KR20120057565A - 항-ＦｃＲＨ５ 항체 및 면역접합체 및 사용 방법 - Google Patents

항-ＦｃＲＨ５ 항체 및 면역접합체 및 사용 방법 Download PDF

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KR20120057565A
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cell
amino acid
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크리스티 엘킨스
앤드류 폴슨
알렌 에벤스
카멜리아 아담스
빙 젱
자가트 알. 주누툴라
조-앤 혼고
얀 유
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 FcRH6에 특이적인 항체, 포유동물에서 조혈성 종양의 치료에 유용한 상기 항체를 포함하는 조성물, 및 이러한 목적으로 상기 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-ＦｃＲＨ５ 항체 및 면역접합체 및 사용 방법{Anti-FcRH5 antibodies and immunoconjugates and methods of use}
서열 목록에 대한 참조
본원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 포함하며, 전체가 참조로 본원에 포함된다. 2010년 2월 10일자로 생성된 상기 ASCII 카피는 PR5ll42.txt라 명명되며, 85,281 byte 크기이다.
본 발명은 포유동물에서 조혈성 종양의 치료에 유용한 조성물 및 이를 위한 상기 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
악성 종양 (암)은 미국에서 심장 질환 다음으로 두 번째의 주요 사인이다 [Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)]. 암은, 증식하여 종양 덩어리를 형성하는 정상 조직으로부터 유래되는 비정상적 또는 신생물성 세포 수의 증가, 이들 신생물성 종양 세포에 의한 인접 조직의 침습, 및 결국 전이로 불리는 과정을 통해 국소 림프절 및 먼 부위로 혈액 또는 림프계를 통해 확산하는 악성 세포의 생성을 특징으로 한다. 암성 상태에서, 세포는 정상 세포가 성장하지 않을 조건 하에 증식한다. 암은 상이한 정도의 침습성 및 공격성을 특징으로 하는 매우 다양한 형태로 그 자신을 나타낸다.
혈액의 세포 성분, 예를 들어 림프구, 백혈구, 혈소판, 적혈구 및 천연 킬러 세포가 생성되는 과정인 조혈과정 동안 생성되는 세포를 포함하는 암이 조혈성 암으로 불린다. 혈액 및 림프 조직에서 발견할 수 있고 면역 반응에 중요한 림프구는 각각 체액성 및 세포 매개성 면역을 매개하는 2가지 주요 부류의 림프구: B 림프구 (B 세포) 및 T 림프구 (T 세포)로 분류된다.
B 세포는 골수 내에서 성숙하고, 그들의 세포 표면 상에 항원-결합 항체를 발현하면서 골수를 떠난다. 나이브 (naive) B 세포가 이의 막-결합된 항체에 특이적인 항원과 처음 마주치면, 세포는 빠르게 분열하기 시작하고 이의 자손은 기억 B 세포 및 이펙터 (effector) 세포 ("혈장 세포"로 불림)로 분화한다. 기억 B 세포는 수명이 보다 길고, 최초의 모 세포와 동일한 특이성을 갖는 막-결합된 항체를 계속 발현한다. 혈장 세포는 막-결합된 항체를 생성하지는 않지만, 대신에 분비될 수 있는 형태의 항체를 생성한다. 분비된 항체가 체액성 면역의 주요 이펙터 분자이다.
T 세포는 미성숙 T 세포의 증식 및 분화를 위한 환경을 제공하는 흉선 내에서 성숙한다. T 세포 성숙 동안, T 세포는 T-세포 수용체를 생성하는 유전자 재배열, 및 성숙 T 세포의 세표-표면 표현형을 결정하는 것을 돕는 양성 및 음성 선택을 겪는다. 성숙 T 세포의 특징적인 세포 표면 마커는 CD3:T-세포 수용체 복합체 및 공동수용체 중 하나, 즉 CD4 또는 CD8이다.
암 요법을 위한 효과적인 세포성 표적을 발견하기 위한 시도에서, 연구자들은 하나 이상의 정상 비-암성 세포(들)에 비해 하나 이상의 특정 유형(들)의 암 세포의 표면 상에서 특이적으로 발현되는 막횡단 (transmembrane) 또는 막-회합된 폴리펩티드를 확인하고자 하였다. 종종, 이러한 막-회합된 폴리펩티드는 비-암성 세포의 표면에 비해 암 세포의 표면 상에서 더욱 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-연관 세포 표면 항원 폴리펩티드의 확인은 항체-기초 요법을 통한 파괴를 위해 암 세포를 특이적으로 표적화하는 능력을 발생시켰다. 이와 관련하여, 항체-기초 요법은 특정 암의 치료에서 매우 효과적인 것으로 입증되었다는 것에 주목한다. 예를 들어, HERCEPTIN® 및 Rituxan® (둘 모두 Genentech Inc., South San Francisco, California)은 각각 유방암 및 비-호지킨 (Hodgkin) 림프종을 치료하기 위해 성공적으로 사용되고 있는 항체이다. 보다 구체적으로, HERCEPTIN®은 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 원-종양유전자 (proto-oncogene)의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 재조합 DNA-유래된 인간화 모노클로날 항체이다. HER2 단백질 과다발현은 원발 유방암의 25 내지 30％에서 관찰된다. Rituxan®은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대해 생성된 유전학적으로 조작된 키메라 (chimera) 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 이들 두 항체는 CHO 세포에서 재조합 방식으로 생성된다.
암 요법을 위한 효과적인 세포성 표적을 발견하기 위한 다른 시도에서, 연구자들은 (1) 하나 이상의 특정 유형(들)의 비-암성 정상 세포(들)에 비해 하나 이상의 특정 유형(들)의 암 세포(들)에 의해 특이적으로 생성되는 비-막-회합 폴리펩티드, (2) 하나 이상의 정상 비-암성 세포(들)보다 유의하게 더 높은 발현 수준으로 암 세포에 의해 생성되는 폴리펩티드, 또는 (3) 암성 및 비-암성 상태 모두 (예를 들어, 정상 전립선 및 전립선 종양 조직)에서 이의 발현이 단일 (또는 매우 제한된 수의 상이한) 조직 유형(들)에만 특이적으로 제한되는 폴리펩티드를 확인하고자 하였다. 상기 폴리펩티드는 세포 내에 위치할 수 있거나, 암 세포에 의해 분비될 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 암 세포 자체에 의해서가 아니라, 오히려 암 세포에 대한 강화 또는 성장-향상 효과를 갖는 폴리펩티드를 생성 및/또는 분비하는 세포에 의해 발현될 수 있다. 이러한 분비형 폴리펩티드는 종종 암 세포에 정상 세포에 비해 성장 이점을 제공하는 단백질이고, 예를 들어 혈관형성 인자, 세포성 부착 인자, 성장 인자 등과 같은 물질을 포함한다. 이러한 비-막 회합형 폴리펩티드의 길항제의 확인은 이러한 암의 치료를 위한 효과적인 치료제로서 역할을 하는 것으로 예상될 것이다. 또한, 이러한 폴리펩티드의 발현 패턴의 확인은 포유동물에서 특정 암의 진단에 유용할 것이다.
포유동물 암 요법에서 상기 확인된 진전에도 불구하고, 각각 포유동물에서 종양의 존재를 검출할 수 있고 신생물성 세포 성장을 효과적으로 억제할 수 있는 추가의 치료제가 매우 필요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 암성 및 비-암성 상태 모두에서 이의 발현이 단일 (또는 매우 제한된 수의 상이한) 조직 유형(들), 조혈 조직에만 특이적으로 제한되는 폴리펩티드인 세포 막-회합형, 분비형 또는 세포내 폴리펩티드를 확인하고, 포유동물에서 조혈성 암의 치료적 처치 및/또는 검출에 유용한 조성물을 생성하기 위해 이들 폴리펩티드 및 이의 코딩 핵산을 사용하는 것이다.
염색체 1q21의 이상은 B 세포 림프종 및 골수종을 포함한 B 세포 악성종양에서 일반적이나, 이들 이상에 의해 표적되는 유전자는 충분히 알려져 있지 않다. 밴드 1q21-q23을 수반하는 염색체 이상은 B 세포 비-호지킨 림프종 및 다발성 골수종 모두에서 가장 빈번한 유전자 병변 중의 것이다. 비-호지킨 림프종 하위유형 중에서 전위 및 중복을 포함하는 1q21-q23에서의 전위 중지점이, 종종 소포성 및 미만성 큰 B 세포 림프종 (DLCL), 경계-지역 B-세포 림프종 및 버킷 림프종에서 단일 염색체성 이상으로 보고되었다. 골수종 세포주에서 t(1:14)(q21:q32) 염색체 전위의 중지점을 클로닝함으로써, 면역글로불린 상위부류 수용체 전위 관련 (IRTA) 1 및 IRTA2로 불리는 2개의 유전자가 확인되었다. ITRA2는 BXMASl [Nakayama et at, Biochm. Biophys. Res Commun. 285 830-7, 2001] 및 FcRH5 [Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9772-7, 2001]로 확인된 서열과 동일하다. IRTA1 및 IRTA2는 둘다 일 부류의 관련 유전자인 IRTA의 구성원이다.
FcRH5 (또는 IRTA2)는 Fc 수용체 부류에 상동성을 갖는 세포 표면 수용체이다. 이는 정상적으로는 성숙한 B 세포에서 발현되며, FcRH4 (IRTAl)보다 말초 림프 기관에서 상이한 분포를 갖는다. IRTA1은 경계 영역 B 세포에서 발현되며, ITRA2는 또한 배아 중심의 중심세포 및 면역모세포에서 발현된다. IRTA2 발현은 1q21 이상과 함께 다발성 골수종 및 버킷 림프종 세포주에서 해제된다 [Milter et al., Blood 99:2662-2669, 2002]. B 세포 악성종양에서 lq21 구조 재배열의 고빈도 연루는, IRTAl 및 IRTA2가 이들 질환의 발병기전에 중요하다는 것을 제시한다 [PCT 공개 출원 WO 01/38490; 미국 공개 특허원 20080292632, 이들의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨] [Poison, et al., Int Immunol. 2006 Sep; 18(9): 1363-73].
FcRH5가 발현되는 경우, 특히 만성 치료를 위해 환자에게 투여될 때, 항원성이 최소이거나 없는, FcRH5 항원에 대한 치료 항체를 생성하는 것이 유익하다. 본 발명은 상기 필요와 다른 필요를 충족시킨다. 본 발명은 현재의 치료 조성물의 한계를 극복하는 항-FcRH5 항체를 제공하고, 또한 아래 상세한 설명으로부터 명백할 추가의 이점을 제공한다.
암의 치료에서 세포독성제 또는 세포 증식 억제제, 즉 종양 세포를 치사시키거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 접합체 (ADC), 즉, 면역접합체의 사용 [Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; US 4975278]은, 종양으로의 약물 모이어티 (moiety)의 표적화된 전달, 및 그 내에서의 세포내 축적을 가능하게 하며, `이들 비접합된 약물 제제의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 [Baldwin et al. (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506]. ADC의 치료 지수, 즉 최대 효능 및 최소 독성을 개선하기 위한 노력은 약물-연결 및 약물-방출 특성 [Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549]뿐만 아니라 폴리클로날 항체 [Rowland et al. (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87] 및 모노클로날 항체 (mAb)의 선택에 촛점을 맞추었다. 항체 약물 접합체에 사용되는 약물 모이어티는 박테리아 단백질 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 단백질 독소, 예를 들어 리신, 소분자, 예를 들어 아우리스타틴 (auristatin), 겔다나마이신 [Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791], 메이탄시노이드 [EP 1391213; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623], 및 칼리케아미신 [Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342], 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신 [Rowland et al. (1986), 상기 참조]을 포함한다. 약물 모이어티는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 세포독성 및 세포 증식 억제 메카니즘에 영향을 줄 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성이거나 활성이 작은 경향이 있다.
아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체) [WO 02/088172]가 (i) 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y (Lewis Y)에 특이적인); (ii) 혈액암 상의 CD30에 특이적인 cAC10 [Klussman et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al. (2003) Blood 102(4): 1458-1465; US 2004/0018194]; (iii) CD20-발현 암 및 면역 질환의 치료를 위한 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭산 [WO 04/032828]; (iv) 결장직장암 치료를 위한 항-EphB2R 항체 2H9 [Mao et al. (2004) Cancer Research 64(3): 781-788]; (v) E-셀렉틴 항체 [Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6394]; (vi) 트라스투주마브 (HERCEPTIN®, US 2005/0238649), 및 (vii) 항-CD30 항체 [WO 03/043583]에 약물 모이어티로서 접합되었다. 아우리스타틴 E의 변이체는 US 5767237 및 US 6124431에 개시되어 있다. 모노클로날 항체에 접합된 모노메틸 아우리스타틴 E는 2004년 3월 28일 간행된 문헌 [Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623]에 개시되어 있다. 아우리스타틴 유사체 MMAE 및 MMAF가 각종 항체에 접합되었다 [US 2005/0238649].
약물 모이어티를 항체에 부착시키는, 즉, 공유결합을 통해 연결시키는 통상적인 수단은 일반적으로 약물 모이어티가 항체 상의 많은 부위에 부착되는 분자의 불균질 혼합물을 생성한다. 예를 들어, 세포독성 약물은 일반적으로 항체의 종종 수많은 리신 잔기를 통해 항체에 접합되어, 불균질 항체-약물 접합체 혼합물을 생성한다. 반응 조건에 따라, 불균질 혼합물은 일반적으로 0 내지 약 8개 이상의 부착된 약물 모이어티를 갖는 항체의 분포를 포함한다. 추가로, 약물 모이어티 대 항체의 특정 정수비를 갖는 접합체의 각각의 하위군 내에 약물 모이어티가 항체 상의 다양한 부위에 부착되는 잠재적으로 불균질한 혼합물이 존재한다. 분석 및 제조 방법은 접합 반응으로부터 생성되는 불균질 혼합물 내에서 항체-약물 접합체 종 분자를 분리하고 특성화하기에 부적당할 수 있다. 항체는 종종 많은 반응성 관능기를 갖는 크고 복잡하고 구조상 다양한 생체분자이다. 이들의 링커 시약 및 약물-링커 중간체와의 반응성은 pH, 농도, 염 농도, 및 보조-용매와 같은 인자에 의존성이다. 또한, 다단계 접합 과정은 반응 조건을 조절하고 반응물 및 중간체를 특성화하는 어려움 때문에 재현가능하지 않을 수 있다.
pH 7 부근에서 양성자화되고 덜 친핵성인 대부분의 아민과는 달리, 시스테인 티올은 중성 pH에서 반응성이다. 유리 티올 (RSH, 술프하이드릴)기는 비교적 반응성이므로, 시스테인 잔기를 갖는 단백질은 종종 디술피드-연결된 올리고머로서 산화된 형태로 존재하거나, 내적으로 가교된 디술피드기를 갖는다. 세포외 단백질은 일반적으로 유리 티올을 갖지 않는다 [Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, at page 55]. 항체 시스테인 티올기는 일반적으로 항체 아민 또는 하이드록실기보다 친전자성 접합 시약에 대해 더 반응성이고, 즉, 더 친핵성이다. 시스테인 잔기는 유전 공학 기술에 의해 단백질 내로 도입되어, 리간드에 공유결합에 의한 부착을 형성하거나 새로운 분자내 디술피드 결합을 형성하였다 [Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13: 9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; US 6248564]. 그러나, 시스테인 아미노산에 대한 단백질의 다양한 아미노산 잔기의 돌연변이에 의한 시스테인 티올기에서의 조작은, 특히 쌍을 이루지 않은 (유리 Cys) 잔기 또는 반응 또는 산화에 비교적 접근가능한 기의 경우, 잠재적으로 문제가 된다. 이. 콜라이 (E. coli)의 주변세포질, 배양 상등액, 또는 부분적으로 또는 완전히 정제된 단백질 내에서든 단백질의 농축 용액에서, 단백질의 표면상의 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기는 쌍을 이루고 산화되어 분자간 디술피드를 형성할 수 있고, 따라서 단백질 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다. 디술피드 이량체 형성은 새로운 Cys가 약물, 리간드, 또는 다른 표지 (label)에의 접합에 대해 비반응성이 되도록 한다. 또한, 단백질이 새로 조작된 Cys와 존재하는 Cys 잔기 사이에서 분자내 디술피드 결합을 산화에 의해 형성하면, 두 Cys 티올기는 활성 부위 참여 및 상호작용에 이용가능하지 않다. 또한, 단백질은 미스폴딩 (misfolding) 또는 3차 구조의 상실에 의해 불활성 또는 비-특이적으로 될 수 있다 [Zhang et al. (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9].
시스테인-조작된 항체는 FAB 항체 단편 (thioFab)으로서 설계되고, 전장, IgG 모노클로날 (thioMab) 항체로서 표현된다 [Junutula, J.R. et al. (2008) J Immunol. Methods 332:41-52; US 2007/0092940, 이의 내용이 참조로 포함된다]. ThioFab 및 ThioMab 항체는 새로 도입된 시스테인 티올에서 링커를 통해 티올-반응성 링커 시약 및 약물-링커 시약과 접합되어, 항체 약물 접합체 (Thio ADC)를 생성하였다.
특허 출원 및 공개를 포함한 본원에 인용된 모든 참조문은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 항-FcRH5 항체 또는 이의 기능성 단편, 및 조혈성 종양의 치료에서 이의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기하거나 아래에서 설명되는 임의의 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 항체는 모노클로날 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편을 포함한 항체 단편, 디아바디 (diabody), 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체 또는 이의 각각의 항원 에피토프에 대한 항-FcRH5 폴리펩티드 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체이다. 본 발명의 항체는 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 독소, 예를 들어 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 돌로스타틴 유도체 또는 칼리케아미신, 항생제, 방사성 동위원소, 핵산분해 효소 등에 임의로 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있고, 바람직하게는 항체가 결합하는 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 검출 목적을 위해, 본 발명의 항체는 검출가능하게 표지되거나 고체 지지체 등에 부착될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은, FcRH5에 대한 항체의 일가 (monovalent) 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 Fab 단편으로서 항체의 친화도) 또는 FcRH5에 대한 항체의 이가 (bivalent) 형태의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG 단편으로서 항체의 친화도)가, 도 9 (서열 번호 19) 및 도 10 (서열 번호 21)에 제시된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어지거나, 이 서열로 본질적으로 구성되는 뮤린 항체 (예를 들어, FcRH5에 대한 Fab 단편 또는 IgG 단편으로서 뮤린 항체의 친화도) 또는 키메라 항체 (예를 들어, FcRH5에 대한 Fab 단편 또는 IgG 단편으로서 키메라 항체의 친화도)의 일가 친화도 또는 이가 형태의 친화도와 각각 실질적으로 동일하거나, 더 낮거나, 더 높은, 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.4 nM, 0.2 nM 또는 0.5 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
한 측면에서,
(i) 서열 KASQDVSTAVA (서열 번호 26)를 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열 SASYRYT (서열 번호 27)를 포함하는 HVR-L2,
(iii) 서열 QQHFSSPRT (서열 번호 28)를 포함하는 HVR-L3,
(iv) 서열 GFTFSSYAVS (서열 번호 35)를 포함하는 HVR-H1,
(v) 서열 ATISSGGSLTFYLDSVR (서열 번호 36)를 포함하는 HVR-H2, 및
(vi) 서열 PIPDYYALDY (서열 번호 37)를 포함하는 HVR-H3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는, FcRH5에 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 다른 양태에서, HVR-H2는 서열 번호 36의 서열을 갖는다. 또 다른 양태에서, 항체는 인간 κ 하위군 1 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서열 번호 19로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 서열 번호 21로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서열 번호 19로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 다른 양태에서, 항체는 서열 번호 21로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 서열 번호 31, 32, 33 및 34로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 서열 번호 22, 23, 24 및 25로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서열 번호 31, 32, 33 및 34로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 서열 번호 22, 23, 24 및 25로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 측면에서, 서열 번호 26, 27, 28, 35, 36 또는 37에 도시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR을 포함하는 FcRH5에 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 다른 양태에서, 변형은 치환, 삽입 또는 결실이다.
또 다른 양태에서, 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 프레임워크 서열이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 항체의 일가의 친화도가 도 9 (서열 번호 19) 및 도 10 (서열 번호 21)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 뮤린 항체의 일가의 친화도와 실질적으로 동일한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 항체의 일가의 친화도가 도 9 (서열 번호 19) 및 도 10 (서열 번호 21)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 뮤린 또는 키메라 항체의 일가의 친화도 보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 더 큰 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 항체의 일가의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 뮤린 또는 키메라 항체의 일가의 친화도 보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60배 더 낮은 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 이가 형태의 뮤린 항체의 친화도와 실질적으로 동일한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 이가 형태의 뮤린 또는 키메라 항체의 친화도 보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 더 큰 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 이가 형태의 뮤린 또는 키메라 항체의 친화도 보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60배 더 낮은 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.4 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 일 양태에서, 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도는 0.4 nM +/- 0.04이다.
하나의 다른 측면에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.2 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 일 양태에서, 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도는 0.2 nM +/- 0.02이다.
하나의 다른 양태에서, 본 발명은 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.5 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 일 양태에서, 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도는 0.5 nM +/- 0.01이다.
모든 측면에서, 결합 친화도는 Kd 값으로 표현된다. 또 다른 측면에서, 결합 친화도는 비아코아 (Biacore) 또는 방사면역분석법으로 측정된다.
하나의 다른 측면에서, 본 발명은 세포독성제에 접합되었을 때 종양 세포 성장을 억제하는 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포독성제에 접합되었을 때 종양 세포 성장을 억제하는 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
한 양태에서, 인간화 항체 및 키메라 항체는 둘다 일가 또는 이가인 항체이다. 또 다른 양태에서, 인간화 항체 및 키메라 항체는 둘다 Fc 영역에 연결된 단일 Fab 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 도 11에 도시된 HVR1-HC, HVR2-HC 및/또는 HVR3-HC 서열 (서열 번호 35 내지 37)을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 가변 도메인은 도 11에 도시된 FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC 및/또는 FR4-HC 서열 (서열 번호 31 내지 34)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 도 11에 도시된 CH1 및/또는 Fc 서열 (서열 번호 38 및/또는 39)을 포함한다.
하나의 다른 측면에서, 본 발명은 도 11에 도시된 HVR1-LC, HVR2-LC 및/또는 HVR3-LC 서열 (서열 번호 26 내지 28)을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 가변 도메인은 도 11에 도시된 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 및/또는 FR4-LC 서열 (서열 번호 22 내지 25)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 도 11에 도시된 CL1 서열 (서열 번호 29)을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 도 10에 도시된 서열 (서열 번호 21)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 도 9에 도시된 서열 (서열 번호 19)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 기술된 중쇄 가변 도메인 및 본원에 기술된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 항체를 제공한다.
하나의 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 중쇄 가변 도메인 및 본원에 기술된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 항체는 일가이며 Fc 영역을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산 및 서열 번호 41 내지 44로부터 선택되는 서열을 포함하는 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체를 포함한다. 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 FcRH5 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 모 항-FcRH5 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 교체하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5 폴리펩티드에 결합하고, 하기로부터 선택되는 하나 이상의 HVR 서열을 포함하는 모 항-FcRH5 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 교체하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산을 포함하는 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체를 포함한다:
(i) 서열 KASQDVSTAVA (서열 번호 26)를 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열 SASYRYT (서열 번호 27)를 포함하는 HVR-L2,
(iii) 서열 QQHFSSPRT (서열 번호 28)를 포함하는 HVR-L3,
(iv) 서열 GFTFSSYAVS (서열 번호 35)를 포함하는 HVR-H1,
(v) 서열 ATISSGGSLTFYLDSVR (서열 번호 36)를 포함하는 HVR-H2, 및
(vi) 서열 PIPDYYALDY (서열 번호 37)를 포함하는 HVR-H3.
시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 이의 각각의 항원 에피토프에 대한 항-FcRH5 폴리펩티드 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체 또는 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 독소, 예를 들어 아우리스타틴 또는 메이탄시노이드에 임의로 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있고, 바람직하게는 항체가 결합하는 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 진단 목적을 위해, 본 발명의 항체는 검출가능하게 표지되거나 고체 지지체 등에 부착될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 FcRH5 항체 (본원에 정의된 바와 같이 전장 및 이의 단편을 포함한다)를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 적합한 숙주 세포 내에서 상기 항체 (또는 이의 단편)을 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 발현시키고, 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5를 발현하는 제1 세포 및 세포-표면 표적 항원을 발현하는 제2 세포에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 제공한다. 한 양태에서, 제2 세포는 T 세포이다. 한 양태에서, 세포-표면 표적 항원은 CD3이다. 특정 양태에서, 이중특이적 항체는 캐비티로의 돌출 (protuberance-into-cavity) 항체이다. 한 양태에서, 이중특이적 항체는 비당화된다. 한 양태에서, 이중특이적 항체는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 숙주 세포에서 생성된다. 한 양태에서, 이중특이적 항체는 하나 이상의 Fc 이펙터 기능이 결여된다. 한 양태에서, 이중특이적 항체는 ADCC 활성이 결여된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체-약물 접합체, 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 용기; 및 용기 내에 담긴 조성물을 포함하는 제품을 제공하고, 여기서 조성물은 본 발명의 하나 이상의 FcRH5 항체를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 FcRH5 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 완충액을 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 및/또는 예방 처치를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 FcRH5 항체의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 및/또는 예방 처치를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 제조 제품의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 및/또는 예방 처치를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 키트의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 항체와 접촉시켜 상기 세포의 성장의 억제를 유발하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5를 발현하는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유동물을 치료학적으로 처치하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 포유동물에게 치료 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여, 상기 포유동물을 효과적으로 치료하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5의 증가된 발현과 연관된 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여, 상기 세포 증식성 장애를 효과적으로 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 상기 증식성 장애는 암이다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 세포를 유효량의 본 발명의 항체와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 세포의 성장은 FcRH5의 성장 강화 효과에 적어도 부분적으로 의존적이다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 세포를 유효량의 본 발명의 항체와 접촉시켜 상기 종양을 효과적으로 치료하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 종양을 치료학적으로 처치하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 종양의 성장은 FcRH5의 성장 강화 효과에 적어도 부분적으로 의존적이다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 환자에게 본원에 기재된 면역접합체, 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 세포를 FcRH5에 대한 면역접합체의 결합을 허용하는 조건 하에 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체에 노출시키는 단계를 포함하는, B 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 추가의 처리 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 일 방법은 표적 세포 및/또는 조직 (예: 암 세포)이 방사선 처치 또는 화학요법제에 노출되는 단계를 추가로 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 유효량의 항-FcRH5 항체를 유효량의 또 다른 치료제 (예를 들어, 항-혈관형성제, 또 다른 항체, 화학요법제, 세포독성제, 면역억제제, 프로드럭, 사이토킨, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 또는 성장-억제제)와 병용하여 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 항-FcRH5 항체 또는 면역접합체는 다양한 신생물성 또는 비-신생물성 상태를 치료하기 위한 항암제 또는 항-혈관형성제와 병용된다. 특정 예시에서, 항-FcRH5 항체는 Velcade® (보르테조미브), Revlimid® (레날리도미드), 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시마브, 플베스트란트, 비노렐빈, 베바시주마브, 빈크리스틴, 시스플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조미브, 레날리도미드, 덱사메타손, 멜팔린, 프레드니손, 빈크리스틴, 탈리도미드와 병용된다.
치료되는 특정 암 징조에 따라, 본 발명의 병용 요법은 추가의 치료제, 예를 들어 화학요법제, 또는 추가의 요법, 예를 들어 방사선요법 또는 수술과 병용될 수 있다. 많은 공지된 화학요법제가 본 발명의 병용 요법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 특정 징조의 치료에 표준인 화학요법제가 사용될 것이다. 병용될 각각의 치료제의 용량 또는 횟수는 바람직하게는 다른 제제(들) 없이 사용될 때의 상응하는 치료제의 용량 또는 횟수와 동일하거나 더 적다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 검출가능한 표지를 포함하는 본원에 기술된 임의의 항-FcRH5 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내에서 FcRH5의 존재를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 샘플을 본 발명의 항체에 노출시키고, 상기 샘플 내의 FcRH5에 대한 항체의 결합을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플 내의 FcRH5에 대한 상기 항체의 결합은 상기 샘플 내에 상기 단백질이 존재함을 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5를 발현하는 세포, 예를 들어 B 세포의 증가와 연관된 세포 증식성 장애를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 생물학적 샘플 내의 시험 세포를 임의의 상기 항체와 접촉시키고; FcRH5에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 샘플 내의 시험 세포에 결합된 항체의 수준을 결정하고; 대조 샘플 내의 세포에 결합된 항체의 수준에 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 결합된 항체의 수준은 시험 및 대조 샘플 내의 FcRH5-발현 세포의 수로 표준화되고, 대조 샘플에 비해 시험 샘플 내의 결합된 항체의 수준이 더 높은 것이 FcRH5를 발현하는 세포와 연관된 세포 증식성 장애의 존재를 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명은 혈액 또는 혈청 내에서 가용형 FcRH5를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 B 세포 증식성 장애를 겪는 것으로 의심되는 포유동물로부터의 혈액 또는 혈청의 시험 샘플을 본 발명의 항-FcRH5 항체와 접촉시키고, 정상 포유동물로부터의 혈액 또는 혈청의 대조 샘플에 비해 시험 샘플 내에서 가용형 FcRH5의 증가를 검출하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 FcRH5를 발현하는 세포에 결합시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
도 1은 키메라 항-인간 FcRH 7D11 경쇄 (DNA)를 도시한다.
도 2는 키메라 항-인간 FcRH5 7Dl1 경쇄 (아미노산)를 도시한다.
도 3은 키메라 항-인간 FcRH5 7D11 중쇄 (DNA)를 도시한다.
도 4는 키메라 항-인간 FcRH5 7D11 중쇄 (아미노산)를 도시한다.
도 5는 키메라 항-인간 FcRH5 (mAb10A8) 경쇄 (DNA)를 도시한다.
도 6은 키메라 항-인간 FcRH5 (mAblOA8) 경쇄 (아미노산)를 도시한다.
도 7은 키메라 항-인간 FcRH5 (mAblOA8) 중쇄 (DNA)를 도시한다.
도 8은 키메라 항-인간 FcRH5 (mAb10A8) 중쇄 (아미노산)를 도시한다.
도 9는 뮤린 10A8과 인간화 10A8vl에 대한 가변 경쇄와 인간 컨센서스 VL 카파 I (huKI) 도메인 (서열 번호 64)과의 정렬을 나타낸다.
도 10은 뮤린 10A8과 인간화 10A8vl에 대한 가변 중쇄와 인간 하위군 컨센서스 VH (hum) 도메인 (서열 번호 65)과의 정렬을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 항체 (Hul0A8vl)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 thio-Mab의 시스테인 조작된 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 thio-Mab의 시스테인 조작된 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 14는 FcRH5 항체의 교차반응성을 나타낸다.
도 15는 FcRH5 항체의 교차반응성을 나타낸다.
도 16은 FcRH5 항체의 교차반응성을 나타낸다.
도 17은 FcRH5 항체의 FACS 분석을 나타낸다.
도 18은 FcRH5 항체 적정을 나타낸다.
도 19는 FcRH5 항체 적정을 나타낸다.
도 20은 본 발명의 thio-Mab의 FACS 분석을 나타낸다.
도 21은 본 발명의 thio-Mab의 FACS 분석을 나타낸다.
도 22는 본 발명의 thio-Mab의 FACS 분석을 나타낸다.
도 23은 본 발명의 thio-Mab의 FACS 분석을 나타낸다.
도 24는 본 발명의 접합된 항체의 FACS 분석을 나타낸다.
도 25는 본 발명의 접합된 항체의 FACS 분석을 나타낸다.
도 26은 본 발명의 항체의 평균 종양 부피에 대한 효과를 나타낸다.
도 27은 본 발명의 항체의 평균 체중에 대한 효과를 나타낸다.
도 28은 본 발명의 항체의 평균 종양 부피에 대한 효과를 나타낸다.
도 29는 본 발명의 항체의 평균 체중에 대한 효과를 나타낸다.
도 30a는 본 발명의 항체 접합체의 평균 종양 부피에 대한 효과를 나타낸다.
도 30b는 본 발명의 항체 접합체의 평균 체중에 대한 효과를 나타낸다.
도 31은 단일 화합물 용량 반응 분석을 나타낸다.
도 32는 단일 화합물 용량 반응 분석을 나타낸다.
도 33은 PRO820 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 58)을 나타내며, 여기서 서열 번호 58은 본원에서 "DNA56041-1416" (본원에서 "FcRH5"로도 언급됨)로 표시되는 클론이다. 뉴클레오티드 서열은 굵게 표시하고 밑줄을 그어 나타낸 출발 및 정지 코돈을 갖는 FcRH5를 코딩한다 [Goddard 등의 미국 특허 7491529 참조].
도 34는 도 33에 나타낸 서열 번호 59의 코딩 서열로부터 유도되는 아미노산 서열 (서열 번호 59)을 나타낸다 [Goddard 등의 미국 특허 7491529 참조].
도 35A-B는 PRO52387 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 60)을 나타내며, 여기서 서열 번호 60은 본원에서 "DNA257845" (본원에서 "FcRH5"로도 언급됨)으로 표시되는 클론이다. 뉴클레오티드 서열은 굵게 표시하고 밑줄을 그어 나타낸 출발 및 정지 코돈을 갖는 FcRH5를 코딩한다 [Chang 등의 미국 공개 특허원 20060251662 참조].
도 36은 도 36A-B에 나타낸 서열 번호 61의 코딩 서열로부터 유도되는 아미노산 서열 (서열 번호 61)을 나타낸다 [Chang 등의 미국 공개 특허원 20060251662 참조].
도 37은 PRO314992 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 62)을 나타내며, 여기서 서열 번호 62는 본원에서 시노몰거스 원숭이로부터의 "DNA676969" (본원에서 "cyno FcRH5"로도 언급됨)로 표시되는 클론이다.
도 38은 도 37에 나타낸 서열 번호 63의 코딩 서열로부터 유도되는 아미노산 서열 (서열 번호 63)을 나타낸다.
도 39는 생쥐에서 평균 종양 부피에 대한 항체 면역접합체와 하나 이상의 화학요법제의 병용 투여 효과를 나타낸다.
도 40은 각각의 투여군에 있는 동물에 대한 체중 변화율 (%)을 나타낸다.
도 41은 생쥐에서 평균 종양 부피에 대한 항체 면역접합체와 하나 이상의 화학요법제의 병용 투여 효과를 나타낸다.
도 42는 각각의 투여군에 있는 동물에 대한 체중 변화율 (%)을 나타낸다.
도 43은 생쥐에서 평균 종양 부피에 대한 항체 면역접합체와 하나 이상의 화학요법제의 병용 투여 효과를 나타낸다.
도 44는 각각의 투여군에 있는 동물들에 대한 체중 변화율 (%)을 나타낸다.
도 45는 본 발명의 항체 접합체의 평균 종양 부피에 대한 효과를 나타낸다.
도 46은 본 발명의 항체 접합체의 평균 체중에 대한 효과를 나타낸다.
도 47은 본 발명의 항체 접합체의 평균 종양 부피에 대한 효과를 나타낸다.
도 48은 본 발명의 항체 접합체의 평균 체중에 대한 효과를 나타낸다.
본 발명은 포유동물에서 조혈성 종양의 치료에 유용한 조성물을 확인하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 제조 제품 및 조혈성 종양의 치료를 위한 상기 조성물의 사용 방법을 제공한다.
상기 방법, 조성물, 키트 및 제조 제품에 대한 상세한 설명을 본원에서 제공한다.
I. 일반적인 기술
본 발명의 실시에서는 달리 지시하지 않으면 당업계의 기술 범위 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds. 1987, 및 주기적인 업데이트); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001)]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
II. 정의
본원 명세서의 설명을 위해, 다음 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우마다 단수로 사용되는 용어는 복수를 포함하고 그 반대도 성립할 것이다. 기술된 임의의 정의가 참조로 포함되는 임의의 문서와 충돌할 경우에는, 아래에서 기술된 정의가 적용될 것이다.
본원에서 "B-세포 표면 마커" 또는 "B-세포 표면 항원"은 그에 대해 결합하는 길항제, 예를 들어 천연 발생 B-세포 항원에 대한 리간드의 결합을 길항할 수 있는, B-세포 표면 항원 또는 가용성 형태의 B-세포 표면 항원에 대한 항체 (이로 제한되지 않음)로 표적화될 수 있는, B 세포의 표면 상에 발현되는 항원이다. 예시적인 B-세포 표면 마커는 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커를 포함한다 (이에 대한 설명은 문헌 [The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York]을 참조). 다른 B-세포 표면 마커는 RP105, FcRH2, B-세포 CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA, 및 239287을 포함한다. 특히 목적하는 B-세포 표면 마커는 포유동물의 다른 비-B-세포 조직에 비해 B 세포 상에 우선적으로 발현되고, 전구체 B 세포와 성숙 B 세포 모두 상에 발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "FcRH5"는 달리 나타내지 않으면 포유동물, 예를 들어 영장류 (예를 들어, 인간, 시노몰거스 원숭이 (cyno)) 및 설치류 (예를 들어, 생쥐 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 FcRH5를나타낸다. 인간 FcRH5는 또한 본원에서 "TAHO18" 또는 "PRO85143" (서열 번호 2)로 언급되며, 본원에서 "DNA340394"로도 언급되는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1)에 의해 코딩된다. 또한, 시노몰거스 FcRH5는 본원에서 "cyno FcRH5"로 언급된다. 용어 "FcRH5"는 프로세싱되지 않은 "전장" FcRH5 및 세포 내에서의 프로세싱에 의해 생성된 임의의 형태의 FcRH5를 포함한다. 또한, 상기 용어는 FcRH5의 천연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체, 대립유전자 변이체, 및 이소형을 포함한다. 본원에서 설명되는 FcRH5 폴리펩티드는 다양한 공급원, 예를 들어 인간 조직 유형 또는 다른 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 FcRH5 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 대응하는 FcRH5 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드는 자연에서 단리될 수 있거나 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열 FcRH5 폴리펩티드"는 구체적으로 특정 FcRH5 폴리펩티드의 천연 발생 절두 (truncated) 또는 분비 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 택일적으로 스플라이싱된 형태) 및 폴리펩티드의 천연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 본원에 개시되는 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드는 첨부 도면에 제시된 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 출발 및 정지 코돈 (표시될 경우)은 도면에서 굵은 글씨체 및 밑줄로 표시된다. 첨부 도면에서 "N"으로 표시된 핵산 잔기는 임의의 핵산 잔기이다. 그러나, 첨부 도면에 개시된 FcRH5 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로서 본원에서 지정된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 제시되지만, 도면에서 아미노산 위치 1의 상류 또는 하류에 위치하는 다른 메티오닌 잔기가 FcRH5 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로서 사용될 수 있다고 생각할 수 있고, 또한 가능하다.
"mulOA8" 또는 "MA10A8" 또는 "뮤린 FcRH5 (10A8) 항체" 또는 "뮤린 항-FcRH5(10A8) 항체"는 서열 번호 18 (도 9)의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 20 (도 10)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 뮤린 항-FcRH5 모노클로날 항체를 구체적으로 나타내기 위해 사용된다. 뮤린 항-FcRH5 모노클로날 항체는 시판 공급원으로부터 구입할 수 있다.
"chlOA8" 또는 "chMAFcRH5 (10A8)" 또는 "chFcRH5 (10A8)" 또는 "키메라 MAFcRH5 (10A8) 항체"는 서열 번호 15 (도 6)의 경쇄를 포함하는 키메라 항-인간 FcRH5 항체이다. 서열 번호 15의 경쇄는 도 9에 나타낸 가변 도메인 및 인간 IgG1의 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 키메라 항-FcRH5 (10A8) 항체는 서열 번호 17 (도 8)의 중쇄를 추가로 포함한다. 서열 번호 17의 중쇄는 도 10에 나타낸 가변 도메인 및 인간 IgG1의 중쇄 불변 도메인은 추가로 포함한다.
"ch7D11" 또는 "chMAFcRH5 (7D11)" 또는 "chFcRH5 (7D11)" 또는 "키메라 MAFcRH5 (7D11) 항체는, 인간 IgG1의 경쇄 불변 도메인을 포함하는 서열 번호 11 (도 2)의 경쇄를 포함하는 키메라 항-인간 FcRH5 항체를 구체적으로 나타내기 위해 사용된다. 키메라 항-FcRH5 (7D11) 항체는 인간 IgG1의 중쇄 불변 도메인을 포함하는 서열 번호 13 (도 4)의 중쇄를 추가로 포함한다.
"항-cynoFcRH5" 또는 "항-cyno FcRH5"는 cyno FcRH5에 결합하는 항체를 나타내기 위해 사용된다.
"10A8-이식편" 또는 "10A8-이식된 '인간화' 항체" 또는 "hu10A8 이식편"은 뮤린 10A8 항-FcRH5 항체 (mu10A8)의 초가변 영역을 억셉터 인간 컨센서스 VL 카파 I (huKI) 및 인간 하위군 III 컨센서스 VH (huIII) 내로 이식시켜 생성된 이식편을 구체적으로 나타내기 위해 본원에서 사용된다 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)] (실시예 1 및 도 9 (서열 번호 19) 및 10 (서열 번호 21) 참조). "hu10A8" 또는 "hu10A8v1"은 인간화 10A8 항체를 구체적으로 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
아미노산 잔기/위치의 "변형"은 본원에서 사용되는 출발 아미노산 서열에 비해 1차 아미노산 서열의 변화를 의미하고, 여기서 변화는 상기 아미노산 잔기/위치를 포함하는 서열 변경으로부터 발생한다. 예를 들어, 전형적인 변형은 잔기의 (또는 상기 위치에서) 다른 아미노산으로의 치환 (예를 들어, 보존적 또는 비-보존적 치환), 상기 잔기/위치에 인접한 하나 이상의 (일반적으로 5 또는 3개 미만) 아미노산의 삽입, 및 상기 잔기/위치의 결실을 포함한다. "아미노산 치환", 또는 이의 변이는 예정된 (출발) 아미노산 서열 내의 존재하는 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 교체하는 것을 의미한다. 일반적으로 및 바람직하게는, 변형은 출발 (또는 "야생형") 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 변이체 폴리펩티드의 적어도 하나의 물리생화학적 활성을 변경시킨다. 예를 들어, 항체의 경우에, 변경되는 물리생화학적 활성은 표적 분자에 대한 결합 친화도, 결합능 및/또는 결합 효과일 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로, 예를 들어, 목적하는 생물학적 또는 면역학적 활성을 보이는 한, 단일 항-FcRH5 모노클로날 항체 (작용제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 온전한 (intact) 모노클로날 항체 포함), 다중 에피토프 특이성을 갖는 항-FcRH5 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 다가 항체, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이중특이적 항체), 단일쇄 항-FcRH5 항체, 및 항-FcRH5 항체의 단편 (아래 참조) (Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함), 디아바디, 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함한다. 용어 "면역글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 상호 교환가능하게 사용된다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙된 항체일 수 있다.
용어 "항-FcRH5 항체" 또는 "FcRH5에 결합하는 항체"는 FcRH5를 표적으로 할 때 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 FcRH5에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 바람직하게는, 관련되지 않는 비-FcRH5 단백질에 대한 항-FcRH5 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사면역분석법 (RIA)으로 측정시에 FcRH5에 대한 항체 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 양태에서, FcRH5에 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤0.1 nM이다. 특정 양태에서, 항-FcRH5 항체는 상이한 종으로부터의 FcRH5 사이에서 보존된 FcRH5의 에피토프에 결합한다.
"단리된 항체"는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과의 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는, 항체의 자연 환경 중의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 계내 (in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
기본 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 이종4량체 당단백질이다 (IgM 항체는 J 쇄로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종4량체 단위로 이루어지고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 한편, 분비형 IgA 항체는 중합되어, J 쇄과 함께 2 내지 5개의 기본 4-쇄 단위를 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있다). IgG의 경우에, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 한편, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소형에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에서 가변 도메인 (VH)을 갖고, 이어서 α 및 γ 쇄 각각에 대해서는 3개의 불변 도메인 (CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대해서는 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N-말단에서 가변 도메인 (VL)을 갖고, 이어서 이의 다른 말단에서 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 함께 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH 및 VL의 페어링은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조 및 특성에 대해서는 예를 들어, 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물종의 L 쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다로 불리는 2개의 분명하게 구분되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 그들의 중쇄 (CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 이소형으로 지정될 수 있다. 5가지 부류의 면역글로불린, 즉, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭하는 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재한다. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능에서 비교적 적은 차이에 기초하여 하위부류로 추가로 나누어지고, 예를 들어 인간은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2의 하위부류를 발현한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 나타낸다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 언급될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 언급될 수 있다. 상기 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편이 항체들 사이에서 서열이 크게 상이함을 나타낸다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 범위 범위에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9 내지 12개 아미노산 길이의 "초가변 영역"으로 불리는 가변성이 매우 높은 보다 짧은 영역에 의해 분리되는 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 비교적 가변성이 낮은 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 입체형태의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트 입체형태를 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)]. 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 나타낸다.
"온전한" 항체는 항원 결합 부위 및 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 가질 수 있다.
본원의 목적상 "네이키드 (naked) 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 [미국 특허 5,641,870의 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)]; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 한 양태에서, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다.
항체를 파파인으로 분해시키면 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (이 명칭은 쉽게 결정화하는 이의 능력을 반영한다)을 생성한다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인 (VH), 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대하여 일가이고, 즉, 하나의 항원 결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신으로 처리하면, 이가 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 대략적으로 대응하고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 단일의 큰 F(ab')2 단편이 생성된다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기가 추가된다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편들의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 유지되는 두 H쇄의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 단편은 강한 비공유 회합 상태의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 이쇄 Fv 종에 유사한 "이량체성" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 이들 2개의 도메인의 폴딩은 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (H 및 L 쇄 각각으로부터 3개의 루프)를 생성한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)이라도 전체 결합 부위보다는 낮은 친화도이기는 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단일쇄 Fv" (또한 "sFv" 또는 "scFv"로 약칭함)는 단일 폴리펩티드 쇄 내로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 관해서는 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; 및 [Borrebaeck 1995, 하기 참조]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타내고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL)에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 이러한 항체 단편은, V 도메인의 쇄내 (intra-chain) 페어링이 아니라 쇄간 (inter-chain) 페어링이 달성되어 이가 단편, 즉 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편을 생성하도록, VH 및 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5 내지 10개 잔기)를 갖는 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 구성함으로써 제조된다. 디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있다. 이중특이적 디아바디는 2개의 "교차 (crossover)" sFv 단편의 이종이량체이고, 여기서 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인은 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재한다. 디아바디는, 예를 들어 문헌 [EP 404,097; WO 93/11161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 설명되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미한다. 즉, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는, 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되는 고도의 특이성을 갖는다. 또한, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체는 합성되고 다른 항체에 의해 오염되지 않을 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생성해야 하는 것으로 파악되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체뿐만 아니라, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편을 포함한다 [미국 특허 4,816,567; Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)]. 본원에서 관심있는 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열, 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 영장류화 (primatized) 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수령의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 비-인간종 (공여 항체), 예를 들어 생쥐, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수령 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수령 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 더욱 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem . Soc . Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr . Op . Biotech. 5:428-433 (1994)] 및 여기에 인용된 참조문헌을 참조한다.
항체를 나타내기 위해 본원에서 사용되는 "Thio"는 시스테인-조작된 항체를 나타내는 한편, 항체를 나타내기 위해 본원에서 사용되는 "hu"는 인간화 항체를 나타낸다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성되고/되거나 본원에 개시되는 임의의 인간 항체 제조 기술을 이용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특히 배제한다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol ., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는, 항원 시험 접종에 반응하여 항체를 생성하도록 변형시킨, 단 내인성 유전자자리는 무력화된 유전자이식 동물, 예를 들어 면역화된 이종생쥐 (xenomouse)에 항원을 투여하여 만들어질 수 있다 (예를 들어, XENOMOUSE™ 기술에 대해서는 미국 특허 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Li et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 서열에서 초가변성이고/이거나 구조상 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역; 즉, VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 많은 초가변 영역 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기초하고, 가장 흔히 사용된다 [Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 코티아 (Chothia)는 그 대신 구조 루프의 위치를 나타낸다 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]. 카바트 넘버링 방식을 사용하여 넘버링할 때 코티아 CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변한다 (이것은 카바트 넘버링 방식이 H35A 및 H35B에 삽입을 두기 때문이고; 35A 및 35B가 존재하지 않을 경우, 루프는 32에서 끝나고; 35A만이 존재할 경우, 루프는 33에서 끝나고; 35A와 35B가 모두 존재할 경우, 루프는 34에서 끝난다). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라 (Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 각각의 상기 초가변 영역의 잔기를 아래에 나타낸다.
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초가변 영역은 다음과 같이 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH에서 26-35B (H1), 50-65, 47-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 상기 정의 각각에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의되는 초가변 영역 잔기와 다른 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이의 변형은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서 항체 편집 (compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 나타낸다. 상기 넘버링 시스템을 이용하는 경우, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 그 내부로의 삽입에 대응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 함께 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)을 언급하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 색인"은 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 언급하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에 보고된 EU 색인 참조). "카바트에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않으면, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의해 넘버링된 잔기를 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않으면, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 (예를 들어, EU 넘버링에 대해 미국 특허 가출원 60/640,323, 도면 참조).
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 이의 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙을 설명한다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al ., Proc Nat . Acad . Sci . USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al ., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al ., J. Immunol . 154(7):3310-9 (1995); Hawkins et al ., J. Mol . Biol ., 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용되는 "작용제 항체"는 관심 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 활성을 모방하는 항체이다.
"종-의존성 항체", 예를 들어 포유동물 항-인간 IgE 항체는 제2 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 것보다 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대해 더욱 강한 결합 친화도를 갖는 항체이다. 보통, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합하지만" (즉, 결합 친화도 (Kd) 값이 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1 x 10-8 M 이하, 가장 바람직하게는 약 1 x 10-9 M 이하이지만), 제2 비-인간 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화도는 인간 항원에 대한 이의 결합 친화도보다 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1000배 더 약하다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 바와 같은 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용되는 "결합 친화도"는 결합쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원을 더욱 빠르게 결합하고 보다 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 양태를 아래에 설명한다.
결합 친화도를 나타내기 위해 본원에서 사용되는 "또는 이보다 우수한"은 분자와 이의 결합 파트너 사이의 보다 강한 결합을 의미한다. 본원에서 사용되는 "또는 이보다 우수한"은 보다 작은 Kd 값으로 제시되는, 보다 강한 결합을 의미한다. 예를 들어, 항원에 대한 친화도가 "0.6 nM이거나 또는 이보다 우수한" 항체에서, 항체의 항원에 대한 친화도는 <0.6 nM, 즉, 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM 등이거나 또는 0.6 nM 미만의 임의의 값이다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 하기 분석에서 설명되는 바와 같이, 관심 항체의 Fab 버젼 및 이의 항원을 사용하여 수행된 방사성 표지된 항원 결합 분석 (RIA)에 의해 측정된다 [Chen, et al., (1999) J. Mol . Biol . 293: 865-881]. 분석 조건을 확립하기 위해, 미세적정 플레이트 (Dynex)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 철야 코팅한 후, PBS 중의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (약 23℃)에서 코팅하였다. 비흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599)]의 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 철야 인큐베이션하지만, 평형이 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물은 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1％ Tween-20으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 ㎕/웰의 섬광제 (scintillant) (MicroScint-20; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 Topcount 감마 계수기 (Packard) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다. 또 다른 양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 약 10의 반응 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용함으로써 측정한다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc.)을 제조사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml (약 0.2 μM)으로 희석한 후, 약 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성하도록 5 ㎕/min의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후에, 미반응 기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/min의 유속으로 25℃에서 0.05％ Tween 20을 함유하는 PBS (PBST)에 주입한다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램 (sensorgram)을 동시 피팅 (fitting)함으로써 단순 일대일 랭그뮈어 (Langmuir) 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로 계산한다 (예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol . Biol 293: 865-881] 참조). 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M-1s-1을 초과하면, 온-레이트는, 분광기, 예를 들어 정지 유동 설치 분광분석기 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도기 (ThermoSpectronic)에서 측정할 때, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "회합율" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 또한 상기한 바와 같은 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 사용하여 상기 설명된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술로 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 구문 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은, 당업자가 특정 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록, 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 본 발명의 항체와 연관되고, 다른 하나는 참조/비교 항체와 연관됨) 사이에 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 항체에 대한 값의 함수로서, 바람직하게는 약 50％ 미만, 바람직하게는 약 40％ 미만, 바람직하게는 약 30％ 미만, 바람직하게는 약 20％ 미만, 바람직하게는 약 10％ 미만이다.
본원에서 사용되는 구문 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은, 당업자가 특정 값 (예를 들어, Kd 값, HAMA 반응)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하도록, 2개의 수치 값 (일반적으로 하나는 본 발명의 항체와 연관되고, 다른 하나는 참조/비교 항체와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 항체에 대한 값의 함수로서, 바람직하게는 약 10％ 초과, 바람직하게는 약 20％ 초과, 바람직하게는 약 30％ 초과, 바람직하게는 약 40％ 초과, 바람직하게는 약 50％ 초과이다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 예정된 항원이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 천연 발생 또는 합성 화합물이다. 바람직하게는, 표적 항원은 폴리펩티드이다.
본원의 목적상 "억셉터 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유도된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유도된" 억셉터 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 기존의 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 기존의 아미노산 변화가 존재할 경우, 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 또는 3개 이하의 기존의 아미노산 변화가 존재한다. 기존의 아미노산 변화가 VH에 존재할 경우, 바람직하게는 상기 변화는 위치 71H, 73H 및 78H 중의 3개, 2개 또는 1개에서만 발생하고; 예를 들어, 상기 위치에서의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 한 양태에서, VL 억셉터 인간 프레임워크의 서열은 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔하게 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 하위군이다. 한 양태에서, VL에 대해서, 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 양태에서, VH에 대해서, 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 하위군 III이다.
"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]의 가변 중쇄 하위군 III 내의 아미노산 서열로부터 얻은 컨센서스 서열을 포함한다. 한 양태에서, VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 다음 서열의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 번호 49)-H1-WVRQAPGKGLEWV (서열 번호 50)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열 번호 51)-H3-WGQGTLVTVSS (서열 번호 52).
"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 [Kabat et al., 상기 참조]의 가변 경쇄 카파 하위군 I 내의 아미노산 서열로부터 얻은 컨센서스 서열을 포함한다. 한 양태에서, VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 다음 서열의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 번호 45)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (서열 번호 46)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 번호 47)-L3-FGQGTKVEIKR (서열 번호 48).
"비변형된 인간 프레임워크"는 억셉터 인간 프레임워크와 동일한 아미노산 서열을 갖는, 예를 들어 억셉터 인간 프레임워크 내에 인간의 비-인간 아미노산으로의 치환(들)이 결여된 인간 프레임워크이다.
본원의 목적상 "변경된 초가변 영역"은 이에 하나 이상의 (예를 들어, 1 내지 약 16개의) 아미노산 치환(들)을 포함하는 초가변 영역이다.
본원의 목적상 "비변형된 초가변 영역"은 그 영역이 유도된 비-인간 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역, 즉, 이에 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 영역이다.
관심 항원, 예를 들어 종양-연관 폴리펩티드 항원 표적물을 "결합하는" 항체는 항체가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화할 때 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하고, 다른 단백질과 유의하게 교차반응하지 않는 것이다. 이러한 양태에서, "비-표적" 단백질에 대한 항체의 결합의 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사면역분석법 (RIA)에 의해 결정할 때 이의 특정 표적 단백질에 대한 항체의 결합의 약 10％ 미만일 것이다. 표적 분자에 대한 항체의 결합에 대해서, 용어 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적물 상의 에피토프에 대한 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은 비-특이적인 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적인 결합은, 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 표적, 예를 들어 과량의 비-표지된 표적에 유사한 대조 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 특이적인 결합은 프로브에 대한 표지된 표적물의 결합이 과량의 비표지된 표적물에 의해 경쟁적으로 억제될 경우에 표시된다. 본원에서 사용되는 용어 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은, 예를 들어 표적에 대한 Kd가 적어도 약 10-4 M, 달리 적어도 약 10-5 M, 달리 적어도 약 10-6 M, 달리 적어도 약 10-7 M, 달리 적어도 약 10-8 M, 달리 적어도 약 10-9 M, 달리 적어도 약 10-10 M, 달리 적어도 약 10-11 M, 달리 적어도 약 10-12 M, 또는 이보다 큰 분자에 의해 제시될 수 있다. 한 양태에서, 용어 "특이적인 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 의미한다.
"FcRH5 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는" 항체 또는 "성장 억제성" 항체는 적절한 FcRH5 폴리펩티드를 발현하거나 과다발현하는 암 세포의 측정가능한 성장 억제를 초래하는 것이다. FcRH5 폴리펩티드는 암 세포의 표면 상에 발현된 막횡단 폴리펩티드일 수 있거나 또는 암 세포에 의해 생성되고 분비되는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직한 성장 억제성 항-FcRH5 항체는, 일반적으로 대조군은 시험되는 항체로 처리되지 않은 종양 세포인 적절한 대조군에 비해, FcRH5-발현 종양 세포의 성장을 20％ 초과, 바람직하게는 약 20％ 내지 약 50％, 더욱 바람직하게는 50％ 초과 (예를 들어, 약 50％ 내지 약 100％)의 수준으로 억제한다. 한 양태에서, 성장 억제는 세포 배양물에서 약 0.1 내지 30 ㎍/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정될 수 있고, 여기서 성장 억제는 종양 세포의 항체에 대한 노출 1 내지 10일 후에 결정된다. 생체내에서 종양 세포의 성장 억제는 하기 실험 실시예 섹션에서 설명되는 바와 같이 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 항체는 항-FcRH5 항체를 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 체중으로 투여할 때 종양 크기 또는 종양 세포 증식이 처음 항체 투여시로부터 약 5일 내지 3개월 내에, 바람직하게는 약 5 내지 30일 이내에 감소하면 생체내에서 성장 억제성인 것이다.
"세포자멸을 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화 및/또는 막 소포 (세포자멸체로 칭함)의 형성에 의해 결정되는, 예정된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 세포는 대체로 FcRH5 폴리펩티드를 과다발현하는 것이다. 바람직하게는, 세포는 종양 세포, 예를 들어, 조혈 세포, 예를 들어 B 세포, T 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 단핵구, 혈소판 또는 적혈구이다. 세포자멸과 관련된 세포 사건을 평가하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위 (translocation)는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 DNA 래더링 (laddering)을 통해 평가할 수 있고; DNA 단편화와 함께 핵/염색질의 응축은 저이배체 (hypodiploid) 세포의 임의의 증가에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 세포자멸을 유도하는 항체는 아넥신 결합 분석에서 비처리 세포에 비해 아넥신 결합의 유도를 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 야기하는 것이다.
"세포 사멸을 유도하는" 항체는 생존가능한 세포를 비생존가능한 것으로 만드는 것이다. 상기 세포는 FcRH5 폴리펩티드를 발현하고, FcRH5 폴리펩티드를 특이적으로 발현하거나 과다발현하는 세포 유형의 세포이다. 세포는 특정 세포 유형에 대한 암성 또는 정상 세포일 수 있다. FcRH5 폴리펩티드는 암세포의 표면에 발현되는 막횡단 폴리펩티드일 수 있거나 또는 암세포에 의해 생성되어 분비되는 폴리펩티드일 수 있다. 세포는 암 세포, 예를 들어, B 세포 또는 T 세포일 수 있다. 시험관내 세포 사멸은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사멸을 구별하기 위해서 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 결정될 수 있다. 따라서, 세포 사멸에 대한 분석은 열 불활성화된 혈청을 사용하여 (즉, 보체의 부재 하에) 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. 항체가 세포 사멸을 유도할 수 있는 지를 결정하기 위해, 요오드화프로피듐 (PI), 트리판 블루 [Moore et al., Cytotechnology 17:1-11 (1995)] 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가되는 막 통합성의 상실을 비처리 세포와 비교하여 평가할 수 있다. 바람직한 세포 사멸-유도 항체는 BT474 세포에서의 PI 흡수 분석에서 PI 흡수를 유도하는 것이다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 의미하고, 항체 이소형에 따라 상이하다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하여, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위하여 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226, 또는 위치 Pro230의 아미노산 잔기로부터 이의 카르복실-말단으로 확장되도록 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합할 것을 필요로 하고, 예를 들어 본원의 정의란에 개시된 바와 같은 다양한 분석법을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이인자형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이의 천연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교시에, 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게, 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 바람직하게는 적어도 약 80％의 서열 상동성, 또는 가장 바람직하게는 적어도 약 90％의 서열 상동성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 95％ 이상의 서열 상동성을 가질 것이다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 특정 세포독성의 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비형 Ig가 상기 세포독성의 이펙터 세포를 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 만드는 세포독성의 한 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장시키고", 상기 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol . 9:457-92 (1991)]의 464면 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 예를 들어 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 달리, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고, 상기 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적 스플라이싱된 형태를 포함하여, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 이의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 [M. in Daeron, Annu . Rev . Immunol. 15:203-234 (1997)]. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); de Haas et al., J. Lab . Clin . Med . 126: 330-41 (1995)]에 개시되어 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 또한 모체 IgG의 태아로의 전달에 작용하는 신생아의 수용체인 FcRn을 포함한다 [Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976); Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)].
생체내 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 유전자이식 생쥐 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 Fc 변이체 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석될 수 있다. WO 00/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Shields et al., J. Biol . Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 일반적으로 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하의 표적 세포 용해를 의미한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 인지체 (cognate) 항원에 결합된 (적절한 하위부류의) 항체에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어 미국 특허 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)] 참조한다.
용어 "Fc 영역-포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 의미한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 정제 동안 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447 잔기가 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체의 혼합물을 포함할 수 있다.
FcRH5 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 존재하지 않는 FcRH5 폴리펩티드의 형태를 의미한다. 통상적으로, FcRH5 폴리펩티드 ECD는 1％ 미만의 상기 막횡단 및/또는 세포질 도메인을 가질 것이고, 바람직하게는 0.5％ 미만의 상기 도메인을 가질 것이다. 본 발명의 FcRH5 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인은 소수성 도메인의 유형을 확인하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된다는 것을 알 수 있을 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 상이할 수 있지만, 본원에서 초기에 확인된 도메인의 어느 한 말단에서 약 5개 이하의 아미노산이 상이할 가능성이 가장 크다. 따라서, 임의로 FcRH5 폴리펩티드의 세포외 도메인은 실시예 또는 명세서에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인 경계의 어느 한 측면에 약 5개 이하의 아미노산을 함유할 수 있고, 신호 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 상기 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는 핵산이 본 발명에서 고려된다.
본원에 개시된 FcRH5 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치가 본 명세서 및/또는 첨부 도면에 제시될 수 있다. 그러나 신호 펩티드의 C-말단 경계는 상이할 수 있지만, 본원에서 초기에 확인된 신호 펩티드 C-말단 경계의 어느 한 측에서 약 5개 이하의 아미노산이 상이할 가능성이 가장 크고, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 아미노산 서열 요소의 유형을 확인하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Nielsen et al., Prot . Eng . 10:1-6 (1997); von Heinje et al., Nucl . Acids . Res. 14:4683-4690 (1986)] 참조). 또한, 일부 경우에, 분비형 폴리펩티드로부터 신호 서열의 절단이 완전히 균일하지는 않으므로 1 초과의 분비종이 생성되는 것으로 인정된다. 신호 펩티드가 본원에서 확인되는 신호 펩티드의 C-말단 경계의 어느 한 측면 상의 약 5개 이하의 아미노산 내에서 절단된 상기 성숙 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 고려된다.
"FcRH5 폴리펩티드 변이체"는 FcRH5 폴리펩티드, 바람직하게는 본원에 개시된 전장 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 활성 FcRH5 폴리펩티드, 본원에 개시된 신호 펩티드가 결여된 FcRH5 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 FcRH5 폴리펩티드의 세포외 도메인 또는 본원에 개시된 전장 FcRH5 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편 (예를 들어, 전장 FcRH5 폴리펩티드의 완전한 코딩 서열의 일부만을 나타내는 핵산에 의해 코딩되는 것)를 의미한다. 상기 FcRH5 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 부가 또는 결실된 FcRH5 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, FcRH5 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 전장 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 결여된 FcRH5 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 FcRH5 폴리펩티드의 세포외 도메인 또는 본원에 개시된 전장 FcRH5 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 구체적으로 규정된 단편과 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성, 달리 적어도 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상적으로, FcRH5 변이체 폴리펩티드의 길이는 적어도 약 10개 아미노산, 달리 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600개 이상의 아미노산이다. 임의로, FcRH5 변이체 폴리펩티드는 천연 FcRH5 폴리펩티드 서열에 비해 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 달리 천연 FcRH5 폴리펩티드 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
본원에서 확인된 펩티드 또는 폴리펩티드 서열, 즉, FcRH5 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 비율 (％)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭 (gap)을 도입시킨 후, 특이적인 펩티드 또는 폴리펩티드 서열, 즉, FcRH5 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성 요소로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 범위에 포함되는 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 전장 서열에 대해 최대 정렬의 달성에 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 값 ％는 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성되고, ALIGN-2 프로그램의 완전한 소스 코드 (source code)는 하기 표 1에 제시된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc. 소유로서, 하기 표 1에 제시된 소스 코드는 미국 저작국 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)에 사용자 기록문서로 출원되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc.로부터 공개적으로 입수가능하거나, 하기 표 1에 제시된 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-이가 사용되는 상황에서, 제시된 아미노산 서열 A의 제시된 아미노산 서열 B에 대한 아미노산 서열 동일성 ％ (달리 제시된 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 ％를 갖거나 포함하는 제시된 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 x X/Y
상기 식에서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 것으로 평가된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 ％는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 ％와 동일하지 않을 것임을 알 수 있을 것이다.
"FcRH5 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "FcRH5 변이체 핵산 서열"은 본원에 정의된 바와 같은 FcRH5 폴리펩티드, 바람직하게는 활성 FcRH5 폴리펩티드를 코딩하고, 본원에 개시된 전장 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 결여된 전장 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 FcRH5 폴리펩티드의 세포외 도메인 또는 본원에 개시된 전장 FcRH5 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편 (예를 들어, 전장 FcRH5 폴리펩티드의 완전한 코딩 서열의 일부만을 나타내는 핵산에 의해 코딩되는 것)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80％의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 통상적으로, FcRH5 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 전장 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 결여된 전장 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 서열이 존재하거나 존재하지 않는 FcRH5 폴리펩티드의 세포외 도메인 또는 본원에 개시된 전장 FcRH5 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 약 80％의 핵산 서열 동일성, 달리 적어도 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
통상적으로, FcRH5 변이체 폴리뉴클레오티드의 길이는 적어도 약 5개 뉴클레오티드, 달리 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, 1200개 뉴클레오티드이고, 상기 맥락에서 용어 "약"은 언급된 뉴클레오티드 서열 길이 ± 언급된 길이의 10％를 의미한다.
