発現系
を作成して、その蛋白質の抗体を作成する。【効果】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４
０は、白血球の機能を制御する医薬品を検索することに
使用が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、白血球に発現する
ヒトおよびマウス由来の新規な７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０，またはその塩に関する。また、本発明
は、前記のヒトおよびマウス由来の７回膜貫通型受容体
蛋白質ＥＴ２４０，それをコードする核酸あるいはその
誘導体に関する。

【０００２】さらに、本発明は、この核酸を用いて遺伝
子操作によりヒトおよびマウス由来の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＴ２４０を発現させる７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＴ２４０の製造方法、及びそれに使用される発現
ベクター及び形質転換体に関する。また、さらに本発明
は、ヒトおよびマウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＴ２４０を用いて、この蛋白質に対するリガンドを決
定する方法、この蛋白質との結合を阻害する化合物をス
クリーニングする方法あるいはこの蛋白質に対する抗体
に関する。

【０００３】本発明では、ヒトおよびマウス由来の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を用いて白血球の機能
を制御する医薬品を開発することができる。

【０００４】

【従来の技術】白血球は血液細胞の一種であり、免疫・
炎症の種々の機能を司る。特に、感染の際には、種々の
有益な免疫・炎症反応のメカニズムによって、生体を防
御する（麻生芳郎訳、一目でわかる免疫学、メティガ
ル・サイエンス・インターナショナル発行、４８−６
１，１９９３年）。しかし、その一方で自己免疫など望
ましくない免疫・炎症作用をも引き起こす（麻生芳郎
訳、一目でわかる免疫学、メディカル・サイエンス・イ
ンターナショナル発行、６２-７３,１９９３年）。従っ
て、白血球の機能を制御する方法を得ることによって、
有益な免疫応答を引き起こし、感染や腫瘍の治癒をもた
らしたり、あるいは有害な免疫応答を減退させることに
より、自己免疫性疾患などを治療したりすることが可能
になると予想される。

【０００５】白血球の機能、すなわち、その増殖、分
化、活性化、化学遊走等は白血球に発現している様々な
受容体蛋白質によって制御されている。受容体とは、細
胞表面に存在し、他の細胞の表面や体液中に存在するシ
グナル分子と高い親和性で結合し、そしてその結合とい
う細胞外の出来事を細胞内シグナルに変換して細胞の応
答を引き起こすものである（中村桂子・松原健一監修、
細胞の分子生物学（第２版）、教育社、９３６，１９
９０年）。

【０００６】従って、これらの受容体の機能を変化させ
るもの、すなわちその受容体と結合して刺激するもの
や、受容体と結合して刺激を遮るもの、その刺激が細胞
内に伝達されることを阻害するものを得ることができれ
ば、白血球の機能を正や負に制御し、さらには、白血球
の機能の不足や過剰に起因する疾患の治療に役立つ物質
を得られることが予想される。

【０００７】白血球の受容体としては、サイトカイン受
容体ファミリー、ＥＧＦ（ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏ
ｗｔｈＦａｃｔｏｒ）受容体ファミリー、７回膜貫通
型受容体ファミリーなど種々の受容体蛋白質が知られて
おり（ＴｈｅＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ
ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，アカデミックプレス、３８−４
９，１９９３年）、その機能は多岐にわたっている。

【０００８】７回膜貫通型受容体蛋白質ファミリーは、
このような受容体ファミリーの一つであり、Ｇ蛋白質共
役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ）、ロドプシン型受容体などとも呼ばれ
る。白血球における７回膜貫通型受容体蛋白質の研究は
比較的新しく開始されており、いまだ数多くの未知の７
回膜貫通型受容体蛋白質が存在すると考えられている。

【０００９】現在までに白血球に存在する７回膜貫通型
受容体蛋白質として同定されたものとしては、アナフィ
ラトキシンと結合する受容体群、ケモカインと結合する
受容体群、ＰＡＦ（血小板活性化因子）と結合する受容
体などがある。例えば、アナフィラトキシンの受容体
は、好中球やマクロファージの機能、例えば、活性酸素
の産生、化学遊走、細胞接着の活性化に関与している
（Ｂｏｕｌｅｙ，Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３０，２９９３−２９９９，１９９１年）。ケモカイン
と結合する受容体群の一つ、マウスのＩＬ―８（インタ
ーロイキン８）受容体ホモログの欠損マウスでは、炎症
誘導物質の腹腔内投与による好中球浸潤が減少したと同
時に好中球増加症、骨髄やリンパ節での顆粒球、形質細
胞の増加が観察された（飯笹久、松島綱治、臨床免疫、
２８，７３１−７３７，１９９６年）。従って、これら
の７回膜貫通型受容体蛋白質は、白血球の増殖、分化、
活性化、化学遊走等を制御している。

【００１０】これらの受容体に作用する化合物のうち、
疾患の治療剤として可能性があると考えられているもの
の中には、ＩＬ−８，ＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ
ＣｈｅｍｏｔａｃｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎ１）のよう
に受容体に結合して刺激するものや、ＩＬ―８変異体の
ように受容体と結合して刺激を遮るものがある（Ｈｏｗ
ａｒｄ，Ｏ．Ｍ．Ｚ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ，１４，４６
−５１，１９９６年）。

【００１１】７回膜貫通型受容体においては、多くの場
合、受容体とシグナル分子の関係は１対１対応に対応し
ているのではない。従って、疾患の治療を考えた場合に
はシグナル分子を知ることだけでは不十分である。例え
ば、セロトニンの場合には、セロトニンという単一のシ
グナル分子に対し、イオンチャンネル型受容体という全
く異なるシグナル伝達経路の受容体を含む１４種の受容
体が知られており、さらに、個々の受容体に特異的に結
合する化合物も知られており（１９９６Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ＆ＩｏｎＣｈａｎｎｅｌＮｏｍｅｎｃｌａ
ｔｕｒｅＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ＴｒｅｎｄｓＰ
ｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、１９９６年）、それぞれ
異なる疾患の治療への応用も考えられている。また、ケ
モカイン群の場合には、単一のシグナル分子が多数の受
容体と反応すると同時に、単一の受容体が多数のシグナ
ル分子と反応する例も多く知られている（Ｃ．Ａ．Ｐｏ
ｗｅｒら、ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃ
ｉ．１７，２０９−２１３，１９９６年）。

【００１２】従って、仮に単一のシグナル分子が疾患の
原因であるとしても、細胞の種類によって異なる受容体
が場合によっては複数存在し、疾患の原因である特定の
細胞群の機能を特異的に制御する場合には、その細胞に
作用するシグナル分子の特定よりもその細胞に発現して
いる受容体を特定することが重要となる。例えば、白血
球に作用するシグナル分子群ケモカイン群の場合、シグ
ナル分子ＲＡＮＴＥＳ（ＲｅｇｕｌａｔｅｄｏｎＡ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ＮｏｒｍａｌＴｃｅｌｌｅ
ｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｓｅｃｒｅｔｅｄ）に対し
ては種々の白血球が反応するが、好酸球にはケモカイン
受容体の一つＣＣＲ３が特異的に発現しており、好酸球
を特異的に制御する方法を検索する際には受容体ＣＣＲ
３が必要となる（Ｈｏｗａｒｄ，Ｏ．Ｍ．Ｚ．ら、ＴＩ
ＢＴＥＣＨ，１４，４６−５１，１９９６年）。

【００１３】また、ヒトとその他の種の受容体では同一
の化合物に対する反応が異なることも知られており（例
えば、ＭａｒｌｅａｕＳ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５７，４１４１−４１４６（１９９６））、ヒ
トの受容体に対して活性化の作用をもつものが他の種の
受容体に対し、活性化を阻害するものとして働く例も知
られている。従って、ヒトに対する医薬品を開発するた
めには、ヒト由来の受容体を得ることが必要である。

【００１４】さらに、これらの受容体の中にはウィルス
の感染の際の受容体として働くものがあることが知られ
ており（たとえば、ＣｈｏｅＨ．ら、Ｃｅｌｌ８
５，１１３５−１１４８，１９９６年）、これらの受
容体に結合する分子がウィルスの感染を防ぐことも知ら
れている（たとえば、ＢｌｅｕｌＣ．Ｃ．ら、Ｎａ
ｔｕｒｅ，３８２，８２９−８３３，１９９６年
）。こういった場合にも、ウィルスの感染する細胞に
発現する受容体を知ることが肝要となる。また、これら
の場合にも、特定のウィルスが感染するためには、特定
の種の受容体が必要であることも知られている。従っ
て、この場合にもヒトに対する医薬品を開発するために
は、ヒト由来の受容体を得ることが必要である。

【００１５】また、実験動物としては、様々な技術がマ
ウスにおいてもっとも進んでおり、マウスの遺伝子の一
部が得られれば、マウスのゲノム遺伝子の取得が容易に
なり、それらの技術、例えば、トランスジェニックマウ
ス、ジーンターゲッティングマウスなどの技術を利用で
きるようになる。さらに、マウスのゲノム上の遺伝子を
ヒト遺伝子に置き換えた実験用のマウスを作製すること
もできる。

【００１６】現在に至るまで、白血球に作用するシグナ
ル分子のうち、例えば既知のケモカインのうちＰＦ４，
ＨＣＣ１などの受容体については７回膜貫通型受容体蛋
白質であると推定されているものの、受容体タンパク質
は同定されていない（ＰｒｅｍａｃｋＢ．Ａ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２，１１７４−１１７
８，１９９６年；ＬｏｅｔｓｃｈｅｒＭ．ら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．８４，９６３−９６９，１９９６年）。
特にケモカイン群については、さらに多くの新規ケモカ
インが存在すると推定されており（Ｈｏｗａｒｄ，Ｏ．
Ｍ．Ｚ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ，１４，４６−５１，１９
９６年）、さらに未知のケモカインに対する多くの受容
体が存在することが期待される。以上のように、白血球
に作用する分子の受容体はすべて理解されたわけではな
く、白血球にはさらに多くの７回膜貫通型受容体蛋白質
が存在し、かつ、それらの受容体の作用を変化させるも
のを得ることによって、白血球の機能を制御し、ひいて
は、疾患を制御する方法が得られると期待される。

【００１７】一方、慢性関節リューマチおよび多発性硬
化症などの自己免疫疾患は、全身または臓器特異的な難
治性の慢性炎症を特徴としている。現在の治療に用いら
れている医薬品は、治療効果が低い、または治療効果が
高くても副作用が強い等の種々の不十分なところが指摘
されている。これらの問題を解決するためには、自己免
疫疾患の発症機序を明らかにし、その機序のみを特異的
に阻害する薬剤が必要である。自己免疫疾患の発症機序
には後天的な免疫異常以外にも遺伝的な素因や感染等の
関与も考えられ、未だに詳細は明らかにされていない。
しかし、近年、自己免疫性疾患の慢性炎症の誘導および
悪化に細胞性免疫が関与していることが動物モデルから
明らかにされている。そして、その発症は、白血球の一
種、自己反応性Ｔ細胞が抗原提示細胞上の自己抗原と反
応し、この反応が引き金となってサイトカイン、ケモカ
インの分泌やそれに対する細胞の遊走その他の反応のカ
スケードが動き始め、さらに多くの自己反応性Ｔ細胞や
白血球の別の１種、単核球の浸潤を伴う炎症が形成され
るためと考えられている。従って、この自己反応性Ｔ細
胞の活性化を抑制することは、続いて生じる様々な反応
を抑制し、自己免疫性疾患の治療につながると考えられ
る。

【００１８】多発性硬化症は中枢神経系の自己免疫疾患
であり、その病態モデルであるマウスの実験的アレルギ
ー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）はその発症機序の解析がもっと
も進んでいる病態モデルである。この疾患モデルは、神
経髄鞘に存在するミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）やプ
ロテオリピッドアポ蛋白質に反応する自己反応性Ｔ細胞
により誘導されることが知られており、そのＴ細胞をク
ローン化したものもいくつかの研究機関で樹立されてい
る（例えば、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．５
８，１６７−１７６（１９９５））。しかし、これ
らの細胞の機能を制御している受容体、特に７回膜貫通
型受容体蛋白質についてはこれまで報告されていない。
従って、白血球、特に自己反応性Ｔ細胞に作用する分子
とその受容体はすべて理解されたわけではなく、自己反
応性Ｔ細胞にも今まで知られていない７回膜貫通型受容
体蛋白質が存在し、かつ、それらの受容体の作用を変化
させるものを得ることによって、自己反応性Ｔ細胞の機
能を制御し、ひいては、自己免疫性疾患を制御する方法
が得られると期待される。

【００１９】７回膜貫通型受容体蛋白質に作用する内因
性の物質は様々な受容体に対し様々な物質が知られてい
る。例えば、生理アミンであるグルタミン酸、ドーパミ
ンはそれぞれグルタミン酸受容体群、ドーパミン受容体
群に結合する。また、ペプチドである神経ペプチドＹ，
エンドセリンはそれぞれ神経ペプチドＹ受容体群、エン
ドセリン受容体群に結合する（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．およ
びＳｔｅｖｅＡｒｋｉｎｓｔａｌｌ著、ＴｈｅＧ−
ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｎｋｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒＦ
ａｃｔｓＢｏｏｋ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．、１９９４年）。これらの中には、ケモカイン
群、ＰＡＦのように白血球に作用することが知られてい
るものとそうでないものがある。

【００２０】これらの７回膜貫通型受容体蛋白質を活性
化する物質は、天然・非天然を問わず、その物質と７回
膜貫通型受容体蛋白質、受容体を発現している細胞の３
者に依存して様々な細胞内シグナル分子の変動を引き起
こす。そのシグナル分子の変動は、例えば、細胞内ｃＡ
ＭＰ濃度の上昇・下降、イノシトールリン酸濃度の上
昇、細胞内カルシウム濃度の上昇、といった反応があり
（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．およびＳｔｅｖｅＡｒｋｉｎｓ
ｔａｌｌ著、ＴｈｅＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｎｋｅ
ｄｒｅｃｅｐｔｏｒＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，１９９４年）、そ
のそれぞれを測定する方法も開発されている。従って、
これらの反応を測定することにより、特定の物質が特定
の７回膜貫通型受容体蛋白質を活性化するかどうかある
いはその活性化を妨げるかどうかを判断する事ができ
る。このような物質が７回膜貫通型受容体蛋白質と結合
して生じる、増殖・遺伝子発現の変動・化学遊走などの
生理学的な現象を観察する方法も知られており、同じ
く、特定の物質が特定の７回膜貫通型受容体蛋白質を活
性化するかどうかあるいはその活性化を妨げるかどうか
を判断することができる。

【００２１】このように７回膜貫通型受容体蛋白質に作
用する物質の同定方法としては種々の方法が知られてお
り、これらの方法を利用するためには、７回膜貫通型受
容体蛋白質を同定すること、特にヒトの医薬品として有
用な物質を得るためにはヒト由来の７回膜貫通型受容体
を取得するこが肝要である。こういった考察に基づく
と、白血球、特に自己反応性Ｔ細胞の機能を制御し、疾
患の制御を行うためには、これまで知られていない７回
膜貫通型受容体を取得すること、特にヒトの医薬品とし
て有用な物質を得るためにはヒト由来の７回膜貫通型受
容体を取得することが大きな課題である。

