JP2001523977A - Apaf−1、ced−4ヒト相同体、カスパーゼ−3の活性化因子 - Google Patents
Apaf−1、ced−4ヒト相同体、カスパーゼ−3の活性化因子Info
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Abstract
(57)【要約】
アポトーシスを変調可能なApaf-1と命名された新規ポリペプチドが提供される。Apaf-1キメラ、Apaf-1をコードしている核酸、及びApaf-1に対する抗体を含む組成物もまた提供される。
Description
【発明の詳細な説明】
APAF-1、CED-4ヒト相同体、カスパーゼ-3の活性化因子
発明の分野
本発明は、一般に、ここに「Apaf-1」と命名する新規なポリペプチドの
同定、単離、及び組換え生産に関する。
発明の背景 アポトーシス又は「プログラムされた細胞死」
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスによ
り部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞
死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病
理的形態として特性付けられる。これに対して、細胞死の他の「生理的」形態は
通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する。細胞死のこの規則的又は
コントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される(例えば、Bar
rら,Bio/Technology,12:487-493(1994):Stellerら,Science,267:1445-144
9(1995)を参照)。
アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多く
の生理的プロセスにおいて自然に生じる(Itohら,Cell,66:233-243(1991))。
アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、癌、狼瘡、疱疹ウイスル感染を含む種
々の病理的条件に関連している(Thompson,Science,267:1456-1462(1995))。
アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキン
ソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成
性貧血、心筋梗塞、脳卒中、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他
の病理状態に関連している(Thompson,上掲を参照)。
典型的には、アポトーシス性細胞死には、細胞内における一又は複数の特徴的
な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、
核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。アポト
ーシス
の認知された生化学的マーカーはヌクレオソームフラグメントへのクロマチンの
切断である。
様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞
変化を惹起又は誘発すると考えられている(Raff,Nature,356:397-400(1992)
;Steller,上掲;Sachsら,Blood,82:15(1993))。例えば、ホルモンの刺激、
例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長
因子の退薬により惹起され得る(Watanabe-Fukunagaら,Nature,356:314-317(1
992))。また、いくつかの同定された発癌遺伝子、例えばmyc、rel、及び
E1A、及び腫瘍サプレッサー、例えばp53が、アポトーシスを誘発する役割
を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も
同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている(Thompson,上
掲)。アポトーシスは、線虫(C.elegans)のCed-3、CCP32(今はカスパ
ーゼ-3)、ヒトのYama/アポペイン(Apopain)、及びショウジョウバエのD
CP-1を含む、アスパラギン酸残基に対して特異性を有するシステインプロテ
アーゼのファミリーの活性化によってもまた誘発される。これらのプロテアーゼ
はカスパーゼと命名されている(Alnemriら,Ce1l,87:171,(1996))。
アポトーシス誘発性シグナル伝達複合体
現在理解されているように、アポトーシスプログラムは、少なくとも3つの重
要な成分−活性化因子、阻害剤及びエフェクターを含む。線虫において、これら
の成分はそれぞれ3つの遺伝子、Ced-4、Ced-9及びCed-3によりコ
ード化されている(Steller,Science,267:1445(1995);Chinnaiyanら,Scienc
e,275:1122-1126(1997))。二つの遺伝子Ced-3とCed-4はアポトーシス
を開始するために必要とされる(YuanとHorvitz,Development 116:309-320,(199
0))。Ced-9は、Ced-3とCed-4の上流で機能するが、Ced-3とC
ed-4の活性化を妨げることによりアポトーシスプログラムをネガティブに調
節する(Hengartnerら,Cell 76:665-676(1994))。
線虫において描写されたアポトーシスプログラムは、Ced-9とCed-3の
相同体を含む哺乳動物細胞において保存される。これら相同体の一つBcl-2
は、部分的にCed-9に代わって線虫においてアポトーシスを妨げ得る(Hengar
tner
とHorvitz,1994,Cell 76:665-676)。他の相同体は、カスパーゼ-3を含む、C
ed-3に密接に関連するシステインプロテアーゼである(Yuanら,Cell 75:641-
652(1993):Xueら,Genes & Dev.10:1073-1083(1996))。Ced-4は、哺乳動物
の対応物が見つけられていない唯一の線虫の一般的アポトーシス遺伝子である。
この遺伝子は線虫アポトーシス経路においてCed-9の下流であるがCed-3
の上流で機能すると信じられている(ShahamとHorvitz,Genes & Dev.10:578-59
1,(1996),Cell 86:201-208(1996))。
哺乳動物細胞において、カスパーゼ-3は、細胞に死ぬようにシグナル伝達さ
れるとき、20kDaと10kDaの活性なヘテロダイマーにタンパク分解性に
変換される32kDaの不活性な前駆体としてサイトゾル画分中に通常は存在す
る(Schlegelら,Biol.Chem.271:1841-1844,(1996);Wangら,EMBO J.15:1012-
1020,(1996))。ミトコンドリアの外膜上に位置するBcl-2は、カスパーゼ-3
の活性化を妨げる。カスパーゼ-3活性化に対する必要な補助因子であるチトク
ロムCをミトコンドリアが放出することをブロックすることによりこれをなすよ
うである(Liuら,Cell 86:147-157,(1996);Yangら,Science 275:1129-1132,(19
97);Kluck,ら,Science 275:1132-1136,(1997))。相同的組換えによりマウスゲ
ノムからカスパーゼ-3を欠失させると、脳におけるアポトーシスの欠如のため
に、神経細胞の過剰な蓄積が生じる(Kuidaら,Nature 384:368-372(1996))。活性
なカスパーゼ-3を正常なサイトゾルに添加すると、アポトーシスプログラムを
活性化する(Enariら,nature 380:723-726(1996))。従って、カスパーゼ-3はア
ポトーシスを誘発するために必要かつ十分である。
カスパーゼ-3に対して同定された基質には、ポリ(ADPリボース)、ポリメ
ラーゼ(PARP)、ステロール調節成分結合タンパク質(SREBP)、U1随伴
70kDaタンパク質、N4-GD1、ハンチンチン(huntingtin)及びDNA依
存性プロテインキナーゼが含まれる(Casicola-Rosenら,J.Exp.Med.183:1957-1
964(1996);Naら,J.Biol.Chem.271:11209-11213(1996);Goldbergら,Nat.Genet
.13(4):442-449(1996);Wangら,EMBO J.15:1012-1020(1996);Nicholsonら,Na
ture 376:37-43,(1995))。
本出願人は正常に成長しているHela細胞由来のサイトゾル画分を使用して
アポトーシスを研究するためのインビトロアポトーシス系を最近確立した。この
系を使用して、哺乳動物のアポトーシスに関与する2つのタンパク因子:チトク
ロムC(Liuら,1996,上掲)と40kDaと45kDaのサブユニットの新規な
ヘテロダイマーであるDNA断片化因子(DFF)とを同定した。DFFは、カス
パーゼ-3の下流で機能して、アポトーシスの特徴であるゲノムDNAのヌクレ
オソームセグメントへの断片化を誘発する(Wyllieら,Nature 284:555-556,(198
0);Liuら,1997上掲)。
発明の概要
本出願人は、本出願において「Apaf-1」と命名される新規なタンパク質(
配列番号:2)をコード化したDNA配列(配列番号:1)を同定した。Apaf-
1はCed-4の哺乳動物相同体であると信じられる。ヒトApaf-1の天然配
列は、Ced-3の相同的ドメインをN末端に含み、C末端にCed-4相同的ド
メインと複数のWD-40反復が続く新規な130kDaのポリペプチドである
。Apaf-1はチトクロムCと複合体を形成し、アポトーシス経路においてカ
スパーゼ-3を活性化することが見出された。
選択的にスプライシングされた転写物であるApaf-1Lもまた発見された
。その新規な核酸配列(配列番号:15)とコード化タンパク質(配列番号:16)
は類似の活性を有しており、本発明においては、任意のApaf-1ポリペプチ
ドとして本発明内に含まれる。
本発明は、単離されたApaf-1タンパク質を提供する。特に、本発明は、
図5A−50及び図6の残基1〜1194を含んでなるアミノ酸配列(配列番号
:2)を含む、単離された天然配列Apaf-1タンパク質を提供する。他の実施
態様においては、単離されたApaf-1タンパク質は、図5A−5O及び図6
の残基1〜1194(配列番号:2)を含んでなる天然配列Apaf-1タンパク
質と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する。
他の実施態様において、本発明はApaf-1タンパク質をコードする単離さ
れた核酸分子(配列番号:1)を提供する。核酸分子は、Apaf-1タンパク質
又はApaf-1の特定のドメイン、例えばチトクロムC結合ドメイン又はAT
P結合ドメインをコードするRNA又はDNAであり、あるいはそのようなコー
ド核酸配
列に対して相補的であり、少なくとも中程度、場合によっては高度の厳密性条件
下でそれに安定して結合したまま残る。一実施態様において、核酸配列は:
(a)アミノ酸残基1〜1194をコードする図5A−50の核酸配列(配列番
号:1)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド578〜4159);
(b)アミノ酸1〜1194をコードし、翻訳開始部位の5'末端及び/又は終
止コドン配列の3'末端に位置する核酸を更に含む、図5A−5Oの拡大された
cDNA配列(配列番号:1)(すなわち、ヌクレオチド1〜7042);
(c)アミノ酸残基1〜1205をコードする図16A−16Hの核酸配列(配
列番号:15)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド578〜4192);
(d)アミノ酸残基1〜1205をコードし、翻訳開始部位の5'末端及び/又
は終止コドン配列の3'末端に位置する核酸を更に含む、図16A−16Hの拡
大されたcDNA配列(配列番号:15)(すなわち、ヌクレオチド1〜7075)
;及び
(e)遺伝コードの縮退の範囲内において(a)、(b)、(c)又は(d)配列に相当
する配列;
から選択される。
さらなる実施態様において、本発明はApaf-1タンパク質又はAdaf-1
の特定のドメインをコード化した核酸分子を含んでなるベクターを提供する。ま
た、該ベクター又は核酸分子を含んでなる宿主細胞も提供される。Apaf-1
の生産方法もさらに提供される。
さらなる実施態様において、本発明はApaf-1又はその一部をコードする
核酸配列を含んでなるベクター及び遺伝子作成物が提供される。
他の実施態様において、本発明はApaf-1に特異的に結合する抗体を提供
する。抗体はアゴニスト、アンタゴニスト又は中和抗体であってよい。
本発明のさらなる実施態様では、Apaf-1タンパク質、Apaf-1をコー
ドする核酸配列、又は抗Apaf-1抗体を含む製造品及びキットが提供される
。
本発明の新規な遺伝子、タンパク質、及び抗体は、アポトーシスのシグナルが
伝達された細胞をスクリーニングし同定するために特に有用である。加えて、本
発明の遺伝子及びタンパク質は、アポトーシスを調節するのに有用な薬剤を同定
するために候補化合物をスクリーニングするのに特に有用である。図面の簡単な説明
図1は、Apaf-1の精製にいたる精製手順の概略を示す。
図2は、カスパーゼ-3前駆体のその活性化型へのタンパク分解性切断により
検定されたアポトーシスを惹起する薬剤の組合わせを示す。
図3は、モノQカラムにより精製されたHela細胞上清のサイトゾル画分の
Apaf-1活性(S100)を示す。
図4は、銀染色PAGEゲル(8%)において図3に記述され、およそ130k
Daの分子量を有するカラム画分のApaf-1タンパク質を示す。
図5A−5Oは、ヒトApaf-1のDNA配列及び推定アミノ酸配列を示す
。
図6は、Apaf-1のタンパク質配列を示す。過去に配列決定された14の
トリプシン及びLys-Cペプチド(表1)に下線を引く。推定上のWD反復はボ
ックスで囲む。
図7は、水平なバーで示したApaf-1構造の概略図である。図5A−5O
及び6のアミノ酸残基に対応する数を示す。Ced-3相同領域、Ced-4相同
領域、及び13WD反復が示されている。
図8は、Ced-3のN末端プロドメインと相同性を共有するApaf-1のア
ミノ酸配列を示す(Yuanら,上掲(1993))。同一のアミノ酸は強調文字で示す。保
存されたアミノ酸はボックスで囲む。
図9は、Ced-4(YuanとHorvitz,上掲(1992))のアミノ酸と相同性を共有す
るApaf-1のアミノ酸配列を示す。
図10は、Apaf-1mRNAの組織分布と相対的発現を示すノーザンブロ
ットの図である。
図11は、Apaf-1のインビトロ翻訳を示す抗Apaf-1抗体で探索した
免疫ブロットの図である。
図12は、Apaf-1の免疫沈降を示す抗Apaf-1抗血清で探索したウェ
スタンブロットである。
図13は、抗Apaf-1抗体でのApaf-1/チトクロムCインキュベーシ
ョン混合物からのチトクロムCの免疫沈降を示す抗チトクロムC抗体で探索した
ウ
ェスタンブロットである。
図14は、抗Apaf-1抗体及び抗カスパーゼ-3抗体で探索したウェスタン
ブロットで、哺乳動物細胞における組換えApaf-1とカスパーゼ-3の発現を
立証するものである。
図15は、抗カスパーゼ-3抗体で探索したウェスタンブロットで、カスパー
ゼ-3の切断を誘発するための組換え的に発現されたApaf-1の使用を立証す
るものである。
図16A−16Hは、Apaf-1Lをコードする核酸配列を示す。Apaf-
1と比較して更に33の核酸に下線が付されている。
図17はApaf-1Lのアミノ酸配列を示す。更に11のアミノ酸に下線が
付されている。
図18は、実施例9に記載されたように、Apaf-1Lの更なる33のヌク
レオチドの5'及び3'末端の両側から設計された2つのプライマーを使用してH
eLaのmRNAからの第一鎖を増幅することにより産生した2つのRT-PC
R産物(Apaf-1及びApaf-1L)を示す臭化エチジウムで染色した2%ア
ガロースゲルである。
図19Aは、抗Apaf-1抗体及び抗カスパーゼ-3抗体で探索したウェスタ
ンブロットで、293細胞における組換えApaf-1Lとカスパーゼ-3の発現
を立証するものである。図19Bは、抗カスパーゼ-3抗体で探索したウェスタ
ンブロットで、カスパーゼ-3の切断を誘発するための組換え的に発現されたA
paf-1Lの使用を立証するものである。
好適な実施態様の詳細な説明
I.定義
ここで使用される際の「Apaf-1タンパク質」及び「Apaf-1」という
用語には、天然配列Apaf-1、Apaf-1Lのような選択的なスプライシン
グ変異体(以下の実施例においてより詳細に記載する)、及びApaf-1変異体(
ここでさらに定義される)が含まれる。これらの用語には、ヒトを含む種々の哺
乳動物由来のApaf-1が含まれる。Apaf-1は種々の供給源、例えばヒト
組織型又は
他の供給源から単離されたもの、あるいは組換え又は合成法により調製されたも
のであってよい。
「天然配列Apaf-1」には、天然由来のApaf-1と同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドを含んでなる。しかして、天然配列Apaf-1は、任意
の哺乳動物から自然に生じるApaf-1のアミノ酸配列を有し得る。このよう
な天然配列Apaf-1は、自然から単離することもできるし、組換え又は合成
手段により生産することもできる。「天然配列Apaf-1」という用語には、
特に、Apaf-1の自然に生じる切断又は分泌形、自然に生じる変異体形(例え
ば、選択的にスプライシングされた型)及びApaf-1の自然に生じる対立遺伝
子変異体が含まれる。
「Apaf-1変異体」とは、図5A−5O(配列番号:2)又は図17(配列番
号:16)に示されている推定アミノ酸配列を有するApaf-1と少なくとも約
80%のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義する生物学的に活性なApaf
-1を意味する。このようなApaf-1変異体には、例えば、図5A−5O(配
列番号:2)あるいは図17(配列番号:16)の配列のN-又はC末端において一
又は複数のアミノ酸残基が付加もしくは欠失されたApaf-1タンパク質が含
まれる。通常、Apaf-1変異体は、図5A−5O(配列番号:2)又は図17(
配列番号:16)のアミノ酸配列と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性
、より好ましくは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、さらにより好まし
くは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有している。
ここで同定されたApaf-1配列に対する「パーセント(%)アミノ酸配列同
一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要なら
ば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、A
paf-1配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセ
ントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための
アラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばALIGNTM又はMeg
align(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエア
を使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長
に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含
む、アラインメン
トを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチ
ド」に融合したApaf-1、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポ
リペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトーブを
提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さはApaf-1の活性を阻
害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他の
エピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポ
リペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のア
ミノ酸残基(好ましくは約10〜約20の残基)を有する。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために
使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収され
たポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断
又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他の
タンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、
ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより
、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほ
ど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元
あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性が得られるように充分な
ほど精製される。Apaf-1の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しない
ため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインシトゥーのポリペプチ
ドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1
つの精製工程により調製される。
「単離された」Apaf-1核酸分子は、同定され、Apaf-1核酸の天然源
に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子であ
る。単離されたApaf-1核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以
外のものである。ゆえに、単離されたApaf-1核酸分子は、天然の細胞中に
存在するApaf-1核酸細胞とは区別される。しかし、単離されたApaf-1
核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあ
るApaf-1を通常発現する細胞に含まれるApaf-1核酸分子を含む。
「対照配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に関連付けられ
たコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適
な対照配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム
結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及
びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に関連付けられ
」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの
分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのD
NAに作用可能に関連付けられている;プロモーター又はエンハンサーは、配列
の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に関連付けられている;又は
リボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコー
ド配列と作用可能に関連付けられている。一般的に、「作用可能に関連付けられ
る」とは、関連付けられたDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には
近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接してい
るわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。
そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリ
ゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に抗Apaf-1モ
ノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び阻止又は中和抗体を含む)
、及び多エピトープ特異性抗Apaf-1抗体組成物を包含している。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体
の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少
量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル
抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(
エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む通常の(ポリクローナル)抗体
とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。
ここで、モノクローナル抗体は、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブ
クラスの命名に拘わらず、定常ドメインを有する抗Apaf-1抗体の可変(高頻
度可変を含む)ドメイン、又は重鎖を有する軽鎖、他の種由来の鎖を有するある
種由来
の鎖、あるいは異種タンパク質との融合体をスプライシングすることによって得
られるハイブリッド及び組換え抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限
りそれら抗体断片(例えばFab、F(ab')2及びFv)を特に含む。例えば、米
国特許第4816567号、及びMageら,Monoclonal Antibody Production Tec hniques and Applications
,pp.79-97(Marcel Dekker,Inc.:ニューヨーク,198
7)を参照。
従って、「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られ
たという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないこ
とを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル
抗体は、最初にKohler及びMilsteinによって、Nature,256:495(1975)に記載さ
れたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは例えば米国特許第48
16567号に記載された組換えDNA法によって作ることができる。「モノク
ローナル抗体」は、例えばMcCaffetyら,Nature,348:552-554(1990)に記載さ
れた技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫
グロブリン鎖あるいはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2
あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来
する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの相
補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異
性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換さ
れたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グ
ロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって
置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCD
Rもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの
修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗
体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに
対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のもの
である、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む
。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Fc)、典型的
にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでな
る。
ここで意図している「生物学的に活性な」及び「所望の生物学的活性」とは、
ここに記載する無細胞系においてもしくはインビボ又はエキソビボで少なくとも
1種の哺乳動物細胞において(作用的又は刺激する形で)アポトーシスを変調する
能力を有していることを意味する。特に、Apaf-1の生物学的活性は、アポ
トーシス事象を誘発するためのカスパーゼ-3の活性化である。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典
型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNA
の分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴
う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この
活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、FACS分析、又はDNA電気泳動法等
、全て従来から知られている方法により決定し測定することができる。特に、ア
ポトーシスは、以下の実施例と上掲のLiuらに記載される無細胞系において測定
することができる。
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法及
び予防的療法及び防護的療法を称する。
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒトウシ、ウマ、イヌ及びネコ
を含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ましい実施態
様においては、哺乳動物はヒトである。
II. 本発明の組成物と方法
本発明は、新規に同定され、単離されたApaf-1タンパク質を提供する。
特に本出願人は、ヒトApaf-1タンパク質を同定し、分離した。このApa
f-1タンパク質の性質と特徴は、以下の実施例においてさらに詳細に記載する
。ここで開示されるApaf-1タンパク質の性質と特徴に基づき、Apaf-1
はCed-4の哺乳動物相同体であるというのが本出願人の信ずるところである
。
A. Apaf-1はCed-4の哺乳動物相同体である
Apaf-1がCed-4の哺乳動物の相同体であることを一連の証拠が示唆し
ている。第一に、Apaf-1は、300を越えるアミノ酸にわたってCed-4
と有意の配列相同性を示す;第二に、保存されたヌクレオチド結合領域、及び2
58位のイソロイシンを含むCed-4の幾つかの重要な領域がApaf-1にお
いて保存されている(図8);第三に、カスパーゼ-3の活性化を媒介するApa
f-1の
生化学的機能は遺伝子研究により描写されるようにCed-4の機能と一致して
いる。遺伝子研究は、Ced-4の過剰発現による線虫のALMニューロンの死
滅がCed-3突然変異体において大きく低減される一方、Ced-3の過剰発現
によるこれらニューロンの死滅はCed-4の突然変異によっては影響を受けな
いので(Hengartnerら,上掲;ShahamとHorvitz,上掲)、Ced-9Ced-4がC
ed-9の下流であるがCed-3の上流で機能することを示している。同様に、
bcl-2はApaf-1活性の補助因子であるチトクロムCの放出を制御するこ
とによりApaf-1の上流で機能する(Kluckら,上掲;Yangら,上掲)。
B. カスパーゼ-3活性化の誘発メカニズム
Apaf-1自体はカスパーゼではないと思われる。同定された全てのカスパ
ーゼ中に存在する保存された活性部位ペンタペプチドQACR(又はQ/G)Gは
Apaf-1には存在していない。WD反復を含むタンパク質の殆どは、機能が
酵素的というよりもむしろ調節性である(Neerら,1994,Nature 371:297-300)。
ATPを利用するタンパク質のなかで保存されている領域の同定は、カスパーゼ
-3活性化反応におけるdATPの必要性と一致する。この場合、dATPはA
TPより好ましい。
Apaf-1はアポトーシスの開始における重要な因子であると思われる。A
paf-1は、双方ともアポトーシスの誘発における重要な因子であるチトクロ
ムCとdATPに結合する。協働して、Apaf-1、チトクロムC、dATP
及びApaf-3は、無細胞系又は細胞及び組織内において、アポトーシスに対
する独特なモデル系を形成する。
Apaf-1、並びにApaf-1キメラ分子及び抗Apaf-1抗体を如何に
調製するかにつき、以下に説明する。
B. Apaf-1の調製
以下の説明は、主として、Apaf-1核酸を含むベクターで形質転換又はト
ランスフェクトされた細胞を培養してApaf-1を生産する方法に関する。も
ちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてApaf-1を調
製することはできると考えられる。
1. Apaf-1をコードするDNAの単離
Apaf-1をコードするDNAは、Apaf-1mRNAを保有していてそれ
を検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のcDNA
ライブラリから得ることができる。従って、ヒトApaf-1DNAは、実施例
2に記載されたヒトのHeLa細胞cDNAのライブラリのように、ヒトの組織
から調製されたcDNAライブラリ、及び他のライブラリ、特に高いアポトーシ
ス活性が知られている脾臓、胎性脳等のような組織から調製されたDNAライブ
ラリから簡便に得ることができる。そのようなDNAライブラリは、例えばクロ
ーンテック及びストラタジーンから商業的に入手可能である。またApaf-1
コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得
ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタン
パク質を同定するために設計された(Apaf-1に対する抗体又は少なくとも約
20−80塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングさ
れる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニン
グは、例えばSambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(New York:C
old Spring Harbor Laboratory Press,1989)に記載されている標準的な手順を
使用して実施することができる。Apaf-1をコードする遺伝子を単離する他
の方法はPCR方法論を使用するものである(Sambrookら,上掲;Dieffenbachら,PCR Primer :A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press,199
5))。
スクリーニングの好ましい方法は、種々のヒト組織からcDNAライブラリを
スクリーニングするために選別したオリゴヌクレオチド配列を用いることである
。以下の実施例2には、cDNAライブラリのスクリーニング技術を記載してい
る。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽
性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、
スクリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリダイゼーション時に検
出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は、当該分野
において良く知られており、32P標識されたATPのような放射標識、ビオチン
化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高厳密性を含むハイ
ブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookらに提供されている。
全てのタンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定
ア
ミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNA
の生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従
来のプライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリをス
クリーニングすることにより得られる。
Apaf-1変異体はApaf-1DNAに適切なヌクレオチド変化を導入する
か、所望のApaf-1ポリペプチドを合成することにより、調製することがで
きる。アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、膜係留特性
の変更のように、Apaf-1の翻訳後過程を改変し得ることは当業者であれば
理解されることである。
ここで記載されている天然全長配列Apaf-1又はApaf-1の種々のドメ
インにおける変異は、例えば米国特許第5364934号に記載された保存的あ
るいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して発
生させることができる。変異は、Apaf-1をコードしている一又は複数のコ
ドンの置換、欠失又は挿入であり、天然配列Apaf-1に対してApaf-1の
アミノ酸配列に変化が生じている。場合によっては、変異は、Apaf-1分子
の一又は複数のドメインにおいて、少なくとも1つのアミノ酸を任意の他のアミ
ノ酸に置換することによりなされる。変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特
異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びPCR突然変異誘発のような
、当該分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異
誘発(Carterら,Nucl.Acids.Res.,13:4331(1986);Zollerら,Nucl.Acids
.Res.,10:6487(1987))、カヤット突然変異(Wellsら,Gene,34:315(1985))
、制限選択的突然変異誘発(Wellら,Philos.Trans.R.Soc.London.SerA,31
7:415(1986))又は他の既知の技術をクローンDNAに実施してApaf-1変異
体のDNAを生産することができる。
また、特定のリガンド又はレセプターとの相互作用に関与する、近接配列に沿
った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使
用することもできる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミ
ノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステ
インが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越
えた側鎖が
除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸であ
る。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることも好ましい。さらに、アラ
ニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される(Creighton,The Proteins,
(W.H.Freeman & Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976))。アラ
ニン置換により適切な量の変異体を生じない場合には、アイソテリックアミノ酸
を使用することができる。
一度選択されたApaf-1変異体が生産されると、例えばここで記載する無
細胞系において以下の実施例3に記載するようにして、カスパーゼ-3の活性化
におけるそれらの活性に対して、それらをスクリーニングすることができる。
2. 複製可能なベクターへの核酸の挿入
Apaf-1をコードした核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、さら
なるクローニング又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々
なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに
制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、
複製開始点、一つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモ
ーター、及び転写終結配列であり、それぞれ以下に説明する。
(i)シグナル配列成分
Apaf-1は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナ
ル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN末端に特異的切断部位
を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても
生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入
されるApaf-1DNAの一部である。好ましく選択された異種シグナル配列
は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによ
って切断される)ものである。シグナル配列は、例えばアルカリンフォスファタ
ーゼ、ベニシリナーゼ、lppあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの
群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、
シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー
(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リー
ダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸フォスフ
ォターゼリーダー、白体
(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP 362,179)、又は
1990年11月15日に公開された国際特許第WO90/13646号に記載
されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、同一あるいは
関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、並びに単純ヘルペスグリコ
タンパク質Dシグナルのようなウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシ
グナル配列がタンパク質の直接分泌に使用できるが、インビボにおけるヒト細胞
の細胞膜へのApaf-1の挿入を通常指示する天然Apaf-1プレ配列が十分
である。
このような前駆体領域のDNAは、好ましくは、Apaf-1をコードするD
NAにリーディングフレームが結合される。
(ii)複製開始点成分
発現とクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞において
ベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニング
ベクターにおいて、宿主染色体DNAとは独立にベクターが複製することを可能
にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多
くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR32
2に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミ
ド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、
アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベク
ターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不
要である(SV40開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用い
られる)。
多くの発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、それらは少な
くとも一つのクラスの生物において複製可能であるが、発現のために他の生物に
形質移入され得る。例えば、大腸菌においてベクターがクローン化され、そのベ
クターが酵母あるいは哺乳動物細胞に形質移入され、宿主細胞染色体と独立して
複製することはできないとしても、発現する。
DNAは宿主ゲノムに挿入することによって増殖され得る。これは、例えばベ
クターにバシラスゲノムDNAに見られる配列と相補的なDNA配列を含めるこ
とにより、宿主としてバシラス(Bacillus)種を用いて容易に達成される。このベ
クターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同的組換え及びApaf-
1DN
Aの挿入をもたらす。しかし、Apaf-1をコードするゲノムDNAの回収は
、Apaf-1DNAを切除するのに制限酵母による消化を必要とするために、
外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
(iii)選択ゲノム成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択的マーカーとも称される
選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択的培地で成長させた形質転換宿主細胞の
生存又は成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターと共
に形質転換していない宿主細胞は培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a
)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートあるいはテトラサイクリンの
ような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、(c)
例えばバシリ(Bacilli)に対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、
複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬品が用いられる。異
種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬品性を付与し、選択工程を生存
するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、ネオマイシン(S
outhernら,J.Molec.Appl.Genet.,1:327(1982))、ミコフェノール酸(Mulli
ganら,Science,209:1422(1980))又はハイグロマイシン(Sugdenら,Mol.Cell
.Biol.,5:410-413(1985))が使用される。上述した3つの例は、真核生物のコ
ントロール下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬品G418又はネオマイシン(ジ
ェネテシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、又はハイグロマイシンにそれぞれ
耐性を付与する。
哺乳動物の細胞に適切な選択的マーカーの他の例は、DHFRあるいはチミジ
ンキナーゼのように、Apaf-1核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定
することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉
することによって当該形質転換細胞のみが生存できるような独特に適応化された
淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下
で形質転換細胞を培養することにより課し、選択遺伝子とApaf-1をコード
するDNAの双方を増幅させる。増幅は、成長に重要なタンパク質の生産に対す
る要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内に直列に反復される
プロセスである。増幅されたDNAから増大したApaf-1量が合成される。
増幅可能な遺伝子の
ほかの例には、メタロチオネインI及びII、アデノシンディアミナーゼ、及び
オルニチンデカルボキシラーゼが含まれる。
DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、まず、DHFRの競合的
アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の
全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細
胞は、Urlaubほかにより,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:7216(1980)に記載
されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるチャイニー
ズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である。形質転換した細胞は次に濃度の高い
メトトレキセートに接触させる。これによりDHFR遺伝子の複数コピーが合成
され、同時に、Apaf-1をコードするDNAのような発現ベクターを含む他
のDNAの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もしMtxに高度に耐性で
ある変異体DHFR遺伝子が使用されたような場合には内在性DHFRの存在に
かかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ATCC番号CCL61CHO−
K1を使用することができる(EP117,060)。
あるいは、Apaf-1をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質
、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選
択的マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DH
FRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のよ
うなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を有する培地
における細胞成長により選択することができる。米国特許第4965199号を
参照。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtr
p1遺伝子である(Stinchcombら,Nature,282:39(1979);Kingmanら,Gene,7
:141(1979);Tschemperら,Gene,10:157(1980))。trp1遺伝子は、例えば
、ATCC第44076号あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成
長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する(Jones,
Genetics,85:12(1977))。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1破壊が存在することは
、トリプトファンの不存在下における成長による形質転換を検出する有効な環境
を提供する。同様に、Leu2欠陥を有する酵母株(ATCC 20,622あるいは38,626
)は、Leu2遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、1.6μmの円形プラスミドpKD1由来のベクターは、クルイヴェロ
マイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる(Bianchiほか.,
Curr.Genet.,12:185(1987))。より最近では、組換え子ウシのキモシンの大量
生産のための発現系がK.ラクティス(lactis)に対して報告されている(Van den
Berg,Bio/Technology,8:135(1990))。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株か
らの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー
発現ベクターも開示されている(Fleerほか.,Bio/Technology,9:968-975(1991)
)。
(iv)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Apa
f-1核酸に作用可能に結びついているプロモーターを含む。プロモーターは、
作用可能に結合しているApaf-1核酸配列のような特定の核酸配列の転写及
び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約100ないし1000bp)の開始
コドンの上流側(5')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは
典型的には、誘発的なクラス及び構成的なクラスの2つのクラスに属する。誘発
的なプロモーターは、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件の変化
に対応してその制御の下でDNAからの転写レベルを上昇させるプロモーターで
ある。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロ
モーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によっ
て供給源DNAからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配
列を挿入することで、Apaf-1をコードするDNAに作用的に結合している
。天然のApaf-1プロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれ
もApaf-1DNAの直接増幅及び/又は発現に用いることができる。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトー
スプロモーター系(Changほか.,Nature,275:615(1978),Goeddelほか.,Nature
,281:544(1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモータ
ー系(Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980);EP36,776)、及びハイブリッ
ドプロモーター、例えばtacプロモーターを含む(deBoerほか.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,80:21-25(1983))。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好
適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は、任意
の所
望の制限部位を提供するためにリンカーあるいはアダプターを使用することでA
paf-1をコードするDNA(Siebenlistほか.,Cell,20:269(1980))にそれら
を作用可能に結合させることが可能である。細菌系で使用するプロモータもまた
Apaf-1をコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.
