UA115219C2 - Глікозилгідролазні ферменти і їх застосування - Google Patents

Глікозилгідролазні ферменти і їх застосування Download PDF

Info

Publication number
UA115219C2
UA115219C2 UAA201204936A UAA201204936A UA115219C2 UA 115219 C2 UA115219 C2 UA 115219C2 UA A201204936 A UAA201204936 A UA A201204936A UA A201204936 A UAA201204936 A UA A201204936A UA 115219 C2 UA115219 C2 UA 115219C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
shi
sequence
polypeptide
composition according
residues
Prior art date
Application number
UAA201204936A
Other languages
English (en)
Inventor
Бенджамін Бауер
Меган Йі Хсі
Тейс КАПЕР
Бредлі Р. Келемен
Сьюзанн Е. ЛАНТЦ
Едмунд А. Ларенас
Колін Мітчінсон
Стівен Кім
Уілльям Д. Хітц
Марк Емптейдж
Кейт Дюмон Вінг
Original Assignee
Даніско Юес Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Даніско Юес Інк. filed Critical Даніско Юес Інк.
Publication of UA115219C2 publication Critical patent/UA115219C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2485—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1,3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується, глікозилгідролазних ферментів, композицій, що містять такі ферменти, і способів застосування цих ферментів і композицій.

Description

(56) Оаїаразе ЕМВІ |Опіїпе| 15 Арії 2003 (2003-04- 15), "Репісійшт пегдиеї тАМА Гог хуЇозідазе, сотріеїе савз.", ХРОО2633644, гейіємей їтот ЕВІ ассезвіоп по. ЕМВ АВО93564 Оагабазе ассезвіоп по. АВО93564 раїаразе ЕМВІ. |(Опіїпе| 19 Аргїї 2007 (2007-04- 19), "Репісійшт ригригодепит аїрна-і - агаріпоїгапозідазе 2 (аріг) депе, соптрієїе сав.",
ХРОО2633645, геміємейд тот ЕВІ ассезвіоп по.
ЕМВІСЕР490448 Раїабазе ассезвіоп по.
ЕР490448
МагооїІез-Сіагк Е еї а!: "Ехргеззіоп райетв ої їеп
ПетісеїІшмазе депез ої пе Яатепіоиз їШпдив
Тиісподепта геезеї оп майоив сагроп зоцгсев",
УЧоштаї ої Біотесппоіоду, ЕІземієг зсіеєпсе рибіїзпегз, Атзіегаат, МІ, мої. 57, по. 1-3, 16
Зерієтбег 1997 (1997-09-16), радез 167-179
Масі-Аїідпег авзігіа К еї а!: "Тапзсгіріопаї гедиайоп ої хуп!, епсодіпд пе таїп гедшаюг ої Те хуІапо|уїйс апа сейПиоуїйс еплуте зузіет іп
Нуросгеєа |есоппа.", Арріїєд апа епмігоптепіаї тісгобіоїоду Мом 2008 ЇМКО- Рибтеа:18791032,
Уоі. 74, по. 21, Мометбрег 2008 (2008-11), радез 6554-6562
МО 2009045627 Аг, 09.04.2009 (54) ГЛІКОЗИЛГІДРОЛАЗНІ ФЕРМЕНТИ І ІХ ЗАСТОСУВАННЯ (57) Реферат:
Винахід стосується, глікозилгідролазних ферментів, композицій, що містять такі ферменти, і способів застосування цих ферментів і композицій.
1. ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
Ця заявка вимагає пріоритет на основі попередніх заявок США 61/245273, поданої 23 вересня 2009 року, і 61/289886, поданої 23 грудня 2009 року, описи яких включені тут за допомогою посилання. 2. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Даний винахід, загалом, стосується глікозилгідролазних ферментів, композицій, що містять такі ферменти, і способів застосування цих ферментів і композицій, наприклад, для оцукрювання або перетворення целюлозних і геміцелюлозних речовин в цукри. 3. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Біоперетворення відновлюваної лігноцелюлозної біомаси в ферментований цукор, який потім ферментується з утворенням спирту (наприклад, етанолу), як альтернатива рідким паливам, привертав інтенсивну увагу дослідників з 1970-их років, коли сталася нафтова криза, оскільки Організація країн-експортерів нафти (ОРЕС) зменшила продукцію нафти (Випдау Н. К., "Епегду: Ше Ббіотавб5 оріїопбв". ММ: УМПеу; 1981; ОіІввоп І., Напп-Надегда! В. Еплуте МісгоБб
Тесппо! 1996, 18:312-31; 7аідімак 4. єї а!., Аррі Містобріо! Віоїєснпої 2001, 56:17-34; Са!їБе М. еї аї.,
Аррі! Містобіо! Віоїесппо! 2002, 59:618-28). Етанол широко використовувався у вигляді 1090 суміші з бензином в США або у вигляді чистого палива для транспортних засобів в Бразилії в останні два десятиріччя. Важливість паливного біоетанолу буде збільшуватися паралельно стрімкому зростанню цін на нафту і поступовому виснаженню її джерел. Крім того, ферментовані цукри все більше використовуються для виробництва пластику, полімерів і інших продуктів на основі біологічних матеріалів, і очікується, що ця індустрія суттєво розшириться в найближчі роки. Таким чином, продовжує зростати потреба в наявних в надлишку ферментованих цукрах низької вартості, які можуть бути використані як сировина замість сировини на основі нафти.
Головними серед застосовних відновлюваних вихідних матеріалів є целюлоза і геміцелюлоза (ксилани), які можуть бути перетворені в ферментовані цукри. Ферментативне перетворення цих полісахаридів в розчинні цукри, наприклад глюкозу, ксилозу, арабінозу, галактозу, манозу і/або інші гексози і пентози, відбувається внаслідок об'єднаних дій різних ферментів. Наприклад, ендо-1,4-В-глюканази (ЕС) і екзоцелобіогідролази (СВН) каталізують
Зо гідроліз нерозчинної целюлози в целоолігосахариди (наприклад, з целобіозою, що є основним продуктом), тоді як В-глюкозидази (ВО) каталізують перетворення олігосахаридів в глюкозу.
Ксиланази разом з іншими допоміжними білками (необмежувальні приклади яких включають в себе І-а-арабінофуранозидази, ферулоїл- і ацетилксиланестерази, глюкуронідази і р- ксилозидази) каталізують гідроліз геміцелюлоз.
Клітинні стінки рослин складаються з гетерогенної суміші комплексних полісахаридів, які взаємодіють за допомогою ковалентних і нековалентних способів. Комплексні полісахариди клітинних стінок вищих рослин включають в себе, наприклад, целюлозу (В-1,4-глюкан), яка звичайно становить 35-5095 вуглецю, виявлюваного в компонентах клітинних стінок. Полімери целюлози самоасоціюються за допомогою утворення водневих зв'язків, вандерваальсових взаємодій і гідрофобних взаємодій з утворенням напівкристалічних целюлозних мікрофібрил.
Ці мікрофібрили включають в себе також некристалічні райони, звичайно відомі як аморфна целюлоза. Ці целюлозні мікрофібрили закладені в матриксі, утвореному геміцелюлозами (що включають в себе, наприклад, ксилани, арабінани і манани), пектинами (наприклад, галактуронами і галактанами) і різними іншими ВД-1,3- і ВД-1,4-глюканами. Ці матриксні полімери часто є заміщеними, наприклад, залишками арабінози, галактози і/або ксилоли, з утворенням висококомплексних арабіноксиланів, арабіногалактанів, галактомананів і ксилоглюканів. Цей геміцелюлозний матрикс, в свою чергу, оточений поліфенольним лігніном.
Складність цього матриксу робить важкою деградацію мікроорганізмами, оскільки компоненти лігніну і геміцелюлози повинні бути зруйновані, перш ніж ферменти можуть діяти на мікрофібрили целюлозної серцевини. Звичайно потрібна консорція різних ферментативних активностей для руйнування полімерів клітинної стінки для вивільнення моносахаридів, що її складають. Для оцукрювання клітинних стінок рослин лігнін повинен бути зроблений проникним і геміцелюлоза повинна бути зруйнована для того, щоб целюлозодеградуючі ферменти могли діяти на їх субстрат.
Незалежно від типу целюлозного вихідного матеріалу, вартість і гідрлітична ефективність ферментів є головними факторами, які обмежують комерціалізацію процесів біоперетворення біомаси. Вартість одержання продукованих мікробами ферментів тісно пов'язана з продуктивністю штаму, продукуючого фермент, і кінцевим виходом активності в ферментаційному бульйоні. Гідролітична ефективність мультиферментного комплексу залежить як від властивостей окремих ферментів, синергізму серед них, так і від їх співвідношення в мультиферментній суміші.
У даній галузі існує потреба в ідентифікації ферментів і/або сумішей/композицій ферментів, які здатні перетворювати рослинні і/або інші целюлозні або геміцелюлозні матеріали в ферментовані цукри з поліпшеними ефективністю і виходом. 4. СУТЬ ВИНАХОДУ
Цей опис винаходу забезпечує деякі глікозилгідролазні поліпептиди, що мають геміцелюлолітичну активність, які включають в себе, наприклад, ксиланази (наприклад, ендоксиланази), ксилозидази (наприклад, В-ксилозидази), арабінофуранозидази (наприклад,
Ї-а-арабінофуранозидази), нуклеїнові кислоти, що кодують ці поліпептиди, і способи приготування і застосування цих поліпептидів і/або нуклеїнових кислот. Цей опис оснований, частково, на виявленні нових ферментів і варіантів, які мають ксиланазну, В-ксилозидазну і/або
І-с-арабінофуранозидазну активності. Цей опис оснований також на ідентифікації фФерментних сумішей (або композицій), які ефективно каталізують целюлозні і геміцелюлозні матеріали. Для мети цього опису фермент може бути визначений або як поліпептид, який має конкретну ферментативну активність, або як цей фермент. Наприклад, ксиланаза може називатися поліпептидом, що має ксиланазну активність, або ксиланазним ферментом, і ВД-ксилозидаза може називатися або поліпептидом, що має р-ксилозидазну активність, або ВД-ксилозидазним ферментом.
Ферменти і/або ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані для одержання цукрів з біомаси. Одержані таким чином цукри можуть бути використані мікроорганізмами для продукування етанолу або можуть бути використані для продукування інших біопродуктів в різних промислових застосуваннях. Таким чином, цей опис забезпечує також описані тут промислові застосування (наприклад, процеси оцукрювання у виробництві етанолу) з використанням цих ферментів і/або ферментних сумішей/композицій. Ферменти і/або ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані для зменшення вартості у виробництві біопалива.
У одному аспекті винахід цього опису стосується ферментів (в тому числі їх варіантів) або ферментних сумішей/композицій, які застосовні для гідролізу головних компонентів
Зо лігноцелюлозної біомаси (що включають в себе, наприклад, целюлозу, геміцелюлозу і лігнін) або будь-якого матеріалу, що містить целюлозу і/або геміцелюлозу. Такі лігноцелюлозна біомаса і/або матеріал, що містить целюлозу і/або геміцелюлозу, включають в себе, наприклад, насіння, зерна, бульби, рослинні відходи або відходи переробки корму або промислової переробки (наприклад, стебел) зерна (в тому числі серцевин (серцевин) кукурудзяних качанів, кукурудзяної соломи і т.п.), трав (наприклад, соргаструму пониклого, такого як Зогудпазігит пшапе; або проса прутоподібного, наприклад виду Рапісит, такого як Рапісит мігдафшт), деревини (що включає в себе, наприклад, деревні стружки, відходи обробки), паперу, пульпи, переробленого паперу (наприклад, газетного паперу).
Ферментні суміші/композиції цього винаходу можуть бути використані для гідролізу целюлози, що містить лінійний ланцюг В-1,4-зв'язаних глюкозних груп, або геміцелюлози, комплексної структури, яка варіюється від рослини до рослини.
Ферментні суміші/композиції цього винаходу можуть містити ряд різних ферментів, що включають в себе целюлази і/або геміцелюлази. Наприклад, ці ферментні суміші/композиції цього винаходу можуть бути використані для гідролізу біомаси або придатного вихідного матеріалу (сировини). Ферментні суміші/композиції цього винаходу можуть переважно містити суміші ферментів, вибрані, наприклад, з ксиланаз, ксилозидаз, целобіогідролаз, арабінофуранозидаз і/або інших ферментів, які можуть розщеплювати геміцелюлозу до мономерних цукрів. Ферментна суміш/композиція цього винаходу може містити суміш двох або більше, трьох або більше або чотирьох або більше ферментів, вибраних з однієї або декількох
БО ксиланаз, однієї або декількох ксилозидаз, однієї або декількох целобіогідролаз, однієї або декількох арабінофуранозидаз і одного або декількох ферментів, які здатні перетворювати геміцелюлозу до мономерних цукрів. Інші ферменти, які можуть розщеплювати геміцелюлозу до мономерних цукрів, включають в себе, без обмеження, целюлазу, геміцелюлазу або композицію, яка містить целюлазу або геміцелюлазу. Ферментна суміш/композиція цього винаходу може містити суміш двох або більше, трьох або більше або чотирьох або більше ферментів, вибраних з ксиланази, ксилозидази, целобіогідролази, арабінофуранозидази і щонайменше одного іншого ферменту, здатного перетворювати геміцелюлозу до мономерних цукрів. Один необмежувальний приклад ферментної суміші/композиції містить суміш ксиланази, ксилозидази, целобіогідролази, арабінофуранозидази і ВД-глюкозидази. Ферментна суміш/композиція цього винаходу є придатною композицією, яка є композицією, що не зустрічається в природі.
У даному контексті термін "композиція, що зустрічається в природі", стосується композиції, продукованої джерелом, що зустрічається в природі, яке містить один або декілька ферментативних компонентів або одну або декілька активностей, де кожний з цих компонентів або кожна з цих активностей знаходяться у співвідношенні і при рівні, які виробляються джерелом, що зустрічається в природі, виявлюваним в природі, до якого не торкалася рука людини і який не був модифікований рукою людини. Таким чином, композицією, що зустрічається в природі, є, наприклад, композиція, яка продукується організмом, не модифікованим відносно целюлолітичних або геміцелюлолітичних ферментів, так що співвідношення або рівні цих ферментів-компонентів є незміненими в порівнянні з цими співвідношенням або рівнями, продукованими нативним організмом в його природному оточенні. З іншого боку, "композицією, що не зустрічається в природі", називають композицію, яка одержується за допомогою: (1) об'єднання целюлолітичних або геміцелюлолітичних компонентів-ферментів або у співвідношенні, що зустрічається в природі або не зустрічається в природі, тобто зміненому співвідношенні; або (2) модифікації організму для експресії, надекспресії або недостатньої експресії одного або декількох ендогенних або екзогенних ферментів; або (3) модифікації організму таким чином, що щонайменше один ендогенний фермент є делетованим (виключеним). Термін "композиція, що не зустрічається в природі", може також стосуватися композиції, продукованої організмом, що зустрічається в природі і не модифікований, але культивується у виготовленому людиною середовищі або в оточенні, яке відрізняється від природного оточення організму, так що кількості або масові співвідношення конкретних ферментів в цій композиції відрізняються від кількостей або масових співвідношень, існуючих в композиції, продукованій нативним організмом, що вирощується в його природному середовищі.
Ферментною сумішшю/композицією цього винаходу, описаною тут, є, наприклад, ферментаційний бульйон. Цей ферментаційний бульйон може бути бульйоном міцеліального гриба, в тому числі, наприклад, Тгісподегта, НитісоЇїа, Ризагішт, Аврегоїййи5, Меигозрога,
РепісіШит, Серпаіозрогішт, Аспіуа, Родозрога, Епдоїпіа, Мисог, Соспійороїц5, Ругісцшагіа або
Зо Спгузовзрогішт. Одним прикладом гриба Тгісподегта 5рр. є Тісподепта геезві. Одним прикладом гриба Репісійит 5рр. є Репісійшт їипісшобзит. Цей ферментаційний бульйон може бути, наприклад, безклітинним ферментаційним бульйоном або бульйоном цільних клітин.
У іншому прикладі ферментною сумішшю/композицією цього винаходу, описаною тут, є целюлазна композиція. Ця целюлазна композиція є целюлазною композицією міцеліальних грибів, що включають в себе, наприклад, Тгісподегта, такий як Тгісподегта геезеї. Ця целюлазна композиція може продукуватися міцеліальном грибом, наприклад Тгісподегта, таким як Тгісподегта геезеї.
Наприклад, ферментна суміш/композиція цього винаходу може містити: (а) один або декілька ксиланазних ферментів, де щонайменше один з вказаних ксиланазних ферментів є
Хупа2 Тгісподегта геезеї, Хуп3 Тгісподепта геезеї, АтиХуп2 або АгтиХуп5б; (5) один або декілька р- ксилозидазних ферментів, де щонайменше один з вказаних В-ксилозидазних ферментів є р- ксилозидазою групи 1 або В-ксилозидазою групи 2, де ВД-ксилозидазою групи 1 є ЕмУЗА або
Ема4ЗзА, а ВД-ксилозидазою групи 2 є РІ4ЗА, Ем430, ЕГмЗ9А, Ем4ЗЕ, Бо43А, Ем43В, РабтА, С24З3А або Вхі! Тгісподегта геезеї; (с) один або декілька І-а-арабінофуранозидазних ферментів, де щонайменше однією з вказаних І-а-арабінофуранозидаз є АЇїТ4З3А, Ем43В, РІЗ21А, Раб1А або
Ем51А; (а) один або декілька целюлазних ферментів; і, необов'язково, (е) один або декілька інших компонентів. Ця ферментна суміш/композиція є придатною ферментною сумішшю/композицією, яка є такою, що не зустрічається в природі. Бажано, щоб ці один або декілька целюлазних ферментів (4) були здатні досягати щонайменше 0,00005 фракційного продукту на мг білка на грам набухлої в фосфорній кислоті целюлози (РАЗС), як визначено калькофлуор-аналізом. У одному необмежувальному прикладі об'єднана маса ксиланазного ферменту (ксиланазних ферментів) в цій композиції може представляти або становити 5-45 мас. 95 (наприклад, 5-25 мас. 9о, 5-15 мас. 95, 10-15 мас. 95) об'єднаної або загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса В-ксилозидазного ферменту (В-ксилозидазних ферментів) може представляти або становити 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас.
Фо, 5-10 мас. 95) загальних білків в цій композиції, тоді як об'єднана маса І-а- арабінофуранозидазного ферменту (-а«-арабінофуранозидазних ферментів) може представляти або становити 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 2-20 мас. 95, 5-15 мас. 95, 5- 10 мас. 95) об'єднаної або загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса бо целюлазного ферменту (целюлазних ферментів) може представляти або становити 30-80 мас.
Фо (наприклад, 40-70 мас. 95, 50-60 мас. 95) об'єднаної або загальної маси білка в цій композиції.
Ферментна суміш/композиція цього винаходу, описана тут, є, наприклад, композицією ферментаційного бульйону. Цей ферментаційний бульйон є, наприклад, бульйоном міцеліального гриба, в тому числі, без обмеження, Тгісподегта, Нитісоїа, Ризагішт, Азрегоїйи5, Мешпгозрога, РепісшШіит, СерпаІовзрогішт, АсПіуа, Родозрога, Епадоїніа, Мисог, СоспПііорої св,
Ругісшагіа або Спгузозрогішт. Одним прикладом гриба Тгісподегта 5рр. є Пісподетта геезеі.
Одним прикладом гриба Репісіййшт 5рр. є Репісіййшт їипісшозит. Цей ферментаційний бульйон може бути, наприклад, безклітинним ферментаційним бульйоном або бульйоном цільних клітин. Ферментна суміш/композиція цього винаходу, описана тут, може бути також целюлазною композицією, наприклад целюлазною композицією міцеліальних грибів. Ця целюлазна композиція, наприклад, може бути продукована міцеліальним грибом, таким як Тгісподегта.
Наприклад, ферментна суміш/композиція цього винаходу може містити (а) один або декілька ксиланазних ферментів, де щонайменше одним з вказаних ксиланазних ферментів є
Хупг2 Піснодепта геезві, Хуп3 Тіснодетта геезеї, АТиХуп2 або АгтиХуп5; (5) один або декілька Д- ксилозидазних ферментів, де щонайменше один з вказаних одного або декількох ||Д- ксилозидазних ферментів є В-ксилозидазою групи 1 або ДВ-ксилозидазою групи 2, де ВД- ксилозидазою групи 1 є ЕмЗА їі Ем4ЗА і Д-ксилозидазою групи 2 є РІ4ЗА, Ем430, ЕмУЗ9А, ЕмаЗЕ,
Ео43А, Ем43В, Рабт1А, С7243А і/або Вхі! Ттісподепта геевзеї; (с) один або декілька р- ксилозидазних ферментів групи 2, вибраних з АТЯЗА, Ем4З3В, РІТА і/або Емо1А; (а) один або декілька целюлазних ферментів; і, необов'язково, (е) один або декілька інших компонентів.
Бажано, щоб ці один або декілька целюлазних ферментів (4) були здатні досягати щонайменше 0,00005 фракційного продукту на мг білка на грам набухлої в фосфорній кислоті целюлози (РАЗС), як визначено калькофлуор-аналізом. Ця ферментна суміш/композиція є придатною ферментною сумішшю/композицією, яка є такою, що не зустрічається в природі. У одному необмежувальному прикладі об'єднана маса ксиланазного ферменту (ксиланазних ферментів) може представляти або становити 5-45 мас. 95 (наприклад, 5-25 мас. 95, 5-15 мас.
Фо, 10-15 мас. 95) об'єднаної або загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса р- ксилозидазного ферменту (ВД-ксилозидазних ферментів) групи 1 може становити 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 маб. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білка в цій композиції, тоді як
Зо об'єднана маса ВДВ-ксилозидазного ферменту (В-ксилозидазних ферментів) групи 2 може становити 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білка в цій композиції, і де об'єднана маса целюлазного ферменту (целюлазних ферментів) може представляти або становити 30-80 мас. 95 (наприклад, 40-70 мас. 95, 50-60 мас. 95) об'єднаної або загальної маси білка в цій композиції. Співвідношення маси В-ксилозидазних ферментів групи 1 до маси ДВ-ксилозидазних ферментів групи 2 може бути, наприклад, 1:10-107 (наприклад, 1:8-8:1, 16-61, 1:4-4:11, 1:2-2:1 або 1:1). Ферментна суміш/композиція цього винаходу може додатково містити додаткові компоненти, які можуть бути допоміжними білками або іншими білковими/небілюовими компонентами. Ці додаткові компоненти можуть становити, наприклад, 1-50 мас. 95, 1-10 мас. 95, 2-5 мас. 95, 5-10 мас. 95 або 5-20 мас. 95 загальної маси білків в цій композиції. Описана тут ферментна суміш/композиція є, наприклад, композицією ферментаційного бульйону. Цей ферментаційний бульйон є, наприклад, бульйоном міцеліального гриба, в тому числі, без обмеження, Тгісподегта, Нитісоїа, Ризагішт, Азрегоїйи5,
Мешйгозрога, РепісшШішт, Серпаіозрогішт, АсПіуа, Родозрога, Епадоїніа, Мисог, СоспПііороїсв,
Ругісшагіа або Спгузозрогішт. Одним прикладом гриба Тгісподегта 5рр. є Пісподетта геезеі.
Одним прикладом гриба Репісшіит 5рр. є Репісійшт гипісшобзит. Цей ферментаційний бульйон може бути, наприклад, безклітинним ферментаційним бульйоном або бульйоном цільних клітин. Ферментна суміш/композиція цього винаходу, описана тут, може бути також целюлазною композицією, наприклад целюлазною композицією міцеліальних грибів. Ця целюлазна композиція, наприклад, може бути продукована міцеліальним грибом, таким як Тгісподегта.
У наступних прикладах ферментна суміш/композиція цього винаходу може містити (а) один або декілька ксиланазних ферментів, де щонайменше одним з вказаних ксиланазних ферментів є Хуп2 Тісподетта геезві, Хуп3 Тгісподепта геезеї, АгиХуп2 або АгтиХуп5 Тгісподегта геезеї; (Б) один або декілька ВД-ксилозидазних ферментів групи 1 Ем3ЗА і Ем4З3ЗА або рД- ксилозидазних ферментів групи 2 РІ4ЗА, Ем430, Ем39А, Ем4З3Е, Бо43А, Ем43В, Раб1А, 743А іабо Вхі1 Тгісподепта геезеї; (с) один або декілька І -с-арабінофуранозидазних ферментів, де щонайменше один з вказаних одного або декількох І-а-арабінофуранозидазних ферментів є
АТЗА, Ем43В, РІБ1А або Ем51А; (4) один або декілька Д-глюкозидазних ферментів; і, необов'язково, (е) один або декілька інших компонентів. Ця ферментна суміш/композиція є придатною ферментною сумішшю/композицією, яка є такою, що не зустрічається в природі. У бо одному необмежувальному прикладі об'єднана маса ксиланазного ферменту (ксиланазних ферментів) в цій композиції може представляти або становити 5-45 мас. 95 (наприклад, 5 мас.
Фо до 25 мас. 95, 5-15 мас. 95, 10-15 мас. 95) об'єднаної або загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса ВД-ксилозидазного ферменту (В-ксилозидазних ферментів) може становити 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса І-а-арабінофуранозидазного ферменту (І -а- арабінофуранозидазних ферментів) може становити 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білка в цій композиції, і де об'єднана маса р- глюкозидазного ферменту (В-глюкозидазних ферментів) може становити 2-50 мас. 905 (наприклад, до 50 мас. 95, 2-10 мас. 95 або 3-8 мас. 95) об'єднаної або загальної маси білка в цій композиції. Ця ферментна суміш/композиція може додатково містити додаткові компоненти, які можуть бути допоміжними білками або іншими білковими/небілюювими компонентами. Ці додаткові компоненти можуть становити, наприклад, 1-50 мас. 95, 1-10 мас. 95, 2-5 мас. 95, 5-10 мас. ую або 5-20 мас. 95 загальної маси білків в цій композиції. Описана тут ферментна суміш/композиція є, наприклад, композицією ферментаційного бульйону. Цей ферментаційний бульйон є, наприклад, бульйоном міцеліального гриба, в тому числі, без обмеження,
Тисподенпта, Нитісоїа, Ризапцт, АврегадійШв5, Мецгозрога, Репісіййшт, СерНнаіозропцт, АснНіуа,
Родозрога, Епаоїйіа, Мисог, СоспііобоїШ5, Ругісціагіа або Спгузозрогішт. Одним прикладом гриба Тгісподепта 5рр. є Тісподепа геезві. Одним прикладом гриба РепісшШішт 5рр. є
Репісіййшт Яипісцшобит. Цей ферментаційний бульйон може бути, наприклад, безклітинним ферментаційним бульйоном або бульйоном цільних клітин. Ферментна суміш/композиція цього винаходу, описана тут, може бути також целюлазною композицією, наприклад целюлазною композицією міцеліальних грибів. Ця целюлазна композиція, наприклад, може бути продукована міцеліальним грибом, таким як Тгісподегта.
Ферментна суміш/композиція цього винаходу може також містити, наприклад, (а) один або декілька ксиланазних ферментів, де щонайменше один з вказаних одного або декількох ксиланазних ферментів є Хуп2 Тгісподегта геезеї, Хуп3 Тгісподегта геезеї, АТиХуп2 або
АтиХупб; (5) один або обидва з ВД-ксилозидазних ферментів групи 1: ЕмЗА і Ем4ЗА; (с) один або декілька з ВД-ксилозидазних ферментів групи 2, вибраних з РІ4ЗА, Ем430, ЕГмЗ9А, ЕмаЗЕ, Го4ЗА,
Ем4а3В, Раб1А, О7243А і/або Вхі1 Тгісподегта геезеї; і (4) один або декілька ВД-глюкозидазних
Зо ферментів; і, необов'язково, (е) один або декілька інших компонентів. Ця ферментна суміш/композиція є придатною ферментною сумішшю/композицією, яка є такою, що не зустрічається в природі. У одному необмежувальному прикладі, об'єднана маса ксиланазного ферменту (ксиланазних ферментів) становить 5-45 мас. 95 (наприклад, 5-25 маб. 95, 5-15 мас. чо, 10-15 мас. 95) загальної маси білків в цій композиції, тоді як об'єднана маса р- ксилозидазного ферменту (В-ксилозидазних ферментів) групи 1 становить 2-50 мас. 90 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білків в цій композиції, тоді як об'єднана маса ВД-ксилозидазного ферменту (В-ксилозидазних ферментів) групи 2 становить 2- 50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білків в цій композиції, тоді як об'єднана маса ВД-глюкозидазного ферменту (ВД-глюкозидазних ферментів) становить 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білків в цій композиції. Співвідношення маси В-ксилозидазних ферментів групи 1 до маси р- ксилозидазних ферментів групи 2 може бути, наприклад, 1:10-10:1, наприклад 1:8-8:1, 1:6-671, 1:4-4:1, 1:2-2:1 або 1:11. Ця ферментна суміш/композиція цього винаходу може додатково містити додаткові компоненти, які можуть бути допоміжними білками або іншими білковими/небілюковими компонентами. Ці додаткові компоненти можуть становити, наприклад, 1-50 мас. 95, 1-10 мас. 95, 2-5 мас. 95, 5-10 мас. 95 або 5-20 мас. 95 загальної маси білків в цій композиції. Описана тут ферментна суміш/композиція є, наприклад, композицією ферментаційного бульйону. Цей ферментаційний бульйон є, наприклад, бульйоном міцеліального гриба, в тому числі, без обмеження, Тгісподегта, Нитісоїа, Ризагішт, Азрегоїйи5,
Мешйгозрога, РепісшШішт, Серпаіозрогішт, АсПіуа, Родозрога, Епаоїйпіа, Мисог, СоспПііороїсв5,
Ругісшагіа або Спгузозрогішт. Одним прикладом гриба Тгісподегта 5рр. є Пісподетта геезеі.
Одним прикладом гриба Репісіййшт 5рр. є Репісіййшт їипісшозит. Цей ферментаційний бульйон може бути, наприклад, безклітинним ферментаційним бульйоном або бульйоном цільних клітин. Ферментна суміш/композиція цього винаходу, описана тут, може бути також целюлазною композицією, наприклад целюлазною композицією міцеліальних грибів. Ця целюлазна композиція, наприклад, може бути продукована міцеліальним грибом, таким як Тгісподегта.
Крім того, ферментна суміш/композиція цього винаходу може містити, наприклад, (а) один або декілька ксиланазних ферментів, де щонайменше одним з вказаних ксиланазних ферментів є Хуп2 Тгісподегта геезеї, Хуп3 Тгісподегта геезеї, АгиХуп2 або АгпХуп5; (Б) один 60 або декілька ДВ-ксилозидазних ферментів, де щонайменше один з вказаних одного або декількох В-ксилозидазних ферментів є В-ксилозидазою групи 1 або рД-ксилозидазою групи 2, де рД-ксилозидаза групи 1 може бути ЕмЗА або ЕмазА, а рД-ксилозидаза групи 2 може бути РІ4ЗА,
Ем430, ЕГУЗ9А, ЕРм4ЗЕ, Бо43А, ЕРм43В, Раб1А, 743А і/або Вхі1 Тгісподегта геезеї; і (с) один або декілька І --арабінофуранозидазних ферментів, де щонайменше один з вказаних одного або декількох І-а-арабінофуранозидазних ферментів є АТЗА, Ем43В, РІБ1А або РЕм514А; і, необов'язково, (4) один або декілька інших компонентів. Ця ферментна суміш/композиція є придатною ферментною сумішшю/композицією, яка є такою, що не зустрічається в природі. У одному необмежувальному прикладі об'єднана маса ксиланазного ферменту (ксиланазних ферментів) становить 5-45 мас. 95 (наприклад, 5 мас. 95 до 25 мас. 95, 5-15 мас. 95, 10-15 мас.
Фо) загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса ВД-ксилозидазного ферменту (р- ксилозидазних ферментів) становить 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас. 90, 5-10 мас. 90) загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса І-а- арабінофуранозидазного ферменту (І-а-арабінофуранозидазних ферментів) становить 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 5-25 мас. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білка цієї композиції.
Ця ферментна суміш/композиція цього винаходу може додатково містити додаткові компоненти, які можуть бути допоміжними білками або іншими білковими/небілковими компонентами. Ці додаткові компоненти можуть становити, наприклад, 1-50 мас. 95, 1-10 мас. 95, 2-5 мас. 95, 5-10 мас. ую або 5-20 мас. 95 загальної маси білків в цій композиції. Описана тут ферментна суміш/композиція є, наприклад, композицією ферментаційного бульйону. Цей ферментаційний бульйон є, наприклад, бульйоном міцеліального гриба, в тому числі, без обмеження,
Тисподенпта, Нитісоїа, Ризапцт, АврегадійШв5, Мецгозрога, Репісіййшт, СерНнаіозропцт, АснНіуа,
Родозрога, Епаоїйіа, Мисог, СоспііобоїШ5, Ругісціагіа або Спгузозрогішт. Одним прикладом гриба Тгісподепта 5рр. є Тісподепа геезві. Одним прикладом гриба РепісшШішт 5рр. є
Репісіййшт Яипісцшобит. Цей ферментаційний бульйон може бути, наприклад, безклітинним ферментаційним бульйоном або бульйоном цільних клітин. Ферментна суміш/композиція цього винаходу, описана тут, може бути також целюлазною композицією, наприклад целюлазною композицією міцеліальних грибів. Ця целюлазна композиція, наприклад, може бути продукована міцеліальним грибом, таким як Тгісподегта.
Ферментна суміш/композиція цього винаходу може бути також сумішшю/композицією, яка містить (а) один або декілька ксиланазних ферментів, де щонайменше одним з вказаних одного або декількох ксиланазних ферментів є Хуп2 Тіісподепта геезеї, Хуп3 Тісподегта геезеї, АТиХуп2 або АїиХупб; (Б) один або обидва з ВД-ксилозидазних ферментів групи 1: ЕМЗА і
ЕмаЗА; (с) один або декілька з ВД-ксилозидазних ферментів групи 2, вибраних з РІ4ЗА, Ем430,
Ем39А, Ем4ЗЕ, Го43А, ЕРм43В, Ра5б1тА, с743А і/або Вхі!1 Тгісподегта геезеї; і, необов'язково, (а) один або декілька інших компонентів. Ця ферментна суміш/композиція є придатною ферментною сумішшю/композицією, яка є такою, що не зустрічається в природі. У одному необмежувальному прикладі об'єднана маса ксиланазного ферменту (ксиланазних ферментів) становить 5-45 мас. 95 (наприклад, 5-25 мас. 95, 5-15 мас. 95, 10-15 мас. 95) загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса В-ксилозидазного ферменту (В-ксилозидазних ферментів) групи 1 може становити 2-50 мас. Фо (наприклад, 2-30 мас. 905, 5-25 мас. Фо, 5-10 мас.
Фо) загальної маси білка в цій композиції, тоді як об'єднана маса ВД-ксилозидазного ферменту (р- ксилозидазних ферментів групи 2 може становити 2-50 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. Фо, 5-25 мас. 95, 5-10 мас. 95) загальної маси білка в цій композиції. Співвідношення маси р- ксилозидазних ферментів групи 1 до маси рД-ксилозидазних ферментів групи 2 може бути, наприклад, 1:10-10:1, наприклад 1:8-8:1, 316-611, 1:4-4:1, 1:2-2:1 або 1:1. Ферментна суміш/композиція цього винаходу може додатково містити додаткові компоненти, які можуть бути допоміжними білками або іншими білковими/небілюювими компонентами. Ці додаткові компоненти можуть становити, наприклад, 1-50 мас. 905, 1-10 мас. 95, 2-5 мас. 95, 5-10 мас. 95 або 5-20 мас. 95 загальної маси білків в цій композиції. Описана тут ферментна суміш/композиція є, наприклад, композицією ферментаційного бульйону. Цей ферментаційний бульйон є, наприклад, бульйоном міцеліального гриба, в тому числі, без обмеження, Тгісподегта,
Нитісоїа, Ризагішт, Авгрегодійшв, Меийговзрога, РепісйШішт, Серпаіозрогішт, АсНіуа, Родозрога,
Епдоїщшіа, Мисог, СосПпіІйороЇш5, Ругісшіагіа або Спгузозрогішт. Одним прикладом гриба
Тиісподента 5рр. є Тісподепта геезеі. Одним прикладом гриба Репісіййшт 5рр. є РепісшШит
Типісцобзит. Цей ферментаційний бульйон може бути, наприклад, безклітинним ферментаційним бульйоном або бульйоном цільних клітин. Ферментна суміш/композиція цього винаходу, описана тут, може бути також целюлазною композицією, наприклад целюлазною композицією міцеліальних грибів. Ця целюлазна композиція, наприклад, може бути продукована міцеліальним грибом, таким як Тгісподегта.
Ці ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані в харчовій промисловості, наприклад для випікання, для обробки фрукти і овочів, в руйнуванні сільськогосподарських відходів, в приготуванні корму для тварин, у виробництві целюлози і паперу, у виготовленні текстилю або в домашніх і промислових чистильних агентах. Ці ферменти і ферменти в ферментних сумішах/композиціях цього опису продукуються, наприклад, кожний незалежно, мікроорганізмом, наприклад грибами або бактеріями.
Ці ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані також як комерційні ферменти або композиції для розщеплення лігноцелюлози з будь-яких придатних джерел, що включають в себе всі біологічні джерела, такі як рослинні біомаси, наприклад кукурудза, зернові злаки (наприклад, соргаструм пониклий, такий як 5огупавзігит пшап5; або просо прутоподібне, наприклад виду Рапісит, такого як Рапісит мігда(шт), або деревину або продукти переробки деревини, в промисловості, що переробляє деревину, деревні стружки, іМабо в паперовій промисловості, в текстильній промисловості, в домашніх і промислових чистильних агентах і/або в переробці відходів біомас.
У іншому аспекті цей опис забезпечує виділені, синтетичні або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що мають щонайменше приблизно 7095, наприклад щонайменше приблизно 7195,
Тео, Зо, т49Уо, ТУ, бю, 7ичУо, 78905, 7995, 8095, 8190, 8295, 8395, 8495, 8590, 8695, 8795, 8890; 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9696, 9795, 9895, 9995 або повну (10095), ідентичність послідовності з послідовністю нуклеїнових кислот 5ЕО ІЮО МО-:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49 або 50 на протязі району щонайменше приблизно 10, наприклад щонайменше приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 або 2000, залишків. У зв'язку з цим даний опис забезпечує виділені, синтетичні або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, які здатні гібридизуватися, при умовах високої жорсткості, з комплементом 9795, 9895, 9995 або повної (10095) ідентичності послідовності з послідовностями нуклеїнових кислот 5ЕО ІЮ МО-:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,
А1, 46, 47, 48, 49 або 50 або їх фрагментом. Цей фрагмент може, наприклад, мати довжину щонайменше 200, 250 або 300 суміжних залишків. Даний опис забезпечує нуклеїнові кислоти,
Зо що кодують поліпептид, який має геміцелюлолітичну активність. Зразкова геміцелюлолітична активність включає в себе, без обмеження, ксиланазну, В-ксилозидазну і/або І1-а- арабінофуранозидазну активність. Зразкові поліпептиди, що мають геміцелюлолітичну активність, включають в себе, без обмеження, ксиланазу, ДВ-ксилозидазу і/або І1-а- арабінофуранозидазу.
Цей опис додатково забезпечує виділені, синтетичні або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що кодують фермент цього опису, який включає в себе поліпептид, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43 або 44 або їх субпослідовність (наприклад, каталітичний домен ("СО") або вуглеводзв'язувальний модуль ("СВМ")), або їх придатний варіант. У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота цього опису кодує зрілий білок або білок з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43 або 44, який необов'язково функціонально зв'язаний з гетерологічною сигнальною послідовністю, наприклад сигнальною послідовністю Тгісподегта геезеі СВНІ. Переважно, ця нуклеїнова кислота кодує поліпептид, який має геміцелюлолітичну активність, наприклад ксиланазну, рД-ксилозидазну і/або І-с-арабінофуранозидазну активність. Нуклеїнова кислота цього опису кодує геміцелюлазу, наприклад ксиланазу, ДВ-ксилозидазу і/або 1-а- арабінофуранозидазу або їх придатний варіант. Додаткові нуклеїнові кислоти цього опису представлені в розділі 6.2 нижче.
Цей опис додатково забезпечує експресійні касети, що містять нуклеїнову кислоту цього опису або її субпослідовність. Наприклад, ця нуклеїнова кислота має щонайменше приблизно 7095, наприклад щонайменше приблизно 7595, 8095, 8595, 9095, 91905, 9295, 93905, 94905, 9595, 9690, 9795, 9895 або 9995, ідентичність послідовності з послідовністю нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ
МО:-1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49 або 50 на протязі району щонайменше приблизно 10 залишків, наприклад щонайменше приблизно 10, 20, 30, 40, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 500 залишків. У іншому прикладі ця нуклеїнова кислота кодує поліпептид 5ЕО ІЮО МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43 або 44, де ця нуклеїнова кислота необов'язково функціонально зв'язана з промотором. Цим промотором може бути, наприклад, грибний, вірусний, бактеріальний промотор, промотор ссавця або промотор рослини. Цим промотором може бути бо конститутивний промотор або індукований промотор. Зразковий придатний промотор може експресуватися в міцеліальних грибах, наприклад Тгісподепта геезеі. Придатний промотор може бути одержаний з міцеліального гриба, наприклад Тгісподегта геезеї, наприклад промотор гена целобіогідролази І ("СЬН1") з Тіснподента геезві.
Цей опис забезпечує додатково рекомбінантну клітину, сконструйовану для експресії нуклеїнової кислоти цього опису або експресійної касети цього опису. Наприклад, ця нуклеїнова кислота має щонайменше приблизно 7095, наприклад щонайменше приблизно 7595, 8095, 8590, 9095, 9195, 9295, 9395, 94905, 9595, 9б9Ую, 9795, 9895 або 9995, ідентичність послідовності з послідовністю нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО':1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49 або 50 на протязі району щонайменше приблизно 10 залишків, наприклад щонайменше приблизно 10, 20, 30, 40, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 500 залишків. Ця нуклеїнова кислота може кодувати поліпептид 5ЕО ІЮ МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43 або 44, де ця нуклеїнова кислота необов'язково функціонально зв'язана з промотором. Ця експресійна касета може містити нуклеїнову кислоту, що має щонайменше приблизно 7095 (наприклад, щонайменше приблизно 7595, 8095, 8595, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995) ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО-1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49 або 50 на протязі району щонайменше приблизно 10 нуклеотидних залишків. Наприклад, ця експресійна касета може містити нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид 5ЕО ІО МО :2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43 або 44, де ця нуклеїнова кислота необов'язково функціонально зв'язана з промотором.
Рекомбінантною клітиною є переважно рекомбінантна бактеріальна клітина, рекомбінантна клітина ссавця, рекомбінантна грибна клітина, рекомбінантна дріжджова клітина, рекомбінантна клітина комахи, рекомбінантна клітина водорості або рекомбінантна клітина рослини. Наприклад, цією рекомбінантною клітиною є рекомбінантна клітина міцеліального гриба, така як клітина Тгісподегта, Нитісоїа, Ризагішт, АврегоїЙйи5, Меигозрога, Репісіит,
Сернаіозропит, Аспіуа, Родозрога, Епаоїйіа, Мисог, СоспііобоЇи5, Ругісшіагіа або Спгузозрогійт.
Цей опис забезпечує трансгенні рослини, що містять нуклеїнову кислоту цього опису або експресійну касету цього опису.
Цей опис забезпечує виділені, синтетичні або рекомбінантні поліпептиди, які містять
Зо амінокислотну послідовність, що має щонайменше приблизно 8095, наприклад щонайменше приблизно 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 95965, 9695, 9795, 9895 або 9995 або повну (10095), ідентичність послідовності з поліпептидом 5ЕО ІЮ
МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43 або 44 на протязі району щонайменше приблизно 10, наприклад щонайменше приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 або 350, залишків або на протязі повної довжини незрілого поліпептиду, повної довжини зрілого поліпептиду, повної довжини СО або повної довжини СВМ. Зразкові поліпептиди включають в себе фрагменти довжиною щонайменше приблизно 10, наприклад щонайменше приблизно 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, залишків. У конкретних варіантах здійснення, ці фрагменти містять СО і/або СВМ. Коли фрагмент містить як СО, так і СВМ ферменту цього опису, цей фрагмент необов'язково включає в себе лінкер, що розділяє СО і СВМ. Цим лінкером може бути природний лінкер або гетерологічний лінкер. У деяких варіантах здійснення поліпептиди цього опису мають одну або декілька геміцелюлазних активностей. Поліпептидні або пептидні послідовності цього опису включають в себе послідовності, що кодуються нуклеїновими кислотами цього опису. Зразкові поліпептиди описані в розділі 6.1.
Цей опис додатково забезпечує химерний або злитий білок, що містить щонайменше один домен поліпептиду цього опису (наприклад, СО, СВМ або обидва). Щонайменше один домен може бути функціонально зв'язаний з другою амінокислотною послідовністю, наприклад сигнальною пептидною послідовністю.
Таким чином, цей опис забезпечує химерний або злитий білок, що містить сигнальну послідовність поліпептиду цього опису, функціонально зв'язану з другою послідовністю, наприклад, що кодує амінокислотну послідовність гетерологічного поліпептиду, який не асоційований природно з цією сигнальною послідовністю. Таким чином, цей опис забезпечує рекомбінантний поліпептид, що містить залишки 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1- 21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38 або 1-40 поліпептиду, наприклад, з послідовностями 5ЕО ІЮ МО2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43 або 44. Додаткові зразкові химерні або злиті поліпептиди описані в розділі 6.1.1.
Цей опис забезпечує також способи одержання рекомбінантного поліпептиду, які передбачають: (а) культивування клітини-хазяїна, сконструйованої для експресії поліпептиду цього опису; і (б) витягання цього поліпептиду. Витягання цього поліпептиду включає в себе, наприклад, витягання ферментаційного бульйону, що містить цей поліпептид. У деяких варіантах здійснення витягання цього поліпептиду може включати в себе додаткову стадію (додаткові стадії) очищення.
Цей опис забезпечує способи гідролізу, розривання або руйнування целоолігосахариду, арабіноксиланового олігомеру або глюкан- або целюлозовмісної композиції, які передбачають контактування цієї композиції з ферментом, ферментною сумішшю/композицією цього опису при придатних умовах, де цей фермент або ферментна суміш/композиція гідролізує, розриває або руйнує целоолігосахарид, арабіноксилановий олігомер або глюкан- або целюлозовмісну композицію.
Цей опис забезпечує ферментні суміші або композиції (також звані тут "фФерментною сумішшю/композицією"), які містять поліпептид цього опису або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою цього опису. У деяких варіантах здійснення поліпептид цього опису має одну або декілька активностей, вибраних з ксиланазної, ДВ-ксилозидазної і 1-а- арабінофуранозидазної активностей. У деяких варіантах здійснення ферментні суміші/композиції використовуються або є застосовними для деполімеризації целюлозних і геміцелюлозних полімерів до метаболізованих вуглецевих частин молекул. Ферментні суміші цього опису можуть знаходитися у формі композиції, наприклад у вигляді продукту виготовлення. Ця композиція може бути, наприклад, готовою формою і може мати фізичну форму, наприклад рідини або твердої речовини. У зразкових варіантах здійснення ферментна суміш/композиція цього опису включає в себе целюлазу, що містить щонайменше три різних типи ферментів, вибрані з (1) ендоглюканази, (2) целобіогідролази і (3) ВД-ксилозидази; або щонайменше три різні ферментативні активності, вибрані з (1) ендоглюканазної активності, каталізуючої розщеплення внутрішніх Д8-1,4-зв'язків целюлозних або геміцелюлозних матеріалів, що приводить до більш коротких глюкоолігосахаридів, (2) целобіогідролазної активності, каталізуючої розщеплення і вивільнення, "екзо"-способом, одиниць целобіози (наприклад, Д-1,4-глюкоза-глюкоза-дисахариду) і (3) Д-глюкозидазної активності, каталізуючої
Зо вивільнення глюкозних мономерів з коротких целоолігосахаридів (наприклад, целобіози).
Зразкові ферментні суміші/композиції цього опису представлені в розділі 6.3.4. нижче.
У іншому аспекті цей опис забезпечує способи обробки матеріалу біомаси, що містить лігноцелюлозу, які передбачають контактування композиції, що містить целюлозу і/або ферментований цукор, з поліпептидом цього опису або поліпептидом, що кодується нуклесновою кислотою цього опису, або ферментною сумішшю/композицією (наприклад, продуктом виготовлення (виробом)) цього опису. Придатний матеріал біомаси, що містить лігпоцелюлозу, може бути одержаний з сільськогосподарської культури, побічного продукту кормового або харчового виробництва, відходів одержання лігноцелюлозного продукту, залишку рослин або відходів паперу або продукту з відходів паперу. Поліпептиди цього опису можуть мати одну або декілька ферментативних активностей, вибраних з целюлазної, ендоглюканазної, целобіогідролазної, В-глюкозидазної, ксиланазної, мананазної, ВД- ксилозидазної, арабінофуранозидазної і інших геміцелюлазних активностей. Придатні відходи рослин можуть включати в себе зерно, насіння, стебла, листя, шкірку, шкаралупу, серцевини кукурудзяних качанів, солому, трави, деревину, деревні стружки, деревну масу і тирсу. Травами можуть бути, наприклад, Індійська трава або соргаструм пониклий. Травою може бути також, наприклад, Міскантус (Мізсапіпи5). Паперовими відходами можуть бути, наприклад, викинений або використаний папір для фотокопій, папір для принтерів комп'ютерів, папір для ноутбуків, папір для друкарських машинок, газети, журнали, картон і різні пакувальні матеріали на основі паперу. Паперовими відходами може також бути, наприклад, паперова волокниста маса.
Цей опис забезпечує композиції (що включають в себе ферменти, ферментні суміші/композиції, наприклад продукти виготовлення (вироби) цього опису), які містять суміш гідролізуючих геміцелюлозу і целюлозу ферментів і щонайменше один матеріал біомаси.
Необов'язково, цей матеріал біомаси містить лігноцелюлозний матеріал, одержаний з сільськогосподарської культури. Альтернативно, матеріалом біомаси є побічний продукт виробництва їжі і кормів. Придатний матеріал біомаси може бути також лігноцелюлозним побічним продуктом, залишками рослин, відходами паперу або продуктом з відходів паперу або містить відходи рослин. Ці відходи рослин можуть включати в себе зерно, насіння, стебла, листя, шкірку, шкаралупу, серцевини кукурудзяних качанів, солому, трави, деревину, деревні стружки, деревну масу і тирсу. Травами можуть бути, наприклад, Індійська трава або бо соргаструм пониклий. Травою можливо також, наприклад, Міскантус (Мізсапіпиз). Прикладами паперових відходів можуть бути, наприклад, викинений або використаний папір для фотокопій, папір для принтерів комп'ютерів, папір для ноутбуків, папір для друкарських машинок, газети, журнали, картон і різні пакувальні матеріали на основі паперу. Приклади паперових відходів можуть також включати в себе, наприклад, паперову волокнисту масу.
Вся доступна публічно інформація, до дати подачі заявки, що включає в себе, наприклад, публікації, патенти, заявки на патент, послідовності СепВапк і депозити АТСС, цитовані тут, спеціально включені тут за допомогою посилання. 5. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР І ТАБЛИЦЬ
Таблиці 1А, 18. Таблиця 1А забезпечує підсумовування ідентифікаторів послідовностей, використовуваних в даному описі винаходу для глікозилгідролазних ферментів; Таблиця 18 забезпечує номери доступу для додаткових глікозилгідролазних ферментів, на які робляться посилання в прикладах.
Таблиця 2. Активність експресованих білків на синтетичних субстратах рМРА і рМРХ (визначених в розділі 7.1.6 нижче) відносно фонової активності хазяїна Тгісподегта геєезвї Оцай деїіеїе. Фон хазяїна Оцаай аеїеїе (або "Хоцай") визначається як активність експресованого білка (експресованих білків) в штамі Оцай деїейе, ділена на активність фонового штаму Оцай авє!еїе без експресованого білка (експресованих білків). Наприклад, величина »1 вказує на те, що цей експресований білок має активність, більш високу, ніж активність фону.
Таблиця 3. Ксиланазна активність очищених кандидатних ендоксиланаз з ксиланом деревини берези, інкубованим при 507С, рн 5.
Таблиця 4. Процентне перетворення олігомерів арабіноксилану серцевин кукурудзяних качанів з розрахунку на загальний доступний цукор, визначене за допомогою кислотного гідролізу. Дивіться приклад 4.
Таблиця 5. Результати експерименту (описаного в прикладі 7), що визначають рівень геміцелюлозної активності для гідролізу обробленої серцевини кукурудзяного качана до мономерних цукрів. Стовпець, озаглавлений "Ж досліду", показує рандомізований експериментальний порядок. Стовпець, озаглавлений "Ж випробування", показує послідовність стандартної експериментальної схеми. Стовпець, озаглавлений "Оцай", показує фракцію загального білка, яка походить з культурального супернатанту для росту штаму Оцай ав!івїєй
Зо Т. геезеї. Стовпець, озаглавлений "Хуп3", показує фракцію загального білка, яка є Хуп3
Тіісподегпта геезеї. Стовпець, озаглавлений "Рм430", показує фракцію загального білка, яка є
Ем430О0. Стовпець, озаглавлений "Ем51А", показує фракцію загального білка, яка є ЕМАТА.
Стовпець, озаглавлений "Рм4З3А", показує фракцію загального білка, яка є Ем43А. Стовпець, озаглавлений "Рм43В", показує фракцію загального білка, яка є Ем43В. Стовпець, озаглавлений "навантаження (мкг/мл вуглеводу)", показує білок, завантажений в реакцію оцукрювання, в одиницях мікрограмів білка на міліграм вуглеводу. Стовпці, озаглавлені "Ху! мг/мл, Сім мг/мл,
Агаь мг/мл і сжЖХ А мг/мл", показують концентрацію ксилози, глюкози, арабінози і комбінації цих трьох цукрових продуктів, яка детектується в кінці реакції оцукрювання. Стовпці, озаглавлені "Ху теор. 9У5, СІ теор. 95 і Агар теор. 95", показують процент теоретичного виходу ксилози, глюкози і арабінози, що досягається в кінці реакції оцукрювання.
Таблиця 6. Розраховані співвідношення семи ферментних компонентів для передбаченого максимального виходу глюкози, ксилози і арабінози з гідролізу серцевини кукурудзяного качана. Стовпець "навантаження загальних мг/г вуглеводів" показує загальну дозу ферменту, при якій розраховуються ці прогнози. Ряди, озаглавлені "Загальне число мг/мл СЖХА, 95 вихід глюкози, 95 вихід ксилози і 95 вихід арабінози", показують реакцію, для якої був розрахований оптимум. Стовпець, озаглавлений "г2-дані, підігнані до моделі, включають в себе обидва завантаження", показує г-5диагей статистичний параметр для підгонки моделі до даних, представлених в таблиці 5. Стовпці, озаглавлені "фракція АссеїПегазе, фракція Оцчаай аеї 5!йр, фракція очищеного Тгісподегта геезеії Хуп3, фракція очищеного Ем430О, фракція очищеного
Ем51А, фракція очищеного Ем4ЗА і фракція очищеного Ем43В", показують фракцію того компонента, який, як розраховано, є оптимальним, за допомогою моделі, підігнаної до даних в таблиці 5.
Таблиця 7. Уточнення завантажень ферменту для максимального гідролітичного перетворення серцевини кукурудзяного качана з використанням сумішей, що включають в себе ферменти ЕмУЗА і Ем430 в 1,06 г, 1495 сухих речовин в реакціях передобробленої серцевини кукурудзяного качана. Стовпці, відмічені назвами ферментів, вказують мг кожного з перерахованих ферментів на грам використовуваного глюкану або ксилану.
Таблиця 8. Уточнення завантажень ферменту для максимального перетворення серцевини кукурудзяного качана з використанням сумішей, що містять Ем5т1А як єдину 1-а- 60 арабінофуранозидазу в 1,06 г, 1495 сухих речовин в реакціях передобробленої серцевини кукурудзяного качана. Умови, використовувані для оцукрювання, були такими, як умови, описані в прикладі 7. Стовпці, відмічені назвами ферментів, вказують мг кожного з перерахованих ферментів на грам використовуваного глюкану або ксилану. Стовпці, відмічені назвами вуглеводів, показують мг/мл кожного продукованого вуглеводного продукту, на основі вимірювань, проведених з використанням витіснювальної хроматографії. Стовпець »2ар2 включає в себе всі олігомери, більші ніж дисахарид.
Таблиця 9. Виходи цукру, одержані з сумішей А, В, С очищених геміцелюлаз, тестованих в 1,06 г, 1495 сухих речовин в реакціях передобробленої серцевини кукурудзяного качана. Умови, використовувані для оцукрювання, були такими, як умови, описані в прикладі 7. Суміш А: 6 мг
ХупЗ3 Тісподепта геезеї, 4 мг ЕмЗА, 1 мг Ем51А на грам ксилану. Суміш В: 6 мг ХупЗ3 Пісподетта геезеї, 1 мг Ем4а30О, З мг ЕмазА, З мг Ем43В на грам ксилану. Суміш С: 6 мг ХупЗ3 Пісподетптта геезеї, З мг ЕмЗА, 1 мг Ем430, 1 мг ЕмМ51А на грам ксилану. Стовпці, відмічені мономерними цукрами, показують 95-й вихід кожного з перерахованих мономерів.
Таблиця 10. Виходи цукрів з обробки препаратів геміцелюлози з серцевини кукурудзяного качана, сорго, проса прутоподібного і багаси цукрової тростини сумішами геміцелюлози А, В, С.
Ці реакції проводили при 100-мкл шкалі в 50 мМ рН 5,0 натрійацетатному буфері протягом 6 годин при 48"С, як описано в прикладі 8. Показаний 5-й вихід для кожного мономерного цукру.
Таблиця 11. Концентрація більшості ферментів, експресованих різними інтегрованими експресійними штамами Т. геезеї (позначеними НЗА, З9А, 69А, АТОА, ОбА, 102, 44А, 11А, Б9А), визначена процентом інтегрованої зони ВЕРХ.
Таблиця 12. Перелік параметрів передобробки проса прутоподібного і результати оцукрювання з різних передобробок.
Таблиця 13. Результати оцукрювання пульпи твердої деревини ферментною композицією, продукованою інтегрованим штамом Т. геезеії НЗА, в реакціях з різними кількостями сухих речовин, ферментів і часом інкубування.
Таблиця 14. Оцукрювання пульпи твердої деревини ферментною композицією, продукованою інтегрованим штамом НЗА на протязі діапазону температур і діапазону рн.
Були передбачені сигнальні послідовності, перераховані нижче і в прикладах. Ці прогнози виконували з використанням алгоритму зЗідпаІР (доступного в пЕр:/Лимли.ср5.аш.ак). Прогнози
Ко) доменів виконували на основі однієї або декількох з баз даних Ріат, ЗМАКТ або МСВІ.
Фіг. 1А, 18. Фіг. 1А: нуклеотидна послідовність ЕМЗА (ЗЕО ІЮО МО:1). Фіг. 18: амінокислотна послідовність ЕмЗА (5ЕБЕО ІЮ МО:2). 5ЕО ІЮ МО:2 є послідовністю незрілого ЕмЗА. Ем3ЗА має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-23 5ЕО ІО МО:2 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 24-766 5ЕБЕО ІЮ МО:2. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 2А, 2В. Фіг. 2А: нуклеотидна послідовність РІ4ЗА (5ЕО ІЮО МО:3). Фіг. 2В: амінокислотна послідовність РІ4АЗА (5ЕО ІЮ МО:4). БЕО ІЮО МО:4 є послідовністю незрілого РІ4ЗА. РІ4ЗА має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-20 5ЕО ІЮО МО:4 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 21-445 5ЕО ІЮ МО:4. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом, передбачений вуглеводзв'язувальний модуль (СВМ") показаний великими буквами і передбачений лінкер, що розділяє СО і СВМ, вказаний курсивним шрифтом.
Фіг. ЗА, ЗВ. Фіг. ЗА: нуклеотидна послідовність Ем43Е (5ЕО ІЮО МО:5). Фіг. ЗВ: амінокислотна послідовність ЕмаЗЕ (З5ЕО ІЮ МО:6). 5ЕО ІЮ МО:6 є послідовністю незрілого Ем4З3Е. Ем4З3Е має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-18 5ЕО ІЮО МО:6 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 19-530 5ЕО ІЮ МО:6. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 4А,4В. Фіг. 4А: нуклеотидна послідовність ЕМ39А (ЗЕО ІЮ МО:7). Фіг. 4В: амінокислотна послідовність Ем39А (З5ЕО ІЮ МО:8). БЕО ІЮО МО:8 є послідовністю незрілого Ем39А. Ем39А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-19 5ЕО ІЮО МО:8 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 20-439 5ЕО ІЮ МО:8. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 5А, 5В. Фіг. БА: нуклеотидна послідовність Ем4ЗА (5ЕО ІЮО МО:9). Фіг. 58: амінокислотна послідовність Ем4ЗА (5ЕО ІО МО:10). БЕО ІЮО МО:10 є послідовністю незрілого Ем4ЗА. Ем4З3А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-22 5ЕО ІЮО МО:10 (підкреслену); 60 передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 23-449 5ЕО ІЮ МО:10. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом, передбачений СВМ показаний великими буквами і передбачений лінкер, що розділяє консервативний домен і СВМ, вказаний курсивним шрифтом.
Фіг. бА, 6В. Фіг. бА: нуклеотидна послідовність Ем43В (ЗЕО ІЮО МО:11). Фіг. 6В: амінокислотна послідовність Ем43В (5ЕО ІО МО:12). БЕО ІО МО:12 є послідовністю незрілого Ем43В. Ем43В має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-16 5ЕО ІЮ МО:12 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 17-574 5ЕО ІЮ МО:12. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 7А, 7В. Фіг. 7А: нуклеотидна послідовність РабБтА (5ЕБО ІЮ МО:13). Фіг. 7В: амінокислотна послідовність РабтА (5ЕО ІЮО МО:14). БЕО ІЮ МО:14 є послідовністю незрілого
Раб1А. РабтА має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-20 5ЕО І
МО:14 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 21-676 5БО ІЮ МО:14. Передбачений консервативний домен І-а-арабінофуранозидази показаний жирним шрифтом. Для цілей експресії ця геномна ДНК була оптимізована відносно кодонів для експресії в Т. геезеї (дивіться фіг. 60В).
Фіг. 8А, В. фіг. ВА: нуклеотидна послідовність 5243А (ЗЕО ІЮО МО:15). Фіг. 88: амінокислотна послідовність 5243А (5ЕО ІЮ МО:16). 5ЕБЕО ІЮ МО:16 є послідовністю незрілого 5243А. 5243А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-18 5БЕО ІЮ МО:16 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 19-340 5ЕО ІЮ МО:16. Для цілей експресії передбачену сигнальну послідовність (3743А замінювали сигнальною послідовністю Т. геезеї
СВНІ (тугКІамізапасага (ЗЕО ІО МО:51)) в Т. геезеї (дивіться фіг. 61).
Фіг. 9А, 9В. Фіг. 9А: нуклеотидна послідовність Ео43А (5ЕО ІЮ МО:17). Фіг. 98: амінокислотна послідовність Го43А (5ЕО ІЮ МО:18). 5ЕО ІЮО МО:18 є послідовністю незрілого Го43А. Бо43А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-20 5БЕО І МО:18 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 221-348 5ЕО І МО:18. Передбачений
Зо консервативний домен показаний жирним шрифтом. Для цілей експресії передбачену сигнальну послідовність Го43А замінювали сигнальною послідовністю Т. геезеі СВНІ (тугКкІамізапагага (ЗЕО ІО МО:51)) (дивіться фіг. 62).
Фіг. 10А, 108. Фіг. 10А: нуклеотидна послідовність АТЗА (5ЕБО ІЮО МО:19). Фіг. 108: амінокислотна послідовність АТ43ЗА (5ЕО ІЮ МО:20). 5ЕО ІО МО:20 є послідовністю незрілого
АТ4ЗА. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 11А, 118. Фіг. 11А: нуклеотидна послідовність РІБТА (5ЕБЕО ІЮО МО:21). Фіг. 118: амінокислотна послідовність РІБТА (5ЕО ІЮ МО:22). БЕО ІО МО:22 є послідовністю незрілого
РІБ1А. РІ51А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-20 5ЕО І
МО:22 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 21-642 5ЕО ІЮ МО:22. Передбачений консервативний домен І1-а-арабінофуранозидази показаний жирним шрифтом. Для цілей експресії передбачену сигнальну послідовність РІБТЛА замінювали оптимізованою відносно кодонів сигнальною послідовністю Т. геезеі СВНІ (тугКіамізайагага (5ЕО 10 МО:51)) (підкресленою) і нуклеотидну послідовність РІЗТА оптимізували відносно кодонів для експресії в Т. геезві (дивіться фіг. 63).
Фіг. 12А, 128. Фіг. 12А: нуклеотидна послідовність АїТиХуп2 (ЗЕО ІО МО:23). Фіг. 128: амінокислотна послідовність АгТиХуп2 (ЗЕО ІО МО:24). БЕО ІЮО МО:24 є послідовністю незрілого
АтиХуп2. АтиХуп2 має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-18 5ЕО
ІЮО МО:24 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає
БО зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 119-228 5ЕО І МО:24.
Передбачений консервативний домен СНІ1Т1 показаний жирним шрифтом.
Фіг. 13А, 138. Фіг. 13А: нуклеотидна послідовність АїТиХуп5 (ЗЕО ІЮО МО:25). Фіг. 138: амінокислотна послідовність АгТиХуп5 (5ЕО ІЮ МО:26). БЕО ІО МО:26 є послідовністю незрілого
АтиХуп5. АгтиХуп5 має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-19 5ЕО
ІО МО:26 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 020-313 5ЕО 10 МО:26.
Передбачений консервативний домен СНІ1Т1 показаний жирним шрифтом.
Фіг. 14А, 148. Фіг. 14А: нуклеотидна послідовність Ем430 (ЗЕБО ІЮ МО:27). Фіг. 148: амінокислотна послідовність Ем43О (5ЕО ІЮ МО:28). БЕО ІЮО МО:28 є послідовністю незрілого 60 Ем4а30. Рм430 має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-20 5ЕО І
МО:28 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 21-350 5ЕБО ІЮ МО:28. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 15А, 158В. Фіг. 15А: нуклеотидна послідовність РІ43В (5ЕБЕО І МО:29). Фіг. 158: амінокислотна послідовність РІА3ЗВ (5ЕО ІЮ МО:30). 5ЕО ІО МО:30 є послідовністю незрілого
РІ43В. РІ4З3В має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-20 5ЕО ІЮ
МО:30 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 21-321 5ЕБО ІЮ МО:30. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 16А, 168. Фіг. 16А: нуклеотидна послідовність Ем51А (5ЕО ІЮО МО:31). Фіг. 168: амінокислотна послідовність Ем5ТА (5ЕО ІЮ МО:32). 5ЕО ІЮ МО:32 є послідовністю незрілого
Ем5о1А. Гм51А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-19 5ЕО ІЮ
МО:32 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 20-660 5ЕБО ІЮ МО:32. Передбачений консервативний домен І -л-арабінофуранозидази показаний жирним шрифтом.
Фіг. 17А, 17В. Фіг. 17А: нуклеотидна послідовність С9518 (5ЕО ІЮ МО:33). Фіг. 178В: амінокислотна послідовність С951В (5ЕБЕО ІЮ МО:34). 5ЕО ІО МО:34 є послідовністю незрілого
С9518. С9518 має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-20 5ЕО ІЮ
МО:34 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 21-670 5ЕБО ІЮ МО:34. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 18А, 188. Фіг. 18А: нуклеотидна послідовність Ем43С (5ЗЕБЕО ІЮ МО:35). Фіг. 188: амінокислотна послідовність Ем4З3С (5ЕО ІЮ МО:36). 5ЕО ІЮ МО:36 є послідовністю незрілого
Емаз3С. Рм43С має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-22 5ЕО І
МО:36 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 23-333 5ЕБО ІЮ МО:36. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 19А, 198. Фіг. 19А: нуклеотидна послідовність Ем30А (5ЕО ІЮ МО:37). Фіг. 198: амінокислотна послідовність Ем30А (ЗЕ ІЮО МО:38). 5ЕО ІЮ МО:38 є послідовністю незрілого
Ко) Ем3З0А. ГмЗ0А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-19 5ЕО ІЮ
МО:38 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 20-537 5ЕО ІЮ МО:38.
Фіг. 20А, 208. Фіг. 20А: нуклеотидна послідовність Ем43Е (5ЕБО ІЮ МО:39). Фіг. 208: амінокислотна послідовність Ем4З3Е (5ЕО ІЮ МО:40). 5ЕО ІЮ МО:40 є послідовністю незрілого
Ем4аЗБг. Ем43Е має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-20 5ЕО І
МО:40 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 21-315 5ЕО ІЮ МО:40.
Фіг. 21А, 218. Фіг. 21А: нуклеотидна послідовність Хуп3 Тгісподегта геезеї (ЗЕО ІЮО МО:41).
Фіг. 218: амінокислотна послідовність ХупЗ3 Тгісподепта геезеї (ЗЕО ІЮ МО:42). 5ЕО ІЮО МО:42 є послідовністю незрілого ХупЗ3 Тгісподегта геезеї. Хуп3 Тгісподегта геезеї має передбачену сигнальну послідовність, відповідну положенням 1-16 ЗЕО б МО:42 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну положенням 117-347 5ЕО ІЮ МО:42. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Фіг. 22. Амінокислотна послідовність Хуп2 Тгісподегта геезеії (ЗЕО ІЮ МО:43). Сигнальна послідовність підкреслена. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Кодуюча послідовність може бути знайдена в Тоітопеп еї аі. ВібтесппоЇоду, 1992, 10:1461-65.
Фіг. 23. Амінокислотна послідовність Вхі! Тгісподепта геезеі (ЗЕО ІЮ МО:44). Сигнальна послідовність підкреслена. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Кодуюча послідовність може бути знайдена в МагдоїІе5-СіагКк єї а. Аррі. Епмігоп. Містобіо!. 1996, 6б2(10):3840-46.
Фіг. 24. Амінокислотна послідовність Во!І1ї Тгісподегта геезеі (ЗЕО ІЮ МО:45). Сигнальна послідовність підкреслена. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом.
Кодуюча послідовність може бути знайдена в Вагтей еї аї. Віо- Тесппоіоаду, 1991, 9(6):562-567.
Фіг. 25. Аналіз целюлазної активності з використанням РАБЗС-гідролізу з калькофлуор- детектуванням.
Фіг. 26. Профіль елюції ксиланази.
Фіг. 27. ДСН-ПААГ-детектування двоступеневого розділення АТиХуп5. Доріжка 1: неочищена проба. Доріжка 2: елюат з феніл-колонки. Доріжка 3: елюат з СЕ-колонки. 60 Фіг. 28. Плазміда РЕМТК/О-ТОРО.
Фіг. 29. рТтехЗам.
Фіг. ЗОА, ЗОВ. Продуктивність різних ферментів на серцевинах кукурудзяних качанів як субстраті. Стрижні помилок представляють експериментальні помилки, асоційовані з тричі повторюваними аналізами кукурудзяних качанів. Числа в дужках вздовж х-осі представляють дози ферментів в мг білка на г целюлози.
Фіг. 31. Продуктивність різних ферментних сумішей/композицій на серцевинах кукурудзяних качанів як субстраті. Стрижні помилок представляють експериментальні помилки, асоційовані з тричі повторюваними аналізами кукурудзяних качанів. Числа в дужках вздовж х-осі представляють дози ферментів в мг білка на г целюлози.
Фіг. 32. Продуктивність різних ферментних сумішей/композицій на серцевинах кукурудзяних качанів як субстраті. Стрижні помилок представляють експериментальні помилки, асоційовані з тричі повторюваними аналізами кукурудзяних качанів. Числа в дужках вздовж х-осі представляють дози ферментів в мг білка на г целюлози.
Фіг. 33. Продуктивність різних ферментних сумішей/композицій на серцевинах кукурудзяних качанів як субстраті. Стрижні помилок представляють експериментальні помилки, асоційовані з тричі повторюваними аналізами кукурудзяних качанів. Числа в дужках вздовж х-осі представляють дози ферментів в мг білка на г целюлози.
Фіг. 34. Продуктивність різних ферментних сумішей/композицій на серцевинах кукурудзяних качанів як субстраті. Стрижні помилок представляють експериментальні помилки, асоційовані з тричі повторюваними аналізами кукурудзяних качанів. Числа в дужках вздовж х-осі представляють дози ферментів в мг білка на г целюлози.
Фіг. ЗБА-35С. Продуктивність різних ферментних сумішей/композицій на серцевинах кукурудзяних качанів як субстраті. Стрижні помилок представляють експериментальні помилки, асоційовані з тричі повторюваними аналізами кукурудзяних качанів. Числа в дужках вздовж х- осі представляють дози ферментів в мг білка на г целюлози.
Фіг. 36. Аномерна область протонного ЯМР коротких олігомерів арабіноксилану показує розщеплення з використанням Ем43А плюс Ем438В.
Фіг. 37. Аномерна область протонного ЯМР коротких олігомерів арабіноксилану показує відщеплення Д-1,2-зв'язаної ксилози від арабінози з використанням ЕмЗА.
Фіг. 38. Зіставлення між амінокислотними послідовностями В-ксилозидази Тгісподептта геезеї і ЕУЗА.
Фіг. 39. Плазміда РЕМТК-ТОРО-Ваї (943/942).
Фіг. 40. Експресуючий вектор рТгехЗд 943/942 Ва1.
Фіг. 41. Плазміда РЕМТК-Тгісподетта геезеї Хупз.
Фіг. 42. Експресуючий вектор рТгехЗд/ЛІгісподегта геезеї Хуп3.
Фіг. 43. Плазміда РЕМТК-ЕУЗА.
Фіг. 44. Експресуючий вектор рТгехбд/ЕмЗА.
Фіг. 45. Плазміда ТОРО ВіІип/Реді!1 -"м430.
Фіг. 46. Плазміда ТОРО ВіІоп/Реді1-ЕмотА.
Фіг. 47А-47О0. Перетворення глюкану (фіг. 47А) і ксилану (фіг. 478) в мономерні цукри за допомогою ферментаційних бульйонів секретованого ферменту з інтегрованих експресуючих штамів Т. геезеі. Проби 3-ого дня аналізували на міру перетворення глюкану і ксилану як в мономерні, так і в розчинні олігомерні продукти (фіг. 47С). Фіг. 47О показує хроматографічне порівняння ферментного продукту з трьох інтегрованих експресуючих штамів Т. геевві.
Експериментальні умови описані в прикладі 1. Співвідношення білків розрізнюються серед трансформантів і можуть бути кількісно визначені у вигляді процента від загальної площі інтегрованого піка. "ЕСІ" відмічає підсумовану площу піків ендоглюканази. Епаон додавали до проби білка в малих кількостях як реагент для ВЕРХ-аналізу.
Фіг. 48А, 488. Оцукрювання, збільшене у виході мономера ксилози у відповідь на додавання геміцелюлози до ферментної композиції, продукованої інтегрованим штамом, при 7 мг загального білка на грам глюканнксилан в передобробленій аміаком серцевині кукурудзяного качана. Фіг. 48А: геміцелюлази Ризагішт мепісіПоіїдеє як компоненти цієї ферментної композиції, продуковані цим інтегрованим штамом. Фіг. 48В: геміцелюлази з інших грибів.
Фіг. 49А, 498. Оцукрювання, збільшене у виході мономера глюкози у відповідь на додавання геміцелюлози до ферментної композиції, продукованої інтегрованим штамом, при 7 мг загального білка на грам глюканнксилан в передобробленій аміаком серцевині кукурудзяного качана. Фіг. 49А: геміцелюлази Ризагішт мепісіПоіїдеє як компоненти цієї ферментної композиції, продуковані цим інтегрованим штамом. Фіг. 498: геміцелюлази з інших 60 грибів.
Фіг. 50А, 508. Оцукрювання, збільшене у виході мономера арабінози у відповідь на додавання геміцелюлози до ферментної композиції, продукованої інтегрованим штамом, при 7 мг загального білка на грам глюканянксилан в обробленій аміаком серцевині кукурудзяного качана. Фіг. 50А: геміцелюлази ЕРизагчт мегіісПШіоіде5 як компоненти цієї ферментної композиції, продуковані цим інтегрованим штамом. Фіг. 50В: геміцелюлази з інших грибів.
Фіг. 51. Графічне зображення продуктивності оцукрювання по всіх умовах передобробки. Х- вісь відповідає експериментальним результатам, перерахованим в таблиці 12. Виходи розраховані на основі теоретичних кількостей глюкану або ксилану, доступного в сирому просі прутоподібному. Всі виходи основані на мономерних цукрах, що вивільняються після З днів оцукрювання з коктейлем (сумішшю) ферментів.
Фіг. 52. Зіставлення амінокислотних послідовностей ряду ДВ-ксилозидаз СНЗО.
Підкресленими залишками з жирним шрифтом є передбачений каталітичний звичайний залишок кислота-основа (відмічений як "А" над зіставленням) і каталітичний нуклеофільний залишок (відмічений як "М" над зіставленням). Підкреслені залишки з нормальним шрифтом знаходяться в межах 4 ангстремів цього субстрату в активних центрах відповідних ЗО-структур (рар: Тийм і 26059, відповідно). Передбачається, що непідкреслені залишки в цій послідовності
Ем«З9А знаходяться в межах 4 ангстремів зв'язаного субстрату в активному центрі.
Фіг. 53. Зіставлення амінокислотних послідовностей ряду гідролаз сімейства сНа43.
Амінокислотні залишки, висококонсервативні серед членів цього сімейства, показані у вигляді підкреслених і надрукованих жирним шрифтом амінокислотних залишків.
Фіг. 54. Зіставлення амінокислотних послідовностей ряду гідролаз сімейства СОНО1.
Амінокислотні залишки, висококонсервативні серед членів цього сімейства, показані у вигляді підкреслених і надрукованих жирним шрифтом амінокислотних залишків.
Фіг. 55А, 558. Зіставлення амінокислотних послідовностей ряду ендоксиланаз сімейства
СНІО ії ОНІ1. Фіг. 55А: Зіставлення ксиланаз сімейства СНІТ0. Підкреслені залишки, надруковані жирним шрифтом, є каталітичними нуклеофільними залишками (відміченими "М" над зіставленням). Фіг. 55В: Зіставлення ксиланаз сімейства ЗНІТ1. Підкреслені залишки, надруковані жирним шрифтом, є каталітичними нуклеофільними залишками і звичайними залишками кислота-основа (відміченими "М" і "А", відповідно, над цим зіставленням).
Зо Фіг. 56А, 568. Оцукрювання передобробленого розбавленим аміаком проса прутоподібного різними ферментними сумішами/композиціями. Фіг. 56А: перетворення глюкану. Фіг. 568: перетворення ксилану. Числа під цими фігурами на х-осі стосуються кількості загальних мг кожного білка в конкретній ферментній суміші/композиції на г глюкану або ксилану, як описано в прикладі 13.
Фіг. 57А, 578. Оцукрювання передобробленого розбавленим аміаком проса прутоподібного ферментною композицією, продукованою інтегрованим штамом НЗА. Фіг. 57А: перетворення глюкану. Фіг. 578: перетворення ксилану. Експериментальні умови описані в прикладі 14.
Фіг. 58А-58С. Оцукрювання розширеної водяною парою багаси цукрової тростини ферментною композицією, продукованою інтегрованим штамом НЗА, при різних дозах ферментів. Фіг. 58А: перетворення глюкану. Фіг. 588: перетворення ксилану. Фіг. 58С: З-денне перетворення глюкану і ксилану. Експериментальні умови описані в прикладі 17.
Фіг. 59А-59С. Оцукрювання передобробленого розбавленою кислотою кукурудзяного волокна різними ферментами або ферментними сумішами. Фіг. 59А: перетворення глюкану. фіг. 598: перетворення ксилану. Фіг. 59С: 5-денне перетворення глюкану і ксилану. Відповідний цукор (глюкоза або ксилоза) відображав цукор, продукований з ферментативної стадії, мінус рівні вихідного цукру. Співвідношення, показані вздовж х-осі, представляють дозу ферменту в мг загального білка на грам целюлози. Експериментальні умови описані в прикладі 18.
Фіг. бОА, 60ОВ. Фіг. б60А: розшифрована кКДНК для Раб5т1А (ЗЕБО ІЮ МО:46). Фіг. 608: оптимізована відносно кодонів кКДНК для Ра5бТА (5ЕО ІО МО :47).
Фіг. 61. Кодуюча послідовність для конструкції, що містить сигнальну послідовність СВНІ1 (підкреслену) зліва від геномної ДНК, що кодує зрілий (243А (ЗЕО ІЮ МО:48).
Фіг. 62. Кодуюча послідовність для конструкції, що містить сигнальну послідовність СВНІ1 (підкреслену) зліва від геномної ДНК, що кодує зрілий Го43А (5ЕО ІЮ МО:49).
Фіг. 63. Оптимізована відносно кодонів кодуюча послідовність для конструкції, що містить сигнальну послідовність СВНІ1 (підкреслену) зліва від оптимізованої відносно кодонів ДНК, що кодує зрілий РІБ1А (5ЕО ІЮО МО:50).
Фіг. 64. Зіставлення амінокислотних послідовностей ряду гідролаз сімейства снНнЗ.
Амінокислотні залишки, висококонсервативні серед членів цього сімейства, показані у вигляді підкреслених і надрукованих жирним шрифтом амінокислотних залишків. Бокс відмічає передбачений каталітичний залишок з фланкуючими залишками, які, як передбачено, беруть участь в зв'язуванні субстрату.
Фіг. 65. Зіставлення амінокислотних послідовностей двох репрезентативних гідролаз сімейства ЕРизагішт ОЗНЗО. Амінокислотні залишки, які є консервативними серед членів цього сімейства, показані підкресленням і жирним шрифтом. 6. ДОКЛАДНИЙ ОПИС
Ферменти традиційно класифікували по субстратній специфічності і продуктах реакції. У "догеномній ері" функція розглядалася як найбільш податлива (і, можливо, найбільш застосовна) основа для порівняння ферментів, і аналізи на різні ферментативні активності були добре розроблені протягом багатьох років і привели до відомої схеми ЕС-класифікації.
Целюлази і інші глікозилгідролази, які діють на глікозидні зв'язки між двома вуглеводними частинами (або вуглеводною частиною і невуглеводною частиною - як це відбувається в нітрофенілглікозидних похідних) позначаються, згідно з цією схемою класифікації, як ЕС 3.2.1.-, з кінневою цифрою, що вказує точний тип розщеплюваного зв'язку. Наприклад, згідно з цією схемою, ендодіюча целюлаза (1,4-В-ендоглюконаза) позначається як ЕС 3.2.1.4.
З появою широко розповсюджених проектів секвенування геному дані секвенування полегшили аналізи і порівняння споріднених генів і білків. Крім того, зростаюча кількість ферментів, здатних діяти на вуглеводні частини молекул (тобто карбогідраз) були кристалізовані і були з'ясовані з 3-ЮО-структур. Такі аналізи ідентифікували невеликі сімейства ферментів зі спорідненою послідовністю, які містять консервативні тривимірні укладання, які можуть бути передбачені на основі з амінокислотної послідовності. Крім того, було показано, що ферменти з одними і тими ж або схожими тривимірними укладаннями виявляють одну і ту ж або схожу стереоспецифічність гідролізу, навіть у випадку каталізу різних реакцій (Непгіззаї еї аІ.,, 1998, РГЕВ5 Гей 425(2): 352-4; Сошіпно апа Непгіззаї, 1999, іп Сепеїісв, Біоспетівзігу апа есоїоду ої сеїІшміозе аедгадайоп. Т. Кітига. ТоКуо, Опі Рибіїзпег5 Со: 15-23).
Ці відкриття створюють базис класифікації на основі послідовності вуглеводних модулів, який доступний в формі бази даних Інтернету, Сагропуагаїе-Асіме еп/Уте зегмег (САУ), доступної в пер://айтр.спг5-тг5пП/САй У/іпдех.йпіті! (Сагопуагаїе-асіме епгутев: ап іпівадгаїєй дагаразе арргоасі. Дивіться Сапіагеї еї аїІ., 2009, Мисієїс Асід5 Ке5. 37 (ЮОагаразе із5це): 0233-
Зо З8).
САйу визначає чотири основних класи карбогідратаз, що розрізнюються типом каталізованої реакції: глікозилгідролази (СН), глікозилтрансферази (СТ), полісахаридліази (РІ) і карбогідратестерази (СЕ). Ферменти цього опису винаходу є глікозилгідролазами. ОН є групою ферментів, які гідролізують глікозидний зв'язок між двома або більше вуглеводами або між вуглеводом і невуглеводною частиною. Система класифікації для глікозилгідролаз, згрупованих по схожості послідовностей, привела до визначення більше 85 різних сімейств. Ця класифікація доступна на Ууер-сайті САУ.
Ферменти цього опису належать, самі по собі, до сімейств глікозилгідролаз З, 10, 11, 30, 39, 43 і/або 51.
Ферменти сімейства З глікозидгідролаз ("ЗНЗ") включають в себе, наприклад, рД- глюкозидазу (ЕС 3.2.1.21); В-ксилозидазу (ЕС 3.2.1.37); М-ацетил-ВД-глюкозамінідазу (ЕС 3.2.1.52)у; глюкан-В-1,3-глюкозидазу (ЕС 3.2.1.58); целодекстриназу (ЕС 3.2.1.74); екзо-1,3-1,4- глюканазу (ЕС 3.2.1) і ВД-галактозидазу (ЕС 3.2.1.23). Наприклад, СНЗ-ферментами можуть бути ферменти, які мають В-глюкозидазну, ВД-ксилозидазну, М-ацетил-ВД-глюкозамінідазну, глюкан-р- 1,3-глюкозидазну, целодекстриназну, екзо-1,3-1,4-глюканазну і/або Д-галактозидазну активність. Звичайно ЗНЗ-ферменти є глобулярними білками і можуть складатися з двох або більше субдоменів. Каталітичний залишок був ідентифікований як аспартатний залишок, який, в ВД-глюкозидазах, розташований в М-кінцевій третині цього пептиду і знаходиться в межах амінокислотного фрагмента БОМУУ (її еї а). 2001, Віоспет. 9. 355:835-840). Відповідною послідовністю в Ва!ї з Т. геезеі є Т2660267Уу268 (якщо рахувати від метіоніну в стартовому положенні), з каталітичним залишком аспартату, що є 0267. Ця гідроксил/аспартатна послідовність є також консервативною в перевірених ЗНЗ Д-ксилозидазах. Наприклад, відповідна послідовність в Вхі!ї Т. геезеі є 53100311 і відповідна послідовність в ЕУЗА є 52900291.