본원에서 확인된 FcRH5 코딩 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성 비율 (％)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭을 도입시킨 후, FcRH5 핵산 서열 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 범위에 포함되는 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나 본원의 목적상, 핵산 서열 동일성 값 ％는 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성되고, ALIGN-2 프로그램의 완전한 소스 코드는 하기 표 1에 제시된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc. 소유로서, 하기 표 1에 제시된 소스 코드는 미국 저작국 (Washington D.C., 20559)에 사용자 기록문서로 출원되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)로부터 공개적으로 입수가능하거나, 하기 표 1에 제시된 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
핵산 서열 비교를 위해 ALIGN-이가 사용되는 상황에서, 제시된 핵산 서열 C의 제시된 핵산 서열 D에 대한 핵산 서열 동일성 ％ (달리 제시된 핵산 서열 D에 대해 특정 핵산 서열 동일성 ％를 갖거나 포함하는 제시된 핵산 서열 C로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 x W/Z
상기 식에서, W는 C 및 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 것으로 평가된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D의 뉴클레오티드의 총수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않을 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 ％는 C에 대한 D의 아미노산 서열 동일성 ％와 동일하지 않을 것임을 알 수 있을 것이다. 구체적으로 나타내지 않으면, 본원에 사용된 모든 핵산 서열 동일성 값 ％는 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 문단에서 설명된 바와 같이 얻는다.
다른 양태에서, FcRH5 변이체 폴리뉴클레오티드는 FcRH5 폴리펩티드를 코딩하고, 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건 하에 본원에 개시된 전장 FcRH5 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자이다. FcRH5 변이체 폴리펩티드는 FcRH5 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
FcRH5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 대해 사용될 때, 용어 "전장 코딩 영역"은 본 발명의 전장 FcRH5 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열을 의미한다 (첨부 도면에 종종 출발 코돈으로부터 정지 코돈에 이르기까지의 서열로 제시됨). ATCC에 기탁된 핵산에 대해 사용될 때, 용어 "전장 코딩 영역"은 ATCC에 기탁된 벡터 내에 삽입된 cDNA의 FcRH5 폴리펩티드-코딩 부분을 의미한다 (첨부 도면에 종종 출발 코돈으로부터 정지 코돈에 이르기까지의 서열로 제시됨 (출발 및 정지 코돈은 도면에서 굵은 글씨체로 밑줄로 나타낸다)).
본원에 개시된 다양한 FcRH5 폴리펩티드를 설명하기 위해 사용될 때, "단리된"은 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 일반적으로 폴리펩티드의 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비-환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는, FcRH5 폴리펩티드 자연 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 계내 (in situ) 폴리펩티드를 포함한다. 그러나 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" FcRH5 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 다른 폴리펩티드-코딩 핵산은 폴리펩티드-코딩 핵산의 자연 환경에서 그와 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 환경과 다른 것이다. 따라서, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 자연 세포에 존재하는 특정 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포의 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는, 폴리펩티드를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 포함한다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 원핵 세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 (enhancer)를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비 단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보좀 결합 부위는 해독을 촉진하도록 위치할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 페이스 (reading phase)로 존재한다. 그러나 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결합에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (adaptor) 또는 링커가 통상의 용례에 따라 사용된다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 더욱 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 이의 융점 이하의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 서열 사이의 요구되는 상동성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 더욱 높은 상대 온도는 반응 조건을 더욱 엄격하게 만들고, 더욱 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격성에 대한 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해서는 문헌 [Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의되는 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃의 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트의 사용; (2) 혼성화 동안 변성제, 예를 들어 포름아미드, 예를 들어 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ Ficoll/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨 (42℃)의 사용; 또는 (3) 42℃의 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)를 사용한 10분 세척, 이어서 55℃의 EDTA 함유 0.1 x SSC로 구성된 10분 동안의 고엄격성 세척과 함께, 42℃에서 50％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M/시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용한 용액에서 철야 혼성화에 의해 확인될 수 있다.
"중등 엄격성 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인될 수 있고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 ％SDS)의 사용을 포함한다. 중등 엄격성 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단 처리 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서의 철야 인큐베이션, 이어서 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC 중에서의 필터 세척을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 적응시키는데 필요한 온도, 이온 강도 등의 조절 방법을 알 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프 택을 붙인 (epitope tagged)"은 "택 (tag) 폴리펩티드"에 융합된 FcRH5 폴리펩티드 또는 항-FcRH5 항체를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 의미한다. 택 폴리펩티드는 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하도록 충분한 잔기를 갖지만, 그가 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한, 택 폴리펩티드는 바람직하게는 상기 항체가 다른 에피토프에는 실질적으로 교차반응하지 않도록 매우 특별하다. 적합한 택 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기, 보통 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 약 20개의 잔기)를 갖는다.
본원의 목적상 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연 발생 FcRH5의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유하는 FcRH5 폴리펩티드의 형태(들)를 의미하고, "생물학적" 활성은 천연 또는 자연 발생 FcRH5가 갖는 항원 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력 이외의 다른, 천연 또는 자연 발생 FcRH5에 의해 유발되는 생물학적 기능 (억제성 또는 자극성)을 의미하고, "면역학적" 활성은 천연 또는 자연 발생 FcRH5가 갖는 항원 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력을 의미한다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 FcRH5 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "작용제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 FcRH5 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 작용제 또는 길항제 분자는 구체적으로 작용제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 FcRH5 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유기 소분자 등을 포함한다. FcRH5 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제를 확인하기 위한 방법은 FcRH5 폴리펩티드를 후보 작용제 또는 길항제 분자와 접촉시키고 FcRH5 폴리펩티드와 통상적으로 관련되는 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
"정제된"은 분자가 그를 함유하는 샘플의 적어도 95 중량％, 또는 적어도 98 중량％의 농도로 샘플 내에 존재함을 의미한다.
"단리된" 핵산 분자는, 예를 들어 이의 자연 환경에서 그와 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 핵산 분자를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 추가로 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 밖에 존재하거나 또는 이의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 그가 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 나타내도록 의도된다. 한 유형의 벡터는 그 내부에 추가의 DNA 절편이 결합될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결합될 수 있다. 특정 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포 내에서 자동 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 그에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "재조합 벡터")로서 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 플라스미드는 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 포함될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 그들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 표지와의 접합에 의해 합성 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡 (cap)" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 하전을 띄지 않는 연결기 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)로 및 하전을 띈 연결기 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 갖는 변형, 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터컬레이터 (intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 솔라렌 등)을 갖는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형 연결기 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 갖는 것, 및 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형 형태를 포함한다. 또한, 당 내에 보통 존재하는 임의의 하이드록실기는, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 교체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대해 추가의 연결기를 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 (capping group) 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사형, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결기는 대체 연결기로 교체될 수 있다. 상기 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결기를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알킬임)로 교체되는 양태를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 일반적으로 길이가 약 200개 뉴클레오티드 미만인 짧은, 일반적으로 단일 가닥의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배제하는 의미가 아니다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오티드에 동등하고 완전히 적용가능하다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장으로 특징지어지는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 조혈성 암 또는 혈액-관련 암, 예를 들어 림프종, 백혈병, 골수종 또는 림프성 악성종양, 및 비장암, 림프절의 암 및 암종, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 암의 보다 특정한 예는 B-세포 연관 암, 예를 들어 고등급, 중등급 및 저등급 림프종 (B 세포 림프종, 예를 들어 점막-연관-림프성 조직 B 세포 림프종 및 비-호지킨 림프종 (NHL), 외투막 세포 림프종, 버키트 림프종, 소형 림프구성 림프종, 변연대 림프종, 미만성 대세포 림프종, 여포성 림프종, 및 호지킨 림프종 및 T 세포 림프종 포함) 및 백혈병 (2차 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 예를 들어 B 세포 백혈병 (CD5+ B 림프구 포함), 골수성 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 예를 들어 급성 림프모구 백혈병 (ALL) 및 골수이형성증), 및 다른 혈액 및/또는 B 세포- 또는 T-세포-연관 암을 포함한다. 또한, 추가의 조혈 세포, 예를 들어 다형핵 백혈구, 예를 들어 호염기구, 호산구, 호중구 및 단핵구, 수지상 세포, 혈소판, 적혈구 및 천연 킬러 세포의 암도 포함된다. 다음 중에서 선택된 암성 B 세포 증식성 장애도 포함된다: 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 (hairy cell) 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종. B-세포 암의 기원은 다음을 포함한다: 변연대 B-세포 림프종은 변연대의 기억 B-세포에서 유래하고, 여포성 림프종 및 미만성의 거대 B-세포 림프종은 배 중심의 밝은 구역 내의 중심세포에서 유래하고, 만성 림프구성 백혈병 및 소형 림프구성 백혈병은 B1 세포 (CD5+)에서 유래하고, 외투막 세포 림프종은 외투 구액내의 나이브 B-세포에서 유래하고, 버키트 림프종은 배 중심의 암 구역의 중심모세포에서 유래한다. 본원에서 "조혈 세포 조직"으로 언급되는 조혈 세포를 포함하는 조직은 흉선 및 골수 및 말초 림프 조직, 예를 들어 비장, 림프절, 점막과 연관된 림프 조직, 예를 들어 장-연관 림프 조직, 편도, 파이어 판 (Peyer's patch) 및 충수돌기 및 다른 점막, 예를 들어 기관지 내막과 연관된 림프 조직을 포함한다. 상기 암의 추가의 특정 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 신경아교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 백혈병 및 다른 림프구 증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본원에서 "B-세포 악성종양"은 비-호지킨 림프종 (NHL), 예를 들어 저등급/여포성 NHL, 소형 림프구성 (SL) NHL, 중등급/여포성 NHL, 중등급 미만성 NHL, 고등급 면역모세포 NHL, 고등급 림프모구 NHL, 고등급 작은 비-절단된 세포 NHL, 거대 질병 (bulky disease) NHL, 외투막 세포 림프종, AIDS-관련 림프종, 및 발덴스트롬 (Waldenstrom) 고분자글로불린혈증, 비-호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세 호지킨병 (LPHD), 소형 림프구 림프종 (SLL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 무통성 NHL, 예를 들어 재발형 무통성 NHL 및 리툭시마브-불응성 무통성 NHL; 백혈병, 예를 들어 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병, 만성 골수모구성 백혈병; 외투막 세포 림프종; 및 다른 혈액 종양을 포함한다. 상기 악성종양은 B-세포 표면 마커, 예를 들어 FcRH5에 대해 지시되는 항체로 치료될 수 있다. 상기 질병은 B 세포 표면 마커, 예를 들어 FcRH5에 대해 지시되는 항체의 투여에 의해 치료되는 것으로 본원에서 고려되고, 비접합된 ("네이키드") 항체 또는 본원에 개시된 바와 같이 세포독성제에 접합된 항체의 투여를 포함한다. 또한, 상기 질병은 본 발명의 항-FcRH5 항체 또는 본 발명의 항-FcRH5 항체 약물 접합체를 다른 항체 또는 항체 약물 접합체, 다른 세포독성제, 방사선 조사 또는 다른 치료와 동시에 또는 연속적으로 투여하는 병용 요법에 의해 치료되는 것으로 본원에서 고려된다. 본 발명의 예시적인 치료 방법에서, 본 발명의 항-FcRH5 항체는 항-CD20 항체, 면역글로불린, 또는 이의 CD20 결합 단편과 조합되어 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 항-CD20 항체는 네이키드 항체 또는 항체 약물 접합체일 수 있다. 병용 요법의 양태에서, 항-FcRH5 항체는 본 발명의 항체이고, 항-CD20 항체는 Rituxan® (리툭시마브)이다.
본원에서 사용되는 용어 "비-호지킨 림프종" 또는 "NHL"은 호지킨 림프종 이외의 림프계의 암을 의미한다. 호지킨 림프종은 일반적으로 호지킨 림프종에 리드-스턴버그 (Reed-Sternberg) 세포가 존재하고 비-호지킨 림프종에 상기 세포가 존재하지 않는다는 사실에 의해 비-호지킨 림프종과 구별될 수 있다. 본원에서 사용되는 상기 용어에 포함되는 비-호지킨 림프종의 예는 당업계에 공지된 분류 방식, 예를 들어 문헌 [Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000)]에 기재된 개정된 유업-아메리카 림프종 (Revised European-American Lymphoma: REAL) 방식에 따라 당업자 (예를 들어, 종양학자 또는 병리학자)에 의해 확인되는 임의의 림프종을 포함한다. 특히, 도 11.57, 11.58 및 11.59의 목록을 참조한다. 보다 구체적인 예는 재발된 또는 불응성 NHL, 전선 (front line) 저등급 NHL, 단계 III/IV NHL, 화학요법 내성 NHL, 전구체 B 림프모구 백혈병 및/또는 림프종, 소형 림프구 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 전림프구성 백혈병 및/또는 소형 림프구성 림프종, B-세포 전림프구성 림프종, 면역종 및/또는 림프형질세포성 림프종, 림프형질세포성 림프종, 변연대 B 세포 림프종, 비장 변연대 림프종, 림프절외 변연대 - MALT 림프종, 림프절 변연대 림프종, 모발상 세포 백혈병, 형질세포종 및/또는 형질세포 골수종, 저등급/여포성 림프종, 중등급/여포성 NHL, 외투막 세포 림프종, 여포 중심 림프종 (여포성), 중등급 미만성 NHL, 미만성의 거대 B-세포 림프종, 활동성 NHL (활동성 전선 NHL 및 활동성 재발 NHL), 자가 줄기세포 이식 후에 재발된 또는 이식에 불응성인 NHL, 원발성 종격의 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 고등급 면역모세포성 NHL, 고등급 림프모구 NHL, 고등급 비-절단된 소세포 (high grade small non-cleaved cell) NHL, 거대 질환 NHL, 버키트 림프종, 전구체 (말초) 대과립 림프구성 백혈병, 균상식육종 및/또는 세자리 (Sezary) 증후군, 피부 (cutaneous) 림프종, 큰세포 역형성 림프종, 혈관중심성 림프종을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
혈장 세포 장애는 혈장 세포 클론의 비조절된 분열 또는 증식으로부터 발병한다. 혈장 세포는 활성화된 림프구 (즉, B 세포)로부터 생긴다. 각각의 B 세포는 외래 물질, 즉 항원에 대해 특이적인 이의 세포 표면에 배치된, B 세포 수용체로 공지된, 독특한 수용체를 생성한다. B 세포 수용체가 이의 인지체 항원에 결합하는 경우, 수용체를 발현하는 세포는 활성화되어 세포 주기에 재진입하여 이에 대한 많은 클론 카피를 생성한다. 클론은 주로 골수에 존재하며 항체로서 혈류로 방출되는 B 세포 수용체의 카피를 생성하도록 특화되는 혈장 세포로 성숙한다. 혈장 세포 장애에서, 혈장 세포 또는 모 B 세포는 유전적 손상을 겪고, 그 결과 세포 분열 및/또는 활성에 대한 정상적인 구속을 억제하거나 이에 불감하게 된다. 이러한 세포로부터 유도되는 딸 혈장 세포는 억제됨이 없이 분열하고/하거나 과량의 동일한 면역글로불린 (항체)을 생성할 수 있다는 점에서 악성이다. 종종, 생성된 면역글로불린은 불완전하거나 혈청, 조직 또는 기관 (특히, 신장)에 단백질 (또한, 특정 장애에 의존적인, 모노클로날 단백질, M 단백질, 파라단백질 또는 아밀로이드 단백질로도 알려짐)의 축적을 초래할 수 있는 부정확한 형태를 지녀, 기관 기능이상 및/또는 부전을 이끌 수 있다. 혈장 세포 장애는, 클론의 증식 특성, 골수 수반 정도 및 발현되는 M 단백질 유형에 기초하여 구별되는, 의미 미결정의 모노클로날 감마병증 (MGUS), 다발성 골수종 (MM), 고분자글로불린혈증, 중쇄 질환, 및 전신성 경쇄 아밀로이드증 (AL)을 포함한다. 추가의 혈장 세포 장애는 고립 형질세포종, 골수외성 형질세포종, 다발성 고립 형질세포종, 혈장 세포 백혈병, 왈덴스트롬 고분자글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinaemia), B-세포 비-호지킨 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병이다. 비록 리툭시마브 및 알렘투주마브와 같은 새로운 면역요법이 일부 B-세포 악성종양에서 질환을 없애고 전체적인 생존을 개선시켰지만, 이러한 요법은, 각각 CD20 및 CD52인 표적 항원이 악성 클론 혈장 세포에 의해 충분히 발현되지 않기 때문에, 어느 정도는 혈장 세포 장애의 치료에 효과적이다고 판명되지 않았다. 따라서, 혈장 세포 장애의 개선된 요법을 확인하고 개발하는 것이 필요하다 [미국 공개 특허원 20080166742 및 20080317745, 각각 전체가 참조로 본원에 포함됨].
B 세포, 혈장 세포 및 다발성 골수종 세포 (MM 환자 샘플로부터의 세포를 포함)에서 FcRH5 (IRTA2)의 발현은 이미 밝혀졌다 [미국 공개 특허원 20060251662, 전체가 참조로 본원에 포함됨]. 따라서, 다발성 골수종 샘플에서 FcRH5 발현 패턴에 비추어, 이 분자는 혈장 세포 장애, 예를 들어 본원에 기술된 장애 (즉, 다발성 골수종) 및 항체-분비와 관련된 질환, 예를 들어 알레르기 또는 자가면역 질환을 포함하여 포유동물에서 종양 요법을 위한 우수한 표적물이다.
"장애"는 본 발명의 물질/분자 또는 방법을 사용한 처치로부터 이익을 얻는 임의의 상태이다. 이것은 포유동물이 문제의 질병에 걸리기 쉽게 하는 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적인 예는 암성 상태, 예를 들어 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프성 악성종양; 신경세포, 아교세포, 성상세포, 시상하부 및 다른 선, 포식세포, 상피, 간질 및 포배강 (blastocoelic) 장애; 및 염증, 면역 및 다른 혈관신생-관련 장애를 포함한다. 장애는 추가로 암성 상태, 예를 들어 B 세포 증식성 장애 및/또는 B 세포 종양, 예를 들어, 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종을 포함한다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도 비정상적인 세포 증식과 연관된 질환을 나타낸다. 한 양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에서 사용되는 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 칭한다.
본원에서 "자가면역 질환"은 개체의 자기 자신의 조직 또는 기관 또는 공동-분리계 (co-segregate)로부터 발생하거나 이에 대해 지시되는 질환 또는 장애 또는 이의 증상 또는 그로부터 발생하는 상태이다. 많은 상기 자가면역 및 염증성 장애에서, 많은 임상적 및 실험적 마커가 존재할 수 있으며, 이에는 과감마글로불린혈증, 자가항체의 높은 수준, 조직 내의 항원-항체 복합체 침착, 코르티코스테로이드 또는 면역억제 치료로부터의 이점, 및 이환된 조직에서의 림프성 세포 집합체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. B-세포 매개 자가면역 질병에 대해 임의의 특정 이론에 제한되지는 않지만, B 세포는 자가항체 생성, 면역 복합체 형성, 수지상 및 T-세포 활성화, 사이토킨 합성, 직접 케모킨 방출 및 이소성 신생 림프 형성을 위한 핵심 장소의 제공을 포함하여, 많은 기계적인 경로를 통한 인간 자가면역 질병에서 발병 효과를 보이는 것으로 믿어진다. 각각의 상기 경로는 자가면역 질병의 병리에서 상이한 정도로 참여할 수 있다.
"자가면역 질환"은 기관-특이적 질환 (즉, 면역 반응은 내분비계, 조혈계, 피부, 심폐계, 위장계 및 간계, 신장계, 갑상선, 귀, 신경근육계, 중추신경계 등과 같은 기관계에 대해 특이적으로 작용함) 또는 다수의 기관계에 영향을 줄 수 있는 전신 질환 (예를 들어, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 류마티스성 관절염, 다발성 근육염 등)일 수 있다. 바람직한 상기 질환은 자가면역 류마티스성 장애 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 쇼그렌 (Sjoegren) 증후군, 공피증, 루푸스, 예를 들어 SLE 및 루푸스 신장염, 다발성 근육염/피부근육염, 한랭글로불린혈증, 항-인지질 항체 증후군, 및 건선성 관절염), 자가면역 위장 및 간 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염 및 크론 질환), 자가면역 위염 및 악성 빈혈, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 및 복강 질환), 혈관염 (예를 들어, ANCA-음성 혈관염 및 ANCA-관련 혈관염, 예를 들어 처크-스트라우스 (Churg-Strauss) 혈관염, 베게너 (Wegener) 육아종증, 및 현미경적 다발성 혈관염), 자가면역 신경 장애 (예를 들어, 다발성 경화증, 안진전 간대성 근경련 증후군, 중증 근무력증, 시신경척수염, 파킨슨 (Parkinson) 병, 알츠하이머 질환, 및 자가면역 다발성 신경병증), 신장 장애 (예를 들어, 사구체신염, 구드패스츄어 (Goodpasture) 증후군, 및 버거 (Berger) 질환), 자가면역 피부 장애 (예를 들어, 건선, 두드러기, 심상성 천포창, 수포성 유사천포창, 및 피부 홍반성 루프스), 혈액 장애 (예를 들어, 혈소판감소 자색반, 혈전 혈소판감소 자색반, 수혈후 자색반, 및 자가면역 용혈 빈혈), 죽상경화증, 포도막염, 자가면역 청각 질환 (예를 들어, 내이 질환 및 청각 상실), 베체트 (Behcet) 질환, 레이노 (Raynaud) 증후군, 기관 이식 및 자가면역 내분비 장애 (예를 들어, 당뇨-관련 자가면역 질환, 예를 들어 인슐린-의존 당뇨병 (IDDM), 애디슨 (Addison) 질환, 및 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브 (Grave) 질환 및 갑상선염))을 포함한다. 더욱 바람직한 상기 질병은, 예를 들어 류마티스성 관절염, 궤양성 결장염, ANCA-관련 혈관염, 루푸스, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 그레이브 질환, IDDM, 악성 빈혈, 갑상선염, 및 사구체신염을 포함한다.
몇몇 경우에 상기 나열된 것을 포함하는, 본원에서 정의된 다른 자가면역 질환의 구체적인 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 관절염 (급성 및 만성 류마티스성 관절염, 예를 들어 연소성 발병 류마티스성 관절염 및 병기, 예를 들어 류마티스성 활막염, 통풍 또는 통풍성 관절염, 급성 면역학적 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 타입 II 콜라겐 유발 관절염, 감염성 관절염, 라임 (Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 스틸 (Still) 질환, 척추 관절염, 골관절염, 만성 프로그레디엔테 (chronica progrediente) 관절염, 변형 관절염, 만성 원발성 (chronica primaria) 다발관절염, 반응성 관절염, 폐경기 관절염, 에스트로겐 결핍 관절염, 및 강직 척추염/류마티스성 척추염), 자가면역 림프구 증식 질환, 염증성 과다증식성 피부 질환, 건선, 예를 들어 반상 건선, 물방울 모양 (gutatte) 건선, 농포성 건선, 및 손톱 건선, 아토피, 예를 들어 아토피성 질병, 예를 들어 고초열 및 욥 (Job) 증후군, 피부염, 예를 들어 접촉 피부염, 만성 접촉 피부염, 탈락 피부염, 알레르기 피부염, 알레르기 접촉 피부염, 두드러기, 포진성 피부염, 화폐상 피부염, 지루성 피부염, 비-특이적 피부염, 원발성 자극성 접촉성 피부염 및 아토피성 피부염, x-관련 과다 IgM 증후군, 알레르기성 안내 염증성 질환, 만성 자가면역 담마진을 비롯한 담마진, 예를 들어 만성 알레르기성 담마진 및 만성 특발성 담마진, 근육염, 다발성 근육염/피부근육염, 아동 피부근육염, 독성 표피 괴사성 용해, 경피증 (전신성 경피증 포함), 경화증, 예를 들어 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예를 들어 척수-눈 (spino-optical) MS, 원발성 진행성 MS (PPMS) 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신성 경화증, 죽상경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 실조성 경화증, 시신경 척수염 (NMO), 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론 질환, 자가면역-매개 위장 질환, 위장 염증, 결장염, 예를 들어 궤양성 결장염, 현미경적 결장염, 콜라겐성 결장염, 폴립성 결장염, 괴사성 소장결장염, 및 전층의 결장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 장 염증, 괴저성 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 성인성 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 비롯한 호흡 곤란 증후군, 수막염, 포도막의 전체 또는 부분 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액성 장애, 이식편 대 숙주 질환, 혈관부종, 예를 들어 유전성 혈관부종, 수막염에서의 뇌신경 손상, 임신성 포진, 임신성 유사천포창, 음낭 소양증, 자가면역 조숙 난소 부전, 자가면역 상태로 인한 돌발성 청각 상실, IgE-매개 질환, 예를 들어 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염, 예를 들어 라스무센 (Rasmussen) 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예를 들어 앞포도막염, 급성 앞포도막염, 육아종성 포도막염, 비-육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 뒤포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신증후군이 있거나 없는 사구체신장염 (GN), 예를 들어 만성 또는 급성 사구체신장염, 예를 들어 원발성 GN, 면역-매개 GN, 막성 GN (막성 신장병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신장병증, 유형 I 및 유형 II를 비롯한 막- 또는 막성 증식성 GN (MPGN), 및 급속 진행성 GN (RPGN), 증식성 신장염, 자가면역 다분비선 내분비 부전, 국한성 형질세포 귀두염을 비롯한 귀두염, 귀두포피염, 중심원심성 윤상 홍반, 지속성 피부이색성 홍반, 다형 홍반, 윤상 육아종, 광택 태선, 경화성 및 위축성 태선, 단순 만성 태선, 극상 태선, 편평 태선, 판상 어린선, 표피박리성 과각화증, 전암성 각화증, 괴저성 농피증, 알레르기성 상태 및 반응, 음식 알레르기, 약물 알레르기, 곤충 알레르기, 희귀 알레르기성 장애, 예를 들어 비만세포증, 알레르기성 반응, 알레르기성 또는 아토피성 습진, 건조 습진, 발한장애성 습진 및 소수포성 수장족저 습진을 비롯한 습진, 천식, 예를 들어 기관지성 천식, 기관지 천식 및 자가면역 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 상태, 외래 항원, 예를 들어 임신 동안 태아 A-B-O 혈액형에 대한 면역 반응을 수반하는 질환, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 루푸스, 예를 들어 신장염 루푸스, 뇌염 루푸스, 소아 루푸스, 비-신장 루푸스, 신장외 루푸스, 원판상 루푸스 및 원판상 홍반성 루푸스, 탈모성 루푸스, SLE, 예를 들어 피부 SLE, 아급성 피부 SLE, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 및 파종상 홍반성 루푸스, 연소성 발병 (타입 I) 당뇨병, 예를 들어 소아 IDDM, 성인 발병 당뇨병 (타입 II 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 당뇨병성 요붕증, 당뇨성 망막병증, 당뇨성 신장병증, 당뇨성 결장염, 당뇨성 대동맥 장애, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민과 관련된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 림프종양 육아종증을 비롯한 육아종증, 무과립증, 맥관염 (예를 들어, 대혈관 혈관염, 예를 들어 류머티스성 다발성 근육통 및 거대-세포 (타카야스 (Takayasu)) 동맥염, 중간혈관 혈관염, 예를 들어, 카와사키 (Kawasaki) 질환 및 결절성 다발성 동맥염/결절성 동맥주위염, 면역혈관염, CNS 혈관염, 피부 혈관염, 과민 혈관염, 괴사성 혈관염, 예를 들어 섬유소성 괴사성 혈관염, 전신성 괴사성 혈관염, ANCA-음성 혈관염 및 ANCA-관련 혈관염, 예를 들어 처크-스트라우스 증후군 (CSS), 베게너 육아종증, 및 현미경적 다발성 혈관염), 관자 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰스 (Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 (Diamond Blackfan) 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA)을 비롯한 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 애디슨 질환, 진성 적혈구계 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역성 호중구감소증(들), 혈구감소증, 예를 들어 범혈구감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 누출과 관련된 질환, CNS 염증성 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 기관 손상 증후군, 예를 들어 패혈증, 외상 또는 출혈에 대한 이차성 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 운동신경염, 알레르기성 신경염, 베체트 질환/증후군, 캐슬맨 (Castleman) 증후군, 구드패스츄어 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 (Stevens-Johnson) 증후군, 유사천포창 또는 천포창, 예를 들어 수포성 유사천포창, 반흔성 (점막) 유사천포창, 피부 유사천포창, 심상성 천포창, 부신생물성 천포창, 낙엽상 천포창, 점막 유천포창 및 홍반 천포창, 후천성 수포성 표피 박리증, 안구 염증, 바람직하게는 알레르기성 안구 염증, 예를 들어 알레르기성 결막염, 선형 IgA 수포 질환, 자가면역-유발 결막 염증, 자가면역 다내분비질환, 라이터 (Reiter) 질환 또는 증후군, 자가면역 상태로 인한 열 손상, 전자간증, 면역 복합성 장애, 예를 들어 면역 복합성 신장염, 항체-매개 신장염, 신경염증성 장애, 다발성 신경병증, 만성 신경병증, 예를 들어 IgM 다발성 신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 저혈소판증 (예를 들어, 심근 경색 환자에 의해 발병됨), 예를 들어 혈전 저혈소판 자반병 (TTP), 수혈후 자반병 (PTP), 헤파린-유도 저혈소판증, 및 자가면역 또는 면역-매개 저혈소판증, 예를 들어 특발성 저혈소판자반병 (ITP) (만성 또는 급성 ITP 포함), 공막염, 예를 들어 특발성 각공막염, 상공막염, 고환 및 난소의 자가면역 질환 (자가면역 고환염 및 난소염 포함), 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예를 들어 자가면역 갑상선염, 하시모토 (Hashimoto) 질환, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염) 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브 질환, 그레이브 안질환 (안병증 또는 갑상선-관련 안병증), 다분비선 증후군, 예를 들어 자가면역 다분비선 증후군, 예를 들어 유형 I (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 신경학적 부신생물 증후군, 예를 들어 람버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증 증후군 또는 이튼-람버트 (Eaton-Lambert) 증후군을 비롯한 부신생물 증후군, 근육강직 (stiff-man 또는 stiff-person) 증후군, 뇌척수염, 예를 들어 알레르기 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근육 무력증, 예를 들어 흉선종-관련 중증 근육 무력증, 소뇌변성, 신경근강직증, 안진전 또는 안진전 근경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다소성 운동 신경병증, 쉬한 (Sheehan) 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 폐렴, 예를 들어 림프성 간질 폐렴 (LIP), 폐쇄 세기관지염 (비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 버거병 (IgA 신병증), 특발성 IgA 신병증, 선상 IgA 피부병, 급성 유열 호중구성 피부병, 각질하 농포성 피부병, 일과성 극세포해리 피부병, 경화증, 예를 들어 원발성 담관성 경화증 및 폐경화증, 자가면역 장병증 증후군, 복강 질환, 비열대 스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 예를 들어 혼합 한랭글로불린혈증, 근위축 측삭 경화증 (ALS; 루게릭 (Lou Gehrig) 질환), 관상 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예를 들어 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 청각 상실, 다발성연골염, 예를 들어 불응성 또는 재발된 또는 재발형 다발성연골염, 폐단백증, 각막염, 예를 들어 코간 (Cogan) 증후군/비-매독성 간질성 각막염, 벨 (Bell) 마비, 스위트 (Sweet) 질환/증후군, 자가면역 딸기코, 포진 (zoster)-관련 통증, 아밀로이드증, 비-암성 림프구 증가증, 원발성 림프구 증가증 (모노클로날 B 세포 림프구 증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마병증 및 의미 미결정 모노클로날 감마병증 (MGUS)) 포함), 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 채널병증, 예를 들어 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 귀먹음, 실명, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근육병증, 국소성 또는 분절성 또는 국소성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 내분비 안구병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역 간장 장애, 섬유근육통, 다내분비 기능부전, 쉬미트 증후군, 부신염, 위 위축, 초로성 치매, 탈수초 질환, 예를 들어 자가면역 탈수초 질환 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증, 드레슬러 증후군, 원형 탈모증, 전체 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 수지경화증 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 예를 들어, 항-정자 (spermatozoan) 항체로 인한 불임, 혼합성 결합 조직 질환, 샤가스병, 류마티스성 열, 재발형 유산, 농부 폐, 다형 홍반, 심장절개후 증후군, 쿠싱 (Cushing) 증후군, 조류 사육자 폐, 알레르기성 육아종 맥관염, 양성 림프구성 맥관염, 알포트 (Alport) 증후군, 폐포염, 예를 들어 알레르기성 폐포염 및 섬유성 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 기생충 질환, 예를 들어 리슈만편모충증, 파동편모충증, 주혈흡충증, 회충증, 아스페르질루스증, 샘터 (Sampter) 증후군, 카플란 (Caplan) 증후군, 뎅기열, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 미만성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 섬유성 종격염, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 안구내염, 기관 융기성 홍반 (erythema elevatum et diutinum), 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 (Shulman) 증후군, 펠티 (Felty) 증후군, 사상충증, 섬모체염, 예를 들어 만성 섬모체염, 홍채이색 섬모체염, 홍채섬모체염 (급성 또는 만성), 또는 푸크 (Fuch) 섬모체염, 헤노흐-쉔라인 (Henoch-Schonlein) 자색반, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, SCID, 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 에코바이러스 감염, 폐혈증 (전신성 염증성 반응 증후군 (SIRS)), 내독소혈증, 췌장염, 티록신증, 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신처리후 증후군, 선천 풍진 감염, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스 감염, 볼거리, 에반 (Evan) 증후군, 자가면역 생식선 기능부전, 시덴함 (Sydenham) 무도병, 연쇄상구균 감염후 신염, 폐색성 혈전혈관염, 갑상선독소증, 척수 매독, 맥락막염, 거대-세포 다발성근육통, 만성 과민 폐렴, 결막염, 예를 들어 봄철 카타르, 건조 각막결막염 및 유행성 각막결막염, 특발성 신장염 증후군, 최소 변화 신장병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 이식 기관 재관류, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도/폐 질환, 규폐증, 아프타, 아프타 구내염, 동맥경화성 장애 (뇌혈관 부전증), 예를 들어 동맥경화성 뇌병증 및 동맥경화성 망막병증, 무정자형성증, 자가면역 용혈, 뵈크 (Boeck) 질환, 한랭글로불린혈증, 뒤피트렌 (Dupuytren) 구축, 수정체 아낙필라시성 안염, 알레르기성 장염, 나성 결절성 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 류머티스성 열, 하만-리치 (Hamman-Rich) 질환, 감각신경 청각 상실, 발작성 혈색소뇨증, 성선기능저하증, 국한성 회장염, 백혈구 감소증, 염증성 단핵구증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신장증, 교감성 안염, 신생아 안염, 시각 신경염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발성 신경근염, 괴저성 농피증, 케르바인 (Quervain) 갑상선염, 후천성 비장 위축증, 비-악성 흉선종, 림프성 모낭 흉선염, 백반증, 독성-쇼크 증후군, 음식 중독, T 세포 침윤과 관련된 상태, 백혈구-부착 결핍증, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민과 관련된 면역 반응, 백혈구 누출과 관련된 질환, 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 자가면역 다내분비질환, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역 위축성 위염, 류머티스성 질환, 혼합성 결합 조직 질환, 신증후군, 췌도염, 다내분비 부전, 자가면역 다분비선 증후군, 예를 들어 다분비선 증후군 유형 I, 성인발병형 특발성 부갑상선기능저하증 (AOIH), 심근병증, 예를 들어 확장성 심근병증, 후천성 수포 표피박리증 (EBA), 혈색소침착증, 심근염, 신증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비-화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 벌집, 전두, 상악 또는 접형 부비동염, 알레르기성 부비동염, 호산구-관련 장애, 예를 들어 호산구증가증, 폐 침윤 호산구증가증, 호산구증가증-근육통 증후군, 로플러 (Loffler) 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구증가증, 기관지폐 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구 함유 육아종, 아나필락시스, 척추관절병증, 혈청검사 음성인 척추관절염, 다내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤 (Bruton) 증후군, 유아의 일과성 저감마글로불린혈증, 위스코트-알드리치 (Wiskott-Aldrich) 증후군, 혈관확장성 운동실조증 증후군, 혈관확장증, 콜라겐 질환과 관련된 자가면역 장애, 류머티즘, 예를 들어 만성 관절류머티즘, 림프절염, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능장애, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 신장 허혈, 뇌 허혈, 및 혈관화 동반 질환, 알레르기성 과민 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 허혈성 재관류 장애, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 림프종성 기관기관지염, 염증성 피부병, 급성 염증성 성분을 동반한 피부병, 다발성 기관 부전, 수포성 질환, 신장 피질 괴사, 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증성 장애, 눈 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈-관련 증후군, 사이토킨-유도 독성, 기면증, 급성 중증 염증, 만성 난치 염증, 신우염, 동맥내막 과증식증, 소화궤양, 판막염 및 자궁내막증이다. 상기 질병은 B 세포 표면 마커, 예를 들어 FcRH5에 결합하는 항체의 투여에 의해 치료되는 것으로 본원에서 고려되고, 비접합된 ("네이키드") 항체 또는 본원에 개시된 세포독성제에 접합된 항체의 투여를 포함한다. 또한, 상기 질병은 동시에 또는 연속적으로 투여되는 다른 항체 또는 항체 약물 접합체, 다른 세포독성제, 방사선 조사 또는 다른 치료제와 함께 본 발명의 항-FcRH5 항체 또는 항-FcRH5 항체 약물 접합체의 병용 요법에 의해 치료되는 것으로 본 발명에서 고려된다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 표적된 병리학적 상태 또는 질환을 억제하거나 이의 진행 속도를 느리게 하는 (완화하는) 것을 목적으로 하는 치료 목적의 처치 및 예방 또는 억제 조치를 모두 의미한다. 치료가 필요한 피험체는 질환이 이미 발생한 피험체 및 장애를 갖기 쉬운 피험체 또는 장애가 억제되어야 하는 피험체를 포함한다. 피험체 또는 포유동물은 본 발명의 방법에 따라, 치료량의 항-FcRH5 항체를 투여한 후, 환자가 다음 중 하나 이상의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재를 보일 경우에 FcRH5 폴리펩티드-발현 암에 대해 성공적으로 "치료된다": 암 세포의 수 감소 또는 암 세포의 부재; 종양 크기의 감소; 암의 연조직 및 뼈로의 퍼짐을 포함하여 말초 기관 내로 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장의 어느 정도의 억제 및/또는 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감; 이환율 및 사망률 감소, 및 삶의 질 개선. 상기 항-FcRH5 항체가 암세포 성장을 억제하고/하거나 존재하는 암세포를 사멸시킬 정도로, 항체는 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 또한, 상기 징후 또는 증상의 감소는 환자에 의해 지각될 수도 있다.
질병의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 잘 알려진 통상적인 절차에 의해 쉽게 측정가능하다. 암 치료를 위해, 효능은, 예를 들어 질병 진행시까지의 시간 (TTP)의 평가 및/또는 반응 속도 (RR)의 결정에 의해 측정할 수 있다. 전이는 병기 분류 (staging) 시험 및 골 스캔 및 칼슘 수준 및 뼈로의 퍼짐 정도를 결정하기 위한 다른 효소에 대한 시험에 의해 결정될 수 있다. 또한, 골반 및 영역 내의 림프절로의 퍼짐을 관찰하기 위해 CT 스캔을 수행할 수 있다. 흉부 X-선 및 공지의 방법에 의한 간 효소 수준의 측정을 사용하여 폐 및 간 각각으로의 전이를 관찰한다. 질환을 모니터링하기 위한 다른 통상적인 방법은 경직장 초음파영상 (TRUS) 및 경직장 생검침 (TRNB)을 포함한다.
보다 국소 암인 방광암에 대해, 질환의 진행을 결정하기 위한 방법은 방광경 검사에 의한 소변 세포 평가, 소변 내 혈액의 존재 모니터링, 초음파 검사 또는 정맥 신우 조영사진에 의한 요로상피관의 가시화, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 및 자기 공명 영상화 (MRI)를 포함한다. 원격 전이의 존재는 복부 CT, 흉부 x-선, 또는 골격의 방사선 핵종 영상화에 의해 평가될 수 있다.
"만성" 투여는 급성 방식과 달리 연장된 기간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하기 위해 연속적인 방식으로 제제(들)을 투여하는 것을 의미한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 행해지지는 않지만, 특성상 주기적인 치료이다.
"개체"는 척추동물이다. 특정 양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물 (예를 들어, 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류, 생쥐 및 래트를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 포유동물은 인간이다.
암 증상의 완화 치료를 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하여 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 추가의 치료제와 "병용한" 투여는 동시 (병행) 및 임의의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 용량 및 농도에서 그에 대해 노출되는 세포 또는 포유동물에게 무독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충된 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 완충액, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN®, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS®를 포함한다.
"고체상" 또는 "고체 지지체"는 본 발명의 항체가 접착 또는 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고체상의 예는 부분적으로 또는 전적으로 유리 (예를 들어, 조절된 공극 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 포함한다. 특정 양태에서, 정황에 따라, 고체상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있고; 다른 부분에서는 정제 칼럼 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피 칼럼)일 수 있다. 또한, 이 용어는 미국 특허 4,275,149에 기재된 것과 같은, 별개 입자의 비연속적 고체상을 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어, FcRH5 항체)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포좀의 성분은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 2층 구조로 배열된다.
"소분자" 또는 "유기 소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 이하인 것으로 규정된다.
"개체", "피험체" 또는 "환자"는 척추동물이다. 특정 양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물 (예를 들어, 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류, 생쥐 및 래트를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "약제학적 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하게 하는 형태이고 제제가 투여되는 피험체에게 허용되지 않게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다. 상기 제제는 멸균 상태일 수 있다.
"멸균" 제제는 무균 상태이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 존재하지 않는다.
본원에 개시된 항체의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 통상적인 방법으로 실험에 의해 결정될 수 있다.
용어 "치료 유효량"은 피험체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애의 "치료"에 효과적인 항체 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물은 암 세포 수의 감소, 종양 크기의 감소, 말초 기관으로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도의 지연 및 바람직하게는 정지); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도의 지연 및 바람직하게는 정지); 어느 정도의 종양 성장의 억제; 및/또는 암과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감을 달성할 수 있다. 상기 "치료"에 대한 본원의 정의를 참조한다. 약물이 암세포 성장을 억제하고/하거나 존재하는 암세포를 사멸시킬 정도로, 상기 약물은 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. "예방 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 나타낸다. 반드시 그러한 것은 아니지만 일반적으로, 예방 용량은 질병의 보다 초기 단계 전에, 또는 보다 초기 단계에서 피험체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
항-FcRH5 항체의 "성장 억제량"은 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암 세포의 성장을 시험관내에서 또는 생체내에서 억제할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하기 위한 항-FcRH5 항체의 "성장 억제량"은 실험적으로 및 통상의 방식으로 결정될 수 있다.
항-FcRH5 항체의 "세포독성량"은 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암 세포를 시험관내에서 또는 생체내에서 파괴할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하기 위한 항-FcRH5 항체의 "세포독성량"은 실험적으로 및 통상의 방식으로 결정될 수 있다.
"FcRH5-발현 세포"는 내인성 또는 형질감염된 FcRH5 폴리펩티드를 세포 표면 상에 또는 분비된 형태로 발현하는 세포이다. "FcRH5-발현 암"은 세포 표면 상에 존재하는 FcRH5 폴리펩티드를 갖거나 또는 FcRH5 폴리펩티드를 생성하고 분비하는 세포를 포함하는 암이다. "FcRH5-발현 암"은 임의로 항-FcRH5 항체가 그에 대해 결합하여 암에 대해 치료 효과를 가질 수 있도록, 세포 표면 상에 충분한 수준의 FcRH5 폴리펩티드를 생성한다. 다른 양태에서, "FcRH5-발현 암"은 임의로 항-FcRH5 항체 길항제가 그에 대해 결합하여 암에 대해 치료 효과를 가질 수 있도록, 충분한 수준의 FcRH5 폴리펩티드를 생성하고 분비한다. 후자의 경우에, 길항제는 종양 세포에 의한 분비형 FcRH5 폴리펩티드의 생성 및 분비를 감소, 억제 또는 방지하는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. FcRH5 폴리펩티드를 "과다발현하는" 암은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포에 비해 이의 세포 표면에서 유의하게 더 높은 수준의 FcRH5 폴리펩티드를 갖거나, 생성하고 분비하는 것이다. 상기 과다발현은 유전자 증폭 또는 전사 또는 해독 증가에 기인할 수 있다. FcRH5 폴리펩티드 과다발현은 (예를 들어, FcRH5 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로부터 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있는 단리된 FcRH5 폴리펩티드에 대해 제조된 항-FcRH5 항체를 사용한 면역조직화학 분석; FACS 분석 등을 통해) 세포 표면 상에 존재하거나 또는 세포에 의해 분비된 증가된 수준의 FcRH5 단백질을 평가함으로써 검출 또는 예측 분석으로 결정될 수 있다. 달리, 또는 추가로, 세포에서 FcRH5 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 mRNA의 수준은, 예를 들어 FcRH5-코딩 핵산 또는 이의 상보체에 대응하는 핵산 기초 프로브를 사용한 형광 계내 혼성화 (FISH; 1998년 10월 공개된 WO98/45479 참조), 서던 블로팅, 노던 블로팅, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들어 실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 통해 측정할 수 있다. FcRH5 폴리펩티드 과다발현은, 예를 들어 항체 기초 분석 (또한, 예를 들어, 1990년 6월 12일 등록된 미국 특허 4,933,294; 1991년 4월 18일 공개된 WO91/05264; 1995년 3월 28일 등록된 미국 특허 5,401,638; Sias et al., J. Immunol . Methods 132:73-80 (1990) 참조)을 이용하여 생물학적 유체, 예를 들어 혈청 내의 흘림 항원을 측정하여 조사할 수 있다. 상기 분석 외에, 다양한 생체내 분석을 당업자는 이용할 수 있다. 예를 들어, 환자의 신체 내의 세포를 검출가능한 표지, 예를 들어, 방사성 동위원소로 임의로 표지된 항체에 노출시킨 후, 예를 들어, 방사성의 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 기노출된 환자로부터 얻은 생검의 분석에 의해, 환자에서 항체의 세포에 대한 결합을 평가할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합한 항체 유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 (즉, "이종"인) 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 일반적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성하기 위해 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체로 검출가능하거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 제한하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소, 예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제 (intercalating agent), 효소 및 이의 단편, 예를 들어 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 및 이의 단편 및/또는 변이체, 및 아래에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하고자 의도된다. 다른 세포독성제는 아래에 기재된다. 살종양제는 종양 세포를 파괴한다.
"독소"는 세포의 성장 또는 증식에 유해한 효과를 보일 수 있는 임의의 물질이다.
"화학요법제"는 작용 메커니즘과 상관없이 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 포함한다. 화학요법제의 예는 다음을 포함한다: 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 염산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디인 (enediyne) 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (Angew, Chem . Intl . Ed . Engl . (1994) 33: 183-186); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테치미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프로리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 로족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 TAXOL® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ 크레모포르-비함유, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE® 독세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; GEMZAR® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16): 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이단드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르, CPT-11) (5-FU 및 류코보린과 함께 하는 이리노테칸 치료 요법을 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; VELCAOE; Revlimid® (레날리도미드); 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 (옥살리플라틴 처리 요법을 포함) (FOLFOX); 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR (예를 들어, 에를로티니브 ((Tarceva™)) 및 VEGF-A의 억제제, 및 상기 임의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
또한, 화학요법제의 정의에는 다음이 포함된다: 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTONㆍ토레미펜; 부신선에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테치미드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN® 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸, 및 ARIMIDEX® 아나스트로졸; 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연관되는 신호 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras; 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, ANGIOZYME® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예를 들어 유전자 요법 백신, 예를 들어 ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 [미국 특허 4,675,187], 및 상기 임의의 물질의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체.
또한, "화학요법제"의 정의에는 치료 항체, 예를 들어 알렘투주마브 (Campath), 베바시주마브 (Avastin®, Genentech); 세툭시맙 (ERBITUX®, Imclone); 파미투루마브 (VECTIBIX®, Amgen), 리툭시마브 (Rituxan®, Genentech/Biogen Idec), 퍼투주마브 (OMNITARG™, 2C4, Genentech), 트라스투주마브 (HERCEPTIN®, Genentech), 토시투모마브 (Bexxar, Corixia), 및 항체 약물 접합체, 겜투주마브 오조가미신 (MYLOTARG®, Wyeth)이 포함된다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관내에서 또는 생체내에서 세포, 특히 FcRH5를 발현하는 암 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 FcRH5를 발현하는 세포의 비율 (%)을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 (S기 이외의 다른 시기에) 세포 주기 진행을 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 제제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목에서 유도된 항암 약물이다. 유럽 주목에서 유도된 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세관의 조립을 촉진시키고, 탈중합을 억제함으로써 미세관을 안정화시켜 세포의 유사분열을 억제한다.
"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다. 독소루비신의 전체적인 화학 명칭은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라하이드로-6,8,11-트리하이드록시-8-(하이드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
용어 "사이토킨"은 세포간 매개자로서 다른 세포에 대해 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적 용어이다. 상기 사이토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장인자; 섬유모세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러관 억제 물질; 생쥐 고나도트로핀-관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-성장인자; 전환 성장인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 사이토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.
용어 "포장 삽입물"은 증상, 사용, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 치료 제품 사용에 대한 경고를 포함하는, 치료 제품의 상업적 포장에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "세포내 대사물질"은 항체-약물 접합체 (ADC)에 대한 세포 내부의 대사 과정 또는 반응으로부터 생성되는 화합물이다. 대사 과정 또는 반응은 효소 과정, 예를 들어 ADC의 펩티드 링커의 단백 분해 절단, 또는 관능기, 예를 들어 하이드라존, 에스테르, 또는 아미드의 가수분해일 수 있다. 세포내 대사물질은 세포로의 도입, 확산, 섭취 또는 수송 후에 세포내 절단을 겪는 항체 및 유리 약물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "세포 내에서 절단된" 및 "세포내 절단"은 약물 모이어티 (D)와 항체 (Ab) 사이의 공유결합에 의한 부착, 즉 링커가 파괴되어 유리 약물을 세포 내에서 항체로부터 해리시키는, 항체-약물 접합체 (ADC)에 대한 세포 내의 대사 과정 또는 반응을 의미한다. 따라서, ADC의 절단된 모이어티는 세포내 대사물질이다.
용어 "생체이용률"은 환자에게 투여된 약물의 소정량의 전신 이용률 (즉, 혈액/혈장 수준)을 의미한다. 생체이용률은 투여된 투여형으로부터 전신 순환계에 도달하는 약물의 시간 (속도) 및 총량 (정도)의 측정치를 나타내는 절대적인 용어이다.
용어 "세포독성 활성"은 ADC 또는 ADC의 세포내 대사물질의 세포-사멸, 세포증식 억제 또는 성장 억제 효과를 의미한다. 세포독성 활성은 1/2의 세포가 생존하는 단위 부피당 농도 (몰 또는 질량)인 IC50 값으로서 표현될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 1 내지 12개의 탄소 원자 (C1-C12)의 포화 직쇄 또는 분지쇄 일가 탄화수소 라디칼을 나타내고, 여기서 알킬 라디칼은 임의로 아래에서 설명되는 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환될 수 있다. 다른 양태에서, 알킬 라디칼은 1 내지 8개의 탄소 원자 (C1-C8), 또는 1 내지 6개의 탄소 원자 (C1-C6)이다. 알킬기의 예는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-헵틸, 1-옥틸 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "알케닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는 2 내지 8개의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 일가 탄화수소 라디칼을 나타내고, 여기서 알케닐 라디칼은 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환될 수 있고, "시스" 및 "트랜스" 배향, 또는 달리, "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다. 그 예는 에틸렌 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2) 등을 포함한다.
용어 "알키닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 2 내지 8개의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 일가 탄화수소 라디칼을 나타내고, 여기서 알키닐 라디칼은 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환될 수 있다. 그 예는 에티닐 (-C≡CH), 프로피닐 (프로파르길, -CH2C≡CH) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "카르보사이클", "카르보사이클릴", "카르보사이클릭 환" 및 "사이클로알킬"은 모노사이클릭 환으로서 3 내지 12개의 탄소 원자 (C3-C12) 또는 바이사이클릭 환으로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 일가의 비-방향족 포화 또는 부분 불포화 환을 의미한다. 7 내지 12개의 원자를 갖는 바이사이클릭 카르보사이클은, 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열될 수 있고, 9 또는 10개의 환 원자를 갖는 바이사이클릭 카르보사이클은 바이사이클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서, 또는 브릿지 시스템, 예를 들어 바이사이클로[2.2.1]헵탄, 바이사이클로[2.2.2]옥탄 및 바이사이클로[3.2.2]노난으로서 배열될 수 있다. 모노사이클릭 카르보사이클의 예는, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐, 1-사이클로헥스-3-에닐, 사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실, 사이클로운데실, 사이클로도데실 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"아릴"은 모 방향족 환계의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 6 내지 20개의 탄소 원자 (C6-C20)의 일가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 아릴기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시되다. 아릴은 포화, 부분 불포화 환, 또는 방향족 카르보사이클릭 환에 융합된 방향족 환을 포함하는 바이사이클릭 라디칼을 포함한다. 일반적인 아릴기는 벤젠으로부터 유도된 라디칼 (페닐), 치환 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐, 인데닐, 인다닐, 1,2-디하이드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아릴기는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환된다.
용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭 환"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 적어도 하나의 환 원자가 질소, 산소, 인 및 황 중에서 선택된 헤테로원자이고, 나머지 환 원자는 C인 3 내지 20개의 환 원자의 포화 또는 부분 불포화 (즉, 하나 이상의 이중 및/또는 삼중 결합을 환 내에 갖는다) 카르보사이클릭 라디칼을 의미하고, 여기서 하나 이상의 환 원자는 임의로 아래에서 설명되는 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환된다. 헤테로사이클은 3 내지 7개의 환 원을 갖는 모노사이클 (2 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P, 및 S 중에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자) 또는 7 내지 10개의 환 원을 갖는 바이사이클 (4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P, 및 S 중에서 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자), 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로사이클은 문헌 [Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 특히 Chapters 1, 3, 4, 6, 7, 및 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 Volumes 13, 14, 16, 19, 및 28; J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다. 또한, "헤테로사이클릴"은 헤테로사이클 라디칼이 포화, 부분 불포화 환, 또는 방향족 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환에 융합된 라디칼을 포함한다. 헤테로사이클릭 환의 예는 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 테트라하이드로피라닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티옥사닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H-피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로티에닐, 디하이드로푸라닐, 피라졸리디닐이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자바이사이클로[4.1.0]헵타닐, 아자바이사이클로[2.2.2]헥사닐, 3H-인돌릴 퀴놀리지닐 및 N-피리딜 우레아를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 스피로 모이어티가 상기 정의 내에 포함된다. 2개의 환 탄소 원자가 옥소 (=O) 모이어티로 치환된 헤테로사이클릭기의 예는 피리미디노닐 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐이다. 본원에서 헤테로사이클기는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환된다.
용어 "헤테로아릴"은 5원, 6원, 또는 7원 환의 일가 방향족 라디칼을 의미하고, 질소, 산소, 및 황 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는, 5 내지 20개 원자의 융합 환계 (이 중 적어도 하나는 방향족임)를 포함한다. 헤테로아릴기의 예는 피리디닐 (예를 들어, 2-하이드록시피리디닐 포함), 이미다졸릴, 이미다조피리디닐, 피리미디닐 (예를 들어, 4-하이드록시피리미디닐 포함), 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 푸리닐, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐, 및 푸로피리디닐이다. 헤테로아릴기는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환된다.
헤테로사이클 또는 헤테로아릴기는 가능한 경우에 탄소 (탄소-연결된), 또는 질소 (질소-연결된) 결합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 탄소 결합되는 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6, 푸란, 테트라하이드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5, 이속사졸, 피라졸, 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에 결합된다.
비제한적인 예로서, 질소 결합되는 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2, 모르폴린의 위치 4, 및 카르바졸, 또는 β-카르볼린의 위치 9에 결합된다.
"알킬렌"은 1 내지 18개 탄소 원자의 포화, 분지쇄 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하고, 모 알칸의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는 2개의 일가 라디칼 중심을 갖는다. 대표적인 알킬렌 라디칼은 메틸렌 (-CH2-), 1,2-에틸 (-CH2CH2-), 1,3-프로필 (-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸 (-CH2CH2CH2CH2-) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"C1-C10 알킬렌"은 화학식 -(CH2)1-10-의 직쇄, 포화 탄화수소기이다. C1-C10 알킬렌의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 데칼렌을 포함한다.
"알케닐렌"은 2 내지 18개 탄소 원자의 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하고, 모 알켄의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는 2개의 일가 라디칼 중심을 갖는다. 대표적인 알케닐렌 라디칼은 1,2-에틸렌 (-CH=CH-)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"알키닐렌"은 2-18개 탄소 원자의 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하고, 모 알킨의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는 2개의 일가 라디칼 중심을 갖는다. 대표적인 알키닐렌 라디칼은 아세틸렌 (-C≡C-), 프로파르길 (-CH2C≡C-), 및 4-펜티닐 (-CH2CH2CH2C≡C-)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"아릴렌"은 하기 구조로 제시되는 바와 같이 두개의 공유결합은 가지며 오르토, 메타, 또는 파라 입체형태로 존재할 수 있는 아릴 기이며, 여기서, 페닐 기는 비치환되거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택됨)을 포함하고 이로 제한되지 않는 4개 이하의 기로 치환될 수 있다:
Figure pct00002
"아릴알킬"은 탄소 원자 (통상적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자)에 결합한 수소 원자 중의 하나가 아릴 라디칼로 대체된 비환식 알킬 라디칼을 의미한다. 대표적인 아릴알킬기는 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아릴알킬기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하고, 예를 들어 알카닐, 알케닐 또는 알키닐기를 포함하는, 아릴알킬기의 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하고, 아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자를 포함한다.
"헤테로아릴알킬"은 탄소 원자, 통상적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합한 수소 원자 중의 하나가 헤테로아릴 라디칼로 대체된 비환식 알킬 라디칼을 의미한다. 통상적인 헤테로아릴알킬기는 2-벤즈이미다졸릴메틸, 2-푸릴에틸 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 헤테로아릴알킬기는 탄소 원자 6 내지 20개를 포함하며, 예를 들어, 알카닐, 알케닐 또는 알키닐기를 포함하는, 헤테로아릴알킬기의 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하고 헤테로아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로아릴알킬기의 헤테로아릴 모이어티는 3 내지 7개의 환 원을 갖는 모노사이클 (탄소 원자 2 내지 6개) 또는 7 내지 10개의 환 원을 갖는 바이사이클 (탄소 원자 4 내지 9개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개), 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "프로드럭"은 모 화합물 약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 적고 효소에 의해 활성화되거나 보다 활성의 모 형태로 전환될 수 있는, 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986); Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)] 참조). 본 발명의 프로드럭은 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 술페이트-함유 프로드럭, 펩티드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형 프로드럭, 당화 프로드럭, 베타-락탐-함유 프로드럭, 임의 치환된 페녹시아세타미드-함유 프로드럭, 임의 치환된 페닐아세타미드-함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 프로드럭을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기한 화학요법제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
"방사선 요법"은 통상적으로 기능할 능력을 제한하거나 세포를 완전히 파괴하도록 세포에 충분한 손상을 유도할 지시된 감마선 또는 베타선의 사용을 의미한다. 처리 용량 및 기간을 결정하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 많은 방법이 있을 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 전형적 처리는 1회 투여로 주어지며, 전형의 용량은 1일당 10 내지 200 단위 (Gray)의 범위이다.
"대사물질"은 특정 화합물 또는 이의 염의 신체 내의 대사를 통해 생성된 산물이다. 화합물의 대사물질은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 확인할 수 있고, 그 활성은 본원에서 설명되는 바와 같은 시험을 이용하여 결정할 수 있다. 상기 산물은, 예를 들어 투여된 화합물의 산화, 환원, 가수분해, 아미드화, 탈아미드화, 에스테르화, 탈에스테르화, 효소에 의한 절단 등에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 이의 대사 산물 생성에 충분한 시간 동안 포유동물과 접촉시키는 것을 포함하는 과정에 의해 생성된 화합물을 포함하는, 본 발명의 화합물의 대사물질을 포함한다.
"리포좀"은 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열에 유사한 2층 구조로 배열된다.
"링커"는 공유결합을 포함하는 화학적 모이어티 또는 항체를 약물 모이어티에 공유결합에 의해 부착시키는 원자의 쇄를 의미한다. 다양한 양태에서, 링커는 알킬디일, 아릴디일, 헤테로아릴디일과 같은 이가 라디칼, 알킬옥시의 반복 단위 -(CR2)nO(CR2)n- (예를 들어, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시), 및 알킬아미노 (예를 들어, 폴리에틸렌아미노, Jeffamine™))와 같은 모이어티; 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트, 및 카프로아미드를 포함하는 이산 에스테르 및 아미드를 포함한다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너에 겹쳐질 수 없는 특성을 갖는 분자를 의미하고, 용어 "아키랄"은 이의 거울상 파트너에 겹쳐질 수 있는 분자를 의미한다.
용어 "입체 이성질체"는 동일한 화학적 구성을 가지나, 공간의 원자 또는 기의 배열에서 상이한 화합물을 의미한다.
"부분 입체 이성질체"는 2 이상의 키랄 중심이 있고 이들 분자가 서로 거울상이 아닌 입체 이성질체를 의미한다. 부분 입체 이성질체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어, 융점, 비점, 스펙트럼 성질, 및 반응성을 갖는다. 부분 입체 이성질체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고 분해능 분석 과정 하에 분리될 수 있다.
"거울상 이성질체"는 서로 겹쳐질 수 없는 거울상인 2개의 입체 이성질체 화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 입체화학 정의 및 규약은 일반적으로 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw - Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; 및 Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc. New York]을 따른다. 많은 유기 화합물은 광학 활성 형태로 존재한다. 즉, 이들은 평면-편광의 평면을 회전하는 능력을 가진다. 광학 활성 화합물을 설명함에 있어서, 접두사 D 및 L, 또는 R 및 S는 이의 키랄 중심(들)에 대해 분자의 절대적 입체형태를 표시하기 위해 사용된다. 접두사 d 및 l 또는 (+) 및 (-)은 화합물에 의한 평면-평광 회전 표시를 나타내기 위해 사용되는데, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. 접두사 (+) 또는 d로 표시된 화합물은 우선성이다. 주어진 화학적 구조에서, 이 입체 이성질체는 이들이 서로 거울상이라는 것만 제외하고는 동일하다. 특정 입체 이성질체는 또한 거울상 이성질체로 불릴 수 있고, 이러한 이성질체의 혼합물은 종종 거울상 이성질체 혼합물로 불린다. 거울상 이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로 불리는데, 이들은 화학적 반응 또는 과정에 있어, 어떠한 입체선택성 또는 입체특이성도 존재하지 않은 경우가 있을 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 2개의 거울상 이성질체 종의 등몰 혼합물을 의미한다.
용어 "호변 이성질체" 또는 "호변 이성질체 형태"는 낮은 에너지 장벽을 통해 상호 전환될 수 있는 상이한 에너지의 구조 이성질체를 의미한다. 예를 들어, 양성자 호변 이성질체 (양성자성 (prototropic) 호변 이성질체로도 알려짐)는 양성자의 이동을 통한 상호전환, 예를 들어 케토-에놀 및 이민-엔아민 이성체화를 포함한다. 원자가 (valence) 호변 이성질체는 일부 결합 전자의 재구성에 의해 상호전환을 포함한다.
본원에서 사용되는 구문 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염을 의미한다. 예시적인 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트 "메실레이트", 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌-비스(2-하이드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염은 다른 분자, 예를 들어 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 카운터 이온의 도입을 수반할 수 있다. 카운터 이온은 모 화합물의 하전을 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 염은 이의 구조 내에 1 초과의 하전 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전 원자가 약제학적으로 허용되는 염의 일부인 경우에는 다수의 카운터 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전 원자 및/또는 하나 이상의 카운터 이온을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물이 염기이면, 목적하는 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에 이용가능한 임의의 적합한 방법, 예를 들어 유리 염기의 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 메탄술폰산, 인산 등, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 숙신산, 만델산, 푸마르산, 말론산, 피루브산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 피라노시드산, 예를 들어 글루쿠론산 또는 갈락투론산, 알파 하이드록시산, 예를 들어 시트르산 또는 타르타르산, 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산, 방향족 산, 예를 들어 벤조산 또는 신남산, 술폰산, 예를 들어 p-톨루엔술폰산 또는 에탄술폰산 등의 처리에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물이 산이면, 목적하는 약제학적으로 허용되는 염은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 유리 산의 무기 또는 유기 염기, 예를 들어 아민 (1차, 2차 또는 3차), 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 등의 처리에 의해 제조될 수 있다. 적합한 염의 예는 아미노산, 예를 들어 글리신 및 아르기닌, 암모니아, 1차, 2차 및 3차 아민, 및 사이클릭 아민, 예를 들어 피페리딘, 모르폴린 및 피페라진으로부터 유도된 유기 염, 및 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 알루미늄 및 리튬으로부터 유도된 무기 염을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
구문 "약제학적으로 허용되는"은 물질 또는 조성물이 제제를 구성하는 다른 성분, 및/또는 그로 치료되는 포유동물과 화학적으로 및/또는 독성학적으로 적합해야 함을 나타낸다.
"용매화물"은 하나 이상의 용매 분자와 본 발명의 화합물의 회합체 또는 복합체를 의미한다. 용매화물을 형성하는 용매의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산, 및 에탄올아민을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 용어 "수화물"은 용매 분자가 물인 복합체를 의미한다.
