JPH1132770A

JPH1132770A - ７回膜貫通型受容体蛋白質ｊｅｇ６２

Info

Publication number: JPH1132770A
Application number: JP9198428A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Ishimaru; 弘石丸; Takeshi Ono; 剛大野
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 1999-02-09

Abstract

(57)【要約】【課題】白血球の機能を制御し、疾患の制御を行うこ
と【解決手段】これまで知られていない７回膜貫通型受
容体を取得すること。【効果】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６
２は、白血球の機能を制御する医薬品を検索することに
使用が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、白血球に発現する
新規な７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２，それを構
成している部分ペプチドまたはこれらの塩に関する。ま
た、本発明は、前記７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６
２，それを構成している部分ペプチドをコードする核酸
あるいはその誘導体に関する。

【０００２】さらに、本発明は、この核酸を用いて遺伝
子操作により７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２を発
現させる７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の製造方
法、及びそれに使用される発現ベクター及び形質転換体
に関する。また、さらに本発明は、７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ６２を用いて、この蛋白質に対するリガン
ドを決定する方法、この蛋白質との結合を阻害する化合
物をスクリーニングする方法あるいはこの蛋白質に対す
る抗体に関する。

【０００３】本発明では、７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ６２を用いて白血球の機能を制御する医薬品を開発
することができる。

【０００４】

【従来の技術】白血球は血液細胞の一種であり、免疫・
炎症の種々の機能を司る。特に、感染の際には、種々の
有益な免疫・炎症反応のメカニズムによって、生体を防
御する（麻生芳郎訳、一目でわかる免疫学、メティガ
ル・サイエンス・インターナショナル発行、４８−６
１，１９９３年）。しかし、その一方で自己免疫など望
ましくない免疫・炎症作用をも引き起こす（麻生芳郎
訳、一目でわかる免疫学、メディカル・サイエンス・イ
ンターナショナル発行、６２-７３,１９９３年）。従っ
て、白血球の機能を制御する方法を得ることによって、
有益な免疫応答を引き起こし、感染や腫瘍の治癒をもた
らしたり、あるいは有害な免疫応答を減退させることに
より、自已免疫性疾患などを治療したりすることが可能
になると予想される。

【０００５】白血球の機能、すなわち、その増殖、分
化、活性化、化学遊走等は白血球に発現している様々な
受容体蛋白質によって制御されている。受容体とは、細
胞表面に存在し、他の細胞の表面や体液中に存在するシ
グナル分子と高い親和性で結合し、そしてその結合とい
う細胞外の出来事を細胞内シグナルに変換して細胞の応
答を引き起こすものである（中村桂子・松原健一監修、
細胞の分子生物学（第２版）、教育社、936, 1990
年）。

【０００６】従って、これらの受容体の機能を変化させ
るもの、すなわちその受容体と結合して刺激するもの
や、受容体と結合して刺激を遮るもの、その刺激が細胞
内に伝達されることを阻害するものを得ることができれ
ば、白血球の機能を正や負に制御し、さらには、白血球
の機能の不足や過剰に起因する疾患の治療に役立つ物質
を得られることが予想される。

【０００７】白血球の受容体としては、サイトカイン受
容体ファミリー、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）
受容体ファミリー、７回膜貫通型受容体ファミリーなど
種々の受容体蛋白質が知られており（The Leucocyte An
tigen FactsBook，アカデミックプレス、38-49, 1993
年）、その機能は多岐にわたっている。７回膜貫通型受
容体蛋白質ファミリーは、このような受容体ファミリー
の一つであり、Ｇ蛋白質共役型受容体（G-protein coup
led receptor）、ロドプシン型受容体などとも呼ばれ
る。白血球における７回膜貫通型受容体蛋白質の研究は
比較的新しく開始されており、いまだ数多くの未知の７
回膜貫通型受容体蛋白質が存在すると考えられている。

【０００８】現在までに白血球に存在する７回膜貫通型
受容体蛋白質として同定されたものとしては、アナフィ
ラトキシンと結合する受容体群、ケモカインと結合する
受容体群、ＰＡＦ（血小板活性化因子）と結合する受容
体などがある。例えば、アナフィラトキシンの受容体
は、好中球やマクロファ一ジの機能、例えば、活性酸素
の産生、化学遊走、細胞接着の活性化に関与している
（Bouley，F．ら、Biochemistry 30,2993-2999,1991
年）。ケモカインと結合する受容体群の一つ、マウスの
ＩＬ―８（インターロイキン８）受容体ホモログの欠損
マウスでは、炎症誘導物質の腹腔内投与による好中球浸
潤が減少したと同時に好中球増加症、骨髄やリンパ節で
の顆粒球、形質細胞の増加が観察された（飯笹久、松島
綱冶、臨床免疫、２８,７３１-７３７,１９９６年）。
従って、これらの７回膜貫通型受容体蛋白質は、白血球
の増殖、分化、活性化、化学遊走等を制御している。こ
れらの受容体に作用する化合物のうち、疾患の治療剤と
して可能性があると考えられているものの中には、ＩＬ
−８，ＭＣＰ−１（Monocyte Chemotactic Protein 1）
のように受容体に結合して刺激するものや、ＩＬ―８変
異体のように受容体と結合して刺激を遮るものがある
（Howard,O.M.Z．ら、TIBTECH，14,46-51,1996年）。

【０００９】７回膜貫通型受容体においては、多くの場
合、受容体とシグナル分子の関係は１対１対応に対応し
ているのではない。従って、疾患の治療を考えた場合に
はシグナル分子を知ることだけでは不十分である。例え
ば、セロトニンの場合には、セロトニンという単一のシ
グナル分子に対し、イオンチャンネル型受容体という全
く異なるシグナル伝達経路の受容体を含む１４種の受容
体が知られており、さらに、個々の受容体に特異的に結
合する化合物も知られており（1996 Receptor&Ion Chan
nel Nomenclature Supplement, Trends Pharmacol.Sc
i.、1996年）、それぞれ異なる疾患の治療への応用も考
えられている。また、ケモカイン群の場合には、単一の
シグナル分子が多数の受容体と反応すると同時に、単一
の受容体が多数のシグナル分子と反応する例も多く知ら
れている（C.A.Powerら、Trends Pharmacol.Sci.17,209
-213,1996年）。

【００１０】従って、仮に単一のシグナル分子が疾患の
原因であるとしても、細胞の種類によって異なる受容体
が場合によっては複数存在し、疾患の原因である特定の
細胞群の機能を特異的に制御する場合には、その細胞に
作用するシグナル分子の特定よりもその細胞に発現して
いる受容体を特定することが重要となる。例えば、白血
球に作用するシグナル分子群ケモカイン群の場合、シグ
ナル分子ＲＡＮＴＥＳ（Regulated on Activation，Nor
mal T cell expressed and secreted）に対しては種々
の白血球が反応するが、好酸球にはケモカイン受容体の
一つＣＣＲ３が特異的に発現しており、好酸球を特異的
に制御する方法を検索する際には受容体ＣＣＲ３が必要
となる（Howard,O.M.Z．ら、TIBTECH,14,46-51,1996
年）。

【００１１】さらに、これらの受容体の中にはウイルス
の感染の際の受容体として働くものがあることが知られ
ており（たとえば、Choe H. ら、Cell 85, 1135-1148,
1996年）、これらの受容体に結合する分子がウイルスの
感染を防ぐことも知られている（たとえば、Bleul C.C.
ら、Nature, 382, 829-833, 1996年）。こういった場合
にも、ウイルスの感染する細胞に発現する受容体を知る
ことが肝要となる。

【００１２】現在に至るまで、白血球に作用するシグナ
ル分子のうち、例えば既知のケモカインのうちＰＦ４，
ＨＣＣ１などの受容体については７回膜貫通型受容体蛋
白質であると推定されているものの、受容体タンパク質
は同定されていない（Premack B.A．ら、Nature Medici
ne 2,1174-1178,1996年；Loetscher M．ら、J.Exp.Me
d．84,963-969,1996年）。特にケモカイン群について
は、さらに多くの新規ケモカインが存在すると推定され
ており（Howard，O.M.Z．ら、TIBTECH,14,46-51,1996
年）、さらに未知のケモカインに対する多くの受容体が
存在することが期待される。以上のように、白血球に作
用する分子の受容体はすべて理解されたわけではなく、
白血球にはさらに多くの７回膜貫通型受容体蛋白質が存
在し、かつ、それらの受容体の作用を変化させるものを
得ることによって、白血球の機能を制御し、ひいては、
疾患を制御する方法が得られると期待される。

【００１３】７回膜貫通型受容体蛋白質に作用する内因
性の物質は様々な受容体に対し様々な物質が知られてい
る。例えば、生理アミンであるグルタミン酸、ドーパミ
ンはそれぞれグルタミン酸受容体群、ドーパミン受容体
群に結合する。また、ペプチドである神経ペプチドＹ，
エンドセリンはそれぞれ神経ペプチドＹ受容体群、エン
ドセリン受容体群に結合する（Watson,S．およびSteve
Arkinstall著、The G-protein linked receptor FactsB
ook, Academic Press Inc.、1994年）。これらの中に
は、ケモカイン群、ＰＡＦのように白血球に作用するこ
とが知られているものとそうでなものがある。

【００１４】これらの７回膜貫通型受容体蛋白質を活性
化する物質は、天然・非天然を問わず、その物質と７回
膜貫通型受容体蛋白質、受容体を発現している細胞の３
者に依存して様々な細胞内シグナル分子の変動を引き起
こす。そのシグナル分子の変動は、例えば、細胞内ｃＡ
ＭＰ濃度の上昇・下降、イノシトールリン酸濃度の上
昇、細胞内カルシウム濃度の上昇、といった反応があり
（Watson,S．およびSteve Arkinstall著、The G-protei
n linked receptor FactsBook, Academic PressInc.,19
94年）、そのそれぞれを測定する方法も開発されてい
る。従って、これらの反応を測定することにより、特定
の物質が特定の７回膜貫通型受容体蛋白質を活性化する
かどうかあるいはその活性化を妨げるかどうかを判断す
る事ができる。このような物質が７回膜貫通型受容体蛋
白質と結合して生じる、増殖・遺伝子発現の変動・化学
遊走などの生理学的な現象を観察する方法も知られてお
り、同じく、特定の物質が特定の７回膜貫通型受容体蛋
白質を活性化するかどうかあるいはその活性化を妨げる
かどうかを判断することができる。

