JP3771585B2 - MCP−1、MIP−1αおよび/またはRANTESに結合可能なケモカインレセプターおよびその用途 - Google Patents
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Description
ケモカインは、走化性サイトカインの成長する群であり、細胞の回復および活性化に役割を果たしていると考えられている(Oppenheim, J.J. et al., Ann Rev Immunol., 9 617-48, (1991), Schall, T.J., Cytokine, 3 165-183, (1991))。それらは、主として白血球の活性化および回復に関与しているが、これに限定されるものではない。タンパク質のこのスーパーファミリーを更に分析することにより、これは更にタンパク質の2個の亜科に分割することができることが示された。これらは、タンパク質のアミノ末端付近の2個の保存されたシステイン残基のスペーシングに基づいてCXCまたはα−ケモカイン、およびCCまたはβ−ケモカインと呼ばれている。
今日までに、CCケモカイン群について2個のレセプターが同定されている。第一の、主としてMIP−1α(マクロファージ炎症性ポリペプチド−1α)およびRANTES(活性化時に生じた、誘導され分泌された正常なT−細胞(Raised on Activation, Normal T-cell derived and Secreted)は、以前に記載されている(Gao, J.L. et al., J. Exp. Med., 177, 1421-7(1993), Neote, K. et al., Cell, 72, 415-25(1993))。最近になって報告された第二のCC−ケモカインレセプターは、MCP−1(単球ケモトラクタントタンパク質−1(monocyte chemotractant protein-1), Charo, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2752-2756(1994))に対するものである。更に最近になり、ヒトサイトメガロウイルスによって発現されたもう一つのレセプターUS28は、RANTES、MIP−1α、およびMCP−1のレセプターであることが示された(Gao, J.L. and Murphy, P.M., J. Biol. Chem., 269, 28539-28542(1994))。3種類のレセプターは総て、セブン・トランスメンブレーン・アルファ・ヘリカル・セグメント型(seven transmembrane alpha helical segment type)のものであり、細胞の膜中に発現される。
しかしながら、これまで開示されていないケモカインレセプターを同定し、これらを特定し、ケモカインレセプターの構造および機能を更に完全に明らかにする必要が残っている。
本発明によれば、第3図に示されるアミノ酸配列を有するケモカインレセプターが提供される。
このレセプターは、MCP−1、MIP−1α、およびRNATESを結合することができるのが好ましい。これは、好塩基性細胞およびT−細胞の機能に重要であることがある。
これは、薬学活性を有する薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。従って、本発明は、その範囲内に(タンパク質であってもよくまたはあってはならない)このような薬剤を包含する。これらの薬剤は、薬学上許容可能なキャリヤーとの医薬組成物で提供することができる。
このような組成物は、本発明の範囲内にある。これは、キャリヤーを薬学活性を有する薬剤を無菌条件下にて混合することによって製造することができる。医薬組成物は、単位投与形態で提供することができる。これは、使用説明書を含むキットの一部として存在することもできる。
医薬組成物は、例えば経口(口腔または舌下を含む)、直腸、鼻内、局所(口腔、舌下または経皮を含む)、腔内、または非経口(皮下、筋肉内、静脈内、または皮内を含む)経路のような任意の適当な経路によって投与に適合させることができる。
本発明のレセプターは、アレルギー、例えば喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎、枯草熱、湿疹、または食物アレルギーの治療に有用な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。これは、結膜炎の治療に有用な薬剤をスクリーニングするのにも用いることができる。MCP−1、MIP−1αおよびRANTESは総て、本発明のレセプターに結合し、好塩基性細胞からヒスタミンを放出させることができる。この結合をブロックする薬剤は、これによって好塩基性細胞からヒスタミンの放出を防止または減少させる(すなわち、MCP−1、MIP−1αまたはRANTESに拮抗的に作用する)。このような薬剤は、MCP−1、MIP−1αまたはRANTESの変異体(MCP−1、MIP−1αまたはRANTESに対して1個以上のアミノ酸が欠失、置換または挿入されているもの)であってもよいが、これは本質的なことではない。
これは、T−リンパ球の活性化である免疫および他の炎症状態の共通の特徴にも関与することがある。
薬剤の本発明のレセプターへの結合は、適当な手法によって分析することができる。
例えば、電気生理学的手法を用いることができる。一つのこのような手法では、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞を用いて、本発明のレセプターを発現することができる。レセプターを卵母細胞膜上で発現させた後、上記レセプターをコードするRNAの卵母細胞への微量注入を行うことができる。
リガンドレセプターに結合するときには、リガンドは、細胞内の貯蔵所または細胞外供給源からカルシウムイオンを放出させることができる。次いで、これらのカルシウム・フラックス(calcium fluxes)により、電気生理学的に測定することができる細胞膜中の塩化物電流が生じる。
このような電流は、例えばWahlestedt, C., Ann. N.Y. Acad. Sci., 632, 116-22(1991)、およびBoton, R. et al., J. Physiol. (London), 408, 511-534(1989)に記載されている。
