JP2001516203A

JP2001516203A - エクソダスケモカイン物質及び方法

Info

Publication number: JP2001516203A
Application number: JP52280098A
Authority: JP
Inventors: ロマス，ロバート
Original assignee: アドバンストリサーチアンドテクノロジーインスティチュート
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2001-09-25
Also published as: BR9707142A; CA2242384A1; HUP0000316A2; CN1213401A; IL125351A0; CZ220298A3; NO983238L; WO1998021330A1; NO983238D0; EP0894134A1; PL327853A1; AU5255398A; SK96398A3; US6096300A

Abstract

(57)【要約】本発明は、エクソダスと命名された、ヒトマクロファージ由来のＣ−Ｃケモカインをコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。さらに本発明によって提供されるのは、精製及び単離されたケモカインタンパク質、その断片及びポリペプチド類似体、それに対する抗体、ならびにその組換え製造のための材料及び方法である。これらの産物は、治療、診断及び医学画像への適用において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】エクソダスケモカイン物質及び方法本出願は、概してケモカインに関し、さらに詳細には、エクソダスと命名されたヒトＣ−Ｃケモカイン及びその類似体をコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドによりコードされる、精製及び単離されたケモカインポリペプチドと、これらのポリペプチドの組換え製造のための材料及び方法と、そしてこれらポリペプチドの医療用途、特に化学療法の際の骨髄保護（myeloprotection）における用途、骨髄増殖性疾患の処置における用途、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に対する用途に関するものである。発明の背景ケモカイン（「インタークライン（intercline）」及び「ＳＩＳサイトカイン」としても知られている）は、先ず白血球の遊走及び活性化を調節し、それによって免疫系の促進及び調節を補助する、分泌小タンパク質（およそ７０〜１００アミノ酸、8〜12キロダルトンのサイズ）のスーパーファミリーで構成されている。「ケモカイン」の名称は、走化性サイトカインの語に由来しており、これらのタンパク質が白血球の走化性を促進する能力を言及したものである。事実、ケモカインは病理組織への炎症細胞に対する主要な誘引物質を含んでいると考えられる。［総括的に、Baggioliniら、Advances in Immunology、55巻、97〜179頁( 1994)；Oppenheim、The Chemokines、Lindleyら編、183〜186頁、Plenum Press ，NY(1993)］。ケモカインは一般に白血球によって分泌されるが、いくつかのケモカインは多くの組織において発現される。Baggioliniら（前出）、表II。あるケモカインは、白血球に加えて内皮細胞及び繊維芽細胞などの様々な細胞をも活性化または誘引する。これまでに同定されたケモカインは、一般に、互いに20〜70％のアミノ酸同一性を呈しており、４つの高く保存されたシステイン残基を含んでいる。これらシステイン残基の最初の２つの相対的な位置に基いて、さらにケモカインは２つのサブファミリーに分類されている。ヒトクロモソーム４に位置する遺伝子によってコードされる「Ｃ−Ｘ−Ｃ」あるいは「α」サブファミリーでは、最初の２つのシステインが１つのアミノ酸によって分かたれている。ヒトクロモソーム１７に位置づけされている遺伝子によってコードされる「Ｃ−Ｃ」あるいは「β」サブファミリーでは、最初の２つのシステインが隣接している。種々のケモカインのＸ線結晶解析及びＮＭＲによる実験の結果、各ファミリーで、第１及び第３システインが第１のジスルフィド架橋を形成し、そして第２及び第４のシステインが第２のシステイン第２のジスルフィド架橋を形成しており、これらがタンパク質の天然のコンフォメーションに強く影響していることが示唆されている。ヒトだけで、各ケモカインサブファミリーにつきおよそ１０の別個の配列が報告されている。双方のサブファミリーケモカインは、２０から２５アミノ酸の特徴的なリーダー配列をを有している。Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、ＩＬ−８、ＧＲＯα/β/γ、血小板塩基性タンパク質、血小板因子４（ＰＦ４）、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、マクロファージ走化性及び活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＩＰ−１０、その他を含み、どれか２つのアミノ酸配列を比較するとおよそ25から60％の相同性を共有している（互いに84〜88％同一であるＧＲＯα/β/γのメンバーを除く）。サブファミリーのメンバーのほとんど（ＩＰ−１０及び血小板因子４を除く）は、最初の２つのシステイン残基の上流に共通のＥ−Ｌ−Ｒトリペプチドモチーフを共有している。Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、一般に好中球の強力な刺激剤であり、速やかなる形状変化、走化性、レスピラトリーバースト、及び脱顆粒を惹き起こす。ＩＬ−８を含む特定のＣ−Ｘ−ＣケモカインのＮ−末端アミノ酸配列の特異的な切除は、活性の顕著な減少に結びつく。マクロファージ炎症性タンパク質ＭＩＰ−１α［Nakaoら、Mol.Cell Biol.、1 0巻、3646頁(1990)］及びＭＩＰ−１β［Brownら、J.Immunol.、142巻、679頁(1 989)］、単球走化性タンパク質ＭＣＰ−１［Matsushimaら、J.Exp.Med.、169巻、1485頁(1989)］、ＭＣＰ−２［Van Dammeら、J.Exp.Med.、176巻、59頁(1992) 及びChangら、Int.Immunol.、1巻、388頁(1989)］、及びＭＣＰ−３［Van Damme ら（前出）］、ＲＡＮＴＥＳ［Schallら、J.Immunol.、141巻、1018頁(1988)］、Ｉ−３０９［Millerら、J.Immunol.、143巻、2907頁(1989)］エオタキシン［R othenbergら、J.Exp.Med.、181巻、1211〜1216頁(1995)］、その他を含むＣ−Ｃケモカインは、互いに25〜70％のアミノ酸同一性を共有している。Ｃ−Ｃケモカインは、一般に単球、リンパ球、好塩基球及び好酸球を活性化するが、好中球の活性化は行わない。報告されたＣ−Ｃケモカインのほとんどは単球を活性化して、カルシウムの流動と走化性が惹き起こされる。さらに選択的な効果が、リンパ球、例えばＲＡＮＴＥＳに最も強く応答するＴ−リンパ球などに認められる。Ｃ−Ｃケモカインは、構造上の相同性と活性の類似に従って、さらに細分化することができる。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳは、ファミリーの他のメンバーとよりも密接な相同性と生物学的活性の範囲とを有している。Ｃ−Ｃケモカインファミリーに含まれる他のサブファミリーは、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）であり、これはＣ−Ｃケモカインファミリーの他のメンバーとよりも相互の構造的類似性が高く、優先的に単球を刺激して遊走し、炎症性刺激に対する応答を行う。欠失及び置換類似体の研究により、重要な受容体結合領域は先ずケモカインのアミノ末端残基にあり、次に第２システイン残基に続くループにある第２領域であるらしいことが明らかになっている。これらの一般的な機能のための要件は、あらゆるケモカインに共通であるらしい。［Clark-Lewisら、J.Leukocyte Bio. 、57巻、703頁(1995)］ケモカイン受容体は、７つの膜貫通ドメイン・ロドプシン様Ｇタンパク質結合受容体である。ＩＬ−８に対して特性を有する受容体は、Holmesら、Science、2 53巻、1278〜83頁(1991)によってクローニングされており、一方ＩＬ−８、ＧＲＯ及びＮＡＰ−２を認識する類似の受容体（77％の同一性）が、Murphy及びTiff any、Science、253巻、1280〜83頁(1991)によってクローニングされている。Ｃ −Ｃケモカイン受容体のうち５つが今日までにクローニングされている。すなわち、ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳを認識するＣ−Ｃケモカイン受容体−１（ＣＣＲ−１）［Neoteら、Cell 72巻、415〜425頁(1993)］、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１に対する受容体（ＣＣＲ−４）［Powerら、J.Biol.Chem. 、270巻、19495〜19500頁(1995)］、ＭＣＰ−１受容体（ＣＣＲ−２Ｂ）［Charo ら、Proc.Natl.Acad.Sci.、91巻、2752〜56頁(1994)］エオタキシン受容体（ＣＣＲ−３）［Combadiereら、J.Biol.Chem.、270巻、16491〜16494頁(1995)］、ならびにＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳに対する受容体（ＣＣＲ −５）［Raportら、 J.Biol.Chem.、271巻、17161〜17166頁(1996)］である。これらの受容体は、多機能性の傾向があり、数多くの相違するケモカインに結合しうる。受容体自体がヒトの疾患において役割を果たしているかもしれない。例えば、ヒト赤血球細胞上のDuffy抗原（赤血球ケモカイン受容体としても知られている）は、ＩＬ−８、ＮＡＰ−２、ＧＲＯα、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１を含むケモカインに強固に結合するが、マラリア誘起寄生体であるPlasmodium kno wlesiに対する侵入受容体（invasion receptor）である。２つのヘルペスウイルス（herpesviridae）である、Herpesvirus saimiri及びヒトサイトメガロウイルスもまた、機能性を有するケモカイン受容体相同体をコードしているらしい。［ Ahujaら、Immunol.Today、15巻、281〜(1994)；Murphy、Ann.Rev.Immunol.、12 巻、593〜633頁(1994)；Horuk、TIPS、15巻、159頁(1994)］それらのプロ炎症性活性のゆえに、ケモカインは慢性関節リウマチ、心筋梗塞、及び成人呼吸窮迫症候群などの炎症組織破壊を包含する多岐にわたる疾患において役割を果たすものと考えられている。多くのケモカインの役割、特にＣ−Ｘ −ＣケモカインＩＬ−８は、様々な病理状態において報告されている。概説として、Baggioliniら（前出）、表VIIを参照されたい。例えば、いくつかの研究にて、リウマチ性疾患、変形性関節症、及び通風に罹患した患者の炎症関節の滑液に高レベルのＩＬ−８が観察されている。乾癬もまた、ＩＬ−８の過剰生産と関わっている。病理状態におけるＣ−Ｃケモカインの役割もまた、報告されている。例えば、ＭＣＰ−１の濃度は、他の関節疾患に罹患している患者よりも慢性関節リウマチに罹患している患者の滑液の方が高い。単核食細胞のＭＣＰ−１依存性の流入は、特発性肺線維症の発症における重要な事象でありうる。アテローム性動脈硬化領域内への単球の動員におけるＣ−Ｃケモカインの役割は、現在のところ大いに興味あるところであって、ＭＣＰ−１発現の増大がマクロファージに富む動脈壁に検出されているが、正常な動脈組織では検出されていない。ＭＣＰは、血管新生の誘導及び腫瘍成長または転移にも関係しているかもしれない。悪性細胞におけるＭＣＰ−１の発現が、in vivoでこのような細胞が腫瘍を形成する能力を抑制することが示されている。（米国特許第5,179,078号を参照のこと、引用することで、この特許の開示内容を本明細書の一部とする）他のケモカイン活性には、骨髄前駆細胞の増殖を阻害する能力が包含される。組換えＭＩＰ−１αは、幹細胞及び前駆細胞の骨髄造血を抑制することが示されており（ＭＩＰ−１βはそうではない）、多分化能前駆細胞の、成長因子により刺激される増殖（顆粒球−赤血球−マクロファージー巨核球のコロニー形成単位、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）ならびに赤血球のバースト形成単位の（ＢＦＵ−Ｅ）及び顆粒球−マクロファージ前駆細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）の副次集団（subpopulation）を抑制するその能力において選択的であるらしい。［Broxm eyerら、Blood、76巻、1110〜1116頁(1990)］これらの効果は、細胞毒性効果ではなく、どちらかといえば細胞周期阻止である。ＭＩＰ−２α、ＩＬ−８、ＰＦ４及びＭＣＡＦもまた、造血幹／前駆細胞増殖の抑制剤であることが報告されている。［Broxmeyerら、J.Immunol.、150巻、3448〜3458頁(1993)；Broxmeyerら、Ann.Hematol.、71巻、235〜246頁(1995)］これらのケモカインは、骨髄性前駆体のレベルで直接作用するらしい。いくつかの報告により、ＭＩＰ−１αが化学療法剤の細胞毒性効果から多分化能造血細胞を保護する潜在力を有することが示されている。［Dunlopら、Blood、79巻、2221〜2225頁(1992) 及びLordら、Blood、79巻、2605〜2609頁(1992)］報告によれば、Cytoxan（商標名、Bristol-Myers Squibb Oncology社販売のシクロホスファミド）を骨髄保護剤として、ＭＩＰ−１α類似体（名称はＢＢ１００１０、British Biotechnolog y）の使用についての臨床試験が進行中である。近年、いくつかのＣ−Ｃケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳ）がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の生産を阻害するという報告が種々なされている。［Cocchiら、Science、270巻、1811頁(1996)；Fauci、Nature、3 78巻、561頁(1996)］１つの研究で、ＨＩＶに曝されながらもＨＩＶ陰性のままである個体のＣＤ４＋リンパ球がこれらＣ−Ｃケモカインを極めて高レベルで発現していることが報告されている。［Paxtonら、Nature Med.