【００１５】このように７回膜貫通型受容体蛋白質に作
用する物質の同定方法としては種々の方法が知られてお
り、これらの方法を利用するためには、７回膜貫通型受
容体蛋白質を同定することが肝要である。こういった考
察に基づくと、白血球の機能を制御し、疾患の制御を行
うためには、これまで知られていない７回膜貫通型受容
体を取得することが大きな課題である。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、白血球
の機能を制御し、疾患をコントロールする手法はいまだ
完成されていない。その最大の原因は、疾患と関連した
白血球の機能を制御している受容体蛋白質、特に７回膜
貫通型受容体蛋白質が同定されていない点にある。本発
明の課題は、新規な７回膜貫通型受容体蛋白質、またそ
の蛋白質をコードするｃＤＮＡ，その蛋白質の発現系、
この蛋白質の応用、さらにその蛋白質の抗体を提供する
ことにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、白血球に
新規７回膜貫通型受容体が存在することを予想し、これ
らが白血球の機能を制御する医薬品の探索に役立つと考
えた。そこで実際に白血球に発現している新規な７回膜
貫通型受容体蛋白質ｃＤＮＡを取得するために、Differ
ential Display法（例えば、Liang,P．ら、Curr.Biol.
7,274-280,1995年）、ＲＤＡ法（Lisitsyn, N．ら、Sci
ence 259, 946-951,1993年）、degenerative PCR法（In
nis M.A．ら、PCR Protocols, pp39-53,1990年）など種
々の方法を、種々のヒト組織、白血球、白血球細胞株な
どを材料に検討した。特にdegenerative PCR法について
は、実施例１に示すプライマーを一例とする２0種以上
のプライマーを試験した。このような鋭意努力の結果、
白血球細胞株Jurkatより、本発明の７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ６２のｃＤＮＡ断片を取得した。そのの
ち、そのｃＤＮＡコード領域全長を取得し、それがコー
ドする新規タンパク質の発現系を作成し、さらにその抗
体を作成することにより、本発明を完成した。

【００１８】すなわち、本発明は配列表配列番号１に記
載のアミノ酸配列を含有する７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ６２に関する。また、配列表配列番号１に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする核
酸、これら核酸群の中から選ばれる核酸と、宿主細胞中
で発現可能なべクター核酸とを連結してなる組み換えＤ
ＮＡ体ベクター、これら組み換えＤＮＡ体ベクターによ
り形質転換された７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２
発現細胞、これらの細胞を培養し培養細胞から生産され
た化合物を採取する配列表配列番号1に記載のアミノ酸
配列を含有するポリペプチド（7回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ６２）の製造方法に関する。また、本発明は、
この7回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２に対するリガ
ンドのスクリーニング方法に関する。

【００１９】さらに、本発明は、この7回膜貫通型受容
体蛋白質ＪＥＧ６２を特異的に認識する抗体に関する。
本発明の7回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２のアミノ
酸配列を、配列表配列番号1に示し、それらをコードす
るＤＮＡ配列を配列表配列番号2に示した。これらの配
列をデータベース（GenBankリリース100.0，April，199
7年）で比較したところ、これらは新規な配列であっ
た。また、特許配列データベースDGENE (Derwent Infor
mation Ltd.,JUN 15, 1997)で比較したところ、これら
は新規な配列であった。

【００２０】また該7回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６
２の部分ペプチドを免疫原として各々に対する抗体（抗
体を含有する抗血清も含む）を作製し、この7回膜貫通
型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の精製法を確立し、本発明を
完成した。以下、本発明を詳細に説明する。配列表にお
いて、配列番号1のアミノ酸配列は、本発明の7回膜貫通
型受容体蛋白質ＪＥＧ６２のアミノ酸配列である。

【００２１】また、配列番号2の配列は本発明の7回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の全アミノ酸配列及びそれ
をコードしているｃＤＮＡ配列であり、ｃＤＮＡ配列の
４０２番目のＡから１５２３番目のＧが構造遺伝子（ア
ミノ酸をコードしている部分）である。配列番号3の配
列は本発明の7回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２に相
補的なｃＤＮＡ配列である。

【００２２】配列表配列番号４および５は、白血球に発
現している既知の7回膜貫通型受容体蛋白質の配列より
デザインしたdegenerative PCR法のためのプライマーの
配列である。配列表配列番号６および７、８および９は
配列表配列番号２および３の配列をもとに設計したサブ
クローニング用のプライマーである。

【００２３】なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の
左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下、Ｎ末とい
う）及びカルボキシル基末端（以下、Ｃ末という）であ
り、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ5’末端及
び3’末端である。また、表に関しては、表1は本発明の
7回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２と既知の遺伝子と
をアミノ酸配列での相同性を比較したものである。 Gen
etyx-Mac/DB Ver.37.0(Software Development Co.,Lt
d.)を用いてGenBank CDS（リリース100.0，April，１99
7年）をサーチしたのち、上位１0種についてGenetyx-Ma
c Ver.9.0（Software Development Co., Ltd．）を用い
てアミノ酸の同一度を計算させた結果である。表２は本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２と既知の遺
伝子とをｃＤＮＡ配列での相同性を比較したものであ
る。 Genetyx-Mac/DB Ver.37.0を用いてGenBank（リリ
ース100.0，April，１997年）をサーチしたのち、上位
２0種についてGenetyx-Mac Ver.9.0を用いてｃＤＮＡ配
列の同一度を計算した結果である。

【００２４】また、本発明で述べられる遺伝子操作に必
要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検
討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組
換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡ
ライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通
常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前
記の通常の実験書としては、たとえば、Molecular Clon
ing, A laboratory manual,1989年、Eds.,Sambrook,J.,
Fritsch,E.F., and Maniatis,T., Cold Spring Harbor
Laboratory Pressを挙げることができる。

【００２５】本発明のポリペプチドは、少なくとも配列
表配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有
するが、自然界で生じることが知られている生物種内変
異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点
変異による変異によって生じる改変体も、配列表配列番
号１のポリペプチドの性質を失わない限り配列表配列番
号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するものとして本発明の新規化合物に含まれ
る。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えばBennet
tらの特許出願（WO 96/2645）などに詳しく記載されて
おり、これらを参考にして作製することができ、これら
の方法によって改変、置換されたポリペプチドも本発明
に含まれる。

【００２６】配列表配列番号１のアミノ酸配列から予想
されることとして、糖鎖が付加される部分がある。Ｎ-
グリコシド結合の共通配列は、Asn-X-Ser／Thrであるこ
とが知られているが、配列番号１で１７番目のＡｓｎ
（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）がそれと同等な配列を有し
Ｎ―グリコシド修飾を受けている可能性がある。また、
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結
合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基
が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加され
たタンパク質の方がポリペプチドそのものよりも一般に
生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性
を有していると考えられる。したがって、配列番号１の
配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンやＮ−グルコシドやＮ−ア
セチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グリコシ
ドあるいはＯ−グリコシド結合してなるポリペプチドも
本発明に含まれる。

【００２７】また、実施例１に示すように、本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の天然のｃＤＮＡ断
片は白血病細胞Ｊｕｒｋａｔの亜株ＪｕｒｋａｔＺ１
８に由来するｃＤＮＡから取得された（亜株Ｊｕｒｋａ
ｔＺ１８は受託番号：ＦＥＲＭＢＰ-５８６６とし
て平成9年３月１１日に日本国通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている）。従って、本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２のｍＲＮＡ
は白血球細胞に発現していることが示された。また、実
施例３に示したように本発明の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ６２の天然のｍＲＮＡは白血球の多いと考えら
れるヒト組織、脾臓および胸腺に検出された。また、本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の天然のｃ
ＤＮＡ断片はバーキットリンフォーマ細胞株Ｒａｊｉに
由来するｃＤＮＡから取得された。従って、これらの材
料を用いても、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥ
Ｇ６２の天然のｃＤＮＡを取得することができる。ｍＲ
ＮＡは、細胞内のメカニズムにより蛋白質へと翻訳され
るので、白血球における本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ６２の天然のｍＲＮＡの検出は７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ６２の発現と同等と考えられる。

【００２８】これら配列番号１で表されるアミノ酸配列
を含有する７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２または
その塩、または、その蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩は、診断を目的とした抗体の作成や、治療を目的とし
た医薬品の検索に有用である。配列番号１のアミノ酸配
列をデータベース（GenBank CDS（リリース100.0，Apri
l，１997年），GenBankリリース100.0，April，1997
年）で比較したところ、これらは新規な配列であった。
該アミノ酸配列をKyte-Doolittleの方法（J.Mol.Biol.1
57:105, 1982）に従って、アミノ酸配列から疎水性部
分、親水性部分を解析した。その結果、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２は細胞膜通過部分を７つ
有する細胞膜蛋白質として、細胞表面に発現されること
が明らかとなった。

【００２９】表１に本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ６２と上記データベースとの比較で類似度が高い
とされた、これまで知られている７回膜貫通型受容体蛋
白質の配列の相同性の比較を示した。本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２は、既知のヒトおよびその
他のほ乳類の７回膜貫通型受容体蛋白質と３0％程度の
相同性を示し、新規なヒト７回膜貫通型受容体蛋白質で
あることが示された（表１）。既知の受容体の種間の相
同性は、例えば、アンジオテンシン受容体Ｉａの場合、
ヒト（Swiss-Prot Entry AG2R-Human）とラット（Swiss
-Prot Entry AC22-Rat）問で９０％を越える。従って、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２はこれま
でヒト以外の種で知られている受容体蛋白質のヒトにお
ける対応物ではないと考えられる。しかし、ほかの７回
膜貫通型受容体蛋白質との相同性がせいぜい３０％であ
り、本発明のペプチドＪＥＧ６２が７回膜貫通型受容体
に属する蛋白質であることがこのことからも示された。
これらの相同性から期待される既知のリガンドとして
は、例えば、ケモカイン群やソマトスタチン、アンジオ
テンシン、ブラディキニンなどの小ペプチドのホルモン
などが挙げられる。

【００３０】

【表１】

【００３１】また、配列表配列番号１のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドをコードする本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質の天然のｃＤＮＡ配列については、配列表
配列番号２にアミノ酸配列とともに示した。これらの遺
伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自
然界から分離した、染色体ＤＮＡ，またはｃＤＮＡにお
いて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードす
るアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列
が変異した例はしばしば認められる。また、５’非翻訳
領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列
の規定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列
は変異しやすい。このような変異や遺伝コードの縮重に
よって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。
以下、これらＤＮＡ群を本発明のＤＮＡとよぶ。

【００３２】配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列
と実質的に同等なポリペプチドをコードする本発明のＤ
ＮＡは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２
を製造する上で有用である。配列表配列番号２のＤＮＡ
配列をデータベース（GenBankリリース100.0，April，1
997年）で比較したところ、これは新規な配列であっ
た。表２に配列番号２の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥ
Ｇ６２のｃＤＮＡ配列とこれまで知られている７回膜貫
通型受容体蛋白質のｃＤＮＡの配列の相同性の比較を示
した。本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の
ｃＤＮＡは、既知のヒトおよびその他のほ乳類の受容体
と５５％以下の相同性を示し、新規なヒトの７回膜貫通
型受容体蛋白質ｃＤＮＡであることが示された。既知の
受容体ｃＤＮＡの種間の相同性は、例えば、アンジオテ
ンシン受容体の場合、ヒト（GenBank Entry HSU20860）
とラット（GenBank Entry S67465）間で８４％程度であ
る。従って、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
６２はｃＤＮＡ配列からみてもこれまでヒト以外の種で
知られている受容体蛋白質のヒトにおける対応物ではな
いと考えられる。また、他の遺伝子との相同性が５５％
以下であるので、他の既知の遺伝子を用いて一般的に行
われているクロスハイブリダイゼーションを用いたスク
リーニングでクローニングすることは困難であると考え
られる。