電気生理学的手法またはレセプター結合に対する生物学的応答に依存する他の手法の使用に対する代替法としては、更に直接的な結合分析法を用いることができる。例えば、リガンドを検出可能な標識で標識し、レセプターに結合させ、次に標識を検出することができる。用いることができる好適な標識としては、放射能標識、蛍光標識、検出可能な変化を引き起こすことができる酵素などが挙げられる。
本発明のレセプターは、アテロームの治療に好適な薬剤をスクリーニングするのに用いることもできる。この場合には、MCP−1がアテローム性動脈硬化症斑に対する単球の重要な補充装置であることに留意すべきである。レセプターを用いて、このような補充を防止または減少する(MCP−1αに対して拮抗的に作用する)薬剤をスクリーニングすることができる。このような薬剤はMCP−1自身の変異体(MCP−1に対して1個以上のアミノ酸が欠失、置換または挿入されているもの)であってもよいが、これは本質的なことではない。
本発明のレセプターのもう一つの用途は、幹細胞の増殖を抑制する薬剤をスクリーニングすること、すなわちMIP−1αの作動薬をスクリーニングすることである。MIP−1αは、造血幹細胞の増殖を抑制することが示されている(Graham, G.J. et al., Nature, 344, 442-(1990))。レセプター作動薬は、それ自体で、化学療法の際に幹細胞の増殖を防止するのに用いることができ、従ってこれは幹細胞をこのような化学療法の潜在的損傷作用から保護する。
MIP−1αは、幹細胞増殖抑制剤であることが知られており、幹細胞増殖抑制剤である薬剤を、本発明のレセプターを用いてスクリーニングすることができる。このような薬剤はMIP−1α自身の変異体(MIP−1αに対して1個以上のアミノ酸が欠失、置換または挿入されているもの)であることができるが、これは本質的なものではない。
本発明のレセプターのもう一つの用途は、移植の拒絶反応の可能性を減少させまたは拒絶反応が起こるまでの時間を増加させるのに用いられる薬剤をスクリーニングすることにある。高濃度のRANTESが腎臓移植片に見られることがあり、このような移植の拒絶反応に関係していることがある。従って、本発明のレセプターへのRANTESの結合を防止しまたは減少させる薬剤は、RANTESに拮抗的に作用することによって移植に用いられることがある。このような薬剤はRANTES自身の変異体(RANTESに対して1個以上のアミノ酸が欠失、置換または挿入されているもの)であることができるが、これは本質的なものではない。
本発明のもう一つの用途は、ウイルスによって媒介される疾病の治療に有用な物質のスクリーニングにある。従って、本発明は、抗ウイルス薬のスクリーニングに用いることができる。
この一例は、AIDSの治療に用いられる薬剤のスクリーニングにある。MIP−1αおよびRANTES濃度は、他の患者より長期間生存している幾人かのAID患者に少なくとも部分的に関与していることが示されてきた。本発明のレセプターはMIP−1αおよび/またはRANTESに結合することがあるので、これはAIDSの治療に用いることができる他の薬剤のスクリーニングに用いることができる。
ヒトサイトメガロウイルスおよびヘルペスウイルスはケモカインレセプターを有することも注目に値する。本発明を用いて、このようなウイルスによって媒介される疾病の治療に用いられる薬剤のスクリーニングに用いることができる。
本発明は第3図に示されるアミノ酸配列を有するレセプターに限定されず、上記配列に対して1個以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換を有する変異体(対立および非対立変異体)であって、この変異体がケモカイン:RANTES、MIP−1α、およびMCP−1の少なくとも1個に結合することができるものを包含することに留意すべきである。(しかしながら、レセプターはこれらのケモカインの総てに結合することができるのが望ましい。)結合は、既に説明したように、卵母細胞を用いて電気生理学的分析法での細胞の応答を観察することによって決定することができる。
例えば、当業者であれば、タンパク質のある種の特性を実質的に変更しまたはこれに悪影響を及ぼすことなく同様な特性を有する他のアミノ酸の代わりに各種のアミノを用いることができることが多いことを理解されるであろう。例えば、アミノ酸であるグリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンを互い(脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸)の代わりに用いることができる。互いに代わりによく用いることができる他のアミノ酸としては、
フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン(芳香族性側鎖を有するアミノ酸);リシン、アルギニンおよびヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸);アスパルテートおよびグルタメート(酸性側鎖を有するアミノ酸);アスパラギンおよびグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸)、およびシステインおよびメチオニン(硫黄を含む側鎖を有するアミノ酸)
が挙げられる。従って、本発明は、1個以上の上記置換を有する第3図に示されるレセプターの変異体を本発明の範囲内に包含する。
しかしながら、第3図に示されるアミノ酸配列を有するレセプターの変異体が、このアミノ酸配列と実質的なアミノ酸同一性を有することが好ましい。アミノ酸の同一性の程度は、「ベストフィット(bestfit)」(SmithおよびWaterman著、応用数学の進歩(Advances in Applied Mathematics), 482-489, (1981))のようなプログラムを用いて計算して、2個の配列の間の類似性の最適セグメントを見いだすことができる。アラインメント(alignment)は、SchwartzおよびDayhof(1979)タンパク質配列および構造の図解(Atlas of Protein Sequence and Structure)、Dayhof, M.O.監修、353-358頁に記載されているようなアミノ酸類似性のマトリックスを用いて得た得点を最大にすることに基づいている。