、2巻、412頁(1996 )］この阻害に対する可能な機構は、ケモカイン受容体ファミリーのメンバーとしてのＨＩＶ共受容体の単離及び同定によって示唆されている。ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βに結合するＣＣＲ−５受容体は、ほとんどの向マクロファージ性ＨＩＶ株に対する主要な共受容体として同定されている［Dengら、Nature、381巻、661頁(1996)；Dragicら、Nature、381巻、667頁(1996)；Alkh atibら、Science、272巻、1955頁(1996)］。副次的（occasional）初代ＨＩＶ− １向マクロファージ性株は、ＣＣＲ−３及びＣＣＲ−２Ｂ受容体にin vitroで相互作用することが報告されている［Choeら、Cell、85巻、1135頁(1996)；Doranz ら、Cell、85巻、1149頁(1996)］。「フシン（fusin）現在、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４として知られている）」と命名されたケモカイン受容体は、ＨＩＶの向Ｔ細胞株に対する受容体として同定されている［Fengら、Science 272巻、872頁(1996) ］。これらのＨＩＶ共受容体は、ケモカイン受容体ファミリーに含まれており、ヒト標的細胞へのＨＩＶの融合及び進入のための、ＣＤ４との共受容体であると考えられる。従って、この重要な分子ファミリーの病理状態における役割をさらに解明するために、そしてケモカイン誘導産物を利用した、かかる状態のための改善された処置法を開発するために、さらなるＣ−Ｃケモカインの同定及び特徴付けが希求され続けている現状にある。本発明にとって興味深いのは、1996年２月２９日に公開された国際公開第WO 9 6/05856号であり、これには、ヒト胆嚢及び９週齢ヒト胎盤組織にそれぞれ由来するｃＤＮＡライブラリーからの、ヒトケモカインベータ−４（Ｃｋβ−４）とヒトケモカインベータ−１０（Ｃｋβ−１０）と命名された２種のケモカインの同定が報告されている。Ｃｋβ−４は本明細書中に記載されるエクソダスケモカインと、ＤＮＡ及びアミノ酸配列の双方で非常に類似している（相違点は、Ｃｋ β−４が、成熟エクソダスケモカインの第４残基の後ろにさらにアラニンを含むことと、エクソダスの２２アミノ酸のリーダー配列に比してＣｋβ−４の報告された推定リーダー配列は２４アミノ酸であることである）。ケモカインＣｋβ− ４またはＣｋβ−１０のいずれの生物学的活性も、調べられていない。特に、公開公報には、ＨＩＶ感染の病因におけるこれらケモカインの潜在的役割について言及されておらず、さらに骨髄増殖性疾患を処置するためのこれらケモカインの使用が特に記載されるものでもない。さらに興味深いのは、他のＣ−Ｃケモカイン、すなわち、エクソダス／ＭＩＰ −３α−ＬＡＲＣと密接に関連しているらしく、３１％のアミノ酸同一性を示し、独特の同じAsp-Cys-Cys-Leuモチーフが第１の２つのシステインの近傍に認められる、エクソダス−２と命名された別のＣ −Ｃケモカインのクローニングである。［Hromasら、J.Immunol.、159巻、2554 〜2558頁(1997)］Ｃ−Ｃサブファミリーのケモカインは、例えば、感染、炎症の部位や、Ｃ−Ｃケモカイン受容体分子を含む他の部位を画像化するための、医学画像における用途を有することが示されている。例えば、Kunkelらの米国特許第5,413,778号（引用することにより本明細書に組み入れる）を参照されたい。このような方法には、当該技術分野で知られた技術（例えば、米国特許第4,965,392号及び5,037,6 30号（これらは引用することにより本明細書に組み入れる）を参照のこと）を使用した、Ｃ−Ｃケモカインへの標識試薬（例えば、放射活性同位体）の化学的接着、医薬上容認された担体に含まれる標識付けされたケモカインの被験者への投与、標識付けされたケモカインの標的部位への蓄積の許容、そして標的部位におけるin vivoでの標識付けされたケモカインの画像化が包含される。医学画像手段の利用しうる集積を増加させるための、さらなる新しいＣ−Ｃケモカインに対する必要性が現存している。さらに一般的に、走化性及び炎症のメディエータとしてのケモカインの重要性のゆえに、炎症及び免疫応答のモジュレーションを容易ならしめるためのケモカインファミリーの新しいメンバーの同定及び単離の必要性がある。例えば、免疫応答を促進する物質は、創傷の治癒や、肺炎などの感染性疾患からの回復速度を促進しうる。ケモカインのプロ炎症性効果を阻害する物質は、関節炎、クローン病、及び他の自己免疫疾患などの、炎症により媒介される病態を処置するために有用であるかもしれない。加うるに、ケモカイン発現と、炎症状態及び病態との間の立証された相関により、ケモカインの用途として、さらにケモカインと特異的免疫反応性を有する抗体物質として、診断及び予知の指標が提供され、かような診断及び予知の指標を容易ならしめるために新しいケモカインを同定及び単離することに対する必要性が現存している。如上のすべての理由により、新しく発見されたケモカインの組換え製造の方法の必要性が現存し、この方法は、ケモカイン及び／またはケモカイン阻害剤が関わる臨床適用法を容易ならしめるものである。発明の要約本発明は、エクソダスと命名されたヒトＣ−Ｃケモカイン、ならびにその断片及び類似体をコードする精製及び単離されたポリヌクレオチド；精製及び単離されたエクソダスポリペプチド、その断片及び類似体；これらポリペプチド、その断片及び類似体の組換え製造のための材料及び方法；かかるエクソダスポリペプチド及び類似体に対する抗体；これらポリペプチド、断片、類似体、または抗体を含む医薬組成物；ならびにこれらポリペプチド、断片、類似体、または抗体を用いた、予防及び治療的処置を包含する処置を提供することによって前記の１以上の要求を満たすものである。エクソダスは、リンパ球及び単球において優先的に発現され、そして炎症性刺激により顕著にアップレギュレーションを受けるＣ−Ｃケモカインファミリーの一員である。エクソダスをコードするcDNAの推定アミノ酸配列は、９５アミノ酸の鎖長であり、このうち最初の２２のＮ−末端残基がシグナル配列を構成する。本明細書にて立証されたような、エクソダスの生物学的活性から、数多くの相異なる臨床適用法にエクソダスが有用となりうることが期待される。他のＣ−Ｃケモカインと同様に、エクソダスは単核細胞の走化性を刺激する。重要なことには、エクソダスは、造血前駆細胞増殖を阻害し、さらに感染細胞におけるＨＩＶの生産をも阻害する。本発明によって提供されるものの詳細は以下の通りである：配列番号：２で示されるエクソダスアミノ酸配列をコードする、精製されたポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡ、双方ともセンス及びアンチセンス鎖）、特に配列番号：１で示されるヌクレオチド配列の、エクソダスタンパク質をコードする部分（ヌクレオチド第４３〜３２７位）からなるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；配列番号：２で示されるアミノ酸第１〜７３位をコードする、精製されたポリヌクレオチド、特に配列番号：１の第１０９〜３２７位のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；ならびに（ａ）配列番号：１のＤＮＡのヌクレオチド第４３〜３２７位；（ｂ）配列番号：１のＤＮＡのヌクレオチド第４３〜３２７位の相補鎖に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または遺伝コードの縮重がなければストリンジェント条件下でハイブリダイズすると考えられるポリヌクレオチド；及び（ｃ）配列番号：１のＤＮＡのヌクレオチド第４３〜３２７位と同じエクソダスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドよりなる群から選択される、全長のエクソダスをコードする、精製されたポリヌクレオチド。本発明はさらに、かかるポリペプチドを含むベクター、特にエクソダスをコードするＤＮＡが発現制御ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている発現ベクター、かかるポリヌクレオチドで安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、ならびにこれらの宿主細胞を培養し、そして当該宿主細胞またはその栄養培地からエクソダスを単離することによってエクソダスを製造するための、対応する方法も提供するものである。さらに本発明は、精製されたエクソダスポリペプチド、特に配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号：２のアミノ酸第１〜７３位を含むポリペプチドを提供する。本発明の別の特徴によって、モノクローナル抗体を含む、エクソダスに特異的反応性を有する抗体及びかかるモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が提供される。本発明のさらに別の特徴によれば、ＨＩＶ増殖を阻害するに有効な量のエクソダスタンパク質産物を被験者に投与する（特に、被験者がＨＩＶに曝されるおそれがあるか、ＨＩＶに曝されているか、またはＨＩＶに感染している場合）ことによる、ＨＩＶ感染に対する耐性の増強方法が提供される。本発明のこの特徴により、ＨＩＶ増殖を阻害するに有効な量のエクソダスタンパク質産物を、ＨＩＶに感染した被験者に投与する工程を含む、ＨＩＶ感染の処置の方法が提供される。本発明のさらなる特徴によれば、骨髄前駆細胞増殖を抑制するに有効な量のエクソダスタンパク質産物投与する（特に、被験者が化学療法または放射線療法を受けている場合）工程を含む、細胞毒性効果から骨髄前駆細胞を保護する方法が提供される。また別の本発明の特徴によれば、悪性骨髄前駆細胞増殖を抑制するに有効な量でエクソダスタンパク質産物を投与する工程を含む、骨髄増殖性疾患の処置方法が提供される。以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、エクソダスをコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、双方ともセンス及びアンチセンス鎖）を提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノミック及びcDNA配列ならびに化学的に合成されたＤＮＡ配列が包含される。このエクソダスケモカインをコードするcDNAのヌクレオチド配列を、５’及び３’非コード配列を含めて配列番号：１に示す。ヌクレオチド第４３〜３２７位が、配列番号：１のこのＤＮＡのエクソダスタンパク質をコードする部分を含み、そして本発明の好ましいＤＮＡは、配列番号：１の第１０９〜３２７位のヌクレオチドを含むものであって、これはシグナル配列を含まない、成熟、分泌エクソダスタンパク質と推定されるコード配列を含んでいる。ケモカインエクソダスのアミノ酸配列を、配列番号：２に示す。本発明の好ましいポリヌクレオチドには、前記のごときポリヌクレオチドに加えて、配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、そして遺伝コードの既知の縮重だけのために前段落に記載したポリヌクレオチドと相違するポリヌクレオチドが包含される。同様に、配列番号：２の２２アミノ酸（−２２位から−１位）は、切断されて成熟エクソダスケモカインを生じるシグナルペプチドを構成しており、好ましいポリヌクレオチドには、配列番号：２のアミノ酸第１〜７３位をコードするポリヌクレオチドが包含される。かくして、好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸第１〜７３位を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、精製されたポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドに対する用途には、ヒトエクソダスをコードするゲノミックＤＮＡ（その遺伝子は、Ｃ−Ｃケモカイン遺伝子に特徴的な３つのエクソン／２つのイントロン構造を有していると考えられる（Baggioliniら（前出）を参照のこと））を同定及び単離するため；エクソダスと相同なタンパク質をコードする非ヒト遺伝子を同定及び単離するため；エクソダスと類似性を有するヒト及び非ヒトケモカインを同定するため；ならびにエクソダスを発現する細胞、及びこのタンパク質が発現される条件を同定するための、ハイブリダイゼーションプローブとしての用途が挙げられる。しかして、別の特徴において、本発明は、配列番号：１のＤＮＡの、エクソダスをコードする部分の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする精製されたポリヌクレオチドを提供する。同様に、本発明は、遺伝コードの縮重（redundancy）がなければ配列番号：１のＤＮＡのエクソダスをコードする部分の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる、精製されたポリヌクレオチドを提供する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、以下の通りである。すなわち、42℃にて、5X SSC、20mM NaPO₄、 pH6.8、50％ホルムアミドでハイブリダイゼーションを行い、そして42℃にて、0 .2X SSCで洗浄する。ハイブリダイズされるべき配列の長さ及びＧＣヌクレオチド塩基含量に基づいてこれらの条件を経験的に変更することが望ましいこと、そしてかかる変更を決定するための標準の常則があることが、当業者には理解される。［例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：a Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、Cold Spring Harbor Laboratory(1989) を参照されたい。］別の特徴において、本発明は、本発明のＤＮＡ（これまでに述べたＤＮＡのいずれかを含む）を組み込んだプラスミド及びウイルスＤＮＡベクターを包含する。好ましいベクターには、組み込まれたエクソダスをコードするcDNAが、内在性または異種発現調節配列に作動可能に連結された発現ベクターが含まれる。このような発現ベクターは、エクソダスをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに含んでもよく、このベクターを発現させて、興味の対象たるエクソダスポリペプチドを含む融合タンパク質を得ることができる。別の特徴において、本発明には、本発明のＤＮＡまたはベクターで安定にトランスフェクトまたは形質転換された原核性または真核性宿主細胞が包含される。好ましい宿主細胞において、本発明のＤＮＡまたはベクターによってコードされるエクソダスポリペプチドが発現される。本発明のＤＮＡ、ベクター、及び宿主細胞は、例えば、本発明のエクソダスポリペプチドの大量組換え製造のための方法において有用である。かかる方法はそれ自体が、本発明の要旨である。