【００２２】一方、ウシの７回膜貫通型受容体ＰＰＲ１
は、ウシの舌由来の受容体として報告されており、神経
ペプチドの受容体である可能性が論議され、肺での強い
発現が報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９４，５０４−５
１１（１９９３））ものの、白血球での発現はこれ
まで報告されていない。また、この受容体の自己免疫性
疾患、特に多発性硬化症やそのモデルであるＥＡＥにお
ける役割については全く知られていない。従って、ＰＰ
Ｒ１が、疾患を制御する可能性については全く知られて
いない。すなわち、ＰＰＲ１が、白血球、特に自己反応
性Ｔ細胞の機能を制御し、ひいては疾患の制御をする可
能性については全く知られていない。

【００２３】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、白血
球、特に自己反応性Ｔ細胞の機能を制御し、疾患をコン
トロールする手法はいまだ完成されていない。その最大
の原因は、疾患と関連した白血球の機能を制御している
受容体蛋白質、特に７回膜貫通型受容体蛋白質が同定さ
れていない点にある。本発明の課題は、新規な７回膜貫
通型受容体蛋白質、またその蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａ，その蛋白質の発現系、この蛋白質の応用、さらにそ
の蛋白質の抗体を提供することにある。

【００２４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、白血球に
新規７回膜貫通型受容体が存在することを予想し、これ
らが白血球の機能を制御する医薬品の探索に役立つと考
えた。そこで実際に白血球に発現している新規な７回膜
貫通型受容体蛋白質ｃＤＮＡを取得するために、Ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｉｓｐｌａｙ法（例えば、Ｌｉ
ａｎｇ，Ｐ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７，２７４−２
８０，１９９５年）、ＲＤＡ法（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，
Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９，９４６−９５１，
１９９３年）、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＰＣＲ法
（ＩｎｎｉｓＭ．Ａ．ら、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ，ｐｐ３９−５３，１９９０年）など種々の方法
を、種々のヒト組織、白血球、白血病細胞株などを材料
に検討した。特にｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＰＣＲ法
については、実施例３に示すプライマーを一例とする２
０種以上のプライマーを試験した。さらにＥＡＥ発症性
自己反応性マウスＴ細胞４Ｒ３１２株を実際に作製し、
種々の条件で培養し、そのＲＮＡを材料として遺伝子取
得を試みた。このような鋭意努力の結果、ＥＡＥ発症性
自己反応性Ｔ細胞４Ｒ３１２株より、マウス由来の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のｃＤＮＡ断片を取得
した。そののち、公知のデータベースから、これに類似
した２つのマウス由来のｃＤＮＡ断片を発見し、マウス
ゲノムＤＮＡおよびマウスｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ
（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏ
ｎ）により、これらのｃＤＮＡ断片とマウス由来のＥＴ
２４０遺伝子断片が同一の遺伝子をコードしていること
を確認し、そのｃＤＮＡ配列をアミノ酸に翻訳すること
により、マウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２
４０のペプチド断片のアミノ酸配列を得た。さらに、公
知のデータベースから、これらに類似した２つの独立し
たヒト由来のｃＤＮＡ断片を発見した。この２者の配列
に基づいてゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、配
列決定を行ったところ、意外なことにこの２つの断片は
一つの遺伝子の重ならない領域をコードしていたことが
判明し、マウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２
４０のｃＤＮＡ断片と強く類似していることがわかっ
た。そこでこの断片の配列を用いて、さらにこれまで知
られていなかったヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＴ２４０のｃＤＮＡコード領域全長を取得し、そのコ
ードする新規蛋白質の発現系を作成し、さらにその抗体
を作成することにより、本発明を完成した。

【００２５】すなわち、本発明は配列表配列番号１およ
び２に記載のアミノ酸配列を含有するヒトおよびマウス
由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０に関する。
また、配列表配列番号１および２に記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードする核酸、これら核酸
群の中から選ばれる核酸と、宿主細胞中で発現可能なべ
クター核酸とを連結してなる組み換えＤＮＡ体ベクタ
ー、これら組み換えＤＮＡ体ベクターにより形質転換さ
れたヒトおよびマウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＴ２４０発現細胞、これらの細胞を培養し培養細胞か
ら生産された化合物を採取する配列表配列番号1および
２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（ヒト
およびマウス由来の7回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４
０）の製造方法に関する。また、本発明は、このヒトお
よびマウス由来の7回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０
に対するリガンドのスクリーニング方法に関する。

【００２６】さらに、本発明は、このヒト由来の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を特異的に認識する抗体
に関する。本発明のヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０のアミノ酸配列を、配列表配列番号１に示
し、それをコードする天然のＤＮＡ配列を配列表配列番
号３に示した。本発明のマウス由来の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＴ２４０のアミノ酸配列の一部を、配列表配
列番号２に示し、それをコードする天然のＤＮＡ配列を
配列表配列番号４に示した。

【００２７】これらの配列をデータベース（ＧｅｎＢａ
ｎｋリリース１００．０，Ａｐｒｉｌ，１９９７年）で
比較したところ、これらは新規な配列であった。また、
特許配列データベースＤＧＥＮＥ（Ｄｅｒｗｅｎｔ
ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＬｔｄ．，９７１１３０Ｕ
Ｐ）で比較したところ、これらは新規な配列であった。
また該ヒト由来７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０発
現細胞を免疫原としてヒト由来７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０に対する抗体（抗体を含有する抗血清も含
む）を作製し、この７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４
０の精製法を確立し、本発明を完成した。

【００２８】以下、本発明を詳細に説明する。配列表に
おいて、配列番号１のアミノ酸配列は、本発明のヒト由
来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のアミノ酸配
列である。また、配列番号２のアミノ酸配列は、本発明
のマウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の
一部のアミノ酸配列である。

【００２９】また、配列番号３の配列は本発明のヒト由
来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の全アミノ酸
配列及びそれをコードしているｃＤＮＡ配列である。ま
た、配列番号４の配列は本発明のマウス由来の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の一部のアミノ酸配列及び
それをコードしているｃＤＮＡ配列である。配列表配列
番号５および６は、白血球に発現している既知の７回膜
貫通型受容体蛋白質の配列よりデザインしたｄｅｇｅｎ
ｅｒａｔｉｖｅＰＣＲ法のためのプライマーの配列で
ある。

【００３０】配列表配列番号７および８は、公知のデー
タベースＧｅｎＢａｎｋのエントリーＨ６７２２４、Ａ
Ａ２１５５７７をもとに設計したサブクローニング用の
プライマーである。配列表配列番号９および１２は、公
知のベクターλＴｒｉｐｌＥｘのアームの配列をもとに
設計したサブクローニング用のプライマーである。

【００３１】配列表配列番号１０および１１は公知のデ
ータベースＧｅｎＢａｎｋのエントリーＨ６７２２４の
相補鎖をもとに設計したサブクローニング用のプライマ
ーである。配列表配列番号１３および１４は公知のデー
タベースＧｅｎＢａｎｋのエントリーＡＡ２１５５７７
の配列をもとに設計したサブクローニング用のプライマ
ーである。

【００３２】配列表配列番号１５および１６は配列表配
列番号４の配列をもとに設計したサブクローニング用の
プライマーである。配列表配列番号１７および１８は配
列表配列番号３の配列をもとに設計したサブクローニン
グ用のプライマーである。配列表配列番号１９は実験的
アレルギー性脳脊髄炎を作製する際に用いたオリゴペプ
チドの配列である。

【００３３】なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の
左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下、Ｎ末とい
う）及びカルボキシル基末端（以下、Ｃ末という）であ
り、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及
び３’末端である。また、表に関しては、表１は本発明
の一つ、ヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４
０と既知の遺伝子をアミノ酸配列での相同性を比較した
ものである。Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ／ＤＢＶｅ
ｒ．３７．０（ＳｏｆｔｗａｒｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてＧｅｎＢａｎｋＣ
ＤＳ（Ｒｅｌ．１００Ａｐｒｉｌ１９９７；Ｐ
ｒｉｍａｔｅｓ，Ｒｏｄｅｎｔ，Ｍａｍｍａｌｓ，Ｖ
ｅｒｔｅｂｒａｔｅ，Ｐａｔｅｎｔのサブデータベー
ス）をサーチしたのち、上位１０種についてアミノ酸の
同一度を計算させた結果である。表２は本発明の一つ、
マウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０と既
知の遺伝子とをアミノ酸配列での相同性を比較したもの
である。Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ／ＤＢＶｅｒ．３
７．０（ＳｏｆｔｗａｒｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ
（Ｒｅｌ．１００Ａｐｒｉｌ１９９７；Ｐｒｉｍ
ａｔｅｓ，Ｒｏｄｅｎｔ，Ｍａｍｍａｌｓ，Ｖｅｒｔ
ｅｂｒａｔｅ，Ｐａｔｅｎｔのサブデータベース）を
サーチしたのち、上位１０種についてアミノ酸の同一度
を計算させた結果である。

【００３４】表３は本発明の一つ、ヒト由来の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＴ２４０と既知の遺伝子とをｃＤＮ
Ａ配列での相同性を比較したものである。Ｇｅｎｅｔ
ｙｘ−Ｍａｃ／ＤＢＶｅｒ．３７．０を用いてＧｅｎ
Ｂａｎｋ（リリース１００．０，Ａｐｒｉｌ，１９９７
年；Ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ｒｏｄｅｎｔ，Ｍａｍｍａ
ｌｓ，Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ，Ｐａｔｅｎｔのサブデ
ータベース）をサーチしたのち、上位１０種についてｃ
ＤＮＡ配列の同一度を計算した結果である。表４は本発
明の一つ、マウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ
２４０と既知の遺伝子とをｃＤＮＡ配列での相同性を比
較したものである。Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ／ＤＢ
Ｖｅｒ．３７．０を用いてＧｅｎＢａｎｋ（リリース１
００．０，Ａｐｒｉｌ，１９９７年；Ｐｒｉｍａｔｅ
ｓ，Ｒｏｄｅｎｔ，Ｍａｍｍａｌｓ，Ｖｅｒｔｅｂｒ
ａｔｅ，Ｐａｔｅｎｔのサブデータベース）をサーチ
したのち、上位１０種についてｃＤＮＡ配列の同一度を
計算した結果である。

【００３５】また、本発明で述べられる遺伝子操作に必
要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検
討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組
換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡ
ライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通
常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前
記の通常の実験書としては、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ，１９８９年、Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを挙げ
ることができる。

【００３６】本発明のポリペプチドの一つは、ヒト由来
であり、かつ、少なくとも配列表配列番号１のアミノ酸
配列からなるポリペプチドを有するが、自然界で生じる
ことが知られている生物種内変異、アレル変異等の突然
変異によって生じる改変体も、配列表配列番号１のポリ
ペプチドの性質を失わない限り配列表配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するものとして本発明の新規化合物に含まれる。また、
本発明のポリペプチドの他の一つは、マウス由来であ
り、かつ、少なくとも配列表配列番号２のアミノ酸配列
からなるポリペプチドを含むが、自然界で生じることが
知られている生物種内変異、アレル変異等の突然変異に
よって生じる改変体も、配列表配列番号２のポリペプチ
ドの性質を失わない限り配列表配列番号２で表されるア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するも
のとして本発明の新規化合物に含まれる。

【００３７】配列表配列番号１および２のアミノ酸配列
から予想されることとして、糖鎖が付加される部分があ
る。Ｎ−グリコシド結合の共通配列は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓ
ｅｒ／Ｔｈｒであることが知られているが、配列番号１
で６番目のＡｓｎ（Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ）が、それ
と同等な配列を有しＮ―グリコシド修飾を受けている可
能性がある。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン
のＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンま
たはスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これ
らの糖鎖が付加された蛋白質の方がポリペプチドそのも
のよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、ま
た強い生理活性を有していると考えられる。したがっ
て、配列番号１または２の配列を含有するポリペプチド
のアミノ酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
やＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−
グリコシドあるいはＯ−グリコシド結合してなるポリペ
プチドも本発明に含まれる。

【００３８】また、実施例３に示すように、本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のマウス由来の天然
のｃＤＮＡ断片は、マウスＥＡＥ発症性Ｔ細胞株４Ｒ３
１２より取得された。従って、本発明のマウス型７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のｍＲＮＡはＥＡＥ発症
性マウスＴ細胞に発現していることが示された。実施例
７に示したように本発明のマウス型７回膜貫通型受容体
蛋白質ＥＴ２４０の天然のｍＲＮＡはマウス組織、肺、
心、肝に強く発現していた。実施例９に示したようにマ
ウス組織、舌、腸管リンパ球にも検出された。さらに実
施例８に示したように本発明のヒト型７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＴ２４０の天然のｍＲＮＡは小腸、心臓に強
く発現していた。また、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＴ２４０のヒト由来のｃＤＮＡ断片は肺に由来す
るｃＤＮＡから取得された。以上の結果を総合すると、
本発明のマウス型、ヒト型の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＴ２４０の天然のｍＲＮＡは全身的に発現しているも
のの、特に粘膜系のリンパ球系白血球に発現しているも
のと推定された。ｍＲＮＡは、細胞内のメカニズムによ
り蛋白質へと翻訳されるので、これらの組織における本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の天然のｍ
ＲＮＡの検出は７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の
発現と同等と考えられる。

【００３９】なお、上記の結果から、マウス肺・心臓、
ヒト小腸・心臓などの組織を材料として用いても、それ
ぞれマウス由来、ヒト由来の本発明の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＴ２４０の天然のｃＤＮＡを取得することが
できる。これら配列表配列番号１および配列番号２で表
されるアミノ酸配列を含有するヒトおよびマウス由来の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０またはその塩は、
診断を目的とした抗体の作成や、治療を目的とした医薬
品の検索に有用である。マウスのＥＡＥ発症性Ｔ細胞に
発現していることから、例えば多発性硬化症を含む自己
免疫性疾患の診断や、多発性硬化症を含む自己免疫性疾
患の治療を目的とした医薬品の検索に特に有用であると
考えられる。また、粘膜系のリンパ球系白血球に発現し
ていることから、自己免疫性消化管疾患、例えば、クロ
ーン病、潰瘍性大腸炎の診断、治療を目的とした医薬品
の検索に特に有用であると考えられる。

