CN104870637A - 组合物及使用方法 - Google Patents

Abstract

本组合物和方法涉及来自解半纤维素芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶、编码所述β-甘露聚糖酶的多核苷酸以及它们的制备和/或使用方法。含有所述β-甘露聚糖酶的制剂适用于水解木质纤维素生物质底物，尤其是那些包含明显的水平的半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的木质纤维素生物质底物。

Description

组合物及使用方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2012年12月7日提交的国际专利申请PCT/CN2012/086181的优先权，将该国际专利申请以引用的方式全文并入本文。

技术领域

本组合物和方法涉及源自解半纤维素芽孢杆菌(Bacillushemicellulosilyticus)的β-甘露聚糖酶、编码β-甘露聚糖酶的多核苷酸以及它们的生产和使用方法。含有重组β-甘露聚糖酶的制剂具有广泛的用途，例如用于水解某些软木类型的木质纤维素材料和/或包含半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的木质纤维素生物质底物。

背景技术

纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可被多种产生能够将聚合物底物水解成单体糖类的胞外酶的微生物(例如，细菌、酵母和真菌)降解和用作能源(Aro等人，(2001)，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)，276：24309-24314)。因为非可再生资源方法的局限性，纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的(Krishna等人，(2001)，Bioresource Tech.(《生物资源技术》)，77：193-196)。通过生物过程有效利用纤维素是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径(Ohmiya等人，(1997)，Biotechnol.Gen.Engineer Rev.(《生物技术和遗传工程评论》)，14：365-414)。

木质纤维素生物质材料的酶促水解大多集中于纤维素酶，其为水解纤维素(包含β-1，4-葡聚糖或βD-葡糖苷键)而导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。传统上将纤维素酶分为三大类：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶([β]-D-葡糖苷葡糖水解酶；EC 3.2.1.21)(“BG”)(Knowles等人，(1987)，TIBTECH，5：255-261；以及Schulein，(1988)，MethodsEnzymol.(《酶学方法》)，160：234-243)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen和Penttila，1995年，Mycota(《菌界》)，303-319)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在是结晶纤维素有效溶解所必需的(Suurnakki等人，(2000)，Cellulose(《纤维素》)，7：189-209)。β-葡糖苷酶起到从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡糖苷释放D-葡萄糖单元的作用(Freer，(1993)，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)，268：9337-9342)。

但是，为了从木质纤维素生物质材料获得有用的可发酵糖，木质素通常将首先需要例如通过各种预处理方法进行透化，并且使半纤维素破坏以便纤维素酶接触到纤维素。半纤维素具有复杂的化学结构，它们的主链由甘露聚糖、木聚糖和半乳聚糖组成。甘露聚糖类型的多糖存在于多种植物和植物组织中，例如存在于植物的种子、根、鳞茎和块茎中。这类糖可包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖，并且它们通常含有直链β-1，4-连接的甘露糖单元和/或半乳糖单元构成的直链和散布链(interspersed chain)。大多数类型的甘露聚糖不溶于水中，从而形成某些植物组织(如棕榈仁和象牙椰子)的硬度特性。另一方面，半乳甘露聚糖往往可溶于水中，并且存在于豆科植物的种子胚乳中且据信有助于保持这些种子中的水。

复杂的木质纤维素结构和相当顽拗的植物细胞壁的酶促水解涉及许多不同的内切酶和外切酶(例如纤维素酶和半纤维素酶)的协同和/或相续的作用。β-木聚糖酶和β-甘露聚糖酶是内切酶，而β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶是外切酶。为破坏半纤维素，可将木聚糖酶与其他辅助蛋白(其非限制性例子包括L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡萄糖醛酸酶和β-木糖苷酶)一起应用。

内切-1，4-β-D-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链中的β-1，4-甘露糖苷键的随机水解，释放出短链和长链寡甘露糖苷。短链寡甘露糖苷可包括甘露二糖和甘露三糖，不过有时候也可包括一些甘露糖。这些短链寡甘露糖苷可被β-甘露糖苷酶(E.C.3.2.1.25)进一步水解。另外，杂多糖的侧链糖可例如通过α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶和/或通过乙酰甘露聚糖酯酶进一步水解至完全。Puls J.，(1997)，Macromol.Symp.(《大分子评论集》)120：183-196。

已从细菌、真菌、植物和动物分离了β-甘露聚糖酶。参见Araujo A.等人，(1990)，J. App.Bacteriol.(《应用细菌学杂志》)68：253-261；Dutta S.等人，(1997)，Plant Physiol.(《植物生理学》)113：155-161；Puchar V.等人，(2004)Biochim.Biophys.Acta(《生物化学与生物物理学学报》)1674：239-250。还已克隆了来自多种生物体的编码这些酶的基因并进行了测序，基于它们的序列，它们中许多(如果不是全部的话)也已被归类为糖基水解酶(GH)家族5或者26的成员。参见例如Bewley D.J.，(1997)，Planta(《植物》)203：454-459；Halstead J.R.等人，(2000)，FEMS Microl.Lett.(《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》)192：197-203；Xu B.等人，(2002)，Eur.J. Biochem.(《欧洲生物化学杂志》)269：1753-1760；Henrissat，B.，(1991)，Biochem.J.(《生物化学杂志》)280：309-316。尽管大多数β-甘露聚糖酶由其来源生物分泌，但有一些已知与细胞结合。从一给定的生物体，可能有不止一种源自不同的基因或者相同基因的不同产物、具有不同的等电点的甘露聚糖酶，这个事实据信是这些酶的重要性的指示。

β-甘露聚糖酶已在商业应用中使用，例如在诸如纸张和纸浆行业、食品和饲料行业、医药行业和能源行业之类的行业中使用。Lee J.T.等人，(2003)，Poult.Sci.(《禽类科学》)82：1925-1931；McCutchen M.C.等人，(1996)，Biotechnol.Bioeng.(《生物技术与生物工程》)52：332-339；Suurnakki A.等人，(1997)，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.(《生物化学工程与生物技术进展》)，57：261-287。但是，取决于甘露聚糖酶的来源微生物，不同的β-甘露聚糖酶可具有不同的性质和活性谱(activity profile)，这些不同的性质和活性谱可能使它们更适合于一种或多种工业应用而不适合于其他工业应用。木质纤维素生物质底物(尤其是来自植物来源的那些木质纤维素生物质底物)的水解众所周知是困难的，因此，已被发现可用于其他工业应用的甘露聚糖酶中很少(如果有的话)已被用来水解木质纤维素材料。

因此，对于鉴定这样的甘露聚糖酶和/或包含这种酶的组合物存在着需求，所述甘露聚糖酶和/或组合物与市售的、新鉴定的或者工程改造的纤维素酶和其他半纤维素酶联合，可有效地并能够将多种基于植物的和/或其他的纤维素或者半纤维素材料转化成可发酵糖，同时具有足够的或者改善的效力、改善的可发酵糖产率和/或改善的作用于多种多样的纤维素原料的能力。使用工程改造的微生物产生新的甘露聚糖酶也是重要的和合乎期望的，因为这些是可能高成本效益地制备酶的手段。

发明内容

本组合物和方法的一个方面是应用或者使用从解半纤维素芽孢杆菌(Bacillus hemicellulosilyticus)菌株这个细菌物种分离的高活性β-甘露聚糖酶来水解木质纤维素生物质底物。本文描述的SEQ ID NO：2序列最初作为对芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株N16-5的测序的结果而得到描述，并且它被指明为β-甘露聚糖酶前体。参见例如Ma Y.等人，(2004)，Extremophiles(《嗜极菌》)8(6)：447-454。到目前为止，这个酶及其任何近同源物都没有被用于水解或者帮助水解木质纤维素生物质材料。包含这种多肽或其变体的组合物未曾被制备。此外，包含这种多肽或其变体加上一种或多种纤维素酶、一种或多种半纤维素或者一种或多种纤维素酶和一种或多种半纤维素的组合的组合物已被制备或者用于与纤维素生物质水解和转化为可溶性可发酵糖相关的工业应用中。

因此本发明的一个方面是这样的发现，即与SEQ ID NO：2或者与成熟序列SEQ ID NO：3(其为SEQ ID NO：2的残基33-493)具有至少70％(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者更高)同一性、优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％同一性的重组Bhe Man2多肽具有β-甘露聚糖酶活性。本发明的另一个方面是这样的发现，即当将与SEQ IDNO：2或者与成熟序列SEQ ID NO：3具有至少70％(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者更高)同一性的重组多肽与一种或多种纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素酶组合时，该重组多肽赋予该组合物或混合物改善的水解木质纤维素生物质底物的能力。这种改善包括例如选自以下的性质中的一者或多者：葡聚糖转化提高、从给定的生物质底物得到葡萄糖的产率提高、木聚糖转化提高、木糖产率提高、从给定的生物质底物得到总可溶性糖的产率提高、在某一固形物水平下的给定生物质底物的液化更加快速以及在某一固形物水平下的生物质底物的粘度降低更加快速。改善还可包括这样的出乎意料的发现，即这种多肽当与任选还包含一种或多种其他半纤维素酶的纤维素酶混合物或者组合物进行组合时，可用于增强纤维素生物质的转化和水解。所得的包含Bhe Man2多肽的混合物与具有相同浓度/比例/量的所有其他酶但不具有Bhe Man2的对等混合物相比，具有改善的水解性能。在一些实施例中，Bhe Man2多肽可替代例如高达约20重量％(例如高达约20重量％、高达约18重量％、高达约16重量％、高达约14重量％、高达约12重量％、高达约10重量％、高达约8重量％、高达约5重量％等)的纤维素酶混合物或者组合物，并且该替代的组合物当用于水解给定的木质纤维素生物质底物时将保持其能力和水解性能，或者甚至与未被替代的但具有相同酶组成和相同总蛋白的对等纤维素混合物或者组合物相比具有改善的水解(例如较高的葡聚糖和/或木聚糖转化率、较高的总糖产量、较快的液化和/或改善的粘度降低)。

本组合物和方法的一个方面涉及源自解半纤维素芽孢杆菌的糖基水解酶家族5的β-甘露聚糖酶多肽或其具有β-甘露聚糖酶活性的合适变体(在本文中称为“Bhe Man2”或者“Bhe Man2多肽”)、编码所述酶的核酸、包含所述酶的组合物以及制备所述β-甘露聚糖酶多肽及包含其的组合物并将它们应用于水解或者转化木质纤维素生物质为可溶性可发酵糖的方法。特别合适的木质纤维素生物质材料是那些含有半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的木质纤维素生物质材料然后可将此类可发酵糖转化成纤维素乙醇、燃料以及其他生物化学物质和可用产物。在某些实施例中，β-甘露聚糖酶多肽当与包含至少一种纤维素酶或至少一种其他半纤维素酶的酶混合物或者与包含至少一种纤维素酶和至少一种其他半纤维素酶的酶混合物进行组合时，所得到的酶混合物与例如来自各种微生物的、具有类似的最佳pH和/或类似的最佳温度的其他β-甘露聚糖酶相比，能够具有提高的或者增强的水解木质纤维素生物质材料的能力。

这种提高的或者增强的水解木质纤维素生物质材料的能力例如反映在以下方面：不仅由经某种方式预处理的给定木质纤维素生物质底物的酶促水解所产生的总可溶性糖的产量极大地提高，而且出乎意料的是葡萄糖的产量也提高(反映较高的葡聚糖转化率)和/或木聚糖的产量也提高(反映较高的木聚糖转化率)。

该提高的或者增强的水解木质纤维素生物质材料的能力，也可反映在这种酶组合物改善或者加速经预处理的生物质材料的液化和/或降低其粘度的合乎期望的能力。如果使用高固形物水平的生物质材料作为底物的话，这种粘度/液化有益效果是最显著的。当使用该酶组合物/混合物来分解或者水解往往具有高度纤维性和顽拗性(recalcitrant)(这种性质导致特别粘稠的原料)的木材生物质时，这种粘度/液化有益效果也是巨大和重要的。

该提高的或者增强的水解木质纤维素生物质的能力，容许用Bhe Man2多肽替代高达约20重量％(例如高达约20重量％、高达约18重量％、高达约16重量％、高达约14重量％、高达约12重量％、高达约10重量％、高达约8重量％、高达约5重量％等)的任何给定的任选包含一种或多者其他半纤维素酶的纤维素酶组合物，从而减少用来水解给定底物的纤维素酶及其中的酶的量而又不牺牲性能。实际上，使用该替代的组合物，水解性能可能甚至得到改善。减少水解或者糖化木质纤维素生物质所需的纤维素酶组合物的量及其中的酶的量，可以极大地节约产生纤维素糖的成本，该纤维素糖然后可制备成乙醇或者其他下游有价值的生物化学品和有用产物。

本组合物和方法的各方面涉及源自解半纤维素芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶或其合适的变体(在本文中称为“Bhe Man2”或者“Bhe Man2多肽”)、编码所述酶的核酸以及产生所述β-甘露聚糖酶并将其用于各种工业上有用的应用例如用于水解或者转化木质纤维素生物质为可溶性可发酵糖的方法。然后可将此类可发酵糖转化成纤维素乙醇、燃料以及其他生物化学品和有用产物。如本文所证明的，Bhe Man2多肽及包含Bhe Man2多肽的组合物当与至少一种纤维素酶和/或至少一种其他半纤维素酶组合时，与来自类似微生物的具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他β-甘露聚糖酶相比，具有改善的水解木质纤维素生物质底物，尤其是那些含有至少一定的明显水平的半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的木质纤维素生物质底物的性能。该改善的性能可以是，Bhe Man2多肽和/或包含BheMan2多肽的酶组合物当与具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他微生物β-甘露聚糖酶相比时，当用来在适合酶促水解的条件下水解木质纤维素生物质底物水时，所产生的总可溶性糖的量提高。出乎意料的是，该Bhe Man2多肽和/或包含这种多肽的组合物与那些具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他微生物β-甘露聚糖酶相比，也具有改善的葡聚糖转化率和/或改善的木聚糖转化率。作为另一种选择或者除此之外，该改善的性能可以是，BheMan2多肽和/或包含Bhe Man2多肽的酶组合物赋予生物质底物快速的粘度降低/液化，使得总体水解不仅在有效性方面而且在效率方面得到改善。

在一些实施例中，将Bhe Man2多肽在酶组合物中与一种或多种纤维素酶一起或者在所述纤维素酶存在下应用，以水解或者分解合适的生物质底物。该一种或多种纤维素酶可以是例如一种或多种β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和/或内切葡聚糖酶。例如，该酶组合物可包含Bhe Man2多肽、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在一些实施例中，所述纤维素酶中的至少一者异源于该Bhe Man2，因为所述纤维素酶中的至少一者不源自解半纤维素芽孢杆菌。在一些实施例中，所述纤维素酶中的至少两种彼此异源。

在一些实施例中，将Bhe Man2多肽在酶组合物中与一种或多种其他半纤维素酶一起或者在所述半纤维素酶存在下应用。该一种或多种其他半纤维素酶可以是例如其他甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和/或L-阿拉伯呋喃糖苷酶。在一些实施例中，所述其他半纤维素酶中的至少一者异源于Bhe Man2，因为所述其他半纤维素酶中的至少一者(其可选自一种或多种其他甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和/或L-阿拉伯呋喃糖苷酶)不源自解半纤维素芽孢杆菌。在某些实施例中，所述其他半纤维素酶中的至少两者彼此异源。

在另外的实施例中，将该Bhe Man2多肽在酶组合物中与一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶一起或者在所述纤维素酶和其他半纤维素酶存在下应用。例如，该酶组合物包含Bhe Man2多肽、无或一种或两种其他甘露聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种β-葡糖苷酶、无或一种或多种木聚糖酶、无或一种或多种β-木糖苷酶以及无或一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

在一些实施例中，使用Bhe Man2多肽来替代高达约20重量％(以组合物中的蛋白质的总重量计)(例如高达约20重量％、高达约18重量％、高达约16重量％、高达约14重量％、高达约12重量％、高达约10重量％、高达约8重量％、高达约5重量％等)的包含一种或多种纤维素酶、任选还包含一种或多种其他非Bhe Man2半纤维素酶的酶组合物。在一些实施例中，与在组合物中没有Bhe Man2存在但具有所有其他纤维素酶和/或半纤维素酶以及具有相同蛋白质总重量的对等未替代的酶组合物相比，该如此替代的酶组合物具有类似的或者改善的糖化性能。在一些实施例中，与在组合物中没有Bhe Man2但具有所有其他纤维素酶和/或半纤维素酶以及包含相同蛋白质总重量的未替代的对等酶组合物相比，该替代的酶组合物可从相同的木质纤维素生物质底物产生相同量的葡萄糖和/或木糖，或者产生的葡萄糖和/或木糖的量高出约5％，或者产生的葡萄糖和/或木糖的量高出约7％，或者产生的葡萄糖和/或木糖的量高出约10％，或者产生的葡萄糖和/或木糖的量甚至还更高。在一些实施例中，当与在组合物中不包含Bhe Man2但包含所有其他纤维素酶和/或半纤维素酶以及包含相同蛋白质总重量的未替代的对等酶组合物相比时，该替代的酶组合物当用来水解给定固形物水平下的给定木质纤维素生物质底物时，减少该生物质底物的粘度达相同的程度或者更大的程度。

在某些实施例中，将Bhe Man2多肽或者包含Bhe Man2多肽的组合物在产乙醇微生物存在下施加到木质纤维素生物质底物或者部分水解的木质纤维素生物质底物，该产乙醇微生物能够代谢由木质纤维素生物质底物的酶促水解产生的可溶性可发酵糖并将这类糖转化成乙醇、生物化学品或者其他有用材料。该过程可为严格的顺序过程，其中水解步骤在发酵步骤之前进行。备选地，该过程可为混合过程，其中水解步骤首先开始，但在一段时间内与稍后开始的发酵步骤重叠。该过程可在另外一种备选形式中为同步水解和发酵过程，其中生物质底物的酶促水解在由酶促水解产生的糖被产乙醇生物发酵的同时进行。

Bhe Man2多肽例如可以是这样的酶组合物的一部分，该酶组合物是能够在合适的条件下表达或者过量表达这种多肽的工程改造的微生物的全发酵液产物(whole broth product)。在某些实施例中，Bhe Man2多肽可以经遗传工程改造成在细菌宿主细胞中表达，例如在埃希杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或者链霉菌属(Streptomyces)中表达。在某些实施例中，Bhe Man2多肽可以经遗传工程改造成在真菌宿主细胞中表达，例如在真菌亚门(Eumycotina)的丝状形式中的任何一者的宿主细胞中表达。因此，合适的丝状真菌宿主细胞可包括但不限于以下各属的细胞：支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysoporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、棒囊壳属(Corynascus)、毛壳菌属(Chaertomium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filobasidium属、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛霉属、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)属、侧耳属(Pleurotus)、柱顶孢属(Scytaldium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、孢子丝菌属(Sporotrichum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳菌属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。

