JPH0775536B2 - 遺伝子組み換え菌を用いた酵素生産装置 - Google Patents
遺伝子組み換え菌を用いた酵素生産装置Info
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- JPH0775536B2 JPH0775536B2 JP61067907A JP6790786A JPH0775536B2 JP H0775536 B2 JPH0775536 B2 JP H0775536B2 JP 61067907 A JP61067907 A JP 61067907A JP 6790786 A JP6790786 A JP 6790786A JP H0775536 B2 JPH0775536 B2 JP H0775536B2
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- Japan
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- enzyme
- tank
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- filtration
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/14—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing enzymes
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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- C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子組み換え菌による酵素生産方法及びその
方法に用いられる酵素生産装置に関し、特に酵素を大量
に生産するために用いられるものである。
方法に用いられる酵素生産装置に関し、特に酵素を大量
に生産するために用いられるものである。
近年、遺伝子組み換え菌を用いた有用物質の生産が注目
されている。しかし、これら有用物質の生産は実験段階
に留まっているものが多い、大量生産可能な段階には達
していない。
されている。しかし、これら有用物質の生産は実験段階
に留まっているものが多い、大量生産可能な段階には達
していない。
本発明は上記事情を考慮してなされたものであり、酵素
を大量に生産することができる遺伝子組み換え菌による
酵素生産方法及びこの方法に使用される酵素生産装置を
提供しようとするものである。
を大量に生産することができる遺伝子組み換え菌による
酵素生産方法及びこの方法に使用される酵素生産装置を
提供しようとするものである。
本発明の遺伝知組み換え菌を用いた酵素生産装置は、酵
素遺伝子及びアポリプレッサーを生成する調節遺伝子を
導入した宿主菌を、コリプレッサーを含む培地を用いて
培養する培養槽と、該培養槽内の培養液を通過させて前
記コリプレッサーをクロスフロー濾過により除去する筒
状のセラミックフィルターと、培養液を前記培養槽から
フィルターを通過させる循環させる循環系と、前記培養
槽にコリプレッサーを含まない培地を供給する培地供給
槽とを具備したことを特徴とするものである。
素遺伝子及びアポリプレッサーを生成する調節遺伝子を
導入した宿主菌を、コリプレッサーを含む培地を用いて
培養する培養槽と、該培養槽内の培養液を通過させて前
記コリプレッサーをクロスフロー濾過により除去する筒
状のセラミックフィルターと、培養液を前記培養槽から
フィルターを通過させる循環させる循環系と、前記培養
槽にコリプレッサーを含まない培地を供給する培地供給
槽とを具備したことを特徴とするものである。
酵素遺伝子及びアポリプレッサーを生成する調節遺伝子
を導入した宿主菌では、調節遺伝子でアポリプレッサー
が生成される。本発明方法では初期には、この宿主菌を
コリプレッサーを含む培地を用いて培養するので、調節
遺伝子で生成されるアポリプレッサーがコリプレッサー
と結合してリプレッサーとなり、このリプレッサーが酵
素遺伝子のオペレータ部位に結合して転写を抑制する。