【００４０】配列表配列番号１および配列番号２のアミ
ノ酸配列をデータベース（ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ（リ
リース１００．０，Ａｐｒｉｌ，１９９７年）、Ｓｗｉ
ｓｓＰｒｏｔ（リリース３４．０，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１
９９６年）で比較したところ、これらは新規な配列であ
った。また、この配列を特許データベース（ＤＧＥＮ
Ｅ、ＤｅｒｗｅｎｔＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＬｔ
ｄ．；９７１１３０ＵＰ）で比較したところ、これらは
新規な配列であった。配列番号１のアミノ酸配列をＫｙ
ｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ酸
配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結
果、本発明のヒト由来７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２
４０は細胞膜通過部分を７つ有する細胞膜蛋白質とし
て、細胞表面に発現されることが明らかとなった。配列
番号２のアミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ
の方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１
９８２）に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親水
性部分を解析したところ、ほぼ配列番号１の後半部分と
対応する疎水性部分、親水性部分が得られ、細胞膜通過
部分を７つ有する細胞膜蛋白質の一部（第２膜貫通部分
の途中からＣ末端部分）を構成するものと予測された。

【００４１】表１に本発明の蛋白質の一つ、ヒト由来の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０と上記データベー
スとの比較で類似度が高いとされた、これまで知られて
いる配列の類似度を示した。本発明の一つ、ヒト由来の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０は、既知のヒト由
来の７回膜貫通型受容体蛋白質と一致せず、新規なヒト
由来の７回膜貫通型受容体蛋白質であることが示され
た。

【００４２】

【表１】

【００４３】表２に本発明の蛋白質の一つ、マウス由来
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０と上記データベ
ースとの比較で類似度が高いとされた、これまで知られ
ている７回膜貫通型受容体蛋白質の配列の類似度を示し
た。本発明の一つ、マウス由来の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＴ２４０は、既知のマウス由来の７回膜貫通型受
容体蛋白質と一致せず、新規なマウス由来の７回膜貫通
型受容体蛋白質であることが示された。

【００４４】

【表２】

【００４５】既知のウシ由来の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＰＰＲ１が本発明のヒトおよびマウス由来の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の両者と強い相同性を示し
たが、その類似度はそれぞれ８６％、８４％であり、同
一ではなかった。従って、本発明のヒトおよびマウス由
来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０は物質として
新規な蛋白質であった。

【００４６】なお、これらのサーチ（表１、表２）で類
似度が高いとされた蛋白質はすべて７回膜貫通型受容体
であり、このことからも本発明のヒトおよびマウス由来
の蛋白質ＥＴ２４０が７回膜貫通型受容体に属する蛋白
質であることが示された。これらの相同性から期待され
るリガンドとしては、例えば、ケモカイン群が挙げられ
る。

【００４７】また、配列表配列番号１のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドをコードする本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質のヒト由来の天然のｃＤＮＡ配列について
は、配列表配列番号３にアミノ酸配列とともに示した。
配列表配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードする本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質のマウ
ス由来の天然のｃＤＮＡ配列については、配列表配列番
号４にアミノ酸配列とともに示した。これらの遺伝子配
列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自然界か
ら分離した、染色体ＤＮＡ，またはｃＤＮＡにおいて、
遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードするアミ
ノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列が変異
した例はしばしば認められる。実際に実施例１０におい
て、ヒト天然のｃＤＮＡライブラリーから配列表配列番
号３のヌクレオチドの６７８番目の残基ＡがＧになった
クローンが取得されている。この変異はコドンがＡＣＡ
からＡＣＧに変化しているが、どちらもアミノ酸として
Ｔｈｒ（スレオニン）をコードしており、その結果得ら
れるアミノ酸配列は変化しない。このような変異を含む
ＤＮＡ配列も本発明のＤＮＡに含まれる。また、５’非
翻訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸
配列の規定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ
配列は変異しやすい。このような変異や遺伝コードの縮
重によって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれ
る。以下、これらＤＮＡ群を本発明のＤＮＡとよぶ。

【００４８】配列表配列番号１または配列表配列番号２
で表されるアミノ酸配列と実質的に同等なポリペプチド
をコードする本発明のＤＮＡは、本発明のヒトおよびマ
ウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を製造
する上で有用である。表３に本発明のｃＤＮＡ配列の一
つ、ヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の
ｃＤＮＡと、上記データベースとの比較で類似度が高い
とされた、これまで知られているｃＤＮＡ全長配列の類
似度を示した。本発明の一つ、ヒト由来の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＥＴ２４０のｃＤＮＡは、既知のヒト由来
のｃＤＮＡ全長配列と一致せず、新規なヒト由来の７回
膜貫通型受容体蛋白質のｃＤＮＡであることが示され
た。

【００４９】

【表３】

【００５０】表４に本発明のｃＤＮＡ配列の一つ、マウ
ス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のｃＤＮ
Ａ配列と上記データベースとの比較で類似度が高いとさ
れた、これまで知られているｃＤＮＡ全長配列の類似度
を示した。本発明の一つ、マウス由来の７回膜貫通型受
容体蛋白質ＥＴ２４０のｃＤＮＡは、既知のマウス由来
のｃＤＮＡ全長配列と一致せず、新規なマウス由来の７
回膜貫通型受容体蛋白質のｃＤＮＡの一部であることが
示された。

【００５１】

【表４】

【００５２】既知のウシ由来の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＰＰＲ１のｃＤＮＡが本発明のヒトおよびマウス由来
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のｃＤＮＡの両
者と強い相同性を示したが、その類似度はそれぞれ８
８．４％、８２．０％であり、同一ではなかった。従っ
て、本発明のヒトおよびマウス由来の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＴ２４０をコードするｃＤＮＡは物質として
新規なｃＤＮＡであった。

【００５３】なお、これらのサーチ（表３、表４）で類
似度が高いとされたｃＤＮＡ配列はすべて７回膜貫通型
受容体のｃＤＮＡ配列であり、このことからも本発明の
ヒトおよびマウス由来の蛋白質ＥＴ２４０が７回膜貫通
型受容体に属する蛋白質であることが示された。これら
のｃＤＮＡの相同性から期待されるリガンドとしては、
例えば、ケモカイン群が挙げられる。

【００５４】配列番号３および４で示される塩基配列を
有するＤＮＡは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｅ
Ｔ２４０を作成する上で、また、本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＥＴ２４０の詳細な機能を検討する上で有
用である。さらに、配列表配列番号３および４の遺伝子
配列またはその相補鎖の配列を有する核酸、及びその誘
導体を用いれば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｅ
Ｔ２４０のｃＤＮＡクローン、ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮ
Ａ，ゲノム遺伝子クローンなどを検出することができ
る。たとえば、診断を目的としてこれらの遺伝子の発現
を調べる方法として、配列表配列番号３または４の遺伝
子配列を有する相補し得る核酸、つまりアンチセンスＤ
ＮＡ，ＲＮＡ，及びそれらがメチル化、メチルフォスフ
ェート化、脱アミノ化、またはチオフォスフェート化さ
れた誘導体すなわちアンチセンス核酸を用い、ハイブリ
ダイゼーション、プライマーエクステンション、ヌクレ
アーゼ・プロテクション・アッセイ等の手法によって行
うことが出来る。ハイブリダイゼーションによる天然の
ｍＲＮＡの検出の例は、実施例７、８に示した。例え
ば、遺伝子診断を目的としてこれらの遺伝子を調べる方
法として、配列表配列番号３または４の遺伝子配列を有
する核酸、つまりＤＮＡ，ＲＮＡ，及びそれらがメチル
化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチオ
フォスフェート化された誘導体を用い、ゲノミックサザ
ーンハイブリダイゼーション等の手法によって行うこと
があげられる。同様な方法でラット等の他の生物の本発
明の遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングがで
きる。さらに、ヒト、マウスを含めたゲノム上の遺伝子
のクローニングも同様に可能である。従って、そのよう
にしてクローニングされたこれらの遺伝子を用いれば、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の更に詳
細な機能も明らかにすることが出来る。特に本発明によ
り、マウスｃＤＮＡ遺伝子の配列が明らかになり、実施
例９に示したようにマウスゲノムの遺伝子を検出するこ
とが可能になった。従って、マウスゲノム遺伝子のクロ
ーニングは容易に実施することができる。マウスでは様
々な遺伝子操作技術が発達しており、トランスジェニッ
クマウス、ジーンターゲッティングマウス、また、本発
明の遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノ
ックアウトマウスなどの方法を用いて本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の更に詳細な機能も明らか
にすることが出来る。また、本発明の遺伝子のヒト・マ
ウスのゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治
療への応用も可能である。

【００５５】また、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＴ２４０の更に詳細な機能を明らかにすることを目的
として、細胞や生体へのアンチセンス核酸の投与も考え
られる利用法である。本発明の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０の過剰な反応が病態となっている疾患につ
いては、これらアンチセンス核酸により遺伝子の発現を
抑えることによって、治療を行うことも可能である。ま
た、アンチセンス核酸を適当なベクターに組み込み、そ
のベクターを用いることも可能である。これらアンチセ
ンス核酸の作成例・使用例についてはＭｕｒｒａｙ，
Ｊ．Ａ．Ｈ．編、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥＲＮＡＡＮＤ
ＤＮＡ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２
年、に詳しい。

【００５６】以上のように、配列表配列番号３および４
の遺伝子配列またはその相補鎖の配列を有する核酸、及
びその誘導体は診断、治療などに有用である。本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０遺伝子がマウスの
ＥＡＥ発症性Ｔ細胞に発現していることから、例えば多
発性硬化症を含む自己免疫性疾患の診断や、多発性硬化
症を含む自己免疫性疾患の治療を目的とした医薬品の検
索に特に有用であると考えられる。また、粘膜系のリン
パ球系白血球に発現していることから、自己免疫性消化
管疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎の診断、治
療を目的とした医薬品の検索に特に有用であると考えら
れる。

【００５７】本発明の核酸を含有するベクターとして
は、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２，ｐＵＣ８，ｐＵ
Ｃ１９，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１９（いずれも日本国宝
酒造社製）などが挙げられるが、その他のものであって
も宿主内で複製増殖できるものであればいずれも用いる
ことができる。実施例１０にベクターとしてｐＣＲ３．
１を、宿主として大腸菌ＩＮＶαＦ’を用いた例を示し
た。また本発明のＤＮＡを含有するファージベクターと
しては、例えばλｇｔ１０，λｇｔ１１（米国Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社製）などが挙げられるが、その他のもの
であっても宿主内で増殖できるものであれば用いること
ができる。このようにして、得られたベクターは適当な
宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌、などにカル
シウムクロライド法等を用いて導入し、本発明のＤＮＡ
を含有するベクターを保持する形質転換体を作成するこ
とができる。上記エシェリヒア属菌の例としては、エシ
ェリヒアコリＫ１２ＨＢ１0１，ＭＣ１０６１，
ＬＥ３９２，ＪＭ１０９、ＩＮＶαＦ’などが挙げられ
る。上記バチルス属菌の例としてはバチルスサチリス
Ｍ１１１４等が挙げられる。また、ファージベクター
は、例えば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージン
グ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１：
２４４２−，１９７８）を用いて導入することができ
る。尚、本発明のヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを
含むプラスミドｐＥＴ２４０Ｈを大腸菌ＩＮＶαＦ’に
遺伝子導入した形質転換細胞（実施例１０）Ｅ．ｃｏｌ
ｉ：ＩＮＶαＦ’−ｐＥＴ２４０Ｈは、日本国通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１２月
２２日に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ―６２１３として寄託
されている。

【００５８】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２
４０をコードする塩基配列を有する核酸を含有するベク
ターは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０
をコードする塩基配列を有する核酸を製造する上で、ま
た、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の核
酸を保持する形質転換体を作成する上で有用である。上
記の方法にて作成した本発明の核酸を用いた７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＴ２４０の発現には、成書によって知
られている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓ
ｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰ
ｒｅｓｓ，１９９０；および横田ら、バイオマニュアル
シリーズ４，遺伝子導入と発現・解析法、羊土社、１９
９４）、多数の方法が用いられる。すなわち、分離した
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつなぎ、動
物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原
核細胞を宿主として生産させることができる。

【００５９】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２
４０を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコード
する核酸はその５’末端に翻訳開始コドンを有し、ま
た、３’末端には翻訳終止コドンを有していてもよい。
これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成
核酸アダプターを用いて付加することもできる。更に該
ＤＮＡを発現させるには上流にプロモーターを接続す
る。ベクターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯
草菌由来プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλ
ファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィル
ス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げ
られる。

【００６０】本発明に用いられるプロモーターとして
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが
好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、
宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰ
プロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿
主が原核細胞である場合には、プロモーターとともにリ
ボゾーム結合部位をもつことが好ましい。

【００６１】宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０
由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、
メタルチオネインプロモーター、ヒートショックプロモ
ーターなどが利用できる。本発明のポリペプチドを発現
させる時、配列表配列番号１および２のアミノ酸配列と
実質的に同等な蛋白質をコードする核酸のみでもよい
が、膜表面への発現を保証する必要のある場合には、既
知シグナルペプチドをコードする核酸をＮ末に付加した
り、産生されたポリペプチドの検出を容易にするための
既知抗原エピトープをコードする核酸を付加すること
で、特別の機能を付加した蛋白質を生産させることもで
きる。このような技術の一つの例として、Ｃｈｏｅ，
Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ，８５，１１３５−１１４８，１９
９６年を挙げることができる。

【００６２】本発明者らは、実施例１０に示したごと
く、ヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を
発現する発現ベクターとして配列表配列番号３に記載の
ＤＮＡ配列のうち蛋白質をコードする部分を含むＤＮＡ
を発現ベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社）につなぎ、本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを作
製した。このようにして構築されたヒトおよびマウス由
来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０をコードする
ＤＮＡを含有する発現ベクターを用いて、本発明のＤＮ
Ａを含むベクターを保持する形質転換体を製造する。

【００６３】宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バ
チルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌、酵母、動物細胞など
が挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞であ
るＣＯＳ―７，Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター
細胞ＣＨＯ，カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。この
ようにして得られる本発明のヒトおよびマウス由来の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０をコードする塩基配
列を有する核酸を含有するベクターは、本発明のヒトお
よびマウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０
を産生する上で有用である。

【００６４】実施例１１，１３に示したごとく、上記の
発現ベクターを遺伝子導入し、７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０をＣＨＯ細胞、２9３細胞などで発現さ
せ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転換体
が得られる。これらの形質転換体は本発明の７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＴ２４０を産生する上で有用である。
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０と実質的
に同等な蛋白質をコードする塩基配列を有する核酸を含
有するベクターを保持した形質転換体を作成し、それぞ
れ公知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件に
より培養することによって、本発明の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＴ２４０またはその塩を製造することができ
る。例えば実施例１１のようにＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏ
ｔｔｉｎｇを用いたり、また、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｌＳｏｒｔ
ｅｒ）によって検査することにより、ヒトおよびマウス
由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の生産を確
認することができる。