D.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生
物の遺伝子は、転写開始部位から25ないし30塩基上流に見出されるATリッ
チ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見
出される他の配列は、Xが任意のヌクレオチドであるCXCAAT領域である。
大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端にポリA尾部が付
加されていることを示すシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列
は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリ
セラートキナーゼ(Hitzemanほか,J.Biol.Chem.,255:2073(1980))又は他の糖
分解酵素(Hessほか,J.Adv.EnzymeReg.,7:149(1968);Holland,Biochemistr
y,17:4900(1987))、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒド
ロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクト
キナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効
果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロキナーゼ2、イソサ
イトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオ
ネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及び
ガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好
適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許第73657号に記載されてい
る。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのApaf-1転写は、例えば、ポ
リオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、
アデ
ノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス
、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及び最も好ましく
はサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター
、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリ
ンプロモーター、熱衝撃プロモーター、そしてApaf-1配列に通常付随する
プロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り
、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起
点をさらに含むSV40制限断片として簡便に得られる(Fiersほか,Nature,27
3:113(1978);Mulligan及びBerg,Science,209:1422-1427(1980);Pavlakisほか
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:7398-7402(1981))。ヒトサイトメガロウィ
ルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる
(Greenawayほか,Gene,18:355-360(1982))。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィル
スを用いて哺乳動物宿主でDNAを発現する系が、米国特許第4419446号
に開示されている。この系の修飾は、米国特許第4601978号に記載されて
いる(サルの細胞での免疫インターフェロンをコードしているcDNAの発現に
ついて、Grayら,Nature,295:503-508(1982)を;単純ヘルペスウイルス由来の
チミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞のヒトγ-インターフェ
ロンcDNAの発現について、Nature,297:598-601(1982);培養マウス及びウサ
ギ細胞におけるヒトインターフェロン1の発現について、Canaani及びBerg,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,79:5166-5170(1982)を;プロモーターとしてラウス
肉腫ウィルスの長い末端反復配列を用いたCV-1サル腎臓細胞、ニワトリ胚線
維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、及びマウスNIH
-3T3細胞における細菌CAT配列の発現について、Gormanほか,Proc.Natl
.Acas.Sci.USA,79:6777-6781(1982)を参照のこと)。
(v)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明のApaf-1をコードしているDNAの転
写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エ
ンハンサーは、通常は約10から300bpで、プロモーターに作用してその転
写を増強するDNAのシス作動要素である。エンハンサーは、相対的に方向及び
位置に独
立しており、転写ユニットの5'(Laiminsほか,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
8:993(1981))及び3'(Luskyほか,Mol.Cell Bio.,3:1108(1983))、イントロン
内部(Banerjiほか,Cell,33:729(1983))並びにコード配列自身の内部(Osborne
ほか,Mol.Cell Bio.,4:1293(1984))に見出されている。哺乳動物の遺伝子由
来の多くのエンハンサー配列が知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブ
ミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核
細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点
の後期側のSV40エンハンサー(bp100-270)、サイトメガロウィルス
初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及
びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化の
ための増強要素については、Yaniv,Nature,297:17-18(1982)もまた参照のこと
。エンハンサーは、Apaf-1コード配列の5'又は3'位でベクター中にスプ
ライスされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
(vi)転写終止成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物
由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終止及びmRNAの
安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA
又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領
域は、Apaf-1をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断
片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
(vii)ベクターの組立てと分析
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの組立てには標準的なラ
イゲーション技術を用いる。分離されたプラスミド又はDNA断片を切断し、整
え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーショ
ンする。
組立てられたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ラ
イゲーション混合物を用いて、大腸菌K12菌株294(ATCC 31446)を形質転換
し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換
細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌク
レアーゼ
消化により分析し、及び/又はMessingほか,Nucleic Acids Res.,9:309(1981
)の方法又はMaxamほか,Methods in Enzymology,65:499(1980)の方法によって
配列決定する。
(viii)一過性発現ベクター
Apaf-1をコードしているDNAの哺乳動物細胞における一過性発現をも
たらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞
が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコード
されている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果
的に複製できる発現ベクターを使用することを含む(Sambrookほか,上掲)。一過
性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたDN
Aによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学
的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にす
る。したがって、一過性発現系は、本発明において、Apaf-1変異体を同定
する目的のために特に有用である。
(ix)適切な例示的脊椎動物細胞ベクター
組換え脊椎動物細胞培養でのApaf-1の合成に適応するのに適切な他の方
法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingほか,Nature,293:620-625(1981);Mante
iほか,Nature,281:40-46(1979);欧州特許第117060号;及び欧州特許第1
17058号に記載されている。
3. 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な
宿主細胞は、原核生物、酵母、又は上述の高等真核生物細胞である。この目的に
とって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰
性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌
、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サ
ルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャ
ンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(l
icheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開されたDD 266,710に開示されたバ
シリ・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びスト
レプトマイセス属
を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであ
る。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Apaf-1を
コードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロ
ミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなか
で最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般
的に入手可能で有用である。
グリコシル化Apaf-1の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導さ
れる。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能
である。原則的には、脊椎動物であろうと無脊椎動物培養であろうと、任意のよ
り高等の真核生物細胞培養が使用できる。無脊椎動物細胞の例としては植物及び
昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可
能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエ
ジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガス
ター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている(例えば、Luc
kowほか,Bio/Technology,6:47-55(1988);Millerほか,Genetic Engineering,
Setlowほか,eds.,Vol.8(Plenum Publishing,1986),pp.277-279;及びMaeda
ほか,Nature,315:592-594(1985)を参照のこと)。トランスフェクションのため
の種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカNPVのL−1
変異体とボンビクス・モリNPVのBm−5株が公に利用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコのような植
物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌
アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのある菌株と共にインキュベートする
ことによってトランスフェクトされる。A.トゥメファシエンスと共に植物細胞
培養をインキュベートする間に、Apaf-1をコードしているDNAが、植物
細胞宿主がトランスフェクトされるようにその植物細胞宿主に移され、そして適
切な条件下でApaf-1をコードしているDNAを発現させる。加えて、例え
ば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような
、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる(Depickerほか,J.
Mol.Appl.Gen.,1:561(1982))。また、T-DNA780遺伝子の上流領域から
分離されるDNA
セグメントは、組換えDNAを含む植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを
活性化又は増強しうる(1989年6月21日公開のEP 321,196)。
培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は、当該分野おいてよく知られてい
る(例えば、Tissue Culture,Academic Press,編者Kruse and Patterson(1973)を
参照のこと)。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換
されたサル腎臓CV1株(COS-7,ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁
培養での成長のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか,J.Gen V
irol.,36:59(1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK,ATCC CCL 10);チャイニーズ
ハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO,Urlaub及びChasin,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,77:4216(1980));マウスのセルトリ細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.
,23:243-251(1980));サルの腎細胞(CVI ATCC CCL70);アフリカミドリザルの腎
細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA,ATCCC CL 2);イヌ腎細
胞(MDCK,ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);ヒ
ト肺細胞(W138,ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2,HB 8065);マウス乳房腫瘍細
胞(MMT 060562,ATTC CCL51);TRI細胞(Motherほか,Annals N.Y.Acad.Sci.
,383:44-68(1982));MRC5細胞;及びFS4細胞である。
宿主細胞をトランスフェクトし、そして好ましくは上述のApaf-1生成の
ための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形
質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適
当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
トランスフェクションは、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにか
かわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り上げを意味する。多数のトランス
フェクションの方法が当業者に知られている。例えば、CaPO4及びエレクト
ロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じ
たときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体成分によってであ
ろうと、DNAが複製可能であるように、生物体中にDNAを導入することを意
味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な
方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookほかにより記載された塩化カ
ルシウム
を用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な
細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメフ
ァシエンスによる感染が、Shawほか,Gene,23:315(1983)及び1989年6月29日公
開の国際特許第89/05859号に記載されたように、ある種の植物細胞の形
質転換に用いられる。加えて、1991年1月10日に公開された国際特許第WO91
/00358号に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフ
ェクトすることもできる。
このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb,
Virology,52:456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細
胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第4399216号に記載されて
いる。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingenほか,J.Bact.,130:94
6(1977)及びHsiaoほか,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3829(1979)の方法に
よって実施する。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、
核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリ
カチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融
合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術に
ついては、Keownほか,Methods in Enzymology,185:527-537(1990)及びMansour
ほか,Nature,336:348-352(1988)を参照のこと。
4.宿主細胞の培養
本発明のApaf-1を生成するために用いられる原核細胞は、前掲のSambroo
kほかにより記載されているような適切な培地で培養される。
Apaf-1の生産に用いられる哺乳動物の宿主細胞は種々の培地において培
養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(Sigma)、最小
必須培地(「MEM」,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及びダルベッコの改良イ
ーグル培地(「DMEM」,Sigma)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン
及び/又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長
因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩
)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジ
ン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモ
ル範囲で通常存在す
る無機化合物と定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応
じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られて
いる適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現
のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者
には明らかであろう。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール
、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach,M.
