SK96398A3 - Exodus chemokine materials and methods - Google Patents

Description

vynález sa všeobecne týka chemokinov, sa týka prečisteného a izolovaného polynukleotidu chemokin označený Exodus a jeho chemokinových materiálov polypeptidov pri liečbe syndrómu

Predložený presnejšie kódujúceho analógií, polypeptidov a spôsobov rekombinantnej a terapeutického použitia myeloprotekcii počas mye1opro1i feratívnych ludský C-C i prečistených kódovaných označený a izolovaných polynukleotidmi, produkcie týchto týchto polypeptidov, zvlášť chemoterapie, pri ochorení a pri liečbe získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS).

Doteraiší stav techniky

Chemokiny, taktiež známe ako interkriny” a SIS cytokiny, obsahujú superrodinu malých secernovaných proteínov (velkosti asi 70 - 100 aminokyselín a 8 - 12 kilodaltonov), ktoré primárne regulujú migráciu a aktiváciu leukocytov, a tak napomáhajú stimulácii a regulácii imunitného systému. Názov chemokin je odvodený od termínu chemotaktický cytokin a označuje schopnosť týchto proteínov stimulovať chemotaxiu leukocytov. Okrem toho, chemokiny môžu znamenať hlavný stimul pre migráciu zápalových buniek do patologických tkanív (viď všeobecne, Baggiolini et al., Advances. in Immunology, 55: 97 - 179 (1994), Oppenheim, The Chemokines, Lindley et al., vyd., str. 183 - 186, Plénum Press, NY (1993)). Aj keď sú vo všeobecnosti chemokiny secernované leukocytmi, niektoré chemokiny sú exprivované v mnohých tkanivách. Baggiolini et al., supra, Tabuľka II.

Niektoré chemokiny taktiež aktivujú alebo priťahujú rôzne typy buniek, okrem leukocytov, ako sú endoteliálne bunky a fibroblasty.

Už identifikované chemokiny vykazujú vo všeobecnosti medzi sebou 20 - 70% identitu aminokyselín a obsahujú štyri vysoko konzervované cysteinové zvyšky. Na základe relatívnej pozície prvých dvoch z týchto cysteinových zvyškov, boli chemokiny ďalej klasifikované do dvoch podrodín. V C-X-C podrodine, kódované gény umiestnené sú prvé dva cysteinové zvyšky C-C alebo v β alebo a

4.chromozóme, sú prvé dva cysteinové jednou aminokyselinou. V kódované gény, ktoré boli prvé dva cysteinové na ludskom separované podrodine, zmapované na ludský chromozóm 17, zvyšky susedia. Rontgenová kryštálografia a NMR štúdie niekolkých chemokinov ukázali, že prvý a tretí cystein tvoria prvý disulfidový mostík a druhý a štvrtý cystein tvoria druhý disulfidový mostík, čo značne ovplyvňuje prirodzenú konformáciu proteínov. U samotných ludí bolo popísaných takmer desať rôznych sekvencií pre každú chemokinovú podrodinu. Chemokiny oboch podrodín majú charakteristické leader sekvencie s dvanástimi až dvadsiatimipiatimi aminokyselinami.

C-X-C chemokiny, ktoré zahŕňajú IL-8,

GROa/p/r, doštičkový bázický proteín, doštičkový faktor 4, neutrofily aktivujúce peptid 2 faktor pre makrofágy (NAP-2), chemotaktický a aktivačný (MCAF), IP-10 a ďalšie, vykazujú 25

- 60% identitu pri sekvencií (okrem GRO porovnaní dvoch α/β/Τ'členy, ktoré aminokyse1inových sú medzi sebou identické na 84 - 88%).

Väčšina z členov podrodiny ( s výnimkou IP-10 a doštičkového faktora 4) má spoločný E-L-R tripeptidový motív upstream s dvoma cysteinovými zvyškami. C-X-C sú vo všeobecnosti silnými stimulátormi neutrofilov spôsobujúcimi rýchlu zmenu tvaru, chemotaxiu, respiračné vzplanutie a degranuláciu. Špecifické zkrátenie N-koncovej aminokyselinovej sekvencie určitých C-X-C chemokinov, vrátane IL-8, je asociované so značným zvýšením aktivity.

C-C chemokiny, ktoré zahrňujú makrofágové zápalové proteiny ΜΙΡ-Ια (Nakao et al., Mol. Celí Biol. 10: 3646 (1990)) a ΜΙΡ-Ιβ (Brown et al., J. Immunol., 142: 679 (1989)), Monocytové chemotaktické proteiny MCP-1 (Matshushima et al., J. Exp. Med., 169: 1485 (1989)), MCP-2 (Van Damme et al., J. Exp. Med., 176: 59 1992) a Chang et al., Int. Immunol., 1: 388 (1989)), a MCP-3 (Van Damme et al., vyššie), RANTES (Schall et al., J. Immunol., 141: 1018 (1988)), 1-309 (Miller et al., J. Immunol., 143: 2907 (1989)), eptaxin (Rothenberg et al. J. Exp. Med., 181: 1211 - 1216 (1995)) a ďalšie majú medzi sebou 25% až 70% identitu aminokyselín. C-C chemokiny aktivujú vo všeobecnosti monocyty, lymfocyty, basofily a eosinofily, ale nie neutrofily. Väčšina z popísaných C-C chemokinov aktivuje monocyty a spôsobuje tok vápnika a chemotaxiu. Selektívnejšie účinky je možné pozorovať na lymfocytoch, napríklad na T-lymfocytoch, ktoré najsilnejšie odpovedajú na RANTES.

C-C chemokiny môžu byť ďalej delené podlá štrukturálnej hemológie a podobných aktivít. ΜΙΡ-Ια , ΜΙΡ-2β a RANTES majú bližšiu hemológiu ako ostatní členovia rodiny. Inou podrodinou v rámci C-C chemokinovej rodiny sú monocytové chemotaktické proteiny (MCP), ktoré sú medzi sebou štrukturálne podobnejšie s inými členmi C-C chemokinovej rodiny, a ktoré preferovane stimulujú monocyty k migrácii a k odpovedi na zápalové stimuly.

Štúdie s delečnými a substitučnými analógmi ukázali, že zásadné regióny pre väzbu na receptor sú pravdepodobne primárne v amino-koncových zvyškoch chemokinov a po nich nasleduje druhý región v slučke po druhom cysteine. Tieto všeobecné požiadavky pre funkciu sa zdajú byť spoločné pre všetky chemokiny (Clark-Lewis et al., J. Leukocyte Bio., 57: 703 (1995)).

Receptory pre chemokiny sú receptory spojené s rhodopsínu podobným G proteínom so transmembránovými doménami. Špecifický receptor siedmimi pre IL-8 klonoval Holmes et al., Science, 253: 1278 - 83 (1991), zatiaľ čo podobný receptor (77% identita), ktorý rozpoznáva

IL-8, GRO a NAP-2 klonoval Murphy a Tiffany, Science, 253: 1280 - 83 (1991). Doposiaľ bolo klonovaných päť receptorov pre C-C chemokiny: C-C chemokinový receptor 1 (CCR-1), ktorý rozpoznáva MIP-la a RANTES (Neote et al., Celí, 72: 415 - 425 (1993)), receptor (CCR-4) pre ΜΙΡ-Ια , RANTES a MCP-1 (Power et al., J. Biol. Chem., 270: 19495 -19500 (1995)), MCP-1 receptor (CCR-2B) (Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 2752 - 56 (1994)), eotaxinový receptor (CCR-3) (Combadiere et al., J. Biol. Chem., 270: 16491 - 16494 (1995)) a receptor (CCR-5) pre ΜΙΡ-Ια , MIP-Ιβ a RANTES (Raport et al., J. Biol. Chem., 271: 17161 - 17166 (1996)).

Tieto receptori majú tendenciu byť multifunkčné a môžu viazať mnoho rôznych chemokinov. Receptori sami o sebe môžu mať úlohu v ľudských ochoreniach. Napríklad Duffy antigén na ľudských červených krvinkách (známy aj ako erytrocytárny chemokinový receptor), ktorý viaže mnoho chemokinov, vrátane IL-8, NAP-2, GROa, RANTES, MCP-1, je inváznym receptorom pre parazita spôsobujúceho maláriu, Plasmodium knowlesi. Zdá sa, že taktiež dva herpesvírusy, Herpesvirus saimiri a ľudský cytomegalovirus, tiež kódujú funkčné homológy chemokinového receptora. (Ahuja et al., Immunol. Today, 15: 281 (1994), Murphy et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 593 - 633 (1994), Horuk, TIPS, 15: 159 (1994)).

Vzhladom k ich protizápalovým aktivitám sa predpokladá úloha chemokinov v širokej škále ochorení spôsobujúcich zápalovú deštrukciu tkanív, ako je reumatoidná artritída, infarkt myokardu a syndróm respiračnej tiesne dospelých. Úloha mnohých chemokinov, hlavne C-X-C chemokinu IL-8, bola dobre popísaná u mnohých patologických stavov. Všeobecne vid’ Baggiolini et al., vyššie, tabulka VII. Napríklad v niekoľkých štúdiách boli popísané vysoké hladiny IL-8 v synoviálnej tekutine zápalových kĺbov u pacientov trpiacich reumatickým ochorením, osteoartritídou a dnou. Psoriáza je tiež spojená s nadprodukciou IL-8.

Úloha C-C chemokinov v patologických stavoch bola taktiež dobre dokumentovaná. Napríklad koncentrácia MCP-1 je vyššia v synoviálnej tekutine pacientov trpiacich reumatoidnou artritídou, ako u pacientov trpiacich na iné reumatické ochorenie. MCP-1 dependentná migrácia mononukleárnych fagocytov môže byť významným dejom pri vývoji idiopatickej plúcnej fibrózy. Úloha C-C chemokinov pri migrácii monocytov do atherosklerotických oblastí je v súčasnosti intenzívne skúmaná a zvýšená expresia MCP-1 bola detekovaná v makrofágy, ale nie môžu zúčastňovať indukcie a metastázovaní. Expresia potláčala schopnosť týchto (Viď U.S.patent č.5179078, oblastiach arteriálnej v normálnom steny bohatej na tkanive artérií. MCP sa tiež angiogenézy a nádorového rastu MCP-1 v maligných bunkách buniek tvoriť nádory in vivo. tu uvedený ako odkaz).

Iné aktivity chemokinov zahrňujú schopnosť inhibovať proliferáciu progenitorových buniek kostnej drene. Rekombinantný ΜΙΡ-Ια, ale nie ΜΙΡ-Ιβ, potláča myelopoézu kmeňových a progenitorových buniek a zdá sa byť selektívny vo svojej schopnosti potláčať rastovými faktormi stimulovanú proliferáciu progenitorových buniek (kolónie tvoriacich celok granulocytárnych - erytroidných - makrofágových

- megakaryocytových, CFU-GEMM) a subpopulácie vzplanutí tvoriacich celok erytroidných (BFU-E) a kolónie tvoriace celok granulocytárnych - makrofágových (CFU-GM) progenitorových buniek. (Boxmeyer et al., Blood, 76: 1110

- 1116 (1990)). Tieto účinky nie sú cytotoxickými účinkami, ale skôr zástavou bunkového cyklu. MIP-2a, IL-8, PF4 a MCAF boli taktiež popísané ako supresory proliferácie hematopoetických kmeňových/progenitorových buniek. (Boxmeyer et al., J. Immunol., 150: 3448 - 3458 (1993), Boxmeyer et al., Ann. Hematol., 71: 235 - 246 (1995)). Zdá sa, že tieto chemokiny účinkujú priamo na úrovni myeloidných progenitorov. Niektoré správy naznačujú, že ΜΙΡ-Ια je silne účinný pri ochrane hematopoetických buniek pred cytotoxickým účinkom chemoterapeutických činidiel (Dunlop et al., Blood, 79: 2221 - 2225 (1992) a Lord et al., Blood, 79: 2605

- 2609 (1992)). V súčasnosti prebiehajú klinické pokusy pre použitie ΜΙΡ-Ια analógie (označenej BB100100, British Biotechnology) ako myeloprotektívneho činidla s Cytoxan^R (cyklofosfamid od Bristol-Myers Squiib Oncology).

Nedávno bolo popísaných niekoľko štúdií o tom, že niektoré C-C chemokiny, ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ a RANTES, inhibujú produkciu vírusu ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV). (Cocchi et al., Science, 270: 1811 (1996), Fauci, Náture, 378: 561 (1996)). Jedna štúdia hovorí o tom, že CD4+ lymfocyty jedincov, ktorí boli vystavení HIV, ale ostali HIV-negatívni, exprivujú veľmi vysoké hladiny týchto C-C chemokinov. (Paxton et al., Náture Med., 2: 412 (1996)).

Potenciálny mechanizmus pre túto inhibíciu bol naznačený izoláciou a identifikáciou HlV-koreceptora ako člena rodiny chemokinových receptorov. CCR-5 receptor, ktorý viaže RAŇTES, ΜΙΡ-Ια a MIP-Ιβ, bol identifikovaný ako hlavný ko-receptor pre väčšinu makrofágotrofických HIV kmeňov (Deng et al., Náture, 3841: 667 (1996), Alkhatib et al., Science, 272: 1955 (1996)). Bolo napísané, že príležitostné primárne HIV-1 makrofágotrofické kmene interagujú s CCR-3 a CCR-2B receptormi in vitro (Choe et al., Celí, 85: 1135 (1996), Doranz et al., Celí, 85: 1149 (1996)). Chemokinový receptor označený ako Fusin (teraz známy ako C-X-C chemokinový receptor CXCR-4) bol identifikovaný ako receptor pre T-trofné kmene HIV (Feng et al., Science, 272: 872 (1996)). Tieto HIV ko-receptory sú v rodinách chemokinových receptorov a zdajú sa byť kofaktormi s CD4 pre fúziu a vstup HIV vírusu do ludských cielových buniek.

Preto existuje potreba identifikácie a charakterizácie ďalších C-C chemokinov pre ďalšie zhodnotenie úlohy tejto významnej rodiny molekúl v patologických stavoch a pre vývoj zlepšenej liečby takýchto stavov za použitia produktov odvodených od chemokinov.

S predloženým vynálezom súvisí Medzinárodná prihláška č. WO 96/05856 publikovaná 29.2.1996, ktorá popisuje identifikáciu dvoch chemokinov nazvaných ludský chemokin beta-4 (Ckp-4) a ludský chemokin beta-10 (Ckβ-10) z cDNA knižníc odvodených z ludského žlčníka a ludského deväťtýždňového fetálneho tkaniva, v príslušnom poradí. Ck3~4 je ako v DNA, tak aj v aminokyselinovej sekvencii velmi podobný chemokinu Exodus tu popísanému (rozdiel je ten, že Ckβ-4 má ďalší alanin po zvyšku 4 zrelého chemokinu Exodus, a že popísaná odvodená leader sekvencia Ckβ-4 má 24 aminokyselín, oproti 22 aminokyselinovej leader sekvencii

Exudusu). Neboli určené žiadne biologické aktivity ani chemokinu ΌΚβ-4, ani chemokinu Ckp-lO. Konkrétne, publikácia sa nezmieňuje o žiadnej potenciálnej úlohe týchto chemokinov v patogenézii HIV infekcie, ani špecificky nepopisuje použitie týchto chemokinov pri liečbe myeloproliferativnych ochorení.

Tiež je zaujímavé klonovanie iného C-C chemokinu, označeného ako Exodus-2, ktorý sa zdá byť blízkym príbuzným Exodus/MIP-3a-LARC, keďže vykazuje 31% aminokyselinovú identitu a rovnaký jedinečný Asp-Cys-Cys-Leu motív pozorovaný okolo dvoch cysteínov (Hromas et al., J. Immunol., 159: 2554 - 2558 (1997)).

Bolo ukázané, že chemokiny C-C rodiny sú použiteľné v zobrazovacích metódach v medicíne, napríklad pre zobrazovanie miesta infekcie, zápalu a iných miest majúcich molekuly C-C chemokinového receptora. Viď napr. Kunkel et al., U.S. patent č.5413778, tu uvedený ako odkaz. Takéto metódy vyžadujú chemické pripojenie značkovacieho činidla (napr. rádioaktívneho izotopu) na C-C chemokin za použitia v odbore známych techník (viď napr. U.S. patenty č.4965392 a 5037630, tu uvedené ako odkaz), podanie značeného chemokinu vo farmaceutický prijateľnom nosiči, subjektu, umožnenie akumulácie značeného chemokinu v cieľovom mieste a zobrazenie značeného chemokinu in vivo v cieľovom mieste. V odbore existuje potreba ďalších nových C-C chemokinov pre zväčšenie arzenálu prostriedkov pre zobrazovanie v medicíne.

