CN109883932B - 流式抗体及其制备方法和滴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种流式抗体及其制备方法和滴定方法，该流式抗体的制备方法包括如下步骤：采用反应缓冲液制备APC溶液；向APC溶液中加入ASE进行封闭反应，得第一中间体；向含第一中间体的反应缓冲液中加入SMCC进行活化反应，得第二中间体；将DTT与IgG或IgM进行还原反应，得还原IgG或还原IgM；将含还原IgG或还原IgM的反应缓冲液与含第二中间体的反应缓冲液混合，过夜反应，加入NEM，反应，即得。该流式抗体的制备方法操作简便，可重复使用，且制成的流式抗体染色指数显著提升，明显减少背景结合，显著提升目标细胞的荧光亮度。
Description
技术领域
本发明涉及一种流式抗体及其制备方法和滴定方法。
背景技术
抗体与蛋白偶联工艺，是通过对抗体或目的蛋白进行活化，使它们通过共价键偶联成一个具有生物靶向性的复合物。该偶联工艺在基于抗体的免疫学检测方法中发挥着重要作用，如流式抗体、免疫荧光抗体、免疫组化抗体、Western Blot的酶标二抗等等以及抗体偶联药物。借着抗体，尤其是单克隆抗体，功能蛋白被赋予特异性识别靶分子的能力，使得功能蛋白的实用性大大提高。
抗体与蛋白染料的偶联本质上是蛋白质与蛋白质之间的偶联。蛋白质分子中可用于偶联反应的活性基团通常有氨基、羧基和巯基。蛋白质分子之间的偶联通常通过一些活性化学小分子与两个蛋白分子的活性基团分别连接而实现。抗体重链之间通常含有丰富的、暴露在水溶液中的二硫链，容易被DTT、TECP、2-ME等试剂还原为巯基，因而常常被用作抗体修饰的活性靶点。这样，与抗体偶联的蛋白分子上只需引入与巯基反应的活性基团，如马来酰亚胺(NEM)等，即可实现蛋白分子与部分还原后的抗体之间的偶联。
蛋白质分子作为生物大分子通常含有多个活性反应基团。当蛋白分子之间偶联时，常常会发生蛋白分子之间交联，形成沉淀。对于流式抗体修饰而言，二硫键被还原后，会在一个抗体分子上至少形成两个巯基。与之偶联的蛋白染料，通常通过氨基修饰引入与巯基反应的活性基团，即也会在蛋白染料表面形成多个活化位点。当两者偶联之时，很容易形成多个分子交联的庞大分子，最终在流式抗体应用中表现为：细胞的荧光信号分布变宽，并且在阳性细胞群之外形成多个杂峰，严重扭曲目标蛋白表达水平的分布情况。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种能够改善目标蛋白表达水平的分布情况的流式抗体及其制备方法和滴定方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种流式抗体的制备方法，包括如下步骤：
采用反应缓冲液制备别藻青蛋白(APC)溶液；
向所述APC溶液中加入乙酰基琥珀酰亚胺酯(ASE)，于37±1℃条件下进行封闭反应，得第一中间体；
向含所述第一中间体的反应缓冲液中加入琥珀酰亚胺4-(N-马来亚酰胺甲基)-环己胺-1-羧酸(SMCC)，于37±1℃条件下进行活化反应，得第二中间体；
将二硫苏糖醇(DTT)与IgG或IgM于37±1℃条件下进行还原反应，得还原IgG或还原IgM；
将含还原IgG或或还原IgM的反应缓冲液与含所述第二中间体的反应缓冲液混合，于4℃条件下，过夜反应，得第三中间体；
向含所述第三中间体的反应缓冲液中加入NEM，于37±1℃条件下反应，即得。
在其中一个实施例中，所述IgG或所述IgM与所述APC的质量比例为19-21:22-25。
在其中一个实施例中，所述流式抗体的制备方法还包括剔除未反应的ASE、剔除未反应的SMCC、剔除未反应的DTT、剔除未反应的NEM的步骤。