【００６５】このようにして作成した、本発明のヒトお
よびマウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０
またはその塩を用いて、本発明のヒトおよびマウス由来
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のリガンドを決
定することができる。そのためには、まず、リガンド候
補である試験化合物を、純化した、または、未精製の、
本発明のヒトまたはマウス由来の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＴ２４０と接触させ、試験化合物の本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０に対する結合もしくは
その結合により引き起こされる反応を測定する。試験化
合物の本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０に
対する結合を測定する場合には、純化した、または、未
精製の本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０と
試験化合物を接触させ、複合体量および／または未結合
の試験化合物量を測定する。複合体量および／または未
結合の試験化合物量を測定する方法としては、例えば、
放射性化合物や色素などを用いて試験化合物を標識し、
複合体と未結合の試験化合物を分離し、標識を用いて複
合体量および／または未結合の試験化合物量を測定す
る。この一つの例を実施例１２に示した。

【００６６】受容体と結合する化合物が知られている場
合には、その化合物を標識し、試験化合物が標識化合物
と競合するかどうかをもって、試験化合物の結合を測定
することもできる。これらの方法の例として、浅沼幹人
ら、実験医学１１，２２−２９，１９９３年に挙げられ
ている方法がある。そのほかにも、ＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔ
ｉｌｌａｔｉｏｎＰｒｏｘｉｍｉｔｙＡｓｓａｙ）
のように複合体と未結合の試験化合物を分離せずに測定
する方法もある。

【００６７】一方、試験化合物と本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＥＴ２４０の結合によりひき起こされる反
応を測定する場合には、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＴ２４０の共役しているシグナル伝達系によって
様々な方法が考えられる。このような方法として、例え
ば唐木英明ら編、実験医学７，ｐｐ２６−１０９，１９
８９年のように細胞内カルシウムを測定する方法、Ｓａ
ｍｓｏｎ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５，ｐｐ３３６
２−３３６７，１９９６年のようにマイクロフィジオメ
ーターを用いる方法、細胞内ｃＡＭＰの量を測定する方
法、などがある。リガンドとの結合によって引き起こさ
れる反応を測定する１つの例を実施例１３に示した。こ
れらＥＴ２４０蛋白質もしくはその塩、または、その部
分ペプチドまたはその塩と試験化合物を接触させるＥＴ
２４０蛋白質に対するリガンドを決定する方法は７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０に結合して白血球細胞の
反応を制御する、疾患の治療を行う物質を検索する上で
有用である。

【００６８】さらに上記のようにして、リガンド、すな
わち、ヒトおよびマウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０に作用するものを発見した場合には、その
作用の変化、すなわち、その活性化を行ったり、活性化
を阻害したりする物質を検索することが可能である。そ
のことは、（i）ヒトまたはマウス由来の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＥＴ２４０もしくはその塩に、リガンドを
接触させた場合と（ii）ヒトまたはマウス由来の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０もしくはその塩またはそ
の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドおよび試験
化合物を接触させた場合との比較を行うことによって行
うことができる。その一つの例を実施例１４に示した。
この方法は、７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０に作
用して白血球細胞の反応を制御する、疾患の治療を行う
物質を検索する上で有用である。特にヒトの疾患を治療
するための薬物を検索する際には、ヒト由来の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＴ２４０が有用である。

【００６９】ヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ
２４０を特異的に認識する抗体は実施例１５に示したよ
うにして作製することができる。抗原であるヒト由来の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を発現させる細胞
は、抗体作製のために細胞を投与される受け手の個体に
免疫反応を起こさせないものであればよい。特定のウシ
個体に由来する細胞に、例えば実施例１０で示したヒト
由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０をコードす
る核酸を保持するベクターを導入し、その細胞を元の個
体に戻すことによって、実施例１５と同様にしてウシＰ
ＰＲ１蛋白質に反応せず、ヒト由来の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＥＴ２４０を特異的に認識する抗体を作製する
ことができる。

【００７０】また、配列表配列番号１に示したアミノ酸
配列の全長をＧＳＴ（グルタチオンＳ―トランスフェラ
ーゼ）などと融合させたものを精製して、または未精製
のまま、抗原として用いることもできる。このペプチド
をそのまま、またはＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐ
ｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）やＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）といったキャリア蛋白
質と架橋した後に必要に応じてアジュバントと共に動物
へ接種せしめ、その血清を回収することでヒト由来のＥ
Ｔ２４０蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）
を含む抗血清を得ることができ、さらにウシＰＰＲ１蛋
白質により吸収することによって、ウシＰＰＲ１蛋白質
に反応せず、ヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ
２４０を特異的に認識する抗血清を作製することができ
る。また、抗血清より抗体を精製して使用することも可
能である。接種する動物としては、ヒツジ、ウシ、ヤ
ギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクロー
ナル抗体作製にはヒツジ、ウサギが好ましい。また、ハ
イブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクロ
ーナル抗体を得ることも可能であるが、この場合にはマ
ウスが好ましい。成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏ
ｗｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）に示された各種の方法
ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイ
ムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝
子組換え体抗体によっても作製することができる。この
ように作製された抗体は本発明のヒト由来の７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＴ２４０の精製に利用できる。

【００７１】また、実施例１５に示したヒト由来の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を特異的に認識する抗
体を用いれば、本発明のヒト由来の７回膜貫通型受容体
蛋白質ＥＴ２４０の検出、測定が可能であり、細胞の分
化異常を伴う疾患、例えば悪性腫瘍、ウイルス感染など
の疾患の診断薬として使用でき得る。また、実施例１１
に示すように、この検出、測定には、Ｗｅｓｔｅｒｎ
Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｌＳｏｒｔｅｒ）な
どを用いることができる。ＦＡＣＳを用いた臨床診断の
例は、例えば、天神美夫ら編、フローサイトメトリーハ
ンドブック、サイエンスフォーラム社、１９８４年、の
第４部フローサイトメトリーの臨床医学への応用、に
示されている。これら検出、測定については、Ｗｅｓｔ
ｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉ
ｎｇ）に関してはＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗｅｔ
ａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ４７１−５１０にその方法
の詳細が、免疫沈降、免疫測定などに関しては、同書ｐ
ｐ４２１−４７０，ｐｐ５５３−６１２にそれぞれ詳細
が記されている。ＦＡＣＳの際の細胞の染色について
は、高津聖志、瀧伸介、免疫研究の基礎技術、羊土社、
１９９５年、ｐｐ１６−６１に、ＦＡＣＳの操作につい
ては、天神美夫ら編、フローサイトメトリーハンドブッ
ク、サイエンスフォーラム社、１９８４年に詳細が示さ
れている。

【００７２】以上のように、配列表配列番号１で表され
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
ることを特徴とするヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０またはその塩に対する抗体は本発明のヒト
由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を発現して
いる細胞を同定する上で有用である。

【００７３】

【発明の実施の形態】以下に発明を実施する形態につい
て例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではな
い。

【００７４】

【実施例１】４Ｒ３１２株の樹立ＭＢＰペプチド（配列表配列番号１９：ＦＫＮＩＶＴＰ
ＲＴＰＰＰＳ）はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製４３０Ａ型ペプチド合成機を用いた固相法にて合
成した。このＭＢＰペプチドの濃度が８ｍｇ／ｍｌにな
るように以下のＭＢＰペプチドエマルジョン溶液を作製
した。

【００７５】まず、完全フロイントアジュバンド（Ｄｉ
ｆｃｏ社）に結核死菌（青山Ｂ株、日本ビーシージー、
国立予防衛生研究所から入手）を最終濃度４ｍｇ／ｍｌ
になるように加え、アジュバンド溶液とした。さらに、
ＭＢＰペプチド溶液９００μｌとこのアジュバンド溶液
９００μｌをガラス注射筒でよく混合し、ＭＢＰペプチ
ドエマルジョン溶液とした。

【００７６】このＭＢＰペプチドエマルジョン溶液を、
ＳＪＬ／Ｊマウス（９週齢、メス；日本チャールスリバ
ーより入手）の両後肢蹠の皮下に２５μｌずつ注入し
た。さらに１μｇのｉｓｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ（科研製薬）溶液を、免疫直後およ
び２日後に尾静脈より２００μｌの生理食塩水溶液とし
て注入した。

【００７７】肉眼での観察により臨床症状的にＥＡＥを
発症しているマウスを選び出し、免疫後６３日目に、腋
窩、鼠径及び膝窩リンパ節を採取した。リンパ節をメス
で細かく切ったのち、シリコン栓を用いて、１５０番の
メッシュでこし、単細胞懸濁液とした。この単細胞懸濁
液を１０μｇ／ｍｌのＭＢＰペプチドを含む培地（５％
ＦＣＳ（ウシ胎児血清；Ｂｉｏｓｅｒｕｍ社より入
手）、Ｃｌｉｃｋ’ｓＥＨＡＡ培地；Ｉｒｖｉｎｅ
ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣａｔ．Ｎｏ．９５８２)で４
×１０⁶個／ｍｌに調製し、２５ｃｍ²のフラスコ（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ社）に１０ｍｌ／フラスコで加え、フラス
コを立てて培養を開始した。

【００７８】継代用の培地に含まれるＦａｃｔｏｒは以
下のように調製した。ＲＧＦ（ＲａｔＧｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒ）は１０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ
（Ｓｉｇｍａ社）および１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６
４０培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）で１０⁶細胞／ｍｌ
のＳＤラット（チャールスリバー）の脾細胞を４８時間
刺激後、上清を回収し、終濃度が２０ｍｇ／ｍｌになる
ようにα−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄｅを添
加し、ＲＧＦとした。また、ＥＬ４ｓｕｐは、１ｎｇ／
ｍｌのホルボールミリステートアセテート（Ｓｉｇｍａ
社）を含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社；５％Ｆ
ＣＳを含む）で１０⁶個／ｍｌに調製したマウスＥＬ
４．ＩＬ−２細胞（ＡＴＣＣより入手可能。ＡＴＣＣＴ
ＩＢ−１８１）を２４時間刺激後、培養上清を回収し、
ＥＬ４ｓｕｐとした。

【００７９】前記のリンパ節細胞を、培養６日目に継代
培地（Ｃｌｉｃｋ’ｓＥＨＡＡ培地、５％ＦＣＳ、１
５％ＲＧＦ、ＥＬ４ｓｕｐ１％を含む）に培地を交換
後、同じ培地で４×１０⁶個／ｍｌに調製し、２４穴プ
レートに１．２ｍｌ／穴で分注し、５％二酸化炭素雰囲
気中３７℃で培養した。さらに約１週間後、１０μｇ／
ｍｌのＭＢＰペプチドおよび約２×１０⁶個／ｍｌの抗
原提示細胞（ＳＪＬ／Ｊマウスの脾細胞を３０００Ｒで
Ｘ線照射して調製した）の存在下で５％二酸化炭素雰囲
気中３７℃で培養し（抗原刺激）、約１週間後に継代培
地に培地を交換し、さらに５％二酸化炭素雰囲気中３７
℃で約１週間培養した。これを培養の１サイクルとし、
２週間ごとにこの培養サイクルを繰り返した。まきこみ
細胞数は徐々に減らし、最終的には２．５〜５×１０⁵
個／ｍｌで行った。

【００８０】この培養を３サイクル繰り返した後、限外
希釈により個々のクローンに分割した。そのうちの１ク
ローンを４Ｒ３１２株と命名した。４Ｒ３１２株も上記
と同様に培養サイクルを繰り返して拡大培養し、以降の
実験に用いた。

【００８１】

【実施例２】４Ｒ３１２株のＥＡＥ発症性の確認４Ｒ３１２株を実施例１に示したように拡大培養し、５
×１０⁶個の抗原刺激後３日目の４Ｒ３１２株をＳＪＬ
／Ｊマウス（８週齢、メス；チャールスリバーより購
入）に尾静脈より注入した。２匹のマウスに注入した。
肉眼による症状観察により、一匹は５日目に一匹は６日
目にＥＡＥの発症が観察された。

【００８２】

【実施例３】マウス由来の新規７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＴ２４０断片の取得マウス４Ｒ３１２株は実施例１に示したように拡大培養
し、全体で約１×１0⁷個の細胞を培養して材料とし
て使用した。ピペッティングにより、細胞を懸濁後、１
０００ｒｐｍで１５分の遠心（ＫＳ−８３００型、久保
田製作所、ＲＳ３０００／６型ローター）後、上清を吸
引・廃棄し、ＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅ
ｒｅｄＳａｌｔｓ；大日本製薬（株）製 Cat.No．２
８-１0３-0５）を３０ｍｌ加え懸濁後、再度同じ条件で
遠心した。以下、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用い、製造者のプロトコル（Ｒｅ
ｖ．４．ＸＶ−０２５−００−０７）１１〜１４頁に従
って（ｓｅｃｏｎｄｃｏｌｕｍｎｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎは行わなかった）、ｍＲＮＡを抽出した。エタ
ノール沈殿後、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，
Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１９８
９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎｏｆｔｈｅＡｍｏｕｎｔｏｆＤＮＡｏｒ
ＲＮＡに従って定量した。約２μｇのｍＲＮＡを用い、
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＣｈｏｉｃｅＳｙｓｔｅｍ
ｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）添付の５ｘＦｉｒｓｔ
ｓｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ１０μｌ、 0.1ｍＭ
ＤＴＴ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社
製）５μｌ、ＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮａｓｅ（Ｂｏ
ｅｒｈｉｎｇｅｒ社製）１μｌを加え、滅菌水で全量
を５０μｌにし、室温で５分間放置した。その後、フェ
ノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿後、次の
ようにｃＤＮＡ合成を行った。

【００８３】ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＣｈｏｉｃｅ
ＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ
（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いてｃ
ＤＮＡ合成を行った。プロトコル１１〜１７頁（Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ１および２）に従い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）
プライマーを用いて２重鎖（ｄｓ）ＤＮＡを合成した。
その後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール
沈殿後、４０μｌの滅菌水に溶解した（これをｃＤＮＡ
サンプルと呼ぶ）。

【００８４】このｃＤＮＡサンプルのうち４μｌを用い
てＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝
酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付の
バッファーを５μｌ，酵素に添付のｄＮＴＰｍｉｘｔ
ｕｒｅ４μｌと配列表の配列番号５に示した合成オリ
ゴヌクレオチドＡおよび、配列表の配列番号６に示し
た合成オリゴヌクレオチドＢをそれぞれ２００ｐｍｏｌ
を加え、最終容量５０μｌとした。

【００８５】この混合物を、ＴａＫａＲａＰＣＲｔ
ｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ４８０を用いて、９５℃
１分、４０℃２分、７２℃３分を５サイクル行ったの
ち、９５℃１分、５０℃２分、７２℃３分を２５サイク
ル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロース
・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日
本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約７０
０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。こ
のバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝
酒造社製）で精製後、ＴＡｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングした。

【００８６】すなわち、ベクターとしてｐＣＲＩＩＶ
ｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲＩ
Ｉという）を用い、ベクターと先のＤＮＡとをそのモル
比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤ
ＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＣ
ＲＩＩを大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔＣｏｍｐｅｔｅｎｔ
ＣｅｌｌｓＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）
を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半
固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置
し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアン
ピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付
け、８時間程度３７℃で震とう培養し、菌体を回収し、
ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い
て添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラ
スミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約７００ｂ
ｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組
み込まれていることを確認し、確認されたクローンにつ
いて、組み込まれているｃＤＮＡの塩基配列決定を行っ
た。