Všeobecnejšie, vzhľadom k významu chemokinov ako mediátorov chemotaxie a zápalu, existuje potreba identifikácie a izolácie nových členov chemokinovej rodiny pre uľahčenie modulácie zápalových a imunitných odpovedí.

Napríklad, zlúčeniny, ktoré navodzujú imunitnú odpoveď, môžu navodzovať hojenie rán alebo môžu urýchľovať zotavenie po infekčných chorobách ako je pneumonia. Zlúčeniny, ktoré inhibujú pro-zápalový účinok chemokinov, môžu byť užitočné pri liečbe patologických stavov sprostredkovaných zápalom, ako je artritída, Crohnova choroba a iné autoimunitné ochorenia.

Ďalej, stanovená korelácia medzi expresiou chemokinov a zápalovými stavmi a ochoreniami poskytuje diagnostické a prognostické indikácie pre použitie chemokinov rovnako ako pre použitie protilátok, ktoré sú špecificky imunoreaktívne s chemokinmi, existuje potreba pre identifikáciu a izoláciu nových chemokinov pre uľahčenie takých diagnostických a prognostických indikácií.

Podľa všetkých dôvodov uvedených vyššie existuje potreba rekombinantných metód pre produkciu novoobjavených chemokinov, kde tieto metódy uľahčia klinické aplikácie zahŕňajúce chemokiny a/alebo inhibítory chemokinov.

Podstata vynálezu

Predložený vynález spĺňa jednu alebo viac potrieb uvedených vyššie, a to tým, že poskytuje prečistený a izolovaný polynukleotid kódujúci ľudský C-C chemokin nazvaný Exodus, a jeho fragmenty a analógie, prečistené a izolované polypeptidy Exodusu, ich fragmenty a analógie, materiály a spôsoby pre rekombinantnú produkciu týchto polypeptidov, ich fragmentov a analógií, protilátky k takým Exodus polypeptidom a analógiám, farmaceutické prípravky obsahujúce tieto polypeptidy, fragmenty, analógie alebo protilátky a liečbu za použitia týchto polypeptidov, fragmentov, analógií alebo protilátok, ktorá zahŕňa profylaktickú a terapeutickú liečbu.

Exodus je členom C-C chemokinovej rodiny, ktorá je vyjadrená preferenčne na lymfocytoch a monocytoch a je značne stimulovaná zápalovými podnetmi. Odvodená aminokyselinová sekvencia cDNA kódujúca Exodus má dĺžku 95 aminokyselín, v ktorej prvých dvadsaťdva N-koncových zvyškov obsahuje signálnu sekvenciu. Vzhladom k jeho biologickým aktivitám, ktoré sú tu ukázané, sa očakáva jeho využitie v množstve rôznych klinických aplikáciách. Podobne ako ďalšie C-C chemokiny stimuluje chemotaxiu mononukleárnych buniek. Exodus signifikantne inhibuje proliferáciu hematopoetických progenitorových buniek a taktiež inhibuje produkciu HIV v infikovaných bunkách.

Vynález špecificky poskytuje: prečistené polynukleotidy (t.j. DNA a RNA, ako sense, tak aj antisense reťazce) kódujúce Exodus aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, obzvlášť DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu skladajúcu sa z časti kódujúcej Exodus protein (nukleotidy 43 až 327) nukleotidové sekvencie SEQ ID NO: 1; prečistené polynukleotidy kódujúce aminokyseliny 1 až 73 SEQ ID NO: 2, zvlášť DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu skladajúcu sa z nukleotidov 109 až 327 SEQ ID NO: 1; a prečistené polynukleotidy kódujúce kompletný Exodus vybrané zo skupiny skladajúce sa z: (a) nukleotidov 43 až 327 DNA SEQ ID NO: 1; (b) polynukleotidu, ktorý hibridizuje za prísnych podmienok s komplementárnym reťazcom nukleotidov 43 až 327 DNA SEQ ID NO: 1 alebo ktorý by mohol s nimi hibridizovať za prísnych podmienok vďaka degenerácii genetického kódu; a (c) polynukleotidu, ktorý kóduje rovnaký Exodus polypeptid ako nukleotidy 43 až 327 DNA SEQ ID NO: 1. Vynález tiež poskytuje vektory obsahujúce také polynukleotidy, obzvlášť expresné vektory, v ktorých je DNA kódujúca Exodus operatívne naviazaná na DNA sekvenciu kontrolujúcu expresiu, hostiteľské bunky stabilne pretransformané alebo transfektované takou polynukleotidovou DNA a odpovedajúce metódy pre produkciu Exodu kultivácií takých hostiteľských buniek a izolácií Exodu kultivácií z hostiteľských buniek alebo zo živného média. Vynález ďalej poskytuje prečistené Exodus polypeptidy, obzvlášť polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, alebo polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 73 SEQ ID NO: 2. Iný aspekt vynálezu poskytuje protilátky špecificky reaktívne s Exodusom, vrátane monoklonálnych protilátok a hybridných bunkových línií produkujúcich také monoklonálne protilátky.

Ešte ďalší aspekt vynálezu poskytuje spôsob pre zvýšenie rezistencie na HIV infekciu, kedy je subjektu podané množstvo Exodus proteínového produktu účinné pri inhibícii proliferácie HIV, zvlášť tam, kde existuje riziko expozície subjektu HIV, alebo kde bol subjekt vystavený HIV, alebo kde bol infikovaný HIV. Tento aspekt vynálezu taktiež poskytuje spôsob pre liečbu HIV infekcie, pri ktorom je subjektu infikovanému HIV podané množstvo Exodus proteínového produktu účinné pri inhibícii proliferácie HIV. Ďalší aspekt vynálezu poskytuje spôsob pre ochranu progenitorových buniek kostnej drene pred cytotoxickými účinkami, kde tento spôsob obsahuje podanie množstva Exodus proteínového produktu účinného pri potlačení proliferácie progenitorových buniek kostnej drene, zvlášť v tom prípade keď u subjektu prebieha chemoterapia alebo rádioterapia. Ešte ďalší aspekt vynálezu poskytuje spôsob pre liečbu myeloproliferatívnych ochorení obsahujúci podanie množstva Exodus proteínového produktu účinného pri potlačení proliferácie maligných progenitorových buniek kostnej drene. Vynález je podrobnejšie popísaný nižšie.

Vynález poskytuje prečistené a izolované polynukleotidy (t.j. DNA a RNA, ako sense, tak aj antisense reťazce) kódujúce Exodus. Preferované DNA sekvencie podľa predloženého vynálezu zahŕňajú genómové cDNA sekvencie a chemicky syntetizované DŇA sekvencie.

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca tento Exodus chemokin, vrátane 5' a 3' nekódujúcich sekvencií, je daná v SEQ ID NO: 1. Nukleotidy 43 až 327 obsahujú časť tejto DNA SEQ ID NO: 1 kódujúcej Exodus protein a preferovaná DNA podľa predloženého vynálezu obsahuje nukleotidy 109 až 327 SEQ ID NO: 1, ktoré obsahujú predpokladanú kódujúcu sekvenciu zrelého, secernovaného Exodus proteinu bez jeho signálnej sekvencie.

Aminokyselinová sekvencia chemokinu Exodus je daná v SEQ ID NO: 2. Preferované polynukleotidy podľa predloženého vynálezu zahŕňajú, okrem polynukleotidov popísaných vyššie, polynukleotidy kódujúce aminokyselinovú sekvenciu danú v SEQ ID NO: 2, ktoré sa líšia od polynukleotidov popísaných v predchádzajúcom odstavci iba vďaka dobre známej degenerácii genetického kódu.

Podobne, pretože dvadsaťdva až -1) SEQ ID NO: štepený kôli získaniu preferované polynukleotidy obsahujú zrelého tie, aminokyselín (pozície signálny peptid, ktorý je Exodus chemokinu, zahŕňajú ktoré kódujú aminokyseliny až 73 SEQ ID NO: 2. Tak je preferovaný polynukleotid prečistený polynukleotid kódujúci polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny 1 až 73 SEQ ID NO: 2.

Do použitia pre polynukleotidy podlá predloženého vynálezu patrí použitie ako hybridizačnej sondy, pre identifikáciu a izoláciu genómovej DNA kódujúcej ludský Exodus, kde tento gén pravdepodobne má tri exonové/dve intronové štruktúry charakteristické pre gény pre C-C chemokiny (viď Baggiolini et al., vyššie); pre identifikáciu a izoláciu non- ludských génov kódujúcich proteiny homologné k Exodusu; pre identifikáciu ludských a non-ludských chemokinov podobajúcich sa Exudusu; a pre identifikáciu tých buniek, ktoré exprivujú Exodus a stavov, počas ktorých je tento protein exprivovaný.

Tak, v ďalšom aspekte, vynález poskytuje prečistený polynukleotid, ktorý hybridizuje za prísnych podmienok s komplementárnym reťazcom Exodus kódujúcich častí DNA SEQ

ID NO: 1. Podobne vynález poskytuje prečistený polynukleotid, ktorý, vzhladom k zastupitelnosti genetického kódu, by mohol hybridizovať za prísnych podmienok s komplementárnym reťazcom Exodus kódujúcich častí DNA SEQ

ID NO: 1. Príkladné prísne hybridizačné podmienky sú nasledovné: hybridizácia pri 42 °C v 5X SSC, 20 mM NaPO₄, pH 6,8, 50% formamid; a premývanie pri 42 °C v 0,2X SSC.

Odborníci podmienky v odbore empiricky vedia, že je žiadúce meniť tieto v závislosti od dĺžky a obsahu GC nukleotidovej bázy sekvencii, ktoré majú byť hybridizované, a že existujú vzorce pre určenie takýchto variácií (viď napr. Saombrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. vydanie, Cold Spring Harbor, New York: Cold

Spring Harbor Laboratory (1989)).

V inom aspekte vynález zahrňuje plazmidové a vírusové DNA vektory inkorporujúce DNA podlá predloženého vynálezu, vrátane akejkoľvek DNA popísanej vyššie. Preferované vektory zahrňujú expresné vektory, v ktorých je inkorporovaná DNA kódujúca Exodus operatívne naviazaná na endogénnu alebo heterológnu expresiu kontrolujúcu sekvenciu. Také expresné vektory môžu ďalej obsahovať DNA sekvencie kódujúce polypeptid operatívne naviazané na DNA sekvencie kódujúce Exodus, kde tieto vektory môžu byť exprivované za získania fúzneho proteínu obsahujúceho požadovaný Exodus polypeptid.

V inom aspekte vynález obsahuje prokaryotickú alebo eukaryotickú hostiteľskú bunku stabilne transfektovanú alebo transformovanú DNA alebo vektorom podľa predloženého vynálezu. V preferovaných exprivovaný Exodus polypeptid podľa predloženého vynálezu.

hostiteľských bunkách je kódovaný DNA alebo vektorom DNA, vektory a hostiteľské bunky podľa predloženého vynálezu sú použiteľné, napríklad, v spôsoboch pre rekombinantnú produkciu veľkých množstiev Exodus polypeptidov podľa predloženého vynálezu. Také spôsoby sú sami o sebe aspekty predloženého vynálezu. Napríklad, vynález obsahuje spôsob produkcie Exodusu, v ktorom je hostiteľská bunka podía predloženého vynálezu kultivovaná vo vhodnom živnom médiu a Exodus proteín je izolovaný z buniek alebo z média.

V ešte inom aspekte vynález obsahuje prečistené a izolované Exodus polypeptidy. Preferovaným peptidom je prečistený chemokinový polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny 1 až 73 SEQ ID NO: 2. Polypeptidy podía predloženého vynálezu môžu byť prečistené z prirodzených zdrojov, ale výhodne sú produkované rekombinantnými postupmi za použitia DNA, vektorov a/alebo hostiteíských buniek podía predloženého vynálezu alebo sú syntetizované chemicky. Prečistené polypeptidy podľa predloženého vynálezu môžu byť glykosylované (napr. O-väzbou alebo N-väzbou) alebo neglykosylované, vo vode rozpustné alebo nerozpustné, oxidované, redukované, atď. v závislosti od vybranej hostiteľskej bunky, spôsobu rekombinantnej produkcie, spôsobu izolácie, spracovania, skladovacieho pufra a podobne. Alternatívne môžu byť Exodus polypeptidy pripravené chemickou syntézou peptidov za použitia techník, ktoré boli úspešne použité pri produkcii iných chemokinov ako sú IL-8 (Clark-Lewis et al. , J. Biol. Chem., 266: 23128 - 34 (1991)) a MCP-1.

Vynález tiež zahrňuje fragmenty Exodus polypeptidov, v ktorých je jeden alebo viac N-koncových alebo C-koncových zvyškov deletovaný, a ktoré si uchovávajú jednu alebo viac biologických aktivít charakteristických pre C-C chemokiny.

Iný aspekt vynálezu zahŕňa analógie Exodus polypeptidu, v ktorých je jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov pridaný, deletovaný alebo nahradený v Exoduse podľa predloženého vynálezu, a ktoré si uchovávajú jednu alebo viac biologických aktivít charakteristických pre C-C chemokiny. Takéto analógie sú užitočné, napríklad, pre lekárske zobrazovacie metódy popísané vyššie alebo pre liečebné metódy popísané ďalej. Tieto môžu byť pripravené akýmikoľvek rekombinantnými alebo syntetickými spôsobmi známymi v odbore, vrátane tých, ktoré sú popísané ďalej v príklade 7.

Príklady analógií zahŕňajú substitúcie v aminokyselinovej sekvencií Exodusu, ktoré sú navrhnuté pre zvýšenie homológie s chemokinmi, s ktorými je najbližší príbuzný. Substitúcie navrhnuté pre zyýšenie homológie pozícii ktoré spôsobia vyššiu RANTES zahŕňajú nahradenie 1-10 v pozícii 11 12 serinom,

MIP-la alebo zvyškami fenylalanínom, nahradenie < nahradenie nahradenie izoleucínu v zahŕňajú nahradenie alaninu zrelého proteinu threonínom, alebo tyrosínom. Ďalšie homológiu zvyškov 1-8

1-9 RANTES, nahradenie glycinu v glutamovej serínu v pozícii 60 s MIP-la,

Exodusu nahradenie : glycinu pozícii kyseliny pozícii tyrosínom a Tieto s rodinou C-C chemokinov v pozícii 31 v sekvencií nahradenie fenylalaninu v substitúcie, MIP-Ιβ a zvyškami leucínu pozícii kyselinou glutamovou, pozícii 36 serínom, glutamínom, nahradenie nahradenie serínu v pozícii 67 kyselinou asparágovou.

substitúcie môžu byt prevedené jednotlivo alebo v akýchkolvek kombináciách a predpokladá sa, že majú potenciál pre zvýšenie aktivity Exodusu pri myelosupresii alebo pri inhibícii produkcie HIV.

Iné substitúcie, navrhnuté pre posilnenie charakteru aminokyseliny v danej pozícii (napríklad pokial je aminokyselina hydrofóbna, tak nahradenie je viac hydrofóbne) môžu tiež zvyšovať aktivity Exodusu: nahradenie asparagínu v pozícii 6 kyselinou asparágovou, nahradenie leucínu v pozícii 18 izoleucínom, nahradenie glutamínu v pozícii 29 kyselinou glutamovou, nahradenie asparagínu v pozícii 38 kyselinou asparágovou, nahradenie valínu v pozícii 50 izoleucínom a nahradenie glutamínu v pozícii 56 kyselinou glutamovou. Tieto substitúcie môžu byt prevedené jednotlivo alebo v akýchkolvek kombináciách.

Príbuzný aspekt vynálezu zahŕňa analógie, ktorým chýbajú biologické aktivity Exodusu, ale ktoré sú schopné kompetitívne chemokinov s napríklad, v alebo nekompetitívne inhibovat väzbu C-C ich receptormi. Také analógie sú užitočné, terapeutických prípravkoch alebo spôsoboch inhibovania biologickej aktivity endogénneho Exodusu alebo iných C—C chemokinov u hostiteľa. U takýchto analógií polypeptidu Exodus sa špecificky predpokladá, že budú modulovať väzbové charakteristiky Exodusu na receptory pre chemokiny a/alebo na iné molekuly (napríklad heparín, glykosaminoglykany, erytrocytárne receptory pre chemokiny), ktoré sú považované za významné pri prezentácii Exodusu na jeho receptor.