例えば、本発明は、好適な栄養培地中で本発明の宿主細胞が生育され、そしてエクソダスタンパク質がその細胞または培地から単離される、エクソダスの製造のための方法を包含する。さらに別の特徴において、本発明は、精製及び単離されたエクソダスポリペプチドを包含する。好ましいペプチドは、配列番号：２のアミノ酸第１〜７３位を含むアミノ酸配列を有する、精製されたケモカインポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、天然の供給源がら精製されうるが、好ましくは、本発明のＤＮＡ、ベクター、及び／または宿主細胞を用いた組換え法によって製造されるものであり、あるいは、化学合成される。本発明の精製されたポリペプチドは、グリコシル化（例えば、Ｏ−結合もしくはＮ−結合）されていても、またはグリコシル化されていなくても、水溶性でももしくは不溶性でも、酸化、還元されているなど、選択された宿主細胞、組換え法、単離法、プロセッシング、保存用緩衝液等によって、種々可能である。あるいは、エクソダスポリペプチドは、ＩＬ−８［Clark-Lewisら、J.Biol.Chem.、266巻、23128〜34頁(1991)］及びＭＣＰ−１などの他のケモカインの製造のために首尾良く用いられている技術を使用して、化学的ペプチド合成によって調製してもよい。本発明はまた、エクソダスポリペプチド断片をも企図し、これは１以上のＮ− 末端またはＣ−末端アミノ酸残基が欠失し、且つＣ−Ｃケモカインに特徴的な１以上の生物学的活性が維持されているものである。本発明の別の特徴には、本発明のエクソダスから１以上のアミノ酸残基が付加、欠失、または置換され、且つＣ−Ｃケモカインに特徴的な１以上の生物学的活性を維持している、エクソダスポリペプチド類似体が含まれる。かかる類似体は、例えば、前記の医学画像診断法または下記の処置方法のために有用である。これらは、実施例７に後述する技術を含め、当該技術分野における既知の組換えまたは合成法のいずれかによって調製するとよい。類似体の例には、最も密接に関連しているケモカインとの相同性の増加をもたらすように設計された、エクソダスアミノ酸配列の置換体が含まれる。Ｃ−Ｃケモカインファミリーとの相同性の増加をもたらすように設計される置換には、成熟タンパク質配列の第３１位のアラニンをスレオニンに置換、または第２６位のフェニルアラニンをチロシンに置換することが包含される。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びＲＡＮＴＥＳとの相同性の増加をもたらすと考えられる他の置換には、エクソダスの残基第１〜８位を、ＭＩＰ−１αの残基第１〜１０位に、またはＲＡＮＴＥＳの残基第１〜９位に置換すること、第１１位のロイシンをフェニルアラニンに置換すること、第１２位のグリシンをセリンに置換すること、第２５位のグリシンをグルタミン酸に置換すること、第３６位のグルタミン酸をセリンに置換すること、第４６位のセリンをグルタミンに置換すること、第６０位のイソロイシンをチロシンに置換すること、そして第６７位のセリンをアスパラギン酸に置換することが含まれる。これらの置換は、単独またはあらゆる組み合わせて行うことができ、そして、骨髄抑制またはＨＩＶ生産の阻害におけるエクソダスの活性の増強に対する可能性を有することが期待される。特定の位置でのアミノ酸の特性を増強するように設計された他の置換（例えば、アミノ酸が疎水性ならば、置換はより疎水性となるようにすべきである）すなわち、第６位のアスパラギンをアスパラギン酸に置換すること、第１８位のロイシンをイソロイシンに置換すること、第２９位のグルタミンをグルタミン酸に置換すること、第３８位のアスパラギンをアスパラギン酸に置換すること、第５０位のバリンをイソロイシンに置換すること、そして第５６位のグルタミンをグルタミン酸に置換することなどは、エクソダスの活性も増強するかもしれない。これらの置換は、単独またはあらゆる組合せで行うことができる。エクソダスの生物学的活性を欠くが、Ｃ−Ｃケモカインの受容体（１または複数）への結合を競合的または非競合的に阻害することができる類似体が、本発明の関連する特徴に含まれる。かかる類似体は、例えば、宿主での内在性エクソダスまたは他のＣ−Ｃケモカインの生物学的活性を阻害するための治療用組成物または治療法において有用である。このようなエクソダスポリペプチド類似体は、特に、受容体へのエクソダスの呈示において重要と考えられるケモカイン受容体及び／または他の分子（例えば、ヘパリン、グリコサミノグリカン、赤血球ケモカイン受容体）の結合特性をモジュレートすることが特に企図されたものである。関連する特徴において、本発明によって、かようなエクソダスポリペプチド類似体をコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、例えば、エクソダスポリペプチド類似体を組換え製造するために有用である）、かかるポリヌクレオチドを組み込んだプラスミド及びウイルスベクター、ならびにかかるＤＮＡまたはベクターで安定に形質転換された原核性または真核性の宿主細胞が提供される。別の特徴において、本発明のエクソダスポリペプチド及びポリペプチド類似体と特異的免疫反応性を有する抗体物質（例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラまたはヒト化抗体等）が、本発明に包含される。さらに本発明には、本発明の抗体物質を生産するハイブリドーマ細胞系が包含される。かかる抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの精製用、例えば周知のＥＬＩＳＡ技術を用いた、液体または組織試料中のエクソダスの検出または定量的測定用、そして受容体（１または複数）へのエクソダスの結合のモジュレーション用などのために有用である。あるケモカイン抗体（例えば、抗ＩＬ−８抗体）は、劇的な抗炎症効果を有することが示されている。本発明の組換えエクソダスポリペプチド及びポリペプチド類似体は、エクソダスの受容体（１または複数）を発現している細胞を同定するために、そして受容体（１または複数）をコードするポリヌクレオチドを単離するための標準的な発現クローニング技術において、結合反応における抗体の替わりに利用することができる。例えば、後述の実施例１６、ならびにHolmes ら（前出）及びCharoら（前出）にそれぞれ記載されるＩＬ−８及びＭＣＰ−１受容体のクローニングを参照されたい。かかるエクソダスポリペプチド、エクソダスポリペプチド類似体、及びエクソダス受容体ポリペプチドは、エクソダスケモカイン活性のモジュレーションのため、ならびにポリペプチド及び化学的（例えば、小分子）エクソダスアゴニスト及びアンタゴニストの同定のために有用である。本明細書において用いられる場合。「エクソダスタンパク質産物」の語には、エクソダスポリペプチド、その断片、または類似体が含まれ、これには、国際公開第WO 96/05856号（前出）に記載されている、エクソダスに関連する生物学的活性を保持するケモカインＣｋβ−４などのような、エクソダスの選択的（alte rnative）にスプライシングされた変異体が含まれている。本発明者らは、Ｃｋ β−４に認められる余分なアラニン（エクソダスの第４残基の後）が、イントロン−エクソンの境界に該当することを立証している。この領域を越えて配列決定を行うと、これらの２つのフォームのエクソダスは、選択的スプライシングによって生じることが示される。本発明はまた、創傷または感染性疾患に罹患している哺乳動物における免疫応答を増強するための方法で使用するための、エクソダスタンパク質産物を含む医薬組成物をも企図する。さらに企図されるのは、関節炎、クローン病、または他の自己免疫疾患などの、炎症によって媒介される病理状態における炎症を低減するための方法における使用を目的とする、エクソダスタンパク質産物またはそれに対する抗体を含む医薬組成物である。さらに企図されるのは、アテローム性動脈硬化、血管新生または腫瘍成長もしくは転移を低減するのに使用するための医薬組成物である。特に企図されるのは、造血幹細胞または前駆細胞の増殖を抑制するのに使用するための医薬組成物である。かかる骨髄抑制は、化学療法または放射線療法の際の細胞毒性効果に対して、幹／前駆細胞を保護しうる。さらにまた企図されるのは、骨髄前駆細胞増殖を抑制するための医薬製造を目的とするエクソダスタンパク質産物の使用であり、当該医薬は、化学療法または放射線療法を受けている被験者に投与するのに特に望ましい。さらに特に企図されるのは、骨髄増殖性疾患の処置に使用するための医薬組成物と、骨髄増殖性疾患を処置するための医薬製造を目的とするエクソダスタンパク質産物の使用である。さらに特に企図されるのは、近時にＨＩＶに曝されたが、未だ試験をしていないが、または標準的な診断法によればＨＩＶ陽性であることが確認された患者（例えば、ＨＩＶ陽性の母親からの新生児、ＨＩＶ陽性の血液に曝された医療従事者等）、ＨＩＶに曝されるおそれのある患者、またはすでにＨＩＶに感染している患者、すなわち、ＨＩＶ陽性患者を処置するのに使用するための医薬組成物である。さらに企図されるのは、ＨＩＶ増殖を阻害するための医薬製造を目的とするエクソダスタンパク質産物の使用であり、当該医薬は、ＨＩＶに曝されるおそれのある、またはＨＩＶに曝された、またはＨＩＶに感染した被験者への投与のために特に好ましい。さらにまた企図されるのは、ＨＩＶ感染を処置するための医薬製造を目的とする、エクソダスタンパク質産物の使用である。かかる医薬組成物は、エクソダスタンパク質産物、またはそれに対する抗体を、生理学的に容認しうる希釈剤または担体と共に含み、そして、臨床適用法に応じて、例えば抗炎症剤または抗ＨＩＶ剤などといった適切な他の治療剤を随意に含んでもよい。エクソダスタンパク質産物の投与量は、処置すべき病理状態に応じて、１μg〜100mg/kg体重、好ましくは５〜100μg/kg体重の範囲で変動する。かかる医薬組成物は、処置すべき状態に応じて、皮下、筋肉内、静脈内、肺内、経皮、髄腔内、経口、または座剤での投与を含む、様々な経路によって投与することができる。処置に当たっている医者が決定するとおりに、エクソダスタンパク質産物の用量は増減してよく、処置期間を短縮または延長してもよい。投与の頻度は、薬剤の薬物動態パラメータ及び投与経路に応じるものである。至適な医薬処方は、投与経路及び所望の投与量に応じて当業者により決定されよう。例えば、Remingto n's Pharmaceutical Sciences、18版（1990、Mark Publishing Co.、Easton、ペンシルバニア州18042）の第1435〜1712頁を参照されたい（この開示内容は、引用することによって本明細書に組み入れる）。かかる処方は、投与される薬剤の物理的状態、安定性、in vivoでの遊離速度、及びin vivoでのクリアランス速度を左右するかもしれない。当業者であれば、良好な医薬実務及び個々の患者の臨床状態によって決定付けられる、有効な投与量、及びそれに伴うレジュメを容易に至適化するであろう。投与方法に関わらず、特定の用量は、体重、体表面積または器官のサイズに従って計算されるとよい。前記した各々の処方に関わる処置のための適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改善が、特に本明細書に開示される投与量の情報やアッセイ、そして前記のヒト臨床試験において観察される薬物動態データに鑑み、当業者によって日常的に過度の実験を必要とせずに行われる。適切な投与量は、適切な用量応答データに関連した血液レベル量を決定するための確立されたアッセイを使用することによって確認されるとよい。最終的な投薬のレジュメは、薬物の作用を修飾する様々な因子（例えば、薬物の比活性、損傷の重篤さ及び患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性及び食事、何らかの感染の重篤さ、投与時間及び他の臨床的因子）を考慮して、担当医によって決定される。研究の遂行に伴い、様々な疾患及び状態の処置のための適切な投与レベルに関するさらなる情報が明らかになるであろう。前記のエクソダス物質及び方法は、様々な臨床適用法において使用されうる。第１に、ケモカインは単球及びマクロファージを誘引及び活性化する（Baggioli niら（前出））ので、病原となる炎症環境におけるエクソダスの発現は、患部にさらなる単球及びマクロファージもしくは他の白血球を補充することによって、既存の白血球を活性化することによって、または患部への白血球の残存を誘導することによって疾患を増悪させるかもしれない。しかして、エクソダスの化学誘引活性の阻害により、有害な炎症プロセスを緩和できることが期待される。重要なことには、かかる取り組みの潜在的な恩恵が、好中球を誘引及び活性化するＣ −Ｘ−ＣケモカインであるＩＬ−８に関する実験において直接的に立証されているのである。ＩＬ−８に対して作製された抗体は、好中球により媒介される炎症性疾患を阻害する傑出した能力を有している［Haradaら、J.Leukoc.Biol.、56巻、559頁(1994)］。エクソダスの阻害は、単球またはマクロファージが役割を果たすと推定される疾患（例えば、クローン病、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ））において同様の効果を有することが予測される。あるいは、ケモカインは創傷治癒及び血管新生において正の効果を有することも示されているので、エクソダスの効果を増強することが疾患に有利な役割を果たすかもしれない。しかして、外来のエクソダスタンパク質産物またはエクソダスアゴニストは、かかる疾患からの回復を増進するのに有益であるかもしれない。エクソダスタンパク質産物またはエクソダスアゴニストは、Ｃ−ＣケモカインＴＣＡ３が有するマウスにおける腫瘍形成を阻害する能力（Laningら（前出））によって示唆されるごとく、腫瘍の処置において臨床的に重要であることが解明するかもしれない。エクソダスは、例えば、様々な非特異的エフェクター細胞を腫瘍部位に誘引及び活性化する、または特異的な抗腫瘍免疫性を刺激することによって、直接的または間接的に腫瘍形成を阻害するように作用するかもしれない。加えて、本明細書にて示されるエクソダスについての骨髄抑制効果は、化学療法または放射線療法を受けている患者に対し、当該患者の骨髄性幹細胞または骨髄性前駆細胞への有害な効果を減少させて、実質的な恩恵を生じさせうる。例えば、細胞周期に特異的な化学療法剤の投与前または投与中（例えば、１日前、直前、または同時）に、エクソダスタンパク質産物で処置することで、その薬剤の細胞毒性効果から骨髄を保護しうる。かような細胞周期に特異的な化学療法剤には、ビンブラスチン、エトポシド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、メトトレキセート、ヒドロキシウレア、フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）が含まれる。前記したとおり、ＭＩＰ−１α類似体（ＢＢ１００１０、British Biotechnology）は、Cytoxan （商標名）療法（シクロホスファミド、Bristol-Myers Squibb Oncology社製）における骨髄保護剤として、現在臨床試験中である。