Butler編(IRL Press,1991)に見出すことができる。
この明細書において言及される宿主細胞は培養中の細胞並びに宿主動物内にあ
る細胞を包含する。
5. 遺伝子増幅/発現の検出
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写
を定量化するノーザンブロット法(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:52
01-5205(1980))、ドットブロット法(DNA分析)、又はインシトゥハイブリッド
形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いる
ことができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に32Pである。しかしなが
ら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾された
ヌクレオチドもまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放
射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素等のような広範囲の標識で標識することがで
きるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。また、DNA二本鎖、RN
A二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を
含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで
、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合し
ており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存
在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試
料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的
な標識化
抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的
標識、蛍光標識、又はルミネサンス標識である。
試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクロー
ナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡
便には、抗体は、天然配列Apaf-1ポリペプチドに対して、又はここで提供
されるDNA配列をベースとした合成ペブチドに対して、又はApaf-1DN
Aに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る
。
6. Apaf-1ポリペプチドの精製
Apaf-1は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。Ap
af-1が膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用
いて膜から引き離すか、又はその細胞外ドメインを酵素的に切断して引き離すこ
とができる。
Apaf-1がヒト起源以外の組換え細胞でつくられるときは、Apaf-1は
ヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、Apa
f-1に関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又は
ポリペプチドからApaf-1を精製することが望ましい。第一段階として、培
地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、A
paf-1を、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手
順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画
;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEA
Eによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫
酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;及びI
gGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラムである。
残基が欠失され、挿入され、又は置換されたApaf-1変異体は、その変異
によってしばしば惹起された実質的な性質変化を考慮に入れて、天然配列Apa
f-1と同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポ
リペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原、免疫グロブリン配列、又は
レセプター配列とApaf-1との融合体の調製は精製を容易にする;配列に対
する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着するため
に使用するこ
とができる。他の種類のアフィニティーマトリックスもまた使用することもでき
る。
例えばフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼイ
ンヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な
汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然配列Ap
af-1に適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるApaf-1又
はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれ
ば分かるであろう。
7. Apaf-1ポリペプチドの共有結合的修飾
Apaf-1の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。Apaf-1の共
有結合的修飾の一つの型は、Apaf-1の標的アミノ酸残基を、Apaf-1の
N末端又はC末端残基、又は選択された側鎖と反応できる有機誘導体化剤と反応
させることによって分子内に導入することができる。
二官能性試薬による誘導体形成は、抗Apaf-1抗体を精製する方法に使用
する水不溶性支持体マトリックス又は表面へのApaf-1の架橋に有用であり
、またその逆も同様である。二官能性試薬による誘導体形成は、Apaf-1分
子を架橋させてApaf-1二量体を産生するのにも有用である。このような二
量体により結合アビディティーが増大させられ、インビボにおける分子の半減期
が延びる。通常使用される架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-
2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシン
イミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ
二官能性イミドエステル、及びビス-N-マレイミド-1,8-オクタンのような二
官能性マレイミドが含まれる。メチル-3-((p-アジドフェニル)ジチオ)プロピ
オイミダートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる
光活性化中間体を生じる。また、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性の水
不溶性マトリックス及び米国特許第3969287号;3691016号;41
95128号;4247642号;4229537号及び4330440号に記
載されている反応性基質がタンパク固定に用いられる。
その他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグル
タ
ミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンとリジンのヒドロキシル
化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニ
ン、及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化(T.E.Creighton,Proteins:St ructure and Molecular Properties
,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,PP.
79-86(1983))、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基の
アミド化を含む。残基の修飾型も本発明の範囲に入る。
本発明の範囲内に含まれるApaf-1ポリペプチドの共有結合的修飾の他の
タイプは、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「
天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列Apaf-1に見出される一
又は複数の炭水化物部分の欠失、及び/又は天然配列Apaf-1に存在しない
一又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味することをここでは意図し
ている。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N結合又はO結合の何れかであ
る。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。アス
パラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここでXはプロリンを除
く任意のアミノ酸)というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物
部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれ
らのトリペプチド配列の何れかが存在すると、可能性の有るグリコシル化部位が
作り出される。O結合グリコシル化は、ヒドロキシルアミノ酸、最も一般的には
セリン又はスレオニン(5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた
用いられるが)に、糖類N-アセチルガラクトーサミン、ガラクトース、又はキシ
ロースの一つが結合することを意味する。
Apaf-1ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、
それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(N結合グリコシル化部位のもの)
を含むように変化させることによって達成される。この変化は、天然配列Apa
f-1への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換
によってもなされる(O結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、Apa
f-1アミノ酸はDNAレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳
するコドンが産生されるように予め選んだ塩基でApaf-1ポリペプチドをコ
ードしているDNAを突然変異することによって変更される。このDNA突然変
異は、上記に記
載され前掲の米国特許第5364934号に記載された方法を用いてなされる。
Apaf-1ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、該
ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。用いられる結合様
式に応じて、糖(類)は、(a)アルギニンとヒスチジンに、(b)遊離のカルボキシ
ル基に、(c)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(d)セリン
、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、
(e)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は
(f)グルタミンのアミノ基に結合される。これらの方法は1987年9月11日
公開の国際特許第WO87/05330号及びAplin及びWriston,CRC Crit .Re v.Biochem.
,pp259-306(1981)に記載されている。
Apaf-1ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵
素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然
変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化は、化合物トリフル
オロメタンスルホン酸、又は等価な化合物へ該ポリペプチドを曝露し、該ポリペ
プチドを無傷のまま残しながら、結合糖(N-アセチルグルコサミン又はN-アセ
チルガラクトサミン)を除く殆ど又は全ての糖を切断する。化学的脱グリコシル
化は、Hakimuddinほか,Arch.Biochem Biophys.,259:52(1987)及びEdgeほか,
Anal.Biochem.,118:131(1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水
化物部分の酵素的切断は、Thotakuraほか,Meth.Enzymol.,138:350(1987)に記
載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用して達成す
ることができる。
潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskinほか,J.Biol.Chem.
,257:3105(1982)によって記載されているように、化合物ツニカマイシンを使用
して防ぐことができる。ツニカマイシンはタンパク質-N-グルコシド結合の形成
を阻害する。
Apaf-1の共有結合的修飾の他のタイプは、米国特許番第4640835
号;第4496689号;第4301144号;第4670417号;第479
1192号又は第4179337号に記載されているように、Apaf-1ポリ
ペプチドを、種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコー
ル、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることを
含む。
8. Apaf-1キメラ
また本発明は、他の異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したApaf
-1を含むキメラ分子を提供する。
一実施態様では、キメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを
提供するタグポリペプチドとのApaf-1の融合体を含む。エピトープタグは
一般にApaf-1のアミノ又はカルボキシル末端に位置させられる。Apaf-
1のこのようなエピトープタグが付けられた形は、その存在をタグポリペプチド
に対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給する
と、Apaf-1を抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の種類のアフィ
ニティーマトリックスを用いたアフィニティー精製によって直ぐに精製すること
ができる。
様々なタグポリペプチドとその各抗体は従来から良く知られている。例には、
fluHAタグポリペプチドとその抗体12CA5(Fieldほか,Mol.Cell.Bio
l.,8:2159-2165(1988));c-mycタグとそれに対する8F9、3C7、6E
10、G4、B7及び9E10抗体(Evanほか,Molecular and Cellular Biolog
y,5:3610-3616(1985));及び単純ヘルペスウィルス糖タンパクD(gD)タグと
その抗体(Paborskyほか,Protein Engineering,3(6):547-553(1990))が含まれ
る。他のタグポリペプチドには、フラッグ-ペプチド(Flag-peptide)(Hoppほか,
BioTechnology,6:1204-1210(1988));KT3エピトープペプチド(Martinほか,
Science,255:192-194(1992));α-チューブリンエピトープペプチド(Skinnerほ
か,J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991));及びT7遺伝子10タンパクペ
プチドタグ(Lutz-Freyermuthほか,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397
(1990))が含まれる。ひとたびタグポリペプチドが選択されれば、それに対する
抗体を、ここに開示した方法を用いて産生することができる。
一般的に、エピトープタグApaf-1は、上述した方法に従い作成され生産
される。エピトープタグApaf-1は以下の実施例においてもまた記載されて
いる。Apaf-1タグポリペプチド融合体は、Apaf-1タンパク質をインフ
レームでコードしているcDNA配列をタグポリペプチドDNA配列に融合させ
、得られたDNA融合作成物を適当な宿主細胞に発現させることによって好まし
く作成される。通常は、本発明のApaf-1タグポリペプチドキメラを調製す
るときは、A
paf-1をコードしている核酸を、タグポリペプチドのN末端をコードしてい
る核酸にその3'末端で融合させるが、5'融合もまた可能である。例えば、約5
〜約10のヒスチジン残基を有するポリヒスチジン配列はN末端又はC末端で融
合され、アフィニティークロマトグラフィーにおける精製ハンドルとして使用さ
れる。
エピトープタグApaf-1は、抗タグ抗体を用いてアフィニティークロマト
グラフィーによって精製することができる。アフィニティー抗体が付着されるマ
トリックスには、例えばアガロース、調製穴明きガラス又はポリ(スチレンジビ
ニル)ベンゼンが含まれる。ついで、エピトープタグApaf-1は、当該分野に
おいて知られた技術を使用して、アフィニティーカラムから溶出される。
他の実施態様において、キメラ分子は免疫グロブリン配列と融合したApaf
-1ポリペプチドを含む。キメラ分子は、また特定のApaf-1ドメイン配列、
例えば免疫グロブリン配列と融合したApaf-1の細胞外ドメイン配列も含む
。これには、モノマー、又はホモ-又はヘテロ-マルチマー、そして特にはホモ-
又はヘテロダイマー又は-テトラマー型のものが含まれ;場合によっては、キメ
ラはダイマー型又はホモダイマー重鎖型であり得る。一般的に、これらの構築免
疫グロブリンは以下の図に示されるような既知の単位構造を有している。
基本的な4鎖の構造単位はIgG、IgD及びIgEが存在する型である。4
鎖の単位がより大なる高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される;IgM
が一般にジスルフィド結合によって一緒になった基本的な4鎖単位のペンタマー
として存在する。IgAグロブリン、そして時折IgGグロブリンはまた血清中
にマルチマー型で存在する。マルチマーの場合は、各4鎖単位は同一であるか異
なっている。
次の図は、いくつかの例示的なモノマー、ホモ-及びヘテロダイマー及びホモ-
及びヘテロマルチマー構造を示している。これらの図は単に例証するためのもの
であって、マルチマーの鎖は、天然免疫グロブリンと同様にジスルフィド結合し
ていると考えられる。
モノマー:
ホモダイマー:
ヘテロダイマー:
ホモテトラマー:ヘテロテトラマー:
及び
上図において、「A」はApaf-1配列又は異種性配列に融合したApaf-
1配列を意味する;Xは、Aと同一でも異なっていてもよい付加的な薬剤、免疫
グロブリンスーパーファミリーのメンバーの一部で、例えば天然又はキメラ免疫
グロブリン可変領域を含む可変領域又は可変領域様ドメイン、例えばシュードモ
ナス外毒素又はリシンのような毒素、又は他のサイトカイン(すなわち、IL-1、
インターフェロン-γ)又は細胞表面分子(すなわち、NGFR、CD40、OX40、Fas抗原
、ショープ及び粘液腫ポックスウィルスのT2タンパク質)のような他のタンパク
質に機能的に結合している配列、又は定常ドメインと通常は結合していないポリ
ペプチド治療剤である;Yはリンカー又は他のレセプター配列である;VL、VH
、CL及びCHは免疫グロブリンの軽又は重鎖の可変又は定常ドメインを表す。「
A」としてApaf-1配列の少なくとも1つのCRDと、「X」としてCRD
の反復性パターンを有する他の細胞表面タンパク質とを含む構造体が特に含まれ
る。
上図は、単に本発明の可能性のあるキメラ構造を例証したものであって、全て
の可能性を包括するものではない。例えば、これらの作成物のいずれにおいても
、望ましくはいくつかの異なった「A」、「X」又は「Y」があるかもしれない
。また、重又は軽鎖定常ドメインは、同一又は異なる免疫グロブリンから由来し
たものであってもよい。図示された類似の構造のあらゆる可能な組合わせは全て
本発明の範囲に入る。
一般的にキメラ分子は、ある種の抗体からの可変ドメインが他の種の可変ドメ
インで置換されたキメラ抗体と同様にして作成することができる。例えば、EP 0
125 023;EP 173,494;Munro,Nature,312:597(1984年12月13日);Neuberger
ら,
Nature,312:604-608(1984年);Sharonら,Nature,309:364-367(1984年);Mo
rrisonら,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984);Morrisonら,
Science,229:1202-1207(1985);Boulianneら,Nature,312:643-646(1984年)