V príbuznom aspekte vynález poskytuje prečistené a izolované polynukleotidy kódujúce také analógie polypeptidu Exodus, kde tieto polynukleotidy sú užitočné, napríklad, pre rekombinantnú produkciu analógií polypeptidu Exodus; plazmidové a vírusové vektory inkorporujúce takéto polynukleotidy; a prokaryotické alebo eukaryotické hostiteľské bunky stabilne transformované takými DNA alebo vektormi.

V inom aspekte vynález obsahuje protilátkové prípravky (napríklad monoklonálne alebo polyklonálne protilátky, jednoreťazcové protilátky, chimerické alebo humanizované protilátky a podobne), ktoré sú špecificky imúnnoreaktívne s polypeptidmi Exodus alebo s polypeptidovými analógiami podľa predloženého vynálezu. Vynález ďalej obsahuje hybridné bunkové línie, ktoré produkujú protilátkové substancie podľa predloženého vynálezu. Takéto protilátky sú použiteľné, napríklad, pre prečistenie polypeptidov podľa predloženého vynálezu, pre detekciu alebo kvantitatívne meranie Exodusu v tekutinách alebo vo vzorcoch tkanív, napr. pri použití dobre známych ELISA techník a pre moduláciu väzby Exodusu na jeho receptory. U niektorých protilátok proti chemokinom (napr. u anti-IL-8 protilátky) boli dokázané dramatické protizápalové účinky.

Rekombinantné polypeptidy Exodus alebo polypeptidové analógie pódia predloženého vynálezu môžu byť použité namiesto protilátok vo väzbových reakciách, pri identifikácii buniek exprivujúcich receptory pre Exodus a pri štandardných technikách expresného klonovania pre izolovanie polynukleotidov kódujúcich receptory. Viď napríklad príklad 16 ďalej a klonovanie IL-8 MCP-1 receptorov v Holmes et al., vyššie a Charo et al·, vyššie v príslušnom poradí. Takéto Exodus polypeptidy, analógie Exodus polypeptidov a polypeptidové receptory pre Exodus sú užitočné pri modulácii aktivity chemokinu Exodus a pri identifikácii polypeptidových a chemických (napr. s malou molekulou) agonistov a antagonistov Exodusu.

Ako je tu použité, Exodus proteínový produkt zahŕňa Exodus polypeptidy, jeho fragmenty alebo analógie, vrátane alternatívne zostrihaných variánt Exodusu, ako je chemokin Ck8~4 popísaný v Medzinárodnej prihláške č. WO 96/05856, vyššie, ktoré si uchovávajú odpovedajúce biologické aktivity Exodusu. Dokázali sme, že extra alanín nachádzaný v Ckp-4 (po zvyšku 4 Exodusu) spadá do väzby exon-intron. Sekvencovanie tohoto regiónu naznačuje, že tieto dve formy Exodusu vznikajú alternatívnym zostrihom.

Vynález taktiež obsahuje farmaceutické prípravky obsahujúce Exodus proteínový produkt pre použitie v spôsoboch pre zvýšenie imunitnej odpovede u cicavcov postihnutých ranami alebo infekčným ochorením. Tiež obsahuje farmaceutické prípravky obsahujúce Exodus proteínové produkty alebo protilátky proti nim, pre použitie v spôsoboch pri redukcii zápalu alebo zápalom sprostredkovaných patologických stavov, ako je artritída, Crohnova choroba alebo iné autoimunitné ochorenia. Ďalej sú obsiahnuté farmaceutické prípravky pre použitie pri redukcii atherosklerósy, angiogenézii alebo nádorového rastu alebo metastázovaní.

Jednotlivo sú obsiahnuté farmaceutické prípravky pre použitie v potláčaní proliferácie hernetopoetických kmeňových alebo progenitorových buniek. Taká myelosupresia môže chrániť kmeňové/progenitorové bunky pred cytotoxickými účinkami počas chemoterapie alebo rádioterapie. Taktiež je predpokladané použitie Exodus proteínového produktu na výrobu liečiva na potlačenie proliferácie progenitorových buniek kostnej drene, kde uvedené liečivo je zvlášť navrhované pre podanie subjektom, u ktorých prebieha chemoterapia alebo rádioterapia.

Taktiež sú jednotlivo obsiahnuté farmaceutické prípravky pre použitie pri liečbe myeloproliferaťívnych ochorení a použitie Exodus proteínového produktu na výrobu liečiva na liečbu myeloproliferatívnych ochorení.

Ďalej sú jednotlivo obsiahnuté farmaceutické prípravky pre použitie pri liečbe pacientov nedávno vystavených HIV, ale doposiaľ netestovaných alebo bez preukázania HIV-pozitivity štandardnými diagnostickými postupmi (napr. novorodenci od HlV-pozitívnych matiek, lekársky personál vystavený HlV-pozitívnej krvi), pacientov s rizikom expozície HIV, alebo pacientov už infikovaných HIV, t.j. HlV-pozitívnych pacientov. Taktiež je obsiahnuté použitie Exodus proteínového produktu na výrobu liečiva na inhibíciu proliferácie HIV, kde uvedené liečivo je zvlášť vhodné pre podanie subjektom s rizikom expozície HIV, alebo vystavených HIV, alebo infikovaných HIV. Ďalej je obsiahnuté použitie

Exodus proteínového produktu na výrobu liečiva na liečbu HIV infekcie.

Takéto farmaceutické prípravky obsahujú Exodus proteínový produkt alebo fyziologicky prijateľným voliteľne obsahovať iné závislosti od klinickej protilátky proti nemu, riedidlom alebo nosičom vhodné terapeutické činidlá v aplikácie, napr. protizápalové spolu s a môžu činidlo alebo anti-HIV činidlo. Dávka Exodus proteínového produktu sa bude veľmi líšiť od asi ^g do 100 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodne od 5 do 100 μg/kg telesnej hmotnosti, v závislosti od patologického stavu, ktorý je liečený. Takéto farmaceutické prípravky môžu byť podané mnohými spôsobmi, v závislosti od liečeného stavu, vrátane podkožného, intramuskulárneho, intravenosného, intrapulmonárneho, transdermálneho, intrathekálneho, orálneho alebo čipkového podania.

Dávka Exodus proteínového produktu môže byť zvýšená alebo znížená a trvanie liečby môže byť zkrátené alebo predĺžené podľa rozhodnutia ošetrujúceho lekára. Frekvencia dávkovania činidla a formulácia bude od bude závisieť spôsobu určená od farmakokinetických parametrov podania. Optimálna farmaceutická odborníkom spôsobu podania Pharmaceutical Scinces, a požadovanej dávky.

18. vydanie v odbore na základe Viď napr. Remington's (1990, Mack Publishing

Co., Easton, PA 18042) str. 1435 - 1712, ktorých obja vy sútu uvedené ako odkaz. Takéto prípravky môžu ovplyvňovať fyzikálny stav, stabilitu, rýchlosť in vivo uvolňovania a rýchlosť in vivo klírens podaného činidla.

Odborníci v odbore budú ľahko optimalizovať účinné dávkovanie a súčasné režimy podania ako sú určené praxou v odbore a klinickým stavom jednotlivého pacienta. Bez ohľadu na spôsob podania môže byť určitá dávka vypočítaná podľa telesnej hmotnosti pacienta, povrchu tela alebo veľkosti orgánu. Ďalšia úprava výpočtov potrebná pre určenie vhodnej dávky pre liečbu každou z vyššie uvedených formulácií zbytočného je rutinne prevedená odborníkom v odbore bez experimentovania, zvlášť vo svetle informácií o dávke a testov tu popísaných, tak ako aj na základe farmakokinetických dát pozorovaných v klinických pokusoch na ľuďoch zmienených vyššie. Vhodné dávky môžu byť upresnené za použitia zavedených testov na hladinu v krvi spolu s vhodnými dátami dávka-odpoveď. Konečný dávkový režim bude určený ošetrujúcim lekárom po zvážení rôznych faktorov, ktoré modifikujú účinok liečiva, napr. špecifické aktivity liečiva, závažnosti poškodenia a reaktivity pacienta, veku, zdravotného stavu, telesnej hmotnosti, pohlavia, dietetických návykov pacienta, závažnosti akejkoľvek infekcie, dobe podania a od iných klinických faktorov. S postupom prevádzania štúdií budú dostupné ďalšie informácie týkajúce sa vhodných dávkových hladín pre liečbu rôznych ochorení a stavov.

Materiály a spôsoby produkcie Exodusu popísané vyššie môžu byť použité v niekoľkých klinických aplikáciách. Poprvé, pretože chemokiny priťahujú a aktivujú monocyty a makrofágy (Baggiolini et al., vyššie), môže expresia Exodusu v mieste patogénneho zápalového deja exacerbovať ochorenie presunom ďalších monocytov a makrofágov alebo iných leukocytov do miesta ochorenia, aktiváciou leukocytov, ktoré sú v ňom už prítomné alebo indukciou zotrvania leukocytov v tomto mieste. Preto, od inhibície chemotaktickej aktivity Exodusu sa očakáva, že zmierni škodlivé zápalové procesy. Signifikantne bol potenciálny prínos takéhoto prístupu priamo preukázaný v pokusoch využívajúcich IL-8, C-X-C chemokin, ktorý priťahuje a aktivuje neutrofily. Protilátky namierené proti IL-8 mali silnú schopnosť inhibovať zápalové ochorenia sprostredkované neutrofilmi (Harada et al., J. Leukoc. Biol., 56: 559 (1994)). Od inhibície Exodusu sa očakáva, že bude mať podobný účinok u ochorenia, kde sa predpokladá úloha monocytov a makrofágov, napríklad pri Crohnovej chorobe, reumatoidnej artritíde, atheroskleróze, infarkte myokardu alebo pri akútnom syndróme dychovej tiesne (ARDS).

Alternatívne, zvýšenie účinnosti Exodusu môže byť u ochorenia výhodné, pretože bolo ukázané, že chemokiny majú pozitívny účinok pri hojení rán a angiogenézii. Preto môžu byť exogénne Exodus proteínové produkty alebo Exodus agonisti výhodné v navodzovaní hojenia u takých ochorení.

Exodus proteínové produkty alebo Exodus agonisti môžu byť taktiež klinicky výhodné pri liečbe nádorov, ako naznačuje schopnosť C-C chemokinu TCA3 inhibovať tvorbu nádorov u myší (viď Laning et al., vyššie). Exodus môže priamo alebo nepriamo pôsobiť inhibíciu tvorby nádorov, napr. priťahovaním alebo aktiváciou rôznych nešpecifických efektorových buniek do miesta nádoru alebo stimuláciou špecifickej protinádorovej imunity.

Okrem toho, tu ukázaný myelosupresívny účinok Exodusu naznačuje, že Exodus proteínové produkty alebo Exodus agonisti môžu byť významným prínosom pre pacientov dostávajúcich chemoterapiu alebo rádioterapiu, pri ktorej budú redukovať škodlivé účinky terapie na myeloidné kmeňové alebo progenitorové bunky pacienta. Napríklad, liečba Exodus proteínovým produktom pred alebo počas (napríklad deň pred, bezprostredne pred alebo zároveň) podaním fázovo špecifického chemoterapeutického činidla môže chrániť kostnú dreň pred cytotoxickými účinkami činidla.

Takéto fázovo špecifické etoposid, chemoterapeutické daunorubicín, činidlá zahŕňajú vinblastín, doxorubicín, idarubicín, methotrexát, hydroxyureu, fluorouracil, cytosin arabinosid, mercaptopurín, thioguanín, pentostatín, fludarabin a 2-chlordeoxyadenosid (2-CDA). Ako bolo spomenuté vyššie analógia ΜΙΡ-Ια (označená BB10010, British Biotechnology) je teraz v klinickom pokuse ako myeloprotektívny agens pri terapii Cytoxanom^R (cyklofosfamid od Bristol-Myers Squibb

Oncology).

Schopnosť Exodusu inhibovať proliferáciu myeloidných bunkových línií závislých na cytokinoch, ako je tu ukázaná, naznačuje, že Exodus proteínový produkt bude taktiež používaný aj pri liečbe myeloproliferatívnych ochorení, vrátane, ale bez obmedzení, chronickej myeloidnej leukémie, esenciálnej trombózy, myelofibrózy a polycetamia vera. Podanie Exodus proteínového produktu v tejto indikácii môže byť súčasné s podaním iných chemoterapeutických agensov alebo iných cytokinov, ako je inferón.

Ďalej, u C-C chemokinov RANTES, ΜΙΡ-Ια a MIP-Ιβ bolo ukázané, že potláčajú replikáciu vírusu ludskej imunodeficiencie HIV.l (Cocchi et al., Science, 270: 1811 - 1815 (1995))., čo ich robí možnými terapeutickými činidlami pri prevencii alebo liečbe AIDS. Schopnosť Exodusu inhibovať proliferáciu HIV, ako je tu ukázaná, naznačuje, že Exodus proteínový produkt bude taktiež prínosom pri liečbe pacientov s AIDS, pri prevencii nástupu alebo progresie AIDS alebo pri navodení rezistencie na HIV infekciu po expozícii HIV. Plne rozvinutý AIDS sa neobjavuje ihneď po infekcii HIV; existuje tu variabilná doba, počas ktorej pacient zostáva zdravý, ale vikazuje virémiu. Táto virémia je udržiavaná opakovaním replikácie vírusu a reinfekciou krvných buniek. Jedna štúdia ukázala, že meranie plazmatického obsahu vírusu (takisto ako počtu CD4 lymfocytov) môže určovať následné riziko AIDS alebo smrti (Ho, Science, 272: 1124 - 1125 (1996)). Interferencia s kontinuálnym cyklom replikácie vírusu môže preto viesť k zlepšeniu prognózy.

Okrem toho, stanovená korelácia medzi expresiou chemokinov a zápalovými stavmi a chorobami, poskytuje diagnostickú a prognostickú indikáciu pre použitie Exodus proteínových produktov, vrátane protilátkových substancií, ktoré sú špecificky imúnnoreaktívne s Exodusom. Také Exodus materiály sú užitočné v spôsoboch pre diagnostiku a hodnotenie prognózy zápalových stavov a ochorení, takisto ako pre medicínske zobrazovanie oblastí zahrnutých pri takýchto ochoreniach a stavoch.

Mnoho ďalších aspektov a výhod vynálezu budú odborníkom v odbore jasné po preštudovaní nasledujúceho podrobného popisu vynálezu, ktorý popisuje jeho preferované prevedenia.

Popis obrázkov na pripojených výkresoch

Obrázok 1 popisuje účinok rôznych koncentrácií Exodusu na chemotaxiu mononukleárnych buniek.

Obrázok 2 popisuje účinok neošetreného a ACN-ošetreného Exodusu na hematopoézu u myší.

Obrázok 3 ukazuje účinok Exodusu samého alebo s MCP-1 alebo MIG na bunkový cyklus hematopoetických progenitorov u myší.

Obrázok 4 ukazuje účinok myeloidnej bunkovej línie MO7E.

Obrázok 5 ukazuje účinok myeloidnej bunkovej línie TF-1.

Exodusu na proliferáciu

Exodusu na proliferáciu

Obrázok 6 ukazuje účinok prečisteného syntetického

Exodusu na proliferáciu myeloidnej bunkovej línie MO7E.

Obrázok 7 ukazuje účinok Exodusu na uvolňovanie HIV p24 proteínu mononukleárnymi bunkami po infekcii HIV.

Obrázok 8 ukazuje účinok prečisteného syntetického Exodusu na uvolňovanie HIV p24 proteínu mononukleárnymi bunkami po infekcii HIV.

Vynález je založený na identifikácii cDNA sekvencie kódujúcej Exodus a na charakterizácii aktivít Exodusu.

Kompletná cDNA chemokinu Exodus má dĺžku 821 nukleotidov. Je tu konsensuálne polyadenylačné miesto v 786. 3 netranslatovaná sekvencia má mnoho AAAU sekvencii, ktoré sprostredkujú stabilitu mRNA v mnohých génoch pre cytokiny. Tieto sekvencie navodzujú degradáciu správy a spôsobia krátky polčas mnohých cytokinových transkriptov, vrátane chemokinov. Existuje tu krátky 5'netranslatovaný región s 43 nukleotidmi.