Ферменти сімейства 39 глікозидгідролаз ("ЗНЗ9") мають а-І -ідуронідазну (ЕС 3.2.1.76) або
В-ксилозидазну (ЕС 3.2.1.37) активність. Тривимірна структура двох Д-ксилозидаз СНЗО, з
Тпеппоапаегорасієгішт засспагоїуйсит (піргої Ассезбіоп Мо РЗбО0Об) і Сеобрасійи5 зіеагоїпегторпіїи5 (Опіргої Ассез5зіоп Мо 0О92ЕМ2), була з'ясована (дивіться Уапод еї аї.,.). Мої.
Віої. 2004, 335(1): 155-65 і Сілек еї аїЇ,, 9. Мої. Віої. 2005, 353(4): 838-46). Найбільш бо висококонсервативні райони в цих ферментах розташовані в їх М-кінцевих ділянках, які мають класичне (а/В)в ТІМ БаїтеІ-укладання з двома ключовими глутаміновими кислотами активного центра, розташованими на С-кінцевих сторонах р-ланцюгів 4 (кислота/основа) і 7 (нуклеофіл).
Передбачено, що залишки Е168 і Е272 ЕГм39А функціонують як каталітичні кислота/основа і нуклеофіл, відповідно, на основі зіставлення послідовностей вищезазначених ДВ-ксилозидаз
СІНЗУО з Тпеппоапаегобасіегішт засспагоїмісит і беобрасіїйи5 «Теагоїпегторнпіїи5 з ЕмЗ9А.
Ферменти сімейства 43 глікозидгідролаз ("ЗН43") включають в себе, наприклад, І -а- арабінофуранозидазу (ЕС 3.2.1.55)3; ВД-ксилозидазу (ЕС 3.2.1.37); ендоарабінаназу (ЕС 3.2.1.99) іабо галактан-1,3-В-галактозидазу (ЕС 3.2.1.145). Наприклад, ферменти ОНАЗ можуть мати 1 -а- арабінофуранозидазну активність, В-ксилозидазну активність, ендоарабінаназну активність іабо галактан-1,3-Д-галактозидазну активність. Ферменти сімейства СН4З виявляють структуру, подібну п'ятилопатевому В-пропелеру. Ця подібна пропелеру структура основується на п'ятикратному повторенні лопатей, складених з чотириланцюжкових рВ-структур. Каталітична загальна основа, аспартат, каталітична загальна кислота, глутамат, і аспартат, який модулює рКа цієї загальної основи, були ідентифіковані через кристалічну структуру Сеїїмібгіо іаропіси5
С)ІАрпаЗА і підтверджені сайт-направленим мутагенезом (дивіться Мигі270 еї аї., Маї. Бігисії. Віої. 2002, 9(9) 665-868). Ці каталітичні залишки розташовані в трьох консервативних блоках, розподілених широко по всій цій амінокислотній послідовності (Роп5 еї аї., Ргоїеіп5: 5ігисіиМмге,
Еипеїоп апа Віоіпіоптаїййсв5, 2004, 54:424-432). Серед ферментів сімейства снаЗ, тестованих на корисну активність в гідролізі біомаси, передбачені каталітичні залишки показані жирним шрифтом і підкресленням залишків в послідовностях фіг. 53. Ця кристалічна структура ксилозидази Стеобрасіи5 5іеагоїйепторнуїв (Вгих еї аї., У. Мої. Віо., 2006, 359:97-109) передбачає декілька додаткових залишків, які можуть бути важливими для зв'язування субстрату в цьому ферменті. Оскільки ферменти сімейства СНА3, тестовані на гідроліз біомаси, мали переваги, що розрізнюються відносно субстрату, ці залишки не є повністю консервативними в послідовностях, зіставлених на фіг. 53. Однак, серед перевірених ксилозидаз, декілька консервативних залишків, які сприяють зв'язуванню субстрату, або через гідрофобну взаємодію, або через утворення водневих зв'язків, є консервативними і відмічаються одинарними підкресленнями на фіг. 53.
Ферменти сімейства 51 глікозидгідролаз ("ЗН51") мають І-а-арабінофуранозидазну (ЕС
Зо 3.2.1.55) або ендоглюканазну (ЕС 3.2.1.4) активність. Структура кристала високого розрізнення
І-с-арабінофуранозидази СН51 з Сеобасіїйи5 5іеагоїпегторпйїи5 Т-6 показує, що цей фермент є гексамером, з кожним мономером, організованим в два домени: 8-Ббагтеї! (барабан) (В/с) і 12- ланцюжковий В-сендвіч з топологією рулету з джемом (дивіться Номеї! еї а. ЕМВО 4. 2003, 22(19):4922-4932). Можна очікувати, що каталітичні залишки будуть кислотними (і консервативними по всіх послідовностях ферменту в цьому сімействі. При зіставленні амінокислотних послідовностей ЕмО1А, РІЗТА і Раб1А з ферментами СНІ більш різноманітної послідовності 8 кислотних залишків залишаються консервативними. Вони показані жирним шрифтом і підкреслені на фіг. 54.
Ферменти сімейства 10 глікозидгідролаз ("ЗНІ10") мають також структуру 8-баїтеї (В/с0). Вони гідролізують ендоспособом із збереженням механізму, який використовує щонайменше один кислотний каталітичний залишок в звичайному процесі каталізу кислота/основа (Реїї еї аї., 5.
Віої. Спет., 2004, 279(10): 9597-9605). Були з'ясовані кристалічні структури ксиланаз СНІТО
Репісійит вітріїсізвітит (Опіргої Р5У6588) і Тпептпоазси5 ашйгапіаси5 (Опіргої Р23360), що знаходяться в комплексі з субстратами в цих активних центрах (дивіться Зсптійаії еї аІ. Віоспет., 1999, 38: 2403-2412; і Го І еддіо еї аІ. РЕВ5 І ей. 2001, 509: 303-308). Хуп3З3-залишки Г/ісподетта геезеії, які є важливими для зв'язування субстрату і каталізу, можуть бути вироблені із зіставлення з послідовностями вищезазначених ксиланаз СНІО з РепісшШіит в5іптріїсізвітит і
Тпептоазсив аигапііасивх (фіг. 55А). Передбачається, що залишок Е282 Хуп3 Тгісподегта геезеї є каталітичним нуклеофільним залишком, тоді як передбачається, що залишки Е91, МО92, КОБ5, 097, 598, НІ28, УМ132, 0135, М175, Е176, 219, 0252, Н2г54, М/312 і/або МУ320 беруть участь в зв'язуванні субстрату і/або каталізі.
Ферменти сімейства 11 глікозидгідролаз ("ЗНІ1") мають стркутуру рулету з джемом. Вони гідролізують ендоспособом із збереженням механізму, який використовує щонайменше один кислотний каталітичний залишок в звичайному процесі каталізу кислота/основа. Декілька інших залишків, розподілених по всій їх структурі, можуть сприяти стабілізації ксилозних ланок в субстраті, поряд з парою ксилозних мономерів, які розщеплюються гідролізом. Випробовували три ендоксиланази сімейства СНІ, і їх послідовності зіставляються на фіг. 558. Е118 (або Е86б в зрілому Хуп2 Т геезеї) і Е209 (або Е177 в зрілому Хуп2 Т. геезеї) були ідентифіковані як каталітичні нуклеофільні і звичайні/кислота/основа залишки в Хуп2 Тгісподепта геезеїі, 60 відповідно (дивіться НамикКаїпеп еї а). Віоспет., 1996, 35:9617-24).
Ферменти сімейства 30 глікозидгідролаз ("зЗНЗО") зберігають ферменти, що мають глюкозилцерамідазну (ЕС 3.2.1.453; 8-1,б-глюканазну (ЕС 3.2.1.75); В-ксилозидазну (ЕС 3.2.1.37); В-глюкозидазну (3.2.1.21) активність. Першою кристалічною структурою ЗНЗО була пов'язана з хворобою Гоше В-глюкоцереброзидаза людини, з'ясована СгаромуєКкі, бан апа
Ногомі/ї» (Стії Вем Віоспет Мої Віо! 1990; 25(6) 385-414). НЗО має (са/В)в ТІМ Баїтє!-укладання з двома ключовими глутаміновими кислотами активного центра, розташованими на С-кінцевих сторонах Д-ланцюгів 4 (кислота/основа) і 7 (нуклеофіл) (Непгіззаї В. еї а!., Ргос Маї! Асай 5сі
ИБА, 92(15): 7090-4, 1995; Чогаап сеї а!., Арріїєд Містобріо! Віотеснпої, 86: 1647, 2010). Глутамат 162 ЕГмуЗОбА є консервативним в 14 із 14 зіставлених ЗНЗО-білків (13 бактеріальних білків і однієї ендо-бБ-ксиланази з гриба Віохрога з номером доступу АЮОб2369), і глутамат 250 ЕмМЗ0А є консервативним в 10 з тих же самих 14, є аспартатом в інших трьох і некислотним в одному з них. Є інші помірно консервативні кислотні залишки, але немає інших висококонсервативних. 6.1. Поліпептиди цього опису
Цей опис забезпечує виділені, синтетичні або рекомбінантні поліпептиди, які містять амінокислотну послідовність, що має щонайменше приблизно 8095, наприклад щонайменше приблизно 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 95965, 9695, 9790, 9895, 9995 або повну (10095), ідентичність послідовності з поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2, 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44 або 45 на протязі району щонайменше приблизно 10, наприклад щонайменше приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 або 350, залишків або на протязі повної довжини незрілого поліпептиду, повної довжини консервативного домену і/або повної довжини СВМ. Цей консервативний домен може бути передбаченим каталітичним доменом ("СО"). Зразкові поліпептиди включають в себе також фрагменти з щонайменше приблизно 10, наприклад щонайменше приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 або 600, залишків в довжину. Ці фрагменти можуть містити консервативний домен і/або СВМ. Якщо фрагмент містить консервативний домен і СВМ ферменту, цей фрагмент необов'язково включає в себе лінкер, що розділяє ці дві частини. Цим лінкером може бути природний лінкер або гетерологічний лінкер. Передбачається, що поліпептиди цього опису можуть кодуватися
Зо послідовністю нуклеїнової кислоти, що має щонайменше приблизно 8595, приблизно 8695, приблизно 8795, приблизно 8895, приблизно 8995 або приблизно 9095 ідентичність послідовності з ЗЕО ІО МО:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 або 41, або послідовністю нуклеїнової кислоти, здатною гібридизуватися при умовах високої жорсткості з комплементом 5ЕО ІО МО, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 або 41 або з його фрагментом. Зразкові нуклеїнові кислоти цього опису представлені в розділі 6.2 нижче.
Поліпептиди цього опису включають в себе білки, які мають амінокислотну послідовність щонайменше з 8595, наприклад щонайменше 8695, 87905, 8890, 8990, 909о, 9190, 9290, 939, 9490, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995, ідентичністю послідовності щонайменше з 50 суміжними амінокислотними залишками послідовностей глікозилгідролаз 5ЕО 10 МО:С2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44 або 45. Наприклад, поліпептид цього опису може включати в себе амінокислотні послідовності, що мають щонайменше 8595, наприклад щонайменше 8695, 8790, 8895, 8995, 9095, 9196, 9295, 9396, 9495, 9595, 9696, 9790, 9890 або 99595, ідентичність послідовності щонайменше з 10, наприклад щонайменше 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 або 350, суміжними амінокислотними залишками послідовностей глікозилгідролаз 5ЕО 10 МО 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44 або 45. Ця послідовність суміжних амінокислот відповідає консервативному домену і/або СВМ, і/або сигнальній послідовності.
Будь-яка з описаних тут амінокислотних послідовностей може бути вироблена разом або в поєднанні щонайменше з 1, наприклад, щонайменше з 2, 3, 5, 10 або 20 гетерологічними амінокислотами, фланкуючими кожну з С- і/або М-кінцевих сторін вказаної амінокислотної послідовності, і/або делеціями щонайменше 1, наприклад, щонайменше 2, 3, 5, 10 або 20 амінокислот з С- і/або М-кінцевих сторін ферменту цього опису.
Інші варіації також знаходяться в межах обсягу цього опису. Наприклад, один або декілька амінокислотних залишків можуть бути модифіковані для збільшення або зменшення рі ферменту. Зміна величини рі може бути досягнута видаленням глутаматного залишку або заміною його іншим амінокислотним залишком.
Цей опис забезпечує конкретно ЕмуЗА, РІ4З3А, Ем4ЗЕ, Ем39А, Ем4З3А, Ем43В, Раб1А, 7243А,
Ео43ЗА, АТаЗА, РІБТА, АтХупг, АтиХуп5, Ем430, РІ4ЗВ, ЕмазЗВ, Емот1А, Хуп3 Тісподетпта геезві,
Ге) Хуп2 Ттісподегпта геезеї, Вхі! Тгісподегта геезеї і/або поліпептид Воді! Тгісподепта геезві.
Комбінація одного або декількох з цих ферментів переважно присутня в ферментній суміші/композиції цього винаходу, наприклад суміші, яка не зустрічається в природі.
ЕмЗА: Амінокислотна послідовність ЕмЗА (5ЕО ІЮ МО:2) показана на фіг. 18, 38 і 64. 5ЕО ІО
МО:2 є послідовністю незрілого Ем3ЗА. Ем3ЗА має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-23 5ЕО ІЮ МО:2 (підкреслену); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 24-766
ЗЕБЕО ІЮО МО:2. Передбачені консервативні домени показані жирним шрифтом на фіг. 18.
Показано, що ЕмЗА має Д-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням п-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозиду, ксилобіози, змішаних лінійних ксилоолігомерів, розгалужених олігомерів арабіноксилану з геміцелюлози або передобробленої розбавленим аміаком серцевини кукурудзяного качана як субстратів. Передбаченим каталітичним залишком є 0291, тоді як фланкуючі залишки, 5290 і С292, як передбачається, беруть участь в зв'язуванні субстрату (фіг. 64). Е175 і Е213 є консервативними у всіх інших ферментах ОНУ, їі передбачається, що вони мають каталітичні функції. У даному контексті "поліпептидом ЕмЗА" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 85595, наприклад щонайменше 8695, 8790, 8895, 8996, 9090, 9195, 9295, 9396, 9496, 9595, 96, 9790, 9896, 9995 або 10095, ідентичність послідовності щонайменше з 50, наприклад щонайменше з 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 або 700, суміжними амінокислотними залишками серед залишків 24-766 5БО ІЮ МО:2. Поліпептид ЕУЗА є переважно незміненим в порівнянні з природним ЕмЗА в залишках 0291, 5290, С292, Е175 і
Е213. Поліпептид ЕмЗА є переважно незміненим щонайменше в 7095, 7595, 8095, 8595, 90905, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед ЕмУЗА, Вхі!
Тіісподегта геезеї і/або Воді! Тгісподегта геезеї, як показано в зіставленні фіг. 64. Поліпептид
Ем«ЗА переважно містить повний передбачений консервативний домен природного ЕмЗА, як показано на фіг. 18. Один зразковий поліпептид ЕмуЗА цього винаходу містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8790, 8895, 8995, 909, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 969, 9796, 9896, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого ЕУЗА, як показано на фіг. 18. Поліпептид
ЕмМЗА цього винаходу переважно має В-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид БЕмЗА цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 100965 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:2 або із залишками (Її) 24-766, (ії) 73-321, (ії) 73-394, (ім) 395-622, (м) 24-622 або (м) 73-622 5ЕО І МО2. Цей поліпептид переважно має В-ксилозидазну активність.
РІ4ЗА: Амінокислотна послідовність РІ4ЗА (5ЕО ІЮ МО:4) показана на фіг. 28 і 53. 5ЕО ІЮ
МО:4 є послідовністю незрілого РІ43А. РІ43А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-20 5ЕО ІЮ МО:4 (підкреслену на фіг. 28); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 21-445 5ЕО ІЮ МО:4. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом, передбачений СВМ великими буквами і передбачений лінкер, що розділяє СО ії СВМ, курсивним шрифтом на фіг. 28. Було показано, що РІ4ЗА має Вр-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням п-нітрофеніл-В-ксилопіранозиду, ксилобіози, змішаних лінійних ксилоолігомерів або передобробленої аміаком серцевини кукурудзяного качана як субстратів. Передбачені каталітичні залишки включають в себе або рз2 або 060, 0145 ії Е206. С-кінцевим районом, підкресленим на фіг. 53, є передбачений СВМ.
У даному контексті "поліпептидом РІ4ЗА" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8690, 8795, 8890, 8990, 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9590, 9695, 9790, 98905, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 21-445
ЗЕО Ір МО:4. Поліпептид РІ4ЗА переважно є незміненим в порівнянні з природним РІ4ЗА в залишках 032 або ЮбО, 0145 і Е206. Поліпептид РІ4ЗА є переважно незміненим щонайменше в то, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які, як було виявлено, є консервативними у всьому сімействі білків, що включають в себе РІ4ЗА, 1,2, 3,4, 5, 6, 7 або всі 8 з інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. 53. Поліпептид РІ4ЗА цього винаходу переважно містить два або більше з наступних доменів: (1) передбачений СВМ, (2) передбачений консервативний домен і (3) лінкер РІ4ЗА, показаний на фіг. 28. Один зразковий поліпептид РІ4ЗА цього винаходу містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8790, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9696, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого РІ43ЗА, як показано на фіг. 28. Поліпептид РІ43ЗА цього винаходу переважно має В-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид РІ43ЗА цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 100965 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:4 або із залишками (Її) 21-445, (ії) 21-301, (ії) 21-323, (ім) 21-444, (м) 302-444, (мі) 302-445, (мії) 324-444 або (мії) 324-445
ЗЕО ІЮ МО:4. Цей поліпептид має переважно р-ксилозидазну активність.
ЕмазЕ: Амінокислотна послідовність ЕмаЗЕ (5ЕО ІЮ МО:6) показана на фіг. ЗВ і 53. 5ЕО ІЮ
МО:б є послідовність незрілого Ем43Е. Ем43Е має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-18 5ЕО ІЮ МО:б (підкреслену на фіг. ЗВ); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 19-530 5ЕО ІЮО МО:6. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. ЗВ. Показано, що Ем43Е має В-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням 4-нітрофеніл-В-О-ксилопіранозиду, ксилобіози і змішаних лінійних ксилоолігомерів або передобробленої аміаком серцевини кукурудзяного качана як субстратів. Передбачені каталітичні залишки включають в себе або 040, або 071, р155 ії Е241. У даному контексті "поліпептидом Ем4ЗЕ" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8790, 8895, 8995, 9095, 9190, 9290, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 19-530 5ЕО ІЮО МО:6. Поліпептид Ем4З3Е переважно є незміненим в порівнянні з природним Ем43Е в залишках 40 або 071, 0155 і Е241. Поліпептид Ем4ЗЕ є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які, як було виявлено, є консервативними серед сімейства ферментів, що включають в себе Ем4ЗЕ, і1,2, 3,4, 5, 6, 7 або всі 8 з інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. 53. Один поліпептид Ем4З3Е переважно містить весь передбачений консервативний домен природного Ем43Е, як показано на фіг. ЗВ. Один зразковий поліпептид Ем4ЗЕ містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8690, 8795, 8890, 899ю, 9095, 91905, 9295, 9390, 9490, 9590, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого Ем4ЗЕ, як показано на фіг.
ЗВ. Поліпептид Ем4З3Е цього винаходу переважно має рД-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид Ем43Е цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 100965 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:6 або із залишками (Її) 19-530, (ії) 29-530, (ії) 19-300 або (ім) 29-300 5ЕО ІЮ МО:6. Цей поліпептид має переважно рД- ксилозидазну активність.
Ем39А: Амінокислотна послідовність Ем39А (ЗЕО ІЮ МО:8) показана на фіг. 4В і 52. 5ЕО ІО
МО:8 є послідовністю незрілого Ем39А. Ем39А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-19 5ЕО ІЮ МО:8 (підкреслену на фіг. 48); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 200-439 5ЕО ІЮО МО:8. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 4В. Було показано, що Ем39А має рВ-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням п-нітрофеніл-В-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних, лінійних ксилоолігомерів як субстратів. Передбачається, що залишки Е168 і Е272
Ем39А функціонують як каталітичні кислота-основа і нуклеофіл, відповідно, на основі зіставлення послідовностей вищезгаданих ксилозидаз (СНЗО з ТНептоапаєгобасієгійт засспагоїмісит (Опіргої Ассеззіоп Мо РЗБ6906) і Сеобасійи5 «їеагоїпегторпйи5 (Опіргої Ассезвіоп
Мо 092ЕМ2) з Гм39А. У даному контексті "поліпептидом ЕУЗ9А" називають поліпептид або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8690, 879Уо, 8895, 89905, 9090, 91905, 9295, 9395, 9495, 9590, 96905, 97905, 98905, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 20-439 5ЕО ІЮ МО:8. Поліпептид Ем39А переважно є незміненим в порівнянні з природним Ем39А в залишках Е168 і Е272. Поліпептид ЕГмЗ9А є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед сімейства ферментів, що включають в себе ЕмуЗ9А і ксилозидази з
Тпеппоапаегобасіегічт засспагоїуїйсит і сбеобасіїйи5 5(еагоїпегторпіїи5 (дивіться вище). Один поліпептид Ем39А переважно містить весь передбачений консервативний домен природного
Ем39А, як показано на фіг. 48. Один зразковий поліпептид ЕмЗ9А містить послідовність, що має щонайменше 8595, 869о, 879о, 8895, 8995, 9095, 91905, 9296, 939, 9495, 9595, 9690, 9790, 9895, 9990 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого ЕмУЗ9А, як показано на фіг. 4В. Поліпептид Ем39А цього винаходу переважно має ВД-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид Ем3З9А цього винаходу переважно містить амінокислотну 60 послідовність щонайменше з 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 100965 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:8 або із залишками (Її) 20-439, (ії) 20-291, (ії) 145-291 або (ім) 145-439 5ЕО ІО МО:8. Цей поліпептид має переважно р- ксилозидазну активність.
ЕмазА: Амінокислотна послідовність Ем4ЗА (5ЕО ІЮ МО:10) показана на фіг. 58 і 53. 5ЕО І
МО:10 є послідовністю незрілого Ем43А. Рм43А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-22 5ЗЕО ІЮ МО:10 (підкреслену на фіг. 58); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 23-449 5ЕО ІЮО МО:10. На фіг. 58 передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом, передбачений СВМ великими буквами і передбачений лінкер, що розділяє
СО ї СВМ, курсивним шрифтом. Було показано, що ЕРм4ЗА має р-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням 4-нітрофеніл-В-О-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних, лінійних ксилоолігомерів, розгалужених олігомерів арабіноксилану з геміцелюлози і/або лінійних ксилоолігомерів як субстратів. Передбачені каталітичні залишки включають в себе або 034, або 062, 0148 і Е209. У даному контексті "поліпептидом Ем4ЗА" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 85595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 23-449 5ЕО ІЮ МО:10. Поліпептид
Ем4ЗА переважно є незміненим в порівнянні з природним Ем4ЗА, в залишках 034 або 062, 0148 і Е209. Поліпептид Ем4ЗА є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 95905, 9890 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед сімейства ферментів, що включають в себе ЕмаЗА і 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або всі 9 інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. 53. Поліпептид Ем4ЗА переважно містить повний передбачений СВМ природного Ем43ЗА і/або повний передбачений консервативний домен природного Ем4ЗА, і/або лінкер Ем4ЗА, як показано на фіг. 58. Один зразковий поліпептид Ем4ЗА містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8790, 8895, 8995, 9095, 9195, 9296, 9395, 9495, 9596, 969, 9790, 9895, 99956 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого Ем4ЗА, як показано на фіг. 58.
Поліпептид Ем4ЗА цього винаходу переважно має рД-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид Ем43ЗА цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО:10 або із залишками (Її) 23-449, (ії) 23-302, (ії) 23-320, (ім) 23-448, (м) 303-448, (мі) 303-449, (мії) 321-448 або (мії) 321-449
ЗЕО ІЮ МО:10. Цей поліпептид має ВД-ксилозидазну активність.
Ем4азЗВ: Амінокислотна послідовність ЕмаЗВ (5ЕО ІЮ МО:12) показана на фіг. 6В і 53. 5ЕО І
МО:12 є послідовністю незрілого Ем43В. Рм43В має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-16 5ЕО ІЮ МО:12 (підкреслену на фіг. 68); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 17-574 5ЕО ІЮ МО:12. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 6В. Було показано, що Ем43В має як ВД-ксилозидазну, так і 1-а- арабінофуранозидазну активності, наприклад, в першому ферментативному аналізі з використанням 4-нітрофеніл-В-О-ксилопіранозиду і п-нітрофеніл-с-І -арабінофуранозиду як субстратів. Було показано, у другому ферментативному аналізі, що він каталізує вивільнення арабінози з розгалужених арабіноксилоолігомерів і каталізує збільшене вивільнення ксилози з олігомерних сумішей в присутності інших ксилозидазних ферментів. Передбачені каталітичні залишки включають в себе або 038, або О68, 0151 і Е236. У даному контексті "поліпептидом
Ем4а3В" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 869о, 879о, 8895, 8995, 9095, 91905, 9296, 939, 9495, 9595, 9690, 9790, 9895, 9990 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 або 550 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 17-574 5ЕО
ІЮ МО:12. Поліпептид Ем43В переважно є незміненим, в порівнянні з природним Ем43ЗВ, в залишках 038 або 068, 0151 і Е236. Один поліпептид Ем43В є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 98905 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед сімейства ферментів, що включають в себе Ем43ЗВ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або всі 9 інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. 53. Один поліпептид Ем43В переважно містить повний передбачений консервативний домен природного Ем43В, як показано на фіг. 6В і 53. Один поліпептид Ем4ЗВ містить послідовність, що має щонайменше 8595, 8695, 879, 8890, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого Ем43В, як показано на фіг. 6В. Поліпептид Ем43В даного винаходу переважно має ВрВ-ксилозидазну активність, І-с-арабінофуранозидазну активність або як рД- бо ксилозидазну, так і Ї -л-арабінофуранозидазну активності.
Таким чином, поліпептид Ем43В цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9990 або 100975 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:12 або із залишками (Її) 17-574, (і) 27-574, (ії) 17-303 або (ім) 27-303 5БЕО ІОЮ МО:12. Цей поліпептид має ВД-ксилозидазну активність, І-с-арабінофуранозидазну активність або як Д-ксилозидазну, так і 1-а- арабінофуранозидазну активності.
РабтА: Амінокислотна послідовність РабтТА (5ЕО ІЮ МО:14) показана на фіг. 7В і 54. 5ЕО ІЮ
МО:14 є послідовністю незрілого Раб1А. Раб1А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-20 5ЕО ІЮ МО:14 (підкреслену на фіг. 7В); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 21-676 5ЕО ІЮ МО:14. Передбачений І-с-арабінофуранозидазний консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 7В. Було показано, що Раб1А має р-ксилозидазну активність і І-с-арабінофуранозидазну активність, наприклад, в ферментативних аналізах з використанням п-нітрофеніл-В-ксилопіранозиду і п-нітрофеніл-с-І -арабінофуранозиду. Було показано, що він каталізує вивільнення арабінози з розгалужених арабіноксилоолігомерів і каталізує збільшене вивільнення ксилози з олігомерних сумішей в присутності інших ксилозидазних ферментів. Консервативні кислотні залишки включають в себе Е43, Ю50, Е257,
Е296, Е340, ЕЗ370, Е485 і Е493. У даному контексті "поліпептидом РабтТА" називають поліпептид іабо його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8890, 89960, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 або 650 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 21-676 5ЕО ІЮ МО:14. Поліпептид
Раб1А переважно є незміненим, в порівнянні в природним Ра51А, в залишках Е43, 050, Е257,
Е296, Е340, Е370, Е485 і Е493. Поліпептид Раб1А є переважно незміненим щонайменше в то95, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед групи ферментів, що включають в себе Ра5б1А, Ем51А і РІ514А, як показано в зіставленні фіг. 54.
Поліпептид РабТА переважно містить передбачений консервативний домен природного Ра?1А, як показано на фіг. 7В. Один зразковий поліпептид РабтА містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 869о, 879о, 8895, 8995, 9095, 91905, 9296, 939, 9495, 9595, 9690, 9790, 9895, 9990 або 10095 ідентичність послідовності з послідовністю зрілого Ра51А, як показано на фіг. 7В.
Поліпептид Раб1А цього винаходу має р-ксилозидазну активність, І-«-арабінофуранозидазну активність або як Д-ксилозидазну, так і І -л-арабінофуранозидазну активності.
Таким чином, поліпептид РабтА цього винаходу містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:14 або із залишками (і) 21-676, (ії) 21- 652, (ії) 469-652 або (ім) 469-676 5ЕО ІОЮ МО:14. Цей поліпептид переважно має ВД-ксилозидазну активність, 1І-а-арабінофуранозидазну активність або як Д-ксилозидазну, так і 1/-а- арабінофуранозидазну активності.
О243А: Амінокислотна послідовність 5243А (5ЕО ІЮО МО:16) показана на фіг. 88 і 53. 5ЕО ІЮ
МО:16 є послідовністю незрілого (3243А. (з3743А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-18 5ЗЕО ІЮ МО:16 (підкреслену на фіг. 88); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 19-340 5ЕО ІЮ МО:16. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 88. Було показано, що (7243А має р-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням п-нітрофеніл-В-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних, лінійних ксилоолігомерів як субстратів. Передбачені каталітичні залишки включають в себе або 033, або 068, 0154 і Е243. У даному контексті "поліпептидом С243А" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 300 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 19-340 5БО І0О МО:16. Поліпептид С7243А переважно є незміненим, в порівнянні з природним 5243А, в залишках ЮЗ3З3 або 068, 0154 і
Е243. Поліпептид (7243А є незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед групи ферментів, що включають в себе
С743А і 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або всі 9 інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. 53.
Один поліпептид С243А переважно містить передбачений домен природного С743А, як показано на фіг. 8В. Один зразковий поліпептид (1243А містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 869о, 879о, 8895, 8995, 9095, 91905, 9296, 939, 9495, 9595, 9690, 9790, 9895, 9990 або 10095 ідентичність послідовності з послідовністю зрілого (37243А, як показано на фіг. 88. 60 Поліпептид 57243А даного винаходу переважно має В-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид (3243А цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9990 або 100975 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО:16 або із залишками (Її) 19-340, (ії) 53-340, (ії) 19-383 або (ім) 538-383 5ЕО ІЮ МО:16. Цей поліпептид переважно має рД- ксилозидазну активність.
Ео43А: Амінокислотна послідовність Го43А (5ЕО ІЮО МО:18) показана на фіг. 9В і 53. 5ЕО ІО
МО:18 є послідовністю незрілого Бо43А. Ро43А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-20 5ЗЕО ІЮ МО:18 (підкреслену на фіг. 98); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 21-348 5ЕО ІЮ МО:18. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 9В. Було показано, що Бо43А має р-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням п-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозиду, ксилобіози і/або змішаних, лінійних ксилоолігомерів як субстратів. Передбачені каталітичні залишки включають в себе або 037, або 072, 0159 і Е251. У даному контексті "поліпептидом ЕБо43А" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8895, 89965, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9696, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 300 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 18-344 5БО ІЮ МО:18. Поліпептид Ео43А переважно є незміненим, в порівнянні з природним Ро43А, в залишках 037 або 072, 0159 і
Е251. Поліпептид Го43А є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9890 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед групи ферментів, що включають в себе Ео43А і 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або всі 9 інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. 53. Один поліпептид Ео43А переважно містить передбачений консервативний домен природного Ео43А, як показано на фіг. 98. Один зразковий поліпептид Ро4ЗА містить послідовність, що має щонайменше 8595, 86925, 879, 8895, 899ю, 9095, 9190, 9295, 9390, 9490, 9590, 9695, 9795, 98905, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого Бо43А, як показано на фіг. 98. Поліпептид Ео43А даного винаходу переважно має В-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид Бо43А цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9990 або 100975
Ко) ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО:18 або із залишками (Її) 21-341, (ії) 107-341, (ії) 21-348 або (ім) 107-348 5ЕО ІЮ МО:18. Цей поліпептид переважно має р- ксилозидазну активність.
АТ4ЗА: Амінокислотна послідовність АТЗА (ЗЕО І МО:20) показана на фіг. 108 і 53. 5ЕО ІЮ
МО:20 є послідовністю незрілого АТЗА. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 108. Було показано, що АТЗА має І-а-арабінофуранозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням п-нітрофеніл-сас-Ї - арабінофуранозиду як субстрату. Було показано, що АЇ4ЗА каталізує вивільнення арабінози з набору олігомерів, що вивільняються з геміцелюлози за допомогою дії ендоксиланази.
Передбачені каталітичні залишки включають в себе або 026, або 058, 0139 і Е227. У даному контексті "поліпептидом АїЗА" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8690, 8795, 8890, 8990, 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9590, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 300 суміжними амінокислотними залишками 5ЕО ІЮ МО:20. Поліпептид АТЗА переважно є незміненим, в порівнянні з природним АЇТ4ЗА, в залишках 026 або 058, 0139 і
Е227. Поліпептид АЇ4ЗА переважно є незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9090, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед групи ферментів, що включають в себе АГАЗА і 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або всі 9 інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. 53. Поліпептид АТЩЗА переважно містить передбачений консервативний домен природного
АТАЗА, як показано на фіг. 10В. Один зразковий поліпептид АГЗА містить послідовність, яка має
БО 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 99956 або 100905 ідентичність послідовності з хЕО ІЮ МО:20. Поліпептид АГТ4ЗА цього винаходу переважно має І - а-арабінофуранозидазну активність.
Таким чином, поліпептид АїТЗА цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9990 або 100975 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО:20 або із залишками (Її) 15-558 або (ії) 15-295 5ЕО ІЮ МО:20. Цей поліпептид переважно має І -а-арабінофуранозидазну активність.
РІБ1А: Амінокислотна послідовність РІБТА (ЗЕО ІЮО МО:22) показана на фіг. 118 і 54. 5ЕО ІЮ
МО:22 є послідовністю незрілого РІБТ1А. РІБТА має передбачену сигнальну послідовність, 60 відповідну залишкам 1-20 5ЕО ІЮ МО:22 (підкреслену на фіг. 118); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 21-642 5БО ОО МО:22. Передбачений консервативний домен (| -а- арабінофуранозидази показаний жирним шрифтом на фіг. 11В. Було показано, що РІ21А має І - а-арабінофуранозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням 4- нітрофеніл-а-І -арабінофуранозиду як субстрату. Було показано, що РІБТ1А каталізує вивільнення арабінози з набору олігомерів, що вивільняються з геміцелюлози за допомогою дії ендоксиланази. Передбачені консервативні залишки включають в себе Е43, 050, Е248, Е287,
Е331, Е360, Е472 і Е480. У цьому контексті, "поліпептидом РІБТА" називають поліпептид і/або варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8690, 879Уо, 8895, 89905, 9090, 91905, 9295, 9395, 9495, 9590, 96905, 97905, 98905, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 або 600 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 21-642 5БО0 І МО:22. Поліпептид РІБ1А переважно є незміненим, в порівнянні з природним РІ51А, в залишках Е43, 050, Е248, Е287,
Е331, ЕЗ360, Е472 і Е480. Поліпептид РІ51А є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8090, 9095, 95965, 98965 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед РІЗ1А, Ра?1А і
Ем51А, як показано в зіставленні фіг. 54. Один поліпептид РІЗТА переважно містить передбачений консервативний домен природного РІ51А, показаний на фіг. 118. Один зразковий поліпептид РУТА містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 90960, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9790, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого
РІБ1А, показаною на фіг. 118. Поліпептид РІБТА цього винаходу переважно має 1 -а- арабінофуранозидазну активність.
Таким чином, поліпептид РІБТА цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 100965 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО:22 або із залишками (Її) 21-632, (ії) 461-632, (ії) 21-642 або (ім) 461-642 5ЕО ІЮО МО:22. Цей поліпептид має І-а- арабінофуранозидазну активність.
АтиХуп2: Амінокислотна послідовність АТиХуп2 (ЗЕО ІО МО:24) показана на фіг. 128 і 558.
ЗБО ІЮ МО:24 є послідовністю незрілого АїТиХуп2. АїТиХуп2 має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-18 5ЕО ІЮ МО:24 (підкреслену на фіг. 128Б); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 19-228 5ЕБЕО ІЮ МО:24. Передбачений консервативний домен СНІ показаний жирним шрифтом на фіг. 128. Було показано, що АїйХуп2 має ендоксиланазну активність безпосередньо спостереженням його здатності каталізувати збільшене продукування ксилозного мономера в присутності ксилобіозидази при дії цих ферментів на передобробленій біомасі або на виділеній геміцелюлозі. Консервативні каталітичні залишки включають в себе Е124, Е129 і Е215. У даному контексті "поліпептидом
АгпХупг" називають поліпептид і/або варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9696, 9795, 9895, 9995 або 100905 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175 або 200 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 19-228 5ЕО І МО: 24. Поліпептид АпХуп2 переважно є незміненим, в порівнянні з природним АїиХуп2, в залишках Е124, Е129 і Е215.
Поліпептид АйиХуп2 є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 8595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед АїиХуп2, АТиХуп5 і Тгісподегта геезеї Хуп2, як показано в зіставленні фіг. 558. Поліпептид АїиХуп2 переважно містить повний передбачений домен природного АйХуп2, показаний на фіг. 128. Один зразковий поліпептид
АтиХуп2 містить послідовність яка має щонайменше 8595, 8695, 879Уо, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого
АтТиХуп2, показаною на фіг. 128. Поліпептид АїХуп2 цього винаходу переважно має ксиланазну активність.
АтиХупо: Амінокислотна послідовність АїТиХуп5 (5ЕО ІЮ МО:26) показана на фіг. 13В і 558.
ЗБО ІЮ МОс26 є послідовністю незрілого АїТиХуп5. АїТиХуп5 має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-19 5ЕО ІВ МО:26 (підкреслену на фіг. 138В); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 20-313 5ЕО ІЮ МО:26. Передбачений консервативний домен ОН1І1 показаний жирним шрифтом на фіг. 13В. Було показано, що АїшХуп5 має ендоксиланазну активність безпосередньо спостереженням його здатності каталізувати збільшене продукування ксилозного мономера в присутності ксилобіозидази при дії цих ферментів на передобробленій біомасі або на виділеній геміцелюлозі. Консервативні каталітичні залишки включають в себе Е119, Е124 і Е210. Передбачений СВМ знаходиться бо поблизу С-кінцевої сторони, характеризується численними гідрофобними залишками і іде за довгим рядом багатих серином, багатих треоніном амінокислот. Цей район показаний підкресленням на фіг. 558. У даному контексті "поліпептидом АїиХуп5о5" називають поліпептид і або варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9090, 9195, 9295, 9395, 9496, 9Бов, Об, 97905, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 275 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 20-313 5ЕО ІЮ МО:26. Поліпептид АйХуп5 переважно є незміненим, в порівнянні з природним АїиХуп5, в залишках Е119, Е120 ї Е210. Поліпептид
АтиХуп5 є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 99965 амінокислотних залишків, які є консервативними серед АїйиХуп5, АїшХупа2 і Тгісподегта геезеї
Хуп2, як показано в зіставленні фіг. 558. Поліпептид АїТиХупо5 переважно містить повний передбачений СВМ природного АйХуп5 і/або повний передбачений домен природного АїТиХуп5 (підкреслений), показаний на фіг. 13В. Один зразковий поліпептид АїйХуп5 містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8690, 8795, 8890, 899ю, 9095, 91905, 9295, 9390, 9490, 9590, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого АїиХуп5, показаною на фіг. 138. Поліпептид АїиХуп5 цього винаходу переважно має ксиланазну активність.
Ем4азр: Амінокислотна послідовність Ем430О (5ЕО ІЮ МО:28) показана на фіг. 148 і 53. 5ЕО ІЮ
МО:28 є послідовністю незрілого Ем430. ЕРм430 має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-20 5ЕО ІЮ МО:28 (підкреслену на фіг. 148); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 21-350 5ЕО ІЮ МО:28. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 148. Було показано, що Ем43А має В-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням п-нітрофеніл-В-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних, лінійних ксилоолігомерів як субстратів. Передбачені каталітичні залишки включають в себе або 037, або 072, 0159 і Е251. У цьому контексті, "поліпептидом Ем430" називають поліпептид і/або варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 879», 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 або 320 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 21-350 5ЕО ІЮ МО:28. Поліпептид Ем43А переважно є незміненим, в порівнянні з природним Ем43О0, в залишках 037 або 072, 0159 і Е251. Поліпептид Ем430 є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед групи ферментів, що включають в себе Ем430 і 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або всі 9 інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. 53. Поліпептид Ем430 переважно містить повний передбачений СО природного Ем430, показаний на фіг. 148. Один зразковий поліпептид Ем430 містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8790, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого Ем43О, показаною на фіг. 148. Поліпептид Ем43О цього винаходу переважно має В-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид Ем430О0 цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9990 або 100975 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:28 або із залишками (Її) 20-341, (ії) 21-350, (ії) 107-341 або (ім) 107-350 5ЕО ІЮ МО:28. Цей поліпептид переважно має р- ксилозидазну активність.
РІ4З3В: Амінокислотна послідовність РІ4ЗВ (ЗЕО ІЮО МО:30) показана на фіг. 158 і 53. 5ЕО ІЮ
МО:30 є послідовністю незрілого РІ43В. РІ43В має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-20 5ЕО ІЮ МО:30 (підкреслену на фіг. 158); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 21-321 5ЕО ІЮ МО:30. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 158. Консервативні кислотні залишки в консервативному домені включають в себе 032, 061, 0148 і Е212. Було показано, що Рі43В має ВД-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням п-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозиду, ксилобіози і/або змішаних, лінійних ксилоолігомерів як субстратів. У даному контексті "поліпептидом РІ4З3В" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8790, 8895, 8995, 909, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 969, 9796, 9896, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 280 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 21-321 5ЕО І МО:30. Поліпептид
РІ4ЗВ переважно є незміненим, в порівнянні з природним РІ4З3В, в залишках 032, 061, 0148 і
Е212. Поліпептид РІ4З3В є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9090, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед групи ферментів, що включають в себе РІ4ЗВ і 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або всі 9 інших амінокислотних послідовностей в зіставленні фіг. бо 53. Поліпептид РІ4ЇЗВ переважно містить передбачений консервативний домен природного
РІ4ЗВ, показаний на фіг. 158. Один зразковий поліпептид РІ4ЗВ містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 869о, 879о, 8895, 8995, 9095, 91905, 9296, 939, 9495, 9595, 9690, 9790, 9895, 9990 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого РІ43В, показаною на фіг. 158. Поліпептид РІ4ЗВ цього винаходу переважно має р-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид Рі43ЗВ цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9990 або 100975 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:30. Цей поліпептид переважно має В-ксилозидазну активність.
Ем51А: Амінокислотна послідовність ЕМ51А (5ЕО ІЮ МО:32) показана на фіг. 168 і 54. 5ЕО ІЮ
МО:32 є послідовністю незрілого Ем51А. Ем51А має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-19 5ЕО ІЮ МО:32 (підкреслену на фіг. 168); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 20-660 5ЕО ІЮ МО:32. Передбачений І-с-арабінофуранозидазний консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 168. Було показано, що Ем51А має 1 -а- арабінофуранозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням 4- нітрофеніл-с-І -арабінофуранозиду як субстрату. Було показано, що Ем51А каталізує вивільнення арабінози з набору олігомерів, що вивільняються з геміцелюлози за допомогою дії ендоксиланази. Консервативні залишки включають в себе Е42, 049, Е247, Е286, Е330, Е359,
Е479 і Е487. У цьому контексті "поліпептидом РМ51А" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8790, 8895, 8995, 9095, 9190, 9290, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 або 625 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 20-660 5ЕО ІЮ МО:32. Поліпептид ЕмМО1А переважно є незміненим, в порівнянні з природним Ем91А, в залишках Е42, 049, Е247, Е286,
Ез330, Е359, Е479 і Е487. Поліпептид Ем51А є переважно незміненим щонайменше в 7095, 80905, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед Ем51А, Раб1А і
РІ51А, як показано в зіставленні фіг. 54. Поліпептид Ем51А переважно містить передбачений консервативний домен природного Ем51А, показаний на фіг. 168. Один зразковий поліпептид
ЕМеТА містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 87905, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності з послідовністю зрілого Ем51А, показаною на фіг. 168. Поліпептид Ем51ТА цього винаходу переважно має 1 -а- арабінофуранозидазну активність.
Таким чином, поліпептид Ем51А цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9990 або 100975 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:32 або із залишками (Її) 21-660, (ії) 21-645, (ії) 450-645 або (ім) 450-660 5ЕО ІЮ МО:32. Цей поліпептид переважно має І - а-арабінофуранозидазну активність.
Хуп3: Амінокислотна послідовність Хуп3 Тгісподепта геезеї (ЗЕО ІЮ МО:42) показана на фіг. 218. 5ЕО ІО МО:42 є послідовністю незрілого Хуп3 Тгісподегта геезеї. Хуп2 Тгісподегта геезеї має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-16 5ЕО І МОс42 (підкреслену на фіг. 218); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 17-347 5ЕО ІЮ МО:42. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 218. Було показано, що Хуп3
Тіісподегпта геезеі має ендоксиланазну активність, безпосередньо спостереженням його здатності каталізувати збільшене продукування ксилозного мономера в присутності ксилобіозидази, коли ці ферменти діють на передобробленій біомасі або на виділеній геміцелюлозі. Консервативні каталітичні залишки включають в себе Е91, Е176, Е180, Е195 і
Е282, як визначено зіставленням з іншим ферментом сімейства СНІО, Хубз! дельта з зігеріотусев ПНаївієдії (Сапаї!в єї аіІ., 2003, Асі Стгувіаіоаг. О Віої. 59:1447-53), який має 3395 ідентичність послідовності з ХупЗ Тгісподегта геезеі. У цьому контексті "поліпептидом Хупз3
Тіісподегта геезвї" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 869о, 879о, 8895, 8995, 9095, 91905, 9296, 939, 9495, 9595, 9690, 9790, 9895, 9990 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 300 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 177-347 5ЕО ІЮ МО:42. Поліпептид ХупЗ3
Тісподепта геебзєї переважно є незміненим, в порівнянні з природним поліпептидом Хупз3
Тгпісподегта геезеї, в залишках Е9О1І, Е176, Е180, Е195 і Е282. Поліпептид Хуп3 Пісподегтта геєзві є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед Хуп3 і Хубз1 дена Тгісподепта геезеїі.
Поліпептид ХупЗ3 Тгіснподетта геєзєї переважно містить повний передбачений консервативний бо домен природного ХупЗ Тгісподепта геезеі Хуп3, показаний на фіг. 218. Один зразковий поліпептид ХупЗ3 Тгісподепта геезеї містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8890, 89905, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9690, 9790, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого ХупЗ Тгісподегта геезеї, показаною на фіг. 218. Поліпептид Хупз3
Тпісподегта геезеї цього винаходу переважно має ксиланазну активність.
Хуп2: Амінокислотна послідовність Хуп2 Тгісподепта геезеї (ЗЕО ІЮО МО:43) показана на фіг. 22 1 558. 5ЕО ІЮ МО:43 є послідовністю незрілого Хуп2 Тгісподегта геезеі. Хуп2 Тгісподегта геезеі має передбачену препропептидну послідовність, що відповідає залишкам 1-33 5ЕО ІЮ
МО:43 (підкреслену на фіг. 22); передбачається, що розщеплення цієї передбаченої сигнальної послідовності між положеннями 16 і 17 дає пропептид, який процесується кексинподібною протеазою між положеннями 32 і 33, генеруючи зрілий білок, що має послідовність, відповідну 33-222 ЗЕО ІЮ МО:43. Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 22. Було показано, що Хуп2 Тгісподепта геезеії має ендоксилозидазну активність, безпосередньо спостереженням його здатності каталізувати збільшене продукування ксилозного мономера в присутності ксилобіозидази, коли ці ферменти діють на передобробленій біомасі або на виділеній геміцелюлозі. Консервативні кислотні залишки включають в себе Е118, Е123 і Е209. У цьому контексті, "поліпептидом Хуп2 Тгіснодепта геезеї" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 85595, 8бов, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150 або 175 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 33-222 5ЕО ІО МО:43. Поліпептид Хуп2
Тісподетгта геезеїі переважно є незміненим, в порівнянні з природним Хупа2 Тгісподепта геезеї, в залишках Е118, Е123 і Е209. Поліпептид Хуп2 Пісподепта геезвї є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед Тгісподепта геезеї Хуп2, АтХупа2 і АтиХуп5, як показано в зіставленні фіг 558. Поліпептид Хуп2 Тгісподепта геезеі переважно містить повний передбачений консервативний домен природного Хуп2 Ттгісподегта геезеї, показаний на фіг. 22. Один зразковий поліпептид Хуп2 Тісподепта геезеї містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого Хуп2 Тгісподегта геезеї, показаною на фіг. 22. Поліпептид
Зо Хуп2г Тпісподегта геезеї цього винаходу переважно має ксиланазну активність.
Вх/1: Амінокислотна послідовність Вхі! Тгісподегпта геезеї (ЗЕО ІЮО МО:44) показана на фіг. 23 і 64. 5ЕО ІЮ МО:44 є послідовністю незрілого Вхі! Тгісподегпта геезеї. ВхІ1 Тгісподепта геезеї має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-18 5ЕО І МОс44 (підкреслену на фіг. 23); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 19-797 5ЕО ІЮ МО:44. Передбачені консервативні домени показані жирним шрифтом на фіг. 23. Було показано, що Вхі!
Тпісподегта геезеї має рД-ксилозидазну активність, наприклад, в ферментативному аналізі з використанням /п-нітрофеніл-В-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних, лінійних ксилоолігомерів як субстратів. Консервативні кислотні залишки включають в себе Е193, Е234 і
Ор310. У даному контексті "поліпептидом Вхії Тгісподегта геєзвї" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 869о, 8795, 889ю, 8995, 9090, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 969, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700 або 750 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 117-797 5ЕО ІО МО:44. Поліпептид ВХхії
Тісподегта геезвеї переважно є незміненим, в порівнянні з природним Вхі! Тгісподепта геезеї, в залишках Е193, Е234 і 0310. Поліпептид ВхХІ!ї Тгісподепта геєзєеі переважно є незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед Вхі!, ЕмЗА Ттгісподегта геезеї і ВдІ1 Тгісподегпта геезеї, як показано в зіставленні фіг. 64. Поліпептид ВхіІї Гісподепта геезеї переважно містить повні консервативні домени природного Вхі! Тгісподегта геезеї, показані на фіг. 23. Зразковий поліпептид ВХхі!
Тісподетгта геезвї містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8890, 899о, 9090, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 96905, 9790, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого
ВХ Ттісподегта геезеї), показаною на фіг. 23. Поліпептид ВхХіІ! Тгісподепта геезеї цього винаходу переважно має В-ксилозидазну активність.
Таким чином, поліпептид ВхХіІ!ї Тгісподегта геезеі цього винаходу переважно містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9095, 9195, 9295, 93905, 9495, 9595, 96905, 97905, 9890, 9995 або 10095 ідентичністю послідовності 5ЕО ІЮ МО:44. Цей поліпептид переважно має р- ксилозидазну активність.
ВаІ1: Амінокислотна послідовність ВЯП! (5ЕО ІЮ МО:45) показана на фіг. 24 і 64. Ва! 60 Тіісподегта геезеї має передбачену сигнальну послідовність, відповідну залишкам 1-19 5ЕО ІЮ
МО:45 (підкреслену на фіг. 24); передбачається, що відщеплення цієї сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, відповідну залишкам 20-744 5ЕО ІЮ МО45
Передбачений консервативний домен показаний жирним шрифтом на фіг. 24. Було показано, що Ва! Тгісподегта геезеі має ВД-глюкозидазну активність, спостереженням здатності каталізувати гідроліз пара-нітрофеніл-В-Ю-глюкопіранозиду для одержання пара-нітрофенілу і здатність гідролізу целобіози. Консервативні кислотні залишки включають в себе 0164, Е197 і р267. У цьому контексті, "поліпептидом Ва! Тгіісподетта геезвєї" називають поліпептид і/або його варіант, що містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 889ю, 8995, 9090, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 969, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності щонайменше з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 або 780 суміжними амінокислотними залишками серед залишків 20-744 5ЕО ІЮ МО:45.
Поліпептид Ва!1 Пісподетгта геезеї переважно є незміненим, в порівнянні з природним Ва, в залишках 0164, Е197 ії 0267. Поліпептид ВадіІї Тгісподепта геебзєї є переважно незміненим щонайменше в 7095, 8095, 9095, 9595, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, які є консервативними серед Ва11, ЕмЗА Тгісподегта геезеї і Вхі1 Тгісподегпта геезеї, як показано в зіставленні фіг. 64. Поліпептид Ва! Тиісподепта геезеі переважно містить повний передбачений консервативний домен природного Ва! Тгісподегта геезеї, показаний на фіг. 24.
Один зразковий поліпептид Водії Тісподегта геезві містить послідовність, яка має щонайменше 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичність з послідовністю зрілого Вді! Тгісподепта геезеї, показаною на фіг. 24. Поліпептид
Ва!1 Тгісподегта геезеї цього винаходу переважно має рД-глюкозидазну активність.
Таким чином, даний опис забезпечує ряд виділених, синтетичних або рекомбінантних геміцелюлолітичних поліпептидів або варіантів, описаних нижче: (1) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 24-766 5ЕО І МО:2; (ії) 73-321 5ЕО ІЮ МО 2; (ії) 73-394 5ЕО ІЮ МО:2; (їм) 395- 622 5ЕО І МОс2; (м) 24-622 5ЕО ІЮ МО:2 або (ім) 73-622 5ЕО ІЮО МО:2; цей поліпептид переважно має р-ксилозидазну активність; або (2) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-445 5ЕО І МО 4; (ії) 21-301 5ЕО І МО 4; (ії) 21-323 5БЕО ІЮ МО 4; (ім) 21-444
ЗЕО ІЮ МО:4; (м) 302-444 5ЕО ІЮ МОС4; (мі) 302-445 5ЕО ІЮ МО 4; (мії) 324-444 5ЕО ІОЮО МО:4 або (мії) 324-445 5БЕО ІЮ МО 4; цей поліпептид переважно має р-ксилозидазну активність; або (3) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 19-530 5ЕО ІЮ МО:6; (ії) 29-530 5ЕО ІО МО:6; (ії) 19-300 5ЕО ІО МО:6 або (ім) 29- 300 5ЕО ІЮ МО:6; цей поліпептид переважно має р-ксилозидазну активність; або (4) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 20-439 5ЕО І МО:8; (її) 20-291 5ЕО ІЮ МО:8; (ії) 145-291 5ЕО ІО МО:8 або (ім) 145-439 5ЕО ІЮО МО:8; цей поліпептид переважно має рВ-ксилозидазну активність; або (5) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 23-449 5ЕО ІЮ МО':10; (ії) 23-302 5ЕО І МО:10; (ії) 23-320 5ЕО І МО:10; (ім) 23- 448 5ЕО І МО 10; (м) 303-448 5ЕО ІЮ МО:10; (мі) 303-449 5ЕО ІЮ МО:10; (мії) 321-448 5ЕО Ір
МО:10 або (мії) 321-449 5ЕБО ІО МО:10; цей поліпептид переважно має рДВ-ксилозидазну активність; або (6) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 17-574 5ЕО ІЮ МО:12; (ії) 27-574 5ЕО І МО 12; (ії) 17-303 5ЕО ІО МО:12 або (ім) 27-303 5ЕО ІЮ МО:12; цей поліпептид переважно має як р-ксилозидазну активність, так і 1 -а- арабінофуранозидазну активність; або (7) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-676 5ЕО ІЮ МО 14; (ії) 21-652 5ЕО ІЮ МО:14; (ії) 469-652 5ЗЕО ІЮ МО:14 або (м) 469-676 БЕО ІЮО МО:14; цей поліпептид переважно має як ВД-ксилозидазну активність, так і 1 - а-арабінофуранозидазну активність; або (8) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (і) 139-340 5ЕО ІО МО:16; (ії) 538-340 5ЕО ІО МО:16; (ії) 19-383 БЕО ІЮО МО:16 або (ім) 53-383 5ЕО ІЮ МО:16; цей поліпептид переважно має В-ксилозидазну активність; або (9) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-341 5ЕО ІЮ МО:18; (ії) 107-341 5ЕО І МО':18; (ії) 21-348 5ЕО ІЮ МО:18 або (м) 107-348 5ЕО ІО МО:18; цей поліпептид переважно має ВД-ксилозидазну активність; або (10) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 15-558 ЗЕО ІО МО:20 або (ії) 15-295 5ЕО ІЮ МО:20; цей поліпептид переважно має І -а-арабінофуранозидазну активність; або (11) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-6382 5ЕО ІЮ МО:22; (ії) 461-632 5ЕО ІЮ МО:22; (ії) 21-642 5ЕО ІЮ МО:22 або (м) 461-642 5ЕО ІЮ МО:22; цей поліпептид переважно має І-а-арабінофуранозидазну активність; або (12) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 20-341 5ЕО ІЮ МО:28; (ії) 21-350 5ЕО І МО:28; (іїї) 107-341 5ЕО ІЮ МО:28 або (м) 107-350 5ЕО ІОЮ МО:28; цей поліпептид переважно має ВД-ксилозидазну активність; або (13) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-660 5ЕО ІЮ МО:32; (ії) 21-645 5ЕО ІЮО МО:32; (іїї) 450-645 5ЕО ІЮ МО:32 або (м) 450-660 5ЕО ІЮ МО:32; цей поліпептид переважно має І-а-арабінофуранозидазну активність.
Даний опис забезпечує також композиції (наприклад, целюлазні композиції, або ферментні суміші/композиції) або ферментаційні бульйони, збагачені одним або декількома з вищеописаних поліпептидів. Таким чином, ця ферментна суміш/композиція є композицією, що не зустрічається в природі. Цією целюлазною композицією може бути, наприклад, целюлазна композиція міцеліальних грибів, така як целюлазна композиція Тгісподепта. Цим
Зо ферментаційним бульйоном може бути ферментаційний бульйон міцеліального гриба, наприклад ферментаційний бульйон Тгісподегта, Нитісоїа, Ризагішт, Азрегойшв5, Меигозрога,
Репісіййшт, СерпаІозрогішт, АспіІуа, Родозрога, Епадоїйіа, Мисог, СоспііороЇн5, Ругісціагпа або
Спгузозрогічт. Зокрема, цим ферментаційним бульйоном може бути, наприклад, ферментаційний бульйон одного з Ттгісподепта 5рр., такого як Тгісподегта геезеї, або
Репісіййшт 5рр., такого як РепісШіит 7ипісшозит. Цим ферментаційним бульйоном може бути переважно також безклітинний ферментаційний бульйон.
Крім того, даний опис забезпечує клітини-хазяїни, які сконструйовані рекомбінантно для експресії описаного вище поліпептиду. Цими клітинами-хазяїнами можуть бути, наприклад, клітини-хазяїни міцеліальних грибів, такі як клітини Тгісподегта, Нитісоїа, Ризагішт, Азрегойив,
Мешйгозрога, Репісіййшт, СерНаіозрогішт, Аспіуа, Родовзрога, Епаоїйіа, Мисог, соспііороїшв5,
Ругісшагіа або Спгузозрогішт. Зокрема, цими клітинами-хазяїнами можуть бути, наприклад, клітина Тгісподегта 5рр. (така як клітина Тгісподегта геезеї) або клітина Репісіййшт (така як клітина Репісійшт 7ипісчіовит), клітина АзрегойЙив5 (така як клітина АзрегоїЇїи5 огу/ає або клітина
Азрегоїйи5 піашапе) або клітина Ризагішт (така як клітина Ризагішт мепісШоїде5 або клітина
Еизатішт охузрогит). 6.1.1. Злиті білки
Даний опис забезпечує також злитий білок, який включає в себе домен білка даного опису, приєднаний до одного або декількох злитих сегментів, які є звичайно гетерологічними відносно цього білка (тобто одержаними з іншого джерела, ніж білок цього опису). Придатні злиті
БО сегменти включають в себе, без обмеження, сегменти, які можуть збільшувати стабільність білка, забезпечують іншу бажану біологічну активність і/або сприяють очищенню цього білка (наприклад, афінною хроматографією). Придатним злитим сегментом може бути домен будь- якого розміру, який має бажану функцію (наприклад, надає збільшені стабільність, розчинність, дію або біологічну активність і/або спрощує очищення білка). Злиті сегменти можуть бути приєднані до аміно- або карбоксильних кінців цього домену (цих доменів) білка даного опису. Ці злиті сегменти можуть бути чутливими до розщеплення. Наявність цієї чутливості може бути корисною, наприклад, вона може полегшувати безпосереднє витягання цього білка, що представляє інтерес. Злиті білюи одержують переважно культивуванням рекомбінантної клітини, трансфікованої злитою нуклеїновою кислотою, яка кодує білок, який включає в себе 60 злитий сегмент, приєднаний або до карбоксилкінцевої сторони, або до амінокінцевої сторони,
або злиті сегменти приєднані як до карбоксилкінцевої, так і до амінокінцевої сторони білка або його домену.
Таким чином, білки даного опису включають в себе також продукти експресії злитих генів (наприклад, надекспресованої, розчинної і активної форми рекомбінантного білка), мутагенізованих генів (наприклад, генів, що мають модифікації кодонів для посилення транскрипції і трансляції генів) і укорочених генів (наприклад, генів, що мають сигнальні послідовності, видалені або замінені гетерологічною сигнальною послідовністю).
Глікозилгідролази, які утилізують нерозчинні субстрати, часто є модулярними ферментами.
Вони звичайно містять каталітичні модулі, приєднані до одного або декількох некаталітичних вуглеводзв'язувальних доменів (СВМ). Вважається, що в природі СВМ посилюють взаємодію глікозилгідролази з її субстратним полісахаридом-мішенню. Таким чином, цей опис забезпечує химерні ферменти, що мають змінену субстратну специфічність, які включають в себе, наприклад, химерні ферменти, що мають множинні субстрати як результат "5ріісед-іп" (введених за допомогою сплайсингу) гетерологічних СВМ. Гетерологічні СВМ химерних ферментів цього опису можуть бути також сконструйовані таким чином, що вони є модулярними, так що вони приєднуються до каталітичного модуля або каталітичного домену (Ср", наприклад, при активному центрі), який може бути подібним чином гетерологічним або гомологічним відносно глікозилгідролази.
Таким чином, цей опис забезпечує пептиди і поліпептиди, які складаються з СВМ/СО- модулів або містять СВМ/СО-модулі, які можуть бути гомологічно спарені або приєднані з утворенням химерних (гетерологічних) СВМ/СО-пар. Таким чином, ці химерні поліпептиди/пептиди можуть бути використані для поліпшення або зміни продуктивності ферменту, що представляє інтерес. Таким чином, цей опис забезпечує химерні ферменти, які містять, наприклад, щонайменше один СВМ ферменту 5ЕО ІЮО МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44 або 45. Наприклад, один поліпептид цього опису включає в себе амінокислотну послідовність, що містить СО і/або СсвМ глікозилгідролазної послідовності зЗЕО ІЮ МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44 або 45. Таким чином, поліпептид цього опису може бути переважно злитим білком, який містить функціональні домени з двох або більше різних білків (наприклад,
Ко) СВМ з одного білка, зв'язаний з СО з іншого білка).
Поліпептиди цього опису можуть бути переважно одержані і/або використані "по суті в чистій" формі. Наприклад, поліпептид цього опису складається щонайменше з приблизно 80 мас. 95 (наприклад, щонайменше приблизно 85 мас. 95, 90 мас. 95, 91 мас. 95, 92 мас. 95, 93 мас.
Фо, 94 мас. 95, 95 мас. 95, 96 мас. 95, 97 мас. 95, 98 мас. 95 або 99 мас. 95) загального білка в конкретній композиції, яка також включає в себе інші інгредієнти, такі як буфер або розчин.
Крім того, поліпептиди цього опису можуть бути переважно одержані і/або використані в рекомбінантних культуральних бульйонах (наприклад, культуральних бульйонах міцеліальних грибів). Ці рекомбінантні культуральні бульйони можуть бути такими, що не зустрічаються в природі; наприклад, цей культуральний бульйон може бути одержаний з використанням рекомбінантної клітини-хазяїна, яка сконструйована для експресії гетерологічного поліпептиду цього опису, або з використанням рекомбінантної клітини-хазяїна, яка сконструйована для експресії ендогенного поліпептиду цього опису у більших або менших кількостях, ніж рівні ендогенної експресії (наприклад, в кількості, яка є в 1, 2, 3, 4, 5 або більше разів більшою або меншою, ніж рівні ендогенної експресії). Крім того, поліпептиди цього опису можуть бути переважно одержані і/або використані як рекомбінантні культуральні бульйони, продуковані "інтегрованими" штамами клітин-хазяїнів, які були сконструйовані для експресії множини поліпептидів цього опису в бажаних співвідношеннях. Ці зразкові бажані співвідношення описані тут, наприклад, в розділі 6.3.4 нижче. 6.2. Нуклеїнові кислоти і клітини-хазяїни
Даний опис забезпечує нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептид цього опису, наприклад поліпептид, описаний в розділі 6.1 вище.
Цей опис забезпечує виділені, синтетичні або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щонайменше приблизно 7095, наприклад щонайменше приблизно 7195, 7295, 7З9ю, 7490, 759о, 769, 7 79Ую, 7890, 7990, 8090, 8190, 8295, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 99965 або повну (10095), ідентичність послідовності з нуклеїновою кислотою ЗЕО ІЮО МО'1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23,25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49 або 50 на протязі району щонайменше приблизно 10, наприклад щонайменше приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 60 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800,
Зо
1850, 1900, 1950 або 2000, нуклеотидів. Даний опис забезпечує також нуклеїнові кислоти, що кодують щонайменше один поліпептид, який має геміцелюлолітичну активність (наприклад, ксиланазну, ВД-ксилозидазну і/або І -л-арабінофуранозидазну активність).
Нуклеїнові кислоти цього опису включають в себе також виділені, синтетичні або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що кодують послідовність ЖЕО ІЮО МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44 або 45, і їх субпослідовності (наприклад, консервативний домен або вуглеводзв'язувальний домен ("СВМ") і їх варіанти). Нуклеїнова кислота цього опису може, наприклад, кодувати зрілий білок 5ЕО ІЮО МО:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44 або 45.
Цей опис, конкретно, забезпечує нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид ЕмУЗА, РІ4ЗА,
ЕмаЗЕ, ЕуЗ9А, Ем4ЗА, Ем4ЗВ, РабтА, с224З3А, Го43А, АТЗА, РІЗТА, АтХуп2г, АтиХупо, Ема4з0,
РІАЗВ, ЕРм4аЗ3В, ЕкмО1А, ХупЗ3 Пісподетта геезві, Хуп2 Пісподетта геезві, Вхії Пісподепта геезеї або ВадіІ1 Тгісподегта геезеї.
Наприклад, цей опис забезпечує виділену молекулу нуклеїнової кислоти, де ця молекула нуклеїнової кислоти кодує: (1) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 24-766 5ЕО І МО:2; (ії) 73-321 5ЕО ІЮ МО:2; (ії) 73-394 5ЕО ІЮ МО:2; (їм) 395- 622 5ЕО ІЮ МО:2; (м) 24-622 5ЕО ІЮ МО:2 або (ім) 73-622 5ЕО ІЮО МО:2; або (2) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-445 5ЕО І МО 4; (ії) 21-301 5ЕО І МО 4; (ії) 21-323 5БЕО ІЮ МО 4; (ім) 21-444
ЗЕО ІЮ МО 4; (м) 302-444 5ЕО ІЮ МОС4; (мі) 302-445 5ЕО ІЮО МО 4; (мії) 324 444 5ЕО ІЮ МО:4 або (мії) 324-445 5ЕО ІЮ МО 4; або (3) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 19-530 5ЕО ІЮ МО:6; (ії) 29-530 5ЕО ІО МО:6; (ії) 19-300 5ЕО ІО МО:6 або (ім) 29- 300 5ЕО ІЮО МО:6; або (4) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 20-439 5ЕО І МО:8; (її) 20-291 5ЕО ІЮ МО:8; (ії) 145-291 5ЕО ІО МО:8 або (ім) 145-439 БЕО ІЮО МО:8; або (5) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ії) 23-449 5БЕО І МО:10; (її) 23-302 5ЕО ІЮ МО 10; (іїї) 23-320 5ЕО ІО МО 10; (ім) 23- 448 5ЕО І МО 10; (м) 303-448 5ЕО ІЮ МО:10; (мі) 303-449 5ЕО ІЮ МО:10; (мії) 321-448 5ЕО Ір
МО:10 або (мії) 321-449 5ЕО ІО МО:10; або (6) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 17-574 5ЕО ІЮ МО:12; (ії) 27-574 5ЕО І МО 12; (ії) 17-303 5ЕО ІО МО:12 або (ім) 27-303 5ЕО ІЮО МО:12; або (7) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-676 5ЕО ІЮ МО 14; (ії) 21-652 5ЕО ІЮ МО:14; (ії) 469-652 5ЗЕО ІЮ МО:14 або (м) 469-676 5БЕО ІЮ МО:14; або (8) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 19-340 5ЕО ІЮ МО:16; (ії) 538-340 5ЕО ІЮО МО:16; (ії) 19-383 5ЕО ІО МО:16 або (ім) 53-383 5ЕО ІЮ МО:16; або (9) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-341 5ЕО ІЮ МО:18; (ії) 107-341 5ЕО І МО':18; (ії) 21-348 5ЕО ІЮ МО:18 або (м) 107-348 5ЕО ІО МО:18; або (10) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 15-558 ЗЕО ІЮ МО:20 або (ії) 15-295 5ЕО ІО МО:20; або (11) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-6382 5ЕО ІЮ МО:22; (ії) 461-632 5ЕО ІЮ МО:22; (ії) 21-642 5ЕО ІЮ МО:22 або бо (м) 461-642 5ЕО ІОЮ МО:22; або
(12) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 20-341 5ЕО ІЮ МО:28; (ії) 21-350 5ЕО І МО:28; (іїї) 107-341 5ЕО ІЮ МО:28 або (м) 107-350 5ЕО ІО МО:28; або (13) поліпептид, що містить амінокислотну послідовність з щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 10095 ідентичністю послідовності, що відповідає положенням (ї) 21-660 5ЕО ІЮ МО:32; (ії) 21-645 5ЕО ІЮО МО:32; (іїї) 450-645 5ЕО ІЮ МО:32 або (м) 450-660 5ЕО 10 МО:32.
Даний опис забезпечує також: (1) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 90905, 9190, 9290, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з зЗЕО ІЮ МО:1, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом
ЗЕО ІЮ МО:1, або з його фрагментом; або (2) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9195, 9290, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з зЗЕО ІЮ МО:3, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом
ЗЕО ІЮ МО:З або з його фрагментом; або (3) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9195, 9290, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з зЗЕО ІЮ МО:5, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом
ЗЕО ІЮ МО:5 або з його фрагментом; або (4) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9195, 9290, 9395, 9495, 9595, 9690, 9795, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО:7, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом
ЗЕО ІЮ МО/:7 або з його фрагментом; або (5) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9195, 9290, 9395, 9495, 9595, 96905, 9795, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з зБЕО ІЮ МО:9, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом
ЗЕО ІЮ МО:9 або з його фрагментом; або
Зо (6) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 90905, 9190, 9290, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО:11, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом ЗЕО ІЮ МО:11 або з його фрагментом; або (7) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9195, 9290, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО:13, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом ЗЕО ІЮ МО:13 або з його фрагментом; або (8) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9195, 9290, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО:15, або о нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом 5ЕО ІЮО МО:15, або (9) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9195, 9290, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9890, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО:17, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом ЗЕО ІЮ МО:17 або з його фрагментом; або (10) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9190, 92, 9390, 9490, 9595, 9690, 9790, 9895, 9995 або більшу) ідентичність послідовності з БЕО ІЮ
МО:19, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом ЗЕО ІЮ МО:19 або з його фрагментом; або (11) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9190, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9990 або більшу) ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ
МО:21, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом ЗЕО ІЮ МО:21 або з його фрагментом; або (12) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9190, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9990 або більшу) ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ
МО:27, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом 5ЕО ІЮ МО:2 або з його фрагментом; або (13) нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 9095, 9190, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9990 або більшу) ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ
МО:31, або нуклеїнову кислоту, яка здатна гібридизуватися в умовах високої жорсткості з комплементом ЗЕО ІЮ МО:31 або з його фрагментом.
Цей опис забезпечує також експресійні касети і/або вектори, які містять вищеописані нуклеїнові кислоти.
Переважно, нуклеїнова кислота, що кодує фермент цього опису, функціонально зв'язана з промотором. Конкретно, якщо бажаною є рекомбінантна експресія в міцеліальній грибний клітині-хазяїні, цим промотором може бути грибний промотор. Ці нуклеїнові кислоти можуть, наприклад, знаходитися під контролем гетерологічних промоторів. Ці нуклеїнові кислоти можуть також експресуватися під контролем конститутивного або індукованого промотору.
Приклади промоторів, які можуть бути використані, включають в себе, але не обмежуються ними, промотор целюлази, промотор ксиланази, промотор 1818 (раніше ідентифікований як високоекспресований білок за допомогою ЕЗТ-картування Тгісподегта). Наприклад, цей промотор може бути переважно промотором целобіогідролази, ендоглюконази або р- глюкозидази. Одним особливо переважним промотором може бути, наприклад, промотор целобіогідролази, ендоглюканази або ДВ-глюкозидази Тгісподегта геезеї. Наприклад, цей промотор є промотором целобіогідролази 1 (сбп1). Необмежувальні приклади промоторів включають в себе промотор СЬНІ, срНг, едії, едіг, едіІЗ, ед1і4, еадіб, ркії, ара1, хуп1 або хуп2г.
Додаткові необмежувальні приклади включають в себе промотор СЬНІ, срНг, еадії, едіг, евіЗ, еді4, едіб, ркі!, дра, хуп1 або хуп2 Тгісподепта геезеї.
Даний опис забезпечує клітини-хазяїни, які сконструйовані для експресії одного або декількох ферментів цього опису. Придатні клітини-хазяїни включають в себе будь-який мікроорганізм (наприклад, клітини бактерії, протист, водорості, гриба (наприклад, дріжджів або міцеліальних грибів) або іншого мікроба) і переважно клітини бактерії, дріжджів або міцеліального гриба.
Придатні клітини-хазяїни бактеріальних родів включають в себе, але не обмежуються ними, клітини Езспегіспіа, Васійиб5, Гасіорасійй5, Рхеипдотопаз і Бігеріотусе5. Придатні клітини бактеріальних видів включають в себе, але не обмежуються ними, клітини Ез5сПегіспіа соїї,
ВасшШиз зибій5, Васіив5 Іспепіогтів, І асіобасійи5 бгемі5, Рзендотопавх аегидіпоза і Зігеріотусев5
Імідапв.
Придатні клітина-хазяїни родів дріжджів включають в себе, але не обмежуються ними, клітини Засспаготусев5, Зспі7озасспаготусе5, Сапаїда, Напзепиїа, Ріспіа, Кісумеготусез і
Рпайіа. Придатні клітини видів дріжджів включають в себе, але не обмежуються ними, клітини засспаготусез сегемівіає, ЗСпігозасспаготусез ротбе, Сапаїйда аїІрісапв, Напзепшиїа роїутогрга,
Ріспіа разіогі5, Р. сападепві5, Кіпумеготусез тагхіапиз і Рпайа гпподогута.
Придатні клітини-хазяїни міцеліальних грибів включають в себе всі міцеліальні форми підрозділу Ештпусоїіпа. Придатні клітини родів міцеліальних грибів включають в себе, але не обмежуються ними, клітини Асгетопіцт, Азрегоійи5, А!йгеобавіадішт, Віегкапаега, Сегірогіорвів,
Спгузорогішт, Соргіпив, Согіоїив5, Согупазси5, Спавіотішт, Стуріососсив, Ніобавзідійт, Ризагійт,
СіррегеМПа, Нитісоіа, Нуростєа, Мадпаропйе, Мисог, Мусеїорпійтога, Мисог, Меосаїтавіїх,
Мешйгозрога, Раесіотусев, Репісіййшт, РНнапегоснавїе, РПебіа, Ріготусев, Рівеигоїш5, Зсутаідійт, зспігорпуПит, Зрогоїгіспит, ТаІаготусе5, Тпегптоавзсив5, ТПіеїаміа, Тоїуросіадійт, Тгатегїез і
Тиісподенпта. Придатні клітини можуть також включати в себе клітини різних анаморфних і телеморфних форм цих міцеліальних грибних родів.
Придатні клітини видів міцеліальних грибів включають в себе, але не обмежуються ними, клітини АзрегуйШив5 амжатогі, Азрегоуйи5 Типтідаст5, Авзрегдййи5 Тоеїйди5, АзрегдйШивз |аропісив,
АзрегоїПив5 підшапв, АзрегодйПив5 підег, Аврегойнив5 огугає, Спгузозрогішт ІшсКпомжмепзе, Ризагійт расіпаіоіде5, Ривзагішт сегеарй5, Ривапйит стооКуейПйепвзе, Ривагішт сцитогит, Ризагйт дгатіпеагит, Ривзагпит дгатіпит, Ривагшт Пеїегозрогит, Ризапййт педипаї, Еиваглит охузрогит, Ризагит геїйсшашт, Ризапйит гозет, Ризапйит 5затрисіпит, Ризагішт загсосптоит,
Еизатцт з5рогоїгіспіоїде5, Ривзагшт 5цйцірпитешт, Ривзагшт їогцобзит, Ризагйт іспоїПесіоідев,
Еизагішт мепепайшт, В|є"Капдега адивіа, Сепгірогпорвіє апеїйпа, Сегірогіорвів апеїнпа,
Сегірогіорвзіз сагедієа, Сепрогіорзів дімезсепв, Сепгірогіорвіє раппосіпіа, Сегірогіорвів гімціовза,
Сегірогпіорвів зибгиїта, Сегірогіорвзіє зибмептіврога, Соргіпи5 сіпегеи5, Согіоїшв Пігтеши5, Нитісоїа іпвоїеп5, Нитісоїа Іапидіпозва, Мисог тіенеї, Мусеїїорпійпога ІШепторпіїа, Мешйгозрога сгазвза,
Мешйгозрога іпіептедіа, Репісіййшт ригригтодепит, РепісіШт сапебзсепв5, Репісійшт воїйшт,
Репісійит 7ипісшобвит, РНапегоспаєїе спгузозрогішт, РНебіа гадіаїє, Ріешоїи5 егупдаії,
Таіаготусе5 Памив5, ТНієїаміа іегтевігії, Тгатеїев5 мова, Тгатеїев мегвісоЇог, Гіісподегта
Ппагліапит, Тгісподегта Копіпадії, Тгісподепта Іопдібгаспіаййшт, Тгісподепта геезеї і Тгісподегта міпіде.
Цей опис додатково забезпечує рекомбінантну клітину-хазяїна, яка сконструйована для експресії одного або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше або п'яти або більше з поліпептидів ЕУЗА, РІ4ЗА, ЕмаЗЕ, ЕмЗ9А, Ем4ЗА, Ем4аЗВ, РабтА, (1243А, Го4ЗА,
АТЗА, РІБ1ТА, АїиХуп2, АтТиХуп5, Ем430О, РІ4З3В і Гм51А. Ця рекомбінантна клітина-хазяїн є, наприклад, рекомбінантною клітиною-хазяїном Тгісподепта геезеіз У одному конкретному прикладі, цей опис забезпечує рекомбінантний гриб, такий як рекомбінантний Тгісподегта геезеї, який сконструйований для експресії одного або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше або п'яти або більше з поліпептидів ЕуЗА, РІ4ЗА, Ем4ЗЕ, ЕмЗ9А,
Ем43ЗА, Ем43В, РазбтА, 743А, Го43А, АМКЗА, РІУТА, АтиХуп2, АтиХуп5, Ем430, РІ4ЗВ і Еме1А. Цей опис забезпечує рекомбінантну клітину-хазяїна Тгісподегта геезеї, сконструйовану для експресії 1, 2, 3, 4, 5 або більше з поліпептидів ЕмЗА, РІ4ЗА, Ем4ЗЕ, ЕмЗ9А, Ема4ЗА, Ема4ЗВ,
Раб1тА, 0743А, Го43А, АТАЗА, РІБ1А, АгТиХуп2, АгтиХуп5, Ем430, РІ4ЗВ і ЕмМе1А.
Цей опис забезпечує клітину-хазяїна, наприклад рекомбінантну грибну клітину-хазяїна або рекомбінантний міцеліальний гриб, сконструйовану для рекомбінантної експресії щонайменше однієї ксиланази, щонайменше однієї р-ксилозидази і однієї І -с-арабінофуранозидази. Цей опис забезпечує також рекомбінантну клітину-хазяїна, наприклад рекомбінантну грибну клітину- хазяїна або рекомбінантний міцеліальний гриб, такий як Тгісподегта геевеї, який сконструйований для експресії 1, 2, 3, 4, 5 або більше з поліпептидів ЕуЗА, РІ4ЗА, ЕмаЗЕ,
Е«З9А, Ем4ЗА, Ем43В, РабзтА, С7243А, ГБо43А, АТЗА, РІЗ1А, АтиХуп2, АтиХуп5, Ем430, РІ4ЗВ і
Ем514А, нарівні з одним або декількома з Хуп2 Тісподегта геезві, Хуп3 Тісподегта геезвї, Вхі!
Тіісподегта геезеї і/або Вді! Тгісподегта геезеї. Цією рекомбінантною клітиною-хазяїном є, наприклад, клітина-хазяїн Тгісподепта геезеіз Цим рекомбінантним грибом є, наприклад, рекомбінантний Тгісподегіта геезеї. Цей опис забезпечує клітину-хазяїна Тгісподепта геезеї або рекомбінантний гриб Тгісподегта геезеї, який сконструйований для рекомбінантної експресії 1, 2, 3, 4, 5 або більше з поліпептидів ЕМЗА, РІ4ЗА, Ем4ЗЕ, ЕмЗ9А, Ем4ЗА, Ем43В, РабтА, с24ЗА,
Ео43А, АТЗА, РІБ1А, АїТиХуп2, АпиХуп5, Ем430О, РІ43В і Ем51А, нарівні з рекомбінантною експресією одного або декількох з Хуп2 Тісподепта геезвї, Хуп3 Тісподепта геезвї Хуп3, Вхі!
Тіісподегта геезеї і/або Воді! Тгісподегта геезеї.
Даний опис забезпечує також рекомбінантну клітину-хазяїна, наприклад клітину-хазяїна
Зо міцеліального гриба або рекомбінантний організм, наприклад міцеліальний гриб, такий як рекомбінантний Тгісподегпта геезеї, який сконструйований для рекомбінантної експресії поліпептидів Хуп3 Тгісподепта геезеї, поліпептидів Водії, ЕмЗА, Ем43О і Ем51А Ттгісподегта геезеі. Наприклад, цією рекомбінантною клітиною-хазяїном є переважно клітина-хазяїн
Тгісподегта геезеі. Цим рекомбінантним грибом є переважно рекомбінантний Тгісподегта геезеї. Цей опис забезпечує, наприклад, клітину-хазяїна Тгісподегта геезеї, сконструйовану для рекомбінантної експресії поліпептидів ХупЗ3 Тгісподепта геезвї, Вдії, ЕУЗА, Ем430О0 і Ем51А
Тісподегта геезві.
Крім того, цей опис забезпечує рекомбінантну клітину-хазяїна або рекомбінантний гриб, який сконструйований для експресії ферментної суміші, що містить придатні ферменти у співвідношеннях, придатних для оцукрювання. Цією рекомбінантною клітиною-хазяїном є, наприклад, клітина-хазяїн гриба. Цим рекомбінантним грибом є, наприклад, рекомбінантний
Тпісподепгта геезеї. Зразкові ферментні суміші/кількості, присутні у придатних ферментних сумішах, описані в розділі 6.3.4 нижче.
Цей опис додатково забезпечує трансгенні рослини, що містять нуклеїнову кислоту цього опису або експресійні касети цього опису. Цією трансгенною рослиною може бути, наприклад, злакова рослина, рослина кукурудзи, рослина картоплі, рослина томата, рослина пшениці, олійна рослина, рослина рапсу, рослина ячменю або рослина тютюну. 6.3. Ферментні суміші для оцукрювання
Даний опис винаходу забезпечує композицію, що містить ферментну суміш/композицію, яка здатна руйнувати лігноцелюлозний матеріал. Така мультиферментна суміш/композиція містить щонайменше один поліпептид даного опису в комбінації з одним або декількома додатковими поліпептидами даного опису або одним або декількома ферментами з інших мікроорганізмів, рослин або організмів. Розглядаються синергічні ферментні комбінації і пов'язані з ними способи. Цей опис включає в себе способи для ідентифікації оптимальних співвідношень ферментів, включених в ці суміші/композиції, для деградації конкретного лігноцелюлозного матеріалу. Ці способи включають в себе, наприклад, тести для ідентифікації оптимальної ферментної суміші/композиції і співвідношень для ефективного перетворення конкретного лігпоцелюлозного субстрату в цукри, що його складають. Наведені нижче приклади включають в себе аналізи, які можуть бути використані для ідентифікації оптимальних співвідношень і бо сумішей/композицій ферментів, якими повинні деградуватися лігноцелюлозні матеріали.