【００８７】挿入ｃＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シーク
エンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調
製はＰＲＩＳＭ，ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＤｙ
ｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製）を用いて行なった。０．５ｍｌ容のマイクロチ
ューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの
０．８ｐｍｏｌ／μｌの−２１Ｍ１３ユニバーサル・プ
ライマー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）および６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエ
ンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラ
ルオイルを重層後、９６℃３０秒、５５℃１５秒および
６０℃４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サ
イクル行ない、４℃で５分間保温した。反応後、８０μ
ｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層
を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行なった。１
００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌
後、室温、１４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行
ない沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄
後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用
サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１
０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０
℃，２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供
した。

【００８８】７５個のクローンについてＤＮＡ配列決定
を行ったところ、２個のクローンが配列表配列番号４の
ＤＮＡ配列の１番目のＴから６２７番目のＣに対応する
配列を有していた（両端のプライマーの配列を含まな
い）。ＧｅｎＢａｎｋリリース１００．０，Ａｐｒｉ
ｌ，１９９７年のサーチの結果、この配列は７回膜貫通
型受容体群と類似していることが判明した（以下、この
断片をマウス由来ＥＴ（ＥＡＥ発症性Ｔ細胞由来）２４
０断片とよぶ）。

【００８９】

【実施例４】マウス由来の新規７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＴ２４０断片のＣ末端を含む配列の取得実施例３で得られたマウス由来ＥＴ２４０断片ｃＤＮＡ
配列をもとにマウスのＥＳＴ（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳ
ｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ）データベース（ＧｅｎＢａｎ
ｋリリース１００．０，Ａｐｒｉｌ，１９９７年）をサ
ーチした。この結果、ほぼ同一の遺伝子をコードしてい
ると考えられるマウスのＥＳＴ断片、エントリーＡＡ０
１４３７３、ＡＡ０５０２７３の２種（両者とも１３．
５ｄｐｃと１４．５ｄｐｃのｅｍｂｒｙｏの等量
混合のライブラリー由来）を利用することによって、配
列表配列番号４のＤＮＡ配列の５０１残基目のＧ以降の
ｃＤＮＡ配列が得られた。

【００９０】実施例３で得られた配列とこの配列を接続
し、配列表配列番号４に示したＤＮＡ配列、マウス由来
の新規７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のｃＤＮＡ
配列の一部を得た。また、その配列をアミノ酸に翻訳
し、配列表配列番号２に示したマウス由来の新規７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のアミノ酸配列の一部を
得た。

【００９１】なお、これらのエントリー２者は配列表配
列番号４のＤＮＡ配列の５９８残基目のＧにあたる残基
がＣとなっており、配列表配列番号４に示した配列とは
異なっていた。

【００９２】

【実施例５】ヒト由来の新規７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０の配列の取得実施例３で得られたマウス由来ＥＴ２４０断片ｃＤＮＡ
配列をもとにヒトのＥＳＴ（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅ
ｑｕｅｎｃｅＴａｇ）データベース（ＧｅｎＢａｎｋ
リリース１００．０，Ａｐｒｉｌ，１９９７年）をサー
チした。この結果、２種のＥＳＴ断片、ＡＡ２１５５７
７（ｔｏｎｓｉｌｌａｒｃｅｌｌｓｅｎｒｉｃｈｅ
ｄｆｏｒｇｅｒｍｉｎａｌｃｅｎｔｅｒＢｃ
ｅｌｌｓｂｙｆｌｏｗｓｏｒｔｉｎｇ（ＣＤ２０
⁺，ＩｇＤ^-）のライブラリー由来）、Ｈ６７２２４（Ｗ
ｅｉｚｍａｎｎＯｌｆａｃｔｏｒｙＥｐｉｔｈｅｌ
ｉｕｍのライブラリー由来）が得られた。

【００９３】この２種の断片の配列を元に、オリゴヌク
レオチドＦ１（配列表配列番号７；５’ＧＣＴＧＴＡＧ
ＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴＣＡＣ
３’；Ｈ６７２２４の配列の一部、配列表配列番号３
の２５９残基目のＧから２８７残基目のＣに対応）とオ
リゴヌクレオチドＲ１（配列表配列番号８；５’ＧＣ
ＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＡＴＧ
ＴＣ３’；配列表配列番号３のＤＮＡ配列の８３５残
基目のＧから８６１残基目のＣの相補鎖に対応するが８
６０残基目のＣに対応する残基（配列表配列番号８の２
残基めに対応）が相補するＧではなくＣになっているの
はＡＡ２１５５７７の配列の相補鎖の一部を用いたた
め）を作製し、ヒト由来のゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０−１）を鋳型として
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔ
ｉｏｎ）法にて遺伝子の増幅を行い、遺伝子配列の解析
に供した。

【００９４】ＰＣＲにはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社
製）を用いた。このｃＤＮＡライブラリー溶液１μｌと
脱イオン水３８．５μｌを混合し９５℃で７分間加熱し
たものに、Ｔａｑポリメラーゼに添付のバッファー５μ
ｌと、２．５ｍＭｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造
社製）４μｌと、オリゴヌクレオチドＦ１およびＲ１を
それぞれ２０ピコモルを加え、９５℃３分間加熱後Ｔａ
ｑポリメラーゼ０．５μｌを加え、最終容量５０μｌと
した。

【００９５】この両方の混合物を、ＴａＫａＲａＰＣ
ＲｔｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ４８０を用いて、９
４℃１分、６５℃２分、７２℃３分を５サイクル、９４
℃１分、６３℃２分、７２℃３分を５サイクル、９４℃
１分、６０℃２分、７２℃３分を５サイクル行ったの
ち、９５℃１分、５０℃２分、７２℃３分を２５サイク
ル行い、最後に７２℃７分を１サイクル行った。このＰ
ＣＲ産物を１％アガロース・ゲル中で電気泳動を行い、
エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、
紫外線下で観察した。約６００ｂｐのＰＣＲ産物をゲル
から切り出し、ＴａＫａＲａＳｕｐｒｅｃ０１を用い
て、ＤＮＡの精製を行った。この精製ＤＮＡをＴＡクロ
ーニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用
い、添付のプロトコールに従って、ｐＣＲ２．１ベクタ
ーに組み込んだ。ＤＮＡを組み込んだｐＣＲ２．１ベク
ターを大腸菌ＩＮＶαＦ′ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌ
ｌｓ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、
アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含む
Ｌ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに
蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニ
ーを無作為選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時
間程度３７℃で振とう培養し、菌体を回収し、ウィザー
ドミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の
説明書に従ってプラスミドを分離し，ＤＮＡの塩基配列
決定に供した。これらのクローンのうち３個のＤＮＡ配
列をＤＮＡシークエンサーにより解析し、そのコンセン
サス配列をｃＤＮＡ配列とし、配列表配列番号３にある
ＤＮＡ配列の２８８番目のＴから８３４番目のＣまでの
塩基配列を決定した（両端のプライマー配列を含まな
い）。この配列は、実施例３、４で得られたマウス由来
の新規７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０のｃＤＮＡ
配列と強く類似していた。

【００９６】このようにして得られたＤＮＡ断片をヒト
ＥＴ２４０断片と命名した。なお、公知のエントリーＨ
６７２２４では配列表配列番号３のＤＮＡ配列の５６４
残基目以降のＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＣＣＣに対応する部
分がＮＣＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣとなっており、配列
表配列番号４に示した配列とは異なっていた。また、公
知のエントリーＡＡ２１５５７７には、配列表配列番号
４のＤＮＡ配列の７４４残基目のＣにあたる残基のあと
に余分なＡが挿入されており、７７７、７８７、８０
７、８２７残基目にあたるところはＮとなっており、配
列表配列番号４に示した配列とは異なっていた。

【００９７】

【実施例６】ヒト７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４
０全長遺伝子の配列決定ヒト肺由来のｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
社、Ｃａｔ＃ＨＬ５０３０ｔ）を鋳型としてＰＣＲ（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）
法にて遺伝子の増幅を行い、遺伝子配列の解析に供し
た。

【００９８】ヒト７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０
遺伝子の５’末の決定には以下のような方法を用いた。
ＰＣＲにはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い
た。このｃＤＮＡライブラリー溶液１μｌと脱イオン水
３８．５μｌを混合し９５℃で７分間加熱したものに、
Ｔａｑポリメラーゼに添付のバッファー５μｌと、２．
５ｍＭｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）４μｌ
と、このｃＤＮＡライブラリーのベクターのアーム配列
を利用したオリゴヌクレオチドＬＤ―５：５’ＣＴＣ
ＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴ
ＧＧＴ３’（配列表配列番号９）、およびオリゴヌク
レオチドＲ３：５’ＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣ
ＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＡＣ３’
（配列表配列番号１０；配列表配列番号３の３４２番目
のＧから３７０番目のＣの塩基配列のアンチセンス配
列）を、それぞれ２０ピコモルを加え、９５℃３分間加
熱後Ｔａｑポリメラーゼ０．５μｌを加え、最終容量５
０μｌとした（この反応液を反応液Ｒ３とする）。同時
にオリゴヌクレオチドＲ３の代わりに、オリゴヌクレオ
チドＲ２：５’ＧＣＡＴＴＡＡＣＡＧＣＣＣＡ
ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧ３’（配列表配列
番号１１；配列表配列番号３の２８５番目のＣから３１
１番目のＧの塩基配列のアンチセンス配列）を用いた反
応液も調製した（この反応液を反応液Ｒ２とする）。

【００９９】この両方の混合物それぞれを、ＴａＫａＲ
ａＰＣＲｔｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ４８０を
用いて、９４℃１分、７２℃４分を５サイクル、９４℃
１分、６８℃２分、７２℃３分を５サイクル、９４℃１
分、６５℃２分、７２℃３分を５サイクル行ったのち、
９５℃１分、５５℃２分、７２℃３分を２０サイクル行
い、最後に７２℃７分を１サイクル行った。このＰＣＲ
産物を１．５％アガロース・ゲル中で電気泳動を行い、
エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、
紫外線下で観察した。ある程度はっきりとしたバンドと
して検出されたバンドを反応液Ｒ３とＲ２で比較し、反
応液Ｒ３の方が約６０残基長いバンドが増幅されている
ものを選び出した。反応液Ｒ２で約４５０ｂｐ、反応液
Ｒ３で約５００ｂｐのバンドがそれにあたり、そのＰＣ
Ｒ産物をゲルから切り出し、ＴａＫａＲａＳｕｐｒｅ
ｃ０１を用いて、ＤＮＡの精製を行った。この精製ＤＮ
ＡをＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ
社製）を用い、添付のプロトコールに従って、ｐＣＲＩ
Ｉベクターに組み込んだ。ＤＮＡを組み込んだｐＣＲＩ
Ｉベクターを大腸菌ＩＮＶαＦ′Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導
入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍ
ｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレ
ートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置した。現れてき
たコロニーをそれぞれ２個ずつ無作為選択し、同濃度の
アンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植
え付け、１８時間程度３７℃で振とう培養し、菌体を回
収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）
を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し，Ｄ
ＮＡの塩基配列決定に供した。これらのクローンのＤＮ
Ａ配列は実施例３と同様にＤＮＡシークエンサーにより
解析した。

【０１００】その結果、反応液Ｒ３由来の１クローンの
みがプライマー部分の他に実施例５で得られた配列と共
通する配列をもっており、配列表配列番号３にあるＤＮ
Ａ配列の１番目のＡから３４１番目のＴまでのＤＮＡ配
列であった。さらにヒト７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ
２４０遺伝子の３’末の決定には以下のように５’末の
取得と同様の方法を用いた。

【０１０１】５’末の取得の際のプライマーＬＤ−５の
かわりにこのｃＤＮＡライブラリーのベクターのアーム
配列を利用したオリゴヌクレオチドＨ：ＡＴＡＣＧＡ
ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴ
ＧＧＣ（配列番号１２）を用い、オリゴヌクレオチドＲ
３、Ｒ２のかわりにそれぞれオリゴヌクレオチドＦ３：
ＧＣＴＧＣＧＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣ
ＧＣＡＴＧＧＡＣ（配列番号１３；配列表配列番号
３の８３０番目のＧから８５５番目のＣに対応する塩基
配列）、オリゴヌクレオチドＦ２：ＧＴＣＡＧＴ
ＴＡＴＡＧＴＴＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＣ
ＡＡＣＴＧ（配列番号１４；配列表配列番号３の７４
２番目のＧから７７１番目のＧに対応する配列、Ｇｅｎ
ＢａｎｋエントリーＡＡ２１５５７７の配列を用いたた
め、配列番号１４の４残基目によけいなＡが含まれてい
る）、を用い、電気泳動の際に約１１０ｂｐの長さの差
の断片を選択した。実際には約４００ｂｐのオリゴヌク
レオチドＦ３を用いた反応液由来の断片と約５１０ｂｐ
のオリゴヌクレオチドＦ２を用いた反応液由来の断片を
ゲルから切り出した。５’末の取得と同様にクローニン
グし、それぞれ現れてきたコロニーを無作為に２個ずつ
選択し、ＤＮＡ配列を決定した。その結果、オリゴヌク
レオチドＦ２を用いた反応液由来の１クローンのみがプ
ライマー部分の他に実施例５で得られた配列と共通する
配列をもっており、配列表配列番号３にあるＤＮＡ配列
の７７２番目の塩基Ｃから１１５０番目の塩基Ａまでの
塩基配列であった。なお、エントリーＡＡ２１５５７７
では配列表配列番号３にあるＤＮＡ配列の８５９番目の
塩基Ｇから８７０番目の塩基Ｃまでの塩基配列がＧＧＣ
ＮＡＴＣＣＡＡＧＴＮとなっており、配列表配列番号３
の配列と異なっていた。

【０１０２】これらの配列と実施例５で得られた配列を
つなぎあわせることによって、配列表配列番号３のＤＮ
Ａ配列を得、それをさらにアミノ酸に翻訳することによ
り配列表配列番号１のアミノ酸配列を得た。

【０１０３】

【実施例７】発現しているマウス組織の解析実施例３で得られた４Ｒ３１２細胞株由来マウス７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０の各臓器における遺伝子
発現をノーザンハイブリダイゼーションにて解析した。
ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎ
（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔフィルター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社
製、コード＃７７６２−１）を用い、５倍濃度のＳＳＰ
Ｅ溶液（１倍濃度のＳＳＰＥ溶液は０．１５ＭＮａＣ
ｌ，１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄，ＩｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ
７．４）、１０倍濃度のデンハルト液（和光純薬社
製）、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、和光純薬
社製）、終濃度５０％ホルムアミド（和光純薬社製）、
及び１００μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精
子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を含むハイブリダイゼーシ
ョン液中に浸し、４２℃にて２時間振とうした。