Odvodená aminokyselinová sekvencia Exodusu číta 95 aminokyselín. Toto je v súlade s C-C chemokinovou rodinou, kde je dĺžka členov rodiny v rozsahu od 91 do 99. Prvých 22 aminokyselín Exodusu vytvára silne hydrofónny signálny peptid. Štyri cysteiny, ktoré sa zúčastňujú na disulfidových väzbách, ktoré definujú túto rodinu, sú v Exoduse taktiež konzervované. Exodus je najbližšie príbuzný ΜΙΡ-Ια a RANTES na aminokyselinovej úrovni, s 26 - 28% identitou a s asi 75% podobnosťou, pokiaľ sú brané do úvahy konzervatívne zmeny. Exodus je zvlášť podobný RANTES v aminokyselinách 24 - 46 a znova od 58 do 75, kde medzi týmito pozíciami je iba šesť nekonzervatívnych zmien.

Aj keď má Exodus mnoho konzervovaných aminokyselinových charakteristík iných ludských C-C chemokinov, je tu niekolko neobvyklých charakteristík Exodusu, ktoré stoja za zaznamenanie. Exodus má vysoko bázický karboxy-koniec, ktorý sa viac podobá MCP-podrodine než RANTES. Okrem toho, Exodus nemá konzervovaný tyrosin a threonin na pozíciách 47 a 51, v príslušnom poradí, ktoré sú prítomné u všetkých ďalších ludských chemokinov, vrátane RANTES. Nie je jasné, či tieto dve vysoko konzervované aminokyseliny majú úlohu v aktivite C-C chemokinov, pretože sa nepredpokladá, že by boli v kontakte s receptorom.

Rôzne aspekty a výhody predloženého vynálezu budú jasné po preštudovaní nasledujúcich ilustračných príkladov. Príklad 1 popisuje identifikáciu cDNA pre Exodus. Príklad 2 popisuje pokusy na vyšetrovaní charakteru expresie génu pre Exodus v rôznych ludských bunkových líniách a tkanivách.

Príklad 3 popisuje rekombinantnú expresiu Exodus génu v cicavčích bunkách. Príklad 4 popisuje ďalší spôsob pre rekombinantnú expresiu Exodus génu v cicavčích bunkách a prečistenie vzniknutého proteinu. Príklad 5 poskytuje protokol pre expresiu Exodus génu v prokaryotických bunkách a prečistenie vzniknutého proteinu. Príklad 6 poskytuje protokol pre rekombinantnú produkciu Exodusu v kvasinkách alebo v bunkách od bezobratlovcov. Príklad 7 popisuje produkciu Exodusu a analógií Exodusu peptidovou syntézou alebo metódami rekombinantnej produkcie. Príklad 8 poskytuje protokol pre generovanie monoklonálnych protilátok, ktoré sú špecificky imúnnoreaktívne s Exodusom. Príklad 9 je adresovaný účinku Exodusu na chemotaxiu monocytov in viro. Príklad 10 je určený účinkom Exodusu na proliferáciu myeloidných progenitorových buniek, myeloidných bunkových línií a progenitorových buniek chronickej myeloidnej leukémie. Príklad 11 je určený účinku Exodusu na produkciu HIV p24 proteinu. Príklady 12, 13, 14 a 15 poskytujú in vivo testy chemotaxie a aktivácie leukocytov, inhibície nádorového rastu a aktivácie leukocytov po intraperitoneálnej alebo subkutánej injekcii. Príklad 16 popisuje klonovanie receptoru pre Exodus.

Príklady prevedenia vynálezu

Príklad 1

Identifikáciu cDNA sekvancie kódujúcej Exodus

Ako je popísané v Takeda et al., Human Mol. Genetics, 2: 1793 - 1798 (1993), messengerová RNA bola pripravená z dissekovaných normálnych ludských buniek ostrovčekov slinivky brušnej od dospelého jedinca a prvý reťazec cDNA bol syntetizovaný oligo(dT) primingom za použitia primeru, ktorý obsahoval Xhol miesto. Po syntéze druhého reťazca cDNA a tupom zakončení boli EcoRI adaptéry ligované na cDNA, ktorá bola potom frakcionovaná podlá velkosti pre odstránenie produktov velkosti menšej než 100 párov báz. po trávení Xhol boli produkty klonované do lambda ZAP II a aplikované v XLl-Blue MRF' bunkách (Stratagene, La Jolla, CA). Knihovňa bola konvertovaná do plasmidov za pomoci pBluescript SK - podlá návodu výrobcu. Čiastočná sekvencia 1000 z týchto náhodne izolovaných cDNA z pankreatických ostrovčekov bola určená jednokolovým automatickým sekvencovaním. Tieto sekvencie boli uložené v GenBank (Takeda et al., vyššie) a boli zrovnané s ďalšími sekvenciami v National Center for Biotechnology Information (NCBI) databázy. Priemerná dĺžka cDNA sekvencií použitých na zrovnanie bola asi 200 bp. Táto práca bola publikovaná v Takeda et al., vyššie.

V nadväznosti na prácu Takedu et al. bol medzi týmito 1000 Expressed Sequence Tags (EST) pankreatických ostrovčekov identifikovaný kloň kódujúci Exodus nasledujúcim spôsobom.

Pri opakovanom porovnaní konsensuálnej chemokinovej servisu NCBI homológiu k chemokinovej sekvencie s týmito EST za použitia BLAST bolo zistené, že jeden z klonov má vzdialenú rodine C-C chemokinov. Táto homológia ku rodine sa zvýšila potom, ako bolo manuálnym dvojreťazcovým sekvencovaní identifikovaných niekolko chýb v v sekvencovaní v pôvodnom automatizovanom behu potom, ako bol správne charakterizovaný región a čítací rámik. Tento kloň Takedom et al. pôvodne označený ako HBC2850, nebol identický so žiadnym iným chemokinom. cDNA v tomto klone sa skladala z 821 nukleotidov, ktoré obsahovali celý otvorený čítací rámik chemokinového proteínu. Tento chemokin bol označený ako Exodus.

Rozdiely medzi Exodus DNA sekvenciou, danou SEQ ID NO: 1 a EST sekvenciou podlá Takeda et al., sú nasledujúce (s ohladom na číslovanie nukleotidov podlá SEQ ID NO: 1): v nukleotide 64 (C v Exoduse) bol EST nukleotid N; v nukleotide 71 (C v Exoduse) bol EST nukleotid ''N; medzi nukleotidmi 130 až 131 EST obsahoval extra G bázu, ktorá spôsobovala posun čítacieho rámiku; medzi nukleotidmi 150 až 151 EST obsahoval extra T bázu, ktorá spôsobovala posun

	čítacieho rámiku;	v nukleotide 193 (C	v Exoduse)	bol EST
•	nukleotid	N; v	nukleotide	196	(C	v	Exoduse)	bol	EST
	nukleotid	N; v	nukleotide	271	( A	v	Exoduse)	bol	EST
«	nukleotid	N a v	nukleotide	309	( tfljtf	v	Exoduse)	boli	EST

nukleotidy GC.

Príklad 2

Charakter expresie Exodus génu v bunkových líniách a tkanivách

Charakter Exodus mRNA expresie bol vyšetrovaný Northern blottingom mRNA extrahovanej z rôznycch ludských tkanív a bunkových línií. Použitou sondou bola cDNA obsahujúca kompletný kódujúci región Exodusu, izolovaná elektroforézou na agarosovom gele a značená ³²p-dCTP a ³²p-dTTP (DuPontNEN, Boston, MA) náhodným primingom podlá návodu výrobcu (BMB, Indianapolis, IN).

A. Expresia génu Exodus v ludských tkanivách.

RNA bola izolovaná z bunkových línií a kultivovaných monocytov za použitia RNA STAT-60 (Tel-Test B Inc.,

Friendswood, TX) podlá návodu výrobcu. Celková RNA (20 μ9) bola frakciovaná na 0,8% formaldehydovom agarosovom gele, bola prenesená o nitroceluózy, hybridizovaná a premytá za prísnych podmienok. Filmy boli exponované po dobu jedného dňa s intenzifikovaným snímaním pri -80 °C.

Human Multiple Tissue Northern blot a Human Immune Systém Multiple Tissue Northern (Clontech, Palo Alto, CA) boli taktiež sondované Exodus cDNA a boli premývané za prísnych podmienok podlá návodu výrobcu. Autorádiografy boli exponované rovnako ako vyššie po dobu 1-4 dní.

Zdá sa, že Exodus má velmi restrihovaný charakter expresie. Nebol exprivovaný v mnohých testovaných bunkových líniách, vrátane TMR3233 neuroblastómu, MDA kareinomu prsníka, erytroleukémie, Jurkat T-bunkovej leukémie, HL60 buniek diferencovaných na granulocyty kyselinou retinoovou, 3T3 embryonálnych fibroblastov alebo 293 buniek embryonálnej ladviny. Pri analýze komerčne pripravených Northern blotov rôznych normálnych ludských tkanív na Exodus expresiu bola expresia detekovaná v plúcach a nebola v srdci, mozgu, placente, pečeni od dospelých, kostrovom svale, ladvine, slinivke brušnej, slezine alebo kostnej dreni. Velkosť transkriptu bola približne 0,9 kB, čo odpovedá veTkosti cDNA tu popísanej, s pridaním poly A konca.

Avšak, keď bol komerčne pripravený Northern blot lymfoidného tkaniva vyšetrovaný na Exodus expresii, tak bolo zistené, že je v značnom množstve exprivovaný v niekoľkých rôznych lymfoidných orgánoch. Exodus bol vysoko exprivovaný v periférnych lymfatických uzlinách, apendixe, periférnych krvných mononukleárnych bunkách a fetálnej pečeni. O niečo menej značne bol exprivovaný v thyme a nebola zistená detekovaná expresia v slezine alebo kostnej dreni.

Tento charakter expresie je typický pre mnoho chemokinov. Exodus bol exprivovaný zvlášť v lymfoidnom tkanive, hlavne v lymfatických uzlinách, apendixe a periférnej krvi. Je možné, že lymfoidné tkanivo použité v tejto Northern blot analýze mohlo byť aktivované nejakými imunologickými stimulmi, čo mohlo spôsobiť vyššiu než obvyklú hladinu expresie Exodusu. Slabá expresia Exodusu v kostnej dreni oproti periférnej krvi mohla byť spôsobená skutočnosťou, že kostná dreň je zložená zvlášť z nezrelých myeloidných a erytroidných prekursorov, zatiaľ čo v periférnej krvi je oveľa viac zrelých mononukleárnych buniek.

B. Expresia Exodus génu po zápalovom stimule.

Pretože expresia mnohých chemokinov je indukovaná v mononukleárnych bunkách zápalovými stimulmi, bola expresia Exodusu po expozícii rôznych bunkových línií LPS, TNF-a alebo PMA analyzovaná Northern blot analýzou.

Monocytárna bunková línia THP-1 bola získaná od Američan Type Culture Collection (Rockville, MD). Bunky boli udržiavané v RPMI 1640 médiu (Biowhitaeker, Walkersville, MD) doplnenom 10% fetálnym teľacím sérom (FCS, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah), 25mM HEPES, 100 U/ml penicilínu a 100 μ9/ιη1 streptomycínu (tkanivové kultivačné antibiotiká, Life Technologies, Gaithersburg, MD). Pre stimulačné pokusy boli bunky kultivované v hustote jeden milión buniek na ml za prítomnosti forbolesteru (PMA, Sigma, St. Louis, MO).

Imortalizovaná endoteliálna bunková línia ludskej endotelialnej veny I-HUVEC bola ziskana od Dr. Jay Nelson, University of Oregon, a bola kultivovaná v RPMI 1640 doplnenom 10% FCS (Hyclone), 400 μg/ml G418 (Life

Technologies, Grand Island, a 30 μg/ml endoteliálneho (Collaborative Biomedicals konfluencie 70 - 80%, potom

NY), 1 U/ml heparínu (Sigma) bunkového rastového faktora

Products, Bedford, MA) do bola kultivovaná za prítomnosti alebo za absencie 10 ng/ml faktora nekrózy nádorov a (TNF-a, Peprotech, NJ) v rôznych časových obdobiach.

Mononukleárne bunky periférnej krvi boli prečistené na Histopaque gradientech (Sigma) a monocyty boli izolované adherenciou na plasty. Monocyty boli kultivované po dobu 6 dní, s náhradou média každé dva dni po umožnení diferenciácie do makrofágov. Bunky boli stimulované 100 ng/ml lipopolysacharidu (LPS, Sigma) v rôznych časových obdobiach.

Expresia Exodusu bola vysoko indukovaná, pokial boli mononukleárne bunky periférnej krvi vystavené LPS po dobu 8 alebo 12 hodín. Expresia Exodusu bola opäť vysoko indukovaná, pokial boli endoteliálne bunky pupočnej vény vystavené expresia zápalové monocytárnej indukovaná, a s miernym

TNF-α po

Exodusu zostávala vysoká, stimuly. Pri ošetrení leukémie PMA bola s dosiahnutím piku poklesom potom.

dobu iba troch hodín.

pokial bunkovej expresia 48 hodín

Signifikantne, boli prítomné línie THP-1 Exodusu tiež po expozícii

Tieto výsledky naznačujú, že Exodus bol slabo exprivovaný, pokial neboli zápalové stimuly prítomné. Avšak, pokiaľ bol takýto stimul prítomný, potom bol Exodus rýchlo a stabilne zvýšene exprivovaný. Charakter stimulu samotného sa taktiež zdá byť bez obmedzení, keď všetky LPS, TNF-a a PMA stimulovali Exodus. Produkcia Exodusu sa tak zdá byť funkciou zrelých lýmfofagocytárnych buniek, zvlášť po zápalových stimuloch, ale nie funkciou nezrelých myeloidných buniek.

Príklad 3

Produkcia rekombinantného Exodusu v COS bunkách

Rekombinantný Exodus bol produkovaný prechodnou transfekciou Exodus cDNA do COS buniek. Kompletná Exodus cDNA bola subklonovaná za použitia spoločných reštrikčných miest do polylinkerového miesta pECE (Ellis et al., Celí, 45: 721 (1986)) a SV-40 riadeného expresného vektora, v sense orientácii. COS bunky v log fáze (Američan Type Clture Collection (ATCC) č. CRL 1651) boli umiestnené v DMEM s 10% FCS (Hyclone) a 100 U/ml penicilínu a 100 μg/ml streptomycínu (tkanivové kultivačné antibiotiká, Life Technologies, Gaithersburg, MD) v hustote jeden milión buniek na 100 mm kultivačný disk a boli indukované cez noc. Dvadsať ug prečistenej pECE-Exodus plasmidovej DNA na platňu bolo použité na transfekciu COS buniek Lipofectínom podľa návodu výrobcu (Life Technologies, Bethseda, MD). Prečistený pECE plasmid (bez Exodus DNA) bol identicky transfektovaný do COS buniek a slúžil ako kontrola. Expresný vektor s reportérovým génom pre beta-galaktosidázu (SV40/beta-Gal, Pharmacia, Piscataway, NJ) bol spoločne transfektovaný na kontrolu účinnosti transfekcie. O 72 hodín neskôr bol supernatant kultúry COS buniek filtrovaný cez 0,2 μιη filtre a uskladnený pri -70 °C. Po odstránení supernatantu boli vyrobené bunkové lyzáty a aktivita beta galaktosidázy bola testovaná ako bolo skôr popísané v Rosenthal, Meth. Enzymol., 152: 704 (1987). Pri prevedení pECE a pECE-Exodus transfekcie boli účinnosti transfekcie, ako boli určené aktivitou beta-galaktosidázy, medzi sebou v rozmedzí 10%.