经工程改造的表达或者过量表达Bhe Man2多肽的微生物还可表达和/或分泌一种或多种纤维素酶及任选还有一种或多种其他半纤维素酶中的一者或多者或全部。该一种或多种纤维素酶可选自例如一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种β-葡糖苷酶和/或一种或多种纤维二糖水解酶。该一种或多种其他半纤维素酶可选自例如一种或多种其他β-甘露聚糖酶、一种或多种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、一种或多种木聚糖酶和/或一种或多种β-木糖苷酶。所得的包含Bhe Man2多肽的酶混合物对于本申请的目的而言是“共表达的酶混合物”。

在另一个实施例中，经工程改造的表达或者过量表达Bhe Man2多肽的微生物可以是与表达所述纤维素酶的一者或多者和/或所述其他半纤维素酶的一者或多者的一种或多种其他微生物不同的微生物。该一种或多种纤维素酶可选自例如一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种β-葡糖苷酶和/或一种或多种纤维二糖水解酶。该一种或多种其他半纤维素酶可选自例如一种或多种其他β-甘露聚糖酶、一种或多种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、一种或多种木聚糖酶和/或一种或多种β-木糖苷酶。因此，Bhe Man2多肽可与一种或多种纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素酶进行组合以形成酶混合物/组合物，其为Bhe Man2多肽和其他多肽的“物理混合物”或者“掺混物”。在该共表达的酶混合物可观察到或者可实现的该改善的能力也在包含BheMan2多肽的该掺混物可观察到或者可实现。

如本文所证明的，Bhe Man2多肽和包含Bhe Man2多肽的组合物在发生木质纤维素生物质的糖化和降解的条件下具有改善的效力。当将包含Bhe Man2多肽的酶组合物水解给定的生物质底物的性能，与包含某些其他具有类似最佳pH和/或最佳温度的微生物β-甘露聚糖酶的、在其他方面相当的酶组合物的该性能进行比较时，该包含Bhe Man2多肽的酶组合物的改善的效力得到证实。在某些实施例中，本文的组合物和方法的Bhe Man2多肽，与来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3的包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的ScoMan1多肽或者来自热速芽孢杆菌(Bacillus caldovelox)的包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的Bsp Man1多肽或者来自小单孢菌(Micromonospora sp.)L5的包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的Msp Man2多肽相比，水解任选经过预处理的给定木质纤维素生物质底物的能力提高至少约5％(例如，至少约5％、至少约7％、至少约10％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％或者更多)。该水解给定生物质底物的性能可使用在给定的一组糖化条件下从给定的木质纤维素生物质产生的总可溶性糖的量进行测量。该水解给定生物质底物的性能也可使用在某一糖化条件下从给定木质纤维素生物质底物产生的葡萄糖的量或者从该生物质底物转化的葡聚糖转化百分数进行测量。例如，葡聚糖转化百分数可使用实例9(本文)中描述的方法进行评估。由此，本文的组合物和方法的Bhe Man2多肽当以某个量包含在给定的酶组合物中时(当它是酶组合物的一部分时)，与包含相同量的ScoMan1或者相同量的Bsp Man1或者相同量的Msp Man2而在其他方面相同的酶组合物在相同的水解条件下相比，赋予葡聚糖转化百分数至少5％的提高(例如，5％的提高、7％的提高、10％的提高、11％的提高、12％的提高、13％的提高、14％的提高、15％的提高或者更高百分比的提高)。作为另一种选择或者除此之外，水解给定生物质底物的性能可使用在某一糖化条件下从给定木质纤维素生物质底物产生的木糖的量或者从该底物转化的木聚糖转化百分数进行测量。例如，木聚糖转化百分数可使用实例9(本文)中描述的方法进行评估。由此，本文的组合物和方法的Bhe Man2多肽当以某个量包含在给定的酶组合物中时(当它是酶组合物的一部分时)，与包含相同量的ScoMan1或者相同量的Bsp Man1或者相同量的Msp Man2而在其他方面相同的酶组合物在相同的水解条件下相比，赋予木聚糖转化百分数至少5％的提高(例如，5％的提高、7％的提高、10％的提高、11％的提高、12％的提高、13％的提高、14％的提高、15％的提高或者更高百分比的提高)。

此外，水解给定生物质底物的性能可通过该生物质底物的液化或粘度降低的幅度或程度或者具有特定固形物水平的给定底物的这种液化或粘度降低的速度进行测量。该粘度降低和/或液化及其速率可使用实例10(本文)中描述的方法进行评估。由此，本文的组合物和方法的Bhe Man2多肽当以某个量包含在给定的酶组合物中时，与包含相同量的ScoMan1或者相同量的Bsp Man1或者相同量的Msp Man2而在其他方面相同的酶组合物在相同的水解条件下和在水解反应进行相同的时间段后相比时，赋予粘度降低或者液化水平至少5％的提高。

本组合物和方法的各方面包括包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的重组多肽，其中该多肽具有β-甘露聚糖酶活性。在一些方面，Bhe Man2多肽和/或应用于酶组合物中或者水解木质纤维素生物质底物的方法中的Bhe Man2多肽为(a)源自、可获自或者产生自解半纤维素芽孢杆菌(例如，芽孢杆菌菌株N16-5；(b)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％(例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的重组多肽；(c)包含与SEQ ID NO：2的催化结构域即氨基酸残基33至493具有至少70％(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的重组多肽；(d)包含与成熟形式SEQ ID NO：3的氨基酸序列即SEQID NO：2的氨基酸残基33至493具有至少70％(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的重组多肽；或者(e)(a)、(b)、(c)或(d)的具有β-甘露聚糖酶活性的片段。在某些实施例中，提供具有β-甘露聚糖酶活性的变体多肽，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的一个或多个氨基酸残基的置换、缺失和/或插入。在某些实施例中，该多肽包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，该多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，该多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，该多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。

在某些实施例中，Bhe Man2多肽具有在约pH 8.0至9.0之间的最佳pH。在一些实施例中，Bhe Man2多肽在pH 6.0和pH 9.0之间保留最大β-甘露聚糖酶活性的70％以上。

在某些实施例中，Bhe Man2多肽的最佳温度为约64℃。在一些实施例中，Bhe Man2多肽在50℃至74℃之间的温度下保留其最大β-甘露聚糖酶活性的80％以上。

在一些实施例中，Bhe Man2多肽具有良好的热稳定性。例如，BheMan2多肽当在约75℃的温度温育约2小时时保留β-甘露聚糖酶活性的约50％。在某些实施例中，该多肽当在低于55℃的温度温育约2小时时保留β-甘露聚糖酶活性的至少95％。

本组合物和方法的各方面包括包含本文所描述的重组Bhe Man2多肽及一种或多种纤维素酶的组合物。在一些实施例中，该一种或多种纤维素酶可选自一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶和/或一种或多种β-葡糖苷酶。

本组合物和方法的各方面包括包含本文所描述的重组Bhe Man2多肽及一种或多种半纤维素酶的组合物。在一些实施例中，该一种或多种其他半纤维素酶可选自一种或多种木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和一种或多种其他甘露聚糖酶。

本组合物和方法的各方面包括包含本文所描述的重组Bhe Man2多肽及一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶的组合物。例如，该一种或多种纤维素酶可选自内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶，并且该一种或多种其他半纤维素酶可包括木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和其他甘露聚糖酶。

如本文所证明的，本文所描述的Bhe Man2多肽可赋予除了包含一种或多种纤维素酶以外还包含Bhe Man2多肽的酶混合物或组合物改善的水解、糖化或者降解给定木质纤维素生物质底物的能力，该底物任选已经经过预处理并且还任选其含木聚糖的组分中的至少一些已从含葡聚糖的组分移除或者分离。这种改善的水解、糖化或者降解给定木质纤维素生物质底物的能力可由以下事实得到证明：使用包含至少一种纤维素酶和Bhe Man2多肽的给定酶组合物，其中Bhe Man2多肽的量高达该酶组合物的约20重量％(例如，高达约2重量％、高达约5重量％、高达约7重量％、高达约10重量％、高达约12重量％、高达约15重量％、高达约16重量％、高达约17重量％、高达约18重量％、高达约19重量％、高达约20重量％)，来水解特定木质纤维素生物质底物，相比于包含相同比例的所有相同的其他酶但不包含Bhe Man2多肽的对等酶组合物，所实现的葡聚糖转化百分数明显更高。

作为另一种选择或者除此之外，本文所描述的Bhe Man2多肽可赋予除了包含一种或多种其他半纤维素酶以外还包含Bhe Man2多肽的酶混合物或组合物改善的水解、糖化或者降解给定含木聚糖的木质纤维素生物质底物的能力，该底物任选已经经过预处理并且还任选其含木聚糖的组分中的至少一些已从含葡聚糖的组分移除或者分离。这种改善的水解、糖化或者降解给定木质纤维素生物质底物的能力可由以下事实得到证明：使用包含至少一种其他半纤维素酶和Bhe Man2多肽的给定酶组合物，其中Bhe Man2多肽的量高达该酶组合物的约20重量％(例如，高达约2重量％、高达约5重量％、高达约7重量％、高达约10重量％、高达约12重量％、高达约15重量％、高达约16重量％、高达约17重量％、高达约18重量％、高达约19重量％、高达约20重量％)，来水解含木聚糖的木质纤维素生物质底物或者源自该底物的含木聚糖的组分，相比于包含相同比例的所有相同的其他酶但不包含Bhe Man2多肽的对等酶组合物，所实现的木聚糖转化百分数明显更高。

本组合物和方法的各方面包括包含本文所详述的重组Bhe Man2多肽和木质纤维素生物质的组合物。合适的木质纤维素生物质可例如来源于农作物、食物或饲料生产的副产物、木质纤维素废品、植物残体(包括例如草渣)或废纸或纸制废品。某些特别合适的生物质可以是包含至少明显水平的半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的生物质。合适地，该生物质可优选为富含半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或富含葡甘露聚糖(GM)的生物质，例如包含至少约0.5重量％(例如0.5重量％、至少约0.7重量％、至少约1.0重量％、至少约1.2重量％、至少约1.5重量％、至少约2.0重量％、至少约2.5重量％或更多)的GGM，或者包含至少约0.5重量％(例如0.5重量％、至少约0.7重量％、至少约1.0重量％、至少约1.2重量％、至少约1.5重量％、至少约2.0重量％、至少约2.5重量％或更多)的GM，或者包含至少约0.5重量％(例如0.5重量％、至少约0.7重量％、至少约1.0重量％、至少约1.2重量％、至少约1.5重量％、至少约2.0重量％、至少约2.5重量％、至少约3.0重量％、至少约3.5重量％、至少约4.0重量％、至少约4.5重量％、至少约5.0重量％或更多)的GGM和GM组合的生物质。在某些实施例中，已对木质纤维素生物质进行一个或多个预处理步骤以使木聚糖、半纤维素、纤维素和/或木质素材料更易被酶触及或对酶更敏感，从而更适合酶促水解。合适的预处理方法可为例如在反应器中对生物质材料使用包含强酸和金属盐的稀溶液的催化剂。参见例如美国专利No.6,660,506、No.6,423,145。作为另一种选择，合适的预处理可为例如如美国专利No.5,536,325中所述的多步骤方法。在某些实施例中，根据美国专利No.6,409,841的公开内容，可使用约0.4％至约2％的强酸对生物质材料进行一个或多个阶段的稀酸水解。预处理方法的另外实施例可包括在例如如下文献中所述的那些：美国专利No.5,705,369；Gould，(1984)，Biotech.&Bioengr.(《生物技术与生物工程》)，26：46-52；Teixeira等人，(1999)，Appl.Biochem&Biotech.(《应用生物化学与生物技术》)，77-79：19-34；国际公布的专利申请WO2004/081185；或者美国专利公布No.20070031918或国际公布的专利申请WO06110901。合适的木质纤维素生物质底物的一个非限制性例子是使用如本文实例10中描述的美国农业部的SPORL方案预处理的软木底物。合适的木质纤维素生物质底物的另一个非限制性例子是碱性KRAFT预处理的软木浆FPP-27。

本发明还涉及编码具有β-甘露聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其中该分离的多核苷酸选自：

(1)编码包含与SEQ ID NO：2或者与SEQ ID NO：3具有至少70％(例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(2)与SEQ ID NO：1具有至少70％(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，或者在中等严格条件、高严格条件或者极高严格条件下与SEQ ID NO：1或与其互补序列杂交的多核苷酸。

本组合物和方法的各方面包括采用编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者成熟序列SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％同一性(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的氨基酸序列的重组多肽的分离的核酸序列，来制备或者产生具有β-甘露聚糖酶活性的Bhe Man2多肽的方法。在一些实施例中，该多肽还包含天然或者非天然信号肽，使得所产生的BheMan2多肽由宿主生物体分泌，例如该信号肽包含与SEQ ID NO：13-41任一者具有至少90％同一性的序列，以容许在多种真菌宿主细胞、酵母宿主细胞和细菌宿主细胞中的异源表达。在某些实施例中，该分离的核酸包含与SEQ ID NO：1具有至少70％(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在某些实施例中，分离的核酸还包含编码信号肽序列的核酸序列。在某些实施例中，信号肽序列可为选自SEQ ID NO：13-41的一者。在某些具体的实施例中，使用编码SEQ ID NO：17或者18的信号肽序列的核酸序列来在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达Bhe Man2多肽。

本发明组合物和方法的各方面包括包含与调控序列有效组合的上述分离的核酸的表达载体。

本发明组合物和方法的各方面包括包含该表达载体的宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。

本发明组合物和方法的各方面包括包含上述宿主细胞和培养基的组合物。本组合物和方法的各方面包括产生Bhe Man2多肽的方法，该方法包括：在培养基中，在适合产生β-甘露聚糖酶的条件下，培养上文所描述的宿主细胞。

本组合物和方法的各方面包括一种组合物，该组合物包含根据上文所述的产生β-甘露聚糖酶的方法产生的培养基的上清液中的Bhe Man2多肽。

在一些方面，本发明涉及包含编码如上文和本文中所描述的具有β-甘露聚糖酶活性的多肽的多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、工程改造的宿主细胞。在另外的方面，本发明涉及使用所述核酸构建体、重组表达载体和/或工程改造的宿主细胞来制备或者产生本发明的β-甘露聚糖酶多肽或者包含这种β-甘露聚糖酶多肽的组合物的方法。具体地讲，本发明涉及例如包含与和SEQ ID NO：2或者和成熟序列SEQ ID NO：3具有至少70％同一性、或者由和SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的多核苷酸编码的β-甘露聚糖酶的成熟序列有效连接的合适信号肽的核酸构建体，涉及分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体或者包含这种核酸构建体的工程改造的宿主细胞。在一些实施例中，信号肽和β-甘露聚糖酶序列源自不同的微生物。

还提供了包含与调控序列有效组合的分离的核酸的表达载体。另外，提供了包含该表达载体的宿主细胞。在另外的实施例中，提供了组合物，该组合物包含宿主细胞和培养基。

在一些实施例中，宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。

在另外的实施例中，Bhe Man2多肽由宿主细胞异源表达。例如，BheMan2多肽由不是解半纤维素芽孢杆菌的工程改造的微生物表达。在一些实施例中，Bhe Man2多肽与一种或多种纤维素酶基因共表达。在一些实施例中，Bhe Man2多肽与一种或多种其他半纤维素酶基因共表达。

在一些方面，提供包含前面段落的重组Bhe Man2多肽的组合物和制备这种组合物的方法。在一些实施例中，该组合物还包含一种或多种纤维素酶，其中该一种或多种纤维素酶与Bhe Man2多肽一起由宿主细胞共表达。在其他实施例中，包含Bhe Man2多肽的组合物可以是分离的、任选经过纯化的Bhe Man2多肽与一种或多种纤维素酶和/或其他酶物理共混的掺混物。例如，该一种或多种纤维素酶可选自无或一种或多种β-葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶和/或一种或多种内切葡聚糖酶。在某些具体的实施例中，这种β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和/或内切葡聚糖酶如果存在的话，可与Bhe Man2多肽一起由单一宿主细胞共表达。在一些实施例中，该两种或多种纤维素酶中的至少两者可彼此异源或者源自不同的生物体。例如，该组合物可包含至少一种β-葡糖苷酶和至少一种纤维二糖水解酶，其中该β-葡糖苷酶和该纤维二糖水解酶不来自相同的微生物。在一些实施例中，所述纤维素酶中的一者或多者是宿主细胞内源的，但以与在宿主细胞中原本的天然表达水平不同的水平被过量表达或者表达。例如，所述纤维素酶中的一者或多者可以是里氏木霉CBH1和/或CBH2，它们为里氏木霉宿主细胞天然所有，但CBH1和CBH2任一者或两者在与Bhe Man2多肽一起在里氏木霉宿主细胞中共表达时被过量表达或不足表达。

在某些实施例中，包含重组Bhe Man2多肽的组合物还可包含一种或多种其他半纤维素酶，其中该一种或多种其他半纤维素酶与Bhe Man2多肽一起由宿主细胞共表达。例如，该一种或多种其他半纤维素酶可选自一种或多种其他β-甘露聚糖酶、一种或多种木聚糖酶、一种或多种β-木糖苷酶和/或一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。在某些实施例中，这种其他甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和L-阿拉伯呋喃糖苷酶如果存在的话，可与Bhe Man2多肽一起由单一宿主细胞共表达；或者作为另一种选择，这种其他甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和L-阿拉伯呋喃糖苷酶中的一者或多者或全部如果存在的话，不是与Bhe Man2多肽一起在单一宿主细胞中共表达，而是各个酶由其各自的宿主细胞产生后被物理混合或共混在一起以形成酶组合物。