【０１０４】放射性同位元素³²Ｐにて標識されたマウス
由来ＥＴ２４０断片プローブは以下のように作製した。
すなわち、マウスＥＴ２４０断片が組み込まれたベクタ
ーｐＣＲＩＩより、制限酵素ＥｃｏＲＩにてベクターよ
り挿入断片を切り出し、０．８％アガロース・ゲル中で
電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社
製）にて染色後、紫外線下で観察し、約６００ｂｐのバ
ンドをゲルから切り出してＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫ
ｉｔ（フナコシ社製）を用いて精製した。得られたＤＮ
Ａ断片をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ
ＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社製コードＲＰＮ１６０７）を用いて標識し
た。すなわち、ＤＮＡ１００ｎｇにプライマー液１０μ
ｌ，５×反応緩衝溶液２０μｌ及び脱イオン水を加えて
全量を８６μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、
α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（アマーシャム社製、コードＡＡ
０００５）１０μｌ，及びＫｌｅｎｏｗ酵素溶液４μ１
を加えて、３７℃で１０分間水浴し、放射標識したマウ
スＥＴ２４０断片を合成した。更にその後、セファデッ
クスカラム（ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎＳ
ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０：独逸国ベーリンガーマンハ
イム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分
間氷冷後使用した。

【０１０５】このようにして³²Ｐ標識されたマウスＥＴ
２４０遺伝子断片プローブをハイブリダイゼーション液
に添加し、４２℃にてさらに１６時間振とうし、ハイブ
リダイゼーションを行った。次に、０．１％ＳＤＳを含
む、各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸
し、室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温で１５分間
洗浄した。さらに、０．１％ＳＤＳを含む、各々の成分
の最終濃度が０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で室温で１５分
間洗浄を行った。洗浄を終了したフィルターを増感スク
リーンを使用して、−８５℃でオートラジオグラフィー
を行った。その結果、全てのレーンで１．５〜２．２ｋ
ｂ付近のバンドが認められ、特に肺、心、肝で強いバン
ドが観察された。

【０１０６】

【実施例８】発現しているヒト組織の解析実施例５，６で得られたヒト７回膜貫通型受容体蛋白質
ＥＴ２４０の各臓器における遺伝子発現をノーザンハイ
ブリダイゼーションにて解析した。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔフ
ィルター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製、コード＃７７６０−
１）を用い、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液（１倍濃度のＳＳ
ＰＥ溶液は０．１５ＭＮａＣｌ，１０ｍＭＮａＨ₂
ＰＯ₄，ＩｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）、１０倍濃度
のデンハルト液（和光純薬社製）、２％ＳＤＳ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム、和光純薬社製）、終濃度５０％ホル
ムアミド（和光純薬社製）、及び１００μｇ／ｍｌの沸
騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ社
製）を含むハイブリダイゼーション液中に浸し、４２℃
にて２時間振とうしたのち、実施例７と同様の方法で³²
Ｐ標識されたヒトＥＴ２４０遺伝子断片プローブを調製
し、ハイブリダイゼーション液に添加し、４２℃にて１
６時間振とうし、ハイブリダイゼーションを行った。

【０１０７】次に、０．１％ＳＤＳを含む、各々の成分
の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸し、室温で３回
洗浄後、さらに同溶液で室温で１５分間洗浄した。さら
に、０．１％ＳＤＳを含む、各々の成分の最終濃度が
０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で室温で１５分間洗浄を行っ
た。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用
して、−８５℃でオートラジオグラフィーを行った。そ
の結果、前立腺を除く全てのレーンで１．５〜２．２ｋ
ｂ付近のバンドが認められ、特に心、小腸で強いバンド
が観察された。

【０１０８】

【実施例９】発現しているマウス組織のＰＣＲによる
解析腸管および舌におけるマウスＥＴ２４０遺伝子の発現を
ＰＣＲによって調べた。腸管リンパ球の調製はＣｕｒｒ
ｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１５，３．１９．１
〜３．１９．４に従った。

【０１０９】すなわち、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（メス、１
２週齢）２匹をエーテル麻酔下で頸椎脱臼により屠殺
し、開腹後小腸よりパイエル板を切除し切開した後、内
容物を洗い、残りの小腸を約１．５ｃｍ長に切断して三
角フラスコ中に集めた。フラスコに終濃度２％のＦＣＳ
（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を加えたＲＰＭＩ１６４０
培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を４５ｍｌ加え３７℃
にて３０分間攪拌した。茶こしを用いて濾液を回収し
た。茶こしに残った残渣を５０ｍｌの遠心管中に入れ、
ＲＰＭＩ１６４０培地を１５ｍｌ加え、激しく１５秒振
り、茶こしを用いて濾液を回収した。これを３回繰り返
した。これらの濾液を合わせ、グラスウールのカラムに
通した後、遠心し細胞を沈殿させペレットの細胞を回収
して１５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。再
度フラスコに戻し、フラスコ内での攪拌に始まる手続き
を２回繰り返して、細胞を回収した。

【０１１０】これらの細胞回収液を遠心し細胞を再度集
め、一つのストックとし、さらに２回ＰＢＳ（Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｔｓ；大日本製
薬（株）製Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−１０３−０５）で洗
った。この細胞を８ｍｌの４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ溶
液（ＲＰＭＩ１６４０培地中）に懸濁後、半量ずつ２ｍ
ｌの７５％Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液（ＲＰＭＩ１６４０
培地中）に重層し、室温で８００×ｇで２０分間遠心し
た。４０％溶液と７５％溶液の境界面の細胞画分をＩＥ
Ｌ（ＩｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌＬｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｅｓ）として回収した。

【０１１１】この細胞を５×１０⁶個を回収しＱｕｉ
ｃｋＰｒｅｐＴｏｔａｌＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏ
ｎｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて製造者のプ
ロトコルに従って全ＲＮＡを精製した。舌については、
開頭後舌全部を切り取り、手術用はさみで細かく切断
し、以下ＱｕｉｃｋＰｒｅｐＴｏｔａｌＲＮＡｅ
ｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
用いて製造者のプロトコルに従って全ＲＮＡを精製し
た。

【０１１２】これらのＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８９−０１１）のキット
を用いてｃＤＮＡを合成した。また、マウスＤＮＡゲノ
ムはＣｌｏｎｔｅｃｈ社より購入した（Ｃａｔ．Ｎｏ．
６６５０−１）。

【０１１３】上記のｃＤＮＡ３μｌ（ゲノムＤＮＡは１
００ｎｇ相当を３μｌに希釈した。また、ネガティブコ
ントロールには水を同量加えた。）に７μｌのｄＮＴＰ
混合物、４μｌの１０ｘ緩衝液、２μｌの２５ｍＭＭ
ｇＣｌ₂溶液、１μｌずつ（２０ｐｍｏｌずつ）のプラ
イマーｍ２４０Ｆ（配列表配列番号１５；５’ＧＣＴＣ
ＡＴＣＡＡＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＡＡ
ＧＴＣＴＣ３’、配列表配列番号４のＤＮＡ配列の
４１７番目のＧから４４８番目のＣに対応）、プライマ
ーｍ２４０Ｒ（配列表配列番号１６；５’ ＴＴＡＡＡ
ＴＧＧＴＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴ
ＡＧ３’、配列表配列番号４のＤＮＡ配列の７６１番目
のＣから７８９番目のＴおよびストップコドンＴＡＡの
相補鎖に対応）を加え、ＰＣＲ混合液とした。この混合
液を、ＴａＫａＲａＰＣＲｔｈｅｒｍａｌＣｙｃ
ｌｅｒ４８０を用いて、９４℃１分、５５℃２分、７
２℃３分を３０サイクル行ったのち、７２℃７分の反応
を行った。このＰＣＲ産物を０．８％アガロース・ゲル
中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジー
ン社製）にて染色後、紫外線下で観察した。その結果、
ネガティブコントロールを除く３つのサンプルで約４０
０ｂｐの同じ移動度のバンドが観察された。このバンド
のサイズは、実施例３および４で得られた断片が同一の
遺伝子をコードしていると考えたときに得られるバンド
のサイズ３７５ｂｐとよく一致した。

【０１１４】

【実施例１０】 7回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０
発現ベクターの作製ヒト肺由来のｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
社、Ｃａｔ＃ＨＬ５０３０ｔ）を鋳型として全長ＥＴ２
４０遺伝子のＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲにはＨｉｇｈ
ＦｉｄｅｌｉｔｙＴａｑポリメラーゼ（ベーリンガー
マンハイム社製）を用いた。このファージライブラリー
溶液２μｌと脱イオン水３６μｌを混合し９５℃で７分
間加熱したものに、Ｔａｑポリメラーゼ１μｌと、Ｔａ
ｑポリメラーゼに添付のバッファー５μｌと、２．５ｍ
ＭｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）４μｌ
と、オリゴヌクレオチドＦ４：５’ＡＣＴＡＣＡＡＡＡ
ＧＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＡＡＣ
３’（配列表配列番号１７；配列表配列番号３の２番目
のＴから２２番目のＣまでの２１残基の５’側に制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を導入するためのＡＡＧ
Ｃ、スペーサー配列ＡＣＴＡＣＡＡを加えたもの）、お
よびオリゴヌクレオチドＲ４：５’ＡＡＡＡＧＣＴＣＧ
ＡＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣＴＡＡＡ
ＡＧ３’（配列表配列番号１８；配列表配列番号３の１
０４９番目のＣから１０７６番目のＣの塩基配列のアン
チセンス配列の５’側に制限酵素ＸｂａＩの認識部位を
導入するためのＣＴＣ，スペーサー配列としてのＡＡＡ
ＡＧを加えたもの）を、それぞれ２０ピコモルを加え、
最終容量５０μｌとした。

【０１１５】この混合物を、ＴａＫａＲａＰＣＲｔ
ｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ４８０を用いて、９５℃
１分、６５℃２分、７２℃３分を５サイクル行ったの
ち、９５℃１分、６２℃２分、７２℃３分を５サイク
ル、さらに９５℃１分、５９℃２分、７２℃３分を５サ
イクル行い、その後９５℃１分、５０℃２分、７２℃３
分を２０サイクル行って、最後に７２℃７分の反応を行
った。このＰＣＲ産物を０．８％アガロース・ゲル中で
電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社
製）にて染色後、紫外線下で観察し、約１０００ｂｐの
ｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。この、目的
とする遺伝子産物をゲルから切り出し、Ｓｕｐｒｅｃ０
１（宝酒造製）を用いて、ＤＮＡの精製を行った。この
精製ＤＮＡをＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＴＡＣｌｏｎｉ
ｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、
添付のプロトコールに従って、ｐＣＲ３．１ベクターに
組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたｐＣＲ３．１を大腸
菌ＩＮＶαＦ′ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（Ｉｎ
ｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリ
ン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏ
ｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２
時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為
選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液
体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振とう
培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラス
ミドを分離した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩでの切断によ
り、正しい方向に断片が挿入されているものを選び出
し、ＤＮＡの塩基配列決定に供した。

【０１１６】ＤＮＡ塩基配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｅｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用い
て、実施例３と同様に行った。シークエンスプライマー
はＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉ
ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添付のプライマーと実
施例５に記載のＦ１およびＲ１プライマーを用いた。７
つのクローンについて塩基配列の決定を行い、そのコン
センサス配列は、配列表配列番号３に示したｃＤＮＡの
配列と同一であり、そのコンセンサス配列をもつ発現プ
ラスミドをｐＥＴ２４０Ｈと命名した。なお、７クロー
ンのうち３クローンは配列表配列番号３のＤＮＡ配列の
６７８番目の残基ＡがＧに変わっていた。この変化は頻
度が高いため、アリリック変異であると判断した。

【０１１７】なお、このプラスミドｐＥＴ２４０Ｈを大
腸菌ＩＮＶαＦ’に導入した菌株Ｅ．ｃｏｌｉ：ＩＮＶ
αＦ’−ｐＥＴ２４０Ｈは日本国通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−
６２１３として寄託されている。

【０１１８】

【実施例１１】発現ベクターの細胞への遺伝子導入と
発現実施例１０で作製した発現ベクターを２９３細胞（大日
本製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１
５７３）に遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の継
代は、ＭＥＭｗｉｔｈＥａｒｌｅｓＳａｌｔｓ
（ＭＥＭアール液体培地、大日本製薬（株）Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．１２−１０２−５４ＣＮ）を用い、１０％馬血清
（５６℃２０分間熱処理して非働化した；ＩＣＮＢｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．Ｎｏ．２９２
１１４９）、１００分の１量のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ溶液（大日本製薬（株）Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６−７０Ｄ−４９ＤＮ）を加えた。細胞
は、５×１０⁴個／ｍｌから５×１０⁵個／ｍｌの濃度
で培地中に植え付け、３７℃、５％二酸化炭素、湿度１
００％で培養し、コンフルエントになるまで培養した。
培地を吸引・廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液（Ｃｏｓｍ
ｏＢｉｏＣｏ．，Ｌｔｄ．）処理により、細胞をプ
レート底面よりはがした。前記の培地（血清を含む）を
加えて反応を停止させた。その後、ピペッティングによ
って細胞を均一に懸濁し、遠心して（１０００ｒｐｍ
１５分；ＫＳ−８３００型、久保田製作所、ＲＳ３００
０／６型ローター）回収し、新しい培地に再度懸濁し継
代した。遺伝子導入は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキ
ット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＶ２７８０−１）を用いリン酸
カルシウム共沈法にて行い（添付のプロトコル６ペー
ジ）、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を
コードするＤＮＡを保持する形質転換体を作成した。Ｄ
ＮＡは３５ｍｍプレートあたり５μｇを用いた。

【０１１９】膜画分の調製は、以下のように行った。ｐ
ＥＴ２４０を遺伝子導入した細胞およびｐｃＤＮＡ３プ
ラスミドを導入した細胞を２４〜４８時間培養した。そ
の後、培地はアスピレータで吸引し廃棄し、ＰＢＳ（大
日本製薬（株）Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−１０３−０５）を
用いて細胞を洗浄し、その後１ｍｌ／プレートのＰＢＳ
を加え、ＣｅｌｌＳｃｒａｐｅｒ−Ｌ（住友ベークラ
イト、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＳ−９３３００）を用いてプレ
ートからはがした。その後、３プレートあたり１ｍｌの
ＰＢＳを加え、プレートを洗浄し、回収した細胞に加え
た。この細胞懸濁液をＰｏｌｙｔｒｏｎ（ＫＩＮＥＭＡ
ＴＩＫＡ社製、ＰＴ１０−ＳＫ）で破砕し、マイクロチ
ューブ用遠心機（トミー精工、ＭＲＸ−１５０型）で４
℃，１３０００×ｇで１５分間遠心した。上清を捨て、
さらに２度ＰＢＳを加え懸濁後、同じ条件で遠心した。
バイオ・ラッド社のプロテインアッセイキットを用いて
蛋白質を定量し、蛋白質量が、１ｍｇ／ｍｌになるよう
ＰＢＳを加えて調製した。この懸濁液を膜画分調製液と
した。