Príklad 4

Produkcia rekombinantného Exodusu v CHO bunkách a jeho prečistenie

PCR bola použitá na aplikáciu báz 30 až 330 Exodus cDNA (ukázaných v SEQ ID NO: 1), ktoré obsahujú 13 bp 5' nekódujúce a 3 bp 3' nekódujúce sekvencie. Sekvencie dprimerov boli: 5' -GGCGAAGCTITGAGCTAAAAACCATG (SEQ ID NO:

3) a 5'-GCGGGAATTCTTACATGTTCTTGACT (SEQ ID NO: 4). Pre ulahčenie klonovania obsahovali tieto primery HindlII a EcoRI reštrikčné miesta, v príslušnom poradí (ukázané kurzívou). Fragment bol klonovaný do vektora pDCl (popísané v súvisiacej US patentovej prihláške poradové č. 08/558658, podanej 16.11.1995, ktorá je tu uvedená ako odkaz), ktorý je pBR322 derivátom, ktorý obsahuje CMV bezprostredne včasný promotor susediaci s klonovacím miestom pre uľahčenie expresie insertu a taktiež obsahujúci bakteriálny beta-laktamasový gén a gén pre myší dihydrofolát reduktasu (DHFR) pre umožnenie selekcie plasmidov v bakteriálnych a cicavčích bunkách, v príslušnom poradí (Sambrook et al., vyššie). Konštrukt obsahujúci Exodus insert bol linearizovaný reštrikčným trávením Pvul (BMB, Indianapolis, IN), ktorý štiepi sekvenciu vektora. Linearizovaný plasmid bol zrážaný ethanolom a znovu rozpustený v HBS (20 mM HEPES-NaOH, ph 7,0; 137 mM NaCl, 5 mM KC1; 0,7 mM Na₂HPO₄;

mM Dextrózy). Po elektroporácii bolo 10⁷ buniek CHO bunkovej línie DG44 (Urlab et al., Celí, 33: 405 (1983)) premytých, resuspendovaných v 1 ml PBS, zmiešaných s 10 μ9 linearizovaného plasmidu a prenesených do 0,4 cm elektroporačnej kyvety. Suspenzia bola elektroporovaná za použitia Biorad Gene Pulser (Richmond, CA) pri 290 voltoch, 960 μΕ3Γ3άοο!ι. Transformanty boli selektované kultiváciou v DMEM/F12 médiu (Gibco) obsahujúcim 10% dialyzovanej FCS (Hyclone, Logan, UT) a neobsahujúcim hypoxantín a thymidín. Bunky z niekoľkých stovák transformovaných kolónií boli zhromaždené a znovu umiestnené v DMEM/F12 médiu obsahujúcom 20 nM methotrexátu (Sigma, St. Luis, MO). Kolónie, ktoré prežili toto kolo selekcie boli izolované a expandované za zisku jednotlivých kolónií. Hladina expresie Exodusu bola určená nasledujúcim spôsobom.

Klony boli kultivované na tkanivových kultivačných platniach do približne 90% konfluencie v DMEM/F12 médiu obsahujúcom 10% dializovanej FCS, a tu chvíľu bola nahradená médiom. Bunky rástly po dobu 4 dní v DMEM/F12 médiu obsahujúcom 1% dializované FCS. Supernatant bol zavedený do kolóny Heparin Sepharosa CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ). Kolóna bola premytá 0,2 M NaCl v 20 mM Tris, ph 7,5 a chemokin bol eluovaný 0,6 M NaCl v 20 mM Tris, ph 7,5. Eluovaný Exodus bol frakciovaný SDS-PAGE cez 18% Tris glycínový gel (NOVEX, San Diego, CA) a bol prenesený do PVDF membrány (Millipore, Bedford, MA). Exodus pásik migrujúci v asi 7 kD bol potvrdený detekciou za použitia králičieho polyklonálneho antiséra špecifického pre Exodus (pripraveného ako je popísané v príklade 8, ďalej).

Klony exprivujúce najvyššiu hladinu chemokinu Exodus môžu byť expandované pre proteínovú produkciu velkých množstiev. Vzniknutý rekombinantný Exodus je produkovaný a prečistený zo supernatantu nasledujúcim spôsobom. Exodus pásik migrujúci pri asi 7 kD je excidovaný a N-koniec je sekvencovaný na automatizovanom sekvenátore (Applied Biosystems, Model 473A, Foster City, CA).

« Ako ďalší krok prečistenia je Exodus eluovaný z Heparin-Sepharosa kolóny vnesený do 1,6 M NaCl a je » zavedený do kolóny HI-Propyl 40 mikrónovej živice (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ). Kolóna je premytá 1,6 M NaCl v 20 mM Tris, ph 7,5 a Exodus je eluovaný 20 mM Tris, ph 7,5.

Integrita eluovaného Exodusu je potvrdená aminokyselinovou analýzou na potvrdenie pomeru aminokyselín určeného aminokyselinovou sekvenciou a hmotnostnou spektrofotometriou na potvrdenie predpokladanej veíkosti.

Príklad 5

Produkcia rekombinantného Exodusu v baktériách

Príkladný protokol pre rekombinantnú expresiu Exodusu v baktériách a prečistenie vzniknutého produktu nasleduje.

DNA sekvencia kódujúca zrelú formu proteinu je amplifikovaná PCR a je klonovaná do vektora pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ). pGEX vektor je navrhnutý na produkciu fúz neho proteínu obsahujúceho glutathion-S-transferázu (GST), kódovaného vektorom a proteínu kódovaného DNA fragmentom insertovaným do klonovacieho miesta vektora. Primery pre PCR SÚ SEQ ID NO: 4 a 5'- TAT CGG ATC CTG GTT CCG CGT GAA TCA GAA GCA AGC AAC T-3\ ktorý obsahuje BamHI reštrikčné miesto, štepiace miesto pre trombín (Chang, Eur. J. Biochem. , 151: 217 (1985) a nukleotidy 109 až 127 SEQ ID NO: 1. Vzniknutý PCR produkt je trávený BamHI a EcoRI a je insertovaný do pGEX-3X plasmidu tráveného BglII a EcoRI.

Ošetrenie rekombinantného fúzneho proteinu trombínom alebo faktorom Xa (Pharmacia, Piscataway, NJ) by malo štiepiť fúzny protein za uvoínenia chemokinu z GST časti. pGEX-3X/Exodus konštrukt je transformovaný do E. coli XL-1 Blue buniek (Stratagene, La Jolla, CA) a jednotlivé transformanty boli izolované a kultivované. Plasmidová DNA z jednotlivých transformantov je prečistená a čiastočne sekvencovaná za použitia automatizovaného sekvenátora pre potvrdenie prítomnosti požadovaného insertu Exodus génu v správnej orientácii.

Indukcia GST/Exodus fúzneho proteínu je dosiahnutá kultiváciou transformovanej XL-1 Blue kultúry pri 37 °C v LB médiu (doplnenom karbencilínom) do optickej denzity 0,4 pri vlnovej dĺžke 600 nm, nasledované ďalšou inkubáciou po dobu 4 hodín za prítomnosti 0,5 mM isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Fúzny protein, od ktorého sa očakáva, že bude produkovaný ako nerozpustné inklúzne telieska v baktériách, môže byť prečistený nasledujúcim spôsobom. Bunky sú zberané centrifugáciou; premyté 0,15 M NaCl, 10 nM Tris, ph 8, 1 mM EDTA; a sú ošetrené 0,1 mg/ml lysozymu (Sigma Chemical Co.) po dobu 15 minút pri izbovej teplote. Lyzát je prejasnený sonikáciou a bunková drt je peletovaná centrifugáciou po dobu 10 minút pri 12000 x g. Peleta obsahujúca fúzny protein je resuspendovaná v 50 mM Tris, ph 8 a 10 mM EDTA, prevrstvená na 50% glycerol a centrifúgovaná po dobu 30 minút pri 6000 x g. Peleta je resuspendovaná v štandardnom fosfáte pufrovanom salinickom roztoku (PBS) bez Mg⁺⁺ a Ca⁺⁺. Fúzny protein je dalej prečistený frakcionáciou resuspendovanej pelety v denaturačnom SDS polyakrylamidovom gele (Sambrook et al., vyššie). Gel je namočený v 0,4 M KC1 na vizualizáciu proteínu, ktorý je excidovaný a elektroeluovaný v gélom prechádzajúcom pufre bez SDS. Pokiaľ je GST/Exodus fúzny protein produkovaný v baktériách ako rozpustný protein, potom môže byť prečistený za použitia GST Purification Module (Pharmacia Biotech).

Fúzny protein môže byť podrobený tráveniu trombínom na odštiepenie GST zo zrelého Exodus proteínu. Tráviaca reakcia (20 - 40 μg fúzneho proteínu, 20 - 30 jednotiek ľudského trombínu (4000 U/mg (Sigma) v 0,5 ml PBS)) je inkubovaná 16 - 48 hodín pri izbovej teplote a je zavedená na denaturujúci SDS-PAGE gel na frakcionáciu produktov reakcie. Gel je namočený do 0,4 M KC1 na vizualizáciu proteínových pásikov. Identita proteínového pásika odpovedajúceho očakávanej molekulárnej hmotnosti Exodus môže byť potvrdená čiastočnou analýzou aminokyselinovej sekvencie za použitia automatizovaného sekvenátora (Applied Biosystem Model 473A, Foster City, CA).

Alternatívne, DNA sekvencia kódujúca predpokladaný zrelý Exodus protein môže byť klonovaná do plasmidu obsahujúceho požadovaný promotor a, voliteľne, leaderovú sekvenciu (viď napríklad Better et al., Science, 240: 1041 - 43 (1988)). Sekvencia tohto konštruktu môže byť potvrdená automatizovaným sekvencovaním. Plasmid je potom transformovaný do E. coli kmeňa MC1061 za použitia štandardných postupov využívajúcich CaCl₂ inkubáciu a ošetrenie baktérií tepelným šokom (Sambrook et al., vyššie). Transformované baktérie sú kultivované v LB médiu doplnenom karbencilínom a produkcia exprivovaného proteínu je indukovaná rastom vo vhodnom médiu. Pokial je prítomná, potom bude leader sekvencia spôsobovať sekréciu zrelého Exodus proteínu a bude štiepená behom sekrécie.

Secernovaný rekombinantný proteín je prečistený z bakteriálneho kultivačného média metódou popísanou vyššie v príklade 4 alebo napríklad adaptovaním metód, popísaných skôr, na prečistenie rekombinantne produkovaného RANTES chemokinu (Kuna et al., J. Immunol., 149: 636 - 642)), MGSA chemokinu (Horuk et al., J. Biol. Chem., 268: 541 - 46 (1993)) a IP-10 chemokinu (exprivovaného v hmyzích bunkách) (Sarris et al., J. Exp. Med., 178: 1127 - 1132 (1993)).

Príklad 6 a

Rekombinantná produkcia Exodusu v kvasinkách alebo v bunkách bezobratlovcov

Príkladný protokol pre rekombinantnú expresiu Exodusu v kvasinkách alebo v bunkách od bezobratlovcov a prečistenie vzniknutého produktu nasleduje.

Kódujúci región Exodus cDNA je amplifikovaný PCR. DNA kódujúca kvasinkovú pre-pro-alfa leader sekvenciu je amplifikovaná z kvasinkovej genómovej DNA v PCR reakcii za použitia primeru obsahujúceho nukleotidy 1 - 20 génu pro alfa množiaci faktor a iného primeru komplementárneho k nukleotidom 255 - 235 toohoto génu (Kurjan and Herskowitz,

Celí, 30: 933 - 943 (1982)). Fragmenty pre-pro-alfa leader sekvencie a Exodus kódujúce sekvencie sú ligované do plasmidu obsahujúceho promotor kvasinkovej alkoholdehydrogenázy (ADH2), takže promotor riadi expresiu fúzneho proteínu skladajúceho sa z pre-pro-alfa faktora * fúzovaného zo zrelým Exodus polypeptidom. Ako uvádza Rose and Broach, Meth. Enz., 185: 234 - 279, D. Goeddel, vyd., ^fc Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990), vektor dalej obsahuje ADH2 transkripčný terminátor downstream od klonovacieho miesta, kvasinkový 2-mikrón zdroj replikácie, kvasinkový leu-2d- gén, kvasinkové REP1 a REP2 gény, E. coli beta-lakmasový gén a E. coli zdroj replikácie. Beta-lakmasa a leu-2d gény umožňujú selekciu v baktériách a v kvasinkách, v príslušnom poradí. Leu-2d gén taktiež ulahčuje zvýšenie počtu kópií plasmidu v kvasinkách pre indukciu vyšších hladín expresie. REP1 a REP2 gény kódujú proteíny zahrnuté v regulácii počtu kópií plasmidu.

Λ * DNA konštrukt popísaný v predošlom odstavci je transformovaný do kvasiniek za použitia známych metód, napr. ošetrenie octanom líthnatým (Stearns et al., Meth. Enz., vyššie, str. 280 - 297). ADH2 promotor je indukovaný po vyčerpaní glukózy v kultivačnom médiu (Price et al., Gene, 55: 287 (1987)). Pre-pro-alfa sekvencia spôsobuje sekréciu fúzneho proteínu z buniek. Súčasne kvasinkový KEX2 protein štiepi pre-pro sekvenciu zo zrelého Exodus chemokinu (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5330 - 5334 (1984)).

Alternatívne je Exodus rekombinantne exprivovaný v kvasinkách za použitia komerčne dostupného expresného systému, napr. Pichia Expression Systém (Invitrogen, San Diego, CA), podľa návodu výrobcu. Tento systém taktiež využíva pre-pro-alfa sekvenciu na riadenie sekrécie, ale transkripcia insertu je riadená alkoholoxidasovým (A0X1) promotorom po indukcii methanolom.

Secernovaný rekombinantný Exodus je prečistený z kvasinkového kultivačného média napríklad metódami použitými pre prečistenie Exodusu zo supernatantov bakteriálnych a cicavčích buniek (viď príklady 4 a 5 vyššie).

Alternatívne je cDNA kódujúca Exodus klonovaná do bakulovirového expresného vektora pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Tento vektor obsahujúci Exodus je potom použitý podľa návodu výrobcu (PharMingen) na infekciu buniek Spodoptera frugiperda v sF9 bezproteinového média a na produkciu rekombinantného proteínu. Proteín je prečistený a koncentrovaný z média za použitia heparin-Sepharosovej kolóny (Pharmacia, Piscataway, NJ) a sekvenčných kolón delených podľa molekulovej hmotnosti (Amicon, Beverly, MA) a je resuspendovaný v PBS. SDS-PAGE analýza ukazuje jediný prúžok a potvrdzuje veľkosť proteínu a Edmanové sekvencovanie na Porton 2090 Peptide Sequencer potvrdzuje jeho N-koncovú sekvenciu.

Príklad 7

Produkcia analógií Exodusu

Rekombinantné techniky ako sú tie, ktoré sú popísané v predchádzajúcich príkladoch môžu byť použité na prípravu analógií Exodus polypeptidu. Presnejšie, polynukleotidy kódujúce Exodus sú modifikované tak, aby kódovali požadované polypeptidové analógie za použitia dobre známych techník, napr. miestne riadenej mutagenézy a polymerasovej reťazovej reakcie. Viď všeobecne Sambrook et al., vyššie, kapitola 15. Modifikované polynukleotidy sú exprivované rekombinantne a rekombinantne polypeptidové analógie sú prečistené tak, ako je popísané v predchádzajúcich príkladoch.

Zvyšky kritické pre aktivitu Exodusu sú identifikované, napríklad podlá homológie s inými C-C chemokinmi a substitúciou alanínov za nativné aminokyselinové zvyšky Exodusu. Cysteiny sú často zásadné pre funkčnú integritu proteínov, vzhladom k ich kapacite tvoriť disulfidové väzby. Na určenie toho, či akýkoľvek zo štyroch cysteinov v Exoduse je zásadný pre enzymatickú aktivitu je každý cystein mutovaný jednotlivo na serín.

Iné príklady analógií zahŕňajú substitúcie v aminokyselinovej sekvencií Exodusu navrhnuté na spôsobenie vyššej homológie s chemokinmi, s ktorými je najbližším príbuzným. Substitúcie navrhnuté na spôsobenie vyššej homológie s rodinou C-C chemokinov zahŕňajú nahradenie alanínu v pozícii 31 sekvencie zrelého proteinu threonínom alebo nahradenie fenylalanínu v pozícii 26 tyrosínom. Iné substitúcie, ktoré spôsobia vyššiu homológiu s ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ a RANTES zahŕňajú nahradenie zvyškov 1 - 8 Exodusu zvyškami 1-10 ΜΙΡ-Ια alebo zvyškami 1-9 RANTES, nahradenie leucínu v pozícii 11 fenylalanínom, nahradenie glycínu v pozícii 12 serínom, nahradenie glycínu v pozícii 25 kyselinou glutamovou, nahradenie kyseliny glutamovej v pozícii 36 serínom, nahradenie serínu v pozícii 46 glutamínom, nahradenie isoleucínu v pozícii 60 tyrosínom a nahradenie serínu v pozícii 67 kyselinou asparágovou. Tieto substitúcie môžu byt prevedené jednotlivo alebo v akýchkolvek kombináciách a očakáva sa, že by mali mat potenciál pre zvýšenie aktivity Exodusu pri myelosupresii alebo pri inhibícii produkcie HIV.