용어 "보호기"는 화합물 상의 다른 관능기와 반응하면서 특정 관능기를 차단 또는 보호하기 위해 통상적으로 사용되는 치환기를 의미한다. 예를 들어, "아미노-보호기"는 화합물 내의 아미노 관능기를 차단 또는 보호하는, 아미노기에 부착된 치환기이다. 적합한 아미노-보호기는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc)을 포함한다. 유사하게, "하이드록시-보호기"는 하이드록시 관능기를 차단 또는 보호하는, 하이드록시기의 치환기를 의미한다. 적합한 보호기는 아세틸 및 실릴을 포함한다. "카르복시-보호기"는 카르복시 관능기를 차단 또는 보호하는, 카르복시기의 치환기를 의미한다. 통상적인 카르복시-보호기는 페닐술포닐에틸, 시아노에틸, 2-(트리메틸실릴)에틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸, 2-(p-톨루엔술포닐)에틸, 2-(p-니트로페닐술페닐)에틸, 2-(디페닐포스피노)-에틸, 니트로에틸 등을 포함한다. 보호기 및 이의 용도에 대한 일반적인 설명에 대해서는, 문헌 [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991]을 참조한다.
"이탈기"는 또 다른 관능기에 의해 치환될 수 있는 관능기를 의미한다. 이러한 이탈기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 예는 할라이드 (예, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 메탄술포닐 (메실), p-톨루엔술포닐 (토실), 트리플루오로메틸술포닐 (트리플레이트), 및 트리플루오로메틸술포네이트를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
약어
링커 성분:
MC = 6-말레이미도카프로일
Val-Cit 또는 "vc" = 발린-시트룰린 (프로테아제 절단가능 링커 내의 예시적인 디펩티드)
시트룰린 = 2-아미노-5-우레이도 펜타노산
PAB = p-아미노벤질옥시카르보닐 ("자가 희생적 (self immolative)" 링커 성분의 예)
Me-Val-Cit = N-메틸-발린-시트룰린 (여기서, 링커 펩티드 결합은 카텝신 B에 의한 이의 절단을 방지하기 위해 변형됨)
MC(PEG)6-OH = 말레이미도카프로일-폴리에틸렌 글리콜 (항체 시스테인에 부착될 수 있음)
세포독성 약물:
MMAE = 모노-메틸 아우리스타틴 E (MW 718)
MMAF = 약물의 C-말단에 페닐알라닌이 존재하는 아우리스타틴 E (MMAE)의 변이체 (MW 731.5)
MMAF-DMAEA = DMAEA (디메틸아미노에틸아민)가 C-말단 페닐알라닌에 아미드 연결된 MMAF (MW 801.5)
MMAF-TEG = 테트라에틸렌 글리콜이 페닐알라닌에 에스테르화된 MMAF
MMAF-NtBu = MMAF의 C-말단에 아미드로서 부착된 N-t-부틸
DM1 = N(2')-데아세틸-N(2')-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신
DM3 = N(2')-데아세틸-N2-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신
DM4 = N(2')-데아세틸-N2-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-메이탄신
추가의 약어는 다음과 같다: AE는 아우리스타틴 E, Boc는 N-(t-부톡시카르보닐), cit는 시트룰린, dap는 돌라프로인, DCC는 1,3-디사이클로헥실카르보디이미드, DCM은 디클로로메탄, DEA는 디에틸아민, DEAD는 디에틸아조디카르복실레이트, DEPC는 디에틸포스포릴시아니데이트, DIAD는 디이소프로필아조디카르복실레이트, DIEA는 N,N-디이소프로필에틸아민, dil는 돌라이소류신, DMA는 디메틸아세트아미드, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘, DME는 에틸렌글리콜 디메틸 에테르 (또는 1,2-디메톡시에탄), DMF는 N,N-디메틸포름아미드, DMSO는 디메틸술폭사이드, doe는 돌라페닌, dov는 N,N-디메틸발린, DTNB는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), DTPA는 디에틸렌트리아민펜타아세트산, DTT는 디티오트레이톨, EDCI는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염, EEDQ는 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로퀴놀린, ES-MS는 전자 분사 질량분석법, EtOAc는 에틸 아세테이트, Fmoc는 N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐), gly는 글리신, HATU는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, HOBt는 1-하이드록시벤조트리아졸, HPLC는 고압 액체 크로마토그래피, ile는 이소류신, lys는 리신, MeCN(CH3CN)는 아세토니트릴, MeOH는 메탄올, Mtr는 4-아니실디페닐메틸 (또는 4-메톡시트리틸), nor는 (1S,2R)-(+)-노르에페드린, PBS는 포스페이트 완충 식염수 (pH 7.4), PEG는 폴리에틸렌 글리콜, Ph는 페닐, Pnp는 p-니트로페닐, MC는 6-말레이미드카프로일, phe는 L-페닐알라닌, PyBrop는 브로모 트리스-피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트, SEC는 크기 배제 크로마토그래피, Su는 숙신이미드, TFA는 트리플루오로아세트산, TLC는 박막 크로마토그래피, UV는 자외선, 및 val는 발린이다.
"유리 시스테인 아미노산"은 모 항체 내로 조작되고, 티올 관능기 (-SH)를 갖고, 분자내 또는 분자간 디술피드 브릿지로서 페어링되지 않는 시스테인 아미노산 잔기를 의미한다.
용어 "티올 반응성 값"은 유리 시스테인 아미노산의 반응성에 대한 정량적 특성이다. 티올 반응성 값은 티올-반응성 시약과 반응하는, 시스테인 조작된 항체 내의 유리 시스테인 아미노산의 비율이고, 최대 1의 값으로 전환된다. 예를 들어, 100％ 수율로 티올-반응성 시약, 예를 들어 바이오틴-말레이미드 시약과 반응하여 바이오틴-표지된 항체를 형성하는, 시스테인 조작된 항체 상의 유리 시스테인 아미노산의 티올 반응성 값은 1.0이다. 80％ 수율로 티올-반응성 시약과 반응하는, 동일한 또는 상이한 모 항체 내로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산의 티올 반응성 값은 0.8이다. 티올-반응성 시약과 전혀 반응하지 못하는, 동일한 또는 상이한 모 항체 내로 조작된 다른 시스테인 아미노산의 티올 반응성 값은 0이다. 특정 시스테인의 티올 반응성 값 결정은 ELISA 분석, 질량 분광분석, 액체 크로마토그래피, 자가방사선촬영, 또는 다른 정량 분석 시험에 의해 수행할 수 있다.
"모 항체"는 그로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 하나 이상의 시스테인 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 모 항체는 천연 또는 야생형 서열을 포함할 수 있다. 모 항체는 다른 천연, 야생형, 또는 변형된 형태의 항체에 비해 기존의 아미노산 서열 변형 (예를 들어 부가, 결실 및/또는 치환)을 가질 수 있다. 모 항체는 관심 표적 항원, 예를 들어 생물학상 중요한 폴리펩티드에 대해 지시될 수 있다. 또한, 비폴리펩티드 항원 (예를 들어, 종양-관련 당지질 항원; US 5091178 참조)에 대해 작용하는 항체도 고려된다.
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III. 본 발명의 조성물 및 방법
본 발명은 항-FcRH5 항체 또는 이의 기능성 단편, 및 조혈성 종양의 치료에서 이의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기하거나 아래에서 설명되는 임의의 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체 또는 이의 각각의 항원 에피토프에 대한 항-FcRH5 폴리펩티드 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체이다. 본 발명의 항체는 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 독소, 예를 들어, 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 돌로스타틴 유도체 또는 칼리케아미신, 항생제, 방사성 동위원소, 핵산분해 효소 등에 임의로 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있고, 바람직하게는 항체가 결합하는 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 검출 목적을 위해, 본 발명의 항체는 검출가능하게 표지되거나 고체 지지체 등에 부착되거나 할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 항체의 일가 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 Fab 단편으로서 항체의 친화도)가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어지거나, 이 서열로 본질적으로 구성되는 뮤린 항체 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 뮤린 항체의 친화도) 또는 키메라 항체 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 키메라 항체의 친화도)의 일가 친화도와 실질적으로 동일한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 항체의 일가 친화도 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 항체의 친화도)가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 제시된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어지거나, 이 서열로 본질적으로 구성되는 뮤린 항체 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 뮤린 항체의 친화도) 또는 키메라 항체 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 키메라 항체의 친화도)의 일가 친화도 보다 더 낮은, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60배 더 낮은 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 항체의 일가 친화도 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 항체의 친화도)가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 제시된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어지거나, 이 서열로 본질적으로 구성되는 뮤린 항체 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 뮤린 항체의 친화도) 또는 키메라 항체 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 키메라 항체의 친화도)의 일가 친화도보다 더 큰, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 더 큰 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 제시된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어지거나, 이 서열로 본질적으로 구성되는, 이의 이가 형태에서 뮤린 항체 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도) 또는 키메라 항체 (예를 들어, Fab 단편으로서 FcRH5에 대한 키메라 항체의 친화도)의 친화도와 실질적으로 동일한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 제시된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어지거나, 이 서열로 본질적으로 구성되는, 이의 이가 형태에서 뮤린 항체 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도) 또는 키메라 항체 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG 단편으로서 키메라 항체의 친화도)의 친화도보다 더 낮은, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60배 더 낮은 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 제시된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어지거나, 이 서열로 본질적으로 구성되는, 이의 이가 형태에서 뮤린 항체 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도) 또는 키메라 항체 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG 단편으로서 키메라 항체의 친화도)의 친화도보다 더 큰, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 더 큰 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.4 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.4 nM +/- 0.04인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.3 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.32 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.36 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.4 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.44 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.48 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.5 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.3 nM 내지 0.5 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.32 nM 내지 0.48 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.36 nM 내지 0.44 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.2 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.2 nM +/- 0.02인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.1 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.12 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.14 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.16 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.18 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.2 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.22 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.24 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.26 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.28 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.30 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.1 nM 내지 0.3 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.12 nM 내지 0.28 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.14 nM 내지 0.26 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.16 nM 내지 0.24 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.18 nM 내지 0.22 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.5 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.5 nM +/- 0.1인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.4 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.5 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.6 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.7 nM 또는 이보다 우수한 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.3 nM 내지 0.7 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.4 nM 내지 0.6 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, FcRH5에 대한 IgG로서 항체의 친화도)가 0.5 nM 내지 0.55 nM인 인간화 항-FcRH5 항체를 제공한다.
한 측면에서, FcRH5에 대한 뮤린 항체의 일가 친화도는 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)의 가변 도메인 서열을 포함하는 Fab 단편의 결합 친화도와 실질적으로 동일하다.
당업계에 잘 확립된 바와 같이, 리간드의 이의 수용체에 대한 결합 친화도는 임의의 다양한 분석을 사용하여 결정할 수 있고, 다양한 정량적 값으로 표현될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 결합 친화도는 Kd 값으로 표현되고, (예를 들어, 최소 결합력 (avidity) 효과를 갖는) 고유한 결합 친화도를 반영한다. 일반적으로 및 바람직하게는, 결합 친화도는 세포 부재 또는 세포-연관 환경에서 시험관내에서 측정된다. 본원에 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 결합 친화도의 배수 차이는 인간화 항체 (예를 들어, Fab 형태로)의 일가 결합 친화도 값 및 참조/비교 항체 (예를 들어, Fab 형태로) (예를 들어, 공여체 초가변 영역 서열을 갖는 뮤린 항체)의 일가 결합 친화도 값의 비로서 정량될 수 있고, 여기서 결합 친화도 값은 유사한 분석 조건 하에 결정된다. 따라서, 한 양태에서, 결합 친화도의 배수 차이는 Fab 형태의 인간화 항체 및 상기 참조/비교 Fab 항체의 Kd 값의 비로서 결정된다. 예를 들어, 한 양태에서, 본 발명의 항체 (A)가 참조 항체 (M)의 친화도보다 "3배 더 낮은" 친화도를 가지면, A에 대한 Kd 값이 3x인 경우에, M의 Kd 값은 1x이고, A의 Kd 대 M의 Kd의 비는 3:1일 것이다. 이와 반대로, 한 양태에서, 본 발명의 항체 (C)가 참조 항체 (R)의 친화도보다 "3배 더 큰" 친화도를 가지면, C에 대한 Kd 값이 1x인 경우에, R에 대한 Kd 값은 3x이고, C의 Kd 대 R의 Kd의 비는 1:3일 것이다. 본원에서 설명되는 것을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 많은 분석, 예를 들어 비아코어, 방사면역분석법 (RIA) 및 ELISA를 사용하여 결합 친화도 측정을 수행할 수 있다.
한 측면에서,
(a) (i) 서열 KASQDVSTAVA (서열 번호 26)를 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열 SASYRYT (서열 번호 27)를 포함하는 HVR-L2,
(iii) 서열 QQHFSSPRT (서열 번호 28)를 포함하는 HVR-L3,
(iv) 서열 GFTFSSYAVS (서열 번호 35)를 포함하는 HVR-H1,
(v) 서열 ATISSGGSLTFYLDSVR (서열 번호 36)를 포함하는 HVR-H2, 및
(vi) 서열 PIPDYYALDY (서열 번호 37)를 포함하는 HVR-H3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는, FcRH5에 결합하는 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L1은 서열 번호 26의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L2는 서열 번호 27의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L3은 서열 번호 28의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H1은 서열 번호 35의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H2는 서열 번호 36의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H3은 서열 번호 37의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 이들 서열을 (본원에서 설명되는 바와 같이 조합하여) 포함하는 본 발명의 항체는 인간화 또는 인간 항체이다.
한 측면에서,
(a) (i) 서열 KASQDVSTAVA (서열 번호 26)를 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열 SASYRYT (서열 번호 27)를 포함하는 HVR-L2,
(iii) 서열 QQHFSSPRT (서열 번호 28)를 포함하는 HVR-L3,
(iv) 서열 GFTFSSYAVS (서열 번호 35)를 포함하는 HVR-H1,
(v) 서열 ATISSGGSLTFYLDSVR (서열 번호 36)를 포함하는 HVR-H2, 및
(vi) 서열 PIPDYYALDY (서열 번호 37)를 포함하는 HVR-H3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR; 및
(b) 서열 번호 26, 27, 28, 35, 36 또는 37에 도시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 적어도 하나의 변이체 HVR을 포함하는, FcRH5에 결합하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L1은 서열 번호 26의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L2는 서열 번호 27의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L3은 서열 번호 28의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H1은 서열 번호 35의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H2는 서열 번호 36의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H3은 서열 번호 37의 서열을 포함한다. 한 양태에서, 이들 서열을 (본원에서 설명되는 바와 같이 조합하여) 포함하는 본 발명의 항체는 인간화 또는 인간 항체이다.
한 측면에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항체를 제공하고, 여기서 각각의 HVR은 서열 번호 26, 27, 28, 35, 36 또는 37로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어지거나, 이 서열로 본질적으로 구성되고, 서열 번호 26은 HVR-L1에 대응하고, 서열 번호 27은 HVR-L2에 대응하고, 서열 번호 28은 HVR-L3에 대응하고, 서열 번호 35는 HVR-H1에 대응하고, 서열 번호 36은 HVR-H2에 대응하고, 서열 번호 37은 HVR-H3에 대응한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이들은 각각 순서대로 서열 번호 26, 27, 28, 35, 36 및 37을 포함한다.
본 발명의 항체에서 변이체 HVR은 HVR 내에 있는 하나 이상의 잔기에 대해 변형을 가질 수 있다.
숙주 피험체에서 사용하기 위한 치료제는 바람직하게는 상기 피험체에서 치료제에 대한 면역 반응을 거의 또는 전혀 유발하지 않는다. 한 양태에서, 본 발명은 이와 같은 치료제를 제공한다. 예를 들어, 한 양태에서, 본 발명은 숙주 피험체에서 서열 번호 18 & 20의 서열을 포함하는 항체에 비해 실질적으로 감소된 수준으로 인간 항-생쥐 항체 반응 (HAMA)을 유발하고/하거나 유발할 것으로 예상되는 인간화 항체를 제공한다. 다른 예에서, 본 발명은 인간 항-생쥐 항체 반응 (HAMA)을 최소로 유발하거나 전혀 유발하지 않거나, 또는 상기 반응을 최소로 유발하거나 전혀 유발하지 않을 것으로 예상되는 인간화 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명의 항체는 항-생쥐 항체 반응을 임상적으로 허용되는 수준으로 또는 상기 수준보다 적은 수준으로 유발한다.
본 발명의 인간화 항체는 이의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인에 하나 이상의 인간 및/또는 인간 컨센서스 비-초가변 영역 (예를 들어, 프레임워크) 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 추가의 변형은 인간 및/또는 인간 컨센서스 비-초가변 영역 서열 내에 존재한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 도메인은 한 양태에서 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열인 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 아미노산 위치에서 변형된 변이체 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체의 경쇄 가변 도메인은 한 양태에서 κI 컨센서스 프레임워크 서열인 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 아미노산 위치에서 변형된 변이체 κI 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다.
당업계에 공지되어 있고, 본원에서 아래에 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 묘사하는 아미노산 위치/경계는 전후 관계 및 당업계에 공지된 다양한 정의 (아래 설명된 바와 같은)에 따라 상이할 수 있다. 가변 도메인 내의 일부 위치는, 이들 위치가 한 기준 세트 하에서는 초가변 영역 내에 위치할 수 있지만 다른 기준 세트 하에서는 초가변 영역 외부에 존재하는 것으로 볼 수 있기 때문에, 혼성 초가변 위치로서 간주될 수 있다. 또한, 하나 이상의 상기 위치는 연장된 초가변 영역 (아래에서 추가로 설명되는 바와 같은)에서 볼 수 있다. 본 발명은 상기 혼성 초가변 위치에 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 상기 초가변 위치는 중쇄 가변 도메인 내에 하나 이상의 위치 26 내지 30, 33 내지 35B, 47 내지 49, 57 내지 65, 93, 94 및 101 내지 102를 포함한다. 한 양태에서, 상기 혼성 초가변 위치는 경쇄 가변 도메인 내에 하나 이상의 위치 24 내지 29, 35 내지 36, 46 내지 49, 56 및 97을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 혼성 초가변 위치에서 변형된 인간 변이체 인간 하위군 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 위치 26 내지 30, 33 내지 35, 48 내지 49, 58, 60 내지 63, 93 및 101 중의 하나 이상의 위치에서 변형된 변이체 인간 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 위치 24, 27 내지 29, 56 및 97 중의 하나 이상의 위치에서 변형된 변이체 인간 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 위치 26 내지 30, 33 내지 35, 48 내지 49, 58, 60 내지 63, 93 및 101 중의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 또는 전부에서 변형된 변이체 인간 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 위치 24, 27 내지 29, 56 및 97 중의 1, 2, 3, 4, 5개 또는 전부에서 변형된 변이체 인간 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 항체는 항체가 목적하는 생물학적 특징 (예를 들어, 목적하는 결합 친화도)을 보인다면 임의의 적합한 인간 또는 인간 컨센서스 경쇄 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 인간 κ 경쇄의 프레임워크 서열의 적어도 일부 (또는 전부)를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 인간 κ 하위군 I 프레임워크 컨센서스 서열의 적어도 일부 (또는 전부)를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 도 9 내지 11에 제시된 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 세포독성제에 접합된 인간화 항-FcRH5 항체이다. 한 측면에서, 세포독성제에 접합된 인간화 항-FcRH5 항체는 이종이식편에서 종양 진행을 억제한다.
한 측면에서, 인간화 항체 및 키메라 항체는 둘 모두 일가이다. 한 양태에서, 인간화 및 키메라 항체는 둘 모두 Fc 영역에 연결된 단일 Fab을 포함한다. 한 양태에서, 참조 키메라 항체는 인간 Fc 영역에 연결된 도 2 (서열 번호 11) 및 도 4 (서열 번호 13)에 제시된 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 양태에서, 인간 Fc 영역은 IgG (예를 들어, IgG1, 2, 3 또는 4)의 해당 영역이다.
한 측면에서, 본 발명은 도 9 내지 11에 제시된 HVR1-HC, HVR2-HC 및/또는 HVR3-HC 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 가변 도메인은 도 9 내지 11에 제시된 FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC 및/또는 FR4-HC 서열을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 도 11에 제시된 CH1 및/또는 Fc 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 HVR1-HC, HVR2-HC 및/또는 HVR3-HC 서열 (도 10 및 11), 및 FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC 및/또는 FR4-HC 서열 (도 10 및 11)을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 HVR1-HC, HVR2-HC 및/또는 HVR3-HC 서열 (도 10 및 11)을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 도 11에 제시된 CH1 및/또는 Fc 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 HVR1-HC, HVR2-HC 및/또는 HVR3-HC 서열 (도 10 및 11), 및 FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC 및/또는 FR4-HC 서열 (도 10 및 11)을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 CH1 및/또는 Fc (도 11)을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 도 9 및 11에 제시된 HVR1-LC, HVR2-LC 및/또는 HVR3-LC 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 가변 도메인은 도 9 및 11에 제시된 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 및/또는 FR4-LC 서열을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 도 11에 제시된 CL1 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 도 9 및 11에 제시된 HVR1-LC, HVR2-LC 및/또는 HVR3-LC 서열, 및 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 및/또는 FR4-LC 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 도 9 및 11에 제시된 HVR1-LC, HVR2-LC 및/또는 HVR3-LC 서열, 및 CL1 서열을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 도 9 및 11에 제시된 HVR1-LC, HVR2-LC 및/또는 HVR3-LC 서열, 및 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 및/또는 FR4-LC 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 도 11에 제시된 CL1 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 모 항체의 하나 이상의 아미노산이 WO2006/034488; US 2007/0092940 (그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 유리 시스테인 아미노산으로 교체된 시스테인 조작된 항체를 포함한다. 임의의 형태의 항-FcRH5 항체가 이와 같이 조작, 즉 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 모 Fab 항체 단편은 조작되어 시스테인 조작된 Fab (본원에서 "ThioFab"로서 칭함)를 형성할 수 있다. 유사하게, 모 모노클로날 항체는 조작되어 "ThioMab"을 형성할 수 있다. 단일 부위 돌연변이는 ThioFab에서 단일 조작된 시스테인 잔기를 생성시키는 반면, IgG 항체의 이량체 성질 때문에 단일 부위 돌연변이는 ThioMab에서 2개의 조작된 시스테인 잔기를 생성한다는 것을 알아야 한다. 본 발명의 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 세포-결합된 FcRH5 폴리펩티드에 우선적으로 결합하는 모노클로날 항체, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체, 및 항체의 항원-결합 단편, 융합 폴리펩티드 및 유사체를 포함한다. 시스테인 조작된 항체는 달리 반드시 모 항체를 변경시키지는 않으면서 항체의 서열 설계 및/또는 선택에 의해, 예를 들어 파지 디스플레이 항체 설계 및 선택에 의해 또는 경쇄 및/또는 중쇄 프레임워크 서열 및 불변 영역의 드 노보 (de novo) 설계를 통해, 항체 또는 Fab 내의 본원에서 개시된 위치에 시스테인을 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 시스테인 조작된 항체는 티올 반응성 값이 0.6 내지 1.0; 0.7 내지 1.0 또는 0.8 내지 1.0인 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산을 포함한다. 유리 시스테인 아미노산은 모 항체 내로 조작되고 디술피드 브릿지의 일부가 아닌 시스테인 잔기이다. 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 말레이미드 또는 할로아세틸을 통해 세포독성 및/또는 영상화 화합물을 조작된 시스테인의 부위에 부착시킬 때 유용하다. 말레이미드기에 대한 Cys 잔기의 티올 관능기의 친핵 반응성은 단백질 내의 임의의 다른 아미노산, 예를 들어 리신 잔기의 아미노기 또는 N-말단 아미노기에 비해 약 1000배 더 크다. 요오도아세틸 및 말레이미드 시약의 티올 특이적 관능성은 아민기와 반응할 수 있지만, 보다 높은 pH (>9.0) 및 보다 긴 반응 시간이 필요하다 [Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London].
한 측면에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 적합한 위치에서 조작된 시스테인을 포함하고, 여기서 위치는 경쇄의 경우에 카바트 등에 따라 넘버링되고 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD], 중쇄 (Fc 영역 포함)의 경우에는 EU 넘버링에 따라 넘버링된다 [Kabat et al. (1991), 상기 참조].
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산을 포함하는 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체를 포함하고, 여기서 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 FcRH5 폴리펩티드에 결합하고, 본원에 기술된 하나 이상의 HVR 서열을 포함하는 모 항-FcRH5 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 교체하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 전장 아미노산 서열을 갖는 시스테인 조작된 항체 또는 본원에 개시된 신호 펩티드가 결여된 시스테인 조작된 항체 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성, 달리 적어도 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 전장 아미노산 서열을 갖는 시스테인 조작된 항체, (b) 본원에 개시된 신호 펩티드가 결여된 시스테인 조작된 항체 아미노산 서열, (c) 본원에 개시된, 신호 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 막횡단 시스테인 조작된 항체 단백질의 세포외 도메인, (d) 본원에 개시된 임의의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 또는 (e) 본원에 개시된 전장 시스테인 조작된 항체 아미노산 서열의 임의의 다른 구체적으로 규정된 단편을 코딩하는 DNA 분자의 상보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, N-말단 신호 서열이 존재하지 않고/않거나 개시 메티오닌이 존재하지 않는, 단리된 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체를 제공한다. 상기 항체를 제조하는 방법을 또한 본원에 기재하고, 여기서 상기 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 시스테인 조작된 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 세포 배양물로부터 시스테인 조작된 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 막횡단 도메인이 결실되거나 또는 막횡단 도메인이 불활성화된 단리된 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체를 제공한다. 상기 항체를 제조하기 위한 방법도 본원에 기재하고, 여기서 상기 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 시스테인 조작된 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 세포 배양물로부터 시스테인 조작된 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 이종 (비-FcRH5) 폴리펩티드에 융합된, 본원에 기재된 임의의 시스테인 조작된 항체를 포함하는 단리된 항-FcRH5 키메라 시스테인 조작된 항체를 제공한다. 상기 키메라 분자의 예는 이종 폴리펩티드, 예를 들어, 면역글로불린의 에피토프 택 서열 또는 Fc 영역에 융합된, 본원에 기재된 임의의 시스테인 조작된 항체를 포함한다.
시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체 또는 이의 각각의 항원 에피토프에 대한 항-FcRH5 폴리펩티드 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 독소, 예를 들어, 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 돌로스타틴 유도체 또는 칼리케아미신, 항생제, 방사성 동위원소, 핵산분해 효소 등에 임의로 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있고, 바람직하게는 항체가 결합하는 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 진단 목적을 위해, 본 발명의 항체는 검출가능하게 표지되거나 고체 지지체에 부착되거나 할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항-FcRH5 항체 및 항-FcRH5 시스테인 조작된 항체를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 임의의 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 예로서, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이 세포, 또는 효모 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법을 추가로 제공하고, 이는 숙주 세포를 관심 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 세포 배양물로부터 관심 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
시스테인 조작된 항체는 암 치료에 유용할 수 있고, 세포 표면 및 막횡단 수용체, 및 종양 관련 항원 (TAA)에 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 (약물 또는 표지 모이어티에 접합되지 않은) 네이키드 항체로서 또는 항체-약물 접합체 (ADC)로서 사용될 수 있다. 본 발명의 시스테인 조작된 항체는 티올-반응성 시약과 부위-특이적으로 및 효율적으로 커플링될 수 있다. 티올-반응성 시약은 다관능성 링커 시약, 포획 표지 시약, 형광단 시약, 또는 약물-링커 중간체일 수 있다. 시스테인 조작된 항체는 검출가능한 표지로 표지되고, 고상 지지체에 고정되고/되거나 약물 모이어티와 접합될 수 있다. 티올 반응성은 반응성 시스테인 아미노산으로의 아미노산 치환이 L10 내지 L20, L105 내지 L115, L109 내지 L119, L116 내지 L126, L122 내지 L132, L163 내지 L173, L200 내지 L210의 아미노산 범위로부터 선택된 경쇄의 범위 내에서; H1 내지 H10, H18 내지 H28, H79 내지 H89, H107 내지 H117, H109 내지 H119, H111 내지 H121의 아미노산 범위로부터 선택된 중쇄의 범위 내에서; 및 H270 내지 H280, H366 내지 H376, H391 내지 401에서 선택된 범위 내의 Fc 영역에서 이루어질 수 있는 임의의 항체로 일반화될 수 있고, 여기서 아미노산 위치의 넘버링은 카바트 넘버링 시스템 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]의 위치 1에서 시작되고, 이후에 WO2006034488; US 2007/0092940에 개시된 바와 같이 순차적으로 계속된다. 또한, 티올 반응성은 항체의 특정 도메인, 예를 들어 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인인 CH1, CH2 및 CH3으로 일반화될 수도 있다. 0.6 이상의 티올 반응성 값을 유도하는 시스테인 교체는 온전한 항체인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM (IgG 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2 포함) 각각의 중쇄 불변 도메인 α, δ, ε, γ 및 μ에서 만들어질 수 있다. 상기 항체 및 이의 용도는 WO2006/034488; US 2007/0092940에 개시되어 있다.
본 발명의 시스테인 조작된 항체는 바람직하게는 이의 야생형 모 항체 대응물의 항원 결합 능력을 보유한다. 따라서, 시스테인 조작된 항체는 바람직하게는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항원은, 예를 들어 종양 관련 항원 (TAA), 세포 표면 수용체 단백질 및 다른 세포 표면 분자, 막횡단 단백질, 신호전달 단백질, 세포 생존 조절 인자, 세포 증식 조절 인자, 조직 발달 또는 분화와 연관된 분자 (예를 들어, 조직 발달 또는 분화에 기능적으로 기여하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 분자), 림포킨, 사이토킨, 세포 주기 조절에 관여하는 분자, 혈관형성에 관여하는 분자 및 혈관신생에 관여하는 분자 (예를 들어, 혈관신생에 기능적으로 기여하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 분자)를 포함한다. 종양 관련 항원은 클러스터 (cluster) 분화 인자 (즉, FcRH5를 포함하고 이로 제한되지 않는 CD 단백질)일 수 있다. 본 발명의 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 이의 모 항-FcRH5 항체 대응물의 항원 결합 능력을 보유한다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 B 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는 세포의 표면 상에 FcRH5 항원이 발현될 때를 포함하여 FcRH5 항원, 예를 들어 인간 항-FcRH5 이소형 베타 및/또는 알파에 특이적으로 결합할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 반응성 모이어티, 활성화된 모이어티, 또는 반응성 시스테인 티올기를 통해 항체에 공유결합에 의해 부착될 수 있는 임의의 표지 모이어티에 접합될 수 있다 [Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL]. 부착된 표지는 리간드 친화도, 항체/항원 결합, 또는 이온 복합체 형성을 조정하기 위해 (i) 검출가능한 신호를 제공하거나, (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출가능한 신호를 변형시켜, 예를 들어 FRET (형광 공명 에너지 전달)를 생성시키거나; (iii) 항원 또는 리간드와의 상호작용을 안정화하거나 이들과의 결합친화도를 증가시키거나, (iv) 하전, 소수성, 형태 또는 다른 물리적 파라미터에 의해 이동성, 예를 들어 전기영동 이동성, 또는 세포-투과도에 영향을 주거나, 또는 (v) 포획 모이어티를 제공하는 기능을 할 수 있다.
표지된 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 특정 세포, 조직, 또는 혈청에서 관심 항원의 발현을 검출하기 위한 진단 분석에서 유용할 수 있다. 진단 적용을 위해, 항체는 일반적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 일반적으로, 하기 범주로 분류될 수 있는 수많은 표지를 이용할 수 있다:
방사성 동위원소 (방사선 핵종), 예를 들어 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At 또는 213Bi. 방사성 동위원소 표지된 항체는 수용체 표적화된 영상화 실험에 유용하다. 항체는 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사성 동위원소 금속에 결합하거나 킬레이팅되거나 또는 다른 방식으로 복합체를 형성하며 항체의 조작된 시스테인 티올과 반응성인 리간드 시약으로 표지될 수 있다. 금속 이온과 착물을 형성할 수 있는 킬레이팅 리간드로는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA (Macrocyclics, Dallas, TX) 등이 있다. 방사선 핵종은 본 발명의 항체-약물 접합체와의 복합체 형성을 통해 표적화될 수 있다 [Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146].
링커 시약, 예를 들어 DOTA-말레이미드 (4-말레이미도부티르아미도벤질-DOTA)는 문헌 [Axworthy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807]의 절차에 따라 아미노벤질-DOTA를 이소프로필클로로포르메이트 (Aldrich)로 활성화시킨 4-말레이미도부티르산 (Fluka)과 반응시켜 제조할 수 있다. DOTA-말레이미드 시약은 시스테인 조작된 항체의 유리 시스테인 아미노산과 반응하여 항체 상에 금속 착물 형성 리간드를 제공한다 [Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86]. 킬레이팅 링커 표지 시약, 예를 들어 DOTA-NHS (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노(N-하이드록시숙신이미드 에스테르)는 시판되고 있다 (Macrocyclics, Dallas, TX). 방사선 핵종 표지된 항체를 사용한 수용체 표적 영상화는 종양 조직 중 항체의 점진적인 축적을 검출 및 정량함으로써 경로 활성화의 마커를 제공할 수 있다 [Albert et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210]. 접합된 방사성 금속은 라이소좀 분해 후 세포 내에 남아있을 수 있다.
영상화 실험을 위한 항체 표지로서 적합한 금속-킬레이트 복합체가 다음 문헌에 개시되어 있다: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich et al. (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al. (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al. (1990) J. Cancer 1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al. (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al. (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al. (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al. (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al. (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al. (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al. (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al. (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al. (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인 등을 비롯한 플루오레세인 유형, TAMRA 등을 비롯한 로다민 유형; 단실; 리사민 (Lissamine); 시아닌; 피코에리트린; 텍사스 레드 (Texas Red) 및 이들의 유사체. 형광 표지는, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 참조]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) 및 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL)에서 시판하는 것을 포함한다.
다양한 효소-기질 표지가 이용가능하거나 문헌에 개시되어 있다 [US 4275149]. 효소는 일반적으로 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질에서 색상 변화를 촉매할 수 있고, 이것은 분광광도 분석으로 측정할 수 있다. 달리, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광 변화를 정량하는 기술은 상기한 바와 같다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 이후에는 (예를 들어, 화학발광 측정기를 사용하여) 측정될 수 있는 광을 방출하거나 형광 수용자에게 에너지를 제공할 수 있다. 효소 표지의 예로는 루시퍼라제 (예, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; US 4737456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 있다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al. (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed J. Langone ＆ H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어 다음을 포함한다:
(i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 염산염 (TMB))를 산화시킴),
(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트, 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제.
당업자는 많은 다른 효소-기질 조합을 이용할 수 있다. 일반적인 검토를 위해서 US 4275149 및 US 4318980을 참조한다.
표지는 아미노산 측쇄, 활성화된 아미노산 측쇄, 시스테인 조작된 항체 등과간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체를 바이오틴과 접합시키고, 상기 언급한 표지의 3가지 광범위한 범주 중 임의의 표지가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합될 수도 있고, 또는 그 반대로 접합될 수도 있다. 바이오틴은 스트렙타비딘에 선택적으로 결합하기 때문에, 표지는 이와 같은 간접적인 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 달리, 표지를 폴리펩티드 변이체와 간접적으로 접합시키기 위해서, 폴리펩티드 변이체는 작은 합텐 (예, 디곡신)과 접합시키고 상기 언급한 여러 유형의 표지 중 하나를 항-합텐 폴리펩티드 변이체 (예, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 따라서, 표지를 폴리펩티드 변이체와 간접적으로 접합시킬 수 있다 [Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego].
본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어 ELISA, 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석 등에 사용될 수 있다 [Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.].
검출 표지는 결합 또는 인식 사건을 국소화하고 가시화하며 정량하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 표지된 항체는 세포-표면 수용체를 검출할 수 있다. 검출가능하게 표지된 항체의 또 다른 용도는 비드를 형광 표지된 항체와 접합시키고, 리간드의 결합시에 형광 신호를 검출하는 것을 포함하는 비드-기초 면역포획 (immunocapture) 방법이다. 유사한 결합 검출 방법은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 효과를 이용하여 항체-항원 상호작용을 측정하고 검출한다.
검출 표지, 예를 들어 형광 염료 및 화학발광 염료 [Briggs et al. (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058]는 검출가능한 신호를 제공하고, 일반적으로, 바람직하게는 다음 특성과 함께 항체를 표지하는데 적용가능하다: (i) 표지된 항체는 낮은 배경으로 매우 높은 신호를 생성하여 소량의 항체가 세포-비함유 분석 및 세포-기초 분석 둘 모두에서 민감하게 검출될 수 있도록 해야 하고, (ii) 표지된 항체는 광안정성이어서 형광 신호가 유의한 광표백 (photo bleaching) 없이 관찰되고 모니터링되며 기록될 수 있어야 한다. 표지된 항체를, 특히 살아있는 세포의 막 또는 세포 표면에 결합시키는 것을 포함하는 적용을 위해, 상기 표지는 (iii) 효과적인 접합체 농도 및 검출 감수성 달성하도록 양호한 수용성을 보유하고, (iv) 세포의 정상적인 대사 과정을 파괴하거나 조기 세포 사멸을 초래하지 않도록 살아있는 세포에 무독성인 것이 바람직하다.
세포 형광 강도의 직접 정량화 및 형광 표지 사건의 확인, 예를 들어 펩티드-염료 접합체의 세포 표면 결합은 살아있는 세포 또는 비드와의 혼합/해독 (mix-and-read), 비-방사성 분석을 자동화한 시스템 (FMAT® 8100 HTS 시스템, Applied Biosystems, Foster City, Calif.))에서 수행될 수 있다 [Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204]. 표지된 항체의 용도에는, 세포 표면 수용체 결합 분석, 면역포획 분석, 형광 연결된 면역흡착 분석 (FLISA), 카스파제-절단 [Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907], 세포자멸 [Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51] 및 세포독성 분석도 포함된다. 형광 마이크로부피 분석 기술은, 세포 표면에 표적화된 분자에 의한 상향 또는 하향 조절을 확인하는데 이용될 수 있다 [Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51].
본 발명의 표지된 항체는 생체의학적 영상화와 분자 영상화의 다양한 방법 및 기술, 예를 들어 (i) MRI (자기 공명 영상화), (ii) MicroCT (컴퓨터 단층촬영), (iii) SPECT (단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영), (iv) PET (양전자 방출 단층촬영) [Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49], (v) 생체발광, (vi) 형광, 및 (vii) 초음파에 의한 영상화 바이오마커 및 프로브로서 유용하다. 면역섬광조영술 (immunoscintigraphy)은 방사성 물질로 표지된 항체를 동물 또는 인간 환자에게 투여하고 항체가 위치하는 신체 부위의 사진을 찍는 영상화 절차이다 [US 6528624]. 영상화 바이오마커는 객관적으로 측정되어 정상적인 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료 개입에 대한 약리학적 반응의 지시자로서 평가될 수 있다. 생물 마커는 여러가지 유형일 수 있다: 제0형은 질환의 천연 병력 마커이며, 공지된 임상 지표, 예를 들어 류마티스성 관절염에서 활액 염증의 MRI 평가와 세로로 (longitudinally) 상관관계가 있고; 제I형 마커는 비록 작용 메카니즘이 임상 결과와 관련되지 않을 수는 있지만 이 메카니즘에 따른 개입 효과를 보여주며; 제II형 마커는 대리 종점으로서 기능하여, 바이오마커의 변화 또는 바이오마커로부터의 신호, 예를 들어 류마티스성 관절염에서 CT에 의한 골 부식으로 측정되는 바와 같이, 표적화된 반응의 "유효성"에 대한 임상적 이점을 예측한다. 따라서, 영상화 바이오마커는 (i) 표적 단백질의 발현, (ii) 표적 단백질에 대한 치료제의 결합, 즉 선택성, 및 (iii) 소실율 및 반감기 약력학 데이타에 대한 약동학 (PD) 치료 정보를 제공할 수 있다. 시험관에서 사용되는 바이오마커에 비해 생체내 영상화 바이오마커의 이점은 비-침습적 치료, 정량화가능한 전신 평가, 반복적 투여 및 평가, 즉 여러 시점에서의 투여 및 평가, 및 전임상 결과 (작은 동물)로부터 임상 (인간) 결과로의 잠재적으로 이전가능한 효과를 포함한다. 몇몇 적용의 경우, 생체영상화는 전임상 연구에서의 동물 실험을 대체하거나 그 횟수를 최소화한다.
펩티드 표지 방법은 널리 공지되어 있다. 문헌 [Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al. (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.; De Leon-Rodriguez et al. (2004) Chem. Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al. (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237]을 참조한다.
충분히 근접한 두 모이어티, 즉 형광 리포터 및 퀀쳐 (quencher)로 표지된 펩티드 및 단백질에서는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)이 일어난다. 리포터기는 대체로 특정 파장의 광에 의해 여기되고 최대 밝기의 방출을 위한 적절한 스톡스 이동 (Stokes shift)으로 에너지를 수용기 또는 퀀쳐기에게 전달하는 형광 염료이다. 형광 염료에는 연장된 방향성 (extended aromaticity)을 갖는 분자, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 및 이들의 유도체가 있다. 형광 리포터는 온전한 펩티드 중의 퀀쳐 모이어티에 의해 부분적으로 또는 유의하게 퀀칭될 수 있다. 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 펩티드의 절단시에, 검출가능한 형광 증가가 측정될 수 있다 [Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34].
본 발명의 표지된 항체는 친화도 정제 제제로서 사용될 수도 있다. 이 과정에서, 표지된 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 세파덱스 (Sephadex) 수지 또는 여과지와 같은 고체상에 고정된다. 고정된 항체를 정제될 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 고정된 폴리펩티드 변이체에 결합된 정제될 항원을 제외하고는 샘플 중에 존재하는 실질적으로 모든 물질을 제거할 적합한 용매로 지지체를 세척한다. 최종적으로, 상기 지지체를 폴리펩티드 변이체로부터 항원을 방출시킬 또 다른 적합한 용매, 예를 들어 글리신 완충액 (pH 5.0)로 세척한다.
표지 시약은 전형적으로 (i) 시스테인 조작된 항체의 시스테인 티올과 직접 반응하여 표지된 항체를 형성할 수 있거나, (ii) 링커 시약과 반응하여 링커-표지 중간체를 형성할 수 있거나, 또는 (iii) 링커 항체와 반응하여 표지된 항체를 형성할 수 있는 반응성 관능기를 보유한다. 표지 시약의 반응성 관능기로는, 말레이미드, 할로아세틸, 요오도아세트아미드 숙신이미딜 에스테르 (예, NHS, N-하이드록시숙신이미드), 이소티오시아네이트, 술포닐 클로라이드, 2,6-디클로로트리아지닐, 펜타플루오로페닐 에스테르 및 포스포르아미다이트가 있으나, 다른 관능기도 사용될 수 있다.
예시적인 반응성 관능기는 검출가능한 표지, 예를 들어 바이오틴 또는 형광 염료의 카르복실기 치환체 중의 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 (NHS)이다. 표지의 NHS 에스테르는 예비 형성, 단리, 정제 및/또는 특성화될 수 있거나, 또는 계내 형성되어 항체의 친핵기와 반응할 수 있다. 전형적으로, 표지의 카르복실 형태는 카르보디이미드 시약, 예를 들어 디사이클로헥실카르보디이미드, 디이소프로필카르보디이미드, 또는 유로늄 시약, 예를 들어 TSTU (O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트, HBTU (O-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트), 또는 HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트), 활성자, 예를 들어 1-하이드록시 벤조트리아졸 (HOBt) 및 N-하이드록시숙신이미드의 수가지 조합과의 반응으로 활성화되어 표지의 NHS 에스테르를 형성한다. 몇몇 경우에는, 표지 및 항체가 표지의 계내 활성화 및 항체와의 반응으로 커플링되어 표지-항체 접합체를 1 단계로 형성할 수 있다. 다른 활성화 및 커플링 시약으로는, TBTU (2-(1H-벤조트리아조-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트), TFFH (N,N',N",N'"-테트라메틸유로늄 2-플루오로-헥사플루오로포스페이트), PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트, EEDQ (2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로-퀴놀린), DCC (디사이클로헥실카르보디이미드), DIPCDI (디이소프로필카르보디이미드), MSNT (1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸, 및 아릴 술포닐 할라이드, 예를 들어 트리이소프로필벤젠술포닐 클로라이드가 있다.
본 발명의 알부민 결합 펩티드- Fab 화합물:
한 측면에서, 본 발명의 항체는 알부민 결합 단백질에 융합된다. 혈장-단백질 결합은 수명이 짧은 분자의 약력학 특성을 개선시키는데 효과적인 수단일 수 있다. 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이다. 혈청 알부민 결합 펩티드 (ABP)는 조직 흡수, 투과 및 확산의 변경 등을 비롯하여 융합된 활성 도메인 단백질의 약동학을 변경시킬 수 있다. 이들 약동학 파라미터는 적절한 혈청 알부민 결합 펩티드 서열의 특이적 선택을 통해 조정될 수 있다 [US 20040001827]. 일련의 알부민 결합 펩티드가 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 확인되었다 [Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746]. 본 발명의 화합물은 (i) 문헌 [Dennis et al. (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043]의 표 III 및 표 IV, 35038면, (ii) US 20040001827의 [0076] 서열 번호 9 내지 22, 및 (iii) WO 01/45746의 12 내지 13면에 제시되어 있는 ABP 서열을 포함하며, 상기 문헌 모두가 본원에 참조로 포함된다. 알부민 결합 펩티드를 Fab 중쇄의 C-말단에 1:1의 화학양론적 비율 (1 ABP/1 Fab)로 융합시켜 알부민 결합 (ABP)-Fab를 조작한다. 이들 ABP-Fab와 알부민의 회합은 토끼 및 생쥐에서 항체 반감기를 25배 초과로 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서, 상술된 반응성 Cys 잔기는 이들 ABP-Fab에 도입되어 세포독성 약물과의 부위-특이적 접합 및 이후의 생체내 동물 연구에 사용될 수 있다.
예시적인 알부민 결합 펩티드 서열은 서열 번호 53 내지 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 이로 제한되지 않는다:
CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF (서열 번호 53)
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (서열 번호 54)
QRLIEDICLPRWGCLWEDDF (서열 번호 55)
RLIEDICLPRWGCLWEDD (서열 번호 56)
DICLPRWGCLW (서열 번호 57)
항체-약물 접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체, 또는 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 추가로 면역접합체를 사용하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 면역접합체는 세포독성제 또는 검출가능한 제제에 공유결합에 의해 부착된 임의의 상기 항-FcRH5 항체를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 FcRH5 항체는 또 다른 FcRH5 항체에 의해 결합되는 FcRH5 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 FcRH5 항체는 또 다른 FcRH5 항체에 의해 결합되는 에피토프로부터 먼 FcRH5 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 제1 동물 종의 FcRH5에 특이적으로 결합하고, 제2 동물 종의 FcRH5에는 특이적으로 결합하지 않는다. 한 양태에서, 제1 동물 종은 인간 및/또는 영장류 (예를 들어, 시노몰거스 원숭이)이고, 제2 동물 종은 뮤린 (예를 들어, 생쥐) 및/또는 개이다. 한 양태에서, 제1 동물 종은 인간이다. 한 양태에서, 제1 동물 종은 영장류, 예를 들어 시노몰거스 원숭이이다. 한 양태에서, 제2 동물 종은 뮤린, 예를 들어 생쥐이다. 한 양태에서, 제2 동물 종은 개이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 담체는 약제학적으로 허용되는 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 FcRH5 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 임의의 유형, 예를 들어 재조합 벡터, 예를 들어, 발현 벡터일 수 있다. 임의의 다양한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 한 양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이이다. 한 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 FcRH5 항체 (본원에 정의된 바와 같이 전장 및 이의 단편을 포함한다)를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 적합한 숙주 세포 내에서 상기 항체 (또는 이의 단편)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 발현시키고, 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 용기; 및 용기 내에 담긴 조성물을 포함하는 제품을 제공하고, 여기서 조성물은 본 발명의 하나 이상의 FcRH5 항체를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 한 양태에서, 항체를 포함하는 조성물은 일부 양태에서 약제학적으로 허용되는 것인 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 제품은 피험체에게 조성물 (예를 들어, 항체)를 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 FcRH5 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 완충액을 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 양태에서, 완충액은 약제학적으로 허용되는 것이다. 한 양태에서, 길항제 항체를 포함하는 조성물은 일부 양태에서 약제학적으로 허용되는 것인 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 키트는 피험체에게 조성물 (예를 들어, 항체)을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 목적의 및/또는 예방 목적의 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 FcRH5 항체의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 목적의 및/또는 예방 목적의 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 목적의 및/또는 예방 목적의 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 목적의 및/또는 예방 목적의 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 목적의 및/또는 예방 목적의 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 제품의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 질병, 예를 들어 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료 목적의 및/또는 예방 목적의 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 키트의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 항체와 접촉시켜 상기 세포의 성장의 억제를 유발하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5를 발현하는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유동물을 치료 목적으로 처치하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 포유동물에게 치료 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 상기 포유동물을 효과적으로 치료하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5의 증가된 발현과 연관된 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 피험체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 상기 세포 증식성 장애를 효과적으로 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 상기 증식성 장애는 암이다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 성장이 FcRH5의 성장 강화 효과에 적어도 부분적으로 의존적인 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포를 유효량의 본 발명의 항체와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 성장이 FcRH5의 성장 강화 효과에 적어도 부분적으로 의존적인 종양을 치료 목적으로 처치하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포를 유효량의 본 발명의 항체와 접촉시켜 상기 종양을 효과적으로 치료하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
한 측면에서, 본 발명은 환자에게 본원에 기재된 면역접합체, 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다. 한 양태에서, 암은 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택된다. 한 양태에서, 환자에게 세포독성제를 항체-약물 접합체 화합물과 병용하여 투여한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5에 대한 면역접합체의 결합을 허용하는 조건 하에 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체에 세포를 노출시키는 단계를 포함하는, B 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, B 세포 증식은 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택된다. 한 양태에서, B 세포는 이종이식편이다. 한 양태에서, 노출은 시험관내에서 실시된다. 한 양태에서, 노출은 생체내에서 발생한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내에서 FcRH5의 존재를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 샘플을 본 발명의 항체에 노출시키고, 상기 샘플 내의 FcRH5에 대한 상기 항체의 결합을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플 내의 FcRH5에 대한 상기 항체의 결합은 상기 샘플 내에 상기 단백질이 존재함을 나타낸다. 한 양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플은 B 세포를 포함한다. 한 양태에서, 생물학적 샘플은 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종을 포함하고 이로 제한되지 않는 B 세포 질환 및/또는 B 세포 증식성 장애를 겪고 있거나 겪고 있는 것으로 의심되는 포유동물로부터 채취한 샘플이다.
한 측면에서, FcRH5를 발현하는 세포, 예를 들어 B 세포의 증가와 연관된 세포 증식성 장애를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 생물학적 샘플 내의 시험 세포를 임의의 상기 항체와 접촉시키고; FcRH5에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 샘플 내의 시험 세포에 결합된 항체의 수준을 결정하고; 대조 샘플 내의 세포에 결합된 항체의 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 결합된 항체의 수준은 시험 및 대조 샘플 내의 FcRH5-발현 세포의 수로 표준화되고, 대조 샘플에 비해 시험 샘플 내의 결합된 항체의 수준이 더 높은 것은 FcRH5를 발현하는 세포와 연관된 세포 증식성 장애의 존재를 나타낸다.
한 측면에서, 혈액 또는 혈청 내에서 가용형 FcRH5를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 B 세포 증식성 장애를 겪는 것으로 의심되는 포유동물로부터의 혈액 또는 혈청의 시험 샘플을 본 발명의 항-FcRH5 항체와 접촉시키고, 정상 포유동물로부터의 혈액 또는 혈청의 대조 샘플에 비해 시험 샘플 내에서 가용형 FcRH5의 증가를 검출하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 검출 방법은 포유동물의 혈액 또는 혈청 내에서 가용형 FcRH5의 증가와 연관된 B 세포 증식성 장애를 진단하는 방법으로서 유용하다.
한 측면에서, 본 발명의 항체를 FcRH5를 발현하는 세포에 결합시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 항체는 세포독성제에 접합된다. 한 양태에서, 항체는 성장 억제제에 접합된다.
본 발명의 방법은 FcRH5의 발현과 연관된 임의의 적합한 병리학적 상태, 예를 들어 세포 및/또는 조직에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 조혈 세포이다. 예를 들어, 조혈 세포는 림프구, 백혈구, 혈소판, 적혈구 및 천연 킬러 세포로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 B 세포 또는 T 세포이다. 한 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 림프종 세포, 백혈병 세포, 또는 골수종 세포로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 추가의 처리 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 방법은 표적화된 세포 및/또는 조직 (예를 들어, 암 세포)을 방사선 처치 또는 화학요법제에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 설명되는 바와 같이, FcRH5 (또는 IRTA2)는 다발성 골수종 및 버킷 림프종 세포주에서 하향조절되는 것으로 관측되었다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 양태에서, 표적화되는 세포 (예를 들어, 암 세포)는 FcRH5를 발현하지 않는 세포에 비해 FcRH5가 발현되는 세포이다. 추가의 양태에서, 표적화되는 세포는 동일한 조직 유형의 정상적인 비-암 세포에 비해 FcRH5 발현이 증강된 암 세포이다. 한 양태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 세포의 사멸을 유발한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 임의의 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포도 제공한다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이 세포, 또는 효모 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 항체를 생성하는 방법이 추가로 제공되고, 바람직한 항체의 발현에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 관심 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 항-FcRH5 항체를 담체와 조합하여 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로, 담체는 약제학적으로 허용되는 담체이다.
본 발명의 또 다른 측면은 항-FcRH5 폴리펩티드 항체에 반응성인 상태의 치료에 유용한 의약의 제조를 위한, 본원에서 설명되는 항-FcRH5 폴리펩티드 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 I의 항체-약물 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물이고, 여기서 항체당 평균 약물 로드는 약 2 내지 약 5, 또는 약 3 내지 약 4이다.
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 I의 ADC 화합물, 화학식 I의 ADC 화합물의 혼합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
또 다른 측면은 화학식 I의 ADC 화합물 및 항암 특성 또는 다른 치료 효과를 갖는 제2 화합물을 포함하는 약제학적 병용 제제를 제공한다.
또 다른 측면은 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 상기 세포의 증식을 억제하기에 효과적인 양의 화학식 I의 항체-약물 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물로 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 상기 세포의 증식을 억제하는 방법이다.
또 다른 측면은 환자에게 치료 유효량의 화학식 I의 ADC를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법이다.
또 다른 측면은 항체-약물 접합체, 용기, 및 치료를 표시하는 포장 삽입물 또는 표지를 포함하는 제품, 즉, 키트를 포함한다.
본 발명의 한 측면은 (a) 시스테인 조작된 항체의 조작된 시스테인기를 링커 시약과 반응시켜 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성시킨 다음, (b) Ab-L을 활성화된 약물 모이어티 D와 반응시켜, 항체-약물 접합체를 형성시키는 단계를 포함하거나; 또는 (c) 약물 모이어티의 친핵기를 링커 시약과 반응시켜 약물-링커 중간체 D-L을 형성시킨 다음, (d) D-L을 시스테인 조작된 항체의 조작된 시스테인기와 반응시켜, 항체-약물 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 화학식 I의 항체 약물 접합체 화합물의 제조 방법이다.
본 발명의 한 측면은 (a) 세포를 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체-약물 접합체에 노출시키고; (b) 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체-약물 접합체 화합물의 세포에 대한 결합 정도를 결정하는 단계를 포함하는, 암 세포를 검출하기 위한 분석이다.
A. 항- FcRH5 항체
한 양태에서, 본 발명은 본원에서 치료제로서 사용될 수 있는 항-FcRH5 항체를 제공한다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합체 항체를 포함한다.
1. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 어쥬번트 (adjuvant)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성될 수 있다. 관련 항원 (특히, 합성 펩티드가 사용될 때)을 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질에 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 항원은 이관능성제 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여,키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제에 접합될 수 있다.
동물은, 예를 들어 (각각 토끼 또는 생쥐에 대해) 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체를 3 부피의 프로인트 (Freund) 완전 어쥬번트와 합한 후 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후에, 동물에 프로인트 완전 어쥬번트 중의 펩티드 또는 접합체를 처음 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 부스팅한다. 7일 내지 14일 후에, 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 동물은 역가 안정기까지 부스팅한다. 접합체는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양으로 제조될 수도 있다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위해 응집제, 예를 들어 명반이 적절하게 사용된다.
2. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 4,816,567]에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 생쥐 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터는 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 설명한 바와 같이 면역화된다. 달리, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후에, 림프구는 단리된 후, 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합된다 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모골수종 세포 (본원에서 융합 파트너로 칭함)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 하이코크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 선택 배양 배지는 일반적으로 하이코크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 융합 파트너 골수종 세포는, 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 융합되지 않은 모세포에 대해 선택하는 선택 배지에 민감한 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 라인, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 생쥐 종양 (입수처: Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA) 및 SP-2 및 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653 세포 (입수처: American Type Culture Collection)에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 생쥐-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 [Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
하이브리도마 세포가 성장하는 배지는 항원에 대해 지시되는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal . Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. 상기 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는, 예를 들어 생쥐 내로 세포의 i.p. 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원 역할을 한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이어서 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해 다른 경우라면 항체 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포로 형질감염된다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 문헌 [Skerra et al., Curr . Opinion in Immunol ., 5:256-262 (1993); Plueckthun, Immunol. Revs . 130:151-188 (1992)]을 참조한다.
추가의 양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991)]에서는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체의 단리를 설명하고 있다. 후속 문헌은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생성 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)], 및 매우 큰 파지 라이브러리 제조를 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 [Waterhouse et al., Nuc . Acids . Res ., 21:2265-2266 (1993)]을 설명하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열을 치환시키거나 [미국 특허 4,816,567; Morrison, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851 (1984)], 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)의 코딩 서열의 전부 또는 일부와 융합시킴으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생성하도록 변형시킬 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 이가 항체를 생성한다.
3. 인간 및 인간화 항체
본 발명의 항-FcRH5 항체는 추가로 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 이의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수령자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 생쥐, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수령 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수령 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역에 대응한다. 또한, 인간화 항체는 최적으로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역 일부의 대응 영역을 포함할 것이다 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992)].
비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 그 내부에 도입된 비-인간 기원의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입 (import)" 잔기로서 종종 언급되고, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체 [미국 특허 4,816,567]이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항체가 인간 치료용으로 의도될 때 항원성 및 HAMA (인간 항-생쥐 항체) 반응의 감소에 매우 중요하다. HAMA 반응의 감소 또는 제거는 적합한 치료제의 임상 개발에서 유의한 측면이다 (예를 들어, 문헌 [Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495] 참조). 본원에서 설명되는 바와 같이, 본 발명은 HAMA 반응이 감소되거나 제거되도록 인간화된 항체를 제공한다. 이들 항체의 변이체는 또한 그 일부가 아래에서 추가로 설명되는, 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 V 도메인 서열이 확인되고, 그 안의 인간 프레임워크 영역 (FR)이 인간화 항체를 위해 수용된다 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol . Biol ., 196:901 (1987)]. 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수 개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 [Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)].
예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같은 항체로부터의 아미노산 서열은 프레임워크 및/또는 초가변 서열(들)의 다양성을 위한 출발 (모) 서열로서 사용할 수 있다. 출발 초가변 서열이 연결되는 선택된 프레임워크 서열은 본원에서 억셉터 인간 프레임워크로서 언급된다. 억셉터 인간 프레임워크가 인간 면역글로불린 (이의 VL 및/또는 VH 영역)의 것이거나 이로부터 유도된 것일 수 있지만, 억셉터 인간 프레임워크는 인간 컨센서스 프레임워크 서열의 것이거나 이로부터 유도되는 것이 바람직하고, 그 이유는 상기 프레임워크가 인간 환자에서 최소의 면역원성을 갖거나 또는 전혀 갖지 않는 것으로 입증되었기 때문이다.
억셉터가 인간 면역글로불린으로부터 유도되는 경우에, 공여체 프레임워크 서열을 인간 프레임워크 서열의 집합체 내의 다양한 인간 프레임워크 서열과 정렬시킴으로써 공여체 프레임워크 서열에 대한 이의 상동성을 기초로 하여 선택된 인간 프레임워크 서열을 임의로 선택하고, 가장 상동성인 프레임워크 서열을 억셉터로서 선택할 수 있다.
한 양태에서, 본원에서 인간 컨센서스 프레임워크는 VH 하위군 III 및/또는 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 서열의 것이거나 이로부터 유도되는 것이다.
억셉터는 인간 면역글로불린으로부터의 것이든 인간 컨센서스 프레임워크로부터의 것이든 상관없이 선택되는 인간 프레임워크 서열과 서열이 동일할 수 있지만, 본 발명은 억셉터 서열이 인간 면역글로불린 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열에 관해 기존의 아미노산 치환을 포함할 수 있음을 고려한다. 상기 기존의 치환은 단지 인간 면역글로불린 서열 또는 컨센서스 프레임워크 서열에 관해 바람직하게는 최소, 대체로 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 차이이다.
비-인간 항체의 초가변 영역 잔기는 VL 및/또는 VH 억셉터 인간 프레임워크 내로 삽입된다. 예를 들어, 카바트 CDR 잔기, 코티아 초가변 루프 잔기, Abm 잔기, 및/또는 접촉 잔기에 대응하는 잔기를 삽입할 수 있다. 임의로, 다음과 같은 연장된 초가변 영역 잔기가 삽입된다: 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3), 26 내지 35B (H1), 50 내지 65, 47 내지 65 또는 49 내지 65 (H2) 및 93 내지 102, 94 내지 102, 또는 95 내지 102 (H3).
초가변 영역 잔기의 "삽입"이 본원에서 논의되지만, 이것은 다양한 방식으로 수행될 수 있고, 예를 들어 바람직한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 이의 프레임워크 잔기가 억셉터 인간 프레임워크 잔기로 변경되도록 생쥐 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시킴으로써, 또는 초가변 도메인 잔기가 비-인간 잔기로 변경되도록 인간 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시킴으로써, 또는 바람직한 서열을 코딩하는 핵산을 합성함으로써 생성될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
본원의 실시예에서, 초가변 영역-이식된 변이체는 각각의 초가변 영역에 대해 별개의 올리고뉴클레오티드를 사용하는, 인간 억셉터 서열을 코딩하는 핵산의 Kunkel 돌연변이유발에 의해 생성되었다 [Kunkel et al., Methods Enzymol . 154:367-382 (1987)]. 적합한 초가변 영역-항원 상호작용을 교정하고 재-확립하기 위해 통상적인 기술을 이용하여, 프레임워크 및/또는 초가변 영역 내에 적절한 변화를 도입할 수 있다.
파지(미드) 디스플레이 (본원에서 일부 정황에서는 파지 디스플레이로도 칭함)가 서열 무작위화에 의해 생성된 라이브러리에서 많은 상이한 잠재적인 변이체 항체를 생성하고 스크리닝하기 위한 편리하고 신속한 방법으로서 이용될 수 있다. 그러나, 변경된 항체를 제조하고 스크리닝하기 위한 다른 방법도 당업자에게 이용가능하다.
파지(미드) 디스플레이 기술은 리간드, 예를 들어 항원에 결합하는 신규한 단백질을 생성하고 선택하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지(미드) 디스플레이 기술을 이용함으로써, 표적 분자에 높은 친화도로 결합하는 서열에 대해 신속하게 분류될 수 있는 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 일반적으로 바이러스 코트 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 융합된다. 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 유전자 III 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열에 융합된 일가 파지미드 디스플레이 시스템이 개발되었다 [Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods : A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)]. 일가 파지미드 디스플레이 시스템에서, 유전자 융합체는 낮은 수준으로 발현되고, 입자의 감염성이 유지되도록 야생형 유전자 III 단백질도 발현된다. 펩티드 라이브러리를 생성하고 이들 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 많은 특허 (예를 들어, 미국 특허 5,723,286, 미국 특허 5,432,018, 미국 특허 5,580,717, 미국 특허 5,427,908 및 미국 특허 5,498,530)에 개시되어 있다.
무작위 DNA 서열의 삽입에 의한 단일 유전자의 변경 또는 관련 유전자 패밀리의 클로닝에 의한 것을 포함하는 많은 방식을 통해 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드의 라이브러리가 제조되었다. 파지(미드) 디스플레이를 사용하여 항체 또는 항원 결합 단편을 디스플레이하는 방법은 미국 특허 5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717, 및 5,658,727에 기재되어 있다. 이어서, 라이브러리는 목적하는 특징을 갖는 항체 또는 항원 결합 단백질의 발현에 대해 스크리닝된다.
선택되는 아미노산을 주형 핵산 내로 치환시키는 방법은 당업계에 잘 확립되어 있고, 그 일부가 본원에서 설명된다. 예를 들어, 초가변 영역 잔기는 Kunkel 방법을 이용하여 치환될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)] 참조).
올리고뉴클레오티드의 서열은 변경되는 초가변 영역에 대한 하나 이상의 설계된 코돈 세트를 포함한다. 코돈 세트는 목적하는 변이체 아미노산을 코딩하도록 사용된 상이한 뉴클레오티드 삼중체 서열의 세트이다. 코돈 세트는 IUB 코드에 따라 아래 나타낸 바와 같이 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 등몰 혼합물을 지정하기 위해 기호를 사용하여 나타낼 수 있다.
IUB 코드
G 구아닌
A 아데닌
T 티민
C 시토신
R (A 또는 G)
Y (C 또는 T)
M (A 또는 C)
K (G 또는 T)
S (C 또는 G)
W (A 또는 T)
H (A 또는 C 또는 T)
B (C 또는 G 또는 T)
V (A 또는 C 또는 G)
D (A 또는 G 또는 T)
N (A 또는 C 또는 G 또는 T)
예를 들어, 코돈 세트 DVK에서, D는 뉴클레오티드 A 또는 G 또는 T일 수 있고; V는 A 또는 G 또는 C일 수 있고; K는 G 또는 T일 수 있다. 상기 코돈 세트는 18가지의 상이한 코돈을 제시할 수 있고, 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, 및 Cys를 코딩할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 또는 프라이머 세트는 표준 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 코돈 세트에 의해 제공되는 뉴클레오티드 삼중체의 모든 가능한 조합을 나타내고, 목적하는 군의 아미노산을 코딩하는 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 세트는, 예를 들어 고체상 합성에 의해 합성할 수 있다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "축퇴성 (degeneracy)"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 잘 공지되어 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 상기 뉴클레오티드 세트는 시판 핵산 합성기 (예를 들어, Applied Biosystems로부터 입수가능함)를 사용하여 합성할 수 있거나, (예를 들어, Life Technologies, Rockville, MD)로부터) 상업적으로 입수할 수 있다. 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드의 세트는 일반적으로 전체 서열 내에서 코돈 세트에 의해 확립되는 상이한 서열을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형에 혼성화를 허용하는 서열을 갖고, 또한 클로닝 목적을 위한 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
한 방법에서, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열은 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Zoller et al., Nucleic Acids Res . 10:6487-6504 (1987)]에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 공지되어 있다. 간단히 설명하면, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열은 목적하는 코돈 세트를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 세트를 DNA 주형에 혼성화함으로써 생성되고, 여기서 주형은 가변 영역 핵산 주형 서열을 함유하는 단일 가닥 형태의 플라스미드이다. 혼성화 후, DNA 중합효소를 사용하여 주형의 전체 제2 상보성 가닥을 합성하고, 이는 따라서 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 것이고, 올리고뉴클레오티드 세트에 의해 제공되는 바와 같은 코돈 세트를 함유할 것이다.