在其中一个实施例中，剔除未反应的试剂的步骤为：将反应后的相应溶液稀释，转移至50kDa超滤管中，于11000-13000rpm转速下离心2-10min。
在其中一个实施例中，所述反应缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在其中一个实施例中，所述采用反应缓冲液制备APC溶液包括如下步骤：取APC的饱和硫酸铵溶液，离心，弃上清液，采用反应缓冲液溶解沉淀的APC，再次离心，将液体体积浓缩至第一预设浓度。
由上述任一项所述流式抗体的制备方法制备而成的流式抗体。
上述所述的流式抗体在流式细胞术中的应用。
一种流式抗体的滴定方法，采用流式细胞术对所述流式抗体进行滴定，包括如下步骤：
取上述所述的流式抗体置于EP管中，用反应缓冲液稀释至第二预设浓度；从第二预设浓度的流式抗体溶液中取出一半体积的流式抗体溶液移入新的EP管中，加入反应缓冲液，对流式抗体进行对半稀释；如此下去，依次对新的EP管中的流式抗体溶液进行对半稀释至第10管，得到呈浓度梯度的各流式抗体溶液，再向各管中加入小鼠脾脏细胞，于4℃条件下进行染色反应，再加入适量磷酸盐生理缓冲液，离心，弃上清液，重复一次；再用磷酸盐生理缓冲液垂悬沉淀的小鼠脾脏细胞，上机检测细胞APC通道荧光信号。
在其中一个实施例中，所述小鼠脾脏细胞的制备过程如下：获取小鼠脾脏，用磷酸盐生理缓冲液清洗干净后，置于200目筛网上，用注射器活塞研磨，得到小鼠脾脏细胞悬液；将所述小鼠脾脏细胞悬液离心，弃上清液，沉淀的细胞用红细胞裂解液重悬，室温静置后，加入磷酸盐生理缓冲液混匀；离心，弃去上清；加入磷酸盐生理缓冲液重悬细胞，弃上清液，向沉淀的细胞中加入磷酸盐生理缓冲液，对细胞计数后，调整细胞密度到2×107个/mL；细胞按照50μL/管分装，即每管含1×106个小鼠脾脏细胞。
本发明的有益效果是：
本发明的流式抗体预先采用ASE对APC进行封闭处理，再采用SMCC对封闭处理后的APC进行氨基活化，再将氨基活化的APC与部分还原的IgG或IgM进行偶联，偶联后再采用NEM对多余巯基封闭处理，得到荧光偶联抗体可作为流式抗体，染色指数显著提升，明显减少背景结合，显著提升目标细胞的荧光亮度。该流式抗体的制备方法操作简便，可重复使用，可降低生产成本。
附图说明
图1为采用0.2μg的实施例1制备流式抗体对小鼠脾脏细胞染色测试的流式直方图；
图2为实施例2的滴定用量测试图；
图3为直接采用0.2μg的常规抗小鼠CD4-APC抗体对小鼠脾脏细胞染色测试的流式直方图。
具体实施方式
以下对本发明进行举例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种流式抗体制备方法，包括如下步骤：
S1，制备浓度为1mg/mL的APC溶液：
取APC的60％饱和硫酸铵溶液(含APC 24μg)，于12000rpm转速下离心2min，弃上清液。采用500μL反应缓冲液溶解沉淀的APC，置于50kDa超滤管中，于12000rpm转速下离心3min，以剔除硫酸铵，并重复一次，将溶液体积浓缩至24μL，即浓度为1mg/mL的APC溶液。
其中，反应缓冲液优选为磷酸盐缓冲液。该磷酸盐缓冲液为：每升反应缓冲液含5.85g氯化钠、29g十二水合磷酸氢二钠、2.94g二水磷酸二氢钠和0.372g乙二胺四乙酸二钠。
S2，采用ASE封闭APC制备第一中间体：
向步骤S1所得的APC溶液中加入ASE，封闭APC，修饰相关的活性基团，于37℃条件下，反应1h后，用反应缓冲液稀释至500μL，转移至50kDa超滤管中，于12000rpm转速下离心3min，并重复两次，剔除多余未反应的ASE，将液体体积浓缩至24μL，得第一中间体溶液。