Ďalšie substitúcie navrhnuté na zvýšenie vlastností aminokyselín v danej pozícii (napr. pokial je aminokyselina hydrofóbna, potom substitúcia je viac hydrofóbna) môžu taktiež zvyšovat aktivity Exodusu: nahradenie asparagínu v pozícii 6 kyselinou asparágovou, nahradenie leucínu v pozícii 18 izoleucínom, nahradenie glutamínu v pozícii 29 kyselinou glutamovou, nahradenie asparagínu v pozícii 38 kyselinou asparágovou, nahradenie valínu v pozícii 50 isoleucínom a nahradenie glutamínu v pozícii 56 kyselinou glutamovou. Tieto substitúcie môžu byt prevedené jednotlivo alebo v akýchkolvek kombináciách.

C-koncové delécie sú pripravené, napríklad trávením 3 konca kódujúcej sekvencie pre Exodus exonukleázou III po rôznu dobu a potom ligáciou skrátenej kódujúcej sekvencie do plasmidovej DNA kódujúcej stop kodon vo všetkých čítacích rámikoch. N-koncové delécie sú pripravené podobným spôsobom trávením 5' konca kódujúcej sekvencie a potom ligáciou trávených fragmentov do plasmidu obsahujúceho promotorovú sekvenciu a iniciačný methionin bezprostredne upstream od miesta promotora. Tieto N-koncové delečné analógie môžu byt taktiež exprivované ako fúzne proteíny.

Alternatívne, analógie Exodus polypeptidu môžu byt taktiež pripravené chemickou syntézou peptidov za použitia techník, ktoré boli úspešne použité pri produkcii iných chemokinov ako je IL-8 (Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem., 266: 23128 - 34 (1991)) a MCP-1. Také metódy sú výhodné vzhladom k ich rýchlosti, sú spolahlivé pre krátke sekvencie ako sú chemokiny a umožňujú selektívne vkladanie nových, neprirodzených aminokyselín a iných chemických modifikácií.

Vlastnosti analógií Exodusu na jednom alebo viacerých typoch buniek

T-lymfocytoch, obsiahnutých monocytoch, v zápalovom procese (napr. makrofázach, bazofíloch, neutrofÍloch, žírnych bunkách, endoteliálnych bunkách, epiteliálnych bunkách a iných) sú testované v odbore známymi technikami, ktoré boli použité pre testovanie takýchto vlastností množstva iných chemokinov. Vlastnosti analógií Exodusu z híadiska inhibície myeloproliferácie a produkcie HIV sú taktiež testované podía príkladu 10 a 11, ďalej.

Príklad 8

Príprava protilátok k Exodusu

Chemokin Exodus bol syntetizovaný chemicky v podstate takým spôsobom, ako je popísané v príklade 7. Pre uskladnenie bol Exodus riedený v RPMI médiu obsahujúcom 1% hovädzí sérový albumín (Sigma, St. Louis, MO). Exodus bol potom prečistený z média prechodom cez Heparin Sepharose CL-6B kolónu (Pharmacia, Piscataway, NJ). Kolóna bola premytá roztokom 0,2 M NaCl a 20mM Tris, ph 7,5 a chemokin bol eluovaný 0,6 M NaCl a 20 mM Tris, ph 7,5.

Pre vývoj polyklonálneho antiséra bolo 50 μς Exodusu emulsifikovaných vo Freundovom kompletnom adjuvans pre imunizáciu králikov. V intervaloch 21 dní bolo 50 μg Exodusu emulsifikovaných vo Freundovom nekompletnom adjuvans pre dosyťovacie dávky. Toto antisérum rozpoznáva chemicky syntetizovaný Exodus a Exodus odvodený od CHO buniek (pripravený ako je popísané v príklade 4) vo Western blote.

Pre vývoj monoklonáIných protilátok k Exodusu je myši injikovaný periodicky rekombinantný Exodus (napríklad 10 - 20 μ9 emulsifikovaných vo Freundovom nekompletnom adjuvans) získaný ako je popísané v ktoromkolvek z príkladov 3 až 7. Myši je podané konečné pre-fúzne dosýtenie Exodusu v PBS a o štyri dni neskôr je myš utratená a je odobratá slezina. Slezina je umiestnená v 10 ml RPMI 1640 bez séra a jednotlivá bunková suspenzia je vytvorená rozdrvením sleziny medzi zmrazenými koncami dvoch sklenených mikroskopických sklíčok ponorených do RPMI 1640 bez séra, doplneného o 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvatu sodného, 100 jednotiek/ml penicilínu a 100 μg/ml streptomycínu RPMI (Gibco, Canada). Bunková suspenzia je filtrovaná cez sterilný Nitex bunkový filter so 70-sitom (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) a je dvakrát premytá centrifugáciou pri 200 g po dobu 5 minút a resuspendovaním peliet v 20 ml RPMI bez séra. Splenocyty pripravené z troch naivných Balb/c myší sú pripravené podobným spôsobom a sú použité ako kontrola. NS-1 myelómové bunky, udržiavané v log fáze v RPMI s 11% fetálnym hovädzím sérom (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) po dobu troch dní pred fúziou, sú centrifugované pri 200 g po dobu 5 minút a peleta je dvakrát premytá ako bolo popísané v predchádzajúcom odstavci.

x 10⁸ buniek sleziny sa kombinovalo s 2,0 x 10⁷ NS-1 buniek a centrifugovalo a supernatant bol aspirovaný. Bunková peleta sa vytlačí odčerpaním tuby a 1 ml 37 °C PEG 1500 (50% v 75 mM Hepes, ph 8,0) (Boehringer Mannheim) sa pridá počas miešania v priebehu 1 minúty a potom nasleduje ml RPMI bez

RPMI a bunky sú centrifugované pri odstránení supernatantu ml RPMI obsahujúcom 15% 0,4 μΜ thymidinu (HAT) (Boehringer Mannheim) a 10 Corning 96 dnom (Corning, pridanie 7 ďalších 8 ml dobu 10 minút. Po resuspendovaná v 200 hypoxantínu sodného, jednotiek/ml IL-6 splenocytov/ml a umiestnia sa na tkanivové kultivačné platne s plochým New York).

séra v priebehu 7 minút. Pridá sa

200 je FBS, (Gibco), 25 x 10⁶ jamkové Corning x g po peleta 100 μΜ

1,5

V dňoch 2, 4 a 6 po fúzii sa 100 μΐ média odoberie z jamiek fúznych platní a nahradí sa čerstvým médiom. V deň 8 sa fúzia vyšetruje ELISA testovaním na prítomnosť myších IgG viazajúcich sa na Exodus nasledujúcim spôsobom. Immulon 4 platne (Dynatech, Cambridge, MA) sú potiahnuté po dobu 2 hodín pri 37 °C 100 ng/jamku Exodusu riedeného v 25 mM Tris, ph 7,5. Poťahovací roztok je aspirovaný a pridá sa 200 μΐ/jamku blokovacieho roztoku (0,5% rybia kožná želatína (Sigma) riedená v CMF-PBS) a inkubuje sa po dobu 30 minút pri 37 °C. Platne sú trikrát premyté PBS s 0,05% Tween 20 (PBST) a pridá sa 50 μΐ supernatantu. Po inkubácii pri 37 °C po dobu 30 minút a po premytí ako je uvedené vyššie sa pridá 50 μΐ kozieho anti-myšieho IgG(fc) konjugovaného s chrenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) riedeného 1:3500 v PBST. Platne sú inkubované ako je uvedené vyššie, premyté štyrikrát v PBST a pridá sa 100 μΐ substrátu skladajúceho sa z 1 mg/ml o-fenylendiaminu (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H₂O₂ v 100 mM citrátu, ph 4,5. Farebná reakcia sa ukončí po 5 minútach pridaním 50 μΐ 15% H₂SO₄. A_49o sa číta na čítačke platní (Dynatech).

Selektované fúzne jamky sú klonované dvakrát riedením do 96 jamkových platní na jamku po 5 dňoch.

a vizuálnym skórovaním počtu kolónií Monoklonálne protilátky produkované hybridómmi sú izotypované za použitia Isotrip systému (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN).

Príklad 9

Účinok Exodusu na chemotaxiu monocytov

Aktivita Exodusu bola hodnotená v testoch chemotaxie prevedených tak, ako to skôr popísal Martinet

Immunol. Meth., 174: 209, 1994 a Keller et al., 1972. Dvadsať ml periférnej dobrovolníkov

J. Immunol

Meth., 1: 165, odobratých hepar in i z ovaných a potom prekrytá krvi bolo od zdravých skúmavkách v 10 ml

Krv bola riedená 1:1 s PBS ml Histopaque (Sigma). Po centrifugácii pri 400 g po dobu 25 minút boli bunky na rozhraní odobrané a dvakrát premyté v PBS. Bunky boli resuspendované v DMEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) s 100 U/ml penicilínu a 100 μg/ml streptomycínu (tkanivové kultivačné antibiotiká, Life Technologies) v koncentrácii 10⁶/ml. Bol pridaný sterilný hovädzí sérový albumín do konečnej koncentrácie 0,2 mg/ml.

100 μΐ tejto bunkovej suspenzie bolo pridaných do každej medzijamkovej spojky (Costar). DMEM s antibiotikami a 0,2% BSA s alebo bez čistého syntetického Exodusu bolo pridané do spodných jamiek 24 jamkovej platne. Všetky koncentrácie Exodusu boli prevedené trojito. Medzijamkové spojky boli umiestnené do spodných jamiek a inkubované pri 37 °C po dobu 90 minút. Po dokončení inkubačnej doby boli spojky odstránené a koniec filtra bol oškrabaný gumenou tyčinkou na odstránenie adherentných buniek. Celá spojka bola potom farbená Wright-Giemsou. Bunky adherujúce na spodný povrch spojky a tie, ktoré migrovali do spodnej jamky boli počítané v troch plnohodnotných poliach a boli zrátané spolu na získanie celkového počtu migrujúcich buniek.

Prečistený syntetický Exodus bol testovaný v koncentráciách 5, 50 a 500 ng/ml. Pre porovnanie bol ΜΙΡ-Ια testovaný v koncentrácii 833 ng/ml. Kontrola neobsahovala žiadny chemokin. Výsledky sú ukázané na obrázku 1. Hodnoty predstavujú priemer dvoch pokusov prevedených trojito, plus alebo mínus štandardná odchýlka. Hviezdičky predstavujú štatisticky signifikantné rozdiely od kotrol p < 0,05 za použitia nepárovaného Student's t-testu.

Tieto výsledky ukazujú, že Exodus stimuloval chemotaktickú aktivitu normálnych ľudských mononukleárnych buniek periférnej krvi, ako je merané medzijamkovou migráciou. Najvyššia koncentrácia Exodusu stimulovala chemotaxiu účinnejšie ako najúčinnejšia koncentrácia ΜΙΡ-Ια.

Podobné výsledky boli získané s Exodus proteínovým produktom, čo bol Exodus s ďalším alanínom po zvyšku 4.

Príklad 10

Účinok Exodusu na proliferáciu myeloidných buniek

A. Účinok na myeloidné progenitorové bunky

Účinok Exodus proteínového produktu na tvorbu hematopoetických kolónií bol testovaný v podstate tak, ako už bolo skôr popísané, napr. v Broxmeyer et al., Blood, 76: 1110 (1990). Bunky kostnej drene boli odobraté od ludských darcov po získaní informovaného súhlasu. Bunky ľudskej kostnej drene v nízkej hustote 5 x 10⁴/ml boli umiestnené v 1% methylcelulóze v Iscovom modifikovanom esenciálnom médiu (Biowhitaker, Walkersville, MD) doplnenom 30% FCS (Hyclone), rekombinantným ľudským erytropoetinom (EPO, 1 U/ml, Amgen, Thousand Oaks, CA), rekombinantným ľudským interleukinom 3 (IL-3, 100 U/ml, Immunex, Seattle, WA) a rekombinantným ľudským faktorom kmeňových buniek (SCF, 50 ng/ml, Amgen) na analýzu na kolónie tvoriace celky granulocytov/makrofágov (CFU-GM), na kolónie tvoriace celky granulocytov/erytrocytov makrofágov/megakaryocytov (CFU-GEMM) alebo na blasty tvoriace celky - erytrocyty (BFU-E). Kultúry boli inkubované pri 5% C0₂ a nízkom tlaku kyslíka (5%) po dobu 14 dní a potom boli hodnotené na tvorbu kolónií za použitia inverzného mikroskopu slepým spôsobom. Pokusy boli prevedené aspoň dvakrát v trojitom prevedení.

Rôzne množstvá supernatantu COS buniek obsahujúceho Exodus, pripraveného ako je popísané v príklade 3, vyššie, boli testované v tomto teste, rovnako ako ΜΙΡ-Ια (R&D Systems, Minneapolis, MN) v koncentrácii 50 ng/ml. Výsledky sú ukázané v tabuľke 1, ďalej, a ukazujú priemerný počet hematopoetických progenitorových kolónií na platňu, plus alebo mínus štandardná odchýlka.

Tabuľka 1

Chemokin v médiu	CFU-GM	BFU-E	CFU-GEMM
Kontrola (bez chemokinu)	53 ± 8	56 ± 8	24 ± 5
ΜΙΡ-Ια 50 ng/ml	23 ± 4	37 ± 3*	12 ± 1*
Exodus supernatant COS buniek (0,2 ml v 2 ml celkového média)	21 ± 3	29 ± 2*	11 ± 1*
Exodus supernatant COS buniek (0,1 ml v 2 ml celkového média)	24 ± 4*	27 ± 5*	11 ± 2
Exodus supernatant COS buniek (0,05 ml v 2 ml celkového média)	23 ± 5*	36 ± 3*	14 ± 1
Exodus supernatant COS buniek (0,025 ml v 2 ml celkového média)	47 + 8	58 ± 6	24 ± 1
Iba pECE supernatant COS buniek (0,2ml v 2 ml celkového média)	50 ± 6	60 ± 7	23 ± 3

* p < 0,005 (iné hodnoty nie sú signifikantne odlišné od kontroly alebo pECE pri p < 0,05)

Exodus v supernataňte COS buniek inhiboval tvorbu kolónií hematopoetických progenitorov spôsobom závislým na dávke o niečo menej účinnejšie než maximálna dávka ΜΙΡ-Ια. Nebol tu žiadny štatistický rozdiel medzi COS bunkovým médiom samotným a médiom z COS buniek, ktoré boli transfektované prázdnym pECE expresným vektorom. Pri 50 ng/ml rekombinantného ľudského ΜΙΡ-Ια, čo je dávka, pri ktorej je biologický účinok v plató, tu bola štatisticky signifikantná redukcia ako u CFU-GM (43% kontrolného média), BFU-E (60% kontroly), tak CFU-GEMM (50% kontroly). Pri najvyšších koncentráciách rekombinantného Exodusu použitých v týchto pokusoch tu bolo taktiež štatistické signifikantné zníženie ako CFU-GM (42% kontroly), BFU-E (48% kontroly) tak CFU-GEMM (48% kontroly).

Táto inhibícia Exodusom bola závislá na dávke v tom, že tri najvyššie hladiny Exodusu vykazovali inhibíciu proliferácie hematopoetických progenitorov ako je merané testom tvorby kolónií. Avšak, najnižšie použité koncentrácie Exodusu nevykazovali žiadnu takúto inhibíciu. Podobne ako ΜΙΡ-Ια inhibuje Exodus progenitory viacúrovňovým spôsobom.

Prečistený syntetický Exodus bol taktiež testovaný v tomto teste. Výsledky sú ukázané v tabulke 2, ďalej, a ukazujú priemerný počet hematopoetických progenitorových kolónií na platňu, plus alebo mínus štandardná odchýlka.