일반적으로, 길이가 적어도 25개 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적 올리고뉴클레오티드는 돌연변이(들)을 코딩하는 뉴클레오티드(들)의 측면에서 주형에 완전히 상보성인 12 내지 15개의 뉴클레오티드를 가질 것이다. 이는 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA 주형 분자에 적절하게 혼성화할 것을 보장한다. 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Crea et al., Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA, 75:5765 (1978)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 이용하여 쉽게 합성된다.
DNA 주형은 박테리오파지 M13 벡터로부터 유래된 벡터 (상업적으로 이용가능한 M13mp18 및 M13mp19 벡터가 적합함), 또는 문헌 [Viera et al., Meth . Enzymol., 153:3 (1987)]에 설명된 바와 같이 단일 가닥 파지 복제 기점을 함유하는 벡터에 의해 생성된다. 따라서, 돌연변이시킬 DNA를, 단일 가닥 주형을 생성하기 위해 상기 벡터 중 하나에 삽입시킬 수 있다. 단일 가닥 주형의 생성은 상기 문헌 [Sambrook et al.]의 섹션 4.21-4.41에 기재되어 있다.
천연 DNA 서열을 변경시키기 위해, 올리고뉴클레오티드를 적합한 혼성화 조건 하에 단일 가닥 주형에 혼성화시킨다. 이어서, DNA 중합효소, 보통 T7 DNA 중합효소 또는 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편을 첨가하여, 합성을 위한 프라이머로서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형의 상보성 가닥을 합성한다. 따라서, DNA의 하나의 가닥이 유전자 1의 돌연변이형을 코딩하고, 다른 가닥 (원래의 주형)이 유전자 1의 천연의 비변경된 서열을 코딩하도록 이종이중체 분자가 형성된다. 이어서, 상기 이종이중체 분자를 적합한 숙주 세포, 보통 원핵세포, 예를 들어 이. 콜라이 JM101 내로 형질전환시킨다. 세포를 성장시킨 후, 아가로스 플레이트 상에 플레이팅하고, 돌연변이된 DNA를 함유하는 박테리아 콜로니를 확인하기 위해 32-포스페이트로 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스크리닝한다.
바로 앞에 설명된 방법은 플라스미드의 두 가닥이 모두 돌연변이(들)을 함유하는 동종이중체 분자가 생성되도록 변형될 수 있다. 변형은 다음과 같다: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 상기 설명된 바와 같이 단일 가닥 주형에 어닐링시킨다. 3가지 데옥시리보뉴클레오티드인 데옥시리보아데노신 (dATP), 데옥시리보구아노신 (dGTP), 및 데옥시리보티미딘 (dTT)의 혼합물을 dCTP-(aS)로 불리는 변형된 티오데옥시리보시토신 (Amersham으로부터 입수가능함)과 합한다. 상기 혼합물을 주형-올리고뉴클레오티드 복합체에 첨가한다. DNA 중합효소를 상기 혼합물에 첨가하면, 돌연변이된 염기를 제외하고 주형에 동일한 DNA의 가닥이 생성된다. 또한, 상기 새로운 DNA 가닥은 dCTP 대신에 dCTP-(aS)를 함유할 것이고, 이는 제한 엔도뉴클레아제 분해로부터 보호하는 기능을 한다. 이중가닥 이종이중체의 주형 가닥을 적절한 제한 효소로 절단한 후, 주형 가닥을 ExoIII 뉴클레아제 또는 다른 적절한 뉴클레아제로 돌연변이를 유발시킬 부위(들)을 함유하는 영역을 지나서 분해시킬 수 있다. 이어서, 반응을 중지시켜 단지 부분적으로 단일 가닥인 분자를 생성한다. 이어서, 4가지의 모든 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP, 및 DNA 리가제의 존재 하에 DNA 중합효소를 사용하여 완전 이중가닥 DNA 동종이중체를 형성한다. 이어서, 상기 동종이중체 분자를 적합한 숙주 세포 내로 형질전환시킬 수 있다.
앞서 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 세트의 서열은 주형 핵산에 혼성화하기에 충분한 길이이고, 또한 반드시는 아니지만 제한 부위를 함유할 수 있다. DNA 주형은 박테리오파지 M13 벡터로부터 유래된 벡터, 또는 문헌 [Viera et al., Meth . Enzymol ., 153:3 (1987)]에 설명된 바와 같이 단일 가닥 파지 복제 기점을 함유하는 벡터에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 돌연변이시킬 DNA를 단일 가닥 주형을 생성하기 위해 상기 벡터 중 하나에 삽입해야 한다. 단일 가닥 주형의 생성은 상기 문헌 [Sambrook et al.]의 섹션 4.21-4.41에 기재되어 있다.
또 다른 방법에 따르면, 항원 결합은 복구된 초가변 영역의 선택을 통한 항체의 인간화 동안 회복될 수 있다 (2005년 2월 18일 출원된 미국 특허 출원 11/061,841 참조). 이 방법은 비-인간 초가변 영역을 억셉터 프레임워크 상에 삽입하고, 억셉터 프레임워크 서열을 변형시키지 않으면서 하나 이상의 초가변 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 도입시키는 단계를 포함한다. 달리, 하나 이상의 아미노산 치환의 도입에는 억셉터 프레임워크 서열의 변형이 수반될 수 있다.
또 다른 방법에 따르면, 라이브러리는 각각의 세트가 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 제공된 코돈 세트에 의해 확립되는 상이한 서열을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드를 갖는 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트를 제공함으로써 생성될 수 있다. 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트는 가변 도메인 주형 핵산 서열과 함께 중합효소 연쇄 반응에 사용되어 PCR 산물의 "라이브러리"를 생성할 수 있다. PCR 산물은 확립된 분자 생물학 기술을 이용하여 다른 관련 또는 비관련 핵산 서열, 예를 들어, 바이러스 코트 단백질 및 이량체화 도메인과 융합될 수 있으므로 "핵산 카세트"로서 언급될 수 있다.
PCR 프라이머의 서열은 초가변 영역 내의 용매 접근가능한 매우 다양한 위치에 대해 하나 이상의 설계된 코돈 세트를 포함한다. 상기한 바와 같이, 코돈 세트는 목적하는 변이체 아미노산을 코딩하기 위해 사용되는 상이한 뉴클레오티드 삼중체 서열의 세트이다.
적절한 스크리닝/선택 단계를 통해 선택되는, 목적하는 기준을 충족시키는 항체 선택체는 표준 재조합 기술을 이용하여 단리되고 클로닝될 수 있다.
항체가 항원에 대한 높은 결합 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석의 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이를 조사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 이의 항원을 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.
다양한 형태의 인간화 항-FcRH5 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 면역접합체를 생성하기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)과 임의로 접합된 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 달리, 인간화 항체는 온전한 항체, 예를 들어 온전한 IgG1 항체일 수 있다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역화시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자이식 동물 (예를 들어, 생쥐)을 현재 생성할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 (germ-line) 돌연변이체 생쥐의 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실은 내인성 항체 생성을 완전히 억제하는 것으로 기술되었다. 이러한 생식계열 돌연변이체 생쥐 내로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 전달하면 항원 시험 접종시에 인간 항체를 생성할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); 미국 특허 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852] 참조).
달리, 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)]을 사용하여, 비면역화된 공여체로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생성할 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트형 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주 또는 부 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임으로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이된다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 포함하므로, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이들 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 것이다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]에 검토된 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. V-유전자 절편의 수개의 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 생쥐의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여체로부터 V 유전자의 레퍼토리를 제조할 수 있고, 항원 (자가항원 포함)의 다양한 어레이에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991); Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905 참조한다.
상기 논의한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성할 수 있다 [미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조].
4. 항체 단편
특정 상황에서, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 보다 작은 크기로 인해 신속한 소실이 가능하고, 고형 종양에 대한 접근성을 개선할 수 있다.
항체 단편의 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백 분해를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성할 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 달리, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 [Carter et al., Bio / Technology 10:163-167 (1992)]. 다른 방법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 양태에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 [WO 93/16185; 미국 특허 5,571,894; 미국 특허 5,587,458 참조]. Fv 및 sFv는 불변 영역이 결여된 온전한 결합 부위를 갖는 유일한 유형이고; 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합체를 생성하도록 제작될 수 있다 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 참조]. 또한, 항체 단편은, 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
5. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 본원에 설명된 FcRH5 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 이러한 항체는 FcRH5 결합 부위를 다른 단백질에 대한 결합 부위와 조합할 수 있다. 달리, 항-FcRH5 아암 (arm)은 FcRH5-발현 세포에 대한 세포성 방어 메카니즘에 집중하고 편재시키기 위해, 백혈구 상의 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3), 또는 IgG의 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 FcRH5를 발현하는 세포에 편재시키기 위해 사용할 수 있다. 이들 항체는 FcRH5-결합 아암, 및 세포 독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
WO 96/16673는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체를 기술하고, 미국 특허 5,837,234는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체를 기술한다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO 98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 5,821,337에서는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시하고 있다. CD3 항원 상의 에피토프 및 제2 에피토프에 결합하는 추가의 이중특이적 항체가 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [미국 특허 5,078,998 (항-CD3/종양 세포 항원); 5,601,819 (항-CD3/IL-2R; 항-CD3/CD28; 항-CD3/CD45); 6,129.914 (항-CD3/악성 B 세포 항원); 7,112,324 (항-CD3/CD19); 6,723,538 (항-CD3/CCR5); 7,235,641 (항-CD3/EpCAM); 7,262,276 (항-CD3/난소 종양 항원); 5,731,168 (항-CD3/CD4IgG)]을 참조한다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 그 중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성한다. 대체로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 문헌 [WO 93/08829; Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 접근에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 바람직하게는, 융합은 힌지의 적어도 일부를 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인, CH2 및 CH3 영역을 사용한다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 세포 내로 동시-형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 목적하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 균등 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 생성할 때 또는 상기 비가 목적하는 쇄 조합의 생성에 유의한 영향을 갖지 않을 때, 단일 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 접근의 바람직한 양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 5,731,168에 기재된 다른 접근에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 바람직한 계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써, 큰 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체 (homodimer)에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다. 이러한 접근으로 생성되는 이중특이적 항체는 본원에서 "캐비티로의 돌출 (protuberance-into-cavity)" 항체로 불린다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 바이오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 [미국 특허 4,676,980], 및 HIV 감염의 치료를 위해 [WO 91/00360, WO 92/200373; EP 03089] 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 통상적인 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결기를 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 온전한 항체가 단백 분해 방식으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 복합화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용할 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp . Med ., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 따로 분비되고, 시험관내에서 지시된 화학 커플링 반응되어 이중특이적 항체를 형성하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양으로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다 [Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 후, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체의 생성에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 대체 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 너무 짧아 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 페어링할 수 없는 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 페어링하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 [Gruber et al., J. Immunol ., 152:5368 (1994)].
이가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt et al. J. Immunol . 147:60 (1991)].
6. 이종접합체 항체
또한, 이종접합체 항체가 본 발명의 범위에 속한다. 이종접합체 항체는 2개의 공유결합에의해 연결된 항체로 이루어진다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키기 위해 [미국 특허 4,676,980], 및 HIV 감염의 치료를 위해 [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] 제안되었다. 항체는 가교결합제를 수반하는 것을 포함한, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조할 수 있을 것이다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용하여, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트, 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및, 예를 들어 미국 특허 4,676,980에 개시된 것을 포함한다.
7. 다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 이가 항체보다 빠르게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 다가 항체 (예를 들어, 4가 항체) (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는, 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
8. 이펙터 기능 조작
예를 들어, 항체의 항원 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 향상시키도록 이펙터 기능에 관하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 달리 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역 내에 도입되어, 상기 영역 내에서 쇄내 디술파이드 결합을 형성할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 [Caron et al., J. Exp Med . 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992)]. 향상된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체성 항체도 또한 문헌 [ Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 이종이관능성 가교결합기를 사용하여 제조할 수 있다. 달리, 이중 Fc 영역을 갖는 항체는 조작될 수 있고, 그에 의해 향상된 보체 분해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다 [Stevenson et al., Anti - Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 포함시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.
9. 면역접합체
본 발명은 또한 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체 (상호교환가능하게 "항체-약물 접합체", 또는 "ADC"로 언급됨)에 관한 것이다.
특정 양태에서, 면역접합체는 항체 및 화학요법제 또는 다른 독소를 포함한다. 이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기 기재되어 있다. 사용할 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 방사성 접합된 항체의 생성을 위해 다양한 방사선 핵종이 이용가능하다. 그 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO 94/11026을 참조한다.
항체 및 하나 이상의 작은 분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 아우리스타틴 펩티드, 예를 들어 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체), 메이탄시노이드, 예를 들어 DM1, 트리코텐, 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에서 고려된다.
예시적인 면역접합체 - 항체-약물 접합체
본 발명의 면역접합체 (또는 "항체-약물 접합체" ("ADC"))는 아래 화학식 I의 것일 수 있고, 여기서 항체는 임의의 링커 (L)를 통해 하나 이상의 약물 모이어티 (D)에 접합된다 (즉, 공유결합에 의해 부착된다). ADC는 thioMAb 약물 접합체 ("TDC")를 포함할 수 있다.
<화학식 I>
Figure pct00020
따라서, 항체는 직접 또는 링커를 통해 약물에 접합될 수 있다. 화학식 I에서, p는 항체당 약물 모이어티의 평균 수이고, 이는, 예를 들어 항체당 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티, 특정 양태에서 항체당 1 내지 약 8개의 약물 모이어티일 수 있다. 본 발명은 화학식 I의 항체-약물 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 항체당 평균 약물 로딩은 약 2 내지 약 5, 또는 약 3 내지 약 4이다.
a. 예시적인 링커
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), 및 링커 시약과 접합으로부터 생성된 것: 링커 모이어티 4-머캅토펜타노산 형성 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), 링커 모이어티 4-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)메틸)사이클로헥산카르복실산 형성 N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC", 본원에서 "MCC"로도 칭함), 링커 모이어티 4-머캅토부타노산 형성 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-(피리딘-2-일디술파닐)부타노에이트 ("SPDB"), N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB"), 하나 이상의 반복 단위로서 에틸렌옥시 -CH2CH2O- ("EO" 또는 "PEO")를 포함한다. 추가의 링커 성분이 당업계에 공지되어 있으며, 일부를 아래에 기재한다.
링커는 세포에서 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커 (예를 들어, 하이드라존), 프로테아제-감수성 (예를 들어, 펩티다제-감수성) 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커 [Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992); 미국 특허 5,208,020]를 사용할 수 있다.
특정 양태에서, 링커는 하기 화학식 II에 제시된 바와 같다:
Figure pct00021
II
상기 식에서, A는 스트레쳐 (stretcher) 단위이고, a는 0 내지 1의 정수이고; W는 아미노산 단위이고, w는 0 내지 12의 정수이고; Y는 스페이서 단위이고, y는 0, 1, 또는 2이고; Ab, D, 및 p는 화학식 I에서 상기 정의되어 있다. 이러한 링커의 예시적인 양태는 본원에 참조로 명백하게 포함되는 US 2005-0238649 A1에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 링커 성분은 항체를 다른 링커 성분 또는 약물 모이어티에 연결시키는 "스트레쳐 단위"를 포함할 수 있다. 예시적인 스트레쳐 단위를 아래에 제시한다 (여기서, 물결선은 항체에 대한 공유결합에 의한 부착 부위를 나타낸다):
Figure pct00022
일부 양태에서, 링커 성분은 아미노산 단위를 포함할 수 있다. 하나의 이러한 양태에서, 아미노산 단위는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 허용하여, 세포내 프로테아제, 예를 들어 라이소좀 효소에 노출시에 면역접합체로부터 약물 방출을 용이하게 한다 (예를 들어, 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat . Biotechnol . 21:778-784] 참조). 예시적인 아미노산 단위는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 및 펜타펩티드를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-리신 (fk 또는 phe-lys); 또는 N-메틸-발린-시트룰린 (Me-val-cit)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 단위는 천연 발생 아미노산 잔기 및 소수 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 특정 효소, 예를 들어 종양-연관 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 그들의 선택성 측면에서 설계되고 최적화될 수 있다.
일부 양태에서, 링커 성분은 항체를 약물 모이어티에 직접 또는 스트레쳐 단위 및/또는 아미노산 단위에 의해 연결시키는 "스페이서" 단위를 포함할 수 있다. 스페이서 단위는 "자가 희생적" 또는 "비-자가 희생적"일 수 있다. "비-자가 희생적" 스페이서 단위는 이의 일부 또는 모두가 ADC의 효소에 의한 (예를 들어, 단백 분해에 의한) 절단시에 약물 모이어티에 결합된 상태로 유지되는 단위이다. 비-자가 희생적 스페이서 단위의 예는 글리신 스페이서 단위 및 글리신-글리신 스페이서 단위를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 서열-특이적인 효소에 의한 절단에 감수성인 펩티드성 스페이서의 다른 조합도 또한 고려된다. 예를 들어, 종양 세포 관련 프로테아제에 의한, 글리신-글리신 스페이서 단위를 함유하는 ADC의 효소에 의한 절단은 ADC의 나머지로부터 글리신-글리신-약물 모이어티를 방출시킬 것이다. 이어서, 하나의 이러한 양태에서, 글리신-글리신-약물 모이어티는 종양 세포 내에서 별도의 가수분해 단계를 거치고, 이에 의해 글리신-글리신 스페이서 단위를 약물 모이어티로부터 절단한다.
"자가 희생적" 스페이서 단위는 별도의 가수분해 단계를 수행하지 않으면서 약물 모이어티를 방출시킨다. 특정 양태에서, 링커의 스페이서 단위는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 하나의 이러한 양태에서, p-아미노벤질 알콜은 아미드 결합을 통해 아미노산 단위에 부착되고, 카르바메이트, 메틸카르바메이트, 또는 카르보네이트가 벤질 알콜과 세포독성제 사이에 형성된다 (예를 들어, 문헌 [Hamann et al. (2005) Expert Opin . Ther . Patents (2005) 15:1087-1103] 참조). 한 양태에서, 스페이서 단위는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB)이다. 특정 양태에서, p-아미노 벤질 단위의 페닐렌 부분은 Qm으로 치환되고, 여기서 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4의 정수이다. 자가 희생적 스페이서 단위의 예는 p-아미노벤질 알콜에 전자적으로 유사한 방향족 화합물 (예를 들어, US 2005/0256030 A1 참조), 예를 들어 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 [Hay et al. (1999) Bioorg . Med . Chem . Lett . 9:2237] 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 추가로 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아미드 결합 가수분해시에 환화되는 스페이서, 예를 들어 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 [Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2:223]; 적절하게 치환된 바이사이클로[2.2.1] 및 바이사이클로[2.2.2] 환계 [Storm, et al., J. Amer . Chem . Soc., 1972, 94:5815]; 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 [Amsberry, et al., J. Org. Chem ., 1990, 55:5867]를 사용할 수 있다. 글리신의 a-위치에서 치환된 아민-함유 약물의 제거 [Kingsbury, et al., J. Med . Chem ., 1984, 27:1447]도 또한 ADC에서 유용한 자가 희생적 스페이서의 예이다.
한 양태에서, 스페이서 단위는 아래에 제시된 분지된 비스(하이드록시메틸)스티렌 (BHMS) 단위이고, 이것은 다수의 약물을 삽입하고 방출시키는데 사용될 수 있다:
Figure pct00023
여기서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4의 정수이고, n은 0 또는 1이고; p는 1 내지 약 20이다.
다른 양태에서, 링커는 하나 초과의 약물 모이어티를 분지화 다관능성 링커 모이어티를 통해 항체에 공유결합에 의해 부착시키기 위한 수지상 유형의 링커일 수 있다 [Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768]. 수지상 링커는 ADC의 효능과 관계가 있는 약물 대 항체의 몰비, 즉 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 시스테인 조작된 항체가 단지 하나의 반응성 시스테인 티올기를 보유하는 경우에는, 다수의 약물 모이어티를 수지상 링커를 통하여 부착시킬 수 있다.
예시적인 링커 성분 및 이의 조합물은 화학식 II의 ADC와 관련하여 아래에 제시된다:
Figure pct00024
Figure pct00025
스트레쳐, 스페이서, 및 아미노산 단위를 포함하는 링커 성분은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 US 2005-0238649 A1에 기재된 방법에 의해 합성할 수 있다.
b. 예시적인 약물 모이어티
(1) 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체를 포함한다. 메이탄시노이드는 튜불린 중합화를 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 [미국 특허 3896111]. 뒤이어, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성하는 것으로 밝혀졌다 [미국 특허 4,151,042]. 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체는, 예를 들어 미국 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 또는 발효 생성물의 유도체화에 의해 제조하기에 비교적 이용가능하고, (ii) 디술피드 및 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기 적합한 메이탄신 화합물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리하거나 유전 공학 및 발효 기술을 이용하여 생성할 수 있다 [US 6790952; US 2005/0170475; Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973]. 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체는 또한 공지된 방법에 따라 합성 방식으로 제조할 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 변형된 방향족 환을 갖는 것, 예를 들어 C-19-데클로로 [미국 특허 4256746] (안사미토신 P2의 수소화알루미늄리튬 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시 (또는 C-20-데메틸) +/- C-19-데클로로 [미국 특허 4361650 및 4307016] (스트렙토마이세스 (Streptomyces) 또는 악티노마이세스 (Actinomyces)를 사용한 탈메틸화, 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/- 데클로로 [미국 특허 4,294,757] (아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨), 및 다른 위치에 변형을 갖는 것을 포함한다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 C-9-SH [미국 특허 4424219] (메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR) [US 4331598]; C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) [미국 특허 4450254] (노카르디아 (Nocardia)로부터 제조됨); C-15-하이드록시/아실옥시 [US 4364866] (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조된); C-15-메톡시 [미국 특허 4313946 및 4315929] (트레위아 누들플로라 (Trewia nudlflora)로부터 단리됨); C-18-N-데메틸 [미국 특허 4362663 및 4322348] (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시 [US 4371533] (메이탄시놀의 삼염화티탄/LAH 환원에 의해 제조됨)와 같은 변형을 갖는 것을 포함한다.
메이탄신 화합물 상의 많은 위치가 연결 유형에 따라 연결기 위치로서 유용한 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 에스테르 연결기를 형성하기 위해, 하이드록실기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 하이드록실기를 갖는 C-20 위치가 모두 적합하다 [US 5208020; US RE39151; US 6913748; US 7368565; US 2006/0167245; US 2007/0037972].
메이탄시노이드 약물 모이어티는 다음 구조를 포함한다:
Figure pct00026
여기서, 물결선은 ADC의 링커에 대한 메이탄시노이드 약물 모이어티의 황 원자의 공유결합에 의한 부착 나타낸다. R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬일 수 있다. 아미드기를 황 원자에 부착시키는 알킬렌 쇄는 메타닐, 에타닐, 또는 프로필일 수 있고, 즉, m은 1, 2, 또는 3이다 [US 633410; US 5208020; US 7276497; Chari et al. (1992) Cancer Res . 52: 127-131; Liu et al. (1996) Proc . Natl . Acad. Sci USA 93:8618-8623].
메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체 이성질체, 즉, D의 키랄 탄소에서 R 및 S 입체형태의 임의의 조합이 본 발명의 화합물에 고려된다. 한 양태에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 다음 입체화학 구조를 가질 것이다:
Figure pct00027
메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적인 양태는 다음 구조를 갖는 DM1; DM3; 및 DM4를 포함한다:
Figure pct00028
여기서, 물결선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 약물의 황 원자의 공유결합에 의한 부착 나타낸다 [WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1].
다른 예시적인 메이탄시노이드 항체-약물 접합체는 다음 구조 및 약어를 갖는다 (여기서 Ab는 항체이고, p는 1 내지 약 8임):
Figure pct00029
하나의 양태에서, 항체-약물 접합체는 DM4가 SPDB 링커를 통해 항체의 티올기에 연결된 것이다 [미국 특허 6913748 및 7276497, 이들의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨].
DM1이 BMPEO 링커를 통해 항체의 티올기에 연결된 예시적인 항체-약물 접합체는 다음 구조 및 약어를 갖는다:
Figure pct00030
여기서, Ab는 항체이고; n은 0, 1 또는 2이고; p는 1, 2, 3 또는 4이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 이의 제조 방법, 및 이들의 치료 용도는, 예를 들어 그 개시내용이 본원에 참조로 명백하게 포함되는 문헌 [Erickson, et al. (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; 미국 특허 5,208,020, 5,416,064, US 2005/0276812 A1 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1]에 개시되어 있다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다 (예를 들어, 그 개시 내용이 본원에 명백하게 참조로 포함되는 미국 특허 5,208,020 참조). 메이탄시노이드는 공지된 기술에 의해 합성하거나 천연 공급원으로부터 단리할 수 있다. 적합한 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 환 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어 다양한 메이탄시놀 에스테르가, 예를 들어 미국 특허 5,208,020, 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다.
예를 들어, 그 개시 내용이 본원에 명백하게 참조로 포함되는 문헌 [미국 특허 5208020; 유럽 특허 0 425 235 B1; Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); US 2005/016993 A1]에 개시된 것을 포함한, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위한, 많은 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 US 2005/0276812 A1 ("Antibody Drug Conjugates and Methods")에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 링커는 상기 확인된 특허에 개시된 바와 같은 디술피드기, 티오에테르기, 산불안정기, 광불안정기, 펩티다제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기를 포함한다. 추가의 링커를 본원에 기재하고 예시한다.
항체 및 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 특정 양태에서, 디술피드 연결기를 제공하기 위해 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) [Carlsson et al., Biochem . J. 173:723-737 (1978)] 또는 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)이다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결기는 통상적인 커플링 기술을 이용하여 하이드록실기와 반응시킴으로써 형성할 수 있다. 반응은 하이드록실기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 하이드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 한 양태에서, 연결기는 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
(2) 아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드성 유사체 또는 유도체, 예를 들어 아우리스타틴 [미국 특허 5635483; 5780588]에 접합된 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 [Woyke et al. (2001) Antimicrob . Agents and Chemother. 45(12):3580-3584], 항암 [미국 특허 5663149] 및 항진균 활성 [Pettit et al. (1998) Antimicrob . Agents Chemother . 42:2961-2965]을 갖는 것으로 밝혀졌다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 [WO 02/088172].
예시적인 아우리스타틴 양태는 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF [US 2005/0238649; Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623 (2004년 3월 28일), 이의 기술이 모두 참조로 명백히 포함됨]를 포함한다.
펩티드성 약물 모이어티는 하기 화학식 DE 및 DF 중에서 선택될 수 있다:
Figure pct00031
여기서, DE 및 DF의 물결선은 독립적으로 각각의 위치에서 항체 또는 항체-링커 성분에 대한 공유결합에 의한 부착 부위를 나타내고;
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나;
또는 R4 및 R5는 함께 화학식 -(CRaRb)n-의 카르보사이클릭 환을 형성하고, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보사이클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되고;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
각각의 R8은 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 또는 NR12이고, 여기서 R12는 C1-C8 알킬이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
각각의 R15는 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)nSO3-C1-C8 알킬이고;
각각의 R16은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)로부터 선택되고;
n은 0 내지 6의 정수이다.
한 양태에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고, R5는 -H 또는 메틸이다. 예시적인 양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이다.
또 다른 양태에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 -H이다.
또 다른 양태에서, 각각의 R8은 -OCH3이다.
예시적인 양태에서, R3 및 R4은 각각 이소프로필이고, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이고, 각각의 R8은 -OCH3이고, R9는 -H이다.
한 양태에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
한 양태에서, R10은 아릴이다.
예시적인 양태에서, R10은 -페닐이다.
예시적인 양태에서, Z가 -O-일 때, R11은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
한 양태에서, Z가 -NH일 때, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
다른 양태에서, Z가 -NH일 때, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
화학식 DE의 예시적인 아우리스타틴 양태는 MMAE이고, 여기서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 공유결합에 의한 부착 나타낸다:
Figure pct00032
화학식 DF의 예시적인 아우리스타틴 양태는 MMAF이고, 여기서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 공유결합에 의한 부착 나타낸다 ([US 2005/0238649; Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem . 17:114-124] 참조):
Figure pct00033
다른 예시적인 양태는 펜타펩티드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에서 페닐알라닌 카르복시 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물 [WO 2007/008848], 및 펜타펩티드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에서 페닐알라닌 측쇄 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물을 포함한다 [WO 2007/008603].
다른 약물 모이어티는 다음 MMAF 유도체들을 포함하고, 여기서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 공유결합에 의한 부착 나타낸다:
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
한 측면에서, 상기 제시한 바와 같은 트리에틸렌 글리콜 에스테르 (TEG)를 포함하고 이에 제한되지 않는 친수성기가 R11에서 약물 모이어티에 부착될 수 있다. 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 친수성기는 약물 모이어티의 내재화 및 비-응집화를 돕는다.
아우리스타틴/돌라스타틴 또는 이의 유도체를 포함하는 화학식 I의 ADC의 예시적인 양태는 문헌 [US 2005-0238649; Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124, 본원에 참조로 명백하게 포함됨]에 기재되어 있다. MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 예시적인 양태는 다음 구조 및 약어를 갖는다 (여기서, "Ab"는 항체이고; p는 1 내지 약 8이고, "Val-Cit" 또는 "vc"는 발린-시트룰린 디펩티드이고; "S"는 황 원자이다). 본원에서 황 연결된 ADC의 구조적 설명의 몇몇에서, 항체는 단지 황 연결 양상을 나타내도록 "Ab-S"로서 표시되며, 특정 황 원자가 다수의 링커-약물 모이어티를 보유하는 것을 나타내지 않는다. 다음 구조의 좌측 괄호는 또한 Ab와 S 사이의 황 원자의 좌측에 놓일 수 있고, 이는 본원 전체에서 설명된 본 발명의 ADC에 대해 동등한 설명일 것이다.
Figure pct00037
Figure pct00038
MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 예시적인 양태는 Ab-MC-PAB-MMAF 및 Ab-PAB-MMAF를 추가로 포함한다. 흥미롭게도, 단백 분해에 의해 절단가능하지 않은 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역접합체는 단백 분해에 의해 절단가능한 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역접합체에 대응하는 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 [Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem . 17:114-124]. 상기한 경우에, 약물 방출은 세포 내에서 항체 분해에 의해 이루어지는 것으로 생각된다.
전형적으로, 펩티드-기초 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에 잘 알려져 있는 액체상 합성 방법 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press]에 따라 제조할 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 문헌 [US 2005-0238649 A1; 미국 특허 5635483; 미국 특허 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am . Chem . Soc . 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti - Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem . Soc . Perkin Trans . 15:859-863 및 Doronina (2003) Nat . Biotechnol. 21(7):778-784]의 방법에 따라 제조할 수 있다.
특히, 화학식 DF의 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티, 예를 들어 MMAF 및 이의 유도체는 문헌 [US 2005-0238649 A1; Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem . 17:114-124]에 기재된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 화학식 DE의 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티, 예를 들어 MMAE 및 이의 유도체는 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat . Biotech . 21:778-784]에 기재된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 약물-링커 모이어티 MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, 및 MC-vc-PAB-MMAE는, 예를 들어 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784; 미국 특허 출원 공개 US 2005/0238649 A1]에 기재된 바와 같은 통상적인 방법으로 편리하게 합성한 후, 관심있는 항체에 접합할 수 있다.
(3) 칼리케아미신
다른 양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해서는 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 American Cyanamid Company)을 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1을 포함하고 이로 제한되지 않는다 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993); Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998); 및 상기 언급된 American Cyanamid Company의 미국 특허]. 항체가 접합될 수 있는 다른 항-종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 모두 세포내 작용 부위를 갖고, 형질막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체-매개된 내재화를 통한 이들 물질의 세포 내 흡수는 그들의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
c. 다른 세포독성제
항체에 접합될 수 있는 다른 항종양 물질은 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 제제의 패밀리, 및 에스페라미신 [미국 특허 5,877,296]을 포함한다.
사용할 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.
특정 양태에서, 면역접합체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합된 항체의 생성을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 면역접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 섬광조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)용 스핀 (spin) 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 면역접합체 내에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지가 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 [Fraker et al. (1978) Biochem . Biophys . Res . Commun . 80:49-57]을 이용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
특정 양태에서, 면역접합체는 프로드럭 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)을 활성 약물, 예를 들어 항암 약물로 전환시키는 프로드럭-활성화 효소에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 이러한 면역접합체는 항체 의존 효소 매개 프로드럭 요법 ("ADEPT")에서 유용하다. 항체에 접합될 수 있는 효소는 인산염 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 (serratia) 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 당화된 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 및 페니실린 G 아미다제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 효소는 당업계에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술에 의해 항체에 공유결합시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)]을 참조한다.
d. 약물 로딩
약물 로딩은 화학식 I의 분자에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수인 p로 표시된다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개의 약물 모이어티 (D)일 수 있다. 화학식 I의 ADC는 1 내지 20개의 약물 모이어티와 접합된 항체의 집합체를 포함한다. 접합 반응에 의한 ADC의 제조에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수는 통상적인 수단, 예를 들어 질량 분광분석, ELISA 분석, 및 HPLC에 의해 특성 분석될 수 있다. 또한, p의 측면에서 ADC의 정량적 분포를 결정할 수 있다. 일부 경우에, p가 다른 약물 로딩을 갖는 ADC로부터의 특정 값인 균질 ADC의 분리, 정제 및 특성 결정은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 화학식 I의 항체-약물 접합체의 약제학적 제제는 이러한 접합체의 1, 2, 3, 4개 이상의 약물 모이어티에 연결된 항체와의 불균질 혼합물일 수 있다.
일부 항체-약물 접합체에 대해, p는 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 예시적인 양태에서와 같이 부착이 시스테인 티올인 경우에, 항체는 단지 하나 또는 수개의 시스테인 티올기를 가질 수 있거나, 또는 링커가 부착할 수 있는, 충분히 반응성인 티올기를 단지 하나 또는 여러 개 가질 수 있다. 특정 양태에서, 보다 큰 약물 로딩, 예를 들어 p>5는 특정 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성 상실을 일으킬 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 ADC에 대한 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 또는 약 3 내지 약 5이다. 실제로, 특정 ADC에 대해, 항체당 약물 모이어티의 최적비는 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있음이 밝혀졌다. US 2005-0238649 A1을 참조한다.
특정 양태에서, 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는 예를 들어, 아래에 논의된 바와 같이 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올기를 함유하지 않고; 실제로 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디술피드 브릿지로서 존재한다. 특정 양태에서, 항체를 부분 또는 완전 환원 조건 하에 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 환원시켜 반응성 시스테인 티올기를 생성할 수 있다. 특정 양태에서, 항체는 반응성 친핵기, 예를 들어 리신 또는 시스테인을 드러낼 변성 조건에 적용된다.
ADC의 로딩 (약물/항체 비)은 상이한 방식, 예를 들어 (i) 항체에 대해 몰 과량의 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 제한, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형에 대한 부분 또는 제한 환원 조건에 의해 조절될 수 있다.
하나 초과의 친핵기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과, 이어서 약물 모이어티 시약과 반응하면, 생성되는 생성물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티의 분포를 갖는 ADC 화합물들의 혼합물이라는 것을 알 수 있을 것이다. 항체당 약물의 평균 수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정에 의해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개별 ADC 분자는 질량 분광분석에 의해 혼합물 중에서 확인되고, HPLC, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [McDonagh et al. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K. J., et al., "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al., "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004]을 참조한다. 특정 양태에서, 단일 로딩 값을 갖는 균질 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
e. 면역접합체의 특정 제조 방법
화학식 I의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하는 몇몇 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 항체의 친핵기를 이가 링커 시약과 반응시켜, 공유결합을 통해 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵기를 이가 링커 시약과 반응시켜, 공유결합을 통해 D-L을 형성시킨 후, 이를 항체의 친핵기와 반응시키는 방법. 두 번째 경로를 통해 화학식 I의 ADC를 제조하는 예시적인 방법은 본원에 참조로 명백하게 포함되는 US 2005-0238649 A1에 기재되어 있다.
항체 상의 친핵기는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 하이드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체는 당화된다)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 하이드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는, 항체가 완전히 또는 부분적으로 환원되도록 환원제, 예를 들어 DTT (디티오트레이톨) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)로 처리함으로써 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵기를 리신 잔기의 변형을 통해, 예를 들어 리신 잔기와 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)을 반응시켜 아민을 티올로 전환시켜 항체 내로 도입될 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4개 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조함으로써) 항체 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 또한 항체 상의 친전자기, 예를 들어 알데하이드 또는 케톤 카르보닐기와 링커 시약 또는 약물 상의 친핵기 사이의 반응에 의해 생성될 수 있다. 링커 시약 상의 유용한 친핵기는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 양태에서, 항체를 변형시켜 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입한다. 다른 양태에서, 당화된 항체의 당은, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜, 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 (Schiff) 염기 기는 안정한 연결기를 형성할 수 있거나, 예를 들어 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결기를 형성할 수 있다. 한 양태에서, 당화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데하이드 및 케톤) 기가 항체 내에 생성될 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 다른 양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 항체를 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신에 알데하이드를 생성할 수 있다 [Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852]. 이러한 알데하이드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응될 수 있다.
약물 모이어티 상의 친핵기는, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 상업적으로 이용가능한 다음 시판 가교결합제 시약 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL, U.S.A.)로부터의 것; [2003-2004 Applications Handbook and Catalog]의 467-498면 참조)을 사용하여 제조된 ADC를 명백히 고려하고 이로 제한되지 않는다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트).
항체 및 세포독성제를 포함하는 접합체는 또한 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO94/11026을 참조한다.
달리, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 분자는 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되거나 서로 인접해 있는 접합체의 항체 및 세포독성 부분을 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체는 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있으며, 여기서 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여된 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 접합체의 순환계로부터의 제거된 후, 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)가 투여된다.
예시적인 면역접합체 - Thio -항체 약물 접합체
a. 시스테인 조작된 항- FcRH5 항체의 제조
본 발명의 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체 및 모 항-FcRH5 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 DNA는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 부위-지시된 (또는 올리고뉴클레오티드-매개된) 돌연변이유발에 의한 제조 [Carter et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al. (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488; Liu et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260], PCR 돌연변이유발 [Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al. (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; 및 Vallette et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733], 및 폴리펩티드를 코딩하는 미리 제조된 DNA의 카세트 돌연변이유발 [Wells et al. (1985) Gene 34:315-323]을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 제조한다. 돌연변이유발 프로토콜, 키트, 및 시약은 상업적으로 이용가능하고, 예를 들어 QuikChange® 다중 부위 지시된 돌연변이유발 키트 (tratagene, La Jolla, CA)가 존재한다. 단일 돌연변이는 또한 PCR 기초 돌연변이유발에 의해 주형으로서 이중 가닥 플라스미드 DNA를 사용하는 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이유발에 의해서 생성된다 [Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al. (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500]. 재조합 항체의 변이체는 제한 단편 조작에 의해 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 중복 연장 (overlap extension) PCR에 의해서도 또한 제조될 수 있다. 돌연변이유발 프라이머는 시스테인 코돈 치환(들)을 코딩한다. 표준 돌연변이유발 기술을 이용하여 이러한 돌연변이체 시스테인 조작된 항체를 코딩하는 DNA를 생성할 수 있다 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N. Y., 1993].
파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553]을 사용하여, 항-FcRH5 인간 항체 및 항체 단편을 비면역화된 공여체로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 생성할 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트형 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주 또는 부 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임으로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이된다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 포함하므로, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이들 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 것이다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성의 일부를 모방한다 [Johnson et al. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571; Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Griffith et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; US 5565332; US 5573905; US 5567610; US 5229275].
항-FcRH5 항체는 공지의 올리고펩티드 합성 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 재조합 기술을 이용하여 제조하고 정제될 수 있다. 적절한 아미노산 서열, 또는 이의 일부는 고체상 기술을 이용하여 직접 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다 [Stewart et al., Solid - Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154]. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 이용하여 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 고체상 합성은, 예를 들어 t-BOC 또는 Fmoc 보호된 아미노산을 사용하고 Applied Biosystems 펩티드 합성기 (Foster City, CA)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행될 수 있다. 항-FcRH5 항체 또는 FcRH5 폴리펩티드의 다양한 부분들을 따로 화학적으로 합성하고, 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합함으로써 목적하는 항-FcRH5 항체 또는 FcRH5 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
항체 단편을 생성하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백 분해를 통해 유도되거나 [Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al. (1985) Science, 229:81], 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성되었다. Fab, Fv 및 ScFv 항-FcRH5 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비되어 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 본원에서 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 달리, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있거나 [Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167], 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항-FcRH5 항체는 (scFv) 단일쇄 Fv 단편일 수 있다 [WO 93/16185; US 5571894; US 5587458]. 항-FcRH5 항체 단편은 또한 "선형 항체"일 수 있다 [US 5641870]. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
아래의 설명은 주로 항-FcRH5-코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포를 배양함으로써 항-FcRH5 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 항-FcRH5 항체를 코딩하는 DNA는 항-FcRH5 항체 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 따라서, 인간 항-FcRH5 항체 또는 FcRH5 폴리펩티드 DNA는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득될 수 있다. 항-FcRH5 항체-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득될 수 있거나 공지의 합성 과정 (예를 들어, 자동 핵산 합성)에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 설계, 선택 및 제조 방법에 의해 친전자성 관능기와 반응성인 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체를 수득할 수 있다. 추가로 이들 방법에 의해 지정되고 설계된 선택적인 부위에서 약물 분자를 갖는 항체 접합체 화합물, 예를 들어 항체-약물 접합체 (ADC) 화합물이 수득될 수 있다. 항체 표면 상의 반응성 시스테인 잔기는 티올 반응기, 예를 들어 말레이미드 또는 할로아세틸을 통한 약물 모이어티의 특이적 접합을 허용한다. 말레이미드기에 대한 Cys 잔기의 티올 관능기의 친핵 반응성은 단백질 내의 임의의 다른 아미노산 관능기, 예를 들어 리신 잔기의 아미노기 또는 N-말단 아미노기에 비해 약 1000배 더 크다. 요오도아세틸 및 말레이미드 시약 내의 티올 특이적 관능기는 아민기와 반응할 수 있지만, 보다 높은 pH (>9.0) 및 보다 긴 반응 시간이 요구된다 [Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London]. 단백질 내의 유리 티올의 양은 표준 엘만 (Ellman) 분석에 의해 평가될 수 있다. 면역글로불린 M은 디술피드-연결된 펜타머의 예인 한편, 면역글로불린 G는 함께 하위단위를 결합시키는 내부 디술피드 브릿지를 갖는 단백질의 예이다. 이와 같은 단백질에서, 반응성 유리 티올을 생성하기 위해 디티오트레이톨 (DTT) 또는 셀레놀과 같은 시약 [Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304: 147-156]을 사용하여 디술피드 결합을 환원하는 것이 요구된다. 상기 방법은 항체 3차 구조 및 항원 결합 특이성을 상실시킬 수 있다.
PHESELECTOR (반응성 티올의 선택을 위한 파지 ELISA) 분석은 ELISA 파지 포맷으로 항체 내의 반응성 시스테인기 검출을 가능하게 함으로써 시스테인 조작된 항체의 설계에 도움이 될 수 있다 [Junutula, J.R. et al. (2008) J Immunol. Methods 332:41-52; WO 2006/034488; US 2007/0092940]. 시스테인 조작된 항체를 웰 표면에 코팅한 후, 파지 입자와 함께 인큐베이션하고, HRP 표지된 2차 항체를 첨가하고, 흡광도를 검출한다. 파지 상에 디스플레이된 돌연변이체 단백질은 신속하고 강력하고 고효율 방식으로 스크리닝될 수 있다. 시스테인 조작된 항체의 라이브러리가 제조되며, 항체 또는 다른 단백질의 무작위 단백질-파지 라이브러리로부터 유리 Cys 통합을 위한 적절하게 반응성인 부위를 확인하기 위한 것과 동일한 접근을 이용하여 결합 선택을 받을 수 있다. 상기 기술은 파지 상에 디스플레이된 시스테인 돌연변이체 단백질을 또한 티올-반응성인 친화도 시약 또는 리포터기와 반응시키는 것을 포함한다.
PHESELECTOR 분석은 항체 내의 반응성 티올기의 스크리닝을 허용한다. 이 방법에 의한 A121C 변이체의 확인은 예시적인 것이다. 전체 Fab 분자는 반응성 티올기를 갖는 보다 많은 ThioFab 변이체를 확인하기 위해 효과적으로 검색될 수 있다. 분획별 표면 접근성 (fractional surface accessibility) 파라미터를 사용하여 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기에 대한 용매의 접근성을 확인하고 정량하였다. 표면 접근성은 용매 분자, 예를 들어 물이 접촉할 수 있는 표면적 (Å2)으로 표현될 수 있다. 물의 점유 공간은 1.4 Å 반경 구체와 비슷하다. 소프트웨어는 공지의 x-선 결정학 유도된 좌표를 사용하여 단백질의 각각의 아미노산의 표면 접근성을 계산하기 위한 알고리즘을 이용하는 결정학 프로그램의 CCP4 Suite ["The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. D50:760-763]로서 무료로 사용가능하거나 허가를 받아 사용할 수 있거나 [Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825], 인터넷 www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html을 통해 사용가능하다. 표면 접근성 계산을 수행하는 2개의 예시적인 소프트웨어 모듈은 문헌 [B. Lee and F. M. Richards (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400]의 알고리즘을 기초로 한 "AREAIMOL" 및 "SURFACE"이다. AREAIMOL은 단백질의 용매 접근가능한 표면을 프로브 구 (용매 분자를 나타냄)의 중심의 궤적으로서 정의하는데, 이는 이것이 단백질의 판 데르 발스 (Van der Waals) 표면 위로 굴러다니기 때문이다. AREAIMOL은 (원자 반경과 프로브 반경의 합과 동일한, 원자 중심으로부터의 거리에서) 각각의 원자 주위의 연장된 구 상에 표면 지점을 생성하고 이웃하는 원자들과 회합된 동등한 구 내에 놓인 것을 제거하여 용매 접근가능한 표면적을 계산한다. AREAIMOL은 PDB 좌표 파일에서 원자의 용매 접근가능한 면적을 찾아내고, 잔기에 의해, 쇄에 의해 및 전체 분자에 대해 접근가능한 면적을 요약한다. 개별 원자에 대한 접근가능한 면적 (또는 면적 차이)은 슈도-PDB (pseudo-PDB) 출력 파일에 기록될 수 있다. AREAIMOL은 각각의 원소에 대해 단일 반경을 추정하고, 오직 제한된 수의 상이한 원소들만을 인식한다.
AREAIMOL 및 SURFACE는 절대적 접근성, 즉 제곱 옹스트롬(Å)의 수를 보고한다. 분획별 표면 접근성은 폴리펩티드 내의 아미노산과 관련된 표준 상태를 참조하여 계산된다. 참조 상태는 트리펩티드 Gly-X-Gly이고, 여기서 X는 관심있는 아미노산이고, 참조 상태는 '연장된' 입체형태, 즉, 베타-가닥으로 존재하는 것과 같아야 한다. 연장된 입체형태는 X의 접근성을 최대화한다. 접근가능한 면적을 Gly-X-Gly 트리펩티드 참조 상태 내의 접근가능한 면적으로 나누고 그 몫을 보고하는데, 이것이 분획별 접근성이다. 접근율 (％)은 분획별 접근성 × 100의 값이다. 표면 접근성 계산을 위한 또 다른 예시적 알고리즘은, 물 구체에 대한 아미노산 잔기의 분획별 접근성을 폴리펩티드의 X선 좌표에 기초하여 계산하는 프로그램 xsae의 SOLV 모듈에 기초한다 [Broger, C,F. Hoffman-LaRoche, Basel]. 항체 내의 모든 아미노산에 대한 분획별 표면 접근성은 이용가능한 결정 구조 정보를 이용하여 계산할 수 있다 [Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995].
시스테인 조작된 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리하고 서열 결정된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원 역할을 한다. 일단 단리된 후, DNA를 발현 벡터 내로 도입할 수 있고, 이어서 이를 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 항체 단백질을 생성하지 않는 다른 포유동물 숙주 세포, 예를 들어 골수종 세포 [US 5807715, US 2005/0048572, US2004/0229310]로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포 내에서 모노클로날 항체를 합성한다.
설계 및 선택 후에, 조작되고 고도로 반응성이고 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기인 "유리 시스테인 아미노산"을 갖는 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 ThioFab는, (i) 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이 시스템 [Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262; Plueckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188] 또는 포유동물 세포 배양 시스템 [WO 01/00245], 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에서의 발현, 및 (ii) 통상의 단백질 정제 기술을 이용한 정제 [Lowman et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988]를 통해 생성될 수 있다.
조작된 Cys 티올기는 친전자성 링커 시약 및 약물-링커 중간체와 반응하여, 시스테인 조작된 항체 약물 접합체 및 다른 표지된 시스테인 조작된 항체를 형성한다. 쌍을 이루어 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합을 형성하는 모 항체에 존재하는 시스테인 조작된 항체의 Cys 잔기는 임의의 반응성 티올기를 갖지 않고 (환원제로 처리하지 않으면), 친전자성 링커 시약 또는 약물-링커 중간체와 반응하지 않는다. 새로 조작된 Cys 잔기는 쌍을 이루지 않은 채로 유지되어, 친전자성 링커 시약 또는 약물-링커 중간체, 예를 들어 약물-말레이미드와 반응, 즉 접합할 수 있다. 예시적인 약물-링커 중간체는 MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE, 및 MC-vc-PAB-MMAF를 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 조작된 Cys 잔기의 구조적 위치는 순차적 넘버링 시스템에 따라 넘버링한다. 이 순차적 넘버링 시스템은 N-말단에서 출발하는 카바트 넘버링 시스템 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]과 상관관계가 있으며, 이는 a, b, c로 표시한 삽입이 카바트 넘버링 방식 (아래쪽 열)과 다르다. 카바트 넘버링 시스템의 사용시, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 이 내부로의 삽입에 대응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 시스테인 조작된 중쇄 변이체 부위는 순차적 넘버링 및 카바트 넘버링 방식에 의해 확인된다.
한 양태에서, 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는
(a) 모 항-FcRH5 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 치환하고;
(b) 시스테인 조작된 항체를 티올-반응성 시약과 반응시켜, 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체의 티올 반응성을 결정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
시스테인 조작된 항체는 티올-반응성 시약에 대하여 모 항체보다 더욱 반응성일 수 있다.
유리 시스테인 아미노산 잔기는 중쇄 또는 경쇄에, 또는 불변 또는 가변 도메인에 위치될 수 있다. 항체 단편, 예를 들어 Fab도 항체 단편의 아미노산을 치환하는 하나 이상의 시스테인 아미노산으로 조작되어 시스테인 조작된 항체 단편을 형성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는
(a) 하나 이상의 시스테인 아미노산을 모 항-FcRH5 항체 내로 도입하여 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체를 생성하고;
(b) 티올-반응성 시약을 사용하여 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성을 결정하는 단계를 포함하고; 여기서 시스테인 조작된 항체가 티올-반응성 시약에 대하여 모 항체보다 더욱 반응성인, 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체를 제조하는 (만드는) 방법을 제공한다. 시스테인 조작된 항체를 제조하는 방법의 단계 (a)는
(i) 시스테인 조작된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 돌연변이시키고;
(ii) 시스테인 조작된 항체를 발현시키고;
(iii) 시스테인 조작된 항체를 단리하고 정제하는 것을 포함할 수 있다.
시스테인 조작된 항체를 제조하는 방법의 단계 (b)는 파지 또는 파지미드 입자로부터 선택되는 바이러스 입자 상에 시스테인 조작된 항체를 발현시키는 것을 포함할 수 있다.
시스테인 조작된 항체를 제조하는 방법의 단계 (b)는 또한
(i) 시스테인 조작된 항체를 티올-반응성 친화도 시약과 반응시켜 친화도 표지된, 시스테인 조작된 항체를 생성하고;
(ii) 친화도 표지된, 시스테인 조작된 항체의 포획 매질 (capture media)에 대한 결합을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는
(a) 하나 이상의 시스테인 아미노산을 모 항체 내로 도입하여 시스테인 조작된 항체를 생성하고;
(b) 시스테인 조작된 항체를 티올-반응성 친화도 시약과 반응시켜 친화도 표지된, 시스테인 조작된 항체를 생성하고;
(c) 친화도 표지된, 시스테인 조작된 항체의 포획 매질에 대한 결합을 측정하고;
(d) 티올-반응성 시약을 사용하여 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성을 결정하는 단계를 포함하는, 티올 반응성에 대해 고도로 반응성인 쌍을 이루지 않은 시스테인 아미노산을 갖는 시스테인 조작된 항체를 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.
시스테인 조작된 항체를 스크리닝하는 방법의 단계 (a)는
(i) 시스테인 조작된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 돌연변이시키고;
(ii) 시스테인 조작된 항체를 발현시키고;
(iii) 시스테인 조작된 항체를 단리하고 정제하는 것을 포함할 수 있다.
시스테인 조작된 항체를 스크리닝하는 방법의 단계 (b)는 파지 또는 파지미드 입자로부터 선택되는 바이러스 입자 상에 시스테인 조작된 항체를 발현시키는 것을 포함할 수 있다.
시스테인 조작된 항체를 스크리닝하는 방법의 단계 (b)는 또한
(i) 시스테인 조작된 항체를 티올-반응성 친화도 시약과 반응시켜 친화도 표지된, 시스테인 조작된 항체를 생성하고;
(ii) 친화도 표지된, 시스테인 조작된 항체의 포획 매질에 대한 결합을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
b. 항- FcRH5 IgG 변이체의 시스테인 조작
시스테인은 본원에 기재된 시스테인 조작 방법에 의해 중쇄 118 (EU 넘버링) (순차적 넘버링의 중쇄 위치 118에 해당) 부위에서 전장 키메라 모 모노클로날 항-FcRH5 항체에, 또는 경쇄 205 (카바트 넘버링) (순차적 넘버링의 경쇄 위치 209에 해당) 부위에서 전장 키메라 모 모노클로날 항-FcRH5 항체에 도입하였다.
생성된 중쇄 118 (EU 넘버링)에서 시스테인을 갖는 시스테인 조작된 항체는 (a) 중쇄 서열 (서열 번호 42)과 경쇄 서열 (서열 번호 41)을 갖는 thio-hu10A8v1-HC(A118C) (도 12)였다.
생성된 경쇄 205 (카바트 넘버링)에서 시스테인을 갖는 시스테인 조작된 항체는 (a) 중쇄 서열 (서열 번호 44)와 경쇄 서열 (서열 번호 43)을 갖는 thio-hu10A8v1-LC(V205C) (도 13)였다.
이들 시스테인 조작된 모노클로날 항체를 1 mM 시스테인을 함유하는 배지 내에서 일시적 발효에 의해 CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포에서 발현시켰다.
c. 표지된 시스테인 조작된 항- FcRH5 항체
시스테인 조작된 항-FcRH5 항체는 부위-특이적으로 및 효율적으로 티올-반응성 시약과 커플링될 수 있다. 티올-반응성 시약은 다관능성 링커 시약, 포획, 즉 친화도, 표지 시약 (예를 들어, 바이오틴-링커 시약), 검출 표지 (예를 들어, 형광단 시약), 고체상 고정 시약 (예를 들어, SEPHAROSE™, 폴리스티렌, 또는 유리), 또는 약물-링커 중간체일 수 있다. 티올-반응성 시약의 한 예는 N-에틸 말레이미드 (NEM)이다. 예시적인 양태에서, ThioFab와 바이오틴-링커 시약을 반응시키면 조작된 시스테인 잔기의 존재 및 반응성을 검출 및 측정할 수 있는 바이오티닐화 ThioFab을 제공한다. ThioFab와 다관능성 링커 시약을 반응시키면 약물 모이어티 시약 또는 다른 표지와 추가로 반응할 수 있는 관능성 링커를 갖는 ThioFab을 제공한다. ThioFab와 약물-링커 중간체을 반응시키면 ThioFab 약물 접합체를 제공한다.
본원에 기재된 예시적인 방법은 일반적으로 항체의 확인 및 생성에, 보다 일반적으로는 본원에 설명된 설계 및 스크리닝 단계의 적용을 통해 다른 단백질에 적용될 수 있다.
이러한 접근은, 반응성기가, 예를 들어 말레이미드, 요오도아세트아미드, 피리딜 디술피드, 또는 다른 티올-반응성 접합 파트너인 다른 티올-반응성 시약의 접합에 적용될 수 있다 [Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671]. 티올-반응성 시약은 약물 모이어티, 형광단, 예를 들어 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 염료, 영상화 또는 방사성 요법 금속에 대한 킬레이팅제, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지 또는 검출 택, 또는 소실-변형제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체, 제3 성분에 결합하는 펩티드, 또는 다른 탄수화물 또는 친지질성 물질일 수 있다.
d. 시스테인 조작된 항- FcRH5 항체의 용도
시스테인 조작된 항-FcRH5 항체, 및 이의 접합체는 치료제 및/또는 진단제로서 사용될 수 있다. 본 발명은 추가로 B-세포 관련 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 예방, 관리, 치료 또는 개선 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 세포 증식성 장애, 예를 들어 암, 예를 들어, 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종과 연관된 하나 이상의 증상의 예방, 관리, 치료 또는 개선 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 FcRH5 관련 질환 또는 상기 장애를 발병할 소인의 진단 방법, 및 B 세포-연관 FcRH5 폴리펩티드에 우선적으로 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편의 확인 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 B 세포 관련 질환에 반응성인 상태의 치료에서 유용한 의약의 제조를 위한 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체의 용도에 관한 것이다.
e. 시스테인 조작된 항체 약물 접합체 ( Thio -항체 약물 접합체 ( TDC ))
본 발명의 또 다른 측면은 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체 (Ab), 및 아우리스타틴 약물 모이어티 (D)를 포함하는, 하기 화학식 I의 항체-약물 접합체 화합물에 관한 것이고, 여기서 시스테인 조작된 항체는 링커 모이어티 (L)에 의해 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산을 통해 D에 부착된다:
Figure pct00039
I
여기서, p는 1, 2, 3, 또는 4이고; 시스테인 조작된 항체는 모 항-FcRH5 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산으로 교체하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된다.
본 발명의 다른 측면은 화학식 I의 항체-약물 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물이고, 여기서 항체당 평균 약물 로딩은 약 2 내지 약 5, 또는 약 3 내지 약 4이다.
시스테인 조작된 항-FcRH5 항체 약물 접합체의 잠재적인 이점은 개선된 안전성 (보다 큰 치료 지수), 개선된 PK 파라미터를 포함하여, 접합체를 안정화시키고 이의 활성 결합 입체형태를 보유할 수 있는 항체 쇄간 디술피드 결합이 보유되고, 약물 접합 부위가 제한되며, 시스테인 조작된 항체의 약물-링커 시약에 대한 접합으로부터 시스테인 조작된 항체 약물 접합체를 제조함으로써 생성물이 더욱 균질해진다.
링커
"링커", "링커 단위", 또는 "연결하다"는 항체를 약물 모이어티에 공유결합에 의해 부착시키는 공유결합 또는 원자의 쇄를 포함하는 화학적 모이어티를 의미한다. 다양한 양태에서, 링커는 L로 표시된다. "링커" (L)은 하나 이상의 약물 모이어티 (D) 및 항체 단위 (Ab)를 연결하여 화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있는 이관능성 또는 다관능성 모이어티이다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 약물 및 항체에 결합하기 위한 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조할 수 있다. 시스테인 조작된 항체 (Ab)의 시스테인 티올은 링커 시약, 약물 모이어티 또는 약물-링커 중간체의 친전자성 관능기와 결합을 형성할 수 있다.
한 측면에서, 링커는 항체 상에 존재하는 친핵 시스테인에 반응성인 친전자기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체의 시스테인 티올은 링커 상의 친전자기와 반응성이고, 링커에 대한 공유결합을 형성한다. 유용한 친전자기는 말레이미드 및 할로아세트아미드기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
링커는 알킬디일, 아릴렌, 헤테로아릴렌과 같은 이가 라디칼, -(CR2)nO(CR2)n-, 알킬옥시의 반복 단위(예를 들어, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시), 및 알킬아미노 (예를 들어, 폴리에틸렌아미노, Jeffamine™)와 같은 모이어티; 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트, 및 카프로아미드를 포함하는 이산 에스테르 및 아미드를 포함한다.
시스테인 조작된 항체는 문헌 [Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773]의 766면의 접합 방법에 따라 링커 시약 또는 약물-링커 중간체, 친전자성 관능기, 예를 들어 말레이미드 또는 α-할로 카르보닐과 반응한다.
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 이루어질 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe" 또는 "af"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB"), 하나 이상의 반복 단위로서의 에틸렌옥시 -CH2CH2O- ("EO" 또는 "PEO")를 포함한다. 추가의 링커 성분은 당업계에 공지되어 있고, 일부는 본원에 기재된다.
한 양태에서, ADC의 링커 L은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00040
상기 식에서, -A-는 항체 (Ab)의 시스테인 티올에 공유결합에 의해 부착된 스트레쳐 단위이고;
a는 0 또는 1이고;
각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위이고;
w는 독립적으로 0 내지 12의 정수이고;
-Y-는 약물 모이어티에 공유결합에 의해 부착된 스페이서 단위이고;
y는 0, 1, 또는 2이다.
스트레쳐 단위
스트레쳐 단위 (-A-)는 존재하는 경우, 항체 단위를 아미노산 단위 (-W-)에 연결시킬 수 있다. 이와 관련하여, 항체 (Ab)는 스트레쳐의 관능기와 결합을 형성할 수 있는 관능기를 갖는다. 자연적으로 또는 화학 조작을 통해 항체 상에 존재할 수 있는 유용한 관능기는 술프하이드릴 (-SH), 아미노, 하이드록실, 카르복시, 탄수화물의 아노머 하이드록실기, 및 카르복실을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 측면에서, 항체 관능기는 술프하이드릴 또는 아미노이다. 술프하이드릴기는 항체의 분자내 디술피드 결합의 환원에 의해 생성될 수 있다. 달리, 술프하이드릴기는 2-이미노티올란 (트라우트 시약) 또는 다른 술프하이드릴 생성 시약을 사용한 항체의 리신 모이어티의 아미노기의 반응에 의해 생성될 수 있다. 한 양태에서, 항체 (Ab)는 스트레쳐 단위의 친전자성 관능기와 결합을 형성할 수 있는 유리 시스테인 티올기를 갖는다. 화학식 I의 접합체에서 예시적인 스트레쳐 단위는 화학식 II 및 III에 도시되고, 여기서 Ab-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의된 바와 같고, R17은 (CH2)r, -C3-C8 카르보사이클릴, -O-(CH2)r, 아릴렌, (CH2)r-아릴렌-, -아릴렌-(CH2)r-, (CH2)r-(C3-C8 카르보사이클릴), -(C3-C8 카르보사이클릴)-(CH2)r, -C3-C8 헤테로사이클릴, (CH2)r-(C3-C8 헤테로사이클릴), -(C3-C8 헤테로사이클릴)-(CH2)r, -(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-, -(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, 및 -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-로부터 선택되는 이가 라디칼이고; 여기서 Rb는 H, C1-C6 알킬, 페닐, 또는 벤질이고; r은 독립적으로 1-10의 정수이다.
아릴렌은 방향족 환계로부터 2개의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 6-20개 탄소 원자의 이가 방향족 탄화수소 라디칼을 포함한다. 전형적인 아릴렌기는 벤젠, 치환 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
헤테로사이클릴기는 하나 이상의 환 원자가 헤테로원자, 예를 들어, 질소, 산소, 및 황인 환계를 포함한다. 헤테로사이클 라디칼은 탄소 원자 1 내지 20개, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개를 포함한다. 헤테로사이클은 3 내지 7개의 환 원을 갖는 모노사이클 (탄소 원자 2 내지 6개, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개)일 수 있거나, 또는 7 내지 10개의 환 원을 갖는 바이사이클 (탄소 원자 4 내지 9개, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개), 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로사이클은 문헌 [Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 특히 제1, 3, 4, 6, 7, 및 9장; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 제13, 14, 16, 19 및 28권; 및 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다.
헤테로사이클의 예는 피리딜, 디하이드로피리딜, 테트라하이드로피리딜 (피페리딜), 티아졸릴, 테트라하이드로티오페닐, 황 산화 테트라하이드로티오페닐, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌릴, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐, 피롤리닐, 테트라하이드로푸라닐, 비스-테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 비스-테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥타하이드로이소퀴놀리닐, 아조시닐, 트리아지닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 티에닐, 티안트레닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 페녹사티닐, 2H-피롤릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 1H-인다졸릴, 푸리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 시놀리닐, 프테리디닐, 4Ah-카르바졸릴, 카르바졸릴, β-카르볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴누클리디닐, 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 벤조트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 옥신돌릴, 벤족사졸리닐 및 이사티노일을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
카르보사이클릴기는 모노사이클로서 탄소 원자 3 내지 7개, 또는 바이사이클로서 탄소 원자 7 내지 12개를 갖는 포화 또는 불포화 환을 포함한다. 모노사이클릭 카르보사이클은 환 원자 3 내지 6개, 보다 일반적으로 환 원자 5 또는 6개를 갖는다. 바이사이클릭 카르보사이클은, 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 7 내지 12개의 환 원자, 또는 바이사이클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 9 또는 10개의 환 원자를 갖는다. 모노사이클릭 카르보사이클의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐, 1-사이클로헥스-3-에닐, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸을 포함한다.
화학식 I의 ADC의 모든 예시적인 양태, 예를 들어 화학식 II 내지 VI로부터, 명확하게 도시되지 않은 경우에도, 조작된 시스테인 잔기의 수에 따라 1 내지 4개의 약물 모이어티가 항체 (p = 1-4)에 연결된다는 것을 알 수 있을 것이다.