しかしながら、配列同一性の程度は少なくとも50%または少なくとも60%であるのが好ましく、75%を上回るのが更に好ましい。少なくとも80%、例えば少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性が、最も好ましい。
レセプターまたはその変異体はN−末端メチオニンを含むことができる。このようなメチオニンは翻訳の際に取り込まれ、以後外れないことがある。
レセプターまたは変異体は、別の残基(例えば、タンパク質)に共有結合することができる。従って、融合タンパク質を形成することができる。これらは当該技術分野では周知であり、同定または精製を助け、またはレセプターまたはその変異体の特性を変更する(例えば、その安定性および/またはその結合特性を変更するのに用いることができる。
MIP−1α、RANTESおよび/またはMCP−1に対する結合を保持したまま1個以上のアミノ酸を第3図に示されるアミノ酸配列から欠失することができるので、上記配列を有するレセプターの末端切断型変異体を提供することもできる。これらは、N−末端欠失、C−末端欠失であってもよく、または上記配列内部で起こることもある。
(どのような性質の)レセプターまたは変異体でも、実質的に純粋な形態で提供することができる。これは、他のタンパク質から単離することができ、また細胞膜から単離することができる。これは、(用いた発現系によって)グリコシル化したまたはグリコシル化していない形態であってもよい。本発明のレセプターまたはその変異体は、任意の適当な手法によって提供することができる。
遺伝子クローニングの手法を用いるのが好ましい。このような手法は、例えばJ. Sambrook et al., 分子クローニング(Molecular Cloning)第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に開示されている。
あるいは、化学的合成を用いることもできる(この方法は余り好ましくない)。例えば、短い合成ペプチドを製造して、次にこれらを互いに結合して、本発明の物質を提供することができる。このようなペプチドは、当業者に知られている手法によって製造することができる。従って、分子の一端を固定して、所望なアミノ酸残基を順次に添加することができる。保護基を用いて、望ましくない副反応を回避することができ、次に外すことができる。
本発明のレセプターの変異体は、レセプター自身と共に、以下において本発明による物質と呼ばれる。
このような物質は、抗体を生じさせまたは選択するのに用いることができる。従って、本発明は、本発明の物質に結合する抗体を包含する。好ましい抗体は、本発明の物質に特異的に結合して、このような物質を精製するのに用いることができる。抗体は、モノクローン性でも、またはポリクローン性であってもよい。
本発明の物質を適当な動物宿主(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギまたはサル)に注射すると、その動物でポリクローン性抗体の産生を刺激することによってポリクローン性抗体を生じさせることができる。必要ならば、アジュバントを、本発明の物質と共に投与することができる。次に、抗体を、本発明の物質へのそれらの結合によって精製することができる。
モノクローン性抗体は、ハイブリドーマから産生させることができる。これらは、所望な抗体を産生するメラノーマ細胞および脾臓細胞を融合させ、不変の細胞系を形成することができる。これは、周知のKohler & Milstein法である(Nature, 256, 52-55(1975))。
特定のタンパク質に結合するモノクローン性およびポリクローン性抗体を産生する手法は、現在では当該技術分野において完全に開発されている。それらは、標準的な免疫学の教科書、例えばRoitt et al., 免疫学、第二版(1989年), Churchill Livingstone, ロンドンに記載されている。
全抗体の他に、本発明は、本発明の物質に結合することができるその変異体を包含する。
従って、本発明は、抗体断片および合成構造体を包含する。抗体断片および合成構造体の例は、Dougall et al., Tibtech, 12, 372-379(1994年9月)によって示されている。
抗体断片としては、例えばFab、F(ab′)2、およびFv断片が挙げられる(Roitt et al.[上記引用]を参照されたい)。
Fv断片を修飾して、一本鎖Fv(scFv)分子として知られている合成構造体を産生することができる。これには、分子の安定性に寄与するVhおよびV1領域を共有結合するペプチドリンカーが挙げられる。
他の合成構造体としては、CDRペプチドが挙げられる。これらは、抗原結合決定基を含んでなる合成ペプチドである。ペプチド類似体を用いることもできる。これらの分子は通常はコンホメーションが限定された有機環であって、CDRループの構造に類似しておりかつ抗原と相互作用する側鎖を有するものである。
合成構造体としては、キメラ分子が挙げられる。従って、例えば人体に適応させた(または霊長類に適応させた)抗体またはその誘導体は、本発明の範囲内にある。人体に適応させた抗体の例は、齧歯類の高頻度可変領域を除くヒト骨格領域を有する抗体である。
合成構造体としては、抗原との結合製の他に幾つかの所望な特性を有する分子を提供する共有結合した残基を含んでなる分子も挙げられる。例えば、この残基は、標識(例えば、蛍光または放射性標識)、または薬学活性を有する薬剤であることができる。
本発明の抗体またはその誘導体は、多種多様な用途を有する。それらは、本発明の物質の精製および/または同定に用いることができる。従って、それらは、診断に用いてもよい。
それらは、本発明の物質をスクリーニングするためのキットの形態で提供することができる。
本発明は、本発明の物質(すなわち、上記レセプターまたはその変異体)をコードする核酸分子もその範囲内に包含する。核酸分子はRNAまたはDNAでよく、単離したまたは組換え形態で提供することができる。
本発明の核酸分子は、任意の適当な手法によって提供することができる。
遺伝子クローニングの手法が好ましい(Sambrook et al.,上記引用を参照されたい)。所定の核酸配列の変異体は、突然変異誘発の手法(例えば、特定部位の突然変異誘発)によって調製することができる。
化学的合成法を用いることもできるが、余り好ましくない。