Tabuľka 2

Koncentrácia chemokinu v médiu	CFU-GM	BFU-E	CFU-GEMM
Kontrola (bez chemokinu)	85 ± 3	97 ± 4	39 ± 3
Exodus (200 ng/ml)	43 ± 11	43 ± 2	19 ± 3
Exodus (200 ng/ml)	39 ± 3	41 ± 2	20 ± 2
Exodus (200 ng/ml)	42 ± 10	42 ± 3	17 ± 2
Exodus (200 ng/ml)	41 ± 2	50 ± 2	20 ± 4
Exodus (200 ng/ml)	51 ± 3	70 ± 10	27 ± 1
Exodus (200 ng/ml)	64 ± 8	87 ± 3	32 ± 2
ΜΙΡ-Ια (100 ng/ml)	41 ± 2	44 ± 3	19 ± 2
IL-8 (100 ng/ml)	42 ± 2	44 ± 2	19 ± 2
PF-4 (100 ng/ml)	42 ± 4	44 ± 5	19 ± 1
RANTES (100 ng/ml)	81 ± 7	99 ± 4	37 + 1
NAP-2 (100 ng/ml)	83 ± 2	93 ± 3	39 ± 4

Bola tu štatisticky významná (Študent's T-test) redukcia v tvorbe kolónií všetkých troch typov pri koncentráciách Exodusu pod 25 ng/ml (p < 0,005). Prečistený syntetický Exodus sa choval rovnako ako Exodus v supernatantoch COS buniek. Obidva zdroje Exodusu sú účinné v inhibícii proliferácie progenitorov hematopoetickej drene aspoň rovnako dobre, ak nie lepšie, ako ΜΙΡ-Ια.

Obdobné výsledky ukazujuce inhibiciu proliferácie hernátopoetických progenitorov, tvorby kolónií, boli získané Exodus proteínovým produktom, alanínom po zvyšku 4.

ako boli merane testami s prečisteným syntetickým čo bol Exodus s ďalším

Tieto výsledky ukazujú, že Exodus proteínový produkt inhiboval proliferáciu hematopoetických progenitorov. Okrem toho, Exodus proteínový produkt bol rovnako účinný ako ΜΙΡ-Ια. Toto naznačuje, že Exodus proteínový produkt bude užitočný ako fázovo špecifické chemoprotektívne činidlo.

Ďalšie pokusy potvrdili účinnosť Exodus proteínového produktu in vivo na hematopoéze u myší. Pokusy boli prevedené v podstate tak, ako popísal Broxmeyer et al., Ann. Hematol., 71: 235 - 246, 1995, za použitia neošetreného syntetického Exodusu a Exodusu ošetreného 30% acetonitrilu/ 1% kyseliny trifluoroctové (ACN) ako je popísané v Mantel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2232 - 2236 (1993). U chemokinov, ktoré existujú v roztoku ako multimery stimuluje ošetrenie ACN tvorbu monomérov, ktoré sú aktívnou formou in vivo, a tak zvyšuje aktivitu chemokinu. Chemokiny ošetrené ACN môžu byť aktívne v koncentráciách 200-krát nižších než neošetrené chemokiny.

Stručne, roztoky neošetreného Exodusu alebo ACN-ošetreného Exodusu boli pripravené v koncentráciách od 0,001 do 50 ng/ml Exodusu. ACN-ošetrené alebo neošetrené riedidlo slúžilo ako kontrola na dôkaz toho, že ACN nie je toxický. Normálnym C3H/HeJ myším bola injikovaná dávka 0,2 ml každého roztoku a myši boli utratené po 24 hodinách. Z ich femorov boli získané neseparované bunky kostnej drene a boli umiestnené bud' na agar s kondiciovaným médiom pre myšie slezinné bunky s 10% objem/objem mitogénom z líčidla amerického (PWMSCM) na hodnotenie CFU-GM, alebo na methylcelulózu s ľudským erytropoetínom (Epogen^R, Amgen, Thousand Oaks, CA), PWMSCM a hernín (Eastman Kodak Co., Rochester, NY) na hodnotenie BFU-E/CFU-GEMM. Počet kolónií bol určený po siedmych dňoch inkubácie v zvlhčenom prostredí v ESPEC N2-O2-CO2 inkubátore BNP-210 (Taboi ESPEC Corp., South Planfield, NJ) v 5% C0₂ a 5% 0₂. Výsledky sú ukázané na obrázku 2.

Výsledky ukázali, že neošetrený Exodus redukoval tvorbu CFU-GM kolónií na priemerne 56% voči kontrole pri injekcii jednej dávky 0,2 ml 25 ng/ml Exodusu. ACN-ošetrený Exodus redukoval tvorbu CFU-GM kolónií na priemerne 53% voči kontrole pri injekcii jednej dávky 0,2 ml 0,1 ng/ml Exodusu. Inhibícia in vivo tvorby CFU-GM indukovaná ako ACN-ošetreným, tak neošetreným Exodusom bola štatisticky významná pri p < 0,05.

V inom pokuse bol účinok neošetreného Exodusu na in vivo cyklus hematopoetických progenitorov hodnotený za použitia zabíjacieho testu s tritiovaným thymidínom ako ho popísal Broxmeyer et al., Ann. Hematol., vyššie, a Mantel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vyššie. Stručne, myši boli ošetrené rôznymi koncentráciami neošetreného Exodusu (0,5, 1 alebo 10 ng/ml) samého alebo v kombinácii s ďalšími neošetrenými chemokinmi (Exodus v koncentrácii 0,01 alebo 0,1 ng/ml buď s MCP-1 alebo MIG v koncentrácii 0,01 alebo 0,1 ng/ml). Zvieratá boli potom po 24 hodinách utratené a bola odobratá kostná dreň na zabijaci test s tritiovaným thymidínom. Keďže bunky v S-fáze bunkového cyklu preferenčne vychytávajú thymidín, sú zabíjané týmto vychytávaním tritiovaného thymidínu, zatiaľ čo bunky, ktoré nie sú v S-fáze, sú nepoškodené. Počet buniek v S-fáze je hodnotený počtom usmrtených buniek, vzhľadom ku kontrolnému počtu kolónií buniek, ktoré neboli ošetrené tritiovaným thymidínom. Hodnoty sú vyjadrené ako percento progenitorov v S-fáze a sú normalizované na celkový počet progenitorov na femor. Výsledky pre CFU-GM sú vyjadrené na obrázku 3.

Výsledky ukazujú, že signifikantne redukuje v S-fáze bunkového cyklu jedna injekcia 10 ng/ml Exodusu percento CFU-GM progenitorov na priemerne 4% (p < 0,001), v porovnaní s priemernou hodnotou 56% CFU-GM v S-fáze. Okrem toho, Exodusom indukovaná inhibícia progresie bunkového cyklu pre CFU-GM bola synergná s ošetrením MCP-1 a MIG. Pokiaľ boli veľmi nízke koncentrácie Exodusu injikované s MIG alebo MCP-1, potom tu bola vyššia redukcia CFU-GM v S-fáze. Tak môže kombinácia chemokinov produkovať účinnejšiu inhibíciu hematopoézy.

Tieto výsledky naznačujú, že Exodus môže prechodne zastaviť progresiu bunkového cyklu progenitorových buniek kostnej drene, a preto môže byť použitý na ochranu normálnej kostnej drene pred cytotoxickou chemoterapiou v S-fáze.

B. Účinok na myeloidné bunkové línie

Účinok Exodus proteínových produktov na proliferáciu myeloidných bunkových línií závislých na cytokinoch bol taktiež testovaný, ikidské myeloidné bunkové línie TF-1 a MO7E (Avanzi et al., Brit. J. Hematol., 69: 359 (1988)) vyžadujú GM-CSF pre maximálnu proliferáciu. Primitívne bunkové línie akútnej myeloidnej leukémie závislé na cytokinoch TF-1 a M07E (obe dary od Dr. Hal Broxmeyer, Indiana University, Indiana) boli kultivované v RPMI médiu 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) plus 10% FCS (Hyclone), 100 U/ml penicilínu a 100 μg/ml streptomycínu (tkanivové kultivačné antibiotiká, Life Technologies, Gaithersburg, MD). Toto médium bolo doplnené faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov/makrofágov (GM-CSF, 100 U/ml, Immunex, Seattle, WA) a faktorom kmeňových buniek (SCF, 50 ng/ml, Amgen, Thousand Oaks, CA) pre normálny rast v log fáze.

Exodus v supernatantoch COS buniek pripravený ako je popísané v príklade 3 bol testovaný v konečnom riedení 1/10. Výsledky sú ukázané na obrázku 4 (pre MO7E bunky) a obrázku 5 (pre TF-1 bunky). Keď bol supernatant COS buniek pridaný k MO7E bunkám v log fáze za prítomnosti GM-CSF a SCF, bola proliferácia počas nasledujúcich 72 hodín redukovaná na 10,4% kontroly. Keď bol supernatant COS buniek pridaný k TF-1 bunkám v log fáze, ktoré boli taktiež kontinuálne vystavené GM-CSF a SCF, tak bola proliferácia celkom inhibovaná. Exodus nevykazoval cytotoxické účinky, pretože bunky ošetrené Exodusom mali viac než 95% životaschopnosť v ktoromkolvek časovom bode, ako bolo hodnotené vylučovaním trypanovej modrej a tento výsledok bol zhodný s kontrolnými bunkami.

Prečistený syntetický Exodus taktiež celkom inhiboval proliferáciu MO7E buniek, ako je ukázané na obrázku 6. Každý bod je priemerom štyroch oddelených pokusov. Hviezdičky ukazujú štatistickú významnosť pri p <0,05 za použitia párového t-testu. Životaschopnosť sa taktiež nezmenila po pridaní Exodusu.

Tieto výsledky ukazujú, že Exodus bude taktiež užitočný pri liečbe myeloproliferatívnych ochorení ako je chronická myeloidná leukémia.

C. Účinok na progenitory chronickej myeloidnej leukémie

Účinok Exodusu (taktiež nazývaného Exodus-1) na proliferáciu progenitorov u chronickej myeloidnej leukémie (CML) bol hodnotený za použitia testov tvorby kolónií ako ich popisuje Hromas et al., Blood, 89: 3315 - 3322 (1997). Stručne, bunky kostnej drene sú odobrané od šiestich pacientov s CML v chronickej fáze. Dreňové bunky v nízkej hustote 5 x 10⁴/ml boli umiestnené v 1% methylcelulóze v Iscovom modifikivanom Dulbeccovom médiu doplnenom 30% fetálnym telacím sérom, 1 U/ml ludského erytropoetínu (Epogen^R, Amgen), 100 U/ml ludského interleukínu (Genetics Inštitúte) a 50 ng/ml ludského faktora kmeňových buniek (Amgen) za prítomnosti alebo za absencie 100 ng/ml Exodusu a za prítomnosti alebo za absencie 100 ng/ml ΜΙΡ-Ια. Kultúry boli inkubované v 5% C0₂ a nízkom (5%) tlaku kyslíku po dobu 14 dní, a potom boli hodnotené za použitia inverzného mikroskopu na CFU-GM, CFU-GEMM a BFU-E. Počet kolónií pre kultúry ošetrené Exodusom alebo ΜΙΡ-Ια bol zrovnaný s počtom kolónií pre kontrolné kultúry a bol vyjadrený ako percento kontrolnej CFU a BFU. Dáta sú ukázané v tabulke 3, ďalej.

Tabuľka 3

Ošetrenie	% kontrolnej CFU-GM	% kontrolnej BFU-E	% kontrolnej CFU-GEMM
100 ng/ml Exodus	52 ± 5*	44 ± 19*	J* 57 ± 6
100 ng/ml ΜΙΡ-Ια	9 ± 3	1 ± 8	3 ± 6

Štatisticky významné (p < 0,05) za použitia párového

Študent t-testu

Tieto dáta ukazujú, že u týchto šiestich pacientov s CML v chronickej fáze Exodus významne inhiboval tvorbu progenitorových kolónií. Exodus bol omnoho účinnejší než ΜΙΡ-Ια v potlačení proliferácie, čo naznačuje, že účinky Exodusu sú sprostredkované receptorom, ktorý ΜΙΡ-Ια neaktivuje.

CML progenitory nadmerne exprivujú BCR-ABL fúzny onkoproteín, konštitutívne aktivujú cytoplazmatickú tyrosín kinázu, ktorá stimuluje proliferáciu. Skutočne, zosilnená expresia BCR-ABL v bunkovej kultúre je transformujúca u mnohých typov buniek, vrátane NIH 3T3 buniek. Účinok Exodusu na progresiu bunkového cyklu progenitorov od troch pacientov v chronickej fáze CML bol ďalej vyšetrovaný za použitia testu zabíjania s tritiovanou thymidín kinázou, ako bol popísaný vyššie. Ošetrenie CML progenitorov Exodusom zastavilo progresiu bunkového cyklu v priemere 55 ± 5% CFU-GM, 45 ± 13% BFU-E a 50 ± 10% CFU-GEMM. Tak bol inhibičný signál Exodusu schopný prekonať agresívny proliferačný signál BCR-ABL v progenitoroch CML.

Tieto výsledky ukazujú, že Exodus potláča hematopoézu a môže byť. účinný pri liečbe CML v chronickej fáze.

Príklad 11

Účinok Exodusu na proliferáciu HIV

Schopnosť Exodus proteínových produktov inhibovať proliferáciu HIV, pokiaľ je meraný HIV produkciou p24 proteínu, bola testovaná za použitia štandardného p24 ELISA testu ako ho skôr popísal Cocchi et al., Science, 270: 1811 (1996). Mononukleárne bunky periférnej krvi od zdravých dobrovoľníkov boli izolované na Ficolovom gradiente. Tieto bunky boli aktivované 1 ng/ml PHA (Sigma, St. Louis, MO) v RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) plus 10% FCS (Hyclone), 100 U/ml penicilínu a 100 gg/ml streptomycínu (tkanivové kultivačné antibiotiká, Life Technologies, Gaithersburg, MD) po dobu 48 hodín pri 37 °C, boli premyté v kompletnom médiu, potom infikované TCID_5o == 5000 HIV kmeňov BAL (z ATCC) alebo A018-H112-2 (z ATCC) po 1 hodinu v kompletnom médiu pri 37 °C. Bunky sa potom trikrát premyjú v médiu po odstránení nadbytku vírusu a resuspendujú sa v koncentrácii 5 x 10⁵ buniek/0,3 ml na test v kompletnom médiu plus rekombinantný ľudský IL-2 (10 ng/ml, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) plus rekombinantný Exodus alebo v supernatantoch pECE transfektovaných COS buniek pre kontrolu. Po šiestich dňoch kultivácie so supernatantmi bez buniek hodnotí sa obsah HIV p24 za použitia enzýmovo viazaného imunoabsorbentného testu (ELISA, Abbott Laboratories, Chicago, IL). Pokusy boli prevedené trojito.

Supernatant COS buniek obsahujúci Exodus v konečnom riedení 1:2 (t.j. 0,15 ml supernatantu COS buniek v celkom 0,3 ml v každej jamke), supernatant COS buniek obsahujúci Exodus v konečnom riedení 1:4, ΜΙΡ-Ια v kocentrácii 625 ng/ml a 1250 ng/ml (stĺpec 1 a stĺpec 2, v príslušnom poradí, na obrázku 7) a supernatant pECE COS buniek (bez

Exodusu) boli merané v deň 6 po infekcii. Výsledky sú ukázané na obrázku 7. ludskej periférnej

Keď boli normálne mononukleárne bunky krvi stimulované PMA infikované mnohonásobne dvoma kmeňmi HIV, bol Exodus schopný signifikantne inhibovať proliferáciu obidvoch kmeňov. V najvyšších použitých koncentráciách rekombinantného Exodusu bola proliferácia HIV kmeňa BAL znížená na 39% vzhladom ku kontrole, zatial čo proliferácia HIV kmeňa A018 bola redukovaná na 27% vzhladom ku kontrole. Táto inhibícia bola menej vyznačená, pokial bola koncentrácia Exodusu redukovaná. Okrem toho, táto inhibícia bola v súlade s inhibíciou pozorovanou pre ΜΙΡ-Ια, ktorý bol použitý v týchto pokusoch ako pozitívna kontrola. Inhibícia spôsobená Exodusom nebola spôsobená cytotoxicitou, pretože tu nebol žiadny rozdiel v životaschopnosti buniek ošetrených Exodusom oproti kontrole.

Podobné výsledky pre prečistený syntetický Exodus proteínový produkt (Exodus s ďalším alanínom po zvyšku 4) v koncentrácii 1 μg/ml a ΜΙΡ-Ια v koncentrácii 1. μg/ml sú ukázané na obrázku 8. Výsledky sú ukázané v deň 3, 6 a 9 po infekcii. V deň 9 po infekcii bol inhibičný účinok Exodusu podobný ako účinok pozorovaný s ΜΙΡ-Ια v rovnakej koncentrácii. V tomto predbežnom pokuse neboli pozorované žiadne účinky tohto Exodus proteínového produktu v koncentráciách menších ako 1 μg/ml.