【００３３】

【表２】

【００３４】実際に、クロスハイブリダイゼーションの
アプローチを用いた例も数多くあるが、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２はクローニングされてい
ない（例えば、Murphy,P.M．ら、Science 253,1280-128
3，1991年； Combadiere C.ら、J.Biol.Chem．270, 164
91-16494,1995年）。実施例３に示すように、本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２のｃＤＮＡ配列の
一部を用いてNorthern解析を行ったところ、既知の受容
体遺伝子と考えられる転写産物は検出されなかった。ま
た、実施例２に示すように、本発明の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＪＥＧ６２のｃＤＮＡ配列の一部を用いてｃＤ
ＮＡライブラリースクリーニングを行ったところ、既知
の受容体遺伝子と考えられるクローンは検出されなかっ
た。このことから、実際に既知の遺伝子を用いたクロス
ハイブリダイセーションを用いたスクリーニングでクロ
ーニングすることは困難であることが示された。

【００３５】配列番号２で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２
を作成する上で、また、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ６２の詳細な機能を検討する上で有用であ
る。さらに、配列表配列番号２の遺伝子配列の少なくと
も一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ
以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上の核酸、及びそ
の誘導体、および／または、配列表配列番号３の遺伝子
配列の少なくとも一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒ
から１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上
の核酸、及びその誘導体、を用いれば、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２のｃＤＮＡクローン、ｃ
ＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ，ゲノム遺伝子クローンなどを検
出することができる。必要な核酸の長さはその配列の特
異性、検出しようとしている核酸との結合の安定性によ
って異なるが、ＤＮＡを用いてＰＣＲによって検出する
場合には、Ｔｍ（２本鎖解離温度）が摂氏４５度以上で
あることが望ましい。ＰＣＲのようにＤＮＡ同志が結合
する場合には、一つのＧＣ結合を４度とし、一つのＡＴ
結合を２度として合算し、Ｔｍを推定することができ
る。従って、ＧＣコンテントが高い場合には１２ｍｅｒ
の、一般的な５０％ぐらいのＧＣコンテント領域で１６
ｍｅｒの核酸が必要となる。よりＤＮＡとの結合が安定
な核酸誘導体を用いる場合にはさらに短い核酸を用いて
検出することが可能である。ハイブリダイゼーションに
よるｃＤＮＡクローンの検出の例は、実施例２に示し
た。例えば、遺伝子診断を目的としてこれらの遺伝子を
調べる方法として、配列表配列番号２および３の一部の
遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、さ
らに望ましくは２０ｍｅｒ以上の核酸、つまりＤＮＡ，
ＲＮＡ，及びそれらがメチル化、メチルフォスフェート
化、脱アミノ化、またはチオフォスフェート化された誘
導体を用い、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の手法
によって行うことがあげられる。同様な方法でマウス等
の他の生物の本発明の遺伝子のホモログの検出や遺伝子
クローニングができる。さらに、ヒトを含めたゲノム上
の遺伝子のクローニングも同様に可能である。従って、
そのようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用い
れば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の
更に詳細な機能も明らかにすることが出来る。例えば、
近年の遺伝子操作技術を用いれば、トランスジェニック
マウス、ジーンターゲッティングマウス、また、本発明
の遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノッ
クアウトなどのあらゆる方法を用いることが出来る。ま
た、本発明の遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺伝子
診断、遺伝子治療への応用も可能である。

【００３６】配列表配列番号３の遺伝子配列の少なくと
も一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ
以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上の核酸、及びそ
の誘導体、をコードするＤＮＡを用いれば、実施例３に
示したように本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
６２ｍＲＮＡの検出が可能である。たとえば、診断を
目的としてこれらの遺伝子の発現を調べる方法として、
配列表配列番号３の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅ
ｒから１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以
上の相補し得る核酸、つまりアンチセンスＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，及びそれらがメチル化、メチルフォスフェート化、
脱アミノ化、またはチオフォスフェート化された誘導体
すなわちアンチセンス核酸を用い、ハイブリダイゼーシ
ョン、プライマーエクステンション、ヌクレアーゼ・プ
ロテクション・アッセイ等の手法によって行うことが出
来る。また、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
６２の更に詳細な機能を明らかにすることを目的とし
て、細胞や生体へのアンチセンス核酸の投与も考えられ
る利用法である。本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ６２の過剰な反応が病態となっている疾患について
は、これらアンチセンス核酸により遺伝子の発現を抑え
ることによって、治療を行うことも可能である。また、
アンチセンス核酸を適当なベクターに組み込み、そのベ
クターを用いることも可能である。これらアンチセンス
核酸の作成例・使用例についてはＭｕｒｒａｙ，Ｊ．
Ａ．Ｈ．編、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥＲＮＡＡＮＤＤ
ＮＡ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２年、
に詳しい。

【００３７】以上のように、配列表配列番号２の遺伝子
配列の少なくとも一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒ
から１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以上
の核酸、及びその誘導体、及び配列表配列番号３の遺伝
子配列の少なくとも一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅ
ｒから１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ以
上の核酸、及びその誘導体、は診断などに有用であり、
配列表配列番号３の遺伝子配列の少なくとも一部の遺伝
子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、さらに
望ましくは２０ｍｅｒ以上の核酸、及びその誘導体は診
断、治療などに有用である。

【００３８】本発明の核酸を含有するベクターとして
は、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２，ｐＵＣ８，ｐＵ
Ｃ１９，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１９（いずれも日本国宝
酒造社製）などが挙げられるが、その他のものであって
も宿主内で複製増殖できるものであればいずれも用いる
ことができる。実施例４にベクターとしてｐＴａｒｇｅ
Ｔを、宿主として大腸菌を用いた例を示した。また本発
明のＤＮＡを含有するファ一ジベクターとしては、例え
ばλgt10，λgt11（米国Stratagene社製）などが挙げら
れるが、その他のものであっても宿主内で増殖できるも
のであれば用いることができる。このようにして、得ら
れたベクターは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Esch
erichia）属菌、バチルス（Bacillus）属菌、などにカ
ルシウムクロライド法等を用いて導入し、本発明のＤＮ
Ａを含有するベクターを保持する形質転換体を作成する
ことができる。上記エシェリヒア属菌の例としては、エ
シェリヒアコリＫ１２ＨＢ１0１，ＭＣ１０６
１，ＬＥ３９２，ＪＭ１０９、ＩＮＶαＦ’などが挙げ
られる。上記バチルス属菌の例としてはバチルスサチ
リスＭ１１１４等が挙げられる。また、ファージベクタ
ーは、例えば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージ
ング法（Proc.Natl.Acad.Sci．71:2442-, 1978）を用い
て導入することができる。尚、本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ６２の全アミノ酸配列をコードする
ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＪＥＧ６２ＢＳを大腸菌Ｉ
ＮＶαＦ’に遺伝子導入した形質転換細胞（実施例２）
Ｅ．ｃｏｌｉ：ＩＮＶαＦ’−ｐＪＥＧ６２ＢＳは、日
本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平
成９年７月４日に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ―６００７
として寄託されている。

【００３９】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
６２をコードする塩基配列を有する核酸を含有するベク
ターは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２
をコードする塩基配列を有する核酸を製造する上で、ま
た、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の核
酸を保持する形質転換体を作成する上で有用である。上
記の方法にて作成した本発明の核酸を用いた７回膜貫通
型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の発現には、成書によって知
られている（Kriegler, Gene Transfer andExpression-
A Laboratory Manual, Stockton Press,1990；および横
田ら、バイオマニュアルシリーズ４，遺伝子導入と発現
・解析法、羊土社、１99４）、多数の方法が用いられ
る。すなわち、分離した７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥ
Ｇ６２のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発
現ベクターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細
胞、バクテリアなどの原核細胞を宿主として生産させる
ことができる。

【００４０】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
６２を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコード
する核酸はその５’末端に翻訳開始コドンを有し、ま
た、３’末端には翻訳終止コドンを有していてもよい。
これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成
核酸アダプターを用いて付加することもできる。更に該
ＤＮＡを発現させるには上流にプロモーターを接続す
る。ベクターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯
草菌由来プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλ
ファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィル
ス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げ
られる。

【００４１】本発明に用いられるプロモーターとして
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが
好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、
宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰ
プロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿
主が原核細胞である場合には、プロモーターとともにリ
ボゾーム結合部位をもつことが好ましい。

【００４２】宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０
由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、
メタルチオネインプロモーター、ヒートショックプロモ
ーターなどが利用できる。本発明のポリペプチドを発現
させる時、配列表配列番号１のアミノ酸配列と実質的に
同等な蛋白質をコードする核酸のみでもよいが、膜表面
への発現を保証する必要のある場合には、既知シグナル
ペプチドをコードする核酸をＮ末に付加したり、産生さ
れたポリペプチドの検出を容易にするための既知抗原エ
ピトープをコードする核酸を付加することで、特別の機
能を付加した蛋白質を生産させることもできる。このよ
うな技術の一つの例として、Choe,H．ら、Cell,85,1135
-1148, 1996年を挙げることができる。

【００４３】本発明者らは、実施例４に示したごとく、
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２を発現する発現ベ
クターとして配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡを発現ベクターｐＴａｒｇｅＴ（Prom
ega社）につなぎ、本発明のＤＮＡを含む発現ベクター
を作製した。このようにして構築された７回膜貫通型受
容体蛋白質ＪＥＧ６２をコードするＤＮＡを含有する発
現ベクターを用いて、本発明のＤＮＡを含むベクターを
保持する形質転換体を製造する。

【００４４】宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バ
チルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細
胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ―７，Ｖｅｒ
ｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，カイコ細
胞ＳＦ９などが挙げられる。このようにして得られる本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２をコードす
る塩基配列を有する核酸を含有するベクターは、本発明
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２を産生する上で
有用である。

【００４５】実施例５，７に示したごとく、上記の発現
ベクターを遺伝子導入し、７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ６２をＣＨＯ細胞、２9３細胞などで発現させ、こ
れら発現プラスミドで形質転換された形質転換体が得ら
れる。これらの形質転換体は本発明の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＪＥＧ６２を産生する上で有用である。本発明
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２と実質的に同等
な蛋白質をコードする塩基配列を有する核酸を含有する
ベクターを保持した形質転換体を作成し、それぞれ公知
の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培
養することによって、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ６２またはその塩を製造することができる。例
えば実施例５のようにWestern blottingを用いたり、ま
た、ＦＡＣＳによって検査することにより、７回膜貫通
型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の生産を確認することができ
る。