【０１２０】こうして得られた膜画分調製液を用いてウ
ェスタンブロッティング法にて７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０の発現を確認した。すなわち、膜画分をＡ
ＣＩジャパン社製のＳＤＳ―ＰＡＧＥ用電気泳動槽及び
ＳＤＳ―ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエ
ントゲル５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従
ってＳＤＳ―ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２―メ
ルカプトエタノール（２―ＭＥ）を加えて５分間の沸騰
水浴加熱処理により還元処理を行った。マーカーとして
はＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量
用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッファーにつ
いては添付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ―
ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブ
ランフィルター（ＢｉｏＲａｄ社製）に同社製ミニトラ
ンスブロットセルにより転写した。

【０１２１】このように作製されたフィルターをブロッ
クエース（大日本製薬社製）、ＴＢＳ―Ｔ（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１３７ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．
６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に４℃で一晩振とう
してブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティン
グ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付の説明書
に従い、一次抗体として実施例１５に記載した抗ＥＴ２
４０抗血清を用い、二次抗体としてペルオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇロバ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反
応させた。

【０１２２】抗体の反応時間は各々室温で一時間反応さ
せ、各反応間はＴＢＳ―Ｔにて１０分間室温で振とう洗
浄する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィ
ルターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、ポリ
塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光させ
た。分子量マーカーとの比較の結果、約３８〜４２ｋ
ＤのバンドがｐＥＴ２４０Ｈを遺伝子導入をしたものに
ついてのみ得られ、ｐｃＤＮＡ３を導入した細胞には観
察されなかった。

【０１２３】

【実施例１２】リガンドのスクリーニング遺伝子導入を行わない２９３細胞とＥＴ２４０形質転換
体２９３細胞の膜画分を実施例１１と同様にして調製し
た。膜画分調製液５０μｌもしくはＰＢＳ（大日本製薬
（株）Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−１０３−０５）と放射性標
識された候補化合物ＣＧＳ２１６８０（Ｄｕｐｏｎｔ
ＮＥＮ社、カタログ番号ＮＥＴ−１０２１）５０μ
ｌ（終濃度１００ｎＭ）、ＰＢＳ５０μｌを加え、全
量を１５０μｌとした。混合して候補化合物と７回膜貫
通型受容体蛋白質ＥＴ２４０を接触させ、３７℃で３０
分間保温した後、マイクロチューブ用遠心機（トミー精
工、ＭＲＸ−１５０型）で室温、１５０００×ｇで１５
分間遠心し、ＥＴ２４０蛋白質と結合した候補化合物と
結合していないものを分離した。その上清を１μｌと
り、１０ｍｌの液体シンチレーター用カクテル（Ｄｕｐ
ｏｎｔＮＥＮ，ＥＣＯＮＯＦＬＵＯＲ−２）に加え、
混合した。その後、ＢｅｃｋｍａｎＬＳ６０００ＬＬ
型シンチレーションカウンターを使用して放射活性をカ
ウントし、ＥＴ２４０遺伝子導入の有無で得られた放射
活性を比較した。

【０１２４】その結果、得られた放射活性はＥＴ２４０
遺伝子導入の有無で差がなかった。

【０１２５】

【実施例１３】リガンドのスクリーニング実施例１０で作製した発現ベクターをＣＨＯ細胞（大日
本製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６
１）に遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の継代は、
Ｆ−１２ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅ（ＨＡＭ
培地、ＧＩＢＣＯＢＲＬカタログ番号１１７６５−０
４７）を用い、最終濃度１０％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ
ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ；ＧＩＢＣＯＢＲＬＣ
ａｔ．Ｎｏ．１００９９−１４１；５６℃２０分間熱処
理して非働化した）、１００分の１量のＰｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ溶液（大日本製薬
（株）Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−７０Ｄ−４９ＤＮ）を加え
た。細胞は、５×１０⁴個／ｍｌから５×１０⁵個／ｍ
ｌの濃度で培地中に植え付け、３７℃、５％二酸化炭
素、湿度１００％で培養し、コンフルエントになるまで
培養した。培地は吸引・廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液
（ＣｏｓｍｏＢｉｏＣｏ．，Ｌｔｄ．）処理により、
細胞をプレート底面よりはがした。前記の培地（血清を
含む）を加えて反応を停止させた。その後、ピペッティ
ングによって細胞を均一に懸濁し、遠心して（１０００
ｒｐｍ１５分；ＫＳ−８３００型、久保田製作所、Ｒ
Ｓ３０００／６型ローター）回収した。新しい培地に再
度懸濁し、継代した。

【０１２６】遺伝子導入は、ＢＩＯＲＡＤ社のＧｅｎ
ｅＰｕｌｓｅｒを用いてエレクトロポレーションで行っ
た。ＣＨＯ細胞は上記のようにトリプシン処理を行い
プレート底面よりはがし、エレクトロポレーション用緩
衝液（２７２ｍＭＳｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭＭｇＣ
ｌ₂，７ｍＭリン酸緩衝液）で洗浄後、５ｘ１０⁶ｃｅ
ｌｌ／５００μｌになるよう同じエレクトロポレーシ
ョン用緩衝液に懸濁し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＣｕ
ｖｅｔｔｅに分注した。実施例１０で作製したプラス
ミドのＤＮＡｐＥＴ２４０Ｈを５μｇ用いた。５分間
氷冷後、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒのセルチャンバーに入
れ、３μＦ，５５０Ｖの条件で２回パルスをかけた。再
度５分間氷冷後、３７℃に保温した培地を１０ｍｌ加え
直径１０ｃｍの細胞培養用シャーレに移した。その後、
約２４時間後に培地を新しいものと交換しさらに約２４
時間培養した。さらにこの細胞を、種々の細胞濃度で４
００μｇ／ｍｌの濃度のネオマイシン（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｉｎ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ１８１１−０２３）を含む培
地に植え替えた。その後、２週間前後培養し増殖した細
胞をヒトＥＴ２４０蛋白質発現細胞とした。

【０１２７】以上のように作成したヒト由来７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＴ２４０発現細胞を用いて、化学遊走
の測定を行った。リガンド候補物質としては、ＬＰＳ
（リポポリサッカライド）投与ラット血清を用いた。７
週令のＷｉｓｔａｒラットを（株）日本生物材料より購
入した。サルモネラミネソタＲＥ５９５由来ＬＰＳ（Ｓ
ｉｇｍａ社製）を日本薬局方生理食塩水に最終濃度１ｍ
ｇ／ｍｌになるように懸濁した。懸濁液をソニケーター
（Ｂｒａｎｓｏｎ社製）でソニケートし、透明な液とし
た。これを日本薬局方生理食塩水で１０倍に希釈し、４
００μｌ，尾静脈より投与した。投与後約２２時間後の
ラットをエーテル麻酔し開腹して心臓より採血した。マ
イクロチューブ用遠心機（トミー精工、ＭＲＸ−１５０
型）で４℃，１３０００×ｇで１５分間遠心し、その上
清を−２０℃で保存した。これを被検物質溶液とした。

【０１２８】９６穴マイクロプレートチャンバー（フナ
コシ（株）カタログ番号ＦＥ―２２９２−９６）に９６
穴マイクロプレート（フナコシ（株）カタログ番号ＦＥ
―２３００−０２）および１５μｇ／ｍｌのフィブロネ
クチン（Ｓｉｇｍａ，ＰＢＳ（大日本製薬（株）カタロ
グ番号２８−１０３−０５）中に溶解した）で処理した
８μｍのポアサイズのフレームフィルター（フナコシ
（株）カタログ番号ＦＥ−２３４０−０８）を据え付け
た。下室には０．１５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を含
むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯＢＲＬカタログ番
号２２４００−０７１）で被検物質溶液を１０倍希釈し
て加えた。上室には０．１５％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ
１６４０に懸濁した７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４
０発現細胞を加え、被検物質とＥＴ２４０蛋白質を接触
させた。この状態の９６穴マイクロプレートチャンバー
を５％二酸化炭素、３７℃で５時間保温した。フィルタ
ーを固定・染色して顕微鏡下で観察した。その結果、化
学遊走している細胞が観察された。

【０１２９】

【実施例１４】リガンドと拮抗する物質のスクリーニ
ングＥＴ２４０形質転換ＣＨＯ細胞を用い形質転換体の化学
遊走試験を行った。（i）実施例１３で作製したＥＴ２
４０形質転換ＣＨＯ細胞に発現する７回膜貫通型受容体
蛋白質ＥＴ２４０と実施例１３に示したＬＰＳ投与ラッ
ト血清をリガンドとして用いて実施例１３と同様に化学
遊走している細胞を観察した。さらに、（ii）実施例１
３の実験の際に上室および下室に含まれる溶液に最終濃
度１００μＭのＮ−エチルカルボキシアミドアデノシン
（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて実施例１３と同様に化学遊
走している細胞を観察した。そののち、（i）（ii）を
比較したが、両者に差はなかった。

【０１３０】

【実施例１５】ＥＴ２４０蛋白質を認識する抗体の作
成実施例１０で作製した発現ベクターをＢＡＬＢ／ｃ３
Ｔ３細胞（大日本製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ
番号ＣＣＬ−１６３）に遺伝子導入した。遺伝子導入前
の細胞の継代は、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥ
Ｍ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用い、最終濃度１０％の
ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ；Ｇ
ＩＢＣＯＢＲＬＣａｔ．Ｎｏ．１００９９−１４
１；５６℃２０分間熱処理して非働化した）、１００分
の１量のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｉｎ溶液（大日本製薬（株）Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−７０
Ｄ−４９ＤＮ）を加えた。細胞は、５×１０⁴個／ｍｌ
から５×１０⁵個／ｍｌの濃度で培地中に植え付け、３
７℃、５％二酸化炭素、湿度１００％で培養し、コンフ
ルエントになるまで培養した。培地は吸引・廃棄し、Ｅ
ＤＴＡトリプシン液（ＣｏｓｍｏＢｉｏＣｏ．，Ｌ
ｔｄ．）処理により、細胞をプレート底面よりはがし
た。前記の培地（血清を含む）を加えて反応を停止させ
た。その後、ピペッティングによって細胞を均一に懸濁
し、遠心して（１０００ｒｐｍ１５分；ＫＳ−８３０
０型、久保田製作所、ＲＳ３０００／６型ローター）回
収した。新しい培地に再度懸濁し、継代した。

【０１３１】遺伝子導入は、ＢＩＯＲＡＤ社のＧｅｎ
ｅＰｕｌｓｅｒを用いてエレクトロポレーションで行っ
た。ＣＨＯ細胞は上記のようにトリプシン処理を行い
プレート底面よりはがし、エレクトロポレーション用緩
衝液（２７２ｍＭＳｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭＭｇＣ
ｌ₂，７ｍＭリン酸緩衝液）で洗浄後、５ｘ１０⁶ｃｅ
ｌｌ／５００μｌになるよう同じエレクトロポレーシ
ョン用緩衝液に懸濁し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＣｕ
ｖｅｔｔｅに分注した。実施例１０で作製したＥＴ２
４０発現ベクターのＤＮＡを５μｇ用いた。５分間氷冷
後、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒのセルチャンバーに入れ、３
μＦ，５５０Ｖの条件で２回パルスをかけた。再度５分
間氷冷後、３７℃に保温した培地を１０ｍｌ加え直径１
０ｃｍの細胞培養用シャーレに移した。その後、約２４
時間後に培地を新しいものと交換しさらに約２４時間培
養した。さらに培養上清を、種々の細胞濃度で４００μ
ｇ／ｍｌの濃度のネオマイシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，
ＧＩＢＣＯＢＲＬ１８１１−０２３）を含む培地に
植え替えた。その後、２週間前後培養し増殖した細胞を
ヒトＥＴ２４０蛋白質発現細胞とした。

【０１３２】この細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫する
ことによって本発明のヒト由来のＥＴ２４０蛋白質の抗
体を作製した。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャー
ルスリバーより購入、メス、７週齢）の腹腔内に上記の
ようにして調製した１×１０⁷の細胞を打ち、２週置き
に５回繰り返して投与した。最後の免疫は静脈内に細胞
を投与した。７日後に全採血しその血清を、抗ヒトＥＴ
２４０蛋白質抗血清とした。

【０１３３】

【発明の効果】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ
２４０は、白血球の機能を制御する医薬品を検索するこ
とに使用が可能である。

【０１３４】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：３５０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Ala Leu Glu Gln Asn Gln Ser Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Glu Asn 1 5 10 15 Glu Met Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Ser Gln Tyr Glu Leu Ile Cys Ile 20 25 30 Lys Glu Asp Val Arg Glu Phe Ala Lys Val Phe Leu Pro Val Phe Leu 35 40 45 Thr Ile Val Phe Val Ile Gly Leu Ala Gly Asn Ser Met Val Val Ala 50 55 60 Ile Tyr Ala Tyr Tyr Lys Lys Gln Arg Thr Lys Thr Asp Val Tyr Ile 65 70 75 80 Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Leu Phe Thr Leu Pro Phe 85 90 95 Trp Ala Val Asn Ala Val His Gly Trp Val Leu Gly Lys Ile Met Cys 100 105 110 Lys Ile Thr Ser Ala Leu Tyr Thr Leu Asn Phe Val Ser Gly Met Gln 115 120 125 Phe Leu Ala Cys Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Val Ala Val Thr Lys Val 130 135 140 Pro Ser Gln Ser Gly Val Gly Lys Pro Cys Trp Ile Ile Cys Phe Cys 145 150 155 160 Val Trp Met Ala Ala Ile Leu Leu Ser Ile Pro Gln Leu Val Phe Tyr 165 170 175 Thr Val Asn Asp Asn Ala Arg Cys Ile Pro Ile Phe Pro Arg Tyr Leu 180 185 190 Gly Thr Ser Met Lys Ala Leu Ile Gln Met Leu Glu Ile Cys Ile Gly 195 200 205 Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Met Gly Val Cys Tyr Phe Ile Thr Ala 210 215 220 Arg Thr Leu Met Lys Met Pro Asn Ile Lys Ile Ser Arg Pro Leu Lys 225 230 235 240 Val Leu Leu Thr Val Val Ile Val Phe Ile Val Thr Gln Leu Pro Tyr 245 250 255 Asn Ile Val Lys Phe Cys Arg Ala Ile Asp Ile Ile Tyr Ser Leu Ile 260 265 270 Thr Ser Cys Asn Met Ser Lys Arg Met Asp Ile Ala Ile Gln Val Thr 275 280 285 Glu Ser Ile Ala Leu Phe His Ser Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Val 290 295 300 Phe Met Gly Ala Ser Phe Lys Asn Tyr Val Met Lys Val Ala Lys Lys 305 310 315 320 Tyr Gly Ser Trp Arg Arg Gln Arg Gln Ser Val Glu Glu Phe Pro Phe 325 330 335 Asp Ser Glu Gly Pro Thr Glu Pro Thr Ser Thr Phe Ser Ile 340 345 350