このため、酵素の生産が抑制された状態で菌体が増殖
し、菌体数そのものは増加する。その後、培養液からコ
リプレッサーを除去するとともに、コリプレッサーを含
まない培養液を用いて培養すると、宿主菌により酵素が
生産される。このように菌体数を増加させた後に酵素を
生成させるので、酵素の大量生産が可能となる。
を導入した宿主菌では、調節遺伝子でアポリプレッサー
が生成される。本発明方法では初期には、この宿主菌を
コリプレッサーを含む培地を用いて培養するので、調節
遺伝子で生成されるアポリプレッサーがコリプレッサー
と結合してリプレッサーとなり、このリプレッサーが酵
素遺伝子のオペレータ部位に結合して転写を抑制する。
このため、酵素の生産が抑制された状態で菌体が増殖
し、菌体数そのものは増加する。その後、培養液からコ
リプレッサーを除去するとともに、コリプレッサーを含
まない培養液を用いて培養すると、宿主菌により酵素が
生産される。このように菌体数を増加させた後に酵素を
生成させるので、酵素の大量生産が可能となる。
また、本発明の酵素生産装置は、培養槽、培養液からコ
リプレッサーを除去する手段となる筒状のフィルター及
び培養液の循環系ならびにコリプレッサーを含まない培
地を供給する培地供給槽を設けたものである。筒状のフ
ィルターではクロスフローロ過によりコリプレッサーが
迅速に除去されるので、上記の酵素生産方法を容易に適
用することができ、酵素生産の制御及び大量生産が可能
になる。
リプレッサーを除去する手段となる筒状のフィルター及
び培養液の循環系ならびにコリプレッサーを含まない培
地を供給する培地供給槽を設けたものである。筒状のフ
ィルターではクロスフローロ過によりコリプレッサーが
迅速に除去されるので、上記の酵素生産方法を容易に適
用することができ、酵素生産の制御及び大量生産が可能
になる。
以下、本発明をβ−ガラクトシダーゼの生産に適用した
実施例を図面を参照して説明する。
実施例を図面を参照して説明する。
まず、遺伝子組み換え技術により、第３図に示すよう
に、トリプトファンプロモータtrpを含むプラスミドpOC
T2に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子lacZ、β−ガラクト
シドパーミアーゼ遺伝子lacY、ガラクトシドトランスア
セチラーゼ遺伝子lacAを導入したプラスミドpMCT98を調
製した。黒い矢印で示す部位trpにはプロモータＰ、オ
ペレータＯ、アテニュエータAtが存在する。
に、トリプトファンプロモータtrpを含むプラスミドpOC
T2に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子lacZ、β−ガラクト
シドパーミアーゼ遺伝子lacY、ガラクトシドトランスア
セチラーゼ遺伝子lacAを導入したプラスミドpMCT98を調
製した。黒い矢印で示す部位trpにはプロモータＰ、オ
ペレータＯ、アテニュエータAtが存在する。
次に、pMCT98とアポリプレッサーtrpRをクローン化した
プラスミドpRLK13（第４図図示）とを金属イオンの共存
下で、大腸菌C600内に移植して形質転換した。
プラスミドpRLK13（第４図図示）とを金属イオンの共存
下で、大腸菌C600内に移植して形質転換した。
この形質転換された大腸菌C600では、コリプレッサーで
あるトリプトファンが存在すると、このトリプトファン
がプラスミドpRLK13のtrpR部位で生成されるアポリプレ
ッサーと結合してリプレッサーを生成し、このリプレッ
サーがプラスミドpMCT98のtrp部位のオペレータに結合
して転写が抑制される。逆に、トリプトファンが存在し
ないと転写が開始される。下記表に上記のようにして得
られた大腸菌C600を培養したときのトリプトファン濃度
とβ−ガラクトシダーゼの比活性との関係を示す。下記
表から明らかなように、トリプトファン濃度が高いほ
ど、比活性が低くなっている。
あるトリプトファンが存在すると、このトリプトファン
がプラスミドpRLK13のtrpR部位で生成されるアポリプレ
ッサーと結合してリプレッサーを生成し、このリプレッ
サーがプラスミドpMCT98のtrp部位のオペレータに結合
して転写が抑制される。逆に、トリプトファンが存在し