本明細書に示されるように、エクソダスがサイトカイン依存性の骨髄性細胞系の増殖を阻害する能力によって、エクソダスタンパク質産物が骨髄増殖性疾患（慢性骨髄性白血病、本態性血小板増加症、骨髄線維症、及び真性赤血球増加症を含むが、これらに限定されない）を処置するにも有用であることが示される。この目的のためのエクソダスタンパク質産物の投与は、インターフェロンなどの、他の化学療法剤または他のサイトカインの投与と併用してもよい。さらに、Ｃ−ＣケモカインであるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１ βは、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１の複製を抑制することが示されており［ Cocchiら、Science、270巻、1811〜1815頁(1995)］、それらがＡＩＤＳの予防または処置での療法剤たる可能性を有することを含意している。本明細書にて示されるようにエクソダスがＨＩＶ増殖を阻害する能力は、ＡＩＤＳ患者の処置のために、ＡＩＤＳの発症及び進行の抑止において、またはＨＩＶに曝された後のＨＩＶ感染に対する耐性の促進においても、エクソダスタンパク質産物が有益であることを示唆している。本格的なＡＩＤＳは、ＨＩＶ感染の直後に顕示されるのでなく、患者が健康なままであるがウイルス血症を呈する時期が様々な期間にわたって存在する。このウイルス血症は、継続的なウイルスの複製及び血液細胞の再感染の繰り返しによって維持される。ある研究から、血漿ウイルス負荷の測定（さらにＣＤ４リンパ球計数）により、ＡＩＤＳの後の危険性あるいは死亡を予測することができることが見出されている。［Ho、Science、272巻、1124〜1125 頁(1996)］従って、ウイルス複製の継続的な周期の妨害の結果、予後の改善が惹起こされうるのである。加うるに、ケモカイン発現と、炎症状態及び病態との間の立証された相関により、エクソダスタンパク質産物の用途として、エクソダスと特異的免疫反応性を有する抗体物質を含めて、診断及び予知の指標が提供される。かかるエクソダス物質は、炎症状態及び病態の診断及び予知判断のため、そしてかかる状態及び病態に関わる領域の医学画像術のための方法において有用である。本発明の数多くの特徴及び利点は、現在のところ好ましい本発明の実施態様を記載した、以下の発明の詳細な説明を考慮すれば、当業者に明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、単核細胞の走化性に対する、様々な濃度のエクソダスの効果を示す。図２は、マウスにおける造血に対する、未処置及びＡＣＮ−処置エクソダスの効果を示す。図３は、マウスにおける造血前駆細胞の細胞周期に対する、エクソダス単独またはＭＣＰ−１もしくはＭＩＧ併用による効果を示す。図４は、骨髄性細胞系ＭＯ７Ｅの増殖に対するエクソダスの効果を示す。図５は、骨髄性細胞系ＴＦ−１の増殖に対するエクソダスの効果を示す。図６は、骨髄性細胞系ＭＯ７Ｅの増殖に対する、精製された合成エクソダスの効果を示す。図７は、ＨＩＶ感染後の単核細胞によるＨＩＶｐ２４タンパク質の遊離に対するエクソダスの効果を示す。図８は、ＨＩＶ感染後の単核細胞によるＨＩＶｐ２４タンパク質の遊離に対する、精製された合成エクソダスタンパク質産物の効果を示す。発明の詳細な説明本発明は、エクソダスをコードするcDNA配列の同定及びエクソダスの活性の特徴付けに基づくものである。ケモカインエクソダスの完全なcDNAは、８２１ヌクレオチドの鎖長である。第７８６位にコンセンサスポリアデニル化部位が存在する。３’非翻訳配列は、多くのサイトカイン遺伝子にてmRNAの安定性をメディエートする、多数のAAAU配列を有している。これらの配列は、メッセンジャーの分解を促進し、ケモカインを含め、多くのサイトカインの転写物の半減期が短いことに寄与している。４３ヌクレオチドの、短い５’非翻訳領域がある。エクソダスの推定アミノ酸配列には、９５アミノ酸が含まれる。これは、Ｃ− Ｃケモカインファミリーに一貫したものであり、このファミリーのメンバーの鎖長は９１から９９の範囲にある。エクソダスの最初の２２アミノ酸は、強い疎水性のシグナルペプチドを構成している。このファミリーを画定する、ジスルフィド結合に関与する４つのシステインもまた、エクソダスに保存されている。エクソダスは、アミノ酸レベルでＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳに最も密接に関連しており、２６〜２８％の同一性があって、保存的な変化を考慮すれば約７５％の類似性がある。エクソダスは特に、ＲＡＮＴＥＳのアミノ酸第２４〜４６位、そして第５８〜７５位に類似しており、これらの部位間には、非保存的変化はわずか６つしかない。エクソダスは他のヒトＣ−Ｃケモカインの保存されたアミノ酸の特徴の多くを有しているものの、特筆すべき様々な独特の、エクソダスの特徴がある。エクソダスは、高い塩基性のカルボキシ末端を有し、ＲＡＮＴＥＳよりもＭＣＰサブファミリーに、より一致している。加えて、エクソダスは第４７位及び５１位にそれぞれ保存された、チロシン及びスレオニン（ＲＡＮＴＥＳを含め他のヒトＣ−Ｃケモカインすべてに存在している）を欠失している。これら２つの高度に保存されたアミノ酸は、受容体に接触すると予測されないので、Ｃ−Ｃケモカイン活性において役割を果たしているか否かは明らかではない。本発明の様々な特徴及び利点は、以下の実施例を考慮すれば理解されるであろう。実施例１には、エクソダスcDNAの同定を記載する。実施例２には、様々なヒト細胞系及び組織におけるエクソダス遺伝子発現のパターンを調べる実験を記載する。実施例３には、哺乳動物細胞におけるエクソダス遺伝子の組換え発現を記載する。実施例４には、哺乳動物細胞におけるエクソダス遺伝子の組換え発現のための別の方法、及び得られたタンパク質の精製を記載する。実施例５には、原核細胞におけるエクソダス遺伝子の発現及び得られたタンパク質の精製のためのプロトコルを示す。実施例６には、酵母または無脊椎動物細胞におけるエクソダスの組換え製造のためのプロトコルを示す。実施例７には、ペプチド合成または組換え製造法による、エクソダス及びエクソダス類似体の製造を記載する。実施例８には、エクソダスと特異的に免疫反応性を有するモノクローナル抗体を作製するためのプロトコルを示す。実施例９には、in vitroでの単球の走化性に対するエクソダスの効果を述べる。実施例１０には、骨髄性前駆細胞、骨髄性細胞系及び慢性骨髄性白血病前駆細胞の増殖に対するエクソダスの効果を述べる。実施例１１には、ＨＩＶｐ２４タンパク質生産に対するエクソダスの効果を述べる。実施例１２、１３、１４及び１５には、化学誘引及び白血球活性化、腫瘍生長阻害、ならびに腹腔内または皮下注射後の白血球活性化のin vivoでのアッセイを示す。実施例１６には、エクソダス受容体のクローニングを記載する。実施例１エクソダスをコードするcDNA配列の同定 Takedaら、Human Mol．Genetics、2巻、1793〜1798頁(1993)に記載のとおりに、解剖された正常成人膵臓島細胞からメッセンジャーＲＮＡを調製し、そしてXh oI部位を含むプライマーを使用してオリゴ（ｄＴ）プライミングにより第１のcD NA鎖を合成した。第２のcDNA鎖合成及び平滑化の後に、そのcDNAにEcoRIアダプターを連結し、次にこれをサイズ分画して、1000塩基対を下回るサイズの産物を除去した。XhoI消化の後、産物をラムダZAPIIへとクローニングし、そしてXl-1- Blue MRF’細胞（Stratagene社、La Jolla、カリホルニア州）にて増幅した。製造元の指示書に従い、pBluescript SK-を取り出すことによりライブラリーをプラスミドに変換した。これらの無作為に単離された膵臓島細胞cDNAの1000の部分配列をシングルパス自動化配列決定によって調べた。これらの配列はGenBankに寄託され（Takedaら（前出））、National Center for Biotechnology Informat ion（ＮＣＢＩ）データベースの他の配列と比較された。比較のために使用されたcDNA配列の平均鎖長はおよそ２００塩基対であった。この成果はTakedaら（前出）に公開されている。 Takedaらの研究に続いて、エクソダスをコードするクローンが、以下のようにこれら1000の膵臓島発現配列タグ（ＥＳＴ）のなかから同定された。ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサービスを使用した、これらのＥＳＴに対するコンセンサスケモカイン配列の比較により、クローンのうち１つがＣ−Ｃケモカインファミリーに遠い相同性を保持していることが明らかになった。ケモカインファミリーへのかかる相同性は、手動ジデオキシ２本鎖配列決定によって元の自動化パスから種々配列エラーを同定して、コード領域及び読み取り枠を適正に特徴付けした後には増大していた。このクローンは、元はTakedaらによってHBC2850と命名され、他の既知のケモカインのいずれとも同一ではなかった。このクローンのcDNAは８２１ヌクレオチドからなり、これはケモカインタンパク質の読み取り枠全体を含んでいる。このケモカインは、エクソダスと命名された。エクソダスcDNA配列（配列番号：１に示される）とTakedaらのＥＳＴ配列との間の差異は、以下の通りである（ヌクレオチド番号付けは配列番号：１に従う）。すなわち、ヌクレオチド６４（エクソダスでは「C」）で、ＥＳＴヌクレオチドは「N」；ヌクレオチド７１（エクソダスでは「C」）で、ＥＳＴヌクレオチドは「N」；ヌクレオチド１３０と１３１の間で、ＥＳＴは読み取り枠にシフトを生じさせる余分な「G」塩基を含む；ヌクレオチド１５０と１５１の間でＥＳＴは読み取り枠にシフトを生じさせる余分な「T」塩基を含む；ヌクレオチド１９３（エクソダスでは「C」）で、ＥＳＴヌクレオチドは「N」；ヌクレオチド１９６（エクソダスでは「C」）で、ＥＳＴヌクレオチドは「N」；ヌクレオチド２７１（エクソダスでは「A」）で、ＥＳＴヌクレオチドは「N」；そしてヌクレオチド３０９（エクソダスでは「T」）で、ＥＳＴヌクレオチドは「GC」であった。実施例２細胞系及び組織におけるエクソダス遺伝子発現パターンエクソダスmRNA発現のパターンを、様々なヒト組織及び細胞系から抽出したmRNAのノザンブロッティングで調べた。使用したプローブは、アガロースゲル電気泳動によって単離され、製造元（ＢＭＢ、Indianapolis、インディアナ州）の指示書に従ってランダムプライミングにより³²Ｐ−ｄＣＴＰ及び³²Ｐ−ｄＴＴＰ（DuPont-ＮＥＮ、Boston、メリーランド州）でラベルされた、エクソダスの完全なコード領域を含むcDNAであった。Ａ．ヒト組織におけるエクソダス遺伝子発現製造元の指示書に従つて、ＲＮＡＳＴＡＴ−６０（Tel-Test B Inc.、Priend swood、テキサス州）を使用して細胞系及び培養単球からＲＮＡを単離した。総ＲＮＡ（20μｇ）を、0.8％ホルムアルデヒドアガロースゲルにて分画し、ニトロセルロースに転写し、ストリンジェント条件下にハイブリダイズ及び洗浄した。−80℃で、増感スクリーンと共に１日間、フィルムに露光した。 Human Multiple Tissue Northern blotとHuman Immune System Multiple Tiss ue Northern（Clontech、Palo Alto、カリホルニア州）も、製造元の指示書に従ってストリンジェント条件下にエクソダスcDNAでプローブ探査し、洗浄した。オートラジオグラフは、前記の通り、１〜４日間露光した。エクソダスは非常に限定された発現パターンを有すると思われた。エクソダスは、ＴＭＲ３２２神経芽細胞腫、ＭＤＡ乳癌、Ｋ５６２赤白血病、Jurkat Ｔ細胞白血病、ＨＬ６０前骨髄球性白血病、レチノイン酸で顆粒球に分化したＨＬ６０細胞、３Ｔ３胎児線維芽細胞または２９３胎児腎細胞を含む、試験をした数多くの細胞系にて発現されていなかった。商用に調製された、様々な正常ヒト組織のノザンブロットをエクソダス発現について分析すると、肺に発現が検出され、心臓、脳、胎盤、成人肝、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓または骨髄には検出されなかった。転写物のサイズは、およそ0.9kBであり、ポリAテイルが付加されているとすると、報告されたcDNA のサイズと一致していた。しかしながら、商用に調製されたリンパ様組織のノザンブロットをエクソダス発現について調べた場合、様々な異なるリンパ様器官で高度に発現されていることが見出された。エクソダスは、末梢リンパ節、虫垂、末梢血単核細胞、及び胎児肝にて高度に発現されていた。胸腺での発現はそれ程高くなく、脾臓または髄では検出可能な発現は認められなかった。この発現パターンは、多くのケモカインで典型的なものである。エクソダスは、主としてリンパ様組織、特にリンパ節、虫垂、及び末梢血にて発現していた。このノザンブロット分析にて使用されたリンパ様組織は、なんらかの免疫学的刺激によって活性化されていて、しかして通常レベルよりもエクソダスの発現が高くなっている可能性がある。末梢血とは逆に骨髄におけるエクソダスの発現が乏しいのは、骨髄が主として未成熟の骨髄球及び赤血球前駆細胞で構成されているのに対し、末梢血にははるかに成熟した単核細胞があるという事実に起因しているのかもしれない。Ｂ．炎症性刺激後のエクソダス遺伝子発現多くのケモカインの発現は炎症性刺激により単核細胞にて誘導されるので、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、またはＰＭＡを様々な細胞系に曝した後のエクソダスの発現をノザンブロットによって分析した。単球細胞系ＴＨＰ−１は、American Type Culture Collection（Rockville、メリーランド州）より入手した。細胞は、10％胎児ウシ血清（ＦＣＳ、Hyclone Laboratories,Inc.、 Logan、ユタ州）、25mM ＨＥＰＥＳ、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン（組織培養抗生物質、Life Technologies、Gaithersburg、メリーランド州）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地（Biowhitaker、Walkersville、メリーランド州）にて維持した。刺激実験のためにホルボールエステル（ＰＭＡ、Si gma、St．Louis、ミズーリ州）の存在下に1ml当たり1,000,000細胞数の密度で細胞を培養した。不死化したヒト臍静脈内皮細胞系Ｉ−ＨＵＶＥＣは、オレゴン大学のDr.Jay N elsonより入手し、10％ＦＣＳ（Hyclone）、400μg/mlＧ４１８（Life Technolo gies、Grand Islands、ニューヨーク州）、1u/mlヘパリン（Sigma）、及び30μg /ml内皮細胞成長因子（Collaborative Biochemical Products、Bedford、メリーランド州）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地にて、70〜80％の周密度まで培養し、次いで様々な期間、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α、Peprotech、ニュージャージー州）の存在下または非存在下に培養した。