在另外的方面，包含重组Bhe Man2多肽的组合物还可包含一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶，其中该一种或多种纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素酶与Bhe Man2多肽一起由宿主细胞共表达。例如，Bhe Man2多肽可与一种或多种β-葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种内切-木聚糖酶、一种或多种β-木糖苷酶和/或一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶以及其他非纤维素酶非半纤维素酶或蛋白质一起在相同的宿主细胞中共表达。作为另一种选择，包含重组Bhe Man2多肽并包含一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶的组合物可通过在产生后将Bhe Man2多肽与一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶物理混合在一起来制备，其中Bhe Man2多肽和该一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶从不同的宿主细胞产生。本组合物和方法的各方面因此包括包含上文描述的除了表达Bhe Man2多肽以外还共表达多种酶的宿主细胞及培养基的组合物。作为另一种选择，本组合物和方法的各方面包括第一组合物和第二组合物并任选包括第三组合物，该第一组合物包含表达Bhe Man2多肽并任选还表达一种或多种其他酶/蛋白质的第一宿主细胞，该第二组合物包含表达例如一种或多种纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素酶的第二宿主细胞，该第三组合物包含表达例如与该第一和第二宿主细胞所表达的纤维素酶和/或其他半纤维素酶不同的一种或多种其他纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素酶的第三宿主细胞。如果适宜的话，这种由宿主细胞的产酶得到的第一、第二和第三组合物可适当地进行物理共混或者混合以形成构成本组合物的酶的掺混物。还提供这样的组合物，其包含按照本文的方法在一种培养基或者多种培养基(视所需而定)的上清液中产生的Bhe Man2多肽和其他酶。此类培养基上清液可按原样使用，进行很少或不进行产生后的加工，所述产生后的加工可通常包括用以移除细胞碎片的过滤、细胞杀死程序和/或用以富集或浓缩其中的酶的超滤或其他步骤。此类上清液在本文中称为“全发酵液”或“全纤维素酶发酵液”。

在另外方面，本发明涉及在适于降解或转化纤维素材料并适于从纤维素材料产生物质的条件下施加或使用上述组合物的方法。

在另一个方面，提供了用于将纤维素材料降解或转化成可发酵糖的方法，该方法包括：使优选已经经历一个或多个预处理步骤的纤维素材料与前述段落之一的Bhe Man2多肽或者包含这种多肽的组合物进行接触以产生可发酵糖。

因此，本说明书涉及下列具体方面：

在第一方面，一种包含重组多肽和一种或多种纤维素酶的酶组合物，所述重组多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有β-甘露聚糖酶活性。

在第二方面，第一方面所述的酶组合物，其中当所述重组多肽构成所述酶组合物的高达20重量％时，所述重组多肽改善所述酶组合物的水解性能，其中所述改善的水解性能包括：

(a)在相同的水解条件下从给定木质纤维素生物质底物转化的葡聚糖转化百分数提高、木聚糖转化百分数提高和/或葡聚糖转化百分数及木聚糖转化百分数提高；或者

(b)在相同的水解条件下给定木质纤维素生物质底物的粘度减少快至少约5％。

在第三方面，第一或者第二方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ ID NO：4的ScoMan1的β-甘露聚糖酶活性相比具有提高的β-甘露聚糖酶活性。

在第四方面，第一或者第二方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ ID NO：5的Bsp Man1的β-甘露聚糖酶活性相比具有提高的β-甘露聚糖酶活性。

在第五方面，第一或者第二方面的所述酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ ID NO：6的Msp Man2的β-甘露聚糖酶活性相比具有提高的β-甘露聚糖酶活性。

在第六方面，第一至第五方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽当在pH 6至pH 9的pH范围进行温育时保留所述β-甘露聚糖酶活性的70％以上。

在第七方面，第一至第六方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽在约pH8.0至约pH 9.0的pH下具有最佳β-甘露聚糖酶活性。

在第八方面，第一至第七方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽当在50℃至74℃之间的温度下进行温育时，保留所述β-甘露聚糖酶活性的至少80％或者更多。

在第九方面，第一至第八方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽在约64℃的温度具有最佳β-甘露聚糖酶活性。

在第十方面，第一至第九方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽在约75℃的温度温育约2小时时保留所述β-甘露聚糖酶活性的至少50％。

在第十一方面，第一至第十方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽在最高55℃的温度温育约2小时时保留所述β-甘露聚糖酶活性的至少95％。

在第十二方面，第一至第十一方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在第十三方面，第一至第十二方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在第十四方面，第一至第十三方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在第十五方面，第一至第十四方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述一种或多种纤维素酶选自一种或多种β-葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶和一种或多种内切葡聚糖酶。

在第十六方面，第一至第十五方面中的任一个方面所述的酶组合物，还包含一种或多种其他半纤维素酶。

在第十七方面，第十六方面所述的酶组合物，其中所述一种或多种其他半纤维素酶选自一种或多种其他β-甘露聚糖酶、一种或多种木聚糖酶、一种或多种β-木糖苷酶和一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

在第十八方面，一种编码包含与SEQ ID NO：2或者与成熟多肽SEQ IDNO：3具有至少70％同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸，其中所述重组多肽具有β-甘露聚糖酶活性。

在第十九方面，第十八方面所述的核酸，其中所述重组多肽还包含信号肽序列。

在第二十方面，第十九方面所述的核酸，其中所述信号肽选自SEQ IDNO：13-41中的任何一者。

在第二十一方面，一种表达载体，所述表达载体包含与调控序列有效组合的第十八至第二十方面中的任何一个方面所述的核酸。

在第二十二方面，一种包含第二十一方面所述的表达载体的宿主细胞。

第二十三方面，第二十二方面所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或者真菌细胞。

在第二十四方面，一种包含第二十二方面或者第二十三方面所述的宿主细胞及培养基的组合物。

第二十五方面，一种产生β-甘露聚糖酶的方法，包括：在培养基中，在适合产生所述β-甘露聚糖酶的条件下，培养第二十二或者第二十三方面所述的宿主细胞。

在第二十六方面，一种包含根据第二十五方面所述的方法在所述培养基的上清液中产生的所述β-甘露聚糖酶的组合物。

第二十七方面，一种用于水解木质纤维素生物质底物的方法，包括：使所述木质纤维素生物质底物与第一至第十七和第二十六方面中的任何一个方面所述的酶组合物进行接触，以产生葡萄糖和其他糖类。

第二十八方面，第二十七方面所述的方法，其中所述木质纤维素生物质底物包含高达约20重量％、高达约15％或者高达约10重量％的半乳葡甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。

第二十九方面，一种包含第一至第十七方面中的任何一个方面所述的酶组合物及木质纤维素生物质底物的组合物。

第三十方面，第二十九方面所述的组合物，其中所述木质纤维素生物质底物包含高达约20重量％或者高达约15重量％或者高达约10重量％的半乳葡甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。

附图说明

图1示出了pML356(aprE-BhcnmanA)载体的图谱。

图2示出了pTrex3gM构建体的图谱。

图3示出了Bhe Man2的pH曲线。pH对Bhe Man2的β-甘露聚糖酶活性的影响是使用1％刺槐豆胶作为底物在50mM柠檬酸钠和50mM磷酸钠缓冲液中在50℃保持10分钟而测量的，该缓冲液被调节至在pH 2-9之间的各个pH值。将Bhe Man2多肽在其最佳pH下的甘露聚糖酶活性归一化到100％，并将该多肽在其他pH值下的甘露聚糖酶活性作为最佳pH下的活性的相对活性示出。

图4示出了Bhe Man2的温度曲线。温度变化对Bhe Man2的β-甘露聚糖酶活性的影响是使用1％刺槐豆胶作为底物在pH 6.0的50mM柠檬酸钠缓冲液中在30℃至78℃之间的各温度值下保持10分钟测量的。将BheMan2多肽在其最佳温度下的甘露聚糖酶活性归一化到100％，并将该多肽在其他温度值下的甘露聚糖酶活性作为最佳温度下的活性的相对活性示出。

图5示出了Bhe Man2的热稳定性曲线。Bhe Man2的热稳定性是通过在pH 6.0的50mM柠檬酸钠缓冲液中在40℃至65℃范围内的设定温度下温育2小时测定的。在温育后，测量每个温育温度下的剩余甘露聚糖酶活性。使用从保持在冰上同样2小时的Bhe Man2多肽对照样品测量的活性作为100％活性，以归一化残余活性测量值。

图6A-6C示出了如下的酶组合在相同的水解条件下和在不同的反应持续时间对给定的生物质底物即碱性KRAFT预处理的软木底物FPP-27所实现的水解水平的比较：市售的纤维素酶/半纤维素酶组合物TRIO^TM；9份TRIO^TM与1份(即10重量％)Bhe Man2多肽的共混物；9份TRIO^TM与1份GH5的三种其他β-甘露聚糖酶之一的共混物，所述三种其他β-甘露聚糖酶为SEQ ID NO：4的天蓝色链霉菌A3β-甘露聚糖酶(“ScoMan1”)、SEQ ID NO：5的热速芽孢杆菌β-甘露聚糖酶(“Bsp Man1”)、SEQ ID NO：6的小单孢菌L5β-甘露聚糖酶(“MspMan2)。图6A示出了24小时后的水解结果。图6B示出了48小时后的水解结果。图6C示出了72小时后的水解结果。实验的细节见实例9。

图7示出了如下的酶组合对FPP-27碱性KRAFT预处理的软木底物在24小时至72小时的时程后的总水解的比较：TRIO^TM；9份TRIO^TM与分别1份(即10重量％)Bhe Man2多肽、SEQ IDNO：4的天蓝色链霉菌A3β-甘露聚糖酶(“ScoMan1”)、SEQ ID NO：5的热速芽孢杆菌β-甘露聚糖酶(“Bsp Man1”)、SEQ ID NO：6的小单孢菌L5β-甘露聚糖酶(“Msp Man2)的共混物。实验的细节见实例9。

图8A-图8G描绘了本公开的序列和序列标识符。

具体实施方式

1.综述

本文描述涉及来自解半纤维素芽孢杆菌的属于糖基水解酶家族5的重组β-甘露聚糖酶的组合物和方法。本组合物和方法部分地基于这样的观察结果，即重组Bhe Man2多肽较于具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他已知β-甘露聚糖酶，赋予包含至少一种纤维素酶和/或至少一种其他半纤维素酶的纤维素酶和/或半纤维素酶组合物改善的水解木质纤维素生物质材料或者原料的能力。本组合物和方法还基于这样的观察结果，即当将包含重组Bhe Man2多肽的组合物用于水解合适的木质纤维素生物质底物，尤其是当这种底物在高固形物水平下被处理时，并且当这种底物含有明显水平的半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)时，该多肽赋予快速的粘度降低。Bhe Man2多肽的这些特征使其或其变体适合用于多种过程，包括例如用于木质纤维素生物质原料的转化或者水解。

在更详细地描述本发明组合物和方法之前，应当理解，本发明组合物和方法不限于所述的具体实施例，因为这些当然可改变。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施例的目的，并非旨在进行限制，因为本发明组合物和方法的范围将仅受所附权利要求的限定。

当提供值的范围时，应当理解，介于该范围的上限与下限之间的每一个中间值(除非上下文另有明确指明，否则精确到下限单位的十分之一)和所述范围内的任何其他所述值或中间值均涵盖于本发明的组合物和方法内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，并且也涵盖于本发明组合物和方法内，除非是在所述范围内的任何明确排除的界限。当所述范围包括界限中的一者或两者时，排除这些被包括的界限中的任一者或两者的范围，也被包括在本发明组合物和方法中。

某些范围在本文中通过前面带有术语“约”的数值表述。术语“约”在本文中用于为它之后的确切数字以及接近或近似该术语之后的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似明确列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其中表述它的上下文中提供明确列举的数字的基本上等值的数字。例如，与数值相关的术语“约”是指该数值的-10％至+10％的范围，除非该术语在上下文中另有明确定义。又如，短语“约6的pH值”是指5.4至6.6的pH值，除非pH值另有明确定义。

本文提供的标题并不是对本发明组合物和方法的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例都可以通过整体参考本说明书而获得。因此，通过整体参考本说明书可更完全地限定下文定义的术语。

本文档被组织成多个章节，以便于阅读；然而，读者将会认识到，在一个章节中进行的陈述可以应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明组合物和方法所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于实践或测试本发明组合物和方法，但是现在描述的是代表性的示例性方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利以引用的方式并入本文，如同每个单独的出版物或专利明确地并单独地指示为以引用的方式并入，并且以引用方式并入本文来公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。任何出版物的引用是关于提交日前的其公开内容，并不应视为承认本发明组合物和方法由于在先发明而无权早于此类出版物。另外，所提供的公布日期可能与实际的公布日期不同，这可能需要独立地核实。

根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述(该)”包括多个指代物。因此，例如，提及“酶”包括多个此种酶，而提及“剂量”则包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

还应当注意，权利要求书可能撰写成排除了任何任选元素。由此，该陈述旨在充当使用与权利要求书要素的引用相关的诸如“仅有”、“只有”等等的排他性术语或使用“负性”限制的先行基础。

当关于对象细胞、核酸、多肽/酶或载体而使用时，术语“重组”指该对象已从其天然状态经过修饰。因此，例如，重组细胞表达未在天然(非重组)形式的细胞中存在的基因，或者以不同于自然界中存在的水平或条件表达天然基因。重组核酸可与天然序列相差一个或多个核苷酸和/或在表达载体中有效连接至异源序列，例如异源启动子、允许分泌的信号序列等。重组多肽/酶可与天然序列相差一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码β-甘露聚糖酶的核酸的载体例如是重组载体。

还应当注意，如本文所用，术语“基本上由...组成”是指这样的组成，其中该术语之后的组分与其他已知的组分共存，所述其他已知的组分总量少于总组成的30重量％，并且不会促进或干扰组分的作用或活性。

还应当注意，如本文所用，术语“包含”意指包括但不限于术语“包含”之后的组分。术语“包含”之后的组分是必要或强制性的，但包含该组分的组合物还可包含其他非强制性或任选的组分。

还应当注意，如本文所用，术语“由...组成”意指包括并限于术语“由...组成”之后的组分。因此术语“由...组成”之后的组分是必要或强制性的，并且组合物中不存在其他组分。

对于本领域技术人员而言，阅读本公开后将显而易见的是，本文所描述和图示的各个实施例中的每一个都具有分立的组分和特征，在不脱离本文所述的本发明组合物和方法的范围或实质的前提下，这些组分和特征可容易地与其他若干实施例中任一者的特征分离或合并。任何所列举的方法可以按列举的事件顺序或按逻辑上可行的任何其他顺序实施。

2.定义

“B-甘露聚糖酶”意指具有催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖的(1→4)-β-D-甘露糖苷键的裂解或者水解的能力的酶多肽或多肽结构域。

本文所用的“Bhe Man2”或者“Bhe Man2多肽”指属于源自解半纤维素芽孢杆菌的糖基水解酶家族5的β-甘露聚糖酶(例如重组β-甘露聚糖酶)(及其变体)，该β-甘露聚糖酶当与具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他已知β-甘露聚糖酶相比时，在纤维素酶和/或半纤维素酶组合物水解任选经过预处理的木质纤维素生物质底物的能力方面对该组合物赋予出乎意料的改善。Bhe Man2多肽可构成纤维素酶和/或半纤维素酶混合物的实质部分，例如高达约20重量％(例如高达约20重量％、高达约15重量％、高达约10重量％、高达约9重量％、高达约8重量％、高达约7重量％、高达约6重量％、高达约5重量％、高达约4重量％、高达约3重量％、高达约2重量％、高达约1重量％)，并在相同的条件下实现给定木质纤维素生物质底物的相等或者更佳的水解。这容许使用较少的纤维素酶/半纤维素酶并更有效地进行生物质水解，从而使得总体纤维素生物质转化过程在经济上更加可行和可持续。还出乎意料地发现，本文的Bhe Man2多肽赋予快速的粘度降低或者液化，这在生物质底物在高固形物水平下经酶处理时尤其显著。根据本组合物和方法的各方面，Bhe Man2多肽包括那些具有SEQID NO：2所示氨基酸序列的多肽，以及与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2的成熟序列或者与SEQ ID NO：2的长度为至少80个残基的片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一性的衍生多肽或者变体多肽，其中所述Bhe Man2多肽不仅具有β-甘露聚糖酶活性且能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖的(1→4)-β-D-甘露糖苷键的转化水解，而且比具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他β-甘露聚糖酶具有更高的β-甘露聚糖酶活性，并且赋予高固形物生物质底物的快速粘度降低和液化，这种性质是在其他已知的β-甘露聚糖酶中未曾观察到的。

“家族5糖基水解酶”或“GH5”是指符合根据如下文献的分类的糖基水解酶家族5的定义的多肽：Henrissat，Biochem.J.(《生物化学杂志》)，280：309-316，(1991)以及Henrissat&Cairoch，Biochem.J.(《生物化学杂志》)，316：695-696，(1996)。

根据本文描述的本组合物和方法的Bhe Man2多肽可被分离或纯化。所谓纯化或分离意指通过将Bhe Man2多肽从与其天然相关的天然存在的成分中的一些或所有分离而使Bhe Man2从其天然状态改变。此类分离或纯化可通过本领域公认的分离技术如离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水分离、渗析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀法或其他蛋白质盐沉淀法、离心、尺寸排阻色谱法、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离来实现，以移除最终组合物中不期望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。还可以然后将提供附加有益效果的组分添加到含有Bhe Man2的组合物，例如活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物或者其他酶类或化学品。

如本文所用，“微生物”是指细菌、真菌、病毒、原生动物以及其他微生物或微观生物体。

如本文所用，多肽的“衍生物”或“变体”意指通过如下方式衍生自前体多肽(例如，天然多肽)的多肽：将一个或多个氨基酸添加到C端和N端中任一者或二者、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点置换一个或多个氨基酸、在多肽的任一个或两个末端或在氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸、或者在氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸。Bhe Man2衍生物或变体的制备可以任何方便的方式实现，例如通过修饰编码天然多肽的DNA序列、将该DNA序列转化到合适的宿主中以及表达经修饰的DNA序列以形成衍生物/变体Bhe Man2。衍生物或者变体还包括经化学修饰的Bhe Man2多肽，例如糖基化或者以其他方式改变Bhe Man2多肽的特性。本组合物和方法涵盖Bhe Man2的衍生物和变体，这种衍生物和变体与多种具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他β-甘露聚糖酶相比时，在相同的木质纤维素生物质底物水解条件下将会表现出改善的β-甘露聚糖酶活性，所述其他β-甘露聚糖酶为例如具有SEQ IDNO：4的序列的ScoMan1、具有SEQ ID NO：5的序列的Bsp Man1或者SEQID NO：6的Msp Man2。在一些实施例中，这种衍生物和变体还将赋予纤维素酶和/或半纤维素酶组合物快速的粘度降低和液化，在生物质底物经受包含本文的Bhe Man2多肽的酶组合物后，与当该生物质底物经受除了不包含Bhe Man2多肽之外具有相同的量、比例和类型的酶的对等酶组合物时相比，能够在相同的时间内实现例如至少10％(例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％或更多)改善的粘度下降或者更高的液化。