【００４６】このようにして作成した、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２またはその塩を用いて、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２のリガン
ドを決定することができる。そのためには、まず、リガ
ンド候補である試験化合物を、純化した、または、未精
製の、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２と
接触させ、試験化合物の本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ６２に対する結合もしくはその結合により引
き起こされる反応を測定する。試験化合物の本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２に対する結合を測定
する場合には、純化した、または、未精製の本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２と試験化合物を接触
させ、複合体量および／または未結合の試験化合物量を
測定する。複合体量および／または未結合の試験化合物
量を測定する方法としては、例えば、放射性化合物や色
素などを用いて試験化合物を標識し、複合体と未結合の
試験化合物を分離し、標識を用いて複合体量および／ま
たは未結合の試験化合物量を測定する。この一つの例を
実施例６に示した。

【００４７】受容体と結合する化合物が知られている場
合には、その化合物を標識し、試験化合物が標識化合物
と競合するかどうかをもって、試験化合物の結合を測定
することもできる。これらの方法の例として、浅沼幹人
ら、実験医学１１，２２−２９，１９９３年に挙げられ
ている方法がある。そのほかにも、ＳＰＡ（Scintillat
ion Proximity Assay）のように複合体と未結合の試験
化合物を分離せずに測定する方法もある。

【００４８】一方、試験化合物と本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ６２の結合によりひき起こされる反
応を測定する場合には、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ６２の共役しているシグナル伝達系によって
様々な方法が考えられる。このような方法として、例え
ば唐木英明ら編、実験医学７，ｐｐ２６−１０９，１９
８９年のように細胞内カルシウムを測定する方法、Sams
on,M．ら、Biochem.35,pp3362-3367,1996年のようにマ
イクロフィジオメーターを用いる方法、細胞内ｃＡＭＰ
の量を測定する方法、などがある。リガンドとの結合に
よって引き起こされる反応を測定する１つの例を実施例
７に示した。これらＪＥＧ６２蛋白質もしくはその塩、
または、その部分ペプチドまたはその塩と試験化合物を
接触させるＪＥＧ６２蛋白質に対するリガンドを決定す
る方法は７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２に結合し
て白血球細胞の反応を制御する、疾患の治療を行う物質
を検索する上で有用である。

【００４９】さらに上記のようにして、リガンド、すな
わち、７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２に作用する
ものを発見した場合には、その作用の変化、すなわち、
その活性化を行ったり、活性化を阻害したりする物質を
検索することが可能である。そのことは、（i）７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２もしくはその塩またはそ
の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させ
た場合と（ii）７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２も
しくはその塩またはその部分ペプチドもしくはその塩
に、リガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比
較を行うことによって行うことができる。その一つの例
を実施例８に示した。この方法は、７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ６２に作用して白血球細胞の反応を制御す
る、疾患の治療を行う物質を検索する上で有用である。

【００５０】７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２を特
異的に認識する抗体は実施例１０に示したようにして作
製することができる。抗体を作製するためのペプチドの
長さは特に限定されないが、ＪＥＧ６２蛋白質を特徴づ
けられる長さがあればよく、好ましくは６アミノ酸以
上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれ
ばよい。このペプチドをそのまま、またはＫＬＨ（keyh
ole-limpet hemocyanin）やＢＳＡ（bovine serum albu
min）といったキャリア蛋白質と架橋した後に必要に応
じてアジュバントと共に動物へ接種せしめ、その血清を
回収することでＪＥＧ６２蛋白質を認識する抗体（ポリ
クローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。ま
た、抗血清より抗体を精製して使用することも可能であ
る。接種する動物としては、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサ
ギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体
作製にはヒツジ、ウサギが好ましい。また、ハイブリド
ーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗
体を得ることも可能であるが、この場合にはマウスが好
ましい。また、配列表配列番号１に示したアミノ酸の全
長または６残基以上、望ましくは８残基以上のアミノ酸
配列をＧＳＴ（グルタチオンＳ―トランスフェラー
ゼ）などと融合させたものを精製して、または未精製の
まま、抗原として用いることもできる。このような抗原
の作成の一例を実施例９に示し、抗体の作成の一例を実
施例１０に示した。成書（Antibodies a laboratory ma
nual, E.Harlow et al., Cold Spring Harbor Laborato
ry）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング
法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用い
て、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても作
製することができる。このように作製された抗体は本発
明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２の精製に利用
できる。

【００５１】また、実施例１０に示したこれらの７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２を特異的に認識する抗体
を用いれば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
６２の検出、測定が可能であり、細胞の分化異常を伴う
疾患、例えば悪性腫傷、ウイルス感染などの疾患の診断
薬として使用でき得る。また、実施例５に示すように、
この検出、測定には、Western Blotting, FACS（Fluore
scence Activated Cell Sorter）などを用いることがで
きる。ＦＡＣＳを用いた臨床診断の例は、例えば、天神
美夫ら編、フローサイトメトリーハンドブック、サイエ
ンスフォーラム社、１9８４年、の第４部フローサイ
トメトリーの臨床医学への応用、に示されている。これ
ら検出、測定については、Western Blotting（Immunobl
otting）に関してはAntibodies laboratory manual, E.
Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, pp４
７１-５１0にその方法の詳細が、免疫沈降、免疫測定な
どに関しては、同書ｐｐ４２１−４７０，ｐｐ５５３−
６１２にそれぞれ詳細が記されている。ＦＡＣＳの際の
細胞の染色については、高津聖志、瀧伸介、免疫研究の
基礎技術、羊土社、１９９５年、ｐｐ１６−６１に、Ｆ
ＡＣＳの操作については、天神美夫ら編、フローサイト
メトリーハンドブック、サイエンスフォーラム社、１９
８４年に詳細が示されている。

【００５２】以上のように、配列表配列番号１で表され
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
ることを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６
２またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはその
塩に対する抗体は本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ６２を発現している細胞を同定する上で有用であ
る。

【００５３】

【発明の実施の形態】以下に発明を実施する形態につい
て例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではな
い。

【００５４】

【実施例１】新規７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２断片の取得白血球細胞ＪｕｒｋａｔＥ６−１（ＡＴＣＣＴＩＢ
−１５２）はＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）よ
り入手し、ＩＬ―２（インターロイキン２）産生能の高
い亜株をさらに選択し、ＪｕｒｋａｔＺ１８株と命名
した。この細胞株は、前述のように日本国通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−５８６６として寄託されている。これを拡大培
養して保存し実験に用いた。細胞はセルバンカー（十慈
化学工業（株））に１mlあたり約１0⁷の濃度で懸濁し、
液体窒素液漕にて凍結保存した。通常の培養の際には、
培地はＲＰＭＩ１６４０（GIBCO BRL Cat.No.22400-07
1）を用い、最終濃度１0％のＦＢＳ（Fetal BovineSeru
m;GIBCO BRL Cat.No.10099-141；摂氏５６度２0分間熱
処理して非働化した）、１００分の１量のPenicillin-S
treptomycin溶液（大日本製薬（株）Cat.No．１６-７0D
-４9DN）を加えた。１0⁴細胞／mlから１0⁵細胞／mlにな
るように細胞を加え、摂氏３７度，５％二酸化炭素、湿
度１00％で培養し、１0⁶細胞／ml前後になった時点でピ
ペットでよく混合した後に新しい培地に植え替えた。

【００５５】全体で約５×１0⁷個の細胞を培養し、１０
００ｒｐｍで１５分の遠心（ＫＳ−８３００型、久保田
製作所、ＲＳ３０００／６型ローター）後、上清を吸引
・廃棄し、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Salts；大日本
製薬（株）製 Cat.No．２８-１0３-0５）を３０ｍｌ加
え懸濁後、再度同じ条件で遠心した。以下、Quick Prep
mRNA Purification Kit（Pharmacia Biotech製）を用
い、製造者のプロトコル（Rev.4.XV-025-00-07）１１〜
１４頁に従って（second column purificationは行わな
かった）、ｍＲＮＡを抽出した。エタノール沈殿後、Mo
lecular Cloning, A laboratory manual,1989, Eds. Sa
mbrook,J.,Fritsch,E.F., and Maniatis,T., Cold Spri
ng harbor Laboratory PressのE5,Spectrophotometric
Determination of the Amount of DNA or RNAに従って
定量した。１μｇのｍＲＮＡを用い、SuperScript Choi
ce System for cDNA Synthesis（Life Technologies
製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。プロトコル１１〜
１７頁（Protocol１および２）に従い、oligo（dT）プ
ライマーを用いて２重鎖（ｄｓ）ＤＮＡを合成した。そ
の後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈
殿後、４0μlの滅菌水に溶解した（これをｃＤＮＡサン
プルと呼ぶ）。

【００５６】このｃＤＮＡサンプルのうち４μｌを用い
てＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。Ｐ
ＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードR00１
A）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ，酵素
に添付のdNTP mixture４μｌと配列表の配列番号４に示
した合成オリゴヌクレオチドA および、配列表の配列番
号５に示した合成オリゴヌクレオチドBをそれぞれ２０
０ｐｍｏｌを加え、最終容量５0μlとした。

【００５７】この混合物を、TaKaRa PCR thermal Cycle
r 480を用いて、摂氏９５度１分、摂氏４０度２分、
摂氏７２度３分を５サイクル行ったのち、摂氏９５度１
分、摂氏５０度２分、摂氏７２度３分を２５サイクル行
った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロース・ゲ
ル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジ
ーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約７００ｂ
ｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。このバ
ンドをゲルから切り出して Suprec01（宝酒造社製）で
精製後、TA cloningキット（Invitrogen社製）を用いて
クローニングした。すなわち、ベクターとしてpCRII Ve
ctor（Invitrogen社製、以下pCRIIという）を用い、ベ
クターと先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるよう
に混ぜ合わせて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen社
製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み
込まれたベクターpCRIIを大腸菌One Shot Competent Ce
lls（Invitrogen社製）に遺伝子導入し、アンピシリン
（Sigma社製）を５０μｇ／ｍｌ含むL-Broth（宝酒造社
製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度摂氏３
７度に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同
濃度のアンピシリンを含むL-Broth液体培地２ｍｌに植
え付け、８時間程度摂氏３７度で震とう培養し、菌体を
回収し、ウィザードミニプレップ（Promega社製）を用
いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプ
ラスミドを制限酵素EcoRIにて消化して、約７００ｂｐ
のＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み
込まれていることを確認し、確認されたクローンについ
て、組み込まれているｃＤＮＡの塩基配列決定を行っ
た。