ないと転写が開始される。下記表に上記のようにして得
られた大腸菌C600を培養したときのトリプトファン濃度
とβ−ガラクトシダーゼの比活性との関係を示す。下記
表から明らかなように、トリプトファン濃度が高いほ
ど、比活性が低くなっている。
この大腸菌を用いて、第１図に概略構成を示す酵素生産
装置によりβ−ガラクトシダーゼの生産を行なった。ま
ず、第１図図示の酵素生産装置について説明する。第１
図において、培養槽１中には上記のようにして得られた
遺伝子組み換え大腸菌C600の培養液２が収容される。こ
の培養液２は恒温槽３から送られる恒温水によって一定
温度に維持される。クロスフローロ過を行なう場合、こ
の培養液２は配管４、ポンプ５及びボールバルブ６を介
装した配管７、流量計８ならびに入口配管９を通ってフ
ィルターケース10内に設けられたセラミックフィルター
11内を通過する。このセラミックフィルター11を透過し
たロ過液１は電磁弁13を介装したロ過液配管14を通って
ロ過液槽15に収容される。一方、菌体を含む濃縮液はボ
ールバルブ16を介装した出口配管17を通って培養槽１に
循環される。なお、配管４と配管７との間にはポンプ５
と並列して、ボールバルブ18を介装したバイパス配管19
が接続されている。また、入口配管９及び出口配管17に
はそれぞれ圧力計20、21が設けられている。また、ロ過
液配管14には、電磁弁22を介装した逆洗用のガス供給配
管23が接続されている。更に、培養槽１には液面計24が
設けられており、この液面計24と連動するポンプ25によ
り新しい培養液がロ液量に合わせて培地供給槽26から培
養槽１へ供給される。
装置によりβ−ガラクトシダーゼの生産を行なった。ま
ず、第１図図示の酵素生産装置について説明する。第１
図において、培養槽１中には上記のようにして得られた
遺伝子組み換え大腸菌C600の培養液２が収容される。こ
の培養液２は恒温槽３から送られる恒温水によって一定
温度に維持される。クロスフローロ過を行なう場合、こ
の培養液２は配管４、ポンプ５及びボールバルブ６を介
装した配管７、流量計８ならびに入口配管９を通ってフ
ィルターケース10内に設けられたセラミックフィルター
11内を通過する。このセラミックフィルター11を透過し
たロ過液１は電磁弁13を介装したロ過液配管14を通って
ロ過液槽15に収容される。一方、菌体を含む濃縮液はボ
ールバルブ16を介装した出口配管17を通って培養槽１に
循環される。なお、配管４と配管７との間にはポンプ５
と並列して、ボールバルブ18を介装したバイパス配管19
が接続されている。また、入口配管９及び出口配管17に
はそれぞれ圧力計20、21が設けられている。また、ロ過
液配管14には、電磁弁22を介装した逆洗用のガス供給配
管23が接続されている。更に、培養槽１には液面計24が
設けられており、この液面計24と連動するポンプ25によ
り新しい培養液がロ液量に合わせて培地供給槽26から培
養槽１へ供給される。
前記セラミックフィルター11としては、第２図に示すも
のを用いた。このフィルター31は、全長750mmで、６角
柱形状のアルミナ製フィルター本体32の両端にセラミッ
クスシール33を取付け、これらの長手方向に沿って直径
4mmの通過孔34を19個設けたものであり、有効ロ過面積
は0.18m2である。なお、前記フィルター本体32は通過孔
34の周囲で気孔径が徐々に大きくなるような多層構造を
有するもの（セラベールセラミックスフィルター：東芝
セラミックス社製商品名）である。また、各フィルター
の通過孔に面するアルミナの気孔径は0.2μｍである。
のを用いた。このフィルター31は、全長750mmで、６角
柱形状のアルミナ製フィルター本体32の両端にセラミッ
クスシール33を取付け、これらの長手方向に沿って直径
4mmの通過孔34を19個設けたものであり、有効ロ過面積
は0.18m2である。なお、前記フィルター本体32は通過孔
34の周囲で気孔径が徐々に大きくなるような多層構造を
有するもの（セラベールセラミックスフィルター：東芝
セラミックス社製商品名）である。また、各フィルター
の通過孔に面するアルミナの気孔径は0.2μｍである。
上記酵素生産装置により、以下のようにしてβ−ガラク
トシダーゼを生産した。