6.3.1. Рівень техніки
Клітинні стінки вищих рослин складаються з різноманітності вуглеводних полімерних (СР) компонентів. Ці СР взаємодіють за допомогою ковалентних і нековалентних способів, забезпечуючи структурну цілісність, необхідну для утворення жорстких клітинних стінок і опору тургорному тиску в рослинах. Головним СР, виявленим в рослинах, є целюлоза, яка утворює структурний скелет клітинної стінки. Під час біосинтезу целюлози, ланцюги полі-В-1,4-0-глюкози самоасоціюються за допомогою утворення водневих зв'язків і гідрофобних взаємодій з утворенням целюлозних мікрофібрил, які додатково самоасоціюються з утворенням більш великих фібрил. Целюлозні фібрили є часто нерівномірними структурно і містять райони кристалічності, що варіюється. Міра кристалічності целюлозних фібрил залежить від того, як щільно впорядковане водневе зв'язування між і серед ланцюгів, що складають целюлозу. Зони з менш впорядкованим зв'язуванням і, отже, більш доступні глюкозні ланцюги, називають аморфними районами.
Загальна модель деполімеризації целюлози до глюкози включає в себе мінімально три різні ферментативні активності. Ендоглюканази розщеплюють целюлозні ланцюги всередині до коротких ланцюгів в процесі, який збільшує кількість доступних кінців, які Є більш чутливими до екзоглюканазної активності, ніж інтактні целюлозні ланцюги. Ці екзоглюканази (наприклад, целобіогідролази) є специфічними або для редукуючих кінців, або для нередукуючих кінців, і вивільняють, в більшості випадків, целобіозу, димер глюкози. Потім цю целобіозу, що накопичується, піддають розщепленню целобіазами (наприклад, В-1,4-глюкозидазами) до глюкози.
Целюлоза містить тільки ангідроглюкозу. На відміну від цього, геміцелюлоза містить ряд різних цукрових мономерів. Наприклад, крім глюкози, цукрові мономери в геміцелюлозі можуть також включати в себе ксилозу, манозу, галактозу, рамнозу і арабінозу. Геміцелюлози в основному містять ЮО-пентозні цукри і іноді малі кількості І -цукрів. Ксилоза звичайно присутня в найбільшій кількості, але мануронова кислота і галактуронова кислота також мають тенденцію бути присутніми. Геміцелюлози включають в себе ксилан, глюкуроноксилан, арабіноксилан, глюкоманан і ксилоглюкан.
Ферменти і мультиферментні композиції цього опису застосовні для оцукрювання геміцелюлозних матеріалів, що включають в себе, наприклад, ксилан, арабіноксилан і ксилан- або арабіноксиланвмісні субстрати. Арабіноксилан є полісахаридом, що складається з ксилози і арабінози, де І-а-арабінофуранозні залишки приєднані у вигляді точок гілкування до полімерного скелета ВД-(1,4)-зв'язаної ксилози.
Більшість джерел біомаси є досить комплексними, містять целюлозу, геміцелюлозу, пектин, лігнін, білок і золу, серед інших компонентів. Таким чином, в деяких аспектах, даний опис забезпечує ферментні суміші/композиції, що містять ферменти, які надають діапазон або різноманітність субстратних специфічностей при спільній дії для деградації біомаси в ферментовані цукри найбільш ефективним способом. Одним прикладом мультиферментної суміші/композиції даного винаходу є суміш целобіогідролази (целобіогідролаз), ксиланази (ксиланаз), ендоглюканази (ендоглюканаз), ВД-глюкозидази (ВД-глюкозидаз), ВД-ксилозидази (р- ксилозидаз) і, необов'язково, допоміжних білків. Ця ферментна суміш/композиція є переважно композицією, що не зустрічається в природі.
Таким чином, цей опис забезпечує ферментні суміші/композиції (в тому числі продукти виготовлення (вироби)), які містять суміш ксилангідролізуючих, геміцелюлозо- і/або целюлозогідролізуючих ферментів, які включають в себе щонайменше одну, декілька або всі з целюлаз, в тому числі глюканази; целобіогідролази; І -л-арабінофуранозидази; ксиланази; р- глюкозидази і ВД-ксилозидази. Переважно, кожна з цих ферментних сумішей/композицій цього опису містить щонайменше один фермент цього опису. Даний опис забезпечує також ферментні суміші/композиції, які є композиціями, що не зустрічаються в природі. У даному контексті, термін "ферментні суміші/композиції" стосується: (1) композиції, виробленої об'єднанням компонентів-ферментів в формі ферментаційного бульйону або частково або повністю виділених або очищених; (2) композиції, виробленої організмом, модифікованим для експресії одного або декількох компонентів-ферментів; в деяких варіантах здійснення, організм, використовуваний для експресії одного або декількох компонентів-ферментів, може бути модифікований для делеції одного або декількох генів; в деяких інших варіантах здійснення, організм, використовуваний для експресії одного або декількох компонентів-ферментів, може додатково містити білки, що впливають на гідроліз ксилану, гідроліз геміцелюлози і/або гідроліз целюлози; (3) композиції, виробленої об'єднанням ферментів одночасно, роздільно або послідовно під бо час реакції оцукрювання або ферментації; і
(4) ферментної суміші, виробленої іп 5йи, наприклад, під час реакції оцукрювання або ферментації; (5) композиції, виробленої згідно з будь-яким або всіма з (1)-(4).
Термін "ферментаційний бульйон" стосується в даному контексті ферментного препарату, одержаного ферментацією, який не піддається виділенню або мінімальному витяганню і/або очищенню після ферментації. Наприклад, мікробні культури вирощують до насичення, інкубують при обмежуючих вуглець умовах для можливості синтезу білка (наприклад, експресією ферментів). Потім, як тільки цей фермент (ці ферменти) секретується в середовище культури клітин, ці ферментаційні бульйони можуть бути використані. Ферментаційні бульйони цього опису можуть містити нефракціонований або фракціонований вміст ферментаційних матеріалів, одержаних в кінці цієї ферментації. Наприклад, ферментаційні бульйони цього винаходу є нефракціонованими і містять відпрацьоване культуральне середовище і залишки клітин, присутні після піддавання цих мікробних клітин (наприклад, міцеліальних грибних клітин) ферментаційному процесу. Цей ферментаційний бульйон може переважно містити відпрацьовані культуральні середовища, позаклітинні ферменти і живі або убиті мікробні клітини. Альтернативно, ці ферментаційні бульйони можуть бути фракціоновані для видалення цих мікробних клітин. У цих випадках, ферментаційні бульйони можуть, наприклад, містити відпрацьовані культури клітин і позаклітинні ферменти.
Будь-який з ферментів, описаних тут конкретно, може бути об'єднаний з будь-яким одним або декількома ферментами, описаними тут, або з іншими доступними і придатними ферментами з одержанням придатної мультиферментної суміші/композиції. Цей опис не обмежується або не лімітується конкретними зразковими комбінаціями, перерахованими нижче. 6.3.2 Біомаса
Цей опис забезпечує способи і процеси оцукрювання біомаси з використанням ферментів, ферментних сумішей/композицій цього опису. Термін "біомаса", в даному контексті, стосується будь-якої композиції, яка містить целюлозу і/або геміцелюлозу (необов'язково також лігнін в матеріалах лігноцелюлозної біомаси). У цьому контексті біомаса включає в себе, без обмеження, насіння, зерна, бульби, відходи рослин або побічні продукти переробки харчових продуктів або промислової переробки (наприклад, стебел), кукурудзу (в тому числі, наприклад,
Зо серцевини кукурудзяних качанів, кукурудзяну солому і т. п.), трави (в тому числі, наприклад,
Індійську траву, таку як Зогупавігит пшапе; або просо прутоподібне, наприклад, види Рапісит, такі як Рапісшт мігдаїшт), деревину (в тому числі деревні стружки, відходи переробки), папір, пульпу і вторинний папір, виготовлений з макулатури і паперових відходів (в тому числі, наприклад, газетний папір, друкарський папір і т. п.). Інші матеріали біомаси включають в себе, без обмеження, картоплю, сою (наприклад, насіння рапсу), ячмінь, жито, овес, пшеницю, буряк і багасу цукрової тростини.
Цей опис забезпечує способи оцукрювання, які передбачають контактування композиції, що містить матеріал біомаси, наприклад матеріал, що містить ксилан, геміцелюлозу, целюлозу іМабо ферментований цукор, з поліпептидом цього опису або поліпептидом, що кодується нуклесновою кислотою цього опису, або будь-якою з ферментних сумішей/композицій або промисловими виробами цього опису.
Ця оцукрювана біомаса (наприклад, лігноцелюлозний матеріал, оброблюваний ферментами цього опису) може бути вироблена у вигляді ряду продуктів на основі біоматеріалів за допомогою таких процесів, як, наприклад, мікробна ферментація і/або хімічний синтез. У цьому контексті, "мікробною ферментацією" називають процес вирощування і збирання ферментуючих мікроорганізмів при придатних умовах. Ферментуючим мікроорганізмом може бути будь-який мікроорганізм, придатний для застосування в бажаному ферментаційному процесі для одержання продуктів на основі біоматеріалів. Придатні ферментуючі мікроорганізми включають в себе, без обмеження, міцеліальні гриби, дріжджі і бактерії. Ця оцукрювана біомаса може бути, наприклад, приготована у вигляді палива (наприклад, біопалива, такого як біоетанол, біобутанол, біометанол, біопропанол, дизельне паливо, паливо для реактивних двигунів або т. п.) за допомогою ферментації і/або хімічного синтезу. Ця оцукрювана біомаса може бути, наприклад, приготована у вигляді хімічних продуктів (наприклад, аскорбінової кислоти, ізопрену, 1,3-пропандіолу), ліпідів, амінокислот, білків і ферментів за допомогою ферментації і/або хімічного синтезу. 6.3.3. Попередня обробка
Перед оцукрюванням біомасу (наприклад, лігноцелюлозний матеріал) переважно піддають однією або декільком стадіям попередньої обробки для збільшення доступності або чутливості матеріалу ксилану, геміцелюлози, целюлози і/або лігніну до ферментів і, отже, надання більшої бо схильності до гідролізу ферментами і/або ферментними сумішами/композиціями цього опису.
Зб
У одному зразковому варіанті здійснення ця попередня обробка включає піддавання матеріалу біомаси дії каталізатора, що містить розбавлений розчин сильної кислоти і солі металу, в реакторі. Цей матеріал біомаси може бути, наприклад, сирим матеріалом або висушеним матеріалом. Ця попередня обробка може знижувати енергію активації або температуру гідролізу целюлози, з одержанням зрештою більш високих виходів ферментованих цукрів. Дивіться, наприклад, патенти США МоМо 6660506; 6423145.
Інший зразковий спосіб попередньої обробки включає гідроліз біомаси піддаванням матеріалу біомаси першій стадії гідролізу у водному середовищі при температурі і тиску, вибраних для приведення у виконання первинної деполімеризації целюлози в глюкозу. Ця стадія дає суспензію, в якій рідка водна фаза містить розчинені моносахариди, одержувані деполімеризацією геміцелюлози, і тверду фазу, що містить целюлозу і лігнін. Потім цю суспензію піддають другій стадії гідролізу при умовах, які дозволяють деполімеризувати основну частину целюлози, з одержанням рідкої водної фази, що містить розчинені/розчинні продукти деполімеризації целюлози. Дивіться, наприклад, патент США Мо 5536325.
Інший зразковий спосіб включає в себе обробку матеріалу біомаси однією або декількома стадіями гідролізу розбавленою кислотою з використанням приблизно 0,495 - приблизно 295 сильної кислоти; з подальшою обробкою твердого лігноцелюлозного компонента, що не прореагував, гідролізованого кислотою матеріалу лужною делігніфікацією. Дивіться, наприклад, патент США Мо 6409841.
Інший зразковий спосіб попередньої обробки передбачає попередній гідроліз біомаси (наприклад, лігноцелюлозних матеріалів) в реакторі попереднього гідролізу; додавання кислотної рідини до твердого лігноцелюлозного матеріалу з одержанням суміші; нагрівання цієї суміші до температури реакції; підтримання температури реакції протягом періоду часу, достатнього для фракціонування цього лігноцелюлозного матеріалу в солюбілізовану частину, що містить щонайменше 20925 лігніну з цього лігноцелюлозного матеріалу, і тверду фракцію; і видалення цієї солюбілізованої частини при температурі реакції або при температурі, близькій до температури реакції; і витягання цієї солюбілізованої частини. Целюлоза в твердій фракції стає більш податливою для ферментативного розщеплення. Дивіться, наприклад, патент США
Мо 5705369.
Зо Додаткові способи попередньої обробки можуть передбачати застосування пероксиду водню НегО». Дивіться сСопцій, 1984, Віоїесі, апа Віоепдг. 26:46-52.
Попередня обробка може також передбачати контактування матеріалу біомаси зі стехіометричними кількостями гідроксиду натрію і гідроксиду амонію при дуже низькій концентрації. Дивіться Теїхеїга еї аї., 1999, Аррі. Віоспет. апа Віоїтесп. 77-79:19-34.
Попередня обробка може також передбачати контактування лігноцелюлози з хімікалієм (наприклад, основою, такою як карбонат натрію або гідроксид натрію) при рН приблизно 9 - приблизно 14, при помірних температурі і тиску. Дивіться Публікацію РСТ УМО 2004/081185.
У одному переважному способі попередньої обробки використовують, наприклад, аміак.
Такий спосіб попередньої обробки передбачає піддавання матеріалу біомаси дії низької концентрації аміаку при умовах високого вмісту сухих речовин. Дивіться, наприклад, публікацію патенту США Мо 20070031918 і публікацію РСТ УМО 06110901. 6.3.4. Зразкові ферментні суміші
Даний опис забезпечує ферментні суміші/композиції, що містять один або декілька ферментів цього опису. Один або декілька ферментів ферментних сумішей/композицій можуть продукуватися рекомбінантною клітиною-хазяїном або рекомбінантним організмом. Ці ферментні суміші/композиції є переважно композиціями, що не зустрічаються в природі.
Ферментна суміш/композиція цього опису може переважно містити перший поліпептид, що має В-ксилозидазну активність, і додатково містить 1, 2, З або 4 з другого поліпептиду, що має
В-ксилозидазну активність, одного або декількох поліпептидів, що мають 1 -а- арабінофуранозидазну активність, одного або декількох поліпептидів, що мають ксиланазну активність, і одного або декількох поліпептидів, що мають целюлазну активність. Цей перший поліпептид, що має р-ксилозидазну активність, є, наприклад, поліпептидом ЕУЗА, РІ4ЗА, ЕмаЗЕ,
Ем4аЗА, ГРм43В, Раб1А, 7243А, Бо43А або Ем39А. Другий поліпептид, що має рД-ксилозидазну активність, якщо він присутній, є, наприклад, іншим, ніж перший поліпептид, що має р- ксилозидазну активність, і є переважно поліпептидом ЕмЗА, РІ4ЗА, Ем4ЗЕ, Ема4ЗА, ЕмаЗВ,
Ра5б1тА, С243А, Ем430, Бо43А, Ем39А або Вхі! Тгісподегта геезеї. Кожний з одного або декількох поліпептидів, що мають І1-а-арабінофуранозидазну активність, якщо він присутній, є, наприклад, поліпептидом АїЗА, РІ51А, Раб1А, ЕРм43В або Ем51А. Кожний з одного або декількох поліпептидів, що мають ксиланазну активність, є, наприклад, Хуп Тгісподепта геезеї, 60 Хупг, АТиХуп2 або АгтиХуп5 Тгісподепта геезеї. Кожний з одного або декількох поліпептидів, що мають целюлазну активність, якщо він присутній, є, наприклад, ендоглюканазою, наприклад
ЕС1 або ЕС2 Тгтісподегта геезеї, целобіогідролазою, наприклад СВНІ або СВНІ2 Ттісподегта геезеї, або ВД-глюкозидазою, наприклад Ваі/1 Тгісподепта геезеї.
Інша ферментна суміш/композиція цього опису може переважно містити перший поліпептид, що має І-а-арабінофуранозидазну активність, і додатково містить 1, 2, З або 4 з другого поліпептиду, що має І-а-арабінофуранозидазну активність, одного або декількох поліпептидів, що мають рВ-ксилозидазну активність, одного або декількох поліпептидів, що мають целюлазну активність. Ця перша І -с-арабінофуранозидаза є поліпептидом АТЗА, РІЗТА або ЕмБ51А. Ця о друга І-а-арабінофуранозидаза відрізняється від першої 1-а- арабінофуранозидази і є, наприклад, поліпептидом АЇ4ЗА, РІЗ1А, Рабт1А, Ем43В або Гме1А.
Кожна з однієї або декількох ВД-ксилозидаз є, наприклад, поліпептидом ЕУЗА, РІ4ЗА, ЕмаЗЕ,
ЕмаЗА, Ем43В, РабтА, ЕРм430, с7243А, Бо43А, Гм39А або Вхі1 Тгісподегта. У деяких варіантах здійснення, кожна з однієї або декількох ксиланаз є поліпептидом ХупЗ3 Тгісподегта геезві,
Хуп2, АгТиХуп2 або АїиХуп5 Тгісподегта геезеї. У деяких варіантах здійснення, кожна з однієї або декількох целюлаз є незалежно ендоглюканазою, наприклад поліпептидом ЕС1 або ЕС2
Тісподегта геєезві, целобіогідролазою, наприклад поліпептидом СВНІ або СВН2 Ттісподегта геезеї, або ВД-глюкозидазою, наприклад поліпептидом Вді! Тгііснодетта геезвеі.
Ксиланази: Ксиланаза (ксиланази) переважно становить приблизно 0,05 - приблизно 75 мас. 96 ферментів в ферментній суміші/композиції цього опису (тобто процент ксиланази (ксиланаз) є масовим процентом відносно маси всіх білків в цій композиції) або відносною масовою основою (тобто, де процент ксиланази (ксиланаз) є масовим процентом відносно об'єднаної маси ксиланаз, рВ-ксилозидаз, целюлаз, І-а-арабінофуранозидаз і допоміжних білків). Співвідношення будь-якої пари білків один відносно одного може бути легко розраховане в ферментних сумішах/композиціях цього опису. Розглядаються суміші/композиції, що містять ферменти в будь-якому масовому відношенні, одержуваному з описаних тут масових процентів. Вміст ксиланази може знаходитися в діапазоні в якому нижня межа дорівнює 0,05 мас. 95, 1 мас. 95, 2 мас. 95, З мас. 95, 4 мас. 95, 5 мас. 95, 6 мас. 95, 7 мас. 905, 8 мас. 95, 9 мас. 95, 10 мас. 95, 12 мас. 95, 15 мас. 95, 20 мас. 95, 25 мас. 95, 30 мас. 95, 40 мас. 9б, 45 мас. 95 або 50 мас. 96 загальної маси ферментів в ферментній суміші/композиції, і верхня межа дорівнює 10 мас. 905, 15 мас. 95, 20 мас. 95, 25 мас. 95, 30 мас. 95, 35 мас. 95, 40 мас. 95, 50 мас. 95, 55 мас. 95, 60 мас. 95, 65 мас. 95, 70 мас. 95 або 75 мас. 95 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції. Ці одна або декілька ксиланаз в ферментній суміші або композиції можуть представляти, наприклад, 5-20 мас. 95, 10-15 мас. 95 або 15-25 мас. 95 всіх ферментів в цій ферментній суміші/композиції. Зразкові придатні ксиланази для включення в ці ферментні суміші/композиції описані в розділі 6.3.6. нижче.
І-«-арабінофуранозидази: І -«-арабінофуранозидаза (І -л-арабінофуранозидази) переважно становить приблизно 0,05 - приблизно 75 мас. 95 загальної маси ферментів в конкретній ферментній суміші/композиції (тобто, де процент І-а-арабінофуранозидази ( (І-а- арабінофуранозидаз) є масовим процентом відносно маси всіх білків в цій суміші/композиції) або відносною масовою основою (тобто, де процент І1-а-арабінофуранозидази (І -а- арабінофуранозидаз) є масовим процентом відносно об'єднаної маси ксиланаз, ВД-ксилозидаз, целюлаз, І -а-арабінофуранозидаз і допоміжних білків). Співвідношення будь-якої пари білків один відносно одного може бути легко розраховане на основі цього опису. Розглядаються суміші/композиції, що містять ферменти в будь-якому масовому відношенні, одержуваному з описаних тут масових процентів. Вміст І -л-арабінофуранозидази може знаходитися в діапазоні, в якому нижня межа дорівнює 0,05 мас. 905, 1 мас. 95, 2 мас. 95, З мас. 95, 4 мас. 95, 5 мас. 95, 6 мас. 9Уо, 7 мас. 95, 8 мас. 95, 9 мас. 95, 10 мас. Об, 12 мас. 95, 15 мас. 95, 20 мас. 95, 25 мас. 95, 30 мас. 95, 40 мас. 95, 45 мас. 95 або 50 мас. 95 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції, і верхня межа дорівнює 10 мас. 95, 15 мас. 95, 20 мас. 95, 25 мас. 95, 30 мас. о, 35 мас. 95, 40 мас. 95, 50 мас. 95, 55 мас. 95, 60 мас. 95, 65 мас. 95, 70 мас. 95 або 75 мас. 95 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції. Наприклад, ці одна або декілька
І-с-арабінофуранозидаз можуть переважно представляти в ферментній суміші або композиції, наприклад, 2-25 мас. 95, 5-20 мас. 95 або 5-10 мас. 95 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції. Зразкові придатні І -х-арабінофуранозидази для включення в ці ферментні суміші/композиції описані в розділі 6.3.8 нижче.
В-ксилозидази: В-ксилозидаза (В-ксилозидази) переважно становить приблизно 0,05 - приблизно 75 мас. 95 загальної маси ферментів в ферментній суміші/композиції.
Співвідношення будь-якої пари білків один відносно одного може бути легко розраховане на основі цього опису. Розглядаються суміші/композиції, що містять ферменти в будь-якому бо масовому відношенні, одержуваному з описаних тут масових процентів. Вміст ВД-ксилозидази може знаходитися в діапазоні, в якому нижня межа дорівнює 0,05 мас. 905, 1 мас. 95, 2 мас. 905, З мас. 905, 4 мас. 95, 5 мас. 95, 6 мас. 95, 7 мас. 95, 8 мас. 95, 9 мас. 9о, 10 мас. 9б5, 12 мас. 95, 15 мас. у, 20 мас. 95, 25 мас. 90, 30 мас. 95, 40 мас. 905, 45 мас. 95 або 50 мас. 95 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції, і верхня межа дорівнює 10 мас. 95, 15 мас. 905, 20 мас. 95, 25 мас. 9, 30 мас. 95, 35 мас. 9о, 40 мас. 95, 50 мас. 9о, 55 мас. 905, 60 мас. 95, 65 мас. 905, 70 мас. 95 або 75 мас. 95 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції.
Наприклад, В-ксилозидаза (ВД-ксилозидази) може представляти приблизно 0,05 - приблизно 75 мас. до загальної маси ферментів в цій суміші/композиції. ВД-ксилозидаза (ВД-ксилозидази) може також представляти приблизно 0,05 - приблизно 70 мас. 95, приблизно 1 - приблизно 65 мас. 905, приблизно 1 - приблизно 60 мас. 95, приблизно 2 - приблизно 55 мас. 95, приблизно З - приблизно 50 мас. 95, приблизно 4 - приблизно 45 мас. 95 або приблизно 5 - приблизно 40 мас. до загальної маси ферментів в цій суміші/композиції. Ще в одному прикладі, ВД-ксилозидаза (р- ксилозидази) переважно представляє 2-30 мас. 95; 10-20 мас. 95 або 5-10 мас. 95 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції. Зразкові придатні ВД-ксилозидази описані в розділі 6.3.7 нижче.
Целюлази: Целюлаза (целюлази) переважно становить приблизно 0,05 - приблизно 90 мас.
Фо загальної маси ферментів в ферментній суміші/композиції. Співвідношення будь-якої пари білків один відносно одного може бути легко розраховане на основі цього опису. Розглядаються суміші/композиції, що містять ферменти в будь-якому масовому відношенні, одержуваному з описаних тут масових процентів. Вміст целюлази може знаходитися в діапазоні, в якому нижня межа дорівнює 0,05 мас. 9бо, 5 мас. 95, 10 мас. 95, 20 мас. 95, 30 мас. 95, 40 мас. 95, 50 мас. 95, 60 мас. 95, 70 мас. 95 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції, і верхня межа дорівнює 20 мас. 95, 30 мас. 95, 40 мас. 90, 50 мас. 95, 60 мас. 95, 70 мас. 95, 80 мас. 95 або 90 мас. 96 загальної маси ферментів в цій ферментній суміші/композиції. Наприклад, целюлаза (целюлази) може представляти приблизно 30 - приблизно 80 мас. 95, 50-70 мас. 95 або 40-60 мас. 95 загальної маси ферментів в цій суміші/композиції. Зразкові придатні целюлази описані в розділі 6.2.5 нижче. Целюлазні компоненти в ферментній суміші/композиції цього опису переважно здатні досягати щонайменше приблизно 0,005 фракційного продукту на мг білка на грам набухлої від фосфорної кислоти целюлози (РАЗС), як визначено калькофлуор-аналізом.
Зо Наприклад, ці целюлазні компоненти в суміші/композиції цього опису здатні досягати діапазону фракційного продукту на мг білка на грам РАБС, де нижня межа цього діапазону дорівнює приблизно 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,075 або 0,1, і де верхня межа цього діапазону дорівнює 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,075, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 або 0,7. Целюлазні компоненти в суміші/композиції цього опису можуть, наприклад, досягати 0,00005-0,0001, 0,0005-0,001, 0,001-0,005, 0,005-0,03, 0,01 -0,06, 0,02-0,04, 0,01-0,03, 0,02-0,05, 0,02-0,04, 0,01- 0,05, 0,015-0,035 або 0,015-0,075 фракційного продукту на мг білка на грам РАБ5С, як визначено калькофлуор-аналізом. Ця целюлаза може бути, наприклад, цільною целюлазою. Однак, ця целюлаза може також бути переважно збагачена ВД-глюкозидазою.
Допоміжні білки: Ця ферментна суміш/композиція може переважно містити додатково один або декілька допоміжних білків. Вміст допоміжних білків ферментної суміші/композиції може знаходитися в діапазоні від приблизно 0 мас. 95 до приблизно 60 мас. 95 загальної маси білків в ферментній суміші/композиції. Співвідношення будь-якої пари білків один відносно одного може бути легко визначене на основі цього опису. Розглядаються суміші/композиції, що містять ферменти в будь-якому масовому відношенні, одержуваному з описаних тут масових процентів.
Вміст допоміжних білків може знаходитися в діапазоні, в якому нижня межа дорівнює 0 мас. 95, 1 мас. 95, 2 мас. 95, З мас. 95, 4 мас. 95, 5 мас. 95, 6 мас. 95, 7 мас. 95, 8 мас. 95, 10 мас. 95, 12 мас.
Фо, 15 мас. 95, 20 мас. 95, 25 мас. 95 або 35 мас. 95 загальної маси білків в цій ферментній суміші/композиції, і вехня межа дорівнює 2 мас. 95, З мас. 905, 4 мас. 90, 5 мас. 95, 6 мас. 9о, 7 мас. у, 8 мас. 95, 9 мас. 95, 10 мас. 95, 11 мас. 95, 12 мас. 95, 13 мас. 95, 14 мас. 95 15 мас. 95, 20 мас.
БО Фо, 30 мас. 95, 40 мас. 95, 50 мас. 95 або 60 мас. 95 загальної маси білків в цій ферментній суміші/композиції. Наприклад, цей допоміжний білок (ці допоміжні білки) може переважно представляти 0-2 мас. 95, 5-10 мас. 95, 20-50 мас. 95 або 2-5 мас. 95 в цій ферментній суміші/композиції. Зразкові придатні допоміжні білки для включення в ферментні суміші/композиції цього опису представлені в розділі 6.3.9 нижче.
Даний опис забезпечує першу ферментну суміш/композицію для оцукрювання лігноцелюлози, яка містить: (1) приблизно 30 - приблизно 80 мас. 95 (наприклад, 30-80 мас. 95, 35-75 мас. 95, 40-70 мас.
Фо, 40-60 мас. 95, 50-70 мас. 95 і т. д-) целюлази (целюлаз), наприклад цільної целюлази або збагаченої ВД-глюкозидазою цільної целюлази;
(2) приблизно З - приблизно 50 мас. 95 (наприклад, 5-40 мас. 95, 10-30 мас. 95, 5-20 мас. 95, 10-15 маб. Фо, 15-25 мас. 95 і т. д.) ксиланази (ксиланаз), наприклад Хуп2 Тгісподетпта геезві,
Хуп3, АїшХуп2, АтТиХуп5 Тгтісподегта геезеії або суміші одного або більше з попередніх ферментів; (3) приблизно 2 - приблизно 40 мас. 95 (наприклад, 2-35 мас. 95, 5-30 мас. 95, 10-25 мас. 95, 2-30 мас. 95, 10-20 мас. 90, 5-10 мас. Фо і т. д.-) ВД-ксилозидази (р-ксилозидаз), наприклад ЕмУЗА,
РІ4ЗА, Ем430, ЕмУ39А, Ем4ЗЕ, Ем43А, Ем43В, РабтА, Бо43А, 743А, ВхіІ1 Тгісподепта геезеї або суміші одного або більше з попередніх ферментів; (4) приблизно 2 - приблизно 40 мас. 95 (наприклад, 2-35 мас. 95, 5-30 мас. 95, 10-25 мас. 95, 2-25 мас. 95, 5-20 мас. 95, 5-10 мас. 95 і т. д.3) І1-с-арабінофуранозидази (І -а- арабінофуранозидаз), наприклад АТЗА, Ем43В, РабтТА, РІБ1А, Гм51А або суміші двох або більше з попередніх ферментів; і (5) приблизно 0 - приблизно 50 мас. 95 (2-40 мас. 95, 5-30 мас. 95, 10-25 мас. 95, 0-2 мас. 95, 5-10 мас. 95, 20-50 мас. 905, 2-5 мас. 95 і т. д.) допоміжного білка (допоміжних білків).
Даний опис забезпечує другу ферментну суміш/композицію для оцукрювання лігноцелюлози, яка містить: (1) приблизно 30 - приблизно 80 мас. 95 (наприклад, 30-80 мас. 95, 35-75 мас. 95, 40-70 мас.
Фо, 40-60 мас. 95, 50-70 мас. 95 і т. д-) целюлази (целюлаз), наприклад цільної целюлази або збагаченої Д-ксилозидазою цільної целюлази, або приблизно 2 - приблизно 10 мас. 95 (наприклад, 2-8 мас. 95, 4-6 мас. 95, 2-4 мас. 95, 6-8 мас. 95, 8-10 мас. 95, 2-10 мас. 95 і т. д.) Д- ксилозидази (ВД-ксилозидаз), наприклад Ваді1 Тгісподегта геезеї; (2) приблизно З - приблизно 50 мас. 95 (наприклад, 5-40 мас. 95, 10-30 мас. 95, 5-20 мас. 95, 10-15 маб. Фо, 15-25 мас. 95 і т. д.) ксиланази (ксиланаз), наприклад Хуп2 Тгісподегта геезеї,
Хуп3, АТиХуп2, АТиХуп5 Тгісподепта геезеї або суміш двох або більше попередніх ферментів; (3) приблизно 2 - приблизно 40 мас. 95 (наприклад, 2-35 мас. 95, 5-30 мас. 95, 10-25 мас. 95, 2-30 мас. 95, 10-20 мас. 95, 5-10 мас. 95 і т. д.) щонайменше двох ВД-ксилозидаз, де щонайменше одна рД-ксилозидаза вибрана з групи 1 і щонайменше одна рД-ксилозидаза вибрана з групи 2; де: група 1: РУЗА, Ем4ЗА або їх суміш; група 2: Ем430, Раб1А, 0743А, Вхі!1 Тгісподепта геезеї, РІ4ЗА, Ем4ЗЕ, ЕУЗ9А, Ро43А, ЕмаЗ3В або суміш двох або більше попередніх ферментів; (4) приблизно 2 - приблизно 25 мас. 95 (наприклад, 2-25 мас. 95, 5-20 мас. 95, 5-10 мас. 9р і т. д.) І -а-арабінофуранозидази (І -с-арабінофуранозидаз), наприклад АТЗА, Ем4ЗВ, РабтА, РІБТА,
Ем51А або суміш двох або більше попередніх ферментів; і (5) приблизно 0 - приблизно 50 мас. 95 (2-40 мас. 95, 5-30 мас. 95, 10-25 мас. 95, 0-2 мас. 95, 5-10 мас. 95, 20-50 мас. 905, 2-5 мас. 95 і т. д.) допоміжного білка (допоміжних білків).
Даний опис забезпечує третю ферментну суміш/композицію для оцукрювання лігноцелюлози, яка містить: (1) приблизно З - приблизно 50 мас. 95 (наприклад, 5-40 мас. 95, 10-30 мас. 95, 5-20 мас. 95, 10-15 маб. Фо, 15-25 мас. 95 і т. д.) ксиланази (ксиланаз), наприклад Хуп2 Тгісподетпта геезві,
Хуп3 Тгісподегта геезеї, АгиХуп2, АтТиХуп5 або суміш двох або більше попередніх ферментів; і (2) приблизно 2-40 мас. 95 (наприклад, 2-35 мас. 95, 5-30 мас. 95, 10-25 мас. 95, 2-30 мас. 95, 10-20 мас. 95, 5-10 мас. 95 і т. д-) щонайменше двох рД-ксилозидаз, де щонайменше одна р- ксилозидаза вибрана з групи 1 і щонайменше одна р-ксилозидаза вибрана з групи 2; де: група 1: РУЗА, Ем4ЗА або їх суміш; група 2: Ем430, Раб1А, 0743А, Вхі!1 Тгісподепта геезеї, РАЗА, Ем4ЗЕ, Ем39А, ЕБо43А, Ем43В або суміш двох або більше попередніх ферментів.
Даний опис забезпечує четверту ферментну суміш/композицію для оцукрювання лігноцелюлози, яка містить: (1) приблизно 5 - приблизно 25 мас. 95 (наприклад, 2-25 мас. 95, 5-20 мас. 95, 5-10 мас. 9р і т. д.) ксиланази (ксиланаз), наприклад Хуп2 Тгісподегта геезеї, Хуп3 Тгісподегта геезеї, АтиХуп2,
АтиХуп5 або суміш двох або більше попередніх ферментів; (2) приблизно 2 - приблизно 30 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 10-20 мас. 95, 5-10 мас. 95 і т. д.) Д-ксилозидази (Д-ксилозидаз), наприклад ЕмЗА, РІ4ЗА, ЕРм430О, Ем39А, Ем4ЗЕ, ЕмазаА,
Ем4а3В, Раб1А, С243А, Ео43ЗА, Вхі1 Тгісподегта геезеї або суміш двох або більше попередніх ферментів; і (3) приблизно 2 - приблизно 50 мас. 95 (наприклад, 2-5 мас. 95, 5-45 мас. 95, 10-40 мас. 95, 15-30 мас. Фо, 10-25 мас. 95, 5-20 мас. 90, 15-40 мас. Фо і т. д.) ВД-глюкозидази (рД-глюкозидаз), бо наприклад Ва! Тгісподегта геезеїі.
Даний опис забезпечує п'яту ферментну сумішкомпозицію для оцукрювання лігноцелюлози, яка містить: (1) приблизно 5 - приблизно 25 мас. 95 (наприклад, 2-25 мас. 95, 5-20 мас. 95, 5-10 мас. 9р і т. д.) ксиланази (ксиланаз), наприклад Хуп2 Тгісподегта геезеї, Хуп3 Тісподегта геезеї, АТиХупг,
АшхХуп5 або суміш двох або більше попередніх ферментів; і (2) приблизно 2 - приблизно 30 мас. 95 (наприклад, 2-30 мас. 95, 10-20 мас. 95, 5-10 мас. 95 і т. д.) Д-ксилозидази (Д-ксилозидаз), наприклад ЕмЗА, РІ4ЗА, ЕРм430О, Ем39А, Ем4ЗЕ, ЕмазаА,
Ем4а3В, Раб1А, С243А, Ео43ЗА, Вхі1 Тгісподегта геезеї або суміш двох або більше попередніх ферментів.
Даний опис забезпечує шосту ферментну суміш/композицію для оцукрювання лігноцелюлози, яка містить: (1) приблизно 2 - приблизно 50 мас. 95 (наприклад, 2-5 мас. 95, 5-45 мас. 95, 10-40 мас. 95, 15-30 мас. 95, 10-25 мас. 95, 5-20 мас. 906, 15 мас. до 40 мас. Фо ії т. д.) ВД-глюкозидази (р- глюкозидаз), наприклад Ваї11; (2) приблизно З - приблизно 50 мас. 95 (наприклад, 5-40 мас. 95, 10-30 мас. 95, 5-20 мас. 95, 10-15 маб. Фо, 15-25 мас. 95 і т. д.) ксиланази (ксиланаз), наприклад Хуп2 Тгісподегта геезеї,
Хуп3 Тгісподегта геезеї, АгиХуп2, АтТиХуп5 або суміш двох або більше попередніх ферментів; (3) приблизно 2-40 мас. 95 (наприклад, 2-35 мас. 95, 5-30 мас. 95, 10-25 мас. 95, 2-30 мас. 95, 10-20 маб. 90, 5-10 мас. бо і т. д.) ВД-ксилозидази (ВД-ксилозидаз), наприклад ЕмуЗА, РІ4ЗА, Ем430,
ЕмЗ9А, Ем4ЗЕ, Ем4ЗА, Рм43В, РабтА, Сс243А, Бо43А, Вхі1 Тгісподегта геезеї або суміш двох або більше попередніх ферментів; і (4) приблизно 2 - приблизно 25 мас. 95 (наприклад, 2-25 мас. 95, 5-20 мас. 95, 5-10 мас. 95 і т.д.) І-а-арабінофуранозидази (І-с-арабінофуранозидаз), наприклад АМЗА, Ем43В, РабтА,
РІБ1А, Ем591А або суміш двох або більше попередніх ферментів.
Ця шоста ферментна суміш/композиція для оцукрювання лігноцелюлози, наведена вище, може, наприклад, містити приблизно 2 - приблизно 40 мас. 96 щонайменше двох В-ксилозидаз, де щонайменше одна В-ксилозидаза вибрана з групи 1 і щонайменше одна рВ-ксилозидаза вибрана з групи 2; де: група 1: РУЗА, Ем4ЗА або їх суміш;
Зо група 2: Ем430, Раб1А, 0743А, Вхі!1 Тгісподепта геезеї, РАЗА, Ем4ЗЕ, Ем39А, ЕБо43А, Ем43В або суміш двох або більше попередніх ферментів.
Якщо ферментна суміш/композиція цього опису містить ВД-ксилозидази як групи 1, так і групи 2, відношення р-ксилозидаз групи 1 до ВД-ксилозидаз групи 2 є переважно 1:10-10:1. Наприклад, це відношення є переважно 1:2-2:11, 2:5-5:2, 3:8-8:3, 1:4-4:1, 1:5-5:1, 1:7-7:1 або будь-яким діапазоном між будь-якою парою попередніх кінцевих точок (наприклад, 1:10-2:1, 4:1-2:5, 3:8-5:1 і т. д.-). Одним конкретним прикладом придатного співвідношення є приблизно 1:21.
Якщо ферментна суміш/композиція цього опису містить ЕмаЗА як р-ксилозидазу, ця ферментна суміш/композиція може додатково містити Ем43В як І -л-арабінофуранозидазу.
Ферментна суміш/композиція цього опису є, наприклад, переважно частиною реакційної суміші для оцукрювання, що містить біомасу, нарівні з компонентами цієї ферментної суміші/композиції. Наприклад, ця реакційна суміш для оцукрювання може характеризуватися 1, 2, З або всіма 4 з наступних ознак: (ї) загальна маса ксиланази (ксиланаз) на кг геміцелюлози у вказаній реакційній суміші для оцукрювання знаходиться в діапазоні, в якому нижня межа дорівнює приблизно 0,5 г, 1 г, 2 г, З г,4 г, 5 г, 7 габо 10 г, а верхня межа дорівнює незалежно приблизно 5 г, 7 г, 10 г, 15г,20 г, З0 г або 40 г; наприклад, загальна маса ксиланази (ксиланаз) на кг геміцелюлози в цій реакційній суміші може бути 0,5-40 г, 0,5-30 г, 0,5-20 г, 0,5-10 г, 0,5-5 г, 1-40 г, 2-40 г, 3-40 г, 5-40 г, 7-30 г, 10-30 г, 5-20 г або 5-30 г; (ї) загальна маса р-ксилозидази (р-ксилозидаз) на кг геміцелюлози у вказаній реакційній суміші для оцукрювання знаходиться в діапазоні, в якому нижня межа дорівнює приблизно 0,5 г. 1г,2г,Зг,4г,5 г, 7 габо 10 г, а верхня межа дорівнює незалежно приблизно 5 г, 7 г, 10 г, 15 г, 20 г, З0 г, 40 г або 50 г; наприклад, загальна маса ВД-ксилозидази (Д-ксилозидаз) на кг геміцелюлози в цій реакційній суміші може бути 0,5-40 г, 0,5-50 г, 0,5-30 г, 0,5-20 г, 0,5-10 г, 0,5-5 г, 1-40 г, 2-40 г, 3-40 г, 5-40 г, 7-30 г, 10-30 г, 5-30 г, 5-20 г; (ії) загальна маса І -с-арабінофуранозидази (І -л-арабінофуранозидаз) на кг геміцелюлози у вказаній реакційній суміші для оцукрювання знаходиться в діапазоні, в якому нижня межа дорівнює приблизно 002 г, 0,5г, 1 г, 1,5 г, 2 г, 2,5 г, З г, 4 габо 5 г, а верхня межа незалежно приблизно дорівнює 2 г, З г, 4 г, 5 г, 7 г, 10 г, 15 г або 20 г; наприклад, загальна маса 1 -а- арабінофуранозидази (І-с-арабінофуранозидаз) на кг геміцелюлози в цій реакційній суміші 60 може бути 0,2-20 г, 0,5-20 г, 1-20 г, 2-20 г, 2,5-20 г, 3-15 г, 4-20 г, 5-15 г, 5-10 г, 5-20 г або 2,5-15 г;
(м) загальна маса целюлази (целюлаз) на кг геміцелюлози у вказаній реакційній суміші для оцукрювання знаходиться в діапазоні, в якому нижня межа дорівнює приблизно 1 г, З г, 5 г, 7 г, 10 г,12 г,15 г, 18 габо 20 г, а верхня межа дорівнює незалежно приблизно 10 г, 15 г, 18 г, 20 г, 25 г, 30 г, 50 г, 75 г або 100 г; наприклад, загальна маса целюлази (целюлаз) на кг геміцелюлази у вказаній реакційній суміші може бути 1-100 г, 3-100 г, 5-100 г, 7-100 г, 7-100 г, 12-100 г, 15-100 г, 18-100 г, 3-75 г, 5-50 г, 7-75г,10-75г,10 г-50 г, 12-75 г, 12-50 г, 15-75 г, 15-50 г, 18-30 г, 18-75 г. 6.3.5. Целюлази
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть містити одну або декілька целюлаз.
Целюлази є ферментами, які гідролізують целюлозу (Д-1,4-глюкан- або В-О-глюкозидні зв'язки), приводячи до утворення глюкози, целобіози, целоолігосахаридів і т. п. Целюлази звичайно розділяли на три основних класи: ендоглюканази (ЕС 3.2.1.4) ("ЕС"), екзоглюканази або целобіогідролази (ЕС 3.2.1.91) (СВН") ії ДрВ-ксилозидази (В-ЮО-глюкозидглюкогідролаза; ЕС 3.2.1.21) ("Ва") (Кпом/ев5 еї аї., 1987, Ттепав іп Віоїесппоіоду 5(9): 255-261; ЗПМцієїп, 1988,
Меїнодз іп Епгутоіоду, 160: 234-242). Ендоглюканази діють в основному на аморфних частинах целюлозного волокна, тоді як целобіогідролази здатні також деградувати кристалічну целюлозу.
Целюлази для застосування згідно зі способами і композиціями цього опису можуть бути одержані або продуковані рекомбінантно з, самі по собі, одного або декількох з наступних організмів: Стіпіреїй5 5сареПйа, Масгорпотіпа ріазеоїїпа, Мусеїїорпійога Шепторнпіїа, Зогаагіа
Тітісоїа, Моішейна соПеюїгіспоіЇде5, ТНпієЇїаміа іеїтевійв, Астетопішт 5р., Ехідіа діапаціоза, Готев
Тотепіагіи5, Зропаіреїїїв зв5р., ВПі2горпІусіїє гтозеа, ВПіготисог ривіїйш5, РНпусотусев піїеицв,
СНнаєйозвіушт їезепії, Оіріодіа до55уріпа, ШІозрога Біідгатії, Зассороїйв аїйшейПйв5, РепісіШит мегтисціобзит, Репісійит сПпгуводепит, Тпептотусев метисовиб5, Оіаройпе зупадепевіа,
СоПеюййснит Іадепагійт, Мідгозрога 5р., Хуїатіа пурохуїоп, Месійа ріпєа, богдагіа тасгозрога,
Тпівіаміа Шепторнийа, Спаєютішт тогогит, Спаеїотіцт мігзсеп5, СНаєїотішт Бгавіїїепвів,
Снаєютішт сипісоїогит, бузравіозрога Бропіпепвзі5, Сіадотпіпит Тоесипаібзбзітит, 5суїаійаійт
Тепторнйа, Сіосіадійт саїепиіайт, Ривзагішт охузрогит 55р. Іусорегвісі, РГизапйцт охузрогит 55р. рабзбшога, Еивзагцт взоїапі, Ривагішт апдиіоідеб5, ЕРивзагйт роає, Нитісоїа підгезсепв,
Зо Нитісоїа дгізвєа, Рапаєоіиз геїйгидів, Тгатеїе5 запдиіпеа, Зспігорпуйшт соттипе, Тіспоїпесійт говецт, Місто5рпаєгорзів в5р., Асзороїйв віісіоідеи5 5ре)., Рогопіа рипсіаїа, Модиїїврогит 5р.,
Тпісподегта 5р. (наприклад, Тгісподегта геезеї) і СуЇїпагосагроп 5р.
Наприклад, целюлаза для застосування в способі і/або композиції цього опису є цільною целюлазою і/або здатна досягати щонайменше 0,1 (наприклад, 0,1-0,4) фракційного продукту, як визначено калькофлуор-аналізом, описаним в розділі 7.1.10 нижче. 6.3.5.1. ВД-глюкозидаза
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть необов'язково містити одну або декілька р- глюкозидаз. Термін "ВД-глюкозидаза" в даному контексті стосується ВД-О-глікозидглюкогідролази, що класифікується як ЕС 3.2.1.21, і/або членів деяких СН-сімейств, що включають в себе, без обмеження, члени (зН-сімейств 1, 3, 9 або 48, які каталізують гідроліз целобіози для вивільнення В-Ю-глюкози.
Придатна ДВ-глюкозидаза може бути одержана з ряду мікроорганізмів рекомбінантними способами або може бути одержана з комерційних джерел. Приклади Д-глюкозидаз з мікроорганізмів включають в себе, без обмеження, В-глюкозидази з бактерій і грибів.
Наприклад, ВД-глюкозидазу даного опису переважно одержують з міцеліального гриба.
В-глюкозидази можуть бути одержані або продуковані рекомбінантно з, самі по собі,
Азрегоїи5 асиієайв (Камадиспі єї аі. Сепе 1996, 173: 287-288), АврегуйШив Кажмаспі (мазийа єї аі. Аррі. Епмігоп. Місторіої. 1999, 65: 5546-5553), АвзрегуйШи5 огулае (МО 2002/095014),
СеїІшміотопав бБіагоїєа (М/опуд еї ам. Сепе, 1998, 207:79-86), Репісійшт Типісшовит (УМО 2004/078919), Засснаготусорзвів Приїїдега (Масніаа єї аї. Аррі. Епмігоп. Місгобіо!. 1988, 54: 3147- 3155), Зспігозасспаготусез ротре (Ууоой єї аЇ. Майте 2002, 415: 871-880) або Тгісподегта геезеї (наприклад, ВД-глюкозидаза 1 (патент США Мо 6022725), ВД-глюкозидаза З (патент США Мо 6982159), В-глюкозидаза 4 (патент США Мо 7045332), В-глюкозидаза 5 (патент США Мо 7005289), В-глюкозидаза б (публікація патенту США Мо 20060258554), р-глюкозидаза 7 (публікація патенту США Мо 20060258554)).
В-глюкозидаза може бути одержана експресією ендогенного або екзогенного гена, що кодує
В-глюкозидазу. Наприклад, В-глюкозидаза може секретуватися у позаклітинний простір, наприклад, грампозитивними організмами (наприклад, Васійшє5 або Асііпотусеїе5) або еукаріотичними хазяїнами (наприклад, Тгісподегта, Азрегойи5, Засспаготусев або Ріспіа). ІД-
глюкозидаза може бути, в деяких обставинах, надекспресованою або недостатньо експресованою.
В-глюкозидаза може бути також одержана з комерційних джерел. Приклади комерційного препарату ВД-глюкозидази, придатного для застосування в даному описі, включають в себе, наприклад, В-глюкозидазу Тгісподепта геезеї в АссеПегазе? ВО (Оапізсо 5 Іпс., Сепепсої);
МОоМОгУМ' мМ 188 (В-глюкозидазу з Азрегоїйи5 підег); В-глюкозидазу Адгорасіегішт зр. і Д- глюкозидазу Тпептаїда таїйта з Медагуте (Медагуте Іпіегпайопаї Ікеїапа Пю., Ікеїапа.).
Крім того, В-глюкозидаза може бути компонентом цільної целюлази, як описано в розділі 6.3.5.4 нижче.
В-глюкозидазна активність може бути визначена рядом придатних способів, відомих в даній галузі, таких як спосіб, описаний Спеп еї аї., іп Віоспітіса еї Віорпузіса Асіа 1992, 121:54-60, де 1 рМРО означає 1 мкмоль Нітрофенолу, що вивільняється з 4-нітрофеніл-В-О-глюкопіранозиду за 10 хвилин при 507С (122"Р) і рн 4,8. 6.3.5.2. Ендоглюканази
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть необов'язково містити одну або декілька ендоглюканаз. Будь-яка ендоглюканаза (ЕС 3.2.1.4) може бути використана в способах і композиціях даного опису. Ендоглюканаза може бути одержана експресією ендогенного або екзогенного гена ендоглюканази. Ендоглюканаза може бути, в деяких обставинах, надекспресованою або недостатньо експресованою.
Наприклад, Тгісподепта геезеі ЕС1 (Репйціа еї а), Сепе 1986, 63:103-112) і/або ЕС2 (Заіонеїто єї аї., Сепе 1988, 63: 11-21) переважно використовуються в способах і композиціях даного опису.
Одна термостабільна ендоглюканаза ТНієїаміа іегтезігі5 (Кмезіїадае сеї аї., Арріїєй Віоснет.
Віоїесн. 1995, 50:137-143) використовується, в іншому прикладі, в способах і композиціях даного опису. Крім того, можуть бути також використані ЕСЗ Тгісподепта геезеї (ОКада еї аї.
Аррі. Епмігоп. Містобіо!ї. 1988, 64:555-563), ЕСс14 (Заіопеїто еї а. Єшиг. У. Віоспет. 1997, 249:584- 591), ЕС5 (Заіонеєїто еї аї. МоїІесшаг Місгобіоіоду 1994, 13:219-228), ЕСб (публікація патенту
США Мо 20070213249) або ЕС7 (публікація патенту США Мо 20090170181), ендоглюканаза ЕЇ
Асідотегтивх сеїІшіоїуєнси5 (патент США Мо 5536655), ендоглюканаза М Нитісоїа іпзоЇепз (ЕСМ)
Зо (Ргоїєїп Оайа ВапК епігу ЕМО), ендоглюканаза Зіарпуоїгіспит соссозрогит (публікація патенту
США Ме 2007011 1278), ендоглюканаза Е1-СМС Азрегоїи5 асиівеайиз (Ооі еї а). Мисівїс Асіа Везв. 1990, 18:5884), ендоглюканаза СМСавзе-1 Азрегоїи5 Камаснії ІРО 4308 (ЗаКатоїо еї аї. Ситт.
Сепеї. 1995, 27:435-439), ендоглюканаза Егміпіа сагоїюмага (Заапіанії єї аї. сЧепе 1990, 90:9-14) або ендоглюканаза Астетопішт (Шегпторіпйшт А! КО4245 (публікація патенту США Мо 20070148732). Додаткові придатні ендонуклеази описані, наприклад, в УМО 91/17243, УМО 91/17244, МО 91/10732, патенті США Мо 6001639. 6.3.4.3. Целобіогідролази
Будь-яка целобіогідролаза (ЕС 3.2.1.91) ("СВН") може бути необов'язково використана в способах і композиціях даного опису. Целобіогідролаза може бути одержана експресією ендогенного або ексзогенного гена целобіогідролази. Целобіогідролаза може бути, в деяких обставинах, надекспресованою або недостатньо експресованою.
Наприклад, СВНІ Тгісподегта геезеї (Зпоетакег еї аІ. Віо/ГесппоЇІоду 1983, 1:691-696) і/або
СВНІЇ (Теегі еї аїЇ. Віо/Гесппоїосду 1983, 1:696-699) можуть бути переважно використані в способах і сумішах/композиціях даного опису.
Придатні СВН можуть бути вибрані з СВНІ Адагіси5 Бібвроги5 (Зм/і55 Ргої Ассевзвіоп Мо 092400), СВНІ АзрегоШиз асиієеатиз (Зм/із5 Ргої Ассеззіоп Ме 059843), СВНА Азрегоїйи5 підшапь (СепВапк Ассебзіоп Мо АБ420019) або СВНВ (СепВапк Ассебзіоп Мо АБ420020), СВНА
Азрегойив підег (сепВапКк Ассезвзіоп Мо АЕ156268) або СВНВ (СепВапк Ассеззіоп Мо АЕ156269),
СВНІ Сіамісерз ригригеа (Зм/із5 Ргої Ассеззіоп Мо 000082), СВНІТ Соспііобоїн5 сагбопагит (Зм/і55
Ргої Ассеззіоп Ме 2500328), СВНІ Стгурпопесігіа рагазййса (Зуіз5 Ргої Ассезвзіоп Мо 000548),
СВНІ Ризагішт охузрогит (СеІ7А) (Зм/з5 Ргої Ассеззіоп Мо Р46238), СВНІ1.2 Нитісоїа дгізеа (СепВапк Ассезвзіоп Мо 050594), СВНІ Нитісоїа дгізеа маг. Тептоїдеа (СепВапкК Ассезвіоп Мо рб3515), СВНІ.2 (СепВапкК Ассезвзіоп Мо АЕ123441) або ехо1 (СепВапК Ассеззіоп Мо АВО0О3105),
СеІ7В Меїапосагрих аіІротусез (СепВапкК Ассезбзіоп Мо АУ5Ь15705), СВНІ Меийгозрога сгазза (СепВапк Ассеззіоп Мо Х77778), СВНІ (СеІ7А) РепісшШит типісшозит (0.5. Расгепі Рибіїсайоп Мо 20070148730), СВНІ Репісійит |апіпіпейит (СепВапк Ассевзвзіоп Мо 556178), СВН Рпапегоспавіє спгузозрогішт (СепВапкК Ассеб5зіоп Мо М22220) або СВНІ-2 (СеІ70) (СепВапк Ассеввіоп Мо 22656), СВНІА Таїаготусе5 етегзопії (зепВапк Ассеззіоп Ме АР439935), СВНІ Тгпісподегта мііде (СсепВапК Ассевзіоп Мо Х53931) або СВНІ Мо/їмагієеа моїмасеа М14 (СепВапК Ассезвіоп Мо 60 АБ 156693).
6.3.5.4. Цільні целюлази
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть додатково містити цільну целюлазу. У цьому контексті "цільною целюлазою" називають композицію, яка або зустрічається в природі, або не зустрічається в природі, що містить целюлозу, яка містить щонайменше 3 різні типи ферментів: (1) ендоглюканазу, (2) целобіогідролазу і (3) В-глюкозидазу, або містить щонайменше 3 різні ферментативні активності: (1) ендоглюканазну активність, яка каталізує розщеплення внутрішніх Д-1,4-зв'язків, приводячи до більш коротких глюкоолігосахаридів, (2) целобіогідролазну активність, яка каталізує вивільнення "екзо"-типу целобіозних ланок (дисахариду ІД-1,4-глюкоза-глюкоза), і (3) Д-глюкозидазну активність, яка каталізує вивільнення глюкозного мономера з коротких целоолігосахаридів (наприклад, целобіози).
Одна композиція, "що зустрічається в природі, яка містить целюлазу", є композицією, продукованою джерелом, що зустрічається в природі, яка містить один або декілька компонентів або одну або декілька активностей целобіогідролазного типу, один або декілька компонентів або одну або декілька активності ендоглюканазного типу і один або декілька компонентів або одну або декілька активностей рВ-глюкозидазного типу, де кожний з цих компонентів або кожна з цих активностей виявляються при співвідношенні і рівні, продукованих в природі, без втручання руки людини. Таким чином, композицією, що зустрічається в природі, яка містить целюлазу, є, наприклад, композиція, яка продукується організмом, не модифікованим відносно целюлолітичних ферментів, так що це співвідношення або рівні ферментів-компонентів є незміненими відносно співвідношення і рівнів, продукованих нативним організмом в природі. "Композицією, що не зустрічається в природі, яка містить целюлазу", називають композицію, продуковану: (1) об'єднанням компонентів-делюлолітичних ферментів або у співвідношенні, що зустрічається в природі, або у співвідношенні, що не зустрічається в природі; або (2) модифікацією організму для надекспресії або недостатньої експресії одного або декількох целюлолітичних ферментів; або (3) модифікацією організму таким чином, що щонайменше один целюлолітичний фермент є делетованим. "Композицією, що не зустрічається в природі, яка містить целюлазу", називають також композицію, одержану з корекції умов культивування для організму, що зустрічається в природі, таким чином, що цей організм, що зустрічається в природі, росте не при природних умовах і продукує змінений рівень або змінене співвідношення ферментів. Таким чином, в деяких варіантах здійснення, препарат целюлази даного винаходу може мати один або декілька ЕС і/або СВН, і/або р-глюкозидаз, які є делетованими і/або надекспресованими.
У даному описі препарат цільної целюлази може бути препаратом з будь-якого мікроорганізму, який здатний гідролізувати целюлозний матеріал. У деяких варіантах здійснення препаратом цільної целюлази є цільна целюлаза міцеліальних грибів. Наприклад, препарат цільної целюлази може бути одержаний з видів Асгетопішт, Азрегоїййи5, ЕтегісеПа,
Еизагішт, Нитісоїа, Мисог, Мусеїїорпійтога, Мешйгозрога, РепісіПит, суїаїйдіит, ТНієїЇаміа,
Тоїуросіадішт або Тгісподеппта. Препаратом цільної целюлази є, наприклад, цільна целюлаза
АврегодйПи5 асціватшв, Аврегайив ажатоїі, Аврегаоїїи5 Тоеїйдив, АзрегоШив |аропісив5, Азрегайи5 підшапв, Азрегойи5 підег або АзрегодіЙйи5 огугає. Крім того, препаратом цільної целюлази може бути препарат цільної целюлази Ризапйцйт бБасігідіоїде5, Ризапцт сегеєаїйв, Еивзагйт стооКмеПепзе, Ривагпшт сиітогт, Еивагшт дгатіпеагит, Ривагпйт дгатіпит, Ризагит
Пеїегозрогит, Ризагішт педипаї, Ривагит охузрогит, Ривзагпт геїйсшашт, ЕРивагйт гозеийт,
Еивзатішт затбрисіпит, Ризагшит загсоспгоцт, Еивагішт 5рогоїгіспісіде5, Ризапйит 5МйІрпигтейт,
Еизатішт огцовит, Ризагпйцт і іспоїпесіоїде5 або ЕРизагішт мепепаїшт. Препаратом цільної целюлази може бути також препарат цільної целюлази Нитісоїа іпзоЇїєпв5, Нитісоїа Іапидіпоза,
Мисог о тіепеї, Мусеїйорпійога Пепторнпійа, Меийгобврога стазвза, Репісійшт ригригодепит,
РепісіШит ?ипісціовит, 5суїаїїдійт (егторпійшт або ТпівЇаміа Тетевігіз. Крім того, препаратом цільної целюлази може бути препарат цільної целюлази Тгісподента Наггіапит, Тісподегта
Копіпдії, Тгісподегпта Іопдібгаспіаєшт, Тгісподегта геезеї (наприклад, КІ -РЗ37 (ЗНеї-Меїівв (3. єї аї.
Аррі. Містобріо!І. Віотесппоіоду, 1984, 20, рр.46-53), ОМ9414 (АТС Мо. 26921), МАВ 15709,
АТСС 13631, 56764, 56466, 56767) або Тгісподепта мігіде (наприклад, АТСС 32098 і 32086).
Препаратом цільної целюлази може бути, зокрема, переважно препарат цільної целюлази
Тпісподегта геезеї КШСЗ0, який доступний з Американської Колекції Типових Культур у вигляді
Тгісподегта геезеі АТСС 56765. Наприклад, препаратом цільної целюлази може бути також переважно цільна целюлаза Репісійшт Типісціоб5ит, яка доступна з Американської Колекції
Типових Культур у вигляді Репісійшт їипісшовит АТС Митрбег: 10446.
Цей препарат цільної целюлази може бути також одержаний з комерційних джерел.
Приклади комерційних препаратів целюлази, придатних для використання в способах і 60 композиціях даного опису, включають в себе, наприклад, СЕ ОСІ АБ5Т М ї СеїстмМ (Момогутев
А/5) і ГАМІМЕХ"М ВГ, Іпаїддетм 44|, Ргітатазіїм 100, Ргітагтазі"м 200, Зрелуте"Мм СР,
АссеїІегазе? 1000 і АссеПегазе? 1500 (Оапівсо 05. Іпс., Сбепепсог).
Придатні препарати цільної целюлази можуть бути виготовлені з використанням способів культивування будь-якого мікроорганізму, відомих в даній галузі, зокрема ферментації, ферментів, що приводять до експресії, здатних гідролізувати целюлозний матеріал. У даному контексті, "ферментацією" називають культивування у струшуваних колбах, ферментацію в малому масштабі або великому масштабі, таку як безперервні ферментації, періодичні ферментації, періодичні ферментації з підживленням або ферментації твердого стану в лабораторних або промислових ферментерах, виконувані у придатному середовищі і в умовах, які дозволяють експресувати і/або виділяти целюлазу і/або ферменти, що представляють інтерес.
Звичайно цей мікроорганізм культивують в середовищі для культури клітин, придатному для продукування ферментів, здатних гідролізувати целюлозний матеріал. Це культивування здійснюється у придатному поживному середовищі, що містить джерела вуглецю і азоту і неорганічні солі, з використанням процедур і варіацій, відомих в даній галузі. Придатні культуральні середовища, діапазони температур і інші умови для вирощування і продукування целюлази відомі в даній галузі Як один необмежувальний приклад, типовий діапазон температур для продукування целюлаз Тгісподегта геезеї є діапазоном 24-2876.
Препарат цільної целюлази може використовуватися в такому вигляді, в якому він продукується ферментацією, без витягання і/або очищення або з мінімальними витяганням і очищенням. Наприклад, як тільки целюлази секретуються в середовище для культивування клітин, це середовище для культивування клітин, що містить целюлази, може бути використане безпосередньо. Цей препарат цільної целюлази може містити нефракціонований вміст матеріалу ферментації що включає в себе відпрацьоване середовище культури клітин, позаклітинні ферменти і клітини. З іншого боку, препарат цільної целюлази може бути також підданий додатковій переробці в ряді рутинних стадій, наприклад преципітації, центрифугування, афінної хроматографії, фільтрування або т. п. Наприклад, препарат цільної целюлази може бути сконцентрований і потім використаний без додаткового очищення.
Препарат цільної целюлази може бути, наприклад, приготований таким чином, що він містить певні хімічні агенти, які зменшують життєздатність клітин або вбивають клітини після ферментації. Ці клітини, можуть бути, наприклад, лізовані або зроблені проникними з використанням способів, відомих в даній галузі.
Ендоглюканазна активність препарату цільної целюлази може бути визначена з використанням карбоксиметилцелюлози (СМС) як субстрату. Один придатний аналіз вимірює продукування редукуючих кінців, створюваних цією ферментною сумішшю, діючою на СМС, де 1 одиниця є кількістю ферменту, яка вивільняє 1 мкмоль продукту/хв. (спо5е Т. К., Риге 8 Аррі.
Спет. 1987, 59, рр. 257-268).
Цільна целюлаза може бути рВ-глюкозидаза-збагаченою целюлазою. Ця Др-глюкозидаза- збагачена цільна целюлаза звичайно містить ВД-глюкозидазу і препарат цільної целюлази. Ці композиції В-глюкозидаза-збагаченої цільної целюлази можуть бути одержані рекомбінантними способами. Наприклад, такий препарат цільної целюлази може бути одержаний експресією рД- глюкозидази в мікроорганізмі, здатному продукувати цільну целюлазу. Ці композиції Д- глюкозидаза-збагаченої цільної целюлази можуть також, наприклад, містити препарат цільної целюлази і В-глюкозидазу. Наприклад, ця Д-глюкозидаза-збагачена композиція цільної целюлази може переважно містити щонайменше 5 мас. 95, 7 мас. 95, 10 мас. 95, 15 мас. 95 або 20 маб. 95 ії до 25 мас. 95, 30 мас. 95, 35 мас. 95, 40 мас. 95 або 50 мас. 95 Д-глюкозидази з розрахунку на загальну масу білків в цій суміші/композиції. 6.3.6. Ксиланази
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть, наприклад, містити одну або декілька ксиланаз групи А, якими можуть бути Хуп2 Тгісподегта геезеї, Хуп3 Тгісподепта геезеї, АгТиХуп2 або АтиХуп5. Придатні поліпептиди Хуп2 Тгісподепта геезві, Хуп3 Тісподепта геезві, АХупа2 або АїХуп5 описані в розділі 6.1 вище.
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть необов'язково містити одну або декілька ксиланаз, поряд з однією або декількома ксиланазами групи А або замість однієї або декількох ксиланаз групи А. Будь-яка ксиланаза (ЕС 3.2.1.8) може бути використана як ці додаткові одна або декілька ксиланаз. Придатні ксиланази включають в себе, наприклад, ксиланазу
СаідосейШт зассНагоїуїїсит (І ші еї аї. 1990, Аррі. Епмігоп. Містобріої. 56(9):2677-2683), ксиланазу ТПептаїода таїййта (УМіпіепанег є Пебреї, 1995, Аррі. Епмігоп. Містобіої!. 61 (5):1810- 1815), ксиланазу штаму ТНептаїюда 5р. ГО55-8.1 (бітрзгоп еї аї!., 1991, Віоспет. 9. 277, 413- бо 417), ксиланазу Васійи5 сігосшап5 (ВсХ) (патент США Мо 5405769), ксиланазу АврегодїіЇи5 підег
(Кіпоб5піа єї аї., 1995, Чоцта! ої Рептепіайоп апа Віоєпдіпееппа 79(5):422-428), ксиланазу зігеріотусез ІМмідап5 (ЗпагескК еї аЇ., 1991, Сепе 107:75-82; Могозоїї єї аІ. 1986 Віоснет. 9. 239:587-592; КіІшпергеї! єї а!., 1990, Віоспет. 9. 287:45-50), ксиланазу Васійи5 5!бБі5 (Ветіевг еї аї., 1983, Сепе 26(1):59-65), ксиланазу СеЇПшіотопав5 їїті (СіаКе єї а!Ї., 1996, ЕЕМ5 Місгобіоіоду
Ї енеге 139:27-35), ксиланазу Рзеидотопав Пиогезсеп5 (Сіїреп еї а!., 1988, доштаї ої Сепегаї
Містобіоіоду 134:3239-3247), ксиланазу Сіозігідінт Іептосеїїшт (Оотіпдие? еї аї., 1995, Майшиге зЗігисіига! Віоїоду 2:569-576), ксиланазу Васійй5 ритіив5 (Миуепвз еї аї. Арріївеєйд Місгобіоіоду апа
Віотесппоїоду 2001, 56:431-434; Мапд еї аї!., 1998, Мисівїс Асіа5 Нев. 16(148):7187), ксиланазу
Сіозігідіцт асеобшуїїсит Р262 (2арре еї аї., 1990, Мисівїс Асід5 Кев5. 18(8):2179) або ксиланазу
Тисподетта Наггіапит (Нозе 6ї аї., 1987, у. Мої. Віої. 194(4):755-756).
Ксиланаза може бути одержана експресією ендогенного або екзогенного гена, що кодує ксиланазу. Ця ксиланаза може бути, в деяких обставинах, надекспресованою або недостатньо експресованою. 6.3.7. ВД-ксилозидази
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть, наприклад, переважно містити одну або декілька В-ксилозидаз. Наприклад, ця рД-ксилозидаза є ВД-ксилозидазним ферментом групи 1 (наприклад, ЕмЗА або Ем43А) або Д-ксилозидазним ферментом групи 2 (наприклад, РІ4ЗА,
Ем430, Ем39А, Ем4ЗЕ, Го43А, Ем43В, Раб1А, С743А або Вхі! Тгісподепта геезеї). Ці поліпептиди описані в розділі О вище. Наприклад, ферментна суміш/композиція цього опису може переважно містити одну або декілька ВД-ксилозидаз групи 1 і одну або декілька ВД-ксилозидаз групи 2.
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть необов'язково містити одну або декілька |р- ксилозидаз, нарівні з однією або декількома ВД-ксилозидазами групи 1 або замість однієї або декількох В-ксилозидаз групи 2 вище. Будь-яка рД-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37) може бути використана як ці додаткові В-ксилозидази. Придатні В-ксилозидази включають в себе, наприклад, Таіаготусе5 етегзопії Вхі! (Кееп еї аїІ., 2003, Віоспет Віорпуз Кез Соттип. 305(3):579-85), В-ксилозидази Сеобасійнйв5 5івагоїйтепторніїив (Знаїот еї аї!., 2005, Віоспетівігу 44:387-397), В-ксилозидази 5суїаїйдійт пепторпйшт (7апоеєїо еї аї., 2004, 9. Іпа. Місгобіо!.
Віоїеснпої. 31:170-176), ВД-ксилозидази Тгісподепта Ідпогит (5сптіаї, 1998, Меїподе Епгутої. 160:662-671), ВД-ксилозидази Азрегодіїїи5 ажатогі (КигаКаке еї аї!., 2005, Віоспіт. Віорпу5. Асіа
Коо) 1726:272-279), В-ксилозидази Азрегодійи5 мегвісоїог (Апагаде еї а!Ї., 2004, Ргосе55 Віоспет. 39:1931-1938), ВД-ксилозидази 5ігеріотусез з5р. (РіпрпапіснаКат еї а!., 2004, Мопа 9. Містобіої.
Віотесппої. 20:727-733), ВД-ксилозидази Тпептоїода тагіййта (Хиє апа 5пао, 2004, Віоїеснпої.
Гей. 26:1511-1515), ВД-ксилозидази Тгісподепта 5р. ЗУ (Кіт еї аї., 2004, 9. Містобріої. Віоїеснпої. 14:643-645), ВД-ксилозидази Авзрегадїїив5 підег (Одипіїтеїп апа РеїПу, 1980, ВіоїесНпої. Віоепад. 22:1143-1154) або рД-ксилозидази Репісійшт моптаппі (Маївицо еї а!., 1987, Адгіс. ВіоІ. Снет. 51:2367-2379).
В-ксилозидаза може бути одержана експресією ендогенного або екзогенного гена, що кодує
В-ксилозидазу. Ця В-ксилозидаза може бути, в деяких обставинах, надекспресованою або недостатньо експресованою. 6.3.8. | -а-арабінофуранозидази
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть, наприклад, переважно містити одну або декілька І -л-арабінофуранозидаз. Цією І -«-арабінофуранозидазою є, наприклад, АТ4ЗА, Ем4ЗВ,
РІТА, Раб1ТА або Ем51А. Поліпептиди АТЗА, Ем43В, РІБ1А, РазбтА і Ем51А описані в розділі 6.1 вище.
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть необов'язково містити одну або декілька | - а-арабінофуранозидаз, поряд Кк! однією або декількома попередніми Г-а- арабінофуранозидазами. І-с-арабінофуранозидази (ЕС 3.2.1.5553 з будь-якого придатного організму можуть бути використані як додаткові І-а-арабінофуранозидази. Придатні І-а- арабінофуранозидази включають в себе, наприклад, І-а-арабінофуранозидази АзрегдйШив огугає (Митап «5 Виозвіе, 5. Іпа. Містобріо!. Віоїесппої. 2006, 33:247-260), АзрегодіНив5 зоіає (О5піта еї аї!., У. Аррі. Сіусозсі. 2005, 52:261-265), Васіїйш5 Бгеміз (Митап 4 ВНиовіє, 4). Іпа. Місгобіо!.
Віотесппої. 2006, 33:247-260), Васіїи5 в5івагоїпепторпіи5 (Кіт еї аї., у. Місгобріої. Віоїесппої. 2004,14:474-482), Вітідобасієтішт Бгеме (Зпіп еї аї., Аррі. Епмігоп. Містобіої. 2003, 69:71 16-7123),
Вітідобасіетцт Іопдит (Магодоїез еї аї., Аррі. Епмігоп. Містобіо!. 2003, 69:5096-5103), Сіовійаійт
ШептосеїЇшт (Тауйог єї а!., Віоспет. У. 2006, 395:31-37), Гизапит охузрогит (Рападіоюи 6ї аї.,
Сап. 9. Місторіої. 2003, 49:639-644), Ривзапйит охузрогит Її. 5р. аіапінпі (Митап 5 Впозвіє, у. Іпа.
Містобіо!. Віоїеснпої. 2006, 33:247-260), беобасіШив5 5іеагоїпегторпйи5 Т-6 (Зпнаот еї аї., у. Віої!.
Спет. 2002, 277:43667-43673), Ногаєит мцїдаге (І ее еї аї., у. Віої. Спет. 2003, 278:5377-5387),
РепісіШит сНгузодепит (ЗаКатоїю еї аї., Віорпуз. Асіа 2003, 1621:204-21 0), Репісійшт вр. 60 (Вантап вї а!., Сап. 9. Містобіо!. 2003, 49:58-64), Рзендотопах сеїПшШіоза (Митап 8 Впозіе, У. па.
Містобіо!. Віоїтесппої. 2006, 33:247-260), ВНпіготисог ризійи5 (Нантанп еї аї!., Сатбопнуаг. Рез. 2003, 338:1469-1476), Бігеріотусе5 сНапгєийвіб5, Зперіотусе5з Шептоміоїасиб5, ПТпептоапаегобвасієг еїйапоїїсиє5, ГПпептобасійи5 хуїапіуйсив (Митап є Впобіе, У. Іпа. Місгобіо!. Віотесппої. 2006, 33:247-260), Ппеппотопозрога їшзса (Типсег апа Ваї, Роїїа Містобвіо!ї. 2003, (Ргапа) 48:168-172), Тпептоїода таїйіта (Міуагакі, Ехігеторніез 2005, 9:399-406), Тісподегта 5р. ЗУ (Чипо еї аї.,
Адгіс. Спет. Віоїеснпої. 2005, 48:7-10), Азрегоїіи5 Камаснії (Козекі еї аї., Віоспіт. Віорпувз. Асіа 2006, 1760:1458-1464), Ривагішт охузрогит Її. вр. аіапійі (Спасоп-Мапіпег еї аї., Рпувіої. Мої.
Ріапі Раїйої. 2004,64:201-208), Тпептобасійи5 хуїапіїуїсив (Оереспе еї аї., Ргоївїп Епа. 2002, 15:21-28), Нитісоїа іпзоЇеп5, Мегіріїй5 дідапівєив (5огепзеп еї аї., Віотесппої. Ргод. 2007, 237 00- 107) або Карпапизх займив (Коїаке еї аї., у. Ехр. Вої. 2006, 57:2353-2362).
І--арабінофуранозидаза може бути одержана експресією ендогенного або екзогенного гена, що кодує І-а-арабінофуранозидазу. Ця І-а-арабінофуранозидаза може бути, в деяких обставинах, надекспресованою або недостатньо експресованою. 6.3.9. Допоміжні білки
Ферментні суміші/композиції цього опису можуть, наприклад, переважно додатково містити один або декілька допоміжних білків. Приклади допоміжних білків включають в себе, без обмеження, мананази (наприклад, ендомананази, екзомананази і ВД-манозидази), галактанази (наприклад, ендо- і екзогалактанази), арабінази (наприклад, ендоарабінази і екзоарабінази), лігнінази, амілази, глюкуронідази, протеази, естерази (наприклад, естерази ферулової кислоти, ацетилксиланестерази, естерази кумарової кислоти або пектинметилестерази), ліпази, поліпептиди сімейства 61 глікозидгідролази, ксилоглюканази, СІРІ, СІР2, своленін, експансини і руйнуючі целюлозу білки. Приклади допоміжних білків можуть також включати в себе СІР1-подібні білки, СІР2-подібні білки, целобіозодегідрогенази і марганецьпероксидази. У конкретних варіантах здійснення, руйнуючі целюлозу білки є модулями, що зв'язують целюлозу. 6.4. Додаткові застосування
Крім оцукрювання біомаси, ці ферменти і/або ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані в промислових, сільськогосподарських процесах, процесах переробки харчових і кормових продуктів, а також харчових і кормових добавок. Зразкові застосування описані нижче.
Зо 6.4.1. Обробки деревини, паперу і пульпи (целюлозної маси)
Ферменти, ферментні суміші/композиції і способи цього опису можуть бути використані в процесі вторинної переробки лісоматеріалів, деревного продукту, відходів деревини або побічних продуктів деревини, паперової маси, відходів паперу, паперової або деревної целюлози, крафт-целюлози або деревної целюлози або паперової маси або в промисловому процесі. Ці процеси включають в себе, наприклад, обробки лісоматеріалу, деревної целюлози, паперових відходів, паперу або паперової маси або очищення від фарби деревної сировини або паперу. Ці ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути, наприклад, використані для обробки/попередньої обробки паперової маси або переробленої паперової маси або волокнистої сировини і т. п. Ці ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані для збільшення "глянцю" паперу, коли їх включають в папір, паперову масу, перероблений папір або в обробку/переробку паперової маси. Повинно бути зрозуміло, що, чим вище сорт паперу, тим більше глянець; глянець може впливати на здатність зчитування оптичного скануючого пристрою. Внаслідок цього, ферменти, ферментні суміші/композиції і способи/процеси можуть бути використані для виробництва "глянцевого" паперу, що має високий сорт, в тому числі паперу для безперервноструминного друку, лазерного і фотодруку.
Ці ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані для виготовлення або обробки ряду інших целюлозних матеріалів, в тому числі, наприклад, волокон з деревини, бавовни, конопель, льону або бавовняної імітації льняної тканини.
Таким чином, цей опис забезпечує способи вторинної обробки деревини або паперу для лісоматеріалу, деревної целюлози, паперу, паперової маси, відходів паперу з використанням ферменту, ферментної суміші/композиції цього опису.
Ці ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані для очищення від фарби відходів друкарського паперу, таких як газети, або для очищення від фарби паперових відходів безконтактного друку, наприклад ксерографічного і друкованого лазером паперу і сумішей відходів паперу з контактним і безконтактного друком, як описано в патентах США МоМо 6767728 або 6426200; Мео -). УМоса Спет. Тесі. 1986, 6(2):147. Вони можуть бути також використані для одержання ксилози з сорту паперу, одержаного з целюлози з твердої деревини, в процесі, який включає в себе екстракцію ксилану, що міститься в рідкій 60 фазі, піддавання умовам, достатнім для гідролізу ксилану в ксилозу, і витягання цієї ксилози.
Ця стадія екстракції може, наприклад, включати в себе щонайменше одну обробку водної суспензії паперової маси або розчинного в лугу матеріалу ферментом або ферментною сумішшю/композицією (дивіться патент США Мо 6512110). Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані для розчинення целюлози з целюлозних волокон, таких як перероблені паперові продукти, одержані з волокон твердої деревини, суміш волокна твердої деревини і волокна м'якої деревини, відходи паперу, наприклад з недрукованих конвертів, очищених від фарби конвертів, недрукованого конторського паперу, очищеного від фарби конторського паперу і т. п., як описано, наприклад, в патент США Мо 6254722. 6.4.2. Обробка волокон і текстильних матеріалів
Цей опис забезпечує способи обробки волокон і тканин з використанням одного або декількох ферментів, ферментних сумішей/композицій цього опису. Ці ферменти, ферментні суміші/композиції можуть бути використані в будь-якому зі способів обробки волокон або тканин, які відомі в даній галузі. Дивіться, наприклад, патенти США МоМо 6261828; 6077316; 6024766; 6021536; 6017751; 5980581; публікацію патенту США Мо 20020142438 А1. Наприклад, ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані в очищенні від фарби волокна і/або тканини. Якість тканини на дотик і вигляд тканини можуть бути, наприклад, поліпшені способом, який передбачає контактування цієї тканини з ферментом, ферментною сумішшю/композицією цього опису в розчині. Необов'язково, цю тканину обробляють цим розчином під тиском. Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть також використовуватися для видалення плям.
Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані для обробки ряду інших целюлозних матеріалів, в тому числі волокон, наприклад волокон з бавовнику, конопель, льону або бавовняної імітації льону, шитих або нешитих тканин, наприклад трикотажних виробів, плетених виробів, бавовняних тканин, пряжі і рушникової тканини, що виготовляється з бавовни, бавовняних сумішей або природних або виготовлених людиною целюлоз або їх сумішей. Способи обробки текстильних виробів можуть використовуватися разом з іншими обробками текстильних виробів, наприклад очищенням (промиванням) і/або відбілюванням. Очищення, наприклад, є видаленням нецелюлозного матеріалу з бавовняного волокна, наприклад кутикул (що в основному складаються з воску) і стінок первинних клітин (що
Зо в основному складаються з пектину, білка і ксилоглікану). 6.4.3. Обробка харчових продуктів і переробка харчових продуктів
Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису мають численні застосування в промисловості, що перероблює харчові продукти. Вони можуть бути, наприклад, використані для поліпшення екстракції олії з багатого олією рослинного матеріалу, наприклад багатого олією насіння. Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані для екстракції соєвої олії з сої, оливкової олії з оливок, рапсової олії з рапсу або соняшникової олії з насіння соняшника.
Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути також використані для розділення компонентів матеріалів рослинних клітин. Наприклад, вони можуть бути використані для поліпшення розділення рослинних клітин на компоненти. Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути також використані для розділення культур на фракції білка, олії і лушпиння. Цей процес розділення може виконуватися з використанням відомих способів.
Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису, нарівні з наведеними вище застосуваннями, можуть бути використані для збільшення виходу в приготуванні плодово- ягідних і овочевих соків, сиропів і т. п. Вони можуть бути також використані в ферментативній обробці різних речовин або відходів, що походять зі стінок рослинних клітин, наприклад із зернових продуктів, зерна, у виробництві вин і соків, або сільськогосподарських відходів, таких як шкірки овочів, лушпиння бобових, жом цукрового буряка, м'якуш оливок, картопляна кашка і т. п. Крім того, вони можуть бути також використані для модифікації консистенції і/або вигляду перероблюваних фруктів або овочів. Крім того, вони можуть бути використані для обробки рослинного матеріалу таким чином, щоб полегшити переробку цього рослинного матеріалу (в тому числі харчових продуктів), очищення або екстракцію рослинних компонентів. Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути також використані для поліпшення поживної цінності, зменшення водоутримувальної здатності, поліпшення деградовності в рослинах стічних вод і/або поліпшення перетворення рослинного матеріалу в силос (силосований корм) і т. п.
Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути також використані в хлібопекарних застосуваннях. У деяких варіантах здійснення, вони використовуються для бо створення тіста, що не липне, яке не створює труднощів при машинному приготуванні тіста, і для зменшення розмірів печива. Вони можуть бути також використані для гідролізу арабіноксиланів для запобігання швидкій регідратації випеченого продукту, яка може приводити до втрати крихкості, що створює хрускіт, і зменшення збережуваності. Наприклад, вони використовуються як добавки в технології приготування тіста. 6.4.4. Корма або харчові продукти для тварин або кормові або харчові добавки
Цей опис забезпечує способи обробки кормів і харчових продуктів для тварин або кормових і харчових добавок (зирріетепі) з використанням ферментів, ферментних сумішей/композицій цього опису. Тварини включають в себе ссавців (наприклад, людей), птахів, рибу і т. п. Цей опис забезпечує корми, харчові продукти і харчові добавки для тварин, що містять ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису. Обробка кормів, харчових продуктів і добавок для тварин з використанням ферментів цього опису може сприяти доступності нутрієнтів, наприклад крохмалю, білка і т. п., в кормі або добавці (зирріетеп) для тварини. За допомогою розщеплення важких для перетравлювання білків або опосередкованого або прямого виявлення крохмалю (або інших нутрієнтів) ці ферменти, ферментні суміші/композиції можуть робити нутрієнти більш доступними для інших ендогенних або екзогенних ферментів. Вони можуть також просто викликати вивільнення легко розщеплюваних і легко абсорбованих нутрієнтів і цукрів.
При додаванні до корму для тварин, ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису поліпшують розщеплення іп мімо матеріалу клітинних стінок рослин частково зменшенням кишкової в'язкості (дивіться, наприклад, Весагога еї аї., Ргосеедіпд5 ої Ше 151 Бутровішт оп
Епгутевз іп Апіта! Миїийіоп, 1993, рр. 73-77), за допомогою чого досягається краща утилізація рослинних нутрієнтів твариною. Таким чином, з використанням ферментів, ферментних сумішей/композицій цього опису в кормах, швидкість росту і/або коефіцієнт перетворення корму (тобто маса неперетравленого корму відносно приросту маси) цієї тварини можуть бути поліпшені.