在某些方面，本文的组合物和方法的Bhe Man2多肽还可涵盖具有β-甘露聚糖酶活性的多肽或者多肽片段的功能片段，其源自亲本多肽，所述亲本多肽可以是包含SEQ ID NO：2或者由SEQ ID NO：2组成的全长多肽，或者是包含SEQ ID NO：3或者由SEQ ID NO：3组成的成熟序列。功能多肽可在N端区域或C端区域的任一者中或在这两个区域中被截短而生成亲本多肽的片段。出于本发明的目的，功能片段必须具有亲本多肽的β-甘露聚糖酶活性的至少20％，更优选至少30％、40％、50％，或者更优选至少60％、70％、80％，或者甚至更优选至少90％。

在某些方面，Bhe Man2衍生物/变体将与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者与成熟序列SEQ ID NO：3具有70％至99％(或者更高)的氨基酸序列同一性，例如与SEQ.ID NO：2的氨基酸序列或者与成熟序列SEQ ID NO：3具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，氨基酸置换为使用L-氨基酸的“保守氨基酸置换”，其中一个氨基酸被另一个生物学上类似的氨基酸替换。保守氨基酸置换是保留被置换的氨基酸的总体电荷、疏水性/亲水性和/或空间位阻的那些置换。保守置换的例子是下列各组之间的那些置换：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr和Phe/Trp/Tyr。衍生物可例如相差少至1至10个氨基酸残基，如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。在一些实施例中，Bhe Man2衍生物可具有N端和/或C端缺失，其中排除缺失的末端部分的Bhe Man2衍生物与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3中的连续亚区域(contiguous sub-region)相同。

如本文所用，针对本文所鉴定的氨基酸或者核苷酸序列的“序列同一性百分数(％)”，定义为在将候选序列与Bhe Man2序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与Bhe Man2序列的氨基酸残基或者核苷酸相同的氨基酸残基或者核苷酸的百分数。

所谓“同源物”，应当意指与所讨论的氨基酸序列和所讨论的核苷酸序列具有指定程度的同一性的实体。同源序列被认为包括与所讨论的序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的氨基酸序列，该同一性使用常规的序列比对工具(例如，Clustal、BLAST等等)测量。通常，除非另外指明，否则同源物将包括与所讨论的氨基酸序列相同的活性位点残基。

用于执行序列比对和确定序列同一性的方法是技术人员已知的，可在不进行过多实验的情况下执行，并且可确切获得同一性值的计算。参见例如Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology(《现代分子生物学实验技术》)，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(格林出版与威立国际科学，纽约))；以及ALIGN程序(Dayhoff(1978)，载于Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图册》)5：增刊3(National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.(美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区))。多种算法可用于对序列进行比对并确定序列同一性，并且包括例如，Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)48：443的同源比对算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)2：482的局部同源性算法；Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(《美国国家科学院院刊》)85：2444的相似性搜索算法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)70：173-187(1997)；以及BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(参见Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215：403-410)。

使用这些算法的计算机化程序也可供使用，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件、或WU-BLAST-2(Altschul等人，(1996)Meth.Enzym.(《酶学方法》)，266：460-480)；或美国威斯康星州麦迪逊(Madison，Wisconsin，USA)的遗传学计算组(Genetics Computing Group(GCG))软件包版本8中可获得的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；以及加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，California)所开发的PC/Gene程序中的CLUSTAL。本领域的技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在正进行比较的序列的长度上实现最大比对所需的算法。优选地，使用由程序确定的默认参数来确定序列同一性。具体地讲，可使用Clustal W(Thompson J.D.等人(1994)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)22：4673-4680)以如下默认参数确定序列同一性，即：

如本文所用，“表达载体”意指包含有效连接至合适控制序列的DNA序列的DNA构建体，所述控制序列能够影响DNA在合适宿主中的表达。这种控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA上的核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。不同细胞类型可与不同表达载体一起使用。枯草芽孢杆菌中使用的载体的示例性启动子为AprE启动子；变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中使用的示例性启动子为A4启动子(来自黑曲霉(Aspergillus niger))；大肠杆菌中使用的示例性启动子为Lac启动子，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中使用的示例性启动子为PGK1，黑曲霉中使用的示例性启动子为glaA，并且里氏木霉的示例性启动子为cbhI。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中，载体就可独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在合适的条件下可整合到基因组本身中。在本说明书中，质粒和载体有时可互换使用。然而，本发明组合物和方法旨在包括其他形式的表达载体，所述表达载体起到等同功能并且是本领域已知的或成为本领域已知的。因此，广泛的宿主/表达载体组合可用于表达本文所述的DNA序列。可用的表达载体例如可由如下组成：染色体DNA序列、非染色体DNA序列和合成DNA序列的片段，如SV40和已知细菌质粒的各种已知衍生物，例如来自大肠杆菌的质粒，包括col E1、pCR1、pBR322、pMb9、pUC 19及其衍生物；广泛宿主范围质粒，例如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体λ的各种衍生物例如NM989，以及其他DNA噬菌体例如M13和丝状单链DNA噬菌体；酵母质粒，如2μ质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体，如可用于动物细胞的载体；以及衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，如经修饰以采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒。使用本发明组合物和方法的表达载体的表达技术是本领域已知的，并且在例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A  Laboratory Manual(《分子克隆：实验室指南》)，第二版，Cold SpringHarbor Press(冷泉港出版社)(1989)中大体进行了描述。通常，通过经整合事件直接插入特定物种的基因组中，将包含本文所述的DNA序列的此类表达载体转化到单细胞宿主中(参见例如Bennett和Lasure，More Gene  Manipulations in Fungi(《真菌中更多的基因操作》)，Academic Press，San Diego(圣地亚哥学术出版社)，第70-76页(1991)以及其中引用的描述真菌宿主中靶向基因组插入的文章)。

如本文所用，“宿主菌株”或“宿主细胞”意指适于包含根据本发明组合物和方法的DNA的表达载体的宿主。可用于本发明组合物和方法的宿主细胞一般为原核或真核宿主，包括可实现表达的任何可转化微生物。具体地讲，宿主菌株可以是枯草芽孢杆菌、解半纤维素芽孢杆菌、变铅青链霉菌、大肠杆菌、里氏木霉、酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉(Aspergillusoryzae)、勒克瑙金孢子菌(Chrysosporium lucknowence)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)以及各种其他微生物细胞。使用通过重组DNA技术构建的载体来转化或转染宿主细胞。此类转化的宿主细胞可具有如下能力中的一者或多者：复制编码Bhe Man2(及其衍生物或变体(突变体))的载体以及表达所需的肽产物。在根据本发明组合物和方法的某些实施例中，“宿主细胞”意指木霉属物种的细胞和由木霉属物种的细胞产生的原生质体两者。

关于细胞而使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指细胞含有整合到其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然(如，异源)核酸序列。

在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”为已将表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体(包括编码所关注的多肽(例如β-甘露聚糖酶)的多核苷酸在内)引入其中的生物体。示例性宿主菌株是能够表达所关注的多肽的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括由细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或多肽的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。

关于多核苷酸或多肽的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译二者。

如本文所用，“信号序列”意指与蛋白质的N端部分结合的氨基酸的序列，其促进成熟形式的蛋白质分泌到细胞外部。信号序列的该定义为功能定义。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。虽然可在本组合物和方法的各方面中采用Bhe Man2的天然信号序列，但也可采用其他非天然的信号序列(例如选自SEQ ID NO：13-41的信号序列)。

本发明的β-甘露聚糖酶多肽可称为“前体”、“未成熟的”或“全长的”(在这种情况下它们包含信号序列)，或者可称为“成熟的”(在这种情况下它们不含信号序列)。多肽的成熟形式通常是最有用的。除非另有说明，否则本文所用的氨基酸残基编号是指各β-甘露聚糖酶多肽的成熟形式。本发明的β-甘露聚糖酶多肽也可被截短以移除N端或C端，只要所得多肽保留β-甘露聚糖酶活性即可。

本发明的β-甘露聚糖酶多肽也可为“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包含第一β-甘露聚糖酶多肽的至少一部分和第二β-甘露聚糖酶多肽的至少一部分(此类嵌合β-甘露聚糖酶多肽可例如使用涉及对所述β-甘露聚糖酶每者上的结构域进行交换的已知技术而源自第一和第二β-甘露聚糖酶)。本β-甘露聚糖酶多肽可还包括异源信号序列、容许进行跟踪或纯化的表位等等。当术语“异源”用来指用于表达所关注的多肽的信号序列时，其意指该信号序列例如与所关注的多肽来源于不同的微生物。适于表达本文的Bhe Man2多肽的异源信号序列的例子可以是例如来自里氏木霉、其他木霉属物种、黑曲霉、米曲霉、其他曲霉属物种、金孢子菌属及其他生物体的那些信号序列，来自枯草芽孢杆菌、解半纤维素芽孢杆菌、其他芽孢杆菌属物种、大肠杆菌或者其他合适的微生物的那些信号序列。

如本文所用，“功能附接”或“有效连接”意指具有已知或所需活性的调控区或功能域如启动子、终止子、信号序列或增强子区以一定方式附接或连接到靶标(例如，基因或多肽)，使得调控区或功能域根据其已知或所需活性来控制该靶标的表达、分泌或功能。

如本文所用，术语“多肽”和“酶”可互换使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母编码。聚合物可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂非氨基酸。所述术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。还包括在该定义中的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所用，“野生型”与“天然”基因、酶或菌株是指天然存在的那些基因、酶或菌株。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而是涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。

如本文所用，“变体多肽”指通过置换、添加或缺失一个或多个氨基酸，通常利用重组DNA技术，从亲本(或参考)多肽衍生的多肽。变体多肽可与亲本多肽相差少量氨基酸残基。它们可由其与亲本多肽的一级氨基酸序列同源性/同一性的水平限定。合适地，变体多肽与亲本多肽具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者甚至至少99％氨基酸序列同一性。

如本文所用，“变体多核苷酸”编码变体多肽，与亲本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性，或在严格条件下与亲本多核苷酸或其互补序列杂交。合适地，变体多核苷酸与亲本多核苷酸或者与该亲本多核苷酸的互补序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者甚至至少99％核苷酸序列同一性。测定同一性百分比的方法是本领域已知的并且在上文中进行了描述。

术语“源自”涵盖术语“来源于”、“从...获得”、“可由...获得”、“分离自”和“由...产生”，并且通常是指一种指定材料在另一指定材料中找到其起源或者具有可参照另一指定材料而描述的特征。

如本文所用，术语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据测量杂交的条件的“严格性”程度来分类。严格性程度可例如基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高严格性”通常在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)下发生；“高严格性”在比Tm低约5℃-10℃下发生；“中等严格性”在比探针Tm低约10℃-20℃下发生；“低严格性”在比Tm低约20℃-25℃下发生。作为另一种选择或除此之外，杂交条件可基于杂交的盐或离子强度条件，和/或基于一种或多种严格性洗涤，例如：6X SSC＝极低严格性；3X SSC＝低至中等严格性；1X SSC＝中等严格性；0.5X SSC＝高严格性。在功能上，可以使用最高严格性条件来鉴别与杂交探针具有严格的同一性或接近严格的同一性的核酸序列；而高严格性条件用于鉴别与探针具有约80％或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常需要使用相对严格的条件来形成杂交物(例如，使用相对较低的盐和/或高温条件)。

如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。更具体地讲，“杂交”是指在印迹杂交技术和PCR技术期间一条核酸链与互补链形成双链即与之碱基配对的过程。如果某核酸序列与参考核酸序列在中等至高度严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为这两个序列“选择性杂交”。杂交条件基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高严格性”通常在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)下发生；“高严格性”在比Tm低约5℃-10℃下发生；“中等严格性”在比探针Tm低约10℃-20℃下发生；“低严格性”在比Tm低约20℃-25℃下发生。在功能上，可以使用最大限度严格性条件来鉴定与杂交探针具有严格的同一性或接近严格的同一性的序列；而可使用中等或低严格性杂交来鉴定或检测多核苷酸序列同源物。

中等严格性和高严格性杂交条件是本领域熟知的。例如，可通过如下步骤进行中等严格性杂交：在包含20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×邓哈特溶液(Denhardt’ssolution)、10％硫酸葡聚糖和20mg/mL变性剪切鲑精DNA的溶液中于37℃下过夜温育，然后在1×SSC中于约37℃至50℃下洗涤滤膜。高严格性杂交条件可为以65℃和0.1×SSC(其中1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)进行的杂交。作为另一种选择，高严格性杂交条件可于约42℃下在50％甲酰胺、5×SSC、5×邓哈特溶液、0.5％SDS和100μg/mL变性载体DNA中进行，然后在2×SSC和0.5％SDS中于室温下洗涤两次，并且在0.1×SSC和0.5％SDS中于42℃下再洗涤两次。并且极高严格性杂交条件可为以68℃和0.1×SSC进行的杂交。本领域的技术人员知道如何根据适应诸如探针长度等之类的因素的需要来调整温度、离子强度等。

编码变体β-甘露聚糖酶的核酸相比于SEQ ID NO：1的核苷酸与其相同互补序列之间形成的双链体可具有降低1℃-3℃或更多的T_m。

在关于至少两条核酸或多肽的上下文中，短语“实质上类似”或“实质上相同”意指，多核苷酸或多肽包含与亲本或参考序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99％的同一性，或者不包括在不增加功能性的情况下仅为避开本描述所作的氨基酸置换、插入、缺失或修饰的序列。

如本文所用，“表达载体”是指DNA构建体，其含有编码指定多肽且有效连接至能够实现该多肽在合适的宿主中表达的合适控制序列的DNA序列。这种控制序列可包括实现转录的启动子、控制这种转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和/或控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或是潜在基因组插入物。一旦转化到适合宿主中，载体就可独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在一些情况下可整合到宿主基因组中。

术语“重组”是指例如通过使编码序列突变以产生改变的多肽、将编码序列与另一基因的编码序列融合、使基因处于不同启动子控制下、在异源生物体中表达基因、以降低或升高的水平表达基因、以不同于基因的天然表达谱的方式有条件地或组成地表达基因等，对遗传物质(即，核酸、核酸编码的多肽以及包含这些多核苷酸的载体和细胞)进行修饰以改变其序列或表达特征。一般说来，重组核酸、多肽和基于它们的细胞已通过人进行操纵使得其与自然界中存在的相关核酸、多肽和细胞不相同。

“信号序列”是指结合至多肽的N端部分，并且促进成熟形式的多肽从细胞分泌的氨基酸序列。细胞外多肽的成熟形式不含信号序列，其在分泌过程期间被切除。

术语“选择标记”或“可选标记”是指能够在宿主细胞中表达使得易于选择含有所引入的核酸或载体的宿主的基因。可选标记的例子包括但不限于抗微生物物质(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。

术语“调控元件”是指控制核酸序列表达的某一方面的遗传元件。例如，启动子是促进有效连接的编码区的转录起始的调控元件。另外的调控元件包括剪接信号、聚腺苷酸化信号和终止信号。

如本文所用，“宿主细胞”一般为以使用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主的细胞。转化的宿主细胞能够复制编码多肽变体的载体或者表达所需的多肽变体。在载体编码多肽变体的前多肽或原多肽形式的情况下，这些变体在表达时通常由宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。

在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化的手段包括本领域已知的原生质体转化法、氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法等。(参见，Chang和Cohen，(1979)，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)，168：111-115；Smith等人，(1986)，Appl.Env.Microbiol(《应用环境微生物学》)，51：634；以及Ferrari等人，在Harwood，Bacillus(《芽孢杆菌属》)，普莱南出版公司(PlenumPublishing Corporation)，第57-72页，1989年中的综述文章)。

“融合的”多肽序列经由两个所讨论的多肽序列之间的肽键连接，即有效连接。

术语“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)，特别是盘菌亚门(Pezizomycotina)物种的所有丝状形式。

其他科技术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同(参见例如Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology(《微生物学与分子生物学词典》)，第2版，纽约约翰威立出版公司，1994年；以及Hale和Marham，The Harper CollinsDictionary of Biology(《哈珀柯林斯生物学词典》)，哈珀永久出版社(Harper Perennial)，纽约，1991年))。

来自解半纤维素芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶Bhe Man2(SEQ ID NO：2)具有以下氨基酸序列：

MKKSLSQIYHLIICALIASVGIMGITTSPSAASSGFYVDGNTLYDANGQPFVMRGINHGHAWYKDTASTAIPAIAEQGANTIRIVLSDGGQWEKDDIDTVREVIELAEQNKMVAVVEVHDATGRDSRSDLNRAVDYWIEMKDALIGKEDTVIINIANEWYGSWDGSAWADGYIDVIPKLRDAGLTHTLMVDAAGWGQYPQSIHDYGQDVFNADPLKNTMFSIHMYEYAGGDANTVRSNIDRVIDQDLALVIGEFGHRHTDGDVDEDTILSYSEETGTGWLAWSWKGNSTEWDYLDLSEDWAGQHLTDWGNRIVHGADGLQETSKPSTVFSDDNGGSPEPPTATTLYDFEGSTQGWHGSNVAGGPWSVTEWGTSGNYSLKADVNLTSNSSHELYSEQSRNLHGYSQLNATVRHANWGNHGNGMNARLYVKTGSDYTWYSGPFTRINSSNSGTTLSFDLNNIENSHHVREIGVQFSAADNSSGQTALYVDNVTLR

成熟的β-甘露聚糖酶，基于SEQ ID NO：3的预测信号肽序列的移除：SSGFYVDGNTLYDANGQPFVMRGINHGHAWYKDTASTAIPAIAEQGANTIRIVLSDGGQWEKDDIDTVREVIELAEQNKMVAVVEVHDATGRDSRSDLNRAVDYWIEMKDALIGKEDTVIINIANEWYGSWDGSAWADGYIDVIPKLRDAGLTHTLMVDAAGWGQYPQSIHDYGQDVFNADPLKNTMFSIHMYEYAGGDANTVRSNIDRVIDQDLALVIGEFGHRHTDGDVDEDTILSYSEETGTGWLAWSWKGNSTEWDYLDLSEDWAGQHLTDWGNRIVHGADGLQETSKPSTVFSDDNGGSPEPPTATTLYDFEGSTQGWHGSNVAGGPWSVTEWGTSGNYSLKADVNLTSNSSHELYSEQSRNLHGYSQLNATVRHANWGNHGNGMNARLYVKTGSDYTWYSGPFTRINSSNSGTTLSFDLNNIENSHHVREIGVQFSAADNSSGQTALYVDNVTLR

多种具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他细菌β-甘露聚糖酶已被用作本文的基准分子(benchmark molecule)，包括这样一种GH5的β-甘露聚糖酶，其来自天蓝色链霉菌菌株A2，在本文中称为“ScoMan1”，具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：