<화학식 II>
Figure pct00041
<화학식 III>
Figure pct00042
화학식 II의 예시적인 스트레쳐 단위는 R17이 -(CH2)5-이고, 말레이미도-카프로일 (MC)로부터 유도된다:
Figure pct00043
R17이 -(CH2)2-이고, 말레이미도-프로파노일 (MP)로부터 유도된 화학식 II의 예시적인 스트레쳐 단위:
Figure pct00044
R17이 -(CH2CH2O)r-CH2-이고, r이 2인 화학식 II의 예시적인 또 다른 스트레쳐 단위:
Figure pct00045
R17이 -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-이고, Rb가 H이고 각각의 r이 2인 또 다른 화학식 II의 예시적인 다른 스트레쳐 단위:
Figure pct00046
R17이 -(CH2)5-인 화학식 III의 예시적인 스트레쳐 단위:
Figure pct00047
다른 양태에서, 스트레쳐 단위는 항체의 조작된 시스테인 황 원자와 스트레쳐 단위의 황 원자 간의 디술피드 결합을 통해 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체에 연결된다. 상기 양태의 대표적인 스트레쳐 단위는 하기 화학식 IV에 도시되고, 여기서 R17, Ab-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의된 바와 같다.
<화학식 IV>
Figure pct00048
또 다른 양태에서, 스트레쳐의 반응기는 항체의 유리 시스테인 티올과 결합을 형성할 수 있는 티올-반응성 관능기를 함유한다. 티올-반응성 관능기의 예는 말레이미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르, 예를 들어 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 양태의 대표적인 스트레쳐 단위는 하기 화학식 Va 및 Vb에 도시되고, 여기서 -R17-, Ab-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의된 바와 같다.
<화학식 Va>
Figure pct00049
<화학식 Vb>
Figure pct00050
다른 양태에서, 링커는 하나 초과의 약물 모이어티를 분지화 다관능성 링커 모이어티를 통해 항체에 공유결합에 의해 부착시키기 위한 수지상 유형의 링커일 수 있다 [Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43: 1987-1990]. 수지상 링커는 ADC의 효능과 관계가 있는 약물 대 항체의 몰비, 즉 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 시스테인 조작된 항체가 단지 하나의 반응성 시스테인 티올기를 보유하는 경우에는, 다수의 약물 모이어티를 수지상 링커를 통하여 부착시킬 수 있다.
아미노산 단위
링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 단위 (-Ww-)는 존재하는 경우에 본 발명의 시스테인 조작된 항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)에 항체 (Ab)를 연결시킨다.
-Ww-는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 단위이다. 아미노산 단위를 포함하는 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산, 및 또한 소수의 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린을 포함한다. 각각의 -W- 단위는 독립적으로 하기 꺾쇠 괄호 내에 표시된 화학식으로 표시되고, w는 0 내지 12의 정수이다:
Figure pct00051
상기 식에서, R19는 수소, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, 벤질, p-하이드록시벤질, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-피리딜메틸-, 3-피리딜메틸-, 4-피리딜메틸-, 페닐, 사이클로헥실,
Figure pct00052
이다.
R19가 수소 이외의 다른 기인 경우에, R19가 부착되는 탄소 원자는 키랄이다. R19가 부착되는 각각의 탄소 원자는 독립적으로 (S) 또는 (R) 입체형태, 또는 라세미 혼합물로 존재한다. 따라서, 아미노산 단위는 거울상 이성질체적으로 순수하거나, 라세미체, 또는 부분 입체 이성질체일 수 있다.
예시적인 -Ww-아미노산 단위는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 포함된다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연 발생 아미노산 잔기, 및 소수의 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린을 포함한다.
아미노산 단위는 종양-연관 프로테아제를 포함한 하나 이상의 효소에 의해 효소적으로 절단되어 약물 모이어티 (-D)를 방출시킬 수 있으며, 한 양태에서, 이는 방출시에 생체내에서 양성자첨가되어 약물 (D)를 제공한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-연관 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 이의 선택성을 고려하여 설계되고 최적화될 수 있다.
스페이서 단위
스페이서 단위 (-Yy-)는 존재하는 경우 (y = 1 또는 2), 아미노산 단위가 존재할 때 (w = 1-12) 아미노산 단위 (-Ww-)를 약물 모이어티 (D)에 연결시킨다. 달리, 스페이서 단위는 아미노산 단위가 부재할 때 스트레쳐 단위를 약물 모이어티에 연결시킨다. 아미노산 단위 및 스트레쳐 단위가 모두 부재할 때 (w, y = 0), 스페이서 단위는 또한 약물 모이어티를 항체 단위에 연결시킨다. 스페이서 단위는 자가 희생적 및 비-자가 희생적의 두 유형이 존재한다. 비-자가 희생적 스페이서 단위는 항체-약물 접합체 또는 약물 모이어티-링커로부터 아미노산 단위의 절단, 특히 효소적 절단 후에 일부 또는 모든 스페이서 단위가 약물 모이어티에 결합된 상태로 유지되는 단위이다. 글리신-글리신 스페이서 단위 또는 글리신 스페이서 단위를 포함하는 ADC가 종양 세포 연관 프로테아제, 암 세포 연관 프로테아제 또는 림프구 연관 프로테아제를 통한 효소적 절단을 거칠 경우, 글리신-글리신-약물 모이어티 또는 글리신-약물 모이어티는 Ab-Aa-Ww-로부터 절단된다. 한 양태에서, 독립적인 가수분해 반응이 표적 세포 내에서 일어나, 글리신-약물 모이어티 결합을 절단하여 약물을 방출시킨다.
다른 양태에서, -Yy-는 이의 페닐렌 부분이 Qm으로 치환된 p-아미노벤질카르바모일 (PAB) 단위이고, 여기서 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0-4의 정수이다.
비-자가 희생적 스페이서 단위 (-Y-)의 예시적인 양태는 -Gly-Gly-; -Gly-; -Ala-Phe-; -Val-Cit-이다.
한 양태에서, 스페이서 단위가 부재하는 (y=0) 약물 모이어티-링커 또는 ADC, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
달리, 자가 희생적 스페이서 단위를 포함하는 ADC는 -D를 방출할 수 있다. 한 양태에서, -Y-는 PAB기의 아미노 질소 원자를 통해 -Ww-에 연결되고 카르보네이트, 카르바메이트 또는 에테르기를 통해 -D에 직접 연결된 PAB기이고, 여기서 ADC는 다음 예시적인 구조를 갖는다:
Figure pct00053
여기서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0-4의 정수이고, p는 1 내지 4이다.
자가 희생적 스페이서의 다른 예는 PAB기에 전자적으로 유사한 방향족 화합물, 예를 들어 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 [Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237], 헤테로사이클릭 PAB 유사체 [US 2005/0256030], 베타-글루쿠로나이드 [WO 2007/011968], 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아미드 결합 가수분해시에 환화되는 스페이서, 예를 들어 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 [Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223]; 적절하게 치환된 바이사이클로[2.2.1] 및 바이사이클로[2.2.2] 환계 [Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815]; 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 [Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867]를 사용할 수 있다. 글리신에서 치환된 아민-함유 약물의 제거 [Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447]도 또한 ADC에서 유용한 자가 희생적 스페이서의 예이다.
예시적인 스페이서 단위 (-Yy-)는 화학식 X 내지 XII로 표시된다:
Figure pct00054
수지상 링커
다른 양태에서, 링커 L은 1개 초과의 약물 모이어티를 분지화 다관능성 링커 모이어티를 통해 항체에 공유결합에 의해 부착시키기 위한 수지상 유형의 링커일 수 있다 [Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768]. 수지상 링커는 ADC의 효능과 관계가 있는 약물 대 항체의 몰비, 즉 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 시스테인 조작된 항체가 단지 하나의 반응성 시스테인 티올기를 보유하는 경우에는, 다수의 약물 모이어티를 수지상 링커를 통하여 부착시킬 수 있다. 분지형 수지상 링커의 예시적인 양태는 2,6-비스(하이드록시메틸)-p-크레졸 및 2,4,6-트리스(하이드록시메틸)-페놀 덴드리머 단위를 포함한다 [WO 2004/01993; Szalai et al. (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125: 15688-15689; Shamis et al. (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499].
한 양태에서, 스페이서 단위는 2-(4-아미노벤질리덴)프로판-1,3-디올 덴드리머 단위 [WO 2004/043493; de Groot et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494]를 포함하는, 아래에 제시된 구조를 갖는 분지된 비스(하이드록시메틸)스티렌 (BHMS)이고, 이것은 다수의 약물을 도입하고 방출시키기 위해 사용될 수 있다:
Figure pct00055
여기서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4의 정수이고, n은 0 또는 1이고; p는 1 내지 4이다.
화학식 I의 항체-약물 접합체 화합물의 예시적인 양태는 화학식 XIIIa (MC), XIIIb (val-cit), XIIIc (MC-val-cit), 및 XIIId (MC-val-cit-PAB)의 화합물을 포함한다:
Figure pct00056
Figure pct00057
화학식 Ia의 항체-약물 접합체 화합물의 다른 예시적인 양태는 하기 화학식 XIVa-e의 화합물을 포함한다:
Figure pct00058
Figure pct00059
여기서, X는
Figure pct00060
이고,
Y는
Figure pct00061
이고,
R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이다.
다른 양태에서, 링커는 항체 상에 존재하는 친전자기에 반응성인 친핵기를 갖는 반응성 관능기를 갖는다. 항체 상의 유용한 친전자기는 알데하이드 및 케톤 카르보닐기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 링커의 친핵기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자기와 반응하여 항체 단위에 공유결합을 형성할 수 있다. 링커 상의 유용한 친핵기는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항체 상의 친전자기는 링커에 대한 편리한 부착 부위를 제공한다.
전형적으로, 펩티드형 링커는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에 잘 알려져 있는 액상 합성 방법 [E. Schroeder and K. Luebke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press]에 따라 제조할 수 있다. 링커 중간체는 스페이서, 스트레쳐 및 아미노산 단위를 포함하는 반응물의 임의의 조합 또는 순서와 조립될 수 있다. 스페이서, 스트레쳐 및 아미노산 단위는 특성상 친전자성, 친핵성, 또는 유리 라디칼인 반응성 관능기를 사용할 수 있다. 반응성 관능기는 카르복실, 하이드록실, 파라-니트로페닐카르보네이트, 이소티오시아네이트, 및 이탈기, 예를 들어 O-메실, O-토실, -Cl, -Br, -I; 또는 말레이미드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, 하전된 치환체, 예를 들어 술포네이트 (-SO3 -) 또는 암모늄은 시약의 수용성을 증가시키고, 링커 시약과 항체 또는 약물 모이어티와의 커플링 반응을 용이하게 하거나, 또는 ADC 제조에 사용되는 합성 경로에 따라 Ab-L (항체-링커 중간체)과 D, 또는 D-L (약물-링커 중간체)과 Ab와의 커플링 반응을 용이하게 할 수 있다.
링커 시약
항체 및 아우리스타틴의 접합체는 다양한 이관능성 링커 시약, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다.
항체 약물 접합체는 또한 링커 시약: 즉, BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트), 및 비스-말레이미드 시약; 즉, DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜 BM(PEO)2), 및 및 1,11-비스-말레이미도트리에틸렌글리콜 (BM(PEO)3) (이는 Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific (Rockford, IL) 및 다른 시약 공급처로부터 상업적으로 이용가능함)을 사용하여 제조할 수 있다. 비스-말레이미드 시약은 시스테인 조작된 항체의 티올기를 순차적 또는 동시 방식으로, 티올-함유 약물 모이어티, 표지 또는 링커 중간체에 부착시킬 수 있게 한다. 시스테인 조작된 항체의 티올기, 약물 모이어티, 표지, 또는 링커 중간체와 반응성인, 말레이미드 이외의 다른 관능기는 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
Figure pct00062
유용한 링커 시약은 또한 다른 공급처, 예를 들어 Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO)를 통해 입수할 수 있거나, 또는 문헌 [Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7: 180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; WO 04/032828]에 설명된 절차에 따라 합성할 수 있다.
화학식 IIIa의 스트레쳐는 하기 링커 시약을 아미노산 단위의 N-말단과 반응시킴으로써 링커 내로 도입할 수 있다:
Figure pct00063
(여기서, n은 1 내지 10의 정수이고, T는 -H 또는 -SO3Na이다),
Figure pct00064
(여기서, n은 0 내지 3의 정수이다);
Figure pct00065
스트레쳐 단위는 하기 이관능성 시약을 아미노산 단위의 N-말단과 반응시킴으로써 링커 내로 도입할 수 있다:
Figure pct00066
여기서, X는 Br 또는 I이다.
스트레쳐 단위는 또한 하기 이관능성 시약을 아미노산 단위의 N-말단과 반응시킴으로써 링커 내로 도입할 수 있다:
Figure pct00067
말레이미드 스트레쳐 및 파라-아미노벤질카르바모일 (PAB) 자가 희생적 스페이서를 갖는 예시적인 발린-시트룰린 (val-cit 또는 vc) 디펩티드 링커 시약은 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00068
말레이미드 스트레쳐 단위 및 PAB 자가 희생적 스페이서 단위를 갖는 예시적인 phe-lys(Mtr, 모노-4-메톡시트리틸) 디펩티드 링커 시약은 문헌 [Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60]에 따라 제조할 수 있고, 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00069

시스테인 조작된 항- FcRH5 항체-약물 접합체의 제조
화학식 I의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여 몇몇 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 시스테인 조작된 항체의 시스테인기를 링커 시약과 반응시켜, 공유결합을 통해 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 활성화된 약물 모이어티 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵기를 링커 시약과 반응시켜, 공유결합을 통해 약물-링커 중간체 D-L을 형성시킨 후, 이를 시스테인 조작된 항체의 시스테인기와 반응시키는 방법. 접합 방법 (1) 및 (2)에서는 다양한 시스테인 조작된 항체, 약물 모이어티 및 링커를 사용하여 화학식 I의 항체-약물 접합체를 제조할 수 있다.
항체 시스테인 티올기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기; 및 (iv) 디술피드, 예를 들어 피리딜 디술피드를 포함하는, 링커 시약 및 약물-링커 중간체 상의 친전자기와 술피드 교환을 통해 공유결합을 형성할 수 있다. 약물 모이어티 상의 친핵기는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
시스테인 조작된 항체는 환원제, 예를 들어 DTT (클레란드 (Cleland) 시약, 디티오트레이톨) 또는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염; [Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80]; Soltec Ventures (Beverly, MA)로 처리한 후, 재산화시켜 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합을 재형성함으로써 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다 (실시예 5). 예를 들어, CHO 세포에서 발현시킨 전장 시스테인 조작된 모노클로날 항체 (ThioMab)를 약 50배 몰과량의 TCEP로 3시간 동안 37℃에서 환원시켜, 새로 도입된 시스테인 잔기와 배양 배지 내에 존재하는 시스테인 사이에 형성할 수 있는 시스테인 부가물 내의 디술피드 결합을 환원시킨다. 환원된 ThioMab을 희석하고, 10 mM 아세트산나트륨 (pH 5) 중의 HiTrap S 컬럼에 로딩하고, 0.3M 염화나트륨을 함유하는 PBS로 용출시킨다. 디술피드 결합은 실온에서 철야로 묽은 (200 nM) 수성 황산구리 (CuSO4)를 사용하여 모 Mab 내에 존재하는 시스테인 잔기들 사이에서 재확립되었다. 달리, 데하이드로아스코르브산 (DHAA)이 시스테인 부가물의 환원적 절단 후에 시스테인 조작된 항체의 쇄내 디술피드기를 재확립하는데 효과적인 산화제이다. 당업계에 공지된 다른 산화제 및 산화 조건을 사용할 수 있다. 주변 공기 산화가 또한 효과적이다. 상기 약한 부분 재산화 단계는 높은 정확도로 쇄내 디술피드를 효율적으로 형성하고, 새로 도입된 시스테인 잔기의 티올기를 보존한다. 약 10배 과량의 약물-링커 중간체, 예를 들어 MC-vc-PAB-MMAE를 첨가하고, 혼합하고, 약 1시간 동안 실온에서 정치시켜 접합을 수행하고 항-FcRH5 항체-약물 접합체를 형성시켰다. 접합 혼합물을 겔 여과하고, HiTrap S 컬럼에 로딩하고 그를 통해 용출시켜 과잉의 약물-링커 중간체 및 다른 불순물을 제거하였다.
접합을 위한 세포 배양물로부터 발현된 시스테인 조작된 항체를 제조하기 위한 일반적인 공정은 하기와 같다. 세포 배양 배지가 시스테인을 함유하면, 디술피드 부가물이 새로 도입된 시스테인 아미노산과 배지로부터의 시스테인 사이에 형성될 수 있다. 예시적인 ThioMab에서 원으로 표시한 이들 시스테인 부가물은 환원되어 접합에 반응성인 시스테인 조작된 항체를 생성해야 한다. 시스테인 부가물은 아마도 다양한 쇄간 디술피드 결합과 함께, TCEP와 같은 환원제를 사용하여 환원적으로 절단되어 환원된 형태의 항체를 제공한다. 쌍을 이룬 시스테인 잔기들 사이의 쇄간 디술피드 결합은 황산구리, DHAA, 또는 주변 산소에의 노출을 이용한 부분 산화 조건 하에 재형성된다. 새로 도입되고, 조작되고, 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기는 링커 시약 또는 약물-링커 중간체와의 반응을 위해 이용가능하게 남아, 본 발명의 항체 접합체를 형성한다. 포유동물 세포주에서 발현된 ThioMab은 -S-S- 결합 형성을 통해 조작된 Cys에 대해 외부에서 접합된 Cys 부가물을 생성한다. 따라서, 정제된 ThioMab을 환원 및 재산화 절차로 처리하여 반응성 ThioMab을 생성한다. 이들 ThioMab은 세포독성 약물, 형광단, 및 다른 표지를 함유한 말레이미드와 접합하는데 사용된다.
10. 면역리포좀
본원에 개시된 항-FcRH5 항체는 또한 면역리포좀으로서 제형화될 수 있다. "리포좀"은 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 2층 구조로 배열된다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77: 4030 (1980); 미국 특허 4,485,045, 4,544,545; 1997년 10월 23일 공개된 WO97/38731]에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술파이드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol . Chem . 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유된다 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst . 81(19):1484 (1989)].
B. 특정한 항체 제조 방법
1. 목적하는 특성을 갖는 항- FcRH5 항체에 대한 스크리닝
FcRH5 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성하는 기술은 상기 설명되었다. 목적하는 경우에 특정 생물학적 특징을 갖는 항체를 추가로 선택할 수 있다.
본 발명의 항-FcRH5 항체의 성장 억제 효과는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 내인성으로 또는 FcRH5 유전자로 형질감염된 후 FcRH5 폴리펩티드를 발현하는 세포를 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 적절한 종양 세포주 및 FcRH5로 형질감염된 세포를 수일 (예를 들어, 2 내지 7일) 동안 다양한 농도의 항-FcRH5 모노클로날 항체로 처리하고, 크리스탈 바이올렛 또는 MTT로 염색하거나, 일부 다른 비색 분석에 의해 분석할 수 있다. 증식을 측정하는 또 다른 방법은 본 발명의 항-FcRH5 항체의 존재 또는 부재 하에 처리된 세포에 의한 3H-티미딘 흡수를 비교하는 것일 것이다. 처리 후에, 세포를 수거하고, DNA 내로 삽입된 방사성의 양을 섬광 계수기에서 정량한다. 적절한 양성 대조군은 선택된 세포주를 세포주의 성장을 억제하는 것으로 공지된 성장 억제 항체로 처리하는 것을 포함한다. 생체내에서 종양 세포의 성장 억제는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 결정할 수 있다. 종양 세포는 FcRH5 폴리펩티드를 과다발현하는 것일 수 있다. 항-FcRH5 항체는 시험관내에서 또는 생체내에서 FcRH5-발현 종양 세포의 세포 증식을 미처리된 종양 세포에 비해, 한 양태에서 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서 약 25 내지 100％, 보다 바람직하게는 약 30 내지 100％, 훨씬 더 바람직하게는 약 50 내지 100％ 또는 70 내지 100％까지 억제할 것이다. 성장 억제는 세포 배양물 중의 약 0.5 내지 30 ㎍/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정할 수 있고, 여기서 성장 억제는 종양 세포를 항체에 노출시킨지 1 내지 10일 후에 결정된다. 항체는 항-FcRH5 항체를 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 체중으로 투여할 때 항체의 제1 투여로부터 약 5일 내지 3개월 내에, 바람직하게는 약 5 내지 30일 내에 종양 크기를 감소시키거나 종양 세포 증식을 감소시킬 경우에 생체내에서 성장 억제성이다.
세포 사멸을 유도하는 항-FcRH5 항체에 대해 선택하기 위해, 예를 들어 요오드화프로피듐 (PI), 트리판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 표시되는 바와 같은 막 통합성의 상실을 대조군에 비해 평가할 수 있다. PI 흡수 분석은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행될 수 있다. FcRH5 폴리펩티드-발현 종양 세포를 배지 단독과 또는 적절한 항-FcRH5 항체 (예를 들어, 약 10㎍/ml으로)를 함유하는 배지와 함께 인큐베이션한다. 세포를 3일 동안 인큐베이션한다. 각각의 처리 후에, 세포를 세척하고, 세포 덩어리를 제거하기 위해 35 mm의 스트레이너 (strainer) 마개가 있는 12 x 75 튜브 (1 ml/튜브, 처리군 당 3개 튜브) 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)를 넣는다. 샘플을 FACSCAN® 유동 세포 측정기 및 FACSCONVERT® CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 결정할 때 통계학상 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 항-FcRH5 항체를 세포 사멸-유도 항-FcRH5 항체로서 선택할 수 있다.
관심 항체에 의해 결합된 FcRH5 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 통상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석은 시험 항체가 공지의 항-FcRH5 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지를 결정하는데 사용할 수 있다. 달리 또는 추가로, 에피토프 매핑을 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 접촉 잔기를 확인하기 위해 항체 서열을 알라닌 스캐닝에 의해서와 같이 돌연변이시킬 수 있다. 돌연변이체 항체는 초기에 적합한 폴딩을 보장하기 위해 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 시험된다. 상이한 방법에서, FcRH5 폴리펩티드의 상이한 영역에 대응하는 펩티드를 시험 항체와의, 또는 시험 항체 및 특성이 결정되거나 공지된 에피토프를 갖는 항체와의 경쟁 분석에 사용할 수 있다.
2. 특정 라이브러리 스크리닝 방법
본 발명의 항-FcRH5 항체는 목적하는 활성(들)을 갖는 항체를 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특징을 갖는 항체에 대하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 일반적으로 문헌 [Hoogenboom et al. (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ)]에 기재되어 있고, 특정 양태에서는 문헌 [Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093]에 기재되어 있다.
원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는, 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리를 목적하는 항원에 대한 친화도 크로마토그래피에 의해 패닝(panning)한다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡수되어, 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론을 항원으로부터 용출시키고, 추가 사이클의 항원 흡착/용출에 의해 더욱 농축시킬 수 있다. 본 발명의 임의의 항-FcRH5 항체는 관심 파지 클론에 대해 선택하기 위해 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 관심 파지 클론으로부터 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 설명된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항-FcRH5 항체 클론을 제작함으로써 수득할 수 있다.
특정 양태에서, 항체의 항원 결합 도메인은 둘 모두 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 제시하는 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역 (경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 각각 하나씩)으로부터 형성된다. 가변 도메인은 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 설명된 바와 같이 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서 (여기서, VH 및 VL은 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유 연결된다), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 이들을 각각 불변 도메인에 융합되고, 비공유적으로 상호작용한다) 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용되는 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 총칭된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 설명된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 따로 클로닝되고, 파지 라이브러리 내에서 무작위로 재조합될 수 있고, 이어서 이는 항원 결합 클론에 대해 탐색될 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요 없이 면역원에 고-친화도 항체를 제공한다. 달리, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 설명된 바와 같이, 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대해 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록, 나이브 레퍼토리를 클로닝할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 영역을 코딩하도록 및 시험관내 재배열을 달성하도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 합성 방식으로 제조할 수 있다.
특정 양태에서, 부 코트 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 필라멘트형 파지가 사용된다. 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편으로서 (여기서, VH 및 VL 도메인은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 쇄 상에서 연결된다), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. , Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 설명된 바와 같이 하나의 쇄는 pIII에 융합되고, 다른 쇄는 박테리아 숙주 세포 주변세포질 내로 분비되고, 여기서 Fab-코트 단백질 구조의 조립체가 야생형 코트 단백질의 일부를 치환함으로써 파지 표면 상에 디스플레이된다) 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거한 면역 세포로부터 얻어진다. 항-FcRH5 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 요망되는 경우에, 대상체를 항체 반응을 일으키도록 FcRH5로 면역화시키고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초혈 림프구 (PBL)를 라이브러리 제작을 위해 회수한다. 바람직한 양태에서, 항-FcRH5 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 FcRH5 면역화가 FcRH5에 대한 인간 항체를 생성하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 보유하는 (그리고 기능적 내인성 항체 생성 시스템이 결핍된) 유전자이식 생쥐에서 항-FcRH5 항체 반응을 일으킴으로써 수득된다. 인간 항체-생성 유전자이식 생쥐의 생성은 아래에 설명된다.
항-FcRH5 반응성 세포 집단에 대한 추가의 농축은, 예를 들어 FcRH5 친화도 크로마토그래피를 사용한 세포 분리 또는 플루오로크롬-표지된 FcRH5에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 FcRH5-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하기 위한 적합한 스크리닝 절차를 이용함으로써 수득될 수 있다.
달리, 비면역화 공여체로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL을 사용하면 가능한 항체 레퍼토리를 보다 우수하게 제시하고, 또한 FcRH5가 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용하여 항체 라이브러리를 제작할 수 있다. 시험관내 항체 유전자 제작을 포함하는 라이브러리를 위해, 재배열되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 제공하도록 줄기 세포를 대상체로부터 수거한다. 관심 면역 세포는 다양한 동물 종, 예를 들어 인간, 생쥐, 래트, 토끼, 늑대, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 새 종 등으로부터 수득될 수 있다.
항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산은 관심 세포로부터 회수되고 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 목적하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리한 후, 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 설명된 바와 같이 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조함으로써 수득될 수 있다. V 유전자는 문헌 [Orlandi et al. (1989); Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 설명된 바와 같이, 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서 역방향 프라이머 및 J-절편 내에 기초한 정방향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키기 위해, 역방향 프라이머는 또한 문헌 [Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 설명된 바와 같이 리더 (leader) 엑손에 기초될 수 있고, 정방향 프라이머는 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 설명된 바와 같이 불변 영역 내에 기초될 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 [Orlandi et al. (1989); Sastry et al. (1989)]에 설명된 바와 같이 축퇴성을 프라이머 내에 포함시킬 수 있다. 특정 양태에서, 라이브러리 다양성은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 설명된 바와 같이 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 설명된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 (rare) 제한 부위를 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 설명된 바와 같이 하나의 말단에서 택으로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 설명된 바와 같이 택을 붙인 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입할 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 절편으로부터 시험관내에서 유도될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편이 클로닝되고 서열결정되고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨) 매핑되었고 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 이들 클로닝된 절편 (H1 및 H2 루프의 주요 입체형태를 모두 포함함)은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 설명된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머를 사용하여 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 설명된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성을 갖도록 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편이 클로닝되고 서열결정되었고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 합성 V 유전자 레퍼토리 (VH 및 VL 폴드 (fold)의 범위, 및 L3 및 H3 길이에 기초함)는 상당히 구조적으로 다양한 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭 후에, 생식게열 V-유전자 절편을 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열할 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 몇몇 방식으로 함께 조합함으로써 제작될 수 있다. 각각의 레퍼토리가 상이한 벡터 내에서 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어, 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 설명된 바와 같이 시험관내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어, 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993))에 설명된 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근은 이. 콜라이 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 제한을 극복하기 위해 Fab 단편의 2-쇄 특성을 활용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리는 하나는 파지미드 내로, 다른 하나는 파지 벡터 내로 따로 클로닝된다. 이어서, 2개의 라이브러리를 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 조합함으로써, 각각의 세포는 상이한 조합을 함유하고 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 수 (약 1012개 클론)에 의해서만 제한된다. 두 벡터는 모두 생체내 재조합 신호를 함유하여, VH 및 VL 유전자는 단일 레플리콘 상으로 재조합되고, 파지 비리온 내로 동시 패키징된다. 이들 큰 라이브러리는 우수한 친화도 (약 10-8 M의 Kd -1)의 다수의 다양한 항체를 제공한다.
달리, 레퍼토리들은, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991)]에 설명된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝되거나, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에 설명된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 후 클로닝될 수 있다. VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA와 연결시켜 단일쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하기 위해 PCR 조립을 또한 사용할 수 있다. 또 다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20:3831-3837 (1992)]에 설명된 바와 같이 림프구 내에서 VH 및 VL 유전자를 PCR에 의해 결합시킨 후, 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하기 위해 "세포내 PCR 조립"을 이용한다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성의)에 의해 생성된 항체는 중등 친화도 (약 106 내지 107 M-1의 Kd -1)의 것일 수 있지만, 친화도 성숙은 또한 문헌 [Winter et al. (1994), 상기 참조]에 설명된 바와 같이 2차 라이브러리를 제작하고 그로부터 재선택함으로써 시험관내에서 모방될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이를 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류 발생이 위운 (error-prone) 중합효소 (문헌 [Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989)]에 보고된)를 사용함으로써 시험관내에서 무작위로 도입시킬 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은, 예를 들어 선택된 개별 Fv 클론에서 관심 CDR에 이르는 무작위 서열을 보유한 프라이머를 사용하는 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위 돌연변이시키고, 보다 고친화도 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이를 유발하는 방법이 설명되어 있다. 다른 효과적인 방법은 비면역화 공여체로부터 얻은 천연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 사용하여 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10:779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수회의 쇄 재셔플링으로 보다 고친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화도가 약 10-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생성할 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, FcRH5를 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용하거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에서 발현시키거나, 세포 분류에서 사용하거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 바이오틴에 접합하거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에서 사용할 수 있다.
파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건 하에 고정된 FcRH5와 접촉시킨다. 보통, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 설명된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법에 유사한 절차로 FcRH5 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 파지는 단일 선택 라운드에서 20 내지 1,000배 농축될 수 있다. 또한, 농축된 파지를 박테리아 배양물에서 성장시키고, 추가의 선택 라운드를 실행할 수 있다.
선택의 효율은 세척 동안 해리 동력학, 및 단일 파지 상에서 다수 항체 단편이 항원과 동시에 결합할 수 있는지 여부를 포함한 많은 요인에 의해 결정된다. 빠른 해리 동력학 (및 약한 결합 친화도)을 갖는 항체는 짧은 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체상에서 높은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 보유시킬 수 있다. 고밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합에 유리하다. 느린 해리 동력학 (및 우수한 결합 친화도)을 갖는 항체의 선택은 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990); WO 92/09690]에 설명된 바와 같이 오랜 세척 및 일가 파지 디스플레이, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 설명된 바와 같이 낮은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 촉진될 수 있다.
FcRH5에 대한 상이한 친화도, 심지어 근소하게 상이한 친화도를 갖는 파지 항체를 선택하는 것이 가능하다. 그러나, (예를 들어, 일부 친화도 성숙 기술에서 수행된 바와 같이) 선택된 항체의 무작위 돌연변이는 대부분은 항원에 결합되고 몇몇은 보다 고친화도를 갖는 많은 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. FcRH5를 제한하면, 희귀한 고친화도 파지가 경쟁에 의해 제거될 수 있었다. 보다 고친화도의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지를 과잉의 바이오티닐화 FcRH5와 함께 인큐베이션할 수 있지만, FcRH5에 대한 표적 몰 친화도 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 바이오티닐화 FcRH5와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 고친화도 결합 파지를 스트렙타비딘-코팅된 상자성 (paramagnetic) 비드에 의해 포획할 수 있다. 이러한 "평형 포획"에 의해 항체를 그들의 결합 친화도에 따라 선택할 수 있고, 이의 감도로 인해 보다 낮은 친화도의 매우 과잉의 파지로부터 2배 더 높은 정도로 낮은 친화도를 갖는 돌연변이체 클론을 단리할 수 있다. 고체상에 결합된 파지를 세척하는데 사용되는 조건은 또한 해리 동력학을 기초로 하여 식별하도록 조작될 수 있다.
항-FcRH5 클론은 활성에 기초하여 선택할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명은 자연적으로 FcRH5를 발현하는 살아있는 세포에 결합하는 항-FcRH5 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 FcRH5 리간드와 FcRH5 사이의 결합을 차단하지만 FcRH5 리간드와 제2 단백질 사이의 결합을 차단하지 않는 항-FcRH5 항체를 제공한다. 이러한 항-FcRH5 항체에 대응하는 Fv 클론은 (1) 상기 설명된 파지 라이브러리로부터 항-FcRH5 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 FcRH5 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-FcRH5 파지 클론을 고정된 FcRH5에 흡착시키고; (4) 과잉의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정자와 겹치고/겹치거나 공유되는 FcRH5-결합 결정자를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용출시키고; (5) 단계 (4) 이후에 흡착되어 남아있는 클론을 용출시킴으로써 선택될 수 있다. 임의로, 목적하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론을 본원에 설명된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 추가로 농축할 수 있다.
본 발명의 하이브리도마-유래된 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심있는 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 일단 단리한 후, DNA를 발현 벡터 내로 도입할 수 있고, 이어서 이를 재조합 숙주 세포 내에서 목적하는 모노클로날 항체를 합성하기 위해 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시킨다. 박테리아에서 항체-코딩 DNA의 재조합 발현에 관한 참조 문헌은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256 (1993); Plueckthun, Immunol. Revs, 130:151 (1992)]을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 문헌 [Kabat et al. 상기 참조]으로부터 수득될 수 있다)과 조합되어, 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함한 임의의 이소형의 불변 영역을 상기 목적에 사용할 수 있고, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물종으로부터 수득될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 하나의 동물 (예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후 다른 동물종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론이 본원에 사용된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전장 또는 부분 길이의 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
또한, 하이브리도마로부터 유래된 항-FcRH5 항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형될 수 있다. 하이브리도마- 또는 Fv 클론-유래된 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합에 의해 연결시켜 추가로 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조한다.
C. 항체 의존 효소 매개 프로드럭 요법 ( ADEPT )
본 발명의 항체는 또한 프로드럭 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 프로드럭-활성화 효소에 항체를 접합함으로써 ADEPT에 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 4,975,278을 참조한다.
ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은 프로드럭을 이의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 프로드럭에 대해 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 효소는 인산염 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 당화된 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 달리, 본 발명의 프로드럭을 유리 활성 약물로 전환시키기 위해 효소적 활성을 갖는 항체 (당업계에서 "아브자임 (abzyme)"으로도 알려짐)를 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)] 참조). 항체-아브자임 접합체는 종양 세포 집단에 아브자임을 전달하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 효소는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해, 예를 들어 상기 논의된 이종이관능성 가교결합 시약을 사용하여 항-FcRH5 항체에 공유결합시킬 수 있다. 달리, 적어도 본 발명의 효소의 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 항원 결합 영역을 적어도 포함하는 융합 단백질을 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)] 참조).
D. 항- FcRH5 항체
본원에 기재된 항-FcRH5 항체에 추가하여, 항-FcRH5 항체 변이체를 제조할 수 있음이 고려된다. 항-FcRH5 항체 변이체를 코딩 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써 및/또는 목적하는 항체 또는 폴리펩티드의 합성에 의해 제조할 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 항-FcRH5 항체의 해독후 처리를 변경하고, 예를 들어 당화 부위의 수 또는 위치를 변화시키거나 막 앵커링 (anchoring) 특징을 변경시킬 수 있음을 알 것이다.
본원에 기재된 항-FcRH5 항체에서 변이는, 예를 들어, 미국 특허 5,364,934에 제시된 보존적 및 비-보존적 돌연변이를 위한 임의의 기술 및 지침을 이용하여 제조될 수 있다. 변이는 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드에 비해 아미노산 서열을 변화시키는, 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 항-FcRH5 항체의 하나 이상의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 형성된다. 어느 아미노산 잔기가 목적하는 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 항-FcRH5 항체의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고 높은 상동성 영역에서 이루어지는 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 밝혀질 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교체하는, 예를 들어 류신을 세린으로 교체하는, 즉, 보존적 아미노산 교체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에 걸칠 수 있다. 허용된 변이는 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성되는 변이체를 전장 또는 성숙 천연 서열이 나타내는 활성에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다.
항-FcRH5 항체 단편이 본원에서 제공되다. 이러한 단편은, 예를 들어 전장 천연 항체 또는 단백질과 비교할 때 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 단편은 항-FcRH5 항체의 목적하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여된다.
항-FcRH5 항체 단편은 임의의 많은 통상적인 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방법은 효소적 분해에 의해, 예를 들어 특정 아미노산 잔기에 의해 규정된 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 알려진 효소로 단백질을 처리하거나 적합한 제한 효소로 DNA를 분해시킴으로써 항체 또는 폴리펩티드 단편을 생성하고, 목적하는 단편을 단리하는 것을 수반한다. 또 다른 적합한 기술은 목적하는 항체 또는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭하는 것을 수반한다. DNA 단편의 목적하는 말단을 규정하는 올리고뉴클레오티드가 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에 사용된다. 바람직하게는, 항-FcRH5 항체 단편은 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 본원에 개시된 천연 항-FcRH5 항체와 공유한다.
특정 양태에서, 관심있는 보존적 치환을 표 8에 바람직한 치환의 표제 하에 제시한다. 이러한 치환이 생물학적 활성을 변화시키면, 하기 표 8에 예시적인 치환으로 명명하거나 아미노산 부류에 대해 아래에 상세히 설명한 보다 실질적인 변화를 도입하고, 생성물을 스크리닝한다.
Figure pct00070
항-FcRH5 항체의 기능 또는 면역학적 실체의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태로서 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 하전 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피 (bulk)를 유지하는 것에 대한 이의 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 발생 잔기는 공통적 측쇄 특성에 기초하여 다음 군으로 나누어진다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향을 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 부류의 일 구성원을 다른 부류와 교환하는 것을 수반한다. 이러한 치환된 잔기를 또한 보존적 치환 부위 내로, 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비-보존된) 부위 내로 도입할 수 있다.
변이는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-매개 (부위 지시된) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 이룰 수 있다. 항-FcRH5 항체 변이체 DNA를 생성하기 위해 클로닝된 DNA에 대해 부위 지시된 돌연변이유발 [Carter et al., Nucl . Acids Res ., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res ., 10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이유발 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이유발 [Wells et al., Philos . Trans . R. Soc . London SerA , 317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술이 수행될 수 있다.
인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인하기 위해 스캐닝 아미노산 분석을 또한 이용할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산에는 비교적 작은 중성 아미노산이 존재한다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린, 및 시스테인을 포함한다. 알라닌이 상기 군 중에서 일반적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이고, 그 이유는 알라닌이 베타-탄소 너머의 측쇄를 제거하고, 변이체의 주쇄 입체형태를 변경시킬 가능성이 적기 때문이다 [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. 알라닌은 또한 가장 흔한 아미노산이기 때문에 일반적으로 바람직하다. 추가로, 알라닌은 종종 매립된 위치 및 노출된 위치 모두에서 발견된다 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol . Biol ., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당량의 변이체를 생성하지 않을 경우에, 이소테릭 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
항-FcRH5 항체의 적합한 입체형태 유지에 관여하지 않은 임의의 시스테인 잔기도 또한 분자의 산화 안정성을 개선하고 이상 가교결합을 억제하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 이와 반대로, 안정성 (특히, 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편인 경우)을 개선하기 위해, 시스테인 결합(들)을 항-FcRH5 항체에 첨가할 수 있다.
특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 그들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 수반한다. 간단히 설명하면, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개의 부위)를 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이시킨다. 이렇게 생성된 항체 변이체를 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 필라멘트형 파지 입자로부터 일가 양식으로 디스플레이시킨다. 이어서 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하도록 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 달리 또는 추가로, 항체와 FcRH5 폴리펩티드 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
항-FcRH5 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우에), 또는 초기에 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 항-FcRH5 항체의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지시된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
E. 항- FcRH5 항체의 변형
항-FcRH5 항체의 공유 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 하나의 유형의 공유 변형은 항-FcRH5 항체의 표적화된 아미노산 잔기를, 항-FcRH5 항체의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 물질을 사용한 유도체화는, 예를 들어 항-FcRH5 항체를 정제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 항-FcRH5 항체를 가교결합시키기 위해, 및 그 반대를 위해 유용하다. 일반적으로 사용되는 가교결합제는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산을 갖는 에스테르, 동종이관능성 이미도에스테르, 예를 들어 디숙신이미딜 에스테르, 예를 들어 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 이관능성 말레이미드, 예를 들어 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 [T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함된 항-FcRH5 항체의 다른 유형의 공유 변형은 항체 또는 폴리펩티드의 천연 당화 패턴의 변경을 포함한다. "천연 당화 패턴의 변경"은 본원의 목적상 천연 서열 항-FcRH5 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거 (근원적인 당화 부위의 제거에 의해 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의한 당화의 제거에 의해), 및/또는 천연 서열 항-FcRH5 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위의 부가를 의미하고자 의도된다. 추가로, 상기 구문은 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 특성 및 비율의 변화를 포함한, 천연 단백질의 당화의 정성적 변화를 포함한다.
항체 및 다른 폴리펩티드의 당화는 일반적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 나타낸다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대해 탄수화물 모이어티를 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성한다. O-연결된 당화는 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 당, 즉 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나의 부착을 나타내지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있다.
(N-연결된 당화 부위의 경우) 항-FcRH5 항체에 대한 당화 부위의 부가는 하나 이상의 상기한 트리펩티드 서열을 갖도록 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 변경은 또한 (O-연결된 당화 부위의 경우) 본래의 항-FcRH5 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환시켜 이룰 수 있다. 항-FcRH5 항체 아미노산 서열은 특히 목적하는 아미노산으로 해독될 코돈이 생성되도록 항-FcRH5 항체를 코딩하는 DNA를 기선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써, 임의로 DNA 수준에서 변화를 통해 변경시킬 수 있다.
항-FcRH5 항체 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은, 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev . Biochem . pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
항-FcRH5 항체 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해, 또는 당화의 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성할 수 있다. 화학적 탈당화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch . Biochem . Biophys ., 259:52 (1987) 및 Edge et al., Anal . Biochem . 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth . Enzymol ., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성할 수 있다.
항-FcRH5 항체의 다른 유형의 공유 변형은 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시된 방식으로 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 연결시키는 것을 포함한다. 또한, 항체는, 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
본 발명의 항-FcRH5 항체는 또한 또 다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 항-FcRH5 항체를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
한 양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-택 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 택 폴리펩티드와 항-FcRH5 항체의 융합체를 포함한다. 에피토프 택은 일반적으로 항-FcRH5 항체의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프 택을 붙인 형태의 항-FcRH5 항체의 존재는 택 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 택을 제공함으로써 항-택 항체 또는 에피토프 택에 결합하는 다른 유형의 친화도 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 항-FcRH5 항체를 쉽게 정제할 수 있다. 다양한 택 폴리펩티드와 그들의 각각의 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 그 예는 폴리-히스티딘 (poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 택; flu HA 택 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 [Field et al., Mol . Cell . Biol . 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 택 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 택 및 이의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering , 3(6):547-553 (1990)]를 포함한다. 다른 택 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology , 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science , 255:192-194 (1992)]; α-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol . Chem . 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 택 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA , 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.
다른 양태에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과 항-FcRH5 항체의 융합체를 포함할 수 있다. 이가 형태의 키메라 분자 (본원에서 "면역어드헤신"으로도 칭함)에 대해, 상기 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 가용 (막횡단 도메인이 결실된 또는 불활성화된) 형태의 항-FcRH5 항체의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 면역글로불린 융합체는 힌지, IgG1 분자의 CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합체의 생성에 대해서는 또한 미국 특허 5,428,130 (1995년 6월 27일 등록)을 참조한다.
F. 항- FcRH5 항체의 제조
아래의 상세한 설명은 주로 항-FcRH5 항체-코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포의 배양에 의한 항-FcRH5 항체의 생성에 관한 것이다. 물론, 항-FcRH5 항체를 제조하기 위해 당업계에 잘 알려져 있는 다른 방법을 이용할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열, 또는 이의 일부는 고체상 기술을 이용한 직접 펩티드 합성 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am . Chem . Soc . 85:2149-2154 (1963)] 참조)에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화 기술에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems 펩티드 합성기 (Foster City, CA)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 달성될 수 있다. 항-FcRH5 항체의 다양한 부분들을 따로 화학적으로 합성하고, 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합함으로써 목적하는 항-FcRH5 항체를 생성할 수 있다.
1. 항- FcRH5 항체를 코딩하는 DNA 의 단리
항-FcRH5 항체를 코딩하는 DNA는 항-FcRH5 항체 mRNA를 갖고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것을 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 따라서, 인간 항-FcRH5 항체 DNA는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득될 수 있다. 항-FcRH5 항체-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)에 의해 수득될 수 있다.
라이브러리는 관심 유전자 또는 그에 의해 코딩되는 단백질을 확인하도록 설계된 프로브 (예를 들어, 적어도 약 20 내지 80개 염기의 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 절차를 이용하여 수행될 수 있다. 항-FcRH5 항체를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 참조; Dieffenbach et al., PCR Primer : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 충분한 길이이고 가양성 (false positive)이 최소화되도록 충분히 분명해야 한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 스크리닝되는 라이브러리 내의 DNA에 혼성화시 검출될 수 있도록 표지된다. 표지 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 바이오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중등 엄격성 및 높은 엄격성을 포함한 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al., 상기 참조]에 제공되어 있다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 공공 데이타베이스, 예를 들어 GenBank 또는 다른 사설 서열 데이타베이스에 기탁되고 이로부터 이용가능한 다른 공지의 서열과 정렬되고 비교될 수 있다. 분자의 규정된 영역 내의 또는 전장 서열에 걸친 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서의) 서열 동일성은 당업계에 공지되고 본원에 설명된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 처음으로 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고, 필요한 경우에, cDNA로 역전사될 수 없는 mRNA의 전구체 및 처리 중간체를 검출하기 위해 문헌 [Sambrook et al., 상기 참조]에 기재된 바와 같이 통상적인 프라이머 연장 절차를 이용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다.
2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포를 항-FcRH5 항체 생성을 위해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다. 배양 조건, 예를 들어 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험 없이 당업자가 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991); Sambrook et al., 상기 참조]에서 찾을 수 있다.
DNA가 염색체외적으로 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 숙주 내로의 DNA의 도입을 의미하는 진핵 세포 형질감염 및 원핵 세포 형질전환의 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개, 폴리에틸렌글리콜/DMSO 및 전기천공은 당업자에게 공지되어 있다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 참조]에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵생물에 대해 이용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene , 23:315 (1983); 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같은 특정 식물 세포의 형질전환에 이용된다. 세포벽이 없는 포유동물 세포에 대해서는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology , 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법을 이용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 측면은 미국 특허 4,399,216에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 통상적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact ., 130:946 (1977); Hsiao et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법, 예를 들어 핵 미세주사, 전기천공, 온전한 세포와의 박테리아 원형질체의 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴에 의한 방법도 또한 이용할 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하기 위한 다양한 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는 원핵, 효모, 또는 고등 진핵 세포를 포함한다.
a. 원핵생물 숙주 세포
적합한 원핵생물은 원시박테리아 및 진정박테리아, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 이용가능하다. 다른 적합한 원핵생물 숙주 세포는 엔테로박테리아세, 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacilli), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 파라코커스 (Paracoccus) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 하나의 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D. C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC 기탁 번호 27,325]은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이를 발생시키도록 변형될 수 있고, 상기 숙주의 예는 완전한 유전형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan r 을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이가 존재하는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 유전형 W3110 Δ fhuA (Δ tonA ) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ( nmpc - fepE ) degP41 kan R 을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 33D3 [미국 특허 5,639,635] 및 1990년 8월 7일 등록된 미국 특허 4,946,783에 개시된 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 다른 균주 및 이의 유도체, 예를 들어 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 규정된 유전형을 갖는 상기 언급된 박테리아의 유도체를 제작하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 박테리아의 세포 내에서 레플리콘의 복제가능성을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, 레플리콘을 제공하기 위해 잘 공지된 플라스미드, 예를 들어 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410을 사용할 때 이. 콜라이, 세라티아, 또는 살로넬라 종을 숙주로서 적합하게 사용할 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백 분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제가 바람직하게는 세포 배양물에 포함될 수 있다. 달리, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합체 단백질은 특히 당화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 때, 예를 들어 치료 항체가 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 접합되고 면역접합체 자체가 종양 세포 파괴에 유효성을 보일 때 박테리아에서 생성될 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 보다 길다. 이. 콜라이 내에서의 생성이 보다 빠르고 보다 비용 효율적이다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어 미국 5,648,237 (Carter 등), 미국 5,789,199 (Joly 등), 및 미국 5,840,523 (Simmons 등) (발현 및 분비의 최적화를 위한 해독 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 설명) (이들 특허는 본원에 참조로 포함된다)을 참조한다. 발현 후에, 항체는 가용형 분획 내의 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리하고, 예를 들어 이소형에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는, 예를 들어 CHO 세포 내에서 발현되는 항체를 정제하기 위한 방법과 유사하게 수행될 수 있다.
b. 진핵생물 숙주 세포
원핵생물에 추가로, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트형 진균 또는 효모가 항-FcRH5 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)는 흔히 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 숙주는 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe ) [Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383]; 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 [미국 특허 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)], 예를 들어, 케이. 락티스 (K. lactis) [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol . 154(2):737-742 (1983)], 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906) [Van den Berg et al., Bio / Technology, 8:135 (1990)], 케이. 테르모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 마르크시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) [EP 402,226]); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) [EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol . 28:265-278 (1988)]; 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) [EP 244,234]; 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) [Case et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 76:5259-5263 (1979)]; 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) [1990년 10월 31일 공개된 EP 394,538]; 및 필라멘트형 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) [1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357], 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) [Ballance et al., Biochem. Biophys . Res . Commun ., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81: 1470-1474 (1984)] 및 에이. 니거 (A. niger) [Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)]를 포함한다. 메탄올 자화 (methylotropic) 효모가 본원에서 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다, 클로에케라 (Kloeckera), 피키아, 사카로마이세스, 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 구성된 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 효모 부류의 예시적인 특정 종의 목록이 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 제시되어 있다.
당화된 항-FcRH5 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9, 및 식물 세포, 예를 들어 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 세포 배양물을 포함한다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 대응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포에 가장 큰 관심을 기울여 왔고, 배양물 (조직 배양물에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (293 세포 또는 현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포 [Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1997)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)]); 생쥐 세르톨리 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod . 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci . 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항-FcRH5 항체 생성을 위해 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다.
3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용
본 발명의 항체의 재조합 생성을 위해, 그를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)를 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입시킨다. 항체를 코딩하는 DNA는 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써) 통상적인 절차를 이용하여 쉽게 단리되고 서열결정된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용될 숙주 세포에 따라 결정된다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 (일반적으로 포유동물) 기원의 것이다.
벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지 형태로 존재할 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 하나 이상의 이들 성분을 포함하는 적합한 벡터의 제작에는 당업자에게 공지된 표준 결합 기술을 이용한다.
FcRH5는 직접적으로뿐만 아니라 신호 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방식으로 생성될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 항-FcRH5 항체-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군 중에서 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은, 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 팩터 리더 (사카로마이세스 α-팩터 리더 및 미국 특허 5,010,182에 기재된 클루이베로마이세스 α-팩터 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 단백질의 분비를 지시하기 위해 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일한 또는 관련 종의 분비되는 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용할 수 있다.
a. 원핵생물 숙주 세포
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생성 세포, 예를 들어 하이브리도마 세포로부터 단리되고 서열결정될 수 있다. 달리, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 일단 수득되면, 원핵생물 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 입수가능하고 당업계에 공지된 많은 벡터를 본 발명의 목적을 위해 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터 내로 삽입되는 핵산의 크기, 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 따라 결정될 것이다. 각각의 벡터는 이의 기능 (이종성 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 벡터가 존재하게 되는 특정 숙주 세포와의 상용성에 따라, 다양한 성분을 포함한다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 이들 숙주에 대해 사용한다. 발현 및 클로닝 벡터는 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제하도록 하는 핵산 서열, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 (marking) 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 포함하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공하는 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점이 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적합하고, 2μ 플라스미드 기점이 효모에 대해 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)이 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 대해 유용하다. pBR322, 이의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 이들 프로모터를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 미국 특허 5,648,237 (Carter 등)에 상세하게 기재되어 있다.
추가로, 이들 숙주에 관하여 형질전환 벡터로서 숙주 미생물과 상용성인 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 파지 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용할 수 있는 재조합 벡터를 제조하기 위해, 박테리오파지, 예를 들어 λGEM.TM.-11을 사용할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 조정하는 시스트론에 대해 상류 (5')에 위치하는 비해독된 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 일반적으로 2개의 부류, 즉, 유도가능 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도가능 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 이의 조절 하에 시스트론의 증가된 수준의 전사를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 매우 많은 프로모터가 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 분해를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고, 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하기 위해 천연 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터를 모두 사용할 수 있다. 일부 양태에서, 이종성 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 고수율을 가능하게 하므로, 이종성 프로모터가 이용된다.
다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 잘 알려져 있다. 원핵생물 숙주와 함께 사용하는데 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, Nucleic Acids Res ., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac [deBoer et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 80:21-25 (1983)] 또는 trc 프로모터를 포함한다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항-FcRH5 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno; S.D.) 서열을 포함할 것이다. 그러나, 박테리아에서 기능하는 다른 프로모터 (예를 들어, 다른 공지의 박테리아 또는 파지 프로모터)도 또한 적합하다. 그들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 당업자는 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하도록 링커 또는 어댑터를 사용하여 이들 서열을 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 결합시킬 수 있다 [Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269].
본 발명의 한 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 막을 가로지른 발현된 폴리펩티드의 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나, 벡터 내로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종성 폴리펩티드에 천연적인 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대해, 신호 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어지는 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 한 양태에서, 발현 시스템의 두 시스트론 모두에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 이의 변이체이다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생성은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 따라서 각각의 시스트론 내에 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고, 조립되어 세포질 내에서 기능적 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB - 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 하위단위의 적합한 폴딩 및 조립을 허용한다 [Proba and Plueckthun, Gene, 159:203 (1995)].
본 발명은 발현된 폴리펩티드 성분의 정량적 비율이 분비되고 적절하게 조립된 항체의 수율을 최대화하도록 조정될 수 있는 발현 시스템을 제공한다. 이러한 조정은 적어도 부분적으로 폴리펩티드 성분에 대한 해독 강도의 동시 조절에 의해 달성된다.
해독 강도를 조절하기 위한 하나의 기술은 미국 특허 5,840,523 (Simmons 등)에 개시되어 있다. 상기 기술에서는 시스트론 내에서 해독 개시 영역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 주어진 TIR에 대해, 일정 범위의 해독 강도를 갖는 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체가 생성될 수 있어서, 상기 인자를 특정 쇄의 목적하는 발현 수준을 위해 조정하는 편리한 수단을 제공한다. 비록 뉴클레오티드 서열에서 침묵 변화가 바람직하지만, TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경할 수 있는 코돈 변화를 초래하는 통상적인 돌연변이유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열에서 침묵 변화가 바람직하다. TIR에서 변경은, 예를 들어 신호 서열의 변경과 함께, 샤인-달가노 서열의 수 또는 간격의 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이체 신호 서열을 생성하는 하나의 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 (즉, 변화가 침묵인) 코딩 서열의 시작점에서의 "코돈 뱅크 (codon bank)"의 생성이다. 이것은 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치를 변화시켜 달성될 수 있고; 추가로 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 상기 뱅크를 제조하는데 있어서 복잡성을 추가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 상기 돌연변이유발의 방법은 문헌 [Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol . 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
바람직하게는, 그 안의 각각의 시스트론에 대한 일정 범위의 TIR 강도를 갖는 일 세트의 벡터를 생성한다. 상기 제한된 세트는 각각의 쇄의 발현 수준의 비교 및 다양한 TIR 강도 조합 하에 관심 항체 생성물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 미국 특허 5,840,523 (Simmons 등)에 상세히 기재된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 결정될 수 있다. 해독 강도 비교에 기초하여, 본 발명의 발현 벡터 제작물 내에 조합되도록 목적하는 개별 TIR을 선택한다.
b. 진핵생물 숙주 세포
벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
(1) 신호 서열 성분
진핵생물 숙주 세포에서 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 관심있는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 선택되는 이종성 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 대한 판독 프레임에 결합된다.
(2) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점은 단지 조기 프로모터를 포함하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다.
(3) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 선택가능 마커로도 불리는 선별 유전자를 포함할 것이다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실러스 (Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.
선별 방식의 한 예에서는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선별 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선별의 예에서는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 예는 항-FcRH5 항체-코딩 핵산을 흡수하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적절한 숙주 세포는 문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조되고 증식되는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다. 예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 달리, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택가능 마커, 예를 들어 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어 아미노글리코사이드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 함유하는 배지 내에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다 [미국 특허 4,965,199 참조].
효모에서 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
(4) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 대체로 mRNA 합성을 지시하도록 항-FcRH5 항체-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터가 잘 알려져 있다.
실질적으로 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역이고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 첨가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열은 모두 진핵생물 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위해 적합한 프로모팅 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J. Biol . Chem ., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv . Enzyme Reg ., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스와 갈락토스 이용에 중요한 효소를 위한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하는데 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 항-FcRH5 항체 전사는, 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성이라면, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 및 열-쇼크 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 조절된다.
SV40 바이러스의 조기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형이 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 생쥐 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 달리, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(5) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 항-FcRH5 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 이의 전사를 증가시키도록 프로모터에 대해 작용하는, 대체로 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스 작용 (cis-acting) 요소이다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100 내지 270), 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 향상 요소에 대해 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 항-FcRH5 항체 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치된다.
(6) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 (nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터도 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비해독 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항-FcRH5 항체를 코딩하는 mRNA의 비해독 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 포함한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 [WO94/11026과 그에 개시된 발현 벡터 참조].
재조합 척추동물 세포 배양물에서 항-FcRH5 항체의 합성에 채용하기에 적합한 또 다른 방법, 벡터, 및 숙주 세포가 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; EP 117,058]에 기재되어 있다.
4. 숙주 세포의 배양
본 발명의 항-FcRH5 항체를 생성하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지 내에서 배양될 수 있다.
a. 원핵생물 숙주 세포
본 발명의 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용된 원핵 세포는 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지 내에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물을 첨가한 루리아 (luria) 육즙 (LB)을 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 제작에 기초로 하여 선택된 선택제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린이 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외의, 단독으로 또는 복합 질소원과 같은 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되는, 임의의 필요한 보충물이 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어지는 군 중에서 선택된 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵생물 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 이. 콜라이의 성장을 위해, 예를 들어 바람직한 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 30℃ 범위이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이에 대해, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 더욱 바람직하게는 약 7.0이다.
유도가능 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우에, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에 유도된다. 본 발명의 한 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사를 조절하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용의 포스페이트-제한 배지 내에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이 사용된 벡터 제작물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 주변세포질 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 일반적으로 삼투압 쇼크, 초음파처리 또는 분해와 같은 수단에 의해 미생물을 파괴하는 것을 포함한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 파편 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거항 수 있다. 단백질은 예를 들어, 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 달리, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생성된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 생성은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 (fed-batch) 발효 절차가 재조합 단백질의 생성에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양물, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지원)를 분배하기 위해 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량으로 대략 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 나타내고, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 일반적으로 세포를 적합한 조건 하에 목적하는 밀도, 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되고, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 제작물에 따라 다양한 유도제를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있으나, 세포를 대체로 약 12 내지 50시간 동안 유도시킨다.
본 발명의 폴리펩티드의 생성 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비형 항체 폴리펩티드의 적합한 조립 및 폴딩을 개선하기 위해, 섀퍼론 (chaperone) 단백질, 예를 들어 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (섀퍼론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)를 과다발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시-형질전환시킬 수 있다. 섀퍼론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생성된 이종성 단백질의 적합한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다 [Chen et al. (1999) J Bio Chem. 274:19601-19605; 미국 특허 6,083,715 (Georgiou 등); 미국 특허 6,027,888 (Georgiou 등); Bothmann and Plueckthun (2000) J. Biol . Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Plueckthun (2000) J. Biol . Chem . 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol . Microbiol . 39:199-210].
발현된 이종성 단백질 (특히, 단백 분해에 감수성인 단백질)의 단백 분해를 최소화하기 위해, 단백 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 공지의 박테리아 프로테아제, 예를 들어 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합을 코딩하는 유전자 내에서 유전자 돌연변이(들)를 수행하도록 변형될 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하고, 예를 들어 문헌 [Joly et al. (1998), 상기 참조; 미국 특허 5,264,365 (Georgiou 등); 미국 특허 5,508,192 (Georgiou 등); Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
한 양태에서, 단백 분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 섀퍼론 단백질을 과다발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
b. 진핵생물 숙주 세포
상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham's) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 추가로, 문헌 [Ham et al., Meth . Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal . Biochem . 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 미국 특허 Re. 30,985]에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (대체로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물을 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
5. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및/또는 발현은, 예를 들어 본원에 제공된 서열에 기초하여 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하는 통상적인 노던 블로팅 [Thomas, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 77:5201-5205 (1980)], 도트 블로팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화에 의해 샘플 내에서 직접 측정될 수 있다. 달리, DNA 이중체, RNA 이중체, 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함한 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 다시 항체는 표지될 수 있고, 표면 상에서 이중체의 형성시에 이중체에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있도록 이중체가 표면에 결합되는 분석이 수행될 수 있다.
달리, 유전자 발현을 면역학적 방법, 예를 들어 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석에 의해 측정하여 유전자 생성물의 발현을 직접 정량할 수 있다. 면역조직화학 염색 및/또는 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 항체는 천연 서열 FcRH5 폴리펩티드에 대하여, 또는 본원에 제공된 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드에 대하여, 또는 FcRH5 DNA에 융합되고 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대하여 제조할 수 있다.
6. 항- FcRH5 항체의 정제
항-FcRH5 항체의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우에는, 항체는 적합한 세제 용액 (예를 들어, Triton-X 100)을 사용하여 또는 효소에 의한 절단에 의해 막으로부터 방출시킬 수 있다. 항-FcRH5 항체의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들어 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포용해제에 의해 파괴될 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 항-FcRH5 항체를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 다음 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 이온-교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들어 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 사용한 겔 여과; 오염물, 예를 들어 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 항-FcRH5 항체의 에피토프 택을 붙인 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 컬럼. 단백질 정제의 다양한 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은, 예를 들어 사용된 생성 공정의 특성, 및 생성된 특정 항-FcRH5 항체에 따라 결정될 것이다.
재조합 기술을 이용할 때, 항체는 세포 내에서, 주변세포질 공간 내에서 생성되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생성되면, 제1 단계로서, 입자형 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편은, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과 (ultrafiltration)에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al. Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]에서는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비된 항체를 단리하기 위한 절차가 설명되어 있다. 간단히 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 사용하여 농축시킨다. 단백 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의해 좌우된다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 [Lindmark et al. J. Immunol . Meth . 62: 1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 생쥐 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 [Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)]. 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 조절된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, Bakerbond ABX™ 수지 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 회수할 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 pH가 약 2.5 내지 4.5인 용출 완충액을 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
G. 약제학적 제제
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 치료될 상태에 적절한 임의의 경로로 투여될 수 있다. ADC는 일반적으로 비경구로, 즉 주입, 피하, 근육내, 정맥내, 피부내, 경막내 및 경막외로 투여될 것이다.
이들 암을 치료하기 위해, 한 양태에서, 항체-약물 접합체는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 주입을 통해 투여되는 투여량은 용량당 약 1 ㎍/m2 내지 약 10,000 ㎍/m2이고, 일반적으로 총 1, 2, 3 또는 4회 용량을 위해 1주당 1회 투여된다. 달리, 투여량 범위는 약 1 ㎍/m2 내지 약 1000 ㎍/m2, 약 1 ㎍/m2 내지 약 800 ㎍/m2, 약 1 ㎍/m2 내지 약 600 ㎍/m2, 약 1 ㎍/m2 내지 약 400 ㎍/m2, 약 10 ㎍/m2 내지 약 500 ㎍/m2, 약 10 ㎍/m2 내지 약 300 ㎍/m2, 약 10 ㎍/m2 내지 약 200 ㎍/m2, 및 약 1 ㎍/m2 내지 약 200 ㎍/m2이다. 용량은 1일 1회, 1주 1회, 1주 다수회로서 1일 1회 미만, 1개월 다수회로서 1일 1회 미만, 1개월 다수회로서 1주 1회 미만, 1개월 1회로 투여되거나, 또는 질병의 증상을 경감 또는 완화시키기 위해 간헐적으로 투여될 수 있다. 투여는 치료되는 림프종, 백혈병의 종양 또는 증상의 완화시까지 임의의 개시된 간격으로 계속될 수 있다. 증상의 완화 또는 경감이 계속된 투여에 의해 연장되는 경우에는 증상의 완화 또는 경감이 달성된 후에도 투여가 계속될 수 있다.
본 발명은 또한 자가면역 질병에 걸린 환자에게 치료 유효량의 임의의 하나의 선행 양태의 인간화 10A8 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환의 완화 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 항체는 정맥내 또는 피하 투여한다. 항체-약물 접합체는 용량당 약 1 ㎍/m2 내지 약 100 mg/m2의 투여량으로 정맥내로 투여되고, 특정 양태에서, 투여량은 1 ㎍/m2 내지 약 500 ㎍/m2이다. 용량은 1일 1회, 1주 1회, 1주 다수회로서 1일 1회 미만, 1개월 다수회로서 1일 1회 미만, 1개월 다수회로서 1주 1회 미만, 1개월 1회로 투여되거나, 또는 질병의 증상을 경감 또는 완화시키기 위해 간헐적으로 투여될 수 있다. 투여는 치료되는 자가면역 질병의 증상의 경감 또는 완화시까지 임의의 개시된 간격으로 계속될 수 있다. 증상의 완화 또는 경감이 계속된 투여에 의해 연장되는 경우에는 증상의 완화 또는 경감이 달성된 후에도 투여가 계속될 수 있다.