【０１３５】配列番号：２配列の長さ：２６３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Leu Leu Leu Leu Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asn Ala Val His 1 5 10 15 Gly Trp Ile Leu Gly Lys Met Met Cys Lys Val Thr Ser Ala Leu Tyr 20 25 30 Thr Val Asn Phe Val Ser Gly Met Gln Phe Leu Ala Cys Ile Ser Ile 35 40 45 Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Thr Lys Ala Pro Ser Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 60 Arg Pro Cys Trp Ile Ile Cys Cys Cys Val Trp Met Ala Ala Ile Leu 65 70 75 80 Leu Ser Ile Pro Gln Leu Val Phe Tyr Thr Val Asn Gln Asn Ala Arg 85 90 95 Cys Thr Pro Ile Phe Pro His His Leu Gly Thr Ser Leu Lys Ala Ser 100 105 110 Ile Gln Met Leu Glu Ile Gly Ile Gly Phe Val Val Pro Phe Leu Ile 115 120 125 Met Gly Val Cys Tyr Ala Ser Thr Ala Arg Ala Leu Ile Lys Met Pro 130 135 140 Asn Ile Lys Lys Ser Arg Pro Leu Arg Val Leu Leu Ala Val Val Val 145 150 155 160 Val Phe Ile Val Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Val Val Lys Phe Cys Gln 165 170 175 Ala Ile Asp Ala Ile Tyr Leu Leu Ile Thr Ser Cys Asp Met Ser Lys 180 185 190 Arg Met Asp Val Ala Ile Gln Val Thr Glu Ser Ile Ala Leu Phe His 195 200 205 Ser Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Val Phe Met Gly Ala Ser Phe Lys 210 215 220 Asn Tyr Ile Met Lys Val Ala Lys Lys Tyr Gly Ser Trp Arg Arg Gln 225 230 235 240 Arg Gln Asn Val Glu Glu Ile Pro Phe Asp Ser Glu Gly Pro Thr Glu 245 250 255 Pro Thr Ser Ser Phe Thr Ile 260

【０１３６】配列番号：３配列の長さ：１１５０配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATTGGAGCC ATG GCT TTG GAA CAG AAC CAG TCA ACA GAT TAT TAT TAT GAG 51 Met Ala Leu Glu Gln Asn Gln Ser Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu 1 5 10 GAA AAT GAA ATG AAT GGC ACT TAT GAC TAC AGT CAA TAT GAA CTG ATC 99 Glu Asn Glu Met Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Ser Gln Tyr Glu Leu Ile 15 20 25 30 TGT ATC AAA GAA GAT GTC AGA GAA TTT GCA AAA GTT TTC CTC CCT GTA 147 Cys Ile Lys Glu Asp Val Arg Glu Phe Ala Lys Val Phe Leu Pro Val 35 40 45 TTC CTC ACA ATA GTT TTC GTC ATT GGA CTT GCA GGC AAT TCC ATG GTA 195 Phe Leu Thr Ile Val Phe Val Ile Gly Leu Ala Gly Asn Ser Met Val 50 55 60 GTG GCA ATT TAT GCC TAT TAC AAG AAA CAG AGA ACC AAA ACA GAT GTG 243 Val Ala Ile Tyr Ala Tyr Tyr Lys Lys Gln Arg Thr Lys Thr Asp Val 65 70 75 TAC ATC CTG AAT TTG GCT GTA GCA GAT TTA CTC CTT CTA TTC ACT CTG 291 Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Leu Phe Thr Leu 80 85 90 CCT TTT TGG GCT GTT AAT GCA GTT CAT GGG TGG GTT TTA GGG AAA ATA 339 Pro Phe Trp Ala Val Asn Ala Val His Gly Trp Val Leu Gly Lys Ile 95 100 105 110 ATG TGC AAA ATA ACT TCA GCC TTG TAC ACA CTA AAC TTT GTC TCT GGA 387 Met Cys Lys Ile Thr Ser Ala Leu Tyr Thr Leu Asn Phe Val Ser Gly 115 120 125 ATG CAG TTT CTG GCT TGT ATC AGC ATA GAC AGA TAT GTG GCA GTA ACT 435 Met Gln Phe Leu Ala Cys Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Val Ala Val Thr 130 135 140 AAA GTC CCC AGC CAA TCA GGA GTG GGA AAA CCA TGC TGG ATC ATC TGT 483 Lys Val Pro Ser Gln Ser Gly Val Gly Lys Pro Cys Trp Ile Ile Cys 145 150 155 TTC TGT GTC TGG ATG GCT GCC ATC TTG CTG AGC ATA CCC CAG CTG GTT 531 Phe Cys Val Trp Met Ala Ala Ile Leu Leu Ser Ile Pro Gln Leu Val 160 165 170 TTT TAT ACA GTA AAT GAC AAT GCT AGG TGC ATT CCC ATT TTC CCC CGC 579 Phe Tyr Thr Val Asn Asp Asn Ala Arg Cys Ile Pro Ile Phe Pro Arg 175 180 185 190 TAC CTA GGA ACA TCA ATG AAA GCA TTG ATT CAA ATG CTA GAG ATC TGC 627 Tyr Leu Gly Thr Ser Met Lys Ala Leu Ile Gln Met Leu Glu Ile Cys 195 200 205 ATT GGA TTT GTA GTA CCC TTT CTT ATT ATG GGG GTG TGC TAC TTT ATC 675 Ile Gly Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Met Gly Val Cys Tyr Phe Ile 210 215 220 ACA GCA AGG ACA CTC ATG AAG ATG CCA AAC ATT AAA ATA TCT CGA CCC 723 Thr Ala Arg Thr Leu Met Lys Met Pro Asn Ile Lys Ile Ser Arg Pro 225 230 235 CTA AAA GTT CTG CTC ACA GTC GTT ATA GTT TTC ATT GTC ACT CAA CTG 771 Leu Lys Val Leu Leu Thr Val Val Ile Val Phe Ile Val Thr Gln Leu 240 245 250 CCT TAT AAC ATT GTC AAG TTC TGC CGA GCC ATA GAC ATC ATC TAC TCC 819 Pro Tyr Asn Ile Val Lys Phe Cys Arg Ala Ile Asp Ile Ile Tyr Ser 255 260 265 270 CTG ATC ACC AGC TGC GAC ATG AGC AAA CGC ATG GAC ATC GCC ATC CAA 867 Leu Ile Thr Ser Cys Asp Met Ser Lys Arg Met Asp Ile Ala Ile Gln 275 280 285 GTC ACA GAA AGC ATC GCA CTC TTT CAC AGC TGC CTC AAC CCA ATC CTT 915 Val Thr Glu Ser Ile Ala Leu Phe His Ser Cys Leu Asn Pro Ile Leu 290 295 300 TAT GTT TTT ATG GGA GCA TCT TTC AAA AAC TAC GTT ATG AAA GTG GCC 963 Tyr Val Phe Met Gly Ala Ser Phe Lys Asn Tyr Val Met Lys Val Ala 305 310 315 AAG AAA TAT GGG TCC TGG AGA AGA CAG AGA CAA AGT GTG GAG GAG TTT 1011 Lys Lys Tyr Gly Ser Trp Arg Arg Gln Arg Gln Ser Val Glu Glu Phe 320 325 330 CCT TTT GAT TCT GAG GGT CCT ACA GAG CCA ACC AGT ACT TTT AGC ATT T 1060 Pro Phe Asp Ser Glu Gly Pro Thr Glu Pro Thr Ser Thr Phe Ser Ile 335 340 345 350 AAAGGTAAAA CTGCTCTGCC TTTTGCTTGG ATACATATGA ATGATGCTTT CCCCTCAAAT 1120 AAAACATCTG CATTATTCTG AAACTCAAAA 1150

【０１３７】配列番号：４配列の長さ：７８９配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 TTG TTA CTT CTG ATC ACG CTG CCT TTC TGG GCA GTT AAT GCA GTT CAC 48 Leu Leu Leu Leu Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asn Ala Val His 1 5 10 15 GGA TGG ATT CTA GGC AAA ATG ATG TGC AAA GTA ACG TCA GCC CTG TAC 96 Gly Trp Ile Leu Gly Lys Met Met Cys Lys Val Thr Ser Ala Leu Tyr 20 25 30 ACG GTA AAC TTT GTC TCT GGG ATG CAG TTC CTG GCT TGT ATC AGC ATT 144 Thr Val Asn Phe Val Ser Gly Met Gln Phe Leu Ala Cys Ile Ser Ile 35 40 45 GAC AGA TAT TGG GCA ATT ACC AAA GCC CCC AGC CAA TCA GGA GCG GGG 192 Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Thr Lys Ala Pro Ser Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 60 AGA CCC TGT TGG ATC ATC TGT TGC TGT GTG TGG ATG GCC GCC ATC TTG 240 Arg Pro Cys Trp Ile Ile Cys Cys Cys Val Trp Met Ala Ala Ile Leu 65 70 75 80 CTG AGC ATA CCC CAG CTG GTT TTT TAC ACA GTG AAT CAG AAT GCT AGG 288 Leu Ser Ile Pro Gln Leu Val Phe Tyr Thr Val Asn Gln Asn Ala Arg 85 90 95 TGC ACT CCC ATC TTT CCC CAC CAC CTA GGA ACA TCC CTG AAA GCA TCC 336 Cys Thr Pro Ile Phe Pro His His Leu Gly Thr Ser Leu Lys Ala Ser 100 105 110 ATT CAG ATG CTG GAA ATC GGC ATC GGC TTT GTG GTC CCG TTT CTC ATC 384 Ile Gln Met Leu Glu Ile Gly Ile Gly Phe Val Val Pro Phe Leu Ile 115 120 125 ATG GGC GTG TGC TAT GCC AGT ACC GCC AGG GCG CTC ATC AAG ATG CCC 432 Met Gly Val Cys Tyr Ala Ser Thr Ala Arg Ala Leu Ile Lys Met Pro 130 135 140 AAC ATT AAA AAG TCT CGC CCC CTC AGG GTT CTG CTC GCG GTG GTG GTG 480 Asn Ile Lys Lys Ser Arg Pro Leu Arg Val Leu Leu Ala Val Val Val 145 150 155 160 GTT TTC ATT GTC ACC CAG CTG CCC TAT AAC GTT GTT AAG TTC TGC CAA 528 Val Phe Ile Val Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Val Val Lys Phe Cys Gln 165 170 175 GCC ATA GAT GCC ATC TAC CTG CTG ATC ACC AGC TGC GAT ATG AGC AAA 576 Ala Ile Asp Ala Ile Tyr Leu Leu Ile Thr Ser Cys Asp Met Ser Lys 180 185 190 CGC ATG GAT GTC GCC ATC CAA GTC ACA GAG AGC ATC GCG CTC TTC CAC 624 Arg Met Asp Val Ala Ile Gln Val Thr Glu Ser Ile Ala Leu Phe His 195 200 205 AGC TGC CTC AAC CCC ATC CTG TAT GTC TTC ATG GGG GCC TCC TTC AAA 672 Ser Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Val Phe Met Gly Ala Ser Phe Lys 210 215 220 AAC TAT ATC ATG AAA GTG GCC AAG AAA TAT GGA TCC TGG AGA AGA CAG 720 Asn Tyr Ile Met Lys Val Ala Lys Lys Tyr Gly Ser Trp Arg Arg Gln 225 230 235 240 AGA CAG AAC GTG GAA GAA ATT CCT TTT GAT TCT GAG GGT CCT ACA GAG 768 Arg Gln Asn Val Glu Glu Ile Pro Phe Asp Ser Glu Gly Pro Thr Glu 245 250 255 CCA ACC AGT TCT TTT ACC ATT 789 Pro Thr Ser Ser Phe Thr Ile 260

【０１３８】配列番号：５配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴：１８、２２、２４残基めのＮはイノシンを
示す。配列 ATCTTAAGCT TGAACCTNGC CNTNGCDGAC 30 配列番号：６配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴：２２、２８残基めのＮはイノシンを示す。２１残基めのＮはＡまたはＧまたはＣまたはＴを示す。配列 CCCAACGAAT TCRTAGATSA NNGGRTTNAV RCA 33 配列番号７配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTGTAGCAG ATTTACTCCT TCTATTCAC 29 配列番号８配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCCGATGTCC ATGCGTTTGC TCATGTC 27 配列番号９配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTCGGGAAGC GCGCCATTGT GTTGGT 26

【０１３９】配列番号１０配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTGTGTACAA GGCTGAAGTT ATTTTGCAC 29 配列番号１１配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCATTAACAG CCCAAAAAGG CAGAGTG 27 配列番号１２配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATACGACTCA CTATAGGGCG AATTGGC 27 配列番号１３配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTGCGACAT GAGCAAACGC ATGGAC 26 配列番号１４配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTCAGTTATA GTTTTCATTG TCACTCAACT G 31

【０１４０】配列番号１５配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTCATCAAG ATGCCCAACA TTAAAAAGTC TC 32 配列番号１６配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTAAATGGTA AAAGAACTGG TTGGCTCTGT AG 32 配列番号１７配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ACTACAAAAG CTTGGAGCCA TGGCTTTGGA AC 32 配列番号１８配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AAAAGCTCGA GCAGTTTTAC CTTTAAATGC TAAAAG 36 配列番号１９配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser 1 10

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） 15/00 ＡＦターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA03 EA04 GA11 HA01 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 CE02 CE06 CE07 CE14 DA03 4B065 AA91Y AA93X AA93Y CA24 CA25 CA44 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA42 DA50 DA75 DA86 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表配列番号１で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴
とするヒト由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０
またはその塩。
【請求項２】配列表配列番号２で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴
とするマウス由来の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４
０またはその塩。
【請求項３】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０をコードする塩基配列を有する核酸を含有
する核酸。
【請求項４】請求項２記載の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＥＴ２４０をコードする塩基配列を有する核酸を含有
する核酸。
【請求項５】配列表配列番号３で表される塩基配列を
有する請求項３記載のヒト由来の核酸。
【請求項６】配列表配列番号４で表される塩基配列を
含む請求項４記載のマウス由来の核酸。
【請求項７】請求項３または４記載の核酸を含有する
ことを特徴とするベクター。
【請求項８】請求項７記載のベクターを保持すること
を特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０発現
形質転換体。
【請求項９】請求項８記載の形質転換体を培養し、形
質転換体の細胞膜にヒトまたはマウス由来の７回膜貫通
型受容体蛋白質ＥＴ２４０を生成せしめることを特徴と
する請求項１または請求項２記載の７回膜貫通型受容体
蛋白質ＥＴ２４０またはその塩の製造方法。
【請求項１０】請求項１または２記載の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＥＴ２４０もしくはその塩と、試験化合物
とを接触させることを特徴とする請求項１または２記載
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０に対するリガン
ドの決定方法。
【請求項１１】（ｉ）請求項１または２記載の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０もしくはその塩に、リガ
ンドを接触させた場合と（ｉｉ）請求項１または２記載
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０もしくはその塩
に、リガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比
較を行うことを特徴とするリガンドと請求項１または２
記載の７回膜貫通型受容体蛋白質ＥＴ２４０との結合を
阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１２】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＥＴ２４０に対する抗体。