【００５８】挿入ｃＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ap
plied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実
施した。シークエンスサンプルの調製はPRISM，Ready R
eaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（Appli
ed Biosystems社製）を用いて行なった。０．５ｍｌ容
のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、
４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモーター
プライマー（GIBCO BRL社製）および６．５μｌの０．
１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混
合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、摂氏９６
度３０秒、摂氏５５度１５秒および摂氏６０度４分を１
サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行ない、
摂氏４度で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精
製水を加えて撹梓し、遠心分離後、その水層を３回のフ
ェノール・クロロホルム抽出を行なった。１００μｌの
水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）お
よび３００μｌのエタノールを加えて撹栓後、室温、１
４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行ない沈殿を回
収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２
分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとし
た。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤ
ＴＡを含むホルムアミドに溶解して摂氏９０度，２分間
で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。

【００５９】１１６のクローンについてＤＮＡ配列決定
を行ったところ、１個のクローンが配列表配列番号２の
ＤＮＡ配列の６６３番目から１３０７番目に対応する配
列を有していた（両端のプライマーの配列を含まな
い）。 GenBankリリース100.0，April，1997年のサーチ
の結果、この配列は７回膜貫通型受容体群と類似してい
ることが判明した（以下、この断片をＪＥＧ（Jurkat E
xpressed G-protein coupled Receptor）６２断片とよ
ぶ）。

【００６０】

【実施例２】新規7回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２全長遺伝子の
取得ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンフォーマＲａｊｉ細胞由来
のｃＤＮＡライブラリー（CLONTECH社、Cat# HL３０１
２b）からプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃ
ＤＮＡを持ったクローンの検索を行った。10⁶個相当の
プラークをMolecular Cloning, A laboratory manua
l，1989，Eds.、Sambrook,J., Fritsch,E.F.,and Mania
tis,T., Cold Spring Harbor Laboratory Pressの2.109
-111，Immobilization of bacteriophage λ plaques o
n nitrocellulose filtersに従ってプレートし、出現し
たプラークをナイロンフィルター（Hybond N＋；Amersh
am社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアル
カリ処理（1.5M NaCl，0.5M NaOHを染み込ませた濾紙上
に5分間放置）し、次いで中和処理（1.5M NaCl，0.5MTr
is-HCl（pH7.5）を染み込ませた濾紙上に5分間放置）を
2回行い、次に２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳ
Ｃ溶液は0.15M NaCl、15mMクエン酸pH7.0；以下ＳＳＣ
と略す）中で5分間、2度振とう洗浄し風乾した。その
後、ＵＶクロスリンカー（フナコシ社製、モデルＣＬ-1
000）を用いて、このフィルターの紫外線照射を1200×1
60マイクロジュール/cm²で行った。このフィルターを用
いて放射性同位元素³²Pにて標識されたヒト7回膜貫通型
受容体蛋白質遺伝子ＪＥＧ６２断片をプローブにしてハ
イブリダイゼーションを行った。

【００６１】放射性同位元素³²Pにて標識されたＪＥＧ
６２断片プローブは以下のように作製した。すなわち、
ＪＥＧ６２断片が組み込まれたベクターpCRIIより、制
限酵素ＥｃｏＲＩにてベクターより切り出し、０．８％
アガロース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロ
マイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察
し、約７００ｂｐのバンドをゲルから切り出してＧＥＮ
ＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い
て精製した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキ
ット（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇ
ｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製コードＲＰＮ１
６０７）を用いてラジオアイソトープ標識されたＪＥＧ
６２断片のセンスおよびアンチセンスヌクレオチドを合
成した。すなわち、ＤＮＡ１００ｎｇにプライマー液１
０μｌ、５×反応緩衝溶液２０μｌ及び脱イオン水を加
えて全量を８６μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その
後、α−³²Ｐ −ｄＣＴＰ（アマーシャム社製、コード
ＡＡ０００５）１０μｌ，及びＫｌｅｎｏｗ酵素溶液
４μｌを加えて、３７°Ｃで１０分間水浴し、放射標識
したＪＥＧ６２断片を合成した。更にその後、セファデ
ックスカラム（ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０：独逸国ベーリンガーマン
ハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２
分間氷冷後使用した。

【００６２】前述の方法にて作成したフィルターを、各
々の成分の最終濃度が６倍濃度のＳＳＣ溶液、５倍濃度
のデンハルト液（和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム、和光純薬社製）、及び１００μ
ｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（Ｓ
ｉｇｍａ社製）を含むハイブリダイゼーション液中に浸
し、６５°Ｃにて２時間振とうしたのち、前述の方法で
³²P標識されたプローブをハイブリダイゼーション液に
添加し、６５°Ｃにて１６時間振とうし、ハイブリダイ
ゼーションを行った。

【００６３】次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含
む、各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸
し、室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温１５分洗浄
した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使
用して、−８５°Ｃでオートラジオグラフィーを行っ
た。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、
再度プラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニング
を行い、完全に単独のクローンを分離した。

【００６４】単離されたファージクローンのうち２クロ
ーンを以降の遺伝子配列決定に供した。Molecular Clon
ing, A laboratory manual，1989，Eds.,Sambrook,J.,
Fritsch,E.F., and Maniatis,T., Cold Spring Harbor
Laboratory Pressの2.70，の方法に従い、これらのすべ
てのクローンのファージを約10⁹pfu（plaque formingun
it）調製し、Wizard lambda preps（Promega）を用いて
ファージＤＮＡを精製し、制限酵素EcoRIにて消化し、
同様に制限酵素EcoRIで消化したプラスミドpBluescript
II KS（＋）（Stratagene社製）に組み込んだ。これら
のクローンのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより
解析し、配列表配列番号２にあるＤＮＡ配列を決定し
た。配列表配列番号２の４０２番目の塩基Ａから１５２
３番目の塩基Ｇまでの塩基配列がＪＥＧ６２の構造遺伝
子（タンパク質をコードしているＤＮＡ配列）である。
このＪＥＧ６２の全構造遺伝子を含むｃＤＮＡを含むプ
ラスミドをｐＪＥＧ６２ＢＳと命名した。

【００６５】なお、このプラスミドｐＪＥＧ６２ＢＳを
大腸菌ＩＮＶαＦ’に導入した菌株Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｉ
ＮＶαＦ’−ｐＪＥＧ６２ＢＳは日本国通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＢＰー６０
０７として寄託されている。

【００６６】

【実施例３】Ｎｏｒｔｈｅｒｎ解析実施例１，２で得られたヒト７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ６２の各臓器におけるｍＲＮＡ発現をＮｏｒｔｈ
ｅｒｎで解析した。ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔｓフィルター
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製、コード＃７７５７−１、＃７
７５９−１、＃７７６０−１及び＃７７６７−１）を用
い、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液（１倍濃度のＳＳＰＥ溶液
は０．１５ＭＮａＣｌ，１０ｍＭＮａＨ₂Ｐ０₄，１
ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）、１０倍濃度のデンハル
ト液（和光純薬社製）、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム、和光純薬社製）、終濃度５０％ホルムアミド
（和光純薬社製）、及び沸騰水浴により変性したサケ精
子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社製）を含む
ハイブリダイゼーション液中に浸し、４２℃にて２時間
振とうしたのち、実施例２と同様の方法で³²Ｐ標識され
たＪＥＧ６２遺伝子ＥｃｏＲＩ断片プローブをハイブリ
ダイゼーション液に添加し、４２℃にて１６時間振とう
し、ハイブリダイゼーションを行った。

【００６７】次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含
む、各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸
し、室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温１５分洗浄
した。さらに、０．１％ＳＤＳを含む、各々の成分の最
終濃度が０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で室温１５分間洗浄
を行った。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーン
を使用して、−８５°Ｃでオートラジオグラフィーを行
った。ＪＥＧ６２は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格
筋、膵臓、胃、甲状腺、脊髄、リンパ節、気管、副腎、
骨髄、脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、結腸、
末梢血に約４〜５Ｋｂのバンドが認められた。またヒト
細胞株ではＨＬ６０、ＨｅｌａＳ３，Ｋ５６２，ＭＯ
ＬＴ４，Ｒａｊｉ，ＳＷ４８０，Ａ５４９，Ｇ３６１に
バンドが認められた。

【００６８】

【実施例４】７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２発現ベクターの作
製実施例２で単離されたＪＥＧ６２全長遺伝子を含むプラ
スミドクローンを鋳型としてＪＥＧ６２遺伝子のＰＣＲ
（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏ
ｎ）を行った。ＰＣＲにはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ
Ｔａｑポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
を用いた。このプラスミド溶液１μｌ（ＤＮＡ５ｎｇを
含む）に脱イオン水３７．５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ
０．５μｌと、Ｔａｑポリメラーゼに添付のバッファー
５μｌと、２．５ｍＭｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒
造社製）４μｌと、配列表配列番号６に示したオリゴヌ
クレオチドＡ（配列表配列番号２の４０２番目のＡから
４２７番目のＣの２６塩基配列の５’末端にスペーサー
配列ＧＣＧと制限酵素ＢａｍＨＩの酵素配列ＧＧＡＴＣ
Ｃを加えたもの）、および配列表配列番号７に示したオ
リゴヌクレオチドＢ（配列表配列番号３の１１５番目の
Ｔから１５０番目のＧまでの３６塩基配列の相補的配列
の５’末端にスペーサー配列ＧＣＧおよび制限酵素Ｘｂ
ａＩの認識配列ＴＣＴＡＧＡを加えた。また、配列表配
列番号７の２５番目と２７番目のＴをＧに変換した。こ
の結果、コードするアミノ酸には変異は起こらないが、
この遺伝子変換によって、制限酵素ＳＡＣＩＩの切断部
位が形成される）を、それぞれ２０ピコモルを加え、最
終容量５０μｌとした。

【００６９】この混合物を、ＴａＫａＲａＰＣＲｔ
ｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ４８０を用いて、９４℃
３分、５５℃１分、７２℃２分を１サイクル行ったの
ち、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分を２サイク
ル行い、９４℃３０秒、６５℃１分、７２℃２分を２１
サイクル行って、最後に９４℃３０秒、６５℃１分、７
２℃７分の反応を行った。このＰＣＲ産物の一部を０．
８％アガロース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウム
ブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で
観察し、約１１５０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されているこ
とを確認した。

【００７０】残りのＰＣＲ反応溶液を０．８％アガロー
スゲル上で分離し、目的とする遺伝子産物をゲルから切
り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いて、ＤＮＡの
精製を行った。この精製ＤＮＡをｐＴＡＲＧＥＴ（Ｔ
Ｍ）ＭａｍｍａｌｉａｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶ
ｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を
用い、添付のプロトコールに従って、ｐＴＡＲＧＥＴ
（ＴＭ）ベクターに組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれ
たｐＴＡＲＧＥＴ（ＴＭ）を大腸菌ＩＮＶαＦ’Ｃｏｍ
ｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）
を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半
固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置
し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアン
ピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付
け、１８時間程度３７℃で振とう培養し、菌体を回収
し、ウイザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を
用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。こ
のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約１
１５０ｂｐのＤＮＡが切り出されたクローンについて、
組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行い、ＪＥＧ
６２の発現ベクター、ｐＪＥＧ６２を得た。