S3，采用SMCC活化第一中间体制备第二中间体：
向步骤S2所得的第一中间体溶液中加入SMCC，对第一中间体上的氨基进行激活，于37℃条件下，反应30min，用反应缓冲液稀释至500μL，转移至50kDa超滤管中，于12000rpm转速下离心3min，并重复两次，剔除多余未反应的SMCC，将体积浓缩至24μL，得第二中间体溶液。
S4，采用DTT还原IgG制备还原IgG：
取20μg IgG，加入DTT至终浓度为1-10mM，于37℃条件下，反应30min，用反应缓冲液稀释至500μL，转移至10kDa超滤管中，于12000rpm转速下离心8min，并重复两次，剔除多余未反应DTT，将液体体积浓缩至20μL，即还原IgG溶液。
S5，将第二中间体与还原IgG进行偶联反应制备第三中间体：
将步骤S3得到的第二中间体溶液和步骤S4得到的还原IgG溶液进行混合，4℃过夜反应，得第三中间体溶液。
S6，将第三中间体与NEM反应制备荧光流式抗体：
向步骤S5得到的第三中间体溶液中加入NEM，于37℃条件下，反应30min，用反应缓冲液稀释至500μL，转移至50kD超滤管中，于12000rpm转速下离心3min，剔除多余未反应NEM；重复两次，将液体体积浓缩至30μL，再加入70μL反应缓冲液，得荧光流式抗体溶液。将该荧光流式抗体溶液避光贮存于4℃条件下。
实施例2
本实施例提供一种流式抗体的滴定方法，包括如下步骤：
制备小鼠脾脏细胞样品：获取小鼠脾脏，用磷酸盐生理缓冲液清洗干净后，置于200目筛网上，用注射器活塞研磨，得到小鼠脾脏细胞悬液；300g×5min离心后弃去上清；细胞用3mL红细胞裂解液重悬，室温静置3min后，加入12mL磷酸盐生理缓冲液混匀；300g×5min离心，弃去上清；加入5mL磷酸盐生理缓冲液重悬细胞，弃去上清；加入1mL磷酸盐生理缓冲液，对细胞计数后，调整细胞密度到2×107个/mL；细胞按照50μL/管分装，即每管含1×106个小鼠脾脏细胞。
取2μL实施例1制备的荧光流式抗体溶液，置于0.5mL EP管(记为管1)中，用反应缓冲液稀释至10μL；取管1中的流式抗体溶液5μL，移入一只新0.5mL EP管(记为管2)中，加入5μL反应缓冲液，对流式抗体进行对半稀释；如此下去，对流式抗体进行对半稀释到第10管(记为管10)。再向各管中加入45μL磷酸盐生理缓冲液，再加入小鼠脾脏细胞，4℃反应30min；加入1mL磷酸盐生理缓冲液，300g×5min，弃去上清，重复一次；用200μL磷酸盐生理缓冲液垂悬细胞，上机检测细胞APC通道荧光信号。其中，所用的磷酸盐生理缓冲液为：每升含8.01g氯化钠、0.20g氯化钾、1.78g二水合磷酸氢二钠、0.27g磷酸二氢钾，pH 7.4。
本实施例采用流式细胞术对流式抗体进行滴定，确定流式最佳用量和分离指数，测试结果见图1和图2。由图2可以看出，在抗体量小至0.0004μg时，阴阳性细胞群依然清晰可辨。
对比例1
本对比例提供一种采用流式细胞术对小鼠脾脏细胞进行测试，测试过程与实施例2的测试过程基本相同，区别在于：采用的流式抗体为常规的抗小鼠CD4-APC抗体。测试结果见图3。
由图3可以看出，采用常规未封闭活性基团的抗小鼠CD4-APC抗体标记小鼠T细胞后，阴性细胞群信号升高，阳性细胞群峰型宽，并存在杂峰。
与对比例1相比，由图1和图3的对比可以看出，在相同的测试条件下，采用实施例1制备的流式抗体能够明显减少背景结合，改善目标蛋白表达水平的分布情况，显著提升目标细胞的荧光亮度。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种流式抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用反应缓冲液制备APC溶液；