Кормовою добавкою для тварини цього опису може бути гранульований ферментний продукт, який може бути легко змішаний з компонентами корму. Альтернативно, кормові добавки цього опису можуть утворювати компонент преміксу. Цей гранульований ферментний продукт цього опису може мати покриття або може не мати покриття. Розмір частинок цього
Зо ферментного гранулята може бути сумісним з розміром частинок корму і/або компонентів преміксу. Це забезпечує надійний і зручний засіб включення ферментів в корми.
Альтернативно, кормова добавка для тварини цього опису може бути стабілізованою рідкою композицією. Вона може бути суспензією на основі води або масла. Дивіться, наприклад, патент
США Мо 6245546.
Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть надаватися експресією цих ферментів безпосередньо в трансгенних кормових культурах (наприклад, у вигляді трансгенних рослин, насіння і т. п.), таких як зерна, злаки, кукурудза, соя, насіння рапсу, люпин і т. п. Як обговорювалося вище, цей опис забезпечує трансгенні рослини, частини рослин і клітини рослин, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид цього опису. Ця нуклеїнова кислота експресується, так що фермент цього опису продукується в витягуваних кількостях. Ця ксиланаза може бути також витягнута з будь-якої рослини або будь-якої частини рослини. Альтернативно, рослина або частина рослини, що містить цей рекомбінантний поліпептид, може бути використана як така для поліпшення якості харчового продукту або корму, наприклад поліпшення поживної цінності, смакових якостей і реологічних властивостей, або для руйнування антинутритивного фактора.
Цей опис забезпечує способи для видалення олігосахаридів з корму перед споживанням його суб'єктом-твариною з використанням ферменту, ферментної суміші/композиції цього опису.
У цьому способі одержують корм, який має збільшену метаболізовану калорійність. Крім ферментів, ферментних сумішей/композицій цього опису можуть бути використані галактозидази, целюлази і їх комбінації.
Цей опис забезпечує способи утилізації ферменту, ферментної суміші/композиції цього опису як поживної добавки в раціонах тварин приготуванням поживної добавки, що містить рекомбінантний фермент цього опису, і введенням цієї поживної добавки тварині для збільшення утилізації геміцелюлази, що міститься в кормі, який споживає ця тварина. 6.4.5. Обробка відходів
Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути використані в різних інших промислових застосуваннях, наприклад в обробці відходів. Наприклад, в одному аспекті, цей опис забезпечує спосіб розщеплення твердих відходів з використанням ферментів, ферментних сумішей/композицій цього опису. Ці способи можуть передбачати зменшення маси і об'єму по 60 суті необроблених твердих відходів. Тверді відходи можуть бути оброблені способом ферментативного розщеплення в присутності ферментативного розчину (що включає в себе ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису) при контрольованій температурі. Це приводить до реакції без помітної бактеріальної ферментації з мікроорганізмів, що додаються.
Ці тверді відходи перетворюються у розріджувані відходи і будь-які залишкові тверді відходи.
Одержані розріджувані відходи можуть бути відділені від вказаних будь-яких залишкових отверджених відходів. Дивіться, наприклад, патент США Мо 5709796. 6.4.6. Детергентні (мийні), дезінфікуючі і чистильні композиції
Цей опис забезпечує детергентні (мийні), дезінфікуючі або очищувальні (чистильні або дезінфікуючі) композиції що містять один або декілька ферментів, ферментних сумішей/композиції цього опису, і способи приготування і використання цих композицій. Цей опис включає в себе всі відомі способи приготування і використання детергентних (мийних), дезінфікуючих або очищувальних композицій. Дивіться, наприклад, патенти США МоМо 6413928; 6399561; 6365561; 6380147.
У конкретних варіантах здійснення, ці детергентні (мийні) дезінфікуючі або очищувальні композиції можуть бути композицією, що складається з однієї частини або двох частин, неводною рідкою композицією, відлитою твердою, гранулярною формою, формою, що складається з частинок, спресованою таблеткою, гелем і/або пастою і суспензійною формою.
Ферменти, ферментні суміші/композиції цього опису можуть бути також використані як детергентний, дезінфікуючий або очищувальний допоміжний продукт в твердій або рідкій формі. Такі допоміжні продукти призначені для доповнення або посилення продуктивності загальноприйнятих детергентних композицій і можуть додаватися на будь-якій стадії процесу очищення.
Даний опис забезпечує очищувальні композиції, що включають в себе детергентні (мийні) композиції для очищення твердих поверхонь, детергентні композиції для очищення тканин, композиції для миття посуду, композиції для очищення порожнини рота, композиції для чищення зубних протезів і розчини для чищення лінз.
Коли ферменти цього опису є компонентами композицій, придатних для застосування в способі прання в пральній машині, ці композиції можуть містити, нарівні з ферментом, ферментною сумішшю/композицією цього опису, як поверхнево-активну речовину, так і
Зо модифікуючу сполуку. Вони можуть додатково містити один або декілька детергентних компонентів, наприклад органічних полімерних сполук, відбілювальних агентів, додаткових ферментів, пригнічувачів мильної піни, диспергуючих агентів хлорного вапна-мила, грунтової суспензії і агентів проти вторинного відкладення і інгібіторів корозії.
Композиції для прання цього опису можуть також містити пом'якшувальні агенти, такі як додаткові детергентні компоненти. Такі композиції, що містять карбогідразу, можуть забезпечувати очищення тканин, видалення плям, збереження білизни, пом'якшення, міцність забарвлення, інгібування перенесення барвника і дезінфікування при приготуванні як мийних композицій для прання.
Таким чином, цей опис додатково забезпечує спосіб оцукрювання матеріалу біомаси, що містить геміцелюлозу. Такий матеріал біомаси може необов'язково містити целюлозу. Зразкові матеріали біомаси включають в себе, без обмеження, серцевину кукурудзяного качана, просо прутоподібне, сорго і/або багасу. Таким чином, цей опис забезпечує спосіб оцукрювання, який передбачає обробку матеріалу біомаси, описаної тут, яка містить геміцелюлозу і необов'язково целюлозу, ферментною сумішшю/композицією, описаною тут. Ферментна суміш/композиція, використовувана в такому способі цього винаходу, включає в себе 0,5-40 г (наприклад, 0,5-20 г, 0,5-30 г, 0,5-40 г, 0,5-15 г, 0,5-10 г, 0,5-5 г, 0,5-7 г і т. д.) поліпептидів, що мають ксиланазну активність на кг геміцелюлози в цьому матеріалі біомаси. Ферментна суміш/композиція, використовувана в такому способі цього винаходу, може також включати в себе 1-40 г (наприклад, 2-20 г, 3-7 г, 1-5 г або 2-5 г і т. д.) поліпептидів, що мають ксиланазну активність, на кг геміцелюлози в цьому матеріалі біомаси. Ферментна суміш/композиція, використовувана в такому способі, може включати в себе 0,5-50 г (наприклад, 0,5-50 г, 0,5-45 г, 0,5-40 г, 0,5-30 г, 0,5-25 г, 0,5-20 г, 0,5-15 г, 0,5-10 г і т. д.) поліпептиду, що має рД-ксилозидазну активність, на кг геміцелюлози в цьому матеріалі біомаси. Ферментна суміш/композиція, використовувана в такому способі, може також включати в себе 1-50 г (наприклад, 2-40 г, 4-20 г, 4-10 г, 2-10 г, 3-7 г і т. д.) поліпептиду, що має р-ксилозидазну активність, на кг геміцелюлози в цьому матеріалі біомаси. Ферментна суміш/композиція, використовувана в такому способі цього винаходу, може включати в себе 0,2-20 г (наприклад, 0,2-18 г, 0,2-15 г, 0,3-10 г, 0,2-8 г, 0,2-5 г іт. д.) поліпептидів, що мають І-са-арабінофуранозидазну активність, на кг геміцелюлози в цьому матеріалі біомаси. Ферментна суміш/композиція, використовувана в такому способі цього 60 винаходу, може включати в себе 0,5-20 г (наприклад, 1-10 г, 1-5 г, 2-6 г, 0,5-4 г або 1-3 гі т. д.) 5О0 поліпептидів, що мають І-а-арабінофуранозидазну активність, на кг геміцелюлози в цьому матеріалі біомаси. Ця ферментна суміш/композиція може також включати в себе 1-100 г (наприклад, 1-100 г, 2-80 г, 3-50 г, 5-40 г, 2-20 г, 10-30 г або 12-18 г і т. д.) поліпептидів, що мають целюлазну активність, на кг целюлози в цьому матеріалі біомаси. Необов'язково, кількість поліпептидів, що мають В-глюкозидазну активність, може складати до 5095 загальної маси поліпептидів, що мають целюлазну активність.
Один придатний спосіб цього винаходу переважно дає виходи 60-9095 ксилози з геміцелюлозного ксилану обробленого матеріалу біомаси. Придатні матеріали біомаси включають в себе один або декілька, наприклад, з наступних матеріалів: серцевини кукурудзяного качана, проса прутоподібного, сорго і/або багаси. У результаті, спосіб цього винаходу переважно дає щонайменше 7095 (наприклад, щонайменше 7595, щонайменше 8095) ксилози з геміцелюлозного ксилану з одного або декількох з цих матеріалів біомаси.
Наприклад, цей спосіб дає 60-9095 ксилози з геміцелюлозного ксилану матеріалу біомаси, що містить геміцелюлозу, що включає в себе, без обмеження, серцевину кукурудзяного качана, просо прутоподібне, сорго і/або багасу.
Спосіб цього винаходу необов'язково включає в себе додатково витягання моносахаридів.
Далі цей винахід ілюструється наступними прикладами. Ці приклади забезпечені тільки для ілюстративних цілей. Вони не повинні ні в якому випадку розглядатися як такі, що обмежують обсяг або зміст цього винаходу. 7. ПРИКЛАД 1: РЕПРЕЗЕНТАТИВНІ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СПОСОБИ 7.1. Матеріали і способи
Наступні аналізи/способи використовували в прикладі 1 і подальших прикладах. Будь-які відхилення від протоколів, наведених нижче, вказуються. 7.1.1. Одержання геміцелюлози з тканин рослин
Препарати геміцелюлози одержували з використанням модифікації процедури
Ммаон/обробка ультразвуком, описаної Егбгіпдегома еї аї. (Сагропуагасе РоїЇутегв, 1998, 37:231).
Сухий рослинний матеріал подрібнювали пропусканням через сито 1 мм і 10 г цього матеріалу суспендували в 250 мл 595 (мас./об) МаонН. Цю суспензію нагрівали до 807С без перемішування протягом 30 хв., потім обробляли ультразвуком протягом 15 хв. при температурі
Зо навколишнього середовища з використанням ультразвукового дезінтегратора при високій установці. Цю суспезію повертали в умови 80"С на додаткові 30 хв. з подальшим охолоджуванням до кімнатної температури. Тверді речовини видаляли з цієї суспензії центрифугуванням при З3000хд протягом 15 хв. і одержаний супернатант декантували в 1 л етанолу, який був охолоджений на льоду. Через 30 хв. одержаний осад витягували спочатку декантуванням прозорої рідини над осадом з подальшим фільтруванням, не даючи цьому осаду повністю висихати на повітрі. Фільтрувальний осад спочатку промивали 200 мл холодного 8095 етанолу, потім видаляли з фільтра, не даючи йому висихати на повітрі. Цей фільтрувальний осад перерозчиняли в 200 мл води і рН цього розчину доводили до 5,5 оцтовою кислотою. Цей екстрагований вуглевод повторно осаджували додаванням 1 л етанолу на льоду і одержаний залишок знову витягували фільтруванням, як описано вище.
Фільтрувальний осад заморожували і розчинник, що залишився, і воду видаляли ліофілізацією.
Вихід витягнутого вуглеводу знаходився в діапазоні від б до 2395 вихідного рослинного матеріалу залежно від конкретної тканини і конкретного препарату. 7.1.2. Попередня обробка субстратів біомаси розбавленим аміаком
Серцевину кукурудзяного качана і просо прутоподібне передобробляли перед ферментативним гідролізом згідно зі способами і діапазонами обробки, описаними в УМО 06110901А (якщо немає інших вказівок). 7.1.3. Аналіз складу біомаси 2-ступеневі способи кислотного гідролізу, описані в "Оєеїегтіпайоп ої 5ігисічга! сагропуагаїев апа Ідпіп іп Же Біотазв" (Майопа! Кепеул"абіе Епегду Гарогайфогу, Соїдеп, СО 2008, доступній в пОру//лммли.пге!.дом/Ббіотазвз/раїз/42618.ра), використовували для вимірювання складу субстратів біомаси. Результати ферментативного гідролізу повідомляються у вигляді процентного перетворення відносно теоретичного виходу з вихідного вмісту глюкану і ксилану цього субстрату. 7.1.4. Одержання неочищених олігомерів з обробленої аміаком серцевини кукурудзяного качана
Неочищені олігомери для скринінгу геміцелюлаз одержували з серцевини кукурудзяного качана за допомогою наступної процедури. Подрібнену молотком серцевину кукурудзяного качана (середній діаметр «1/4) плюс 695 аміак (мас./мас.) нагрівали до 145"7С прямою інжекцією бо пари в перемішуваний реактор, що знаходиться під тиском. Через 20 хв. надлишок аміаку миттєво випаровувався з цього реактора при кінцевому вакуумі «0,1 бар. Потім цю передоброблену аміаком серцевину кукурудзяного качана поміщали в стерильний перемішуваний реактор для оцукрювання ферментом. Додавали достатню кількість води для одержання кінцевого навантаження сухих речовин 2595 (мас./мас.) після виконання всіх додавань. рН цього реактора підтримували при рН 5,3 4н сірчаною кислотою і температуру контролювали при 47"С. До навантажень 20, 10 ї 5 мг/г целюлози додавали, відповідно,
Зрегуте? СР, Мийтесі? Хуїапазе (апібхсо 5 Іпс., сепепсог) і Момо 188 (Момогутез, ОептагкК) і давали оцукрюватися попередньо обробленій серцевині кукурудзяного качана до цукрів і олігомерів протягом 116 годин. Потім цей матеріал охолоджували до 33"С і рН доводили до 5,8 4н Маон. Потім глюкозу і ксилозу ферментували до етанолу додаванням затравочної культури рекомбінантного штаму 7утотопавх торії (загальний об'єм 1095, номер доступу АТСС РТА- 1798), як описано в патенті США 7354755. Прогресування ферментації простежували, поки не споживалися глюкоза і -9595 ксилози. Аліквоту 0,5 л цього ферментаційного бульйону прояснювали центрифугуванням (21000х9) протягом 20 хв. з подальшим фільтруванням супернатанту через вузол фільтрування 0,2 мікрона (МаЇдепе). Етанол видаляли з відфільтрованого ферментаційного бульйону на ротаційному випарнику, підтримуваному при 35"С під лабораторним вакуумом. Загальний об'єм кінцевої рідини зменшувався в «4 рази цією останньою процедурою. 7.1.5. Аналізи загального білка
Використовували різні способи визначення загального білка залежно від проби білка (тобто очищеної проби, ферментаційного бульйону, комерційного продукту і т. д.). ВСА-аналіз білка є одним прикладом колориметричного аналізу, який вимірює концентрацію білка за допомогою спектрофотометра.
Реагенти: Набір для ВсСА-аналізу білка (Ріегсе СПетісаІЇ, Ргодисі 523227), 50 мМ натрійацетатний буфер рН 5,0, 1595 трихлороцтова кислота (ТСА), 0,Тн Маон, вихідний розчин
В5А, Реагент А, Реагент В (з набору для аналізу білка).
Процедура: Готували розведення ферментів в тест-пробірках з використанням 50 мМ натрійацетатного буфера. Розведений розчин ферменту (0,1 мл) додавали в центрифужні пробірки Еппендорфа на 2 мл, що містять 1 мл 1595 ТСА. Ці пробірки перемішували з
Зо використанням вортекса і поміщали на льодяну баню на 10 хв. Потім ці проби центрифугували при 14000 об./хв. протягом б хв. Супернатант виливали, осад ресуспендували в 1 мл 0, їн маон їі ці пробірки перемішували за допомогою вортекса, поки цей осад не розчинявся.
Стандартні розчини ВЗА готували з вихідного розчину 2 мг/мл. Робочий розчин ВСА готували перемішуванням 0,5 мл Реагенту В з 25 мл Реагенту А. Ресуспендований білок (0,1 мл кожний) додавали в З центрифужні пробірки Еппендорфа. Два мл робочого розчину ВСА додавали в кожну з проб і в пробірки Еппендорфа з серійно розведеним ВЗА-стандартом. Всі пробірки інкубували на бані 37"С протягом 30 хв. Потім ці проби охолоджували до кімнатної температури (15 хв.) і вимірювали оптичну густину при 562 нм в спектрофотометрі.
Розрахунки: Середні величини оптичної густини для кожного В5ЗА-білка-стандарту розраховували і будували у вигляді графіка, з оптичною густиною на х-осі і концентрацією (мг/мл) на у-осі. Застосовували підгонку (накреслювання) лінійної кривої і рівняння для цієї лінії розраховували з використанням формули: у-тх--о.
Грубу концентрацію проб ферментів розраховували підставленням оптичної густини для х- величини. Концентрацію загального білка розраховували множенням на фактор розведення.
Цей загальний білок очищених проб визначали з використанням А280 (дивіться, наприклад,
Расе еї аї., Ргоївїп Зсіепсе, 1995, 4:2411).
Деякі проби білків вимірювали з використанням біуретового способу, модифікованого
УМеіспзеІрацт і СсСотаї, з використанням Бичачого Сироваткового Альбуміну як калібрувального агента (модифікованого Біурета) (УуеіспзеІрацт, Атег. У. Сііп. Рай. 1960, 16:40; Сотаї! єї аї., 9.
Віо!. Спет. 1949, 177:752).
Вміст загального білка ферментаційних продуктів вимірювали також іноді у вигляді загального азоту за допомогою спалення, уловлювання і вимірювання вивільнюваного азоту, або по К'єльдалю (гесп Іарогаїогіе5, м/млу.песпіаре5.сот), або в лабораторії за допомогою способу ООМАБ5 (Ттибрес СМ, мм. есо.сот) (ЗАОЕВ, еї аї. Агспіме5 ої Меїегіпагу Зсієепсе, 9(2):73-79, 2004). Для комплексних білоквмісних проб, наприклад для ферментаційних бульйонів, використовували середній вміст 1695 азоту і фактор перетворення 6,25 азоту в білок.
У деяких випадках, загальний осаджуваний білок вимірювали для видалення інтерферуючого азоту небілка. Використовували 12,595 кінцеву концентрацію ТСА і білоквмісний осад ТСА ресуспендували в 0,1 М Ммаон.
У інших випадках використовували Кумасі Плюс - Поліпшений аналіз Бредфорда (ТПегто зсіепійіс, Косктога, ІС ргодисі Ж23238), відповідно до рекомендації виготовлювача. 7.1.6. Аналізи активності з синтетичним субстратом (пара-нітрофеніловим субстратом)
Активний білок з Т. геезеїі-експресії клонованих генів підтверджували аналізами з модельними субстратами. Активність целюлази і геміцелюлази на синтетичних субстратах, таких як 4-нітрофеніл-с-І -арабінофуранозид (рМРА, Зідта М3641) і 4-нітрофеніл-В-О- глюкопіранозид (рМРО, Зідта М7006), і 4-нітрофеніл-В-ЮО-ксилопіранозид (рМРХ, Зідта М2132) вимірювали таким чином: розчин субстрату готували розчиненням 30 мг синтетичного субстрату в 100 мл 50 мМ натрійацетатного буфера, рН 4,8. Карбонат натрію (1 М) готували для гасіння реакції. Розчин субстрату (100 мкл) розливали в 96-ямкові планшети Собвіаг (за каталогом Мо 9017). 20 мкл проби ферменту розливали в мікротитраційний планшет. Цей мікротитраційний планшет інкубували при 50"С протягом 10 хв. з використанням нагрівального (|і охолоджувального шейкера Ппептотіхег А (Еррепаоп). 50 мкл 1 М карбонату натрію додавали в кожну ямку для гасіння цієї реакції. Оптичну густину при довжині хвилі 400 нм зчитували
Спектрофотометром для мікропланшетів бресігаМах 3400384 (Моїесшаг Оемісе5). Кількість одиниць на мл визначали з використанням калібрувальної кривої п-нітрофенолу. Оцаай ав!вїє (чотири рази делетований) Тгісподепта-хазяїн, з якого були делетовані гени сри1, срп2, еоді! їі еді2 (дивіться М/О 05/001036), аналізували з цими пробами ферментів як контролем на активність ферментів, експресованих в цьому фоні. 1.1.7. Аналіз оцукрювання серцевини кукурудзяного качана
Звичайно оцукрювання серцевини кукурудзяного качана в форматі мікротитраційного планшета виконували згідно з наступними процедурами. Субстрат біомаси, передоброблену розбавленим аміаком серцевину кукурудзяного качана, розводили у воді і рН доводили сірчаною кислотою для одержання 795 целюлозної суспензії з рН 5, яку використовували безпосередньо в цьому аналізі. Тестовані ферменти включали в себе: продукти комерційної целюлази, наприклад Ассеїегазе? 1000, АссеПегазе? 1500 (Оапізсо ШО Іпс., Сепепсої), ферментаційні бульйони Т. геезеї і очищені ферменти. Ці ферменти завантажували на основі мг загального білка на грам целюлози (як визначено аналізом складу) в субстраті серцевини кукурудзяного качана. Ці ферменти розбавляли в 50 мМ натрійцитратному буфері, рН 5,0, з
Зо одержанням бажаної концентрації завантаження в необхідному об'ємі. Сорок мікролітрів розчину ферментів додавали до 70 мг попередньо обробленої розбавленим аміаком серцевини кукурудзяного качана при 796 целюлози на ямку (еквівалента 4,595 кінцевої целюлози). Цей планшет для аналізу інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хв. Ці планшети для аналізу накривали алюмінієвими герметиками для планшетів і ці планшети інкубували при
Б50"С, 200 об./хв. протягом трьох днів. У кінці цього інкубаційного періоду, цю реакцію оцукрювання гасили додаванням 100 мкл 100 мМ гліцинового буфера, рН 10,0, на ямку і цей планшет центрифугували протягом 5 хв. при 3000 об./хв. Десять мікролітрів цього супернатанту додавали до 200 мкл води Міїйї-с) в 96-ямковому ВЕРХ-планшеті і розчинні цукри вимірювали за допомогою ВЕРХ.
Це описує типовий спосіб, який використовували в численних прикладах тут. У деяких прикладах, оцукрювання серцевини кукурудзяного качана вимірювали з використанням модифікованого протоколу. Ці модифікації описані окремими прикладами. 7.1.8. Аналіз цукру за допомогою ВЕРХ
Звичайно проби з гідролізу серцевини кукурудзяного качана готували центрифугуванням для прояснення нерозчинного матеріалу, фільтруванням через найлоновий фільтр 0,22 мкм (Зріп-Х-фільтр для центрифужних пробірок, Согпіпд Іпсогрогаїейд, Согпіпд, МУ) і розведенням до придатної концентрації розчинних цукрів дистильованою водою. Мономерні цукри визначали на зЗподех Бидаг 5Н-О 5НІТО11 колонці 8х300 мм з ЗН-1011Р запобіжною колонкою 6х50 мм (мили. 5подех.пе). Розчинником була 0,01н Нг5О»5, рухома при 0,6 мл/хв. Температура колонки була 50"С і детектування виконували з використанням детектора показника заломлення.
Зовнішні стандарти глюкози, ксилози і арабінози запускали з кожним набором проб. Деякі приклади тут використовують протокол для досягнення тієї ж самої мети з декілька модифікованим набором протоколів. Ці конкретні модифікації описані з окремими прикладами.
Олігомерні цукри розділяли витіснювальною хроматографією з використанням колонки
Товзоп Віозер (Се0О00ОРМУ 7,5 мм х 60 см (мм ло5опбБіозсіепсе.де). Розчинником була дистильована вода при 0,6 мл/хв., і ця колонка функціонувала при кімнатній температурі.
Використовуваними шестивуглецевими цукровими стандартами були: стахіоза, рафіноза, целобіоза і глюкоза; і 5-вуглецевим цукром були: ксилогексоза, ксилопентоза, ксилотетроза, ксилотріоза, ксилобіоза і ксилоза. Ксилоолігомери одержували з Медауте бо (милу. тедауте.сопт). Детектування виконували по показнику заломлення і при кількісному повідомленні результати виражені або у вигляді одиниць площ піків, або у вигляді відносних площ піків в процентах.
Загальні розчинні цукри визначали кислотним гідролізом центрифугованих і прояснених за допомогою фільтра проб, описаних вище. Цю прояснену пробу розводили 1:1 0,вн Нобзох і цей одержаний розчин автоклавували в закритому кришкою флаконі протягом загального часу циклу 1 год. при 1217С. Результати повідомляються без корекції на втрату мономерного цукру під час цього гідролізу. 7.1.9. Аналіз білка за допомогою ВЕРХ
Для розділення і кількісного визначення ферментів, що містяться в бульйоні, з 14-л ферментацій інтегрованих експресійних штамів, виконували рідинну хроматографію (І С) і мас- спектрометрію (М5). Проби ферментів спочатку обробляли рекомбінантно експресованою глюкозидазою епаонН з 5. ріїсайй5 (наприклад, МЕВ РО702І). ЕпдоН використовували при відношенні 0,01-0,03 мкг білка епдоН на мкг загального білка проби і інкубували протягом З годин при 37"С, рН 4,5-6,0, для ферментативного видалення М-зв'язаного глікозилування перед ВЕРХ-аналізом. Потім приблизно 50 мкг білка інжектували для гідрофобної хроматографії з використанням системи Адіепі 1100 НРІС з НіІС-фенільною колонкою і виконували градієнт висока-низька сіль протягом 35 хвилин на пробах концентрованого ферментаційного бульйону. Цей градієнт одержували з використанням високосольового буфера А: 4 М сульфату амонію, що містить 20 мМ фосфат калію, рН 6,75, і низькосольового буфера В: 20 мМ фосфату калію, рН 6,75. Піки детектували з використанням Уф-світла при 222 нм і фракції збирали і ідентифікували мас-спектрометрією. 7.1.10. Аналіз целюлазної активності з використанням калькофлуору білого
Целюлазну активність вимірювали на РАБС з використанням способу з калькофлуором білим (Аррі. Віоспет. Віоїесппої. 161:313-317). Всі використовувані хімікалії були хімікаліями аналітичної чистоти. АмісеІ РН-101 купували з ЕМС ВіоРоїутег (РНіаде!рНіа, РА).
Калкофлуор білий купували з Зідта (51. І оці5, МО). Набухлу в фосфорній кислоті целюлозу (РАС) готували з АмісеІ! РН-101 з використанням адаптованого протоколу Умаїзейй, ТАРРІ 1971, 35:228 і ММосд, Віоспет. 9. 1971, 121:353-362. Коротко, АмісеІ! солюбілізували в концентрованій фосфорній кислоті, потім осаджували з використанням холодної деіонізованої води. Після
Зо збирання і промивання целюлози додатковою кількістю води для нейтралізації рнН, її розбавляли до 195 сухих речовин в 50 мМ натрійацетатному буфері, рН 5,0.
Всі розведення ферменту виконували з використанням 50 мМ натрійфосфатного буфера, рН 5,0. Целюлазу 5С220 (Бапібсо 05 Іпс., сепепсог) розводили до 2,5, 5, 10 і 15 мг білка на г
РАЗС, для одержання лінійної калібрувальної кривої. Підлягаючі тестуванню проби розводили для входження в діапазон цієї калібрувальної кривої, тобто для одержання реакції 0,1-0,4 фракційного продукту. 150 мкл холодного 195 РАЗС додавали до 20 мкл ферментного розчину в 9б-ямкових мікротитраційних планшетах. Цей планшет накривали і інкубували протягом 2 годин при 50"С, 200 об./хв. в термостаті/шейкері Іппома. Цю реакцію гасили 100 мкл 50 мкг/мл
Калькофлуором в 100 мМ Гліцині, рН 10. Флуоресценцію зчитували на мікропланшет-рідері для флуоресценції (бресігаМах М5 ру МоїІесшціаг Оемісез) при довжині хвилі збудження Ех-365 нм і довжині хвилі випромінювання Ет-435 нм. Цей результат (показаний на фіг. 25) виражений у вигляді фракційного продукту згідно з рівнянням:
ЕР-1-(РІ проби - РІ буфера)/(РІ без ферменту - РІ буфер), де ЕР означає фракційний продукт і РІ означає одиниці флуоресценції. 7.1.11. Культивування Ризагішт мепісіПоїдез ії очищення основних геміцелюлазних активностей, детектованих у позаклітинному білку
Джерелом Ризагішт мепісіПйоіде5 дикого типу було джерело, описане в таблиці 1 Рисрз еї аї.,
Еипда! Сепеїйсв апа Віооду 2004, 41:852-863. Цей гриб вирощували з використанням позбавленого крохмалю волокна зерен кукурудзи з використанням модифікації способу, описаного в Гі єї аІ., Арріїєа Віоспетівігу апа ВіоїесппоЇоду 2005, (121-124):321-334.
Крохмаль видаляли з висушеної фракції перикарпію (оплодня) кукурудзи з фракціонування подрібненням сухої кукурудзи суспендуванням 200 г перикарпію кукурудзи в З л водопровідної води і нагріванням до 807С з 5 мл (500 мг) високотемпературної амілази Гідпиолгуте 50 05 (Момогутез, ОептагК). Цю суміш перемішували періодично шпателем і витримували при 80"С протягом 30 хв. і потім давали їй охолоджуватися до кімнатної температури протягом приблизно 2 годин. Одержану суспензію декантували на сито 20 меш (число комірок на 1 дюйм) для часткового видалення води. Тверді речовини на цьому ситі додатково промивали 4 л водопровідної води, потім сушили на повітрі протягом ночі перед кінцевим сушінням в печі при 60"С. Цей висушений матеріал подрібнювали пропусканням через сито 1 мм в ножовому млині (516) перед використанням.
Культуру РЕ. мепісіПоіїде5 підтримували на агарі з декстрозою картоплі (Зідта Рбб85) і середовище для вирощування, збагачене 24 г/л декстрозою картоплі, інокулювали міцелієм з цієї чашки. Цю культуру для вирощування інкубували протягом З днів при З0"С з перемішуванням при 130 об./хв. Після З днів вирощування 150 мл одержаної маси клітин і відпрацьованого середовища використовували для інокуляції індукційного середовища перикарпію кукурудзи. Це індукційне середовище містило 80 г позбавленого крохмалю кукурудзяного перикарпію в 1 л базального середовища (15 г КНегРО»х, 5 г сульфату амонію, 20 г дріжджового екстракту, 0,5 г сульфату магнію і 1 г Твіну 80, при рН 4,8). Цю культуру підтримували при 30"С з перемішуванням при 130 об./хв. протягом 7 днів.
Позаклітинний білок відділяли від маси відпрацьованого зерна і грибних клітин центрифугуванням при 2000х4 протягом 20 хв. Частково прояснений супернатант пропускали спочатку через фільтр 0,45 мкм і потім через фільтр 0,22 мкм. Прояснений фільтрат залишали вистоюватися при 4"С до використання. Фільтрат концентрували приблизно 14-кратно з використанням центрифужних фільтрів Атісоп ультра-4 з межею 30 кДа (МіПіроге).
І-а-арабінофуранозидазну (ГАКЕ) і ВД-ксилозидазну (ВХІ) активності очищали з грибного супернатанту спочатку обміном цих білків в 50 мМ буфер, рН 6,3, (М-морфоліно)- етансульфонова кислота-МаОнН (МЕ5), потім нанесенням білка на аніонообмінну колонку четвертинного аміну Си:Є Неапй Зсієпсе5 О-берпагозе Бавзі Ріож (20 мл-об'єм шару, зрівноважений буфером МЕ5). Використовуваною системою очищення білка була система СН
Неаншт Зсіепсез5 АКіа, що використовує програмне забезпечення Опісогп. Білки елюювали градієнтом 0-0,5 М Масі в буфері МЕ5.
Активність у фракціях колонки спостерігали з використанням або 4-нітрофеніл-В-О- ксилопіранозиду (для ВХІ -активності), або 4-нітрофеніл-с-І -арабінофуранозиду (для ГАКЕ- активності). У обох випадках фракцію 2 мкл колонки додавали до 95 мкл 50 мМ, рН 5,0, натрійацетатного буфера і 5 мкл п-нітрофеніл-субстрату, перемішували і інкубували 2 хв. при 23"С. Додавали 100 мкл ін стоп-розчину карбонату натрію і зчитували оптичну густину при 405 нм.
Активні фракції ферментів з цієї аніонообмінної системи збирали, концентрували з використанням Атісоп Сепігіргер фільтрації і наносили на сульфопропіл-катіонообмінну
Зо колонку (СЕ Неаййп Зсіепсез ЗР-Берпагозе Базі Ріо (20 мл-шар, зрівноважений натрійацетатним буфером) з використанням тієї ж самої системи очищення, яка описана вище.
Білки елюювали градієнтом 0-1 М Масі в натрійацетатному буфері і активність в цих фракціях спостерігали, як описано вище. Потім активні фракції збирали, об'єднували і концентрували, якщо необхідно. Білки в активних фракціях ідентифікували з використанням М5-М5. 7.1.12. Ідентифікація білків з використанням М5-М5
Ідентифікація репрезентативного набору І1-а-арабінофуранозидази сімейства Н54
Еизагішт мепісійоіїде5 (АКЕ), сімейства ЗН5Ь1 ГАКЕ, двох В-ксилозидаз сімейства ЗНЗ і р- ксилозидази сімейства ЗНЗО (ВХІ) описана нижче.
Для ідентифікації ГАКЕ ОН5Б4, 200 мкл Ін НСІ (ЕМ Іпдизхігіе5, Наулпогпе, МУ) додавали до 250 мкл "Фракції В3" (0,35 мг білка) з процедури очищення, описаної вище, і цю пробу охолоджували на льоду протягом 10 хвилин. Потім додавали 200 мкл 5095 ТСА (бЗідта-Апагісн,
І. І оці5, МО) і проби охолоджували на льоду протягом додаткових 10 хвилин для осадження білка. Проби центрифугували протягом 2 хвилин при 16000 гсї і супернатанти викидали.
Осаджений білок промивали 9095 холодним ацетоном (ВаКег 9.Т., РийірвБбигг, МУ), потім центрифугували протягом 1 хвилини при 16000 гої. Супернатант викидали і осад залишали висихати на повітрі. Спочатку до цього осаду додавали 30 мкл 8 М сечовини, потім 4 мкл 0,2 М
ОТ (Зідта-Аїйгісй, 51. І оці5, МО). Пробу інкубували при 52"С протягом 30 хвилин і потім додавали 4 мкл 0,44 М йодацетаміду (бідта-Аїагіси, зі. І оці5, МО) і цей розчин інкубували при кімнатній температурі в темряві протягом 30 хвилин. Потім повільно додавали 120 мкл 0,195 н- октил-В-О-глюкопіранозидної води (Зідта-Аїйагісй, 51. І оці5, МО) і потім пробу розділяли на дві рівні частини. До половини цієї проби додавали 7,5 мкг Трипсину (Рготеда Согр., Мадізоп, УМ), а до іншої половини додавали 4 мкг А5зрМ (Коспе Арріїєд Зсіепсе, Іпаіапароїї5, ІМ). Обидві проби інкубували при 37"С протягом 1 години. Проби гасили 1095 трифтороцтовою кислотою (Тпептозсіепіййс, УММайкштат, МА) з одержанням кінцевого об'єму 0,195 ТЕА. Обидві проби проходили на мас-спектрометрі з іонною пасткою Тпепгтоїппідап (Зап 9дозе, СА) з іонізацією розпиленням електронів ЇСбО-Юеса (Е5І). Колонка Мудас С18 (5 мікрон, ЗО0А, 0,2х150 мм,
Міспгот Віогезоигсе5, Айбригп, СА) працювала при швидкості потоку 200 мкл/хв. Інжекційні об'єми були 50 мкл і їх фільтрували через приєднаний уловлюючий картридж (Реріїде СартТгар,
Міснпгот Віогезошигсез, Айригп, СА) перед завантаженням на цю колонку. Розділення продуктів бо розщеплення виконували з градієнтом таким чином: Розчинник А: 0,190 трифтороцтова кислота в НгО (Вакег .Т., РпйШірзбБиттг, МУ), Розчинник В: 0,0895 трифтороцтова кислота в ацетонітрилі (ВаКег 9.Т., РийШір5ригдо, МУ). Для ідентифікації ГАКЕ ОН51, двох ДВ-ксилозидаз ЗНЗ і р- ксилозидази СНЗО, використовували описаний вище спосіб, за винятком проб, розщеплених
Хімотрипсином (7,5 мкг, бідта-Аїагісй, 2. Гоці5, МО), поряд з Трипсином і АзрМ. Пошукову систему Тигрозедиевзі в Віоугогк5 3.31 (Тпепто, Зап дозе) використовували для ідентифікації білків з бази даних білків Ризагішт мегіісіПоідеє5. Ця база даних білків завантажувалася з
Інституту ВКОАО в пЕр:/Лумлму.ргоадіп:ійще.огуд/аппоїайоп/депотелЛивзагішт мепісіПоідев5/Миїїї
Ромпіоад5»5.пІті. 7.1.13. Індукція ферментів Ризагішт мепісйШоїде5 з використанням попередньо обробленого розбавленим аміаком проса прутоподібного
Для індукції ферментів Ризагішт мегісійіоіїдеє в реакції на попередньо оброблене розбавленим аміаком просо прутоподібне, просо прутоподібне подрібнювали до діаметра «1 мм, потім попередньо обробляли 695 аміаком з розрахунку на суху масу при 5095 вихідній сухій речовині при максимальній температурі 1607"С протягом 90 хвилин. Одержаний матеріал мав 43,395 сухих речовин і містив 0,33695 залишковий аміак.
Культуру РЕ. мепісіПоіЧе5 дикого типу підтримували на агарі з картопляною декстрозою (Зідта Рбб85) і збагачене середовище для вирощування з 24 г/л картопляної декстрози інокулювали міцелієм з цієї чашки. Цю культуру для вирощування інкубували протягом З днів при 24"С з перемішуванням при 140 об./хв., причому за цей час вона ставала каламутною від клітин ЕРизагішт. Після З днів росту, 4 колби, кожна з яких містила 100 мл базального середовища СНгізіїакароціовз (0,195 КН»РО», 00395 СасСі», 0,0395 МоазО:ах7НгО, 2,61965
МагНРОхх7НгО, 0,13495 МанНегРОах1НгО, 1,095 безводний фосфат амонію), інокулювали 4 мл одержаної суспензії клітин. До цієї суспензії додавали два грами сухої речовини передобробленого розбавленим водним аміаком проса прутоподібного як єдине джерело вуглецю.
Після додавання передобробленого проса прутоподібного, рН доводили до 6,5 і колбу обертали при 180 об./хв. 23"С протягом 168 годин. Перед витіснювальною хроматографією, проби аналізували в різних часових точках аналізом Бредфорда на білок, п- нітрофеніларабінофуранозидазну, п-нітрофенілксилозидазну і п-нітрофенілглюкозидазну
Зо активності, і електрофорезом в ДСН-ПААГ на індукцію ферментів. Інтактне не оброблене попередньо просо прутоподібне, 295 глюкозу і пробу без джерела вуглецю включали як паралельні контролі, і було виявлено, що це приводило до набагато більш низьких рівнів індукції ферментів, ніж це було у випадку попередньо обробленого аміаком проса прутоподібного як джерела вуглецю. 7.1.14. Фракціонування витіснювальною хроматографією культурального бульйону
Еизалит мепісіПоідев5
Культуральне середовище Ризагішт мепісіПоідев5, що містить експресійні ферменти з 168- годинної індукції описаної вище, центрифугували при 3500хд для видалення клітинних залишків і клітин. Супернатант фільтрували через фільтр 0,4 мкм з одержанням прозорої темно-жовтої рідини. Цю рідину концентрували (-«4х) два рази у великому концентраторі Атісоп ша ТОК ММ/ сшой (ОРС901024). Одну концентровану пробу 1,7 мл залишали для витіснювальної хроматографії (5ЕС) і аналізували на вміст білка ВСА-аналізом, як описано раніше. Цю концентровану пробу білка наносили на колонку 5ЕС Зирегаех 16/60, зрівноважену 50 мМ натрійацетатним буфером, рН 5,0. Цю колонку елюювали при 1 мл/хв. при 4"С.
Спостерігали оптичну густину цієї проби при 214 нм і 280 нм. Після елюції вільного об'єму, збирали фракції по 1 мл в поліпропіленовому мікротитраційному планшеті з глибокими ямками.
Білоквмісні фракції агрегували в окремий планшет з глибокими ямками і всі фракції вимірювали на концентрацію загального білка за допомогою ВСА-аналізу і п-нітрофеніларабінозидазну, п- нітрофенілксилозидазну і п-нітрофенілтглюкозидазну активності, як описано в прикладі 1 (Аналізи активності з синтетичними субстратами). 7.1.15. Очищення ряду гомологів ЗН4З3, ОН51 ії СНЗ (розділ 8.1 нижче) з ферментації Т. геезвї катіонообмінною хроматографією
Одержання ферментів в масштабі струшуваних колб з культур Тгісподегта геезеї дикого типу виконували, як описано в М/О 2005/001036. Ці препарати позаклітинних ферментів концентрували Атісоп Сепігіргер-фільтрацією, якщо необхідно, і наносили на сульфопропіл- катіонообмінну колонку СЕ Неакй Зсіепсе5 ЗР-5ернагозе Раві Ніом (20-мл шар, зрівноважений натрійацетатним буфером) з використанням системи очищення білків СЕ Неакй Зсіепсе5 АКа із застосуванням програмного забезпечення Опісогп. Білюи елюювали градієнтом 0-1 М Масі в натрійацетатному буфері і активність в цих фракціях спостерігали, як описано вище. Потім бо активні фракції збирали, об'єднували і концентрували, якщо необхідно. Активність у фракціях колонки спостерігали з використанням або 4-нітрофеніл-В-О-ксилопіранозиду (для ВХІ- активності), або 4-нітрофеніл-с-І -арабінофуранозиду (для І АКР-активності). У обох випадках, 2 мкл фракції колонки додавали до 95 мкл 50 мМ, рН 5,0, натрійацетатного буфера і 5 мкл п- нітрофеніл-субстрату, перемішували і інкубували 2 хв. при 23"С. Додавали 100 мікролітрів їн стоп-розчину карбонату натрію і зчитували оптичну густину при 405 нм. У деяких випадках, стадія аніонного обміну була корисною перед катіонним обміном. У цьому випадку, ферментні фракції обмінювали в 50 мМ буфер, рН 6,3, (М-морфоліно)-етансульфонова кислота-чмаон (МЕЗ) і потім наносили на аніонообмінну колонку четвертинного аміну СЕ Неєайй 5сієпсев5 О-
Зерпагозе Базі Біо (20-мл об'єм шару, зрівноважений буфером МЕ5). Використовували систему очищення білка АКіа ргоїеіп, описану для катіонообмінної стадії. Білки елюювали 0-0,5
М градієнтом Масі в буфері МЕ5. Потім ці активні білки обмінювали в 50 мМ, рН 5,0, натрійацетатний буфер перед катіонообмінною хроматографією. 7.1.16. Очищення ксиланаз
Очищення ксиланаз проводили в двох стадіях:
Стадія 1: Гідрофобна хроматографія (НІС). (МНі)250О5 додавали до ферментаційного супернатанту до досягнення кінцевої концентрації 1 М. Використовуваною розділовою колонкою була Ніргер Ріепуї (підпбзиб), 16/10, 20 мл. Буфер А: 20 мМ фосфат натрію, рН 6,0. Буфер В:
Буфер Ан1 М (МН4і)2505. Ступенева елюція: 45905 В; 0905 В; водан109о гліцерин.
Стадія 2: Гель-фільтрація (СЕ). Елюат 095 В з колонки НІС збирали і наносили на колонку
Ні оай 26/60 Зирегдех 75 ргер дгаде (320 мл, СЕ Неайнсаге). Рухомою фазою був 20 мМ фосфат натрію, рН 6,8, що містить 0,15 М Масі. Профіль елюції показаний на фіг. 26. Фіг. 27 показує детектування ДСН-ПААГ двоступеневого розділення АгихХупб.
Арріїєй Віозубзіет5 ВІОСАЮО Мібіоп і Атег5пат РІПаптасіа Віоїесп АКТА Ехріогег використовували для очищення білка ХУМ3 Т. геезеі. Приблизно 150 мл Ксиланази 3, з ультрафільтраційного концентрату, завантажували на знесолювальну колонку зерпадех 5-25М (загальний об'єм «525 мл), зрівноважену в 10 мМ буфері ТЕ5, рН 6,8. Потім 300-400 мл цієї знесоленої проби завантажували на аніонообмінну колонку (смола четвертинного аміну високої густини; Арріїед Віозувіете5 Іпс.). Потім цей зв'язаний білок елюювали з використанням сольового градієнта між 0-1 М хлориду натрію із застосуванням 8 колонкових об'ємів 25 мМ
Зо буфера ТЕ5. Елюція цього білка відбувалася між 0-250 мМ хлориду натрію і була детектована з використанням електрофорезу в 1095 Тріс МОРАСЕ? ДСН-ПААГ (Момех).
Ці елюйовані проби, що містять Ксиланазу 3, концентрували до 10 мл з використанням мембранних концентраторів Мімахєріп 5000 МУУСО (межа відсікання молекулярної маси) (мМімазсіепсе; СЕ Неайпсаге). Потім цей концентрат наносили на Нідп Гоаа 26/60 Зирегаех 200 (ІО я 17-1071-01; СЕ Неайсаге). Цю колонку зрівноважували 25 мМ буфером ТЕЗ, рН 6,8, що містить 100 мМ хлорид натрію, і зв'язаний білок елюювали з використанням більше 8 колонкових об'ємів буфера ТЕЗ з хлоридом натрію.
Чистоту цього елюйованого білка оцінювали за допомогою електрофорезу з використанням 10965 Віз-Ттіз МОРАСЕ? ДСН-ПААГ (Момех), і було визначено, що цей білок мав чистоту 9595. 7.1.17. Очищення ЕГм430
Ультрафільтраційний концентрат (ШЕС) Ризапит мепісіПоїде5 430 піддавали зміні буфера і діалізували проти 50 мМ натрійацетатного буфера, рН 4,0, протягом ночі. Діалізований матеріал пропускали через 1-мл колонку НіТгар, попередньо заповнену сульфорилсефарозною смолою швидкого протікання (ЗЕ НеайПсаге), призначену для застосування зі шприцом.
Очищений Ем430 елюювали 50 мМ натрійацетатним буфером, рН 4,0, з 250 мМ хлоридом натрію. ОЕС і натрійацетатний буфер проштовхували через цю колонку з використанням шприца 5 мл, забезпеченого з'єднувачем СЕ Неаййсаге. Очищений Ем430 діалізували протягом ночі проти 50 мМ натрійацетатного буфера, рН 4,0. Очищений білок аналізували за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ, ВЕРХ і мас-спектрометрії для демонстрації гомогенності. 7.1.18. Очищення ЕМОТА
Ультрафільтраційний концентрат (ЕС) Ризагішт мепісіПоіде5 51А піддавали зміні буфера і діалізували проти 50 мМ натрійацетатного буфера, рН 5,0, протягом ночі. Діалізований матеріал пропускали через колонку б мл КЕБОШОКСЕ 15, попередньо заповнену метилсульфонатною смолою (ЗЕ Неакнйпсаге) ОРОС наносили при 1 мл/хв. проти 50 мМ натрійацетатного буфера, рН 5,0, і елюювали при 5 мл/хв. проти 50 мМ натрійацетатного буфера, рН 5,0, з використанням градієнта хлориду натрію 0-250 мМ. Елюйовані фракції збирали і аналізували за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ. Фракції з очищеним Ем51А концентрували з використанням концентратора 10000 МУУСО МУМімавзріп з Запогіи5 5іетаіт
Віотесп. Очищений Ем5ТА діалізували протягом ночі проти 50 мМ натрійацетатного буфера, рн бо 5,0. Очищений білок аналізували за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ, ВЕРХ і мас-
спектрометрії для демонстрації гомогенності. Для очищення Ем51А використовували систему
АКТА Ехріогег 100 з СЕ НеаїйНсаге. 8. ПРИКЛАД 2: ЕКСПРЕСІЯ ОКРЕМИХ ГЕНІВ ГЕМІЦЕЛЮЛАЗ З РІЗНИХ ВИДІВ В
ТВІСНОРЕВМА РЕЕ5ЕЇ 8.1. Гени Ризагішт мепісШіоїіаев
Послідовність для Ем51А одержували пошуком геному ЕРизагішт мепісіЦіоідеб5 в базі даних
Вгоаа Іпзійше (пер:/Лимли. ргоадіпзійще.ого/) на гомологи арабінофуранозидази СН51.
Наступні гени з Ризагішт мепісйіоіїде5 експресувалися в Тгісподегта геезеї: ЕмЗА, Ема4ЗА,
Ем43В, Ем430, ЕмМ51А, ГУЗВ, Ем43С, Ем39А, Ем43ЗЕ, Ем3З0А, Ем30В і Ем43БР. Послідовність ЕМЗА одержували пошуком на гомологи В-ксилозидази ОНЗ в геномі Ризагішт мегіісіПоіде5. Ця анотована послідовність позбавлена сигнальній послідовності, і використовували програму прогнозу генів Айцдивіи5 (пЕр:/айдивіи5.добісв5.ае/) для ідентифікації послідовності зліва, яка містила сигнальну послідовність. Послідовності для ЕмЗ9А, Ем4ЗА, Ем43В, Ем430, Ем4ЗЕ і Ем30А одержували пошуком геному ЕРизагішт мепісіПоіїдеє на гомологи ВД-ксилозидази ЗНЗУ, ОНЗО і снаЗ.
Відкриті рамки зчитування цих генів геміцелюлоз, що представляють інтерес, ампліфікували за допомогою ПЛР з використанням очищеної/екстрагованої геномної ДНК з
Еизагішт мепісіПоїдеб5 як матриці. Використовуваним ПЛР-термоциклером був ОМА Епдіпе
Теїгайд 2 Рекіег Тпептаї! Сусіег (ВіоКаай І арогайгіе5). Використовуваною ДНК-полімеразою була
ДНК-полімераза РішШНта | Ривіоп Н5 (БЗігаїадепє). Праймерами, використовувані для ампліфікації цих відкритих рамок зчитування, були наступні праймери:
ЕмЗА:
Прямий праймер МНІ124 (5-САСССАТасСтТастоСААТСТТСАС-3) (5ЕО І МО:52),
Зворотний праймер МНІ125 (Х-ТТАСССАСАСТТОваатсттада-3) (5ЕО І МО:53);
ЕмазА:
Прямий праймер МНО75 (5-САССАТОа ТаС,СТаАССТОСССАТТ-3") (ЗЕО ІЮ МО:54),
Зворотний праймер МНО76 (5-ТТАйСТАААСТасСсСАССАСТТИалдАстТТа-3) (5ЕО ІЮ МО:55);
Емазв:
Прямий праймер МНО77 (5-САССАТОСОСТТОоТСттасстТАТТОИаТт-3) (5ЕО ІЮО МО:56),
Зо Зворотний праймер МНО78 (5-СТАСААТТСТОАТТТСАСАДАААСАСО-3) (5ЕО ІЮО МО:57);
Емазо:
Прямий праймер МНОЗ81 (5-САССАтТасСАаСтТСААатТТТсСтТа-3) (5ЕО ІЮ МО':58),
Зворотний праймер МНОВ2 (5-СТАААТСТТАаСАСИ,АИаТААСО-3) (ЗЕО ІО МО:59);
ЕМА1А:
Прямий праймер 5К1159 (Ї-САССАТОСТТСаСтТТСАСТТСААТОСТАС-3) (5ЕО ІЮ МО:60),
Зворотний праймер 5К1160 (5-СТАаСТАпАатАдаастттоС-3) (5ЕО І МО:61);
ЕмЗ9А:
Прямий праймер МНІ116 (-САССАТаСАСТАСастАСССТСАССАС-3) (БЕО І МО:62),
Зворотний праймер МНІ117 (3-ТСАДИТАСАСсСасастастСАСО-3 (5ЕО ІЮ МО:63);
ЕмЗВ:
Зворотний праймер МНІ126 (5-САС САТ САА АСТ СТО ТАС СТА ОСТ Ста -3) (5ЕО Ір
МО:64),
Зворотний праймер МНІ127 (5-СТА СОА ААС тат аАС АстТ САС ат а-3) (ЗЕО І МО:65);
ЕмЗОА:
Прямий праймер МНІ12 (5-САС САТ СТ СТІ Сто асСтТ бат ст То ТАС-3) (5ЕО І
МО:66),
Зворотний праймер МНІ13 (5-ТТА ТТ сат аСА ста асо АСа-3) (5ЕО ІО МО:67);
Емзов:
Прямий праймер МНІТ14 (5-САС САТ САА ТОС ТТ АТС ТСТ бас! ССтТ ТОа-3) (5ЕО І
МО:68),
Зворотний праймер МНІ115 (5-САС; СОС ТСА ТАС Те ТСТ тот То-3) (5ЕО ІЮ МО:69);
Емазс:
Прямий праймер МНО79 (5-САС САТ ба ТСТ ТСТ АТО ТТ ТОО-3) (5ЕО І МО:70),
Зворотний праймер МНОВО (5-СТА САА ДС ССТ Асі АТО АА-3") (5ЕО 10 МО:71);
ЕмЗ9А:
Прямий праймер МНІ116 (5-САС САТ аСА СТА Сас ТАС ССТ САС САС-3) (БЕО ІЮ МО:72),
Зворотний праймер МНІ117 (5-ТСА АСТ АСА ОО ОСТ ОСТ САС С-3 (5ЕО ІЮ МО:73);
ЕмазЗеЕ:
Прямий праймер МНІ147 (5-САС САТ САА СОТ АТА Ста Ст бат сееа-3) (5ЕО ІЮ МО:74), 60 Зворотний праймер МНІ148 (5-СТА ТОС АОС ТОТ САА АСБА СТО ААС С-3) (БЕО ІЮО МО:75);
Емазен:
Прямий праймер МНІ149 (-САССАТатТасАААСТОСТСатсСАСО-3) (ЗЕО ІО МО:76),
Зворотний праймер МНІ150 (5-СТА АТА ДИС ААС дсасі ССА СС АТТ а-3) (5ЕО І МО:77).
Прямі праймери включали в себе чотири додаткових нуклеотиди (послідовності - САСС) на 5-кінці для полегшення направленого клонування в РЕМТК/О-ТОРО (Іпийгодеп, Сагізрайд, СА) (фіг. 28). Умови ПЛР для ампліфікації відкритих рамок зчитування були наступними (за винятком умов для Ем91А): Стадія 1: 947С протягом 2 хв. Стадія 2: 94"С протягом 30 сек. Стадія 3: 57"С протягом 30 сек. Стадія 4: 72"С протягом 30-45 сек. Стадії 2, З і 4 повторювали протягом додаткових 29 циклів. Стадія 5: 72"С протягом 2 хв. Для Ем51А використовували наступні умови: Стадія 1: 947"С протягом 2 хв. Стадія 2: 947"С протягом 30 сек. Стадія 3: 567 протягом 30 сек. Стадія 4: 72"С протягом 45 сек. Стадії 2, 3, 4 повторювали протягом додаткових 25 циклів. Стадія 5: підтримання 47.
Продукти ПЛР відповідних відкритих рамок зчитування геміцелюлаз очищали з використанням набору для очищення ПЛР Оіадиніск РСА Ригіїісайноп Кії (Оіадеп, МаІепсіа, СА).
Очищені продукти ПЛР клонували у вектор РЕМТК/О-ТОРО, трансформували в хімічно компетентні клітини Е. соїї ТОР10 (Іпмігодеп, Сагізрайд, СА), і висівали на ГА-чашки з 50 м.ч. канаміцину. Плазмідну ДНК одержували з трансформантів Е. соїї з використанням набору для одержання плазмід ОІАвзріп (СОіадеп). Дані послідовності для ДНК, інсертованої у вектор
РЕМТА/О-ТОРО, одержували з використанням прямого і зворотного праймерів М1З3 (Зедиеїеси,
Моипіайп Міем,, СА). Вектор РЕМТК/О-ТОРО з правильною ДНК-послідовністю відповідної відкритої рамки зчитування геміцелюлази рекомбінували з попередньо визначеним вектором ртгехзамМ (УМО 05/001036, фіг. 29) з використанням реакційної суміші І К-клонази (Іпмігодеп,
Сапзрад, СА) відповідно до інструкцій виготовлювача. Потім продукт реакції І К-клонази трансформували в хімічно компетентні клітини Е. соїї ТОР10, які потім висівали на ГА, що містить 50 м.ч. карбеніциліну. Одержані експресуючі вектори були плазмідами рТгехЗом, що містять відповідні відкриті рамки зчитування геміцелюлаз, які походили з події рекомбінації між сайтами аккК! і анка2 ртТгехзомМ і сайтами ан і ан 2 рРЕМТК/О-ТОРО; і маркер ацетамідазного відбору Азрегойи5 підшапе (атаз). ДНК цих експресуючих векторів, що містять відповідні відкриті рамки зчитування геміцелюлаз, виділяли з використанням міні-преп-набору Оіадеп і
Зо використовували для балістичної трансформації спор Тгісподепта геезеї зрогев.
Балістичну трансформацію Тгісподегта геезеі експресуючим ртгехЗдМ, що містить відповідну відкриту рамку зчитування геміцелюлази, виконували з використанням наступного протоколу. Трансформацію штаму Тгісподепта геезвїі сеПІіазе диаай авє!єїе (Дерпт, Аерпг, Лев,
Дед2) бомбардуванням гелієм виконували з використанням системи доставки частинок Віоїївііс?
РОБ-1000/Не з Віо-Кай (Негсше5, СА), відповідно до інструкцій виготовлювача (дивіться
Публікації патентів М/О 05/001036 і 005 2006/0003408). Трансформанти переносили на свіжі чашки для ацетамідного відбору (дивіться Публікацію патенту УМО 2009114380). Стабільні трансформанти інокулювали в фільтрувальні мікротитраційні планшети (Соптіпо), що містять 200 мкл на ямку Гліцинового Мінімального середовища (6,0 г/л гліцин; 4,7 г/л (МНа)250О5; 5,0 г/л
КНгРО»; 1,0 г/л МазОх«х 7Н2гО; 33,0 г/л РІРР5; рН 5,5), з подальшим стерильним додаванням суміші «2956 глюкоза/софороза (05 7713725) як джерела вуглецю, 10 мл/л 100 г/л Сасі», 2,5 мл/л Т. геезеї мікроелементів (400х): 175 г/л безводної лимонної кислоти; 200 г/л РезОах7НгО; 16 г/л 7п5042х7НгО; 3,2 г/л СиБОхх5НегО; 1,4 г/л Мп5Охх Нео; 0,8 г/л НзіВОз). Трансформанти вирощували в рідкій культурі протягом 5 днів в збагаченій О2 камері, що знаходиться в 287С- термостаті. Проби супернатанту з фільтрувального мікротитраційного планшета збирали на вакуумному фільтраційному пристрої.
Проби супернатанту піддавали електрофорезу на 4-1295 гелях МиИРАСЕ (Іпмйгодеп,
Сагпізрад, СА), відповідно до інструкцій виготовлювача, для перевірки на експресію. Цей гель забарвлювали Простим синім барвником (Іпмігодеп, Сагізрад, СА). Очищення ферментів ЗНАЗ,
СНО! ї СОНЗ з ферментацій Т. геезеї виконували катіонообмінною хроматографією, як описано в прикладі 1. 8.2. Гени з інших видів
Послідовності РІ4ЗА і РІБТЛА одержували секвенуванням геному РепісшШит Типісшовит.
Запитами, використовуваними для пошуків геному Р. їипісшовзит, були гомологи інших грибних
СН4АЗ ї СНО, доступні в публічних геномах. Програму для прогнозу генів, звану Айдивіи5 (пер:/айдиеш5.добісз.ае/), використовували для підтвердження послідовностей інтронів, разом зі стартовим кодоном. Послідовність Ем430 використовували для запиту геномів (зіббрегеїЇІа7еає (Ризагішт дгатіпеагит) і ЕРивзагішт охузрогит, доступних в базі даних Вгоай Іпвійше, і знаходження послідовностей для (37243А і ЕБо43ЗА, відповідно. Гени для С743А і Ео43А бо синтезували за допомогою СепеАгі (Сепеагйї СтрН, Кедепзбигу, Сегтапу) з сигнальною послідовністю СВНІ замість природної сигнальної послідовності. Жоден ген не містив інтрони.
Ген РІЗ1ТА був кодон-оптимізованим і був синтезований за допомогою СепеАгі з сигнальною послідовністю СВНІ замість природної сигнальної послідовності.
РІ4ЗА і РІОТА клонували і експресували в Тгісподегта геезеї з використанням наступних праймерів:
РІАЗА: МНІ51 (5-САССАТаАСТТСсАдаСаАТТТасТтТАТАТТТТАСО-3) (ЗЕО ІЮО МО:78),
РАЗА: МНІ152 (5-ТТАТасСсаААСТасССААТААТСАААИТТИ-3) (5ЕО ІЮ МО:79),
РІБТА: 5К1168 ('-САССАТИТАССОЯСАДИаСтСассоата-3") (ЗЕО І МО:80),
РУТА: 5К1169 (Ї-СТАСТОСИатсСТТСАаСАСАСССАС-З3) (5ЕО ІЮ МО:81).
Три гени клонували з АзрегдПШи5 Тштідаєв5 для експресії в Тгісподегта геезеї: ксиланаза 2
С,НІ1 (АпхХупг), ксиланаза 5 СНІ1 (АтХуп5) і АТЯЗА ОНАЗ. Праймери для АїХуп2, АгтхХУуп5 і клонуючі праймери АЇ4ЗА показані нижче:
АтиХупае:
Алиті-О4М/С11-Е: (5-сССсСЯаСсОаССаСАССАТОСТТОоТТоТОоСтТАССТаСтТаста-3) (5ЕО
ІО МО:82),
Алиті-0О4М/С11-8: б5-сСсса,аСабасссСсТтТАСТАатТАаАсАатаАТапААасСАаАТОССИ-3') (ЗЕО ІО МО:83);
АтиХупь:
Алиті-О4МУР28-Е: (5-СсСсСасцсассСсасСАССАТОАТСТОСАТТТОоСТСасСтТСА,аСсСтТ-3) (БО І
МО:84),
Алиті-О4М/Е28-8: (5-ссс,асасасссСТТАТСАСТТасСАТАТААСССТасСсААСАдаатТА-3) (ЗЕО ІО МО:85);
АТаЗА:
ЗК1203: (Ї-САССАТОааСАаСТоСАДаТтТТАТОО-3) (5ЕО І МО:86), зКк1204:(15-ТСсСАаатАаастосасАсССАСТО-3) (ЗЕО І МО:87).
Способи, використовувані для клонування і експресії всіх цих генів, були схожими з процедурою, описаною для клонування генів Ризагішт. Додаткові гени, що включають в себе гени, перераховані в таблиці 18, клонували схожим чином. 9. ПРИКЛАД 3: ТЕСТУВАННЯ НА АКТИВНІСТЬ НОВИХ ГЕМІЦЕЛЮЛАЗ НА СИНТЕТИЧНИХ
Коо) СУБСТРАТАХ
Активності ЕмЗА, Ем4ЗА, Ем43В, Ем430 і ряду інших білків, наприклад в таблиці 2, тестували на синтетичних субстратах рМРХ і рМРА, як описано в аналізі активності на синтетичному субстраті в прикладі 1. Т. геезеі Вхії використовували при 0,7 г/л. Проби інших ферментів і контролю-хазяїна Оцасд-деіесе додавали по об'єму з культур для вирощування (в масштабі мікротитраційних планшетів або струшуваних колб. Таким чином, ця абсолютна активність не може порівнюватися між пробами, але є указанням на активний експресований білок з відносною активністю рМРХ і рМРА, показаною в таблиці 2. Активність на пара-нітрофенілових субстратах не використовується як передбачення продуктивності оцукрювання біомаси. 10. ПРИКЛАД 4: ГІДРОЛІЗ ПОПЕРЕДНЬО ОБРОБЛЕНИХ СЕРЦЕВИН КУКУРУДЗЯНОГО
КАЧАНА ПРЕПАРАТАМИ ЦЕЛЮЛАЗИ І ГЕМІЦЕЛЮЛАЗИ
10.1. Продуктивність оцукрювання експресованих білків
Оцінювали продуктивність оцукрювання експресованих білків у вигляді додавань до ферментної суміші з недостатністю І -а-арабінофуранозидази. Кандидати Г-а- арабінофуранозидази оцінювали в 4-денному аналізі оцукрювання качанів додаванням ферментної суміші АссеїІегазе 1500/Т. геезеї Хуп3/РмЗА. Цей скринінг проводили, як описано в аналізі оцукрювання серцевини кукурудзяного качана (прикладі 1), з наступними ферментами і кількостями/концентраціями: - АссеїЇІєгазе? 1500, ТР (загальний азот) 54,2 мг/мл, - Тісподепта геезеї Хупз, 2,9 мг/мл ТР (очищений), - ЕУЗА, 3,2 мг/мл ТР (очищений), - ЕМА1А, 7,8 мг/мл ТР (очищений), - М9514А, 6,8 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), - АІБТ А, 6,7 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), - РІБТА, 3,3 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), - 55514А, 3,0 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), - МО51Т А, 6,8 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), - С9518, 3,6 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), - АТАЗА, 2,6 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), - РІ4ЗА, 2 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), 60 - ЕмаЗЕ, 1,37 мг/мл ТР (ТСА/ВСА). бо
Загальний білок (ТР) очищених проб визначали за допомогою А280, якщо немає інших вказівок. Загальний білок неочищених проб визначали з використанням ВСА відповідно до інструкцій виготовлювача, якщо немає інших вказівок. АссеПегазе? 1500 додавали при 20 мг білка на г целюлози; Тгісподегта геезеї Хуп3 додавали при 5 мг білка на г целюлози; ЕмЗА додавали при 5 мг білка на г целюлози. Ем51А, Мо951А, АКТА, РІБ1ТА, 5551А, Мавт1А, Сд518,
АТЗА, РІ4ЗА або Ем43ЗЕ додавали при 1, З і 5 мг білка на г целюлози. Після 4 днів інкубування, 50"С, 200 об./хв., планшет для аналізу гасили і аналізували за допомогою ВЕРХ на розчинні цукри.
Були виявлені ферменти, які збільшували вихід ксилози або арабінози або зменшували концентрацію целобіози або ксилобіози в цій ферментній суміші. Результати показані на фіг.
ЗОА і 308.
Продуктивність оцукрювання експресованих білків також оцінювали у вигляді додавань до ферментної суміші з недостатністю І-а-арабінофуранозидази і ВД-ксилозидази. Кандидати рД- ксилозидази оцінювали в З-денному аналізі оцукрювання качанів додаванням ферментної суміші АссейПегазе 1500/Т. геезеі Хуп3. Цей скринінг проводили, як описано в аналізі оцукрювання серцевини кукурудзяного качана (прикладі 1), з наступними ферментами і кількостями/концентраціями: - АссеІІегазе? 1500, ТР (загальний азот) 54 2 мг/мл, - Тісподепта геезеї Хупз, 2,9 мг/мл (очищений), - ЕУЗА, 3,2 мг/мл (очищений), - Ем430, 6,8 мг/мл (очищений), - РІ4ЗА, 2 мг/мл ТР (ВСА), - РІ4ЗВ, 2,7 мг/мл ТР (ВСА), - ЕмаЗЕ, 1,37 мг/мл ТР (ВСА), - ЕмаЗЕ, 2,8 мг/мл ТР (ВСА), - ЕУЗОА, 2,7 мг/мл ТР (ВСА).
АссеїІегазе? 1500 додавали при 17,9 мг білка на г целюлози; Т геезеї Хуп3 додавали при 5 мг білка на г целюлози. ЕмЗА, Ем430, РАЗА, РІ4З3В, Ем4ЗЕ, Ем4ЗЕ або ГмЗОА додавали при 1, З і 5 мг білка на г целюлози (Ем43Е додавали тільки при 1 і З мг/г). Після З днів інкубування, 507С,
Зо 200 об./хв., планшет для аналізу гасили і аналізували за допомогою ВЕРХ на розчинні цукри.
Результати показані на фіг. 31. Були виявлені ферменти, які збільшували вихід глюкози, ксилози або арабінози або зменшували концентрацію целобіози або ксилобіози в цій ферментній суміші.
Продуктивність оцукрювання експресованих білків також оцінювали у вигляді додавань до ферментної суміші з недостатністю ксиланази. Під час конструювання інтегрованих експресованих штамів Тгісподегта геезеї Хуп3 (описаних в прикладі 9 нижче), був виділений один штам Т. геезеї (штам Мо 44), який надекспресував білки ВдІ!1, ЕумЗА, Ем5о1А, Ем430, але не експресував ендоксиланазу. Цей штам використовували як фон, до якого додавали кандидатні ксиланази для скринінгу продуктивності. Кандидати ендоксиланази оцінювали в З-денному аналізі оцукрювання качанів додаванням ферментних продуктів зі штаму Мо 44. Цей скринінг проводили, як описано в аналізі оцукрювання серцевини кукурудзяного качана (приклад 1), з наступними ферментами і кількостями/концентраціями: - ферментний продукт штаму Мо 44, 78,6 мг/мл ТР (модифікований Біурет), - Тісподепта геезеї Хупз, 2,9 мг/мл ТР (очищений), - АтиХупаг, 3,3 мг/мл ТР (очищений), - АтихХупз, 5,8 мг/мл ТР (очищений), - АтихХуп5, 14,8 мг/мл ТР (очищений), - Ріохуп'Т, 1,9 мг/мл ТР (очищений), - Б8рХупі! 1,2 мг/мл ТР (очищений).
Ферментну композицію, продуковану штамом Мо 44, додавали при 20 мг білка на г целюлози; кандидатні ксиланазні ферменти додавали при З і 7 мг білка на г целюлози. Після З днів інкубування, при 50"С, 200 об./хв., цей планшет для аналізу гасили і аналізували за допомогою ВЕРХ на розчинні цукри. Були виявлені ферменти, які збільшували вихід ксилоли, глюкози або арабінози або зменшували концентрацію целобіози або ксилобіози в цій ферментній суміші. Результати показані на фіг. 32.
Продуктивність оцукрювання оекспресованих білків Ем51А і РабїА з 1-о- арабінофуранозидазною недостатністю оцінювали і порівнювали. Емо1А і Раб51А оцінювали в 3- денному аналізі оцукрювання серцевини кукурудзяного качана додаванням до ферментної суміші АссеїІегазе? 1000/Т. геезеї Хуп2/Вхії! або ЕмЗА. Цей скринінг проводили, як описано в аналізі оцукрювання серцевини кукурудзяного качана (приклад 1), з наступними ферментами і кількостями/концентраціями: - АссеїІегазе? 1000, 60,6 мг/мл ТР (загальний азот), - Тісподепта геезеї Хупг, 4,1 мг/мл ТР (очищений), - Тисподетта геезві Вхі!, 69 мг/мл ТР (ТСА/загальний азот), - ЕУЗА, 65 мг/мл ТР (ТСА/загальний азот), - ЕМОТ1А, 43 мг/мл ТР (ТСА/ВСА), - РабтА, 85,4 мг/мл ТР (ТСА/загальний азот).
АссеїІегазе 1000 додавали при 20 мг білка на г целюлози; Тгісподегта геезеї Хуп2 додавали при 5 мг білка на г целюлози; Тгісподегпта геезеї Вх!1 або ЕуЗА додавали при 5 мг білка на г целюлози; Ем51А додавали при 5 мг білка на г целюлози; РабТА додавали при 1, 2 або 5 мг білка на г целюлози. Після З днів інкубування, при 50"С, 200 об./хв., цей планшет для аналізу гасили і аналізували за допомогою ВЕРХ на розчинні цукри. Були виявлені комбінації ферментів, які збільшували вихід ксилоли, глюкози або арабінози або зменшували концентрацію целобіози або ксилобіози в цій ферментній суміші. Результати показані на фіг. 33.
Ем51А і Раб51А також оцінювали в З-денному аналізі оцукрювання додаванням ферментної суміші АссеПегазе? 1000/Лтісподегта геезеї Хуп2. У цій частині дослідження використовували очищений Ем51А (29 мг/мл ТР) і РабтА (29 мг/мл). АссеПегазе 1000 додавали при 17,5 мг білка на г целюлози; Тгісподегта геезеі Хуп2 додавали при 4,4 мг/мл білка на г целюлози; ЕМ51А додавали при 4,4 мг білка на г целюлози; Раб51А додавали при 0,9, 1,8 і 4,4 мг білка на г целюлози. Після З днів інкубування, при 50"С, 200 об./хв., цей планшет для аналізу гасили і аналізували за допомогою ВЕРХ на розчинні цукри. Були виявлені комбінації ферментів, які збільшували вихід ксилоли, глюкози або арабінози або зменшували концентрацію целобіози або ксилобіози в цій ферментній суміші. Результати показані на фіг. 34.
Продуктивність оцукрювання експресованих білків також оцінювали у вигляді додавань до ферментної суміші з недостатністю р-ксилозидази. Кандидати В-ксилозидази оцінювали в 3- денному аналізі оцукрювання качанів додаванням ферментної суміші АссеїІегазе 1500/1Т. геезеї
Хуп3. Цей скринінг проводили, як описано в аналізі оцукрювання серцевини кукурудзяного качана (прикладі 1), з наступними ферментами і кількостями/концентраціями: - АссеІІегазе? 1000, ТР (ТСА/загальний азот) 60,6 мг/мл, - Тісподепта геезеї Хупг, 4,1 мг/мл ТР (очищений), - ЕУЗА, 65 мг/мл ТР (ТСА/загальний азот), - ЕхЗВ, 62,9 мг/мл ТР (ТСА/загальний азот), - ЕмЗ9А, 47,5 мг/мл ТР (ТСА/загальний азот), - ЕмЗОВ, 62,9 мг/мл ТР (ТСА/загальний азот), - ЕМОТ1А, 43 мг/мл ТР (ТСА/ВСА).
АссеїІегазе 1000 додавали при 20 мг білка на г целюлози; Тгісподегта геезеї Хуп2 додавали при 5 мг/мл білка на г целюлози; Ем51А додавали при 5 мг білка на г целюлози. ЕмЗ9А, Ем30ОВ,
ЕмЗА або РУуЗВ додавали при 1, 2 або 5 мг білка на г целюлози. Після З днів інкубування, при 50"С, 200 об./хв., цей планшет для аналізу гасили і аналізували за допомогою ВЕРХ на розчинні цукри. Були виявлені ферменти і комбінації ферментів, які збільшували вихід ксилози або арабінози або зменшували концентрацію целобіози або ксилобіози в цій ферментній суміші, з іншою В-ксилозидазою або без іншої В-ксилозидази (Т. геезеї Вхі!). Результати показані на фіг. ЗБА-350. 10.2. Активність кандидатних ендоксиланаз з ксиланом деревини берези
Активність кандидатних ендоксиланаз оцінювали з використанням ксилану деревини берези як субстрату з використанням наступного аналізу. Дев'яносто мікролітрів 195 (мас./об'єм) вихідного розчину ксилану деревини берези (Зідта ХО502) додавали в ямки 96- ямкового мікротитраційного планшета і попередньо інкубували при 50"С протягом 10 хв.
Додавали розведення ферменту і стандарти ксилози (10 мкл) до цього мікротитраційного планшета і ці планшети інкубували при 507"С протягом 10 хв. Тим часом додавали 100 мкл розчину ДНК в ПЛР-пробірки. Після 10-хвилинного інкубування, 60 мкл цієї ферментної реакційної суміші переносили в ПЛР-пробірки, що містять розчин ДНК. Ці пробірки інкубували в термоциклері при 95"С протягом 5 хв. і потім охолоджували до 4"С. Сто мікролітрів цієї реакційної суміші переносили в 96-ямковий планшет і вимірювали оптичну густину при 540 нм.
Готували ксилозну калібрувальну криву і використовували її для розрахунку активності. Одна ксиланазна одиниця визначається як кількість ферменту, необхідна для генерування 1 мкмоль еквівалентів ксилозного редукуючого цукру за хвилину при умовах цього аналізу. Результати показані в таблиці 3. бо 10.3. Ферментний гідроліз олігомерів арабіноксилану з оцукреної серцевини кукурудзяного качана
У цьому дослідженні, піддавали моніторингу ферментний гідроліз олігомерів арабіноксилану після розщеплення передобробленої аміаком серцевини кукурудзяного качана препаратами целюлази і геміцелюлази. Приготування неочищених олігомерів описане в прикладі 1. Загальні олігомерні цукри визначали за допомогою ВЕРХ (дивіться приклад 1) після кислотного гідролізу неочищених олігомерів 295 (06./06.) сірчаною кислотою в запаяному флаконі при 1217С протягом 30 хв. Цю концентрацію цукру коректували відносно малої кількості деградації цукру, визначеної контрольними пробами відомих сумішей цукрів, оброблених за допомогою тієї ж самої процедури. Концентрація загальних цукрів в цьому препараті неочищеного олігомеру, визначена цим способом, була 45 г/л глюкози, 168 г/л ксилози і 46 г/л арабінози. З урахуванням мономерного цукру, присутнього в неочищених олігомерах перед кислотним гідролізом, 8695 глюкози, 9095 ксилози і 4395 арабінози були присутніми в олігомерній формі. Різні В-ксилозидази, арабінофуранозидази і їх суміші тестували на збільшене перетворення арабінозного мономера з препарату неочищених олігомерів. Цей препарат неочищених олігомерів розбавляли в 20 разів до 12 г/л в 50 мМ натрійацетатному буфері, рН 5,0 їі підтримували при 50"С в нагрівальному блоці в закритих кришками пробірках
Еппендорфа на 1,5 мл. Ферменти додавали при кінцевих концентраціях 0,06-0,09 г/л і інкубували протягом 24 год. до завершення. Потім проби видаляли для ВЕРХ-аналізу мономерних цукрів, як описано в прикладі 1. Ці результати представлені в таблиці 4 у вигляді
Фо перетворення в мономерний цукор з розрахунку на загальний цукор, визначений кислотним гідролізом.
Що стосується одержання найвищих виходів (44-7195) оарабінози з олігомерів арабіноксилану, що залишилися, в цій неочищеній суміші олігомерів, дані в таблиці 4 показують, що бінарні комбінації РумЗАжЕм51А, ЕуЗзАзЕм43В і Рм43АжнЕм43В забезпечують найкращі результати. З сімейств послідовностей і активності на штучних субстратах був зроблений висновок, що ЕРУЗА є ВД-ксилозидазою, а ЕмМ51А є І -л-арабінофуранозидазою.
Відомо, що арабінозні цукри в арабіноксилані з серцевини кукурудзяного качана часто зв'язані з ксилозою в обох з положень 2 і З арабінозного цукру. Таким чином, активність, мабуть, гідролізує зв'язок ху(1-2)ага, що робить доступним зв'язок ага(1-3)ху! для гідролізу 1 -а-
Зо арабінофуранозидазою. З тестованих ВД-ксилозидаз тільки ЕУЗА і Ем43А, мабуть, мають цю активність. Крім цього, в цьому скринінгу, мабуть, тільки Ем43В має І-с-арабінофуранозидазну активність серед членів Сімейства 43 з Ризагішт мегіісіПоіде5. Результати показані в таблиці 4. 11. ПРИКЛАД 5: ДІАПАЗОН СУБСТРАТІВ ВД-КСИЛОЗИДАЗ ДЛЯ ЕФЕКТИВНОГО ГІДРОЛІЗУ
СЕРЦЕВИНИ КУКУРУДЗЯНОГО КАЧАНА
У цьому прикладі визначали діапазон субстратів З Д-ксилозидаз і їх зв'язок з ефективним перетворенням ксилоолігомерів серцевини кукурудзяного качана в мономерні цукри.
Приготування гідролізату серцевини кукурудзяного качана, що містить олігомерні цукри, і аналіз мономерних цукрів виконували, як описано в прикладі 1. Визначали спектри протонного ЯМР олігомерних цукрів з мірою полімеризації (ОР), більшою ніж 2, при розділенні витіснювальною хроматографією на Віо-беіІ Р2 (фіг. 36 ії фіг. 37). Спектри олігомерів перед ферментною обробкою позначені як "МОО7 олігомери" в нижній панелі фіг. 36, а спектри тих же самих оліговмісних фракцій після ферментної обробки на інших панелях фіг. Зб і 37 відмічені ферментом обробки.
Фракції Віо-сеє! Р2, що містять олігомери, більші ніж ОР2 (5-10 мг), ліофілізували і потім розчиняли в 0,7 мл ЮО2О-розчину, що містить 0,5 мМ 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонату (055) як внутрішній стандарт. Аліквоти 0,55 мл використовували для ЯМР-проб для оптимізації супресії водного піка, що залишився. Використовували стандартні версії Магіап 20 соїтеїайноп риїзе зедцепсев5, з оптимізацією 30-спектральної ширини для гетеронуклеарних експериментів.
Спектри одержували на Магап МОпйу Іпома з використанням високочутливого кріозонда, працюючого при 500 МГц. З'ясування структури виконували ідентифікацією кореляцій, які характеризують спін-системи для окремих цукрових залишків, і потім ідентифікацією міжглікозидних кореляцій.
Олігомери, що містять арабінозу, визначені за допомогою ЯМР, мають домінуючі одну або декілька розгалужених структур, в яких арабіноза зв'язана ВД-1-53 з ксилозним залишком в полімерному фрагменті. Арабінозний залишок в одержаній гілці додатково замінений ксилозним залишком, зв'язаним Д-1-32 з арабінозою. Невелика кількість арабінози без цієї другої заміни присутня в інших ксилоолігомерах. Т. геезеі Вхії є не дуже ефективним при розщепленні найбільш дальнього зв'язку ксилоза 1-22 арабіноза, як доводиться сигналами, що залишилися, при 5,5-5,55 м.ч. в цих спектрах. Комбінація Ем43А, який є ефективним на бо ксилозних олігомерах з більш довгим ланцюгом, і І -«-арабінофуранозидази Ем43В видаляє більшу частину молекул, але не всі з розгалужених молекул з сигналами в діапазоні 5,5 м.ч., і, на відміну від обробки Т. геезеї Вхі1, не залишає жодного з сигналів при 5,35, які приписують арабінозі, що залишилася, розгалуженій до ксилозного олігомеру.
Аномерний протонний район спектрів інших ксилоолігомерів після обробки тільки ЕМ51А або в комбінації з ЕмЗА виявляє інші результати. Одна І -с-арабінофуранозидаза не є ефективною в зменшенні комплексності сигналів в цьому районі. ВД-ксилозидаза ГуУЗА видаляє по суті всі з ксилоз, протилежних арабінозній гілці, залишаючи в основному просто зв'язані олігомерні структури арабіноза 1-53 ксилоза. Додавання І-а-арабінофуранозидази до ДВ-ксилозидази приводить до достатньо повного перетворення в мономерні цукри, як показано збільшенням сигналу, що приходить від с«- і ВД-аномерних протонів редукуючих цукрів.
Можна також зробити висновок, що збільшена ефективність однієї Д-ксилозидази в порівнянні з іншою зумовлена, мабуть, діапазоном субстрату в зв'язку зі структурною комплексністю аглікону, допустимого як субстрат. 12. ПРИКЛАД 6: ПОРІВНЯННЯ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ! КРИТИЧНИХ ЗАЛИШКІВ В
ВИЗНАЧЕННІ ДІАПАЗОНУ СУБСТРАТІВ В ВД-КСИЛОЗИДАЗАХ СНЗ
Т. геезеї ВД-ксилозидаза (Вхі!) є на 6195 схожою з ортологом Р. мепісШіоїідез (ЕмЗА) і має 4290 ідентичність послідовності, як показано в зіставленні фіг. 38. ЕмЗА має набагато більш широкий діапазон субстратів, ніж Вхії, що, ймовірно, пов'язано з неконсервативними амінокислотами серед цих двох білків. 13. ПРИКЛАД 7: ВИЗНАЧЕННЯ ПЕВНОЇ ГЕМІЦЕЛЮЛАЗНОЇ АКТИВНОСТІ ДЛЯ ГІДРОЛІЗУ
СЕРЦЕВИНИ КУКУРУДЗЯНОГО КАЧАНА ДО МОНОМЕРНИХ ЦУКРІВ
Попередньо оброблену серцевину кукурудзяного качана, як описано в прикладі 1, використовували у вигляді водної суспензії, доведеної приблизно до рН 5 Н25Ох у воді при 18,6 г сухих речовин серцевини кукурудзяного качана на 100 г загальній суспензії. 0,78 г цієї суспензії додавали в скляні флакони на 4 мл і додавали достатню кількість 50 мМ натрійацетатного буфера, рН 5,0, з одержанням загальної маси реакційної суміші 1,06 г після додавань бажаного ферменту. Геміцелюлази додавали у вигляді очищених препаратів, описаних в прикладі 1. Супернатант від штаму диай аеєїеїеа Т. геезеї (Оцай в таблицях 5 і 6) є концентратом фонових білків, експресованих цим штамом Т. геезеї, делетованим в 4 основних
Зо целюлазних активностях (описаних в УМО 05/001036). АссеПегазе? 1000 є сумішшю цільної целюлази з високою ВД-глюкозидазною активністю. Ці флакони інкубували при 230 об./хв. в орбітальному шейкері при 48"С протягом 72 годин і потім додавали 2 мл води. Брали субпробу і додатково розбавляли, центрифугували і фільтрували для ВЕРХ-аналізу на мономерні цукри, як описано в прикладі 1. Експериментальні результати, що визначають застосовні кількості певної геміцелюлазної активності для гідролізу передобробленої серцевини кукурудзяного качана до мономерних цукрів, показані в таблиці 5.