トシダーゼを生産した。
まず、要求アミノ酸、炭素源となるグルコース及び濃度
100〜200μg/mlのトリプトファンを添加した流加培養用
培地を用い、37℃においてpH7で流加培養を５時間行な
った。
100〜200μg/mlのトリプトファンを添加した流加培養用
培地を用い、37℃においてpH7で流加培養を５時間行な
った。
次に、培地供給槽26からトリプトファンを含まない以外
は上記と同一組成の流加培養用培地を供給しながら、培
養槽１内の培養液２をポンプ６によりフィルター11内を
通過させて培養液からトリプトファンを除去し、菌体を
含む濃縮液は培養槽１へ循環させた。
は上記と同一組成の流加培養用培地を供給しながら、培
養槽１内の培養液２をポンプ６によりフィルター11内を
通過させて培養液からトリプトファンを除去し、菌体を
含む濃縮液は培養槽１へ循環させた。
このときの培養時間と、トリプトファン濃度、菌体濁
度、β−ガラクトシダーゼの全活性及び比活性との関係
を第５図に示す。なお、第５図ではロ過開始時を破線で
表示する。また、第６図にロ液量とトリプトファン濃度
との関係を、第７図に培養時間とロ過流束との関係をそ
れぞれ示す。
度、β−ガラクトシダーゼの全活性及び比活性との関係
を第５図に示す。なお、第５図ではロ過開始時を破線で
表示する。また、第６図にロ液量とトリプトファン濃度
との関係を、第７図に培養時間とロ過流束との関係をそ
れぞれ示す。
第５図から明らかなように、ロ過開始後、培養液中のト
リプトファン濃度は急激に減少している。ロ過開始直後
のトリプトファン濃度の減少の様子は第６図に示すよう
なものであり、迅速にトリプトファンを除去できること
がわかる。
リプトファン濃度は急激に減少している。ロ過開始直後
のトリプトファン濃度の減少の様子は第６図に示すよう
なものであり、迅速にトリプトファンを除去できること
がわかる。
また、第５図の菌体濁度の曲線は、ロ過開始直後を除い
ては、菌体が徐々に増殖していることを示している。た
だし、ロ鵜開始前の方がロ過開始後よりも菌体の増加率
が大きくなっている。これは、ロ過開始前は酵素が生成
されず、菌体の増殖だけが行なわれるが、ロ過開始後は
トリプトファンが減少するので菌体が酵素を生成すると
ともに増殖しているものと考えられる。このことは、第
５図のβ−ガラクトシダーゼの全活性及び比活性の曲線
が、ロ過開始前は非常に低い値であるが、ロ過開始後は
急激に像越していることからもわかる。このように、酵
素生成を制御することができ、酵素の大量生産も可能に
なる。
ては、菌体が徐々に増殖していることを示している。た
だし、ロ鵜開始前の方がロ過開始後よりも菌体の増加率
が大きくなっている。これは、ロ過開始前は酵素が生成
されず、菌体の増殖だけが行なわれるが、ロ過開始後は
トリプトファンが減少するので菌体が酵素を生成すると
ともに増殖しているものと考えられる。このことは、第
５図のβ−ガラクトシダーゼの全活性及び比活性の曲線
が、ロ過開始前は非常に低い値であるが、ロ過開始後は
急激に像越していることからもわかる。このように、酵
素生成を制御することができ、酵素の大量生産も可能に
なる。
また、第７図に示すように、ロ過流束は時間とともに徐
々に減少するが、逆洗間隔及び逆洗圧力を調整すること
により、ロ過流束をある程度回復できることがわかる。
々に減少するが、逆洗間隔及び逆洗圧力を調整すること
により、ロ過流束をある程度回復できることがわかる。
なお、上記実施例ではクロスフローロ過を行なうための
フィルターとして第２図に示すような19個の通過孔を有
するアルミナ製セラミックフィルターを用いたが、フィ
ルターは孔径のそろったものであれば材質は金属製や合
成樹脂製等何でもよく、また通過孔が１個あるいは複数
個でもよい。
フィルターとして第２図に示すような19個の通過孔を有
するアルミナ製セラミックフィルターを用いたが、フィ
ルターは孔径のそろったものであれば材質は金属製や合
成樹脂製等何でもよく、また通過孔が１個あるいは複数
個でもよい。
以上詳述した如く本発明によれば、酵素の生産を制御す
ることができ、しかも酵素の大量生産も可能になる等顕
著な効果を奏するものである。
ることができ、しかも酵素の大量生産も可能になる等顕
著な効果を奏するものである。