본 발명은 또한 B 세포 질환, 예를 들어 B 세포 증식성 장애 (비제한적으로 림프종 및 백혈병 포함) 또는 자가면역 질병으로 고통받는 환자에게, 세포독성 분자 또는 검출가능한 분자에 접합되지 않은 임의의 하나의 선행 양태의 인간화 10A8 항체의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 장애의 치료 방법을 제공한다. 항체는 일반적으로 약 1 ㎍/m2 내지 약 1000 mg/m2의 투여량 범위로 투여될 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 항-FcRH5 항체 및/또는 적어도 하나의 이의 면역접합체 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 항-FcRH5 항체-약물 접합체를 포함하는 약제학적 제제를 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 약제학적 제제는 (1) 본 발명의 항체 및/또는 이의 면역접합체, 및 (2) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 양태에서, 약제학적 제제는 (1) 본 발명의 항체 및/또는 이의 면역접합체, 및 임의로 (2) 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다. 추가의 치료제는 아래 설명된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. ADC는 일반적으로 비경구로, 즉 주입, 피하, 근육내, 정맥내, 피부내, 경막내 및 경막외로 투여될 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 (예를 들어, 항-FcRH5 항체 또는 FcRH5 면역접합체를 포함하는) 치료 제제는 목적하는 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 항체 또는 항체-약물 접합체)를 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합하여 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장을 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충액, 예를 들어 아세테이트, Tris, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 등장제, 예를 들어 트레할로스 및 염화나트륨; 슈가, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트; 염-형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
임의로, 그러나 바람직하게는, 제제는 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 염화나트륨을, 바람직하게는 약 생리학적 농도로 포함한다. 임의로, 본 발명의 제제는 약제학적으로 허용되는 보존제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 보존제 농도는 약 0.1 내지 2.0% (통상적으로 v/v)의 범위이다. 적합한 보존제는 약제학적 분야에서 공지된 것들을 포함한다. 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 및 프로필파라벤이 바람직한 보존제이다. 임의로, 본 발명의 제제는 약제학적으로 허용되는 계면활성제를 0.005 내지 0.02%의 농도로 포함할 수 있다.
생체내 투여에 사용할 약제학적 제제는 일반적으로 멸균성이다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
본원의 제제는 또한 치료할 특정 증상에 필요하면 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항-FcRH5 항체 이외에, 하나의 제제 내에, 추가의 항체, 예를 들어, FcRH5 폴리펩티드 상의 상이한 에피토프에 결합하는 제2 항-FcRH5 항체, 또는 특정 암의 성장에 영향을 미치는 성장 인자와 같은 일부 다른 표적에 대한 항체를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 달리 또는 추가로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제, 항-호르몬제, 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물 내에 존재한다.
또한, 활성 성분은, 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 [미국 특허 3,773,919], L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT® (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 하이드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 봉입된 면역글로불린이 장기간 동안 체내에 남아있을 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출된 결과로서 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변화가 일어날 수 있다. 관련된 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지는 경우, 안정화는 술프하이드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
항체는 표적 세포/조직으로의 전달에 적합한 임의의 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 항체는 면역리포좀으로서 제제화될 수 있다. "리포좀"은 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 구조로 배열된다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 77: 4030 (1980); 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545; 및 1997년 10월 23일 공개된 WO97/38731]에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술파이드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al. J. Biol . Chem . 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유된다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst . 81(19):1484 (1989)]을 참조한다.
생체내 투여에 사용할 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
H. 항- FcRH5 항체를 사용한 치료
암에서 FcRH5 발현을 결정하기 위해, 다양한 검출 분석이 이용가능하다. 한 양태에서, FcRH5 폴리펩티드 과다발현은 면역조직화학 (IHC)에 의해 분석될 수 있다. 종양 생검물로부터의 파라핀 포매 조직 절편을 IHC 분석에 적용하고, 다음과 같이 FcRH5 단백질 염색 강도 기준을 부여할 수 있다:
스코어 0 - 염색이 관찰되지 않거나, 10％ 미만의 종양 세포에서 막 염색이 관찰된다.
스코어 1+ - 희미한/거의 지각할 수 없는 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 검출된다. 세포는 단지 이의 막의 일부에서만 염색된다.
스코어 2+ - 약한 내지 중간 정도의 완전한 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 관찰된다.
스코어 3+ - 중간 정도 내지 강한 정도의 완전한 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 관찰된다.
FcRH5 폴리펩티드 발현에 대해 0 또는 1+ 스코어를 갖는 종양은 FcRH5를 과다발현하지 않는 것으로 특성 결정될 수 있는 반면, 2+ 또는 3+ 스코어를 갖는 종양은 FcRH5를 과다발현하는 것으로 특성 결정될 수 있다.
달리 또는 추가로, 종양에서 FcRH5 과다발현 (존재하는 경우)의 정도를 결정하기 위해 FISH 분석, 예를 들어 INFORM® (Ventana, Arizona) 또는 PATHVISION® (Vysis, Illinois)을 포르말린-고정되고 파라핀-포매된 종양 조직에 대해 수행할 수 있다.
FcRH5 과다발현 또는 증폭은, 예를 들어 검출할 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소 또는 형광 표지)의 택을 붙인 분자 (예를 들어, 항체)를 투여하고 표지의 국소화에 대해 환자를 외부에서 스캐닝함으로써 생체내 검출 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 항-FcRH5 항체는 다양한 비-치료 적용을 갖는다. 본 발명의 항-FcRH5 항체는 FcRH5 폴리펩티드-발현 암의 병기 결정에 (예를 들어, 방사선촬영에서) 유용할 수 있다. 항체는 또한 세포로부터 FcRH5 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전을 위해, 시험관내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯으로의 FcRH5 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위해, 다른 세포의 정제에서 하나의 단계로서 혼합된 세포의 집단으로부터 FcRH5-발현 세포를 사멸 및 제거하는데 유용하다.
현재, 암의 병기에 따라, 암 치료는 다음 요법의 하나 또는 조합을 수반한다: 암성 조직의 제거 수술, 방사선 요법, 및 화학요법. 항-FcRH5 항체 요법은 화학요법의 독성 및 부작용을 잘 견디지 못하는 노인 환자에서, 및 방사선 요법의 유용성이 제한되는 전이성 질병에 특히 바람직할 수 있다. 본 발명의 종양을 표적으로 하는 항-FcRH5 항체는 질병의 초기 진단시에 또는 재발 동안 FcRH5-발현 암의 완화에 유용하다. 치료 용도를 위해, 항-FcRH5 항체는 단독으로, 또는 예를 들어 호르몬, 항혈관신생제, 또는 방사성 표지된 화합물과 병용하여, 또는 수술, 한랭요법 및/또는 방사선 요법과 함께 사용될 수 있다. 항-FcRH5 항체 치료제는 다른 형태의 통상적인 요법과 함께 그와 연속적으로 또는 통상적인 요법 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 화학요법 약물, 예를 들어 TAXOTERE® (도세탁셀), TAXOL® (파클리탁셀), 에스트라무스틴 및 미톡산트론은 특히 저위험 (good risk) 환자에서 암을 치료하는데 사용된다. 암을 치료 또는 완화하기 위한 본 발명의 방법에서, 암 환자에게 항-FcRH5 항체를 하나 이상의 상기한 화학요법제를 사용한 치료와 함께 투여할 수 있다. 특히, 파클리탁셀 및 변형된 유도체를 사용한 병용 요법 (예를 들어, EP0600517 참조)이 고려된다. 항-FcRH5 항체는 치료 유효 용량의 화학요법제와 함께 투여될 것이다. 다른 양태에서, 항-FcRH5 항체는 화학요법제, 예를 들어, 파클리탁셀의 활성 및 효능을 향상시키기 위해 화학요법제와 함께 투여된다. 문헌 [Physicians' Desk Reference (PDR)]에는 다양한 암의 치료에 사용된 이들 물질의 투여량이 개시되어 있다. 치료상 효과적인 이들 언급된 화학요법 약물의 투약 방법 및 투여량은 치료할 특정 암, 질병의 정도 및 관련 의사가 잘 알고 있는 다른 요인에 따라 결정될 것이고, 의사가 결정할 수 있다.
하나의 특정 양태에서, 세포독성제에 접합된 항-FcRH5 항체를 포함하는 접합체가 환자에게 투여된다. 바람직하게는, FcRH5 단백질에 결합된 면역접합체는 세포에 의해 내재화되어, 면역접합체가 결합한 암 세포를 사멸시키는데 있어서 면역접합체의 치료 효능을 증가시킨다. 바람직한 양태에서, 세포독성제는 암 세포에서 핵산을 표적으로 하거나 저해한다. 이러한 세포독성제의 예는 상기 기재하였고, 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 발명의 치료제 (예를 들어, 항-FcRH5 항체 또는 이의 독소 접합체)는 공지된 방법에 따라, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들어 볼러스 (bolus)로서 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. 치료제의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.
또한, 생체외 전략이 치료 적용에 이용될 수 있다. 생체외 전략은 피험체로부터 수득된 세포를 FcRH5 길항제를 코딩하는 폴리뉴크레오티드로 형질감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction)하는 것을 포함한다. 이어서, 형질감염되거나 형질도입된 세포를 피험체에 되돌린다. 세포는, 이로 제한됨이 없이, 조혈 세포 (예: 골수 세포, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 또는 B 세포), 섬유아세포, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 또는 근육 세포를 포함하는 다양한 범위의 유형 중 임의의 것일 수 있다.
예를 들어, FcRH5 길항제가 항체 또는 면역접합체인 경우, 길항제는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해, 필요한 경우, 국소 면역억제 처치, 병변내 투여를 위해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 길항제는 펄스 주입에 의해, 특히 감소 용량의 항체와 함께 적합하게 투여된다. 바람직하게는, 투약은, 부분적으로 투여가 단시간인가 장기간인가에 따라, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사로 수행된다.
또 다른 예에서, FcRH5 길항제 화합물은, 종양 장애 또는 위치가 허용되는 경우, 국소적으로, 예를 들어 직접 주사에 의해 투여되며, 주사는 주기적으로 반복될 수 있다. 또한, FcRH5 길항제는 국소 재발 또는 전이를 예방하거나 감소시키기 위해 피험체에 전신적으로 또는 종양 세포에, 예를 들어 종양에 또는 종양의 외과적 절개 후 종양 베드에 직접적으로 전달될 수 있다.
병용하는 치료제의 투여는 전형적으로 제한된 시간 (통상적으로 선택되는 조합에 따라 시간, 일 또는 주)에 걸쳐 수행된다. 병용 요법은 이들 치료제의 순차적 방식, 즉 각각의 치료제가 상이한 시간에 투여되는 방식의 투여, 및 이들 치료제, 또는 치료제 중 적어도 2개 치료제의 실질적인 동시 방식의 투여를 포함하고자 한다.
치료제는 동일 경로에 의해 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용되는 항-FcRH 항체 또는 면역접합체는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있고, 병용되는 화학요법제는 경구 투여될 수 있다. 달리, 예를 들어, 특정 치료제에 따라, 치료제 둘 다를 경구로 투여하거나 치료제 둘 다를 정맥내 주사로 투여할 수 있다. 또한, 치료제가 투여되는 순서는 특정 제제에 따라 다양하다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 각각의 치료제 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg이, 예를 들어 하나 이상의 분리 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량이다. 전형의 1일 용량은, 상술된 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일에 걸쳐 또는 더욱 오랫동안 반복 투여하기 위해, 상술된 방법으로 측정하여 암이 치료될 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다.
본원은 항-FcRH5 항체의 유전자 요법에 의한 투여를 고려한다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 이용에 관한 문헌 [1996년 3월 14일자로 공개된 WO96/07321]을 참조한다.
다른 치료 요법이 항-FcRH5 항체의 투여와 병용될 수 있다. 병용 투여는 별개의 제제 또는 단일 약제학적 제제를 사용하는 동시 투여, 및 어느 한 순서로의 연속 투여를 포함하고, 여기서, 바람직하게는 두 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 시간이 존재한다. 바람직하게는, 이러한 병용 요법은 상승적 치료 효과를 생성한다.
항-FcRH5 항체(들)의 투여를 특정 암과 연관된 다른 종양 항원에 대해 지시된 항체의 투여와 병용하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 치료 목적의 처치 방법은 항-FcRH5 항체(들), 및 하나 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제의 병용 투여 (상이한 화학요법제들, 또는 종양 성장을 또한 억제하는 다른 세포독성제(들) 또는 다른 치료제(들)의 칵테일 (cocktail)의 동시 투여를 포함함)를 포함한다. 화학요법제는 에스트라무스틴 포스페이트, 프레드니무스틴, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 멜파란, 사이클로포스파미드, 하이드록시우레아 및 하이드록시우레아탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제를 포함한다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투약 스케줄은 제조자의 지시에 따라 또는 당업자가 경험적으로 결정하는 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법에 대한 제조 및 투약 스케줄은 또한 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다. 항체는 항-호르몬 화합물; 예를 들어, 항-에스트로겐 화합물, 예를 들어 타목시펜; 항-프로게스테론, 예를 들어 오나프리스톤 [EP 616 812]; 또는 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드와 이러한 분자에 대해 공지된 용량으로 병용될 수 있다. 치료할 암이 안드로겐 비의존 암인 경우에, 환자는 앞서 항-안드로겐 요법을 받을 수 있고, 암이 안드로겐 비의존성으로 된 후, 항-FcRH5 항체 (및 임의로 본원에 기재된 다른 물질)를 환자에게 투여할 수 있다.
때때로, 또한 심장보호제 (요법과 연관된 심근 기능부전을 예방 또는 감소시키기 위해) 또는 하나 이상의 사이토킨을 환자에게 동시 투여하는 것이 유익할 수 있다. 상기 치료 요법에 추가로, 환자는 항체 요법 전에, 동시에 또는 그 후에 암 세포의 수술 제거 및/또는 방사선 요법 (예를 들어, 외부 빔 방사선 조사 또는 방사성 표지된 물질, 예를 들어 항체를 사용한 요법)을 받을 수 있다. 상기 동시 투여되는 임의의 물질에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이고, 물질과 항-FcRH5 항체의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 낮춰질 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 우수 의료 실무와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이러한 측면에서 고려되는 인자는 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만 임의로 해당 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 물질과 함께 제제화된다. 이러한 다른 물질의 유효량은 제제 내의 본 발명의 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 사용된 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 투여량 및 투여 방식은 공지된 기준에 따라 의사가 선택할 것이다. 항체의 적절한 투여량은 상기 규정한 바와 같은 치료할 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 결정될 것이다. 항체는 적합하게는 1회에 또는 일련의 처리에 걸쳐 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 항체는 정맥내 주입 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 질병의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg 체중 (예를 들어, 약 0.1 내지 15 mg/kg/용량)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 투약 요법은 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량, 이어서 약 2 mg/kg의 항-FcRH5 항체의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라 치료는 질병 증상이 목적하는 수준으로 억제될 때까지 지속할 것이다. 상기 요법의 진행은 통상적인 방법 및 분석에 의해 및 의사 또는 다른 당업자에게 공지되어 있는 기준에 기초하여 쉽게 모니터링될 수 있다.
항체 단백질을 환자에 투여하는 것 이외에, 본원은 유전자 요법에 의한 항체의 투여를 고려한다. 항체를 코딩하는 핵산의 이러한 투여는 표현 "치료 유효량의 항체의 투여"에 포함된다. 예를 들어, 세포 내에서 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 대해서는 WO96/07321 (1996년 3월 14일 공개)를 참조한다.
(임의로 벡터에 포함된) 핵산을 생체내에서 및 생체 외에서 환자의 세포 내로 도입하기 위한 2가지의 주요 방법이 존재한다. 생체내 전달을 위해, 핵산은 대체로 항체가 필요한 부위에서 환자 내로 직접 주사된다. 생체 외 치료를 위해, 환자의 세포를 분리하고, 핵산을 이들 단리된 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 직접 또는 예를 들어 환자 내로 이식되는 다공성 막 내에 봉입시켜 환자에게 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 생존가능 세포 내로 도입하기 위해 다양한 기술이 이용가능하다. 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포 내로 전달되는지, 또는 생체내에서 의도하는 숙주의 세포 내로 전달되는지에 따라 상이하다. 시험관내에서 포유동물 세포 내로 핵산의 전달에 적합한 기술은 리포좀의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 흔히 사용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 제1형 단순 포진 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스) 및 지질 기반 시스템 (유전자의 지질 매개 전달에 유용한 지질은, 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 사용한 형질감염을 포함한다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜에 대해서는, 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한 WO 93/25673과 여기에 인용된 참조문을 참조한다.
본 발명의 항-FcRH5 항체는 본원에서 "항체"의 정의에 포함되는 상이한 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 항체는 전장 또는 온전한 항체, 항체 단편, 천연 서열 항체 또는 아미노산 변이체, 인간화, 키메라 또는 융합 항체, 면역접합체, 및 이의 기능성 단편을 포함한다. 융합 항체에서, 항체 서열은 이종성 폴리펩티드 서열에 융합된다. 항체는 목적하는 이펙터 기능을 제공하도록 Fc 영역에서 변형될 수 있다. 본원의 섹션에서 보다 상세히 논의한 바와 같이, 적절한 Fc 영역을 사용하여, 세포 표면에 결합된 네이키드 항체는 예를 들어, 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)을 통해 또는 보체 의존성 세포독성에서 보체를 동원함으로써, 또는 일부 다른 메카니즘에 의해 세포독성을 유도할 수 있다. 달리, 부작용 또는 치료 합병증을 최소화하도록 이펙터 기능을 제거하거나 감소시키는 것을 원하는 경우에는, 특정 다른 Fc 영역을 사용할 수 있다.
한 양태에서, 항체는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프에의 결합에 대해 경쟁하고 실질적으로 결합한다. 본 발명의 항-FcRH5 항체의 생물학적 특징, 구체적으로, 예를 들어 생체내 종양 표적화 및 임의의 세포 증식 억제 또는 세포독성 특징을 갖는 항체가 또한 고려된다.
상기 항체의 생성 방법은 본원에 상세히 설명된다.
본 발명의 항-FcRH5 항체는 포유동물에서 FcRH5-발현 암을 치료하거나, 암의 하나 이상의 증상을 완화시키는데 유용하다. 이러한 암은 조혈 암 또는 혈액-관련 암, 예를 들어 림프종, 백혈병, 골수종 또는 림프성 악성종양, 및 비장암 및 림프절의 암을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 암의 보다 특정한 예는 이러한 B-세포 연관 암, 예를 들어 고등급, 중등급 및 저등급 림프종 (B 세포 림프종, 예를 들어 점막-연관-림프성 조직 B 세포 림프종 및 비-호지킨 림프종, 외투막 세포 림프종, 버키트 림프종, 소형 림프구성 림프종, 변연대 림프종, 미만성 대세포 림프종, 여포성 림프종, 및 호지킨 림프종 및 T 세포 림프종 포함) 및 백혈병 (2차 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 예를 들어 B 세포 백혈병 (CD5+ B 림프구 포함), 골수성 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 예를 들어 급성 림프모구 백혈병 및 골수이형성증), 및 다른 혈액 및/또는 B 세포- 또는 T-세포-연관 암을 포함한다. 암은 상기한 임의의 암의 전이암을 포함한다. 항체는 포유동물에서 FcRH5 폴리펩티드를 발현하는 암 세포의 적어도 일부에 결합할 수 있다. 바람직한 양태에서, 항체는 세포 상의 FcRH5 폴리펩티드에 결합시에 FcRH5-발현 종양 세포를 파괴하거나 사멸시키기 위해, 또는 시험관내에서 또는 생체내에서 이러한 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적이다. 이러한 항체는 (임의의 물질에 접합되지 않은) 네이키드 항-FcRH5 항체를 포함한다. 세포독성 또는 세포 성장 억제 특성을 갖는 네이키드 항체에는 종양 세포 파괴에서 더욱 더 강력하게 만드는 세포독성제를 추가로 포함시킬 수 있다. 세포독성 특성은 항체를 세포독성제와 접합시켜 본원에 기재된 바와 같은 면역접합체를 형성함으로써 항-FcRH5 항체에 부여될 수 있다. 세포독성제 또는 성장 억제제는 바람직하게는 소분자이다. 독소, 예를 들어 칼리케아미신 또는 메이탄시노이드 및 이의 유사체 또는 유도체가 바람직하다.
본 발명은 본 발명의 항-FcRH5 항체, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 암을 치료하기 위한 목적에서, 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있고, 여기서 조성물은 면역접합체로서 또는 네이키드 항체로서 존재하는 하나 이상의 항-FcRH5 항체를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 조성물은 이들 항체를 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제 또는 성장 억제제, 예를 들어 화학요법제와 조합으로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항-FcRH5 항체, 및 담체를 포함하는 제제를 제공한다. 한 양태에서, 제제는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치료 제제이다.
본 발명의 다른 측면은 항-FcRH5 항체를 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 천연 서열 항체뿐만 아니라 항체의 변이체, 변형 및 인간화 버전을 코딩하는, H 및 L 쇄 모두 및 특히 초가변 영역 잔기를 코딩하는 핵산이 포함된다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 항-FcRH5 항체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 FcRH5 폴리펩티드-발현 암을 치료하거나 암의 하나 이상의 증상을 완화시키는데 유용한 방법을 제공한다. 항체 치료 조성물은 의사의 지시에 따라 단기간 (급성) 또는 만성, 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. FcRH5 폴리펩티드-발현 세포의 성장을 억제하고, 상기 세포를 사멸시키는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 항-FcRH5 항체를 포함하는 키트 및 제품을 제공한다. 항-FcRH5 항체를 함유하는 키트는 예를 들어, FcRH5 세포 사멸 분석, 세포로부터 FcRH5 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전을 위해 사용된다. 예를 들어, FcRH5의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항-FcRH5 항체를 포함할 수 있다. 시험관내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯으로의 FcRH5 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위한 항체를 포함하는 키트를 제공할 수 있다. 검출을 위해 유용한 이러한 항체에는 형광 또는 방사성 표지와 같은 표지가 제공될 수 있다.
I. 항체-약물 접합체 치료
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는, 예를 들어 종양 항원의 과다발현을 특징으로 하는 다양한 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 예시적인 상태 또는 과다증식성 장애는 양성 또는 악성 종양; 백혈병 및 림프성 악성종양을 포함한다. 다른 질환은 신경, 신경교, 성상세포, 시상하부, 선상, 포식세포, 상피, 기질성, 포배강, 염증성, 혈관신생성 및 면역, 예를 들어 자가면역 질환을 포함한다.
동물 모델 및 세포-기초 분석으로 확인되는 ADC 화합물은 종양을 보유하는 보다 고등 영장류 및 인간 임상 시험으로 추가로 시험될 수 있다. 인간 임상 시험은 비제한적으로 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종을 포함한 B 세포 증식성 장애를 겪는 환자에서 본 발명의 항-FcRH5 모노클로날 항체 또는 면역접합체의 효능을 시험하기 위해 설계될 수 있다. 임상 시험은 공지의 치료 요법, 예를 들어 공지의 화학요법제 및/또는 세포독성제를 수반한 방사선 요법 및/또는 화학요법과 병용하여 ADC의 효능을 평가하도록 설계될 수 있다.
일반적으로, 치료할 질병 또는 질환은 과다증식성 장애, 예를 들어 B 세포 증식성 장애 및/또는 B 세포 암이다. 본원에서 치료할 암의 예는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종 중에서 선택되는 B 세포 증식성 장애를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
암은 본 발명의 ADC가 암 세포에 결합할 수 있도록, FcRH5-발현 세포를 포함할 수 있다. 암에서 FcRH5 발현을 결정하기 위해, 다양한 진단/예후 분석이 이용가능하다. 한 양태에서, FcRH5 과다발현은 IHC에 의해 분석될 수 있다. 종양 생검물로부터 파라핀-포매 조직 절편을 IHC 분석에 적용하고, 검사되는 종양 세포의 염색 정도에 대해 및 검사되는 비율에서 FcRH5 단백질 염색 강도 기준을 부여할 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, ADC의 적절한 투여량은 상기 규정된 바와 같이 치료할 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 분자가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 결정될 것이다. 분자는 적합하게는 1회에 또는 일련의 처리에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질병의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg)의 분자가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 수 있다. 환자에게 투여할 ADC의 예시적인 투여량은 약 0.1 내지 약 10 mg/kg (환자 체중) 범위이다.
상태에 따라 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 치료는 질병 증상이 목적하는 수준으로 억제될 때까지 지속된다. 예시되는 투약 요법은 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량의 항-ErbB2 항체를 투여한 후, 약 2 mg/kg의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 다른 투약 요법도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링된다.
J. 병용 요법
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 항암 특성을 지닌 제2 화합물과 약제학적 병용 제제 내에 또는 병용 요법으로의 투약 계획에 조합될 수 있다. 약제학적 병용 제제 또는 투약 요법의 제2 화합물은 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않도록 병용물의 ADC에 대해 상보적 활성을 갖는다.
제2 화합물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제, 항-호르몬제, 및/또는 심장보호제일 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 유효한 양으로 병용물에 존재한다. 본 발명의 ADC를 함유하는 약제학적 조성물은 또한, 치료 유효량의 화학요법제, 예를 들어 튜불린-형성 억제제, 토포이소머라제 억제제 또는 DNA 결합제를 가질 수 있다.
한 측면에서, 제1 화합물은 본 발명의 항-FcRH5 ADC이고, 제2 화합물은 항-CD20 항체 (네이키드 항체 또는 ADC)이다. 한 양태에서, 제2 화합물은 항-CD20 항체 리툭시마브 (Rituxan®) 또는 2H7 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA)이다. 본 발명의 항-FcRH5 ADC와의 병용 면역 요법에 유용한 다른 항체는 비제한적으로 항-VEGF (예를 들어, Avastin®)를 포함한다.
비제한적으로 방사선 요법 및/또는 골수 및 말초혈액 이식, 및/또는 세포독성제, 화학요법제, 또는 성장 억제제를 포함한 다른 치료 요법을 본 발명에 따라 확인된 항암제의 투여와 병용할 수 있다. 이러한 한 양태에서, 화학요법제는 하나의 물질 또는 물질들의 조합물, 예를 들어, 사이클로포스파미드, 하이드록시다우노루비신, 아드리아마이신, 독소루비신, 빈크리스틴 (Oncovin™), 프레드니솔론, CHOP, CVP, 또는 COP, 또는 면역치료제, 예를 들어 항-CD20 (예를 들어, Rituxan®) 또는 항-VEGF (예를 들어, Avastin®)이다.
병용 요법은 동시 또는 순차적 요법으로서 투여할 수 있다. 순차적으로 투여될 때, 병용물을 2회 이상의 투여로 투여할 수 있다. 병용 투여는 별개의 제제 또는 단일 약제학적 제제를 사용하는 동시 투여, 및 어느 한 순서의 연속 투여를 포함하고, 여기서 바람직하게는 두 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 시간이 존재한다.
한 양태에서, ADC를 이용한 치료는 본원에서 확인된 항암제, 및 하나 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제의 병용 투여 (상이한 화학요법제들의 칵테일의 병용 투여를 포함함)를 포함한다. 화학요법제는 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제를 포함한다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투약 스케줄은 제조자의 지시에 따라 또는 당업자가 경험적으로 결정하는 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법에 대한 제조 및 투약 스케줄은 또한 문헌 ["Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md]에 기재되어 있다.
상기 동시 투여되는 임의의 물질에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이고, 새로 확인된 물질과 다른 화학요법제 또는 치료의 병용 작용 (상승작용)으로 인해 낮추어질 수 있다.
병용 요법은 "상승작용"을 제공할 수 있고, "상승적"인 것으로 입증되었고, 즉 활성 성분들을 함께 사용할 때 달성된 효과가 화합물을 따로 사용하여 얻은 효과들의 합보다 더 크다. 상승적 효과는 활성 성분들을 (1) 병용되는 단위 투여 제제로 동시-제제화하고 투여하거나 동시에 전달하거나; (2) 별개의 제제로서 교대로 또는 병행하여 전달하거나; (3) 몇몇 다른 요법에 의해 얻어질 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우에, 상승적 효과는 화합물을, 예를 들어 별개의 주사기로 상이한 주사에 의해 순차적으로 투여 또는 전달할 때 얻어질 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는 각각의 활성 성분의 유효 투여량을 순차적으로, 즉 연속적으로 투여하는 반면, 병용 요법에서는 2가지 이상 활성 성분의 유효 투여량을 함께 투여한다.
본 발명의 병용 요법은 하나 이상의 화학요법제(들)를 추가로 포함할 수 있다. 병용 투여는 분리된 제제 또는 단일 약제학적 제제를 사용한 공동투여 또는 동시 투여, 및 바람직하게는 활성 제제 둘 다 (또는 모두)가 이들의 생물 활성을 함께 발휘하는 일정 시간이 있는, 어느 한 순서의 연속 투여를 포함한다.
화학요법제는, 투여하는 경우, 통상적으로 이들에 대해 공지된 용량으로 투여되거나, 약물들의 병용 작용 또는 항대사물성 화학요법제의 투여에 기인할 수 있는 부정적 부작용 때문에, 임의적으로 감량된다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투약 스케쥴은 제조자의 설명에 따르거나 전문가에 의해 경험적으로 결정되는 바와 같이 사용될 수 있다.
병용될 수 있는 다양한 화학요법제가 본원에 기술된다.
일부 양태에서, 병용되는 화학요법제는 면역조절제 (IMids) (탈리도미드 및 Revlimid® (레날리도미드)), 프로테오좀 억제제 (예를 들어, Velcade® (보르테조미브) 및 PS342 포함), 보라 톡소이드 (도세탁셀 및 파클리탁셀 포함), 빈카 (예를 들어, 비노렐빈 또는 빈블라스틴), 백금 화합물 (예: 카르보플라틴 또는 시스플라틴), 아로마타제 억제제 (예를 들어, 레트로졸, 아나스트로졸 또는 엑세메스탄), 항-에스트로겐 (예를 들어, 플베스트란트 또는 타목시펜), 에토포시드, 티오테파, 사이클로포스파미드, 페메트렉세드, 메토트렉세이트, 리포좀 독소루비신, 페길화된 리포좀 독소루비신, 카페시타빈, 겜시타빈, 멜탈린, 독소루비신, 빈크리스틴, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 또는 스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손 및 프레드니손)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 양태 (예를 들어, 다발성 골수종의 처치를 포함하는 양태)에서, 덱사메타손 및 레날리도미드, 또는 덱사메타손, 또는 보르테조미브, 또는 빈크리스틴, 독소루비신 및 덱사메타손, 또는 탈리도미드 및 덱사메타손, 또는 리포좀 독소루비신, 빈크리스틴 및 덱사메타손, 또는 레날리도미드 및 덱사메타손, 또는 보르테조미브 및 덱사메타손, 또는 보르테조미브, 독소루비신, 및 덱사메타손이 병용된다.
일부 양태에서, 병용되는 화학요법제는 Revlimid® (레날리도미드)), 프로테오좀 억제제 (예를 들어, Velcade® (보르테조미브) 및 PS342), 보라 톡소이드 (도세탁셀 및 파클리탁셀 포함), 빈카 (예를 들어, 비노렐빈 또는 빈블라스틴), 백금 화합물 (예: 카르보플라틴 또는 시스플라틴), 아로마타제 억제제 (예를 들어, 레트로졸, 아나스트로졸 또는 엑세메스탄), 항-에스트로겐 (예를 들어, 플베스트란트 또는 타목시펜), 에토포시드, 티오테파, 사이클로포스파미드, 페메트렉세드, 메토트렉세이트, 리포좀 독소루비신, 페길화된 리포좀 독소루비신, 카페시타빈, 겜시타빈, 멜탈린, 독소루비신, 빈크리스틴, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 또는 스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손 및 프레드니손)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
일부 양태 (악성 골수종의 처치를 수반하는 양태)에서, 덱사메타손 및 레날리도미드, 또는 덱사메타손, 및 보르테조미브가 병용된다.
하나의 다른 양태에서, 병용 요법은 항체 또는 면역접합체 및 하나 초과이 화학요법제를 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 면역접합체는 (i) 빈크리스틴, 독소루비신 (리포좀 또는 비-리포좀 제제 중), 및 덱사메타손; (ii) 탈리도미드 및 덱사메타손; (iii) Velcade® (보르테조미브), 독소루비신, 및 덱사메타손; (iv) Velcade® (보르테조미브), 탈리도미드, 및 덱사메타손; (v) 멜팔란 및 프레드니손; (vi) 멜팔란, 프레드니손, 및 탈리도미드; (vii) 멜팔란, 프레드니손 및 Velcade® (보르테조미브); (viii) 빈크리스틴, 독소루비신, 및 덱사메타손; 또는 (ix) 탈리도미드 및 덱사메타손과 병용될 수 있다.
하나의 양태에서, 병용 요법은 본원에 기술된 항체 또는 면역접합체 및 하나 이상의 (i) Velcade® (보르테조미브), (ii) 덱사메타손, (iii) Revlimid® (레날리도미드)를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 병용 요법은 항체 또는 면역접합체, 및 덱사메타손과 Revlimid® (레날리도미드) 둘 모두 또는 Velcade® (보르테조미브)와 덱사메타손 둘 모두를 포함한다. 또 다른 양태에서, 병용 요법은 항체 또는 면역접합체, 및 각각의 Velcade® (보르테조미브), 덱사메타손 및 Revlimid® (레날리도미드)를 포함한다.
K. 제품 및 키트
본 발명의 다른 양태는 FcRH5-발현 암의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이다. 제품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 연관된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 암 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항-FcRH5 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 암의 치료를 위해 사용됨을 나타낸다. 표지 또는 포장 삽입물은 암 환자에게 항체 조성물을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 추가로, 제품은 약제학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 (Ringer)액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적, 예를 들어 FcRH5-발현 세포 사멸 분석, 세포로부터 FcRH5 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전을 위해 유용한 키트도 제공된다. FcRH5 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항-FcRH5 항체를 포함할 수 있다. 시험관내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯으로의 FcRH5 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위한 항체를 포함하는 키트를 제공할 수 있다. 제품과 같이, 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 연관된 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 적어도 하나의 본 발명의 항-FcRH5 항체를 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어, 희석제 및 완충액, 대조 항체를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물에 대한 설명 및 의도하는 시험관내 또는 검출 용도에 대한 지시를 제공할 수 있다.
L. FcRH5 폴리펩티드에 대한 용도
본 발명은 FcRH5 폴리펩티드를 모방하는 화합물 (작용제) 또는 FcRH5 폴리펩티드의 효과를 방지하는 화합물 (길항제)을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보에 대한 스크리닝 분석은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 FcRH5 폴리펩티드에 결합하거나 복합체를 형성하거나, 또는 달리, 예를 들어 세포로부터 FcRH5 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것을 포함하여 다른 세포성 단백질과 코딩된 폴리펩티드의 상호작용을 저해하는 화합물을 확인하기 위해 설계된다. 상기 스크리닝 분석은 화학적 라이브러리의 고효율 스크리닝에 적용가능한 분석을 포함할 것이고, 이는 소분자 약물 후보를 확인하는데 적합하도록 한다.
분석은 당업계에서 널리 특징분석된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석, 및 세포-기초 분석을 포함한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
길항제에 대한 모든 분석은 2가지 성분의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩되는 FcRH5 폴리펩티드와 약물 후보를 접촉시키는 것을 필요로 한다는 점에서 공통적이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체는 반응 혼합물 내에서 단리되거나 검출될 수 있다. 특정 양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 FcRH5 폴리펩티드 또는 약물 후보를 고체상, 예를 들어, 미세적정 플레이트 상에, 공유 또는 비-공유 부착에 의해 고정시킨다. 비-공유 부착은 일반적으로 고체 표면을 FcRH5 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시켜 달성된다. 달리, 고정시킬 FcRH5 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 고착시킬 수 있다. 분석은 검출가능 표지로 표지될 수 있는 비-고정된 성분을 고정된 성분, 예를 들어 고착된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 완료되면, 비-반응 성분은, 예를 들어 세척에 의해 제거하고, 고체 표면에 고착된 복합체를 검출한다. 최초의 비-고정된 성분이 검출가능한 표지를 보유하는 경우에, 표면 상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 나타낸다. 최초의 비-고정된 성분이 표지를 보유하지 않는 경우에는, 복합체 형성은, 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 특정 FcRH5 폴리펩티드와 상호작용하지만 그에 결합하지는 않는 경우에, 폴리펩티드와 이의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 잘 공지되어 있는 방법에 의해 분석될 수 있다. 이러한 분석은, 예를 들어 가교결합, 동시-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시-정제와 같은 전통적인 방법을 포함한다. 추가로, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Chevray and Nathans, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 5789-5793 (1991)]에 개시된 바와 같이 필즈 (Fields)와 동료 [Fields and Song, Nature ( London ), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)]에 의해 설명된 효모 기초 유전자 시스템을 사용하여 모니터링될 수 있다. 많은 전사 활성화제, 예를 들어 효모 GAL4는 2개의 물리적으로 구분되는 모듈 (modular) 도메인으로 이루어지고, 여기서 하나의 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 다른 하나의 도메인은 전사-활성화 도메인으로 작용한다. 상기 공개문에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로 "2-하이브리드 시스템"으로 칭함)은 상기 특성을 이용하고, 2개의 하이브리드 단백질을 사용하며, 여기서 하나의 단백질에서는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합되고, 다른 단백질에서는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된다. GAL4-활성화된 프로모터의 조절 하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따른다. 상호작용 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출된다. 2-하이브리드 기술을 이용하여 2개의 특이적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (MATCHMAKER™)는 Clontech으로부터 상업적으로 입수가능하다. 상기 시스템은 또한 특이적 단백질 상호작용에 관여되는 단백질 도메인의 지도를 작성하고, 이들 상호작용에 중요한 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 제시하도록 확장될 수 있다.
본원에서 확인된 FcRH5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험될 수 있다: 대체로, 유전자의 생성물 및 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물은 2개의 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 하에 충분한 시간 동안 제조된다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응은 시험 화합물의 부재 및 존재 하에 실시된다. 추가로, 양성 대조군으로 역할을 하도록 위약을 제3 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 시험 화합물과 혼합물 내에 존재하는 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)은 본원에서 상기한 바와 같이 모니터링된다. 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서가 아니라 대조 반응물(들)에서 복합체의 형성은 시험 화합물이 시험 화합물과 이의 반응 파트너의 상호작용을 방해함을 나타낸다.
길항제에 대해 분석하기 위해, FcRH5 폴리펩티드를 특정 활성에 대해 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 첨가할 수 있고, FcRH5 폴리펩티드의 존재 하에 목적하는 활성을 억제하는 화합물의 능력은 화합물이 FcRH5 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타낸다. 달리, 길항제는 경쟁적 억제 분석에 적절한 조건 하에 FcRH5 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합된 FcRH5 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 조합함으로써 검출될 수 있다. 수용체에 결합된 FcRH5 폴리펩티드 분자의 수를 사용하여 잠재적인 길항제의 유효성을 결정할 수 있도록, FcRH5 폴리펩티드는 예를 들어 방사성에 의해 표지될 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지된 수많은 방법, 예를 들어 리간드 패닝 및 FACS 분류에 의해 확인할 수 있다 [Coligan et al., Current Protocols in Immun ., 1(2): Chapter 5 (1991)]. 바람직하게는, 폴리아데닐화 RNA를 FcRH5 폴리펩티드에 반응성인 세포로부터 제조하고, 상기 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 풀 (pool)로 분할하고 FcRH5 폴리펩티드에 비반응성인 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키기 위해 사용하는 발현 클로닝이 사용된다. 유리 슬라이드 상에서 성장시킨 형질감염된 세포를 표지된 FcRH5 폴리펩티드에 노출시킨다. FcRH5 폴리펩티드는 요오드화, 또는 부위-특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 도입을 포함한 다양한 수단에 의해 표지될 수 있다. 고정 및 인큐베이션 후에, 슬라이드를 자가방사선촬영 분석에 적용한다. 양성 풀을 확인하고, 하위 풀을 제조하고, 상호작용성 하위 풀 수거를 사용하여 재형질감염시키고, 재-스크리닝 과정을 통해 최종적으로 추정 수용체를 코딩하는 단일 클론을 생성한다.
또 다른 수용체 확인 접근으로서, 표지된 FcRH5 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물 제제와 광친화도-연결될 수 있다. 가교결합된 물질을 PAGE에 의해 분리하여 X-선 필름에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절제하고, 펩티드 단편으로 분리한 후, 단백질 미세 서열결정 (micro-sequencing) 과정에 적용할 수 있다. 미세 서열결정으로부터 얻은 아미노산 서열은 추정 수용체를 코딩하는 유전자를 확인하기 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 설계하는데 사용될 것이다.
길항제에 대한 다른 분석에서, 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 제제를 후보 화합물의 존재 하에 표지된 FcRH5 폴리펩티드와 함께 인큐베이션할 것이다. 이어서, 상기 상호작용을 향상 또는 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
잠재적인 길항제의 보다 특정한 예는 면역글로불린과 FcRH5 폴리펩티드의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 특히 비제한적으로 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 상기 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편을 포함하는 항체를 포함한다. 달리, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 효과를 부여하지 못하여 FcRH5 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 돌연변이된 형태의 FcRH5 폴리펩티드일 수 있다.
본원에서 확인된 FcRH5 폴리펩티드, 및 상기 개시된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 암을 포함한 다양한 질환의 치료를 위해 약제학적 조성물 형태로 투여될 수 있다.
FcRH5 폴리펩티드가 세포내성이고, 전체 항체가 억제제로서 사용되는 경우, 내재화 항체가 바람직하다. 그러나, 항체 또는 항체 단편을 세포 내로 전달하기 위해 리포감염 (lipofection) 또는 리포좀이 또한 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고/하거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90: 7889-7893 (1993)] 참조).
본원의 제제는 또한 치료할 특정 증상에 필요하면 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 달리 또는 추가로, 조성물은 이의 기능을 향상시키는 물질, 예를 들어 세포독성제, 사이토킨, 화학요법제 또는 성장억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합으로 존재한다.
M. 항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 이의 물에서 안정성 때문에 제조상 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지되거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우에 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선시킬 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
N. 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 양태는 FcRH5 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내에서 FcRH5 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 샘플을 FcRH5 폴리펩티드에 결합하는 항체 약물 접합체에 노출시키고, 샘플 내의 FcRH5 폴리펩티드에 대한 이의 항체 약물 접합체를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 이러한 결합의 존재는 샘플 내에 FcRH5 폴리펩티드의 존재를 표시한다. 임의로, 샘플은 FcRH5 폴리펩티드를 발현하는 것으로 의심되는 (암 세포일 수 있는) 세포를 함유할 수 있다. 이 방법에서 사용되는 이의 항체 약물 접합체는 임의로 검출가능하게 표지되거나, 고체 지지체에 부착될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 포유동물에서 종양의 존재를 진단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포를 포함하는 시험 샘플을 FcRH5 폴리펩티드에 결합하는 이의 항체 약물 접합체와 접촉시키고, (b) 이의 항체 약물 접합체와 시험 샘플 내의 FcRH5 폴리펩티드 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 복합체의 형성은 포유동물에서 종양의 존재를 표시한다. 임의로, 이의 항체 약물 접합체는, 예를 들어 검출가능하게 표지되고, 고체 지지체에 부착되고/되거나 조직 세포의 시험 샘플은 암성 종양을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된다.
IV. 항- FcRH5 항체 및 면역접합체를 사용하는 추가의 방법
A. 진단 방법 및 검출 방법
한 측면에서, 본 발명의 항-FcRH5 항체 및 면역접합체는 생물학적 샘플 내에서 FcRH5의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 특정 양태에서, 이러한 조직은 다른 조직에 비해 더 높은 수준으로 FcRH5를 발현하는 정상 및/또는 암성 조직, 예를 들어 B 세포 및/또는 B 세포 관련 조직을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내에서 FcRH5의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 이 방법은 생물학적 샘플을 FcRH5에 대한 항-FcRH5 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 항-FcRH5 항체와 접촉시키고, 항-FcRH5 항체와 FcRH5 사이에 복합체가 형성되는지 검출하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRH5의 증가된 발현과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 이 방법은 시험 세포를 항-FcRH5 항체와 접촉시키고; FcRH5에 대한 항-FcRH5 항체의 결합을 검출함으로써 시험 세포에 의한 FcRH5의 발현 수준을 (정량적으로 또는 정성적으로) 결정하고; 시험 세포에 의한 FcRH5의 발현 수준을 대조 세포 (예를 들어, 시험 세포와 동일한 조직에서 기원하는 정상 세포, 또는 상기 정상 세포와 대등한 수준으로 FcRH5를 발현하는 세포)에 의한 FcRH5의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 대조 세포에 비해 시험 세포에 의한 FcRH5의 더 높은 발현 수준은 FcRH5의 증가된 발현과 연관된 질환의 존재를 나타낸다. 특정 양태에서, 시험 세포는 FcRH5의 증가된 발현과 연관된 질환이 있는 것으로 의심되는 개체로부터 얻는다. 특정 양태에서, 질환은 세포 증식성 장애, 예를 들어 암 또는 종양이다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단할 수 있는 예시적인 세포 증식성 장애는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종을 포함하고 이로 제한되지 않는 B 세포 질환 및/또는 B 세포 증식성 장애를 포함한다.
특정 양태에서, 상기한 바와 같은 진단 또는 검출의 방법은 세포 표면 상에서 또는 이의 표면 상에 FcRH5를 발현하는 세포로부터 얻은 막 제제 내에서 발현된 FcRH5에 대한 항-FcRH5 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 이 방법은 세포를 FcRH5에 대한 항-FcRH5 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 항-FcRH5 항체와 접촉시키고, 항-FcRH5 항체와 세포 표면 상의 FcRH5 사이에 복합체가 형성되는지를 결정하는 단계를 포함한다. 세포의 표면 상에 발현된 FcRH5에 대한 항-FcRH5 항체의 결합을 검출하기 위한 예시적인 분석은 "FACS" 분석이다.
FcRH5에 대한 항-FcRH5 항체의 결합을 검출하기 위해 특정 다른 방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 잘 공지된 항원-결합 분석, 예를 들어 웨스턴 블롯, 방사면역분석법, ELISA (효소 결합된 면역흡착 분석), "샌드위치 (sandwich)" 면역분석, 면역침전 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석, 및 면역조직화학 (IHC)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 항-FcRH5 항체는 표지된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 모이어티 (예를 들어, 형광, 발색, 전자 밀집 (electron-dense), 화학발광, 및 방사성 표지), 및 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 형광단, 예를 들어 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 [미국 특허 4,737,456], 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예를 들어 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 바이오틴/아비딘, 스핀 (spin) 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 항-FcRH5 항체는 불용성 매트릭스 상에 고정된다. 고정은 용액 내에 유리 상태로 남아있는 임의의 FcRH5로부터 항-FcRH5 항체를 분리하는 것을 수반한다. 이것은 통상적으로 분석 절차 전에 항-FcRH5 항체의 불용화에 의해, 수불용성 매트릭스 또는 표면에 대한 흡착에 의해 [미국 특허 3,720,760 (Bennich 등)], 또는 공유 커플링 (예를 들어, 글루타르알데하이드 가교결합 사용)에 의해, 또는 예를 들어 면역침전에 의해 항-FcRH5 항체와 FcRH5 사이의 복합체 형성 후에 항-FcRH5 항체의 불용화에 의해 달성된다.
진단 또는 검출의 임의의 상기 양태는 항-FcRH5 항체 대신에 또는 그에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행할 수 있다.
B. 치료 방법
본 발명의 항체 또는 면역접합체는, 예를 들어 시험관내에서, 생체 외에서 및 생체내에서 치료 방법에 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공하고, 이 방법은 세포를 FcRH5에 대한 면역접합체의 결합을 허용하는 조건 하에 항-FcRH5 항체 또는 이의 면역접합체에 노출시키는 단계를 포함한다. "세포 성장 또는 증식을 억제하는"은 세포의 성장 또는 증식을 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 또는 100％ 감소시키는 것을 의미하고, 세포 사멸의 유도를 포함한다. 특정 양태에서, 세포는 종양 세포이다. 특정 양태에서, 세포는 B 세포이다. 특정 양태에서, 세포는, 예를 들어 본원에 예시된 바와 같은 이종이식편이다.
한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 B 세포 증식성 장애를 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 특정 양태에서, 세포 증식성 장애는 FcRH5의 증가된 발현 및/또는 활성과 연관된다. 예를 들어, 특정 양태에서, B 세포 증식성 장애는 B 세포의 표면에서 FcRH5의 증가된 발현과 연관된다. 특정 양태에서, B 세포 증식성 장애는 종양 또는 암이다. 본 발명의 항체 또는 면역접합체에 의해 치료되는 B 세포 증식성 장애의 예는 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-FcRH5 항체 또는 이의 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, B 세포 증식성 장애를 치료하는 방법은 개체에게 항-FcRH5 항체 또는 항-FcRH5 면역접합체 및 임의로 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어 아래에 제시된 것을 포함하는 약제학적 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 세포 증식성 장애를 치료하는 방법은 개체에게 1) 항-FcRH5 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체; 및 임의로 2) 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어 아래에 제시된 것을 포함하는 약제학적 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 적어도 일부는 인간 이외의 다른 종으로부터 유래한 FcRH5에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 예를 들어, FcRH5를 함유하는 세포 배양물에서, 인간에서, 또는 본 발명의 항체 또는 면역접합체가 교차-반응하는 FcRH5를 갖는 다른 포유동물 (예를 들어, 침팬지, 비비 (baboon), 마모셋, 사이노몰거스 원숭이 및 붉은털 원숭이, 돼지 또는 생쥐)에서 FcRH5에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 한 양태에서, 항-FcRH5 항체 또는 면역접합체는, 면역접합체의 접합된 세포독소가 세포 내부로 접근하도록 항체 또는 면역접합체를 FcRH5와 접촉시켜 항체 또는 면역접합체-항원 복합체를 형성시킴으로써 B 세포 상의 FcRH5를 표적화하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서, FcRH5는 인간 FcRH5이다.
한 양태에서, 항-FcRH5 항체 또는 면역접합체는 증가된 FcRH5 발현 및/또는 활성과 연관된 질환으로 고통받는 개체에서 FcRH5를 결합시키는 방법에서 사용될 수 있고, 이 방법은 개체 내에 존재하는 FcRH5가 결합되도록 개체에게 항체 또는 면역접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 결합된 항체 또는 면역접합체는 FcRH5를 발현하는 B 세포 내로 내재화된다. 한 양태에서, FcRH5는 인간 FcRH5이고, 개체는 인간 개체이다. 달리, 개체는 항-FcRH5 항체가 결합하는 FcRH5를 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 개체는 (예를 들어, FcRH5의 투여에 의해 또는 FcRH5를 코딩하는 이식유전자의 발현에 의해) FcRH5가 도입된 포유동물일 수 있다.
항-FcRH5 항체 또는 면역접합체는 치료 목적으로 인간에게 투여될 수 있다. 또한, 항-FcRH5 항체 또는 면역접합체는 수의용으로 또는 인간 질병의 동물 모델로서, 항체가 교차-반응하는 FcRH5를 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지, 래트 또는 생쥐)에게 투여될 수 있다. 인간 질병의 동물 모델의 경우에, 상기 동물 모델은 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어, 투여량 및 투여의 시간 경과를 시험하는데) 유용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 병용으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 적어도 하나의 추가의 치료제 및/또는 어쥬번트와 동시 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 추가의 치료제는 세포독성제, 화학요법제, 또는 성장 억제제이다. 이러한 한 양태에서, 화학요법제는 하나의 물질 또는 물질들의 조합물, 예를 들어, 사이클로포스파미드, 하이드록시다우노루비신, 아드리아마이신, 독소루비신, 빈크리스틴 (Oncovin™), 프레드니솔론, CHOP, CVP, 또는 COP, 또는 면역치료제, 예를 들어 항-CD20 (예를 들어, Rituxan®) 또는 항-VEGF (예를 들어, Avastin®)이고, 여기서 병용 요법은 암 및/또는 B 세포 질환, 예를 들어 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 외투막 세포 림프종을 포함한 B 세포 증식성 장애의 치료에 유용하다.
상기한 이러한 병용 요법은 병용 투여 (여기서, 2 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제에 포함된다) 및 별개의 투여를 포함하고, 그 경우에, 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 수행될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 또한 방사선 요법과 병용으로 사용될 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체 (및 임의의 추가의 치료제 또는 어쥬번트)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 국소 치료용으로 필요할 경우에 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 추가로, 항체 또는 면역접합체는 적합하게는, 특히 감소하는 투여량의 항체 또는 면역접합체를 사용하는 경우에 펄스 주입에 의해 투여된다. 투약은 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 부분적으로는 투여가 짧은지 또는 장기인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 치료제 (본 발명의 항체 또는 면역접합체)는 우수 의료 실무와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이러한 측면에서 고려되는 인자는 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체 또는 면역접합체는 반드시 그럴 필요는 없지만 임의로 해당 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 물질과 함께 제제화된다. 이러한 다른 물질의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99％로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로로 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해 (단독으로 또는 화학요법제와 같은 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 병용으로 사용될 때) 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 항체 또는 면역접합체의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 항체 또는 면역접합체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상력 및 항체 또는 면역접합체에 대한 반응, 및 담당 의사의 결정에 따라 결정될 것이다. 항체 또는 면역접합체는 적합하게는 한번에 또는 일련의 처리에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질병의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg)의 항체 또는 면역접합체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질병 증상이 목적하는 수준으로 억제될 때까지 지속될 것이다. 항체 또는 면역접합체의 한 가지 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합)의 항체 또는 면역접합체 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20회, 예를 들어 약 6회 용량의 항체 또는 면역접합체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 보다 높은 초기 로딩 용량, 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투약 요법은 약 4 mg/kg의 항체의 초기 로딩 용량 후에 약 2 mg/kg의 항체의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약 요법도 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링된다.
C. 활성 분석
본 발명의 항-FcRH5 항체 및 면역접합체는 당업계에 공지된 다양한 분석에 의해 그들의 물리/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성 결정될 수 있다.
1. 활성 분석
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항-FcRH5 항체 또는 이의 면역접합체를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어 세포 성장 또는 증식을 억제하는 능력 (예를 들어, "세포 사멸" 활성), 또는 예정된 세포 사멸 (세포자멸)을 포함한 세포 사멸을 유도하는 능력을 포함할 수 있다. 생체내에서 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체 또는 면역접합체를 또한 제공한다.
특정 양태에서, 항-FcRH5 항체 또는 이의 면역접합체를 시험관내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 이의 능력에 대해 시험한다. 세포 성장 또는 증식 억제에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 기재된 "세포 사멸" 분석으로 예시된, 세포 증식에 대한 특정 분석에서는 세포 생활력을 측정한다. 하나의 이러한 분석은 CellTiter-Glo™ 발광 세포 생활력 분석 (Luminescent Cell Viability Assay)이고, 이는 Promega (Madison, WI)로부터 상업적으로 입수가능하다. 상기 분석은 대사적 활성 세포의 지표인 존재하는 ATP의 정량을 기초로 하여 배양물 내의 생존가능한 세포의 수를 결정한다 [Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; 미국 특허 6602677]. 분석은 자동화 고효율 스크리닝 (HTS)을 가능하게 하는 96- 또는 384-웰 포맷으로 수행될 수 있다 [Cree et al. (1995) Anticancer Drugs 6:398-404]. 분석 절차는 단일 시약 (CellTiter-Glo® 시약)을 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 수반한다. 이에 의해 세포 용해, 및 루시퍼라제 반응에 의해 발광 신호가 생성된다. 발광 신호는 존재하는 ATP의 양에 비례하고, 이는 배양물에 존재하는 생존가능한 세포의 수에 정비례한다. 데이타는 발광측정기 또는 CCD 카메라 영상 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 출력은 상대 광 단위 (RLU)로서 표현된다.
세포 증식을 위한 다른 분석은 미토콘드리아 리덕타제에 의한 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드의 포르마잔으로의 산화를 측정하는 비색 분석인 "MTT" 분석이다. CellTiter-Glo™ 분석과 마찬가지로, 상기 분석은 세포 배양물에 존재하는 대사적 활성 세포의 수를 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63; Zhang et al. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882] 참조).
한 측면에서, 항-FcRH5 항체를 시험관내에서 세포 사멸을 유도하는 이의 능력에 대해 시험한다. 세포 사멸 유도에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 양태에서, 상기 분석은, 예를 들어 요오드화프로피듐 (PI), 트리판 블루 (문헌 [Moore et al. (1995) Cytotechnology 17:1-11] 참조) 또는 7AAD의 흡수에 의해 표시되는 막 통합성의 상실을 측정한다. 예시적인 PI 흡수 분석에서, 세포를 10％ 열-불활성화 FBS (하이클론 (Hyclone)) 및 2 mM L-글루타민을 보충한 둘베코 개질 이글 배지 (D-MEM):햄 F-12 (50:50) 내에서 배양한다. 따라서, 분석은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행한다. 세포를 100 x 20 mm 디쉬에 디쉬 당 3x106의 밀도로 접종하고, 철야 부착시킨다. 배지를 제거하고 신선한 배지 단독으로 또는 다양한 농도의 항체 또는 면역접합체를 함유하는 배지로 교체한다. 세포를 3일 동안 인큐베이션한다. 처리 후에, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신처리에 의해 탈착시킨다. 이어서, 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하고, 펠렛을 3 ml의 냉 Ca2 + 결합 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) 내에 재현탁시키고, 세포 덩어리를 제거하기 위해 35 mm의 스트레이너-마개가 있는 12 x 75 mm 튜브 (1 ml/튜브, 처리군 당 3개 튜브) 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)를 넣는다. 샘플은 FACSCAN® 유동 세포 측정기 및 FACSCONVERT® CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 분석한다. 이에 의해, PI 흡수에 의해 결정할 때 통계학상 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 항체 또는 면역접합체가 확인된다.
한 측면에서, 항-FcRH5 항체 또는 면역접합체를 시험관내에서 세포자멸 (예정된 세포 사멸)을 유도하는 이의 능력에 대해 시험한다. 세포자멸을 유도하는 항체 또는 면역접합체에 대한 예시적인 분석은 아넥신 결합 분석이다. 예시적인 아넥신 결합 분석에서, 선행 문단에서 논의한 바와 같이 세포를 배양하고 디쉬 내에 접종한다. 배지를 제거하고, 신선한 배지 단독으로 또는 0.001 내지 10 ㎍/ml의 항체 또는 면역접합체를 함유하는 배지로 교체한다. 3일의 인큐베이션 기간 후에, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신처리에 의해 탈착시킨다. 이어서, 세포를 원심분리하고, Ca2 + 결합 완충액 내에 재현탁시키고, 선행 문단에 논의된 바와 같이 튜브 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 표지된 아넥신 (예를 들어, 아넥신 V-FITC) (1 ㎍/ml)을 넣는다. 샘플을 FACSCAN™ 유동 세포 측정기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 분석한다. 이에 의해 대조군에 비해 통계학상 유의한 수준의 아넥신 결합을 유도하는 항체 또는 면역접합체가 확인된다. 세포자멸을 유도하는 항체 또는 면역접합체에 대한 다른 예시적인 분석은 게놈 DNA의 뉴클레오좀내 분해를 검출하기 위한 히스톤 DNA ELISA 비색 분석이다. 이러한 분석은 예를 들어, 세포 사멸 검출 ELISA 키트 (Roche, Palo ALto, CA)를 사용하여 수행될 수 있다.
임의의 상기 시험관내 분석에 사용하기 위한 세포는 자연적으로 FcRH5를 발현하거나 FcRH5를 발현하도록 조작된 세포 또는 세포주를 포함한다. 이러한 세포는 동일한 조직 기원의 정상 세포에 비해 FcRH5를 과다발현하는 종양 세포를 포함한다. 이러한 세포는 또한 FcRH5를 발현하는 세포주 (종양 세포주 포함), 및 정상적으로 FcRH5를 발현하지 않지만 FcRH5를 코딩하는 핵산으로 형질감염된 세포주를 포함한다.
한 측면에서, 항-FcRH5 항체 또는 이의 면역접합체를 생체내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 이의 능력에 대해 시험한다. 특정 양태에서, 항-FcRH5 항체 또는 이의 면역접합체를 생체내에서 종양 성장을 억제하는 이의 능력에 대해 시험한다. 생체내 모델 시스템, 예를 들어 이종이식편 모델을 이러한 시험을 위해 사용할 수 있다. 예시적인 이종이식편 시스템에서, 인간 종양 세포를 적합하게 면역손상시킨 비-인간 동물, 예를 들어 SCID 생쥐에 도입한다. 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 동물에게 투여한다. 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 항체 또는 면역접합체의 능력을 측정한다. 상기 이종이식편 시스템의 특정 양태에서, 인간 종양 세포는 인간 환자로부터의 종양 세포이다. 이종이식편 모델의 제조에 유용한 이러한 세포는 비제한적으로 BJAB-luc 세포 (루시퍼라제 리포터 유전자로 형질감염된 EBV-음성 버키트 림프종 세포주), Ramos 세포 (ATCC, CRL-1923), SuDHL-4 세포 (DSMZ, Braunschweig, Germany, AAC 495), DoHH2 세포 (문헌 [Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 5:221-224 (1991); Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 8: 1385-1391 (1994)] 참조), Granta-519 세포 (문헌 [Jadayel, D.M. et al., Leukemia 11(1):64-72 (1997)] 참조)를 포함하는 인간 백혈병 및 림프종 세포주를 포함한다. 특정 양태에서, 인간 종양 세포는 피하 주사에 의해 적합하게 면역손상시킨 비-인간 동물 내로 또는 이식에 의해 적합한 부위, 예를 들어 유지방체 (mammary fat pad) 내로 도입된다.
2. 결합 분석 및 다른 분석
한 측면에서, 항-FcRH5 항체를 이의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 항-FcRH5 항체를 세포의 표면 상에 발현된 FcRH5에 결합하는 이의 능력에 대해 시험한다. 이러한 시험을 위해 FACS 분석을 사용할 수 있다.
한 측면에서, FcRH5에 대한 결합을 위해 뮤린 10A8 항체 (mu10A8) 및/또는 10A8v1 항체 (hu10A8v1)와 경쟁하는 모노클로날 항체를 확인하기 위해 경쟁 분석을 사용할 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 경쟁 항체는 뮤린 10A8 항체 (mu 10A8) 및/또는 인간화 10A8v1 항체 (hu 10A8v1)가 결합하는 것과 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 예시적인 경쟁 분석은 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]에 제시된 것과 같은 통상적인 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제시되어 있다. 2개의 항체가 각각 서로 다른 항체의 결합을 50％ 이상 차단하는 경우에 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 말해진다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정된 FcRH5를, FcRH5에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 뮤린 10A8 항체, 키메라 10A8 항체 (ch10A8) 및/또는 인간화 10A8v1 항체 (hu10A8v1)) 및 FcRH5에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 이의 능력에 대해 시험되는 제2 표지되지 않은 항체를 포함하는 용액 내에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상등액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 FcRH5를, 제1 표지된 항체만을 포함하고 제2 표지되지 않은 항체를 포함하지 않는 용액 내에서 인큐베이션한다. FcRH5에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후, 과잉의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정된 FcRH5와 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 FcRH5와 회합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이것은 제2 항체가 FcRH5에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁함을 나타낸다. 특정 양태에서, 고정된 FcRH5는 세포의 표면 상에, 또는 이의 표면 상에 FcRH5를 발현하는 세포로부터 수득한 막 제제 내에 존재한다.
한 측면에서, 정제된 항-FcRH5 항체는 N-말단 서열 결정, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 분해를 포함하고 이로 제한되지 않는 일련의 분석에 의해 추가로 특성 결정될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 항체를, 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 및 ADCC)에는 불필요하거나 유해한 많은 용도에 대한 바람직한 후보가 되게 하는, 모든 이펙터 기능이 아니라 일부의 이펙터 기능만을 보유하는 변경된 항체를 고려한다. 특정 양태에서, 목적하는 특성만이 유지되는 것을 보장하기 위해 항체의 Fc 활성을 측정한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석은 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성이 결여될 수 있음), 항체가 FcRn 결합능을 보유하는 것을 보장하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 464면 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 예는 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재되어 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 달리 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되는 지를 확인하기 위해 C1q 결합 분석을 수행할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 소실율/반감기 결정을 수행할 수 있다.
다음 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려고 의도되지 않는다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참조 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예에서 언급된 상업적으로 이용가능한 시약은 달리 지시하지 않는 한 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 실시예에서 사용된 항체는 상업적으로 이용가능한 항체 또는 본원에 기술된 항체이다. 하기 실시예 및 명세서 전체에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)이다.
실시예 1 : FcRH5 를 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 FcRH5에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 설명한다.
모노클로날 항체를 생성하는 기술은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Goding, 상기 참조]에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 면역원은 정제된 FcRH5, FcRH5를 포함하는 융합 단백질, 및 세포 표면 상의 재조합 FcRH5를 발현하는 세포를 포함한다. 면역원의 선택은 과도한 실험 없이 숙련된 기술자에 의해 수행될 수 있다.
생쥐, 예를 들어 Balb/c를 완전한 프로인트 (Freund's) 어쥬번트에 유화된 FcRH5 면역원으로 면역화시키고, 1 내지 100 마이크로그램의 양으로 피하 또는 복강내 주사한다. 달리, 면역원을 MPL-TDM 어쥬번트 (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시키고, 동물의 뒤쪽 발바닥에 주사한다. 이어서, 면역화시킨 생쥐를 선택된 어쥬번트에 유화된 추가의 면역원으로 10 내지 12일 후에 부스팅한다. 그 후, 수주 동안, 생쥐를 또한 추가의 면역화 주사로 부스팅할 수 있다. 혈청 샘플을 ELISA 검정으로 시험하기 위해 레트로-오비탈 출혈로 생쥐로부터 주기적으로 수득하여 항-FcRH5 항체를 검출할 수 있다.
적합한 항체 역가를 검출한 후, 항체에 대해 "양성"인 동물을 면역원의 최종 정맥내 주사로 주사할 수 있다. 3 내지 4일 후, 생쥐를 죽이고, 비장 세포를 수거한다. 이어서, 비장 세포를 선별된 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 P3X63AgU.1 (입수처: ATCC, No. CRL 1597)에 융합시킨다. 융합은 하이브리도마를 생성하며, 이를 비-융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제할 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양판에 플레이팅할 수 있다.
하이브리도마 세포는 면역원에 대한 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝될 것이다. 면역원에 대해 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포의 결정은 당해 기술 분야에 속한다.
양성 하이브리도마 세포를 동계 Balb/c 생쥐에 복강내로 주사하여 항-면역 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생성할 수 있다. 달리, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라크스 또는 롤로 바틀에서 성장될 수 있다. 복수 중에 생성된 모노클로날 항체의 정제는 황산암모늄 침전에 이어 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있다. 달리, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합을 기초로 하는 친화도 크로마토그래피가 이용될 수 있다.
본원에 기술된 FcRH5 폴리펩티드에 대해 지시되는 항체는 이러한 기술(들)을 이용하여 성공적으로 생성될 수 있다. 더욱 구체적으로, (ELISA, FACS 분류 분석 및/또는 면역조직화학 분석으로 측정되는) FcRH5 단백질을 인식하고 이에 결합할 수 있는 기능성 모노클로날 항체가 본원에 기술되는 바와 같은 FcRH4 단백질: PRO820 (DNA56041), PRO52387 (DNA257845)에 대해 성공적으로 생성될 수 있다.