Ці результати з аевідп-ої-ехрегітепіз (ОоЄЕ) (експериментів по проектуванню схеми проведення реакцій) підганяли до моделі поверхні і використовували для визначення найкращих співвідношень 7 ферментних компонентів для найкращого виходу глюкози, ксилози і арабінози при двох тестованих концентраціях загального білка. Результати цих співвідношень для семи ферментних компонентів показані в таблиці 6.
Інше з'ясування цих співвідношень (таблиця 7) проводили з включенням РЕмЗА, і знову з включенням Ем430О0 і підтриманням цієї активності константною при низькому рівні. Схема реакції і умови реакції були ідентичними схемі і умовам, описаним для повного ЮОоєЕ- експерименту.
Реакції (номери експериментів) 20, 21 їі 22 містять тільки суміш цільних целюлазних ферментів, і при навантаженні глюкану 21 мг/г мономеризували приблизно 4895 глюкози, присутньої в кукурудзяному качані, і 2495 ксилози. Додавання ендоксиланази, Тгісподепта геезеі Хуп3, дозволило зменшити навантаження білка цільної целюлази при збереженні приблизно того ж самого виходу глюкозного мономера і збільшеного виходу ксилозного мономера до приблизно 4095 (експеримент Мо 1). Всі комбінації, які давали виходи арабінози вище 4095, вимагали комбінації Ем430, Ем43ЗА і Ем43В або Ем51А, або РмУЗА і ЕмМ51А, або Ем43В.
Ці комбінації мають також тенденцію мати найвище вивільнення ксилози у вигляді мономерного цукру.
Інший набір реакцій, націлений на поліпшення необхідної суміші геміцелюлаз, виконували із збереженням постійного навантаження цільної целюлази і постійного навантаження ендоксиланази. АссеїЇІІегазе? 1000, препарат цільної целюлази, підтримували постійним при 12 мг/г глюкану, і очищену ендоксиланазу Т. геезеї Хуп3 підтримували при 6 мг/г ксилану. ЕМО1А був єдиною І-а-арабінофуранозидазою в цій суміші, в різних дозах. Інші умови реакції бо залишалися тими ж самими, але цей гідролізат аналізували витіснювальною хроматографією,
як описано в прикладі 1. Кількісне визначення окремих цукрів виконували тільки за допомогою площі піків, і ці результати показані в таблиці 8.
Всі комбінації виділяли схожі кількості глюкози і приблизно одну і ту ж кількість загальної розчинної ксилози. Міра редукції в мономерну ксилозу варіювалася залежно від обробки. Без доданої активності для перетворення олігомеру в мономер приблизно 5095 солюбілізованої ксилози залишалися олігомерними, якщо не подавалася щонайменше р-ксилозидаза. ЕмЗА при 2 мг ЕуЗА-білка на г ксилану зменшували »ОР2-олігомери до 3,6 мг/мл. Додавання 2 мг Ем51А- білка на г ксилану до 2 мг ЕуЗА-білка на г ксилану додатково зменшувало »ОР2-олігомери до 1,5 мг/мл. Приблизно 2 мг Ем51А/г ксилану, мабуть, є достатніми для зменшення х»ОР2- олігомерів до мінімуму в присутності необхідних 2 мг/г ЕУЗА (таблиця 8).
Суміш 6 мг/г ксилану Т. геезеї Хуп3, 2 мг/г ЕмЗА і або 1, або 2 мг/г Ем51А є достатнім навантаженням для редукції загального арабіноксилану серцевини кукурудзяного качана до мономерних цукрів. Додавання Ем430 до цієї суміші сприяє перетворенню ксилобіози або інших
ОР2-олігомерів в мономер. У цьому експерименті не вимірювали гідроліз арабінози до мономера. 14. ПРИКЛАД 8: ЕФЕКТИВНІСТЬ ГЕМІЦЕЛЮЛАЗ В ОДЕРЖАННІ МОНОМЕРНИХ ЦУКРІВ З
СЕРЦЕВИНИ КУКУРУДЗЯНОГО КАЧАНА
У цьому прикладі демонструється ефективність набору очищених геміцелюлазних активностей при одержанні мономерних ксилозних і арабінозних цукрів при дії по окремості на передоброблену аміаком серцевину кукурудзяного качана. Готували три суміші (Суміші А, В і С) очищених геміцелюлаз і використовували їх для гідролізу геміцелюлози в передобробленій серцевині кукурудзяного качана в реакціях з 1 г загальних, 1495 сухих речовин, приготованих, як описано в прикладі 1, що проводяться при умовах, описаних в прикладі 1. Мономерні цукри аналізували за допомогою ВЕРХ, як описано в прикладі 1, після 72 годин реакції, і одержані кількості показані в таблиці 9. - Суміш А: 6 мг Тгіісподегта геезеї Хуп3; 4 мг ЕмЗА; 1 мг Ем9тТА на грам ксилану; - Суміш В: 6 мг Тгісподегта геезвеї ХупЗ3; 1 мг Ем430; З мг ЕмазА; З мг Ем4ЗВ на грам ксилану; - Суміш С: 6 мг ГПісподепта геезеї Хуп3; З мг ЕмЗА; 1 мг ЕмаЗ30р; 1 мг Ем51А на грам ксилану.
У цьому експерименті певні набори геміцелюлаз давали злегка менше мономерного цукру,
Зо ніж спостерігали в більш ранніх експериментах, які включали в себе активності для солюбілізації целюлози. Ці виходи були все ще більшими, ніж виходи, спостережувані з додаванням тільки ендоксиланази до препаратів цільної целюлази. Геміцелюлазні активності є ефективними в перетворенні ксилану в мономер.
Той же самий набір сумішей використовували на геміцелюлозних препаратах, одержаних з серцевини кукурудзяного качана, загальної біомаси із зерна сорго, проса прутоподібного і багаси цукрової тростини з використанням процедур, наведених в загальних способах відповідно до прикладу 1. Готували вихідні суспензії кожного геміцелюлозного препарату при 100 мг/мл в 50 мМ натрійацетатному буфері, рН 5,0, і рН перевіряли. Кожну з них розбавляли до 10 мг препарату на мл додатковою кількістю 50 мМ ацетатного буфера. Аліквоти кожної ферментної суміші додавали до 100 мкл з суспензії 10 мг/мл і реакції проводили в двох повторностях, інкубували при 48"С протягом б год. з перемішуванням. Реакційні суміші розбавляли 100 мкл води, центрифугували і фільтрували перед ВЕРХ-аналізом на мономерні цукри, як описано в прикладі 1. 200 мкл кожної геміцелюлозної суспензії розбавляли 200 мкл
О,вн Нг5О», автоклавували при 1217С протягом 30 хв. на рідкому циклі, потім фільтрували і цукри аналізували за допомогою ВЕРХ, як описано в прикладі 1. Результати, показані в таблиці 10, повідомляються у вигляді середнього мономерного цукру, вивільненого ферментною сумішшю, у вигляді процента гідролізованого кислотою цукру, присутнього в цій реакції.
Суміші А і С працювали добре на геміцелюлозі з серцевини кукурудзяного качана і, як видно, в інших експериментах на цільному попередньо обробленому кукурудзяному качані.
Суміші, що містять ЕмЗА, збільшують перетворення арабінози в мономер і дають деяку перевагу в перетворенні ксилози в мономер. Всі З суміші працюють добре на геміцелюлозі, очищеній від інших однодольних рослин. Змішування однієї ендоксиланази, або однієї або двох
В-ксилозидаз, одна з яких має субстратну специфічність вище двох або трьох ксилозних одиниць, зв'язаних ДВ-1-ж54, і І-а-арабінофуранозидази приводить до ефективної геміцелюлазної суміші проти геміцелюлози однодольних рослин. 15. ПРИКЛАД 9: КОНСТРУЮВАННЯ ІНТЕГРОВАНОГО ЕКСПРЕСУЮЧОГО ШТАМУ
ТВІСНОРЕВМА РЕЕ5ЕЇ
Конструювали інтегрований експресуючий штам Тгісподегта геезеї, який коекспресував п'ять генів: ген В-ксилозидази роді! Т. геезеї, ген ендоксиланази хуп3 Т. геезеї, ген Д-
ксилозидази УЗА ЕЕ. мепісіПШоіїдеє5, ген В-ксилозидази 1430 Р. мегісШоїдеб5 і ген а- арабінофуранозидази МТА Р. мепісіПоідев.
Конструювання цих експресійних касет для цих різних генів і трансформація штаму Т. геезеї описані нижче. 15.1. Конструювання експресійної касети ВД-глюкозидази
М-кінцеву частину нативного гена В-глюкозидази Бдії Т. геезеї оптимізували відносно кодонів з використанням ДНК 2.0 (Мепіо РагК, О5А). Ця синтезована частина містила перші 447 основ кодуючого району. Цей фрагмент ПЛР-ампліфікували з використанням праймерів ЗКУО43 і
ЗКО41. Інший район нативного гена ро! ПЛР-ампліфікували з проби геномної ДНК, екстрагованої зі штаму НІ-РЗ7 Т. геезеїі, з використанням праймерів 5КУ40 і 5КО42. Ці два
ПЛР-фрагменти зливали разом в ПЛР-реакції злиття з використанням праймерів 5КО943 і
ЗКО42.
Прямий праймер 5КО43: (Ї-САССАТаАДаАТАТАЧАаАСАСаСтТассаст-3) (5ЕО ІО МО:88),
Зворотний праймер 5КО941: (5-СсчАсСсасостасаалатота,ассосалатастосСасСадсСАа-з3) (5ЕО ІО МО:89),
Прямий праймер 5КО40: (5Б-СТатсаСаааАСсСАСстасасСААдаАстоСсасаасасоаатооа-3) (ЗЕО І МО:90),
Зворотний праймер 5КО42: (5-ССТАСастАССаАСАсаАдаИата-з3) (5ЕО ІО МО:91).
Ці одержані злиті ПЛР;-фрагменти клонували в Сагежау? Епігу вектор РЕМТА М/9О-ТОРО-? ї трансформували в хімічно компетентні клітини Е. сої Опе ЗпоЇ? ТОРІ10 (Іпмйгодеп) з одержанням проміжного вектора, рЕМТКУ-943/942 (фіг. 39). Визначали нуклеотидну послідовність інсертованої ДНК. Цей вектор РЕМТКУ-943/942 з правильною послідовністю Ба рекомбінували з рТтехЗд з використанням протоколу реакції І К СіІопазе?-, описаного Іпмігодеп.
Цю реакційну суміш І К клонази трансформували в хімічно компетентні клітини Е. соїї Опе Зпоїо
ТОРІ0 (Іпийгодеп) з одержанням кінцевого експресуючого вектора, рТгехЗд 943/942 (фіг. 40).
Цей вектор містить також ген атаз АзрегойШив5 підшапв5, що кодує ацетамідазу, як селектований маркер для трансформації Т. геезеїі. Цю експресійну касету ПЛР-ампліфікували з праймерами
Зо ЗК745 і 5К771 для генерування продукту для трансформації цього штаму з використанням способу електропорації, описаного в МО 08153712.
Прямий праймер 5К771: (3-Я4ТСТАСАСТапСАААСасААС-З) (5ЕО ІО МО:94),
Зворотний праймер 5К745: (3-С( ДИ т ТатаАдАатСОастААТОС-3") (ЗЕО ІЮ МО:95). 15.2. Конструювання експресійної касети ендоксиланази
Нативний ген ендоксиланази хуп3 Т. геезхеі ПЛР-ампліфікували з проби геномної ДНК, екстрагованої з Т. геезві, з використанням праймерів хупз3Е-2 і хуп3К-2.
Прямий праймер хупЗв-2: (5-САССАТИАААаСАААСаТтСАттаИатасстостас-3) (5ЕО І МО:94),
Зворотний праймер (хуп3В-2): (5-СТАТТаТААСАТаССААСААТаСсТта,атТАТАТИаССЯИаСТТОасаИа-3) (ЗЕО І МО:С95).
Ці одержані ПЛР-фрагменти клонували в Саїєемау? Епігу вектор, рРЕМТК"М/0О-ТОРО- ії трансформували в хімічно компетентні клітини Е. сої Опе пої? ТОРІ0 (Іпмігодеп) з одержанням проміжного вектора РЕМТЕ/Хуп3 (фіг. 41). Визначали нуклеотидну послідовність інсертованої ДНК. Цей вектор РЕМТЕК/Хуп3 з правильною послідовністю хуп3 рекомбінували з рТгтехЗд з використанням протоколу реакції ЕК СіІопазе?, описаного Іпмйгодеп. Цю реакційну суміш ГЕ клонази трансформували в хімічно компетентні клітини Е. сої Опе Зпої? ТОРІ1О0 (Іпмігодеп) з одержанням кінцевого експресуючого вектора, рТгехзд/Хуп3 (фіг. 42). Цей вектор містить також ген атаз АзрегойШив5 підшапв5, що кодує ацетамідазу, як селектований маркер для трансформації Т. геезеі. Цю експресійну касету ПЛР-ампліфікували з праймерами 5К745 і
ЗК822 для генерування продукту для трансформації цього штаму з використанням способу електропорації.
Прямий праймер 5К745: (5-СЧАИТтТатаАдАдатСаатААТОО-3) (ЗЕО І МО:96),
Зворотний праймер 5К822: (Б-САСИаддадаСассаАТТО-3) (ЗЕО 10 МО:97). 15.3. Конструювання експресійної касети ВД-ксилозидази ЕУЗА
Ген Д-ксилозидази ГУЗА РЕ. мепісПоідез5 ампліфікували з проби геномної ДНК Р. мегіісШоїідез з використанням праймерів МНІ124 і МНІ125.
Прямий праймер МНІ124: (У-САС ССА ТС Та ТСА АТО ТТ да-3) (З5ЕО ІЮ МО:98),
Зворотний праймер МНІ125: (5-ТТА Сас АСА СТІ асо ато та да-3) (ЗЕО І МО:99).
Ці одержані ПЛР-фрагменти клонували в Сайемжмау? Епігу вектор РЕМТЕ"М/Ю-ТОРО- ії бо трансформували в хімічно компетентні клітини Е. сої Опе пої ТОРІ10 (Іпмігодеп) з одержанням проміжного вектора РЕМТК-ЕмЗА (фіг. 43). Визначали нуклеотидну послідовність інсертованої ДНК. Цей вектор РЕМТКУ-РмУЗА з правильною послідовністю ГуЗА рекомбінували з рТгехба з використанням протоколу реакції Б СіІопазе?, описаного Іпмігодеп. Цю реакційну суміш ГК клонази трансформували в хімічно компетентні клітини Е. сої Опе 5пої? ТОРІ1О (Іпмігодеп) з одержанням кінцевого експресуючого вектора, рТгехба/ЕмзЗА (фіг. 44). Цей вектор містить також хлоримуронетилстійкий мутант природного гена ацетолактатсинтази (аїв) Т. геезеі ген, названий арбкК, який використовується разом з природним промотором і термінатором, як селектований маркер для трансформації Т. геезеї (ММО 2008/039370 А1). Цю експресійну касету ПЛР-ампліфікували з праймерами 5К1334, 5К1І335 і 5К1299 для генерування продукту для трансформації Т. геезеї з використанням способу електропорації.
Прямий праймер 5К1334: (5-СОСТ,аАдататАТСИататАда-з) (ЗЕО Ір МО:100),
Прямий праймер 5К1335: (/-ЯЙСААСпаСАААаССССАСТТО-3) (ЗЕО ІЮ МО: 101),
Зворотний праймер 5К1299: (5-СЧТтАасцпассасстСАТСТСАТСТСАТССАТСО-3") (5ЕО ІЮ
МО:102). 15.4. Конструювання експресійної касети ВД-ксилозидази Гм430
Для конструювання експресійної касети В-ксилозидази Ем430 Р. мепісіПоідез5 продукт гена їмаЗзО ампліфікували з геномної ДНК Р.мепісійоіїдез з використанням праймерів 5К1322 і
ЗК1297. Район промотору гена ендоглюканази єдії ПЛР-ампліфікували з геномної ДНК Т. геезеї, екстрагованої зі штаму ВІ-РЗ37, з використанням праймерів 5К1236 і 5К1321. Потім ці два ПЛР-ампліфікованих ДНК-фрагменти зливали разом в ПЛР-реакції злиття з використанням праймерів 5К1236 і 5К1297. Цей одержаний фрагмент ПЛР-злиття клонували у вектор рскК-
Вішпі ПІ-ТОРО (Іпийгодеп) з одержанням плазміди ТОРО Вішп//Редії!-Ем430 (фіг. 45) і хімічно компетентні клітини Е. соїї Опе 5пої? ТОРІ10 (Іпмийгодеп) трансформували з використанням цієї плазміди. Плазміду ДНК екстрагували з декількох клонів Е. соїї і підтверджували з використанням рестрикційного розщеплення.
Прямий праймер 5К1322: (Х-САССАТаСсАаТстосААаттстато-3) (5ЕО ІЮ МО:103),
Зворотний праймер 5К1297: (- СЧСЕТТАСТАаТСААСсТаСсСсСсОаттотатАасСсАса-3) (5ЕО Ір
МО:104),
Прямий праймер 5К1236: (5-САТассАтТосаСссАСсаттттастСАсатооа-3) (5ЕО І
Коо) МО:105),
Зворотний праймер ЗК1321: (5- вАСАСАААСТТаАл,аСстТасСсатаататаасАСААСААсАдаИс-3) (ЗЕО ІЮ МО:106).
Цю експресійну касету ПЛР-ампліфікували з ТОРО ВішпуРеді!ї-Рм430 з праймерами
ЗК1236 і 5К1297 для генерування продукту для трансформації Т. геезеії з використанням способу електропорації, описаного в УМО 2008153712А2. 15.5. Конструювання експресійної касети а-арабінофуранозидази
Для конструювання експресійної касети гена а-арабінофуранозидази МмО1А РЕ. мепісіПоїдев, продукт гена М51А ампліфікували з геномної ДНК РЕ. мепісйШоіде5 з використанням праймерів
ЗК1159 і 5К1289. Район промотору гена ендоглюканази едії ПЛР-ампліфікували з геномної
ДНК Т. геезеї, екстрагованої зі штаму ВІ-РЗ7, з використанням праймерів 5К1236 і 5К1262.
Потім ці два ПЛР-ампліфікованих ДНК-фрагменти зливали разом в ПЛР-реакції злиття з використанням праймерів 5К1236 і 5К1289. Цей одержаний фрагмент ПЛР-злиття клонували у вектор рСВ-Вішпі ПІ-ТОРО (Іпмігодеп) з одержанням плазміди ТОРО Віоп//Редії -Еме1А (фіг. 46) і хімічно компетентні клітини ЕЕ. сої Опе пої? ТОРІ0 (Іпмігодеп) трансформували з використанням цієї плазміди.
Прямий праймер 5К1159: (Б-САССАТАСТ СИС ТСАСТТСААТОСТАИ-3") (5ЕО ІЮ МО:107),
Зворотний праймер 5К1289: (Е-СЧТИаСТАСААСАТАТССААСАС-3) (ЗЕО ІЮ МО:108),
Прямий праймер 5К1236: (5-САТассАтТосаСссАСсаттттастСАсатооа-3) (5ЕО І
МО:109),
Зворотний праймер 5К1262: (Ї-СААСстТаАддасСсаААССАТОСТИа апп АСААСААдаААааАС- 3) (ЗЕО ІЮ МО:110).
Цю експресійну касету ПЛР-ампліфікували з праймерами 5К1298 і 5К1289 для генерування продукту для трансформації Т. геезеї з використанням способу електропорації.
Прямий праймер 5К1298: (5"-СТАИТТАТаСасСАТасСстТтАСАС-3) (5ЕО ІО МО:111),
Зворотний праймер 5К1289: (5"-ЯТайсСтТАпААпАТАТОССААСАС-З3) (5ЕО ІЮ МО-1 12). 15.6. Котрансформація Т. геезеї експресійними касетами р-глюкозидази і ендоксиланази
Мутантний штам Тгісподепта геезеі, одержаний з ВІ-РЗ7 (ЗПеї/-Меївє5 (Сх. еї аї. Аррі.
Містобріо!. ВіоїеснпоЇ. 1984, 20:46-53) і відібраний на високе продукування целюлази, котрансформували експресійною касетою р-глюкозидази (промотор СБП1, ген Д-глюкозидази 1 бо Т.геезеї, термінатор срп1 і маркер атаз) і експресійною касетою ендоксиланази (промотор ср рготоїег, ген хуп3 Т. геезеї і термінатор сбп1) з використанням ПЕГ-опосередкованої трансформації (Репца М. еї аІ. Сепе 1987, 61 (2):155-64). Численні трансформанти виділяли і випробовували на продукування В-глюкозидази і ендоксиланази. Один трансформант, названий штамом Мо 229 Т. геезеій, використовували для трансформації з іншими експресійними касетами. 15.7. Котрансформація штаму Мо 229 Т. геезеі двома експресійними касетами рД- ксилозидази і касетою а-арабінофуранозидази
Штам Мо 229 Т. геезеі котрансформували експресійною касетою ДВ-ксилозидази їМмЗА (промотор СБ, ген ТуЗА, термінатор срп1 і маркер аїі5К), експресійною касетою рД-ксилозидази їмазО (промотор едії, ген їм43О, природний термінатор їм43О0) і експресійною касетою а- арабінофуранозидази їУ51А (промотор еодії, ген їМ51А, природний термінатор 51А) з використанням електропорації. Трансформанти відбирали на чашках з агаром Фогеля, що містять хлоримуронетил (80 м.ч.). Агар Фогеля готували наступним чином, на літр: 5Ох вихідний розчин Фогеля (нижче) 20 мл
ВВІ агар 20 г деіїонізованою НгО довести (постстерильно) до 980 мл 5095 глюкоза 20 мл. 50х вихідний розчин Фогеля (ММО 2005/001036), на літр: у 750 мл деіонізованої води розчинити послідовно:
Мазцитратх2НгО 125,00 г
КНеРО» (безводний) 250,00 г
МНАМО: (безводний) 100 г
МаЗО:хХх ТНгО 10,00 г
СасСігх2НгО 5,00 г розчин мікроелементів Фогеля 5,0 мл розчин біотину Фогеля 2,5 мл деіонізованою водою довести до Тл.
Численні трансформанти виділяли і випробовували на продукування р-ксилозидази і 1 -а- арабінофуранозидази. Трансформанти піддавали також скринінгу на продуктивність перетворення біомаси відповідно до аналізу оцукрювання серцевини кукурудзяного качана, описаного в прикладі 1. Прикладами Т. геезеі-інтегрованих експресійних штамів, описаних тут,
Є НЗА, 39А, АТОА, 11А ї С9А, які експресують всі з генів ВД-глюкозидази 1 Т. геезеї, Хуп3, ЕмЗА,
Ем51А і Рм430О Т. геезеії при різних співвідношеннях (таблиця 11). Приклади інтегрованих експресійних штамів Т. геезеї, описаних тут, включають в себе також 44А, 69А, СОбА і 102, і кожний включає в себе більшість генів для Д-глюкозидази 1 Т. геезеї, ХУМ3З, ЕмЗА, ЕмеТА і
Ем4а30О ТТ. тгеезеі, експресованих при різних співвідношеннях. Штам 44А позбавлений надекспресованого Т. геезеі ХУМЗ3; штам 69А позбавлений Ем51А (підтверджено Вестерн- блотингом, не показано); штами СбА і 102 позбавлені ЕуЗА (таблиця 11), як визначено ВЕРХ- аналізом білка (приклад 1). 16. ПРИКЛАД 10: ПРОДУКТИВНІСТЬ ОЦУКРЮВАННЯ ІНТЕГРОВАНИМИ
ЕКСПРЕСІЙНИМИ ШТАМАМИ т. РЕЕБЗЕЇ НА ПОПЕРЕДНЬО ОБРОБЛЕНІЙ АМІАКОМ
Зо СЕРЦЕВИНІ КУКУРУДЗЯНОГО КАЧАНА
Оцінювали продуктивність оцукрювання ферментними композиціями, продукованими інтегрованими експресійними штамами Т. геезеї, на попередньо обробленій розбавленим аміаком серцевині кукурудзяного качана. Ферментні проби Т. геезеї генерували у вигляді або ультрафільтраційних концентратів (ШЕС), або іншого концентрату. Для генерування ЕС, ферментаційні бульйони Т. геезеї (в масштабі 14 літрів) одержували після відділення клітин центрифугуванням, концентрували з використанням мембранної ультрафільтрації через мембрану Мійроге з межею молекулярної маси 10 кДа. Потім рН доводили до 4,8. Потім відділений від клітин бульйон поліпшували фільтруванням з використанням ЕМУбЄ Висппег- фільтрації. Кожну ферментну пробу аналізували на концентрацію загального білка з використанням модифікованого Біуретового способу.
Продуктивність оцукрювання оцінювали у флаконах або у струшуваних колбах. Кожний препарат ферменту аналізували на продуктивність оцукрювання на 2095 навантаженні сухої речовини (05) попередньо обробленій розбавленим аміаком серцевині кукурудзяного качана (дивіться МО 2006/110901). Потім всі реакційні суміші для оцукрювання титрували сірчаною кислотою до рН 5,0 і додавали азид натрію до кінцевої концентрації 0,0195 (мас./об.), для контролю мікробного забруднення. Потім в кожну реакційну суміш оцукрювання вносили дозу 20 мг загального білка (ТР) ферментного препарату на г субстрату глюкану або ксилану, у міру необхідності. АссеПегазе? 1500 (Ас1500) і інтегрований штам ОЕС вводили при 20 мг загального білка на грам глюкану. Ферментну суміш готували в співвідношенні 25:9:4:3:1 АссеїІегазе? 1500:Хуп3:РмЗА:сЕм51АЕМ430. У цій суміші АссеПегазе? 1500 вводили при 20 мг загального білка на грам глюкану і геміцелюлази вводили на г ксилану (4,3 мг Хуп3З/г ксилану, 1,7 мг ЕмЗА/г ксилану, 1,4 мг Ем51А/г ксилану, 0,5 мг Ем430О/г ксилану). Кожну реакцію оцукрювання інкубували при 507С в ротаційному шейкері, встановленому на 200 об./хв., потім брали проби і розбавляли в 10 разів (06б./06.) перед визначенням концентрації мономерного цукру з використанням ВЕРХ-аналізу (детально описаного в розділі 16.1 нижче в підрозділі "мономерний ВЕРХ-аналіз") після 1, 2, З ії 7 днів оцукрювання (фіг. 47А, 478). У день З оцукрювання з кожної реакції брали також проби по масі (мас./мас-) для ВЕРХ-аналізу концентрації олігомерних цукрів (розділ 16.1, фіг. 47С). Ці результати показують, що ферментні композиції, продуковані інтегрованими штамами НЗА і С9А, забезпечують кращі виходи глюкози і ксилози, ніж АссеїІегазе? 1500 або ферментні суміші, утворені з індивідуально експресованих ферментів.
Хроматографічне порівняння ферментних композицій, продукованих трьома різними інтегрованими штамами, показане на фіг. 470. 16.1. ВЕРХ-аналіз
ВЕРХ-аналіз мономерних цукрів: Кожну пробу аналізували за допомогою ВЕРХ з використанням іоновиключної колонки Віокай Атіпех НРХ-87Н (300х7,8 мм). Всі проби дня 1, 2,
З ї 7 розбавляли в 10 разів по об'єму 5 мМ сірчаною кислотою, фільтрували через фільтр 0,2 мкм перед інжекцією в ВЕРХ і розділяли відповідно до опису виготовлювача.
ВЕРХ-аналіз олігомерних цукрів (кислотний гідроліз): Проби оцукрювання дня З розбавляли в 10 разів по масі водою Міїйї-С), потім додавали сірчану кислоту до кінцевої концентрації 490 (мас./мас.). Готували також стандарт ксилози і глюкози (стандарт витягання цукру - "ЗН5") відомої концентрації і вимірювали для ВЕРХ-аналізу мономерних цукрів, як вказувалося вище, і
ВЕРХ-аналізу для олігомерних цукрів. Потім олігомерні ВЕРХ-проби автоклавували при 1217С протягом 15 хв. і фільтрували через фільтр 0,2 мкм перед інжекцією в іоновиключну колонку
ВЕРХ ВіоВай Атіпех НРХ-87Н (300х7,8 мм) і розділяли відповідно до опису виготовлювача.
Концентрацію олігомерного цукру визначали множенням процентної концентрації утриманої ксилози і глюкози стандарту витягання цукрів (ЗК5) після кислотного гідролізу на ВЕРХ-
Зо концентрації цукрів після кислотного гідролізу кожної проби, з відніманням потім концентрації мономерних цукрів, визначених в розділі "ВЕРХ-аналіз мономерних цукрів" вище. 17. ПРИКЛАД 11: ІДЕНТИФІКАЦІЯ ФІЛОГЕНЕТИЧНО ШИРОКИХ КЛАСІВ ФЕРМЕНТІВ, ЯКІ
МОЖУТЬ ПОЛІПШУВАТИ ПРОДУКТИВНІСТЬ ОЦУКРЮВАННЯ ІНТЕГРОВАНОГО
ЕКСПРЕСІЙНОГО ШТАМУ Т. РЕЕ5ЕЇ
У цьому прикладі ідентифікували ферментну активність, яка обмежує ефективність ферментних композицій, продукованих інтегрованим експресійним штамом Т. геезеї, і наводяться як приклади ферменти з різних видів, які можуть компенсувати цю обмежуючу активність або які могли б замінювати компоненти інтегрованих штамів. 0,95 г попередньо обробленої серцевини кукурудзяного качана, як описано в прикладі 1, додавали в скляні флакони на 20 мл. Достатню кількість 50 мМ натрійацетатного буфера, рн 5,0, і їТн Не50Ох додавали з одержанням загальної маси реакційної суміші 3,00 г при 22 г сухих речовин/100 г загальної суспензії, рН 5,0 після додавань ферментів. Ферментну композицію Т. геезеі, продуковану інтегрованим штамом НЗА (фіг. 48А, 49А і 50А) додавали у вигляді ультрафільтрованого (тобто безклітинного) концентрату до 7 мг загального білка на г глюкану і ксилану, об'єднаних у вихідному матеріалі у всіх флаконах. Крім того, кандидатні геміцелюлази додавали у вигляді ультрафільтрованих препаратів з 14-літрових ферментаційних культур, експресованих штамом Т. геезеії Оцай деїєїє (описаним в УМО 05/001036). Ці кандидатні геміцелюлози додавали при 0, 0,5, 1,0 або 3,0 мг ферментного білка на г об'єднаних глюкану і ксилану. Геміцелюлази включають в себе компоненти ферментної композиції, продукованої самим інтегрованим штамом, в тому числі: - ЕМЗА Ризагтіит мепісіПНоідев, - ЕМА1А Ризатійт мепісПіоідев, - Емазо Ризатлит мепісіПоідев.
А також ферменти з різних грибів: - Ео43А Ризапит охузрогит, - С24ЗА сіррегеїа 7єавє, - РІАЗА Репісйіит Типісшовит, - АТАЗА Аз5регайиз Титідацив, - РабТА Родозрога апзегіпа, бо - РЕА Репісйіит Типісшовит.
Ці флакони інкубували при 180 об./хв. в орбітальному шейкері при 48"С протягом 72 годин.
Потім додавали 12 мл води. Брали субпробу і додатково розбавляли, центрифугували і фільтрували для ВЕРХ-аналізу на мономерні цукри, як описано в прикладі 1.
Результати, показані на фіг. 48А і 488, демонструють, що додавання р-ксилозидазних активностей, таких як Ем430О0 Ризагішт мепісШоіде5 і Бо43А Ризагішт охузрогит, помітно поліпшувало вивільнення мономерної ксилози відносно 7 мг загального білка на г об'єднаних глюкану і ксилану інтегрованого штаму Т. геезеїі. Значущі поліпшення спостерігали навіть при низьких додаваннях 0,5 і 1,0 мг/г.
Результати, показані на фіг. 49А і 498, демонструють, що додавання всіх з цих геміцелюлаз приводить до значущого збільшення мономерної глюкози, навіть »1095 при навантаженнях геміцелюлази 1-3 мг на г об'єднаних глюкану і ксилану.
Результати, показані на фіг. 50А і 508, демонструють, що додавання ферментів СН51, таких як Ем5Т1А Ризагішт мепісШоїде5, і особливо Раб5т1А Родозрога апзегіпе і РІшБ51А Репісійшт
Типісшовзит, приводили до збільшення рівня мономерної арабінози. 185. ПРИКЛАД 12: ОЦУКРЮВАННЯ ПО-РІЗНОМУ ПЕРЕДОБРОБЛЕНОГО ПРОСА
ПРУТОПОДІБНОГО ПРЕПАРАТАМИ ЦЕЛЮЛОЗИ І ГЕМІЦЕЛЮЛОЗИ
Оцінювали продуктивність оцукрювання експресованих целюлаз і геміцелюлаз на попередньо обробленому сирому просі прутоподібному. Діапазон умов для попередньої обробки розбавленим аміаком проса прутоподібного оцінювали на продуктивність оцукрювання з коктейлем (сумішшю) ферментів, складеним з описаних тут ферментів. Умови попередньої обробки варіюються і ефективність попередньої обробки впливає на продуктивність ферментативного гідролізу.
Попередню обробку сирого проса прутоподібного виконували в герметизованих 6"х1/2" пробірках з нержавіючої сталі, які занурювали в нагріту пісочну баню. Суспензію сирого проса прутоподібного, води і гідроксиду амонію (2895 розчин) змішували з бажаними процентом сухих речовин і процентом аміаку і потім завантажували в попередньо оброблену пробірку.
Потім пробірки витримували при бажаній температурі (4/-27"С) протягом бажаного часу і потім гасили на суміші води з льодом протягом приблизно 1 хв. перед переміщенням в умови кімнатної температури. Цю попередньо оброблену суспензію витягували з цих пробірок і давали
Зо їй висихати протягом ночі в ламінарному боксі (з одержанням х»9095 сухих речовин).
Потім висушені попередньо оброблені сухі речовини оцукрювали при 1095 сухих речовин, рН 5, 502С, 200 об./хв. з використанням АссеїІегазе? 1500, Хуп3, ЕмЗА, ЕмО1А і Ем430 (25, 9, 7, 3, 1 мг загального білка/г глюкану або ксилану, відповідно). Використовували 5 мл загального об'єму гідролізату в сцинтиляційних флаконах на 20 мл.
Виходи сглюкану і ксилану розраховували на мономерні глюкозу і ксилозу, що вивільняються в порівнянні з глюканом або ксиланом, з сирої біомаси. Концентрації мономерних цукрів вимірювали за допомогою ВЕРХ (з колонкою ВіоКай Атіпех НРХ 87-Н).
Час попередньої обробки, процент сухих речовин і процент МНз варіювали протягом широкого діапазону для оптимізації результатів оцукрювання. Кожну умову попередньої обробки, яка мала виходи як глюкану, так і ксилану більші, ніж 5095, розглядали як сильний фактор продуктивності. Параметри попередньої обробки, які були сильними факторами продуктивності, перераховані в таблиці 12 разом з їх відповідними процентними виходами глюкану, ксилану і загальними виходами. Перетворення глюкану і ксилану розраховані на мономерні цукри, вивільнювані під час оцукрювання в порівнянні з гліканом або ксиланом, теоретично доступними в цьому сирому просі прутоподібному. Загальне перетворення стосується тільки глюкози і ксилози (фіг. 51). 19. ПРИКЛАД 13: ОЦУКРЮВАННЯ ПОПЕРЕДНЬО ОБРОБЛЕНОГО ПРОСА
ПРУТОПОДІБНОГО ПРЕПАРАТАМИ ЦЕЛЮЛАЗИ І ГЕМІЦЕЛЮЛАЗИ
Крім наведених вище прикладів, продуктивність оцукрювання ферментних сумішей і ферментних композицій, що надається інтегрованим штамом, тестували на декількох субстратах, попередніх обробках і умовах. Ці експерименти показують діапазон продуктивності з використанням ферментної суміші або продукту інтегрованого штаму. Вони демонструють хорошу продуктивність у всьому діапазоні субстратів і попередніх обробок, рН і температурах.
Попередньо оброблене аміаком просо прутоподібне одержували згідно зі способами і діапазонами процесу в УМО 061109014А: просо прутоподібне (38,79о глюкан, 22295 ксилан, 2,590 арабінан, 23,295 лігнін) подрібнювали дробильним молотком для пропускання через сито 1 мм, потім попередньо обробляли при 160"С протягом 90 хв. 695 МНз (мас./мас. ОМ, що додається у вигляді МНАОН). Цей попередньо оброблений субстрат обробляли ферментними сумішами, що містять АссеїІегазе? 1500, Мийтесі? Ксиланазу (обидва є комерційними продуктами Вапізсо А/5, 60 Сепепсог Оімізіоп, Раїо Айо, СА), ЕМЗА, Еме1А і Ем430 в загальній реакційній масі 50 г при 1595 сухих речовин. Загальний білок (ТР) цих комерційних продуктів визначали Біуретовим аналізом.
Інші ферменти були концентратами ультрафільтрацій (ОЕС) після експресії в штамах Т. геезеї з 4 делетованими целюлазами (сеїЇїшШазе диад-аеЇе(ед), з ТР, що визначається аналізом загального білка ТСА-осаджуваного білка. У всі реакційні суміші вводили Ассеїегазе? 1500 при 25 мг ТР/г глюкану і Мийтесі? Ксиланазу (МЕ ХУ) при 9 мг ТР/г ксилану, і ЕмЗА, ЕмО1А і Ем430 вводили, як указано на фіг. 56А, 568, при 3,6 мг ТР/г ксилану, 3,0 мг ТР/г ксилану і 1,0 мг ТР/г ксилану, відповідно. Всі ферменти вводили співвідносно з вихідним вмістом вуглеводів проса прутоподібного перед попередньою обробкою. Реакції оцукрювання проводили при 47С і 337С при рН 5,3 протягом трьох днів.
Результати при 33"С показали, що додавання ЕмЗА, Ем51А і ЕРм430О0 збільшувало перетворення глюкану (фіг. 56А) і більше ніж подвоювало перетворення ксилану (фіг. 56В).
Результати при 47"С показували, що додавання Ем3ЗА, Ем51А і Ем430О0 давало декілька збільшене перетворення глюкану (фіг. 56А) і більше ніж подвоювало перетворення ксилану (фіг. 568). Додавання Ем51А або Ем430, по окремості, давало великі збільшення перетворення ксилану, особливо ксилоолігомерів або мономерів ксилози, відповідно. Додавання одного ЕуУЗА збільшувало виходи ксилози, але в комбінації з Ем51А давало велике збільшення перетворення ксилану в мономер. 20. ПРИКЛАД 14: ОЦУКРЮВАННЯ ПОПЕРЕДНЬО ОБРОБЛЕНОГО ПРОСА
ПРУТОПОДІБНОГО ІНТЕГРОВАНИМ ШТАМОМ Т. КЕЕЗЕЇ
Продуктивність оцукрювання ферментної композиції, продукованої інтегрованим штамом Т. геезеі (НЗА), оцінювали на обробленому розбавленим аміаком просі прутоподібному, приготованому згідно зі способами і діапазонами процесу в М/О 06110901А: глюкан проса прутоподібного (3795 глюкан, 2195 ксилан, 595 арабінан, 1895 лігнін) подрібнювали дробильним молотком для пропускання через сито 1 мм, потім попередньо обробляли при 1607С протягом 90 хв. 10,095 МНз (мас./мас. ОМ, що додається у вигляді МНАОН). У двох повторностях, в колбах
Ерленмейєра на 500 мл, 50 г попередньо обробленої суспензії при 2595 сухих речовин оцукрювали при 48"С, рН 5,3, протягом 7 днів супернатантом з інтегрованого штаму, що вводиться при 14 мг ТР/г вуглеводу (глюканксилан). ТР НЗА визначали аналізом загального азоту ТСА-осадженого білка. Ферменти вводили співвідносно з вихідними вмістами вуглеводів
Зо проса прутоподібного перед попередньою обробкою.
У кінці 7 днів високі рівні перетворення глюкану (52-5595, фіг. 57А) і ксилану (51-5390, фіг. 578) вимірювали за допомогою ВЕРХ. Ці результати показують, що ферментна композиція, продукована цим інтегрованим штамом, може оцукрювати оброблене розбавленим аміаком просо прутоподібне при високому вмісті сухого залишку (2595 сухих речовин). 21. ПРИКЛАД 15: ОЦУКРЮВАННЯ ЦЕЛЮЛОЗИ ТВЕРДОЇ ДЕРЕВИНИ ІНТЕГРОВАНИМ
ШТАМОМ Т. КЕЕЗЕЇ
Продуктивність оцукрювання ферментної композиції, продукованої інтегрованим штамом
НЗА Т. геезеї, оцінювали на промисловій небіленій целюлозі твердої деревини (що одержана з крафт-процесу і кисневої делігніфікації, тий Карра Сеїїшозе би Ріп, Відапо5, Егапсе) з наступним складом: глюкан 75,195, ксилан 19,195, кислоторозчинний лігнін 2,295. Дослідження ферментативного оцукрювання проводили з використанням МКЕЇ стандартного способу аналізу "ГАР-009 Епгутаїййс зЗассНагіісайоп Годі Папосеїішіовіс Віотавв5" (пер:/Лумли. пгеїЇ.дом/ріота»вв/рагв5/42629. раї), за винятком того, що завантаження целюлози було відмінним (що варіює від 9,3 до 2095) і використовували загальну масу 100 г.
Експериментальними умовами були 200 об./хв. і рН 5,0, 50"С. Фермент вводили при 20 мг ТР/г глюкану (з розрахунку на кінцевий сухий залишок) на початку цього експерименту. Проби брали при певних інтервалах часу, якщо вони були розрідженими, і потім аналізували за допомогою
ВЕРХ на концентрацію цукру. Концентрацію глюкози, ксилози і целобіози визначали з використанням системи УМаїег5 НРІС (АШапсе зузіет, УМаїєтз Согр., Мінога, МА).
Використовуваною колонкою ВЕРХ для аналізу цукрів була колонка з Віовбвайд (іоновиключна колонка Атіпех НРХ-87Н (300х7,8 мм), ВіоКаа Іпс., Негсціе5, СА). Всі проби розбавляли в 10 разів 5 мМ сірчаною кислотою, фільтрували через фільтр 0,2 мкм перед інжекцією в ВЕРХ. Як показано (таблиця 13), два експерименти проводили в "режимі з підживленням": попередньо оброблену целюлозу твердої деревини до початкового вмісту сухих речовин 7,095 при часі 0 і інший субстрат додавали в дискретних часових точках в чотирьох рівних порціях під час перших 24 годин з одержанням кінцевого завантаження сухих речовин до 2095.
Результати показали високі рівні перетворення глюкану і ксилану в мономери (до 8995 і 9095, відповідно) з ферментною композицією, продукованою інтегрованим штамом НЗА.
Перетворення збільшувалися з більш високими завантаженнями ферментів і більш тривалими бо періодами часу оцукрювання. Перетворення було більш низьким при вмісті сухих речовин 2095,
ніж при 1595, але це більш низьке перетворення при 2095 могло бути частково зменшене з використанням процесу з підживленням. 22. ПРИКЛАД 16: ОЦУКРЮВАННЯ ЦЕЛЮЛОЗИ ТВЕРДОЇ ДЕРЕВИНИ ІНТЕГРОВАНИМ
ШТАМОМ Т. КЕЕЗЕЇ НА ПРОТЯЗІ ДІАПАЗОНУ ТЕМПЕРАТУРИ І рн
Продуктивність оцукрювання ферментної композиції, продукованої інтегрованим штамом Т. геезеі (НЗА), на промисловій небіленій целюлозі твердої деревини (використовуваній в попередньому прикладі) при 795 целозному завантаженні і 20 мг ТР/г глюкану супернатанту інтегрованого штаму (на основі кінцевого сухого залишку і композиції попередньо обробленого субстрату) тестували при температурах від 45 до 60"С і рН від 4,65 до 5,4 (з 01 М цитратом натрію як буфером). Результати після 2 днів оцукрювання показані в таблиці 14 і показують хороші перетворення глюкану і ксилану на протязі всього діапазону тестованих умов. Ці результати передбачають оптимальні умови для оцукрювання цього субстрату з рН 4,9 ї 50"С, але хороші перетворення спостерігали навіть при рН 5,0 ії 60"С. У подальшому експерименті при 50"С, що включає в себе більш низькі рН (і в іншому незмінені експериментальні умови), хороші оцукрювання спостерігали при рН 3,8, рН 4,0 і рН 4,25, з титрами глюкози і ксилози 45,1 і 9,7 г/л; 50,0111,4 г/лі 57,2 і 13,2 г/л, відповідно. 23. ПРИКЛАД 17: ОЦУКРЮВАННЯ РОЗШИРЕНОЇ ПАРОЮ БАГАСИ (ЖОМУ) ЦУКРОВОЇ
ТРОСТИНИ ФЕРМЕНТНОЮ КОМПОЗИЦІЄЮ, ПРОДУКОВАНОЮ ІНТЕГРОВАНИМ ШТАМОМ,
ПРИ РІЗНИХ ДОЗАХ ФЕРМЕНТІВ
Продуктивність оцукрювання ферментної композиції, продукованої інтегрованим штамом
Тгісподегта геезеї (НЗА), на розширеній парою багасі (жомі) цукрової тростини оцінювали при 795 завантаженні целюлози. Багасу попередньо обробляли інжекцією пари в реакторі ЗіаКкеТесп при надмірному тиску, що дорівнює 210 фунтів на квадратний дюйм (210х6894,757 Па), 20072 з часом знаходження в реакторі 4 хв. Попередньо оброблений матеріал мав наступний склад: глюкан 40,99», ксилан 20,895, лігнін 2795. Супернатант інтегрованого штаму вводили в дозах 10, 20,30, 50 або 80 мг ТР/г глюкану (з розрахунку на кінцевий сухий залишок і композицію попередньо обробленого субстрату). Оцукрювання проводили в об'ємі реакції 5 мл при 50"С, рН 5, протягом З днів. Ці результати (фіг. 58А-С) показали, що продукт інтегрованого штаму, перевершував в продуктивності АссеїПегазе? 1500 (20 мг білка/г глюкану) в перетворенні
Зо глюкану в глюкозу (фіг. 58А і 580) і, особливо, перетворенні ксилану в ксилозу (фіг. 588 і 5850), навіть при половині цієї дози АссеПегазе? 1500. Перетворення глюкану, зокрема, в день 1, збільшувалося значущо у міру збільшення дози загального білка НЗА (фіг. 584А і 585), в той час як перетворення ксилану було більш швидким, з невеликим збільшенням з дня 1 до дня 3,ї дуже високим, навіть при найнижчій дозі загального білка НЗА (фіг. 588 і 5850). 24. ПРИКЛАД 18: ОЦУКРЮВАННЯ ПОПЕРЕДНЬО ОБРОБЛЕНОГО РОЗБАВЛЕНОЮ
КИСЛОТОЮ КУКУРУДЗЯНОГО ВОЛОКНА РІЗНИМИ ФЕРМЕНТАМИ
Продуктивність оцукрювання ферментних сумішей на попередньо обробленому розбавленому сірчаною кислотою кукурудзяному волокні оцінювали у струшуваній колбі на 250 мкл. У типовому експерименті кукурудзяне волокно (початковий склад 3895 Сб-цукрів і 2795 С5- цукрів) доводили до 1595 Ю5 (сухих речовин) і додавали 0,369о (мас./мас. 90) сірчану кислоту.
Потім суспензію кукурудзяного волокна автоклавували при 1217С протягом 60 хв. Потім цю суспензію доводили до рН 5,0 з використанням бн МаОН. Вміст цукру цієї попередньо обробленої проби був 21 г/л глюкози і 12 г/л ксилози. До цього попередньо обробленого субстрату додавали ферменти таким чином (як показано на фіг. 59А, 598, 59С); АссеПегахе? 1500 (АС 1500): 20 мг ТР/г глюкану і 45 мг ТР/г глюкану; АссеПегазе? 1500 - Мийтесі? Ксиланаза (МЕ): 25 мг/г глюкану -- 9 мг ТР/г ксилану і 25 мг ТР/г глюкану -- 20 мг ТР/г ксилану; АссеІегазе? 1500 - Хуп З - ЕМЗА - ЕмБОтТА - Гм430: 25 мг ТР/г глюкану - 9 мг ТР/г ксилану -- 7 мг ТР/г ксилану - З мг ТР/г ксилану -- 1 мг ТР/г ксилану (повна "суміш" ферментів). Загальний білок (ТР) комерційних продуктів (АссеїПегазе? 1500 і Мийтесі? Ксиланаза: Оапізсо 05 Іпс., Сепепсоїг) визначали Біуретовим аналізом. Інші ферменти були концентратами ультрафільтрації (ШЕС) після експресії в штамах Т. геезеі з 4 делетованими целюлазами (сеїШавзе диаа-аеїетеа) (описаними раніше) - їх ТР визначали аналізом загального азоту ТСА-осаджуваного білка. Всі ферменти вводили співвідносно з початковими вмістами вуглеводів кукурудзяного волокна перед попередньою обробкою. Ферментативне оцукрювання проводили при 200 об./хв. і 507С протягом 24 год., 48 год. і 120 год. Проби брали при різних часових інтервалах і аналізували на утворення глюкозних і ксилозних цукрів за допомогою ВЕРХ. Коректований цукор (глюкоза або ксилоза) відображав цукор, продукований з ферментативної стадії, з віднятими вихідними цукрами.
Ці результати показують, що ця повна ферментна суміш перевершувала в продуктивності 60 АссеїйЙПегазе? 1500-Мийтесі? Хуїапазе ("АС 1500-МЕ") в перетворенні глюкану і в перетворенні ксилану, навіть при введенні обох при одному і тому ж загальному білку. Ця повна ферментна суміш здійснювала майже повне перетворення глюкану цього субстрату після 5 днів оцукрювання. 25. КОНКРЕТНІ ВАРІАНТИ ЗДІЙСНЕННЯ І ВКЛЮЧЕННЯ ЗА ДОПОМОГОЮ ПОСИЛАНЬ
Всі публікації, патенти, заявки на патент і інші документи, цитовані в цій заявці, є тим самим включеними за допомогою посилання в їх повному обсязі для всіх цілей в тій же мірі, як якби кожна окрема публікація, патент, заявка на патент або інший документ були б по окремості вказані як такі, що є включеними за допомогою посилання для всіх цілей.
Хоч різні конкретні варіанти здійснення були ілюстровані і описані, повинно бути зрозуміло, що можуть бути зроблені різні зміни без відхилення від суті і обсягу цього опису (цих описів).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«Із» бапівсо ОБ ОоЇйс.
Вомех, Венпіаштівй
Нв, Мезуві Тев
Карек, ТВіл1з
Ккеїсюви, Бтайіву В.
Балі, бимагизє св. галєпаз, Каншемеа д.
МмігшвВівнот, пОБЕл
Жіть Зсаоов
Настю ЩІ лан о,
Ерос, Мах.
Чіпа» Кейї Оптопе «104 Чоні гніказиднінювопазні ферменти ї їх заптосування «доз» З1З7еБит «14й-е ротловопІісИбленяВ «їі» 2010-03-92 «іа» нз бБіууа52 «іі» 2005-09-93 «1505 5 51/сНЗЯНЬ «їі» 2008-15-43 «102 «ух Бакеокїц теквізи 3,3 «10 1 «Зі Ва5В «12» ДНЕ «125 Ецзагьии хехтістіііскев «00» 1 апосісостса апостсацає састуссао десстесезо брбстевоех ацсточасту до чеуцасасс ствечсгама хастлмпося дассйпгяста азоадвеестех здвосваагянх пе азавістаса аластссете зососвосу зазвЯзасод стзесствує тасасосо апуостчавзі взавдотуца свекстясес вузчуасвака кабоссоост сабаанисаєе о зЕстацазчає споаачесльс стазсусадс зесуєазсха пбдсвссвео забсоумото зай потгачомаса всісакодава созапасостя свудусостосщф стпозвостот азпооєтх зво стЕдссдвся скссвспоха сдесдєдаот асвесвоков бссавобесок Еоосагудте
Бе) чекасесгсд асзаєцасст дахоствсцас абсдзсанст гсассднеаст саавосаеоя 48о чедіссасів асоазеаакеЗ зоесзааахое застстсвзЗаа саспослаєци паасессти 535 аадаоЗзессьс посадацесд гсолсі сода ажтссваЗа пзоасососи росзБбассаче содеведссс ЗсевБаїсоуу саззудєстє дазодсоаєв абзапсавояї асоєаєкахе 5 четасопоаса ацовсуталоо сосааасовос скоЧачевлі соЗазаасти сасдсптево го
Ччасссксата созалабоаєс ссосовсуво сІпастдазе ассасодеовя поста тво чедсдсастос зквасасвай зУБІЗаВуЕс зоба сЯ сстасвавоє сзупЧавецоо
Ва асжсссусзає зсдовазсьт Зкассбосво садесоввкссо бссазвудаса стчеовасесоу зо асчслсбаса асаастодчає сасктаучєсаЄ тоходсусса боасзвоцасєво ссдосацаве
ЗО сзсавасаса поздадалсва сесілчвачої досслачоау ссЕвсузсав сзасвопдає 102 ссадскасз зоїскалово рпасозассаї зестессчактс ссобасавссв аасшесовіст 1080 апуслезчваєтст їсакодавтсоФ сбоссбедаве содою авадаскках бсабасеУує 1140 сг повсоа асооссазазс зсазсбдаас педевеваМу пездсечахчь сбазсаєсаау 1500 чазшскстазу акоскодсатст сазабсслос содчважто содбсотсет бваадаокуає їж часасіссоп скстовазох сезувацава засада скУ сваблатсоя абосподето 1325 аасзатлнстк севасєссяста зазсачитас згадала спесососюь псасазисле 12 спЕстачзусац соуасвачес тсдосвідЧає ассзвсзссу сссеузаос засзерасас 14540 васаценсві сссвізабсаз сбадаєссвоев захчссчесв стасоопеува зпвазчсеедчає 1505 сапастесст зестсоусусє всугайечоо босуссУуєсвЯа чеззачасаа зсагсвсва 1555 засссгЗасе чассібачазч богосеуасс скжекссаса адебессокач кобссузвац
МБ стасстоакса ккасесауст созчсзаксаа чесзасчаса сопособ цагалзасвзат їе89 зазатхааса чоаксетву плусваскас осгісадссезо всдзосасас бусащусвхо
Та чассісоовов содцзоцазвза обазсесссасх зЗапоцасоає ссозгсасосв» апвтсссвах
І1ЩЗО зазвсзсассу аусазаєссоЯ сепдеєєвас збдчасессвз часскассяв щеспєтавров 1850 спучачаєст зссососцха стсзасксса зсісосесосх волає сспосвсваю іч29 ассезачтїсс вашссвацїї сеачЧессват авабЕдассї сідасясссв чаячексео
БО вачасскчса чіастозава сісєсдасєвих буссоасЕси ствосаєста вапіавеоКе 8040 задазсавєссу чесдеактає сесюцасесь деІстоссгде бостжлесаяа Чазчсцалчхе 200 зЗчавсствацт сртвспсомор савачассоют чеоаевозс час вса бас яв
Усксксвседа сзпавачсаьво сстасстоадчеч Бапвзоеч ту акзавзеиує чечдвсзсяча его чзагасчлава зсбтчпиабгсв свасосочза влЕгвевио вс ода зляадєтскьасо лави сзацссвауа песауаттас зсбдассізуа вачвадоств Кестадахава деісоюсесаа
ЗИ
Часесоравус пошсеав
ЗВ
«Еійш я «11х 7552 ел Білок
-т1ї5 Бавакіст сертісіфілокова «ай
Ме Це пев дез беш бій Ууаї йїа вій Бек одіж їм бат ГП Ве пе ї 5 Ід 15 ем обі О1Уу пес діа бій дів Але тиж Рео Тух Тр рей риє дДвр. бує 29 Та зо
ТвкЕ Був су Ето Бей бек опує Аваобіу Ті Суб Аве отв бек цей деу
Зх 5. 45
Ехо із був дДка діа АТЬ АдЯ бсецдоуаї АТ Аба Тез тТнЕ Бко сід бгй
ВО З 50 пуз ак оаьу Ав бе Ма1ї Щек обзпобія Так сту Аза Бкбо Вк Ті ОСІХ б то ля ва їв); РЕ Ат ТУух Авп о ТЕр о Теродяй бірж Ата те нів піу сей Аза суу 85 за 35 бек ото БІУ спіу Вкщ РН Азїл дер ТВХ Вхуо рус ТоЄ Ав овіа Ата теє 150 та3 їх пек оБпе БЕ сМЕк Бгто рей оез жест вія Віз я1іа вне Авр о йдр дав сей 115 вага 125
Ії Ні А5р о 118 5ІУу Вл ува оуві СЕУ ТК пі) КІВ Акоу КІ5 рне Тех ї35 138 іх
АвповіУ ШУ ЖЕ Ак біу уав'ваю Ге Тео ТрЕ о рко бах о Уаї Аза рів 145 ІВ 155 їв
Бке Му Аяр рго Ак тТтроб1іу Ахдобвіу бек сів Так Ре сту Ск; АБО ї55 179 175 віз Бей нів Уві Зет Ажо отТук Аїа бу Ту Ті Уві Акб шу перо бі їн Т855 135 5ІУу азр оту бій бій ака Ако її6 Уаї Бій тТве сСув Був нія Тек АТ 155 20 2Ив
Зіу ват Ак овБе бі АВО ТЕробту ау Ей тат АЖЯ Нів Аврора Авр що 218 22
М1а Ппузв їЩе Такобко Зі Аве рей Аїд іо Ту Тую Уа1ї дка Вкб вве 255 ЗО З35 259 ів бі Суб Твх ле ВзроАТа ув УВІ бу Зетої1е Ме Су АЛІ Туд 255 ВО) 255
Аза» Аїа Уві Ап сію Ї1е Руб Аїд Сув АІз Ап обек Тух пед бів 019
Бо во 273
ТнЕ Ті Пес Вху сту Нів ТуроАви ТхроТБу ка Авр Ав Авп отв 11е та зо 255
Таж Бек АвросСув спіу Аїв Мер 515 дер оїіз Ткр бій Ази Нів пу Тук 295 295. зо
Уві був о тТве о Аял о Ата бін пту Та піп Уаї Аїя Бра Бім Аза о біу Меб
ЗО 310 815 320 бзроЯекх бек оСуз пір о Тух Тпс тв Тв обек АвроУаі Бех Авр обер Тує 325 330 33 гув бій сім о пяд Бей Ту бій був Бей Мет Авр Ака бах цем був Агуа зва 345 зу пей Бпе бів біу Гей о таї ців тло 01у Бе ває двропіу Аїів Пув АТа
БІК 355 піз Тер Ав)! о Зет ЇТви о бет рве АТЗ АБроуаї а ОожЖнЕ Був с АТ Ти
В 315 зал
АвриопчО вАьа рей дека дет Ат Уаї б ЗУ кіз хак Се Пец вує ляв 3185 лет ЗЕ 50
ВвроБіу їмт о їев оВге Без о Бе Бей му Був уж Ар опаж Уві Ат Мет 165 Вїху 415 тіж блу РЕЯ Тер ід до АВ отв св труд Теви бій бі ЗДУ тк Яви
Ех 85 та
Зі Ака йіз во РО ши Ні ОБЖ Бо Пцейп оту АТа Ата а тує се 445 1445 зі Пес дво ТЕ АБИ Уві Аза ТЕш суу ВБЕ0 ТВХ Гейл бій ДЕпоОдес аж ї5о 455 «Ей бехг Бів йзр о Авп Тер ТВжш Те обл АТ Узі Дія йіз А1а Ту пуз От 365 КО 45 580
АЕВОТує Тісє Бецотує Бе бу 015 ей р хв бек віх Аве осі 1 «55 ва 95
АдБ АК АвродЕ Бі Аап оре Азо ТуроБго бій бе сьо Беш Тахо їв
Ба) 5аЗ 5 їц бл був ЦПеп бе; век мезо біу бушо ржо Шев Мат та1 та пів тей зх ЗО За сі Ар обі Уаі КЕробзо ТВ Ат спемо ові пувобво дув Був 116 АВИ з па За йех Ті Меа Тер о Уаі Азп Тук Рко бу сіл йвробль» ЗУ тТрж вла Уду 745 БЕН БУ БЕ
МакоАво о Тєю їем Так осіу Ак обувсобек Бто Аїв сту Аку бБец рес ма ба КЕКЯ З
ТвЕ іп Тух хо фагобув Тук ТтТпх За 510 Тіз біу Мес Те Вар МеЄ
ЗО 55 що
Аврочец йка рко Тк оСуз Зет о беб Бе 01у бо ЇДЕ Ту Ак Тхротух
Бе БОС ов
Зеу Тр оБжо Уві Беи Бко Тук о біУ бле Сту беб Нів Тук ТВЖК Гуво рве бІ0 в15 аб піп Ат був о Бре був бек о Ави Буд Бей о Тьк Ре дяроТфе Зіа Бук фей вив 630 235 вай тез пуз біу Суз бок о Біа Сов оТує бек о Аво Ту Суз ДтТа Пед Бто вхо
Єк5 БО 55 тів бів МБ) дек Уві Сув Авп Тахо біу Атт 138 їну Зак о АБо Бне узі вай 565 7 ек цех Уа! Ре ів Був дек сім баї біу РжО ЗУБ БгостуЄ Вго Пе
ЄУ яв 685
Туз ТМму ем Аіа Аїв тує піу йтЯ Бей нів пр Уа) Афіа рко Бас шер
Я БУВ 700 твІ ПпУв азротівз бех опзеш Пій Тер о Тлк оНеподвБр Ап о Тія Аза Ах Акт о т ЕВ біу біз ви шіУу двроцез УВА Уві Ху овко бі Тв Тух ТВЖЕ бе) їв
ТУ 730 735 ез Ар обі ко тТве о біпоАта пу їТв біз Уві Же Без отвЕобіу цпУув 7 тая 755 «ув Аїа Ії Бе) Авровув Тр оБКе біп АвроБКо був бек Ай
Та т6о 85 «2105 3 «из» 0ОБ3ЗЯ «-х12» ДВК еї13з Бепісії)5їшь бмоісь1товит хацоз З з:дссвтсвто Заїссасста сахскстасса ссаддексвах тдачсаєсСуЯЗ ацпсзавацеєе
Га: азсазошесо срлобсаЧет сабстасасе ЧеуЗасссае сасесчаєтляв вївсвакоає та пасчуссая пере сзідця ссасзасвас асссуаводосе сстасгапав сагадсачас 155 кадсаспоає злрсчтоваос зчатаєозаст азветовсвзат зссзвоцесає Ббосязодадо 5-6 стазосвяїь севастдалс саасоозвах дповодцюся саовачесат состролавс за частваясвв с всутвксасос состууссци сасадзсоцахо успстесоче Бавсозеееу 150 пчеаеєслезора зсвоснусас зводлесзоувоопасцвосцота топасевасс зостається лаасавссачуа села сссвс счевсосвко дасзасзата огпадасата сссоарасозя
«во чуйзасссас асесукодуа сапсвазікч аассазчата тчзбасецоа сзцсусзвис
З40 гсбастсача сбосасссас сасодегуае согпоасвовс даведочева бопосевасоа
БО) ссдассвеко соавувзах Кобасусаса ївсвазспоа зсуусатсва ссатвосошо бо їатозачссу атещивцссо сдзудвоас посквовоса счазаассац КдесзиБоЕ 728 ссчкдизсв аїсоводеое десграсесоеу асесавуцдов дозвасстсвс свябсаоечає «ще "по часассвссп асівсодоза савстсстає Вис статое асзасацеа боссшсссопце ви зсаззсзУсь ассазецчаєс КакзсЗсатт спазсавтссь весасааєас ваатацавосс ах зІгссчасол ссзагасцас свсодссда ссазстсвав сспадаслеє сазсстсбтас чо асодсуасавіу зачесузайс Честосабсода бососадяся Совзесзсача зетсесасаче
Ода ізапцссуза сспзвзсзссет чоссаксзат звасочечаєе всзоєсзаває базвочесУса 1080
ЧесЕссоує свудалсссяа Вксхсвскса дессаоусоу сгсстосааа кадсзасчдо 1140 асуаксусва гасвссвосуз аводсвсавсї побтасоассея сспусасвка кастакесссо 1200 аасвссоасяа чі доскчає вБдуасвасо яЕБасстЯсь соугсазасує согассвусо, ійва чотсаччасс спатасссЗх сосеЧеарбозс адссдчадйсав: сататпотаки саасссвуао їз
Каггдасачу Гсабавая 113 «іх «їв» вчу «ім Білою «135 Бепісті1ї1ї:)т ипієтіовит ч«вОопх а
Мек Тша бід ойку ре Віа Тук ї3е Пейорхо Безу Аза бено гей бек уві 1 4 15 12 пу Угі пу Аза Аз оАва вже Блає уаії бій о бзк дів Тук ТЕЖ Аза Лар ай Я Зо тб Аїв Бк Меб Уаї ТУук Азп Ар оАга Уаї Тух Уді вне мес оаБв нів а С
Авш Аве отих біу А1їз ТрБЕ ХУуЮ Тук Ашп Мей ТБх о Кар о Жхро ния ва свце по 55 «б
Чет обБаек Віа дат Ммеб Аза Авпочкросіт взропіяа біу їЗМе Бса Меї ЯвЕ в 70 75. во
Іє ваза йди оре Твх о Ткрод1іо Дав Агя деповів ТтроАтТа Еко бів Уаї 85 я З
Ті Рге Аку дя) бОіу біщ Епе Туюк БрБе Луг Лі рко уаї Ака Ні дай 100 165 110
Авросіу Бех Має дів (16 ше уві БІіу Чаї Бех бек ТВх Хте ТВЕ б1у 1Бг5 183 ї125 тЕб Тук Ні Ар оКів Т1е зу Гея ВЕС Мем Уві сім одеп Внробзін Т38 ізо ї35 14
Ввровсто трюк Уа) Ре 18 дер яр оДяр о біу піп піа Тук о Бео Тує Тгр 14 152 155 ба
Фіу о дапобго АБ фем о Тхротухк За1 Був без Вип о біподзю» Мер Ї38 бер 165 я У
Тук Цег біу дес Ру ТВ обіпй Іі Все без Те Тцровіа с1у Зве пу
180 155 190
Трос яка Тївкошіу Аз о АТасвіп Ага Ба тТнх ТЕ ОЕБе Зіч бів Ата гго ї55 ра) 295 ттрУВХ Тух Пув кг ввипосіу Х1іе Ту тую її Віа Тук АТ С Ата дЕб ві ТІВ 8
Суз Суг Бех ЗІ дер о Її2 Акаа оТук Шех Тих зіу ТпЕ дет Аїа ТцЕ Зіу 225 БЕН) 2АБ речи
Екс Ттротьху Ту Авц шіу УМаї їїе Мак оБхо Так осів біу Хех бек Ре 245 25 55
Те Авпонів бій 51іУу ТІ» Ї16 Аве Блє бій Авт» дяаг Бет Туко ке Ре вп 255 та
Тук пів дю біу Аза їйез Бхо б1у ШУ Сіу б1іу Ту» піп о Вгу беає ві 78 о а55
Су Мяї піа бій бре дув Тук В5поАїа йвробію тТвж Т15 Бус ТВк 115 ва 2-53 запо сія Меї ТнтоТьу Від біу Бхо із бів Ії біу ТвБЕ цем дзповЕО Тух 305 РО 35 3759
Чв1і йку біпосіа вія бія Тйх Вів А1а тур осв Зет пів ті- тн ОСтах
ЗВ зас ву бів чаї Сук дек біп.обЗіу су ї1з АвроМаї Сіу Рре їі2 Авп дви БІ
Зо 355 зо
АвроТук ї1е пу Маї був біу уаі Віз Ре піс Бек обіу Ва йіз бе 355 з5О зва
Ріє дек одівз пт Уаї пів ек А1з двиподек пі СІу Твх тїтїев Віа СІ1Те
ЗВ зо
Нів поем ШіУу бБейї ТАЕ твЕ Зіфотис їм Уві пі Тк оСуз Так оуві РЕ за зо 385 па бек Тйє пуус бі Тер осіп ХВ ОотЕр тре ТБт Уаї Тк оСуз бек о Уаї ет
Ап5 417 55 біу Ат шег 5 Тас сій бе Маї тую Раз Уві Ейез біу б1У Бак сіу ди 455 130 тпх Бі тТух ви пе АвпоББе бвротТухк Тор оба рпе лів 435 40 Б ке й «РІЇ» БВ З «рій ДНК «Різ» Бювасіна такі л1оїае85 «4005 5 акчазачсас зогаспссовх час зео встеОЕЕсча сосопосвех застческуй аітодасвсс бісподсесає свсеспісвао ваксотвссая їсхастовов ск Есосядве 120 звспдатнотвк поссоазся вапвбадсхво сасаеткиЕ ссускІссва сткосваенКо ї5о ззсссвууач сасесстевтх азУксівоя цасосуєсяз ашозачассє сесеудєсве 2549 ксаактссес зпобчааськ соподасуво сатавсовей стсосвестьс асзстактає з00 пчуссззасччКа стозЯаойхс віссессада гасазаазча зсазесачаса засо зби вксозаснаса МсзайокоссаЯа сбадесссло дратасатоя ссссасолло оувзодтссв 125 коцствсавсв ацедевасут созссясвас заштоствої асовсавову пабвобовоє зви часгпзсцася агессакбаса сокоскатасс списа асоусазаає зісушваока ай тессваддасу басссхасиа здомтсавасеу сачебадуко псаачаласас КевзкавсоЗ
ОЗ птссаззасс ссздвузобай ссповеіЗкас зачаревала дасускасеів Бассотазас жо чахсаусства зеззсачьсе сасстодаве содазотсоса ваїсассока дудсосетех га цатествачоа псестлцссЗа гагзгазгсасс спасстассо сс цосеа сосдссвсах ко сазичьеот Мовгааацвс гсосаатоцує чозстдаасасї сабо сатх сзобвацаєе в сексі опсу посасегьсв ЗзуЕБетеЕдєв сезабсвапчо чЧечддстачодча азс вие
Зоо асбошстчтев асадбопвва сасозаціу счабесвксто асссввствст посадив ко чатсасЧецЧа сзвачезазеєса Часввочасс савсеЕсо дласвастег всссбоасесов та ксекдачаці пуувассаєиа босозасасс звзасеесутвсяа ссцествзасав сазешсуасї 1080 писецевеба стазсаєтаз дсяЗсвстасс бассадосоа одааозсодсо абоксасовайа 1325 астсаєУсу абозсспзає ацсеааєвасо вачаставоюк ровсвосває часцчасоде
ТАМ йзосдацесу пасе совзас ЗгЕссадас сваачєцеак всзпсодчсає Бсародвоааї 1255 азсздпагаю псвсавагово сасогвасвс Чдздасуавта садабодвуєз пеасудавеов
ЗО зсаасачассе сбоддзсавас зааадлссасв ссозасаєче сЕсстосдпаау дассвасвоє 185 хеусгазогс сксавсікуз сапсзассса зЗсовидавсво довасвоває сс вовсас тако вагсодфтасе дечессвзуста Єпдаазсасів здсеспвзасу ббсвавнсоїчта савеЕчовоє 1500 чсекїскема скастоассо асптосоадсахо сесвассспо сппсадаляаце скачав 1550 ксдвксавоє КрошавеСо сазсасотоса гава 53 «8125 56 «231» 520 яТ1йх Біпук 212» Було «213» Бо;вакілтщір увутістІі1іїоі1ідехк «00» 6
Мек бує Уаї Жук тТхб о цез Уа! Діва Тк АТїа Тих ех Ми ТВк оРко Аїа 1 5 ІЙ 15
Пен Аха сту бео 118 Бі нів вхо вка Аза ТВХ ТИХ Ре Аа вЕх Бгто ха 23 30 11: ріє Тугк бат Ар орБе тка а5р ав овАвроУуаії Ейпе беп Біу РЕб Авр
За сн 5
Авоа Тух їжу о Тух фрпе Бек оАТя беу Ави Ре СНіх Бра обеж вто б1у Алла 50 5 50 хо уаї Пей обу Бех ув Акр Бем цая Ав ТКко Во о бед ї1е біу ів 65 КО 78 ва бетх лів Бго Ато Ге) Ав; РБе Біу Аврошіу Тук дар опем Рко Еко 51У 55 ЗО 55 бах Жгу Ту ТукоАжд п1у біу Тих Тер Атя дву Зак бем Аа Тр дека 155 ках 118
Був Звк Ава сіу біб Те тую ТТ оОтів сту Су ТІівоАвіи Бе ТЕ Ап 115 хо 175
ТВі лхв о Маі тую ТЕК да беї Бек вхо сій піу КО ТтротТух ай уз 13 35 14
Зіу дви Рде іс дар о Авп дз осСув о їук ТУуК вар дви б5іу тТле Бей Т18 159 А 1595
АвроввроАвроОАЮ ТК о МекотТУх Увь УВІ ТУук сі пек су біб МВСУ
185 170 75
Уві бак бра Гео бе бій Аве біу БНе бек бій Маї Був чек Сів Уві таб 155 ї55
Ммаї Бе Гуз Авий Тк Ар о ЇТе шіу Уа) біпоАвробен Сі бі Дяв ого 195 щю Чо
Мес Тує Гуз І12 двз П1у Гей Тує Тук Хі Грем дво Авродег Еко бек 210 ах его біу Зек сів Ту Тур Ті Тхробуг бек був беж Рко Тор обІУу РЕб Тух ка; 236 235 йо сій дек їув Мя1 пеп о Аїв Авропув Уві Тахо бо те 116 бек обїу сту пах ВЕ 255
ВЕТ дак РІО Ні бій 5Тту Бек во о ф1е Був ТЬу Рхо Вп СЛУ бум ткр о Ба та тТУух о Бне о Мебє шею гне Тако оТкводія Тук ЕТО ЛІВ сіу дхо пем вто Маї та не жво
Те Аня РЕО ТІ тн о ТЕр офі бек Аз оБіУ ме Вко Хі пЕб Уві Був
НІ ве ща іш ліз вза осі КІУ то СіФ лек бек тую БЖ Тк бе); Бк ту ТАЄ 395 З1 315 ЗУ
Азпосзіч УафотТвх Ппуз два Тхев тТвЕ вка Тр Аве отВх РБа о Аср ОДУ Твх 325 аа каву
Бах лез дів БЕБ бех ТЖр о5зіз ТгроАвВи ну А хо с АзроУаї АВ одех 34 345 150 ге отих Ууаї вве Ави яхту Без тк опес ха тн Аза Чех щ16 Тх вуз зву Зо Зе5 йвроІіїв Тух Сіп ія йкЯ дви тт бах Беж ців Вч Тих Ні б1Уу дар
З та ЗБ пів ОВО тах слу Ме уві Буз жїТе Аза рве бек Ро Ме Му Аз обу зх ЗИ зх зав зр обха Аа слу пшо Бек АТа пе Ато дер сів обек Акта ТУух Її ту 405 ЗТ їх
Ті Ні Ако ВБроАвВа Ку туз бле Тк ЇТ16 вла ТвІ бує НІВ су ме го чив 30
Вей Має йвросто їтр лем слу Сну тп Тих Авройеа бІу Фів о ІТе бух 440 445 дів тЗЕ вла Ап Уві бро Бек о біу Аха ТАК БПув о тїле ТЕр оїш:и дха лей 2556 455 450 і Бе; саво Тк бал ока АТ біу хих о б1іу дЕВ ТК ї18 Не Бех Туй 465 175 415 50 пек Тер взр ші МВі Був Тук біз Тв репо осі Вк й Бра був сви а 85 435 тук Авпобіу Тр о А1а Ре вве 185 та Тук Аха Бе Оу Г1а ре Ав що пе Бо вна ліва біо тик Аза Бей зі Б1у чех Хі їбя Уаї б Бех РНе. ТвЕ
ІБ ох ВЕ
АзхМа АТ шХ «від» «ТЕ сїЗ74 ей» ДНЕ 185 Бузакуцют тех ісіітіпуцав «або 7 вілсзетаст стуассстсат сестра скадстпсоа ссоассвасує сосгосасач саачпссасазч сдаєюсочвощта сосксіссаза азесвіздас спусодавсоще сестра са 125 чашіссатах аспоцстазес сдасвасзЗе аспадсчсса асасстссвак ассазабсі 1по сеацтвзасс асассваеасх пайайцссввахс сооспсочо поссссавве бсссетсовоса задктачуссв базова одсса ббазосвсає сссудосясеї ксаастовас гобассовас
За пабсусаста сЗсоцевоса хаасзсбдасх класса потсоксаква соссповое
БО
ЧезавІдаса зЗсвоачноо азвзаскосссо Естесбвуса абсзатодова гочокседаз го асшлтадептві обазаавкса застав сі засолу сбтабавняє чебзеввоче
ЕІ сптабзабгре асостсоова сувоссудат зкгсзсагсв сскоЗзайост бсодхсцеса 540 зачьглтстуч адтастасва сопсосозувсо азасувевсе зсетасоств ставу датос 805 атасЧЕвЕсс астаЗзгадаст засади сде аптачнайза сасьшсосаво авокстттто бо зваБозустлац ссвсаосаєв КусСпоровЕо ЗЕЗЕссцасо агававводотва басесваие пи свагсацкач сусаснасая дасачссссе чЧесвесових ссбозсавса пасбцпсуве тво заччаасоса ацесучяасао саестівіссво пас гасса сссіосоас цгавкаєтчє вай цебсоссуаце вЧссвассяЯа счссовочяз тасчосасас осазкспадса ваасссацдює зав застіссоксв яствоскосс сббдассвцац сс авог ствавадчоосВ Єсусоєвахе
БО таапЗусацео часі чассь ссвсавсоча асоачоасавосх сузевкасвоа салувесате ї025 зостсадаваа псасстаовя ссзсвгасоду ззакудсацу сссзевадчєя згас іно аксдесачочес с вуачаскоя дассазада Годссаввсв давостеча обо оцее їл4й
Гассватсаац поссоасватає гзвадассаєв чссоусазса таваосасвса восезацеах 1592 засатсааза гсаасспксє дазуєзова зласкососа асакоччеас чатавацяєе
Кяео сздвсьсаєо паеессоаосо чаостоудссо аасЗпвавця ссдасувусе сасечаєьсе їз чаддачавда ацейівесва тосудссває всеціовата доссстсктат со їЗ4 «2105 В «тії З «тт Білок «213» Жуцвах ною хектіст1110іцез «апа» В
Мес пів 'отух Аза Тих ївб Тк оТає дез Уві пей Аа опе); ТАК ТК дви ії а 10 15 чаї ліз А1а ОМ біпопіу Тв Аза тек оуаї Ав рез бек пу АвионЕІВ жо 2 З сіу вхо Ада Бувовіа цей зу Шев оліу Бра ЗІ Тук о сауУ ТЕровБто АБ» з5 4 25 дапопт ТВ Кер оуві Ав Тв Беб тів о РХхО АвроРБа гер; уві ТЕ Азр 5О а ча тів Цув Внеа Вп бек о Авп аку Бі бі бі Ада бій ї1в Бго бах без бо ще 75 що іУ Тхв Аза Акз Зіу бі Лує Сі: сху Ту де спуу Аква вре дей бе.