向所述APC溶液中加入乙酰基琥珀酰亚胺酯，于37±1℃条件下进行封闭反应，得第一中间体；
向含所述第一中间体的反应缓冲液中加入SMCC，于37±1℃条件下进行活化反应，得第二中间体；
将DTT与IgG或IgM于37±1℃条件下进行还原反应，得还原IgG或还原IgM；
将含还原IgG或还原IgM的反应缓冲液与含所述第二中间体的反应缓冲液混合，于4℃条件下，过夜反应，得第三中间体；
向含所述第三中间体的反应缓冲液中加入NEM，于37±1℃条件下反应，即得。
2.根据权利要求1所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，所述IgG或IgM与所述APC的质量比例为19-21:22-25。
3.根据权利要求1或2所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，还包括剔除未反应的ASE、剔除未反应的SMCC、剔除未反应的DTT、剔除未反应的NEM的步骤。
4.根据权利要求3所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，剔除未反应的试剂的步骤为：将反应后的相应溶液稀释，转移至50kDa超滤管中，于11000-13000rpm转速下离心2-10min。
5.根据权利要求1或2所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，所述反应缓冲液为磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1或2所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，所述采用反应缓冲液制备APC溶液包括如下步骤：取APC的饱和硫酸铵溶液，离心，弃上清液，采用反应缓冲液溶解沉淀的APC，再次离心，将液体体积浓缩至第一预设浓度。
7.由权利要求1至6任一项的所述流式抗体的制备方法制备而成的流式抗体。
8.权利要求7所述的流式抗体在流式细胞术中的应用。
9.一种流式抗体的滴定方法，其特征在于，采用流式细胞术对所述流式抗体进行滴定，包括如下步骤：
取权利要求7所述的流式抗体置于EP管中，用反应缓冲液稀释至第二预设浓度；从第二预设浓度的流式抗体溶液中取出一半体积的流式抗体溶液移入新的EP管中，加入反应缓冲液，对流式抗体进行对半稀释；如此下去，依次对新的EP管中的流式抗体溶液进行对半稀释至第10管，得到呈浓度梯度的各流式抗体溶液，再向各管中加入小鼠脾脏细胞，于4℃条件下进行染色反应，再加入适量磷酸盐生理缓冲液，离心，弃上清液，重复一次；再用磷酸盐生理缓冲液垂悬沉淀的小鼠脾脏细胞，上机检测细胞APC通道荧光信号。
10.根据权利要求9所述的流式抗体的滴定方法，其特征在于，所述小鼠脾脏细胞的制备过程如下：
获取小鼠脾脏，用磷酸盐生理缓冲液清洗干净后，置于200目筛网上，用注射器活塞研磨，得到小鼠脾脏细胞悬液；
将所述小鼠脾脏细胞悬液离心，弃去上清，沉淀的细胞用红细胞裂解液重悬，室温静置后，加入磷酸盐生理缓冲液混匀；离心，弃上清液；加入磷酸盐生理缓冲液重悬细胞，弃上清液，向沉淀的细胞中加入磷酸盐生理缓冲液，对细胞计数后，调整细胞密度到2×107个/mL；细胞按照50μL/管分装，即每管含1×106个小鼠脾脏细胞。
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