본원에 기술되는 바와 같은 FcRH5 폴리펩티드에 대해 지시되는 모노클로날 항체의 제조 이외에, 많은 모노클로날 항체가 (시험관내 및 생체내 모두에서) 관심 FcRH5 폴리펩티드를 발현하는 세포 (또는 조직)에 세포성 독소를 지시하는데 사용하기 위해 세포 독소에 성공적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 독소 (예: DM1) 유도체화된 모노클로날 항체가 본원에서 기술되는 바와 같은 FcRH5 폴리펩타이드: PRO820 (DNA56041), PRO52387 (DNA257845)에 대해 성공적으로 생성될 수 있다.
A. FcRH5 / IRTA2 ( PRO820 . PRO52387 ) 안정 세포주의 생성
FcRH5 항체를 스크리닝하기 위한 세포주를 제조하기 위해서, 택을 붙인 (tagged) FcRH5/IRTA2 및 택을 붙이지 않은 FcRH5/IRTA2를 안정하게 발현하는 SVT2 생쥐 섬유아세포 세포주를 생성하였다. FcRH5/IRTA2 cDNA를 비장 세포 라이브러리로부터 PCT 증폭하고, TA를 pCR4로 클로닝하였다 (Invitrogen). 택을 붙이지 않은 발현 제작물을 제조하기 위해, 제한 부위를 추가하기 위한 PCR, PCR 생성물의 분해 및 벡터로의 결합을 이용하여 개방 판독 프레임 (ORF)을 포유동물 발현 벡터 pCMV.PD.nbe에 클로닝하였다. N-말단 택을 붙인 발현 제작물을 신호 서열 부재 하에서의 FcRH5/IRTA2 ORF의 증폭 및 PCR 생성물의 gD 택 및 신호 서열 (M G G T A A R L G A V I L F V V I V G H G V R G K Y A L A D A S L K M A D P N R F R G K D L P V L D Q L L) (서열 번호 1)을 포함하는 pMSCVneo (Clontech) 벡터로의 결합에 의해 제조하였다. 각각의 FcRH5/IRTA2에 대해, FACS 특이적 반응성 및 FcRH/IRTA 사이의 교차반응성에 대해 모노클로날 항체를 스크리닝하는데 사용하기 위한 2개의 안정한 세포주를 확립하였다. gD-택을 붙인 발현 벡터 및 택을 붙이지 않은 발현 벡터를 표준 리포펙타민 2000 (Invitrogen; Carlsbad, Ca) 프로토콜에 의해 SVT2 (고농도 글루코즈 DMEM + 10% FBS + 2mM L-글루타민 세포에서 성장됨)에 형질감염하였다. gD-택을 붙인 트랜스펙턴트를 1주일 동안 0.5 mg/ml 게네티신 (Geneticin) (Invitrogen; Carlsbad, Ca) 선별 하에 둔 후, gD-택 특이적 모노클로날 항체 (gD: 952, Genetech; South San Francisco)로 단일 세포 FACS 분류하여 최고의 발현 클론을 수득하였다. 택을 붙이지 않은 트랜스펙턴트를 가시적 콜로니가 성장될 때까지 5.0 μg/ml 푸로마이신 (Calbiochem; La Jolla, Ca) 선별 하에 두었다. 각각의 콜로니로부터의 RNA를 표준 트리졸라 (Trizola) (Invitrogen; Carlsbad, Ca) 프로토콜 및 택마나 (TaqMana) (ABI; FOster City, Ca) 수행에 의해 단리하여 최고의 생성 클론을 결정하였다.
B. FcRH5 / IRTA2 ( PRO820 , PRO52387 )에 대한 모노클로날 항체의 생성
인간 FcRH5를 결합할 수 있는 뮤린 모노클로날 항체를 제조하였다.
FcRH5/IRTA2의 His-택을 붙인 세포외 도메인 (ECD)을 발현하는 벡터를 CHO 세포로 일시적 형질감염시켜 생쥐를 면역화시키기 위한 단백질을 생성하였다. 이 단백질을 니켈 컬럼 상에서 형질감염된 세포 상등액으로부터 정제하고, 단백질의 정체를 N-말단 서열분석으로 확인하였다.
10마리의 Balb/c 생쥐 (Charles River Laboratories, Hollister, CA)를 리비 (Ribi) 어쥬번트 (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO) 중의 재조합 폴리히스티딘-택을 붙인 (HIS6) 단백질로 과다면역화시켰다. 직접적 ELISA에 의해 면역원에 대해 높은 항체 역가를 나타내고 FACS에 의해 관심 FcRH를 안정하게 발현하는 SVT2 생쥐 섬유아세포에 대해 특이적 결합을 나타내는 생쥐로부터의 B-세포를 전술된 프로토콜 [Kohler and Milstein, 1975; Hongo et al., 1995]과 유사한 변형된 프로토콜을 이용하여 생쥐 골수종 세포 (X63.Ag8.653; American Type Culture Collection, Rockiville, MD)와 융합하였다. 10 내지 12일 후, 상등액을 수거하고, 직접적 ELISA 및 FACS에 의해 항체 생성 및 결합에 대해 스크리닝하였다. 제한 희석에 의한 제2 라운드의 서브클로닝 후 최고의 면역결합을 나타내는 양성 클론을 증대시키고, FcRH1, -2, -3, -4, 및 -5 특이성 및 교차반응성을 포함한 추가의 특성화를 위해 배양하였다. 각각의 하이브리도마 계통으로부터 수거된 상등액을 전술된 프로토콜 [Hongo et al., 1995]과 유사한 변형된 프로토콜을 이용하여 친화도 크로마토그래피 (FPLC: Pharmacia fast protein liquid chromatography; Pharmacia, Uppsala, Sweden)로 정제하였다. 이어서, 정제된 항체 제제를 멸균 여과시키고 (0.2-㎛ 공극 크기; Nalgene, Rochester NY), 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) 중 4℃에서 저장하였다.
(ELISA, FACS 분류 분석 및/또는 면역조직화학 분석에 의해 측정시) FcRH5 단백질을 인식하고 이에 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 PRO52837 (FcRH5c/IRTA2c)에 대해 성공적으로 생성하였으며, 하기와 같이 명명하였다:
항-FcRH5-9E2 (이하, 9E2 또는 9E2.1.1로 칭함) (ATCC No. PTA-7207, 2005년 11월 9일 기탁),
항-FcRH5-1H4 (이하, 1H4 또는 1H4.1.1로 칭함) (ATCC No. PTA-7208, 2005년 11월 9일 기탁),
항-FcRH5-13G9 (이하, 13G9 또는 13G9.1.1로 칭함) [미국 가특허출원 61/211,695 (2009년 4월 1일 출원) 및 61/166,214 (2009년 4월 2일 출원)],
항-FcRH5-4D10 (이하, 4D10 또는 4D10.1.1로 칭함) (ATCC No. PTA-7210, 2005년 11월 9일 기탁),
항-FcRH5-6H1 (이하, 6H1 또는 6H1.1.1로 칭함) (ATCC No. PTA-7211, 2005년 11월 9일 기탁),
항-FcRH5-8H6 (이하, 8H6 또는 8H6.1.1로 칭함) (ATCC No. PTA-7212, 2005년 11월 9일 기탁),
항-FcRH5-7D11 (이하, 7D11 또는 7D11.1.1로 칭함) (본원에 기술됨),
항-FcRH5-10A8 (이하, 10A8 또는 10A8.1.1로 칭함) (본원에 기술됨).
1. 친화도 결정 ( 비아코어 분석)
IgG의 FcRH-결합 친화성을 비아코어 2000 표면 플라즈몬 공명 시스템 (BIAcore, Inc.)을 이용하여 결합 및 해리 속도 상수로부터 계산하였다. 바이오센서 칩을 공급자 (BIAcore, Inc.)의 교시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용하여 항-뮤린 IgG (BR-1008-338)의 공유 커플링을 위해 활성화시켰다. 간략히 설명하면, 동력학 분석을 위한 각각의 사이클을 위해, 5 ul의 100 nM IgG를 칩 상에 포착시키고, 다양한 FcRH의 2배 연속 희석물을 150초 동안 20 ul/min의 유속으로 주입하였다. 항원 해리를 재생성 전 180초 동안 모니터링하였다. 25℃에서의 평형 해리 상수를 1:1 랑뮈르 (Langmuir) 결합 모델로 데이터를 피팅하여 계산하였다. 런닝 완충액은 0.05% Tween-20을 갖는 PBS였다. 결과가 하기 표 9에 나타나 있다. 모든 항체가 치료제로서 사용될 충분한 친화성으로 항원을 결합하였다.
Figure pct00071
*포화 농도에서 아주 약간 반응
C. 키메라 항-인간 FcRH5 항체의 제작 및 서열분석
1. 키메라 항-인간 FcRH5 항체 7 D11 ( ch7D11 )
키메라 7D11 IgG1을 제작하기 위해서, 총 RNA를 Qiagen RNeasy 미니 키트 (Cat # 74104)를 사용하고 제조자에 의해 제시된 프로토콜을 이용하여 7D11 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. 7D11 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄에 대해 수득된 N-말단 아미노산 서열을 사용하여, 각각의 쇄에 대해 특이적인 PCR 프라이머를 설계하였다. N-말단 서열에 상응하는 유전자 패밀리의 프레임워크 4와 조화되도록 RT-PCR을 위한 역방향 프라이머를 설계하였다. 또한, 클로닝을 위한 목적하는 제한 부위를 부가하도록 프라이머를 설계하였다. 경쇄에 있어, 이들은 N-말단의 EcoRV 및 프레임워크 4의 3' 말단의 KpnI이었다. 중쇄에 있어, 부가된 부위는 N-말단의 BsiWI 및 VH-CH1 정션에 대해 약간 하류의 ApaI이었다. 프라이머 서열은 하기와 같다:
7D11LCF.EcoRV (7D11 경쇄 정방향 프라이머):　
5' - GATCGATATCYTGCTSACMCARTGTCCAGC - 3' (서열 번호 2)
(B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C)
C7F7LCR.KpnI (7D11 경쇄 역방향 프라이머):
5' - TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC - 3' (서열 번호 3)
(B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C)　　　　　　　　　　　　　　　　
1D1(IIID-2)HCF.BsiWI (7D11 중쇄 정방향 프라이머):
5' - GATCGACGTACGCTGARGTGCARYTGGTGGARTCTGG - 3' (서열 번호 4)
(B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C)
C7F7HCR.ApaI (7D11 중쇄 역방향 프라이머):　
5' - ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT - 3' (서열 번호 5)
(B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C)
경쇄 및 중쇄를 위한 RT-PCR 반응을 Qiagen 1-단계 RT-PCR 키트 (Cat # 210210) 및 제시된 반응 혼합물 및 조건을 이용하여 수행하였다. IgG의 포유동물 세포 발현을 위한 pRK 벡터는 전술한 바와 같다 [Gorman et al., DNA Prot Eng Tech 2:3-10 (1990)]. 벡터를 변형하고, 특정 엔도뉴클레아제 제한 효소 인지 부위를 삽입함으로써 클로닝 및 발현을 용이하게 하였다 [Shields et al., J Biol Chem 2000; 276: 6591-6604]. 증폭된 VL을 인간 카파 불변 도메인을 포함하는 pRK 포유동물 세포 발현 벡터 (pRK.LPG3.HumanKappa)로 클로닝하였다. 증폭된 VH를 전장의 인간 IgG1 불변 도메인을 코딩하는 pRK 포유동물 세포 발현 벡터 (pRK.LPG4.인간HC)에 삽입하였다.
항-인간 FcRH5 (ch7D11)을 위한 생성된 뮤린-인간 키메라 경쇄 (도 1) 및 중쇄 (도 3)의 전체 코딩 영역에 대한 DNA 서열을 수득하였다. 이 DNA에 의해 코딩되는 뮤린-인간 키메라 경쇄 및 중쇄에 대한 폴리펩티드가 각각 도 2 및 4에 나타나 있다. DNA 서열분석 후, 플라스미드의 발현을 분석하였다.
플라스미드를 293 (아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주)에 일시적으로 형질감염시켰다 [Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59-74 (1977)]. 구체적으로, 293 세포를 형질감염 전일에 분할하고, 혈청-함유 배지에 플레이팅하였다. 다음날, 인산칼슘 침전물로서 제조되는 이중-가닥 DNA를 가한 후, pAdVAntageTMDNA (Promega, Madison, WI)를 가하고, 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 혈청-비함유 배지에서 배양하고, 4일 후 수거하였다. 항체 단백질을 단백질 A 컬럼 상에서 형질감염된 세포 상등액으로부터 정제한 후, 10 mM 나트륨 숙시네이트, 140 mM NaCl, pH 6.0로 완충액을 교체하고, Centricon-10 (Amicon)를 사용하여 농축시켰다. 단백질의 정체를 N-말단 서열분석으로 확인하였다. 단백질 농도를 정량적 아미노산 분석으로 측정하였다. 항체를 하기와 같이 SVT2 세포에서 FACS에 의해 인간 FcRH5에 대한 결합에 대해 시험하였다.
2. 키메라 항-인간 FcRH5 항체 10A8 ( ch10A8 )
항체 10A8을 일단의 항-인간 FcRH5 하이브리도마의 구성원으로 이끌어내었다. 기질로서 총 mRNA를 사용하면서 하이브리도마 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 증폭시키도록 상술된 바와 같이 RT-PCR을 이용하여 이들 항체의 생쥐/인간 키메라를 제작하였다. 경쇄 가변 도메인을 인간 불변 카파 도메인을 포함하는 벡터 pRK.LPG3.HumanKappa로 클로닝하고, 중쇄 가변 도메인을 전장의 인간 IgG1 불변 도메인을 코딩하는 벡터 pRK.LPG4.HumanHC로 클로닝하였다. 항-인간 FcRH5 (ch10A8)에 대해 생성된 뮤린-인간 키메라 경쇄 (도 5) 및 중쇄 (도 7)의 전체 코딩 영역에 대해 DNA 서열을 수득하고, 가변 도메인의 프레임워크 및 CDR 영역을 확인하였다. 이 DNA에 의해 코딩되는 10A8 뮤린-인간 키메라 경쇄 및 중쇄에 대한 코딩된 폴리펩티드가 각각 도 6 및 7에 나타나 있다.
10A8의 RT - PCR 클로닝에 사용되는 프라이머의 서열은 다음과 같다:
10A8LCF.EcoRV (10A8 경쇄 정방향 프라이머):　
5' - GATCGATATCGTGATGACCCARTCTCAYAA - 3' (서열 번호 6)
(B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C)
10A8LCR.KpnI (10A8 경쇄 역방향 프라이머):
5' - TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC - 3' (서열 번호 7)
(B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C)　　　　　　　　　　　　　　　　
10A8HCF.BsiWI (10A8 중쇄 정방향 프라이머):
5'-GATCGACGTACGCTGARGTGCARYTG GTGGARTCTGG- 3' (서열 번호 8)
(B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C)
10A8HCR (10A8 중쇄 역방향 프라이머):　
5'-CTGGWCAGGGMTCCAGAGTTCCA - 3' (서열 번호 9)
(B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C)
3. 키메라 항-인간 FcRH5 항체 13 G9 ( ch13G9 )
항체 13G9를 일단의 항-인간 FcRH5 하이브리도마의 구성원으로 이끌어내었다. 기질로서 총 mRNA를 사용하면서 하이브리도마 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 증폭시키도록 RT-PCR을 이용하여 이들 항체의 생쥐/인간 키메라를 제작하였다. 경쇄 가변 도메인을 인간 불변 카파 도메인을 포함하는 벡터 pRK.LPG3.HumanKappa로 클로닝하고, 중쇄 가변 도메인을 전장의 인간 IgG1 불변 도메인을 코딩하는 벡터 pRK.LPG4.HumanHC로 클로닝하였다. DNA 서열분석으로 가변 도메인의 프레임워크 및 CDR 영역을 확인하였다. 13G9의 키메라 및 인간화 버젼이 문헌 [미국 가특허출원 61/211,695 (2009년 4월 1일 출원) 및 61/166,214 (2009년 4월 2일 출원), 이들 문헌 각각이 전체로서 본원에 참조로 포함됨]에 기술되어 있다.
D. 인간화 항-인간 FcRH5 항체 10A8의 생성
잔기 번호는 문헌 [Kabat et al ., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 따른다. 단문자 아미노산 약어가 사용된다. DNA 축퇴는 IUB 코드를 사용하여 표시된다 (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
1. 인간화 항- FcRH5 항체 이식물
다양한 인간화 항-FcRH5 항체가 생성되었다. 뮤린 FcRH5 항체 (10A8)로부터의 VL 및 VH 도메인을 인간 컨센서스 VL 카파 I (huKI) 및 인간 하위군 III 컨센서스 VH (huIII) 도메인과 함께 정렬하였다. 뮤린 10A8의 경쇄 가변 도메인과 인간 컨센서스 서열 카파 I과의 정렬이 도 9에 나타나 있다. 뮤린 10A8 (mu10A8)로부터의 초가변 영역을 억셉터 인간 컨센서스 프레임워크로 조작하여 MA10A8의 직접적 HVR-이식물을 생성하였다 (본원에서 "10A8-이식물" 또는 10A8-이식된 "인간화 항체" 또는 "h10A8 이식물"로 불림). 10A8의 CDR을 포유동물 신호 서열, 인간 V 카파 I 가변 도메인의 컨센서스 서열 및 인간 불변 카파 I 도메인을 포함하는 포유동물 발현 벡터로 조작하였다. 어떠한 뮤린 잔기도 공여 mAb로부터 억셉터 플라스미드로 전달되지 않았다. 쿤클 (Kunkle) 돌연변이유발 프로토콜을 수행한 후, 각각의 CDR을 코딩하는 단일 올리고뉴클레오티드 및 억셉터 플라스미드의 ss DNA를 사용하여 CDR을 전달하였다. 이식된 잔기 및 생성된 인간 10A8 버젼 (hu10A8 v1) 경쇄 가변 도메인 (서열 번호 19)이 도 9에 나타나 있다.
유사하게, 뮤린 10A8 (mu10A8)의 중쇄 가변 도메인의 CDR을 포유동물 신호 서열, 인간 중쇄 하위군 III의 컨센서스 서열 및 전장의 인간 IgG1 불변 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터로 조작하였다. 어떠한 뮤린 잔기도 공여체로부터 억셉터 플라스미드로 전달되지 않았다. 뮤린 10A8 중쇄 가변 도메인, 이식된 인간 하위군 III 가변 도메인 잔기, 및 생성된 인간 10A8 버젼 1 (hu10A8 v1) 중쇄 가변 도메인이 도 10에 나타나 있다.
초기 연구를 위해, 키메라 및 인간화 버젼 1 (hu10A8 v1) 을 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주 [Graham et al., 1977]에서 일시적으로 발현시켰다. 각각의 변이체에 대해 상술된 경쇄 및 중쇄 플라스미드 10 ㎍을 0.1 ml FuGene을 포함하는 0.9 ml DMEM 배지에 가하였다. 이러한 혼합물은 배지 24 ml를 갖는 75% 컨플루언트 293 세포의 하나의 T250 플라스크에 가하기에 충분하였으며, 플라스크를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 PBS로 세척하고, 배지를 인슐린 및 미량 원소로 보충된 혈청-비함유 발현 배지로 대체하였다. 5일 후, 조건조절된 배지를 수거하고, 항체를 단백질 A 세포로즈 (Sepharose) 상에서 친화도 크로마토그래피로 정제하였다.
인간화 버젼 1 (hu10A8 v1) 및 키메라의 상대적 결합 친화도를 FACS 및 스캐챠드 (Scatchard) 분석으로 측정하였다 (하기 참조). 인간화 버젼 1의 친화도는 키메라와 동등한 것으로 보이므로, 친화도를 증가시키기 위한 10A8에 대한 추가의 버젼은 만들지 않았으며, 추가의 연구는 이러한 버전 및 이의 접합된 유도체에 기초한다 (하기 참조).
2. IgG 생성
플라스미드를 293 (아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주)에 일시적으로 형질감염시켰다 [Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59-74 (1977)]. 구체적으로, 293 세포를 형질감염 전일에 분할하고, 혈청-함유 배지에 플레이팅하였다. 다음날, 인산칼슘 침전물로서 제조되는 이중-가닥 DNA를 가한 후, pAdVAntageTMDNA (Promega, Madison, WI)를 가하고, 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 혈청-비함유 배지에서 배양하고, 4일 후 수거하였다. 항체 단백질을 단백질 A 컬럼 상에서 형질감염된 세포 상등액으로부터 정제한 후, 10 mM 나트륨 숙시네이트, 140 mM NaCl, pH 6.0로 완충액을 교체하고, Centricon-10 (Amicon)를 사용하여 농축시켰다. 단백질의 정체를 N-말단 서열분석으로 확인하였다. 단백질 농도를 정량적 아미노산 분석으로 측정하였다. 항체를 하기와 같이 SVT2 세포에서 FACS에 의해 인간 FcRH5에 대한 결합에 대해 시험하였다.
3. 결합 분석 ( FACS 분석)
FcRH5 항체의 교차반응성을 측정하기 위해서, 인간 FcRH1-6을 발현하는 SVT2 세포에 대한 IgG 변이체의 결합을 FACS 분석을 이용하여 분석하였다.
간단히 설명하면, 100 ㎕ 중의 gD 택을 붙인 huFcRH1-6을 안정하게 발현하는 약 106개의 SVT2 세포를 1.0 ug의 뮤린 또는 키메라 Ab [Mu 항-gD (양성 대조군), Mu 항-FcRH5 (1H4) ("mu1H4"), Mu 항-FcRH5 (4D10) ("mu4D10"), Mu 항-FcRH5 (6H1) ("mu6H1"), Mu 항-FcRH5 (7D11) ("mu7D11"), Ch 항-FcRH5 (7D11) ("ch7D11"), Mu 항-FcRH5 (8H6) ("mu8H6"), Mu 항-FcRH5 (9E2) ("mu9E2"), 또는 Mu 항-FcRH5 (13G9) ("mu13G9")]와 함께 인큐베이션하였다. 공 (empty) 벡터를 안정하게 발현하는 SVT2 세포를 동일한 항체와 함께 인큐베이션하고 음성 대조군으로 사용하였다. PE 접합된 래트 항-MuIgG1, 래트 항-MuIgG2a +b, 또는 Mu 항-HuIgG를 제2 검출 항체로 사용하였다. 결과가 도 14에 나타나 있다. FcRH5에 교차-반응하는 Mu 항-FcRH5 (6H1)1을 제외하고는, 모든 시험된 항체들이 FcRH5에 특이적으로 결합한다. FACS 분석시, Mu 항-FcRH5 (8H6)는 약하기는 하지만 FcRH5 특이적 항체이다.
FcRH5 항체의 교차-반응성을 더욱 측정하기 위해서, 인간 FcRH1-6을 발현하는 SVT2 세포에 대한 IgG 변이체 상등액의 결합을 FACS 분석을 이용하여 분석하였다.
간단히 설명하면, gD 택을 붙인 huFcRH1-6을 안정하게 발현하는 약 106개의 SVT2 세포를 1.0 ㎍의 정제된 Ms 항-gD 항체 또는 100 ㎕의 (농도 미지) 뮤린 Ab 하이브리도마 상등액 (Mu 항-FcRH5 (10A8) ("mu10A8"), Mu 항-FcRH5 (10F5) ("mu10F5"))과 함께 인큐베이션하였다. 공 벡터를 안정하게 발현하는 SVT2 세포를 동일한 항체와 함께 인큐베이션하고 음성 대조군으로 사용하였다. PE 접합된 래트 항-MsIgG1을 제2 검출 항체로 사용하였다. 결과가 도 15에 나타나 있다. mu10A8과 mu10F5 항체 모두 FcRH5에 특이적으로 결합한다.
생쥐 FcRH5 항체의 결합을 더욱 측정하기 위해서, 인간 FcRH5를 발현하는 라지 (Raji) 세포 및 시노몰거스 FcRH5를 발현하는 293T 세포에 대한 IgG 변이체의 결합을 FACS 분석을 이용하여 분석하였다.
간단히 설명하면, 약 106개의 인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 라지 세포 및 gD 택을 붙인 cyno FcRH5로 일시적으로 형질감염된 293T 세포를 100㎕ FACS 완충액 (PBS, 0.5% BSA, 0.05% 아지드화나트륨) 중의 1.0 ㎍의 바이오티닐화된 생쥐 이소형 대조군, 바이오티닐화된 mu 항-gD, 바이오티닐화된 mu6H1, 바이오티닐화된 mu13G9, 또는 바이오티닐화된 mu7D11과 함께 인큐베이션하였다. PE 접합된 스트렙트아비딘을 제2 검출 시약으로 사용하였다. 그 결과가 도 16 및 도 17에 나타나 있다.
FcRH5 항체에 대한 추가의 FACS 분석을 위해, 1.0 μg, 0.1 μg 또는 0.01 μg의 항체를 huFcRH5를 안정하게 발현하는 BJAB 세포 및 cynoFcRH5를 안정하게 발현하는 SVT2 세포 106개에 대하여 적정하였다. 간단히 설명하면, 100 ㎕ 중의 약 106개 세포를 106개의 huFcRH5를 안정하게 발현하는 BJAB 세포 및 cynoFcRH5를 안정하게 발현하는 SVT2 세포 당 다양한 양 (1.0 μg, 01. μg 또는 0.01 μg)의 뮤린 Ab mu1H4, mu6H1, mu7D11, mu9E2, mu10A8, mu10F5, 또는 mu13G9와 함께 인큐베이션하였다. 1.0 ug/106개 세포의 적합한 Mu IgG 이소형 대조군과의 인큐베이션을 음성 대조군으로 이용하였다. PE 접합된 래트 항-MuIgG1 또는 래트 항-MuIgG2a +b를 제2 검출 항체로 사용하였다. 그 결과가 도 18 및 19에 나타나 있다. mu1H4, mu6H1, mu7D11, mu9E2, mu10A8, mu10F5, 또는 mu13G9는 FACS 분석에 의해 시노몰거스 FcRH5와 교차 반응하며, 이들은 표적물 의존적 독성을 평가하는 전임상 안정성 조사에 사용될 수 있다.
FcRH5 항체 약물 접합체의 FACS 분석을 위해 (실시예 2 참조), FcRH5 ADC를 증가 농도로 (0.1, 1.0, 및 10 ㎍/mL) 100 ㎕ 반응 부피 중의 106개의 인간 FcRH5로 형질감염되고 이를 안정하게 발현하는 OPM2 세포 또는 시노몰거스 FcRH5로 형질감염되고 이를 안정하게 발현하는 SVT2 세포에 가하였다. 이어서, 샘플을 FACS 완충액 (PBS, 0.5% BSA, 0.1% 나트륨 아지드) 중 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 내화를 억제하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁시키고, 100 ㎕의 반응 부피 중 피코에리트린 (Ms 항-인간-PE) 2차 항체에 접합된 20 ㎕의 생쥐 항-인간 IgG와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 200 ㎕의 2% 파라포름알데하이드/PBS 중에 고정시키고, 유동 세포측정을 수행하였다. 동일한 절차를 단지 최고 농도 (10 ㎍/mL)의 HuIgG에 대해 수행하였다. HuIgG는 세포주 당 기선 PMT를 설정하기 위해 이소형 대조군으로 이용되었다. 유동 세포측정을 BD FACSCalibur®에서 수행하고, 기하 평균 형광 강도를 각각의 샘플에 대해 기록하였다. 기록된 자료를 FlowJo v8.4.5 소프트웨어를 이용하여 분석하였다 (도 20 내지 25 참조). Thio-hu10A8-HC(A118C) 및 thio 및 thio-hu10A8-LC(V205C)는 다양한 농도의 비접합된 항체에서 FACS 분석시 huFcRH5를 안정하게 발현하는 OPM2 세포 및 시노몰거스 FcRH5를 안정하게 발현하는 SVT2 세포에 유사하게 결합한다. Thio-ch10A8-HC(A118C)-MC-vc-PAB-MMAE, thio-hu10A8-HC(A118C)-MC-vc-PAB-MMAE, thio-hu10A8-LC(V205C)-MC-vc-PAB-MMAE, ch10A8-SPDB-DM4, 및 hu10A8-SPDB-DM4는 다양한 농도의 ADC에서 FACS 분석시 huFcRH5를 안정하게 발현하는 OPM2에 유사하게 결합한다.
4. 친화도 측정 ( 스캐챠드 분석)
FcRH5 뮤린 항체 및 IgG 클론의 결합을 더욱 측정하기 위해서, 인간 FcRH5를 발현하는 OPM2 세포 및 시노몰거스 FcRH5를 발현하는 SVT2 세포에 대한 요오드처리된 IgG 변이체의 결합인 스캐챠드 분석을 수행하였다.
스캐챠드 분석을 위해, 0.5 nM I125 표지된 뮤린 또는 IgG 클론 항-FcRH5를 인간-FcRH5를 안정하게 발현하는 형질감염된 OPM2 세포주 및 시노몰거스-FcRH5를 안정하게 발현하는 형질감염된 SVT2의 존재 하에서 50 내지 0.02 nM (12 단계 1:2 연속 희석) 범위의 표지되지 않은 뮤린 또는 IgG 클론 항-FcRH5 각각에 대해 경쟁시켰다. 4℃에서 4시간 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 세포 펠렛 계수를 감마 카운터 (1470 WIZARD Automatic Gamma Counter; Perkin Elmer, Walthem, MA)로 판독하였다. 모든 점은 삼중으로 수행하고, 10분 동안 계수하였다. 평균 CPM을 New Ligand (Genentech, South San Francisco, CA) 프로그램을 이용하여 Kd 계산에 대해 사용하였다. 그 결과가 표 10에 나타나 있다 ("ms"는 뮤린 항체를 나타낸다).
Figure pct00072
실시예 2: 항- FcRH5 항체 약물 접합체 ( ADC )의 생성
항-인간 FcRH5에 대한 항체 약물 접합체 (ADC)의 생성을 위해 사용되는 약물은 메이탄시노이드 DM1 및 DM4 및 돌라스타틴10 유도체 모노메틸라우리스타틴 E (MMAE)를 포함하였다 [US20050276812 (2005년 5월 31일 출원); US20050238649 (2004년 11월 5일 출원), 이둘 모두가 전부 참조로 포함됨]. DM1, DM4, 및 MMAE는 NHL의 화학요법 처치에 사용되는 빈카 알칼로이드 유사분열 억제제 보다 적어도 100배 이상 세포독성인 유사분열 억제제이다 [Doronina et al., Bioconjug . Chem ., 17:114-123 (2006); Doronina et al., Nat . Biotechnol ., 21: 778-784 (2003); Erickson et al., Cancer Res ., 66: 4426-4433 (2006)]. ADC의 생성에 사용되는 링커는 DM1에 대해 SMCC, DM4에 대해 SPDB, 및 MMAF에 대해 MC 또는 MMAE에 대해 MC-vc-PAB 였다. DM1 및 DM4에 대해, 항체를 안정한 티오에스테르 링커 SMCC (접합후에는 MCC로 칭함)를 사용하여 리신의 e-아미노 그룹을 통해 DM1 및 DM4에 연결시켰다. 달리, DM4에 대해, 항체를 SPDB 링커를 사용하여 리신의 e-아미노 그룹을 통해 DM4에 연결시켰다. SMCC 링커를 통해 부착된 DM1은 환원 조건 하에서의 절단에 내성이 있다. 또한, SMCC-DM1 및 SPDB-DM4 ADC는, ADC가 내화되고 리신-Nε-DM1의 방출을 야기시키는 리포좀을 표적하는 경우, 세포 독성을 유도하며, 이는 세포 내부에서 효과적인 항-유사분열제이며, 세포로부터 방출될 때, 리신-Nε-DM1은 무독성이다 [Erickson et al., Cancer Res ., 66: 4426-4433 (2006)]. MMAE에 대해, 항체를 말레이미도카프로일-발린-시투룰린 (vc)-p-아미노벤조일옥시카르보닐 (MC-vc-PAB)에 의해 시스테인을 통해 MMAE에 연결시켰다. MC-vc-PAB 링커는 세포간 프로테아제, 예를 들어 카텝신 B에 의해 절단가능하며, 절단되는 경우, 유리 약물을 방출하고 [Doronina et al., Nat . Biotechnol ., 21: 778-784 (2003)], MC 링커는 세포간 프로테아제에 의한 절단에 내성이다.
항-인간 FcRH5에 대한 항체 약물 접합체 (ADC)를 SMCC-DM1을 사용하여 US 특허원 11/141,344 (2005년 5월 31일 출원, 본원에 전부 참조로 포함됨)에 기술된 절차와 유사하게 생성하였다. 항-인간 FcRH5 정제된 항체를 50 mM 인산칼륨 및 2mM EDTA, pH 7.0을 포함하는 용액으로 완충액-교환하였다. SMCC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 디메틸아세트아미드 (DMA)에 용해시키고, 항체 용액에 가해 10:1의 최종 SMCC/Ab 몰비를 만들었다. 이 반응을 혼합하면서 실온에서 3시간 동안 진행시켰다. 이어서, SMCC-변형된 항체를 150 mM NaCl 및 2 mM EDTA, pH 6.0를 갖는 35 mM 나트륨 시트레이트 중에 평형화시킨 GE Healthcare HiTrap 탈염 컬럼 (G-25) 상에서 정제하였다. DMA에 용해된 DM1을 SMCC 항체 제제에 가하여 10:1의 DM1 대 항체의 몰비를 수득하였다. 반응을 혼합하면서 실온에서 4 내지 20시간 동안 수행하였다. DM1-변형된 항체 용액을 20 부피의 PBS로 투석여과시켜 비반응 DM1을 제거하고, 멸균 여과한 후, 4℃에서 저장하였다. 전형적으로, 40 내지 60% 수율의 항체가 이러한 과정을 통해 수득되었다. 제제는 통상적으로 겔 여과 및 레이저 광 산란에 의해 평가시 95% 초과가 단량체였다. DM1은 252 nm에서 흡수 최고이므로, 항체에 결합된 약물의 양은 252 및 280 nm에서 감별 흡수 측정에 의해 결정될 수 있었다. 전형적으로, 약물 대 항체 비는 3 대 4 였다.
Ab 당 3 내지 4개의 약물을 갖는 항-인간 FcRH5 SPDB DM4 항체-약물 접합체를 생성하기 위해서, 먼저 항체를 SPDB [4-(2-피리딜디티오)부티르산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르]로 변형시켜 디티오피리딜 그룹을 생성하였다. 항체에 대해 4 내지 6배 몰 과량의 SPDB를 가하고, RT에서 90분 동안 반응시켰다. 반응을 5 내지 10 mg/ml의 항체 농도에서 50 mM NaCl, 2 mM EDTA를 갖는 50 mM 인산칼륨, pH 7 중에서 수행한다. SPDB 반응 후, 에탄올을 5% V/V의 최종 농도로 가하고, 티올-포함 DM4 약물을 SPDB에 비해 1.7배 몰 과량으로 가한다. 인큐베이션을 16시간 동안 실온에서 수행한다. 접합물을 투석여과, 겔 여과, 또는 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한다.
항-인간 FcRH5에 대한 항체 약물 접합체 (ADC)를 MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE 약물 링커를 사용하여 미국 특허원 10/983,340 (2004년 11월 5일 출원, 전부 참조로 본원에 포함됨)에 기술된 절차와 유사하게 생성하였다. 정제된 항-인간 FcRH5 항체를 500 mM 붕산나트륨 및 500 mM 염화나트륨, pH 8.0 중에 용해시키고, 과량의 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 처리하였다. 약 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 완충액을 Sephadex G25 수지 상에서 용출시켜 교환하고, 1 mM DTPA를 갖는 PBS로 용출시켰다. 용액에 대한 280 nm에서의 흡광도로부터 감소된 항체 농도 및 DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI)과의 반응에 의한 티올 농도를 측정하고 412 nm에서 흡광도를 측정함으로써 티올/Ab 값을 점검하였다. PBS 중에 용해된 환원된 항체를 얼음 상에서 냉각시켰다. DMSO 중의 약물 링커 MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE를 아세토니트릴 및 물 중에 용해시키고, PBS 중의 냉각된 환원된 항체에 가하였다. 1시간 인큐베이션 후, 과량의 말레이미드를 가해 반응을 퀀칭시키고, 임의의 반응되지 않은 티올 그룹을 캡핑하였다. 반응 혼합물을 원심 한외여과시켜 농축시키고, 항체 약물 접합체를 PBS 중의 G25 수지를 통해 용출시켜 정제하고 탈염시킨 후, 멸균 조건 하에 0.2 μm 필터를 통해 여과시키고, 저장을 위해 냉동시켰다.
실시예 3: 시스테인 조작된 항- FcRH5 항체의 제조
시스테인 조작된 항-FcRH5 항체의 제조를 본원에 기술된 바와 같이 수행하였다. 시스테인 잔기를 항체의 경쇄, 중쇄 또는 Fc 영역에 가해 다양한 약물에 대한 접합을 가능하게 할 수 있다. 시스테인 조작된 항-FcRH5 항체 10A8의 제조시, 경쇄를 암호화하는 DNA를 돌연변이시켜 도 13에 도시되는 바와 같이 카바트 위치 205에 있는 발린 대신 시스테인으로 치환하였다. 중쇄를 암호화하는 DNA를 돌연변이시켜 도 12에 도시되는 바와 같이 중쇄의 EU 위치 118 (연속 위치 118, 카바트 번호 114)에 있는 알라닌 대신 시스테인으로 치환하였다. 항-FcRH5 항체의 Fc 영역을 돌연변이시켜 중쇄 Fc 영역에 있는 EU 위치 400 (연속 위치 400; 카바트 번호 396)에 있는 세린을 시스테인으로 치환할 수 있다.
실시예 4: 뮤린 항- FcRH5 항체 약물 접합체를 사용한 생체내 종양 세포 사멸 검정
A. 이종이식
다양한 항-FcRH5 항체의 효능을 시험하기 위해, 뮤린 항-인간 항체를 DM1에 접합시키고, 생쥐에서 종양에 대한 접합된 변이체의 효과를 분석하였다.
구체적으로, BJAB-루시페라제 세포 (인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 버킷 림프종 세포주)에서 종양을 퇴행시키는 항체의 능력을 분석하였다.
pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5를 BJAB-루시페라제 세포로 형질감염하고 프로마이신 (Calbiochem, San Diego, CA) 선별 후, 생존 세포를 항-FcRH5 항체 (7D11)를 갖는 중간 범위 발현자에 대해 FACS 오토클로닝하였다. 오토클로닝 후, FACS로 측정시 혈장 세포 발현을 가장 근접하게 닮은 FcRH5를 발현하는 BJAB-루시페라제 세포주를 항-FcRH5 항체 (7D11)을 사용하여 FACS 분석으로 선별하였다. 음성 대조군으로서, 공 벡터 pRK.CMV.PD.nbe로 동일한 방식으로 형질감염된 BJAB-루시페라제를 사용하였다.
생쥐 항체의 효능 분석을 위해, 자성 CB17 ICR SCID 생쥐 (6 내지 8주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)의 옆구리에 주사를 통해 2 X 107 개 BJAB-FcRH5 세포를 피하 접종시키고, 이종이식편 종양을 평균 128 mm3로 성장시켰다. 0일은, 하기에서 구체적으로 지시하지 않는 한, 종양이 평균 100 내지 250 mm3인 날 및 제1/또는 유일한 처리 용량이 투여되는 때를 언급한다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 2차원에 기초하여 계산하고, 수학식 V= 0.5a X b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 짧은 직경이다)에 따라 mm3로 나타내었다. 각각의 실험군으로부터 수집된 자료를 평균 + SE로 나타내었다. 8마리 생쥐 그룹을 0일 및 7일에 항-FcRH5 ADC 또는 대조군 항체-약물 접합체로 생쥐 m2 당 항체-연결된 약물 400 ㎍ (생쥐 kg 당 약 8 내지 10 mg ADC에 상당)의 정맥내 (i.v.) 용량으로 매주 처리하였다. 종양을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐의 체중을 실험 동안 주당 1회씩 측정하였다. 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전 또는 종양이 궤양에 임박한 징후를 나타내었을 때 생쥐를 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에 의해 승인되었다.
사용된 항체와 독소 사이의 링커는 DM1에 대해 티오에테르 가교제 SMCC 였다. 추가의 링커는 DM1에 대해 디술피드 링커 SPP 또는 티오에테르 가교제 SMCC 또는 모노메틸아우리스타틴 E (MMAE) 또는 모노메틸라우리스타틴 F (MMAF)에 대해 말레이미드 성분 및 파라-아미노벤질카바모일 (PAB) 자가 희생적 성분을 갖는 MC 또는 MC-발린-시트룰린(vc)-PAB 또는 (발린-시트룰린 (vc)) 디펩티드 링커 시약)을 포함할 수 있다. 사용된 독소는 DM1이었다. 추가의 독소는 MMAE 또는 MMAF를 포함할 수 있다.
이 실험을 위한 항체는 문헌 [Chang et al. PCT/US2004/043514, WO 2005/063299, 본원에 전부 참조로 포함됨]에 기술된 mu7D11 및 본원에 기술된 항-FcRH5 (실시예 1B 참조, 예를 들어 mu7D11, mu6H1, mu10A8, mu13G9, 및 mu9E2)를 포함하였다.
음성 대조군은 항-gp-120에 기초한 접합체 (SMCC-DM1)를 포함하였다.
B. 결과
1. BJAB - FcRH5 이종이식
표 11에 나타낸 약물 접합체 및 용량을 사용한 48일의 시간 경과에서, 항-FcRH5 mu7D11, mu6H1, mu10A8, mu13G9, 및 mu9E2 ADC는 음성 대조군인 항-gp-120 SMCC-DM1과 비교하여 BJAB-FcRH5 종양을 갖는 SCID 생쥐에서 종양 성장을 억제하였다. ADC는 모든 ADC 및 대조군에 대해 0일 및 7일에 (하기 표 11에서 지시되는 바와 같이) 2개 용량으로 투여하였다. 구체적으로, 모든 항-FcRH5 ADC는 종양 성장을 상당히 억제하였다 (도 26).
또한, 동일한 조사에서, 처음 17일에 체중 변화율 (%)을 각각의 투여 그룹에서 측정하였다. 그 결과 (도 27), 이들 뮤린-항-FcRH5 ADC의 투여가 이러한 시간 동안 체중의 상당한 감소 또는 중량 손실을 일으키지 않는 것으로 나타났다.
또한, 표 11에는 시험된 총 생쥐 중 부분적 퇴행 (PR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0일에 측정된 종양 부피의 50% 이하로 떨어지는 경우), 완전 퇴행 (CR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0 mm3로 떨어지는 경우)을 보이는 생쥐의 수가 나타나 있다 (NA: 적용불가); (TI = 조사 끝에 관측가능한 종양의 수).
Figure pct00073
실시예 5: 항- FcRH5 ThioMab 약물 접합체에 의한 생체내 종양 성장 억제 검정
A. 이종이식
MC-vc-PAB-MMAE를 갖는 hu10A8 thioMAb 약물 접합체 및 SPDB-DM4를 갖는 hu10A8 약물 접합체의 효능을 시험하기 위해서, 생쥐에서 10A8 thioMab 약물 접합체 및 10A8 약물 접합체의 효과를 분석하였다.
구체적으로, 인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 OPM2 세포 (다발성 골수종 세포주)에서 종양을 퇴행시키는 항체 능력을 조사하였다.
선형화된 pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5의 OPM2 세포로의 형질감염 및 푸로마이신 (Calbiochem, San Diego, CA) 선별 후, 생존 세포를 MACS LS 컬럼 (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) 상에서 바이오틴 (Pierce Biotechnology, Rockford, Il) 표지된 항-FcRH5.7D11 및 MACS 항-바이오틴 마이크로비드를 사용하여 FcRH5 발현 세포에 대해 분리하였다. 분리 후, FcRH5 발현을, 공 벡터 pRK.CMV.PD.nbe를 음성 대조군으로 사용하면서, 동일한 방식으로, 항-FcRH5 항체 (10A8) 및 형질감염된 OPM2 세포주를 사용하여 FACS 분석으로 확인하였다.
MC-vc-PAB-MMAE를 갖는 hu10A8 thioMAb 약물 접합체 및 SPDB-DM4를 갖는 hu10A8 약물 접합체의 효능을 분석하기 위해, 자성 CB17 ICR SCID 생쥐 (6 내지 8주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)의 옆구리에 주사를 통해 2 X 107개 OPM2-FcRH5 세포를 피하 접종시키고, 이종이식편 종양을 평균 180 mm3로 성장시켰다. 0일은, 하기에서 구체적으로 지시하지 않는 한, 종양이 평균 100 내지 250 mm3인 날 및 제1/또는 유일한 처리 용량이 투여되는 때를 언급한다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 2차원에 기초하여 계산하고, 수학식 V= 0.5a X b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 짧은 직경이다)에 따라 mm3로 나타내었다. 각각의 실험군으로부터 수집된 자료를 평균 + SE로 나타내었다. 8마리 생쥐 그룹을 항-FcRH5 ADC 또는 대조군 항체-약물 접합체를 사용하여 생쥐 2, 4, 또는 8 mg ADC/kg의 단일 정맥내 (i.v.) 용량으로 처리하였다. 종양을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐의 체중을 실험 동안 주당 1회씩 측정하였다. 종양 부피가 3000 mm3에 도달하기 전 또는 종양이 궤양에 임박한 징후를 나타내었을 때 생쥐를 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
음성 대조군은 항-HER2 (HERCEPTIN®) (트라스트주마브)을 기본으로 하는 접합체 (SPDB-DM4 및 MC-vc-PAB-MMAE)를 포함하였다.
B. 결과
1. OPM2 - FcRH5 이종이식
표 12 나타낸 약물 접합체 및 용량을 사용한 35일의 시간 경과에서, SPDB-DM4와 접합된 hu10A8 (Hu-항-FcRH5 (10A8)-SPDB-DM4) 및 MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 hu10A8 thioMAb ("thio-HC-hu-항-FcRH5(10A8)-vc-E")는 음성 대조군인 SPDB-DM4와 접합된 인간화 항-HER2 (Hu-항-HER2 (4D5)-SPDB-DM4) 및 MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 인간화 항-HER2 (4D5) thioMAb ("thio-hu-항-HER2 (4D5)-vc-E)와 비교하여 OPM2-FcRH5 종양을 갖는 SCID 생쥐에서 종양 성장을 억제하였다. ADC는 모든 ADC 및 대조군에 대해 0일에 (하기 표 12에서 지시하는 바와 같이) 단일 용량으로 투여하였다. 구체적으로, 모든 인간화 항-FcRH5 및 인간화 항-FcRH5 thioMAb ADC는 종양 성장을 상당히 억제하였다 (도 28). 항-HER2에 기초한 접합체는 음성 대조군 ("thio-hu-항-Her2 (4D5)-vc-E" 및 "항-Her2 (4D5)-spdb-dm4")으로 사용되었다.
또한, 동일한 조사에서, 처음 14일에 체중 변화율 (%)을 각각의 투여 그룹에 대해 측정하였다. 그 결과 (도 29), 이들 인간화 항-FcRH5 및 인간화 항-FcRH5 thioMAb ADC의 투여가 이러한 시간 동안 체중의 상당한 감소 또는 중량 손실을 일으키지 않는 것으로 나타났다. 또한, 표 12에는 시험된 총 생쥐 중 부분적 퇴행 (PR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0일에 측정된 종양 부피의 50% 이하로 떨어지는 경우), 완전 퇴행 (CR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0 mm3로 떨어지는 경우)을 보이는 생쥐의 수가 나타나 있다 (NA: 적용불가); (TI = 조사 끝에 관측가능한 종양의 수).
Figure pct00074
* 비히클 = 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈, 0.02% PS20
실시예 6: 인간화 항- FcRH5 약물 접합체에 의한 생체내 종양 성장 억제 검정
A. 이종이식
상이한 용량의 SPDB-DM4를 갖는 hu10A8 약물 접합체의 효능을 시험하기 위해서, 생쥐에서 접합된 항체의 효과를 분석하였다.
구체적으로, 인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 OPM2 세포 (다발성 골수종 세포주)에서 종양을 퇴행시키는 항체 능력을 조사하였다.
선형화된 pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5의 OPM2 세포로의 형질감염 및 푸로마이신 (Calbiochem, San Diego, CA) 선별 후, 생존 세포를 MACS LS 컬럼 (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) 상에서 바이오틴 (Pierce Biotechnology, Rockford, Il) 표지된 항-FcRH5.7D11 및 MACS 항-바이오틴 마이크로비드를 사용하여 FcRH5 발현 세포에 대해 분리하었다. 분리 후, FcRH5 발현을, 공 벡터 pRK.CMV.PD.nbe를 음성 대조군으로 사용하면서, 동일한 방식으로, 항-FcRH5 항체 (10A8) 및 형질감염된 OPM2 세포주를 사용하여 FACS 분석으로 확인하였다.
SPDB-DM4를 갖는 hu10A8 약물 접합체의 효능을 분석하기 위해, 자성 CB17 ICR SCID 생쥐 (6 내지 8주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)의 옆구리에 주사를 통해 2 X 107개 OPM2-FcRH5 세포를 피하 접종시키고, 이종이식편 종양을 평균 180 mm3로 성장시켰다. 0일은, 하기에서 구체적으로 지시하지 않는 한, 종양이 평균 100 내지 250 mm3인 날 및 제1/또는 유일한 처리 용량이 투여되는 때를 언급한다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 2차원에 기초하여 계산하고, 수학식 V= 0.5a X b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 짧은 직경이다)에 따라 mm3로 나타내었다. 각각의 실험군으로부터 수집된 자료를 평균 + SE로 나타내었다. 9마리 생쥐 그룹을 항-FcRH5 ADC 또는 대조군 항체-약물 접합체 (ADC)를 사용하여 0.5 내지 12 mg ADC/kg의 단일 정맥내 (i.v.) 용량으로 처리하였다. 종양을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐의 체중을 실험 동안 주당 1회씩 측정하였다. 종양 부피가 3000 mm3에 도달하기 전 또는 종양이 궤양에 임박한 징후를 나타내었을 때 생쥐를 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
음성 대조군은 항-HER2 (HERCEPTIN®) (트라스트주마브)을 기본으로 하는 접합체 (SPDB-DM4)를 포함하였다.
B. 결과
1. OPM2 - FcRH5 이종이식
표 13 나타낸 약물 접합체 및 용량을 사용한 50일의 시간 경과에서, SPDB-DM4와 접합된 인간화 항-FcRH5 (10A8) (hu10A8) ("hu-항-FcRH5 (10A8)-SPDB-DM4")는 음성 대조군인 SPDB-DM4와 접합된 인간화 항-HER2 ("hu-항-HER2 (4D5)-SPDB-DM4"))와 비교하여 OPM2-FcRH5 종양을 갖는 SCID 생쥐에서 종양 성장을 억제하였다. ADC는 모든 ADC 및 대조군에 대해 0일에 (하기 표 13에서 지시하는 바와 같이) 단일 용량으로 투여하였다. 구체적으로, 8 mg/kg 및 12 mg/kg의 인간화 항-FcRH5 ADC는 종양 성장을 상당히 억제하였다 (도 30a).
또한, 동일한 조사에서, 처음 14일에 체중 변화율 (%)을 각각의 투여 그룹에 대해 측정하였다. 그 결과 (도 30b), 이들 인간화 항-FcRH5 및 인간화 항-FcRH5 thioMAb ADC의 투여는 이러한 시간 동안 체중의 상당한 감소 또는 중량 손실을 일으키지 않는 것으로 나타났다. 또한, 표 13에는 시험된 총 생쥐 중 부분적 퇴행 (PR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0일에 측정된 종양 부피의 50% 이하로 떨어지는 경우), 완전 퇴행 (CR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0 mm3로 떨어지는 경우)을 보이는 생쥐의 수가 나타나 있다 (NA: 적용불가); (TI = 조사 끝에 관측가능한 종양의 수).
Figure pct00075
* 비히클 = 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈, 0.02% PS20
실시예 7: 항- FcRH5 ThioMab 약물 접합체에 의한 시험관내 세포 증식 감소 검정
hu10A8 및 hu10A8 thioMAb (HC(A118C) 약물 접합체 (hu 항-FcRH5 (10A8)-네이키드, thio-HC(A118C)-hu-항-FcRH5 (10A8)-네이키드, hu 항-FcRH5 (10A8)-SPDB-DM4, thio-HC(A118C)-hu-항-FcRH5 (10A8)-MC-vc-PAB-MMAE 포함)의 시험관내 효능을 인간-FcRH5를 안정하게 발현하는 형질감염된 OPM2 세포주 (OPM2.CMV.PD.FcRH5.sp.2)를 사용하여 세포 증식 검정으로 측정하였다. CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 어쎄이 (Luminescent Cell Viability Assay)는 시판되며 (Promega Corp., Madison, WI), 균질 검정 방법은 콜레오프테라 루시페라제의 재조합 발현에 기초하였다 [US 5583024; US 5674713; US 5700670]. 이러한 세포 증식 검정은 대사적으로 활성인 세포의 지시자인 존재하는 ATP의 정량화에 기초하여 배양물 중의 생존 세포의 수를 측정한다 [Crouch et al., J. Immunol. Metho., 160: 81-88 (1993); US 6602677]. CellTiter-Glo® 검정은 자동화된 고효율 스크리닝 (HTS)을 따를 수 있는 96 웰 포멧으로 수행되었다 [Cree et al., AntiCancer Drugs, 6:398-404 (1995)]. 균질 검정 절차는 혈청-보충된 배지에서 배양된 세포에 직접적으로 단일 시약 (The CellTiter-Glo® Reagent)을 첨가하는 것을 포함한다.
균질한 "첨가-혼합-측정 (add-mix-measure)" 포멧에 의해 세포를 용해시키고, 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호를 생성한다. 기질인 비틀 푸시페린 (Beetle Luciferin)은 ATP의 AMP로의 동시전환 및 광자의 생성과 함께 재조합 반딧불이 루시페라제에 의해 산화적으로 탈카복실화된다. 생존 세포는 상대적 발광 단위 (RLU)에 반영된다. 자료는 발광측정기 또는 CCD 카메라 영상화 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 산물은 시간 경과에 따라 측정되는 RLU로 제시된다. RLU%는 "비-약물-접합체" 대조군과 비교되는 표준화된 RLU 비율 (%)이다. 달리, 발광으로부터의 광자는 섬광제의 존재 하에 섬광 계수기로 계수될 수 있다. 광 단위는 초당 계수 (count per second: CPS)로 제시될 수 있다.
인간화 항체-약물 접합체의 효능은 CellTiter Glo 발광 세포 생존력 어쎄이 (Promega Corp. Technical bulletin TB288; Mendoza et al., Cancer Res., 62: 5485-5488 (2002))로부터 적응된 하기 프로토콜을 이용하는 세포 증식 검정에 의해 측정되었다:
1. 배지 중 약 75,000개의 OPM2.CMV.PD.FcRH5.SP.2 세포를 포함하는 세포 배양물의 50 ㎕ 분취물을 96-웰의 불투명-벽이 있는 플레이트 각각의 웰에 담았다.
2. hu10A8 또는 thio-HC(A118C)-hu-항-FcRH5 (10A8) Ab 또는 ADC (50 ul)를 10000, 3333, 1111, 370, 123, 41, 14, 4.6 또는 1.5 ng/mL의 최종 농도로 삼중 실험 웰에 가하고, "비-약물 접합체" 대조군 웰은 단지 배지만을 가하며, 3일 동안 인큐베이션하였다.
3. 플레이트를 약 30분 동안 실온으로 맞추었다.
4. CellTiter-Glo 시약 (100 ㎕)을 가하였다.
5. 내용물을 궤도 진탕기 상에서 2분 동안 혼합하여 세포 용해를 유도하였다.
6. 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰다.
7. 발광을 기록하고 RLU% (상대적 발광 단위)로서 그래프로 나타내었다.
8. 대조군으로서 동일한 세포주를 비관련 비-결합 hu-항-Her2.4D5 Ab 또는 ADC (hu-항-Her2.4D5-네이키드, hu-항-Her2.4D5.HC.A118C-네이키드 hu 항-Her2.4D5-SPDB-DM4, hu 항-Her2.4D5.HC.A118C-MC-vc-PAB-MMAE 포함)과 함께 동시에 진행하였다.
배지: OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2 세포는 RPMI1640/20%FBS/2mM 글루타민/1.0 ㎍/ml 푸로마이신 중에서 성장한다.
생쥐 항체-약물 접합체의 효능은 도 31 및 32에 나타나 있다. 이러한 검정 결과가 IC50으로서 mg/ml로 설명된다. IC50은 세포 성장을 50% 억제하는데 필요한 항체 또는 ADC의 농도이다. 비접합된 hu10A8 및 thio-hu 항-FcRH5 (10A8)-HC(A118C)는 10 mg/ml (검정 농도 적정의 최대 한도)의 IC50과 함께 OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2 세포 상에서 시험관내 세포 성장 억제를 나타내지 않는다. Hu 항-FcRH5(10A8)-SPDB-DM4 및 thio-hu 항-FcRH5(10A8)-HC(A118C)-MC-vc-PAB-MMAE 모두 각각 0.03 및 0.04 mg/ml의 IC50으로 OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2 세포 성장 억제를 나타내었다. 또한, hu 항-FcRH5 (10A8)-SPDB-DM4는 보다 높은 농도에서 완전한 OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2 세포 성장 억제를 일으킨다. 대조군 항체 및 ADC 중 단지 hu 항-Her2.4D5-SPDB DM4가 1.8 mg/ml의 IC50과 함께 OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2 세포 성장 억제를 나타낸다. SPDB DM4는 절단가능한 링커 약물이기 때문에, 이러한 성장 억제가 가장 그럴듯한 방관자 (bystander) 약물 활성이다.
실시예 8: 인간화 항- FcRH5 약물 접합체에 의한 생체내 종양 성장 억제 검정
A. 이종이식
Velcade® (보르테조미브)와 병용하는 인간화 (10A8) 약물 접합체 (hu 항-FcRH5 (10A8)-MC-vc-PAB-MMAE)의 효능을 시험하기 위해서, 생쥐에서 종양 (다발성 골수종 OPM2-FcRH5 이종이식편)에 대한 접합된 항체 단독 및 Velcade®와 병용한 접합된 항체의 효과를 분석하였다.
구체적으로, 인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 OPM2 세포 (다발성 골수종 세포주)에서 종양을 퇴행시키는 항체 및 Velcade®의 능력을 조사하였다. 선형화된 pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5의 OPM2 세포로의 형질감염 및 푸로마이신 (Calbiochem, San Diego, CA) 선별 후, 생존 세포를 MACS LS 컬럼 (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) 상에서 바이오틴 (Pierce Biotechnology, Rockford, Il) 표지된 항-FcRH5.7D11 및 MACS 항-바이오틴 마이크로비드를 사용하여 FcRH5 발현 세포에 대해 분리하었다. 분리 후, FcRH5 발현을, 공 벡터 pRK.CMV.PD.nbe를 음성 대조군으로 사용하면서, 동일한 방식으로, 항-FcRH5 항체 (10A8) 및 형질감염된 OPM2 세포주를 사용하여 FACS 분석으로 확인하였다.
MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 hu 항-FcRH5 10A8 단독 및 Velcade®와 병용한 MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 hu 항-FcRH5 10A8의 효능을 분석하기 위해, 자성 CB17 ICR SCID 생쥐 (6 내지 8주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)의 옆구리에 주사를 통해 2 X 107개 OPM2-FcRH5 세포를 피하 접종시키고, 이종이식편 종양을 평균 331 mm3로 성장시켰다. 0일은, 하기에서 구체적으로 지시하지 않는 한, 종양이 평균 172 내지 511 mm3인 날 및 제1/또는 유일한 처리 용량이 투여되는 때를 언급한다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 2차원에 기초하여 계산하고, 수학식 V= 0.5a X b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 짧은 직경이다)에 따라 mm3로 나타내었다. 각각의 실험군으로부터 수집된 자료를 평균 + SE로 나타내었다. 생쥐를 각각 9마리 생쥐의 9개 그룹으로 무작위로 나누고 투약하였다. 그룹 1은 비히클 대조군으로서 0일에 히스티딘 완충액의 단일 정맥내 (IV) 주사 + 0, 3, 7 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 0.9% 염화나트륨 (식염수)의 IV 주사를 맞았다. 그룹 2는 접합체 대조군으로서 0일에 10 mg/kg Hu 항-Her2 트라스트주마브-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1135의 단일 IV 주사를 맞았다. 그룹 3은 0, 3, 7 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 1 mg/kg Velcade®의 IV 주사를 맞았다. 그룹 4 및 5는 0일에 각각 4 또는 10 mg/kg thio hu 항-FcRH5(10A8)-HC-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1465의 단일 IV 주사를 맞았다. 그룹 6 및 7은 0일에 각각 4 또는 10 mg/kg hu 항-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1575의 단일 IV 주사를 맞았다. 그룹 8은 0일에 4 mg/kg hu 항-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1575의 단일 IV 주사 + 0, 3, 7 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 1 mg/kg Velcade®의 IV 주사를 맞았다. 종양을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐의 체중을 처음 3주 동안 주당 2회씩 측정하였다. 종양 부피가 3000 mm3에 도달하기 전 또는 종양이 궤양에 임박한 징후를 나타내었을 때 생쥐를 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
음성 대조군은 항-HER2 (HERCEPTIN®) (트라스트주마브)을 기본으로 하는 접합체 (MC-vc-PAB-MMAE)를 포함하였다.
B. 결과
1. OPM2 - FcRH5 이종이식
약물 접합체 단독 및 Velcade®와 병용한 약물 접합체를 사용한 45일의 시간 경과에서, Velcade®와 병용된 -MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 hu10A8은, 음성 대조군인 -MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 인간화 항-Her2 (Hu 항-Her2 트라스트주마브-MC-vc-PAB-MMAE)와 비교하여, OPM2-FcRH5 종양을 갖는 SCID 생쥐에서 종양 성장을 억제하였다 (도 39). ADC는 모든 약물 접합체 및 대조군에 대해 0일에 단일 용량으로 투여하였다. Velcade®는 0, 3, 7, 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 투여되었다. 추가로, 1 mg/kg Velcade®와 병용한 4 mg/kg의 Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE는, 4 및 10 mg/kg의 Thio Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE, 4 및 10 mg/kg의 Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE, 및 1 mg/kg의 Velcade®로 투약된 단일 제제 그룹과 비교하여, 종양 성장을 상당히 억제하였다 (도 39).
또한, 동일한 조사에서, 처음 24일에 체중 변화율 (%)을 각각의 투여 그룹에 대해 측정하였다 (도 40). 그 결과, Velcade®의 투여는 처리기간 내내 체중 감소 또는 중량 손실을 일으켰으나, 투약을 마친 후에는 중량이 다시 되돌아왔다.
또한, 표 14에는 시험된 총 생쥐 중 부분적 퇴행 (PR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0일에 측정된 종양 부피의 50% 이하로 떨어지는 경우), 완전 퇴행 (CR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0 mm3로 떨어지는 경우)을 보이는 생쥐의 수가 나타나 있다 (NA: 적용불가); (TI = 조사 끝에 관측가능한 종양의 수).
Figure pct00076
* 비히클 = 20 mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% PS20, pH 5.5
실시예 9: 인간화 항- FcRH5 약물 접합체에 의한 생체내 종양 성장 억제 검정
A. 이종이식
Velcade®와 병용하는 인간화 (10A8) 약물 접합체 (Hu 항-FcRH5 10A8-SPDB-DM4)의 효능을 시험하기 위해서, 생쥐에서 종양 (다발성 골수종 OPM2-FcRH5 이종이식편)에 대한 접합된 항체 단독 및 Velcade®와 병용한 접합된 항체의 효과를 분석하였다.
구체적으로, 인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 OPM2 세포 (다발성 골수종 세포주)에서 종양을 퇴행시키는 항체 및 Velcade®의 능력을 조사하였다. 선형화된 pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5의 OPM2 세포로의 형질감염 및 푸로마이신 (Calbiochem, San Diego, CA) 선별 후, 생존 세포를 MACS LS 컬럼 (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) 상에서 바이오틴 (Pierce Biotechnology, Rockford, Il) 표지된 항-FcRH5.7D11 및 MACS 항-바이오틴 마이크로비드를 사용하여 FcRH5 발현 세포에 대해 분리하었다. 분리 후, FcRH5 발현을, 공 벡터 pRK.CMV.PD.nbe를 음성 대조군으로 사용하면서, 동일한 방식으로, 항-FcRH5 항체 (10A8) 및 형질감염된 OPM2 세포주를 사용하여 FACS 분석으로 확인하였다.
-SPDB-DM4와 접합된 hu 항-FcRH5 10A8 단독 및 Velcade®와 병용한 -SPDB-DM4와 접합된 hu 항-FcRH5 10A8의 효능을 분석하기 위해, 자성 CB17 ICR SCID 생쥐 (6 내지 8주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)의 옆구리에 주사를 통해 2 X 107개 OPM2-FcRH5 세포를 피하 접종시키고, 이종이식편 종양을 평균 306 mm3로 성장시켰다. 0일은, 하기에서 구체적으로 지시하지 않는 한, 종양이 평균 197 내지 499 mm3인 날 및 제1/또는 유일한 처리 용량이 투여되는 때를 언급한다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 2차원에 기초하여 계산하고, 수학식 V= 0.5a X b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 짧은 직경이다)에 따라 mm3로 나타내었다. 각각의 실험군으로부터 수집된 자료를 평균 + SE로 나타내었다. 생쥐를 각각 9마리 생쥐의 6 그룹으로 무작위로 나누고 투약하였다. 그룹 1은 0, 3, 7 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 1 mg/kg Velcade®의 정맥내 (IV) 주사를 맞았다. 그룹 2는 비히클 대조군으로서 0일에 히스티딘 완충액의 단일 정맥내 (IV) 주사 + 0, 3, 7 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 0.9% 염화나트륨 (식염수)의 IV 주사를 맞았다. 그룹 3은 접합체 대조군으로서 0일에 4 mg/kg Hu 항-Her2 트라스트주마브-SPDB-DM4, CNJ 1433의 단일 IV 주사를 맞았다. 그룹 4는 0일에 4 mg/kg Hu 항-FcRH5 10A8 SPDB-DM4, CNJ 1503의 단일 IV 주사를 맞았다. 그룹 5는 0일에 4 mg/kg Hu 항-Her2 트라스트주마브-SPDB-DM4, CNJ 1433의 단일 IV 주사 + 0, 3, 7 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 1 mg/kg Velcade®의 IV 주사를 맞았다. 그룹 6은 0일에 4 mg/kg Hu 항-FcRH5 10A8 SPDB-DM4, CNJ 1503의 단일 IV 주사 + 0, 3, 7 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 1 mg/kg Velcade®의 IV 주사를 맞았다. 종양을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐의 체중을 처음 3주 동안 주당 2회씩 측정하였다. 종양 부피가 3000 mm3에 도달하기 전 또는 종양이 궤양에 임박한 징후를 나타내었을 때 생쥐를 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
음성 대조군은 항-HER2 (HERCEPTIN®) (트라스트주마브)을 기본으로 하는 접합체 (SPDB-DM4)를 포함하였다.