ベクターを用いて、本発明の核酸分子を組み込むことができる。ベクターは真核性または原核性ベクターでよく、適当な宿主細胞中または非細胞性発現系に組み込むことができる。
上記核酸分子に相補性の核酸分子も、本発明の範囲内にある。これらは、「アンチセンス分子」と呼ばれることがある。それらを相補性核酸分子にハイブリダイゼーションさせることができ、それによって遺伝子生成物の発現を防止または減少させることができる。従って、それらを用いて、遺伝子発現を変更させることができる。
このような分子の使用は、遺伝子機能および調節を検討する上で有用である。適当な標識およびハイブリダイゼーションの手法を用いて、コード領域の配置を同定することができる。
本発明は、ケモカインレセプターのプローブとして用いることができる核酸もその範囲内に包含する。好ましいプローブは、上記したように、第3図に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはその変異体をコードする核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。このようなプローブは任意の好適な長さのものであることができるが、典型的には15個を上回るヌクレオチドの長さであり、少なくとも100個のヌクレオチドの長さであることができる。
プローブは、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイゼーションする。緊縮ハイブリダイゼーション条件の一例は、35°〜65℃の温度および約0.9モルの塩濃度である。他の緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いることができ、塩濃度を0.9モル程度とする必要はない。
本明細書の第1図および3図に示される核酸配列またはその断片は、プローブまたはプライマーとして、またはプローブまたはプライマーを調製する目的で用いることができる。
プライマーを用いて、例えばPCRまたは他の増幅法を用いることによって核酸配列を増幅することができる。プローブは、診断または精製に用いることができる。
本発明は、添付の図面に関して単なる例として説明される。
第1図は、ヒト脾臓λGT11cDNAライブラリーの検査に用いた「TM(2−7)5.5」と命名されたクローンのcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。
第2図は、TM(2−7)5.5DNAをプローブとして用いることによって上記第1図に関して引用されたライブラリーから単離されたクローンの配列決定に用いた各種プライマーを示す。
第3図は、上記の第2図に関して引用された、「K5.5」と命名されたクローンに関するcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。
第4図〜6図は、様々なハイブリダイゼーションの研究においてTM(2−7)5.5DNAを用いて調製したノザンブロット分析を示す。これらの図においては、下記の得点系を用いている。
+++ オートラジオグラフの4時間暴露した後に視認される極めて強い陽性シグナル。
++ オートラジオグラフの4時間暴露した後に視認される明確な陽性シグナル。
+ オートラジオグラフの4時間暴露した後に視認されないが、24時間後には明確になるシグナル。
+/- 24時間の暴露の後にのみ視認される弱い陽性シグナル。
- シグナルなし。
プローブは、106cpm/mlハイブリダイゼーション溶液の比活性で用いた。
第7図は、白血球および幾つかのヒト細胞系からのK5.5レセプターmRNA発現生成物であって、RNAが逆転写酵素PCRを用いて増幅したもののアガロースゲル上での分析を示す。
図8A図は、K5.5cRNAを微量注射した電圧固定したアフリカツメガエルの卵母細胞を各種のケモカインリガンドで刺激したときに誘導される電流の分析を示す。
第8B図は、異なるケモカイン(両図で比較のために示しているMIP−1αとは異なる)を用いることを除き、第8A図について行ったのと同様な分析を示す。本発明者は、IL−8がCC−CKR3分子に結合することを示す如何なるデーターを得ることもできなかった。本発明の範囲内の好ましいレセプターは、IL−8に結合しない。
第9図は、[125I]MIP−1αおよび[125I]RANTESを用いてヒトおよびネズミCC−CKR−3分子に結合する結合分析の結果を示す。
実施例
IL−8レセプターAおよびB、およびC−C CKR−1(MIP−1α/RANTESレセプター)のアミノ酸配列のアラインメントは、提案されたトランスメンブランドメイン3および4の間の領域が、保存されたアミノ酸配列RYLAIVHAを含むことを示していた。
第二の保存されたアミノ酸配列は、下記のようにこれらの3種類のレセプター並びにfMLP(ホルミル−メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン)およびC5aについての2種類の非ケモカイン走化性ペプチドレセプターに置ける提案された7番目のトランスメンブランドメインに生じる。
CL(またはV,I)NPI(またはL,M,V)I(またはL)YA(またはV)F(またはV)
翻訳して上記のアミノ酸配列を提供することができる可能なコドンの大半を含む縮重オリゴヌクレオチドを調製した。
これらのオリゴヌクレオチドは、配列
a) センス 5′GIT AYY TIG CIA THG TIC AYG C
または
b) アンチセンス 5′AMI RCR TAI ADI AII GGR TTI AIR C
IUB/GCGコードを用いる、但し
I=A、T、GまたはCの代わりに用いることができるイノシン
Y=CまたはT
H=A、CまたはT
M=AまたはC
R=AまたはG
D=A、GまたはT
次にオリゴヌクレオチドを、下記の手続きを用いてヒトCCケモカインレセプターをクローニングするのに用いた。
(a) ヒトK5.5(CC−CKR−3)*と命名された配列のクローニング
(*CC−CKR−3という名称を、優先権書類に用いた名称と一貫性を持たせるため本明細書で用いる。しかしながら、他の研究グループは異なる分子にCC−CKR−3という名称を用いており、本明細書でCC−CKR−3と表される分子は、文献ではCC−CKR−4を表すことがある点が注目される。)