【００７１】

【実施例５】発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現実施例４で作製した発現ベクターを２９３細胞（大日本
製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５
７３）に遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の継代
は、ＭＥＭｗｉｔｈＥａｒｌｅｓＳａｌｔｓ（Ｍ
ＥＭアール液体培地、大日本製薬（株）Ｃａｔ．Ｎｏ．
１２−１０２−５４ＣＮ）を用い、１０％、馬血清（摂
氏５６度２０分間熱処理して非働化した；ＩＣＮＢｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．Ｎｏ．２９２
１１４９）、１００分の１量のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ溶液（大日本製薬（株）Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６−７０Ｄ−４９ＤＮ）を加えた。細胞
は、５×１０⁴個／ｍｌから５×１０⁵個／ｍｌの濃度で
培地中に植え付け、摂氏３７度、５％二酸化炭素、湿度
１００％で培養し、コンフルエントになるまで培養し
た。培地を吸引・廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液（Cosm
o Bio Co.,Ltd．）処理により、細胞をプレート底面よ
りはがした。前記の培地（血清を含む）を加えて反応を
停止させた。その後、ピペッティングによって細胞を均
一に懸濁し、遠心して（１０００ｒｐｍ１５分；ＫＳ
−８３００型、久保田製作所、ＲＳ３０００／６型ロー
ター）回収し、新しい培地に再度懸濁し継代した。遺
伝子導入は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキット（Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．ＩＶ２７８０−１）を用いリン酸カルシウム
共沈法にて行い（添付のプロトコル６ページ）、本発明
の７回膜貰通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２をコードするＤ
ＮＡを保持する形質転換体を作成した。ＤＮＡは３５ｍ
ｍプレートあたり５μｇを用いた。

【００７２】膜画分の調製は、以下のように行った。ｐ
ＪＥＧ６２を遺伝子導入した細胞およびｐｃＤＮＡ３プ
ラスミドを導入した細胞を２４〜４８時間培養した。そ
の後、培地はアスピレータで吸引し廃棄し、ＰＢＳ（大
日本製薬（株）Cat.No．２８-１0３-0５）を用いて細胞
を洗浄し、その後１ml/プレートのＰＢＳを加え、Cell
Scraper-L（住友ベークライト、Cat.No.MS-9３３00）を
用いてプレートからはがした。その後、１ml／３プレー
トのＰＢＳを加え、プレートを洗浄し、回収した細胞に
加えた。この細胞懸濁液をPolytron（KINEMATIKA社製、
PT１0-SK）で破砕し、マイクロチュープ用遠心機（トミ
ー精工、MRX-１５0型）で摂氏４度，１３000xgで１５分
間遠心した。上清を捨て、さらに２度ＰＢＳを加え懸濁
後、同じ条件で遠心した。バイオ・ラッド社のプロテイ
ンアッセイキットを用いて蛋白質を定量し、蛋白質量
が、１mg／mlになるようＰＢＳを加えて調製した。この
懸濁液を膜画分調製液とした。

【００７３】こうして得られた膜画分調製液を用いてウ
ェスタンブロッティング法にて７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ６２の発現を確認した。すなわち、膜画分をＡ
ＣＩジャパン社製のＳＤＳ―ＰＡＧＥ用電気泳動槽及び
ＳＤＳ―ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエ
ントゲル５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従
ってＳＤＳ―ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２―メ
ルカプトエタノール（２―ＭＥ）を加えて５分間の沸騰
水浴加熱処理により還元処理を行った。マーカーとして
はAmersham社製レインボーマーカー（高分子量用）を用
い、サンプルバッファ一、泳動バッファーについては添
付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ―ＰＡＧＥ
終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィ
ルター（BioRad社製）に同社製ミニトランスプロットセ
ルにより転写した。

【００７４】このように作製されたフィルターをブロッ
クエース（大日本製薬社製）、ＴＢＳ―Ｔ（２0mM Tri
s，１３７mM NaCl（pH７.６）、0．１％Tween ２0）に
摂氏４度で一晩振とうしてブロッキングした。ＥＣＬウ
ェスタンブロッティング検出システム（Amersham社）に
添付の説明書に従い、一次抗体として実施例９に記載し
た抗ＪＥＧ６２抗血清を用い、二次抗体としてペルオキ
シダーゼ標識抗ウサギＩｇロバ抗体（Amersham社製）を
反応させた。

【００７５】抗体の反応時間は各々室温で一時間反応さ
せ、各反応間はＴＢＳ―Ｔにて１0分間室温で振とう洗
浄する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィ
ルターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム
（Amersham社製）の反応液に５分間浸し、ポリ塩化ビニ
リデンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。分子
量マーカーとの比較の結果、約３８〜４２kDのバンドが
遺伝子導入をしたものについてのみ得られ、遺伝子導入
をしていない細胞には観察されなかった。

【００７６】

【実施例６】リガンドのスクリーニング遺伝子導入を行わない２9３細胞とＪＥＧ６２形質転換
体２9３細胞の膜画分を実施例５と同様にして調製し
た。膜画分調製液５0μｌもしくはＰＢＳ（大日本製薬
（株）Cat.No．２８-１0３-0５）と放射性標識された候
補化合物CGS ２１６８0（Dupont NEN社、カタログ番号
NET-１0２１）５０μｌ（終濃度１００ｎＭ）、ＰＢＳ
５０μｌを加え、全量を１５０μｌとした。混合して
候補化合物と７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２を接
触させ、摂氏３７度で３０分間保温した後、マイクロチ
ューブ用遠心機（トミー精工、ＭＲＸ−１５０型）で室
温、１５０００ｘｇで１５分間遠心し、ＪＥＧ６２蛋白
質と結合した候補化合物と結合していないものを分離し
た。その上清を１μｌとり、１０ｍｌの液体シンチレー
ター用カクテル（Dupont NEN，ECONOFLUOR-２）に加
え、混合した。その後、Beckman LS6000LL型シンチレー
ションカウンターを使用して放射活性をカウントし、Ｊ
ＥＧ６２遺伝子導入の有無で得られた放射活性を比較し
た。

【００７７】その結果、得られた放射活性はＪＥＧ６２
遺伝子導入の有無で差がなかった。

【００７８】

【実施例７】リガンドのスクリーニング実施例４で作製した発現ベクターをＣＨＯ細胞（大日本
製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ番号CCL-６１）に
遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の継代は、F-１２
Nutrient Mixture（ＨＡＭ培地、ＧＩＢＣＯＢＲＬ
カタログ番号１１７６５-0４７）を用い、最終濃度１0
％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum; GIBCO BRL Cat.No．
１0099-１４１；摂氏５６度２0分間熱処理して非働化し
た）、１００分の１量のPenicillin-Streptomycin溶液
（大日本製薬（株）Cat.No．１６-７0D-４9DN）を加え
た。細胞は、５×１0⁴個／mlから５×１0⁵個／mlの濃度
で培地中に植え付け、摂氏３７度、５％二酸化炭素、湿
度１00％で培養し、コンフルエントになるまで培養し
た。培地は吸引・廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液（Ｃｏ
ｓｍｏＢｉｏＣｏ．，Ｌｔｄ．）処理により、細胞
をプレート底面よりはがした。前記の培地（血清を含
む）を加えて反応を停止させた。その後、ピペッティン
グによって細胞を均一に懸濁し、遠心して（１０００ｒ
ｐｍ１５分；ＫＳ−８３００型、久保田製作所、ＲＳ
３０００／６型ローター）回収した。新しい培地に再度
懸濁し、継代した。

【００７９】遺伝子導入は、Invitrogen社のキット（Ca
t.No.IV2780-1）を用いリン酸カルシウム共沈法にて行
った（添付のプロトコル６ページ）。ＤＮＡは３５mmプ
レートあたり５μｇ用いた。遺伝子導入後、約６時間後
に培地を新しいものと交換しさらに約４８時間培養し
た。さらに培養上清を、種種の細胞濃度で４00μg／ml
の濃度のネオマイシン（Geneticin，GIBCO BRL １８１
１-0２３）を含む培地に植え替えた。その後、２週間前
後培養し増殖した細胞を発現細胞とした。

【００８０】以上のように作成した７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ６２発現細胞を用いて、化学遊走の測定を
行った。リガンド候補物質としては、ＬＰＳ（リポポリ
サッカライド）投与ラット血清を用いた。７週令のWist
arラットを（株）日本生物材料より購入した。サルモネ
ラミネソタＲＥ５9５由来ＬＰＳ（Sigma社製）を日本薬
局方生理食塩水に最終濃度１mg／mlになるように懸濁し
た。懸濁液をソニケーター（Branson）でソニケート
し、透明な液とした。これを日本薬局方生理食塩水で１
0倍に希釈し、４00μｌ，尾静脈より投与した。投与後
約２２時間後のラットをエーテル麻酔し開腹して心臓よ
り採血した。マイクロチュープ用遠心機（トミー精工、
MRX-１５0型）で摂氏４度，１３000xgで１５分間遠心
し、その上清を摂氏-２0度で保存した。これを被検物質
溶液とした。

【００８１】9６穴マイクロプレートチャンバー（フナ
コシ（株）カタログ番号ＦＥ―２２9２-9６）に9６穴マ
イクロプレート（フナコシ（株）カタログ番号ＦＥ―２
３00-0２）および１５μg／mlのフィブロネクチン（Sig
ma，ＰＢＳ（大日本製薬（株）カタログ番号２８-１0３
-0５）中に溶解した）で処理した８μｍのポアサイズの
フレームフィルター（フナコシ（株）カタログ番号ＦＥ
-２３４0-0８）を据え付けた。下室には0.１５％ＢＳＡ
（Sigma社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（GIBCO BRLカ
タログ番号22400-071）で被検物質溶液を１0倍希釈して
加えた。上室には0.１５％ＢＳＡを含むRPMI１６４0に
懸濁した７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２発現細胞
を加え、被検物質とＪＥＧ６２蛋白質を接触させた。こ
の状態の９６穴マイクロプレートチャンバーを５％二酸
化炭素、摂氏３７度で５時間保温した。フィルターを固
定・染色して顕微鏡下で観察した。その結果、化学遊走
している細胞が観察された。

【００８２】

【実施例８】リガンドと桔抗する物質のスクリーニングＪＥＧ６２形質転換ＣＨＯ細胞を用い形質転換体の化学
遊走試験を行った。（i）実施例７で作製したＪＥＧ６
２形質転換ＣＨＯ細胞に発現する７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ６２と実施例７に示したＬＰＳ投与ラット血
清をリガンドとして用いて実施例７と同様に化学遊走し
でいる細胞を観察した。さらに、（ii）実施例７の実験
の際に上室および下室に含まれる溶液に最終濃度１00μ
ＭのＮＥＣＡを加えて実施例７と同様に化学遊走してい
る細胞を観察した。そののち、（i）（ii）を比較した
が、両者に差はなかった。