MRKPRSTLITTAGMAFAAVLGLLFALAGPSAGRAEAAAGGIHVSNGRVLEGNGSVFVMRGVNHAYTWYPDRTGSIADIAAKGANTVRVVLSSGGRWTKTSASEVSALIGQCKANKVICVLEVHDTTGYGEDGAATSLDQAADYWVSVKSALEGQEDYVVVNIGNEPFGNTNYTAWTDATKSAIGKLRGAGLDHALMVDAPNWGQDWSGTMRSNAASVFASDPDRNTVFSVHMYGVYDTAAEVRDYLNAFVGSGLPIVVGEFGDQHSDGNPDEDAIMATAQSLGVGYLGWSWSGNGGGVEYLDMVNGFDPNSLTSWGNRIFYGSNGIAATSRTATVYGGGGGSTGGTAPNGYPYCVNGGASDPDGDGWGWENSRSCVVRGSAADH

基准β-甘露聚糖酶还包括来自热速芽孢杆菌的GH5的被称为“BspMan1”的β-甘露聚糖酶，其具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：5)

MNKKWSYTFIALLVSIVCAVVPIFFSQNNVHAKTKREPATPTKDNEFVYRKGDKLMIGNKEFRFVGTNNYYLHYKSNQMIDDVIESAKKMGIKVIRLWGFFDGMTSENQAHNTYMQYEMGKYMGEGPIPKELEGAQNGFERLDYTIYKAKQEGIRLVIVLTNNWNNFGGMMQYVNWIGETNHDLFYTDERIKTAYKNYVHYLINRKNQYTGIIYKNEPTIMAWELANEPRNDSDPTGDTLVRWADEMSTYIKSIDPHHLVAVGDEGFFRRSSGGFNGEGSYMYTGYNGVDWDRLIALKNIDYGTFHLYPEHWGISPENVEKWGEQYILDHLAAGKKAKKPVVLEEYGISATGVQNREMIYDTWNRTMFEHGGTGAMFWLLTGIDDNPESADENGYYPDYDGFRIVNDHSSVTNLLKTYAKLFNGDRHVEKEPKVYFAFPAKPQDVRGTYRVKVKVASDQHKVQKVQLQLSSHDEAYTMKYNASFDYYEFDWDTTKEIEDSTVTLKATATLTNKQTIASDEVTVNIQNASAYEIIKQFSFDSDMNNVYADGTWQANFGIPAISTPKTRCLRVNVDLPGNADWEEVKVKISPISELSETSRISFDLLLPRVDVNGALRPYIALNPGWIKIGVDQYHVNVNDLTTVTIHNQQYKLLHVNVEFNAMPNVNELFLNIVGNKLAYKGPIYIDNVTLFKKI

基准β-甘露聚糖酶另外包括来自小单孢菌菌株L5的被称为“MspMan2”的β-甘露聚糖酶，其具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：

MKKLLSVAGAALLTALAAVFALGQPAHAATGFSVSNGRLYDANGVEFVMRGVNHAHTWYPQQTSSFANIKALGANTVRVVLSSGDRWTKNSAADVANVISLCKANRMICVLEVHDTTGYGEDGAATTLAKATDYWLSIADVLKGQEKYVIVNIGNEPFGNQGYSAWTTDTSNAIKRLRAAGLTHTIMVDAPNWGQDWTFTMRDNAGTVFAADPQRNTVFSIHMYGVFDTAAEISDYLGRFRTAGLPIVVGEFGFNHSDGNPDEDAIMAYAQANGIGYLGWSWSGNGGGVEYLDMTTAFNPAQLTSWGQRIFNGANGIAATSREASVYAGSTPTASPTGSPTTSPTPTSSPSPTPPPTTTPPPSGGCTATYTVANSWQGGFQGEVKVTAGAAAITGWTVRWTFANGQSVTQAWNASVSNSGSAYTARNVDYNGRLGVGASTSFGFIGSWTGTNSTPAVTCTAS

3.β-甘露聚糖酶多肽、多核苷酸、载体和宿主细胞

A.Bhe Man2多肽

在一个方面，本组合物和方法提供重组Bhe Man2β-甘露聚糖酶多肽、其具有β-甘露聚糖酶活性的片段或者变体。重组β-甘露聚糖酶多肽的一个例子分离自解半纤维素芽孢杆菌。成熟的Bhe Man2多肽具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。类似的、实质上类似的Bhe Man2多肽可存在于自然界中，例如存在于解半纤维素芽孢杆菌或者芽孢杆菌属的其他菌株或分离株中。这些和其他重组Bhe Man2多肽被本组合物和方法涵盖。

在一些实施例中，重组Bhe Man2多肽是与例示的Bhe Man2多肽具有指定程度的氨基酸序列同一性的变体Bhe Man2多肽，例如与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者与成熟序列SEO ID NO：3具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者甚至至少99％序列同一性。序列同一性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文中所述)通过氨基酸序列比对来测定。

在某些实施例中，重组Bhe Man2多肽以重组方式产生于微生物中，例如产生于细菌或真菌宿主生物体中，而在其他实施例中，Bhe Man2多肽以合成方式产生，或者从天然来源(例如，解半纤维素芽孢杆菌)纯化获得。

在某些实施例中，重组Bhe Man2多肽包含不会实质上影响该多肽的结构和/或功能的置换。这些置换的例子是保守突变，如表I中所概述。

表I.氨基酸置换

涉及天然存在的氨基酸的置换一般是通过使编码重组Bhe Man2多肽的核酸突变，然后在生物体中表达该变体多肽来作出。涉及非天然存在的氨基酸的置换或氨基酸的化学修饰一般是在由生物体合成Bhe Man2多肽后通过以化学方式对该多肽进行修饰来作出。

在一些实施例中，变体重组Bhe Man2多肽与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3实质上相同，这意指其不包含不会显著影响多肽的结构、功能或表达的氨基酸置换、插入或缺失。此类变体重组Bhe Man2多肽将包括那些被设计来避开本描述的多肽。在一些实施例中，变体重组Bhe Man2多肽、包含这些变体的组合物和方法与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3实质上并不相同，而是包括在某些情况下会实质上影响本文的多肽的结构、功能或表达的氨基酸置换、插入或缺失，使得与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的多肽相比，可实现改善的特性，包括例如水解含甘露聚糖的木质纤维素底物的比活性改善、当用来处理高固形物生物质底物时粘度下降更快速、在期望的宿主生物体中的表达改善、热稳定性改善、pH稳定性改善等。

在一些实施例中，重组Bhe Man2多肽(包括其变体)具有β-甘露聚糖酶活性。β-甘露聚糖酶活性可使用测量还原糖从半乳甘露聚糖底物的释放(例如根据实例5的描述)的测定法来测定。β-甘露聚糖酶活性可通过与纤维素酶和/或半纤维素酶混合物组合，然后使用这种混合物按照在例如实例9中描述的方案和条件处理合适的含甘露聚糖的生物质底物(例如木材底物等)来测定，或者通过合适的测定法或本领域已知的活性测量方法来测定。

重组Bhe Man2多肽包括“全长”Bhe Man2多肽的保留β-甘露聚糖酶活性的片段。优选地，那些功能片段(即保留β-甘露聚糖酶活性的片段)长度为至少80个氨基酸残基(例如长度为至少80个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少120个氨基酸残基、至少140个氨基酸残基、至少160个氨基酸残基、至少180个氨基酸残基、至少200个氨基酸残基、至少220个氨基酸残基、至少240个氨基酸残基、至少260个氨基酸残基、至少280个氨基酸残基、至少300个氨基酸残基或者更长)。这些片段适当地保留全长前体多肽或全长成熟多肽的活性位点，但可具有非关键性氨基酸残基的缺失。片段的活性可容易地使用本文描述的测量β-甘露聚糖酶活性的方法(例如实例5中描述的测定法)和水解性能测量值(如实例9中描述的那些测量值)进行测定，或者通过合适的测定法或本领域已知的其他活性测量手段进行测定。

在一些实施例中，Bhe Man2氨基酸序列及衍生物作为N端和/或C端融合蛋白产生，例如为了帮助提取、检测和/或纯化和/或为了给Bhe Man2多肽增添功能性质。融合蛋白伴侣的例子包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6XHis、GALA(DNA结合和/或转录激活结构域)、FLAG标签、MYC标签或本领域技术人员已知的其他标签。在一些实施例中，在融合蛋白伴侣与所关注的多肽序列之间提供蛋白水解裂解位点，以允许移除融合序列。合适的是，融合蛋白不妨碍重组Bhe Man2多肽的活性。在一些实施例中，将重组Bhe Man2多肽融合至功能结构域，功能结构域包括前导肽、前肽、结合结构域和/或催化结构域。融合蛋白任选通过接头序列连接至重组Bhe Man2多肽，所述接头序列将Bhe Man2多肽和融合结构域连接而不显著影响任一组分的性质。所述接头任选在功能上促进预期应用。

本发明提供被工程改造成表达本发明的一种或多种Bhe Man2多肽的宿主细胞。合适的宿主细胞包括任何微生物的细胞(例如，细菌、原生生物、藻类、真菌(例如，酵母或丝状真菌)或其他微生物的细胞)，并且优选为细菌、酵母或丝状真菌的细胞。

细菌菌属的合适宿主细胞包括但不限于埃希杆菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属的细胞。合适的细菌物种的细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解半纤维素芽孢杆菌、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和变铅青链霉菌。

合适的酵母属的宿主细胞包括但不限于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和法夫酵母属(Phaffia)的细胞。合适的酵母物种的细胞包括但不限于酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(P.canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的细胞。

丝状真菌的合适宿主细胞包括真菌亚门的全部丝状形式。丝状真菌属的合适细胞包括但不限于支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、棒囊壳属、毛壳菌属、隐球菌属、Filobasidium属、镰刀菌属、赤霉菌属、腐质霉属、巨座壳属、毛霉属、毁丝霉属、毛霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属、柱顶孢属、裂褶菌属、孢子丝菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属的细胞。

合适的丝状真菌物种的细胞包括但不限于泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、勒克瑙金孢子菌、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、Fusariumgraminearum、禾谷镰刀菌(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)、Fusarium negundi、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、网状镰刀菌(Fusarium reticulatum)、粉红色镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰刀菌(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、簇囊镰刀菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、Fusarium venenatum、烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)、间型脉孢菌(Neurospora intermedia)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、变灰青霉(Penicillium canescens)、离生青霉(Penicillium solitum)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉侧菌(Phlebia radiate)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、黄蓝状菌(Talaromyces flavus)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉和绿色木霉(Trichoderma viride)的细胞。

将核酸转化到这些生物体中的方法是本领域已知的。例如，转化曲霉属宿主细胞的合适程序描述于EP 238 023中。

在一些实施例中，将重组Bhe Man2多肽与信号肽融合以例如促进重组Bhe Man2多肽的胞外分泌。例如，在某些实施例中，信号肽为非天然的信号肽如SEQ ID NO：13的枯草芽孢杆菌AprE信号肽。在一些实施例中，Bhe Man2多肽在成熟形式与信号多肽之间具有Ala-Gly-Lys的N端延伸。在具体实施例中，重组Bhe Man2多肽作为分泌的多肽在异源生物体中表达。本文中的组合物和方法因此涵盖在异源生物体中表达Bhe Man2多肽作为分泌的多肽的方法。

本发明还提供了包含上述核酸的表达盒和/或载体。合适地，编码本发明的Bhe Man2多肽的核酸有效连接到启动子。启动子是本领域所熟知的。任何在宿主细胞内发挥功能的启动子均可用于表达本发明的β-甘露聚糖酶和/或任何其他核酸。可用于在各种宿主细胞中驱动本发明的β-甘露聚糖酶核酸和/或任何其他核酸的表达的起始控制区域或启动子数量繁多并且是本领域技术人员熟悉的(参见，例如WO 2004/033646及其中引用的参考文献)。事实上可以使用能够驱动这些核酸的任何启动子。

具体而言，在期望在丝状真菌宿主中进行重组表达的情况下，该启动子可以是丝状真菌启动子。核酸可以处于例如异源启动子的控制下。核酸还可以在组成型或诱导型启动子控制下表达。可使用的启动子的例子包括但不限于纤维素酶启动子、木聚糖酶启动子、1818启动子(此前通过对木霉属进行EST作图鉴定为高表达蛋白质)。例如，该启动子可以合适地为纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶启动子。尤其合适的启动子可以为例如里氏木霉纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶启动子。例如，该启动子是纤维二糖水解酶I(cbh1)启动子。启动子的非限制性例子包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、pki1、gpd1、xyn1或xyn2启动子。启动子的额外非限制性例子包括里氏木霉的cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、pki1、gpd1、xyn1或xyn2启动子。

编码本文的Bhe Man2多肽的核酸序列可包括在载体中。在一些方面，载体含有处于表达控制序列的控制下的编码Bhe Man2多肽的核酸序列。在一些方面，表达控制序列是天然表达控制序列。在一些方面，表达控制序列是非天然表达控制序列。在某些方面，载体含有选择标记或可选标记。在一些方面，将编码Bhe Man2多肽的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中而不具有可选标记。

合适的载体是与所采用的宿主细胞相容的那些。合适的载体可源自例如细菌、病毒(例如源自噬菌体的噬菌体T7或M-13)、粘粒、酵母或植物。合适的载体可以在宿主细胞中以低、中或高拷贝数维持。获得和使用这些载体的方案是本领域的技术人员已知的(参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆实验指南》)，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor)，1989)。

在一些方面，表达载体还包括终止序列。终止控制区域还可源自宿主细胞中天然存在的多种基因。在一些方面，终止序列和启动子序列源自相同来源。

编码Bhe Man2多肽的核酸序列可使用标准的技术掺入到载体如表达载体中(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆实验指南》)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor)，1982)。

在一些方面，可能想要以远高于天然存在的细胞中当前存在的水平来过量表达本方面中所述的Bhe Man2多肽和/或一种或多种任何其他核酸。在一些实施例中，可能想要以远低于天然存在的细胞中当前存在的水平来低表达(例如，突变、失活或缺失)本发明中所述的内源性β-甘露聚糖酶和/或一种或多种任何其他核酸。

B.编码Bhe Man2的多核苷酸

本文所描述的组合物和方法的另一方面是编码具有β-甘露聚糖酶活性的重组Bhe Man2多肽(包括其变体和片段)的多核苷酸或核酸序列。在一些实施例中，在用于引导Bhe Man2多肽在异源生物体(如本文指出的异源生物体)中表达的表达载体的情形中提供该多核苷酸。编码重组Bhe Man2多肽的多核苷酸可以有效连接至调控元件(例如启动子、终止子、增强子等)以帮助表达编码的多肽。

编码重组Bhe Man2多肽的多核苷酸序列的一个例子具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。类似的(包括实质上相同的)编码重组Bhe Man2多肽及变体的多核苷酸可存在于自然界中，例如存在于解半纤维素芽孢杆菌或者芽孢杆菌属的其他菌株或分离株中。鉴于遗传密码的简并性，应认识到具有不同核苷酸序列的多核苷酸可编码相同的Bhe Man2多肽、变体或片段。

在一些实施例中，编码重组Bhe Man2多肽的多核苷酸与该例示的编码Bhe Man2多肽的多核苷酸具有指定程度的氨基酸序列同一性，例如与SEQID NO：2的氨基酸序列或者与成熟序列SEQ ID NO：3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％序列同一性。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文中所述)通过氨基酸序列比对来测定。

在一些实施例中，编码重组Bhe Man2多肽的多核苷酸框内融合于用于引导重组Bhe Man2多肽的细胞外分泌的信号肽的编码序列之后(即下游)。如本文所述，术语“异源”当用来指代用于表达所关注的多肽的信号序列时，其意指该信号序列和所关注的多肽来源于不同的生物体。异源信号序列包括例如那些来自其他真菌纤维素酶基因的信号序列，例如里氏木霉CBH1的信号序列。可在适于表达重组Bhe Man2多肽或适于在将表达载体引入合适宿主细胞之前使表达载体增殖的异源宿主细胞中提供表达载体。

在一些实施例中，编码重组Bhe Man2多肽的多核苷酸与SEQ ID NO：1的多核苷酸(或其互补序列)在指定杂交条件下杂交。条件的例子是本文所述的中等严格性、高严格性和极高严格性条件。

Bhe Man2多核苷酸可为天然存在或合成的(即人造的)，并且可经过密码子优化以在不同宿主中表达、经过突变以引入克隆位点或以其他方式改变以增加功能性。

编码源自解半纤维素芽孢杆菌的Bhe Man2多肽的编码区的核酸序列如下(SEQ ID NO：1)，其中编码预测的信号肽序列的核酸序列以斜体表示：

GCTTTTATGTTGATGGCAATACGTTATATGACGCAAACGGGCAACCATTTGTCATGAGAGGTATTAACCATGGACATGCTTGGTATAAAGACACCGCTTCAACAGCTATTCCTGCCATTGCAGAGCAAGGCGCCAACACGATACGTATTGTTTTATCAGATGGCGGTCAATGGGAAAAAGACGACATTGACACCGTTCGTGAAGTTATTGAGCTTGCGGAGCAAAATAAAATGGTGGCTGTCGTTGAAGTTCATGATGCCACGGGCCGCGATTCGCGCAGTGATTTAAATCGAGCCGTTGATTATTGGATAGAAATGAAAGATGCGCTTATCGGTAAAGAAGATACGGTTATTATTAACATTGCAAACGAGTGGTATGGGAGTTGGGATGGCTCAGCTTGGGCCGATGGCTATATTGATGTCATTCCGAAGCTTCGCGATGCCGGCTTAACACACACCTTAATGGTTGATGCAGCAGGATGGGGGCAATATCCGCAATCTATTCATGATTACGGACAAGATGTGTTTAATGCAGATCCGTTAAAAAATACGATGTTCTCCATCCATATGTATGAGTATGCTGGTGGTGATGCTAACACTGTTAGATCAAATATTGATAGAGTCATAGATCAAGACCTTGCTCTCGTAATAGGTGAATTCGGTCATAGACATACTGATGGTGATGTTGATGAAGATACAATCCTTAGTTATTCTGAAGAAACTGGCACAGGGTGGCTCGCTTGGTCTTGGAAAGGCAACAGTACCGAATGGGACTATTTAGACCTTTCAGAAGACTGGGCTGGTCAACATTTAACTGATTGGGGGAATAGAATTGTCCACGGGGCCGATGGCTTACAGGAAACCTCCAAACCATCCACCGTATTTTCAGATGATAACGGTGGTAGCCCTGAACCGCCAACTGCTACTACCTTGTATGACTTTGAAGGAAGTACACAAGGTTGGCATGGAAGCAACGTAGCCGGTGGCCCTTGGTCCGTAACAGAGTGGGGTACTTCAGGTAACTACTCTTTAAAAGCCGATGTAAATTTAACCTCAAATTCTTCACATGAACTGTATAGTGAACAAAGTCGTAATCTACACGGATACTCTCAGCTCAACGCAACCGTTCGCCATGCCAATTGGGGAAATCACGGTAATGGCATGAATGCAAGACTTTACGTGAAAACGGGCTCTGATTATACATGGTATAGCGGTCCTTTTACACGTATCAATAGCTCCAACTCAGGTACAACGTTATCTTTTGATTTAAACAACATCGAAAATAGTCATCATGTTAGGGAAATAGGCGTGCAATTTTCAGCGGCAGATAATAGCAGCGGTCAAACTGCTCTATACGTTGATAATGTTACTTTAAGA