総RNAは、ChomczynskiおよびSacchiの方法(1987年)(酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によるRNA単離の一段階法(Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction), Anal. Biochem, 162, 156-159)によって1×108KU812細胞から単離した。これらの細胞は、K. Kishi博士、新潟、日本から贈られたヒト好塩基性KU812細胞系からのものであった。
次に、ポリA+mRNAを、ポリA迅速mRNA精製キット(polyA quik mRNA purification kit)(Stratagene)を用いてオリゴdTセルロースクロマトグラフィによって単離した。一本鎖cDNAは、1μgオリゴdT12-18′、4mMメチルマーキュリックヒドロオキシド、1mM dNTPs、50mM トリス−HCl、pH8.3緩衝液、50mM KCl、8mM MgCl2、10単位のRNAsinおよび100単位のAMV逆転写酵素−XL(Life Science Inc.)を含む50μl反応中でポリA+mRNA1μgから、42℃で60分間で調製した。次に、反応混合物5μlを、Techne PHC-2温度循環装置(thermal cycler)中でそれぞれ宿重したオリゴヌクレオチドプライマー(センス5′GIT AYY TIG CIA THG TIC AYG Cおよびアンチセンス5′AMI RCR TAI ADI AII GGR TTI AIR C)3μMを用いて、10mM トリス−HCl、pH8.3緩衝液、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTPSおよび2.5単位のAmplitaq TM(Perkin Elmer Cetus)中でPCR(95℃、2分;37℃、2分;および72℃、2分)40サイクルを施した。
PCR反応生成物を、0.5μg/mlエチジウムブロミドを含む1%アガロースゲル上で可視化した。予測した大きさ(500〜550bp)で移動する反応生成物を、標準的方法によってゲル精製した(Sambrook, J. et al., 1989、分子クローニング:実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク)。次に、ゲル精製したDNAを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を用いて製造業者の使用説明に準じて総容積50μlで37℃で1時間順次処理することによって平滑末端とした。その後、2.5mM dNTPs 2.5μlおよびE. coli DNAポリメラーゼIクレノー断片(New England Biolabs)1μlを加え、インキュベーションを37℃で更に30分間継続した。次いで、反応混合物を70℃で30分間熱不活性化した後、トリス−HCl pH8.0で飽和したフェノール/クロロホルム(1:1(v/v))で1回抽出した。DNAを、−20℃で3M酢酸ナトリウムpH5.5 10μl、グリコーゲン(20mg/ml)(Boehringer)1μl、およびエタノール250μlを添加することによって沈澱させた。DNAを、10,000×gで4℃にて20分間遠心分離して回収し、70%エタノールで洗浄した。最終ペレットを、滅菌水に10ng/μlの濃度で再懸濁した。
pBluescript II SK−クローニングベクター(Stratagene)を、下記のようにして調製した。CsClグラディエントによって精製したプラスミドを、100μlの反応容積で、EcoRVまたはEcoRI(New England Biolabs)200単位を用いて製造業者の使用説明に従って、37℃で2時間消化した。2時間後に、消化したベクターを子牛腸アルカリ性ホスファターゼ(20単位/ml)(Boehringer)10μlで、37℃で更に30分間処理した。反応混合物を68℃で15分間加熱することによって不活性化した後、トリス−HCl pH8.0で飽和したフェノール/クロロホルム(1:1(v/v))で1回抽出した。プラスミドDNAを、−20℃で、3M酢酸ナトリウム pH5.5 10μl、およびエタノール250μlを添加することによって沈殿させた。DNAを、10,000×gで4℃にて20分間遠心分離して回収し、70%エタノールで洗浄した。最終ペレットを、滅菌水に50ng/mlの濃度で再懸濁した。
平滑末端PCR生成物(10ng)を、T4DNAリガーゼ(400,000単位/ml)(New England Biolabs)2μlを用いて、15℃で少なくとも16時間20μlの容量でEcoRVで消化してアルカリ性ホスファターゼ処理を行ったpBluescriptIISk−プラスミドクローニングベクター50ngに連結した。連結生成物を1×TE(10mM トリス−HCl pH8.0/1mM EDTA)で100μlまで希釈し、上記と同様にしてフェノール/クロロホルム抽出した。連結生成物を、3M酢酸ナトリウム pH5.5 10μl、グリコーゲン(20mg/ml)1μl、およびエタノール250μlを−70℃で15分間添加することによって沈澱させた。DNAを上記と同様にして遠心分離によって回収し、滅菌水に10μlに再懸濁した。次に、再懸濁した連結生成物5μlを、Bio Rad Geneパルサーを用いて、製造業者の使用説明に従って、エレクトロコンピテントなE. coli XL-1ブルー株(recA1、endA1、gyrA96、thi−1、hsdR17、supE44、relA1、lac、{F′proAB、LacIqZDM15、Tn10(tetr](40μl)にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、LB培地1mlを加え、細胞を37℃で1時間成育させた。この後、培地100μlを、アンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに採取して、37℃で16時間成育させた。次に、細菌コロニーを、アンピシリン100μg/mlを含むLB培地5mlに採取して、37℃で一晩成育させた。次いで、小規模のプラスミドDNA調製物(ミニーpreps)を、Wizard(商品名)ミニーprepDNA精製システム(Promega)を用いて製造業者の使用説明に従って、それぞれの培養物3mlから作成した。次に、ミニーprepDNA 3μlを、制限酵素HindIIIおよびEcoRI(両方ともNew England Biolabs製)を用いて、製造業者の使用説明に従って、15μlの反応容積で消化した。反応生成物を、0.5μg/mlエチジウムブロミドを含む1%アガロースゲル上で分析した。約500〜550bpの挿入サイズを生じたミニーprepを、次にT3およびT7プライマーおよびSequenase(USB)を用いて製造業者の使用説明に従ってDNA配列分析を施した。