末梢血単核細胞は、Histopaque gradient（Sigma）で精製し、そしてプラスチック接着により単離した。単球は、マクロファージへの分化を許容するように培地を２日毎に交換しつつ、６日間培養した。細胞は、様々な期間、100ng/mlのリポ多糖（ＬＰＳ、Sigma）で刺激した。末梢血単核細胞をＬＰＳに８または１２時間曝した場合に、エクソダス発現は高度に誘導された。また、請静脈内皮細胞をＴＮＦ−αにわずか３時間曝しただけで、エクソダス発現は高度に誘導された。重要なことには、エクソダス発現は、炎症性刺激が存続する限り高値を維持した。単球白血球細胞系ＴＨＰ−１をＰＭＡで処置すると、やはりエクソダスの発現は誘導され、ＰＭＡに曝した後４８時間でピークに達して、その後わずかづつ減衰した。これらの結果、炎症性刺激がなければエクソダスはあまり発現されないことが示唆された。しかしながら、かかる刺激がなされると、エクソダスは速やかに且つ安定にアップレギュレートされた。刺激自体の特性も限定されるものでないらしく、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、及びＰＭＡがすべてエクソダスをアップレギュレートしていた。しかして、エクソダスの製造は、成熟リンパ食細胞の機能（特に炎症性刺激後）であるらしく、未成熟骨髄性細胞の機能ではないらしいと考えられる。実施例３ＣＯＳ細胞における組換えエクソダスの製造ＣＯＳ細胞にエクソダスcDNAを一過性にトランスフェクトすることによって、組換えエクソダスを製造した。全長のエクソダスcDNAを、ｐＥＣＥ［Ellisら、C ell、45巻、721頁(1986)］のＳＶ−４０で駆動する発現ベクターへと、共通の制限酵素部位を用いてセンス方向にサブクローニングした。対数増殖期のＣＯＳ細胞（American Type Culture Collection(ＡＴＣＣ)No．CRL 1651）を、10％ＦＣＳ（Hyclone）ならびに100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン（組織培養抗生物質、Life Technologies、Gaithersburg、メリーランド州）を含むＤＭＥＭに、100mm培養ディッシュ当たり、1,000,000細胞数の密度で播種し、そして終夜インキュベートした。製造元（Life Technologies、Bethesda、メリーランド州）の指示書に従い、リポフェクチンを用いてＣＯＳ細胞をトランスフェクトするために、精製されたｐＥＣＥ−エクソダスプラスミドＤＮＡをプレート当たり20μg用いた。精製されたｐＥＣＥプラスミド（エクソダスＤＮＡを含まない）を、対照として利用すべく同様にＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。レポーター遺伝子ベータ−ガラクシダーゼを含む発現ベクター（ＳＶ４０ベータ−Gal、Pharmacia、Piscataway、ニュージャージー州）を、トランスフェクトの効率確認のための対照として共トランスフェクトした。７２時間後に、ＣＯＳ細胞培養の上清を0.2μmフィルターを通して濾過し、そして-70℃に保存した。上清を回収後、細胞溶解液を作製してベータ−ガラクトシダーゼ活性をRosenthal、Meth.Enzymol.、152巻、704頁(198 7)に以前報告された通りにアッセイした。ｐＥＣＥ及びｐＥＶＥ−エクソダスのトランスフェクションを実施する際に、ベータ−ガラクトシダーゼ活性によって判定された双方のトランスフェクション効率の差は、互いに10％以内であった。実施例４ＣＨＯ細胞における組換えエクソダスの製造及びその精製エクソダスcDNA（配列番号：１に示される）の第３０〜３３０位の塩基（５’ 非コード配列の１３塩基対及び３’非コード配列の３塩基対を含んでいる）を増幅するためにＰＣＲを用いた。ＰＣＲプライマーの配列は、 5'-GGCGAAGCTTTGAGCTAAAAACCATG（配列番号：３）及び 5'-GCGGGAATTCTTACATGTTCTTGACT（配列番号：４）であった。クローニングを容易ならしめるため、これらのプライマーは、HindIII及びEcoRI 制限酵素部位をそれぞれ含んでいる（斜字にて示す）。断片をベクターｐＤＣ１（1995年11月16日出願の共有で係属中の米国特許出願第08/558,658号に記載、これは引用することにより本明細書に組み入れる）へとクローニングした。このベクターは、インサートの発現を促進するため、クローニング部位に隣接してＣＭＶ直接初期プロモーターを、そして細菌及び哺乳動物細胞でのプラスミドの選択を許容するため、それぞれ細菌ベータ −ラクタマーゼ遺伝子及びネズミジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Sambrookら（前出））も含む、ｐＢＲ３２２誘導物である。エクソダスインサートを含む構築体は、PvuI（ＢＭＢ、Indianapolis、インディアナ州）で制限酵素消化する（ベクター配列内で切断する）ことにより線状化した。線状化されたプラスミドは、エタノールで沈殿させ、ＨＢＳ（20mM ＨＥＰＥＳ−NaOH、pH7.0 、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na₂HPO₄、6mMデキストロース）に再度溶解した。エレクトロポレーションのために、ＣＨＯ細胞系ＤＧ４４［Urlabら、Cell、3 3巻、405頁(1983)］の10⁷細胞数を洗浄し、1ml ＰＢＳに再懸濁して、10マイクログラムの線状化プラスミドと混合し、そして0.4cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。懸濁液は、Biorad Gene Pulser（Richmond、カリホルニア州）を用い、290ボルト、960μファラドにてエレクトロポレーションを行った。形質転換体は、10％の透析されたＦＣＳ（Hyclone、Logan、ユタ州）を含有し、ヒポキサンチン及びチミジンを含まないＤＭＥＭ/Ｆ１２培地（Gibco）にて生育することにより選択した。数百の形質転換されたコロニーからの細胞を集めて、 20nMのメトトレキセート（Sigma、St.Louis、ミズーリ州）を含むＤＭＥＭ/Ｆ１２培地に再度播種した。今回生存したコロニーを単離し、殖やして、個々のコロニーを得た。エクソダス発現のレベルは、以下のように定量した。クローンを、10％の透析されたＦＣＳを含有するＤＭＥＭ/Ｆ１２培地にて４日間生育し、その時点で培地を交換した。細胞を1％の透析されたＦＣＳを含有するＤＭＥＭ/Ｆ１２培地にて４日間生長させた。その上清をヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（Pharmacia、Piscataway、ニュージャージー州）のカラムに付した。カラムを0.2M NaClを含む20mM Tris、pH7.5で洗浄し、そして0.6M NaClを含む20mM Tri s、pH7.5で溶出した。溶出されたエクソダスは、18％Trisグリシンゲル（NOVEX 、San Diego、カリホルニア州）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ＰＶＤＦ膜（Millipore、Bedford、メリーランド州）に転写した。およそ7kDに移動するエクソダスのバンドは、エクソダスに対して特異的なウサギ抗血清を用いて検出することにより確認した（以下の実施例８に記載の通りに調製）。エクソダスケモカインを最も高レベルで発現しているクローンを、タンパク質の大量生産用に殖やしてもよい。その結果得られる組換えエクソダスは、以下のように上清から作製及び精製される。およそ7kDに移動するエクソダスのバンドを切り出し、そして自動化配列決定装置（Applied Biosystems、Model 473A、Fo ster City、カリホルニア州）にてＮ−末端を配列決定する。さらなる精製工程として、ヘパリンセファロースカラムから溶出されたエクソダスは、1.6M NaClとして、ＨＩ-Propyl 40ミクロン樹脂（J.T．Baker、Phillip sberg、ニュージャージー州）のカラムに付する。カラムを1.6M NaClを含む20mM Tris、pH7.5で洗浄し、そして20mM Tris、pH7.5でエクソダスを溶出する。溶出されたエクソダスの完全性は、タンパク質配列により予測されるアミノ酸の割合を確認するためのアミノ酸分析、及び予測されるサイズを確認するための質量分光測光法によって確認する。実施例５細菌における組換えエクソダスの製造細菌におけるエクソダスの組換え発現及び得られた産物の精製のためのプロトコルの例を以下に述べる。タンパク質の成熟型をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲにより増殖し、そしてベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（Pharmacia、Piscataway、ニュージャージー州）へとクローニングする。ｐＧＥＸベクターは、このベクターによりコードされるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、ベクターのクローニング部位に挿入されるＤＮＡ断片によりコードされるタンパク質を含む融合タンパク質を製造するように設計されている。ＰＣＲ用のプライマーは、配列番号：４と、5'-TAT CGG ATC CTG GTT CCG CGT GAA TCA GAA GCA AGC AAC T-3'であり、BamHI制限酵素部位、トロンビン切断部位［Chang、Eur.J.Biochem.、151巻、217頁(1985)］、及び配列番号：１のヌクレオチド第１０９〜１２７位を含む。この結果得られるＰＣＲ産物はBamHI及びEcoRIで消化され、そしてBamHI及びEcoRIで消化されたｐＧＥＸ−３Ｘプラスミドに挿入される。トロンビンまたは因子Ｘａ（Pharmacia、Piscataway）ニュージャージ-州）を用いて組み換え融合タンパク質を処置することによって、融合タンパク質を切断でき、ＧＳＴ部分からケモカインを遊離させることができると考えられる。ｐＧＥＸ−３Ｘ/エクソダス構築体を、大腸菌ＸＬ−１ Blue細胞（Stratagene、La J olla、カリホルニア州）へと形質転換させ、個々の形質転換体を単離及び生育した。個々の形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを精製して、自動配列決定装置を用いて部分的に配列決定し、適切な方向に所望のエクソダス遺伝子のインサートが存在することを確認する。ＧＳＴ/エクソダス融合タンパク質の誘導は、形質転換されたＸＬ−１ Blueを、37℃にてＬＢ培地（カルベニシリンを追加）で600nmの波長での吸光度が0.4になるまで生育し、その後0.5mMイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（Sigma Chemical Co.、St．Louis、ミズーリ州）の存在下にさらに４時間インキュベートすることによって成し遂げられる。細菌の中で不溶性の封入体として製造されると考えられる融合タンパク質は、以下の通りに精製するとよい。細胞は、遠心分離によって回収し、0.15M NaCl、 10mM Tris、pH8、1mM EDTAで洗浄し、そして0.1mg/mlのリゾチーム（Sigma Chem ical Co.）で室温にて１５分間処置する。溶解液を超音波処理によって清澄化し、そして12,000x gにて１０分間、細胞の破片をペレット化する。融合タンパク質を含むペレットは、50mM Tris、pH8及び10mM EDTAに再懸濁し、50％グリセロールの上に積層して、6000x gにて３０分間遠心分離を行う。ペレットをMg⁺⁺及びCa⁺⁺不含の標準リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁する。融合タンパク質を、その再懸濁されたペレットを変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて分画することにより（Sambrookら（前出））、さらに精製する。ゲルを0.4M KCl に浸してタンパク質を可視化し、これを切り出してＳＤＳを含まないゲル泳動用緩衝液にて電気的に溶出する。ＧＳＴ/エクソダス融合タンパク質が可溶性タンパク質として細菌において製造されていれば、ＧＳＴ Purification Module（Pharmacia Biotech）を使用して精製するとよい。融合タンパク質は、成熟エクソダスタンパク質からＧＳＴを切断するために、トロンビン消化に付すとよい。消化反応液（20〜4011μg融合タンパク質、20〜3 0単位ヒトトロンビン（4000U/mg、Sigma）を含む0.5ml ＰＢＳ）は、室温にて１６〜４８時間インキュベートし、反応産物を分画するために変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付す。タンパク質のバンドを可視化するために0.4M KCl にゲルを浸す。エクソダスの予測される分子量に対応するタンパク質のバンドの同一性は、自動化配列決定装置（Applied Biosystems Model 473A、Foster City 、カリホルニア州）を使用して部分的なアミノ酸配列分析によって確認するとよい。あるいは、予測される成熟エクソダスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、所望のプロモーターと、任意にリーダー配列を含むプラスミドにクローニングしてもよい［例えば、Betterら、Science、240巻、1041〜43頁(1988)］。この構築体の配列は、自動化配列決定によって確認するとよい。次いでプラスミドを大腸菌株ＭＣ１０６１へと、CaCl₂インキュベーション及び細菌の熱ショック処理を用いた標準法（Sambrookら（前出））を使用して形質転換する。形質転換された細菌は、カルベニシリンを追加したＬＢ培地にて生育し、そして発現されたタンパク質の生産は、好適な培地における生育により誘導される。存在する場合には、リーダー配列は成熟エクソダスタンパク質の分泌に功を奏し、そして分泌時に切断されるはずである。分泌された組換えタンパク質は、実施例４にて前記した方法によって、または例えば換え生産されたＲＡＮＴＥＳケモカイン［Kunaら、J.Immunol.、149巻、6 36〜642頁(1992)］、ＭＧＳＡケモカイン［Horukら、J.Biol.Chem.、268巻、541 〜46頁(1993)］、及びＩＰ−１０ケモカイン（昆虫細胞にて発現）［Sarrisら、 J.Exp.Med.、178巻、1127〜1132頁(1993)］の精製についてこれまでに報告された方法を適用することによって細菌培養物から精製される。