;Caponら,Nature,337:525-531(1989);Trauneckerら,Nature,339:68-70(
1989)を参照のこと。
あるいは、キメラ分子は以下のようにして作製することができる。所望の配列
、例えばApaf-1及び/又はTNFR配列をコードする領域を含むDNAを
、免疫グロブリン様ドメインをコードするドメインの3'末端又はその近傍で、
及びApaf-1又はTNFRポリペプチドのN末端をコードするDNAもしく
はその近傍の点(異なるリーダーの使用が想定される)で、又はTNFRのN末端
コード領域もしくはその近傍(そこでは天然シグナルが使用される)で、制限酵素
により切断する。ついで、このDNA断片を免疫グロブリン軽又は重鎖定常ドメ
インをコードするDNAの近傍に直ちに挿入し、必要ならば、得られた作成体を
欠失変異誘導により整える。好ましくは、キメラ分子がヒトに対するインビボ治
療法を意図したものである場合、Igはヒト免疫グロブリンである。免疫グロブ
リン軽又は重鎖定常領域をコードするDNAは既知であるか、cDNAライブラ
リから直ぐに入手できるか合成される。例えば、Adamsら,Biochemistry,19:2
711-2719(1980);Goughら,Biochemistry,19:2702-2710(1980);Dolbyら,Pro
c.Natl.Acad.Sci..USA,77:6027-6031(1980);Riceら,Proc.Natl.Acad
.Sci.,79:7862-7865(1982);Falknerら,Nature,298:286-288(1982);及び
Morrisonら,Ann.Rev.Immunol.,2:239-256(1984)を参照のこと。
このような融合体の調製方法のさらなる詳細は、イムノアドヘシンの調製に関
する刊行物に見出される。イムノアドヘシン一般、及び特にCD4-Ig融合分
子は、1989年4月6日に公開された国際特許第WO89/02922号に開
示されている。IgG重鎖定常領域に結合している、ヒト免疫不全ウイルス(H
IV)のレセプター、CD4の細胞外部分を含む分子は当該分野において知られ
ており、CD4の可溶性細胞外部分よりも著しく長い半減期とより低いクリアラ
ンスを有することが見出された(Caponら,上掲;Byrnら,Nature,344:667(199
0))。また、特異的キメラTNFR-IgG分子の作成が、Ashkenaziら,Proc.N
atl.Acad.Sci.,
88:10535-10539(1991);Lesslauerら,(J.Cell.Biochem.Supplement 15F,1
991,p.115(P432);及びPeppelとBeutler,J.Cell.Biochem.Supplement 15F,
1991,p.118(P439))に記載されている。
B. Apaf-1の治療的又は非治療的用途
本明細書に開示されているように、Apaf-1は、アポトーシスを誘発する
ために使用される。このアポトーシスの誘発は、以下の実施例に記載するように
、無細胞系又は哺乳動物細胞においてなされる。
また、本発明のApaf-1は非治療的用途においても有用性を有している。
Apaf-1をコードしている核酸配列を、組織特異性の分類のための診断に使
用することもできる。例えば、インシトゥハイブリッド形成、ノーザン及びサザ
ンブロット法、及びPCR分析のような手順を、Apaf-1をコードするDN
A及び/又はRNAが評価されている細胞型中に存在しているか否か、またいく
らの量のタンパク質又はRNAが細胞で生産されるのかを決定するために使用す
ることができる。この実施態様は、死滅が運命付けられている細胞を同定する方
法を提供する。(非アポトーシス制御と比較して)多量の細胞が、死滅が運命付け
られた細胞と相関する。より少ない量になると、細胞が死滅する可能性が低くな
ることになる。アポトーシス細胞中でのAdaf-1の発現は正常な非アポトー
シス細胞における発現より少なくとも2−10X大きいことが予想される。
Apaf-1をコードしている核酸配列は、ここに記載されている組換え技術
によるApaf-1の調製にもまた有用である。
単離されたApaf-1は、未知量のApaf-1を含有するサンプルが調製さ
れた対照として、定量的診断アッセイに使用され得る。またApaf-1調製物
は、抗体を産生する際、Apaf-1に対するアッセイにおける標準として(例え
ば、ラジオイムノアッセイ、ラジオレセプターアッセイ又は酵素結合免疫測定法
における標準としての使用のためにApaf-1を標識することにより)、アフィ
ニティー精製法において、及び例えば放射性ヨウ素、酵素又はフルオロフォアで
標識された場合、特に競合型レセプター結合アッセイにおいて有用である。Ap
af-1の修飾型、例えば前述のApaf-1-IgGキメラ分子(イムノアドヘシ
ン)は、抗Apaf-1抗体の生産における免疫原として使用することができる。
また、Apaf-1をコードする核酸又はその修飾型は、トランスジェニック
動物か「ノックアウト」動物を産生するのに使用でき、これらは治療的に有用な
試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマ
ウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先
に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トラ
ンスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。一実
施形態では、Apaf-1をコードするcDNA、又はその適当な配列(例えば、
Apaf-1-IgG)を、確立された技術によりApaf-1をコードするゲノム
DNAをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、Apaf-
1をコードするDNAを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生す
るために使用することができる。特にマウス又はラット等のトランスジェニック
動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第
4736866号や第4870009号に記述されている。典型的には、特定の
細胞を組織特異的エンハンサーでのApaf-1導入遺伝子の導入の標的にする
。胚段階で動物の生殖系列に導入されたApaf-1をコードする導入遺伝子の
コピーを含むトランスジェニック動物はApaf-1をコードするDNAの増大
した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えば過度のア
ポトーシスを伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター
動物として使用できる。発明のこの側面においては、動物を試薬で治療し、導入
遺伝子を有する未治療の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治療
的処置の可能性が示される。
あるいは、Apaf-1の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたAp
af-1をコードする変更ゲノムDNAと、Apaf-1をコードする内在性遺伝
子との間の相同的組換えによって、Apaf-1をコードする欠陥又は変更遺伝
子を有する「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、Apa
f-1をコードするDNAは、確立された技術に従い、Apaf-1をコードする
ゲノムDNAのクローニングに使用できる。Apaf-1をコードするゲノムD
NAの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカ
ーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベ
クターは無変更のフランキングDNA(5'と3'末端の両方)を数キロベース含む
(例えば、相同的
組換えベクターについてはThomas and Capecchi,Cell,51:503(1987)を参照の
こと)。ベクターは胚性幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入さ
れたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞を選択する(例えば、Li
ほか,Cell,69:915(1992)参照)。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又は
ラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する(例えば、Bradley,Terat
ocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E.J.Roberts
on,ed.(IRL,Oxford,1987),pp.113-152参照)。その後、キメラ性胚を適切
な偽妊娠の雌性乳母に移植し、胎仔に妊娠期間を経させて「ノックアウト」動物
を作る。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術によ
り同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含
む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば細胞の非制御成
長及び/又は腫瘍の発達を含む、Apaf-1ポリペプチドが不在であることに
よるある種の病理的状態及び病理的状態の発達に対して防御する能力によって特
徴付けられる。
Apaf-1タンパク質はアポトーシスを変調する治療的に活性な分子を同定
するアッセイにおいて有用である。特に、アポトーシスの開始を阻害するかその
ような開始を亢進させる化合物をこれらスクリーニング方法により簡便に同定す
ることができる。アポトーシスを阻害する分子は、例えば変性疾患における細胞
死を防ぐために、又は培養細胞の寿命を延ばすために有用である。アポトーシス
の開始を亢進又は促進する分子は、例えば癌の治療あるいはインビトロにおいて
特定の細胞の死滅を促進するために有用である。
Apaf-1への特異的結合に対してチトクロムCと競合的に競合し得る候補
化合物のアッセイは、化学ライブラリの高処理スクリーニング系を提供する。通
常は10K分子量未満の小分子は、細胞に対して透過性である可能性が高いので
薬物療法に望ましく、細胞による分解を被りにくく、タンパク質ほど免疫応答を
誘発しない。小分子は、限定されるものではないが、合成有機又は無機化合物を
含む。多くの製薬会社がそのような分子の広範なライブラリを保有しており、そ
れをAdaf-1への結合を評価することにより簡便にスクリーニングすること
ができる。
上述の無細胞アポトーシスアッセイにおいてチトクロムCと置換しうる候補化
合物のアッセイは、有用なスクリーニング法をさらに提供する。Apaf-1、
A
paf-3、dATP、及び候補薬物を、例えばカスパーゼ3前駆体の存在下で
組合わせると、アポトーシスの誘発が、酵素のタンパク分解性切断又はDNA断
片化により測定される。
C. 抗Apaf-1抗体の調製
本発明は、さらに抗Apaf-1抗体を提供するものである。Apaf-1に対
する抗体は以下のようにして調製することができる。抗体の例としては、ポリク
ローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及び異種抱合体抗体が含まれる
。
1. ポリクローナル抗体
Apaf-1抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方
法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免
疫化剤、所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生
させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮
下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、Apaf-1ポリ
ペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。適切な免疫化剤の例は、Apaf
-1-IgG融合タンパク質又はキメラ分子(Apaf-1EDC-IgG融合タン
パク質を含む)である。また、その表面にApaf-1を発現する細胞を使用して
もよい。免疫化されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている
タンパク質に免疫化剤を抱合させることが有用である。使用され得るそのような
免疫原性タンパク質の例は、限定するものではないが、キーホールリンペットヘ
モシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒ
ビターが含まれる。また、哺乳動物の免疫反応を増強するために、ミョウバンの
ような凝集剤を使用してもよい。使用され得るアジュバントの例には、フロイン
ト完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合
成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度
の実験なく当業者により選択されるであろう。哺乳動物から採血し、血清を検定
して抗体価を求める。望まれるならば、抗体価が増加又はプラトーするまで哺乳
動物に追加免疫を施す。
2. モノクローナル抗体
あるいは、Apaf-1抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクロ
ーナル抗体は、Kohler及びMilstein,上掲に記載されているようなハイブリドー
マ法
を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハム
スター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、
(上述したようにして)免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生
成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することも
できる。
免疫化剤は、典型的にはApaf-1ポリペプチド又はその融合タンパク質を
含む。適切な免疫化剤の例は、Apaf-1-IgG融合タンパク質又はキメラ分
子である。Apaf-IEDC-IgG免疫原の特定の例は、以下の実施例9に記
載している。表面でApaf-1を発現する細胞もまた使用することができる。
一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用さ
れ、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細
胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリ
ンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,M onoclonal Antibodies:Principles and Practice
,Academic Press,(1986)pp.5
9-103)。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物
、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット及びマウスの骨髄腫細
胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生
存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例
えば、親の形質転換細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典
型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジン(「HAT培地」)を含み
、この物質がHGPRT欠乏性細胞の成長を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による
安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性
であるものが望ましい。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、
これはカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Cen
terやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及
びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示れている(Kozbor,J.Immunol.,133:3
001 (1984)、Brodeurほか、Monoclonal Antibody Production Techniques and A
pplications,M
arcel Dekker,Inc.,New York,(1987)pp.51-63)。
ハイブリドーマ細胞を培養する培地を、Apaf-1に対するモノクローナル
抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成さ
れたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(R
IA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測
定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノク
ローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard,Anal.Biochem.,107
:220(1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンを制限希釈工程を経てサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる(Goding,上掲)。こ
の目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びR
PMI-1640倍地が含まれる。更に、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物におい
てインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインA
セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動
法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精
製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第48165
67号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル
抗体をコードするDNAは、常套的な方法によって(例えば、マウス抗体の重鎖
及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブ
を使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドー
マ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、D
NAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS
細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタン
パク質を生成等しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内
でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同
マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換すること
により(米国特許第4816567号;Morrisonほか,上掲)、又は免疫グロブリ
ンコード配列に非免疫グ
ロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修
飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗
体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の
可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく
知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現
を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意のポイン
トで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換
するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法もまた適している。抗体の消化による、その
断片、特にFabフラグメントの調製は、当該分野において知られている慣用的
技術を使用して達成できる。例えば、消化はパパインの使用により行うことがで
きる。パパイン消化の例は、94/12/22に公開された国際特許第WO94
/29348号、及び米国特許第4342566号に記載されている。抗体のパ
パイン消化は、典型的には、Fabフラグメントと呼ばれ、各々が単一の抗原結
合部位を有する2つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのFcフラグメント
を生成する。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、抗原の架橋が尚
も可能なF(ab')2フラグメントが得られる。
また、抗体の消化により生産されたFabフラグメントは、軽鎖の定常ドメイ