本领域普通技术人员公知，由于遗传密码的简并性，具有显著不同的序列的多核苷酸仍然可能编码相同的或者几乎相同的多肽。由此，本组合物和方法的各方面包括含有与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性，包括与SEQ ID NO：1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列的编码Bhe Man2多肽的多核苷酸或其衍生物。在一些实施例中，Bhe Man2多肽含有与SEQ ID NO：1相同的核酸序列。

在一些实施例中，多核苷酸可包括编码信号肽的序列。可适当地采用许多便利的信号序列。

C.从天然分离株纯化

Bhe Man2多肽可通过已知的和通常采用的方法从天然分离株(例如从解半纤维素芽孢杆菌的菌株)纯化。例如，可通过各种物理或者化学手段，如冷冻-解冻循环、超声波处理、机械破坏或者细胞裂解剂，来破坏含有Bhe Man2多肽的细胞。可收集细胞上清液(例如从分泌该蛋白到培养基中的细胞收集)。可通过常规技术从培养基和/或裂解物回收Bhe Man2多肽，所述常规技术包括通过离心、过滤从培养基分离细胞/碎片以及用盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或者过滤液中的蛋白质。然后可通过诸如以下的程序从破坏的细胞纯化Bhe Man2多肽：在离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；硅胶或阳离子交换树脂(例如DEAE)色谱法、色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75进行凝胶过滤；以及亲和色谱。可采用各种蛋白质纯化方法，这类方法是本领域知道的，在例如以下文献中有描述：Deutscher，Methods in Enzymology(《酶学方法》)，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(《蛋白质纯化：原理与实践》)，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约，(1982)。

D.化学合成

作为另一种选择，可通过使用固相技术进行直接肽合成，来产生BheMan2多肽序列或其部分(参见例如Stewart等人，Solid-Phase Peptide  Synthesis(《固相肽合成》)，W.H.Freeman Co.公司，美国加州三藩市(San Francisco，CA)，(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(《美国化学学会杂志》)，85：2149-2154(1963))。可使用手工技术或者通过自动化操作来进行体外蛋白质合成。自动合成可例如使用Applied Biosystems肽合成仪(美国加州福斯特城(Foster City，CA))遵循生产商说明书来完成。BheMan2多肽的各个部分可分别以化学法合成，并使用化学方法或者酶促方法进行组合以产生全长Bhe Man2。

E.重组制备方法

编码Bhe Man2多肽的DNA的分离

编码Bhe Man2多肽的DNA可获自从据信具有Bhe Man2 mRNA(例如解半纤维素芽孢杆菌)并以可检测的水平表达其的微生物制备的cDNA文库。该Bhe Man2编码基因还可获自基因组文库或者通过寡核苷酸合成获得。

可用被设计来鉴定所关注基因或其编码的蛋白质的探针(抗Bhe Man2的抗体或者至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定的探针筛选cDNA或者基因组文库可使用标准的程序来进行，如在以下文献中描述的：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室指南》)，(纽约：冷泉港实验室出版社，1989)。分离编码Bhe Man2的基因的备选手段是使用PCR方法(Sambrook等人，出处同 上；Dieffenbach等人，PCR Primer：A Laboratory Manual(《PCR引物：实验室手册》)，(冷泉港实验室出版社，1995))。

在已知的筛选cDNA文库的技术中，选择作为探针的寡核苷酸序列长度应足够长，并且足够明确以使假阳性减至最低。可将寡核苷酸进行标记，使得它在与被筛选的文库中的DNA杂交时被检测。标记方法是本领域公知的，包括使用放射性标记如³²p标记的ATP、生物素酰化或者酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高严格性条件，在以下文献中提供：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室指南》)，(纽约：冷泉港实验室出版社，1989)。

可通过使用本文第一次公开的推断的氨基酸序列筛选选定的cDNA或基因组文库，并且如果必要的话，使用常规的引物延伸程序(如在以下文献中所述的：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室指南》)，(纽约：冷泉港实验室出版社，1989)检测可能未曾被逆转录成cDNA的mRNA的前体和加工中间体，来获得具有蛋白质编码序列的核酸。

宿主细胞的选择和转化

可用本文所描述的用于产生Bhe Man2的表达载体或者克隆载体转染或者转化宿主细胞。将宿主细胞在常规的营养物培养基中进行培养，该培养基视所需而定进行修饰以便诱导启动子、选择转化株或者扩增编码期望的序列的基因。普通技术人员无需进行过多的实验就可以选择培养条件如培养基、温度、pH等。总体而言，用于使细胞培养物的生产率最大化的原理、方案和实用技术可在以下文献中找到：Mammalian Cell Biotechnology： a Practical Approach(《哺乳动物细胞生物技术：实用方法》)，M.Butler编辑(IRL出版社，1991)；以及Sambrook等人，Molecular Cloning：A  Laboratory Manual(《分子克隆：实验室指南》)，(纽约：冷泉港实验室出版社，1989)。

转染方法是普通技术人员已知的，例如，CaPO₄和电穿孔。取决于所使用的宿主细胞，可使用适于这种细胞的标准技术来进行转化。采用氯化钙的钙处理法(如以下文献中描述的：Sambrook等人，Molecular Cloning： A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室指南》，纽约：冷泉港实验室出版社，1989)或者电穿孔法通常用于原核细胞或者其他具有实质的细胞壁屏障的细胞。使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染来转化某些植物细胞，如在以下文献和专利中描述的：Shaw等人，Gene(《基因》)，23：315，(1983)；1989年6月29日公布的WO 89/05859。对于转化到酵母中，可根据以下文献的方法来进行：Van Solingen等人，J.Bact.(《细菌学杂志》)，130：946，(1977)；以及Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(《美国国家科学院院刊》)，76：3829，(1979)。但是，也可使用其他的将DNA引入细胞中的方法，如细胞核显微注射、电穿孔、微穿孔(microporation)、生物射弹轰击、与完整细胞的细菌原生质体融合、或者聚阳离子例如聚凝胺(polybrene)、聚鸟氨酸。

适于克隆或者表达本文的载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物细胞、酵母细胞或者丝状真菌细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或者革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株可公开获得，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC 53,635)。除了原核微生物，真核微生物如丝状真菌或者酵母也是编码Bhe Man2多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿主。酿酒酵母是常用的低等真核宿主微生物。

在一些实施例中，要转化的微生物包括源自木霉属或者曲霉属的菌株。示例性的菌株包括里氏木霉(其可用于获得过量表达的蛋白质)或者黑曲霉泡盛变体(Aspergillus niger var.awamori)。例如，木霉菌株RL-P37(描述于Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology(《应用微生物学与生物技术》)，20(1984)，第46-53页)已知分泌很高的量的纤维素酶。RL-P37的功能对等物包括里氏木霉(长梗木霉)菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)。另一个例子包括过量生产性突变株，如描述于Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnology(《应用微生物学与生物技术》)，39：738-743(1993)中。例如，设想到，这些菌株还将可用于过量表达解半纤维素芽孢杆菌Bhe Man2多肽或其变体。适当的宿主细胞的选择被认为在本领域的技能范围内。

可复制载体的制备和使用

制备编码Bhe Man2蛋白或其衍生物的DNA(如上所描述)以供插入到适当的微生物中。根据本组合物和方法，编码Bhe Man2多肽的DNA包括所有为编码具有功能性Bhe Man2活性的蛋白质所必需的DNA。由此，本组合物和方法的实施例包括编码源自芽孢杆菌(包括解半纤维素芽孢杆菌)的Bhe Man2多肽的DNA。

编码Bhe Man2的DNA可通过构建携带该编码Bhe Man2的DNA的表达载体来制备。携带所插入的编码Bhe Man2的DNA片段的表达载体，可以是任何能够在给定宿主生物中自主复制或能够整合进宿主的DNA中的载体，通常是质粒、粘粒、病毒颗粒或者噬菌体。各种载体是可公开获得的。还设想到可将编码Bhe Man2的DNA的一个以上的拷贝重组到菌株中以有利于过量表达。

在某些实施例中，用于表达Bhe Man2的DNA序列包括启动子、基因编码区和终止子序列，它们都来源于要表达的天然基因。可通过缺失掉不需要的DNA序列(例如编码不想要的结构域的DNA序列)以留下待在其天然的转录和翻译调控序列控制下表达的结构域，来获得基因截短。选择性标记也可存在于载体上，以便对多个拷贝的Bhe Man2基因序列在宿主中的整合情况进行选择。

在其他实施例中，表达载体是预装配的，并且含有高水平转录所必需的序列，并且在一些情况下含有可选标记。设想到，可将基因或其部分的编码区插入到这个通用表达载体中，使得它处于该表达盒的启动子和终止子序列的转录控制下。例如，pTEX是这种通用表达载体。基因或其部分可插入在强cbh1启动子的下游。

在该载体中，应该使编码本组合物和方法的Bhe Man2的DNA序列有效连接至转录和翻译序列，例如，与结构基因同阅读框的合适启动子序列和信号序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。信号肽提供Bhe Man2或其衍生物的胞外产生(分泌)。编码信号序列的DNA可以是与待表达的基因天然相关联的DNA。但是，本组合物和方法中设想到来自任何合适来源的信号序列，例如来自木霉的外切纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶，来自细菌物种的木聚糖酶，例如来自天蓝色链霉菌等。

可通过多种程序将适当的核酸序列插入到载体中。通常，使用本领域知道的技术将DNA插入到适当的限制性内切核酸酶位点中。载体组分通常包括但不限于信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列中的一者或多者。含有这些组分中的一者或多者的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。

所期望的Bhe Man2多肽不仅直接重组产生，而且还作为与异源多肽的融合多肽产生，该异源多肽可为信号序列或者在成熟蛋白或多肽的N端具有特异性切割位点的其他多肽。通常，信号序列可为载体的组分，或者它可为被插入到载体中的Bhe Man2编码DNA的一部分。信号序列可为选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或者热稳定肠毒素II前导序列的原核生物信号序列。对于酵母分泌而言，信号序列可为例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α因子前导序列，后者描述于美国专利No.5,010,182中)或者酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公布的EP 362,179)、或者1990年11月15日公布的WO 90/13646中描述的信号。

表达载体和克隆载体都可含有使得载体能够在一种或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。对于多种细菌、酵母和病毒这种序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数的革兰氏阴性细菌，而2μ质粒起点适合于酵母。

表达载体和克隆载体将通常含有选择基因，也称为可选标记。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予针对抗生素或者其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨喋呤或者四环素的抗性的蛋白质，(b)补足营养缺陷的蛋白质，或者(c)供应不能从复合培养基获得的关键营养物的蛋白质，例如对于芽孢杆菌来说是编码D-丙氨酸消旋酶的基因。适用于酵母的选择基因是酵母质粒YRp7中存在的trp1基因(Stinchcomb等人，Nature(《自然》)，282：39(1979)；Kingsman等人，Gene(《基因》)，7：141(1979)；Tschemper等人，Gene(《基因》)，10：157(1980))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株(例如ATCC No.44076或PEP4-1)提供选择标志(Jones，Genetics(《遗传学》)，85：12(1977))。用于木霉的示例性选择基因是pyr4基因。

表达载体和克隆载体通常含有与Bhe Man2编码核酸序列有效连接的启动子。该启动子指导mRNA合成。被多种潜在的宿主细胞识别的启动子是公知的。启动子包括真菌启动子序列，例如cbh1或egl1基因的启动子。

适用于原核生物宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等人，Nature(《自然》)，275：615(1978)；Goeddel等人，Nature(《自然》)，281：544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)，8：4057(1980)；EP36,776)，和杂合启动子如tac启动子(deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(《美国国家科学院院刊》)，80：21-25(1983))。另外的启动子，例如来自黑曲霉的A4启动子，也可用于细菌表达系统，例如用于变铅青链霉菌。用于细菌系统的启动子还可含有与编码Bhe Man2多肽的DNA有效连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)，255：2073(1980))或者其他糖酵解酶(Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.(《酶调节进展杂志》)，7：149(1968)；Holland，Biochemistry(《生物化学》)，17：4900(1978))如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。其他酵母启动子(其为诱导型启动子，具有转录受生长条件控制的额外优点)是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子在EP 73,657中有进一步的描述。

用于真核生物宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物)的表达载体将含有转录的终止和稳定化mRNA所必需的序列。这种序列通常从真核生物或者病毒DNA或者cDNA的5′非翻译区(有时是3′非翻译区)获得。这些区域含有作为编码Bhe Man2多肽的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。

Bhe Man2多肽的纯化

各种形式的Bhe Man2多肽(或者Bhe Man2多肽衍生物)可通过上文描述的用于从天然分离株进行分离和纯化的方法从培养基或者从宿主细胞裂解物回收。取决于所采用的宿主细胞和重组酶中的任何变体结构，可使用另外的技术。例如，如果重组酶是膜结合的，可使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或者通过酶促裂解将其从膜释放。重组酶的纯化还可采用A蛋白Sepharose柱来移除污染物如IgG和采用金属螯合柱来结合BheMan2多肽的表位标签形式。所选择的纯化步骤将取决于例如所使用的生产过程的性质、所产生的具体Bhe Man2多肽以及重组酶的任何变体结构。也可采用针对Bhe Man2多肽或其上的表位标签的抗体来纯化该蛋白，例如连接到固相载体的抗Bhe Man2抗体。

4.Bhe Man2的衍生物

如上所描述，除了本文中描述的Bhe Man2的天然序列(例如以全长SEQ ID NO：2和以成熟形式SEQ ID NO：3示出)之外，还设想到可制备具有变更的氨基酸序列的Bhe Man2衍生物。通常，Bhe Man2衍生物将能够与天然Bhe Man2多肽一样赋予纤维素酶和/或半纤维素酶混合物或组合物以下的一者或多者：改善的水解木质纤维素生物质底物(特别是含有甘露聚糖的木质纤维素生物质底物)的能力，和改善的降低生物质底物混合物(特别是高固形物水平的生物质底物混合物)的粘度的能力。可制备这种衍生物以例如改善在特定宿主中的表达、改善分泌(例如通过变更信号序列)、引入表位标签或其他可促进Bhe Man2多肽的纯化和/或分离的序列。在一些实施例中，与天然Bhe Man2多肽相比，衍生物可赋予纤维素酶和/或半纤维素酶混合物或组合物更大的水解木质纤维素生物质底物的能力。在一些实施例中，与天然Bhe Man2多肽相比，衍生物可赋予纤维素酶和/或半纤维素酶混合物更大的粘度降低有益效果(例如粘度降低的改善或者甚至更高的速度和/或程度)。

可通过将适当的核苷酸变化引入到编码Bhe Man2的DNA中，或者通过合成期望的Bhe Man2多肽，来制备Bhe Man2多肽衍生物。本领域技术人员将认识到，氨基酸变化可改变Bhe Man2多肽的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。

天然序列Bhe Man2多肽的衍生物或者本文描述的Bhe Man2的各种结构域的衍生物，可例如使用例如在美国专利No.5,364,934中给出的任何关于保守和非保守突变的技术和指南来制备。序列变化可以是编码Bhe Man2多肽的一个或多个密码子的置换、缺失或插入，该置换、缺失或者插入导致Bhe Man2多肽的氨基酸序列与天然序列Bhe Man2多肽相比出现变化。任选地，序列变化是Bhe Man2多肽的一个或多个结构域中至少一个氨基酸用任何其他氨基酸置换。

可通过将Bhe Man2β-甘露聚糖酶多肽的序列与同源的已知蛋白质分子的序列进行比较并使高度同源性区域中作出的氨基酸序列变化的数目减至最低，可得到关于确定哪个氨基酸残基可被插入、置换或缺失而不会不利地影响期望的Bhe Man2β-甘露聚糖酶活性的指导。氨基酸置换可以是将一个氨基酸用另一个具有类似结构性质和/或化学性质的氨基酸代替，例如将亮氨酸用丝氨酸代替的结果，即保守氨基酸代替。插入或者缺失可任选在1至5个氨基酸的范围内。可通过系统性地对序列中的氨基酸作出插入、缺失或者置换，并使用本领域已知的技术测试所得的衍生物的功能活性，来确定所容许的变化。

可使用本领域知道的方法，如寡核苷酸介导的诱变(定点诱变)、丙氨酸扫描和PCR诱变，来作出序列变化。可在克隆的DNA上进行定点诱变(Carter等人，Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)，13：4331(1986)；Zoller等人，Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)，10：6487(1987))、盒诱变(cassette mutagenesis)(Wells等人，Gene(《基因》)，34：315(1985))、限制选择诱变(restriction selection mutagenesis)(Wells等人，Philos.Trans.R. Soc.London SerA(《伦敦皇家哲学汇刊A系列》)，317：415(1986))或者其他已知的技术，以产生具有变体序列的编码Bhe Man2的DNA。

也可采用扫描氨基酸分析来鉴定连续序列上的一个或多个氨基酸。可采用的扫描氨基酸是相对较小的中性氨基酸。这类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。在这一组中，常常使用丙氨酸作为扫描氨基酸，因为它排除超过β碳的侧链并且不太可能改变衍生物的主链构象。丙氨酸还因为它是最普通的氨基酸而常常被使用。此外，它常见于包埋的位置和暴露的位置二者中(Creighton，The Proteins(《蛋白质》)，W.H.Freeman & Co.公司，纽约)；Chothia，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，150：1(1976))。如果丙氨酸置换不产生足够数量的衍生物，则可使用等构的氨基酸。

5.抗Bhe Man2抗体

本组合物和方法还提供抗Bhe Man2抗体。示例性的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，包括嵌合抗体和人源化抗体。