実施例６酵母または無脊椎細胞におけるエクソダスの組換え製造酵母または無脊椎細胞におけるエクソダスの組換え発現、及び得られる組換えタンパク質の精製についてのプロトコルの例を以下に記載する。エクソダスcDNAのコード領域を、ＰＣＲによって増幅する。酵母のプレ−プロ −アルファリーダー配列をコードするＤＮＡを、アルファメーティング因子の遺伝子及び、この遺伝子のヌクレオチド第２５５〜２３５位に相補的なプライマーを含む１つのプライマーを使用したＰＣＲ反応にて酵母ゲノミックＤＮＡから増幅する［Kurjan及びHerskowitz、Cell、30巻、933〜943頁(1982)］。そのプレ− プロ−アルファリーダーをコードする配列及びエクソダスをコードする配列断片は、成熟エクソダスポリペプチドに融合されたプレ−プロ−アルファ因子からなる融合タンパク質の発現をプロモーターが駆動するよう、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）プロモーターを含むプラスミドへ連結する。Rose及びBr oach、Meth.Enzymol.、185巻、234〜279頁、D.Goeddel編、Academic Press Inc. 、San Diego、カリホルニア州(1990)に教示されるように、ベクターはさらに、クローニング部位の下流にＡＤＨ２転写ターミネーター、酵母「2-ミクロン」複製起点、酵母leu-2d遺伝子、酵母ＲＥＰ１及びＲＥＰ２遺伝子、大腸菌ベータ− ラクタマーゼ遺伝子、ならびに大腸菌の複製起点を含む。ベータ−ラクタマーゼ及びleu-2d遺伝子はそれぞれ、細菌及び酵母における選択性を提供する。leu-2d 遺伝子はまた、酵母におけるプラスミドのコピー数を増やし、発現レベルをより高く誘導する。ＲＥＰ１及びＲＥＰ２遺伝子は、プラスミドコピー数の調節に関わるタンパク質をコードしている。前節に記載したＤＮＡ構築体を、既知の方法（例えば、酢酸リチウム処理［Stearnsら、Methods.Enz.（前出）、280〜297頁］）を使用して酵母細胞に形質転換する。ＡＤＨ２プロモーターは、生育培地中のグルコースの枯渇に伴って誘導される［Priceら、Gene、55巻、287頁(1987)］。プレ−プロ− アルファ配列は、細胞からの融合タンパク質の分泌をもたらす。併せて、酵母ＫＥＸ２タンパク質は、成熟エクソダスケモカインからプレ−プロ配列を切断する［Bitterら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA、81巻、5330〜5334頁(1984)］。あるいは、例えばPichia Expression System（Invitrogen、San Diego、カリホルニア州）などの市販の発現系を使用して、製造元の指示書に従ってエクソダスを組換え法により発現させる。この系もまた、分泌を行うのはプレ−プロ−アルファ配列によっているが、インサートの転写はメタノールによる誘導により、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。分泌された組換えエクソダスは、例えば細菌及び哺乳動物細胞の上清からエクソダスを精製するために使用された方法（前記実施例４及び５を参照）によって、酵母生育培地から精製される。あるいは、エクソダスをコードするcDNAは、バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（PharMingen、San Diego、カリホルニア州）へとクローニングされる。このエクソダス含有ベクターは次いで、製造元（PharMingen）の指示書に従って使用し、ｓＦ９タンパク質を含まない培地中でSpodoptera frugiperda細胞に感染させ、組換えタンパク質が製造される。タンパク質は、ヘパリン−セファロースカラム（Pharmacia、Piscataway、ニュージャージー州）と連続分子サイズ分画カラム（Amicon、Beverly、メリーランド州）を使用して培地から精製及び濃縮され、ＰＢＳに再懸濁される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により単一バンドが示され、タンパク質のサイズを確認して、さらにそのＮ−末端配列をPorton 2090 Peptide SequencerでのEdman配列決定によって確認する。実施例７エクソダス類似体の製造上記実施例に記載されるような組換え技術を使用して、エクソダスポリペプチド類似体を調製することができる。さらに詳細には、エクソダスをコードするポリヌクレオチドを、例えば部位特異的突然変異及びポリメラーゼ連鎖反応などの周知技術を使用して興味の対象たるポリペプチド類似体をコードするように、エクソダスをコードするポリヌクレオチドを修飾する。概して前出のSambrookらの第１５章を参照されたい。修飾されたポリヌクレオチドは組換え法により発現され、そして組換えポリペプチド類似体は、前記実施例に記載のとおりに精製される。エクソダス活性にとって重要な残基は、例えば他のＣ−Ｃケモカインとの相同性により、そして元のエクソダスアミノ酸残基についてのアラニンの置換により同定される。システインはしばしば、ジスルフィド結合形成能のためにタンパク質の機能的完全性に対して重要である。エクソダスの４つのシステインのいずれがが酵素活性のために重要であるか否かを調べるために、各システインをそれぞれにセリンに変異させる。他の類似体の例には、ケモカインと最も密接に関連するケモカインとの相同性の増大をもたらすように設計された、エクソダスアミノ酸配列の置換体が包含される。Ｃ−Ｃケモカインファミリーとの相同性の増大をもたらすように設計された置換には、成熟タンパク質の配列の第３１位のアラニンのスレオニンへの置換、または第２６位のフェニルアラニンのチロシンへの置換が包含される。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳとの相同性の増大をもたらすと考えられる他の置換には、エクソダスの第１〜８位の残基をＭＩＰ−１αの第１〜１０位の残基またはＲＡＮＴＥＳの第１〜９位の残基で置換すること、第１１位のロイシンをフェニルアラニンに置換すること、第１２位のグリシンをセリンに置換すること、第２５位のグリシンをグルタミン酸に置換すること、第３６位のグルタミン酸をセリンに置換すること、第４６位のセリンをグルタミンに置換すること、第６０位のイソロイシンをチロシンに置換すること、第６７位のセリンをアスパラギン酸に置換することが包含される。これらの置換は、単独または組み合わせて、そして骨髄抑制またはＨＩＶ生産の阻害におけるエクソダスの活性を増強する能力を有することが期待されるようになされるとよい。特定の位置でのアミノ酸の特性を増強するように設計された他の置換（例えば、アミノ酸が疎水性ならば置換はより疎水性となるようにすべきである）、すなわち、第６位のアスパラギンをアスパラギン酸に置換すること、第１８位のロイシンをイソロイシンに置換すること、第２９位のグルタミンをグルタミン酸に置換すること、第３８位のアスパラギンをアスパラギン酸に置換すること、第５０位のバリンをイソロイシンに置換すること、そして第５６位のグルタミンをグルタミン酸に置換することなども、エクソダスの活性も増強するかもしれない。これらの置換は、単独またはあらゆる組合せで行うことができる。例えば、様々な時間をかけてエクソヌクレアーゼIIIでエクソダスをコードする配列の３’端を消化し、そして短くなったコード配列を、すべての３つの読み取り枠での終始コドンをコードするプラスミドＤＮＡに連結することによってＣ−末端欠失体を調製する。Ｎ −末端欠失体も同様に、コード配列の５’端を消化し、次いでプロモーター配列及びプロモーター部位のすぐ上流に開始のメチオニンを含むプラスミドへ、消化された断片を連結することによって調製される。これらのＮ−末端欠失類似体は、融合タンパク質として発現されてもよい。または、エクソダスポリペプチド類似体は、ＩＬ−８［Clark-Lewisら、J.Bio l.Chem.、266巻、128〜34頁(1991)］及びＭＣＰ−１などの他のケモカインの製造のために首尾よく使用されている技術を使用した化学合成法によって調製することもできる。このような方法は、迅速であり、ケモカインのような短い配列のためには信頼度が高く、そして新規の非天然アミノ酸及び他の化学的修飾の選択的導入を許容するので、有利である。炎症プロセスに関わる１以上の細胞型（例えばＴリンパ球、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、内皮細胞、上皮細胞等）に対する、エクソダス類似体の特性は、数多くの他のケモカイン同様の特性をアッセイするための使用されてきている当該技術分野において認められた技術によってアッセイされる。骨髄増殖及びＨＩＶ生産の阻害に対するエクソダス類似体の特性は、実施例１０及び１１に従ってアッセイしてもよい。実施例８エクソダスに対する抗体の調製エクソダスケモカインは、本質的に実施例７に記載したとおりに、化学的に合成した。保存のためには、１％ウシ血清アルブミン（Sigma、St．Louis、ミズーリ州）を含有するＲＰＭＩ培地にてエクソダスを希釈した。エクソダスは続いて、ヘパリンセファロースＣＬ −６Ｂカラム（Pharmacia、Piscataway、ニュージャージー州）に通すことによって培地から精製した。カラムを0.2M NaCl及び20mM Tris、pH7.5の溶液で洗浄し、次いで0.6M NaCl及び20mM Tris、pH7.5を用いてケモカインを溶出した。ポリクローナル抗血清を作製するために、ウサギの免疫付与用に50μgのエクソダスをフロインド完全アジュバント中に懸濁した。２１日の間隔で、50μgのエクソダスを追加抗原刺激用にフロインド不完全アジュバントに懸濁した。これらの好血清は、ウェスタンブロットで、化学的に合成したエクソダス及びＣＨＯ細胞由来のエクソダス（実施例４に記載のとおりに調製）を認識した。エクソダスに対するモノクローナル抗体を作製するために、実施例３〜７までのいずれかに記載のとおりにして得られた組換えエクソダス（例えばフロインド完全アジュバントに10〜20μgを懸濁）をマウスに定期的に注射する。ＰＢＳに含まれるエクソダスの融合前追加抗原刺激をマウスに付し、４日後にマウスを屠殺して脾臓を摘出する。脾臓は10mlの無血清ＲＰＭＩ１６４０に入れ、２mM L- グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100単位／mlペニシリン、及び100μg/m lストレプトマイシンを添加した無血清のＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ）(Gibco 、カナダ)の中に浸漬した２枚のガラス顕微鏡スライドの磨りガラス状の（frost ed）端部の間で脾臓を擦り潰すことによって、単一細胞の懸濁液を形成する。細胞懸濁液を、70メッシュのNitex細胞濾過器（Becton Dickinson、Parsippany）ニュージャージー州）を通して濾過し、そして、200ｇで５分間遠心分離して、濾過物を２度洗浄し、そのペレットを、20mlの無血清ＲＰＭＩ中に再懸濁する。３匹の未処置Balb/cマウスから摘出した胸腺細胞を同様に調製して、対照として使用する。ＮＳ−１ミエローマ細胞を、11％の胎児ウシ血清( ＦＢＳ)(Hyclone Laboratories，Inc.、Logan、ユタ州)を含むＲＰＭＩ中にて融合の前に対数増殖期に３日間保持しておき、200gで５分間遠心分離して、ペレットを前段落に記載の通りに２回洗浄する。 1x10⁸細胞数の脾臓細胞を、2.0x10⁷細胞数のNS-1細胞と合わせ、遠心分離してその上清は吸引する。チューブのタッピングにより細胞ペレットを変位させ、37 ℃のＰＥＧ１５００（75mM Ｈｅｐｅｓ、pH8.0中、50％）、（Boehringer Mannh eim）1mlを、1分間にわたってかき混ぜながら加え、続いて、無血清ＲＰＭＩ 7m lを７分間かけて加える。さらに8mlのＲＰＭＩを添加し、200ｇで10分間細胞を遠心分離する。上清を廃棄した後、ペレットは、15％ＦＢＳ、100μMヒポキサンチンナトリウム、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン(ＨＡＴ)(Gibco)、25単位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)及び1.5x10⁶細胞数の胸腺細胞/mlを含む、200 mlのRＰＭＩ中に再懸濁し、そして、96ウェルの組織培養プレート（Corning、Co rning New York）１０枚に播種する。融合後２、４及び６日目に、融合プレートウェルから100μlの培地を取り、そして新鮮な培地に交換する。第８日目に、ＥＬＩＳＡによって融合をスクリーニングし、以下の通りにエクソダスへのマウスＩｇＧ結合の存在について調べる。 Immulon 4プレート（Dynatech、Cambridge、マサチューセッツ州）を、25mM Tri s、pH7.5で希釈した、ウェル当たり100ngのエクソダスで被覆する。被覆溶液を吸引し、ウェル当たり200μlのブロッキング緩衝液［ＣＭＦ−ＰＢＳ中に希釈した0.5％サカナヒフゼラチン（Sigma）］を添加して、37℃にて３０分間インキュベートする。プレートを、0.05％ Tween 20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで、50μlの培養上清50μlを添加する。37℃にて３０分間インキュベートした後、前記の通りに洗浄し、PBSTで1：3500に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ(fc)（Jackson Immuno Research、West Groveペンシルバニア州）を50μl加える。プレートを前記の通りにインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、そして100mMクエン酸塩、pH4.5中、1mg/mlのo-フェニレンジアミン（Sigma）及び0.1μl/mlの30％H₂O₂からなる基質100μlを添加する。呈色反応は、15％H₂SO₄を50μl加えて5分後に停止させる。プレートリーダー（Dynatech）で、Ａ₄₉₀を読み取る。選択された融合ウェルは、96ウェルプレートで２度希釈し、そして５日後にウェル当たりのコロニー数を目視評点することによってクローニングする。ハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体は、Isostripシステム（Boehri nger Mannheim、Indianapolis、インデイアナ州）を使用してアイソタイプ判定する。実施例９単球走化性に対するエクソダスの効果エクソダスの活性を、以前にMartinetら、J.Immunol.Meth.、174巻、209頁、1 994及びKellerら、J．Immunol.Meth.、1巻、165頁、1972にて報告されたとおりに走化性アッセイにて評価した。健常のボランティアから20mlの末梢血を、10ml のヘパリン化チューブに採集した。血液をＰＢＳで1：1に希釈し、次いで10mlの Histopaque（Sigma）を下積層した。