ЯЗ 0 за
ТВ Беа бекойни ТУК ОвкУ Тл ТЕ оАжУ Був о Тухо Ав Аа о АвЗо Бе тує
І0О Во їй зеш там то яв Аврозе) ЗІБ біУ Аза Верозфу у бів сту вк Авіх
120 195
Бакогбсо Ве Бгто Пру Азр Ав СТ1у йеи Ттв отак біб Ме Зі пем Вре 130 135 130 туроАвпосжЕв був) Хаз Бех одвробеи ув віз ніж вва Меса сто ше 1435 ї50 І55 1350 педоюаї тів вер уаї тс АБИ ЗІ бо Ави оті Вр Ті Рре Ткр дер о т55 170 175
Аже с рКа твор обек бій ве Бен о бій Ту Туєк й Ага ВІВ тах Був о пей їво 185 то цез ха Пув ТНЖ Гей Во Бу ТЕХ рей озосео) Бек біт го Аха Меї Віз 135 255 205
Яке ех рко Ті йвпоЗек Ар дер о був Тер оОдів тб ТЕр бе ій ех 219 215 га чаї вла ІМ Ав ув тТБж Уаі Вко дво ї16 Тук Бек Тер о Нів Зіп 31 г е30 235 4
Зі йїа Ткр о зіб о Ако бій рхо Аа обек ТНУ ї1е ко АвроББе ТНК ТвЕ аз Во 255
Меп Ат Аз біп Ту сту Мах вто ЗІО0 Буз ре її Ав оУМаї Аза сл
Кен 25 я
Тух Аїа Азія врЯ Авросіб бій Аа Рго Аза двп беж Маї Тук Тук Тем дя в) еВА
Бех ій пеб бій Аг Ні Азпоївч Аха 51у цей бхЯ А1їз Ап о тро б1іУ 280 295 350
Бек (у баг др ей) Нів Депо Тер оМеї с1їу два без ЇТ1е тую Звуо Так 305 10 зЗ15 зва
Тв бБіу Лак Бех бів бу Тк о ТУгоТую Бхо дво біт бій Ткробіп Аіа ай з3о 335 тук ув Тук Тук Дія Аіа Мас Аїз сту біб Ак Гепчоуді Бит Вуз Ата
Зо 385 355
Лек о бех Вар пес Був РБе Азов оУаі Бе Аза Тс Був ій Сту Ако Буд з55 ЗО Зх тте бує ЇІТе (1есдів б4у ТАК Ага Тйх Увазі Ата був Тут Аза Тів
Зо 375 38о
Був Іїв ек обіу Шев бій Маї Аїз біу Бецобтго Муз Меї біу Тк Уві зва зо 3а5 СЯ пув Узі йго ТВх Тук о Аго РВе АвроТЕр Віз бі» Ро Ави біу буг Уві 403 116 4у5
Ачробіу Бко Уві Аярозей Бі Бій Був Муз Тужх Тих о Туг Зеї Аха Аво
Я 428 35 тн Уві Бек Бех Кто бек тТБу «ї10х З «211 Щ350 «Рій» ДНК «й Бозакійш чвЕтТІсьІ1тТіоіев «(іх З акпесцессоа сстсебсвтї Ззповесато ассатсаєвосс бопусесхосво кедезбсвст сівдсачася асесссавеух ссвазасакс гзсассзчсаз вепсазсасс вакостосас 1250 засадссуся сстзссвскЕ сасауоалове уасавасузася досствссув стксовасвЕя
Іо зсадасьадле абштоукекс десадсадаєс відасовасх Задпсачсвасса фадідкессо 245 згаздссвад васстксачц сруадосавое васнзайссу дапеспаєта вапеуєовис 300 сззаасацая воБкстасок сквхзхусст ЧроесзбавсЯ сспядасзЯЯ сацаясоЧеє збо зібадатасоз Зсогтадсаєсє савсацесух суссосьзта сбсвіссосї подлйаагов кроЧчЕсопзоаа асзасбласах сдасосааєт зЗзкстасаесу всаєссдабоЗ ссададессат
Би «Сстассобао ссвясссбау ассдстастас сепаабовся ассаздвсво чесстсотно 345 «чсоптатта Ксвясаває» акгсСастсгса асаломоасає ссодсачесо Соосавсядо оо
ЧичеазеЯрс трастевовое суводеазуа ссозсцуєсевІ асвзаосхуся азабововає «БО
КасвїЗайстї зстсассотаа спзесбУєесс заууасатвс четасесвас бпуасепацє та пссастудаєс сстлпсасоба ссасоуЧьУо подасчавсз азсезачссв вадевссаєо
ТО вассатеостч бсассвосча сспеідаєдає азсрсдкасе сс ЕВпса свасоесчио о стгзаєзаау чоадсочека гастецссь фсозссевей аузесессва деасощссся опе зЗасзуасптаа сссоссчадас саалаєчаси асзсвачаса сазтосвове савзсУєєт збу авсссапятаЯ ссвацеводв чЧасссовчасії абтоасссадЕ стазочокаЄ бссацвсКаа їп2о зЕстлсвося васасозс саасоаєтось стсаптаала зспусеЯвска саппвачцєх ло «асаавассс асьссЧчасва сассчзогасв вечасчуїєа децевобицч восісзсває
ЕЖЗ3) ацдсацесчва зсавзаакЕца сосбозаєкє зусзасваця ссддтваешех зв оазеасс типа гдоаєдатвна саастассоз азастіцаєвоа астгтасавзця срокоЗзавсе сосесдксеаде тає чакдогассо утасувасаг бекактосве ЧЕ ссесод чегебацасе бодсіссого 1358 вцсзастоссая асідуїсдева чес адесав 1350 ся «81» йвВ «иа спілок хрі3» Жозвкіше тУуакохсїв1ісійев клЗйз Ло
Меє Ткр орви Тахо бек оРхо Бейстер ре Ма Шех о твж Те ей бі гав і х ТО 15
Твх сіу Уді Аїа пебо від АзроАва Бко їїе Узі пів бвротІіє Тух ТБЕ 20 а 30
Аіаз Ар Его Аза БЕЗ Мес Уа1) тут Авп о бім дта ай Тук Пен овае ТНу
Я 45 З бі Вів Авробей Авробуу Зах ТК оАвр Бл Авп Мес Тл одно ТКр о Ага
БЕ 50 їз) вне бек Бак Лід дво оМес Таї АБ оїТте Сів БВ о Бів біТУу Уві тка
БУ То Кок в
Меї бек Гей Був ТЕ ВН ошех ТкЕро дія дей Бек овес Аза УввоАта Зх я о Зб «в 'уях у Віз вхо хв ХУ Муз РБео тує БО ХУ Уа Бко Ма) Ат
То 105 11
Авеводів пуд тТвЕос1уУ Бім мес Азї5 ї1а пі Уві СІМ о уді цех Тв АВГ
ТІВ 2 Т25 тів о цезв бху РЕб Тут ТВг о Аво Аїа Оовла осі Бе Рхо сен Маї 51 Двг 130 ї55 140
АзпобЗіс тіє дер о Рхо тих хУаї Тк тів дБеотТьу двробіу пі Атїа тує т45 Вл 45 150
Теми тую ТЕО ху Вп рБжЕк хіх еЗ Тую тут тай БУ Лев Авлосів ДЕК
165 170 тТ5
Меї рем ожех Тук бек слу бек 116 Хв буз Уа) Зек Геу Те Тнк о Ата
Т8о 185 185
З1іу не сіу бек Люб БЕсодай дап АТа сів Аг Рус ТВж Тве РБаобів 155 да це спічсоіу вхо сто пе стує Був Вт БІ Авп оре) тую ТУЮ Меї тре тТук 219 515 Ей
Ака віз Авт Су о сСуз Зет сій дер тів вхо тую зак ТВ бір сБхо Бех вав я ЗО 255 рев
Ала стих Бім бто Тко Тнх Тут аку СТУ Ужісоуаії Мав дв БУЖСАТа 01У та 25 ЇВ для век гре Тлдк дво Нів Ро Бі ТТ сті Авоовпе їм Ап о пвий сбес
Бо 265 ато
Тук пе вра їук Бі АБ О3уУ Аза цеб вв обіу 51у Бак сЩ1у Ту ТЕ й 250 285 вхо Зеж Чаї дія Уві Змі даж рив ув тТукобЗіб бах Аяб білу сви ге 290 жа зай
БІО вій тів сЗув Мей тек ЖЕ бій біу Ро Віа бій Мен Був бет Де 55 ЗТ лів 32о
Ав РІО Тук Узі Був біб сій АтТа БЦ ТьК Ті АТа Тер дет сій у 335 330 35 тіе бій Твх пі ма був чек бій бІу сту без сяви Ма1ї Аза ве те за Зах ЗИ
ВБосдвп о ЗіУ Аво Тук І11їе Пув Уві Муз Ту УВаі АвроРна пт бек о тБу
БА з«ка зе5 біу вія Бра Твг о вре пет Аїа Ако УВК о Ала Хек йепобЗех Ве ПТУ оту ут ЗіБ зво муз тів зва Ппебобго Бей ші бес вуж ТЕ осіу ув) уві спіу ТЕ
ЗНА 55 395 зап
Суд тВЕ о МаВ о тпе ТЕЖ Тл ші Авп о тТкрвоа стає Тук обу ТВЕ Уві Ар 310 415 сув Еко Чаї Бек біш Віа свйас о сіУу Тк о бех Авб о бен Бае ББа Уві рае го 155 455
Тк обБіу Бек сіу Чек о сіу бек бе; тла Авр о ре два ТтротеЕр біп Бе 05 45о 545 ак «оз ЛІ «ди» 155 «вій ДНК «213У Ковахічи четіісі1іоїйев «Нм 1 втасчевисї студеаставу зеесессок сгвассасту двадсоссох бсседааго 5О задзедлаєт ккссоасата сассаастсх диссстбссву зчасазпсасеє удаїзсексу
Іо їЗусасссадв вадвіцусот стхбстсбов босассссве сатосаєстос пбоессвесу тва сЕгсссЧксї всдссктаац пдзчастссассс васісузаво всажсалесв взасос оівай
АЙ штсоцвузавйо засроссьЯу овуграцесу азчасозосву расова Чисто рах 0 псасстааєса Стіпсудоязссба саваздазсв Євсоасдеса сстосдяася сстацосЯак а5И позсатвіса гедчсутсвж сЕссавуаєс ессавнтосає зспасдаечає сзоасесувує чий чассстчотв состсаачсд вазсозсоакс зпассподаєс удскссоЯаа свое за 180 І азачеттаке чцровБаслоа това стоспаозаза зговртїдоа хастозацау сітвассессо асдсгїсвагає стіпдаасопс асабчачаса бабодостог зудессосаг
ІАКе зСеєзсавос чечасичЕка стастаєсіс вічаєсроссо вадзідзавс тосеуавоає 680 спасєдйотакса сватссстет ппссспосяаа абсвсслзео сстасбовзаче ствасватнає
ТИ" аассспавсс їпассзатсз судоавовісї чЧачевссеог азастчбсося певсоцеоже
ТО ско ссвац зі«ссвазол сазстцукоц зоапебставе ссопествоссся сабспозоєв
З45 засачцаасте сасссзілаз сосчбчаавосо чоло са акоосясату базсоавсчде 05 зчазезЗусєсев ацеблесвассо вобастадле счеаїасстя зЗааввоссобсе сСсозавцеюуа вк впочстазвеФ госсодатза соспдстсвіс авсосссавос сачаозаєта свастгзчалу
Той вачзштавоз адассестте ксвотбссаво свобетазад поповадача саумееско
МН кствшамею ссвазашеко Зорасатсутау ссачссдна всзвсЯсовсе суцрасуєц 1150 суІшссаузва аббадетеча честассзача сазоуааакс пазсовксвЕ бопасолосю хялИ слаадсіснов ссср сва аасазкюь саєагссдос позачессева чессззча кава сяззахчєсЯа чазксассяв КІвсоцєвоЯ сазібссасо аєвєсовошЕ сепсавекасе 1375 сусетксосса савассаавао садсавсват вазсосссвазс седестксся езкросцачею 1555 асачавцексовпавссуссо взтеассцива Чобессассяч Кссссзчаєоє ставав 14545 ччсЧиваєся зссЕвзсатає ставаосачес явсусузсус асбасвасек бочассеоо 1952 айдссасачац зЗсайчасися савсвЕсяасо асазсаєсал савупстоє чачтцвачо їшеа аслзаакссає тЕбактазивоу сКесосссдоаз ссктабеста ссслонасад саавоцаєсе
Іб20 зізасзЧайс чссссзазчоу апатовіЗис сзсЗсдаєсо аабоцасокта сааделосота севсвачада гтчавсаєзу БУукссссдвя вав'сбсадвав сову ї788 «21025 15 сив Свт «2122 Білок «135 Бицвакози уекрісії Кс Зев капа 12
Меє Ака о вле бек тТкр зви бе собСув Бко (ео пе) Віз Меє су Бак оАТа ї іс ї5 х5 зей вуоссва ТВЕ Му тво Авро мя бВет Ту Лук ТИЖ Авап рі Чаї Тей 28 Зо
Рез БІіУ Тжкр. о МНіз беж АВвоБКо Зет був Тіз сій пу ДоробіУу пе оре 30 с їси шує чаї увж ЗежЖ Так о РВессі1іе ет Бпе го 51у Ман о РХо УЗ) тУг ща 55. 5 вів лек Ага оБеробей ді Вал Тжр о вКЗ без Ті8 дау їз Уві Тур о Адо
ЕХ та 75 5 пка ЗТ Дувосів Мей овЕо ху Ї1з бек То пуб ТБ Ала сбіу бі осТа 5 Зо в. він обІіу Мат оТук дів РЕО ТПх Ї1з Ако ТУукК Ніво Був с ОІМ ТВ Туюк ТУК
190 15 її
Мах Ітїе Сув СІ тукссво Оу Мяї зіу йдвр її тіе біу Маф Тіє вБе кіз 120 х25
Буз ТИХ Тк оАяв бо Тер о Авро бів Сех дек Тер бек Ано Буо За1ї Тих
ЗО 135 180 й
Рпе Буг Бго Ав Ну Тіе АБрореб Аве Гси Бе Ттр о АвроАзр оАзросху ї85 і8-О 155 152 муз Уаї Туюк ста Аза ТвЕ піз З1іу Тіє Ж Гец обів ій Ї1е дв оба 153 тт 175 шумі тв БІу біл дев бех Рке пін Гео зп осі Ттр Аво б1у Ту стж тя нет чо
Чіж Уаї Теробко ШіЗ 0іу Бко Мів Ііє Тук Буг Акт Авб о біу Тує Тух і КАТВ) 205
Тує пейп Мет ІТ Ага біз біу Щі Твеж Віз б1Ф с АвроБія Аз її Так тА 5-15 20
Іїе Аза Ако Віа Аха пуз за Таж бі Бхо Тухк ЗО Аза Тук Вл Ав 275 ло Зх Бе
АБа рРЕо Ті бе їлю яв Ако О1у Тв бек обі: Тут Рбесбтеа ТБж ба 245 йо 255 сіу ів сі Авроїви бе біп дзв Те рув сСіу ди То Тур Сіу Мей ре вк ла
Сув ам Аза тиж Дт 116 ТЕ о вія сіл зуу Зак бек ро Мак обіу АК 275 ВО 283 слові Мі пе БЕ два сту ТЕ Тхр Ап Муз Сію іч отюроржко пу за 295 300
Кв о біп ого Маії дк3 б1Уу Акц о Мес Бо БТУу Авт же) аб Бхо був Ро 368 з1й 35 зжа
ТВЕ йо пп отаї ро ЗІ1У АвВроску бло РВЕ Аза Аа Ар о рко АВ Ав 325 530 335
Тук дар о іжи Був пев жи зу Був Їале РЕЖО Кто пів оБпе Уві нія. ну 4 за5 в'я
Ага Уві вкз Ак Аво Сту Віа де чеБЕ їєц беж Бех був Сіу во Ні 353 Зо Зв 1їе Уві Ра пет дтЗ Ап овяй Уаї ТТН ЗРУу Бех Мяї Бей оБгя БРУ дей
З 3715 зви са сте біб рес Зв СТУ бій Аку пі сей дія Ре ті ЗУ Ах дІЧ
З З 35 то зіп татонів тн обео Бнесуув гук бак угі Аакр 116 деровне мук руш
С 410 115
Був Бек Ази о Аяр СІВ ЗТ АТая СбіУ їзїе тТвк о уяі Бне де отак бів ре а2й ї2х 430
АвроНів ПЕ Двро оте сІ1Уу ТІ Уві Ако бецш ра ТЕ Авп бій су Бех 435 444 445.
Ав Бук пу ех Му Пец Аза срнєсаАку де Ах Аза Тьх о сіу Аза іп реств. 455 260 дви Маї о Бто Аза о Бро Бук тав суаї РКО ді Бр Авросіу ТкБ ЗТ опцУуВ ах 470 15 ВО
ЗУ чаю тіє Бет Бей мія Те бій о Ата АТ йно Віа Трх нев отух Май 485 459 55
Бей ші дів беж бе НІВ Вк і Був Так оПеш Азро її Аля ть о щіа зад 5 щі дек Аїа зех Ти чаї Еек біу 5іУ Тк обіу Зх Ре уві 51У Зроби 599 52 пез шху Бко Жук Аза ТВ СУБ Аа оті Мув С1у беж бім Уві бій схов
З за5 840
Бко уз піу 0іу Аве Заї Ту Маї Тв сів ТеротнНу Ту бує Бко Узї вах 550 555 ква
Але тт сІіз Ті а5р Ні пім У) вве Уа) Був Бае бій бу вка 5 «ти» 13
«Ех в «кій» ЦК «2185 рОопОовОста апзекіпа «апп 1 агчасссасо бсазоссаще сопледсососо кЕсЕсодссс состссдсодев аблесоусацех ва зссаЩвсктУ ссоссавуєтос сесЗчсгуЗоу гасазчаєяа соцзасвЕсає чтагтацчеетх зи зЕдсвеузаз гахкосЯсссс чЧеЗасавсіс соссткаесо сіІдсвдсасто суЗзсаєоща
ІДб І чвогдеааво апучабатссв савссслаЗс засапсодса бстасосога зесавестеє
Я авсотодсоє сгсвачлсає гсоачвасьсс сеоссссявасс псовзсватсто бааосссоКе
Емо) чисосодсиха ссстхатосу бсздазаско сссзазессоос скессестас апсуєсеае зей сссодієвзаєса гсцесвассс сазоЗачаче ваачислачу зсвадчасяс саасуобдаву 0 галачьачех басчисовгахтас зопзЗзакЕссза зстасочавбо ссзачачссе чЧажакасасе ао счцапсстсс асзбгаскцу содзаквсазо зачровесгебу зсессвящикх пецозасоса о зіхвосасуу ацассі чо сесбаачаєта чедазоЗУсв здасаяцва адесаачкоу по вапчацчевноач аусЕтдасьо бчідеесстє асуавусєос сеаавсасесна саайсасостке ве чесчудсаці сочзагчуЄєсЧа Зазавсввасї сс чакає бодстпачаст аа 720 ссрдасабоає зас чсачця усасваазпа: сапаєссвеу зві огтсаасх бпассвасею т зЕсесоссот асатесазод чвзаздлвална соазщцевааоа ассдавсксо сСловезсяавх що захопецекс саоссознсва чксстососа чЕсвачаваац саззЗашсоскоек чкЕаасотиЄ 00 чЧасаздасстиЕ секчоускЕс сссодссцса зсасостсоа сздсавсаєсс свлавовоко 60 чиксдазау стаслацвос апхобсссго буавуузсох сесчзясасо чесчасовох 102 чечзасвсса цсовалосстт состав бозлезоацса сасозаусап дссдаєсаня хо сдавсбтоза дбссачбабо ссагшсся: ВеЕсСводачеу3 всжеебстра сбавсосаве 1РО сасачєтеєс заувсскса сбадсевкоас ссісявтаче Єспрссяєсе седавтосув т2по зпагасзаєусз деьсатсевас вубсестьсоя стуаазссчаз рсосусаста подвсуссая.
ЗЕбО. заєсаєссвав сазазециса бпсциосдаа зоскааесас сосзачлчикі дЗзявоачісяй 1121 почат озає зссодстався аочакеяцес бопессовсяс сскасоаас ЄбтаЗсосухка
Ілвй
Ссвиствстас вази ссссса гпЗпатавсоза чеапстгсвас палпвадейсо седвалвосвае 1440 звосасофсс воЗсостсса їсогссасза бСасопвсавье сососчузея Седокова
Іза
Ксассвссост зепледассс ссдасоазио пабтзаусса с сусоссяелу тозатавско аа йилсааслуйь свсоууасас стовІсзсоВ Чесаідсосоп зспсатеста всчзасЯоевЕ
ТЕЗИ сшсисподаз злазатоїса тцсссовсоос птяаасодчсс чеозака сепвоцеває за сіхсугсовко взусасоЧача Чаавсаїта сзадвосабо довчесаск асдсдесвой
Кто
СаКродовос весовссЯск доусзасудаз свбдасог со «суєвуєаво севсставоєї їв часосісвсс асесасссза сСодостовія гасогоуаза еблесодсос ассасвесві 1855 пстасуасвея сппссчоїсч еоапасстас садсавосвос вдассктдатс сс стося 1985 спекяссада зазвусєовсв чсЧосассодя бессттсває десосостоє асаасосоає ї550 їзвасоваєс сездосксек боазачесбсдв сЯдБсісвас чачачасето ето павт мае часах встазассос яловессала ззсасвовас дассолакеся спсоайвоесва 19 шк савз здвзазцалсов ссуксагссовга сзссодавео чдосязевало певоскксяс вІєй ссекуссоачцє кечЧавелсва стос оЯча дасучссувс дсадевгалу пса оЗа зго авазісваз чосаазачав видова се в аа «10 14 чере Бі «122 вілсЕ «?135 Ройовроха алпжехтів «ос 14
Мет зі із меми су Во ВІ Мей ді АкМа Тл рем Вів бБб беї ТАЄ 1 2 16 15 бів був уаї Алта зе АвБробем ВБе хі Гуз Беж бек БУ сту ВБй бує
Ка) 35
Тих жЯе Авр Ттз Меж тух біу Мей меж Ків са) авр хів Ав дял о Баж рт ча сту дво біУу Су іє Тут А15 ОСІ Па 1316 бек Ава Акя Ата ває БІЙ
БО З ЩЕ оту Бех 312 був Ріє РКО Бек Авп оцей АвроАва ТІ Бей Бко чаї 51У за Що різ іу аЩв Тк без ТВ баеам обзаіїть йуБ стен оАій був Рхо ей о Вет бек о А1в 85 Фа з5 цез Бро Тужх Бак Уаї Ази о уаі АтїТа Авлобро був о ба 53У Буд ЗІУу пу 00 105 119
Сі пуб АБ ОТйт опув Сіу Буя Мун оуаї біу зо Віа Ав о йіа біу Еве ії5 Т5У 125 їке біу Ме Аво Уаї уз ха Бій бує Тук тру біу Бек Боз Ніз Уаї 136 155 і4й ть Бк піостк бхв біу Азр вне пі Уві бат Бей Аху йех Від 3 145 ї50 ї55 150
Тех шІу бій ТЕ вра сіу бує дув Чаї Уві пу бпіу зЕУ ех був був їй 17 їі75 зву Буш Ттвз Зх о БВій Му с Рае о бій Мей Уві РЕУЗ Бе Муз дороАїа і80 іх хво ко ваз бек овапц Ав Тр РП Ма1 Маї 515 Тер ойзв Аза по біУу ія 195 МАВ шо
Ппуз Вер ших бвуотей Аеєропей дяв Мей діє Ше Без вів Бк о Блє ТЕ 210 215 таб вва гу біУу дтб був Аяо Су яд вка діє Авго рез Аїв с) Ток Мет ках 230 248 ЖАВ ча овуа пем оцув вхо ХИТ БЦе реч да Рпе сБкро Біу ху Аза Мекобей 245 ше 25 зі БІуУ Аве Тле бво дзротапе Тв тер о буз То Тух Біб тнЕ 1 шу ря БО та
Ржа цею оМдуз АзроАКа вро біу Ме Ахя бі ат сто сіб Тує сл іх рас до 253
ТвЕ ззи обі Тей Біу Печ Маї БІ тує Мет ст бхр ва Ар Авро Меє о КВ за
Авипоцев; бів Бк хів Ух шльу аї Ре Атя сту ви да Пе Ер осту
ЗКУ 3 зна ЗО пек оБпє Уавовко бі беж со Ме ОБУ ТЕ о Уяі тТієе Сіп Зій вій дес 355 зо 325
Авропіо їІзоссзіч Бе мер Тпсобіу АБрОАтТа був Тож ТБ ув тТлр о пМу зе ЗАЗ Во
Аїа чаї Вку Азасгпув пейш о біу Нів вхо був Бко ТгроГуз Маї Був ТЕр
СОУ зе 5 баї 5105 тів біу Авп біб Ар оТЕроїжо Аз1а біу АФ о Бга Д1іа біу БНе 70 тя ЗИ
Зі дек Тук 1 Агп ТУукК о Аха Бле Без оМеї Ме Меї іл АТа ре Два
ЗВ з55 Зах рЖе бів бує Тут Рхо Аве Іза Пуз Ї1е тів Аза Бех рто Бек Ї1е Рая Дар 555 д15 я15 дви Меї ТНЕ Тіє Рго Аза Чбіу Аза Аїа Сію Взропія Вів Бо Тут Цей
Со 425 аза
Тнх Бу Авробіз Ре ах бій ха пе А18 зу рн Ази Ав ода пед 435 148 Яку чо йвровяей Маї Тай Ппем їїєе 01» БІ АТа вів Бех тло Мія Рео АдЕМ їх 55 КУ) п1у шіу 118 лі Тер 10 щ1у др о їйє) Мах реа гей Ро Тер оТкросту 165 ЕК) 375 «во сі; беж Уаї йїа бій діа 112 о рйе їз Ті беж Тих Віа Ак доп опіф 385 БУ ап
Аве ГУ їре ТТ сі Аза тах тує Ата Бко бі цей Дта век Те Дер ас 55 510
Аха тТкробів То оБех Ме тТвкоткроуаі біз Нів Аза Аіа одявр Ро Ді
Ух що 25 чем Тік отЬх Ак ше ТОЖ Бек Тяв о Тук о хХаї ТЕр Або Ті бем діз. Бі
БАЧО) 535 549
Вів Ті т1а Ага бл о тТвх боб Ркз Хві Дер.Ата ро АІа бі Був РКО 515 55 555 БВ
Аза РБе Ар Бгто Бео біе Туж о угі Аіз біу був бек бім Векобі ТУ зав 570 575 51У 11е ве Був діа дів Ма! Тук Авп о шщех лик опій беж ТІВ реє Маї що в и
Зх Гц пу Рве Ав о 51Уу паза дзп БіЗ сіу діа УвМ Аза Авпобам тих 585 по вах чаї Пец тая дуу Бхо Зі АвроРко тує Му ТУух ВБд обр око БЕе Тв 219 615 23 біу тів дкпоУяі т Був СЛ зу о ТНУ ТВксовве Тря Му Аха сту ув ев Зо б а бфу 01у пуш БНе стру Ре тб Бей бу сіу Мей бех Мі йгав Маї цем.
БО вк бій тк АТа бар лів Хаї Був сі ім Був сі Був бі пев ЗМУ був
Би вез -лЕ
ТУ ув ау бли ж «лій» 15 «11» 1055 «в1йУ дик свій» оЗіВБеагеї)в педе «400» 15 штовадоссв Фчітастьесї сосастссте хесктссукЯ длозвачесе гтоссасоває
Гв)
ласзатпишкс стстсвЕсовс садхасаесос зестізсоблаво зксгодовіса букс Едно часаєсткоє Зоссствоссс чосісаібас вбсзаєоаєса заккідацала гчасссьтсаї
ХО сцводеваче асасосаєзза адзогассай зпстасуста хезасаспає пвосЯакосю, 249 стпсосоазсло ассасоатувс ооассетчсса чтасаззаєо зсоссосдаде сроїсосасях
БІ вичтшдсацевто ствасастос созсзацевс зусазасасту ассрвевоє состууссаяа зей звсазсаасоо абасссбсауч азбодагасе чесслесксав савсососоя совок 42 чісссодава зувастусак ссстсасаєс срсзсеверсЗ зосссссова бікс етає ї82 часбчасцаса сазсстсасьт зчсакоазааь шчсегаксвсузч стлассазиї Есалозасає саплаіайца зсвгаціасаз сзвакстазс зстозсассгу саавасаасас сСсоссвескио що адесспсотауа сглосаваєт Чассазачас акчсзсастє Сопдсачебая досеоповає 5650 ахгчосссакЕс стпяссесва Ччасоучседаз ссасесевЕї ссЗзоапвста ачасспасує
То пЕсобсподава с звесстязає тпвсазсасас апсавчатьх астасетоат сСсаєстакасе тво засасзасос нетатоаттст сівоусаво ЄсСвлачаєссе сстрасоедчтсо ппасвоство лапчасацзав ЗІсподессс айхіЗасчао ГаЯдуасовохс взесстачЧувах спорсвайеає зро своазатсацо зпощестахе стаксасцеї дссаачасас создсаазца са сЕОєче зо сводсваавоц сезасбвачає годе асуВе ядсввадоде адвоссвояс вазоаавоеое
Ібхо 1077 «20» 16 курії» 350 «ав Бхпок «Ії бішрежніїа теає «апоз Схб
Меб був бек Бу сеї Ше не Бе Мей їси Чат бве МаЖ су бід вес 1 В 15 5
Те; ойіа Тако одно Ар оАво осувсБко пед її Твжх Жех о дко Тер отих дів
Зо та ЗО
Ар орко Шек вія Ні Мам Бе вия Ар о Ту Пат тю Бей отТук Рко Веї 46 45 «ів АвроХіз дзр АТ пі Ве біз дви обзор Ре АБО біу сіу Ір отУуЄ
З ЗВ о
Атїв мет дта Ав тує нів УВУ отТух вах о т)е Аво Буд сте стук Ппіу вес
Гея, 7 тк 85 лем оБко Уві. АвроНІіВв слу Хпу дів пай ше Маї сів АБ зай Ріо тІтр 85 за з
Ага овековтц сів Мет о ткр о Аїа о Ргро Аво о да Ада КІЗ Пув дп о пІУ цу що 125 118 тУкотук ота Ту рпБ г дів пуд ВЗ о зу Аяр о ввроїіе БОовоВхО ї1е
Мі тай Та пі тав Аїа мах Вес вто тах СБЕе су 1 Бо Бра ха) Бо МеюоОлуБ 155 135 140
Вакотеврохів вхо кіш тих Бе беї І ввроге» Ака Беж Ре Уві дв їх Кл 156
Лек одер Айр о Ако Віа Тук без Аза Тер о Зіу БІТУ ті2е Мав о сіу базу 518 165 170 175 печ осів ко ТЕроІв Авв опув лав БУВ тує Ав; осма дек обІТУ ТК БЦ 185 185 130
Его бі Аж о огТу тв Ада Аія пен ошек Руб бій ії Віа Буд спо беж 195 ЕН о
Муз двроМар НАБСУНУ Пен Атїя бій Бу РКО Ах, АзроМеб цей оте Бей ран) іх й
Апровко бує Так опху Був РКО Бей бей бех Сі АБрозУІ Авробка Ах па 230 З 24
Бре РМе бійпосіїу РЕа ТЕО Ті Віз ув ака дв Був 11іе Тук тую Тен 245 255 во
Тип тТухк беж ТК ОСІ Тк ТвБЕопує Ту безпо МЕ ТуК Ата тре обее Був ко 25 ло
Тех рРко Тукосбуу Рро тТух Тнх о Тух Бій сі дка 12 пев біб воо Уві
В на 85
АврбосСТу Ткроїнт о тТвах нів Бек бек Тів Маї пув Тук іп о Б1іУ (тя Тр 750 2955 зва тТЕРОСе) Ре Тук нив о АВо Аза іже ТЬБЕ одеж сб1у Був Аве Тук Беч саке
Зп 310 315 хлеб бій Уаї Бе Аїа бує Пух Т12 Ткр оТух Ар бе пу Ту Буш 1Тї8 бе)
За з3с 35
Тахо їув Був БЕ 343 «8102 17 «вТїз 1047 «йі2» дик «Іа» Биавгахіцт охуврокуш «ОО» 17 зсспсвуссста ва сстаюо тспсадсвіста судлаетссто дбдассаозсав асосостле бо сзачвсаста збчасвібос собсобоаїс асодвостої сауссдсяца себе 120 сабчисіїїса агадававаєс сосодоЗгкас ссзстсасо всассдавує савіЯасвасе 185 авсччсасаєч зазпосасісвя абасоосясу апсовтсалзс асасстаєсс сасовастазе
АВ зЕсстабссчатеа зачассссЯ: Здсосласвас погас тессзавсста сопводуките нев) тадссавзатт ассаваєусот Фасссстазо дсазопсата аузасзасза атасгакета
ЗБ басекссоссу содаздасва зовснадахс с ссосззавсїя дачекпсеає стссассвач «я сепзоаспацпьс ерсвставоучцс стасазвоачс ссодбасиссбу стасасасво саеакславлоє 289 чстачесасяї сочасассопя тавссацусст тасстсаєся засусодеей скдеусоре 5Ій садстссава ссетсасадуа Бааазазває сетавосязе сагачакодо адвсзадесі.
БО зессіавод дсяссзаєус сствессосео свзагочцоса зосуваусев пдасвсвсаи 55о вацдассассцо Зазвасвого соавапакодто арссподосо сецадасвоц сзадескссе тав свачовазац асвасзадєс зоднстссЕє дадуусссто ззаєссаєва зозозсопави
Во Й сЕЕБагівос ссаурутасто бзеосацтове абсбСсассвосо Ксцьссаєде сасбессаву 54б вдсакствоя яссостварас стассслодо вачавоствЯ ассссаквда дод аЧесе
КІ аскссвідсає збаїкосвув піасазазза свасуотсас сосок оос бузечЧедеве
Зх асексіЧпса зузлабьвнсск гссасвосеіЗ сведсозЗаєдаа вові стадчта їдвсвгазано чЧеледавої таскосасеоя со во ма «ОО» 38 «911» МА «й12» Пілок «813з Бивалімщши схузровущ «ап» 018 меж сій без пу ре Цей зЗек ех Аїа Те Бем Бпе Бе без Тр о бег
В! 5 15 їй ув СУуз Вій Аза сій АлротТрх Ап олврвоТіз о Бко БЖ гецу їф6 ТАКО АВо о Я г Кв) (вч тка цес АТ о дяр вто пе Віа пі ух бе бій зу Буд ато:
В 49 45 аз тук Бо Зек ців дно хів БІ Аїя дей Уаї Уаї дЕй Сіу тТВжЖ осі во 5 55 -Зи та сій тую діа оМек Ак Аве ту Ні ТК тУК беж Ме о Бу бех та та що ті тТук шуу Туз Алр о Рхо аз Уві Авровів зі Заї Айва пер ойек Ма 85 Зо 5-55
Азова Ома) Бко Рв оАТа бує піп сій Меб Тв 38 Бко Аво із Аза 150 105 119
НІв Був де сі сБув тТух Тук бен Туг обне Еко Аіва Був Аве о Був Азр 5 128 125
Сіц тів Ва о бжа оті Зіу Уві АТЗ Ууаї бек дДяв уз Ро ве СРу рІв ї3а І 135 по
Раш: рух Лід Авр ух бек Ттр 118 Бто 0б1іУ ТБ Туксопет Т1е АВроОвВКО 145 ї5а 155 їва
Аів Бех Жук Маї ля ТпроаБр о АВи Бій Дів Ту рей тіє Турозіу щу ї55 їте т
Тїе Тв БР БІу 3 ге» о біп Аза Ткеробів Дер о бує Був дае бе Ав 185 тЕ5 130 біс бех Тер 18 бік сАвр був Діва Аза бкб дви Піу ТВ да Аіа Бей хч5 200 20
Зек о рко сіп оті діа цу Без Бех Був АвроМек соні Був Те ТНЯ З1й 215 215 250
Тпк РЕ: Лк дзропеи Маї Ї1я це іа бо сім ТЬкоСіу пув ко Бен 225 а 235 24 біл вла пію Авройяп був Аку Ага Ве Бре пі Сіу Бо Тко ТТе снів яву ява ДУ
ТувоАко Пі Був цей Тут Ту Цез Ме Тук бек Та» Сі йвротТню це хви кас РА ре пценоуаії тую ліва тре обех Бу сам ТІ Тук Піу Вуз Тух Тит оОтТух 715 ра 85 вжч сі Був і11ї16 дей й о рКо МАТ о Азо су ТЕв ХНУ ТЕ пів Біт БЕЄ а) аа Зоо тів Уаї біо тує рув ЗІ СТЙй Бер откв су рна ре Аха дав Аза НІВ 205 зла ув Бо тну о БЯХ Зі су йвр тую Мей АТО ЗМ гбяї був вія дез му зів отТХВ
За 336. 335 тук дж о Му Аяп о піу уз Ліє бево лей Нія дк РЖЕ
ЗО 345 кіс 15 «вм 1877 «12 МНК
«рії йерекчі1їМая Ечтічаєив «Оп» т9 чзЕдосаосіс Сезуствасс стабсосвсв Забасссват боабасассав костссекЕс ва шстчагссою айптссчасос сайсостало васасвзасоа зослвацдасас сс есче ї25 чЧедаєтотса стЕфосвсвує ссвесосоде бреастекос вЕдеазвассп ачасекасва тво авпсуоавас сдасазосяза Бавеевовак суссссапсвсацагрсосехща Бепссцосуге ж атодзуІйдяс ацеацісову Бабссаксву сссаєстстяс дсгаховеча додосаЯєве 03
СасврпабоЗ біса ввссї «ддссодсяц ассвазцсєї зобу тсає сопе сидає 38 ссзбассаса вбассоаєогЯ свасяпавсся стсдавеусу созівсарза савсцдасосо ха часаксссств ссозссасса ссасасечос стабзосасуху ссусоуачоуа ссацзаєув зацеацсаса сзевсдатоЕ савздасолоч бсавастзасс сапукавста сссссоуавс 540 здеапассосає зазьссапос спдозцесос сасасіхаса зузачдачасочо асвствстає воо сЕсвІдаєст сечазчачазу сзасодачевс Здссастозо вЗассвьоує зсопавитвача
Би асшоспоазсац зісостацза зссвзсассот свевезсссде песіаїсява савааовасо 720 ксацдвоивос Сспасвогоє узассавося пасток сс езаасоазлаа сзудсадесоо
ТЕЙ чУддссакЗса сасрсзусас соссаховоЗа себосветов зЗаассвтос савуздуссаз кА чвугсодтдс ссчеосссас састопоадач азоачсопаЗЕ посатаєсвак ссачесрому
В зозадесавлха госвстодсс дЕстсосассоя ссвзасзваче дасохсстов соувчазаєе зей ччвісзассяа адевасосув пвазосзазак осачеоссоу дЗассовача?є яссоуцеопсатє 1023 сксезУутато засоба тасцес савзсасачяс чактоувест вобесосьсо чудеса стшо
КВ васасптстус Заессасасс сптоспоокає яапсековсст саастосаза себсзачосо 1145 чласзагдцее гассзекетче сасбуснсаза садаседаса ссепічресас пдрасасгяоу
Тло часзоакасх стзасстола зЧкссссаах чазаасасся чсчечассах вопесртасо зч26о сдастадсаси яезббСаавшь Счесвкоаш сЕКссссвуца саагсовучо деспкаспво.
АЗИ осіб сшадче бспасагаца воадсспсодоу васрвечнай чеесостксє асраадесаси іщо чкасспозкКс ссавадваєт укоусодаєсва весгасссоас срлацаехтсв зЗассаспадих 1545 адсастсате асорті састоссоса пегвадсвасо сізсатаува псаавосаюх 15) взссдсдсса всїсчієцав сассазчеьазе 5абвсуапсво злкстастаа сосЯсеБУЮе ї5БО часакусано ссасуєссва сопсолудсо одасссвсовс ссусаєаєаї слосвовоє 15260 ачасассваас часудоазесеа чассаводес Без сава саЗсстсая позскаа 1677 «віймж во
«й11з аа «ій» оБіЛлОК «213» ВзраехоаіЇ1о8 Елі пав «4с0х Ей
Меє дів Аза Роз як ел дек Тук Рео те Ту Т18 іп ожех Тук ТпЕ 1 щі то іно ази орРЖО рей вла Бро бЗіу Терон сбаї др орто сяЕКкК був АХа Тут уд хо 25 зо азів бій бів Ази отьровре ра осСув Уві лат 5 Тв РБае т1і6 Аза тне її 45 вре біу Бей кто (еу тек АТа цес вка дво Тез зіп лей Те сБев пед ко 55 Бо
Ахв бек деп її Ре АяОодкд РКО Бек сів іе РІО Авропев» Абя Уа ве о т Б тТакоАви ІМ біп бій бек шіу її ТУ Ав огБее ТНЖ без о Ака тТук Вів 5 о 55. бін Бі іп оре туї Меч Тіє Уві Бех Тук цв5осСіу Бо Сів тво Був 195 та5 10 сб Бех їні Ве То бак чех дво Бгто тТук о двр о днроАіва дід стЕВвояВЕ 115 тео 175
АвровБто ве: 13 Бе с Ата таї Кі 5ІУ Т1Е Дер оБго АвБожліє виє тр ї3о ї35 гго авеонів ер осіу ТВ Уві тук Уві ЖБу Бек Ахв осів; Азросіт Ме тів 145 І 150 155 155
Був'сів Тут Так пез Аве без Був ТБ зіу АтТа сії біу Бко Уві Ар 165 ї7о ї75 тух рей Ттр оАво СвЬу ТВж шу суу Уаї Тер оїхо чі б1іу хо ків їТе їво їйВ ізо тт Гув Ак Авр обу Тух Тумк оТук без Меє їїе ліва 11 Б1У СУ Тве та5 га 205 сід їєш о Біу Ні бек опБій Тк Ме олія хо Бех Аг Тв о Ака Тпх опіу ех віх 228
Бк Ткробіа Бо тТук о вжо Нів Ап Бо Гей Мем беж Авп Був о баУу ТВух 5 27 ЗВ шо
Бек біц Тух Бпе біп ТНк Уві 53іу Нія Аз Вар оїєо й бід Аве СТУ
То 255 сви сі АваоТеротТур Аза Уві Віз бед бес Тьх дка Звгобіу ра Дів
ЕЕ ее зв
Тжхр о Гув о Анп ТУук о Рхо Меб о Сіу йка біз Тс Уаії Бес віз БРко Від да 25 28 па
То зі буд осіу бі Тр оБто Уві Тіе ЗМ БЕо Уаї Ака сії сій Ме 230 235 За зів З1іу Во Бе гго Рг то дво Туз Ву Маі Сто Ако пту бі б1У 5 10 35 320
Зтіу Ттроїі Пув піп Рто АвроПув Уві Аяо» Бе Ас рго бЗіу Дек був 375 З З ікасвко Аїв о Бів Енеобітюв Тех Жкр вка тую Бро Був тик бі Авео бе за 345 за
Тв о уаї беї вхо сАха ХУ Нів Рко аз ТВ Пеб вхо їм о ТВк Бу Бех 358 ви 3655
Брш ОТуУК Вп овуа Тл оЗТ1уУ Тг овІіа Ашрогвяе був Бго Авроваробіу бе за зу зва
Бек преп осуваі Мет олЛеа Му ЗІіп о УВІ дв отих гей вне Тс тує НЕ таї а 5 з-5 то
ХврочнІі бех Ве дер о Ртс пув уді Віз дер осів пра бла сту мазі ТАЖ ж 5
Уаї Бце Бей отрут бів бів бів Вів Те АБЕ ЦЕ о ФшфУ ФЬаошак Бей Без а Зх СО) -па ТВ ОТ бід бу бен ек со бзж о Уде дак рів Ахеа маї обі Ху 275 4 М
Ака біу вп отТук бра оТхУ Вжо ієй Би бімч Ата Твж Чаї Бтхо УЗ Бко 4590 45 160
Бувозій тТрробує ПЬУ біл тТвк іє Аа Пец бІЗ ге 5їіб дід Заї бек 155 що В зво дЗвеотпк бка тук Мах Бьсе Віз Ата Вів Бгто Віа Вха Ві Рекс свій ЗІ п 30 95 йха Бій тів тТіїе де Ага вій АБ бе Ше) Її Мві беж с3у ВвроТвЕ ра 205 вій біус вх Ре Тпуобіу бег оїво Уді біу уві Тук Віа ТИЖ шЖек Авпобіу
ВІВ ей 585 с-Уу віза сту леж отак ржо Аїда отух ї118 еколо Тло Вку Туко бію СЕУ ов вжи 515
Аж біт паз мес хів во Впе сту Во уві Мав Без бах тує 515 а Уа «аТОух 1 «сок» ЗИ «212з ик «йк3» пев 1жше бабі рова «ай» 1 зізЗцаваца гзвБадсвссо датсьтоо зсасЕозЧосв тавро вскає судасаєосє ви аїсвостасса асосвіесса вазудосчяс айтгалосдосса зососскося абасузосоо 120 аУкссаау ствавссовосї сткатассає вкагаваач бчсессакЕ схзазвсава 185 їсдадчасак ваассвобас озбоЧчасзУсч Чссихатос вовессЕ сяавадсосуас 54 свесссазач баосаєссвес басссачсга ассоссоаакох абеаєсзчаєсст десааточас вн) сзассстаздо чдстссздааї сбдасавасєс сбсбассаєс сессвсдссо аосссвстса.
ЕсНІ зссїсассяа запобтсвас започавоса соч сусдс анабеазачао ач тачавассняа зесчваваєв ївейсоцпчсє саглопзоос спсазчпчацаєс сассавачаша 48о зестстзасає сбоїогксвт сопавнотова сасвадаацх сохсосвасе босавзалеса вок аасесстостл сваавсасавя частчодикос ваЗзасавчеов сузуєсаса посаяваавоу аспе сацсатсваж тассваєааст асиоковася касок даа сссадаодта пава
Бо базЗчевзах ссваасосссу сставесавту гаспвсвавс зівоасзкЗ ахатласоцях
ТЕО
Честадасьо слаапесцаєс вастсосвте псосвалхса савсвансост ссеавсосо що
Єзасазтссіа соход'ова псоасазсоо застадасяя садлаацсвосс гасезаєсла стсгпаєсткус аспоазачаста асобуаввас ктззазасвс сссосаоьгс сзаопесачів
Зоо сзасчсдода заці восовво сусештвсву бізхавчвач авсдаявсоову рачдацчаттюо 5-5 І сошадассяь тагачгазвас псазкзєасу чассовоуаа ЧазазсавеЕа дадсезисеє 1055 цаїтлайсає здати с зсдасдасав чалосхояае ссшезсоває декора 12п8О пвасяссвяа бссацьовко плассаьвсе саїтсазекої бпссугасяя засо х 1140 асстсссуав сдавотксяза собосваавося зтбсосвопо акзтотатсувст пасаевовса 2590 апсзапссов аессосцаса ацеусоссво пхасеассята тезтачесай савасдишки счзастахос Чазоссонр абопаскласс асо осзачає сосявасуваа зесавентат т32Уу зеуйчодасє азазасекат атедсовасо забсссачав асавсабсоає дестакавсв 1380 І стзаянтахос ссатавсєтас сопрсаБеузав сіБоцзодув сзвіссовоаВ ссодедесав 1445 скделвадечев скассаєсва саїссстаєсто сраасдоєкх сатексосво сівавесвавох ї15пе бетваїсдцяат пдосеЧцісасв вагаазаєсєзс гсплавсозеву бФазаавососс сорессклза
Т55О0 ахтавстцттЕр адтодітатка ассаєостсєво асадулазаса Єблогасстпе гбарссвааве 15250 засостаціа актсодоцис стодазазялс ссалтесоссі Єостацоссве спасе
ІбБ5о тесасічсазс аазчекускс сспвзасволо ззацазуадоав агтедесена чЧакависое 740 зствассвсу сасодавеєс сСасьсптсув чассссавса сбсласвазче зодвстаате 1500 чтсавтасаса стоссавкссоїї своавагасєс аасаєсткасс вага сс паасастсасс 1355
Чпоебеуссавоя сідасесуєт позевсавую сусксзасва Ядсепзсагує чвосвачеака їз325а саставоье собссесвутї савассесзса часчсчадчос аастуссосла все со 1985 сдуг кшндітездда ВЕ. вок ом верх Газета ото озна тов всевтх їзхааасача ахсасостава акта солас часссзчопвУх засо васа свчУуксовиє во амастпоуста песуласцавз асоасвасас ачазсссавс ака евечу сезсопавтта 0 свзсадовосс бозузосдксп шспесвассЧе ссазсхечоа дцабосаасо сазауааєсио вів ахастьсасс абсспобев: сстасуаєос зпвасуєассю васвасссся содсасссда ше ацЕгділцаау асічачавос асхсластас котазатост сасчанасах СбдзасссвУ йо
Еткспецвас ства сезсссесяа аасодачева йо «їх се ках бай «ва» сБілок «даЗ» рРепісхкііїїит бизісОотоБОт «ай» ой «в БІУ Му Мат тю Нів Веб ХІз ої Мало Уа Сжис БЕКУМ фена Бе; ве
М ЗУ НЯ Мет б У Нн ку т Ї зйдрі як г дім о йфжиі бер дек
Ю 5 10 15 чвМохіУ Мія Аха тіш ТК тає Бкйп Мва овех бій бат пл іу АЖО ух го 45 о так деж бус пва бій отуж сСьжш теп Меє Бе с1а Ав 112 Вей оНів СТу
З 46 5
Зі Ахо Ту Бу зи тує Ада бів о пео Уаі Вк АБ Ач діа Евйе СІЙ о Зв ва
Сі бек Трек Ма! Тук Бгто Аів Азпоїеч Авроціу Тут Авробеб о у8ї Аз
Б тю В я
Стр лів тів ува Аза Бей Піп оз5п о їем ТБк зва Бто цез бен Бк Бак ще о За
Мет Ехо Заст демо пед йяв Уві Віа рук Сіу Беж дво Авпосіу Щек ЇЇ 106 ах Мо дію це Аза Ага біз біу ТтротТхроБію їїе бів Узі Був Ехо піп оАхо
МІ 128 І
Жук Ала піу Беж Ре тТук Уві біл зу Ар о тук спа бру вро Бе оАвр 33 16
Тіе бек Бем о сій беж Був рез Так Сів ти Маї Ре Аїа Тнх дів Був 125 150 155 ї50 ува Акта бат бек пі Був Нів сіб Авроткр Узі біл отук Був Тук о бпіш
ТБ 178 175 їз Чаї Ро Гу Бук Аз дів Шет Ав Тіе вай йнпо ответ без ТБу 118 180 185 50
Тит Рне др овзг ув слу цей Бу АввоЄту Щех Бей одяпо пе дві опе 155 емо о
Те йек беб Враз о буО Бкс Тс То Авп АБ дк орує Дяпобіу гемо дка тій УК 226 І і
Іїе Авробен чаї ЗІ: Аха Мес дІіз бпбіш пбецобїн о 51іу пуз бе їви Ак 2 230 235 25
Ре бко біу ТУ Зеу Ав оМаї поз б1у ах бів Аза то Тух ТЕ отух паз отв 255. цувз Твродки сій ТвЕ о Маї Біу Дер отяо Був йвр опа Тук бву дхе рЕб
БО І ех 27в
Бех Вів дгротйк Тух бід Бі Бек Авто біу ї1е б51у Цез Хів бій стук р Р) 285
Мет Ав Тхросув йо АвромМет сіуУу Гей Ота Бго Хі Пез Ата уві то авОозіУ ків ТУуЄ Бей бат два піз ах її о щех ба сови Авро це хі 305 зїпй 15 350
Рко Тк Ті АвзроАЕротТнху бемпоАви СБ Гей бій Був їей Мет зту ВІ
Зо 33 зав
Бгто АВ оОТНЕ Ру тул сплту Бех тероАтЯ Аїв Беж ей обсіу Тук вка Ку 340 зх 356
Бтїто Тер отТвХ дів дв тТУух Маї БМ Гі сту дя Зі вбзроАве Бей о Тух 350 355
ЗУ іш ве бій тка отук лів АТа Тк о АкЯа ле ЇВ ОСВІіяЯ тує ТУк Авр. 370 75 ЗО
Віз тів Так БЕ Був тую овВко Нв о Меє То мах Ме вій беж о бейп Те з85 335 зач 300 сів Меб о вВго бі1у Рко Аза Дія АтТа Кіз бек о Азротує Нів бів Тує бек
Ах 410 рек тьЕ РКО про осху ве Маї Бех Сів бе Авмлотує бе Авросла Ме вто ї20 425 430 туаї тих ази Ат Тих Пед о АВп оці оз л16 вів тпх Уаї тую ро Ай 135 230 425
АввоБко Бвжх Ахто Сех Увт ака Тжросіу йех Рго БНе о бто Бе; Тут хо
БО я 168 тер Тер о їіе сту бек Уві Атїа 53 діа Уві Бра рес ГБе шлу 1 м й ал 47А во дкц Аво яву рт ув ІЩїе8 о їле сі АТа Шах о тух піз Бо МеЖ Бере дув 85 ва ах
Ашп оті сбовоАеа Тер обіп Теробет оРка тс оби тів Агж Бре А5р о Аз вео Бо ой ази ват Ваг АгУу БЕ Бех АЖЗ Бех ТМЕЖ беж ТХЕ Бі УЗ) ЗТїе Був опе 515 їх 525
Вей бех ТК оАво ПУа КЗе Тит ЗІ о Авп о реа БІО тих тат отТхв ве аю
ЗО ЛЕ 54 біу Ав Їїв бі Бто Гез о ТУую Ткроуаї Віш сі Ак АЖ бю лай оТтоЕ
В. БІВ 555 о
ЗІу Зек Ап Ї1е Ре дув їв віз Чаї Тухт Авп бек Тк дек Авробаї
І б та 57З
Врш Уві тв о Угі пі ке ді діє Сук дви дів Був Єек Аля Два цей у ЕН зва
ТрЕ Іле Гц век лк двродзровеЗ Ав ліз зеж пвистую КЗ обу у ах во БО
Рко бій Маї Удї був ТБЖ бі ТУ би Щек уві їМЕ Аза Ашіу діа нів
БІЙ БІБ ва сі Афа ре бід ве Яви Мей яко АБИ Бей дек Уві Аіа маї це» Му 5 вла 40 тпЕ бі леї З «ІЗ 35 си12» ДНК «Р1й» Аврегеїі ваз Тінілаєих «4005 3 акедсстсту псгсстівссу Зссроспдед впосососста мудчвостет суссусосссє о чЧосчазвссоа адассаєстос Зіссвайчао аспозпсстве аспацткояо звався со ї25
Чпуевссссаз цобссассозЗ срдудзсавс зоастаєстаєх аствосттосоа дасодавочяє ї85 ччавгачсчасу пузсстасає сезбусєсосс счсоЗсссяь астосуєсва сбтудапдаво
ЕК) чіасосиати спсоссодсзо зазавасточ вассстодавстосствачеа сопаашко 00 їсазсп сут віясасачвос сгсгачстяя садчаауєтаса вссаєбедзатт зсслаччєво зей сіксавсссс восоадсаводя чекасебаао какссасздс саоассвоеса вессосецах «о тчачтастат чека су асзовас втасаассосо дасадевасо чуасососау 480 пчасвскчсс васаспувоя сслосасьув слаасзісотхає зспзссассс астасавіге
За уесстссвЕс дЧаазутазссаяа воасоктсаєсє псачсастос серосясоася ссіссвяцеаз ря) сассозсозс асічосзсся счаєсавоса стесавеосс гадацеатає сосумаєлай жей сстцдотлчвасс басааствес азаєксрсох сасічауЗЧчу свсопаозаса бдопуавсесє тб ткссаєсаєе зсосїзстац 38 «ях ов «12 шия ши Ми» БІЛ. «13» Аврехаії1іав Бушіцатив кАпОот ий мех уві вах о єпе Бех Тут Гео тво бен Аїв Су бет діа Ттія 5іу Аха ї З 15 15
Са Ата лів всго Уві З Бко бі Таоотиє дет Бе Азпос4ц тт Аї а. не Зк З)
Сеоз йгвз слі» РБаз діз сіб вка Аїа біуству бо ех бек Твх 03у Тхр
Се 45
Ав Авлп обіу Тук Тут Туг Зах Бае ЇТхо ТрЕ Авробіу Су З1У дар Уві ве З во
Ткж Тук Тнт йза спіу діа Біу сіу бек Тук беж Тві Ав лЕб Ахо ДЕВ 5 Та та ко таї с1у Азв Рбе аз бі» біу був СІТу Тгродвп о Бко Сіу Зв о Аів Ак ве з за тис тіє йнпоТую біу Біу бас Ре два Бго бекозіу Двпобіу Тухк гер
МВ) мк 12
Вів уві Тих Біт Жтр тах тн дви Бхо Чеа о іїе сій Тух Тук Маї Чеї 115 То їх
Сто Чех тут бі» ТЕ Тут Аки Бо сі бек СІ1у сту ТМх Бе пк Біу 135 135 115
ТпкоуВі АБвоОТБу Азропіх МУ ТУ Тук Авпотза тук Тахо Аїа Уві дк 745 ї555 ї55 156
Тух дз Аїв Бека беж тів іо Слу ТВХ Пув Тл ле тк бів Тук Ткр 155 175 ІТ бет уві Ака Тих осак Муз Ажу Тих ді» бі ЇКЕ Узі ТвЕ Ме о Ата йвй ї5о 155 155
Еїв Ге Авзподіа Тсроцет ато Бей: спі Мекоделоїви біу ТВу Лів дя ї35 20 05
Тух Зіп ї11іе аї Вів ТЕ сій щі ТУк бів Пет бек 5іу бе АБа Бех
БІЙ 2 що
ТТ стьК Ма) ТУк яз «рій» 85 «її» МП «»12з дик «213» Адрекці| ца жлитідатя сані» 25 аковЕсвсося Упеспоссоі садове Заа сттадссоота бсозссезасто авось
Ба ссаєдіЧчаса гассофісац сттадсоедав сохсадасуа ссасоєессво ссачасвуче 32 зсалазсазсоа сстассзока сСсрсосссссЯа ассвасазсв соловтісвазУ чевзавтахаєсз зда авесуслссЯ зло дваєв кзусессваса сазподчевосс ваазсоадстод соаасоксасс 24 счейассавча асрудваєсо адупассоас сабізачева субсссвавя сбасачвада зо чоасчсасая вазшесассва асєскстасе воЗгласаста ссосстсоца садпешксвдах зей сстбсесочцаз ветдсттасих асосчресбас спсактячаєса псавсососее задбоЗзваває 12 їтасасостсз взазетатай сезттасаахє ссбодсксЯс песабзчасоса свацедсавиє зо чсассацеєз згода ссоас псасчадлакс сзудазсасс засазавсав сссацтситу ай зіссассиациа сзчесвоссо саезосавсає созЕссвпос Ффпсазнасаа позаситеєвоє реее чЧасвсеачЕса стассасзза гсасіссяве уся ева прссопоачеє чазсостЯЗе яко асасаєзгвсх абсзавеєат Кбесвстоааа чдуасаксзода севасзатас сеодассако тло зескчеексаї стае чивкс бостссесасо дсавасучся певоактедео бассасессе та
Бевцесецих посстаскоц гачткосойт вага усестосав тд тен веж сстаєзуусв костчаскав чапавасеи бас аеас зуссацсвоеяч зксаввовад зоб ства сразо собастизсВ апсрстрссоп свобпоссва зт едаясо узсатеакт
Зо ссватгастхв сасуаєсуйо бпссасцахо ашетосаасх Фа 18505
ІООЕ
«иїоз яв «й11ї5 ВЕ «ки? Шілож яд» бвдекоії1То8 БОтідьсия ен
Мес о ї1і8 бек їі сек шек Тєй ЗзЄ Бе БІуУ їей Аза Аїа ї185 Аіа бі ї 5 10 15
Вів Туховіа Гео бо вах Або о Буз Беж маї пет оби Але са Ага бій 2 В зо
Тв жів Тве тве це ЗТв Тв бір Тв Ава Ав осСіу тує Тук Тук Бех 35 о 45 те Тлр тн Авт о біу Віз бЗ15 Бек Уві біп о Тук ТВк ойяп бі діа Ху а З ай біу сліз Тук бек уаї Тв Жтв Аза доп Віп о Авап б1у білу Ва Ве Тиг о Ти 75 30
Суз піу Мув бБіу Ткр дви Ро Ббію бег йзр о Яза Ав Тіє Трт Бе Пех
Е5 50 5
Сі бак ВБе Аовпорко Бегобіу АвпоАТа Тук опе бес таі Тух цпіу ТІр о 1К. ЗВ
Таж ЖккодАяо Рге рев Ууа1 бій тує Тук ТМ1е Мем біс йво Тухк о піу Жах ца тво 175
Тук Взи Ето П1іу Вет бору Мей Твр о Нів Гуз біу Тк уві Тих Зак др 135 135 140
Піт обет Лйт о Тух дар о11їе Тухобія Вів біп бік Мяї Депо бій бго бек 145 155 55 150 її баз ту ТВ Віа Лв Бе деп обіп Жук Ткро Бек 35 Ак Біл Дяп т55 170 175
Фу дк дек дет біу тиж уаї Тит оїве Аза дер оНів ра бує 14 Тро 180 і85 ї90
Аза ожех тні су Мес о Азпобен осі ТЕ нів Ап тую сій ле Меї бет ха 200 В
Тахозуа біу тую сіб сек Бек ЗБу Тк обех Тпж ІТТ ТВх Мах бек вх 51 215 ей ім біу ек Зет дв о блУ 01У Зек жі бі1Уу Веб вес век ТВ ті ек иа 2 Зх о
Сех бі век обВех РЕ ТПпК о сіУу 5іуУ Бек біУ Бех був щех Атів ви Тер ах ШО 5 пу бла був о сьу б1у їТе оїу Стровбеї сьу Ре ЇїТпУ Сув Су веж Бек йо 275 шіу тТнЕ був суб Уві ЗежЖ АБп пах тую Тую цех бій був дез 275 ТЕЙ 285 «1 7 к1ії5 1053 «війх дик «йї2» ЕБрзахіншв текБісіїікеававв «поз 27 аспоазсвса зе втадте БЕсаосатту стастясосі гпдассодевв педсЯслеу ей спвауасаста акдаєаестс тестогляси аседасосссвії опеекасучА сессусча. 120 паїзЗкесосу ззазасзаася сбдаЗзессас пеабстсвсй зсассуваче ствах 185 завацевспу чаоцсдлеса сдезезуосауч апазавєсабя асасстязьсс сачовататх а вгсстасшосгя падабсссої сабсочвссвзЕ заспстсдеви пепосазссса Єдаваейтоов а аассузачє ацпсаватася соусу ссісео савстізеа апазспадесва воатсатово
Бо гастроислосу псзазчасава аздаєзачате спсачваєсо чачуссосеае стссапсвад 320 сосзапошчсЕ СКросвасше саасдачадо СЗчетсоєссо чтасттвовя бабочавеск 180 зстатсівта посаєсєвзства Сцусовчаса гаеассграксе Ззвасзлот соаацасуае за садстстсадба ссссосзуда ссасвасасс сттаактоась сабапесста спзсавацих впй чесссовас) ссассавтує спраксвссв свсаєсасса аоствадсва здодвсавасяс 550 зацапттвсто воаспасосссо сдпатстосЧьс аксотозсос ссцчачасзяя сзачесест зий савзосадацча асзасвеадчоФф возазкЕстс дасчтзостЕ дзчЕсалав дсусдаєсваєч їв стобасваєс созсобасвсо саосучидає асосассбсо ссчесратає двери 34 пасасстасч зсссткатас ссапсазоас вацаскстот ассестаєроВ козам еадат яв водасвічава растсссча Чсасвасоде свуєлакаах описі кас зуахдедевя
В асепсуцчаа зіЧасухкеу Чавазевлеаго васцсчачча здасскадла сдасаазцях 152
Зядсаасаєсї ссЧектессся сосравчаляо мно 1053 «й В «вії 330 жаТЕт Білок «15» Ечзакіст текбьсії1коїцев «лох га
Мес су іі Був За Бей бек дет діа бейп Пез ей бек їй ТБж ої 1 З 10 15 вввпобувоАка Вів бів вер оТвк о Аяб Взр ціа вто го Бей лів Тих Аве 2 25 ЗО теп тТЕвоБек Аля АшвоБхо бек АзЕ Ні СсУВЕ ре біз сіу ув о Ови Тхр
БЕ «у 5
Маї тує Ехо дек НІВ АВ І1е спі Аїз бзпоМаї Уазх ал Бу ТпжЕ біу 530 За й сі вла віп Тук Вів Меє АкУу АвоотТую нів ОТНх Тук пек о Меб пуб Те та 75 ва тал Кук іу БУВ Авр ВЕ Мах ГМе Авронів біу узі Ахзв лей ВЖЕ ув 85 ЗО з ля АвроМаї вто ТтроАтя Вуз ЗІБ бій Мел о Ткродів Ріо АБ ові лід
Мо 105 кій
Ту пу дз о бі1у Був тТУук Тук Бей отук Рлє ха Аїя Був АвЕОСбув ЕД
Кл ха Ж змі те вне йга ї1е о 51у аз діа уаї бек Ако Туз Риф Бек О1уУ Рхо і30 55 129 пе Був одхв двр обу Бек Ткроїтїє ГЕО о1у ТБ Тук бак зії дер РЕ х4х 15 155 ї6а вів бех Тук Маї Азр Ту блок зі Аха Тут їеиа ІЗ6 ТЕрозху сіу ї55 170 175
Т12 Ттв обу бі бів зей 510 діа Тк; сій дзр Біж о Цуво тн рне дв їв 155 130 біб де тур це; біу йвв бу Аїн Аїв Бхо дво піу Тс дай Дів бе 135 ни 25
Зет Бхо бій Тїе Віз Був їшні Шес ув бво Має Вів Тув їле ТБу 51 219 215 КО
ТЕт о гхо ка сер оре: Уві Її пейш дія Рко Зі ТВгопі» Був Бка Бей 28 що 235 ко біп вла бін сдяев вва Муз Аха джкз Бе пе біб ЗКу Бк Тер оЗаї нів вах о Б уз вкЯ о ліМ (ув єм Туг тує Пен Має Туг дек ТЕ Зіу Авт Тпе Ніз
Би 5 ла
Вве опей Уа) тТук Аза Твтобек Був оАко Тів Тут бі ржо Тух ТВх о Тух
275 29о ВЕ зЗіпобіу був Їхе о Мес дер о Вко млі Авробіу То Тек отТьх Нів о біу Вву
ОО 25 300 їїж Чаї 510 Тує пув Б1у бій тро Тк їв Не бе дів др віа Вів ах ЗІі0 хв в)
Тпе дав осі пу дер тТяк Ме Ага Фів тай тув Дів ОАхЯ Був Те ТЗ
ЗВ 330 335
Тут Авв Сув Ахрощіу уз ТІ Гей о пемз Тв Вк Бо БУ 18 350 за5 з50 «піт З «ії» 193 «й1Ям Репістізічшт Бапіссб вив ч-апох 23 асзазчссза Зсзсосісос скасупсісе акссподото костсаасопо зпсеаеоцеся. 0 пваспчим сапобесссав Гадедасттв соссавосесвз пс свасвча зара совех 120 чавсастаху саптсцатає пассусдавас чсрачіснаєсе спбечдетас шесссвеса
Т85 часктткавса стоздчаєсег ЗсЕгосуде асапаєсосе бссстудаєс астевстева 245
Евпосачссо сесосссаса азхстудуєу ссачавтеек сатесеназчс абс заз бааасавсви ЗЕсСпаочечи ачабозцесз заававЕдає асзабваєвае Сауцевцяви
БІО зпсвсобтакук сасчсассве бопдосасссо сБоссазеда спссадеаае састосаесе по пбосссдезас спуеузссотса супдавацес ссрасатосе здоксядабачс десУуртсося 480 детсвіксвнов ссачповоча псхвгсваса позаставеь гегсдасаєсос зесоузсасвва
ЗО кагасакстцс асасваваєі чацідаваса зесгсвсасачЯ соабудавио восасашссв а вла ссстлаєсає ост сзасяаа аЕзЗЗзопеова асудазсвас сссзастсзо азестватосс сьо австсаєкше ссуатссазое ссєЄтасясає стісчвотсда зостосьвеЄ бтастостсу га зовзатуааав стассвсопе засто ссаасгаоса сазовсівзах бастасойхв. ва сттсагаєтес сбасдеєссся тецаєтаєва зсссгтодеат о савасвайОої Чедсессата пай сасосквасЕ сегпгасссця асосбвоаєста чЧоаававсяд засавучаас чЧесовкочія за
Чицесзцеке скосукодатє досассивоа бут ахсеса соасадасстс засдоноває чо зсакстпова сусасзосцдос Сеат сасосавнкова соацоссацче зась яутта їпУо тактова в оо вод «яїйе 30 «8119 прі «512» Вілок -г137 Релісіїііпйь ЄрпЕсціовме сад» 30
Мет дет дуа беж їі бец Бр Ту Аза Зв Чаї Бе Дів Тен обед біу ї їх 15 їх
ОгУ Віа 16 Аїв о пл вх о впе Тез Узі Бе) Авпошек яв Вце Бко Авр 2 да за
БЕ бек Бей т)Уе о 5. Тв бетх дек піуУ Ту ТУ Атіа Ре діб тлЕ ТЕЕ 30 48 штж Дей біУу маї пво о АТа свя Уяь о Ата пйех Баї рує АвкоБве Аза тьх 5О 5 ей
ТЕеротйг Бей обуви дей 5їУ ТЕ АяроАла їв бо бі БО рБе Зк девЕ 5 то В во
Тур оуаї АТ бегобек Біо біб ї1ТЄ Тхройі)в го Авромаї Бей Маї ух 5 по 53
Аха АзвошМу Тв оту Уаї Меб Тук тре Шаг дів бак Ате вія бех дер та 1055 та
Зек аіу ув Ні Суд Маї біб Аїв Аза Тагодіз ТВЕ Бак освре дій шу 158 185
Ежо Ту Тит оБкс Меї Авробає Аза Узі Аза Суб Бра ес дво бій спі 3 138 125 біу Віа зів АвбоМів віп біу ря ЇїТїа АвроТвк о Авробім тВх ліве тую 145 150 ї58 ї5О
Уві Мві Тек уз Тіє Аз» 5іУу Аво бек обец Аябо су вве ОошіІє тре Та
Тех уто ТВ
Нів Вк о тТвЕ о Ксо за Меб ем салі зіп МеЄ 015 Аїв дзвоб1Уу Тв о тпЕ 189 185 ї95
Бго оТвт біу Зек РЕб Тіє біпоПез ї1е джроАса Хек Ар о Пем Авробію 185 25а 255
Вко зей ле Мо йха БЖо бек йей цей БПемйофек Авт бі Чі Тух Тує 210 215 ха їец бек орпе беє Бех АвпоТує Тук АвпоТБЕ Ввп туго Тук АвроТах бехт 0 ЗЕ 240
Тук йІта Тук Віа бек Чек 112 Тру шт Рго Тероїве ук бід бех Аїв 245 БИ 258
Ррс тую оАіва Бго Бей гбев узі То бію ТвБр обі: тТбк бет о Авподзр о піу 5 ах МЖК
Аза іечо бек діа Бто біу Біу АІа дяроБрує дек Уві Авросіу Тну Цув щіВ аво 285
Мек рей ре Яів діа Аве цез Авиозіу бів дор Те беж сту бі Ддта «90 95 За
Аїа й Рйе Аів ліз Бек Їїе Тр біз Дія бег Аврохзі Мазі Лю о пей 305 З 315 зд сі «із 31 «415 186 «ти» дик «182 Тахагкілт зеккіст1тівідев «Оп» 31 зкчцеЕтвої ксвуттсаас сстацчоуаст сечоскеце: сечо сова ксаес васвоссв3й ссдасвосая зодсдопеввас шекасваваоу цксассасєтя тощо 155 сазоазтсто ФедскЧатасє вссастуйоя зістаєскодаув Кастваскся дашонадах мо зксазсгнавт ссцпзсзярая сзасасскас Ясоцедееся сбсотаахсов бос ссеЯ ко сасацтваза вакассстьар ссвкскакев чадсезуразвю ссагсяасца боса
Зо сслогсавсст пЕсшЕсуабає сссососцеЄ засусоерос соч Ессяс давасакоемац. зла сстізаавтч здсавцоссав чозачассаце гшсссався вача оБсв поззаакЧее цісвадчавст зазадсясає Бацевссссс гудасгаєо чсосебасав зооссвскке а апласьгст гесоайусав себсвсстає даклестеко ссвосавова зассааубос
АВ запоассявся ацеазсгася чусодавасьс засос храссоства сайчваєоєс й сстазсдаса асзасвосхке вастарсаєс таодасосса зузкзазсава свабславає «чодпавсяеча Езсасаскда савовсуєаєс досисслахо дзусропеуя сгтспвашото же зулацекбає Ссссттлссва стасавсадчє споавсоваєса чЧоісросоавах позбобсдее т78У сачасесвсоя дасамесопа сосоедтінвадце зсбастаноє сасчсеатс срдатауво:
Ай
ЧеспасЕвеаї зазазачачс ссастасасо бпсссоавою чеясводевс дЧазалезата па птваєсвачеас стае соцаводвов бслосязаст посесусвзає счсвсмуєех зво ксдсачолі і. спозавессас садсядвест аболессвас авсоссдаву асересалче 1050 чЧчлчексазчса сапозасєом»г зчзавтсауєв загБоспясив адзстусацеаа сапу 1п5о птатаствата чаєгубсвоєе Зксзосчоь асастодосх спосо ссодвс дфиссопаєол: 1145 сопсосСавбца сеавсвссву ссссрсвусі зодчасодєчех ссосчачасс зайвстсавос таб чазчшсссяї сассксадац сачЧозаосзе вЧчозсоассда поессацесас сосбавассс їхБИ
Еседастсстів стасоаєбоза Чосудалаєса вчудзасвучест сапказвсає сосасудчесе їй
Фавст ссевз сзаодчвасас сасстссств сасбсостсста часов сао завосссаєсе хво сочатексає среасстос сскудисоке стзтводасос собтоадтзад аволясассу 1449 чЧесьссасав соссастосу соЗзавусозч ассассвово тасочечач сстоасуте
ВИМ кІсдттозоадча асовзоста когувіваса агзассабу4 Бсасвесвех дач 15656 сьбокассла ссосавсЯчу дансосоадеь дзаЗозсаа ссссвсаесь Сасоссетуцх. 157 ззатсхтскаш кактодсаао Яесуссасто Ксбослисез спцадласаво апезавстга
І68о весевсодаво актекяодею себасоссва здавсовздав сс чЧасач Кодоомасов 1745 ссаслатоса вісодежодесбпвстосяаста сбЗассовосоо сьосассасс садка ївас часваскшео ссазассво сдесвуисасос ваЕвдстссоссс сассассодсссовоєсодасо ї8ба састсастая пеассзсоцї зачзастваач асзазодазос сстваєоссвоа азбест хЗ2О сасзгдасає сСассвазчає з4ехавсцЕєс стасакскої оссостсаву Чобуссавое
Кен) сспдіосссСя азпстоадвуєееє асутсбксься совасваєслта завздапцесое Косберлвов
Зоо зезчацессстся свазпасввс загбчесобгт асаствачав звекЯссстос азабооадуа 155 чаавадеуЯт Кхссватусо вазчосссстєа асовзасочх сзесчексостт дасасостоса 21БО зсаазсчааа ссостхассосї всостай гї56
«пі ЗЕ свв» бе «ли» БЕдеК
Й.» Боваєта тексісмі лов «й» 3»
Мет 81 вка Ре Зежк бек Іде ме Аха вів вія Ахя Суб Ре УЗ КХха х в 16 ї5
Уак сія йпяж Маі Ази ств буд Ма3 Авройаех му сіу пу Де Ат ТЕЖ 20 25 6 ек ЗКУ Нів бій те бі бе Пед нів іо Дар тів АБО й пех іх 35 40 ра
Азроі сьу Ге Тук АтТа Сбішп ої І18 дк Ай Аха Аза Бпе сій тує за 5 0
Зак оБу5 дув Тут Рез Маї вес іїша Беж БУ ТКа Ажкоа вхо 13-х Ави азр т5 75 ко віз пу Пед Бах ївч Ав Ат лей Авр тлу жо цю пех Аве АХа Те 85 за 55
Гкосуві бетомат ляв Уві був Вжо Сіу у сіУ був с Аза Ту сте та
ТО їп5 тро біу вве ій оАвв сія сбіу тую о ТтвосКу Меї Авроуай Був Шу Кт пуВ 125 та5
Тук Трх о сіу Бек Бпе Тр оМані Бу сі діва Тухє бує сСі1у Нв Рре Ту 135 149
Атасбек їецз дк Зег Ап їни ТВ оАвроАБр Узі Бе спі бевт Уві Був 145 ідо 155 160 уаї дув Бех Мув Аіа Авпоцув був бій Тер Уві бін нів о бію бле чаї 165 170 Іл цем Жпг Рка З5п обу Авт йіз хо АвпоБет дви Аза Тахо ББе АТеа її 155 1855 155
ТЕ оТук АвроБхо Гуз бі Віа Азроз1іу Аї5 Гей Азровпе дзпоїви гіє 5 00 реа
Зек бен реє Бхо Рре Таж Тук Ццуз 21у Ак Муз дви о біу пез дк Маї 210 215 га
Аввобец Аза спіям Ліз зей бін Су Без Ків Бко Бех пе опем вро ре я ка 285 чи
Рко біу ЗРфу Ап Мес бе сі сСіу двпотТик Дяп буд Тк ТкроттроАве
ІБ 250 «5
Ткр був АвротТак без бі Бгто йес дгЯ Ваполксе Бко біу Бббе бій щу о БЕ зл
Уаї їгроАвшпотук дів 5ійх Їйк о Ні бТу бец бі» тіє гер бів Тую пей хт5 о еВ
Зіп Ткровів бо Авр.оійес йап о беп БІО х1іе тів баз бу чаї тух Ата 29 235 з
Сіу пеи Зву Гецсдвробіу Зав о уаї ТБ вро Суз Дефо біп Грем оФів Вхо
Зах ЗІ 315 аа ви ї1е Ашо Ар овіва Бей дя сій ліво 51із БО із дусб о сплу вус Мі овтв І 339 835
Тасобех ув ТЕ оПіу Був Шу дйко дра 5ІЗ Бе: Сіу Ну БКко Муз Буш
Зо заз За
Брпе Ас цей обек Тух Уукі ОХ Ма3і зу дей біс дар Тер ме с Аїасоху за5 255 365
ТУкК Бгто Тих о біУ тТтродно пеж хук Буз пап Ту ЗІ вве орЕбо Меї ре за зх 380 їз обі аїв тів Був був Аза ць вхо вшр ум Тл ща ТІіє ак шек 385 35 па 8цо ху Аів век хів о Авгрогко Узі лу був У АБроАіа піт Бе взюоТІв 105 410 415 тт вала вва СІМ Тра 51 Авротут паж овжо ТУук АкУу Брз ро Ав Уві 120 вв ал пез Уві Ол) Зі орвя два Сеча Бпе двв ода Ав бує Тук СІТУ нія Т18 235 440 а тівобту бій унії Атїа бек ТБу Пі бхо Авп обі о1У ТЕ сту Ткробок 150 455 450
Сіу Аза Бей; Ме Вго Тук Бко Тер Тхр о Тіє бак ту Маї бі Фо Від ї65 470 475 480 чаї Віз мец Сув Біу Бук біз Дко вало Ві с Авровхд Ті Бр ту Твх 155 ЧІ 455
Ейе Тук Аів о бжо Із рей Пув дав біс Баи о Аха Тур осів Тер оАїа Те зас БВ вій
Твх Ме ЗіФобіпп вМе Ата Аза Авропех Ата Меб Та ТВк да ел отак
БА 20 Зв
БетоТрроЖую Мі ТЕр Пежо без Бра Дів бі Ніяк рРуо Мас Тек Кв отву 335 54 пе Рхо Фну Тв іа дер Бе дя Рго Тез Тут отТує Таї Аза пу Був аа лова 235 Ео
Авеосів ВвроМмув ШЕУ ТНХ Пам отіє Теропув БІіУ К1а Аза ух Авлотех
Вл што зт
ТБт був б1у вла Дер уні уз Маії дек їй бдеї Бе був С1у Ма1ї буд
Ей 585 вва жо чіу дів бій ДІВ сій беж тре цен осей Тр овви Пуя 1: Був Авр 555 БОЮ 6о5
Еко тпе Аїа Ріпа дзп о Авробжо Вів Буз піу Вап дя 31 Маї Вер лах
БІВ 65 У
Був Гу Ток о уаї бе Пуз Аіїа Авробіу Був сту ліз Бне Авг ВЗ Гуз 625 535 535 60 ви обго Авт ти бевБ о Жаї Аза маї ев оспія ТВе їй Був Був Оіу Був
Ба 630 бе ко Тук Бех ЕК 260 «е10з 53 «іх» 2315 «ит ОДНЕ «213» Снаєсотіц п1ісровий. «4000» ЗА акдадсасвос стос осЯ сзросстсссо ссдевтессЗс ссСасаосацчео сосацесяса ва чЕчасссгавб солрсездедчав стесацоссов восФасвсаї срссобалах дравчудесасе 12а асатосдлася асаєсвзЕов цазпсоцусас зопсоудастте вачсссевес дечосооосо
Іа стоапвавем усасцвсує говдассаваЯ босствтачишса сабо вет суєюваєсо вка авосттвсоса свебачобос сссствощссї сувссутсок чоачоЗасазе асісосоаау
З ссатаавтшос сасассувев хсусатосст басспсцеїс сосбсавлоуєх поза оуцсяа
Зо вачосаводе цо9сс3азо вагоссодс: асЕЗасоцавІ пдасугсосяу авуасствсв а зпізсаододе сзоасібстає боповсадся собалсовсто аввотсраст состсоісктад що сЧЕсстасає сасазаєсад зссостодспя созсозазат слазсссдаз садова с
БЕ) зсечЧестадас сзацевсавоа сбссадсбос бссосвсова даделеодзсп гасассавса 5ВО асасдектсещцо пдсосочЧасссс сдвессбато вососастасачя пліссадтой взвесксасов аБО честлрапрост дссдасиквї засхаєзаоє ссавсядсви псуптавчаз спосахчавуа ев здатсвсада собсзадепо аобівсство азс нссаоз азосвасавс сага
УВО їхсвоадоесаз атівосачса скгссосуас аздасаставах стсачодазо запассачвуЗ зад чеяастаєо гопоасавсівос соузчвассаує сзачсасвиї бозссссосо зсочаосоде оо ссодосзсоава созсусоаєза всзбасоссв асаєсзчасзау сагодслосюя чесдзеласа 356 тчтасєдузс сонуцаясого засязсазая свогасесазае дпьсаоласа човосцетавоо 02 подаасоцсса со оаптісоса зЗваозеачвоєс соеасохео памозаизав псдехуаата 1359 застсчазчко сстсакозат все есда ссескгозоа сочсосурсаю Фесевачевие ї1ї14о щегассссвв зосзсодавс згсбевоаїроЯ гозапосезу свасзаачає алея чепО шезасессспа сссусасазаз азєтассопує солаластс: бсовсзастес звлавІчеа 1760 азсассссопа сасскоссвес чусксдесча ссоевсавац согчЧсасов пазоспадоєо 1375 асдчасктавссяа сааптсасасс сзчисапасо вогесЗсакс совусссчас сЕзеБеЧаоз 13559 асхатеассцча соадссасосо агсавєсзеса ззУусусспачЕ саасадедас бсссасовесо х450 сетвасастя зазсссестажф сбпзтачасс ассссадоага гуссавсаєс садвасвася 15650 содопсавусу совачЧвсася застоачасу сасссвачає сдессеокос яааекичасоу 1550 лпокосутсци саваасовос сссвсссєся заапозазел саасадтаас сеоасекоці 1676 зивссассте сасасвуаєс стспсадаавпс сбвасадтов ссазвсдучос чтавостаса їв асасзсатєас бубвзосссесв зососбсадесоо соссевадюла сабствсвоЄ бзоссвеосов 1740 авсасассавс застасссад ссассосвусс асасавасва зсвоєсссуве спав,
Та хозосцссав сбосусссеве взсосасадсссе чес оокя сеосчавесаєс сачетосксо ї5бва ссгсасаєта бсзесастпеве «ооссгссспоц ссадсацозю счастоскес чЧасесоваєс 1920 асісоалоьццеос сустсасаче чоебдасзаса бсрочцеясво Ссфгсвадоося деєдбеваєа ї15що асадсавзаа Ззавкаеоояах дбассочсча соусасааєо боабуєччоя пуста яке чоеасачіза бодсавеуць часуустова зічавацсва Зупавазаа» вазоздачня 2100 чзабзусачиз Бсстзауззь ЗісевсаауЯ збдасссосос Ясазсідасос дкссечаєсоу 2150 счесзчазчсач сосссзуссо пабавсасос созадваваа зпоподсоаєо, гадастасау
ТБ кавстзасле: чазацссдаа вопачочаза таке кчанио базестуссз аву саводу ше иа сала ссік Зукочс сус зоудаоувачк Я 2319
ЗТ хаїоОз да «її» БІ «й Бінпою -і3х йаєтовісю ово «абз 34 меж дів Ро Пей Бех рев Атхо Аза Те Зеє гц реа Аза Газ Тв ціу і 3 То 15
Ліз Аза Аїв о Ахта ад оТвЕ цес жає Узі Авіа два бет Біу Є-Щ1у Ви дер яп 25 ЗО
Тих век рес тух Мей тик ОТу 438 Мем ориз О15 дер хтів Ав офий овес 35 та 5 пу дврошіУ біуспев Тук АТ сій де) тів вк дви Бх3 Ата Бе на 50 55 во
Авб дв ек зей СІб о Аза Укротне Аія уаї стіу АБа ес ТНговай СТО 25 тх За що
Ма1ї Чаї ТБЕ Бек ОДях рхОо Її ше Впр оз пем БЕЗ АК безк Уаї Муз 85 За Зо
Уу«ї ТЕ Зек 5ІУ Без сСіу був віз Бу рей уз дЕт олія о1у Тукотко ї.о т05 ше біт Ма Азвотаї піз Буш Тк Аво оБуз тук Бех Зі Ба Ріє тує цех
ТІ5 120 хи
Тук У Аза Тує Ав опіУу був РП Тех ем о Бех лечо мМаї бер вар оТІє хі 135 1 текодва бій так їєєт Аза тн отьву Був Х1іе Буз ЗекоАха ер Маві сій 145 150 185 То
КівоАїа Тер ТЕ Зно Нія Був пе хо рей мем Бко ТАЖ Був беж Аля
ТО 175
Аза лап бек Аза Авзп бек Рг Мах Ген бі: рБе Ако о Рхо був Ніз ба 18 ї55 І50
ТаЕ жів Без бій Бве Ав Те) 11е бек Гец оре Рго Ро Трх Тут Був та5 во 205
Ава Ага оБко Вп бі Ме дк Акад бій цей Меє біц Був без Мід Авр 215 хх р йо Пуз Рко бет жна Мей) Ага 118 вже Біу Ру Ввл ов де БА Оп 225 йо ЗУ за два отутсАХМа Су дзпотук Ткоа дво Тр бек пес Таж Ппей осі Бе рей 245 250 255
Тит двроАжу РКО 0І1у Ага Авробіу Мадї тр о Твх Тук бів Двп Тпу дер
Р 255 ло біу тре біу бе Уаї бти Тук Меї Ні То Азїаа Сто дво оТима АвроМві. 28 285 сСіцсуві уві цес Віа Маї АбасАва с1іу ем о Тук бен ойва біу АвБо У
ЖИ 295 БНО туаї Бто біз піп біз ей Нів Уді ВБе Уві сіб Ав ойїа цен Авп 1 з05 319 ЗІЗ 323
Мев'зіш Рае Дей оМеб бЗ1іу Авр оуді дес ТлЕ Сто її 51Уу ла Ат Акт 355 30 335
Аів був пед о спту Тух Ехо був РкосТтр о Авпи їїє Пуз Ре Уаї іш уві
Зо 345 350
САУ Явп Ст АзроАвл Теч тТкр біт Біу бе) бр зак Тук дув веж ТУК за за Зо
Вк їси цуз'так Мне туж Ар Вів ї1е Мув Ака бує турорка Авт Кіз а7а ЗБ зво
Зег тів ле обех Бех Тр Ав обіс Ре хХаї тТук був би деїх 51Уу бій зх зах БЕ га др тую нів Бу Тух тнНЕ вхо сво авро тТух Зехо Маг бет слі Ре Ар яйб «15 «15 їацз вра о вдзроава Тер о Аза взрозіу нів Бо тів те хг оспМу сій тує
СУ й5 Бе
Атїав тех Тіз бі АвооАвия ТАкоб1іУ Був Без біс авро Тих Аве отТтроАво а 540 245 діа ву Гуз дзй пу ТЕ бу Да Ттвотів Зку бек ох Аза бів. Ата 455 455 бо
Ууаї ве хе Бей пу Аза сій Ака Лев оіу АЗЕ Акч УВІ жерошлу те
Як 47 875 8
Трт вва Ага обую їзіе пез» Сіповяй Сей Аза шех Тук о бм ТЕролЛів ро
285 ка 195
Авеобей т1Т6 бах Ре Тв вій дей Бо дія Аз Тв Тв о ржо ЗекоУаї ач вк ІЙ
Зехотух Кто Тіє тів 10 Бей їец Аза дек Ні Вру і1ТтТе ТБх рів ТВК
ЗАВ З Зав їва о Бко Маї Шер бек Дія Аєр діа Вп біу Кко Аіїа Тук Тхр Уві Аїа 53 З25 з4й бійка сту лів Авр Авросту Бех Тух 11іє Бей Гев Аїа Аїз ві Тук
БА за -55 за
Авт Бех Тнж ші стїу Ала Авроуаї Бо Уаі йкй Уві біл Ре 018 Аха
У Бо 515 ше бі біу Б1у бі йпіу пі Шіу Сім біу бі 1у Зі Ту Б1Уу Аво
ЗВО ах Зо шьу був собі Був біу Мув о зіу Гу Огу біу іч сі Бі біб біу Уві
ВУ як вк пув о йув біу Ар ойко вія ій Гео Тк Ма) цес Тако Аза Ркаосій З1у 510 515 ГІВ
Ето ТхроаЗза нів Ав о Три Вхо бін Ав ПУ о ууУ Аа Маї пу ТВЕКоОТах 625 вий бо 648 тЗаї твкотрьУ пед пу Віз біу Акту Бім біу уаї ве обіш ре бех Бей 545 ОБО п
Еко Азропез бЗст Ха1ї Ав Узі Гев Уді УМаї біз б1у сб Був