本组合物和方法的抗Bhe Man2抗体可包括多克隆抗体。可采用任何便利的用于产生和制备多克隆抗体和/或单克隆抗体的方法，多种这类方法是本领域普通技术人员已知的。

抗Bhe Man2抗体还可使用重组DNA方法来生成，如美国专利No.4,816,567中描述的那些方法。

抗体可以是单价抗体，其可通过重组方法或者通过消化抗体以产生其片段(特别是Fab片段)来生成。

D.细胞培养基

一般来讲，将微生物在适用于产生本文所述的Bhe Man2多肽的细胞培养基中培养。培养使用本领域已知的步骤和变型形式在合适的营养培养基中进行，所述培养基包含碳源和氮源及无机盐。适于生长和纤维素酶产生的培养基、温度范围和其他条件是本领域已知的。作为非限制性例子，通过里氏木霉制备纤维素酶的典型温度范围为24℃至37℃，例如，介于25℃与30℃之间。

a.细胞培养条件

适于真菌培养物的维持和生长的材料和方法是本领域所熟知的。在某些方面，将细胞在容许由插入宿主细胞内的核酸所编码的一种或多种β-甘露聚糖酶多肽的表达的条件下在培养基中培养。可以使用标准的细胞培养条件来培养细胞。在某些方面，将细胞在合适的温度、气体混合物和pH下培养和维持。在某些方面，在合适的细胞培养基中培养细胞。

6.包含重组β-甘露聚糖酶Bhe Man2多肽的组合物

本发明提供工程改造的酶组合物(例如，纤维素酶组合物)或富含重组Bhe Man2多肽的发酵液。在某些方面，该组合物是纤维素酶组合物。该纤维素酶组合物可以是，例如，丝状真菌纤维素酶组合物，如木霉纤维素酶组合物。在一些实施例中，纤维素酶组合物可以是来源于不同的微生物的各种纤维素酶的掺混物或物理混合物；或者它可以是共表达纤维素酶基因的单一工程改造微生物的培养液；或者它可以是一种或多种单独/分别获得的纤维素酶与共表达一种或多种纤维素酶基因的工程改造微生物的培养液混合物的掺混物。

在某些方面，该组合物是包含编码一种或多种纤维素酶多肽的一种或多种核酸的细胞。在某些方面，该组合物是包含纤维素酶活性的发酵液，其中所述发酵液能够将生物质样品中存在的超过约50重量％的纤维素转化成糖。本文所用的术语“发酵液”和“全发酵液”是指通过工程化微生物的发酵制备的酶制剂，该酶制剂在发酵之后不经历或经历最小限度的回收和/或纯化。发酵液可为丝状真菌的发酵液，例如，木霉属、腐质霉属、镰刀菌属、曲霉属、脉孢菌属、青霉属、头孢霉属(Cephalosporium)、绵霉属(Achlya)、柄孢壳菌属(Podospora)、内座壳属(Endothia)、毛霉属、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、梨孢属(Pyricularia)、毁丝霉属或金孢子菌属发酵液。具体地讲，发酵液可以是例如木霉如里氏木霉或者青霉如绳状青霉菌中的一者。发酵液还可以合适地是无细胞发酵液。在一个方面，本发明的纤维素酶、细胞或发酵液组合物中的任一者还可以包含一种或多种半纤维素酶。

在一些方面，在里氏木霉或其经工程改造的菌株中表达全发酵液组合物。在一些方面，在里氏木霉的整合菌株中表达全发酵液，在该整合菌株中，包括Bhe Man2多肽在内的多种纤维素酶已被整合到里氏木霉宿主细胞的基因组中。在一些方面，在整合型里氏木霉菌株中表达的多肽的一种或多种组分已被缺失。

在一些方面，该全发酵液组合物在黑曲霉或其经工程改造的菌株中表达。

作为另一种选择，重组Bhe Man2多肽可在胞内表达。任选地，在酶变体在细胞内表达或利用诸如上述那些的信号序列分泌到周质间隙后，可采用透化或裂解步骤使重组Bhe Man2多肽释放到上清液中。膜屏障的破坏通过使用机械手段如超声波、加压处理(弗氏压碎器(French press))、空化或通过使用膜消化酶如溶菌酶或酶混合物而实现。

在一些方面，使用合适的无细胞表达系统表达编码重组Bhe Man2多肽的多核苷酸。在无细胞系统中，通常将所关注的多核苷酸在启动子帮助下转录，但任选进行连接以形成环状表达载体。在一些实施例中，以外源方式添加或生成RNA而不进行转录，然后在无细胞系统中翻译。

7.使用Bhe Man2多肽水解木质纤维素生物质底物

在一些方面，本文提供用于将木质纤维素生物质转化为糖的方法，该方法包括使生物质底物与本文公开的组合物接触，所述组合物包含能有效地将生物质底物转化成可发酵糖的量的Bhe Man2多肽。合适地，生物质底物包含GGM和/或GM。在某些实施例中，合适的生物质底物可含有高达约2重量％或更多、约3重量％或更多、约4重量％或更多、约5重量％或更多(等等)的GGM和/或GM。

在一些方面，该方法还包括用酸和/或碱和/或机械手段或其他物理手段预处理生物质。在一些方面，酸包括磷酸。在某些方面，碱包括氢氧化钠或氨。在一些方面，机械手段可包括例如牵拉、挤压、压碎、研磨，以及将木质纤维素生物质物理地分解成更小的物理形式的其他手段。其他物理手段还可包括例如使用蒸汽或其他加压烟气或蒸气“解开”木质纤维素生物质以便增加酶对纤维素和半纤维素的可及性。在某些实施例中，预处理方法还可涉及能够分解木质纤维素生物质底物中的木质素的酶，从而使得生物质水解酶组合物中的酶对生物质的纤维素和半纤维素的可及性增加。

生物质：本发明提供使用包含Bhe Man2多肽的本发明酶组合物进行生物质糖化的方法和过程。如本文所用，术语“生物质”是指包含纤维素和/或半纤维素的任何组合物(任选还有木质纤维素生物质中的木质素)。特别合适的是包含明显的量的半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的木质纤维素生物质材料。这种生物质材料可包括例如：KRAFT碱性预处理工业未漂白软木浆FPP-27，其可从法国国家科研署(Agence Nationale de laRecherche)获得，含有约6.5重量％甘露聚糖；SPORL预处理软木(Zhu J.Y.等人，(2010)，Appl.Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物学和生物技术》)，86(5)：1355-65；Tian S.等人，(2010)，Bioresour.Technol.(《生物资源技术》)，101：8678-85)，其含有约4.5重量％甘露聚糖；云杉，其可含有10重量％以上的甘露聚糖。如本文所用，生物质包括但不限于某些软木树木如云杉树、松树、白杨树及源自它们的废料、种子、谷粒、块茎、植物废料(例如，棕榈树空果串，或者棕榈纤维废料)或者食品加工或工业加工的副产物(例如茎秆)、玉米(包括例如玉米芯、秸秆等)、草料(包括例如印度草如黄假高粱(Sorghastrum nutans)；或者柳枝稷草(例如黍属(Panicum)物种，如柳枝稷(Panicum virgatum))、多年生藤条(例如芦竹)、木材(包括例如木屑、加工废料)、纸材、纸浆和回收纸(包括例如报纸、打印纸等等)。其他生物质包括但不限于马铃薯、大豆(例如油菜籽)、大麦、黑麦、燕麦、小麦、甜菜和甘蔗渣。

本发明因而提供糖化方法，该方法包括使包含生物质材料(例如包含木聚糖、半纤维素以及尤其是半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)、纤维素和/或可发酵糖的材料)的组合物与本发明的Bhe Man2多肽，或本发明的核酸或多核苷酸编码的Bhe Man2多肽，或本发明的任何一种包含Bhe Man2多肽的非天然纤维素酶和/或半纤维素酶组合物或制造产物接触。

糖化的生物质(例如由本发明的酶加工的木质纤维素材料)可以通过，诸如微生物发酵和/或化学合成之类的过程制成众多基于生物的产品。如本文所用，“微生物发酵”是指在合适的条件下培养和收获发酵微生物的过程。发酵微生物可以是适用于供产生基于生物的产品的所需发酵过程的任何微生物。合适的发酵微生物包括但不限于丝状真菌、酵母和细菌。通过发酵和/或化学合成，可例如将经糖化的生物质制成燃料(例如，生物燃料，如生物乙醇、生物丁醇、生物甲醇、生物丙醇、生物柴油、喷气燃料等)。通过发酵和/或化学合成，还可例如将经糖化的生物质制成日用化学品(例如，抗坏血酸、异戊二烯、1，3-丙二醇)、脂质、氨基酸、多肽和酶。

预处理：在进行糖化或酶促水解和/或对从糖化获得的可发酵糖进行发酵之前，生物质(例如木质纤维素材料)优选经受一个或多个预处理步骤以使得木聚糖、半纤维素、纤维素和/或木质素材料对于酶组合物(例如，包含Bhe Man2多肽的本发明酶组合物)中的酶更可触及或更敏感，并且因此更易于被酶和/或酶组合物水解。

在一些方面，合适的预处理方法可涉及在反应器中对生物质材料使用包含强酸和金属盐的稀溶液的催化剂。该生物质可以是例如原材料或干燥材料。这种预处理可以降低纤维素水解的活化能或温度，最终使可发酵糖产率更高。参见例如美国专利No.6,660,506；6,423,145。

在一些方面，合适的预处理方法可涉及使生物质材料在含水介质中在所选择的温度和压力下经历第一水解步骤，以便主要实现半纤维素的解聚，而不实现纤维素显著解聚为葡萄糖。这个步骤产生浆液，在所述浆液中液态水相含有因半纤维素解产生的溶解单糖，以及含有纤维素和木质素的固相。随后该浆液在允许主要部分的纤维素解聚的条件下经历第二水解步骤，产生含有纤维素的溶解/可溶解解聚产物的液态水相。参见例如美国专利No.5,536,325。

在其他方面，合适的预处理方法可涉及使用约0.4％至约2％的强酸，通过一个或多个阶段的稀酸水解来处理生物质材料；随后使用碱性脱木质法处理酸水解材料的未反应固态木质纤维素成分。参见例如美国专利No.6,409,841。

在其他方面，合适的预处理方法可涉及在预水解反应器中预水解生物质(例如，木质纤维素材料)；将酸性液体添加至固态木质纤维素材料以制得混合物；将该混合物加热至反应温度；维持反应温度一段时间，所述时间足够使木质纤维素材料分解成溶解部分和固体级分，所述溶解部分含有至少约20％来自木质纤维素材料的木质素，所述固体级分含有纤维素；将溶解的部分与固体级分分离，并且在反应温度或接近反应温度移出溶解部分；以及回收溶解部分。固体级分中的纤维素变得更易于进行酶消化。参见例如美国专利No.5,705,369。在这个方面的变型形式中，作为另一种选择或者进一步地，预水解可涉及使用例如能够分解木质纤维素生物质材料中的木质素的酶来进行预水解。

在其他方面，合适的预处理可涉及过氧化氢H₂O₂的使用。参见Gould，1984，Biotech，and Bioengr.(《生物技术与生物工程》)，26：46-52。

在另外的方面，木质纤维素生物质材料尤其是那些包含明显的量的半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的木质纤维素生物质材料的合适预处理可包括例如法国国家科研署所采用的KRAFT碱性预处理方法。KRAFT预处理方法是公知的和广泛使用的将木材转化为木浆的方法，通常包括用氢氧化钠和硫化钠的混合物(行业内称为“白液”)处理木片，白液能分解将木质素与纤维素连接的键。这是沿用已久的方法，主要用于造纸和纸浆行业，最初由Carl F.Dahl在1879年发明，在1884年授权的美国专利296,935中有描述。还包括美国农业部开发的SPORL预处理方法，该方法专门用于某些软木生物质原料，例如用于松树、云杉树和白杨树材料，如描述于：Zhu等人，(2009)，Bioresource Technol.(《生物资源技术》)，100：2411-18。SPORL预处理方法涉及使用亚硫酸盐在酸性条件下处理这种软木，然后使用圆盘精制(disk refining)来物理性降低尺寸。SPORL方法据报道产生减少的量的发酵抑制剂如羟甲基糠醛和/或糠醛。

在其他方面，预处理还可以包括使生物质材料与化学计量的极低浓度氢氧化钠和氢氧化铵接触。参见Teixeira等人，(1999)，Appl.Biochem.andBiotech.(《应用生物化学与生物技术》)，77-79：19-34。

在一些实施例中，预处理可包括使木质纤维素在约9至约14的pH下在适当温度、压力和pH下接触化学品(例如碱，如碳酸钠或氢氧化钾)。参见已公布的国际申请WO2004/081185。氨用于例如优选的预处理方法。这种预处理方法包括在高固形物含量的条件下使生物质与低浓度的氨接触。参见例如美国专利公布No.20070031918和已公布的国际申请WO06110901。

A.糖化过程

在一些方面，本文提供糖化方法，其包括用包含多肽的酶组合物处理木质纤维素生物质材料，尤其是包含明显的量的半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的木质纤维素生物质材料，其中该多肽具有β-甘露聚糖酶活性并且其中该方法导致该生物质向可发酵糖的转化率达至少约50重量％(例如至少约55重量％、60重量％、65重量％、70重量％、75重量％或80重量％)。在某些方面，该生物质包含木质素。在某些方面，该生物质包含纤维素。在一些方面，该生物质包含半纤维素。在一些方面，包含纤维素的生物质还包含甘露聚糖、木聚糖、半乳聚糖和/或阿拉伯聚糖中的一者或多者。在某些具体的方面，该生物质包含纤维素及至少明显的水平的半乳葡甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。在一些方面，生物质可以是但不限于软木植物(例如松树、云杉树、白杨树)、种子、谷粒、块茎、植物废料(例如棕榈树空果串或棕榈纤维废料)或食品加工或工业加工的副产物(例如茎秆)、玉米(包括例如，玉米芯、秸秆等等)、草料(包括例如印度草如黄假高粱；或柳枝稷草，例如稷属，如柳枝稷)、多年生藤条(例如芦竹)、木材(包括例如木屑、加工废料)、纸、纸浆和回收纸(包括例如报纸、打印纸等)、马铃薯、大豆(例如油菜籽)、大麦、黑麦、燕麦、小麦、甜菜和甘蔗渣。

在一些方面，使包含生物质的材料经历一个或多个预处理方法/步骤，然后再用Bhe Man2多肽或包含Bhe Man2多肽的组合物处理。在一些方面，糖化或者酶促水解还包括用包含本发明的Bhe Man2多肽的酶组合物处理生物质。该酶组合物除了包含Bhe Man2多肽以外，还可例如包含一种或多种纤维素酶，例如一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶和/或一种或多种β-葡糖苷酶。作为另一种选择，该酶组合物可包含一种或多种其他半纤维素酶，例如一种或多种其他β-甘露聚糖酶、一种或多种木聚糖酶、一种或多种β-木糖苷酶和/或一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。在某些实施例中，该酶组合物包含本发明的Bhe Man2多肽、一种或多种纤维素酶、一种或多种其他半纤维素酶。在一些实施例中，该酶组合物是发酵液组合物，任选经历一定的生产/发酵后加工。在某些实施例中，该酶组合物是全发酵液制剂。

在一些方面，提供一种糖化方法，该方法包括用包含多肽的组合物处理木质纤维素生物质材料，其中该多肽与SEQ ID NO：2或者与成熟序列SEQ ID NO：3具有至少约70％(例如至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，并且其中该方法导致生物质向可发酵糖的转化率达到至少约50重量％(例如至少约55重量％、60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％或90重量％)。在一些方面，木质纤维素生物质材料已经历如本文所述的一种或多种预处理方法/一个或多个预处理步骤。

根据前面的描述和以下的实例，本发明组合物和方法的其他方面和实施例将显而易见。

实例

提出以下实例以给本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本组合物和方法的完整公开内容和描述，这些实例无意于限制本发明人认为是他们的发明组合物和方法的范围，也无意于表现以下的实验是所进行的全部或者唯一实验。已努力确保所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑到会有一些实验误差和偏差。

实例1

解半纤维素芽孢杆菌糖基水解酶Bhe Man2的克隆

将解半纤维素芽孢杆菌选择作为可用于工业应用的各种糖基水解酶和其他酶类的潜在来源。通过首先将解半纤维素芽孢杆菌的菌株在LB琼脂平板上于37℃培养24小时，获得用于测序的基因组DNA。从平板刮取细胞材料并使用苯酚/氯仿提取法制备基因组DNA。将基因组DNA用于测序以及用于扩增供表达克隆的bhe Man2基因。将解半纤维素芽孢杆菌的整个基因组用边合成边测序(SBS)技术(www.baseclear.com/sequencing/illumina-sequencing/)进行测序。通过BaseClear(荷兰莱顿公司(Leiden，The Netherlands))进行基因组测序和序列数据的组装。通过BioXpr(比利时那慕尔公司(Namur，Belgium))对重叠群(Contig)进行注释。采用通过BLASTP进行的与来自细菌的其他甘露聚糖酶的同源性比对，鉴定bhe Man2基因的核酸序列。

该基因bhe Man2的核酸序列以SEQ ID NO：1列出。bhe Man2基因编码的蛋白质的氨基酸序列以SEQ ID NO：2列出。在N端，该蛋白质据预测具有长度为32个氨基酸的信号肽，这由设定至SignalP-NN系统的Signal P3.0程序(www.cbs.dtu/services/SignalP)确定(Emanuelsson等人，NatureProtocols(《自然实验室指南》)，2：953-971，2007)。信号序列的存在提示Bhe Man2是分泌性糖基水解酶。

实例2

解半纤维素芽孢杆菌Bhe Man2在枯草芽孢杆菌宿主中的表达

使用以下引物通过PCR从解半纤维素芽孢杆菌基因组DNA扩增BheMan2基因：

引物1(BssHII)5’-TGAGCGCGCA GGCTGCTGGA AAAAGTTCAGGCTTTTATGT TGATGG-3’(SEQ ID NO：7)

引物2(BamHI)5’-CGCGGATCCT TATCTTAAAG TAACATTATCAACGTATAG-3’(SEQ ID NO：8)

正向引物含有aprE信号序列的一部分和成熟Bhe Man2链的起始序列。反向引物含有该基因序列的末端、终止密码子、BamHI位点和3个附加的保护性密码子。通过BssHII/BamHI双重消化和连接将这个扩增的bheMan2基因克隆到表达质粒p2JM中。用限制性内切酶BssHII和BamHI消化枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz，Protein Expr Purif(《蛋白质表达与纯化》)，55：40-52，2007)。将该DNA片段连接到PCR扩增的编码bhe Man2成熟蛋白的基因，导致在枯草芽孢杆菌AprE前肽的3’端和bhe Man2基因的5’端之间添加三个密码子Ala-Gly-Lys。所得的质粒标示为pML356(aprE-BhcnmanA)。在宿主中进行信号肽酶切割后，以该方式产生的重组Bhe Man2多肽将在其氨基末端具有3个附加的氨基酸Ala-Gly-Lys。