400gで25分間遠心分離した後、界面にある細胞を集めてＰＢＳで２度洗浄した。100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン（組織培養抗生物質、Life Technologies）を含むＤＭＥＭ（Life Technologies 、Gaithersburg、メリーランド州）に細胞を10⁶/mlにて再懸濁した。滅菌したウシ血清アルブミン（Sigma）を、0.2mg/mlの最終濃度となるように添加した。この細胞懸濁液100μlを各トランスウェル・インサート（Costar）に加えた。抗生物質及び0.2％ＢＳＡを含み、純粋な合成エクソダスを含むかまたは含んでいないＤＭＥＭを、24ウェルプレートの下方のウェルに添加した。すべてのエクソダス濃度につき、３重に実験した。トランスウェル・インサートを下方のウェルに入れ、そして37℃にて９０分間インキュベートした。インキュベーション期間の完逐時にインサートを取り出し、そしてフィルターの上部をゴム製ポリスマン（rubber policeman）で刷掃して接着細胞を除去した。次いで、インサート全体をWright-Giemsaで染色した。インサートの下面に接着した細胞と、下方ウェルに移動した細胞とを３高力場（3 high power fields）のもとに計数し、そして相加して総移動細胞数を求めた。精製された合成エクソダスは、5、50及び500ng/mlの濃度で試験した。比較のため、ＭＩＰ−１αを833ng/mlの濃度で用いた。対照群は、ケモカインが含まれないものであった。その結果を図１に示す。数値は、３重にて行った２つの実験の平均値、±標準誤差を表している。星印は、非対スチューデントt-検定を用いた、ｐ＜0.05での対照との統計的有意差を表す。これらの結果から、エクソダスはトランスウェル移動により測定した場合に、正常のヒト末梢血単核細胞の走化性を刺激することが示される。エクソダスを最も高濃度に用いた場合に、ＭＩＰ−１αの最高有効濃度よりもさらに高い効率で走化性が刺激された。第４残基の後にさらにアニリンを含むエクソダスであるエクソダスタンパク質産物を用いても、同様の結果が得られた。実施例１０骨髄性細胞の増殖に対するエクソダスの効果Ａ．骨髄性前駆細胞に対する効果造血コロニー形成に対するエクソダスタンパク質産物の効果を、本質的には例えばBroxmeterら、Blood、76巻、1110頁(1990)に以前報告されたとおりにアッセイした。インフォームド・コンセントを得た後に、ヒト提供者から骨髄細胞を採集した。コロニー形成単位顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）または幼若化単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）分析のために、30％ＦＣＳ（Hyclone）、組換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ、1U/ml、Amgen、Thousand Oaks、カリホルニア州）、組換えヒトインターロイキン−３（ＩＬ−３、100U/ml、Immunex、Se attle、ワシントン州）、及び組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、50ng/ml、Amgen ）を追加した、1％メチルセルロースを含むイスコフ変法必須培地（Biowhitaker 、Walkersville、メリーランド州）で、低密度のヒト骨髄細胞を5x10⁴/mlにて播種した。培養物を１４日間、5％CO₂及び低酸素圧（5％）下にインキュベートし、次に盲検的に倒立顕微鏡を使用してコロニー形成について評点した。実施例３にて前記したとおりに調製したエクソダスを含有する、様々な量のＣＯＳ細胞上清を、このアッセイにおいて試験し、ＭＩＰ−１α（Ｒ＆Ｄ Systems、Minneapo lis、ミネソタ州）についても50ng/mlで行った。その結果を以下の表１に示すが、これにはプレート当たりの造血前駆細胞コロニーの平均数、±標準偏差を示している。 ^*ｐ＜0.005（他の数値は、ｐ＜0.05で対照またはpECEと有意差なし）ＣＯＳ細胞上清に含まれるエクソダスは、量依存的に造血前駆細胞コロニー形成を阻害し、これはＭＩＰ−１αの最高使用量よりわずかに有効な効果であった。ＣＯＳ細胞培地単独と、空のｐＥＣＥ発現ベクターで形質転換しておいたＣＯＳ細胞からの培地との間に、統計的な差は認められなかった。 50ng/mlの組換えヒトＭＩＰ−１α（この量で生物学的効果は頭打ちになる）では、ＣＦＵ−ＧＭ（対照培地の43％）、ＢＦＵ−Ｅ（対照の66％）、及びＣＦＵ −ＧＥＭＭ（対照の50％）のいずれにも統計的に有意差のある減少が認められた。これらの実験で最も高い濃度で組換えエクソダスを用いた場合にも、やはりＣＦＵ−ＧＭ（対照の42％）、ＢＦＵ−Ｅ（対照の48％）、及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ（対照の48％）のいずれでも統計的に有意な減少が認められた。エクソダスによる阻害は量依存的であり、コロニー形成阻害アッセイによって測定すると、最も高い３つのレベルのエクソダスによって、造血前駆細胞の増殖の阻害が示された。しかしながら、使用された最も低濃度のエクソダスでは、かかる阻害は示されなかった。ＭＩＰ−１αと同様に、エクソダスは多重線型に前駆細胞を阻害した。精製された合成エクソダスも、このアッセイにおいて試験した。その結果を以下の表２に示すが、これには、プレート当たりの造血前駆細胞コロニーの平均数、±標準偏差を示している。 25ng/mlに至るまでの３種すべての濃度のエクソダスのコロニー形成の減少は統計的に有意（スチューデントＴ検定）であった（ｐ＜0.005）。精製された合成エクソダスは、ＣＯＳ細胞上清中のエクソダスと同様の挙動を示す。いずれの供給源からのエクソダスも、ＭＩＰ−１αよりも劣ることがあるにしても少なくとも造血骨髄前駆細胞増殖を阻害するのに有効である。第４残基の後にさらにアニリンを含むエクソダスである、精製された合成エクソダスタンパク質産物を用いてコロニー形成アッセイによって測定しても、造血前駆細胞の増殖の阻害を示す同様の結果が得られた。これらの結果から、エクソダスタンパク質産物は造血前駆細胞の増殖を阻害することが示される。事実、エクソダスタンパク質産物はＭＩＰ−１αと同程度に有効であった。このことは、エクソダスタンパク質産物が周期特異的な化学保護剤として有用であろうことを示唆するものである。さらなる実験により、マウスにおける造血に対するin vivoのエクソダスタンパク質産物の効果が確認された。実験は、本質的にBroxmeyerら、Ann.Hematol. 、71巻、235〜246頁(1995)に記載の通りに、未処置の純粋な合成エクソダス、及びMantelら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA、90巻、2232〜2236頁(1993)に記載のとおり30％アセトニトリル/1％トリフルオロ酢酸（ＡＣＮ）溶液で処置したエクソダスを使用して行った。マルチマーとして溶液中に存在しているケモカインに対し、ＡＣＮでの処置はモノマーの形成を促進し、このモノマーがin vivoでの活性型であって、しかしてケモカイン活性が増強されるのである。ＡＣＮで処置されたケモカインは、未処置ケモカインよりも200倍低い濃度で活性を有しうる。概略説明すると、未処置またはＡＣＮで処置されたエクソダスの溶液を、0.001から50ng/mlエクソダスの間の様々な濃度に調製した。ＡＣＮ処置または未処置の希釈液を、ＡＣＮが毒性でないことを示すための対照として用いた。正常なＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに各溶液を0.2mlの用量で静脈内注射し、２４時間後に屠殺した。未分離の骨髄細胞を大腿骨から取り、そして、ＣＦＵ− ＧＭ評価のためには10容量％ヤマゴボウ（pokeweed）マイトジェン・マウス脾臓細胞馴化培地（ＰＷＭＳＣＭ）を含む寒天か、またはＢＦＵ−Ｅ/ＣＦＵ−ＧＥＭＭの評価のためにはヒトエリスロポエチン（Epogen（商標名）、Amgen、Thous and Oaks、カリホルニア州）、ＰＷＭＳＣＭ及びヘミン（Eastman Kodak Co、Ro chester、ニューヨーク州）を含むメチルセルロースかのいずれかに播種した。5 ％CO₂及び5％O₂にて、ＥＳＰＥＣ N₂-O₂-CO₂インキュベーターＢＮＰ−２１０（ Taboi ＥＳＰＥＣ Corp.、South Plainfield、ニュージャージー州）で加湿下に７日間インキュベートした後に、コロニー数を定量した。結果を図２に示す。その結果より、25ng/mlのエクソダス0.2mlを単回注射した場合に、未処置エクソダスはＣＦＵ−ＧＭコロニー形成を対照の平均56％に減少させることが示された。ＡＣＮで処理されたエクソダスは、0.1ng/mlのエクソダス0.2mlを単量注射した場合に、ＣＦＵ−ＧＭコロニー形成を対照の平均53％に減少させた。ＡＣＮ処置または未処置エクソダスの双方によって誘導されるin vivoのＣＦＵ−ＧＭ形成の阻害は、ｐ＜0.05にて統計的に有意なものであった。別の実験で、造血前駆細胞のin vivoの循環に対する未処置エクソダスの効果を、本質的にBroxmeyerら、Ann.Hematol.（前出）及びMantelら、Proc.Natl.Aca d.Sci．USA（前出）に記載の通りに、トリチウム化チミジン殺傷アッセイを用いて評価した。概説すると、マウスを様々な濃度の未処置エクソダス（0.5、1もしくは0.1ng/ml ）単独、または他の未処置ケモカインと組み合わせて（0.01もしくは0.1ng/mlのＭＣＰ−１またはＭＩＧと共に、0.01もしくは0.1ng/mlのエクソダス）で処置した。２４時間後にマウスを屠殺し、そしてトリチウム化チミジン殺傷アッセイ用に骨髄を集めた。Ｓ期の細胞周期にある細胞が優先的にチミジンを取り込むので、細胞はトリチウム化チミジンの取り込みによって殺傷され、Ｓ期にない細胞は傷つけられない。トリチウム化チミジンで処置しなかった細胞の対照コロニー数に基づいて殺傷された細胞数を計算することによって、Ｓ期にある細胞の数を概算する。数値は、Ｓ期にある前駆細胞の百分率として表され、大腿骨当たりの前駆細胞の総数に対して標準化される。ＣＦＵ−ＧＭについての結果を図３に示す。その結果より、マウス１匹当たり10ngのエクソダスを単回注射すると、Ｓ期にあるＣＦＵ−ＧＭの平均対照値56％に比較して、細胞周期のＳ期にあるＣＦＵ− ＧＭ前駆細胞の百分率が平均4％に有意に低下することが示された。加えて、エクソダスにより誘導されたＣＦＵ−ＧＭに対する細胞周期進行の阻害は、ＭＣＰ −１及びＭＩＧ処置と相乗的なものであった。非常に低濃度のエクソダスをＭＩＧまたはＭＣＰ−１と共に注射すると、Ｓ期にあるＣＦＵ−ＧＭがさらに大幅に減少した。従って、ケモカインの併用により、さらに強力な造血の阻害がなされうる。これらの結果より、エクソダスは骨髄前駆細胞の細胞周期の進行を一時的に停止させることができ、しかしてＳ期細胞に毒性を有する化学療法に対して骨髄を保護するために使用することができる。Ｂ．骨髄性細胞系に対する効果サイトカイン依存性の骨髄性細胞系の増殖に対するエクソダスタンパク質産物の効果も調べた。ヒト骨髄性細胞系ＴＦ−１及びＭＯ７Ｅ［Avanziら、Brit.J.H aematol.、69巻、359頁(1988)］は、最高度に増殖するためにＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを必要とする。サイトカイン依存性の幼若（primitive）急性骨髄性白血病細胞系ＴＦ−１及びＭＯ７Ｅ（双方ともインディアナ大学、インディアナ州の Broxmeyer博士から供与された）を、10％ＦＣＳ及び100U/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシン（組織培養抗生物質、Life Technologies、Gaithers- burg、メリーランド州）を含むＲＰＭＩ１６４０にて培養した。この培地には、正常な対数増殖期とするために、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、100U/ml、Immunex、Seattle、ワシントン州）及び幹細胞因子（ＳＣＦ、50ng/ml、Amgen、Thousand Oaks、カリホルニア州）が追加された。実施例３に記載の通りに調製されたＣＯＳ細胞上清中のエクソダスを、最終希釈率1／10にて試験した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦの存在下に対数増殖期のＭＯ７ＥにＣＯＳ細胞上清を添加すると、その後７２時間にわたる増殖が対照の10.4 ％に減じられた。やはり継続的にＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦに曝された、対数増殖期のＴＦ−１細胞にＣＯＳ細胞上清を添加すると、増殖が完全に阻害された。エクソダスで処置した細胞は、トリパンブルー排除（exclusion）によって評価した場合に全ての時点で95％を越える生存率を有していたので（対照細胞と同等）、エクソダスが毒性作用を奏しているのではなかった。精製された合成エクソダスは、図６に示す通り、ＭＯ７Ｅ細胞の増殖も完全に阻害した。各データポイントは、４つの別々の実験の平均である。星印は、対合 t-検定を使用した場合に、ｐ＜0.05で統計的に有意であることを表す。やはりエクソダスの添加で生存が変化することはなかった。これらの結果から、エクソダスは慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患を処置するうえで有用であろうことが示唆される。Ｃ．慢性骨髄性白血病前駆細胞に対する効果慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）における前駆細胞増殖に対するエクソダス（「エクソダス−１」とも称する）の効果を、Hromasら、Blood、89巻、3315〜3322頁( 1997)に記載されるごときコロニー形成アッセイを使用して評価した。概説すると、骨髄細胞を、慢性期の６名のＣＭＬ患者から集めた。30％胎児ウシ血清、1U /mLのヒトエリスロポエチン（Epogen（商標名）、Amgen）、100U/mLのヒトインターロイキン−３（Genetics Institute）及び50ng/mLのヒト幹細胞因子（Amgen ）を追加した、1％メチルセルロースを含むイスコフ変法ダルベッコ培地で、100 ng/mlのエクソダスの存在または非存在下、及び100ng/mlのＭＩＰ−１αの存在下または非存在下に、低密度の骨髄細胞を5x10⁴細胞数/mLにて播種した。培養物を１４日間、5％CO₂及び低酸素圧（5％）下にインキュベートし、次に倒立顕微鏡を使用してＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ及びＢＦＵ−Ｅについて評点した。エクソダスまたはＭＩＰ−１αで処置した培養物についてのコロニー数を対照のコロニー数と比較して、対照ＣＦＵまたはＢＦＵの百分率として表現した。