ンと重鎖の第1定常ドメイン(CH1)を含む。Fab'フラグメントは、抗体のヒ
ンジ領域から一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末
端にいくつかの残基が付加されているということで、Fabフラグメントとは異
なっている。Fab'-SHとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオー
ル基を担持しているFab'に対するここでも命名である。F(ab')2抗体フラ
グメントは、本来は、それらの間にヒンジシステインを有するFab'フラグメ
ントの対として生産された。抗体フラグメントの他の化学的結合もまた知られて
いる。
3. ヒト化抗体
本発明のApaf-1抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(
例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖
ある
いはその断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗
原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むも
のである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウ
ス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種
(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエ
ント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残
基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシ
ピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出され
ない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全
てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど
全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくと
も1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、
最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定
常領域の少なくとも一部を含んでなる(Jonesほか,Nature,321:522-525(1986);
Reichmannほか,Nature,332:323-329(1988);及びPresta,Curr.Op Struct.Bi
ol.,2:593-596(1992))。
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。一般的に、ヒト化
抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトア
ミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入
」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗
体の該当する配列を置換することによりウィンター及び共同研究者(Jonesほか,
Nature,321:522-525(1986)、Riechmannほか,Nature,332:323-327(1988)、Ver
hoeyenほか,Science,239:1534-1536(1988))の方法を使用して行える。よって
、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分
が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(U.S.4,816,567)である
。実際には、ヒト化抗体は典型的にはある程度のCDR残基及び場合によっては
いくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換される
ヒト抗体である。
抗原性を軽減するには、ヒト化抗体を生成するために使用するヒトの軽及び重
可変ドメインの両方の選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧
歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列ライブラリ全体
に対
してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗
体のヒトフレームワーク(FR)として受け入れる(Simsほか,J.Immunol.,151:
2296(1993);Chothia及びLesk,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。他の方法では
、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導
される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異な
るヒト化抗体に使用できる(Carterほか,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285
(1992);Prestaほか,J.Immunol.,151:2623(1993))。
更に、抗体は、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持して
ヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親
及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物
の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的
に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリ
ン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは
購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能にお
ける残基の役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原と結合する能力に影
響を及ぼす残基の分析を可能とする。このようにして、例えば標的抗原に対する
親和性を高めるといった、望ましい抗体特徴が得られるように、FR残基をコン
センサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、CD
R残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている(1994年、3月
3日に公開されたWO 94/04679を参照)。
免疫化することで、内在性免疫グロブリンが生成されない状態でもヒト抗体の
完全リパートリを生成することができるトランスジェニック動物(例えばマウス)
を使用することが可能である。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免
疫グロブリン遺伝子配列を移すと、抗原による誘発時にはヒト抗体の生成が生じ
る(例えば、Jakobovitsほか,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551-255(1993)
;Jakobovitsほか,Nature,362:255-258(1993);Bruggermanほか,Year in Immu
no.,7:33(1993)を参照)。また、ヒト抗体はファージ表示ライブラリ(Hoogenboo
m及びWinter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marksほか,J.Mol.Biol.,222:
581(1991))において産生することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法
も、ヒト
モノクローナル抗体の調製に利用することができる(Coleら,Monoclonal Antibo
dies and Cancer Therapy,Alan R.Liss.p.77(1985)及びBoernerら,J.Immun
ol.,147(1):86-95(1991))。
4. 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合にお
いて、結合特異性の一方はApaf-1に対してであり、他方は任意の他の抗原
、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに
対してである。
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つ
の免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく(Millstein及びCuello,Natu
re,305:537-539(1983))。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖のランダムな混合のため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の
精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様
の手順が1993年5月13日公開の国際特許第WO93/08829号、及び
Trauneckerほか,EMBO J.,10:3655-3659(1991)に開示されている。
別のより好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性(抗体-抗原組合せ部
位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。
融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免
疫グロブリン重鎖定常ドメインで起きる。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に
必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫
グロブリン重鎖融合をコードするDNA、望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を
、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これは、
構築に使用する三つのポリペプチド鎖が不等の比である時に最高の収率が得られ
る実施態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調整する際
に大なる柔軟性をもたらす。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖が同比率
で発現すると高収率が得られる場合や比率が特に重要ではない場合には、一つの
発現ベクターに二つ
又は三つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。このアプ
ローチの好適な形態では、二重特異性抗体は、一方のアームの第一結合特異性を
有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グ
ロブリン重鎖/軽鎖対(第二の結合特異性をもたらす)からなる。このような非対
称的構造は、二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在すると容易
な方法で分解できるので、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の
組み合わせから分解し易くすることが見出された。このアプローチは1994年
3月3日公開の国際特許第WO94/04690号によって開示されている。二
重特異性抗体を生成するためのさらなる詳細については、例えばSureshほか,Me
thods in Enzymology,121:210(1986)を参照されたい。
5. 異種抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、2つの共有的
に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞
に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びHIV感染の
治療(WO 91/00360、WO 92/200373;EP 03089)のために提案された。本抗体は、
架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、
インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反
応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成す
ることができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及び
メチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4676980号
に開示されているものが含まれる。
D. Apaf-1抗体の治療的及び非治療的用途
本発明の抗Apaf-1抗体は治療的な有用性を有している。例えば、アゴニ
スト抗Apaf-1抗体は癌細胞においてアポトーシスを活性化又は刺激するた
めに使用することができる。あるいは、アンタゴニスト抗体を使用して過剰のア
ポトーシス(例えば、神経変性疾患)をブロックするか、カスパーゼ-3の活性化
により生じるApaf-1の潜在的な自己免疫/炎症効果をブロックすることが
できる。
さらに、抗Apaf-1抗体は抗Apaf-1の診断検定法、例えば特異的細胞
、組織又は血清における発現を検出する検定法に使用することができる。当該分
野に
おいて知られている様々な診断検定技術、例えば、競合的結合検定、直接的又は
間接的サンドイッチ検定及び不均一又は均一相の何れにおいても実施される免疫
沈降検定を使用することができる(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of T
echniques,CRC Press,Inc.,(1987)pp.147-158)。診断検定法に使用される抗
体は、検出可能部分で標識することができる。検出可能成分は、直接的に又は間
接的に検出可能なシグナルをつくりだすことができなければならない。例えば検
出可能成分は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、蛍光イソチ
オシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、もし
くはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又は西洋わさびペルオキシ
ダーゼ等の酵素であってもよい。Hunterほか,Nature,144:945(1962)、Davidほ
か,Biochemistry,13:1014(1974)、Painほか,J.Immunol.Meth.,40:219(198
1)及びNygrenほか,J.Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)等に記載されて
いる方法を含み、検出可能部分に抗体を抱合させるための当該分野において知ら
れている任意の方法を使用することができる。
また、抗Apaf-1抗体は天然供給源又は組換え細胞培養由来のApaf-1
のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、Apaf-1に対
する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂
や濾過紙のような適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製する
Apaf-1を含む試料と接触させ、ついで、固定された抗体に結合したApa
f-1以外の試料内の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄す
る。最後に、Apaf-1を抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄
する。
抗Apaf-1抗体はまた細胞中のApaf-1発現を同定するために有用であ
り、死滅する運命にある細胞に対する有用なマーカーを提供する。
E. Apaf-1又は抗Apaf-1抗体を含むキット
本発明のさらなる実施態様においては、例えば上述の治療的又は非治療的用途
に使用可能なApaf-1又は抗Apaf-1抗体を含むキット及び製造品が提供
される。製造品にはラベルが付された容器が含まれる。適切な容器には、例えば
ボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのよ
うな種々の物質から形成できる。容器は、上述の治療的又は非治療的用途に有効
な活性剤を
含む組成物を収容する。組成物中の活性剤は、Apaf-1又は抗Apaf-1抗
体である。容器のラベルには、組成物が特定の治療的又は非治療的用途に使用さ
れることが示され、また上述のもののようなインビボ又はインビトロのいずれか
の使用の指示が示されている。
本発明のキットは、典型的には、前掲の容器と、商業上及び使用者の観点から
望まれる、バッファー、希釈液、フィルター、針、注入器及び使用説明が記され
たパッケージ挿入物を含む、材料を含む一又は複数の他の容器を含んでいる。
F. アポトーシスのモデル系
アポトーシスのモデル系が、Apaf-1、Apaf-3、dATP及びチトク
ロムCを組合わせることにより提供される。無細胞系と哺乳動物細胞の双方にお
いての、この薬剤の組合わせは、アポトーシスを誘発するのに十分である。アポ
トーシスはカスパーゼ3のタンパク分解性切断とDNAの断片化により確認され
る。このモデル系を使用して、新規な薬剤が、そのアポトーシス変調能について
スクリーニングされる。
実施例
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。
実験手順 全体的方法と材料
dATPと他のヌクレオチドはファーマシアから;放射性材料はアマシャムか
ら;SDS−PAGEとゲル濾過クロマトグラフィー用の分子量標準はバイオラ
ドから得た。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイ法により測定した。一
般的な分子生物学手法は、上掲のSambrookらに記載されているようにして実施し
た。
実施例1 サイトゾルの分画とカスパーゼ-3活性化の再構成
アポトーシスプログラムがデオキシATP(dATP)の添加により開始される
Liuら(Cell 86:147-157,(1996))に記載されているような無細胞インビトロ系を
、
これらの研究において使用した。この系は、アポトーシスプロテアーゼの活性化
とDNA断片化を誘発する生化学成分の分画と精製を可能にする。アポトーシス
プログラムの開始により、カスパーゼ-3の活性化が生じ、究極的には核内にお
けるDNAの断片化が生じる。無細胞系は、上掲のLiuらにおいて記載されてい
るようにチトクロムC及び活性化dATPと、Hela細胞の懸濁培養液から調
製した100000Xgのサイトゾル上清の画分(S100)を一緒にした。カス
パーゼ-3の活性化を、インビトロ翻訳された35S標識アフィニティー精製カス
パーゼ-3前駆体の切断によりモニターした。タンパク分解断片を、SDS-ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)と続くリン光体イメージングにより可
視化した。
図1は、2つの他の必要な因子であるApaf-1とApaf−3からのチト
クロムC(Apaf-2)の分離に対して使用した分画法を示す。最初の工程は、
Hela細胞サイトゾルのS100画分のSP-セファロースクロマトグラフィ
ーで、Apaf-1とApaf-3(流出分)からチトクロムC(結合画分)を分離し
た。Apaf-1とApaf-3を分離するには、流出画分をヒドロキシルアパタ
イトカラム上に負荷した。流出及び結合画分を収集した。
アポトーシス開始プログラムを再構成するために、流出(Apaf-3)及び結
合(Apaf-1)画分の一定分量(それぞれ4μl)とチトクロムCの一定分量(1
μl中に0.2μg)を、単独又は組合わせて、また1mMのdATPの存在又
は不存在下でインキュベートした。各試料にインビトロ翻訳された35S標識アフ
ィニティー精製カスパーゼ-3を添加し、最終容量25μlのバッファーA(20
mMのHepes-KOH、pH7.5、10mMのKCl、1.5mMのMg
Cl2、1mMのEDTAナトリウム、1mMのEGTAナトリウム、1mMの
ジチオスレイトール、及び0.1mMのPMSF)で試料を30℃で1時間インキ
ュベートした。インキュベーションの終りに、7μlの4X SDS試料バッフ
ァーを各反応に添加した。3分間沸騰させた後、各試料をついで15%SDS
PAGEにかけ、ゲルをニトロセルロースフィルターに移した。フィルターを室
温で16時間の間、リン光体イメージングプレートに露光させ、フジBAS-1
000リン光体イメージャーで可視化した。
図2に示すように、チトクロムCとdATPと共にインキュベーションしたと
き
(1−6レーン)どの画分も単独ではカスパーゼ-3を活性化するためにコンピテ
ントではなかった。しかし、2つの画分(Apaf-1とApaf-3)をチトクロ
ムCとdATPの存在下で混合したとき、カスパーゼ-3の活性化が回復した(7
レーン)。dATPとチトクロムCを反応から取除いたときは活性は検出されな
かった(5及び8レーン)。
実施例2
Apaf-1の精製
さらなる精製のために、実施例1に対して上述したように、チトクロムC、d
ATP、未精製Apaf-3画分、及び基質カスパーゼ-3と共に様々なサイトゾ
ル画分をインキュベートすることにより、Apaf-1活性をアッセイした。実