得られた配列をGenbank/EMBL/DDBJデーターベースに対して比較したところ、分析を行った10/23配列はヒトC−C CKR−1(MIP−1α/RANTESレセプター)に対してDNA水準で60%の同一性を示すことが明らかになった(Neote et al.,分子クローニング、C−Cケモカインレセプターの機能発現およびシグナル化の特徴(Molecular cloning, functional expression and signalling characteristics of a C-C chemokine receptor), Cell, 72, 415-425(1993))。TM(2−7)5.5(K5.5と省略)と命名されたクローンの一つの配列を、第1図に示す。
CsClグラディエントによって精製したプラスミドDNAを、クローンK5.5について標準的方法によって調製した。プラスミドDNA20μgを、制限酵素HindIIIおよびEcoRIを用いて、製造業者の使用説明(New England Biolabs)に従って37℃で消化した。消化生成物を0.5μg/mlエチジウムブロミドを含む1%アガロースゲル上で分析した。配列決定したPCR生成物に相当する514bpのインサートDNAを、上記と同様にしてゲル精製した。514bpインサート100μgを、ランダム−プライドDNA標識キット(Boehringer)を用いて製造業者の使用説明に従って32P−dCTP(Amersham International)で標識し、ヒト脾臓λGT11 cDNAライブラリー(Clontech)の5×105個のクローンを製造業者の使用説明に従ってスクリーニングするのに用いた。ハイブリダイゼーションの後、二重陽性のものを、純粋な陽性ファージプラークが得られるまで、同じプローブで再スクリーニングした。ファージDNAを、標準的方法(Sambrook, J. et al. (1989))を用いて陽性プラークから回収した。精製したファージDNA(100μg)を、緩衝液2(New England Biolabs)中でEcoRI(New England Biolabs)200単位を用いて37℃で16時間消化した。消化生成物を、エチジウムブロミド(0.5μg/ml)を含む1%アガロースゲル上で分画し、cDNAインサートをゲル精製し、上記と同様にしてpBluescript II SK−ベクターのEcoRI部位に連結した。連結生成物を、上記と同様にしてエレクトロポレーションによってE. coli XL-1ブルー株(recA1、endA1、gyrA96、thi−1、hsdR17、supE44、relA1、lac、[F′proAB、lacIqZDM15、Tn10(tetr)](40μl)に形質転換した。個々のアンピシリン耐性の細菌コロニーを、100μg/mlアンピシリンを含むL−ブロスに接種して、37℃で16時間成育させた。ミニ−prepDNAを、上記と同様にして一晩培地3mlから調製した。次に、ミニ−prepDNA 3μlを、制限酵素EcoRIを用いて製造業者の使用説明に従って、15μlの反応容積で消化した。反応生成物を、0.5μg/mlエチジウムブロミドを含む1%アガロースゲル上で分析した。cDNAインサートを含むミニ−prepを、次にApplied Biosystems DNAシークエンサー上でSequenase(商品名)およびT3およびT7プライマーを用いて配列決定した。
E1−C19と命名した一つのクローンを、T7プライマーでK5.5の推定上の5′末端を含むように配列決定することによって示した。クローンE1−C19のCsClグラディエントによって精製したDNAを、次にT3およびT7プライマーおよび上記の配列決定の結果(プライマー配列は第2図に示す)に基づく数個の内部配列決定プライマーで再度配列決定した。E1−C19インサートcDNAの配列を、第3図に示す。
(b) ノザンブロット分析
多重組織ノザンブロットをClontechから購入し、製造業者の使用説明に従ってpTM(2−7)5.5の514bp HindIII/EcoRI断片にハイブリダイゼーションした。他のノザンブロットについては、総RNAをChomczynskiおよびSacchiの方法(1987年)によって細胞系および末梢血白血球母集団から調製した。この研究に用いた細胞系の総ては、10%熱不活性化したFCSおよび50μg/mlゲンタマイシン(いずれもGibco-BRLから購入した)を含むRPMI1640培地中に保持した。総末梢血単核細胞および多形核細胞は、Ficoll(Pharmacia)上で密度グラディエント遠心分離によって精製した。白血球を、FACSスター(Becton Dickinson)上で適当に標識した抗体を用いてFACSによって選別して、B細胞(CD20)、T細胞(CD4、CD8、CD45R0、CD45RA)、および単球(CD14)の純粋な母集団(>90%)を得た。肺マクロファージおよび混合した肺白血球を、Nicod et al.(1989年)の方法(自己蛍光に基づく強いおよび弱い機能のヒト肺修飾細胞の分離(Separation of potent and poorly functional human lung accesory cells based on a utofluorescence), J. Leukocyte. Biol., 45, 458)を用いて切除したヒト肺試料から調製した。
それぞれのRNA5μgを、2.2%(v/v)ホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移し、標準的なノザンブロット法(Sambrook et al(1989))を用いてTM(2−7)5.5から32P−dCTP標識した514bpのインサートでプローブした。結果を、第4図〜6図に示す。
(c) 逆転写酵素PCRによる白血球および幾つかのヒト細胞系におけるK5.5レセプターmRNA発現の分析