得られたデータを以下の表３に示す。 ^*非対スチューデントt-検定を用い、有意差あり（ｐ＜0.05）これらのデータによって、慢性期にあるＣＭＬの６名の患者において、エクソダスが顕著に前駆細胞のコロニー形成を阻害したことが証明される。エクソダスは、増殖の抑制においてＭＩＰ−１αよりも随分有効であり、ＭＩＰ−１αが活性化しない受容体によってエクソダスの効果が媒介されることが示唆されている。ＣＭＬ前駆細胞は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合オンコタンパク質（増殖を刺激する、構成性に活性化されている細胞質チロシンキナーゼ）を過剰発現している。事実、細胞培養におけるＢＣＲ−ＡＢＬの強制過剰発現は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む多くの細胞型における形質転換である。３名の慢性期ＣＭＬ患者からの前駆細胞の細胞周期進行に対するエクソダスの効果を、さらに前記のトリチウム化殺傷アッセイを使用して調べた。ＣＭＬ前駆細胞のエクソダス処置によって、平均で、ＣＦＵ−ＧＭの 55±5％、ＢＦＵ−Ｅの45±13％、及びＣＦＵ−ＧＥＭＭの50±10％、細胞周期の進行が停止された。このように、エクソダスの阻害シグナルは、ＣＭＬ前駆細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬの果敢な増殖シグナルを凌ぐことができた。これらの結果、エクソダスは造血を抑制し、そして慢性期のＣＭＬを処置するために有効でありうることが示唆される。実施例１１ＨＩＶ増殖に対するエクソダスの効果ｐ２４タンパク質のＨＩＶ生産により測定した場合に、ＨＩＶ増殖をエクソダスタンパク質産物が阻害する能力を、Cocchiら、Science、270巻、1811頁(1996) に以前報告された通り、標準ｐ２４ＥＬＩＳＡアッセイを用いて調べた。健常なボランティアのヒトの末梢血単核細胞を、Ficoll勾配にて単離した。これらの細胞を、10％ＦＣＳ（Hyclone）ならびに100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン（組織培養抗生物質、Life Technologies、Gaithersburg、メリーランド州）を含む、ＲＰＭＩ１６４０中の1ng/mlのＰＨＡ（Sigma、St.Louis 、ミズーリ州）で37℃にて４８時間活性化し、完全培地で洗浄して、次に37℃にて完全培地中で１時間、ＴＣＩＤ₅₀＝5000のＨＩＶ株ＢＡＬ（ＡＴＣＣより）またはＡ０１８−Ｈ１１２−２（ＡＴＣＣより）で感染させた。次いで過剰のウイルスを除去するために培地で細胞を３回洗浄し、そして組換えヒトＩＬ−２（10 ng/ml、Boehringer-Mannheim、Indianapolis、インディアナ州）と、組換えエクソダスまたは対照としてｐＥＣＥでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞上清を含む完全培地にて、１つの試験当たり5x10⁵細胞数/0.3mlとなるように再懸濁した。６日間培養した後、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ、Abbott Laboratories、Chicago、イリノイ州）を使用して、細胞を含まない上清をＨＩＶｐ２４の含量について評価した。実験は、３重試験にて実施した。最終的な希釈率1：2のエクソダス含有ＣＯＳ細胞上清（すなわち、各ウェルの合計0.3ml中にＣＯＳ細胞上清を0.15ml）、最終的な希釈率1：4のエクソダス含有ＣＯＳ細胞上清、625ng/ml及び1250ng/mlのＭＩＰ−１α（図７の、それぞれ第１バー及び第２バー）ならびにｐＥＣＥＣＯＳ細胞上清（エクソダスを含まない）を、感染後６日目に測定した。結果を図７に示す。ＰＭＡによって刺激された正常ヒト末梢血単核細胞は、ＨＩＶの２種の株で多重感染され、エクソダスは双方の株にてＨＩＶ増殖を有意に阻害することができた。使用したうちで最高濃度のエクソダスにて、ＨＩＶ株ＢＡＬの増殖は対照の39％に減じられ、一方ＨＩＶ株Ａ０１８の増殖は対照の27％に減じられた。この阻害の程度はエクソダスの濃度を低減すると低下した。加えて、これら実験の陽性対照として使用したＭＩＰ−１αで認められたものと、前記阻害は合致していた。対照の細胞とエクソダスで処置した細胞との生存に差がなかったので、エクソダスによる阻害は細胞毒性に起因するのではなかった。 1μg/mlの濃度の、精製された合成エクソダスタンパク質産物（第４残基の後にさらにアニリンを含むエクソダス）と、1μｇ/mlの濃度のＭＩＰ−１αについての、同様の結果を図８に示す。結果は、感染後３、６及び９日のものを示す。感染後９日目に、エクソダスの阻害効果は同じ濃度のＭＩＰ−１αで認められる効果と同様であった。この予備的実験において、1μg/mLより低い濃度ではエクソダスタンパク質産物の効果は認められなかった。これらの結果より、エクソダスタンパク質産物はＨＩＶの増殖を阻害し、従って、ＨＩＶ感染に対する抵抗性を増強する方法及びＨＩＶ感染を処置する方法において有用であろうことが示唆される。実施例１２ヒト単球／マクロファージ及びヒト好中球に対する、エクソダスの化学誘引及び細胞活性化特性のアッセイヒト単球／マクロファージまたはヒト好中球へのエクソダスの効果を、例えば、ネズミＴＣＡ３で誘導される好中球及びマクロファージの活性化を評価するための、Deviら、J.Immunol.、153巻、5376〜5383頁(1995)により報告された方法によって評価する。かかる実験にて測定される活性化の指標には、インテグリンの活性化に起因するフィブリノゲンへの接着の増大、走化性、活性チッ素中間体の誘導、レスピラトリー・バースト（超酸化物及び過酸化水素の生産）、ならびにサイトカラシンの存在下でのリゾチーム及びエラスターゼのエキソサイトーシスが包含される。Deviらによって論じられたように、これらの活性は炎症に対する白血球の応答の様々な段階に相関している。この白血球応答（Springerら、Ce ll、76巻、301〜314頁(1994)に概説）には、血管の内皮細胞への白血球の接着、内皮層を通過しての移動、ケモカインの供給源に向かっての走化性、及び炎症メディエータの部位特異的遊離が包含される。これらのいずれかの段階でのエクソダスの関与によって、炎症応答をモジュレートすることによる臨床的介入のための重要な標的が提供されるのである。実施例１３エクソダスIn Vivo腫瘍成長阻害アッセイエクソダスの腫瘍成長阻害特性を、例えば、Laningら、J.Immunol.、153巻、4 625〜4635頁(1994)により報告された、ネズミＴＣＡ３の腫瘍成長阻害特性をアッセイするためのプロトコルの変法によってアッセイする。エクソダスをコードするcDNAを、ミエローマ由来の細胞系Ｊ５５８（American Type Culture Collec tion、Rockville、メリーランド州）へとエレクトロポレーションによってトランスフェクトする。トランスフェクト体は、実施例８にて詳説したような、エクソダスに対して作製されたモノクローナル抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）などの標準的技術により、エクソダスの製造についてスクリーニングする。エクソダスを製造するクローン由来の１千万の細胞数の集塊を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの右下４分の１区（quadrant）へ皮下注射する。比較のため、トランスフェクトしていない１千万個の細胞を対照のマウスに注射する。２つの群における腫瘍形成の速度及び頻度を比較し、腫瘍の成長阻害へのエクソダスの有効性を調べる。腫瘍細胞に続いて関係する細胞浸潤の性質を、組織学的手段によって同定する。加うるに、組換えエクソダス（20ng）を、トランスフェクトしていないＪ５５８細胞と混合し、そしてかかる細胞に由来する腫瘍へ注射（１日当たり20ng）して、腫瘍細胞へ外来的に投与されたエクソダスの効果をアッセイする。実施例１４腹腔内注射アッセイ in vivoでエクソダスに応答する細胞を、Luoら、J.Immunol.、153巻、4616〜4 624頁(1994)により報告されたように、マウスの腹腔内へ精製エクソダスを1〜10 0ng注射することによって判定する。注射した後に、末梢血及び腹腔から白血球を単離して、 Diff Quickキット（Baxter、McGraw、イリノイ州）を用いて染色することにより同定する。異なる細胞型の出現の動態を評価するために、様々な時間で白血球の外形（profile）を測定する。別の実験で、エクソダスに対して作製された中和抗体（実施例８）をエクソダスと共に注射して、白血球の浸潤がエクソダスの活性に起因することを確認する。実施例１５ In vivo活性アッセイ−皮下注射エクソダスの化学誘引特性を、例えば、Meurerら、J.Exp.Med.、178巻、1913 〜1921頁(1993)により報告されたプロトコルを適用することによって、in vivo でアッセイする。組換えエクソダス（１箇所当たり10〜500pmol）を、好適な哺乳動物、例えばイヌまたはウサギの皮内に注射する。４時間から２４時間までに、注射した部位における細胞浸潤を組織学的方法によって評価する。エクソダスの存在は、エクソダスに対して作製した抗体を使用する免疫細胞化学によって確認する。細胞浸潤の性質は、BaxterのDiff Quickキットで染色することによって同定する。実施例１６エクソダス受容体のクローニングエクソダス受容体をコードするＤＮＡを、ＩＬ−８受容体遺伝子の単離（Holm esら（前出））、及びＭＣＰ−１受容体遺伝子の単離（Charoら（前出））について以前報告された方法を適用することによってクローニングする。 cDNAライブラリーを、好ましくは走化性及び活性化によってエクソダスに応答する細胞から調製する。エクソダスに対する受容体を高レベルで発現している細胞型を同定するために、放射線ラベルしたエクソダスも使用することができる。ＭＩＰ−１αもしくはＲＡＮＴＥＳに応答しない細胞、またはこれらのリガンドに応答して異なるパターンの受容体減感を示す細胞が、特に好ましい。cDNAライブラリーの、トランスフェクトされたクローンのプールを、オートラジオグラフィーによって放射線ラベルされたエクソダスの結合についてスクリーニングする。陽性のプールを連続的に亜分画して、個々の陽性クローンが得られるまで再スクリーニングする。あるいは、ＰＣＲプライマーの配列が既知ケモカイン受容体の配列の保存された領域に基づくものである、縮重ＰＣＲストラテジーを使用してもよい。エクソダス受容体を単離する可能性を高めるために、反応に使用する鋳型ＤＮＡは、エクソダスに応答性を有する細胞型に由来するcDNAであるとよい。本発明を、特定の実施態様に関して記載しているが、当業者にあっては変更及び修飾が想起されるであろうことが理解される。従って、本発明は請求の範囲によってしか限定を受けるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２に示されるエクソダスのアミノ酸配列をコードする、精製されたポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド。３．前記ＤＮＡが、配列番号：１の第４３〜３２７位のヌクレオチドよりなるヌクレオチド配列を含む請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチド。４．配列番号：２の第１〜７３位のアミノ酸をコードする、精製されたポリヌクレオチド。５．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチド。６．前記ＤＮＡが、配列番号：１の第１０９〜３２７位のヌクレオチドよりなるヌクレオチド配列を含む請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド。７．請求の範囲第２、３、５または６項記載のＤＮＡを含むベクター。８．発現ベクターであり、前記ＤＮＡが、発現制御ＤＮＡ配列と作動可能に連結されている請求の範囲第７項記載のベクター。９．請求の範囲第２、３、５または６項記載のＤＮＡで、工クソダスの発現が許容されるように安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１０．エクソダスを製造するための方法であって、以下の工程すなわち、請求の範囲第９項記載の宿主細胞を栄養培地にて培養し、そして該宿主細胞または該栄養培地からエクソダスを単離する工程を含む方法。１１．請求の範囲第１０項記載の方法によって製造された、精製されたポリペプチド。１２．配列番号：２に示されるエクソダスのアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。１３．配列番号：２に示されるエクソダスのアミノ酸配列第１〜７３位を含む、精製されたポリペプチド。１４．請求の範囲第１５項記載のポリペプチドと特異的な反応性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。１５．請求の範囲第１４項記載のハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体。１６．ＨＩＶの増殖を阻害するに有効な量のエクソダスタンパク質産物を、被験者に投与する工程を含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染への耐性の増強方法。１７．前記被験者が、ＨＩＶに曝されるおそれがあるか、ＨＩＶに曝されているか、またはＨＩＶに感染している請求の範囲第１６項記載の方法。１８．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖を阻害するに有効な量のエクソダスタンパク質産物を、ＨＩＶに感染した被験者に投与する工程を含む、ＨＩＶ感染の処置方法。１９．ＨＩＶ感染の予防または治療処置用の医薬の調製における、エクソダスタンパク質産物の用途。２０．前記医薬が、ＨＩＶ増殖を阻害する請求の範囲第１９項記載の用途。２１．骨髄前駆細胞の増殖を抑制するに有効な量のエクソダスタンパク質産物を被験者に投与する工程を含む、骨髄前駆細胞を細胞毒性効果から保護する方法。２２．前記被験者が、化学療法または放射線療法を受けている、請求の範囲第２１項記載の方法。２３．骨髄前駆細胞増殖の抑制用の医薬の調製におけるエクソダスタンパク質産物の用途。２４．前記医薬が、化学療法または放射線療法を受けている被験者に投与される、請求の範囲第２３項記載の用途。２５．悪性骨髄前駆細胞増殖を抑制するに有効な量のエクソダスタンパク質産物を、骨髄増殖性疾患に罹患している被験者に投与する工程を含む、骨髄増殖性疾患の処置方法。２６．前記骨髄増殖性疾患が、慢性骨髄性白血病、本態性血小板増加症、骨髄線維症、または真性赤血球増加症である、請求の範囲第２５項記載の方法。２７．骨髄増殖性疾患の処置用の医薬の調製におけるエクソダスタンパク質産物の用途。２８．前記骨髄増殖性疾患が、慢性骨髄性白血病、本態性血小板増加症、骨髄線維症、または真性赤血球増加症である、請求の範囲第２７項記載の用途。