第１図は本発明の実施例における酵素生産装置の概略構
成図、第２図は同装置に用いられるフィルターを一部破
断して示す斜視図、第３図及び第４図はそれぞれ本発明
の実施例において大腸菌に移植されたプラスミドの説明
図、第５図は本発明の実施例で得られた培養時間と、ト
リプトファン濃度、菌体濁度、酵素の全活性及び酵素の
比活性との関係を示す特性図、第６図は本発明の実施例
で得られたロ液量とトリプトファン濃度との関係を示す
特性図、第７図は本発明の実施例で得られた培養時間と
ロ過流束との関係を示す特性図である。 １……培養槽、２……培養液、３……恒温槽、４、７…
…配管、５……ポンプ、６、16、18……ボールバルブ、
８……流量計、９……入口配管、10……フィルターケー
ス、11……セラミックフィルター、12……ロ過液、13、
22……電磁弁、14……ロ過液配管、15……ロ過液槽、17
……出口配管、19……バイパス配管、20、21……圧力
計、23……ガス供給配管、24……液面計、25……ポン
プ、26……培地供給槽、31……セラミックフィルター、
32……フィルター本体、33……セラミックスシール、34
……通過孔。
成図、第２図は同装置に用いられるフィルターを一部破
断して示す斜視図、第３図及び第４図はそれぞれ本発明
の実施例において大腸菌に移植されたプラスミドの説明
図、第５図は本発明の実施例で得られた培養時間と、ト
リプトファン濃度、菌体濁度、酵素の全活性及び酵素の
比活性との関係を示す特性図、第６図は本発明の実施例
で得られたロ液量とトリプトファン濃度との関係を示す
特性図、第７図は本発明の実施例で得られた培養時間と
ロ過流束との関係を示す特性図である。 １……培養槽、２……培養液、３……恒温槽、４、７…
…配管、５……ポンプ、６、16、18……ボールバルブ、
８……流量計、９……入口配管、10……フィルターケー
ス、11……セラミックフィルター、12……ロ過液、13、
22……電磁弁、14……ロ過液配管、15……ロ過液槽、17
……出口配管、19……バイパス配管、20、21……圧力
計、23……ガス供給配管、24……液面計、25……ポン
プ、26……培地供給槽、31……セラミックフィルター、
32……フィルター本体、33……セラミックスシール、34
……通過孔。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 999999999 花王株式会社 東京都中央区日本橋茅場町１丁目14番10号 (72)発明者 小林 猛 愛知県名古屋市千種区下方町４丁目29番地 (72)発明者 飯島 信司 愛知県名古屋市千種区北千種３丁目３番２ 号 (72)発明者 谷口 正之 愛知県名古屋市千種区北千種１丁目９番５ 号 仲田住宅ＲＬ−14 (72)発明者 安田 俊二 東京都新宿区西新宿１丁目26番２号 東芝 セラミツクス株式会社内 (72)発明者 加藤 能久 愛知県刈谷市小垣江町南藤１番地 東芝セ ラミツクス株式会社刈谷製造所内 (72)発明者 小川 孝 愛知県刈谷市小垣江町南藤１番地 東芝セ ラミツクス株式会社刈谷製造所内 (72)発明者 川合 修次 愛知県名古屋市緑区嗚海町伝治山１−５ (56)参考文献 特開 昭58−141796（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】酵素遺伝子及びアポリプレッサーを生成す
る調節遺伝子を導入した宿主菌を、コリプレッサーを含
む培地を用いて培養する培養槽と、該培養槽内の培養液
を通過させて前記コリプレッサーをクロスフロー濾過に
より除去する筒状のセラミックフィルターと、培養液を
前記培養槽からフィルターを通過させる循環させる循環
系と、前記培養槽にコリプレッサーを含まない培地を供
給する培地供給槽とを具備したことを特徴とする遺伝子
組み換え菌を用いた酵素生産装置。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61067907A JPH0775536B2 (ja) | 1986-03-26 | 1986-03-26 | 遺伝子組み換え菌を用いた酵素生産装置 |
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