КО Б ато «г10з 35 «ТК ЛО0о «В15» ДНК «йиМ3» Бовахічт чесбівії1Зісоловв «40 35 звілесіствс табсопсбьсс сачсосвістс сесячбаасої гссбавессї. сезацзвсуєє страсосостстч ссобсадева асзочдвсаче ссеаооссвл ссудєстато зловили хо васпашицсса ХедЕсласпа Засясастас есоксассбв ссасосчаєсоу Еігссаяоце
І8О казачолоаса асосскксра сгочічзаав рспавадзїс Есусарссаса пасввачавє 250 пасавоассє шссспавобсї савахачсасуя дахучцсевоя БЕссосозче гарсасдтвах 330 лестісзцегс срастссслос геасподсодя Ззсвачеьяст всблеопвопа пвакоадцядх з85а автсссЕсущ гавасвасоз ссегвазчаах абгудессза созсаасовя Бсдвоссєевоу 475 чЧчодссстодла вачсасваца баазссова ат савчуааза ссбсіцасав сода во 350 авссозссвзсс стаєсславєсо. сесрчссо сазчаасссса всассбявазв чайка 5419 кассссудав возчасасссс сахтвуктсота садетсазозя зсзвсасате стесксстсава
Бо чевоЧеєадає асайзавсяс вус сад езсвсссуст ачаввсттвЕ сассСайптає
ЗИ І спттосаксцав сапассвксвт дасакасьсх асосзвстава сотласеісаца чазесбавесне
Та сохчцпіаеЗ стасослооца Слвассосзсаєс длассбточе сасазевоту Сас те сасзаччаст евсссбзазпу сесбсссасс асдптлатвтоя зскссаєсти сСсавсасеосе очевсутвич азсозсаквЕ суоцеасевє сацствсеяса сбосспаєоу ваебатоах
Зо засавчсасвов стузсавісаа Єалечтвосо асбспасагвов зсазадцкх зегодавех чай цсбаллоесча стела чЧат кусічатесс воФфссссЕісЕ ва 005 «ке ле «2:11 333 «ий Вапек «аа» Бизакісш вже коїев «апох 35
Жатовку деп Гей оЯеї Випе ко бек нія Мем їев Маї Аїа Реве то тре 1 в: ве 15
Гей буд бій Аза онех беж її Аза ре; бек Туз Ак о Авробах бро Мах йо и зо ієкі Бго БІ бе Тер оА1а Авроруо Аа о їіе Аіа ї11е мМаї дврогру ТЕ 45 5
Тух Тухк 518 ре рей ТЕ Тк о Аеросіу Ре сбвІВ б тво сіу са у дБ о 5А є таї Бре Тух Те Тер обу Бак Був дв опи ді бек Тр тТвЕ Був баг «5 ТО 75 во
Авромуз Бо Пе ГМез отрут Зеб Авоосіу ТУ авзпобСіу Ав Уві пе ТЕо в 50: ч5
Аїа тих Ссіу дв сАТа тТкровіа жто Ата ББЯ Та Віа Ата сту біУ Був 195 КТ
Тує Туй Бне Тук нів бек бі Ап Ай рко Чех уаї бех Аев сІіу нів її ї20 155 цу дек тів о ЗРу Аїа Адїа Узі АтТа варопая Бо Сію бОіу Бто Тер був
За 118 ї30
Аза ста Авр обу ово Меб Її Був обі Так бех Леробім ше тіе Мах 145 ї5О ї55 153
Ват Ав обла віз л1е Аврорго Втз діа Бе сб Аврорко Зі Таж СБУ 165 170 175
Був їхрв отук Тів Тук їху сіу йвпобіу Уаї Бто 11е Уаї йїа Б: цей ї85у 185 щ95
Ави Авр о Аво Мес Узі Бек Пер Іуз діа Біу Тер о Нів Сув Т1е Тк сі 135 205 8 бе) біп о Аза Ре дку піц бі Гей ре Уші Аво Тух АгЧ двр ІіУу ТНх 210 2І5 то
Тувк Вів їм ТВП оТрк обек 1їе АвроввроївЕ 51у Бек осі: сАзвр Тук Ака 225 ЗО 235 22 чаї біу тТук діа ТНЕ Від дво лап ориз Яів біу йко ТЕЗ ОТнНХ Тук Аку ре РяеТВ 25а піу бМаї їз) Геу б11 уз Авробін Бех Був обіу 116 їенсАга ТБЕ б1У 255 275
Ніз дп обаех 116 Ті АБлп о ІЇ16 Ехо біу Тпх Азробій ТТ о Тук Ії Аї5 їх ва яп
Тух нів йтхоп Бе Ні хів лто Авоосіу АвпобЗіу Тук Авт Ако Зі ТЕ 253 235 35
ЖЕ їів Аве о дка4 Уві Бо їЗМе Авромув ДзЗев отТаж 51У Сей оБНа зму гу 05 Вб Зій за
Маї Тк Вуз СН дей сб бек ові Баш БкОо Ага го ев 325 330 «21 Д7 сії» 1535
Еїаз БК
ЕКЗ Баватаямї пеуплісмуузоїаав кацо» 37 визстептьог еустсувист сесмешеоюєх дестхїкосваЗ ссвапсслоє зсбсодидає во асзессоска стябсЯвСас сзсоссвидваг стосаловев годагсочекь тастуєсєса чЧазсвсасу чопаосуссяа всезабіссаа васстсоато студаєсаса Зазазвачоує оц ї8о стозалесьєс гсобеавсас басвзасечусо чдевоасекаЕ ссассасссу двасазуанко 240 чЧасптасузсу шсперссзасто сассепсаус ассавсассс асазсоссяза Саадовии зао пожтастатїх стзасєчосяа скдасааваує сасумвіає бтачсавасяа поссвьтвує о такса ясна ссів сзсізароасю гкчЧососечцеце сват асао йзачровцио 125 павчачсанчц сосок сесмо сзавасасс ЗзгасЯісе чевсссосза езаєсодавов 480 свтсцтвасая стлачесцас зусєдачсво сксссесатє асайпусвоЯо коадсвссеса
Ай ціассосасо стдзаттсвЕ свахзчазозо Чесаясьсяч асстоувисеє соссавеьясо й даззсгачеасро садвсЯвесає Босєсттїсьая сасвасусво запсачессвае додескково вве саєагсасуця Сас псабваєсвос Ззакоплазаїх свсачпаєода сктавалеоос тав зачеєччемо воастбовоЯЕ срздавакое ссакстсбсв Ксасавссва спеакастсо "аб задсзаєссоса зосвусєстає чдзасвогаса ссдссавосЕ садводсесуа зозачевчсо 82 закдассався сві сцесвас ззсакодасвс сбісваспаса 4тссваєза азаивосася
З слддасазсса азасодовов аодсвссутє вагясстайс сстсазсера басотястяй
Зо дасочезесо ачассзасаа свасозассе скатстсаєу єсассозевс задасдотаєс їо2о задкїтасса бакслтсцає беслосгблпосасо аседстсасє пдоссасзсса саксеуссое оо чегссевата сасеклссва шктсавпсссту деіссавуаса сеактзЕкоца Басаскусач 1150 азсасосасу збсачсяссоє сабадкчево ассавевсст9 Зсассостає ссезвестуєе
ВО свзеоптаЗаео сіксдодаач бадсоксеса асззсссачо стрсасукс здаєчакочав
ТеЖО птзсасатоц тсозасвсолав здбсзасоста тссоаасоазс аозссалоаци свсодевоссех 1320 182о
Чопсасааста гесЯссассах цвачессяса асваснвасйа псотссаднос чагосссавее 38
Чевтусвоса сосвайстоурт пессвоппса вобаєкукта вусасассіє асревссе
Та згадасссобі сгасавсасо сістассусєт аввзососсва собовассся дЧасеасскеє ее чражфскчацчЕ свбссзацево опідавакас бсосбасссзсо стврашеатсс сатуФуЗеє ха спозалачка сессссачва чоозсатссавЗ азсбзсовасся суаковадцє сУусесассвах
ТО спусасавса спосвіазтай їастовтесе сдасшососо ахочазуєба сочсезсяде їв шВСКлусеситВ ВВЕ 1695 «їй» ЗА «Еркх ЗУХ «вір» Білик «213» Кидакіст хзеккісьіїівілев
«ій» 38
Меб Пед рде Бе оїжеа Уви рем ВБта тер о Чеа діа кпе сій Біа бек їх ї 5 то 15 від пи БІУ Аве отак о дех зві Тле Маї Авр о ЖНЕУ Бех іп Був те т то 25 за уахо щі АБ опльу Рря біу маї бек змі Аза тут йіу Кл діа ЩШув СО 45 з 45 реа вза лев оту та слу Ро бу бух БТ Бьу ем оАвЕ їх Се па 5 ей ке ав облі тТлЕ то сМу Віа слу Іва пек оїіз тів Ах Ав Був ІЗ 55 7о 78 ва ту Сув о АзроАта ес деп одек ТІ тТрж Зест ТК айва ТНХ Агро оАшн рко за 35 азрвовБув сбіп Аіа мії Тук Ні Бре Ар 1 Авро даю пзрозіУ Бій БК 1ї99 105 116 аМасупссех мет біб лтФ рей о Сувз біу ТЕ хе сіу Удх бехоСув ВХ 315 ї2й 125
Бек о бБіу Ат Тк» Дга Ні Ат Тук таї бі меш їів Дій бі тТукоОреш 1595 ї35 шо бек Жук тТух бух біо АТа БУ тії Бо Уві ШеЖ Ні Мав обтУ Ре Би т5а т55 ІБО пз обід Му Ано біу беж Аве вне Меб оцей Зет Та Ата бід ІЙ Ах 165 17 та вів АБО Маії Т)є Бо беш о бец Ні щек йТ1я Мей пі Чек Був с піУ пез ї8о 185 ІЗ0 сСіу вар шле був МеБ Тк буз був Авр о дяп о їЇїе б1у Тгробув Зек бі хх 206 245
Мех ВтротТуює Твтодка Був Бей йів йЗїш реп пів ма1ї Сб був тек їі 1 215 220
ЩШет о Маї їЗе тигопек нів Бій Тух бек о бет Бет Бо Авпобій Рв ОомМеЄ та ра раз кв
Ав; стТвЕ ТАЄ пев о вБко Тв Тер оМеє Бек сій б1у АтТа Аівз АвпоАВр ото 245 25 255 дів Бе йіа тк ОоАТоа Ткр тТук Мах двп о с1іу біу Бех Лев сій О1у Рре 250 ЗБ 278
Таж Тегройіа Маї пу І1воллв бій БІ1У П1еосузі ВялоАТа Ар отїео ек діа Тук їі Тужх Трої біу Уві БІБ тТвЕ о Аяй ап оБув Шу беб те 230 295 30
Зек Нів Заї Тї2е Авр оте Ар о бТуУ Тву Мувовля ТВ Тіе дек Беж ТІВ
Зо 31 315 320 бец тт» Аїа Т18 Аза Ні ТЕО бек одка Нів Тх6 Ако Рхо зіу Дів Вів 3253 з3о 325
Ася рес хек Тв бекобіу Уві Узі ій Азроїлх ТІє баї бі йів Бе
ЗАЗ 345 зо
Зі Аво уві Авропоу Вект о Уяї Чаї Меб Маї бе; Тв обат ак обіу тп 455 зей за5 дів Аза Зів'ТНє Мах дер орез біу Уві Бек спіу беї де рре дах ТИЖ
За ат5 зво
Атїа шій Міа Рпе Тас Бек бер оАта біо лов сій Меб Уаї Азр Таж був зн Зо 185 06
Маі ТЄТнЕ Хей пек Аз сСіу Вк ді ПУш уві тп ді БжлоЗві Ків ТУ 405 1 5
Уві Уві Тйж Уа ма гео ТЕ ТК о Ата Гуз бекодех був ВБхе УВІ дет во Се «Я трх вів Уаії Жек йле лдіпоЗес Аза Рус Тьк о рб Тв вк оУяІУ був Ні ай за 25 тТвх пви Тпх Вів сіб Муз тТвІ ет беж Тих Тих опецояак ТВЕ АТа Буд 150 455 «ва дала Бжко ТВ бвж ТОЖ сій ТБХ о ТБЖж дек Уді Уві сф сбевс віз був ліа
465 я ЕК Сн) тав дув Тех рРхО Уві Ребогха Ул Атва Бек Був ою дек Чет був ДВК ча5 193 455
Віа жо ув о цуз сБу Тіп Гуз Бу лик Трах тТну пу бук Сі1у беж Нів во 505 ій іп обех нів мук совів Чів Бек АТя ТВ Ні Ага гу Сув ка Ні Б1У
БІ зей пев бек тТух АхЯ Ав 01уУ Ні Сув Твх Аз -й за «10 «йі11м 948 «ій ПНК «013» Каватійт таррісті1хоідев «апа» 8 астстлаавнс сесрозсаз соедестісіс досогсаше бесесецедао стодавеясе уоскасксосв зссосовоїесс сдбсассяче сатаєссеусо Бгсасдчассю базове о 190 агчаєтсства чсезезате сссчсьчУсь сасасеууст асзасасісє соссавЧчаєсє
МО ссоїскчавс зЗаассясект давучатоса зчабаспаєьк ососнясов гдсласстуЗ 250 асквсятатс асассааола содсапасаво постадовос содакаєоссо лбасевляат зп зиссацваси асцстзсратсв спссзоосксої гссоссзаос забчеасловои гуесаусьх зо пЕсзостасса усаговзости Ебсасесаяас бостодаєса зессавозцсЯає сдісезссау кссзаасавзса всзасзаєта саебсоссако засодававес кеБсбоссда сеседаееуе 4852 азаслабиче сслсесуоочЯ сопесосос бссодсахса аденсватсоса ассссовоссеє
БО авагосдеса апопвасозчч сссаадсаєя басосоовтся зсавсвспоча сесстсечио во пваздедеса тедвацососс дессвссвес айвоцсааза псвостаста ссусстчео вва тачЕксдаса пока стаспа пассокост зчасасбахасс по саєсчає басасадосо 720 ацдсайсовева стазсосіса ор свасавзу ссбацтазос аздаговуясс газ павУча
ЗВО йпсодацаеей сапетазтся педасскаю" сабодзосуЗ ддасасдаєцо бас ксасі 80 - даквдасоасо своавоЧЕвсх Зчсссватсеа сассяссатя досебодсвос ваУусаскакуи
З зчесассяаст сесесвуаса соуасватосе сусссгикго согасеЕвне з48 «РО» 40 «її» 315 «їй» Білок «рійх ЄЖезакраю тесвісії1їо6іщев «по» 43
Мес їТтр о Пув ієш їжи Уді бек б1у Гм уві Ві Хаї Віа дех Ге ве ї З хо 15
Сіу Маї Азп о Аїа ді Тук БК АДзп Бо піу Бко ув) ТВ о сзіж йкроїве га З Зо джтлоуд! Мія Авробко Тако Ууаі Уві Був тає Бго бех біу МУ Тук Би
З то же пез Віа Ні Тас лу АвроАвп Уаї бек оїеч Ббув'Тйс бах бек Аво оВко
БО За СІ тТвВх йіз Ткробув ЗБ вла ОлУу Аїв Маї рпе рко Вей щу Віа гхо Тор т ТВ. ВЕ чвх ТСвроЗки тТух Жлдх їув Зіу дБ5роБбув Ав Бей тер АТа Бко ву тів бо ЗО чу дат Тут Нів дЕпобім сій Тк Те мер отух тую Важ Аза бер декора 105 105 1:80 сіЖ сіпо Ак ЖБе о Зет дув ків різ о Без Аза Тв ет ому Тв І Ата тв х го 415 1279 15 лох біу Бе букв Тег БВ зп оці» Чаї Уві Уві біб бек Аве АВп ОДБ тІЗО ї35 КК
Ава азротує Ач Вуз хє АвроспуУ Авпо дей те Уа ва о дек Авросту тя БО ї55 ї5О уз Хтроткр зво шех Риво'еїУ ет БчЧе ТХІролеє сіу хів шув ве їїв 1655 170 175 біпоїжшм Аве то Пуз тп орБім Був йдка Тпж о сп1іу шЖеж Бех Мем тук бех 185 185 1950 мн Віа Му Акєц Ав Вій Бех Чаї іч СУ А1іа мМаї піп Аїа ро вра та5 зо 205 їЇле ТпІ Був Ву ху шек ТлЕ Ту тук вд тр омМаї ет Епе дар ому щі ІБ ро,
Сув'Сбив бій сім Аза Аха бетотит ТУук Ак Ма) Мевоуві УУу Аг Бех 245 ай 235 230 ек чеж Ав Так у во стук хаї Авбобуз та Бім осуд За Мах мес 245 иБВ 255 пет осьу біу пу твк сій Тіє мес Аза бек НЕ сту меж х1їе нів СІ 250 285 аб
Бгто ссіу Ні Авт Аза Маїі ве тв Ар Авподяр дАтТа Аврохаї ес Уві
ТУ 28 285
Тук Ні тТук Жук Авр Аве Віа сі Тих Ава бем гео 51Уу їі Аве Ге я гав о
Тез Лю тк о Азвовап БІУ ттроврко Уві Аїа тук 305 310 ЗІ5 «кгїій» 4 «її» 1357 кеїй» Дню к«ві13» тЕїспойзука пеєедні кабох 41 азбданацсае астемтасско зоусетессе деноссста поасссеешю Соссвоства
ГНН зствсєснеє соуастесов Фстсоопчсе суподеоесв ассссасоЗза дозадвасвасу лох їх зластрстцаз вссцеисаезос сбобсавзос абссатсачс псвссевнцяа авваечзускац іо сьсевасєсто дсассасовс спассасопас сеповссавосо задавав сце е 4 акссазпсво зсстсоауссв загозсоссо дасансвоса сдавасласв обечобсзат за ззсавсосвзо доесвасльсаа ссорупчасає дседасьвио точЧісввосЕ Босоисадсва
ЗО авсчесваєї сзабасусея сстасастсгз ахссааоаси спзадесаос сусавоачсн
Я азсавсатеса апсезсусаца гесготзсоз свадесяссо деаспосабає состава зо питдлдсочо взсазшечсна зессочечс таза топевосвотуа паче осос 549
ЕЕсЕтавштсс чосбсстесіс стпосазчанах Стстсзсвте сабзвостува сасазсеттує
НВ;
зпасаздаавє своцасдес авссасхдає Соуастсоох Збагсабузс чабаФфузецх ев сщісавідла зсстгсСсвався азчоассузас попоуспаскост певовБсобоВе ссаддетогу
То спасзастадч сб сгсдча вБЕдссоссксо саосуогода дасоассдпаєсо сстпудовся тва їосскадсахтс васозссвса ахстссассо суссавотає Засвасоїса везе сае з45 чаєстасцес Кссвавегача ксссотсавов язавкссовіє сасочтатко дозасссво або вопсествдає зссассолаєт зчачиствке пестнзачеса возчсстазат пово
ЗО асізапасдуа зеадпсіеоке Басядззаче сводхссоасе соассадесчеа сосаадасво ог забвсзсідеа зле стеса ссачевоосе: есодтаслот псасодачейх сассаєвале 1189 чацегачаса сісалччосзс асодастаєсу частасасся азам австсв аутакесла 1153 азасчхсусса вапасоссвУу табсассоЗу гозапсаєса зла сзачав задсеУсоке 120 соскасстає деккатовас кабавосаос васавсвуає собоссвЗкое ссСтассвача 1259 асЕсасаЗсо сососадесвос авсосессот се сазсас авасбісавс ссовадссао 137 себакзасва сассастооєл ассстасазе ва
ЗЕ
«їм у «вії 347 «К1іж» БІНОЖ ке13з Тріскойеста. певне «00 оч
Мет був Ата дви маї тів Пец Сую бен їви Діа Рро бер обаї Дій Аїа ї 5 15 15 пев вто Твр біз Жвк Ії Ні Пви Авроржо пі бевоАТа Ата узи До о вк 30
Кіа два рам о тах бів Аку Тну ді двродез ТкроАзр Ака бін Віа Бек 35 40 Ге біла бак Її дер бів Пец о Т3іє Був Аг Був піу Був без Ту Ре бсіу
Зо а бо тхвЕ Віа Так о Авр Ага Б1У ей бевоу бів Ав бій Був Ав Аза Аза 1е 55 7 т 80 тіз біпоМа дароцев оду БАЗ Маї ТпК о бЕО сій Бви бек о Меї пув ТЕ па З5 ій одак о ео бів деп оАвго сів Зіу Ми Бей два оТтТеробІ1у Ашрвр Ася вв ідо оз їїб
Ту Гемо Узі Азп пе АТта бій бів Ав осіу Гуз ех І1в АтФ Біу Ні 115 то ї85
Твгопезч Тіє Тур оНів бе; бій реб ВБсо Кіа ТкроУз) Ап оАво 312 Авт їз 135 145
Ав Вів дар о вВак Бесо Ахгу Бій аїр їїе й тТвае смів Уаї бек тТвЕ Ук їде 15 155 і
Чаї ЗТуУ Ато Ту Мув піу мує 1 Аве Аїа ттроАве Уаї Ма Аве Фо 165 В їт5 ту о рпе Ав осі) Ар; опі» дл ва) АКо Беї Беж ах Рв йдех Ак беш па 185 К150 їв Сху біда біл бле Маї Вех 135 Аїз Рое ба Аїа Аїа Ароодзро Ав 155 бе гак
ЗзороБЕФ Бек Біз Ахш о їей Тут їі два АвротТут йдлхй їези Ар о пта о АТа в1й 5-15 пий
АваоТук пі був Уаї Ав осіу бен Був Так Тую Уві Зек буяє ТЕротіє ве 23 й 240 беж бів сту Уві Рхб ї1е Ав о блу 118 31 бек бій бек Кіш пеи ес т БО а
Зі бтіу пу ху БЖ ЗІУ СКК Пе біт вія рез Сі бій іі Дія ТКЕ вкй 65 ал
Узі РІО Маїз ТВК осі Бей та Те тних бра бе» Аве лів ів сту віта тя ва гБЕ
Ркс тт отйЕ Азротух ТЕХ суп тУаї Уа1! Сіп Віа був їеб бек уз пех
ЗО за зас уз о сСув о уах зі гзе о тТве Уві Тквошіу 118 Бек зво пу Айр обек Тер
ЗОо5 зб 315 зай
Аз Али беж ВЕ о АвпоВко Бей Грей о Бпе о АвроАтіа Ап Ро Ап о рко зу
За ЕІ 325 виб АТа Тут Ази овак гія Маї бі ТТе Без оз о 345 «10» 43 «рАїх ло «125 сБілок «КідУ Туз слосекта свевех «800» 45
Мек уаї Шекж Бе Тут Чех бец без дів вія Зв Ежо Бко бак АкКо Вів х 5 0 5 дах Схув дка Бо Аза Ада бій Мах бу беж уві діа баї 51 Ггув йка то 5 ЗО сів отв те ра Бгто бі тре Бім Тук Ав бо біб стек о Бле Тук бет за Яд 45 тую Тер АБподев о сіу Ні Б5іУ 515 ув отв Тує Те Ап о бту Боб Б1У й 59 5 шіу Ва Бне бетоМаї Аа Тер о беє Аво бек о ОБу дз Бе Узі бе бу во то т Що муж зі Ткр бів сБко зу Тк Буз Дей був Мяї ІЗ Авп о вВле бек Ст ща За 35
Бет Тук асп РкосАзп сфе Авп о бет Тут фер бек Уві Тук Біу Тр бек ма хп5 1
Акта Ап о Веб Бей їтїе 35105 Тук тТук Із уаї Ср Ази Бе сіру тає тую
ІТ Не) 155
Взв оБхо бек Тв овБіМсАза ТВЕР Му зем ші сів ах ТвВгобех Авропд у 135 Ко ТЯ
Бас Уві Тук ввр т1з с ТукоАгу Тит бій Ак оУі Ап біт Рко бек оту
МЯв 55 15 ха
Тів Віу ту дія Тк Те Тут біп Тук тТкр бек Уві Ага Аг Ав Кі 165 Та 175 дгаоБеї Зек пу бех о Маї Авт Трх діях зп очув Бве Аа Аївя ТероАїа їі85 185 і51 суп ооМа бу Бей ТнжЖ гей осіУу Ту Ма АвротуК Сій т1їе Уві Аза Уві 155 по та бі 1їіу Тук ра Бех Ек З1іу Бвт діа двкК о тте ТКУ Узі бат 219 215 тт «Хоб са «її жу «или» Біло «вії» Ттісподекща хешвех ев 4
Мабоуві Ап Аа Кіз Дій Бей без Ада Віз Пем БенвоАлв мем Пец овхо х ї о 15
Хпжовів Бу Ата ФМ Ави Ава іп Тих тує вла Ав ТУухХ зекобів бій о 25 5 оту й о вБго баробеий тує Бгто піз Тв Певовіа ТК фе ЖЕ Гей оБеК 3 0 ал
Ріпа гго зр оСув СІВ Ні б БЕо Бейосбув вва Авт Бей УМаї був йо зо 55 я
Бек бек Віа ОїУу Тук бі 530 Акз віз бій АТа бео бі Беж реа срле ат то 75 вп
ТВ їв біч 53» Бач Ті ле Аве Тве о біпоАза Звх ЗК Бо Пі М 85 90 ща тжо Аюкц вед зіу їі бро бла тую біт Уві тхр АБпо тій Аза їеш НА 5 100 05 115 пху їв Вер Ас Аїз АБ ОВие дів Тахо пув о Оїу бу Зі Ббе бі: Ткр тІ5 120 185
Азвотве пек Лье жо Меє Бо 12 Сей тк оТвт Кіа Діаз се. дво гу 135 35 159
ТЕ Гео зі Віз бій т1іє Вів йвроїїє Тіт дех тп О12й Ата Ага Б1я 145 150 155 хво те Зак Два цес БІУ Ав Тук СІМ безос Авр о чаї Тук вів Ехо депоугі хе 176 ВІ
Азпосіх Ба дкопсвет вто Бей тТхробіх ДЕ сту сія обі Тв Бке сту 183 5 155 вій АзроАїа ББз Бе Пец о Шек беж Лів Тук Тих Тук обла бує Те ТЕ 1955 203 205 сіу лів Б1Бв о Стіу біу ві Ав о Вка сій Ні Меч рез о уаі АТа Акта Ле
Ми 2185 ТЕЙ
Уаї Мув Ні Рне Дід йпіу Тук дйвро орви сі) два Тер йБп Дей бі бег пе5 75 235 а) дет йеза Б1іу Бе др Аза Т1і6 Її ТБкобій о сбіп дер о Геза бек обі тую 245 ВО 255
Тек Тахо Бго бій Бе бе Аза АтТа йіз Ах Тук Ата Гуз Бег Ак бак
Б о ев Меб Суя АТа Тук Азп о дек Уді дев Біу Маї Буо Яек Сувзв Дія Депп я ер 85
Кер Ре ЗБе пен ошіє ТУ Бед Бей Акха біцобек Ттробіу Вів о рго бій 5 235 0
Ткв Оу Тух Уаі вт Чех дер був Ар Ів Уві Тукодйжа Уаї ре Ави
Зпа 316 ЗУ зго
Его Ніз йпзроТує іа бек одзв пів Вет о Чех Віз Віа Віа бек Бех їец 325 У в
Вка о Аіа біу Тх Аве тре двроСув Пі 0/п ТУ Туб Вро Тер Вів цем 345 За5 Зо
Аво спі дек обла Узі віз біу бів Уа! дек Ахо біу біз Тіз С10 агу 355 Зо 53 бек уві Тк Вбкд Тео Тук о йіа Авпобеч усі део Гемобіу Тує Ре Дер зт Зх ЛЕ
Був пув' Ави Зі Тук Ак Бех бец о Зіу Тв Муз Авроуаї Маї Буз Ткик 355 335 по
Аво Вів Тео Авт Тіє Жак Тух біб йхвовів Ма о біч З1У Тія Уа о Тяво 405 ма 5 ї-в обу веВоАврОобІіУ Тл без Бгеа без Зеж бує Гу Чаї деа бек Ії оо їх5 430 дія цей гла аіУу вто Тттв о Ах сам ВІВ ТИХ тих бБх Ме; БІВ Ку Аве жлВ тай 45
Тут тує сх РЕФ Віа РЕооТук во х1а бек Бео ї-е) ші: діа Аза пух «50 455 450
Був Ата Ту ту іш Маії Аа Ббе бій Те Бк тик бо тів Аза іу ще ато ЕЕ 485 йалповех тих тах о оіу вве дів ув ла Т18 Біг Аїа Ата ув Був ет
ЩЕ 1959 155
Ав Вув Ме їїле тТУкК Пе бу шу Тє АБО два ТУх фі ств Бій ЗІ
Зо З їй сте діа Азрв охо тат оАтрохТЄ Лі Ткробко бі Аве» осіп Бен о Авробех
БЕЗ 2 па тТїа бо біз Пец бек са. Уаї ту уз ро пепоМа)з уайї Мез бзп Мей о БІВ. 540 і шЗу сіу сій За) Аво Бех Бей ех ої муз Зет ЛЕ Муз Туз Уві з415 550 55 чЕп
Вва Зах їв Угі Жкрощію СБУ тує гло Сіу бій бек віч бО1у Щі АВ. 5 575
Ма пе дО ТТ зей век сьу Був дгЯ АтТа Вга Аїа Зіу Ако Зв. Уві
ЗВО зва 55 тТвЕ ТІ біп Тук Ру А1іа са тує Уа) бів о сСІіп Ре Бгто бІі1псАВО Лер 35 00 5 мес Авпоїво йго ко КаЗробБІіу Був вок о Ави гкосбіУ Бій тТБжЖ Тух ІШе та 515 що
То Ту тв б Був Бкб Уаі Тек бій бе біу бек біУу печа Бе Тук 625 ЗО 835 ко
Тебе Тис рве був бі тпк о Пес віз бах Нія ко був бяЯж БО Був Ра
А 5О 555
Ази Тк Беж беї їТе це обек Азв о рко пів т 03у Тух ТаЕ Отут б5вк вва ва ето січ сів Тіє Его Мав оББе так Вна сі сАзла Аза Ті рух Аа бак озІу
ІВ ВО БВ ув ТрБх ото Бех вто Ту Тпт АТБ Мек Бей ре омаі Ак Те обеж Ав 550 2З5 оо
Ака іт вхо вій ЕКО тУук РІЗ Ав уз Тур о геч таз сСіу Ейе двр Ах 05 7Іа 715 Тео ас олія Авротів Гук шЕУО Сб1Уу Нія Бех бек оГув їз Бек РЩїв реко Т1ї
Т25 3 755
Есе стві бех Аіїа ей віз с Ах Уаї Авробек Нів 51У Авп Акта ів хай 4 талу "аб тук Ве сіу Був Туд сій ва Ата їз дз ТйжЖ Ар пів Зек о Ууаі Буз ї55 780 ТБ пе біб ББа бі) Бей уві бі ім ов Уа Тв ої1е зр Авуи Терорко пло ЗБ и) ен пів сів біп оз тіж Пув Вр Ада ТІ Бо Аво лів 785 750 та5 к21Оз 45 ке лай «21іхз бБідек «2135 ттіскойекна хкевтех «1015 45
Ме Аго ТУухк пра Тк Аза «та Аїа цес Із Бех оАТа Тв о сту Рке Блае 1 З то ІЗ
Аїа Ач ів вородек Нів беж Та дах пьу Ата Бей оАтв Ма дів Мах 20 25 30 уаї Еко зо пі пу ТП Руб ТЕробіу ЛЕ Аа Тег о Авропув йта їжа 35 Ко 15 від віз без Аївз Був Сей Ав бо Бій АвзрогБув У Бім хів Маї Бер 5а ЖЕ «0 сіу маї ші Тжровапо біб сіу Беб бує Уві біу дп отвкобех Бхо віх
Зв та т г
Зевобує Ізв БЕЖ Тут рте пет їм був Гей біп двроббю Бхо без біу я 5. о Зо
Уві та Тут бах тТвпт олію Бех Тато Аза сре Тьх Рус біу Узі ка дій 153 105 110
Аів вет тТвЕ Тер Авромаї Авп їз) ТІ Агу біс й) діу бій ла 118 120 125 с1у бід бій уві груз Віа бБеробіу ТІВ Ні Уві 118 бер» о біу то Угі 13 135 120
Аїа бІіу Вухо во сі був Те о Бко с) 15 БУ вся Аза отЕвобій БІ 145 а 155 тей па сі Хяї АвроРтб Ту зи с ХВк обіУ Із» Дід Ме о біу біп тих тів 185 179 175
Аза оту Тіз біт дея Маї су Ма! бій Аза Тако Аба пу ная тує Тіє 8 ї85 Т50
Сбвз АБВОШіВ бій бід без Авбовку бі ТвЕ її Че Бех вва то Ар 35 ЗО 205 дввоАха тТВх Сей: НівосЯє їж) Ту Тну ТкровБто Бе АТя Авроміа Уві іо 215 ай біп Ата Аза Уг1 Аза век оуаї мес був бек тую Аза Був ав оАвп тТЬу до. 230 235 249
ЇБж ЖІ Аїд о сСув іш Авроа ТУЮ ЖНЕЖ Бей ій ТАЖ Уа пей Туг Ар 24 25 55 спав обец су РНе Рхо ту Тк о Уаї Мет тТВк АБО ТІ Аза діа бі Нів 269 шко жо тре о Тнж о Ууаї сій бех Віа деп бек у Мео Ар оМеє бак Мас рее діє 275 289 зв їх вар орла дей сіу Ап два й веб Тгробіу Вко Ала ве Тв два 29 235 КІ
Аїав Мах Ази бекоАна біп Мах овжо Тс пек дк Узі АвроАвр Мах мах
Зо05 зт 315 320
ТвЕ Аку Ті песо Лів Аів ТЕросгук без Тче бі» біп Ар осів Мід щіу
Зо зх 335
Тук Бто Бех ЕпеоАво Іїз бах Ак АвпочЗаї біп о біу АзпоНів іа ЖЕНЕ ас Зах Зоо дя» Ма) Ака Аїа їЇ1їе Аїа дка пр оБіу Ії Уаї Пей цей Пув Ав Авр 355 зби з65х
Аїд АБ їІа ре) Бго бен був Гуз Руб дра бек тів Аіа Узі ді біу
ЗО ЗУ З89 бах іа АТеа те ї1їе білу Авп Ні дів АгосАва барв рго бек о Сув Дай з85 380 95 409
Вер озув шіУ Суз БзроАвросіу Віз ей обіу Ме шіу Тхробіу бвкопіу 555 4 45
Віа Маї АвпоТух ко Тук о рпе Уві Віз Рго Тухк Дер Віва їТе Авпотпх з 495 4за дха Аїа Яек Бек бій осз1іу Так біб Мя1ї Тк Ген дек дей ТЕ Авровал 435 ЕЕ 345 ст, Ввк ех П1Уу Віз дек АТа ДІ ко Біу Пух Ав оУгі Аза Тіє Уві 255 яке
Вре Іїі2 Тв дів зр обЗекобіу бій сту Жук ХІЇє Тпж о таї бі) б5іу дав ає5 470 475 що
Аів біу дар Аку Аво вва оПем о Аврорто Ткр пів Аз обіУ Авподйіа Сем 485 490 455 чаї біл від уві Дів Оїу Алла Аво бЯес Ави Хаї Її Уві Уві Маї Нів ьОс ко Си
Бех Уві ше фо Щіз іє пес біб Бій тів беч Аза без Бгто пт Уаз ій 5 зи їув' ага уаї Маї Ттв'Аза суу пе по Зех сіб ау ек осіУ Аєв одіж 5з3а п 245 ей Уаї АвроУуаї Сем о ТкросСіу АвроМаї бек Бк жаК о бІТ1у бує ем Ухі1 5 зЗззао пе че тує тиж тів Аіа ПУБ Беж Рез Ав вав лок дБА УВК дже Іже Уаї Бак
Бех то 55 спіу Бі Бек деродаковае бет б Бім їв о рае Їзє ВБротукю Пух НІВ
ЗВУ «85 З
ВНЗ Азр о лар дів вза гїіе Тих Рко ов Тук схо БВ СТУ Тук'сому дей ав вай ев
За тут Тет пу ТБЕ дай Тук Бек джа цем дек УВІ Бедодає тах вій рик 615 5
Тув дек пуу ВЕБ Аза о твк бі вія хв) мах Бо пу зху вто дек бл ща ва 3 Бе)
Те) вів біл Ав Уаї Бла тТпрохмві ХПш Маї Ар б Вів Ада ЗБЕ ОБІіМ 545 550 555 сзка Хаї Твеовіу А1В сі Узі Ата біпомеам Тук Діє Твк бук Ртсх бех що 5655 67 вк олпІій Ро део Тл ро бо був біп їні й Зі ре Віа був гео ва 58 585 пва гва їпкоБко БУ іп дек опьу Таж Аїв ТнЕ бле Авп осі дюч дк
БАС ЗХ то пе авроГен о сбег тТук ТЕВ Авротвх йза Бех Бій бу Тгроуах Зах вто ох ТЕ ТВ тб чат і Бек Биз о б1уУ ре Звї Уа осіУ Кіа Зег Зх Або дв 1 Ак так ЗО І вчи тїпЕ Бек Твх о пво БЕК Мак дій 740 сЕЖОв те «Ріс ВИЗ 1 «й122» ДНЕ «135 роезороикя апанвкіпа «05 46 леавесзсет бпавуосаацс остсусатоз хЕдкЕдасЯає ЕСЕсОнсова вЕЗЄдвас во зітчасткак ЕкчЕсааес соуси взасазсвода ссзвзсассаб зеабочеекх.
Уве зкдсассяачО асаїсзапавй шфіссздодас посадеасся всусрсовохЄ автссесваз 180 саспсокісо вадоцяуєча паазсксстою посаасоссу всзаєсцавйа ссораксадх со адевесаєсі схассогеісяа Зднадостаове авсоссвкБе севесасЯавЕ дссгтасвее 269 зссваттьЕо ссадоссова Зсазудсазу задсолавуцєй асуасассав позування зо аЕсоЗЧсткоя ссаведевоу ас осУзоЗЕ агодегаїся азазауседан сасвогводе зга аастжссаєса вбассзуєта чсасаадуці даєссвтозуЗ Егазесстося свзслацасх 4850 ассслдозаєча ссттсссоеаа зач отУ азс чідазтавосу сбазароадчасо
ЗАЙ ззуасазчач Сбоз4исац состктсвац зассосустоз асадеовасва свое ЯЕк
ШО зЧссачсччо зоідссдвуаЯ сзсазастлаєс совжескткща абсксовассє дасовчевеу сей косо сода сасксаацеац азозазцваї соучссцвав вечасстуше Чдивоасадед т2о
ЗгббЗачег ся адеопаевіми собовоаскто сросзарочса всасчсксца Задтаазасо 730 сецчасасок учсодавака тасдафаєст ассоадссссс тпогаздетова пссдочавася 830 зегеУчсшссу сзуачевста досвазсести аспІсаласо беплоспоазама пагподасоу
Зак десзакдаса Ззаассточа зссоаттодло засув сЯ ссопусесссоас поссувичас
Зец педкосавто созавсслув зепаочаяз чосасссняосо аапссстода плавити зпай рессссасків псовсастах засовпомав БоспосЧсот песусоєсааа пес уьсах тако сесзацессе сппзацлісва чес тсят асоопсаасо зудфеселчаси асп пасао 1150 стос бсовасптяа сталосваттат сУушессстоа пууаєсаєлвя заотувсвас часавагаси сечасассаз дабсаботчес ссассоскспа ссссосаєсва сасдасваєо
ЗІ пеецодалеа сеспосудсов бовссашосу гаестуВоВО сезаттачев серевачецв 1550 -косдессапзи хоазасазвсох дауусавцозб авссдсопвлсо товьолопов часппсостия тя ясусавслів всузкоачнає зпсікудово спабнссьса росспькоєе пІлчсаЧао тд пасаточева стазозссає пбтстсчатс ачевастйнов уаавсоассза саазвковко ївпа сагалоавк заптЗпокчя бопісосацс поч асечеї зусзалецеч пасоавИлстая ї5Б5О спусазсавя плоаперасео пЯбсосевст аптсастода спазкьчева песто ваа їб28 | | І агсесьсЗсеє пссзсачєсво ссдідадяса сіпосзвісЯ асдесссіце садсааасес те ааджесЯвсс сівсЯсСрска ссппуосоуча хаддвоассяза човусасосв Бассхесвву 1743 чекчцсооьсх арейсісзве Сдав'іссвіє себзцсзоеує Ковазекода пав есовас тво
ЧеачеочачсЯу Згцпесазохх Фасощіче аскучусссзое зочасссаса коза яса їв чаесопоцпєсв сроовавсва ато ксяай сачавовста ссекісавсева доссузава їх часоасвачь ксасоскове ссвассузИи ства мич стае сота пводасзво їЗче леззксавая огавовазад звазадсяас чцсвазасви сячагваєта са 2031 «215 С47 «Втр 203 «ії ДИК «2ї3» Штучна послідовність «ЕВ «га» симтуєзевана оптимізована відносно ходонів «ЛК РАБІА. «ох 7 вицатпояси бовацсосочс соссчосусги стостоозсиос беадпастса врешассцле аєсповсогої сеЗсесвазазч свппдасуоє зайлаесса ссчяєвссвь Збасчасска
Т5О0 акшесвслаці дсаєсвасаз сСздсадосуає зЗосадосвисї всуссзачює дембсаусеве 1850 поапчтекссє адяачгачеуа Зал кесес вссзлсстосу повпасудис поешсоссєтс й зчосчесвосе їсдоспесста пвазчексзес заасосеох соопсудсоєх сосомаевош
БІК зчислаєсакст ссвасстова здчасулоааз сопсаачудсв апчЧасассава чшчовасяау
ЗО сесадесьса ссавсдосав секс езчЧат агдатокся аччезссвова веасносащо да зсстросвси поассспода ствсгацеде пасббсцали веадевспесо садпасовеє тБй зпссаспата тхетледчова саацаксдьєс ваздподата пзавчавоося птвачкотасо 245 сачаввечазо посадок яде ссескссаевт затусстоссв вгачоздаесайх свосуксчес шпоссазсово вссотоспазос сцетсаалуву засассстто атоксавось свісьзссис
ЕВ віссодссса ссоесвавлч собйсаацлас зассгосуса годассвоце ссздассата
КО сесцчазсьЧа вососвоськ ссосссосрої сссадссаюз асаєпстсоа зодсавсасе тя сгссасассї часссевосу чізедадасс абсоЗсссопобпвадовосо ссотодлевтя
ВІ зпесзчсассс ззчазкасса девчесасся ЯдЧдсстсудат сласосяцта свпчзасоче зо зоссвсовся зоавсостода доссасовво зоопістІвл спосте поссдсвксяце
ЗИ здетекЧесе сосазачсса дебачустаз чросвоссзас вапссскозча кдадвосаат 3550 вЕСстсесоя зопоасчесва зассасовач подчпсасев босогупсва деокстіуєют та85 сстаадосої зуваздссва зсоуоесзаз етодосавсо водвссауеь соссадесяа 1140 сстуцеразст Ссчачдзаста сабслальас счстбпессста Зчапзчатцаа пуссгісаае 1246 чазазатасо сечасвосав чаїсаєтзсос вщесессоссвя сссссдЧаєсва сактаєлсасе 175 ссадсспуво скдссзасда ссасосвоссос басстсасос созасовасє содледедетче 12 бклсстявас созЗасаасект своасавзччвс засоссвсес бевсесячесв Ззабтастаце і380 асссасссся асупсачсає сасестоуоавс одпуаєскев боссостцоо ссдчечсоце 1450 шосасспсстя пезчачассах скеовсзатс азсасетаце деласчасла сазчатосане їз пусоссевесо вооссеосся сссссдчавос сссЗасово: Зуовасочао таковосеу 15360 з5ссвуєвоя ссссочассо хчосоиссаво ассппосацдла топасоклупя сосок ї5х0 зеЕсссодесос ессвсеатсві сочсдачало боссосовроя вопссссоцо подевайсоє їб53 засттсечасо сссбсокста сЗссассоло сазссорзада сезпсатодо сабссосвач 1740 тчсецзсзецістї асзасзасвс сЗзазацевто сосчгсСачсс тсавчігода счсосссває 180 часоутсцесе сСсезесаассє сасспесстє асо стсса гудассоста савостзсває 185
Часссобссса ссозсвЕсав собсовсааа Чазаезасов ссстсас са депсоусазч
КО ацсзаєзаче ссасскксас собсебсоци ссстсещтеот ссловесоБста пасспшеочає вЯВО пдосяспазая чЕддсвзасоу ааадоднаво допсзауусьв азочасваств а а чеї0О2 45 «лі» 19920 «125 ДЕК «из ручна послідовність
Сея «ий» скомоствийована послідовні по ЗА кари» «83 втомаслода адссосоози сапстсяаос Сосссеадева паастслоце гасоссасояс о застчутстов їпаїсвестая Сацатадасз дсубасосстю стчатесваєцЗі скусазводях
Мо алое чсм сСопвапоцле зсатодсвто сбаептостудах Косавчавеча босоувеута дшссадтався стяєчацеча боастатобо Сассцовакоз асдацанвсепя секс спсзчкссазос вста сптзксазіо задцвеябов сосоцусове ссузєсвуако зо пацеастоссоа зосдосусеса саздавоцЯс кзаїзсвзсв савасусшев сшосавадво зва авудвісасга готвсацнає сєсдейстцеї дропсассяа ссвозачечу асо сецее 9 ссодасаадв чкбадсоарссв ссасастссс адогесдцасє содогладеку сугецаечає во ааєсаєзвцсау себассводс аізЗдоваву акозезачся зесвустіса ясазсоаев 549 сапавачанаєсєв апіасавспа віскадесаск своссвоалаа водасассоче кзпсвезацде об сессздатєсз созвапогслад сайтозасваса сасасссїлоп сауалдавосе псдсчасаєо
БО стсаєковьо асеселадзс содсаззопоа сбсстссога зупвсцаздя ссовоцевкео 7-0 скрсовагзцдас сскпуяттса свааусаляає зазатЕсбастї ввосксвассвй пестастеце: зах ду всавсссаєт австсзуста сосовевсса запассвсосї агсазуссова савосевссву
Во зпасачаадссс адвуссвує бЄдакаассяу зссасстсасс созусазбоуЄ сазусвосяу азцпо мо чаїбовакаві бастасьсса сбаопяслес оачасаєсет зсвасчаста всобосасовЯ 55о чіавачасте едаваатусз чтвспасачо вваповянзза сскгозсвва заяпсстуча 1020 «ий 48 «-511з 1038 «азу ДЕК «72713» Штучна послідовність «ивО -23» сконструйована послідовність СтаЗА «ад» 45 зеЕдіатсоУча зассудеося сакососсецес Бесссясся сацексобоє стсавцасасе да закозсашсс стессссдає бапосасесс сЧесспоичевнь асесстсзао ксавупкове 150 заасасавак іскра сссвбесрсяс дасвосзвая бсвавокече савсоцдеяса 180 чзачласзссос двасасоассаху засузшавовсо себасстевсь статчазвааа света ксще аа завцанссся МБЕаусвасся сздеоїсвек спобововсо возасасссе седоачосааа зЗпо свосазачас ясасіссгіва ссзасссаї задзасуцовз кавсвибасоє збассксосот 380
Фсегаддаса ачдаастацає стбсадавсї сузазтсста сскосвасза чессадзод 0 соесжвсвацту ссдвосвачад стезчайссосу посасабзса човуспавто спсосвестах
ЩО
Чоссасасту всзвстаздує стасстоватс баса ссоздазса ссапопосав щит о честоплсвло псвазазова сксвассаз ссаспчавто пасасавате ссостобуавс
ЯН сусассвачт сосувосусс сесвзавєезсс звостзадєев аддасакуєх сааовбсвсо
БО чаазсасесс досасстсов звасхсусосс сесоздасгз псозавасессв ссаопчссзад тео чЧасзвсавос десуахкосе сувусуєссеЕ бадасссвса зЧезобоасва ЗсстЕвВсЕзо 780 стсавтоаєасо ссасозпуєЯв Свсссвшнує сіпоссбасз бсастіссва чеапавтвю
Я чакссосата сстассасУє Севсахєесії часосізсття аксодасузас пасгсахста
Зоо ачЕвтссота адсасавтуч гсвасзобло себпсоссісвя спадаєчсцив раса оское зво взазчахтасс тстедневучє девододвао езузестоаФь агдясивдав созсвачаєс
Того трассвсвсєс преса 038 | І «вір 50 чевіз Сто «атІ? ДАК «КІЗ» Штучна послідовність
Ва «223» синтазована сптмимізована звідчеасно кодоаміїв послідовність БХБІА «аОд» 55 асутассоча вчессвсяях забсвадечес стсскодсча содссчсзс свбсвсеасе в авсчсосасеб адачлозсач скасваєсасс азспсоастсс всвасоацссх сесуєтсчва 125 зпасассазес асадесасаа сезсадеске гасассечачс гезссодалав ссчаосЕке 185 свудасазса соецсстассо зоссвасстсс засадесасу апісуаваав сппсдсвзаво хай стодсясксс асавостсво сзасссдтлос вопсоссозаса пососеЕсцес посбоватцєєс сптосзазасос бцазсавеоце сазсаєссузе пЕсСсссавслп запас то лоісавсяау зей сЕсвачесує дез цо сузсазессс сгасзсссаду спсзастассв аспусеасиос цасзусачеєс кссазедсева дегсасссла Засауссввсв сдасадсдав оубеваассв 485 зусцссазує асзчазаассо савссалсає азчсвозвас соедосопоан павачеесх.
Зо задспасастста апаасвосст сазсавтсвоо сгсбасазса водчокссав давезоевоє
Ок пЕпавнстЕсе дсстсвсєвоу согсролосе плавсстаса асавспоацосс таасзуєско ва пазаєсчасс печЧрсовоацст сасудзсздач содопзацесва заьсоиссопо соссошащи тий спасесоазаса ссзвасусас ссадцесссоа хаптутдасаса адтапзаста засесьсо 780 чассьсавоо всодсхувоссо доусповаце Чесгадассх асаадовцяд савсаусате чуссісаксо Бубасасоцав срЗасзЗсчве дасвеозуєсєс бссацосуве себсоапоско
Зо гзодсасудес вобасскоеву савсдацате вісвасзаса апсассссся зсопеасвко зей часдаєвейо Бсавссадес сзадспесто отадесоссс сауасасссо сезоЧаукок 1025 кзчазуодства Зсепсадста сссовадесо туднссаєсеа всташотоова зтассупиває ї5И салпуавсвзаєт Бсоапостоа ссиссалчасс басассассї ассоцексоз пспоповеває часаєсаєса ссоесзадів боссдсасаєо ассуєсаєао здадеснсво поацатаско 1255 ччєсстоаста сидцеддцстьє ччастассвс саечтасесца пдссодасцо сгтодесВцє 1250 сазусксаяєє зо сзасоа дзгусецуус восаассцез сцеобаажсау ссадатаех 1375 ззсдрєтато ссавсвасос дадсазсєса зепосяваче дсзасспявЕ сесастстає ро ссабоссача ссаодлюссуєЄ чдасгувузео дссхксевса сспдсодача зЗпадавсаче 1146 ссдзаЗаєса сСссчодссва стасуєсссто авохсссуса ясаєсвасва сбоаЗсзоКоч ів ападосочисссо БааБоческо сдаспссдає вчсачесяда субсосчстс тассеоссоя 1565 саструсасст аасостусач сессвесаво азсассопоа есолшостсеас чазчедяої 1579 пчазсдеазса сспрусосує ссасутолзасс песудесоцчя атзасавцає бСодсвуєсває то вЕскссавло созпосутетя сайсацеасс вслдасавсо сузьовсоваї псавсксошє 1790 цчасібсаасо севасвасде сваслесвсс абссістеуу сучЧасцдвосо сазсуссаце 1800 аассасссопа чсолесссдча зйссассазо зссдадвхоо айвосасово сусоаасчає 1857 сасугдсаєстси ссодачісовзе сшсьессодазсе збо сосдасау сбоесестава Засади 1379 «ЕТ п «їз 17 «дра БАЛОК «іа Трісбоптопав геввеї «А» ВА
Мес Тут Атйї уз їжа Ма Уві їі Бех Азїа Рме цер аїз ТБк Аза Аку 1 5 15 їх
Віа «ким ЗЕ «112 3 сеї» ОПЕК к132 шШкучна песлідонність «рух «ВИЗ» синтетичний тоаимею «За 52 спасссасаст чстлаактес сад 23 «210» 83 «ит й «й1и ДЕК «913 Штучна послідовність «тей «ВЗ длантеаличьний праймер «адм СХ ктасцевлас сочсечсопе ау «ій» 54 «рії се «йо» ДНК «пі13 срУчна послідовність «ке сРЕа?» синтетичний подймер кА» 54 тассвсочсач стоавссесто сао
КЕ
«иа» р «11 В сті т ДНК «105 Штузна поолідавність «ЙО сигйх пинтетичний праймер кадпаз 55
ІКачсівавно бсссаосваї бузацдесу т
Т8 сиїпЗ 56 «11» 5 «вій» дик
Ера» Швувєна посдійовнесть «ВшЙх сей» сицвтетичний праймер «айв ве сасесесуєцес ЕБоСсєсаде свт ве евій» а «15 7 хаТеУ ННК «да» Штучна поспідсовиусте «ЕД «рез пинтетниний праймер жать т? псесавспої закссозсав чаайвсо 27 «в 8 «иіїм 2 куди ДНК «14» Штучна послувовність «их «У сланте вич гарно сще3» синтехсичний праймео «ай» ЗЕ сассвкдсло сосавеоюви бу ше» 5 «112 52 «аїй» ДНК «ер» Люерусна пОоСЛіІдевні сть пут
КИ
«йо3» сицтетичний приймер. «ах Ва скааасстсва дозсовдтав зо -Х «Тім ЄВ «115 8 «812» ДНЕ «8135 Штучна послідовністе «ЙО «апа» спнтатичний праймер «пд» БО сассатчсати сустссвасе сеасеєстез
Мі «Зіб»м ві «ех «12 ДчК -?13» ПП вуєна послідовнійть «ЕВ «вий» синтетичний праймер «4п0йх 6 псказчегачад савозессув о
А
«Біб б «вуї 27 кеїйз НЕ «215 ЛВтучня проснімдозність «ВИХ чий3» синтетичний праймер -4005 67 сассвсдсвас басвоскассс тсайово за «ей» 53 ява сах «из» ЛИХ «313 Швучна посліповвість
ЕК
«йВа» синтетичний позймер «ібох ж птсавчтазву зсодсшцесхсвосо
«ей» б сОЗАВа И «ля ДНК тій Ввучня послідовнасть «ИЙ киш» синтетичний праймер каб» 84 шчвсовідевна ссссспвасо всстьста й «дій» 65. «21 85 «а ОДНЕ. «Рід» Штучна послідавніств «вещх «йп23» синтетичний праймер «ап 55 сіасовааос зсчасваєса сад р аб «й? ЗО «2125 ДНК кат пПррУузна поспідовність «рай» «вий шинтетичний праймер кап» 65 свссатсєтс сЕссоцеова КезеЕссає «ей «Ехі1З 21 хай» ДНК «різ» їтучна послідсвисть пев «235 сСимтетичний. праймер «Ох в7
Есвосклакя своаулоссво З 21 «10 68 «К1ї 28 «віх» ДН «ЖІ Штучна послінавцність «их «ет» смитетишний праймер -40пУ БЕ сассасзчаайу песо соч ге
«гі» 63 «ак я «ріг» ДНК «к?18з штучна нослідовністьь «йду» «й03У Смицтетисний праймер «ацо» 858 пачЧлссссає аудосакеєес тес 23 си 0 ту «єшііх т «155 ЦЕ «13» Штучна послідовність «пи» «ее3»ж синтетичний праймер «апп о сасовьчечи сбсстайсяМ сс жа «Му ті «аї1» й хи1й» ДНК -й1А штучна послідовність «ей ких смвтетизний позймаю «по 71 стасаваццо стаудатвсаа жо «ах» а «а1КЖ «йо ДЕ срійх дфтучка послідовність «йо» «ті» сСиптетичний проазимех «400 75 саєсзЕпево сласесЕвсмс ксастає
Б
-ій» 73 «атм 85 ій ДЕК «13 зцчхУучаа поснідовність «рад» «Род» сивтетихний праймер «Оз т3 ксазпсзоцаа поаЗзсгдетоя пт 75 «вх ста
«й11з 28 «2122 ЛЕК «132 Штучна плолідодність сив каша синтетичний праймер «апов ла савссакувано стасасадче позу б коехо 5 «Р11» 25 «йі2и ДНК «813» с Щтучна послідовність его ких синтетичний праймер: кашах а секвпзсачеї зіаазоато сааео «піб» 75 «21ї» 25 «гій» 0 ЯНК «2155 Етучна лослідовністі» «ВИЩ «иа» бинхетичний праймер «У 76 сзастаєтовоз аввстсскою ссвує
Ж, зх «Вій Ол «ВР» 85 «рів дик иї3» Штучна послідовахсть ий» крик сицтетичний праймер кат и ссваєсзачса зсапфросацоє сао
ІВ
«ВІВ «т112 33 «бу» ВК «214» йтучна послідовність «ІЙ
ФУШОУ» опимтетисний праймеюо «ах В сапсвросух саспосвувсо стусаквів асе 3 «14» 075 жЕКі В
«йї22: ДЯК «іа прручна послійевніть «ей «Ійла синтетичний праймер «аа 79 їкаїдсзчвас гзспсваєває сзавти у 28 кій о фії 5 хі ДНК «213» ЩШтусна гпебліовніста «Же» «ов х сидтетичний праймер «Адп2е Ва сассаєдціуяас салазастст соЯК5
З
«їй» ВІ «1:15 24 «122 дик «138 Штучна послівсовність «Ей «ййа» синтетичний праймер «00» ві стасіссоєє бЕсацеасяну сове 4 «вра» 82 киїїр 40 «рій» ДНК «13» Шеучна послідовність
БУНАЯ
«ий» смитетичний праймер «Оп» 85 сичопаесяо восатачЕвр стебокселта ссгасасокя 40 «кіОх ЯЗ «ії» 42 «вій ДНК «13» Ктучниа послідсвність «сире «ай пиднтетичний праймер «10 сви седасасосо спттастачка засвокуйтз чавасасвов оси 42 біс» БА «2115 За «ТІ» ДНК
«2132 Штучна чеслійовність «ва кава» синтетичними праймер «у» ВА стзсазсесоо ассвоічассе сеаббосетсо доссаоок 48 каиїїж 85 «11» 43 «12 .ЦЯК «дІ13» Штучна пзолілевнихость
Й газ пі тд перущ їй «лйа» спинтаетячний праймер «йо» 85 содшсосдже стпвтсвокс пзагбазавсос стосазувач спа. й
Ей» ВЕ «Ім ОДУ сеї» ДН кРііх Штучна послідавність оси «ва3ж синтатизний краймер «а0пхж 86 свсозвіцаса догесавахх табее «тій 7 «жів хи «та? МНК «135 Штучна послідавнісиуь «ях каеї» синтетичний праймей «ОС» 87 їсзобадевс аудаєсаєте то «10» яв 115 г хи» ЦДНЕ «2135 Штучна политловність «раб» «йЕИх сивтетичний праймер «ап» ОБ сассеєзача сасачавса седцососе 25 теки Ж «гі йо ді» КЕ «ІЙ» штучна псспідсовністе педа» вих сиктеєтичний позймею хіба» 83 слассусостї зепчасеоко дссовакоої сссосочвєва «біб» ЗИ «21ї5 4 «Еірт НЕ «Пій» Штучна послідовність «кох «грі» синтетичний праймер «005» 80 ссдссцезат ассоасеатає дапвосихоюає варену їй «ій» ЗІ ктіїю ло «вій «ДиК чи3ж ЩШтучна послідовність хо» «ег3» сицтетичаий праймер «ай» 5 сетасельзи саатачвая о «рій» 82 «ді» 20 «ит» ДЕ дВТ3» Щтучня поспійовність «ай «23» синтетичний праймер 4005 975 цостачалоц давасоасаве шй кіз са чЧеїіїв сш «12» дик «ВІЗ» Штучна послідовність «ВХ «3 жшинтеатичний праймер «даз 83 чачітцсрсав числа є
З
«із 5 «вії» 35 «їй НЕ «й» Птстучна послідовник отЕ
«их кайЗ» сивтатичний праймер «Ап о 5х сассасчава ссавасасса сепгтавусск сосаа
КЗ
«1» 85 сеМій Я «рія НЕК «135 ЧЦітучна пспоплідс!внішсте «й232 синтетичний Ммрамер «в» 55 ствзІсЯєгеч ассссвасва сСуссусеаса гоосусства що
ЕІ
«ВМ Вб ся ях «Вій» ЛЕК «13» Мтлусєна послиудавніст «ах скфйй» сСинтедичний праймер «вай» 56 чачікскзая пссЧупраависсо чу «ай» а «ії» 18 «еїйи БЕК «Щ13з йПтлучна послідовність «ах «ие3» сийтетичний праймер ««ацпх З сасозазває дасчавео а «ту» ЗВ «вії» 8-4 «рт ДЕК «213» Шручна послідовна єть ях 2297 «ей» симуетичний раймер «пп 58 сассавсцєЕ дсспававтсо сад а «жі 95 «8112 25 «и1пе дяк. «й13з Штусне послідасвньсть си Й
«ета» синтетичний праймер «дод 55 шшасосацдає сспоачЧЕесК зай 23 «кіз 150 «ів т «2195. ЦНЕ «а» бтучна попльдовнаістять «й «кра сиктетичний праймер «40п0з 105 чсогсзчачеду аесцеосзах 2 «Іо» 15 «ік» Сй1 ки122 дик «2135 дфеечна послідовність «ках «РІ?» синтетичний прайнеюв хабйов 0 деовассасаз засессвето со 1 чі 302 «ШО «шій» ВКЕ «21 Штучна поспідавність «аг «ги» синтетичний праймер «ай 302 кезсадсся сстшвошкса сшрсатосса о. 32 еї10» 10 «ких ША «ета ДНЕ кД1З» щтучна поспіловністів кеш «київ синтетичний праймер «апп» 103 шпассакчовУ полавцьсоюм рве
Й
«їх 104 «ие Й «Рій» ДЯК «пі» Шенчна послудовнасть «ад» «2235 сивжшетччний повймер
«аб00» 135 пезеЕгастацс саасососост спосо ат 32 «їй» ТОБ «вх жа 17» дик «і Штучна послідевність «Ех кдшаз синтетичний лізаймеб «480» 105 сакозцаксос сдлесьвссют зрсачекло -а кві 185 «ших 48
Ей» ДНЕ «213» Штучна послідовність же сива» синтетичний праймер «5005 ТЕ часапцазасі Ебзадобсусає дагабзоаас зесвадавох 19 «10 17 -2112 25 «тах лик «ві13 Штучна пошисдовність. «Ерох «203 сжнтетииний праймер «Ай 197 сассакдоау сСасплесазоо савсссоат
Ка «йо» 08 «А ЇЙ хуй ЛИ «РІї12 ЗтУуцна послідовність «й9й» «ВЗ спктетичний праймер «адах Ой зссястстасйва зЗаласссвас ас 27 «То 09 акції ве «віт ДЕК ше Штучна песпідевність «шо «роя» синтетичний праймер
«еФох ЗОЗ саблечасся савсзивІкоа посвувоея а сеї» 10 ка1» За «рід» ДН ка преузнкв о посліцовністі «и «И23» ссицжетичний прзимер ка мо свастовачс савссвзісоє ссуусаозаєс злуздаоадає 33 «ВМ» 111 «Тім т «102 ДАК «10» Шеучна послідовність «а» «23» синтетичний праймер «005 111 заставу адсаксєьеда с 24 «2105. 115 «й» ста «»1й2 ДЕК «Дї3з деучна послідовність «виь «й2ах сидцлетичний праймер пп 115 чксастацза загасссгас ас ге «10» 113 «акт» 5п5 «ях Бішок «тій» зеспасійїї.8 зкваєосмехворитив «по 113
Мак пув Уві Уві дво мМаї Бо декодві слу Вже біл Бу ре тує ув
НН 5 18 З
Аа отже Мув пе Су Уву Зіу Такосі Вжа Бпепобім рез да Ткахь СК 79 25 то пув'сівсотТух Ген одер о нів Бей пев Пец авт біп бій пуз 12 51 різ о ще йрз ТУ Хі Акз Сіу Нівз о Зі пед бйецй дев дер оАзг Уві біу фе отух по 5 ей
Яку віз ув) бій ї1іе ВЕробіу сб Меб пуд Кто бпе Тук вп оБда ТБ ке то ТА в
Тує їі Ар оАко іє Уа1ї вврошШес Тух Беш А1ла пез Аз Ті Ага Бо
Ба Тл (14 вве біу Ре Мес Бус Був Дія бзо віза 5Зек Сіу бзро тів 100 ІС 115
Таж туаї Рьє бук о Трробув Сіу Авпобаї Тргобто Ро Ту ойер Тух Дяпй
115 170 125 пу ТЕВ Ахо бро Гей Гі Маї вів Уві Уаї Зер Ні баз тує б1по Агяр 13 КЗ іч
Тух о віу те бій біб Уаї Аху ТЕ о ТеБ о Мез Вре ЗТ Мах ТлроАви 51 155 150 ЕВ ї60 вто Ав оцей оУаї АБа бнз Тео їувВ Аве Дів Ава Бук вій сти Теє пе 165 то 175 цсуво Ве ТтТух біз Уа отТвВЕ АтТа Аха Ада о Ма3 був Бек уві АЕроРко ВІВ 162: І85 1920 бев'сама У бі зу реа Ата іт бує біУу щі пе ВеЕвослВ тТЕяротів
Ес: ОО СЕОвІ
ТНж о Аво вве ореп нів Рче о сСув Віа ЗМО Ако ЗЕФдФ Уа1 Бк Маї Аврора 215 215 го жк ех га ПІВ БІВ Тук ТЕБЕ Бех Бу Вітя ро Ні Був Був Тато рКа 225 | 230 235 2480 піч Хух тТук тую бій с еб бі) Меп о сбьо ро Вко сіб Авр Меб оба ре БО 255 бій бій Бе бух ТЕЖ оМаї Аж вія ей пф Ара біпй бе Бо Бе Бк 260 2765 27
Кіж Тел Его Тео Нів Вів Тпх біз Тух Аво стТНК дех тує Жековбко 2412 75 ово Ва дез око чаї Ніє АдроТве АтТа йес Зв оАіва А1а Тук 11 діа дк І12г 285 235 300 іви ех От Б1у біу Двр о тук Уаї Звр бек Рпе ПекоТухє Ттр ТБу бле 305 319 з15 БЕ
Бек Ав Уаї Бпе біц бі: Ме Авроуаії Рко Був Аїа Гецо Ра нів бі зо 339 435 сі бе біу Бес уаї діа ред Нів бек їІТе Бго Сув Руо ТБс о рае Ні
За ЗА5 І)
Аїа Епе Тих Ре Рпе Ахповів бер біу Дврозіч деп Пер Тук Дкч Аво 355 350 ЗЕ сіу бій Ме ї1е Ммаві тьк о Ахо ба був Авробіу бек із Аїа Дів Уві
Зо зт зво ем Ттр дав Гео Хаї Меї бі Буз с бїу 035 б51іу реч оТіх Був обі: Уді 885 З ЗА 20 бів би Заї ЇТіє бро Маї бех Бе бат Аза Уві Бе о Гів Буш джд біб 205 що ї5 ї1і2 баї Ява бу» бій Тук С1іу йвлодіа Тер одкоа Уві сттр був біб Мех 420 425 430 сову йко Ро Ак рбе Бго бек Ак Сіп Аза Уаї сій Твх Бей Вко бек 1535 чад АБ
Аїа зіпорко Вів Чаї Меб жо ЗУ Ака АкУу Аїа так Ав бІУ Уві 450 55 5650 тів НІВ цей беж ті Ма1 Пед оБеї був Ап бій Уві тТьк пе тів іш 4655 а 75 ав
Тієб шу О(а ах Аку Алробіц ТЕ Бек Тк отТух Уаф сту сем дя ввр 485 430 дак
Сбіу Пі ІБТесотах бек Тук бек Жас «вібе 115 «Я1ї» 50 «зр Бінек «й3» Трастоапаєкоювостяхозй євапопакозмуюйтилі «апп» 114 мекв їі Був Маї кл Узі Бус дав окАв бек демо гпув Був ЕПЕЖ Бек Еш 1 5 18 ї5
Атя Лтр Ак отух суя Уаї бБіу Тк лу гу цей Бі зви оАка Гез бій га се за пув'о свіч Тук хі М Тк Мешп зує туйк о уаї Пук зо АВл о Ї1е Аюшо гне
35 І 15
Тув о Тук Іле й о сіу Нів осі» по їмо буя дво йароча! Ту тіє туг в
Ага біз Аве уві Уаї біу Авробі Маї Буз Бо Ре Тук Ав ВрБе те 55 70 75 ва
Тух І1з Азродтса ТТе Бе Аво Бех о Риє Пец іп Ті П1у Її дка хо
Бре Чаї Ст їТїе Шіу Ре Меї бхо ув Був еп Віа бас б1у Тв Бі їв Е 116
Таж оуаї РЯз Тух ТРТЕрошій З1іу АБВ Заї Тк орсо Рез Буз Авротук 515 бує Тк обеїг Авробец Чаї буд Аїа зі Гей оНіз кіз Бпе Тіз б5їг ду 130 135 149
Тук бБіу Ії біс бів Маї Пес Був ТтроБжхо ве Ба ЇІТе о тТто Акт Зх 145 150 155 ї6й пко Взп дей був біб бле Тер обуз АзроАіа Авр о був біз Тух Бе тб ІНК) Уа пузв мем Тут Пув Уаії ТЕгоАТвз Гуз йіз хів му бів Маї зм хо Ав
Іо 185 183
Беш був Уаі Сі Сіу бро Віз Ії Сувобїу с21у Ата АвроФук Ттротїе 135 па го
Піо впро вве ге» бах БНе Сув Тек біб бій Авпожаії Бо За) Авро вче 213 215 225 чаї пек дхо нів Аїа Тву Твеобех пу осів бі бій Туєк Тчх Ето ЕВ 285 3 35 245 пен їіїє тук'сіпа ст тів Ме о рео Бек обі Тує Мес пеа Авй бів рдє 215 вав ж
Був тик Уві Вхч їм тів Її Бу Ав бек НІВ Во Рго Ав оце) рхо ап 265 еВ:
Епе НІВ зо Тахо бід тую дв тає бек оТук Зак Вко біп Аа Рго ві аз тво 235
Ні Авротвг оРго БНпе доп дуа Аїя Тук бе Аза Ас їТе пев о Вех Ба 249 295 300 сім піт Аеротук хі Аве дак Бе веж Тук о ткр тво вне Бек Дер Уві 155 З10 315 ЗО влпе осім іч АкКо пер оУаї во Зх бе лп ЕНЕ НЕів сіу бу Ра о пбіу
ЗЕ 335 335
Тела ві Аїя МБ Ап Ме бів Бко Був Еко ТЕ влпестую ТЕ вБа Бев 350 345 о
Бе Ре Ав Аїз Ме біу сів Пій МЕС ре Тук Дк3 Аво бід НІБ Ме 355 За зе пес уві ТвТ Ат ку Ар о Аво с1іУу Бех Ма1ї Аза Мей тів Лія тр Ал 70 З зв сів чі Ме дяро був тв Мо АБо Бкєб вер БІ Веротут 1 МК пі
Зв 355 35 00 іа БФ Маі дЕШ БЗе Бе АЮ Уаії Раб ОСТЇв бу МЕ і БЕЖ БІ дер 80 41 ді сів біз ні бу Дапорус тТхроіу ТЕ о Трротів чів Ммеї 3 Ара ЕКО о а2У «за ха туї рто деж Пув і) Ста Уві вази тм тез Ах обі Мах Аха пев 455 дай 545
Бхо 31: Іїе Мес ТБЕ Беж діл оБта Ме1і Аїв Аве о Азроязуу Тук бе дялх 459 45 АВ
Те Був о Бйе Му Тези сі Був бай оБія МБ) Хв) ен Туко бій Без БЕ ї28 470 475 188 бій ага Ті Авробій бело пес ТБх Тух Х18 ПТУ мен одез дерошек бух 485 1953 кВ
Ті азп боту Ту 500 едтїйв і ситі» 307 сей. Білок «вії» Бепісфі1її5ит віжрікотївзіяю еО» 115 сія Дів бек Уяі бек Т1є дер Аді іїувк рле пу лів Ні бЗ1у пуд Був 1 х 12 1
Тук бен біт Тк 2112 лу др сій Бук тат Безчотак Бихж Ав ТВО пув о В 33
Авповте Аїа Хіе 115 був Віа Авз) Раз біу бів Без Тцу Бко сотн Анд 3 40 їх
Зак оМес же Укр о АвроАта Тих бів Рео Аз Зк об5ію бів бе о тле вва зо 5 ва
Зак Зіу Шек Ар ТУух Пен стуаї два яжпе Аїз білоба Ави сі бує Те о КУ х 80
Ії джу сію нія Тит без таї Тхв нів Бех обій ем о Єво сбіу Тко» Уві 26 ЗБ
ФЯш ух дек дз Те Авропхуа АваА ТВ Бей Тте Щек ні бе) Був ДЕК нів 150 т25 115 ї1їестне Жде Маї Ме ХЕ о дсу Тую пу шву пуз їі Тук Ада Тхе АВ тї15 120 185
Маї пен; соайвзпосіМ Ті нє Авпос1і: Ав ЗМУ Шех ово вхо Ап о бвЕ Мах 130 135 | 144
Бе Тук вп о Уді ті Біш ЗР Ав Ту Мам Ату Гхеа Ктяа Ме бли оте та: ї55 і55 158
Аа Аж бек уві дво ро ВапоАза був о без бук Те ап До ТК Ба 1«5 7 175 тео Ав» Бек А1а ЗІУ Ту пах Буя Уаї ви б5Іу Мек туаї бек Нів Укі1 зна ї55 189
Бу Бук Ттв Бач Вів Аза сту їТї8вожто її Авроз1у гів бу шаек ОІп їз аз ТОБ
Тих Вів Без оФіу А1і8 бітіу дів бЬу Бек Аїа ув вія біу Аза Бей Авп в 25 Р віз їм АТа ЧекоАзів Сіу Такобух 01 Тіз АТа Хі6 Тв бІіа тем Авр 225 230 235 230 ті втіа 5ІЄ Аза бех Беж Тс о Анро туї Чаї два Уві Чаї Ави Адта Су 245 250 г5х рес йав бсіповіа Був Став Маї ші Тіе Трк Уг) ТкробСіу уві Віз Ав 253 255 270
Ехо Дяв о бех Тер оАто бек бек обер Вест Ро Цей цей РБе Ави» Сіу деп ж аще 205 тук Ан рго Буд Аїа Аіа Тух деп А1а (іє АтТа дви діа Бей 39550 235 За «ій ЛІЄ «7115 33 «212» Білок «війм ТтавЕкйстесці аасвикевславі «Од 116 мес Уві дка Рко Тпх гзБ без бе тТпкобят Бем меб Бас Аа Бгто РрБе 1 З ТО 15
Аїа Аїв міх бех бо тів Мей бі сі дра піл Ах дів сіб пеу ді 52 зв | 30 авробіпотец ТТео їв Аїа вхо зі Тед уві тус ВЕ обіу Мах Аля ТБ
За 45 45 ава опіз дм одру рей отТит Тк сту Буд вк Ах дув Ті Тіє сам вів
ЗО Ба 5
Азр о Епе сту Зі о Маї Таж Рло сіб дев о пеКоМмес ПУБ ттродвр Ата. тку 5 то ї5 ва
Бій Ехо Бас сМма бі Ви ра Депо орРде ліва піт АТа Ав тує пед Уадз я 0 У
Ав: о ткроА1а піп осіп АвпобБіУ Пов їй ї18 дгЯа біуУу Нів оби фей чаї тоо 105 за
Тк ів беж пе Це Рко Беж Тео о маї беху бву Ті ТпПЕ Аво пу Аа 15 ї20 Тщи5 тТВк одемз ТУву дай о уазї Меє Був Аза Вів Те ТВЕ ОТ ем Мет ХЕ Олущ 155 І35 іл тух був ОІУ Був Ті Ага А1а Тер АвювоУві Уві два біа Аза» ре сАвт 185 КБ ТО 153 під АзроблуУу бета Аку білотве Мах ре бей й Ха тіє сту бі 185 170 15 двротує ЇТе Бго ІЗ Атїа Рае сів Тв бта Акт Атаса1іва Ааюорко Вей 150 185 150 віз Бпуя цес Лк Їіз Авпап Ази Тек Ап о бецслнр бек йів бек Тує РКО 195 26 ОЗ йув Ту біз Діва Тіє УМаї АвроАта Уаї Буе бів ство Аку б1а Аза біу 510 215 зх
Уаї Вко ї1е яр С1У їЗе 03у йесобів ТБ опів Теи дек Від сім дія
КЗ 5-3 236 и сіу ів 1у Мах пеу 03 Аа Цей йо Гц Без йта бек Дів щу Тех дк5 5 85 косій Ма1ї Аїв їХе Тих бій пей дво Уаї вій сіу діа Бех бхо Тих
БИ вії 270
Аві Тух Маї Авт Уаї Уа1ї Авіх АТ буя Пец одяй Маї біп бвк бує Май
Ж 280 са
Сту іїє Тнт уві Жтр о БіУ уУаї Аїа Аяр БЕО Авробвтг Тур оАто Вів бек 285 95 300 їВЖ ТНЕ Рко пев їей Рів о Авробіу Ав! БМе Ав; оБжо Був Рей Віа ТУК зо5 3160 5 320
АввоАтїв їв оМаї бій АвБр обкл бій Вій 525 -а1й5 17 «21ї» ав «9125 Білок «аа» Бсваєтащм тУуєхкісвькі віче або» 17
Меї дві по тей Бех це) слу пев ВтТа Аза ем бек Пцьи Тем сіу тух і К) 10 15 чЧвх5 бтіу чаї Вей спе уаї йха Віа Бе тт Уйк ДЕ Бех дво Бех боТу й р за цех СІ) Уаї їй Тїе дек еф Ап о віуУ Ні Уві бу Ніж бів сю цех 35 а аа ввробіУ Бе ості діа лак піп Аза БНе БІВ о Атя Аза біб двр.оїсов цей во по ві бі був Азр о бБІУ Мей Бес Муз Пів біУ Тк осів як о Уахковсм Аеромає о то Ка За їви Бвводеж тує леро тів БІУу Віз йіу Бре Бех їі Мей Аг Дей оп15
Зо 5 їТїе БІ бех дек АВ Чек деї б5о Муй Ані Рпє Мак депо шШек Іде 015 120 125 115 кв овве Бех Рко біу бек ро зі Аїа Гюв о Рко Вів Тух Уаї тгролер 1ї5 128 ї25 пу тТухк ват бек Сіу біп Тез їх уаї іа сліпо піз АТа ре був бдто кл те тай
У чад шо пф Ше Був ве оБи Ту с1і1у дво одіа Ткробех Віа Рто шдзу Тух Мак 145 чо 155 то
Му ТПл дал Ні Авросі Аяр одн СІ С шШіЄ Тукоїев був Ш1У Уді лве 165 їто 175 б1іїу Та дів Сув Аза дає Ту бвроїхрогрувсзіп Азіа Тк Віа Аво туї
Ії89 185 1850
Яез Сей бій ТЕроУал бій Бре Хук о бхо Пув ел ослАу Уві Був Уві Тих та5 я хо
Али Гея Су Ббе Тез Азп бій Бко бів Ре АТа Аїа Всо тут Аїа щіу 210 215 то
Меє цей бех Азпозум Тв сап о Ата йіз дзр о вЕле 116 ка Мах цем сі ги 2730 25 2459 зуз Тл Ї1єе Бош буя Ак бу ТІв Нівз Авробес отпк тіж Дів Сув Су я 25 25 азрозіу Бім) бд1іУу ТЕроАзр о бей сп Січ дар мес Ме АТ бі Бе тре зво ба та
Атаобіу Бхо Аврорхо лів х18 Аве тує ее» Зеж Уві ад ТВЕОБУУ Був та КВ. ФВ сіу тух Мам веж РЕо Бо баб Ні Ро без ех КБ Тв о Буз Буд ТНК 2553 ху 50
Укроуви тал осі Тр оАїв Взроїва Те сту с біл Бе ТВЕ БО Тут зЗо5 Зо 318 320
Бпе Тук Авп деп бек бі бій осзьУ біб ЗТ Мер Тчж о Бжв АТЗ Обі дк 395 ЗУ 35
ТТ обі ТБЕ Аїа їей; Хві Авровіа Азпоуші Бек лну Рлае опе; Тук Тр 340. 35 З
Іхе Зіу Ліз бій дви Беж ТВ ОТЬЕ Азп о бек Атя Бей жде вет Ме о їів 355 86 ев су Ар ому ві тТіє Бкб Беж Був дж пе стТхроійіа віп Аза ек БМе 370 375 ЗВО фет дта Рре Ага Вс Бгто пі Аза Атя вка тіж ЗІЗ о Аза Жах Зак чех 85 за 55 що
Маїс Бто пеа Маї ТАБ оУвЗ3. Бек бек ре те) А Такодяр бі Твс чн 485 418 І 415 діа тт сій Уві Бела Авй Аві АроТВК Уві дій нь бак о Мак обі Бей 426 425 ї30
Уві чаї Як сі1у пт Сіу АхУ Аве Бо Ніз Зеї Пез о йпув Бк ва жо)
Ух чта 4585
Тв о Авр о Аза бех дай о АвроМцец ТЕ АКА бей пу нів Пе о Бу АТа тре
Во 455 450
Сі; пса буу Щек Ве бій ТНе Тв Ті Бко бжо ду Ех Пец Уа ощЕх
ЕВ 470 ЗІ 45 ре о маї Тит Ав РНе лЕ5
ЗЕ ТИН Нукивотид во | вне
КО: аміноконлогта
Я Нуклеотня Нуклестидзі послідовність для КУЗА, ферменту СПЯЗ-сімейства З і ТЕазацета еп стоїдов !
З, о Амінокислотя. | Білкова послідовність ЕЗ А
КВ Пуклеотня 0 | Нуклеотидна послідовність для РІЗ А, ферменту СНЯЗ-сімейстна. ії з Вапіс ня Твіст вата Е
Амінокислота. З Білкова постпловність РЕЗА, Ї
В Нуклеотай І Нуклеотидна послідовність лля Бе, ферменту НЯ З сімейства
З Й З Епзвлиа хепіс ом
І Б ї Амідокислеота Білкова послідовність УЗ 7. Пухклебтих Нуклеотидна несліловнісзь лия КУА, фермевту ЯК ЗО-сімейстна і з Бозастя уеліст еще
ЇЇ В амінокислота Біпкова послідовність ЕУЗОА і о Нуклептяид 0 ЗНуклеотедна восліловність для БА, ферменту СН З -сімелетва
Е з Резис ліз пимевіовий рюннінкчкнкя вино В В В п а. Амінокислеа. Білкова послідовність БУЯЗА 1ї. Цуклеотид Нуклебтидна послідовність для РУ43В, ферменту СТ З-сімействй з Репівйїнита Війтетіов і а с. м орденом ділова конк тенет сте кі кет внедет ік дтістееент пек інв ек пе іт тен Ж етикет яті чно нн 12. Амінокислоти Бізкова послідовність ЕУЯЗ В
Го, Нуклеотидо п Уклеотидна послідовність для Рах1 А, ферменту (1НЗ1-сімейства 7 з Родохрога апхегва і 15, Амінокнелота Білкова послідовність Раз1А
Ел меми с ож й -о - и я а 15. Нуклеотид Нуклеотилна послідовність для Сх, ферменту СНЯЗ сімейства з-СіВБетена хваг
І 18. Амінакислота І Білкова послідовність сх А. 47, 1 Мудхсотил. 0 Нуклеотидна послідовність для Бе43А, ферменту НЯ З-сімейства. х ту 7 х ще . щщИк : з Киванит охухроих 18. Амінокислота | Бійкова посліловність БоЯЗ А. 19. 1 Нуклеотці Нуклеотидна послідовність для ЛІЗА, ферменту СНАЗ-сімейкуві
І зАврегр Но битідатія
ШІ Амівакнслота З 0 Бійкова послізовяієть АНА і 21, Її Нуклеотид Нуклеотилна послізовністя- для РІЗ А; ферменту 15 і-сімейства і з Репіспідни ніна 22, Амішкислота Білкова послідовність ЕБ1А 23 Нуклеотид Нуклестидна поснидовність для А піхуво, ферменту СВ сімейстяи з Решсінівк Яипсшовн 28. Амінокислата Білкова послівонність АТах кн? 25, Нукнеосва Нуклеотидна послідовність пля АйіХхуп5, ферменту. аті- : 1 сімеНства з Авреги их Питрагуя зп 4
Таблиця 1А-1
Р БЕСЙ р Нуклеотид або | Зциє
МО: аміноксилота і ов, Амінокиєтлота Білкова послідовність АВІХх уп !
КЕ нена КОНЯ че пен и пи о попи и ПП вк пп п п пп «її. Ро Муклеотня, Нуклеотилня послідовність для БАЗА, ферменту СНІАЗ- Ї
Я сімейства з Бузагіата успі Нове Шо а. Амінокислота Білкова послідовність РУД3О Ї І і 8 т Нуклеотня Неклеотвдна послідовність для МЕЯВ; ферменту СЯ З- / сімейства 3 Рехісі нот. Візістіосвинї
ЗО. РИ Амінокисптота | Білкова послідовність РІЗ В ! спвтеч нею кт ул вкнею ля тиф нію нку су еечн елек кенненйа із чия Ка ківі Сік чне ей стиеьж уч аа от «акіяті Знак еймежьчи Кечіеазсьчея Ккал «те пьмечні чне віавінкях
З. Нуклевтид Нуклеотидна послідовність для ЕХ5 А, ферменту СНУ1-
Н І дімейстяй з Брезпіша усної і
Зо, : Амінокислота | Білкова послідовність КУТА 33. Нуклебтнл | Пуклеотидня носліловність для Си51 В, ферменту ЯЗ 1-
І Е І сімейства з Спастптиши ріобовиті
Амінокислета Бідковв послідовеість Се31В 35, Нуклеотид | Нухлеугидна послідовність ля КУЯ3С, ферменту СНЯЗ- ;
І сімейства з Епвагши усукошШоїдея нення тт тн тин нти шк Амінокаснюта З Білкова послідовність ККЗ Е
Ф7; МЧукаєвтидо 0 Нуклезтилна послідовність дня КУ30А, ферменту СТ30- сімейства з Бавагиит уепісцоїех одіж танні неба днікні ніг тініллднтнв і пін облич дн тн піз я делікатне тт інте о ККпкті пт сіті ідея стою та в нт іп ісж я Кніт ниток нні онкетян
ЗВ. Амінокислота Бійкоза послідовність ЕХЗОА,
КЯ БНуклебтнл Нуклезснянва послідовність ля БУ4УК, ферменту ЗНАЗ- Ї сімейства з Бизаглит Уест оїдев. І 80. лмінокислота Білкова лосліловність РУ балевичі Я. пмежіж чн кет іонна спирті ранеет тот чіксидчо ет донос окрт ній екю тік кет оді не от рат кін нпркденотечіеечя кт
Я. Е Нуклеотид Бикова послідовність Купа, ксиланази СНІЙ з Теюйодений І тссвеї 45, Амівокнелога Біїкова посжіловвість ХувЗ о 43. Амівокислота Білкава послідовність Хупо ксиланази ЗНО з Тонодеста ї
В тесвсї ! 86. аАмінакислатв Білкова послідовність ЗХ)! б-ксиланази СНІ я тпспоЧчегта
В теезеї ся Амінекіислота Білкова послілювність Вії. В-глюкозидязи НІ з х Б
Е І Тесподептватвовеї З що Я ПИ ЗИ НО ВО О ОК 46. Нуклестна Ї Розшифрована КДНК для РабтА, З 4ї. Нуклеотни Кадан-оптимізанана КДНК для РазТА 48, Нуклеотид ! Колуюча послідовність для сигнальної послідовності СВНІ
Е ліворуч відтекомної ДАК, кодуючої зрілий С743А. і 3 се діа титнті катки "нка масі дан ок Ан волі жі дуття міні жін судів я та і ціж мкіпрти піти т піні жія кл тпм век дія пола кто 45, Нуклестид Кодуючалослідоввість для сигнальної послідовна СВІ й ліворуч від гемамної ДАК, кодуючої зрілий Бо43 А, - мнневчесттаан огікаю сечюта чн аекентечс дна ун апіюденок нчкойінтеакнннакчнтне коп нененіткчкоесутнннтатюннкіке чекання ї Щі. Некавотих Капениьоптимізавайа куклобтидня паснідовність дня сигиальної послідовності ! й що ЮВНІ ліворуч вії колин-олтихіяоланої ДЕК. керузочої зрільй РОСА жо я
Таблиція 1А-2 і Фермент Номер доступу Вихідний потам з
МеБА І ХРО ЗбОбяБІМОВІ С Марпаропледняюа 0000
САВА 0000 ХЕ ОІОВО(МОВІ 7 йврейеієлею
І БА ох пол1озеВ35МСВ ро Ругапойного (псітереліїв
ВА 0000 ХРОО01595513 МОВІ) Ї Єріегойнів зсіоговогит шо нищити сни
АВХуУпа | см? зМиіргой Асрегуйие таня
ТВБИхуУп Ї ОКО (Опір і Релістйит пІпістювит
Совки | осАаєМаяінсву 1 еерютусев зе БО
Таблиця ІВ 1. Пейсів Ваєкогонта) М Оееїв Васкогочна) Е 1. Онайсвеювові пон мин НО ЛИН,
Ї ЕУазА ЩЕ СЕ 433 а Ин ик: ЛИШ ШЗА-Я5 939 .Жжю.