通过DNA测序确认从pML356表达的bhe Man2基因的序列(SEQ IDNO：9)。从质粒pML356表达的Bhe Man2多肽的氨基酸序列示为SEQ IDNO：10，其中信号序列以斜体示出，三个附加的残基以粗体示出。从pML356表达的Bhe Man3成熟多肽的氨基酸序列示为SEQ ID NO：11，其中基于预测的切割位点的三残基氨基末端延伸以粗体示出。在切割了末端突出端残基后，成熟Bhe Man2多肽具有SEQ ID NO：12的序列。

如上所述在枯草芽孢杆菌宿主细胞中产生Bhe Man2多肽，并在表达完成后分泌到胞外培养基中。因此，将表达培养基进行过滤和浓缩，并用于蛋白质纯化。

实例3

从枯草芽孢杆菌的培养基纯化β-甘露聚糖酶Bhe Man2

首先将硫酸铵加到浓缩的上清液至1.0M的最终浓度。然后使用三根不同的色谱柱从经过滤和浓缩的培养基上清液纯化Bhe Man2：(1)20mL苯基Sepharose Fast Flow柱，该柱用含有1M硫酸铵的20mM Tris-HCL缓冲液pH 8.0预平衡，用在20mM Tris-HCL缓冲液pH 8.0中的1M至0M硫酸铵的线性盐梯度洗脱；(2)收集柱(1)的洗脱液中的活性级分并脱盐至20mMTris-HCl缓冲液pH 8.0中，然后上样到20mL Q sepharose Fast Flow柱上，该柱用20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0预平衡，用上样缓冲液中的0至0.5MNaCl的线性盐梯度洗脱；和(3)收集柱(2)的洗脱液中的活性级分，加入硫酸铵到这些收集的级分至1M的最终浓度，然后将收集的级分过滤并施加到20mL苯基Sepharose Fast Flow柱，该柱用含有1M硫酸铵的20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0预平衡，然后用20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0中的1M至0M硫酸铵的线性盐梯度进行洗脱。

使用SDS-PAGE测定该多肽的纯度，并使用Bhe Man2多肽的预测分子量(其具有464个氨基酸残基和约51kDa的估计分子量)来确认该BheMan2多肽的身份。使用该纯化的Bhe Man2多肽来进行以下的pH曲线、温度曲线和热稳定性曲线研究。

实例4

解半纤维素芽孢杆菌β-甘露聚糖酶Bhe Man2在里氏木霉宿主中的表 达

可使用PCR从解半纤维素芽孢杆菌基因组DNA扩增Bhe Man2基因，其中天然信号序列和CACC序列添加到正向引物的5’端以进行定向Gateway克隆(美国加州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))。作为另一种选择，可以采用里氏木霉cbhI信号序列替代天然信号序列。bhe Man2基因的PCR产物可用Qiaquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))进行纯化。然后可将纯化的PCR产物克隆到pENTR/D-TOPO载体中，转化进OneTOP10化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司)中，然后涂板于含有50ppm卡那霉素的LA平板上。然后可使用QIAspin质粒制备试剂盒(凯杰公司)从大肠杆菌转化株获得质粒DNA。

然后可使用公知的测序方法，确认插入的DNA的核苷酸序列为SEQID NO：1。然后可使用LR反应(参见英杰公司的方案)，将包含经确认的bhe Man2基因序列的pENTR/D-TOPO_Bhe Man2载体与表达载体pTrex3gM(参见例如国际公布的专利申请WO 05/001036，图2)重组。

然后可将LR反应的产物(即，载体pTrex3gM_Bhe Man2)转化进大肠杆菌OneTOP10化学感受态细胞(英杰公司)中，并涂板于含有50ppm羧苄青霉素的LA培养基上。pTrex3gM载体还含有塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)amdS基因(其编码乙酰胺酶)作为里氏木霉转化的可选标记。pTrex3gM载体还含有位于bhe Man2序列的旁侧的cbhI启动子和终止子。

然后，可将约0.5至1μg的表达载体pTrex3gM_Bhe Man2(或者通过PCR扩增的片段)，采用PEG-原生质体方法(按本文所描述修改)用于转化缺失了主要纤维素酶基因的里氏木霉菌株，例如六重缺失菌株，如在例如国际专利申请公开No.WO 2010/141779中所描述的六重缺失菌株。

对于原生质体制备，可使孢子在木霉极限培养基MM中在150rpm振摇下于24℃生长16-24小时，该极限培养基MM含有20g/L葡萄糖、15g/LKH₂PO₄pH 4.5、5g/L(NH₄)₂SO₄、0.6g/L MgSO₄x7H₂O、0.6g/LCaCl₂x2H₂O、1mL的1000X里氏木霉痕量元素溶液(5g/L FeSO₄x7H₂O、1.4g/L ZnSO₄x7H₂O、1.6g/L MnSO₄×H₂O、3.7g/L CoCl₂×6H₂O)。然后可通过离心收获正在萌发的孢子并且使用50mg/mL的Glucanex G200(诺维信公司(Novozymes AG))溶液进行处理以裂解真菌细胞壁。原生质体的进一步制备可根据以下文献中描述的方法进行：等人，Gene(《基因》)，61(1987)155-164。然后可将200μL总体积的含有约1μg DNA和至少1×10⁷个原生质体的转化混合物用2mL的25％PEG溶液处理，用2体积的1.2M山梨醇/10mM Tris(pH7.5)、10mM CaCl₂稀释，与含有20mM乙酰胺的3％选择性顶层琼脂糖MM混合。然后将所得的混合物倾倒进含有乙酰胺的2％选择性琼脂糖平板上。接着，将板在28℃下温育7-10天。然后将单个转化株转移到含有乙酰胺的新鲜MM平板上。然后使用来自独立克隆的孢子在96孔微量滴定平板或摇瓶中接种发酵培养基。

可将来自培养发酵液的分泌蛋白进行纯化，任选进行一定的发酵后处理，或者可直接用于糖化或者水解含有甘露聚糖的木质纤维素生物质底物。

实例5

Bhe Man2的β-甘露聚糖酶活性

使用购自美格兹密国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme InternationalIreland，爱尔兰布雷市(Bray，Ireland))的1％半乳甘露聚糖(Carob；低粘度)(P-GALML；批号10501)作为底物测量Bhe Man2的β-1，4甘露聚糖酶活性。该测定在含有0.005％Tween-80的50mM乙酸钠缓冲液pH 5.0中进行，其中将该多肽和该底物在50℃下温育10分钟。作为另一种选择，该测定在含有0.005％Tween-80的50mM HEPES缓冲液pH 8.2中进行，其中将该多肽和该底物在30℃下温育30分钟

使用如下文献描述的PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼)测定法定量从水解反应释放的还原糖：Lever，(1972)，Anal.Biochem.(《分析生物化学》)，47：248。使用不同的量的甘露糖作为标准品制作标准曲线，并计算比酶活单位。具体地讲，一个甘露聚糖酶单位定义为在给定一组条件下每分钟产生1微摩尔的甘露糖还原糖当量所需的酶量。

如所测量的，纯化的Bhe Man2多肽的比活性在pH 5.0下为约22单位/毫克，在pH 8.2下为约46单位/毫克。

实例6

Bhe Man2的pH曲线

在具有pH 2至pH 9之间的范围内的不同pH的柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液中进行活性测定。将25μL的0.5M柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液加到96孔板中的65μL的刺槐豆胶(1％水溶液)，并在50℃的测定温度下使底物平衡，然后添加酶。进行了10分钟后，通过将10μL的反应混合物转移到含有100μL的PAHBAH溶液的96孔PCR板的孔来终止酶反应。然后将PCR板在Bio-Rad DNA Engine中在95℃下温育5分钟。随后将PCR板在冰上冷却，并将该孔中的100μL混合物转移到新的96孔测定板。

通过在完成如上所述的反应后在分光光度计中于410nm处测量反应混合物的光密度，测定从底物释放的还原糖的量。各pH下的酶活性以相对活性报告，其中将最佳pH下的酶活性归一化为100％。

Bhe Man2的pH曲线在图3中示出。发现Bhe Man2在约pH 8.0至pH9.0下具有最佳pH。还发现该多肽在pH 6.0至pH 9.0之间保持其最大活性的70％以上。

实例7

Bhe Man2的温度曲线

通过在50mM柠檬酸钠缓冲液pH 6.0中在40℃至84℃之间的不同温度下测量Bhe Man2的β-甘露聚糖酶10分钟，测定纯化的Bhe Man2多肽的最佳温度。该活性以相对活性报告，其中将最佳温度下的活性归一化为100％。Bhe Man2的温度曲线在图4中示出。

发现Bhe Man2具有64℃的最佳温度，并发现它在50℃至74℃之间保持最大活性的80％以上。

实例8

Bhe Man2的热稳定性曲线

在50mM柠檬酸钠缓冲液pH 6.0中测定Bhe Man2的热稳定性。将该酶在PCR热循环仪中在期望的温度下温育2小时。如上文实例5中所描述测量每个样品的剩余或残余活性。使用保持在冰上的对照Bhe Man2样品的活性来定义100％保持的活性。Bhe Man2的热稳定性曲线在图5中示出。

在75℃下温育2小时，Bhe Man2保持约50％活性。在低于55℃的温度下温育2小时后，保持至少95％的β-甘露聚糖酶活性，从而表明BheMan2非常热稳定。

实例9

使用包含Bhe Man2的酶组合物水解碱性KRAFT预处理的软木生物质 底物。

通过法国环境能源控制署(L′Agence Nationale de I′Environmental et de laMaitrise de I′Energie)资助的研究项目(ADEME 0501 C0099)从法国国家科研署(ARN-05-BIOE-007)获得碱性KRAFT预处理的软木底物FPP-27，并进行组合物分析得出以下生物质含量：约2.5重量％Klason木质素；约81.4重量％葡聚糖(glycan)；约7.9重量％木聚糖；约0.8重量％半乳聚糖；和约6.5重量％甘露聚糖。将干固形物荷载水平为8.6％且总纤维素荷载为7％的该底物1.93g与10mg/g葡聚糖的TRIO^TM样品(其按需使用0.05M柠檬酸钠缓冲液pH 5.0预稀释成期望的浓度)混合成反应混合物作为对照。将同样干固形物荷载水平为8.6％且总纤维素荷载为7％的该底物1.93g与具有9mg/g葡聚糖的TRIO^TM和1mg/g葡聚糖的Bhe Man2、或者1mg/g葡聚糖的ScoMan1、或者1mg/g葡聚糖的Bsp Man1、或者1mg/g葡聚糖的Msp Man2的共混酶混合成反应混合物。使用0.1M柠檬酸钠缓冲液将该反应混合物和该对照混合物调节至pH 5。向各反应混合物和对照混合物中的每一者加入5％叠氮化钠以控制微生物生长。

然后将反应混合物和对照混合物在New Brunswick Scientific Innova 44温育振荡器中在50℃和200rpm轻柔搅动下进行温育。在24小时、48小时、72小时后，从每个反应混合物取出约200μL的小量样品，稀释于200μL的MilliQ水中，然后滤过0.2μm过滤器。然后将滤液注射到WatersHPLC中，该HPLC配备有：Waters 2695分离组件(Waters 2695 SeparationModule)，流速设定为0.6mL/min，MilliQ水流动相用0.2μm过滤器脱气；Phenomenex Rezex RCM 300×7.8mM柱和与之串联的RPM 300×7.8mM柱；Phenomenex保护套件(Security Guard Kit)，包括Carbo-Ca 4×3.0mM保护柱(security guard cartridge)；以及Waters 2414折射率检测器，操作温度设定为50℃。分析反应混合物以及对照样品的葡萄糖、木糖和甘露糖的量。结果在图6A-6C中示出。

让反应混合物继续长达72小时，将每个样品的24-72小时之间的时间的总碳水化合物转化率作图，在图7随着时程变化示出。

实例10

Bhe Man2造成的粘度降低

可使用FPP-27KRAFT预处理的软木浆，其经组成分析测出含有以下成分：约2.5重量％Klason木质素；约81.4重量％葡聚糖(glycan)；约7.9重量％木聚糖；约0.8重量％半乳聚糖；和约6.5重量％甘露聚糖。作为另一种选择，可使用相同的SPORL预处理的软木底物，其经组成分析测出含有以下成分：约32.4重量％klason木质素；约49.4重量％葡聚糖；约3.4重量％木聚糖；和约4.6重量％甘露聚糖。作为对照底物，可使用酸预处理的全水解物玉米秸秆(whole hydrolysate corn stover，whPCS)(参见例如www.nrel.gov/docs/fyl losti/47764.pdf)，其不含有任何GGM或GM，但含有约33.8重量％葡聚糖，无木聚糖，和约2.2重量％半乳聚糖。

然后可将干固形物荷载水平为8.6％且总葡聚糖荷载为7.0％的这种底物(包括例如FPP-27底物或者SPORL预处理软木底物，和对照whPCS底物)1.93g与10mg/g葡聚糖的作为对照混合物的TRIO^TM以及与1mg/g葡聚糖的Bhe Man2加9mg/g葡聚糖的TRIO^TM混合成反应混合物。然后使用0.1M柠檬酸钠缓冲液将反应混合物和对照混合物调节至pH 5.0，并可在约50℃的温度下轻柔搅动温育至少16小时。

在温育至少16小时后，可使用Rapid Visco Analyzer Super 4粘度计(Newport Scientific)测定每个所得的混合物(约2-3克样品)的粘度。BheMan2多肽当与TRIO^TM以上述比例混合时，在16小时温育时间点赋予实质的粘度降低有益效果，例如实现粘度降低至少20％。

尽管为了清楚的理解已通过举例说明和实例详细地描述了上述组合物和方法，但本领域普通技术人员根据本文的教导显而易见地知道，可在不背离所附权利要求的精神或者范围的前提下对上述组合物和方法可作出某些改变和修改。

因此，前述内容仅仅举例说明本组合物和方法的原理。应认识到，本领域技术人员将能够作出各种改编，这些改编尽管不在本文中明确描述或者示出，但能体现本组合物和方法的原理，从而包括在其精神和范围内。此外，本文叙述的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本组合物和方法的原理以及本发明人为推进本领域所贡献的构思，因此应被解释为并不限于此类具体叙述的实例和条件。而且，本文中叙述本组合物和方法的原理、方面和实施例及其具体实例的所有陈述，都旨在涵盖其结构等同物和功能等同物两者。另外，意图的是此类等同物包括当前知道的等同物和将来开发的等同物两者，将来开发的等同物即任何所开发的能执行相同的功能的元件，而不论其结构如何。因此，并不意图本组合物和方法的范围局限于本文显示和描述的示例性实施例。

Claims (30)

1.一种酶组合物，所述酶组合物包含重组多肽和一种或多种纤维素酶，所述重组多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有β-甘露聚糖酶活性。

2.根据权利要求1所述的酶组合物，其中所述重组多肽当构成所述酶组合物的高达20重量％时，所述重组多肽改善所述酶组合物的水解性能，其中所述改善的水解性能包括：

(a)在相同的水解条件下，从给定木质纤维素生物质底物转化的葡聚糖转化百分数提高、木聚糖转化百分数提高和/或葡聚糖转化百分数及木聚糖转化百分数提高；或者

(b)在相同的水解条件下，给定木质纤维素生物质底物的粘度降低快至少约5％。

3.根据权利要求1或2所述的酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ ID NO：4的ScoMan1的β-甘露聚糖酶活性相比具有提高的β-甘露聚糖酶活性。

4.根据权利要求1或2所述的酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ ID NO：5的Bsp Man1的β-甘露聚糖酶活性相比具有提高的β-甘露聚糖酶活性。

5.根据权利要求1或2所述的酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ ID NO：6的Msp Man2的β-甘露聚糖酶活性相比具有提高的β-甘露聚糖酶活性。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽当在pH 6至pH 9的pH范围内温育时保留所述β-甘露聚糖酶活性的70％以上。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽在约8.0至9.0的pH下具有最佳β-甘露聚糖酶活性。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽当在50℃至74℃之间的温度下温育时保留所述β-甘露聚糖酶活性的至少80％或者更多。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽在约64℃的温度具有最佳β-甘露聚糖酶活性。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽当在约75℃的温度温育约2小时时保留所述β-甘露聚糖酶活性的至少50％。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽当在高达55℃的温度温育约2小时时保留所述β-甘露聚糖酶活性的至少95％。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的酶组合物，其中所述重组多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的酶组合物，其中所述一种或多种纤维素酶选自一种或多种β-葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶和一种或多种内切葡聚糖酶。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物还包含一种或多种其他半纤维素酶。

17.根据权利要求16所述的酶组合物，其中所述一种或多种其他半纤维素酶选自一种或多种其他β-甘露聚糖酶、一种或多种木聚糖酶、一种或多种β-木糖苷酶和一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

18.一种核酸，所述核酸编码重组多肽，所述重组多肽包含与SEQ IDNO：2或者与成熟序列SEQ ID NO：3具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述重组多肽具有β-甘露聚糖酶活性。

19.根据权利要求18所述的核酸，其中所述重组多肽还包含信号肽序列。

20.根据权利要求19所述的核酸，其中所述信号肽序列选自SEQ IDNO：13-41中的任一者。

21.一种表达载体，所述表达载体包含与调控序列有效组合的根据权利要求18-20中任一项所述的核酸。

22.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求21所述的表达载体。

23.根据权利要求22所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。

24.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求22或23所述的宿主细胞以及培养基。

25.一种产生β-甘露聚糖酶的方法，所述方法包括：在培养基中在合适的条件下培养根据权利要求22或23所述的宿主细胞以产生所述β-甘露聚糖酶。

26.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求25所述的方法在所述培养基的上清液中产生的β-甘露聚糖酶。

27.一种用于水解木质纤维素生物质底物的方法，所述方法包括：使所述木质纤维素生物质底物与根据权利要求1-17和26中任一项所述的酶组合物接触以产生葡萄糖和其他糖类。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述木质纤维素生物质底物包含高达约20重量％、高达约15％或者高达约10重量％的半乳葡甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。

29.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-17中任一项所述的酶组合物和木质纤维素生物质底物。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述木质纤维素生物质底物包含高达约20重量％、或者高达约15重量％、或者高达约10重量％的半乳葡甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。