施例1に対して上に示したように、Adaf-1活性はカスパーゼ-3を切断する
。Apaf-1の精製は6段階の手順により達成した。HeLa S-100からのApaf-1の精製
全ての精製工程を4℃で実施した。SP-セファロースカラム(ファーマシア)
と1回目のヒドロキシアパタイトカラム(バイオラド)以外の全てのクロマトグラ
フィー工程を、自動高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)ステーシ
ョン(ファーマシア)を使用して実施した。
100リットルの培養HeLa細胞懸濁液からの700ml(4.9gのタン
パク質)のHeLa S-100を、上掲のLiuら,1996に記載されたようにして調
製し、バッファーAで平衡にしたSP-セファロースカラム(総容積200ml)
に適用した。バッファーAは実施例1において上述されたようにして調製した。
800mlの流出画分(3648mgのタンパク質)を収集し、バッファーAで平
衡にしたヒドロキシアパタイトカラム(総容積50ml)に直接負荷した。カラム
を、1MのNaClを含む3カラム容量のバッファーAで洗浄し、続いて2カラ
ム容量のバッファーAで洗浄した。結合した物質を200mlの0.3M KP
O4、pH7.5で溶出させた。タンパク質のピークをカラムから溶出させ(11
5ml、287mgのタンパク質)、バッファーAに対して透析し、ついでバッ
ファーAで平衡にした第2のヒドロキシアパタイトカラム(総容積10ml)上に
負荷した。カラムを200
mlのバッファーAから250mMのKPO4、pH7.5の線形勾配で溶出さ
せた。
各10mlの画分を収集し、実施例1に記載したようにして、Apaf-1活
性(カスパーゼ-切断)について検定した。活性な画分(50ml、11mgのタン
パク質)をプールし、バッファーAに対して透析し、ついでバッファーAで平衡
にした5mlのヘパリン-セファロースカラム(ファーマシア)上に負荷した。カ
ラムを、100mMのNaClを含む20mlのバッファーAで洗浄し、100
mMのNaClを含む50mlのバッファーAから400mMのNaClを含む
バッファーAの線形勾配で溶出させた。4mlの画分を収集し、Apaf-1活
性について検定した。活性な画分(8ml、0.86mgのタンパク質)をプール
し、100mMのNaClを含むバッファーAで平衡にしたスーパーデックス2
00 16/60ゲル濾過カラム上に直接負荷した。カラムを同じバッファーで
溶出させ(4回)、4mlの画分を、30mlの溶出から始めて、収集した。画分
をApaf-1活性について検定し、活性な画分をプールし(16ml、32μg
のタンパク質)、100mMのNaClを含むバッファーAで平衡にしたモノQ
5/5カラム(ファーマシア)上に直接負荷した。カラムを、100mMのNaC
lを含む20mlのバッファーAから300mMのNaClを含むバッファーA
の線形勾配で溶出させた。1mlの画分を収集し、Apaf-1活性について検
定した。
精製の最後の工程であるモノQカラムクロマトグラフィーの結果を図3に示す
。Apaf-1活性は250mMのNaClでモノQカラムから溶出した(画分1
4−16)。同じ画分をSDS-PAGEと続いて銀染色にかけ、およそ130k
Daの単一のポリペプチドバンドがApaf-1活性と共溶出することが観察さ
れた(図4)。他のタンパク質はピーク画分において銀染色によっては検出されな
かった(図4、画分14−16)。約130kDaでゲル濾過カラムからApaf
-1活性が溶出したが、これは、Apaf-1が溶液中にモノマーとして存在して
いることを示している(データ示さず)。約10マイクログラムの純粋なApaf
-1を100リットルのHeLa細胞からのサイトゾルから得た。
実施例3
Apaf-1の配列決定とcDNAクローニング
130kDaのApaf-1タンパク質をSDSゲルから切除し、トリプシン
及びLys-C消化にかけた。得られたペプチドをキャピラリー逆相高圧液体ク
ロマトグラフィー(HPLC)により分離した。Apaf-1のタンパク質配列決定
実施例2に記載されたようにして製造され図4(4−8pmol)に示した13
0kDaのApaf-1タンパク質バンドをPVDF膜上のSDSポリアクリル
アミドゲル(ProBlott,アプライド・バイオシステム)から電気溶出させ、切除し
た。バンドを、以前に記載されているようにして(Henzelら,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 90:5011-5015(1993))、低減させ、イソプロピルアセトアミドでアルキル
化し、20μlの0.05Mの炭酸水素アンモニウム、20%のアセトニトリル
中で0.2μgのトリプシン(プロメガ)又はリシン-C(和光)で37℃で17時
間、消化させた。消化された溶液をついで0.32x150mmのC18キャピ
ラリーカラム(LCパッキング・インク)上に直接注入した。溶媒Aは0.1%の
水性TFAであり溶媒Bは0.07%のTFAを含むアセトニトリルであった。
ペプチドを、0−80%の溶媒Bの線形勾配で120分かけて溶出させた。pペ
プチドのピークを195nmで検出し、0.5mlのエッペンドルフ管に手で収
集した。
単離したHPLC画分の各々の一定分量(0.2μl)を、標的位置にある予め
つくられたマトリックス(50%アセトン/50%2-プロパノールに入れた20
mg/mlのα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸プラス5mg/mlのニトロセ
ルロースの0.5μl)のスポットに適用した(Shevchenkoら,Anal.Chem.,68:850
-858,(1996))。イオンを337nmの窒素レーザでのマトリックス補助レーザ脱
離/イオン化により形成した。線形遅延抽出モードで操作したパーセプティブ・
バイオシステムズ・ボイジャー・エリート・フライトタイム質量分析計によりス
ペクトルを取得した。ついで、選択された前駆体質量に対する断片イオンをポス
トソース減衰(PSD)実験により得た(Kaufmannら,International J.Mass Spe
ctro.and Ion Processes,131:355-385,(1994))。低質量のイオン存在量を高め
るために、衝突ガス(空気)を、断片イオンスペクトルの低部分(<200μ)の獲
得の間、衝突細胞に導入した。各ペプチド質量とその随伴断片イオン質量を使用
して、FRAGFI
Tプログラムの増強版(Henzelら,上掲)でインハウス配列データベースを検索し
た。
自動タンパク質配列決定を、オンラインのPTHアナライザーを装備したアプ
ライド・バイオシステムズのシークエンサー、プロサイス(Procise)494A及
び494CLモデルで実施した。ピークを、ネルソン・アナリティカル760イ
ンターフェースを使用してジャスティス・イノベーション・ソフトウェアで積分
した。配列の解読をDECアルファで実施した(Henzelら,1987,J.Chromatogr.4
04:41-52)。
14のペプチドの配列を質量分析及びエドマン分解法により測定した(表1)。
タンパク質データベース検索から、データベース中のどのタンパク質もApaf
-1とは同一ではなかった。
表1
エドウィン配列決定法とMALDI MS分析法により分析されたペプチド a平均同位体質量を示す質量b
該ペプチドは32ダルトンが追加となる酸化トリトファンを含んでいた。
ペプチド2及び4をコードしている変性オリゴヌクレオチド(表1を参照のこ
と)を鋳型として使用してHeLacDNAライブラリでポリメラーゼ連鎖反応(
PCR)を開始させた。Apaf-1のcDNAクローニング
AEloxHelaのcDNAライブラリ(Yokoyamaら,Cell,75:187-197,(
1993))の1μl(108pfu)の一定分量を99℃で15分間加熱してDNA内
容物を放出させた。DNAを300pmolのプライマー-1変性オリゴヌクレ
オチド(配列番号:3)と20pmolのSP6プライマー(配列番号:4)で、9
4℃で30秒、60℃で30秒;及び72℃で1分の5サイクルと続いて94℃
で30秒、55℃で30秒、そして72℃で1分の25サイクルのPCR反応を
使用して直接増幅した。PCR生成物を、PCR精製カラム(キアゲン(Qiagen))
を通過させて精製した。精製した生成物の一部分(1/50)を更に上述のPCR
反応において300pmolのプライマー-2(配列番号:5)及びpmolのプ
ライマー-3(配列番号:6)を使用して増幅した。
285bpのPCR産物が得られ、続いて、TAクローニングキット(インビ
ト
ロゲン)を使用するPCRIIベクター内にサブクローニングした後に配列決定を
した。
配列決定により、ペプチド3をまたコードしていた285塩基対のDNAフラ
グメントを得た。HeLaのcDNAライブラリをこのPCRフラグメントで探
索して、136088ダルトンの計算分子量を持つ1194アミノ酸をコードし
ているオープンリーディングフレームを持つ2つのオーバーラップするcDNA
を同定した(図5A-5O)。多重インフレーム終止コドンをcDNAの5'不飽和
領域に同定したが、これは、これらのcDNAクローンが全長Apaf-1をコ
ードしていることを示している(データは示さず)。
285bpのPCR生成物をrediプライムランダムプライマー標識キット
(アマシャム)を使用してα-32P-dCTPで標識し、ラピッド・ハイブ・バッフ
ァー(アマシャム)中で一晩かけて42℃で複製フィルターをハイブリダイズする
ことによりHeLaのλExloxcDNAライブラリをスクリーニングした。
フィルターを1xクエン酸塩溶液(SSC)/0.1%SDSで室温で15分間2
回洗浄し、0.5xSSC/0.1%SDSにより65℃で10分間1回洗浄し
た。スクリーニングした6x105のプラークのなかで、4のポジティブなクロ
ーンを同定し、1.6kbの部分クローンを特性付けた。1.6kbのインサート
を切除し、上述のようにしてα-32P-dCTPで標識した。Hela細胞のcD
NAライブラリを、上述の手順を使用してこの1.6kbのcDNAで再スクリ
ーニングした。ポジティブなクローン(45)を同定し特性付けした。Apaf-
1の5'部分を含む最も長いクローン(3kb)を配列決定した。このプラスミド
の40ngの一定分量を、3kbインサートの3'末端によりAPPN(5'AC
ATCACGAATCTTTCCCGC)(配列番号:7)及びAPPC(5'AA
CACTTCACTATCACTTCC3')(配列番号:8)と命名された2つの
PCRプライマーにより増幅した。600bpのPCRフラグメントを産生し、
上述のようにしてα-32P-dCTPで標識した。同じフィルターをこのPCRフ
ラグメントで再スクリーニングし、35のポジティブなクローンを同定し特性付
けした。4.5kbのインサートを有する最長のものを配列決定した。このクロ
ーンは3kbの5'クローンと500bpがオーバーラップするApaf-1の3
'末端を含んでいた。全長cDNAを、
500bpのオーバーラップ領域内に位置するEcoR I部位で2つのクロー
ンをライゲーションすることにより得て、図5A−O(配列番号:1)に示す。
図5A−OはまたヒトApaf-1(配列番号:1)によりコード化された予想
アミノ酸配列(配列番号:2)を示す。これまでに配列決定された14のペプチド
の全てが(下線で示された)cDNAのオープンリーディングフレームによりコー
ド化された。質量分析計により測定されたこれらのペプチドの分子量は計算分子
量に一致しており、これらのペプチドの翻訳後の修飾がないことを示している。
実施例4
Apaf-1のドメイン構造
タンパク質のデータベース(ジェンバンク及びプロサイト)のサーチにより、A
paf-1のCOOH末端セグメントが13WD-40の反復を含むことが明らか
になった。この緩く保存された配列の集合は、ヘテロトリマーGプロテインのβ
-サブユニット(Neerら,Nature,371:297-300,(1994);Wallら,Cell,83:1047-10
58,(1995);Sondekら,Nature,379:369-374,(1996))、ミラー-ダイカー脳回欠
損に対するLIS-1遺伝子(Hattoriら,1994,Nature 370:216-218)、及びSR
EBP切断活性化タンパク質(SCAP)(Huaら,Cell,87:415-426,(1996))を
含む、多くの調節タンパク質に見出されている。
また、タンパク質のデータベース(ジェンバンク)のサーチにより、Apaf-
1と、線虫においてアポトーシスプログラムに必要とされる2つのタンパク質で
あるCed-3及びCed-4(Yuan及びHorvitz,上掲)との間の有意な類似性が明
らかになった(図8と9を参照)。Apaf-1のNH2末端の85のアミノ酸はC
ed-3のNH2末端のプロドメインと21%の同一性と53%の類似性を示す(
図9参照)。Apaf-1mpアミノ酸配列とCed-3のN末端プロドメインを
、DNASTARプログラムのリップマン-パーソン法で整列させた。このドメ
インには、上述のように、整列されたCed-4と22%の同一性と48%の類
似性を示す310アミノ酸の伸展が続く(図9)。Ced-4で保存されたアミノ
酸の2つの最長の伸展はApaf-1の142−157及び227−234位に
ある(図7、下線)。これらの2つの領域は、ヌクレオチド結合タンパク質に対す
るウォーカーのA及び
Bボックスコンセンサス配列にそれぞれ対応する(Walkerら,1982,EMBO J.1:945
-951)。250−251位に2つのアスパラギン酸残基と258位にイソロイシ
ンを含むCed-4活性に必要であることが知られている幾つかのアミノ酸(Yuan
及びHorvita,上掲;Chinnaiyanら,上掲)がApaf-1において保存される(図9
、星印)。
実施例5
Apaf-1の組織分布ノーザンブロット分析
複数のヒト成人及び胚性組織からの、レーン当り2μgのポリ(A)+RNAを
含むポリ(A)+RNAブロットをクローンテックから購入した。ラピッド-ハイ
ブバッファー(アマシャム)中で一晩かけて65℃で、(5'ACATCACGAA
TCTTTCCCGC3'(配列番号:9)と5'CAACACTTCACTATC
ACTTCC3')(配列番号:10)で増幅された)アミノ酸590−792に対
応するランダムに初回刺激された607bpのApaf-1PCRフラグメント
2x106cpm/mlでブロットをハイブリダイズした。フィルターを、65
℃で15分間1xSSC/0.5%SDSで、続いて65℃で20分間0.5%
SSC/0.5%SDSで、2回洗浄した。
同じフィルターをまた2.0kbのβ-アクチンcDNAプローブにより65
℃で2時間ハイブリダイズし、ついでフィルターを上述のようにして洗浄した。
左のフィルターを−80℃で8日間増感スクリーンでX線フィルムに感光させ、
右側の2つのフィルターを−80℃で4日間増感スクリーンでX線フィルムに感
光させた。次に、同じフィルターをまたヒトβ-アクチンとハイブリダイズし、
−80℃で増感スクリーンで2時間(左フィルター)又は30分(右の2つのフィ
ルター)フィルムに感光させた。ヒト成人又は胎児組織からの試料を示す。
図10は上述の方法でヒト成人及び胎児組織のノーザンブロットにより分析さ
れたApaf-1のmRNAの組織分布を示す。成人脳、心臓、肝臓、脾臓、骨
格筋、肺、膵臓、胸腺、小腸、大腸、末梢血白血球、腎臓、精巣、卵巣、及び胚
性脳、肝臓、腎臓を含む検査した全ての組織において、約8000のヌクレオチ
ドの主要mRNAを検出したが、これは、Apaf-1の一様な発現を示してい
る。発現は
成人脾臓及び末梢血白血球及び胚性脳、腎臓及び肺において最も高く、その全て
が高いレベルのアポトーシスを有している。
実施例6
組換えApaf-1の生産
Apaf-1を、PCDNA3.1(-)ベクター(インビトロゲン)のNotI及
びEcoRI部位にクローニングされたApaf-1の全コード領域プラス57
7bpの5'非翻訳領域及び約1.5kbの3'非翻訳領域を含む6.0kbのc
DNAフラグメントからインビトロで翻訳した。3'領域を、配列番号:1のヌ
クレオチド5727に位置するEcoRI部位で切り詰めた。TNT T7がカ
ップリングした網状赤血球ライヤート系(プロメガ)を製造者の指示に従って使用
した。
翻訳生成物をウェスタンブロット法により分析した。レーン1は30μlのA
paf-1インビトロ翻訳生成物を含んでいた。レーン2は30μlの翻訳混合
対照を含んでおり、そこではベクターだけが同じ翻訳反応において鋳型として使
用された。レーン3は実施例1に対して記載されたようにして精製された5μl
のApaf-1を含んでいた。
電気泳動後に、試料をニトロセルロースフィルターに移し、フィルターを、A
paf-1[配列番号:1]のアミノ酸10−254を含む組換え融合タンパク質
に対して産生されたApaf-1に対する抗血清(1:5000希釈)で探索した
。融合タンパク質(0.5mg)を使用して、フロイント完全アジュバント中のタ
ンパク質(1:1)の皮下注射によりウサギを免疫化した。フロイント不完全アジ
ュバント中のタンパク質(1:1)を2週間の間隔で2回追加免疫した。ブロット
に形成された抗原-抗体複合体を上述のようなECL法により可視化した。フィ
ルターをコダックX-OMAT X線フィルムに5秒間感光させた。
図11に示すように、抗Apaf-1ポリクローナル抗体は精製タンパク質と
反応した(レーン3)。同じ抗体は、ウサギ網状摂家球ライセート系におけるAp
af-1のcDNAのインビトロ翻訳により合成されたApaf-1にも反応した
(レーン1)。インビトロ翻訳されたApaf-1は精製Apaf-1と同一の位
置に遊走したが、これは、cDNAが全長Apaf-1をコード化したことを確
認するもの
である。
実施例7
チトクロムCはApaf-1に結合する
上に記載したように、Apaf-1とApaf-3によるカスパーゼ-3の活性
化にはチトクロムC並びにdATPが必要となる。Apaf-1がチトクロムC
と直接相互作用をするかどうかを測定するために、結合実験を実施した。
部分的に精製したApaf-1の100μlの一定分量を1mMのdATPの
不存在又は存在下で単独又は2μgのチトクロムCと共に30℃で20分間イン
キュベートした。Apaf-1を、実施例2に対して記載されたように、SPセ
ファロースカラム並びにハイドロキシアパタイトカラムを通してHeLa細胞サ
イトゾルから部分的に精製した。
インキュベーション時間後、試料を抗Apaf-1抗血清で免疫沈降させた。
抗Apaf-1抗血清を、以下のようにして生産した組換えApaf-1融合タン
パク質でウサギを免疫することにより、産生した。
プライマー5'-GCAAAGCTCGAAATCATATGCTTCAACA
TAGAG-3'(配列番号:11)及び5'-TCGCGGCCGCCTCGAGG
GCTCTGGTTGTAAG-3'(配列番号:12)を設計して、1.6kbの
プラスミドApaf-1cDNAオープンリーディングフレームをPCR増幅し
た。増幅された800bpのApaf-1のアミノ酸10−254をコードして
いるフラグメントを、細菌発現ベクターpET-15b(ノバゲン)のNdeI/
XhoI部位にインフレームでサブクローン化した。発現プラスミドを細菌BL
21(DE3)に形質転換した。典型的なApaf-1の調製では、10mlの一
晩をかけて培養されたApaf-1発現ベクター含有細菌を500mlのLBブ
ロスに添加し、37℃、220rpmで振とうすることにより3時間培養した。
ついで、イソプロピル-1-チオ-B-D-ガラクトピラノシド(IPTG)を1mM
の最終濃度になるまで添加し、混合物をさらに2時間培養した。細菌ペレットを
10mlのバッファーB(6MのGuHCl、0.1Mのリン酸ナトリウム、0
.01MのトリスHCl、pH8.0)に再懸濁した。10000gで15分間
遠心分離した後、上清をニッ
ケルアフィニティーカラムに負荷した(6ml)。カラムを、30mlのバッファ
ーBと続く30mlのバッファーC(8Mの尿素、0.1Mのリン酸ナトリウム
、0.01MのトリスHCl、pH8.0)で洗浄した。250mMのイミダゾ
ールを含むバッファーCでカラムを溶出させた。約10mgのApaf-1タン
パク質が500mlの培養物から精製された。
チトクロムCのウェスタンブロット分析を上掲のLieらに記載されているよう
にして実施した。抗Apaf-1抗血清を、上述のようにして生産された組換え
Apaf-1融合タンパク質でウサギを免疫することにより産生した。免疫ブロ
ット分析を、増強化学ルミネッセンスウェスタンブロット検出試薬(アマシャム)
を使用して西洋わさびペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス(チトクロムC)又はヤ
ギ抗ウサギ(Apaf-1)免疫グロブリンGで実施した。
図12に示されるように、Apaf-1に対する抗血清はApaf-1を沈殿さ
せたが、同じ動物からの免疫前血清はそうではなかった。Apaf-1に対する
抗血清はまたチトクロムCを沈殿させたが(図13)、これはチトクロムCがAp
af-1と複合体を形成することを示している。免疫前血清はそのような沈殿を
生じなかった。Apaf-1に対するチトクロムCの結合はdATPの有無には
影響されなかった(図13、レーン3−6)。
未精製サイトゾル抽出物においてチトクロムCがApaf-1と相互作用をす
ることを確認するために、免疫沈降実験を、非分画HeLa細胞S-100を使
用して実施した。図12のレーン7−8に示されているように、S-100画分
のApaf-1は抗Apaf-1抗血清により沈殿させられた。均質化の間サイト
ゾルに放出されるチトクロムC(Liuら,1996,上掲)がApaf-1と共沈降した(
図12、レーン8)。免疫前血清はタンパク質を沈降させなかった(レーン7)。
実施例8
293細胞におけるApaf-1の発現
Apaf-1の全コード領域プラス577bpの5'非翻訳領域及び約1.5k
bの3'非翻訳領域を含む5.7kbのcDNA(実施例6に対して上述したよう
に、ヌクレオチド5727でEcoRI部位で切り詰めたもの)をpcDNA3.
1(-)
ベクター(インビトロゲン)のNotI及びEcoRI部位にサブクローニングし
、プラスミド(pApaf-1)をキアゲンメガ(Qiagen Mega)プラスミドキットを
使用して調製した。ヒト胚性腎臓293細胞を、10%のウシ胎児血清が補填さ
れた培地A(100U/mlのペニシリンと100μg/mlのストレプトマイ
シンサルフェートを含むダルベコの変性イーグル培地)に、100mm皿当り1
x106細胞にてプレーティングし、6−7%CO2の雰囲気中で37℃で単層で
成長させた。24時間のインキュベーション後、細胞を、15μgのベクターだ
け;10μgのpApaf-1プラス5μgのベクター;10μgのベクタープ
ラス5μgのpCPP32(ハムスターカスパーゼ-3)(Wangら,1996,EMBO J.