B. 결과
1. OPM2 - FcRH5 이종이식
약물 접합체 단독 및 Velcade®와 병용한 약물 접합체를 사용한 37일의 시간 경과에서, Velcade®와 병용된 -SPDB-DM4와 접합된 인간화 항-FcRH5 (10A8) (Hu 항-FcRH5 10A8-SPDB-DM4)은, 음성 대조군인 -SPDB-DM4와 접합된 인간화 항-Her2 (Hu 항-Her2 트라스트주마브- SPDB-DM4)와 비교하여, OPM2-FcRH5 종양을 갖는 SCID 생쥐에서 종양 성장을 억제하였다 (도 41). ADC는 모든 약물 접합체 및 대조군에 대해 0일에 단일 용량으로 투여하였다. Velcade®는 0, 3, 7, 및 10일에 2주 동안 주당 2회씩 투여되었다. 추가로, 1 mg/kg Velcade®와 병용한 4 mg/kg의 Hu 항-FcRH5 10A8-SPDB-DM4는, 4 mg/kg의 Hu 항-FcRH5 10A8-SPDB-DM4 및 1 mg/kg의 Velcade®가 투여된 단일 제제 그룹 및 Hu 항-Her2 트라스트주마브-SPDB-DM4 + 1 mg/kg의 Velcade®이 투여된 병용 그룹과 비교하여, 종양 성장을 상당히 억제하였다 (도 41).
또한, 동일한 조사에서, 처음 21일에 체중 변화율 (%)을 각각의 투여 그룹에 대해 측정하였다 (도 42). 그 결과, 인간화 항-FcRH5 ADC 및 Velcade®의 투여는 이 기간 동안 상당한 체중 감소 또는 중량 손실을 일으키지 않는 것으로 나타났다.
또한, 표 15에는 시험된 총 생쥐 중 부분적 퇴행 (PR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0일에 측정된 종양 부피의 50% 이하로 떨어지는 경우), 완전 퇴행 (CR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0 mm3로 떨어지는 경우)을 보이는 생쥐의 수가 나타나 있다 (NA: 적용불가); (TI = 조사 끝에 관측가능한 종양의 수).
Figure pct00077
* 비히클 = 20 mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% PS20, pH 5.5
실시예 10: 인간화 항- FcRH5 약물 접합체에 의한 생체내 종양 성장 억제 검정
A. 이종이식
Revlimid® 및 Rvlimid® + 덱사메타손과 병용되는 인간화 (10A8) 약물 접합체 (Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE)의 효능을 시험하기 위해서, 생쥐에서 종양 (다발성 골수종 OPM2-FcRH5 이종이식편)에 대한 Revlimid® 및 Rvlimid® + 덱사메타손과 병용한 접합된 항체의 효과를 분석하였다.
구체적으로, 인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 OPM2 세포 (다발성 골수종 세포주)에서 종양을 퇴행시키기 위한 Revlimid® 및 Revlimid® + 덱사메타손과 병용된 항체의 능력을 조사하였다. 선형화된 pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5의 OPM2 세포로의 형질감염 및 푸로마이신 (Calbiochem, San Diego, CA) 선별 후, 생존 세포를 MACS LS 컬럼 (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) 상에서 바이오틴 (Pierce Biotechnology, Rockford, Il) 표지된 항-FcRH5.7D11 및 MACS 항-바이오틴 마이크로비드를 사용하여 FcRH5 발현 세포에 대해 분리하었다. 분리 후, FcRH5 발현을, 공 벡터 pRK.CMV.PD.nbe를 음성 대조군으로 사용하면서, 동일한 방식으로, 항-FcRH5 항체 (10A8) 및 형질감염된 OPM2 세포주를 사용하여 FACS 분석으로 확인하였다.
Revlimid® 및 Revlimid® + 덱사메타손과 병용되는 -MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 hu 항-FcRH5 10A8의 효능을 분석하기 위해, 자성 CB17 ICR SCID 생쥐 (6 내지 8주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)의 옆구리에 주사를 통해 2 X 107개 OPM2-FcRH5 세포를 피하 접종시키고, 이종이식편 종양을 평균 446 mm3로 성장시켰다. 0일은, 하기에서 구체적으로 지시하지 않는 한, 종양이 평균 263 내지 630 mm3인 날 및 제1/또는 유일한 처리 용량이 투여되는 때를 언급한다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 2차원에 기초하여 계산하고, 수학식 V= 0.5a X b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 짧은 직경이다)에 따라 mm3로 나타내었다. 각각의 실험군으로부터 수집된 자료를 평균 + SE로 나타내었다. 생쥐를 각각 8마리 생쥐의 9 그룹으로 무작위로 나누고 투약하였다. 그룹 1은 비히클 대조군으로서 0 내지 13일에 매일 DMSO와 MCT 완충액 혼합물의 복강내 (IP) 주사를 맞았다. 그룹 2는 접합체 대조군으로서 0일에 6 mg/kg Hu 항-Her2 트라스트주마브-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1135의 단일 정맥내 (IV) 주사를 맞았다. 그룹 3은 0일에 6 mg/kg Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1672의 단일 IV 주사를 맞았다. 그룹 4는 0 내지 13일에 매일 50 mg/kg Revlimid®의 IP 주사를 맞았다. 그룹 5에는 0 내지 3일 및 7 내지 10일의 2 사이클 동안 4일에 이어 3일 동안은 투약 없이 3 mg/kg 덱사메타손이 매일 경구 (PO) 투여되었다. 그룹 6에는 0 내지 13일에 50 mg/kg Revlimid®가 매일 IP 주사되고, 0 내지 3일 및 7 내지 10일의 2 사이클 동안 4일에 이어 3일 동안은 투약 없이 3 mg/kg 덱사메타손이 매일 경구 (PO) 투여되었다. 그룹 7에는 0일에 6 mg/kg Hu 항-Her2 트라스트주마브-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1135가 단일 IV 주사되고, 0 내지 13일에 50 mg/kg Revlimid®가 매일 IP 주사되며, 0 내지 3일 및 7 내지 10일의 2 사이클 동안 4일에 이어 3일 동안은 투약 없이 3 mg/kg 덱사메타손이 매일 경구 (PO) 투여되었다. 그룹 8에는 0일에 6 mg/kg Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1672가 단일 IV 주사되고, 0 내지 13일에 50 mg/kg Revlimid®이 매일 IP 주사되며, 0 내지 3일 및 7 내지 10일의 2 사이클 동안 4일에 이어 3일 동안은 투약 없이 3 mg/kg 덱사메타손이 매일 경구 (PO) 투여되었다. 그룹 9에는 0일에 6 mg/kg Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1672가 단일 IV 주사되고, 0 내지 13일에 50 mg/kg Revlimid®이 매일 IP 주사되었다. 종양을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐의 체중을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐가 0일의 체중에 비해 15% 초과로 체중을 상실하는 경우, 체중이 다시 늘 때까지 또는 체중 손실이 20%를 초과할 때까지 매일 생쥐의 체중을 달았다. 0일의 체중과 비교하여 체중이 20% 초과로 손실되었을 때, 종양 부피가 3000 mm3에 도달하기 전, 또는 종양이 궤양에 임박한 징후를 나타내었을 때, 생쥐를 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
음성 대조군은 항-HER2 (HERCEPTIN®) (트라스트주마브)을 기본으로 하는 접합체 (MC-vc-PAB-MMAE)를 포함하였다.
B. 결과
1. OPM2 - FcRH5 이종이식
Revlimid® 및 Revlimid® + 덱사메타손과 병용되는 약물 접합체를 사용한 38일의 시간 경과에서, Revlimid® 및 Revlimid® + 덱사메타손과 병용되는 -MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 인간화 항-FcRH5 (10A8) (Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE)는, 음성 대조군인 -MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 인간화 항-Her2 (Hu 항-Her2 트라스트주마브-MC-vc-PAB-MMAE)와 비교하여, OPM2-FcRH5 종양을 갖는 SCID 생쥐에서 종양 성장을 억제하였다 (도 43). ADC는 모든 약물 접합체 및 대조군에 대해 0일에 단일 용량으로 투여하였다. Revlimid®는 0 내지 13일에 매일 50 mg/kg Revlimid®의 IP 주사로 투여되었다. 덱사메타손은 0 내지 3일 및 7 내지 10일의 2 사이클 동안 4일에 이어 3일은 투약 없이 매일 PO 투여되었다. 추가로, 50 mg/kg Revlimid®와 병용한 6 mg/kg Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE, 및 Hu 항-FcRH5 10A8-SPDB-DM4 및 50 mg/kg Revlimid® + 3 mg/kg 덱사메타손과 병용한 6 mg/kg Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE 모두, 6 mg/kg Hu 항-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE, 50 mg/kg Revlimid® (레날리도미드), 및 3 mg/kg 덱사메타손으로 투약되는 단일 제제 그룹과 비교하여 종양 성장을 상당히 억제하였다 (도43).
또한, 동일한 조사에서, 처음 17일에 체중 변화율 (%)을 각각의 투여 그룹에 대해 측정하였다 (도 44). 그 결과, 덱사메타손 및 Revlimid®의 투여는 상당한 체중 감소 또는 중량 손실을 일으키는 것으로 나타났다.
또한, 표 16에는 시험된 총 생쥐 중 부분적 퇴행 (PR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0일에 측정된 종양 부피의 50% 이하로 떨어지는 경우), 완전 퇴행 (CR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0 mm3로 떨어지는 경우)을 보이는 생쥐의 수가 나타나 있다 (NA: 적용불가); (TI = 조사 끝에 관측가능한 종양의 수).
Figure pct00078
앞서 기술된 상세 설명은 당업자가 본 발명을 실시하는데 있어 충분한 것으로 여겨진다. 기탁된 양태는 본 발명의 특정 측면에 대한 단순 예시이므로 본 발명의 범위가 기탁된 제작물로 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 어떠한 제작물도 본 발명의 범위에 속한다. 본원의 물질에 대한 기탁은, 본원에 포함된 기술이 임의의 측면의 본 발명 (이의 최적 모드를 포함)을 실시할 수 있게 하는데 부적합하다는 것을 인정하는 것이 아니며, 특허청구범위의 범위를 제시된 특정 예시로 제한하려는 것이 아니다. 실제로, 본원에 나타내고 기술된 것들에 추가하여, 본 발명에 대한 다양한 변형이 앞선 설명으로부터 당업자에게 분명할 것이며, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속한다.
실시예 11: FcRH5 이중특이적 항체의 생성 및 특징분석
항- CD3 / FcRH5 이중특이적 항체의 제작 및 생성
FcRH5 이중특이적 항체, 특히 항-CD3/FcRH5의 캐비티로의 돌출 이중특이적 항체의 제작이 하기에 기술된다.
다양한 캐비티로의 돌출 이중특이적 항체가 이미 기술되어 있다 [U.S. Pat. Nos. 5,731,168 및 7,183,076; Ridgway et al., Prot. Eng. 9:617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997); Merchant et al., Nat. Biotechn. 16:677-681 (1998)]. 특정 예에서, 문헌 [Chamow et al . Chamow et al . J. Immunol . 153:4268 (1994)]에 전술된 인간화 항-CD3/CD4-IgG 키메라 사이의 CH3 계면은 발현 제작물로 공동형질감염된 포유동물 세포주로부터 회수될 수 있었던 이종다량체 비율 (%)을 최대화하도록 조작되었다. 본원에서 사용되는 "이종다량체"는 적어도 제1 폴리펩티드 및 제1 폴리펩티드와는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 아미노산 서열이 상이한 제2 폴리펩티드를 포함하는 분자, 예를 들어 이중특이적 항체를 언급한다.
앞서의 단락에서 인용되는 문헌에서 기술되는 바와 같이, 이종다량체 형성을 유도하는데 사용되는 전략은 제1 폴리펩티드, 예를 들어 하나의 항체의 H 쇄의 CH3 도메인으로 하나 이상의 "돌출" 돌연변이를 도입하는 것, 및 제2 폴리펩티드, 예를 들어 제2 항체 H 쇄의 CH3 도메인으로 하나 이상의 상응하는 "캐비티" 돌연변이를 도입하는 것에 의존한다. "돌출" 돌연변이는 작은 아미노산을 보다 큰 아미노산으로 대체하였으며, "캐비티" 돌연변이는 큰 아미노산을 보다 작은 아미노산으로 대체하였다. 또한, 돌출 및 캐비티 돌연변이에 추가하여, 유리된 티올-함유 잔기가 2개의 폴리펩티드, 예를 들어 2개의 CH3 도메인의 계면에 도입되었으며, 이는 이종다량체의 형성을 증진시키는 것으로 나타났다. 폴리펩타이드 계면에 도입된 다양한 예시적 캐비티로의 돌출 돌연변이 및 유리된 티올-함유 잔기가 문헌 [미국 특허 5,731,168 및 7,183,076; Ridgway et al., Prot. Eng. 9:617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997); Merchant et al., Nat. Biotechn. 16:677-681 (1998)]에 기술되어 있다.
하기 단계들을 수행하여 항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체를 생성한다. 뮤린 항-CD3 모노클로날 Ab UCHT1 [미국 특허 5,821,337 및 6,407,213; Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217 [1992]; Rodrigues et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 45 [1992]]의 인간화 항-CD3 경쇄 (L) 및 중쇄 (H) 변이체를 코딩하는 이. 콜라이 발현 플라스미드를 제작한다. pAK19를 포함한 많은 적합한 이. 콜라이 발현 플라스미드가 당해 기술 분야에 공지되어 있다 [Carter et al., Bio/Tehcnology 10:163-167 (1992)]. 인간화 항-CD3 H 쇄의 (상술된 바와 같은) CH3 도메인으로의 돌출 또는 캐비티를 도입하기 위한 돌연변이는, 예를 들어 부위-지시된 돌연변이유발로 수행된다. 다양한 부위-지시된 돌연변이유발법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다 [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]. 또한, 인간화 항-FcRH5 경쇄 및 중쇄, 예를 들어 본원에 기술되는 바와 같은 인간화 항-FcRH5 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 이. 콜라이 발현 플라스미드가 제작된다. 인간화 항-FcRH5 H 쇄의 (상술된 바와 같은) CH3 도메인으로 상응하는 캐비티 (항-CD3 CH3 도메인이 돌출 돌연변이를 갖는 경우) 또는 상응하는 돌출 (항-CD3 CH3 도메인이 캐비티 돌연변이를 갖는 경우)을 도입하는 돌연변이는, 예를 들어 부위-지시된 돌연변이유발로 수행된다.
이중특이적 항-CD3/FcRH5 항체는 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 적합한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 33B6로 상술된 이. 콜라이 플라스미드를 형질전환시킴으로써 형성된다 [Rodrigues et al., Cancer Res. 55:63-70 (1995)]. 항체는 전술된 바와 같이 10 L 발효조에서 성장된 형질전환된 이. 콜라이에 의해 분비된다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 항체는 당해 기술 분야에 공지된 절차를 이용하여 정제 및 분석된다 [Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997)].
세포 결합 검정: B 세포 및 T 세포를 결합하는 항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체의 능력을 평가하기 위해서, 인간 말초 백혈구 세포를 당해 기술 분야에 공지된 표준 절차에 따라 피콜 구배를 사용하여 건강한 공여자로부터의 전혈로부터 분리한다. 약 106개 세포를 PBS 중 0.5% BSA 및 2mM EDTA를 포함하는 완충액 중에서 얼음 상의 항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체와 함께 인큐베이션한다. 이어서, 세포를 세척하고, 제작자의 프로토콜 (BD Biosciences, San Diego, CA)에 따라, 항-CD8-APC 및 항-CD138-PE 및 항-CD38-PerCP-Cy5 항체와 함께, FITC-접합된 염소 (Fab')2 항-인간 IgG로 염색한다. 결합 활성은 FACSCaliburTM 유동 세포계수기 (BD Biosciences, San Diego, CA)를 사용하여 FACS-기초 검정으로 평가되고, 분석은 Flowjo 소프트웨어 (Tree Star, Ashland, OR)로 수행된다.
시험관내 세포 사멸 검정: EJM-FcRH5.LSP.2 다발성 골수종 세포 (EJM 세포, DSMZ ACC-560, 인간 FcRH5로 안정하게 트랜스펙션됨)를 표적 세포로 사용하고, 전체 인간 말초 백혈구 세포 또는 CD8+ T 세포와 함께 공동-배양한다. CD8+ T 세포가 사용되는 경우, 이들은 96-웰 환저 플레이트에서 CD8+ T 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 사용한 네가티브 분류에 의해 인간 PBMC로부터 정제된다. 20,000개의 EJM-FcRH5.LSP.2 세포를 표적물: 이펙터 세포 = 1:10이 비율로 항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체의 존재 또는 부재 하에 웰에 가한다. 약 19시간 후, 세포를 제작자의 프로토콜 (BD Biosciences, San Diego, CA)에 따라 표지된 항-CD38-FITC 및 항-CD138-PE로 염색하고, Fluoresbrite® 캘리브레이션 그레이드 6.0 미크론 YG 미세구 (Polysciences, Inc., Warrington, PA)와 혼합한다. 정방향/측방향 스캐터 (scatter)를 게이팅 (gating)하고 CD38-CD138 염색하여 FACS 분석을 수행한다. 죽은 세포는 표준 절차에 따라 프로피디움 요오다이드 염색을 이용하여 제거시킨다. 항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체의 특이 사멸 활성을 하기 수학식으로 계산한다: 특이적 사멸율 (%) = (1 - 처리와 함께 살아 있는 EJM-FCRH5.LSP.2 세포의 수/항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체 부재 하에 이펙터 & EJM-FCRH5.LSP.2 중 살아 있는 EJM-FCRH5.LSP.2 세포의 수)x 100.
생체내 효능: EJM-FcRH5.LSP.2 다발성 골수종 세포를 말초혈 단핵구와 혼합하고, 자성 NOD.CD17-Prkdc scid /J 생쥐 (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA)의 우측 흉부 옆구리에 피하 주사한다. 이어서, 접종된 생쥐를 대조군 및 처리군으로 무작위로 분리한다. 대조군에는 비히클 또는 항-CD3/Her2 대조군 이중특이적 항체를 투여한다. 처리군에는 항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체를 투여한다. 이중특이적 항체는 0.01 내지 10 mg/kg의 범위로 투여된다. 대조군 또는 처리군은 세포 접종 후 1 내지 2시간 내에 정맥내 투여되고 5일 연속해서 매일 반복된다. 종양을 주당 2회씩 캘리퍼스를 사용하여 2차원 (길이 및 폭)으로 측정한다. 생쥐는 주당 2회씩 임상적으로 모니터링된다. 실험이 끝났을 때, 대조-처리 동물에서의 종양 크기를 항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체-처리된 동물에서의 종양 크기와 비교하여 항-CD3/FcRH5 이중특이적 항체 처리의 효능을 평가한다.
실시예 12: 인간화 항- FcRH5 약물 접합체에 의한 생체내 종양 성장 억제 검정
A. 이종이식
상이한 용량의 MC-vc-PAB-MMAE를 갖는 hu10A8 약물 접합체 ("hu-항-FcRH5 (10A8)-MC-vc-PAB-MMAE")의 효능을 시험하기 위해서, 생쥐에서 종양에 대한 접합된 항체의 효과를 분석하였다.
구체적으로, 인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 EJM 세포 (다발성 골수종 세포주)에서 종양을 퇴행시키는 항체 능력을 조사하였다.
EJM (ACC-560) 세포는 DSMZ (Germany)로부터 수득되는 시판되는 인간 다발성 골수종 세포주이다. EJM 세포는 FcRH5를 내인적으로 발현하지 않기 때문에, 인간 FcRH5으로 안정하게 형질감염되어 EJM.CMV.PD.FcRH5.LSP.2 세포주를 생성하였다.
MC-vc-PAB-MMAE를 갖는 hu10A8 약물 접합체의 효능을 분석하기 위해, 자성 CB17 ICR SCID 생쥐 (6 내지 8주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)의 옆구리에 주사를 통해 2 X 107개 EJM2-FcRH5.LSP.2 세포를 피하 접종시키고, 이종이식편 종양을 평균 134 mm3로 성장시켰다. 0일은, 하기에서 구체적으로 지시하지 않는 한, 종양이 평균 100 내지 250 mm3인 날 및 제1/또는 유일한 처리 용량이 투여되는 때를 언급한다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 2차원에 기초하여 계산하고, 수학식 V= 0.5a X b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 짧은 직경이다)에 따라 mm3로 나타내었다. 각각의 실험군으로부터 수집된 자료를 평균 + SE로 나타내었다. 8마리 생쥐 그룹을 항-FcRH5 ADC 또는 대조군 항체-약물 접합체 (ADC)를 사용하여 1 내지 8 mg ADC/kg의 단일 정맥내 (i.v.) 용량으로 처리하였다. 종양을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐의 체중을 2주 동안 주당 1회씩 측정하였다. 종양 부피가 3000 mm3에 도달하기 전 또는 종양이 궤양에 임박한 징후를 나타내었을 때 생쥐를 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
음성 대조군은 항-HER2 (HERCEPTIN®) (트라스트주마브)을 기본으로 하는 접합체 (MC-vc-PAB-MMAE)를 포함하였다.
B. 결과
1. EJM - FcRH5 . LSP .2 이종이식
표 17 나타낸 약물 접합체 및 용량을 사용한 80일의 시간 경과에서, MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 인간화 항-FcRH5 (10A8) (hu10A8) ("hu-항-FcRH5 (10A8)-MC-vc-PAB-MMAE")는 음성 대조군인 MC-vc-PAB-MMAE와 접합된 인간화 항-HER2 ("hu-항-HER2 (4D5)-MC-vc-PAB-MMAE")와 비교하여 EJM-FcRH5.LSP.2 종양을 갖는 SCID 생쥐에서 종양 성장을 억제하였다. ADC는 모든 ADC 및 대조군에 대해 0일에 단일 용량으로 투여하였다. 구체적으로, 모든 용량 수준의 인간화 항-FcRH5 ADC는 종양 성장을 상당히 억제하였다 (도 45).
또한, 동일한 조사에서, 처음 7일에 체중 변화율 (%)을 각각의 투여 그룹에 대해 측정하였다. 그 결과, 이들 인간화 항-FcRH5 ADC의 투여는 이러한 시간 동안 체중의 상당한 감소 또는 중량 손실을 일으키지 않는 것으로 나타났다 (도 46).
또한, 표 17에는 시험된 총 생쥐 중 부분적 퇴행 (PR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0일에 측정된 종양 부피의 50% 이하로 떨어지는 경우), 완전 퇴행 (CR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0 mm3로 떨어지는 경우)을 보이는 생쥐의 수가 나타나 있다 (NA: 적용불가); (TI = 조사 끝에 관측가능한 종양의 수).
Figure pct00079
* 비히클 = 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈, 0.02% PS20
실시예 13: 인간화 항- FcRH5 약물 접합체에 의한 생체내 종양 성장 억제 검정
A. 이종이식
상이한 용량의 SPDB-DM4를 갖는 hu10A8 약물 접합체 ("hu-항-FcRH5 (10A8)- SPDB-DM4")의 효능을 시험하기 위해서, 생쥐에서 종양에 대한 접합된 항체의 효과를 분석하였다.
구체적으로, 인간 FcRH5로 안정하게 형질감염된 EJM 세포 (다발성 골수종 세포주)에서 종양을 퇴행시키는 항체 능력을 조사하였다.
EJM (ACC-560) 세포는 DSMZ (Germany)로부터 수득되는 시판되는 인간 다발성 골수종 세포주이다. EJM 세포는 FcRH5를 내인적으로 발현하지 않기 때문에, 인간 FcRH5으로 안정하게 형질감염되어 EJM.CMV.PD.FcRH5.LSP.2 세포주를 생성하였다.
SPDB-DM4를 갖는 hu10A8 약물 접합체의 효능을 분석하기 위해, 자성 CB17 ICR SCID 생쥐 (6 내지 8주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)의 옆구리에 주사를 통해 2 X 107개 EJM2-FcRH5.LSP.2 세포를 피하 접종시키고, 이종이식편 종양을 평균 134 mm3로 성장시켰다. 0일은, 하기에서 구체적으로 지시하지 않는 한, 종양이 평균 100 내지 250 mm3인 날 및 제1/또는 유일한 처리 용량이 투여되는 때를 언급한다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 2차원에 기초하여 계산하고, 수학식 V= 0.5a X b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 짧은 직경이다)에 따라 mm3로 나타내었다. 각각의 실험군으로부터 수집된 자료를 평균 + SE로 나타내었다. 8마리 생쥐 그룹을 항-FcRH5 ADC 또는 대조군 항체-약물 접합체 (ADC)를 사용하여 2 내지 8 mg ADC/kg의 단일 정맥내 (i.v.) 용량으로 처리하였다. 종양을 실험 동안 주당 2회씩 측정하였다. 생쥐의 체중을 2주 동안 주당 1회씩 측정하였다. 종양 부피가 3000 mm3에 도달하기 전 또는 종양이 궤양에 임박한 징후를 나타내었을 때 생쥐를 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
음성 대조군은 항-HER2 (HERCEPTIN®) (트라스트주마브)을 기본으로 하는 접합체 (SPDB-DM4)를 포함하였다.
B. 결과
1. EJM - FcRH5 . LSP .2 이종이식
표 18 나타낸 약물 접합체 및 용량을 사용한 24일의 시간 경과에서, SPDB-DM4와 접합된 인간화 항-FcRH5 (10A8) (hu10A8) ("hu-항-FcRH5 (10A8)-SPDB-DM4")는 음성 대조군인 SPDB-DM4와 접합된 인간화 항-HER2 ("hu-항-HER2 (4D5)-SPDB-DM4")와 비교하여 EJM-FcRH5.LSP.2 종양을 갖는 SCID 생쥐에서 종양 성장을 억제하였다. ADC는 모든 ADC 및 대조군에 대해 0일에 단일 용량으로 투여하였다. 구체적으로, 8mg/kg의 인간화 항-FcRH5 ADC는 종양 성장을 상당히 억제하였다 (도 47).
또한, 동일한 조사에서, 처음 7일에 체중 변화율 (%)을 각각의 투여 그룹에 대해 측정하였다. 그 결과, 이들 인간화 항-FcRH5 ADC의 투여는 이러한 시간 동안 체중의 상당한 감소 또는 중량 손실을 일으키지 않는 것으로 나타났다 (도 48).
또한, 표 18에는 시험된 총 생쥐 중 부분적 퇴행 (PR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0일에 측정된 종양 부피의 50% 이하로 떨어지는 경우), 완전 퇴행 (CR; 투여 후 임의의 시점에서 종양 부피가 0 mm3로 떨어지는 경우)을 보이는 생쥐의 수가 나타나 있다 (NA: 적용불가); (TI = 조사 끝에 관측가능한 종양의 수).
Figure pct00080
* 비히클 = 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈, 0.02% PS20
SEQUENCE LISTING <110> ELKINS, KRISTI POLSON, ANDREW EBENS, ALLEN ADAMS, CAMELIA ZHENG, BING JUNUTULA, JAGATH R. HONGO, JO-ANNE WU, YAN <120> ANTI-FCRH5 ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES AND METHODS OF USE <130> GNE-0350-PCT <140> Not Yet Assigned <141> Here with <150> 61/266,972 <151> 2009-12-04 <150> 61/166,217 <151> 2009-04-02 <150> 61/211,695 <151> 2009-04-01 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gD tag and signal sequence <400> 1 Met Gly Gly Thr Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser 20 25 30 Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val 35 40 45 Leu Asp Gln Leu Leu 50 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 2 gatcgatatc ytgctsacmc artgtccagc 30 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 3 tttdakytcc agcttggtac c 21 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 4 gatcgacgta cgctgargtg carytggtgg artctgg 37 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 5 acagtgggcc cttggtggag gctgmrgaga cdgtgashrd rgt 43 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 6 gatcgatatc gtgatgaccc artctcayaa 30 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 7 tttdakytcc agcttggtac c 21 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 8 gatcgacgta cgctgargtg carytggtgg artctgg 37 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 9 ctggwcaggg mtccagagtt cca 23 <210> 10 <211> 917 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Light chain of chimeric anti-human FcRH5 (ch7D11) <400> 10 cactcccagc tccaactgca cctcggttct atcgattgaa ttccaccatg ggatggtcat 60 gtatcatcct ttttctagta gcaactgcaa ctggagtaca ttcagatatc ctgctgacac 120 aatctccagc catcctgtct gtgagtccag gagaaagagt cagtttctcc tgcaggtcca 180 gtcagagcat tggcacaaac atacactggt atcagcaaag aacaaatggt tctccaaggc 240 ttctcataaa gtttgcttct gagtctctct ctgggatccc ttccaggttt agtggcagtg 300 gatcagggac agattttact cttagcatca atagtgtgga gtctgaagat tttgcagatt 360 actactgtca acaaagtaat agctggccac tcacgttcgg tgctggtacc aaggtggaga 420 tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga 480 aatctggaac tgcttctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag 540 tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc 600 aggacagcaa 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gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt 60 agcaactgca actggagtac attcagatat cgtgatgacc cagtctcata aattcatgtc 120 cacatcagta agagacaggg tcagcatcac ctgcaaggcc agtcaggatg tgagtactgc 180 tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa ctactgattt attcggcatc 240 ctaccggtac actggagtcc ctgatcgctt cactggcagt ggatctggga cggatttcac 300 tttcaccatc agcagtgtgc aggctgaaga cctggcagtt tattactgtc agcaacattt 360 tagtagtcct cggacgttcg gtggaggtac caaggtggag atcaaacgaa ctgtggctgc 420 accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcttctgt 480 tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa 540 cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac 600 ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta 660 cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg 720 agagtgttaa gcttggccgc catggcccaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 780 ataaagcaat agcatcacaa 800 <210> 15 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Light chain of chimeric anti-human FcRH5 (ch10A8) <400> 15 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe Ser Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr 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Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FR1-LC of Light Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FR2-LC of Light Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 23 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 24 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FR3-LC of Light Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 24 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FR4-LC of Light Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 25 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Gln Gln His Phe Ser Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 29 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic CL1-LC of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 29 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Variable Domain of Light Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe Ser Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 31 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FR1-HC of Heavy Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FR2-HC of Heavy Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 32 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FR3-HC of Heavy Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 33 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FR4-HC of Heavy Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 34 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Val Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Ser Val 1 5 10 15 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Ala Arg Pro Ile Pro Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic CH1-HC of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 100 105 <210> 39 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Fc-HC of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 39 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 40 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Variable Domain of Heavy Chain of Humanized Antibody (hu10A8.v1) <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Pro Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ThioMab-hu10A8.v1-HC(A118C)-Light Chain <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe Ser Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 42 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ThioMab-hu10A8.v1-HC(A118C)-Heavy Chain <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Pro Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 43 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ThioMab-hu10A8.v1-LC(V205C)-Light Chain <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe Ser Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 44 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ThioMab-hu10A8.v1-LC(V205C)-Heavy Chain <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Pro Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 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<400> 50 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 53 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Albumin binding peptide <400> 53 Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Ser Gln Arg Leu Met Glu Asp 1 5 10 15 Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp Phe 20 25 30 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Albumin binding peptide <400> 54 Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp Phe 20 <210> 55 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Albumin binding peptide <400> 55 Gln Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp Phe 20 <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Albumin binding peptide <400> 56 Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Albumin binding peptide <400> 57 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 58 <211> 684 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 gatgtgctcc ttggagctgg tgtgcagtgt cctgactgta agatcaagtc caaacctgtt 60 ttggaattga ggaaacttct cttttgatct cagcccttgg tggtccaggt cttcatgctc 120 tgtgggtgat attactggtc ctggctcctg tcagtggaca gtttgcaagg acacccaggc 180 ccattatttt cctccagcct ccatggacca cagtcttcca aggagagaga gtgaccctca 240 cttgcaaggg atttcgcttc tactcaccac agaaaacaaa atggtaccat cggtaccttg 300 ggaaagaaat actaagagaa accccagaca atatccttga ggttcaggaa tctggagagt 360 acagatgcca ggcccagggc tcccctctca gtagccctgt gcacttggat ttttcttcag 420 agatgggatt tcctcatgct gcccaggcta atgttgaact cctgggctca agtgatctgc 480 tcacctaggc ctctcaaagc gctgggatta cagcttcgct gatcctgcaa gctccacttt 540 ctgtgtttga aggagactct gtggttctga ggtgccgggc aaaggcggaa gtaacactga 600 ataatactat ttacaagaat gataatgtcc tggcattcct taataaaaga actgacttcc 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 684 <210> 59 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Met Leu Leu Trp Val Ile Leu Leu Val Leu Ala Pro Val Ser Gly Gln 1 5 10 15 Phe Ala Arg Thr Pro Arg Pro Ile Ile Phe Leu Gln Pro Pro Trp Thr 20 25 30 Thr Val Phe Gln Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Gly Phe Arg 35 40 45 Phe Tyr Ser Pro Gln Lys Thr Lys Trp Tyr His Arg Tyr Leu Gly Lys 50 55 60 Glu Ile Leu Arg Glu Thr Pro Asp Asn Ile Leu Glu Val Gln Glu Ser 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Ala Gln Gly Ser Pro Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95 His Leu Asp Phe Ser Ser Glu Met Gly Phe Pro His Ala Ala Gln Ala 100 105 110 Asn Val Glu Leu Leu Gly Ser Ser Asp Leu Leu Thr 115 120 <210> 60 <211> 5392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 aattcactaa tgcattctgc tctttttgag agcacagctt ctcagatgtg ctccttggag 60 ctggtgtgca gtgtcctgac tgtaagatca agtccaaacc tgttttggaa ttgaggaaac 120 ttctcttttg atctcagccc ttggtggtcc aggtcttcat gctgctgtgg gtgatattac 180 tggtcctggc tcctgtcagt ggacagtttg caaggacacc caggcccatt attttcctcc 240 agcctccatg gaccacagtc ttccaaggag agagagtgac cctcacttgc aagggatttc 300 gcttctactc accacagaaa acaaaatggt accatcggta cctcgggaaa gaaatactaa 360 gagaaacccc agacaatatc cttgaggttc aggaatctgg agagtacaga tgccaggccc 420 agggctcccc tctcagtagc cctgtgcact tggatttttc ttcagcttcg ctgatcctgc 480 aagctccact ttctgtgttt gaaggagact ctgtggttct gaggtgccgg gcaaaggcgg 540 aagtaacact gaataatact atttacaaga atgataatgt cctggcattc cttaataaaa 600 gaactgactt ccatattcct catgcatgtc tcaaggacaa tggtgcatat cgctgtactg 660 gatataagga aagttgttgc cctgtttctt ccaatacagt caaaatccaa gtccaagagc 720 catttacacg tccagtgctg agagccagct ccttccagcc catcagcggg aacccagtga 780 ccctgacctg tgagacccag ctctctctag agaggtcaga tgtcccgctc cggttccgct 840 tcttcagaga tgaccagacc ctgggattag gctggagtct ctccccgaat ttccagatta 900 ctgccatgtg gagtaaagat tcagggttct actggtgtaa ggcagcaaca atgcctcaca 960 gcgtcatatc tgacagcccg agatcctgga tacaggtgca gatccctgca tctcatcctg 1020 tcctcactct cagccctgaa aaggctctga attttgaggg aaccaaggtg acacttcact 1080 gtgaaaccca ggaagattct ctgcgcactt tgtacaggtt ttatcatgag ggtgtccccc 1140 tgaggcacaa gtcagtccgc tgtgaaaggg gagcatccat cagcttctca ctgactacag 1200 agaattcagg gaactactac tgcacagctg acaatggcct tggcgccaag cccagtaagg 1260 ctgtgagcct ctcagtcact gttcccgtgt ctcatcctgt cctcaacctc agctctcctg 1320 aggacctgat ttttgaggga gccaaggtga cacttcactg tgaagcccag agaggttcac 1380 tccccatcct gtaccagttt catcatgagg atgctgccct ggagcgtagg tcggccaact 1440 ctgcaggagg agtggccatc agcttctctc tgactgcaga gcattcaggg aactactact 1500 gcacagctga caatggcttt ggcccccagc gcagtaaggc ggtgagcctc tccatcactg 1560 tccctgtgtc tcatcctgtc ctcaccctca gctctgctga ggccctgact tttgaaggag 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Val Ser Leu 450 455 460 Ser Ile Thr Val Pro Val Ser Arg Pro Val Leu Thr Leu Ser Ser Ala 465 470 475 480 Glu Ala Leu Thr Phe Glu Gly Ala Thr Val Thr Leu Tyr Cys Glu Val 485 490 495 Gln Arg Gly Ser Pro Arg Ile Leu Tyr Gln Phe Tyr His Glu Asp Val 500 505 510 Pro Leu Gly Ser Asn Ser Thr Pro Ser Val Gly Lys Val Ser Phe Ser 515 520 525 Phe Ser Leu Thr Ala Ala His Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp 530 535 540 Asn Gly Phe Gly Pro Gln Arg Ser Glu Ala Val Ser Leu Phe Val Thr 545 550 555 560 Val Pro Val Ser Arg Pro Ile Leu Thr Leu Arg Val Pro Arg Ala Gln 565 570 575 Ala Val Val Gly Asp Leu Leu Glu Leu Arg Cys Glu Ala Leu Arg Gly 580 585 590 Ser Pro Pro Ile Met Tyr Trp Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly 595 600 605 Ser Ser Ser Val Pro Ser Gly Gly Glu Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu 610 615 620 Thr Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu 625 630 635 640 Val Ala Gln His Ser Asp Thr Ile Ser Leu Ser Val Ile Val Pro Val 645 650 655 Ser Arg Pro Ile Leu Thr Phe Arg Ala Pro Arg Ala Gln Ala Val Val 660 665 670 Gly Asp Leu Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Ser Pro 675 680 685 Ile Leu Tyr Trp Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Lys Ile Ser 690 695 700 Ala Pro Ser Gly Gly Gly Ala Tyr Phe Asn Leu Ser Leu Thr Thr Glu 705 710 715 720 His Ser Gly Ile Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Leu Glu Ala Gln 725 730 735 Arg Ser Glu Met Val Thr Leu Lys Val Ala Val Pro Val Ser Arg Pro 740 745 750 Val Leu Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ala Gln Val Ala Val Gly Asp Leu 755 760 765 Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro Leu Ile Leu Tyr 770 775 780 Gln Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Asn Ser Ser Ala Leu Ser 785 790 795 800 Gly Gly Ala Phe Phe Asn Leu Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly Asn 805 810 815 Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Leu Gly Ala Gln Arg Ser Glu Thr 820 825 830 Val Thr Leu Tyr Leu Thr Gly Leu Thr Glu Asn Arg Ser Gly Pro Val 835 840 845 Ala Thr Gly Val Thr Gly Gly Leu Leu Ser Leu Ala Gly Leu Ala Ala 850 855 860 Val Ala Leu Leu Leu Tyr Cys Trp Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Glu 865 870 875 880 Pro Ala Ser Asp Pro Cys Arg Ser Pro Ser Asp Leu Asp Ser Gln Glu 885 890 895 Pro Thr Tyr His Asn Val Pro Ala Trp Glu Glu Leu Gln Pro Val Tyr 900 905 910 Ser Asn Val Asn Pro Arg Gly Glu Asn Val Val Tyr Ser Glu Val Arg 915 920 925 Ile Ile Arg Glu Lys Lys Lys His Ala Val Ala Ser Asn Pro Arg His 930 935 940 Leu Arg Asn Lys Gly Ser Cys Ile Ile Tyr Ser Glu Val Lys Val Ala 945 950 955 960 Ser Thr Pro Ala Ser Arg Cys Leu Phe Leu Ala Ser Ser Ala Pro His 965 970 975 Arg <210> 64 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 65 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (101)..(101) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> Any amino acid <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Xaa Gly Xaa Gly Gly Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (199)

  1. (a) (i) 서열 KASQDVSTAVA (서열 번호 26)를 포함하는 HVR-L1,
    (ii) 서열 SASYRYT (서열 번호 27)를 포함하는 HVR-L2,
    (iii) 서열 QQHFSSPRT (서열 번호 28)를 포함하는 HVR-L3,
    (iv) 서열 GFTFSSYAVS (서열 번호 35)를 포함하는 HVR-H1,
    (v) 서열 ATISSGGSLTFYLDSVR (서열 번호 36)를 포함하는 HVR-H2, 및
    (vi) 서열 PIPDYYALDY (서열 번호 37)를 포함하는 HVR-H3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 HVR 서열; 및
    (b) 서열 번호 26, 27, 28, 35, 36 또는 37에 도시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR을 포함하는 항-FcRH5 항체.
  2. 제1항에 있어서, 프레임워크 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 변형이 치환, 삽입 또는 결실인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 서열 번호 36의 서열을 갖는 HVR-H2를 포함하는 항체.
  5. 인간 FcRH5에 대한 항체의 일가의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 뮤린 항체의 일가의 친화도와 실질적으로 동일한 인간화 항-FcRH5 항체.
  6. 인간 FcRH5에 대한 항체의 일가의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 뮤린 또는 키메라 항체의 일가의 친화도 보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 더 큰 인간화 항-FcRH5 항체.
  7. 인간 FcRH5에 대한 항체의 일가의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 뮤린 또는 키메라 항체의 일가의 친화도 보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60배 더 낮은 인간화 항-FcRH5 항체.
  8. 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 이가 형태의 뮤린 항체의 친화도와 실질적으로 동일한 인간화 항-FcRH5 항체.
  9. 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 이가 형태의 뮤린 또는 키메라 항체의 친화도 보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 더 큰 인간화 항-FcRH5 항체.
  10. 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 도 9 (서열 번호 18) 및 도 10 (서열 번호 20)에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 이가 형태의 뮤린 또는 키메라 항체의 친화도 보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60배 더 낮은 인간화 항-FcRH5 항체.
  11. 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.4 nM인 인간화 항-FcRH5 항체.
  12. 제11항에 있어서, 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.4 nM +/- 0.04인 인간화 항-FcRH5 항체.
  13. 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.2 nM인 인간화 항-FcRH5 항체.
  14. 제13항에 있어서, 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.2 nM +/- 0.02인 인간화 항-FcRH5 항체.
  15. 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.5 nM인 인간화 항-FcRH5 항체.
  16. 제15항에 있어서, 인간 FcRH5에 대한 이가 형태의 항체의 친화도가 0.5 nM +/- 0.1인 인간화 항-FcRH5 항체.
  17. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 친화도가 Kd 값으로 표현되는 항체.
  18. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 친화도가 비아코아 (Biacore) 또는 방사면역분석법으로 측정되는 항체.
  19. 제1항에 있어서, 인간 κ 하위군 1 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  20. 제1항에 있어서, 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  21. 세포독성제에 접합되었을 때 종양 세포 성장을 억제하는 인간화 항-FcRH5 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체 및 키메라 항체가 둘다 일가 또는 이가인 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체 및 키메라 항체가 둘다 Fc 영역에 연결된 단일 Fab 영역을 포함하는 항체.
  24. 도 11에 도시된 HVR1-HC, HVR2-HC 및/또는 HVR3-HC 서열 (서열 번호 35 내지 37)을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  25. 제24항에 있어서, 가변 도메인이 도 11에 도시된 FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC 및/또는 FR4-HC 서열 (서열 번호 31 내지 34)을 포함하는 항체.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 도 11에 도시된 CH1 및/또는 Fc 서열 (서열 번호 38 및/또는 39)을 포함하는 항체.
  27. 도 11에 도시된 HVR1-LC, HVR2-LC 및/또는 HVR3-LC 서열 (서열 번호 26 내지 28)을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  28. 제27항에 있어서, 가변 도메인이 도 11에 도시된 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 및/또는 FR4-LC 서열 (서열 번호 22 내지 25)을 포함하는 항체.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 도 11에 도시된 CL1 서열 (서열 번호 29)을 포함하는 항체.
  30. 도 10에 도시된 서열 (서열 번호 21)을 포함하는 폴리펩티드.
  31. 도 9에 도시된 서열 (서열 번호 19)을 포함하는 폴리펩티드.
  32. (a) 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항의 중쇄 가변 도메인 및 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 항체.
  33. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항의 중쇄 가변 도메인 및 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  34. 제33항에 있어서, 일가이며 Fc 영역을 포함하는 항체.
  35. 제1항에 있어서, 서열 번호 19로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  36. 제1항에 있어서, 서열 번호 21로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  37. 제1항에 있어서, 서열 번호 31, 32, 33 및 34로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  38. 제1항에 있어서, 서열 번호 22, 23, 24 및 25로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  39. 제1항에 있어서, 서열 번호 31, 32, 33 및 34로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  40. 제1항에 있어서, 서열 번호 22, 23, 24 및 25로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  41. 제35항에 있어서, 서열 번호 21로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  42. 제36항에 있어서, 서열 번호 19로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  43. 서열 번호 21의 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, FcRH5에 결합하는 항체.
  44. 서열 번호 19의 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, FcRH5에 결합하는 항체.
  45. 서열 번호 21의 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 19의 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, FcRH5에 결합하는 항체.
  46. 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  47. 제46항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  48. 제47항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  49. 항-FcRH5 항체의 제조 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 진핵 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함하는 군으로부터 선택된 숙주 세포를 항-FcRH5 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및
    (b) 항체를 단리하는 단계.
  50. 서열 번호 21에 나타낸 아미노산 서열; 또는 이러한 아미노산 서열에 기초한 컨센서스 또는 변이체 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체에 대한 에피토프와 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  51. 제50항에 있어서, 서열 번호 19에 나타낸 아미노산 서열; 또는 이러한 아미노산 서열에 기초한 컨센서스 또는 변이체 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체에 대한 에피토프와 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  52. 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항에 있어서, FcRH5가 세포의 표면 상에 발현되는 항체.
  53. 제52항에 있어서, 세포가 B 세포인 항체.
  54. 제53항에 있어서, B 세포가 B 세포 증식성 장애와 관련되는 항체.
  55. 제54항에 있어서, B 세포 증식성 장애가 암인 항체.
  56. 제55항에 있어서, B 세포 증식성 장애가 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종으로부터 선택되는 항체.
  57. 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  58. 제57항에 있어서, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')2 단편으로부터 선택되는 항체 단편인 항체.
  59. 제57항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  60. 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 21의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 19의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  61. 세포독성제에 공유결합에 의해 부착된 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 면역접합체.
  62. 제61항에 있어서, 세포독성제가 독소, 화학요법제, 약물 모이어티, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로부터 선택되는 면역접합체.
  63. 제62항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 면역접합체.
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서,
    (a) Ab는 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체이고;
    (b) L은 링커이고;
    (c) D는 약물 모이어티이다.
  64. 제63항에 있어서, L이 6-말레이미도카프로일 (MC), 말레이미도프로파노일 (MP), 발린-시트룰린 (val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 (SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카르복실레이트 (SMCC), 4-(2-피리딜디티오)부티르산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (SPDB) 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 (SIAB)로부터 선택되는 면역접합체.
  65. 제63항에 있어서, D가 메이탄시노이드, 아우리스타틴 및 돌로스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역접합체.
  66. 제63항의 면역접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  67. FcRH5를 발현하는 세포를 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시켜 상기 세포의 성장 억제를 유발하는 단계를 포함하는, FcRH5를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합되는 방법.
  69. 제67항에 있어서, 항체가 성장 억제제에 접합되는 방법.
  70. 유효량의 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체를 암을 앓고 있는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 피험체를 치료하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 암이 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종으로부터 선택되는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합되는 방법.
  73. 제70항에 있어서, 항체가 성장 억제제에 접합되는 방법.
  74. 피험체에게 유효량의 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 증식성 장애를 치료하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 증식성 장애가 암인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 암이 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종으로부터 선택되는 방법.
  77. 제74항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합되는 방법.
  78. 제74항에 있어서, 항체가 성장 억제제에 접합되는 방법.
  79. 세포의 성장을 억제하는 방법에 있어서, 상기 세포의 성장이 적어도 부분적으로 FcRH5의 성장 강화 효과에 의존하고, 상기 방법은 세포를 유효량의 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합되는 방법.
  81. 제79항에 있어서, 항체가 성장 억제제에 접합되는 방법.
  82. 포유동물에서 종양을 치료학적으로 치료하는 방법에 있어서, 상기 종양의 성장이 적어도 부분적으로 FcRH5의 성장 강화 효과에 의존하고, 상기 방법은 세포를 유효량의 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 종양이 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종과 관련되는 방법.
  84. 제82항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합되는 방법.
  85. 제82항에 있어서, 항체가 성장 억제제에 접합되는 방법.
  86. 세포를 FcRH5에 대한 면역접합체의 결합에 허용적인 조건 하에 제64항의 면역접합체에 노출시키는 단계를 포함하는, B 세포 증식을 억제하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, B 세포 증식이 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종으로부터 선택되는 방법.
  88. 제86항에 있어서, B 세포가 이종이식편인 방법.
  89. 제86항에 있어서, 노출이 시험관내에서 수행되는 방법.
  90. 제86항에 있어서, 노출이 생체내에서 수행되는 방법.
  91. FcRH5를 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 제1항, 제33항, 제41항, 제164항, 제165항 중 어느 한 항의 항체에 노출시키는 단계 및 상기 샘플에서 FcRH5에 대한 상기 항체의 결합을 측정하는 단계를 포함하며, 샘플에서 FcRH5에 대한 항체의 결합이 상기 샘플에서 상기 단백질이 존재함을 나타내는, FcRH5를 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플에서 FcRH5의 존재를 측정하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 생물학적 샘플이 B 세포 증식성 장애를 앓고 있는 것으로 의심되는 환자로부터 유래되는 방법.
  93. 제92항에 있어서, B 세포 증식성 장애가 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종으로부터 선택되는 방법.
  94. FcRH5를 발현하는 세포를 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체를 FcRH5를 발현하는 세포에 결합시키는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합되는 방법.
  96. 제94항에 있어서, 항체가 성장 억제제에 접합되는 방법.
  97. 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산을 포함하는 시스테인 조작된 항체에 있어서, 상기 시스테인 조작된 항체는 모 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 유리 시스테인 아미노산으로 교체하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 상기 모 항체는 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체인 시스테인 조작된 항체.
  98. 제97항에 있어서, 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산의 티오 반응성 값이 0.6 내지 1.0 범위인 시스테인 조작된 항체.
  99. 제97항에 있어서, 티오-반응성 시약에 대하여 모 항체보다 더욱 반응성인 시스테인 조작된 항체.
  100. 제97항에 있어서, 상기 방법이 시스테인 조작된 항체를 티올-반응성 시약과 반응시킴으로써 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 티오-반응성 시약에 대하여 모 항체보다 더욱 반응성인 시스테인 조작된 항체.
  101. 제97항에 있어서, 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산 잔기가 경쇄 내에 위치되는 시스테인 조작된 항체.
  102. 제97항에 있어서, 세포독성제에 공유결합에 의해 부착된 시스테인 조작된 항체를 포함하는 면역접합체인 시스테인 조작된 항체.
  103. 제102항에 있어서, 세포독성제가 독소, 화학요법제, 약물 모이어티, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로부터 선택되는 시스테인 조작된 항체.
  104. 제97항에 있어서, 포획 표지, 검출 표지 또는 고체 지지체에 공유결합에 의해 부착된 시스테인 조작된 항체.
  105. 제104항에 있어서, 바이오틴 포획 표지에 공유결합에 의해 부착된 시스테인 조작된 항체.
  106. 제104항에 있어서, 형광 염료 검출 표지에 공유결합에 의해 부착된 시스테인 조작된 항체.
  107. 제106항에 있어서, 형광 염료가 플루오레세인 유형, 로다민 유형, 단실, 리사민, 시아닌, 피코에리트린, 텍사스 레드, 및 이들의 유사체로부터 선택되는 시스테인 조작된 항체.
  108. 제104항에 있어서, 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At 및 213Bi로부터 선택된 방사선 핵종 검출 표지에 공유결합에 의해 부착된 시스테인 조작된 항체.
  109. 제104항에 있어서, 킬레이팅 리간드에 의해 검출 표지에 공유결합에 의해 부착된 시스테인 조작된 항체.
  110. 제109항에 있어서, 킬레이팅 리간드가 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA로부터 선택되는 시스테인 조작된 항체.
  111. 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 결합 펩티드를 포함하는 항체.
  112. 제111항에 있어서, 알부민 결합 펩티드가 서열 번호 246 내지 250으로부터 선택되는 항체.
  113. 모 항체에서 카바트 넘버링 (Kabat numbering) 방식에 따른 경쇄의 하나 이상의 위치 및 카바트 넘버링 방식에 따른 중쇄의 하나 이상의 위치 및 EU 넘버링 방식에 따른 중쇄의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산을 포함하는 시스테인 조작된 항체에 있어서, 상기 모 항체는 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체인 시스테인 조작된 항체.
  114. 제113항에 있어서, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 항체.
  115. 제113항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  116. 제115항에 있어서, 항체 단편이 Fab 단편인 항체.
  117. 제113항에 있어서, 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 항체.
  118. 제113항에 있어서, 박테리아에서 생성되는 항체.
  119. 제113항에 있어서, CHO 세포에서 생성되는 항체.
  120. FcRH5 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제109항의 항체에 노출시키는 단계 및 상기 샘플에서 상기 FcRH5 단백질에 대한 상기 항체의 결합을 측정하는 단계를 포함하며, 단백질에 대한 항체의 결합이 상기 샘플 내에 상기 단백질이 존재함을 나타내는, FcRH5 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 FcRH5 단백질의 존재를 측정하는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 샘플이 FcRH5 단백질을 발현하는 것으로 의심되는 세포를 포함하는 방법.
  122. 제120항에 있어서, 세포가 B 세포인 방법.
  123. 제120항에 있어서, 항체가 형광 염료, 방사성 동위원소, 바이오틴, 및 금속-착물 형성 리간드로부터 선택되는 표지에 공유결합에 의해 부착되는 방법.
  124. 제113항의 항-FcRH5 항체 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 제제.
  125. 제113항에 있어서, 아우리스타틴 또는 메이탄시노이드 약물 모이어티에 공유결합에 의해 부착되어 항체 약물 접합체를 형성하는 항체.
  126. 제125항에 있어서, 항체 (Ab), 및 아우리스타틴 또는 메이탄시노이드 약물 모이어티 (D)를 포함하고, 시스테인 조작된 항체가 링커 모이어티 (L)에 의해 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산을 통해 D에 부착되며, 하기 화학식 I을 갖는 화합물인 항체-약물 접합체.
    [화학식 I]
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서, p는 1, 2, 3, 또는 4이다.
  127. 제126항에 있어서, p가 2인 항체-약물 접합체 화합물.
  128. 제126항에 있어서, L이 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물:
    -Aa-Ww-Yy-
    상기 식에서,
    A는 시스테인 조작된 항체 (Ab)의 시스테인 티올에 공유결합에 의해 부착된 스트레쳐 (Stretcher) 단위이고;
    a는 0 또는 1이고;
    각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위이고;
    w는 0 내지 12의 정수이고;
    Y는 약물 모이어티에 공유결합에 의해 부착된 스페이서 단위이고;
    y는 0, 1 또는 2이다.
  129. 제128항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00081

    상기 식에서,
    PAB는 파라-아미노벤질카르바모일이고,
    R17은 (CH2)r, C3-C8 카르보사이클릴, O-(CH2)r, 아릴렌, (CH2)r-아릴렌, -아릴렌-(CH2)r-, (CH2)r-(C3-C8 카르보사이클릴), (C3-C8 카르보사이클릴)-(CH2)r, C3-C8 헤테로사이클릴, (CH2)r-(C3-C8 헤테로사이클릴), -(C3-C8 헤테로사이클릴)-(CH2)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-, -(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2- 및 -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-로부터 선택된 이가 라디칼이고,
    Rb는 H, C1-C6 알킬, 페닐 또는 벤질이고,
    r은 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
  130. 제128항에 있어서, Ww가 발린-시트룰린인 항체-약물 접합체 화합물.
  131. 제128항에 있어서, R17이 (CH2)5 또는 (CH2)2인 항체-약물 접합체 화합물.
  132. 제128항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00082
  133. 제132항에 있어서, R17이 (CH2)5 또는 (CH2)2인 항체-약물 접합체 화합물.
  134. 제128항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00083
  135. 제126항에 있어서, L이 SMCC, SPP, SPDB 또는 BMPEO인 항체-약물 접합체 화합물.
  136. 제126항에 있어서, D가 하기 구조를 갖는 MMAE인 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00084

    여기서, 물결선은 링커 L에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  137. 제126항에 있어서, D가 하기 구조를 갖는 MMAF인 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00085

    여기서, 물결선은 링커 L에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  138. 제126항에 있어서, D가 하기 구조를 갖는 DM1 또는 DM4인 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00086

    여기서, 물결선은 링커 L에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  139. 제125항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및 항체 단편으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 화합물.
  140. 제125항에 있어서, 항체 단편이 Fab 단편인 항체-약물 접합체 화합물.
  141. 하기 구조로부터 선택되는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00087

    Figure pct00088

    여기서, Val은 발린이고, Cit는 시트룰린이고, p는 1, 2, 3 또는 4이고, Ab는 제113항의 항체이다.
  142. 제125항에 있어서, 아우리스타틴이 MMAE 또는 MMAF인 항체-약물 접합체.
  143. 제126항에 있어서, L이 MC-val-cit-PAB 또는 MC인 항체-약물 접합체.
  144. (a) 세포를 제125항의 항체-약물 접합체 화합물에 노출시키는 단계 및
    (b) 항체-약물 접합체 화합물의 상기 세포에 대한 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는, B 세포를 검출하기 위한 분석법.
  145. 세포 배양 배지 중 포유동물 암성 B 세포를 제125항의 항체-약물 접합체 화합물로 처리하여 암성 B 세포의 증식을 억제하는 단계를 포함하는, 세포 증식을 억제하는 방법.
  146. 제125항의 항체 약물 접합체, 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 제제.
  147. 제146항의 약제학적 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  148. 제147항에 있어서, 암이 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  149. 제147항에 있어서, 환자에게 항체-약물 접합체 화합물과 함께 세포독성제를 투여하는 방법.
  150. 제146항의 약제학적 제제,
    용기, 및
    화합물이 FcRH5 폴리펩티드의 과다발현으로 특징지어지는 암을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물 또는 표지를 포함하는 제품.
  151. 제150항에 있어서, 암이 림프종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 활동성 NHL, 재발형 활동성 NHL, 재발형 무통성 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통성 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소형 림프구성 림프종, 백혈병, 모발상 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 외투막 세포 림프종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제품.
  152. 제113항의 항-FcRH5 항체 (Ab), 및 아우리스타틴 또는 메이탄시노이드 약물 모이어티 (D)를 포함하고, 상기 항체가 링커 모이어티 (L)에 의해 하나 이상의 조작된 시스테인 아미노산을 통해 D에 부착되며, 하기 화학식 I을 갖는 화합물인 항체 약물 접합체 화합물의 제조 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    [화학식 I]
    Ab-(L-D)p
    여기서, p는 1, 2, 3 또는 4이다;

    (a) 제113항의 항-FcRH5 항체 (Ab)의 조작된 시스테인 기를 링커 시약과 반응시켜 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성하는 단계 및
    (b) Ab-L을 활성화된 약물 모이어티 (D)와 반응시켜 항체-약물 접합체를 형성하는 단계를 포함하거나, 또는
    (c) 약물 모이어티 (D)의 친핵성 기를 링커 시약과 반응시켜 약물-링커 중간체 D-L을 형성하는 단계 및
    (d) D-L을 상기 항체의 조작된 시스테인 기와 반응시켜 항체-약물 접합체를 형성하는 단계.
  153. 제152항에 있어서, CHO 세포 내에서 항체를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  154. 제152항에 있어서, 발현된 항체를 환원제로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  155. 제154항에 있어서, 환원제가 TCEP 및 DTT로부터 선택되는 방법.
  156. 제154항에 있어서, 발현된 항체를 환원제로 처리한 후 산화제로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  157. 제156항에 있어서, 산화제가 황산구리, 데하이드로아스코르브산 및 공기로부터 선택되는 방법.
  158. 제113항에 있어서, 서열 번호 42로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함하는 항체.
  159. 제113항에 있어서, 서열 번호 41의 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 서열 및 서열 번호 42의 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함하는 항체.
  160. 제113항에 있어서, 서열 번호 44로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함하는 항체.
  161. 제113항에 있어서, 서열 번호 43의 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 서열 및 서열 번호 44의 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함하는 항체.
  162. 제1항, 제33항, 제41항, 제164항 및 제165항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물.
  163. 제162항에 있어서, 담체를 포함하는 조성물.
  164. 서열 번호 20으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 18로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, FcRH5에 결합하는 항체.
  165. 서열 번호 13으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 11로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, FcRH5에 결합하는 항체.
  166. 제113항에 있어서, 시스테인이 경쇄의 위치 205에 존재하는 항체.
  167. 제113항에 있어서, 시스테인이 중쇄의 위치 114에 존재하는 항체.
  168. 제113항에 있어서, 시스테인이 중쇄의 위치 400에 존재하는 항체.
  169. 제53항에 있어서, B 세포가 혈장 세포 장애와 관련되는 항체.
  170. 제169항에 있어서, 혈장 세포 장애가 암인 항체.
  171. 제170항에 있어서, 혈장 세포 장애가 의미 미결정의 모노클로날 감마병증 (MGUS), 다발성 골수종 (MM), 고분자글로불린혈증, 중쇄 질환, 전신성 경쇄 아밀로이드증 (AL), 고립 형질세포종, 골수외성 형질세포종, 다발성 고립 형질세포종, 혈장 세포 백혈병, B-세포 비-호지킨 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병으로부터 선택되는 항체.
  172. 제67항에 있어서, 세포를 유효량의 또 다른 치료제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  173. 제70항에 있어서, 피험체에게 유효량의 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  174. 제74항에 있어서, 피험체에게 유효량의 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  175. 제79항에 있어서, 세포를 유효량의 또 다른 치료제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  176. 제82항에 있어서, 세포를 유효량의 또 다른 치료제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  177. 제86항에 있어서, 세포를 유효량의 또 다른 치료제에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  178. 제147항에 있어서, 환자에게 유효량의 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  179. 제172항에 있어서, 치료제가 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항-혈관형성제, 면역억제제, 프로드럭, 사이토킨, 사이토킨 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 및 성장-억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  180. 제179항에 있어서, 치료제가 벨케이드, 레블리미드, 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시마브, 플베스트란트, 비노렐빈, 에를로티니브, 베바시주마브, 빈크리스틴, 이마티니브, 소라페니브, 라파티니브, 트라스투주마브, 시스플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조미브, 레날리도미드, 멜팔린, 프레드니손, 덱사메타손, 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  181. 제173항에 있어서, 치료제가 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항-혈관형성제, 면역억제제, 프로드럭, 사이토킨, 사이토킨 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 및 성장-억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  182. 제181항에 있어서, 치료제가 벨케이드, 레블리미드, 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시마브, 플베스트란트, 비노렐빈, 에를로티니브, 베바시주마브, 빈크리스틴, 이마티니브, 소라페니브, 라파티니브, 트라스투주마브, 시스플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조미브, 레날리도미드, 멜팔린, 프레드니손, 덱사메타손, 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  183. 제174항에 있어서, 치료제가 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항-혈관형성제, 면역억제제, 프로드럭, 사이토킨, 사이토킨 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 및 성장-억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  184. 제183항에 있어서, 치료제가 벨케이드, 레블리미드, 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시마브, 플베스트란트, 비노렐빈, 에를로티니브, 베바시주마브, 빈크리스틴, 이마티니브, 소라페니브, 라파티니브, 트라스투주마브, 시스플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조미브, 레날리도미드, 멜팔린, 프레드니손, 덱사메타손, 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  185. 제175항에 있어서, 치료제가 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항-혈관형성제, 면역억제제, 프로드럭, 사이토킨, 사이토킨 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 및 성장-억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  186. 제185항에 있어서, 치료제가 벨케이드, 레블리미드, 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시마브, 플베스트란트, 비노렐빈, 에를로티니브, 베바시주마브, 빈크리스틴, 이마티니브, 소라페니브, 라파티니브, 트라스투주마브, 시스플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조미브, 레날리도미드, 멜팔린, 프레드니손, 덱사메타손, 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  187. 제176항에 있어서, 치료제가 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항-혈관형성제, 면역억제제, 프로드럭, 사이토킨, 사이토킨 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 및 성장-억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  188. 제187항에 있어서, 치료제가 벨케이드, 레블리미드, 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시마브, 플베스트란트, 비노렐빈, 에를로티니브, 베바시주마브, 빈크리스틴, 이마티니브, 소라페니브, 라파티니브, 트라스투주마브, 시스플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조미브, 레날리도미드, 멜팔린, 프레드니손, 덱사메타손, 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  189. 제177항에 있어서, 치료제가 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항-혈관형성제, 면역억제제, 프로드럭, 사이토킨, 사이토킨 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 및 성장-억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  190. 제189항에 있어서, 치료제가 벨케이드, 레블리미드, 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시마브, 플베스트란트, 비노렐빈, 에를로티니브, 베바시주마브, 빈크리스틴, 이마티니브, 소라페니브, 라파티니브, 트라스투주마브, 시스플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조미브, 레날리도미드, 멜팔린, 프레드니손, 덱사메타손, 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  191. 제178항에 있어서, 치료제가 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항-혈관형성제, 면역억제제, 프로드럭, 사이토킨, 사이토킨 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 및 성장-억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  192. 제191항에 있어서, 치료제가 벨케이드, 레블리미드, 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시마브, 플베스트란트, 비노렐빈, 에를로티니브, 베바시주마브, 빈크리스틴, 이마티니브, 소라페니브, 라파티니브, 트라스투주마브, 시스플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조미브, 레날리도미드, 멜팔린, 프레드니손, 덱사메타손, 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  193. 제33항에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
  194. 제193항에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 항체.
  195. 제194항에 있어서, 캐비티로의 돌출 (protuberance-into-cavity) 항체인 항체.
  196. 제195항에 있어서, 비당화된 항체.
  197. 제196항에 있어서, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 숙주 세포에서 생성되는 항체.
  198. 제196항에 있어서, 하나 이상의 Fc 이펙터 기능이 결여된 항체.
  199. 제198항에 있어서, ADCC 활성이 결여된 항체.
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