総RNA(容積10μl)10μg、およびオリゴdT15の0.5mg/ml溶液0.5μlを70℃で10分間加熱し、次に氷上で2分間冷却した後、5Xファースト・ストランド緩衝液(5X 1st strand buffer)4μl、0.1M DTT 2μl、10mM dNTPs 1μl、および1μlのSuperscript(商品名)を37℃で1時間加えた。逆転写(RT)反応のための総ての試薬は、オリゴdT15(Stratagene)以外は、Gibco-BRL製であった。次に、それぞれのRT反応の2μlを、プライマーK5−5FLAおよびK5−5FLBのそれぞれ100ピコモルを含む100μl反応混合物中で、PCR(95℃、2分間;55℃、2分間、および72℃、2分間)を40サイクル施した。PCR反応生成物(10μl)を上記の方法と同様にして1%アガロースゲル上でK5.5の完全コード配列に相当する1085bpの反応生成物の存在について分析した。結果を第7図に示し、第7図に示されたレーンの試料は下記の通りである。
(d) アフリカツメガエル卵母細胞におけるK5.5 cRNAの発現
CsClグラディエントによって精製したpE1−C19プラスミドDNA(5μg)を、10μl反応容積中で制限酵素BamHI(New England Biolabs)を用いて37℃で一晩線形化した。線形化したプラスミドを、プロテイナーゼK(16.7mg/ml、Boehringer)2μlで、37℃で30分間処理した。DNAをフェノール(0.1Mトリスで飽和したもの、pH8.0)で2回、およびクロロホルムで1回抽出した。グリコーゲン(20mg/ml保存溶液1μl)を水相に加え、3M酢酸ナトリウムpH5.5 0.1容およびエタノール2.5容を加えた後、線形化したDNAを−80℃で1時間沈澱した。DNAを遠心分離(14,000rpm、4℃、微量遠心分離機中)によって回収し、70%エタノールで洗浄し、RNアーゼを含まない水に250ng/mlの濃度で溶解した。
キャップ形成したcRNA転写物を、20μl転写緩衝液(5X)、4μlNTP混合物(10mM ATP、UTPおよびCTP、3mM GTP)、4μlの0.75M DTT、2.5μlのRNAsin、0.5μlGTP(10mM)、4μlCTPカタログ(10mM m7G(5′)ppp(5′)G)、およびT7またはT3 RNAポリメラーゼをそれぞれ2.5μl含む100μlの反応容積中でBamHI(New England Biolabs)で線形化したDNA1μgから生成した。イン・ビトロの転写反応に用いた総ての試薬は、CAP類似体(Pharmacia)以外はPromega製であった。37℃で1.5時間後に、4μlのRQ1 DNアーゼ(Promega)を加え、反応混合物を37℃で更に15分間インキュベーションした。反応混合物を、0.1Mトリス−HCl、pH8.0で飽和したフェノール/クロロホルム(1:1、v/v)で2回、およびクロロホルムで1回抽出した。グリコーゲン(上記と同様のもの1μl)を水相に加え、3M酢酸ナトリウムpH5.5 0.1容およびエタノール2.5容を加えた後、cRNAを−20℃で一晩沈澱した。cRNAを遠心分離(14,000rpm、4℃、20分間、微量遠心分離機中)によって回収し、ペレットを70%エタノールで洗浄し、滅菌水に1μg/μlの濃度で再懸濁した。cRNA濃度の近似値は、既知濃度のRNAマーカーに対して2.2%(v/v)ホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲル上で再懸濁した材料の一部を移動させることによって得た。試料は、使用前には−80℃で保存した。
卵母細胞は、標準的な方法(Bertrand et al., 1991)によって成熟した雌のアフリカツメガエルから採取した。卵母細胞は、スピナーフラスコ中でCa2+を含まないおよびMg2+を含まない50mlのOR2培地中0.2%(w/v)コラーゲナーゼ(Sigma)中で緩やかに拡販しながら室温で2時間インキュベーションすることによって脱濾胞形成した(OR2培地は82.5mM NaCl、2.5mM KCl、1mM Na2HPO4、15mM HEPES、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.6である)。卵母細胞をOR2で注意しながら濯いだ後、MBS(改質Barth食塩水:88mM NaCl、1mM KCl、0.33mM Ca(NO3)2、0.41mM CaCl2、0.82mM MgSO4、2.4mM NaHCO3、10mM HEPES、pH7.6)で濯ぎ、ステージV〜VIの卵母細胞を選択する前に少なくとも1〜2時間MBS中で回収した。選択した卵母細胞を、ペニシリン/ストレプトマイシン(100単位/ml)(Gibco-BRL)を補足したMBSで18℃で一晩インキュベーションした後、注射した。
卵母細胞を、Drummondの較正6ml毛細管から作られた針を用い、Inject+Matic空気ポンプ(Gabay)を用いて微量注入した。cRNA(25ng/50nl)を細胞質に注入した。卵母細胞を、個々に96穴の平底培養皿のウェルに移して、MBS中で24〜72時間インキュベーションした。
電気生理学的記録は、2個の微小電極(1〜2MΩ、いずれも3M KClを満たしたもの)を用いて電位固定した条件下で室温にてOR2培地で超融合した(superfused)卵母細胞に注入した後1〜3日間行い、膜電位は、Gene Clamp 500装置(Axon)を用いて−100mVに常套的に固定されている。
試験ケモカインはPeptroTechから購入し、またはGlaxo Institute for Molecular Biologyで社内で製造し、PBS中に1μMの濃度で再懸濁した。それぞれのケモカイン50μlを直接電位固定した卵母細胞に適用し、誘導した電流をIBM−PCに結合したTektronix 5113デュアル−ビーム保存オシロスコープで監視した。多重ケモカインを単一の卵母細胞で試験した場合には、それぞれの適用の間に2分間の回収時間を設定した。結果を、第8A図に示す。
第8B図は、異なるケモカイン(MIP−1αとは異なる)を用いることを除き、第8A図に示したものと同様な分析の結果を示す。
MIP−1αについて得た結果とは対照的に、IL−8を用いたときには、有意な電気生理学的応答は見られなかったことが分かる。
(e) HL−60細胞トランスフェクションおよびリガンド結合分析