15:1012-1020):又は10μgのpApaf-1プラス5μgのpCPP32で、(
Huaら,Cell 87:415-426(1996))に記載されたようなMBSトランスフェクショ
ンキット(ストラタジーン)を使用してトランスフェクトした。36時間のさらな
るインキュベーション後、細胞を収集し、サイトゾルS-100画分を実施例2
に対して上述したようにして調製した。
対照(レーン1)、pApaf-1トランスフェクト(レーン2、4)及びpCP
P32トランスフェクト(レーン3、4)細胞からのサイトゾルの一定分量(30
μg)を8%のSDS-PAGE(図14の上のパネル)又は15%のSDS-PA
GE(下のパネル)で分析し、ニトロセルロースフィルター上にブロットした。フ
ィルターを、ウサギ抗Apaf-1抗血清(1:2000、上のパネル)又はウサ
ギ抗ハムスターカスパーゼ-3(1:2000、下のパネル)の何れかで探索した
。抗原−抗体複合体を、上述のような西洋わさびペルオキシダーゼ抱合抗体及び
増強化学ルミネッセンスウェスタンブロット試薬(アマシャム)で可視化させた。
フィルムを30秒(上のパネル)又は40秒(下のパネル)の間露光させた。レー
ン5は実施例2に対して記載されたモノQカラム工程まで精製された3μlのA
paf-1タンパク質を含んでいた。結果は図14に示され、pApaf-1とp
カスパーゼ-3の哺乳動物細胞における発現を示している。
トランスフェクトされた細胞のサイトゾルに対して、実施例1に対して上述し
た無細胞アッセイを使用して、そのアポトーシスを誘導する能力を更に分析した
。提示されたプラスミドでトランスフェクトされた293細胞から調製されたサ
イト
ゾル40μgの一定分量をバッファーAで、1mMのdATP;0.2μgのチ
トクロムC;又は1mMのdATPプラス0.2μgのチトクロムCの存在下で
、30℃で30分間、最終容量が20μlに調整されたバッファーAでインキュ
ベートした。試料を、15%SDS-PAGEにかけ、次いでウサギ抗カスパー
ゼ3抗体(1:2000)を使用してウェスタンブロット分析を実施した。抗原-
抗体複合体を上述のECL法により可視化した。
図15に示されるように、哺乳動物細胞において発現された組換えApaf-
1はdATPとチトクロムCとの組合わせで効果的であった。この混合物はカス
パーゼ3前駆物質のその活性な切断産物への切断を誘発した。
実施例9
選択的にスプライシングされた転写物:Apaf-1L非一致ペプチドフラグメント:
上述のApaf-1遺伝子の配列と同一性を確認するために、遺伝子から発現
されたタンパク質を、実施例3に記載されたようにして、精製し、消化させ、キ
ャピラリー逆相HPLCにより分離し、マトリックス補助レーザー脱着/イオン
化及び質量分析によりペプチドフラグメントを分析した。発現されたタンパク質
のフラグメントに対して得られたスペクトルを、実施例3の精製タンパク質から
得られたスペクトルと比較した。発現されたタンパク質からのペプチド質量の各
々は、1つのフラグメントを除いて、精製タンパク質からのペプチド質量と一致
しているようであった。
実施例3と図5A−OのApaf-1cDNAの5'領域との、Apaf-1(A
p2)の5'領域をコードしている1.4kbの部分クローンの核酸配列の比較に
より、Ap2が、クローン化Apaf-1には見られなかったced-4の相同領
域の最初の11のアミノ酸をコードしている33のヌクレオチドを含んでいたこ
とが明らかにされた。
選択的にスプライシングされた転写物:
選択的にスプライシングされた転写物の存在を確認するために、Apaf-1
の
選択的にスプライシングされた領域を増幅するために設計された特定のプライマ
ーを使用してRT-PCRを実施した。
ラピッドmRNA精製キット(ファーマシア)を使用してHeLaポリ(A)+m
RNAを精製した。実施例3に対して上述された3kbのクローンの3'末端か
ら設計した、特定のプライマーAppC5'-AACACTTCACTATCAC
TTCC-3'[配列番号:8]が、第1ストランドcDNA合成キット(ファーマ
シア)を使用して、第1ストランドcDNAに運ばれた。この第1ストランドの
cDNAの400ngの一定分量を、2つのPCRプライマー:更なる33のヌ
クレオチドの5'側と3'側のそれぞれから設計されたApn5'TAATGAT
TCCTACGTATCATTCTACAATGC-3'[配列番号:13]及びA
ps105'-GAATGATCTCTAACAGCTTC-3'[配列番号:14]
により増幅した。
316bpと283bpの双方のPCR生成物(図17に示す)をTAクローニ
ングキット(インビトロゲン)を使用してPCRIIベクター内にクローン化し配
列決定した。Apaf-1Lの得られた核酸配列を以下に示す[配列番号:15]
。その計算上見積もったアミノ酸配列もまた示す[配列番号:16]。
Apaf-1とApaf-1Lの間の差:
Apaf-1Lのアミノ酸配列[配列番号:16]は、Apaf-1Lのアミノ酸
配列において下線で示されたアミノ酸残基108の後に挿入された更に11のア
ミノ酸(GKDSVSGITSY)を有していることで、Apaf-1アミノ酸配
列[配列番号:2]と異なる(図17を参照)。下線が付された更に33の核酸(T
GGTAAAGATTCAGTTAGTGGAATAACTTCGTA)を持つ
Apaf-1Lの核酸配列[配列番号:15]を図16A−16Hに示す。
2つのPCR生成物が、図18に示されるように、RT-PCR反応から観察
され、これは、この領域にわたって選択的にスプライシングされた転写物の存在
を示している。2つのPCR生成物の直接配列解析により、より長い配列(Ap
af-1L)がAp2の配列をコード化し、挿入された11のアミノ酸を有してい
ることが確認された。より短い生成物はApaf-1の同一配列を有していた。
更に11のアミノ酸がCed-3相同領域とCed-4相同領域の接合部に位置
しているので、Ced-3及びCed-4とのApaf-1Lの全体の相同性はA
paf-1のものと同じままである。Apaf-1Lのアミノ酸82−100の計
算分子量は、実施例3に対して上述した精製Apaf-1のK43ペプチドに対
して測定された質量とまた相関しており、Apaf-1LがHeLa細胞から精
製されたApaf-1内に存在していることを示している。
Apaf-1Lの機能性発現:
組換えApaf-1Lの機能を試験するために、ハムスターカスパーゼ-3をコ
ードしているcDNAインサートを含むプラスミドを、Apaf-1L(Apaf
-1Lの全コード領域プラス577塩基対の5'非翻訳領域と1.5kbの3'非
翻訳領域)をコードしているcDNAインサートを含むプラスミドと共にヒト胚
性腎臓293細胞内に同時形質転換し、もしくはApaf-1の同じ領域をpc
DNA3.1内に挿入した。形質転換方法は実施例8に対して上述したものとし
た。
形質転換した細胞について、実施例3に対して記載したようにして、カスパー
ゼ-3活性化能を検査した。図19A及び19Bに示されるように、Apaf-1
Lは、カスパーゼ-3のより高い発現がApaf-1Lと共に同時形質転換された
ときに観察されたので、Apaf-1と同様に機能した。また、Apaf-1L過
剰発現細胞からの細胞抽出物はより高いカスパーゼ活性化能を示した。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに
取り込む。
【手続補正書】
【提出日】平成11年12月10日(1999.12.10)
【補正内容】
請求の範囲
1. 配列番号:2の配列又は配列番号:16の配列と、少なくとも約80%の
アミノ酸配列同一性を有する単離Apaf-1タンパク質。
2. 配列番号:2の配列又は配列番号:16の配列と、少なくとも約90%の
アミノ酸配列同一性を有する請求項1に記載のApaf-1タンパク質。
3. 配列番号:2の配列又は配列番号:16の配列と、少なくとも約95%の
アミノ酸配列同一性を有する請求項2に記載のApaf-1タンパク質。
4. 配列番号:2又は配列番号:16のアミノ酸残基を含んでなる単離Apa
f-1タンパク質。
5. 異種性アミノ酸配列に融合した請求項1に記載のApaf-1タンパク質
を含んでなるキメラ分子。
6. 前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項5に記載のキ
メラ分子。
7. 前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列である請求項5に記載のキ
メラ分子。
8. 前記免疫グロブリン配列がIgGである請求項7に記載のキメラ分子。
9. 請求項1に記載のApaf-1タンパク質に結合する抗体。
10. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項9に記載の抗体。
11. アゴニスト抗体である請求項9に記載の抗体。
12. 請求項1に記載のApaf-1をコードする核酸配列を含んでなる単離
核酸。13
. 前記核酸配列が、配列番号:2又は配列番号:16のアミノ酸配列のア
ミノ酸配列をコードしている請求項12に記載の核酸。14
. 請求項12に記載の核酸を含んでなるベクター。15
. ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される対照配列に作用可能
に結合した請求項14に記載のベクター。16
. 請求項14に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。17
. 請求項16に記載の宿主細胞を培養して、宿主細胞中にApaf-1タ
ンパク質を発現させることを含んでなるApaf-1タンパク質の生成方法。18
. Apaf-1タンパク質をコードする挿入核酸配列を発現する細胞を含
む非ヒト・トランスジェニック動物。19
. マウス又はラットである請求項18に記載の動物。20
. Apaf-1タンパク質をコードする変更遺伝子を有する細胞を含む、
非ヒト、ノックアウト動物。21
. マウス又はラットである請求項20に記載の動物。22
. 容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物がApaf-1
タンパク質又は抗Apaf-1抗体を含む製造品。23
. インビボ又はエキソビボにおいてApaf-1タンパク質又は抗Apa
f-1抗体を使用するための使用説明書をさらに含んでなる請求項22に記載の
製造品。24
. アポトーシスを変調する薬剤に対する化合物をスクリーニングする方法
において、
Apaf-1タンパク質に結合するチトクロムCを競合的に置換する候補化合
物の置換能を分析し;
候補化合物による前記Apaf-1タンパク質に結合するチトクロムCの競合
的置換を、候補化合物のアポトーシス変調能と相関付ける;
ことを含んでなる方法。25
. アポトーシスを変調する化合物を同定する方法において、
Apaf-1タンパク質、Adaf-3タンパク質、dATP、及びチトクロム
Cを含む混合物中で候補化合物をインキュベートし;
インキュベート混合物にカスパーゼ前駆体を添加し;
候補化合物の不在下での切断と比較した候補化合物の存在下でのカスパーゼ前
駆体の切断変化を、候補化合物のアポトーシス変調能と相関付ける;
ことを含んでなる方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 35/00 A61P 37/00
37/00 43/00 105
43/00 105 C07K 14/47
C07K 14/47 16/18
16/18 19/00
19/00 C12N 1/15
C12N 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 C12P 21/02 C
5/10 21/08
C12P 21/02 G01N 33/15 Z
21/08 33/50 Z
G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA
33/50 5/00 A
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,
NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,L
S,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ
,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL
,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,
BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,E
E,ES,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU
,ID,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
D,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL
,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,
SL,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ,V
N,YU,ZW
(72)発明者 ヘンゼル,ウィリアム ジェー.
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94403,サン マテオ,サウスウッド ア
ヴェニュー 3724番地
(72)発明者 ワン,ジアオドン
アメリカ合衆国 テキサス州 75287,ダ
ラス,ストーン ホロー ウェイ 4063番
地
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 配列番号:2の配列又は配列番号:16の配列と、少なくとも約80%の アミノ酸配列同一性を有する単離Apaf-1タンパク質。 2. 配列番号:2の配列又は配列番号:16の配列と、少なくとも約90%の アミノ酸配列同一性を有する請求項1に記載のApaf-1タンパク質。 3. 配列番号:2の配列又は配列番号:16の配列と、少なくとも約95%の アミノ酸配列同一性を有する請求項2に記載のApaf-1タンパク質。 4. 配列番号:2又は配列番号:16のアミノ酸残基を含んでなる単離Apa f-1タンパク質。 5. 異種性アミノ酸配列に融合した請求項1に記載のApaf-1タンパク質 を含んでなるキメラ分子。 6. 前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項5に記載のキ メラ分子。 7. 前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列である請求項5に記載のキ メラ分子。 8. 前記免疫グロブリン配列がIgGである請求項7に記載のキメラ分子。 9. 請求項1に記載のApaf-1タンパク質に結合する抗体。 10. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項9に記載の抗体。 11. アゴニスト抗体である請求項9に記載の抗体。 12. 請求項1に記載のApaf-1をコードする核酸配列を含んでなる単離 核酸。 13. 配列番号:1又は配列番号:15の核酸配列を含んでなる請求項12に 記載の単離核酸。 14. 前記核酸配列が、配列番号:2又は配列番号:16のアミノ酸配列のア ミノ酸配列をコードしている請求項12に記載の核酸。 15. 配列番号:1又は配列番号:15の核酸配列に高厳密性条件下でハイブ リダイズする核酸配列を含んでなる単離核酸。 16. 請求項12に記載の核酸を含んでなるベクター。 17. ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される対照配列に作用可能 に結合した請求項16に記載のベクター。 18. 請求項16に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。 19. 請求項18に記載の宿主細胞を培養して、宿主細胞中にApaf-1タ ンパク質を発現させることを含んでなるApaf-1タンパク質の生成方法。 20. Apaf-1タンパク質をコードする挿入核酸配列を発現する細胞を含 む非ヒト・トランスジェニック動物。 21. マウス又はラットである請求項20に記載の動物。 22. Apaf-1タンパク質をコードする変更遺伝子を有する細胞を含む、 非ヒト、ノックアウト動物。 23. マウス又はラットである請求項22に記載の動物。 24. 容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物がApaf-1 タンパク質又は抗Apaf-1抗体を含む製造品。 25. インビボ又はエキソビボにおいてApaf-1タンパク質又は抗Apa f-1抗体を使用するための使用説明書をさらに含んでなる請求項24に記載の 製造品。 26. アポトーシスを変調する薬剤に対する化合物をスクリーニングする方法 において、 Apaf-1タンパク質に結合するチトクロムCを競合的に置換する候補化合 物の置換能を分析し; 候補化合物による前記Apaf-1タンパク質に結合するチトクロムCの競合 的置換を、候補化合物のアポトーシス変調能と相関付ける; ことを含んでなる方法。 27. アポトーシスを変調する化合物を同定する方法において、 Apaf-1タンパク質、Adaf-3タンパク質、dATP、及びチトクロム Cを含む混合物中で候補化合物をインキュベートし; インキュベート混合物にカスパーゼ前駆体を添加し; 候補化合物の不在下での切断と比較した候補化合物の存在下でのカスパーゼ前 駆体の切断変化を、候補化合物のアポトーシス変調能と相関付ける; ことを含んでなる方法。
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