【００８３】

【実施例９】ＪＥＧ６２の部分タンパク質の生産融合タンパク質の生産、精製は以下のように行った。実
施例２に示したｐＪＥＧ６２ＢＳを鋳型としてＪＥＧ６
２遺伝子のＣ末断片のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲには
ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＴａｑポリメラーゼ（ベ
ーリンガーマンハイム社製）を用いた。このプラスミド
溶液１μｌ（ＤＮＡ５ｎｇを含む）に脱イオン水３７．
５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ０．５μｌと、Ｔａｑポリ
メラーゼに添付のバッファー５μｌと、２．５ｍＭｄ
ＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）４μｌと、配列
表配列番号８に示したオリゴヌクレオチドＡ（配列表配
列番号２のヌクレオチド１３４７番目のＣから１３７３
番目のＣまでの配列の５’側に制限酵素ＢａｍＨＩの認
識部位ＧＧＡＴＣＣとスペーサー配列ＧＡＧＧを加えた
もの。）、および配列表配列番号９に示したオリゴヌク
レオチドＢ（配列表配列番号３の１１７番目のＡから１
４２番目のＧまでの配列の５’側に制限酵素ＥｃｏＲＩ
の認識部位ＧＡＡＴＴＣとスペーサー配列ＴＧＣＧを加
えたもの。）を、それぞれ２０ピコモルを加え、最終容
量５０μｌとした。

【００８４】この混合物を、ＴａＫａＲａＰＣＲｔ
ｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ４８０を用いて、９４℃
３分、５５℃１分、７２℃２分を１サイクル行ったの
ち、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分を２サイク
ル行い、９４℃３０秒、６５℃１分、７２℃２分を２１
サイクル行って、最後に９４℃３０秒、６５℃１分、７
２℃７分の反応を行った。このＰＣＲ産物の一部を０．
８％アガロース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウム
ブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で
観察し、約２１０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていること
を確認した。

【００８５】残りのＰＣＲ反応溶液を制限酵素ＢａｍＨ
ＩおよびＥｃｏＲＩで切断後、０．８％アガロースゲル
上で分離し、目的とする遺伝子産物をゲルから切り出
し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いて、ＤＮＡの精製
を行った。この精製ＤＮＡをあらかじめ制限酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断したベクターｐＧＥＸ−４
Ｔ−２（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に組み
込んだ。ＤＮＡが組み込まれたプラスミドを大腸菌ＩＮ
ＶαＦ’ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉ
ｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝
酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度
３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、
同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２
ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振とう培養し、
菌体を回収し、ウイザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分
離した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩにて消化して、約２００ｂｐのＤＮＡが切り出
されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩
基配列決定を行い、ＪＥＧ６２のＣ末端部分タンパク質
の発現ベクター、ｐＧＳＴ−ＪＥＧ６２を得た。

【００８６】このｐＧＳＴ−ＪＥＧ６２を含む大腸菌Ｉ
ＮＶαＦ’を一夜３７℃で震とう培養し、アンピシリン
（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏ
ｔｈ液体培地で１０倍希釈し、６００ｎｍの吸光度が
０．６程度になるまでさらに３７℃で震とう培養した。
ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａ
ｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ；ＰａｒｍａｃｉａＢｉｏ
ｔｅｃｈＣａｔａｌｏｇｎｏ．２７−３０５４）を
終濃度１．０ｍＭ加え、３時間さらに３７℃で震とう培
養した。以下、ＧＳＴＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭ
ｏｄｕｌｅ（ＰａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＣ
ａｔａｌｏｇｎｏ．２７−４５７０−０１）を用い
て、添付のプロトコルに従って精製した。

【００８７】

【実施例１０】ＪＥＧ６２蛋白質を認識する抗体の作成配列表配列番号１の３１６番目のＰｒｏから３７４番目
Ｇｌｙまでのペプチドを実施例９に示すようにＧＳＴ
（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ）融合タンパク質として大腸菌で生産し、精製後、免
疫原としてウサギに免疫した。精製した融合タンパク質
をフロイント完全アジュバントを用いてエマルジョンを
形成し、２５０μｇを約２．５kgのウサギ１羽に背部皮
下投与し、その２１日後、４２日後および６３日後にも
それぞれ等量の抗原をフロイント不完全アジュバントを
用いて同様に投与した。抗体価の測定後、全血の採血を
行い、血清を採取して、米国BioRad社製のエコノパック
血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の取扱い説明書に
従って、抗ヒトＪＥＧ６２蛋白質ウサギポリクローナル
抗体を精製して作製した。

【００８８】最初の投与から７３日目にウサギより血液
を麻酔下頚動脈採血により採取後、血清を分離し抗血清
とした。

【００８９】

【発明の効果】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥ
Ｇ６２は、白血球の機能を制御する医薬品を検索するこ
とに使用が可能である。

【００９０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３７４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Pro Thr Leu Asn Thr Ser Ala Ser Pro Pro Thr Phe Phe Trp Ala 5 10 15 Asn Ala Ser Gly Gly Ser Val Leu Ser Ala Asp Asp Ala Pro Met Pro 20 25 30 Val Lys Phe Leu Ala Leu Arg Leu Met Val Ala Leu Ala Tyr Gly Leu 35 40 45 Val Gly Ala Ile Gly Leu Leu Gly Asn Leu Ala Val Leu Trp Val Leu 50 55 60 Ser Asn Cys Ala Arg Arg Ala Pro Gly Pro Pro Ser Asp Thr Phe Val 65 70 75 80 Phe Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Gly Leu Ala Leu Thr Leu Pro Phe 85 90 95 Trp Ala Ala Glu Ser Ala Leu Asp Phe His Trp Pro Phe Gly Gly Ala 100 105 110 Leu Cys Lys Met Val Leu Thr Ala Thr Val Leu Asn Val Tyr Ala Ser 115 120 125 Ile Phe Leu Ile Thr Ala Leu Ser Val Ala Arg Tyr Trp Val Val Ala 130 135 140 Met Ala Ala Gly Pro Gly Thr His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Arg Ile 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ala Val Trp Ala Ala Ala Ala Leu Val Thr Val Pro Thr 165 170 175 Ala Val Phe Gly Val Glu Gly Glu Val Cys Gly Val Arg Leu Cys Leu 180 185 190 Leu Arg Phe Pro Ser Arg Tyr Trp Leu Gly Ala Tyr Gln Leu Gln Arg 195 200 205 Val Val Leu Ala Phe Met Val Pro Leu Gly Val Ile Thr Thr Ser Tyr 210 215 220 Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Gln Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Asp 225 230 235 240 Ser Arg Val Val Ala Arg Ser Val Arg Ile Leu Val Ala Ser Phe Phe 245 250 255 Leu Cys Trp Phe Pro Asn His Val Val Thr Leu Trp Gly Val Leu Val 260 265 270 Lys Phe Asp Leu Val Pro Trp Asn Ser Thr Phe Tyr Thr Ile Gln Thr 275 280 285 Tyr Val Phe Pro Val Thr Thr Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu 290 295 300 Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Leu Arg Arg Glu Pro Arg Gln Ala Leu 305 310 315 320 Ala Gly Thr Phe Arg Asp Leu Arg Ser Arg Leu Trp Pro Gln Gly Gly 325 330 335 Gly Trp Val Gln Gln Val Ala Leu Lys Gln Val Gly Arg Arg Trp Val 340 345 350 Ala Ser Asn Pro Arg Glu Ser Arg Pro Ser Thr Leu Leu Thr Asn Leu 355 360 365 Asp Arg Gly Thr Pro Gly 370