30μgのヒトCC−CKR−3−pcDNA1neo、ネズミCC−CKR−3−pcDNA1neo、またはpcDNA1neoを、Bio Rad Geno Pulster(260ボルト、960μF、0.4cmギャップセル)を用いて、500μl HL−60細胞(2×107個/0.15M NaCl 1ml、20mM HEPES、pH7.3)にエレクトロポレーションを行った。細胞を、25mlのAIM−V血清不含培地(Gibco)を含むT−175フラスコに播種した。トランスフェクションから2または3日目に、細胞を600μg/ml G418を含むAIM−V培地で45mlの総容量まで希釈し、6日目に、細胞を600μg/ml G418を含むAIM−V培地で180mlまで更に希釈した。トランスフェクションの後7〜15日目に、細胞をAIM−V培地(+G418)中で0.4〜1.2×106個/mlの密度に保持し、この間に結合分析を行った。平衡競争結合を、Millipore(商品名)-DV96穴フィルタープレートで、5×105個の細胞を100μl結合緩衝液(1mM CaCl2、5mM MgCl2、0.5%BSA、50mM HEPES、pH7.2)、0.34nM[125I]放射性リガンド、および0.5〜2000nMコールドリガンド中でインキュベーションすることによって行った。室温で1.5時間のインキュベーションの後、細胞を0.5M NaClを含む結合緩衝液で真空瀘過により4回洗浄した。50μlのOptiphaseシンチラント(Wallac)をそれぞれのウェルに加え、放射能をWallac Microbeta Plate Readerで測定した。総てのデーターは、総結合の百分率として規格化した。所定のリガンドに対する総結合は、競合リガンドの非存在下でヒトCC−CKR−3でトランスフェクションした5×105個の細胞に結合した放射能として定義した(範囲:1000〜2500cpm)。
結果を第9図に示し、この図は[125I]MIP−1αおよび[125I]RANTESのヒトおよびネズミCC−CKR−3への高親和性結合を示している。HL−60細胞を、ヒトCC−CKR−3(●)、ネズミCC−CKR−3(■)、または空ベクター(○)でトランスフェクションし、G418を含むAIM−V培地に7〜15日間保持した。平衡競争分析を、上記と同様にして、[125I]MIP−1α(A)および[125I]RANTES(B)を用いて行った。それぞれの点は、3回(A)または4回(B)の異なる実験からの重複点(duplicate points)の平均値±S.D.である。データーに、方程式B/Bmax app=1/(1+([L[/IC50))(式中、B=結合したcpm、Bmax app=競合リガンドの非存在下で結合したcpm、L=競合リガンド、およびIC50=[放射性リガンド]+Kd(Cheng., Y. and Prusoff, W.H., Biochem. Pharmacol., 22: 3099-3108(1973))を用いてGraFit 3.01ソフトウェア(Leatherbarrow., R.J., GraFit Versions 3.01, Erithicus Software Ltd., ステインス,英国(1992年))により曲線に当てはめた。
Claims (18)
- 第3図に示されるアミノ酸配列(配列番号20)を含むか、または第3図に示されるアミノ酸配列(配列番号20)に対して1個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入または置換を有しており、第3図に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列の同一性を有し、RANTES、MIP-1αおよび/またはMCP-1に結合することができるポリペプチド。
- 第3図に示されるアミノ酸配列(配列番号20)を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドの使用を含む、治療に有用な薬剤のスクリーニング方法。
- 前記薬剤がアレルギーの治療に有用である、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤が喘息、枯草熱、アトピー性皮膚炎または鼻炎の治療に有用である、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤が喘息の治療に有用である、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤がアンタゴニストである、請求項3〜6のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤が抗体である請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤がT-リンパ球の活性化によって引き起こされる免疫状態および炎症状態に関与する、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤が移植の拒絶反応の可能性を提言するかもしくは拒絶反応が起こるまでの時間を延長し、アテロームを治療し、または、ウイルスによって媒介される疾病を治療するのに有用である、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤が幹細胞増殖を抑制する、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤がMCP-1、MIP-1αおよび/またはRANTESとケモカインレセプターとの結合をブロックする、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドをコードしている、請求項13に記載の核酸分子。
- 第3図に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項14に記載の核酸分子。
- 第3図に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド183〜1262を含む、請求項15に記載の核酸分子。
- 請求項13〜16のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項17に記載のベクターを含んでなる宿主。
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