Tieto výsledky naznačujú, že Exodus proteínové produkty inhibujú proliferáciu HIV a budú preto užitočné v spôsoboch pre zyýšenie rezistencie voči HIV infekcii a v spôsoboch pri liečbe HIV infekcie.

Príklad 12

Testy chemotaxie a vlastnosti aktivácie buniek zprostredkované Exodusom na ludských monocytoch/makrofágoch a na ludských neutrofÍloch

Účinky Exodusu na ludské monocyty/makrofágy a na ludské neutrofily sú hodnotené, napríklad, metódami, ktoré popísal Devi et al., J. Immunol., 153: 5376 - 5383 (1995) na hodnotenie aktivácie neutrofilov a makrofágov indukované myším TCA3. Známky aktivácie merané v takých štúdiách zahŕňajú zvýšenie adhézie na fibrinogén vďaka aktivácii integrinov, chemotaxii, indukcii reaktívnych medziproduktov dusíka, respiračné vzplanutie (produkcii superoxidu a peroxidu vodíka) a exocytózu lyzozýmu a elastázy za prítomnosti cytochalazínu B. Ako uvádza Devi et al., tieto aktivity korelujú s niekolkými štádiami odpovede leukocytov na zápal. Táto odpoveď leukocytov, popísaná Springerom, Celí, 76: 301 - 314 (1994), zahŕňa adhéziu leukocytov na endoteliálne bunky krvných ciev, migráciu cez endotelovú vrstvu, chemotaxiu smerom k zdroju chemokinov a miestne špecifické uvolnenie zápalových mediátorov. Prítomnosť: Exodusu v ktoromkolvek z týchto štádií poskytuje významný ciel pre klinickú intervenciu modulácií zápalovej odpovede.

Príklad 13

In vivo test inhibície rastu nádorov Exodusom

Inhibičné vlastnosti Exodusu pri nádorovom raste sú testované, napríklad, modifikovaným protokolom, ktorý popísal Laning et al., J. Immunol., 153: 4625 - 4635 (1994) pre testovanie vlastností inhibujúcich nádorový rast myšieho TCA3. Exodus kódujúca cDNA je transfektovaná elektroporáciou do bunkovej línie J558 odvodenej od myelómu (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD). Transfektanty sú vyšetrované na produkciu Exodusu štandardnými technikami ako je ELISA (Enzýmovo viazaný imunoadsorbentný test) za použitia monoklonálnej protilátky generovanej proti Exodusu ako je podrobne uvedené v príklade 8. Bolus 10 miliónov buniek z klonu produkujúceho Exodus je injikovaných podkožné do dolného pravého kvadrantu BALB/c myši. Pre porovnanie je 10 milónov netransfektovaných buniek injikovaných kontrolnej myši. Je porovnávaná rýchlosť a frekvencia tvorby nádorov v dvoch skupinách na určenie účinnosti Exodusu v inhibícii rastu nádorov. Charakter bunkového infiltrátu následne asociovaného s nádorovými bunkami je identifikovaný histologickými prostriedkami. Okrem toho, rekombinantný Exodus (20 ng) je zmiešaný s netransfektovanými J558 bunkami a je injikovaný (20 ng/deň) do nádorov odvodených od takých buniek na hodnotenie účinku Exodusu podaného exogénne do nádorových buniek.

Príklad 14

Test intraperitoneálnej injekcie

Bunky, ktoré odpovedejú na Exodus in vivo, sú určené injekciou 1 - 100 ng prečisteného Exodusu do intraperitoneálnej dutiny myši, ako to popisuje Luo et al., J. Immunol., 153: 4616 - 4624 (1994). Po injekcii sú leukocyty izolované z periférnej krvi a z peritoneálnej dutiny a sú identifikované farbením za použitia Diff Quick kitu (Baxter, McGraw, IL). Profil leukocytov je meraný v rôznu dobu pre hodnotenie kinetiky objavovania rôznych typov buniek. V oddelených pokusoch sú neutralizačné protilátky namierené proti Exodusu (príklad 8) injikované spolu s Exodusom pre potvrdenie toho, že infiltrácia leukocytmi je spôsobená Exodusom.

Príklad 15

Test in vivo aktivity - podkožnej injekcie t

Chemotaktické vlastnosti Exodusu sú testované in vivo adaptáciou protokolu, ktorý popísal Meurer et al., J. Exp. Med., 178: 1913 - 1921 (1993). Rekombinantný Exodus (10 500 pmol/miesto) je injikovaný intradermálne vhodnému cicavcovi, napríklad psom alebo králikom. V čase 4 až 24 hodín je histologickými metódami hodnotená bunková infiltrácia miesta injekcie. Prítomnosť Exodusu je potvrdená imunohistochemicky za použitia protilátok proti Exodusu. Charakter bunkového infiltrátu je identifikovaný farbením za použitia Baxter's Diff Quick kitu.

Príklad 16

Klonovanie receptora pre Exodus

DNA kódujúca receptor pre Exodus je klonovaná adaptáciou postupov skôr popísaných na izoláciu génu receptora pre IL-8, v Holmes et al., vyššie, a na izoláciu génu receptora MCP-1, v Charo et al., vyššie.

Je pripravená cDNA knižnica, výhodne z buniek, ktoré odpovedajú na Exodus chemotaxiou a aktiváciou. Rádioaktívne značený Exodus môže byť taktiež použitý na identifikáciu typov buniek, ktoré exprivujú vysoké hladiny receptora pre Exodus. Bunky, ktoré nereagujú na ΜΙΡ-Ια alebo na RANTES, alebo bunky, ktoré vykazujú iný charakter desensitizácie receptora v odpovedi na tieto ligandy, sú obzvlášť predmetom záujmu. Pooly transfektovaných klonov v cDNA knižnici sú vyšetrované na väzbu rádioaktívne značeného Exodusu autorádiograficky. Pozitívne pooly sú následne subfrakciované a znova vyšetrované, až kým nie sú získané jednotlivé pozitívne klony.

Alternatívne môže byť použitá degenerovaná PCR stratégia, v ktorej sú sekvencie PCR primerov založené na konzervovaných regiónoch sekvencií známych receptorov pre chemokiny. Pre zvýšenie šance izolácie receptora pre Exodus môže byť templátová DNA použitá v reakcii cDNA odvodená od typu bunky reaktívnej na Exodus.

Aj keď bol predložený vynález popísaný v zmysle určitých prevedení, malo by byť odborníkom v odbore zrejmé, že môžu existovať variácie a modifikácie. V súlade s tým by sa vynálezu mali týkať iba také obmedzenia, ktoré sú uvedené v pripojených patentových nárokoch.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovatel: Indiana University Foundation (ii) Názov vynálezu: Materiály a spôsoby pre produkciu chemokinu Exodus (iii) Počet sekvencii: 4 (iv) Adresa pre korešpondenciu (A) Adresa: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray &

Brown (B) Ulica: 233 South Wacker Drive/ 6300 Sears Tower (C) Mesto: Chicago (D) Štát: Illinois (E) Krajina: USA (F) ZIP: 60606-6402 (v) Počítačová čítacia forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatabiIný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verše #1.30 (vi) Údaje o súčasnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(C) Klasifikácia:

(vii) Dáta predchádzajúcej prihlášky:

(A) Číslo prihlášky: US 08/749513 (B) Dátum podania: 15.11.1996 (viii) Zástupca/agent informácie (A) Meno: Rin-Laures, Li-Hsien (B) Registračné číslo: 33547 (C) Referencie/číslo registra: 27866/34328 PCT (ix) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón: (312) 474-6300 (B) Telefax: (312) 474-0448 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 821 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kíúč: CDS (B) Umiestnenie: 43...327 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kíúč: mat_peptid (B) Umiestnenie: 109...327 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

GGTACTCAAC ACTGAGCAGA TCTGTTCTTT GAGCTAAAAA

CC ATG TGC TGT ACC Met Cys Cys Thr -22 -20

AAG AGT TTG CTC CTG GCT GCT

TTG ATG Leu Met -10

TCA GTG CTG CTA CTC CAC CTC

102

Lys

Ser Leu Leu -15

Leu

Ala

Ala

Ser

Val

Leu Leu Leu -5

His

Leu

TGC

GGC

GAA

TCA

GAA

GCA

AGC

AAC

TTT

GAC

TGC

TGT

CTT

GGA

TAC

ACA

150

Cys

Gly

Glu

Ser

Glu

Ala

Ser

Asn

Phe

Asp

Cys

Cys

Leu

Gly

Tyr

Thr

-

1

5

10

GAC

CGT

ATT

CTT

CAT

CCT

AAA

TTT

ATT

GTG

GGC

TTC

ACA

CGG

CAG

CTG

198

Asp

Arg

íle

Leu

His

Pro

Lys

Phe

íle

Val

Gly Phe

Thr

Arg

Gin

Leu

15

20

25

30

GCC

AAT

GAA

GGC

TGT

GAC

ATC

AAT

GCT

ATC

ATC

TTT

CAC

ACA

AAG

AAA

246

Ala

Asn

Glu

Gly

Cys

Asp

íle

Asn

Ala

íle

íle

Phe

His

Thr

Lys

Lys

35

40

45

AAG

TTG

TCT

GTG

TGC

GCA

AAT

CCA

AAA

CAG

ACT

TGG

GTG

AAA

TAT

ATT

294

Lys

Leu

Ser

Val

Cys

Ala

Asn

Pro

Lys

Gin

Thr

Trp

Val

Lys

Tyr

íle

50

55

60

v . .

ŕ·

GTG

CGT

CTC

CTC

AGT

AAA

AAA

GTC

AAG

AAC

ATG

TAAAAÄCTGT GCCTTTTCTG

347

Val

Arg

Leu

Leu

Ser

Lys

Lys

Val

Lys

Asn

Met

70

GAATGGAATT	GGACATAGCC	CAAGAACAGA	AAGAACCTTG	CTGGGGTTGG	AGGTTTCACT	407
TGCACATCAT	GGAGGGTTTA	GTGCTTATCT	AATTTGTGCC	TCACCTGGAC	TTGTCCAATT	467
AATGAAGTTG	ATTCATATTG	CATCATAGTT	TGCTTTGTTT	AAGCATCACA	TTAAAGTTAA	527
ACTGTATTTT	ATGTTATTTA	TAGCTGTAGG	TTTTCTGTGT	TTAGCTATTT	AATACTAATT	587
TTCCATAAGC	TATTTTGGTT	TAGTGCAAAG	TATAAAATTA	TATTTGGGGG	GGAATAAGAT	647
TATATGGACT	TTCTTGCAAG	CAACAAGCTA	ΤΤΤΤΤΤΑΑΆΑ	AAAACTATTT	AACATTCTTT	707
TGTTTATATT	GTTTTGTACT	CCTAAATTGT	TGTAATTGCA	TTATAAAATA	AGAAAAATAT	767
TAATAAGACA	AATATTGAAA	ATAAAGAAAC	AAAAAGTTCT	TCTGTTAAAA	AAAA	821

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 95 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Met -22

Cys Cys -20

Thr

Lys

Ser Leu Leu -15

Leu Ala Ala Leu Met -10

Ser Val

Leu

Leu

Leu

His

Leu

Cys

Gly

Glu

Ser

Glu

Ala

Ser

Asn

Phe

Asp

Cys

Cys

-5

1

5

10

Leu

Gly

Tyr

Thr

Asp

Arg

íle

Leu

His

Pro

Lys

Phe

íle

Val

Gly

Phe

15

20

25

Thr

Arg

Gin

Leu

Ala

Asn

Glu

Gly

Cys

Asp

íle

Asn

Ala

íle

íle

Phe

30

35

40

His

Thr

Lys

Lys

Lys

Leu

Ser

Val

Cys

Ala

Asn

Pro

Lys

Gin

Thr

Trp

45

50

55

Val

Lys

Tyr

íle

Val

Arg

Leu

Leu

Ser

Lys

Lys

Val

Lys

Asn

Met

60

65

70

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 26 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: nukleová kyselina (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

GGCGAAGCTT TGAGCTAAAA ACCATG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 26 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: nukleová kyselina (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

GCGGGAATTC TTACATGTTC TTGACT

Claims (28)

1. Patentové nároky

   1. Prečistený polynukleotid kódujúci aminokyselinovú sekvenciu pre Exodus SEQ ID NO: 2.
2. 2. Polynukleotd podlá nároku 1, ktorý je DNA.
3. 3. DNA podlá nároku 2 obsahujúca nukleotidovú sekvenciu skladajúcu sa z nukleotidov 43 až 327 SEQ ID NO: 1.
4. 4. Prečistený polynukleotid kódujúci aminokyseliny 1 až 73 V SEQ ID NO: 2.
5. 5. Polynukleotid podlá nároku 4, ktorý je DNA.
6. 6. DNA podlá nároku 5 obsahujúca nukleotidovú sekvenciu skladajúcu sa z nukleotidov 109 až 327 SEQ ID NO: 1.
7. 7. Vektor obsahujúci DNA podlá nároku 2, 3, 5 alebo 6.
8. 8. Vektor podlá nároku 7, ktorý je expresný vektor, kde je DNA operatívne naviazaná na DNA sekvenciu kontrolujúcu expresiu.
9. 9. Hostitelská bunka stabilne transformovaná alebo transfektovaná DNA podlá nároku 2, 3, 5, alebo 6 spôsobom umožňujúcim expresiu Exodusu v uvedenej hostiteľskej bunke.
10. 10. Spôsob pre produkciu Exodusu vyz načujúci s a t ý m, že obsahuje kultiváciu hostiteľskej bunky podlá nároku 9 v živnom médiu a izoláciu Exodusu z uvedenej hostiteľskej bunky alebo uvedeného živného média.
11. 11. Prečistený polypeptid produkovaný spôsobom podlá nároku 10.
12. 12. Prečistený polypeptid obsahujúci Exodus aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2.
13. 13. Prečistený polypeptid obsahujúci Exodus aminokyseliny 1 až 73 SEQ ID NO: 2.
14. 14. Hybridomná bunková línia produkujúca monoklonálnu protilátku, ktorá je špecificky reaktívna s polypeptidom podlá nároku 15.
15. 15. Monoklonálna protilátka produkovaná hybridomom podlá nároku 14.
16. 16. Spôsob pre zvýšenie rezistencie voči infekcii vírom iudskej imunodeficiencie (HIV) vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje podanie množstva Exodus proteínového produktu účinného pre inhibíciu proliferácie HIV subjektu.
17. 17. Spôsob podlá nároku 16 vyznačujúci sa tým, že subjekt má riziko expozície HIV, bol vystavený HIV alebo bol infikovaný HIV.
18. 18. Spôsob pre liečbu infekcie vírusom Iudskej imunodeficiencie (HIV) vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie množstva Exodus proteínového produktu účinného pre inhibíciu proliferácie HIV subjektu infikovanému HIV.
19. 19. Použitie Exodus proteínového produktu na prípravu lieku pre profylaktickú alebo terapeutickú liečbu HIV infekcie.
20. 20. Použitie podlá nároku 19, kde liek inhibuje proliferáciu HIV.
21. 21. Spôsob pre ochranu progenitorových buniek kostnej drene pred cytotoxickými účinkami vyznačujúci sa tým, že subjektu je podané množstvo Exodus proteínového produktu účinné pre potlačenie proliferácie progenitorových buniek kostnej drene.
22. 22. Spôsob podľa nároku 21 vyznačujúci sa tým, že u subjektu prebieha chemoterapia alebo rádioterapia.
23. 23. Použitie Exodus proteínového produktu pre prípravu lieku na potlačenie proliferácie progenitorových buniek kostnej drene.
24. 24. Spôsob podľa nároku 23 vyznačujúci sa tým, že liek je podaný subjektu, u ktorého prebieha chemoterapia alebo rádioterapia.
25. 25. Spôsob pre liečbu myeloproliferatívnych ochorení vyznačujúci sa tým, že subjektu trpiacemu myeloproliferatívnym ochorením je podané množstvo Exodus proteínového produktu účinné pre potlačenie proliferácie maligných progenitorových buniek kostnej drene.
26. 26. Spôsob podľa nároku 25 vyznačujúci sa t ý m, že myeloproliferatívnym ochorením je chronická myeloidná leukémia, esenciálna trombocytóza, myelofibróza alebo polycythemia vera.
27. 27. Použitie Exodus proteínového produktu pre prípravu lieku pre liečbu myeloproliferatívnych ochorení.
28. 28. Použitie podľa nároku 25, kde myeloproliferatívnym ochorením je chronická myeloidná leukémia, esenciálna trombocytóza, myelofibróza alebo polycythemia vera.