【００９１】配列番号：２配列の長さ：１６４０配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 TCTAGTTTGG TTCCTGTCAT CTCTGGGACA GGGAACCTCC AGCTCTCTCC CTGGGGTGGA 60 GGCTTGGGGC TGCCCTCCAT AGCGGGGTAA CTCTCCCTTC TCCCCTCCCT CTCTGCCATT 120 TAGAGCCCCT CTTACAGGCG GGCGCATGCA CATATACCCT GGCATTCAGG CTGTGCCTCG 180 CCCTGCCCCA CCTACCACCA ATCTTGACCA ACAGGAAGGT GGTGGGTTGT CCTTTCCACA 240 CCCCTCCCTC TGAGGTGTGG GCGTGGGCCA GGGCTCACCA GAGGCCCCAG AGAAGCACTT 300 AATTCTACAG CCTCCTTCCT AGAGCCTTCA GTGGCCTCTG CCAGTCTGGC AGACACTTGC 360 AGACCTCTCT TCTCAGCACC ACCAATCTCT GATGCCCTGC G ATG CCC ACA CTC AAT 416 Met Pro Thr Leu Asn 5 ACT TCT GCC TCT CCA CCC ACA TTC TTC TGG GCC AAT GCC TCC GGA GGC 464 Thr Ser Ala Ser Pro Pro Thr Phe Phe Trp Ala Asn Ala Ser Gly Gly 10 15 20 AGT GTG CTG AGT GCT GAT GAT GCT CCG ATG CCT GTC AAA TTC CTA GCC 512 Ser Val Leu Ser Ala Asp Asp Ala Pro Met Pro Val Lys Phe Leu Ala 25 30 35 CTG AGG CTC ATG GTT GCC CTG GCC TAT GGG CTT GTG GGG GCC ATT GGC 560 Leu Arg Leu Met Val Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Val Gly Ala Ile Gly 40 45 50 TTG CTG GGA AAT TTG GCG GTG CTG TGG GTA CTG AGT AAC TGT GCC CGG 608 Leu Leu Gly Asn Leu Ala Val Leu Trp Val Leu Ser Asn Cys Ala Arg 55 60 65 AGA GCC CCT GGC CCA CCT TCA GAC ACC TTC GTC TTC AAC CTG GCT CTG 656 Arg Ala Pro Gly Pro Pro Ser Asp Thr Phe Val Phe Asn Leu Ala Leu 70 75 80 85 GCG GAC CTG GGA CTG GCA CTC ACT CTC CCC TTT TGG GCA GCC GAG TCG 704 Ala Asp Leu Gly Leu Ala Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Ala Glu Ser 90 95 100 GCA CTG GAC TTT CAC TGG CCC TTC GGA GGT GCC CTC TGC AAG ATG GTT 752 Ala Leu Asp Phe His Trp Pro Phe Gly Gly Ala Leu Cys Lys Met Val 105 110 115 CTG ACG GCC ACT GTC CTC AAC GTC TAT GCC AGC ATC TTC CTC ATC ACA 800 Leu Thr Ala Thr Val Leu Asn Val Tyr Ala Ser Ile Phe Leu Ile Thr 120 125 130 GCG CTG AGC GTT GCT CGC TAC TGG GTG GTG GCC ATG GCT GCG GGG CCA 848 Ala Leu Ser Val Ala Arg Tyr Trp Val Val Ala Met Ala Ala Gly Pro 135 140 145 GGC ACC CAC CTC TCA CTC TTC TGG GCC CGA ATA GCC ACC CTG GCA GTG 896 Gly Thr His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Arg Ile Ala Thr Leu Ala Val 150 155 160 165 TGG GCG GCG GCT GCC CTG GTG ACG GTG CCC ACA GCT GTC TTC GGG GTG 944 Trp Ala Ala Ala Ala Leu Val Thr Val Pro Thr Ala Val Phe Gly Val 170 175 180 GAG GGT GAG GTG TGT GGT GTG CGC CTT TGC CTG CTG CGT TTC CCC AGC 992 Glu Gly Glu Val Cys Gly Val Arg Leu Cys Leu Leu Arg Phe Pro Ser 185 190 195 AGG TAC TGG CTG GGG GCC TAC CAG CTG CAG AGG GTG GTG CTG GCT TTC 1040 Arg Tyr Trp Leu Gly Ala Tyr Gln Leu Gln Arg Val Val Leu Ala Phe 200 205 210 ATG GTG CCC TTG GGC GTC ATC ACC ACC AGC TAC CTG CTG CTG CTG GCC 1088 Met Val Pro Leu Gly Val Ile Thr Thr Ser Tyr Leu Leu Leu Leu Ala 215 220 225 TTC CTG CAG CGG CGG CAA CGG CGG CGG CAG GAC AGC AGG GTC GTG GCC 1136 Phe Leu Gln Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Asp Ser Arg Val Val Ala 230 235 240 245 CGC TCT GTC CGC ATC CTG GTG GCT TCC TTC TTC CTC TGC TGG TTT CCC 1184 Arg Ser Val Arg Ile Leu Val Ala Ser Phe Phe Leu Cys Trp Phe Pro 250 255 260 AAC CAT GTG GTC ACT CTC TGG GGT GTC CTG GTG AAG TTT GAC CTG GTG 1232 Asn His Val Val Thr Leu Trp Gly Val Leu Val Lys Phe Asp Leu Val 265 270 275 CCC TGG AAC AGT ACT TTC TAT ACT ATC CAG ACG TAT GTC TTC CCT GTC 1280 Pro Trp Asn Ser Thr Phe Tyr Thr Ile Gln Thr Tyr Val Phe Pro Val 280 285 290 ACT ACT TGC TTG GCA CAC AGC AAT AGC TGC CTC AAC CCT GTG CTG TAC 1328 Thr Thr Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu Asn Pro Val Leu Tyr 295 300 305 TGT CTC CTG AGG CGG GAG CCC CGG CAG GCT CTG GCA GGC ACC TTC AGG 1376 Cys Leu Leu Arg Arg Glu Pro Arg Gln Ala Leu Ala Gly Thr Phe Arg 310 315 320 325 GAT CTG CGG TCG AGG CTG TGG CCC CAG GGC GGA GGC TGG GTG CAA CAG 1424 Asp Leu Arg Ser Arg Leu Trp Pro Gln Gly Gly Gly Trp Val Gln Gln 330 335 340 GTG GCC CTA AAG CAG GTA GGC AGG CGG TGG GTC GCA AGC AAC CCC CGG 1472 Val Ala Leu Lys Gln Val Gly Arg Arg Trp Val Ala Ser Asn Pro Arg 345 350 355 GAG AGC CGC CCT TCT ACC CTG CTC ACC AAC CTG GAC AGA GGG ACA CCC 1520 Glu Ser Arg Pro Ser Thr Leu Leu Thr Asn Leu Asp Arg Gly Thr Pro 360 365 370 GGG TGAAGGGCGC AAGCTGAACA CACTCCTCTT TCTGAGATCC ACCAAGTGTA GGATCC 1579 Gly TTGAGTCCTG GGGAGAAGCT GCCCTCTCTG CCAGGCTGCA GTGCCCTCAG GGAAAAGTCT 1639 G 1640

【００９２】配列番号：３配列の長さ：１６４０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡアンチセンス：ＹＥＳ配列 CAGACTTTTC CCTGAGGGCA CTGCAGCCTG GCAGAGAGGG CAGCTTCTCC CCAGGACTCA 60 AGGATCCTAC ACTTGGTGGA TCTCAGAAAG AGGAGTGTGT TCAGCTTGCG CCCTTCACCC 120 GGGTGTCCCT CTGTCCAGGT TGGTGAGCAG GGTAGAAGGG CGGCTCTCCC GGGGGTTGCT 180 TGCGACCCAC CGCCTGCCTA CCTGCTTTAG GGCCACCTGT TGCACCCAGC CTCCGCCCTG 240 GGGCCACAGC CTCGACCGCA GATCCCTGAA GGTGCCTGCC AGAGCCTGCC GGGGCTCCCG 300 CCTCAGGAGA CAGTACAGCA CAGGGTTGAG GCAGCTATTG CTGTGTGCCA AGCAAGTAGT 360 GACAGGGAAG ACATACGTCT GGATAGTATA GAAAGTACTG TTCCAGGGCA CCAGGTCAAA 420 CTTCACCAGG ACACCCCAGA GAGTGACCAC ATGGTTGGGA AACCAGCAGA GGAAGAAGGA 480 AGCCACCAGG ATGCGGACAG AGCGGGCCAC GACCCTGCTG TCCTGCCGCC GCCGTTGCCG 540 CCGCTGCAGG AAGGCCAGCA GCAGCAGGTA GCTGGTGGTG ATGACGCCCA AGGGCACCAT 600 GAAAGCCAGC ACCACCCTCT GCAGCTGGTA GGCCCCCAGC CAGTACCTGC TGGGGAAACG 660 CAGCAGGCAA AGGCGCACAC CACACACCTC ACCCTCCACC CCGAAGACAG CTGTGGGCAC 720 CGTCACCAGG GCAGCCGCCG CCCACACTGC CAGGGTGGCT ATTCGGGCCC AGAAGAGTGA 780 GAGGTGGGTG CCTGGCCCCG CAGCCATGGC CACCACCCAG TAGCGAGCAA CGCTCAGCGC 840 TGTGATGAGG AAGATGCTGG CATAGACGTT GAGGACAGTG GCCGTCAGAA CCATCTTGCA 900 GAGGGCACCT CCGAAGGGCC AGTGAAAGTC CAGTGCCGAC TCGGCTGCCC AAAAGGGGAG 960 AGTGAGTGCC AGTCCCAGGT CCGCCAGAGC CAGGTTGAAG ACGAAGGTGT CTGAAGGTGG 1020 GCCAGGGGCT CTCCGGGCAC AGTTACTCAG TACCCACAGC ACCGCCAAAT TTCCCAGCAA 1080 GCCAATGGCC CCCACAAGCC CATAGGCCAG GGCAACCATG AGCCTCAGGG CTAGGAATTT 1140 GACAGGCATC GGAGCATCAT CAGCACTCAG CACACTGCCT CCGGAGGCAT TGGCCCAGAA 1200 GAATGTGGGT GGAGAGGCAG AAGTATTGAG TGTGGGCATC GCAGGGCATC AGAGATTGGT 1260 GGTGCTGAGA AGAGAGGTCT GCAAGTGTCT GCCAGACTGG CAGAGGCCAC TGAAGGCTCT 1320 AGGAAGGAGG CTGTAGAATT AAGTGCTTCT CTGGGGCCTC TGGTGAGCCC TGGCCCACGC 1380 CCACACCTCA GAGGGAGGGG TGTGGAAAGG ACAACCCACC ACCTTCCTGT TGGTCAAGAT 1440 TGGTGGTAGG TGGGGCAGGG CGAGGCACAG CCTGAATGCC AGGGTATATG TGCATGCGCC 1500 CGCCTGTAAG AGGGGCTCTA AATGGCAGAG AGGGAGGGGA GAAGGGAGAG TTACCCCGCT 1560 ATGGAGGGCA GCCCCAAGCC TCCACCCCAG GGAGAGAGCT GGAGGTTCCC TGTCCCAGAG 1620 ATGACAGGAA CCAAACTAGA 1640

【００９３】配列番号：４配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴：１８、２２、２４残基めのＮはイノシンを
示す。配列 ATCTTAAGCT TGAACCTNGC CNTNGCDGAC 30 配列番号：５配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴：２２、２８残基めのＮはイノシンを示す。
２１残基めのＮはAまたはGまたはCまたはTを示す。配列 CCCAACGAAT TCRTAGATSA NNGGRTTNAV RCA 33

【００９４】配列番号：６配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCGGGATCCA TGCCCACACT CAATACTTCT GCCTC 35配列番
号：７配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCGTCTAGAT CACCCGGGTG TCCCGCGGTC CAGGTTGGTG AGCAG 45 配列番号：８配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GAGGGGATCC CCCCGGCAGG CTCTGGCAGG CACCTTC 37 配列番号：９配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TGCGGAATTC ACCCGGGTGT CCCTCTGTCC AGGTTG 36

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＡＣ１２Ｎ 5/00 ＢＡＤＵＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡＡＤＸＡＤＵＣ１２Ｐ 21/08 ＡＤＸ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ６２またはその塩。
【請求項２】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ６２の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項３】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ６２をコードする塩基配列を有する核酸を含有す
る核酸。
【請求項４】配列表配列番号２で表される塩基配列を有
する請求項３記載の核酸。
【請求項５】配列表配列番号２で表される塩基配列のう
ち少なくとも一部の遺伝子配列を有する１２merから１
６mer以上、さらに望ましくは２０mer以上の核酸、及び
その誘導体。
【請求項６】請求項３記載の核酸であって、配列表配列
番号２で表される塩基配列の４０２番目のＡから１５２
３番目のＧまでの核酸またはその誘導体を含有する核
酸、及びその誘導体
【請求項７】配列表配列番号３で表される塩基配列のう
ち少なくとも一部の遺伝子配列を有する１２merから１
６mer以上、さらに望ましくは２０mer以上の核酸、及び
その誘導体。
【請求項８】請求項６記載の核酸を含有するベクター。
【請求項９】請求項８記載のベクターを保持する７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２発現形質転換体。
【請求項１０】請求項９記載の形質転換体を培養し、形
質転換体の細胞膜に７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６
２を生成せしめることを特徴とする７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ６２またはその塩の製造方法。
【請求項１１】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ６２もしくはその塩または請求項２記載の部分
ペプチドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させる
ことを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ６２
に対するリガンドの決定方法。
【請求項１２】（i）請求項１記載の７回膜貫通型受容
体蛋白質ＪＥＧ６２もしくはその塩または請求項２記載
の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させ
た場合と（ii）請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ６２もしくはその塩または請求項２記載の部分
ペプチドもしくはその塩に、リガンドおよび試験化合物
を接触させた場合との比較を行うことを特徴とするリガ
ンドと請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
６２との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリー
ニング方法。
【請求項１３】請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ６２もしくはその塩または請求項２記載の部分
ペプチドもしくはその塩に対する抗体。