ЕмаЗо. ве ПЕТ ННІ ОСТ ший ша: ЛИН Мишк: ИН КИ ж сх НН
Ї тв. 4000522 ловяя щедро
МА 00031 і ВабА 050 450
БУЗОА 1 ат. 98 с
Е еВ
РА, сш шин ВЗА ля
ОвУЯЗЕ ол 0о !
І бизд 94 459
Бо4ЗА 2541 вія
Таблиця 2
! Вічок | "активність на кснлані березової і деревння при ЗО" (Одиниліюе білка) ни ши ЛИН п и у
Авхупо 062000 оРЕхут ши
Верх У
І лехХуюо п:
Таблиця З
РУЗА 98 | МВ Аа
БУЯЗА кл
Емо 23. й
БУЗТА і
ТеВхі є ЕкаЗА 883 | 832 | 152 щ
Тевхі крав 00000068 10086151 288
ТЕВХИ Ж РУТА Я шо ШИ
АВ МА1ВАСтбярто
ГУЗА ХЕ ними МИ ВИ НИ монах ГЕН
ЕхЗА « ГУЯЗВ СЕЗ МИ сх ИН ПИ У.
БУзА БУЯЄ 56 822 0156 тизатки я 333 що 1385 1 а тиші 71777565 1765
Реазо ка яка 1835235 вазр я рУА 00023500 вер МИ а І кН КЕ 504
Тевхи з руазАякУвіА| 00 8556000 66010082 рУзрярузджвіА | БвЯ |В си и ШИ
Таблиця 4 гТБблюця ХА ги: Таблиня 5 і Гобинця 58 сах й меОФО ск Тк хуив| ВЗ віх в зд БУяЗе УЖ хи | вв | дле юна) хи | бю | ляв й: йо гаупщрию ій Ів ак сет Ома | мшпої збмяоі міюло| ібор'я у юр р зорі х лю пелет кер вно пес вну як вт і ба Гб оо ом) 5 й 03 сад ГАЗ 2555 32 4Е в ПИВ ДНЮ) бли оо о ві ВВ ЕМ БОБ ев под і В ЗВО ОЇ 3.63 о 52) по 02 01 о о 11 рве Зам о | Бала | Бе т | То ж ода б 3 005 й й й 7 ровато 15795 0775 4 | б528 40061 3
В 2021 0021 0251 7 1021 ОБО ГОБооЯ в 5 Сей 3055. зі ВН евщі9| 5-67 | 632 1 ТБ | бвле | 55 12 я Го 3 952 0021 03 10963 о т оно рі19о5| об В І аа 1 9751 | 345 роб оойю об оо о125| 0 тб 1053 ов обся За 1 63 Тов 55
ЕЕ ам |. Я 3 03 оп ов Я 0 ВОМ ТОБІ доле 6125. | ОБО З МН ре В | оре во в З Я боро зе е Гео об ОВ І З ЗОВ, 18 45 04 | 01 5091 09810310. 30 |. 7 153002 11495951 8673 5155 ГІВ, За3 53 зр гом 5 | пи 00518 В 9121 зав |З43И8І 257 1 6049 р 7547 5 Ї 21
КЕ поті РАМИ ЕСЕ Ба о йо А Я, 1 яв | 01 6420 п 1551 151055 19884 2854 1 оо бохо 1 БА ат
Бе по 3 1 603 1707105 бога ЗБ | а 1 ЗБ й га з обі об 53 0. 404 1 к ГО1АЯЮ ДЯВООЮВ) МКЮ БА БЕ 168 ряба го 1 б 3 Гі б 1 б 1797 о5407 13аобв| зві 1 а5о? | 632 зи Я -ЖУ що (ог о С Я в У 1 ЗЕ КЕЙ ут р 5 ай
ОВ МЕС МНЕ У ВО й г 21 г ойом ов тив ба: БОБ | ВО І б В 75 ше б 10251 03451 0051 0 п я аг 15. ен а 13
ЗЕ 4 15.3 0025 0961 051 0 з 1 роя и ек ви Й ВЕК
Габлиня ЗА - ; | . й ; І се | 01 БО 002 ода 0 опо 03 17 | ові. 350931 62 1 03 р 53 Зоб 1 якою 1 51 04 1 0 1 005 002 фо 63 1 о | 21 гово оон! 5906 | Бай | ВО ве р ОВ ее 31. ВА 10 БО 60630005 опр вннві ВВ В. ВО ОВ ОБ) ТОВ, що 55 в ОД о в ВО реа ЕЛЕ ОВМИ фею, ЗВУ 189 зі Біо й р 002) оо» ою а а фло нама та? | «ово 387 ЗО ке ба. 1001 00 00 о5 101 обов 27 ве ОБ Бе БТ 1 ЯЗКИ о
У ТО. в 5 ї ява ове рівний ля р еВяЗ у БЗБІ І ЕТ 1 Бі 64 | 0.1 пз 03516 ГЕЯДЕ УА: ВИЙ КК Я А БК АНА АЖ ЗОВ ЯК
БА 4 її 5021 028 6 сої 017 190015 51 448 1 335 1 352 ва ТОН ішЕо: в знее вав: ВО ЕЕ,
З1 А ба її ої о» 034 6 1051 01 8 ово рова 0785 | 03 | ББю о 155, а о Що 6 1 вав ОЗ
КЕ зник я 5. ої сеї | бою 190 БО ОБ 1 Во о ат) 3.085510 00615 ГОЮ. шо 21 1 3082О БЕВЯБОІ Я ЕЕ нии
Фіра іс по ою по 15 1 1 оОВОБ ла яко ОТ | 4308 | дол а5ої Р В:
КЕШ йо. Вб, о 1 б3 1098 3 | 804 13885 352 1 585) 5850 5; Р 5338
АР Е дя 100 БВ ОО КК Я ГУ ОО 1 оту 1005 3 396 587 ВІ ТОЇ
Я З ох ВЗ ВУЗУ МИ МК) Об 7 оон ів Є торі 4383 г оБ В ОВ пз 5451 бо. 0 її оба оби б 1001 бро. роя разові 095 1 87А вої лаву о пд вин Я
Фа За а п 0 й 116155 | З ве Б 4 ВОНО іні й св вер я Б ща СУК 1056 1 З4 3030 574 ВВА Об о бу
МЕ В Га ловя од | о Р 1 6 179 1 0297, | 302588 шен К ре ВК А
БА 04 1 0 01) 81.01.0085 182851 З ВЯ но боно Ге ЗВ
ВЕСНИ МЕТИ ДИКО НИКИ ПВЕЕК СВ ДОК СН ЗНАННЯ ЯСНЕ ВІВ ОПЕК КИ ЯКІЙ ВРЯТУЙ ВЕК МЕС ВАЗ ВЕС, пі | да | 0 ре 00101 і | ул роза о 1 уз Бе БЕ ЗІЗ
Примітка: Максимальні теоретичні виходи копали, плохати і арабінози розраховували на 45,05 мг/мл, 53,45 мелмаї 591 мими; відповідно
Таблиця 5В
Модеж розрзхованнк оптиминьних співвідношень
Загальне Дав ка, леді де «бракція. Р хБракиїя Р оФракомо3 «Фракоїх ! Фрахщя З Фракція Я прю навантаження | холі акикічеють Ста р ечащеноо реищенсга очного. | очафеного |таюпеного мг тлюкової себесбохко Асевівгаєе Ве Е , я х койночи намптамення) гч » Купі З Ем ГГ РУБІА | Рея» | ча
Загальні | ! ши щ ! ; ан 2 ох о 015 004 вв вена 0 ! шин ши шк тлкОоЗи і й . Й крвижа / з в ох о 022 | вдо вої ож | вок ксилозу : - плн щ- джин шк Я ЕЛ ння - 7 | пд о ол 1 002 ба 225 яд тр пиши шк врабінови 21 од б4 в оз | ода о | оле | ов
Таблиця б
Ме де ТАХ у. щ шк . тот Й Й них Нехай Вих деонлу. Ассвіюгавов | Хупі ЕБуЗА ЕМаО фо Бувтд | РУАЛА ЇЇ ЕжаЗА зве іонловй зміну ж 3-51. 15175155 ах ря я 211910 | 60610 | о 2 2 о КСО - 00 0100 о Е ох тах боляля 1 тв трете тр трах се ? луята тяте й я 1 о 610 1 556Х 239 пи ИЙ МИ М ИИ Ш б 160 4936 | «ав | ли й 155 3 1. о пав тат ява і яБая мя
БВ; ТЕО ЗОВ 8 185 4-8 Шк ША: НИ Аж -8 1.83 З ВОЖДЬ | Ве 7 ЩО 4 2 | тоб ГЕ 35 й о вед | яп і 33595 8 63 В ок. 105 | об | ел | 8бюх | 04
ІП5 фр лов | 63 6 тов | 875 | 1575 6 1 5325 87йи | 3585 1. 75 Мо Шви М сви МАМАМИ МВА ВИЯВ А і МЕсхсаНИ НШ я 5 1 83 9 ТО5 1 5575 й 1515 | во г Ва 1. 338
ШЕ іб5 | ва | 35 105 | 6 0 Бах | а» 3
ШЕ ча 1 855 Рід 0 яв | 55 б 1 ай | бли | 8005 4 3 й вай вив 1 аа 83 рБв | об. 0 1 б | 85 ) 985 вою | 4555 05 | о5 | 8 105 105 с тов ов - ке зія5 | ав тр 71783 057 10571 об 1 505710 1850 во | ат ї85 | 08 53 | 05 | 051 0 їо5 | 105 і важ рові ав 19 105 ба бла? | 08 | буйла і 08575 | 07875 | Бо БОтх,
Таблиця 7
РаА яз ва зарг Целобіоза | Ксилабіоза Ксилоза стан хсийан ксвиван мія заіми васіьт ріках часі
ШИ ТЯ 1.8 2681507 о с ШИ ВИ ЕК Й тб 153 509 їй поїли 17550 рю 55 п и ПК НИ МЕ Я п 1755 | 555 3 504 етроетртв а рр 05 16105 25 1 55 1557 1555 1 8568.
УМ НИ: ТУ Е ШИ
САНИ ВИНА т ОН Є В СЕ ВСЕ тла б шими шо и ПИ ПИ В т КЕН ОСЕНІ НАСЕ ' як р ву 1 а 1 ої Ба А С С Й, шини ши жи 64.8
СЛИНОЮ МИНУВ НННК З ВАН ПИШУ ЗНОВ МЕС НОСКИ о З ЕЕ ШК плисти ши ев ра рен 562 644
ШЕ ШИК 2 783 ГК) си | во |в 48 3.288801 735 | 55566 шин З 2 р8о яв 405 1666
Таблиця 8 омик кіл сюкози Ї Вихід ксилози | Вихіл прабітзи: в ШИ Я
Ще ах ваз
Таблиця 9 перерв сте
А. 55 | та Бл ве | лев | ге | БВ І те вт | виб | Ва с 135 583 | а тою | бле | 25» | ее | а р | зву ов,
Таблиця Ід таро корек тех я тонко рок тек
Ан и я з обя ВА І 1 В ВК.
ЕУВІАчКУИЗЮ ЕвОой | АВ СЯ ЗІЗ 18 В. аа» | 5 студ 0001 ов вай 1535 р бай ля реве 05 Ж М ши ее в | ал 1 вл тк 1 сві ЗБ І ЗБ І Ябя | 302 Зою
Ер я рок | 805 | об зах її ль 1 Зх
ЕЙ в і ув | ж | ВК | об
Таблиця 11
Експериментаньні параметри Веякціх реакцій Я зеікщі З
Час хв.) лежу се Гр МНУІ рн іл Таспересстенихкнаяну то тагального теретенкя яю. СКУНЕ ПОН ЗНИНИ МАННУ НААН С УМА аі їй лю роя | о хи ПО с З ОО ПИ е СИЩИ ши ши шишнши вишш ниУ ш нии граю доме 15001001 и т КТ 475 ТЯ 5385 0. 7вБю ! 63-46 во що. м го рр ті юю ЕК Бак тя БВ а б, а. 180 кА ШК КИ НИМИ Й ШКО С ЗИ сел, шк НК Мк ЗВ Вк НВ НИК ВИННА Ас КН ИНА НН тю пт С ШК М В ВИНЕСЕ ря
Фіг. ІЗ
Ха сук речпани Часїднї Ффернент Я Й |! п Шо Й й іс тв Гянкоза (пл) Кенасза ів) Слювевн, ж ЖКсилан, ше ооблюжан | . | ;
Кз ПИ ИН Р ія | 262 1 8505 ШЕ ве з ШЕ: са з А я Ше У Я СНИ ши и М: и МЕ ЗИ Зо 5425 6385 1
Зк | 4 НІ 12 зве в
Таблиця 13
Я- й 558 01006500, и мет ше пет п НО ІК СВ КЕ Бо вав ТУ
Яб547 Злі 75.05 аа ов
Гоябвіяєтю |ооая? 10 17лв8: 0 | вм | мовою 1 8508
Говавіяго бо. т55о 00 о болеюо 1000еале001 77605
Говоував 01083607 ще 01062 Щ|робвяок 170 ловеви 000 во
БОБІВ | 363 тля об волю її о | 82е55. о вогвоя |З т73я зала | ввлеж ва во лоб іБІБів зи 12571851 везе 10 хо 1 вав аБів; 308. 1. 7588 1879 З8.а5о5 - 2-3 с ББІЩав | б 104,32 о.3ов,
ББІНВ
ШЕ: У ГИ Ес: ле І МИ МЕ ЕС
ВЗ МИС ж Ме СИ ЕС Й 94555 І тб
БаБІ5Я хи: си ших я кс; В М НН зі | 86 1 5ав1 1 240 | пл 781955 І.О,
Би ра ГЕН ВЕЗЕТИ (вою | ол45 1 зв | в.. | «вим 10 чада 0 | Зло
Таблиця 14

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Композиція, яка містить: а) перший поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО:2 або залишками
() 24-766, (ії) 73-321, (іїї) 73-394, (м) 395-622, (м) 24-622 або (мі) 73-622 послідовності 5ЕО ІЮ МО:2; і Б) другий поліпептид або його варіант, що має ксиланазну активність, де другий поліпептид являє собою ксиланазу Тгісподепта або ксиланазу АзрегодійНив5.
2. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид або його варіант, які мають 1 -а- арабінофуранозидазну активність, де третій поліпептид або його варіант мають щонайменше 90 Фо ідентичності послідовності 3: а) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:32 або залишками (ї) 21-660, (ії) 21-645, (іїї) 450- 645 або (ім) 450-660 5ЕО І МО:32; Б) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:20 або залишками (ї) 15-558 або (ії) 15-295 5ЕО Ір МО:20; с) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:12 або залишками (ї) 17-574, (ії) 27-574, (ії) 17-303 або (ім) 27-303 5ЕО ІЮ МО 12; а) амінокислотною послідовністю ЗЕ ІЮ МО:14 або залишками (ї) 21-676, (ії) 21- 652, (іїї) 469- 652 або (ім) 469-676 5ЕО ІЮ МО:14; або е) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:22 або залишками (ї) 21-632, (ії) 461-632, (ії) 21- 642 або (ім) 461-642 5ЕО ІЮ МО:22.
З. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, що має ДВ-ксилозидазну активність, де третій поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності 3: а) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:28 або залишками (ї) 20-341, (ії) 21-350, (іїї) 107- 341 або (ім) 107-350 5ЕО ІЮ МО С28; Б) амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:14 або залишками (ї) 21-676, (ії) 21- 652, (ії) 469- 652 або (ім) 469-676 5БЕО ІЮ МО: 14; с) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:16 або залишками (ї) 19-340, (ії) 535-340, (іїї) 19-383 або (ім) 538-383 5ЕО ІЮ МО:16; Ко) а) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО :44; е) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:4 або залишками (ії) 21-445, (ії) 21-301, (ії) 21-323, (ім) 21-444, (м) 302-444, (мі) 302-445, (мії) 324-444 або (мії) 324-445 5ЕО ІЮ МОА; І) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:6б або залишками (ї) 19-530, (ії) 29-530, (іїї) 19-300 або (ім) 29-300 5БЕО ІЮ МО:6; 9) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:8 або залишками (ї) 20-439, (ії) 20-291, (ії) 145-291 або 145-439 5БЕО ІО МО:8; І) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:18 або залишками (ї) 21-341, (ії) 107-341, (ії) 21- 348 або (ім) 107-348 5ЕО ІЮО МО:18; або ї) амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:12 або залишками (ії) 17-574, (ії) 27-574, (ії) 17-303 або (ім) 27-303 5ЕО І МО:12.
4. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з БЕО ІЮ МО:28 або залишками () 290-341, (ії) 21-350, (її) 107-341 або (ім) 107-350 послідовності БЕО 10 МО:28.
5. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:4 або залишками () 21-445, (ії) 21-301, (ії) 21-323, (ім) 21-444, (м) 302-444, (мі) 302-445, (мії) 324-444 або (мії) 324-445 послідовності БЕО ІЮ МО4.
6. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:6 або залишками (і) 19-530, 60 (ії) 29-530,
(ії) 19-300 або (ім) 29-300 послідовності хЕО ІО МО:6.
7. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:8 або залишками () 20-439, (і) 20-291, (її) 145-291 або (ім) 145-439 послідовності БЕО ІЮ МО:8.
8. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:10 або залишками () 23-449, (і) 23-302, (її) 23-320, (ім) 23-448, (м) 303-448 або (мі) 321-449 5ЕО ІЮ МО:10.
9. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:12 або залишками () 17-574, (і) 27-574, (її) 17-303 або (ім) 27-303 послідовності ФЕО ІО МО:12.
10. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:14 або залишками () 21-676, (і) 21-652, (її) 469-652 або (ім) 469-676 послідовності БЕО 10 МО:14.
11. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 Ко) ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:18 або залишками () 21-341, (і) 107-341, (її) 21-348 або (м) 107-348 послідовності БЕО 10 МО:18.
12. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:16 або залишками () 19-340, (ії) 53-340, (її) 19-383 або (м) 53-383 послідовності ФЕО ІЮ МО:16.
13. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:44.
14. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:32 або залишками () 21-660, (і) 21-645, (її) 450-645 або (ім) 450-660 послідовності БЕО 10 МО:З32.
15. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 БО ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:20 або залишками () 15-558 або (ї) 15-295 послідовності «ЕО ІЮ МО:20.
16. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:22 або залишками () 21-632, (і) 461-632, (її) 21-642 або (м) 461-642 послідовності ФЕО ІЮ МО:22.
17. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою 60 кислотою, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:27, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:27, або її фрагментом.
18. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕБЕСО ІО МО:3, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:3, або її фрагментом.
19. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, яка має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:5, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:5, або її фрагментом.
20. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, яка має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:7, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:7, або її фрагментом.
21. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, яка має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:9, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:9, або її фрагментом.
22. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, яка має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО 10 МО:11, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:11, або її фрагментом.
23. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, яка має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО І0О МО:13, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:13, або її фрагментом.
24. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:17, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 Зо МО:17, або її фрагментом.
25. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:15, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:15, або її фрагментом.
26. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:З31, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:З1, або її фрагментом.
27. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:19, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:19, або її фрагментом.
28. Композиція за п. 1, яка додатково містить третій поліпептид, який кодується нуклеїновою кислотою, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО:21, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:21, або її фрагментом.
29. Композиція за п. 1, де ксиланазою Тгісподепта є поліпептид ХупЗ3 Тгісподепта геезеї або поліпептид Хуп2 Пісподегта геезві.
ЗО. Композиція за п. 29, де, якщо він присутній, поліпептид ХупЗ Тгісподегпта "геезвї БО щонайменше на 90 95 ідентичний послідовності 5ЕСО 10 МО:42 або залишкам 17-347 послідовності ХЕО ІЮ МО:42.
З1. Композиція за п. 29, де, якщо він присутній, поліпептид Хуп2 Тгісподегпта "геезвї щонайменше на 90 95 ідентичний послідовності 5ЕСО 10 МО:43 або залишкам 33-222 послідовності ХЕО ІЮ МО:43.
32. Композиція за п. 29, де, якщо він присутній, поліпептид ХупЗ3 Тгісподепта геезвї кодується нуклеїновою кислотою, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності ФЕО ІЮ МОС41 або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю 5ЕО 10 МО:41, або її фрагментом.
33. Композиція за п. 1, де ксиланазою АзрегодіЇи5 є поліпептид АїиХуп2 або поліпептид АїиХуп5.
34. Композиція за п. 33, де, якщо він присутній, поліпептид АїиХуп2 щонайменше на 90 95 ідентичний послідовності ЖЕО ІЮ МО:24 або залишкам 19-228 послідовності 5ЕО ІЮ МО:24.
35. Композиція за п. 33, де, якщо він присутній, поліпептид АїиХуп» щонайменше на 90 95 ідентичний послідовності 5ЕО ІЮ МО:26 або залишкам 20-313 послідовності 5ЕО ІЮ МО:26.
36. Композиція за п. 33, де, якщо він присутній, поліпептид АїТиХуп2 кодується нуклеїновою кислотою, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності ЗЕО ІЮ МО:23, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:23, або її фрагментом.
37. Композиція за п. 33, де, якщо він присутній, поліпептид АїТиХуп5о кодується нуклеїновою кислотою, яка щонайменше на 90 95 ідентична послідовності ЗЕО ІЮ МО:25, або нуклеїновою кислотою, яка гібридизується, за умов високої жорсткості, з комплементарною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:25, або її фрагментом.
38. Композиція за п. 1, де перший поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичності залишкам 24- 766 послідовності ЗЕО ІЮ МО 2.
39. Композиція за п. 1, де перший поліпептид має амінокислотну послідовність, яка складається із залишків 24-766 5ЕО 10 МО:2.
40. Композиція за будь-яким з пп. 1-39, яка додатково містить один або декілька поліпептидів, що мають целюлазну активність.
41. Композиція за п. 40, де один або декілька поліпептидів, що мають целюлазну активність, є незалежно компонентами цільної целюлази.
42. Композиція за п. 41, де цільною целюлазою є збагачена В-глюкозидазою цільна целюлаза.
43. Композиція за п. 41 або 42, де цільною целюлазою є цільна целюлаза міцеліального гриба.
44. Композиція за будь-яким з пп. 41-43, де цільною целюлазою міцеліального гриба є препарат з видів Асгетопійшт, Азрегодійи5, ЕтегісеМПйа, Еизагішт, Нитісоїа, Мисог, Мусеїорпщтога, Мешцгозрога, Репісіййшт, Зсугаійдішт, Тпіеіаміа, Спгузозрогішт, Ріапегоспаєїе, Тоїуросіадішт або Тисподетта.
45. Композиція за будь-яким з пп. 41-43, де цільною целюлазою є цільна целюлаза СНпгузовзрогішт ІшсКпоуепзє, РНапегоснаєїе сПНгузозрогцт, Тгісподепта геезеї, Тісподетта Ппагліапит, Тгісподегта Копіпаії, Тгісподегта Іопдібгаспіаєшт, Тгісподегпта мігіде або Репсійит Зо Типісшовит.
46. Композиція за п. 40, де один або декілька поліпептидів, що мають целюлазну активність, вибрані з В-глюкозидази, ендоглюканази і целобіогідролази.
47. Композиція за п. 42 або 46, де ВД-глюкозидазою є поліпептид Ва! Тгісподегта геезеїі.
48. Композиція за п. 47, де поліпептид Ваді1 Тгісподегта геезеі щонайменше на 90 95 ідентичний послідовності 5ЕО ІЮ МО:45 або залишкам 32-744 послідовності 5ЕО 10 МО:45.
49. Композиція за будь-яким з пп. 42 і 46-48, де В-глюкозидазний поліпептид складає до 50 мас. до загальної маси целюлазних ферментів в композиції.
50. Композиція за будь-яким з пп. 42 і 46-48, де ВД-глюкозидазний поліпептид складає 2-50 мас. до загальної маси білків в композиції.
51. Композиція за будь-яким з пп. 40-50, де один або декілька поліпептидів, що мають целюлазну активність, складають 30-80 мас. 905 загальної маси білків в композиції.
52. Композиція за п. 51, де один або декілька поліпептидів, що мають целюлазну активність, разом досягають щонайменше 0,00005 фракційного продукту на мг білка на грам набухлої в фосфорній кислоті целюлози (РАЗС), як визначено калькофлуор-аналізом.
53. Композиція за будь-яким з пп. 1-52, що додатково містить один або декілька допоміжних білків, вибраних з групи, що складається з мананаз, галактаназ, арабіназ, лігніназ, амілоаз, глюкуронідаз, протеаз, естераз, ліпаз, ксилоглюканаз, поліпептидів Сімейства 61 глікозидгідролаз, СІР1, СІР2, своленіну, експанзинів, СІР1-подібних білків, СІР2-подібних білків, целобіозодегідрогеназ і марганецьпероксидаз.
54. Композиція за п. 53, де один або декілька допоміжних білків складають 1-50 мас. 95 загальної маси білків в композиції.
55. Композиція за будь-яким з пп. 1-54, де композиція перетворює 60 95 або більше геміцелюлозного ксилану з біомаси в ксилозу.
56. Композиція за п. 55, де композиція перетворює 70 95 або більше геміцелюлозного ксилану з біомаси в ксилозу.
57. Композиція за п. 56, де композиція перетворює 80 95 або більше геміцелюлозного ксилану з біомаси в ксилозу.
58. Композиція за будь-яким з пп. 55-57, де біомасою є серцевина кукурудзяних качанів, кукурудзяна солома, кукурудзяне волокно, просо прутоподібне, сорго, папір, пульпа або багаса бо цукрової тростини.
59. Композиція за будь-яким з пп. 55-57, де біомасою є Міскантус (Мізсапійив5).
60. Композиція за будь-яким з пп. 1-59, яка додатково містить біомасу.
61. Композиція за п. 60, де об'єднана маса поліпептидів, що мають ксиланазну активність, дорівнює 1-40 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
62. Композиція за п. 61, де об'єднана маса поліпептидів, що мають ксиланазну активність, дорівнює 0,5-40 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
63. Композиція за п. 62, де об'єднана маса поліпептидів, що мають ксиланазну активність, дорівнює 0,5-20 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
64. Композиція за будь-яким з пп. 61-63, де об'єднана маса поліпептидів, що мають ксиланазну активність, дорівнює 2-20 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
65. Композиція за будь-яким з пп. 60-64, де об'єднана маса поліпептидів, що мають ВД- ксилозидазну активність, дорівнює 1-50 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
66. Композиція за будь-яким з пп. 60-64, де об'єднана маса поліпептидів, що мають ВД- ксилозидазну активність, дорівнює 0,5-50 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
67. Композиція за п. 66, де об'єднана маса поліпептидів, що мають р-ксилозидазну активність, дорівнює 0,5-40 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
68. Композиція за будь-яким з пп. 65-67, де об'єднана маса поліпептидів, що мають ВД- ксилозидазну активність, дорівнює 2-40 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
69. Композиція за будь-яким з пп. 60-68, де об'єднана маса поліпептидів, що мають І1-а- арабінофуранозидазну активність, якщо вони присутні, дорівнює 0,5-20 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
70. Композиція за будь-яким з пп. 60-68, де об'єднана маса поліпептидів, що мають І -а- арабінофуранозидазну активність, якщо вони присутні, дорівнює 0,2-20 г на 1 кг геміцелюлози в біомасі.
71. Композиція за будь-яким з пп. 60-70, де об'єднана маса поліпептидів, що мають целюлазну активність, якщо вони присутні, дорівнює 1-100 г на 1 кг целюлози в біомасі.
72. Ферментаційний бульйон, який містить композицію за будь-яким з пп. 1-71.
73. Ферментаційний бульйон за п. 72, який є ферментаційним бульйоном міцеліального гриба.
74. Ферментаційний бульйон за п. 73, де міцеліальним грибом є Тгісподепта, Нитісоїа, Зо Еизагішт, Авгрегодійи5, Меийговзрога, РепісШішт, СерНаіозрогішт, АсНіуа, Родозрога, Епаоїніа, Мисог, СоспіороЇн5, Ругісціагіа, Рпапегоспаєїе або Спгузозрогічт.
75. Ферментаційний бульйон за п. 73, де цим міцеліальним грибом є Аврегойш5 ажматогі, Аврегой 5 Тштідаїив5, Азрегоіив5 Тоеїйдив, АзрегойШив5 |аропісив, Азрегойив5 підшапв, Азрегойив підег, Азрегдійнв5 огугає, Спгузовзрогішт ІсКпожепвзе, Ризагпт бБасігаіоіде5, Ризагпцт сегеаї 5, Еивагтішт стооКмеПепбзе, ЕРивапйит ситогит, Еивзапйцт дгатіпеагит, Ривзагпйт дгатіпит, Еизатцт Пеїегозрогит, Еизагішт педипаї, Ризагйшт охузрогит, ЕРизагішт геїйсшацшт, Ризагт гозецт, Еизапйцт затбрисіпит, Еивзагпит загсоспгоицт, Ризапйцт зрогоїпспіоіїде5, Ризагйт 5шрпигтейт, Еивзапйцт гшо5ит, Еивагішт іспоїпесіоїде5, Ризагт мепепашт, ВієЖапаеєга адивєїа, Сепрогпорвзів апеїїпа, Сепрогіорвзіз апеїіпа, Сепрогіорзіє сагедієа, Сегірогіорвів дімезсепв, Сегірогіорзів раппосіпіа, Сегірогпіорвів гімціоза, Сегірогіорзіз зибгита, Сепрогіорзів зирмептізрога, Соргіпив сіпегеив, Согіоїшв Пігтешщив, Нитісоїа іпзоЇеєпв5, Нитісоїа Іапидіпоза, Мисог тієйпеї, Мусеїйорпійога ІШепторНійа, Меийгозрога сгазбза, Мешцгозрога іпіептедіа, Репіснит ригритодепит, РепісіШит сапез5сепв5, Репісійшт з5оїйит, Репісіййшт пісшовит, Рнпапегоснавїе спгузозрогішт, РНПебіа гадіате, Рівитоїшв егупаіїї, Таіаготусе5 Памив, ТНівїаміа іетевігв, Тгатеїев5 мова, Тгатеїе5 мегзісоої, Тіісподепта ПНаггіапит, Пісподепта Копіпадії, Пісподегтта Іопаїбгаспіашт, ТПіснодетта геезеїі або Тіснодетта мігіде.
76. Ферментаційний бульйон за п. 73, де міцеліальним грибом є Азрегодіїи5 або Ризагійт.
77. Ферментаційний бульйон за п. 73, де міцеліальним грибом є Тгісподегпта геезві.
78. Ферментаційний бульйон за п. 73, де міцеліальним грибом є РепісіПит Ягпісшовит.
79. Ферментаційний бульйон за п. 73, де міцеліальним грибом є Мусеїіорпіїйога Іепторніїа.
80. Ферментаційний бульйон за будь-яким з пп. 72-79, який є безклітинним ферментаційним бульйоном.
81. Спосіб перетворення біомаси в цукри, який передбачає контактування біомаси з композицією за будь-яким з пп. 1-71 або з ферментаційним бульйоном за будь-яким з пп. 72-80.
82. Спосіб оцукрювання, який передбачає обробку матеріалу, що містить геміцелюлозу, композицією за будь-яким з пп. 1-71 або ферментаційним бульйоном за будь-яким з пп. 72-80.
83. Спосіб за п. 82, де матеріалом, що містить геміцелюлозу, є серцевина кукурудзяних качанів, кукурудзяна солома, кукурудзяне волокно, просо прутоподібне, сорго, папір, пульпа або багаса цукрової тростини. бо 84. Композиція за п. 82, де матеріалом, що містить геміцелюлозу, є Мізсапіпив5.
85. Спосіб за будь-яким з пп. 82-84, який дає щонайменше 60 95 ксилози з геміцелюлозного ксилану матеріалу, що містить геміцелюлозу.
86. Спосіб за будь-яким з пп. 82-85, який додатково передбачає витягання моносахаридів.
87. Виділена, синтетична або рекомбінантна нуклеїнова кислота, яка кодує поліпептид, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:2 або з амінокислотною послідовністю, відповідною залишкам 24-766, 773-321, 73-394, 395-622, 24-622 або 73-622 послідовності ЗЕО ІЮ МО:2, який має В-ксилозидазну активність.
88. Виділений поліпептид, де вказаний поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичності послідовністю з амінокислотною послідовністю 5ЕО 10 МО:2 або з амінокислотною послідовністю, відповідною залишкам () 24-766, (її) 735-321, (ії) 73-394, (ім) 395-622, (м) 24-622 або (ім) 73-622 послідовності 5ЕО ІЮ МО:2, який має В-ксилозидазну активність.
89. Рекомбінантна клітина-хазяїн, сконструйована для експресії гетерологічного поліпептиду, який має щонайменше 90 95 ідентичності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:2 або амінокислотною послідовностю, що відповідає залишкам 24-766, 73-321, 73-394, 395-622, 24- 622 або 73-622 5ЕО І МО 2.
90. Клітина-хазяїн за п. 89, яка є клітиною міцеліального гриба.
91. Клітина-хазяїн за п. 90, яка є клітиною Гісподепта, Нитісоїа, Ривзагішт, Аврегодіишв, Коо) Мешйгозрога, РепісшШішт, Серпаіозрогішт, Аспіуа, Родозрога, Епаоїнпіа, Мисог, СоспПіороїив, Ругісціагіа, Рнапегоснаєїе або Снгузозрогійт.
92. Клітина-хазяїн за п. 90, яка є клітиною Азрегдін5 ажатотгі, Азрегой5 Титідашв5, Азрегойив5 Тоейдив, Авзрегайи5 |іаропіси5, Азрегодійн5 підшапе, Аврегдййи5 піде", Азрегуйи5 огугає, Спгузовзрогішт ІпсКпомепзе, Ризагішт бБасігаіоіде5, Ризагішт сегеаїїв, Ризапйцт сгооКмеїепвзе, Еизатцт ситогит, Ризапит дгатіпеагпит, Ризайит дгатіпит, Ризагішт Пе(егозрогит, Ризапит педипаї, Ризапйцт охузрогит, Еивзагішт геїйсшціашт, Еивагцт го5зет, Ризагпййт 5затбрисіпит, Еивагтішт загсоспгтоит, Еивапйцт зрогоїгіспіоіде5, ЕРизапйшт зМйрпигешт, Еивайит югиоз5ит, Еизагішт і іспоїйесіоїде5, Еивапйцт мепепайшт, ВіеЖКапаега айдивіа, Сепрогіорзів апеїгіпа, Сепрогіорвзів апеїгіпа, Сегірогіорзіз сагедієа, Сегірогіорзі5 дімезсепв, Сепропорзів раппосіпіа, Сепрогпіорвзів пмціоза, Сепрогіорзіз вз!Ибгита, Сепропорвзіє в5Ирмептізрога, Сорііпив сіпегеицв, Согіоїшє Пігвши5, Нитісоїа іпвоЇїеп5, Нитісоїа Іапидіпова, Мисог тіеНеї, Мусеїїорпійога ІШепторнйа, Мешйгозрога сгтабзза, Мешйгозрога іпіептедіа, РепісШіит ригритодепит, РепісйшШит сапебвсеп5, Репісіййшт в5оїйШт, РепісйШіиит Т7ипісшовит, РНапегоспаєїе спгузозрогішт, РНИевріа гадіате, Рієтоїи5 егупдії, Таіаготусев Памив5, ІНієїаміа Іетевігі5, ГТгатеїе5 мПоза, Тгатеїе5 мегвісоЇог, Пісподептіа Наггіапит, Гісподетгта Копіпдії, Пісподетнта Іопдібгаснпіашт, Гісподегта геезвї або Тісподетпта мігіає.
93. Клітина-хазяїн за п. 91 або п. 92, яка є клітиною Тгісподепта зврр., РепсПШит, Аврегойив5 або Еизатит.
94. Клітина-хазяїн за п. 93, де: (а) Пісподегта з5рр. є ТПісподетта геезві; або (5) Репсійит є РепсіПит ?гпісшовит; або (с) А5регоіПив5 є Азрегдїіи5 огугає або АзрегоіПи5 підшапв; або (а) Ризатіит є Ризагіит мепісіПйоідез5 або Ризагішт охузрогит.
95. Клітина-хазяїн за п. 90 або 92, де цією клітиною є Тгісподепта геезвї або Мусеїїорнійога ІШепторпіїа, де її гетерологічний поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичності з залишками 24-766 послідовності зЗЕО І МО 2.
96. Клітина-хазяїн за п. 89, яка є клітиною бактерії.
97. Клітина-хазяїн за п. 96, де цією бактерією є бігеріотусе5, Тпеппотопозрога, Васійи5 або СеїІмотопав.
98. Спосіб одержання композиції за будь-яким з пп. 1-71 або ферментаційного бульйону за будь-яким з пп. 72-80.
99. Спосіб оцукрювання, який передбачає обробку матеріалу біомаси, що містить геміцелюлозу, композицією за будь-яким з пп. 1-71 або ферментаційним бульйоном за будь-яким з пп. 72-80.
100. Спосіб за п. 99, де цей матеріал біомаси додатково містить целюлозу.
101. Спосіб за п. 99 або 100, де кількість поліпептидів, що мають ксиланазну активність, дорівнює 1-40 г на кг геміцелюлози в матеріалі біомаси.
102. Спосіб за п. 99 або 100, де кількість поліпептидів, що мають ксиланазну активність, дорівнює 0,5-40 г на кг геміцелюлози в матеріалі біомаси.
103. Спосіб за будь-яким з пп. 99-102, де кількість поліпептидів, що мають рВ-ксилозидазну активність, дорівнює 1-50 г на кг геміцелюлози в матеріалі біомаси.
104. Спосіб за будь-яким з пп. 99-102, де кількість поліпептидів, що мають ДВ-ксилозидазну активність, дорівнює 0,5-50 г на кг геміцелюлози в матеріалі біомаси.
105. Спосіб за будь-яким з пп. 99-104, де кількість поліпептидів, що мають І1-а- арабінофуранозидазну активність, дорівнює 0,5-20 г на кг геміцелюлози в матеріалі біомаси.
106. Спосіб за будь-яким з пп. 99-104, де кількість поліпептидів, що мають І1-а- арабінофуранозидазну активність, дорівнює 0,2-20 г на кг геміцелюлози в матеріалі біомаси.
107. Спосіб за будь-яким з пп. 99-106, де кількість поліпептидів, що мають целюлазну активність, дорівнює 1-100 г на кг целюлози в матеріалі біомаси.
108. Спосіб за будь-яким з пп. 99-107, де кількість поліпептидів, що мають ДВ-глюкозидазну активність, дорівнює 50 95 або менше від загальної маси поліпептидів, що мають целюлазну активність.
БЕ МО Нуклестилня послідовність для ГУЗА, ферменту СНУ сімейства л Бихагит увкоспоїдох зкдподпеусайтоптіслоатесазеадсезасаск каско пет ауто азстзаЧасто севсплссаватасостіссзоастосассзавудасстссслаедсвасавстасавсстослатасьссят зКстпсзцсхазвачазосоассоастствуоасизсравосдсогозазалваазиосватскацтяй хшреавзвтакастоссоссоссатавусассвіссдазсассозедчесоаск масо сявсазкисаато Зкасагссвайзаєсозасвоссвацусасваекачсдзяасоваиавсіпвіод ско таздайстоя зчдостсусткоссзаозстсскосскастахцецуссвовтсавкссвсакУусевесеесктакоцато дерпосЕкОосасдавчаєв м іввосасдатаєсоаеввсцкспесавсасспвадласабасукояска аедзссчкплосасодвавк сов сспцасзасосвасосовассототеввнацако стеку Еодсссповавсгосаднеаавівкосистівсвкозвсадссацвнклоссвстатассассаладчеете чпаалисуаскатотадесвассасов ас еастессіосезосастатлехозадасаасе дасте пчачачссттовстосзопассасьстсвеоєсваварсаспеескісазсавсттсевожвас нови сцисва дксісоссадуаовнексосвсдасосаввчаьки м ссаксосусасисесаеванасо озвався зптостосаидтсадасьсогасстчсаочашестамсстовсачузсассооаасвоойсокоуєчакта пслазскоднсосастайтоесснстаочссасодсвачетатстотсатавтсасавчтакчесзадвосвя соасклавозласссвоасазсет кс дачвасувоагачактставскосявлівасаствекассацелайх пістеспвЕссотасавсаааоостеречастоаацеазстовгоопв пах пед соазгасчею вс жсод задцуаєбспсрвсасассатскокосозсудочссааласдсвасзсавсссчсссвакостясачатох саасзоозахивзадттсатоассьсссветсаца стос рлтаазосостутсвсітладлавоас зчсасстесесотаззсьсазззазвазасвоа є касвасавтсочактсевадссваєзанасья сезвоссчеавсазеутсасазеавевкоскссч в остссасазиссоячеькгатасаосвавуаауєх тачисстовсвссазсоводствооуасссоасасгосввасадовсаровсатсатастоацассвсє засзсісточобсоцоссвазчаатьсстаекрасввссестастьсяссетьсієдцасчссотстаспасея зедзчсасадаовкоптсачааосттассцасоачаедесвцскасссттпттсачаалевстстац ксксдпсввцесвсвоЗсЕликвосаяовечаїчарсвачіссассвсасесевсесесаздазевва зазаисваасвасасьс касі овасьасестазсззаділссзосассзсачьсасзчассьясьса сіппвсцлавсзссоокостососдатеассспрсасптавнтиссградтававтасапопачесацасі шт сасзвсксасвісчастсосасапстаставахсаресеосвучачавасиснссвстооасеаєксса ФЕсгрссстатучствиоопооспасевевссявассовачесназоусакаусосавсява иа бізасзтссосавдєсьстстазодаствсазсчсттвагастсодасвотовоцсдекасоссосавоса Ецсеаатокозалавсалецуєсосвекасстссцаскксокстсьстоаисеттассавдаседавоки сизоставсовкхарсссетсвацассствасоалеєтакозіосссквсата ак сс ксаєсца счавоезасятисасвачадсачаєсяквоиівасаєсосзрспссчалаладзавачеоа ую їтапсесізусчастчвоастсвавкзстода зе стасссавцеопавоавсосвачссвеосптвокоца. азаавсчсгЕтосктуасзаасятессслядалсссзатисттоцпна ФІЛА ЗБОЮ МО:2 Бідкова послідовність РУЗА кііпідталаатвіві з даіавазкрувіоскчрізкадісдсзівракгкайнаінавікреєкоди ки ЗААТОАРНІСДИВУКНИМВАСНОСБАСЕРаСНЕАОТОРУВААТОЕРМРІЇНАААУВНОБІНОТОМУУИКА ВАЕТВОСКЕОУЮВЕЙТРНУМРЕУБОУВИСВОЗЕТРОВОАЬНУЗКУАИУ ГУК БИСОКІОВА ХАТКИ АС ПРЕОНОСЕТВНОЕОАКІТРОВІАБЕУХУНРЕОЮСТЕПАНУВІМСАУМАУВаХКАСАНОХСОМТІ СВИНКИ МТКОЦМИТТБВОСАМОВІНОМНКХУКТНАКОАОУДЕЕНОМОззсву річ во Ву ко Ме КМва тв ктітхзвіувст вся касновівгайупекеачтаіаісвзт сот ОСтТЬРІКОКККАОВУВМІСЕИ АВОТБКІООСУВОВАРЕМНВРИТААЕКІСО МАКРО ЕНОНИТТМАУАААККВОХІ БУ ТОЙ БОЗАСБОВОВЕМООКРЕВОБТ ОК ЬВІБОКЕАЛ ОПОРИ ЬКМККІМНО ТОМУ РООЮВОТАХ МОБ ТОВКЕРАЖКОРУТОУКУВКТТВОТОМТОМОСКРТКЯ БРОКТІКИЯТКУЬВУСРССЯ ТК Чак тк» пиЕтеклічі1вссваоуіиаіррідовокатакісва ті Бі квезаркоУрікоіаяуци іх зразткоаізісекизійпівутцепа курва ую ов ріцакіф ік ака тактройокха
Фіг. ІВ
ЗЕСІО МОЗ Нукаватидна послідовність для ВЗА, ферменту: СНАЗ-сіменства з РепісйНигх гилісвіовнт веЕпссевессаскЕшиноиВЕроваєсастучотсваккцасуци осв аауссчисаатите куиздиссвовссагбовасассзсьззеострвассзасзакнтасаксспопооав о асо ссзузасаасассавастассевсбаєвасаєчасацертесвьспзьсовтатсассвча ває зактісоссазосвксасчссагессавечадестяоссявскеасстопсассвасесуааєдочсвазосо сусаенсовтстуссосваслиасскактс аск увостзссповувсвзсвасов са яде таксудтутазсаасчассзаоассасасазупесакассаса ог псоосазастстачвацая звсзасцацаєтсаєсссассвеьвсвксасовізасозісазосатностусассостачава єства у зссідгодтасассаваєссвассвачагаєсавагозсаседсооцдадеостасксвчаєкссясьсає засзустоцаі тота сцансоусва сі сласувссвзассасті тесавозачевсса удава тасвавсасаасоасассаставаксоссьаосвоссо вто стовотатасвоооваєьссяа суденассичсассасточсесасазассвЕсзавдибсвсєвіасссассснпачаацсазесесяс сзаєсасзаозцтасизесдасссстзовасазеовсствоествсссталствоавеоасоссвткосоцає зазвссавастяссазасчассвчкаізбслідазадссакксвнасасвясзсвсасзуаассясьссодасда шевазіасснчюстазиссвоастсаавсічазастоусаасссктасптусчаснасавосодаває чЧасчусатастсстсвчосвсасзечазукетокновуввосозлаахковсо сне озесавих закаЧезаствовеісназцігавадасосацогсссочітсаделоассоастасі пок ова сосок птсстдслакквасуєсдасасєвекосвасасвоскоеЗааззовсвастовтасовсствчазсв сьо, Евексуспосвусасіцесозссздевуасссоазво асо гарвстоа сосок сачгадсисвс су зссозвсадахчсасв осн лу вуссавасавзасасисаєьсавосє вставка спосяче веЧЕВКЕАВЯ
Фіг. ЗА ЗЕ НОЯ Бінкова послідовність РЗА. підкЕвуіірізіієуєукайпріавіусайрарюуупа ступає уу панк звайта писіуістеїіапескапаланарутіренучеуєуартхвоознаісучувавікорувавісскріче ппеїчртетідайадауїуєупраісучкіпцакізузуеркзівівсаоЕчкхкдпадуруствеврих уктпчіууіїаувайссвойікузідесзасурибукучіврецоазктареціїійЕЧповуєєуваоаіро ЗаЧучевУустечікувайукірківнтивоувацідсіврує Ав АВИОВІТТЕуУСЮВКМКУСКІМ МОБуУТКуКОУЛК ОБ воКсАВУАЕАНоссТІДІіНросВТтотТьуатоЕ Тату ТУТСВУ ВСЕ ТОМУ РУкОосВатТазииМКруМога
Фіг. 28
БЕ МО:Б Нуклеотилна послідавність для ЕУЯ3Е, ферменту СНаАЗесімействв з Баевейни уетпсШомея зкувасупасясідпетсоа оса дссансткідасдесзосасспосссосісоастлчасасе зе сзеснасезсстгсспастаєсскаксавссасксазассікесззаталсзакаває есе воє взахазствссаствоссьевобаскессавестссаствсзасосязсадолосососттьсягавовава чзасоссасівасттодвасстсатсоасоврссааскосссзсстча все оссвасодавасоакекее сЕсстозсковпсовсваттвесосоачазасасстазасвксмсесьсазасасадазаоассаакадася позасаскавнесвастосясезвсхстзсоздассточасзкасастотоєсвиспссудааацсов бодсасзасазадвосзаасі особа казсвасбастасосовсзакодсятасідатопатаасЯаєт крассасутвісповсасасацскссоаЗсазачесладоїзксхсвасівесстаччвстівкеволса папсаватстсаоствог кс свачанасастдчає ис созуосевазаст солод саассяевкаває вадасстазосесесстасьвкасосталасувеворсовачі дев овсвсесооВсстувац сет аапсвсспіасцоссоткатахлоссвадоксстсуссазсадатьсавсспоссізсссуаакадвав скедссусасосз зараз оксагалауасьссосвивавсаовостасскоакассвсссверсачасс каксотоссососасоскесачіссекасаовсдясеасовуаоосазссасоачеокососвокекедся зауасесьлагоссядатчозаасеавсттасствавастксстоловссозезасачасавацааєко часалоластоайзосіпессозахостсавсгзокосо осо сзавассзівасссовасяк аашссскесасезссавасаасоцсстчастескссасассустяцевьсзсоззавасасксасгядУєох чазасаспосаєстосассааастсвєзасєдаєсакссасстазавьачезаачатьсанксесесосца завоззецлкоатсодавсочасскесвусексгозадчассзавосасасазарсязтатссассолуви западааачросвсазссассасавазсасаузагоаагарлавсзачозсазосазасавсвасдасо сспчасвавівазачсстасацонаае чес стопа вузассазаліьс оче ода севаськов бассадасосаосяозаассуооувасасса от векасва спас ак овадтасуаавсаєся зчассосзастсвзасьотасзакучссзачсеавсссьсвсасттлссваскочсовосековасіося сецасясласіктзодасссссоатсаллатквцачестексасадпедеа сло
Фіг. ЗА ЗЕ МО Білкова послідовність ЕУЯЗЕ пксучітвна се іссв іл нка спорі зіуакрапічтеідзравсуууквазаєнЕЗруариікак азіівназїідвзірсіпеізуйіррувтуухоціназвіхухкасднуєідсіпнактуєаварецр ук еайлосууй і аа нкуччудедеуктвц задня ка ка учааїеониту Кіпоіуті1пізрадаваснінЕвкарицрувакуївакУєррізадпернаав і кЕрпациулнвхека. увачктртУіарійнавадері сокаапудказвуУрьТруюіщескниствасттсвв ійронено прах пзбіупозісІгсазієкасувахнкізпуспадврезіукійєзвекювкавіваркаозаумннва пекЕслаккистсвеежисосіЗзЧікакайурзатькічікі фі асвраотал і гвуУВийцУукУвКі рогів гізуктахЕлІаесавцеавікеакхва
Фіг. 3В вано: Нукпеотвлиа послідовність для БУЗУА, ферменту СНІЗО-сімейстав з Ки5агин уегісшоїйея вкдеастасопстассстсассаепочарнстлосіссзвассвесавсз ее сосасасавоадцоасяу савссутесзассєстьссааааяссасчцассоздесчаазчессс каз сововетсакатасочсвадеє суападсосспловадодочасвссгосасассачвктсссватавстоасессдлаатссавсковаває суто ссусусссазатстссатсастозакудассасаєстьостіасвазчоааєзостоацесясї тедастсввосубасссапстаствеессасослсаачтвсаспассиветаксутастассьсятої псссхсосоагзичаєлосоасаочаквсаваскссоссястссстлардасаві засада акаласітвскзоз часта сстусвкадалоастсвтвавичесосайци соц «ЕЕ сіла весадоєтсвтсассоатавствЕвчУчзагсзсссстьдусставь ке ластаткАсва сожсоасцассвавасквствсЗутачсстастасктзассосабаполотсзсоз овес сия кЕбацававасясісссосалаастсіксісадтодоссадстасодевсветомсосаєкотовссдеїо акгалазсдусатоастпудетспаксяхадсуєзсайсладасвосссстовкаксвастсстоадсяков чЧастосслпсстосадаасуєазсосоцасаасасьасссссоасхосасосвесевоододснсаакасоцо зчзксседссдасосаносасчксватодУсасостосасассапогвесвазасосадссласс ес дскаспіссоврозасьяовасогсвсавссвтазазчессісчедсадасеваоцтвацездаєстевосї; сеацпайріспассадсазссссастсасадсястассязтассхсцадедочастоястаностазев зазвкдослдссісасласкастасосцассастусачузсазласьсосовесаазоєксо мода сага ааи ст ізссаставцсавоа сова сао вав оссчусаосацовосУєева хчсазаліасласатсаваассазсчЕ кода свусяоуаскосссадаятеасутасотаавоЗее сипнихгасодо сова сЕдоуссдавсцовазачьссасозсатоа вас оздачвадя. «дкатасітатупочослагасуцічадевусссскокасикова
Фіг. ЗА БО МО: Білжева послідевність ГУЗОА, тиуасіскісізіксаузачоасасутізклпоракаіпвуєіуйнрарох а свіра іт кЕп ан худіачірвійнатиаропуічхепзЕзапухстккупла із 1ірпаікавазаоовпе вовк летіноацітва1іканитіецітійсивері й тнакриздеівутувтаткізсксіркиіізадратанье ріївайкипснідьтациксурайувчьоіднизевріаз сірі ст ігадудтрекруйупетуавкеча рапетуууівздієхбкпікуїтапидзчеа з плпимчп іі ідо уурпаситаукууаатасяк ки каеваткжастагкЧаккікігвакутУчакупіківсівтасірктасУкУХсУуЮТОКкаствукидапри аідекктсуванстевивах
Фіг. 4В
ЗЕ МОЗ Нуклеотидна послідовність для ЕкаЗ А, ферменту СТІНА Зас1мейства з- Бувай епосі ое віссострсвсскосссваєтсстсстсопсосаововссесссталосетовсспоопсетостоссадеалаєа ассссатсясосвачалаєстасассдеачассовосассазтодкстасавтоссссаса кора свях сакассосатуасазссвсядекссвсодасттсзасасдлезпасеоделесьевсстедорсачса тає зкастсвиосттюсаусаосасовтукссссатовоевавауассттсацесосуссаасачевчачесь пласптлоассватьптріссвосаааслпаватвсстсаствстя ук есоліссурзасоесаачасоо тоу«васєчсствссочсисесозкограчкассаасавєсствгочассстасасєтчаєесстозчанацесса Еллі совсалсавезасзсссасссаасьастасас сдасастовссосовоапостватсеістассцоє оевассстатастатассасдтснадсесляссавуасавуєтотоставсецічукадсаксвасазвує хЕсасттасвасадетоузацісодсачсстсссозасавссстсацецоссовскасстьссдлаччааоов ссатшсссасвсавосзпасазасствастасакчавстасссапссавеаска тосола псгзслесаасттруатссвасоссассоттассвксзасствсстосиспоссіЗаспхасаачуєа тост зацитссвссавссассссдаоовЕсатсуасісСтузуаасвастедеастосепесвссвсовавачецех сттласаасчтсазсодтакастоствсеу ст чес оссза ва уксо асист рессезачассавчаєсаєстасасаавчсссвасасзастовгватссстувасссвіатугсвадчсвуца пасепаовссассопесіпурскозчозассоатастічачивсосоусаосозваокучсстсзвече ус сжслістасазезатоастясакедачуєсвадудаасодесс си дасазсвссоусосавадасувтов поицсссліспткхпосесазсадстаусвоаоусвазакстацестсовгсстзоусасеяазасесязк аа садігастасстзсасачосаасдастасводваассзасечасткаказовоссосочасеясссезрсаці счсцехалоотассачезасскатссвіллеевксясзасстодогсспавистовесесаасніся зепользоЗсасістацсевя
Фіг. ЗА вка Ю Ма: Білкова послідовність ЕУЯЗА, яюзсері с тазсіісісомваЗпрічудіутсадрауючтупухчу КЕ соваюовзнсасотийчкі свв вупесплотрааікейекайвгахзадичасвукуєутрекпаккустаідчауезіїдруєйаічЕр ітенппеїдйргууійсоаауїукопраїуутківойвізузувівкуві Есадтувтрапачері стево ризуккопіуупіуаапсозедітувурваєцрисукотевакаце не хворуєуітевазУквуваса ідодедуєтзтачевякучвадііреїктитппраціка МЕХУКОЕАВТТАВЕКОТЕТКУЄЮВУТЬМУХ Кронос ІіК Мена АВСВВМВаОпИ ГЕС АТ ОВТ СТА ТОМАТ ОСЕМУЕ пАТОТОІЕЕУЕТОсОоВБЕКЕ МЕНЕ
Фіг. 58 зва 1рмоті Нуквеотидна послідовність для Ем438, ферменту ОМА З-сімейства з Бизаунит уепіспіоідев асослссхстетодастастолоесоссосксвадспатодзавсатостстесеплааассаа часу, Есгссарахасзопаасосвкостессечсавозсаспоассовісстоогаресапазача вуст, спбстуссостсаєсттсдасарссаєстссткссзниксттсссасегасаостсвзадоататевадкс. засісссостсовссазстаку сов сслепазлазесаоіс песо свацессовазасячная плевосзасазчизвассосахчсассявссахросспасвссасавсолаавсапастаспксатстоочвата сеталассттосувсвасьзсксатьдесві ст рсазсвссовссзахтслооттастазалевоасеоора зЧассссастаисттсоаачеслазтсвивксуассссча стат млосасчаєзасозазачуєетатх чЧЕдстасисасочевесасестоссвачачасічасктоплакстотаселостадчлесалацчсповаках сеуладсзасасадоаачізтасаусстоауассосаїявсізгватезсчасодттастаставоге згзаусисссаткІуастьозссзавцастасастаксаствасстесоеалсссповазатвасовуєє сепабслазосствсовЕзасяасссазкссттсассазосасализсасогзараствосапвасга ся тсзозотвдатскЕловссзадатассаазутаатвоч сс сстостастечсвесасвоса гаціасзапіссасссвкадчесотувадетстєвпетсазтсоусвсахазаасааавасавасоусоса зереечсяассастасовочесоовсассьацанасссосісссзазаесдасосталасу с сссстпвада кодасоссісвноцєссвсосасвсаассасаастставазаавстаасавцаєсостпетсасвсетук спассясазазчесссоласазассстоесікевовтсльесьсоззоцосстоссдсатсоцссоссаовеяа асвассчтєассуотастосуєсоссвуласасачаєтавоастаксадзасазесаадоатетадськоові счиаслоестеисавасисасасксічЧексазаватсалодесзсвссдастосзасиосяаотеслатта в пасазасалишевассассясокоссусасосаапоувосяратесовісттоусаттоапо ст кестя сайапссаатосацоввсязпвлаєсквачексоссібосластссполеосасзазададсвсапавк вес Касвесазалзитечсассяачесосозаєлоаскоачесаочасокаа са евсвсаксудачевосс дасцлоасасвесасвассскосвоастЕсаноссасацчайлзсавивссссстасаєсустасзасавсад паазтстсптозатозасосассоадексятскуєсоденуєттосктссаноктакастатссуєзваєуя тазазсвїстапастозатессосвачучачичакоєстастодчасссавручасставацесеоео псасавазосастоаусасако с кЕсСусовааесадасттткаХ
Фіг. вА БЕСЮ МО:12 Білкова аюслійпвеність КУА шІвзніісрііатеваірекскказвуєприїрочвайресічкаців1стсвстівЕраїртуавувья пчкіівБукпсекчірцівчУктазачаднуврсіхупкусуутісву іч Ек спрудеаввя ЗрУкткринійрііяЯнавачктуусаєрвоїбічаїЧіекдаізреїпічпаєачекресрвіуккабуууї пізеуцізесвзісівкахкісуруєзупипріїспкосвеуєдеуЧіноі кос кувчицієстастіва сцувредгвауіЄпусУкчемвкісрУєзтвра і 1 вкрі спро дрЕпаоралУвТЕКоККірріїх плктркауатвівзкуі кірка увхірайвізівчціасісеуЧовЕ КУ ЧТ ЕрЕВЯ деазісУттідіанібічієкірспечевккакіа г тЕтаєзвдоураркутруріснекауів пісак пабвьупідавайта ві йіасававіУводсувоввіічрувсспуютайтсовкодитух сансуУКргоезапетеквеї
Фіг. 68
ЗЕО МОЗ Нукнсотиана послідовність для РаЗ1А, ферменту СН 1-сімейства з Робоврога зпеегіцй зізатсезосисзацссазссртссепозеочголзсзсттодасасавеЕнічеЗстаточатк спот сваціо есудочцасцазсзатвстасттакассасотасдассстароасаслаачтатсаствепотасасстосотовсатку ктдЧсЗсваскосстасастчізуасзкссевавсзоасахтазсаясавскссодасласчастчсаиесаслесчатстатото злосасосускесвЕдайаассали вот ксеостссласосодвсавстоцавссссог сус овсоськсовекайссї ктллзацсктицсевацессстетсосстлучстасептастостссазпуссдесзасссезазазатлсазачаслаця ссзазаасассазадазазаедалсосес тет сасспатссту ск чочкаозаксьсвазатисзовативсвосї тгталскскссасустастьукозпсасавочатассссдлодосаестдстсадеоцвлассассозузачалеево сгагцазузсчссайа чав асааооуляаовсувссазузачочазсстаап с оссстесаввсаво тує пгзасацсласзасассті сс сзовптсцвесосуалтакчечсткосеклатасуасесласатачаачитася сечасаєтаєаєчасуєзчаспсогатпассовістссапатсьсаастедавсацеоессостсссасаєьсазує чазасазчазкозпекчацедсисаскспоссвлассзтттседапстсхаассдльазоссстсхссадссвувават падазесткізгсассастлязсаласссостасуссссоссадрчасвасвкостсдацозразсасохузоатасух сиспзазасадсасоавчлассяєтачосссуплавчсасслоссзласзвазссачеусстоастовссавтаавиотох заоекаччостозксзачтвсакавацта чуда васатозастсадачсссзусасуюзатсссаусссочаво ку астксесесастаасотакссасвс вах ссовдвотеосп ска ескепессвозасадсводстспееовоовитосва чазіспчасодассавссавесазостстсозсоазатстасткостсасточечакчетаачеєссассааасотаатасоу гсечодсдвазсттадтсастосвадесттолаччстсаазс аа кчзчатсоцтаастаудатсчасттассача сою сспчсссчексспачссотасвесавссассостсосссасзактавагазахссссавопаааапсвсстузасаєтая датезойосссцсестгсвсстксозевасвхсасватеоссчечазеастоосац са еваосассстувсовавесо ссдаєсуатессдеказососастсостаавссодарвасотавоасавауавзводізасдсксасооусаастасусу агадсазгтсссзатчуаатеслестеачласзсачатогсятусестсасстссахтчаавосятя утво остах сЕкеттсдеовссастоззадлаидсоуозгаавдаксасеспасчетастсаслерстачесисспсевзслтуоасоосЕ поасхазсдлазсасязсстпауєзсяссасасоястовссозпесскозосаскосастеззссазктостарчЧІсвачноя агискоусссазезеаксвісоуюзаоасшецессивставассосасозусвацессассссувансттсоакота опскассоаазатаясзацаоававсвссодтассткоантаспасссвстасакстодастуавоодакоседатокове поазахскавсассстсавссастовоцеячетосаастсосасоаіцестсвстпоцлсстІачзаєссчевсооаясдас сассопхетсаптзтассаатасссісаволачансвссталосесаксазочссзлваалоадедисаватесасоєтсяв шскдеесдоссссачеассостусвтсадачасоцссстатососьсвадаскупсвеоусзавоозсааоссвуєсаваесях злапевасгаз і «Фіг. 7А
ЕШЮ МОЯ Білкова послідовність Рах1 А щівІкратва вт зрцесуа м лока івуєійейівивЗйадіузеіівигвісдуве тр зплйдизрудаа вікі крізвазрувуупяпр каско кЧкЕЗадапаціятУкичкуєя ЗЕруслеукцйгвузІкваїссе б оккУта кою екатеїурікдарованігууделявазка зЗІвіпіі8і (робочу казівій і ааетує Крок З кт оо еле нка а зві хо кржх заУужетоці ііі улекзлічи ерічичяція Ійдзісразстктіодда нів ті сайаксе жцпамІнкічнокрмкУюхууєїдавоківотрадічнуїкуУс різака їлекури кі а вре давши радвназаппруїсрієємасіакійвівкави і ідезахкНнразуг ака івріричнуовувеай 15, зіекпойкіідасуаруїквійснонзнсяучозаараїстквсзкутєкіайіікакіруйкраакт нізрібутаукзаву і Екааууввкевірувікоцівесачавікчіодрейрузуворі УМ, ектттікаакоЧкЕсіроівузу встала ук ка хек Фіг, 7В Ей мол Нукиеатидна осн хбеність для схаЗА, ферменту СНІЯ3-сімейстав з СІБрегеЦе годе акчтвачессзаціелувактсствоскостоситссікооксаанзскучссассзасавсзасіопескоссовесаокатьну зсзовскалезаслствсозстовеоссоптьвн садово осо тассспінтсясдасвкплатустцатосячавкя врсстзпасччзаассацваозгатлачвозгтасевіпеставсвскаклзатзазчасєстаєчцповссото са ессавкасо асчдосстиатовакачаачатнсссстппднскостосасазаниччасессвсасасецесоасазовзезисаватаска сою азастісстечессазвасежоаввдеввсосксрачайкизчозс січ стсастьвосвеясччсусиосв сус ососовя аззчекчЧовессстозсаєтт свв зцасссозсовкксакочведак а каасаснусскасксдасабзоваєдекаве зепатаассадсстсвзасзвсаоцевасенлвсазозачсасавсязавстзусастччосадцазастдвоассяс чес чат ттсЕслчактЧссазастпалсздлплсакоасасастсссодсхсадавлесісчезасаєзстовексскцатоссовасяестогеа шврезсссстмсрладазесвацасссастстусттсаавоастеслазкксвсапотзсавсавтавсстастасттсасккає тотастоадсалалсссастас ска тетатосозсттоаайдвоссостакцасосківсвостессяаооцеатвактсвавачеє задрЕчакесвачастастовсустаоствксусваавузссвч саван ссесЗатосаавзасатосоуса азчасізосвісЯссалчасвазузствасвачактісокассаганцозазузказцчакстуласвавлвазносяа
Фіг. ВА
БЕ МО:6 Бійкана послідовність Сх шЕВкіісвіі« супів айсоріЇісетукадевани пе ічіуравоїаазгепаріцаЧчузнсоуй чувійкічуавірчайатаівсейгризвкдннаравайнкачкуу зу гракакоіЕгідтатвркрачеї тракенірпкгяійразгУдааакауіансоітоуідкнаакакупавзверопоєваїіврцЧцівхівка кмеіаекриатікіовккукріївваайктєтодрнійкоопкіууі суто сну» уасекоруаруку чззгіієруйскєсвевічкучидяиніїулпавкизокауісакаЕкінуйакакісхЕр Фіг, 88 ЗЕСЛЮ МОНТЕ Нуклеотилна послідовність для ГО43А, ерменту СИНЯ З- сімейства з Ебявлійн охурогити шкдедастедзатекстптсквсачеа став ссокстулосадсагатасястосновацясасия зсзасвісспісростоаісвосцасстосгадесозеалавсостозусесавск ст оузасусвачох пеЗазгорасссврсссподзсввсозаадесаав цьо ссаасдвчсасауавоовасксвасасасеву вззззітассатассктассссасуазвзассентсьзкзоаралачасосост уче сдзсовсадсасопеве кекосвстсоасозсостосекосассаауевасваві г адастсстозоасадетсаталоаасодсвя акапсасс: кеВ ссосассваадааслазаакзазассьспазавсоузазстосеаосьссвасаву серассастсосссавноуосподсаададевачакоссвзасвсзіасазк ав одавссвгоаствоаскася кецагастлагтаассазасстассьсасствасосакакесзазосачесвостссладесьсасадоа тасхадвизассттзасзаос саке авеса сс дссосствасзасяаосзатоасостватсьссю звайсососсаадссавочсавстасасуєвсовецасассавайсассссасалестовксастстооссе ссзасасвоцоваасосевкоаововайучасяесяаЗсзаса кос тсовраосостеоавоиасав Чезсудевачессуоассассссаєакастссасезатзасасосавкосстіостасостаєсттсвах авасатстасоцссстгатассосзесададсаасисесстзассстлутсаговдлевдастастсаєтоава Чеассчсоалосвізацоласачечувоскви ско воазсозсислсоссьстоазоаа сао ісдагсапосолазасладсаасатстдувасзасвацавсдссзапатетечепьсассчксооах Че: ЗА ЗБОЮ МОВ Білкова послідовність БоЯЗА. хаїікеїівна1і1їгвісексаасоа спі воіс сіна йроайутеа кіс урвво с еавху опа анацуви хаувкучнивіукооич айс вод рнакаченарававквзкуу лу тоакакавівкістатавк рзурекачкзнірціувідрасууйкаревуї іначінадчіванайккакравнізйказорпоєпаївр чіаківкавнкісебриічУзівратокрічаецоккквтеорнійккукіууітуз ван тувевк піусвутукчкіїйруійунЕсвавіусукааикі ЕЕ азвевакарікуукаккінуаквакітінхв
Фіг. 98
БЕСНО МО:19 Нуклебтиклна послідовність пля АТ А; ферменту СПНЯЗ-сімейства з Ахресеіия. опіатів зішссатсрссазасукастусіассссасвоштаттсзаїстоасвсоааусстсторосостда ца асгеоляатсссацетчтоассотасосадсчезасавсгсасопттестосотоводесовсекесаскас сЕЕссссостсурестсссрасосваосстзуаєстценцаотуцазасісасаавсватаєтьссвах счасгсацесаставсоссвавсвЕсаецесасопозпузаслогсацісциолатотакостесеастсною десастасизсачассасестокассстассусссозєвсостадосстоскотастааососстаспуєссво себзсеезасссобастасозтчссасптоачацечессопосвоватосоодосзсатпосаксовсесу часатесстстсстассаосастччасауксптаттвсасоссесоссотачовосачаєсаствачсвясася папеспакстзаасасоачачецакапессдуєтоастасстоссоозавсодсасспоавезацеоссооесо соводосссосататстаслачадззасєтатасьастассісзкоас:сясвоааздадтьассвацее «абсассоодвовсоага овес Евавассоозасадціоссілодазссатасеоосасаввссоє тссЕдксЗазслазассасскосодазсасіссвачасвіовацоссві ето ве сспаимацчува счоусазастудсочопссосочопетдадсасссзаїсззадссстосатставовзасівссссатчадесоя чачассотастспосссочссоасісачзадваттасалаголосевесахсозосстосозоаччссява касастдассатткосзосастадакзатсоачессстепспзсчадатездастщаєсзадсвассоца сазвачівузістсасссососазссохацаіасестосусаєстесацьасіозсзакалсставоасацає чЧактстасслістоссссседадссвсссзаатасісттводепоасассотостиксасаасстсався зпеасссполастосаадесспазкаасачцсскасооевепесассспозевсясасссасассута оса чЕвсастотаозсоатоксі т ссЗассосваччтедподасивовоосптовапасоеесвссітасс тсесчесвзссатсвсзвозаєсотвуватсєсствососавастассоаодаосвофссткаксовкссоаь сссосзбздвадассссодезастасаваяцеостосстосадаасосасолсосотостоосааццазд печсоввсадзассвзіссозост каса сссадсссосзавзезуасвосоласакссепосодехососсу пепспловсостосасааауссаявавсвесадесевсевастсотдаєстеовостследпатасупсас: пчсріассчстоусивочоса ча ссведутавасузцоьчсвосуаєсоравуссювосакаках сацпсасасслачетассазсдасададесасаєсавсда вес адесова си сссдадстаседа
Фіг. 108 ЗЕ НО:20 Білкова послідовність ЛІЯ ЗА, каву віліцзуварієронпаарвовутасайкЕтсявакЕїіадроїріуавкаїчникіавлійв греціріїісрбопазіуарікуваеабу і їузуідечекаі кт зваруддааинзорієбатноїйр діла куутєсвзейснікчуаіксозісвтйуїчУвукацеУнрариіуктоадууу вк аєсо ке Зінаймтатгвуттсдркеруріпоїізакосавуєчетовайі бойуповинаузівксвуранкпуриди евоівраамакденро пра дтачосрренкерезезонткарокчажкеревківантчуєтуркє агсхввкоанрикікієваибупісасайт каса іони кос уєта ав кодаеваци У І. зачпізідітіідетвезізівітіхтєокапуворіреаєуртурксясвцеіківідау а свучеваар атхбрачтчлівкапотрчечоухЕ азс уаезповадвтрауівкУкуЧКаатіЗ угору
Фіг. ЮВ
ВЕС МО.
Нухлеотидна послідовність для РІ А, ферменту ЗНЗ -сімейства з Еухапита уегісщцеоїдев асчоазтзазаазсссзссаксоаксттчетсстакезсаскат касок судзпакостатсассапиаасу а госваладуча саусаасзазасєтатьсову се авцдвссчатуєтесяувассетклксстасассасатаслазачи оса аадеснахисааоуасяхвазводсчасза овоч кс ахчоваосесєтсоалаєюассьвуссвачусачиаті я пспасссадсалассіссатоазатзодастссло стат аслчсвачсстацеосттлачалестоаславсоттстаслаєсског агдпстадексксковаснесзссзазцазсовасадсочаазсассазсттсоцеваасузаусізвевчосоасяасзацьсяв зЗсстосавжацег ас споастевкотасоссаоззочасіпкеслазаадакрозаса кісті спаксадласівасесвая заптсжсасавсяцсвапацЕсвасисстстоцеваасвсуачаясвтакксватасзазівсцавевацессссяааааооея Ццтассваловссвякласнскстзассяссастстссвосвсаває киева ассгтсзаасі ва сосцзасовютдеан ої схвассацаааоЗ волосу валаооЗаєсотеудасьвояасвкваксазессихсссссєяаськасвасватсодесса зкадосілачяакстасстозбтзанассвісостовастачазаудевачсссссвсалассввстстаєсстекасдледаєув вестазвайстіацавакккобуси пет сс суєкаосзасонуюзвув каси стевктаск от всявагооватийа зсдумазоазакстсязусассуєсакнекаучссовасчеассоавсосасовасаадела казати чосестактавувасьї зазетачсастісуасхвузаскхсачоспавьвауєчвактсса поведе сплзкесваваєкставксагнсясяесачек сидсожакнайсоуссагтавсксусавасозачуасассдсваассаст сво ссаквсвусаасаловсссксдасох ясЕдазастсстзаєдіатутсосавакасвасавава науку овес спо сватеоввацесотодасозесавсї зедксзазаскудавасзввовсватопаєвссоозвастацянасатасвусцостассзаьссадесагастасоасастахя асачстзаєсаБссосасатасозссатовакссттуасзцадакасс т оудвоспчстссостосадасуасассвеосаяов ссекасвсеталічячесч сус сокансьозавивссосцнуєсвовочссозосясукз ел тайсесвсвлаочисатзаааасту псостссеураваєаєисттїввикоЗквесавссаевкссавазаалацаскоєдастууссавссаватанипокячевзиос часзассвазуаассиссвусссссвсвваклсстое ува касок ссчв сова тсставн уч чвасазавоа зЕЕсассвлялаєзаєсоассапсувсотасссавкскасввокоесараєі товста свасяявпаєтайессксзата свв ЕтссаавУ кс аваккевосааткза сао мскесвасасьваво их ово квасьсвечоурвсвасВ, ЕсспасаауєвуЗс вста коалодтвсаев вав сстссссасвсавяссса вовка оаоеславсктоодаацетско ЕсцасазасяааассясосаваайкохтвсссасовсттоазатачсЯдповократуєстаксвкастдвасастодаєсвайсуя сгабсвсасоатоаасатиєбсваадесостуктдидесносвосо ся веде осогассаосдпіпле коро сводатасваса тазкчачедокавткьовссаесттебсясссоводарссовасосассувастасестозуасоставакугдаавасьстьо асосадістаксастдсавясЗсксатосаусактиваасссвубсьсосуадоставауц са станестсляазетазогах що Фіг ПА
БОЮ нО:22 Білкова послідовність ЕЗ1А перекн най зима нава сілевазуєпк краде ев ово увеізевоа ау схур апічлучвстнкчаміакапіспрізромовнівивказапцвідтвцеацинсікУ кроку тУчаус чати ісцчеулзвактевсквейкочукуч Ук Кказапоапі ЕС ахКоз квітів ІгррхІуппкрисітіспттентявівцкЕістодсаазезУдаруюукипесучо хогувтурзаясувеан пдічіеуноввсчнезво1іачаануїзпауінвеічруї ік ттагівогойсоручавк ані ду рЕрехілумеуспеспсусоівекуіївусинавууйаїсакуриті тезі с епрурзавацяйУнчу Оу ЇУБаівукйсперорлієтосеіасурпирапатаисерірігрннідвуаваскзіідеекпавкіїдає: уавтттпіплаУзртізакйайвзквзкагнньчікіївенкікчизрієснацоаіув учи вки «Чеапіїкааеупасейчтрутудтацспаквапісіівзайрпаєпуродрвучккеіїцяуєвпайцайья ірвівчаікио
Фіг. ТІВ ЗЕ0ІЮ НО: Нуклевтиннаи послідовність яля Айохуйх, ферменту СНІ І-сімейства. з Аврегей в Віянуаці затвор хтссеостаеювустчето сс осЕссяссисвазадссобочстєвосодкопаасосЯ завссзсстспсссвасзузсспскавЕсведачі г сусло овостсасвесавасьсстассов сгдазасазсзчестастасьастссттстачастааеоасоасоссчаосзезасстасассаатуцечее чабаутістсасіссоусгасьодазчоазастсоззчосвастесаісуахсиванооавсьссаассссостада чесати есзаєтесцдчасокасачасстаслдекоасасвачсачавссаєсався зецдтапиасассттсаассосазасодсвакодесаессколсепосівсолородассзсезасоссствах тдаудхвссасчетсессваксдтаєдусасакасавессоствеавечинсзахасетсяддсасасвоє «езсасссводеслосасііасвасяссвасзсцвссовесапстасалосстпостюсясесваатутассв заасстсозсосазсасіпосссакусясасостосзайсявзссуезорастисассакодссавося сіповааслостілзпассазассопосаксаассгаподавстстатааттатссачастосостассявочає гассазассовасосахсгоассЕссяксяскакссасву Фіг, ІА ЗЕ МО: Білкова послідовність АЛІЖУпЙ шхВЕЗІ і асоввідвіавруєраскеЕпетазнатлетаакраксонапутуу вена Уєукаца сазувупитпоцикУцаконпруасвіпуодайпрадпоуїаунисспріїісуутчевудьупрооя кЕхаєчокааатупіусаухупарвісцексЕ каучук саКкк ацетон ідно ЧЕПпуУЧ ітакедудезавазієту
Фіг. 28
Зою МО;25 Нуклеотнана поснідовність для ати Хупо, ферменту СН Т-сімейства 1 АзрегніНих Кидівація хЕцасососатетебессодсесадетткацастспосаста оо цечсасатястсстесуачвсася ваописнупосавпоумнтссачасзаєстедассачесазасаоцсвсазатаасчостаскаска кхОосспоготдассавсосотяаселдатсачтесавсатасгазрстаствосовататачкчеаася счолесазстатавсцеуосетаоссасссортоааваласгодвассоснозлат дассзасасцсва пчпсссазузастатазавсзосасзсазацазачезсеваасосуствссавеласасьаосетесоу сазсттсватсстсссопзавсосіпасстчеосстечтерядастоастассайссссствоксдаасає хжсасесгосувохастассоасачеЕсзсвассетасстспачсасуасссасізаасастуєсасовося акзаласссасстасчасаєстаєзводсассвасвазссластвосттгпвод са спасахтацесаєссья сазбсзатассозіссабсоссосвавасазчечавоссапедасвсядпсассасслозааєсяасігозац. честасассасссптачлаєтаасстоукасссявааставовааисооьессассзачоасесуаца Чсвсссслктасстозаосаксвовоакстсасстачечасхопестіистостдлаавасоазкоадсвастооке застаствсзусаодевзпевсососеворучестастгсозсадтосавотоккотстсаса чує Евтатстотатестодестобсавадецорстчсвккувочочссасі зо сова судову юсьЯЧя сетассеассссксткстузсвокепссазчсбодваттсстатьастоссачедсостоззрасоске кЕдсСасУцтсякЗгосВацілА Фіг, ІЗА За МО Білкова сослідовність А ЛІХ у НІЕБІЗВОСЕЦЬААТАСАУАБРОПЕОУКЬАЕКИТІ ТВОГО ТМНСУУУВЕНІ МСА ОХ МСА БУТ МАМОНЗСОК СОКОМ РОЗОНОХТТВОВЕНРВОМАУСЕУХОВ ТІМ УЮУ ТЕН СВУМРОССМІВКОЇ МТКОСЕТУОІУЕНОСУМОРБІУСТАТЕНОХИОІКОМЕКОВОТУТТАМННЕКАНАСТСНИБСТННКОТУВТЕ сжизоатиТІТуУ подо ооосов і соло кТоснечсварноюевотеанавеи сови ЧУБОСЬ
Фіг. ІЗВ
5ЕЄНО МО:27 Нуклестиляа послідовність для ГУА33, ферменту СИ сімейства з Кохан сепісіноїщех ажосасетивачеівесотатсовтсвссаккавсостассткесассоасовзаттсссслсусвазасасьа абзасассосчессескдаєсассчассістадесьзесууасссптсоадесас ки водаводсавасиь спіозчеккасссасстрасчашаьсдавоссваєасспесвассосассосвначеастсвовасассава авпачаєтассвсасстассосаїдаацаєсаєстьзгоуаввацвісссЗ асо содесовсцу кзсозоточассакатсссавсоуссавосвосвзакчесусесстувсисвастрасавчавсауена зкзісовестссастксстссассавадаказазаговаавссосадаатка тата ссорстссавйсва сосрпечосвссогсованасссясаачачесоудагссссячасуєвсчаатодаєсстостацссяоу ксзувсасвазсовзсчасалатасстсавсіцоуниоаксюессовссвоосссвасоссіоосачай їсасзазасссстзасочносесаастестпочасаваасозохсспвасопозосазтососталекось сааассзссвассідачсвавсисасуосзсвацаєсассчадасазсссасоанвстезсавсстуцєне ссзадасазчсавдсспокосвадсвунууасазтасоасчасчаствкоссадасчоссстозугісясза зсдедосаадекеслопасссевні асо счасасвасалісрсосоеосасесаассксосвац засакссасзохосстасасотассаацдєскацавсстсохсссувсісатпозтусальасасаєтува тами лазізсаачочасвогозсацісосЕссвгсслозі додає ксоотвалчча вас с ЧасасадчЕсазодсоасоазоасіавесуасавизасозсаясастстосе каско ссваадЧасе
Фіг. ІЗА 5ЕО ПО МО: 28 Бізкова послідовність ЕУЯУ веб єіваа іі вапесаяс ві ррізсбІкзайравнеескічеуювнйссаптуУвос вату хаувсузвкиіукОорт а атаіауаотразкадинараваукаокуу уракакаеїхідтачвик ресоекадкенірусузійрагутаєповауїіндчіназцідавойвкегпезиіуаказвпосваїяр сіакізкопвкісегруа1іуі1івреабакрічведйокту с теприувкоокіууїітуз осві стуаєзк пітчвуєучакіїйруйнісвовітеукуденігаЗавсязкауїігЧкагкікуйЙквакі кірка
Фів. 148
ВЕСНОЮ МО: Нуклеотидна послідовність лля РІЗЗА; ферменту СНАЗ-сімейства з-Репісі йти Випістіювит зказасомиассвессососукасусескевасистеоссісок оса саегсаасосц их роде тетсавсадессаєттсоводатсссовосстозтадазасасссвосодасастабосавсесатає пассдозкасоозачісавкосисзачекуссвовеслеоввастттза атома скикосЕвБосоде зсвсасасовтссоопавссаивессассакоуоєськодлсспсзсвавтокодоооосадата се Кезесаздаухастостсасолаатаасаосі сі аззаасазсксазоссаз ан таєсксзсваваєтакав. таздоссавсоваескАс касок астексолсасізсотцооватсанссовчсвавасастуєсься ЧепосасзасьшодассссовссодаазчовсськвозссссудссзатазслоУскасосссліссвскада ссачозасавостассуатоссввсачасставідасаседпасвосасоатас золі сасасасязаатх чЧагафазасацтссазассястагчазассасасавсотасссссвисакасьтсявсвзавк часах подсдаспапрсссавсесзасадсссаавсовасесагслассцаєооспаростевасопвасотведасста частсстацтії оз ссссюотавсозелістастасстсаоте ворот ксовассастасансастлає састівозасвстссаєвсосстасчосвозесеактассодеопсстосвоссадасаакстевуєсттату чаплі отаЗссастоуаастоаочасьазсавкзасудезсассспвасзассссзотоспеоесоаї ек сісозсссагоссвессладасупвоастссасзсказосісватосасавовтассссодосачасосясе тхагісдесеоисвалтаскуацассаусзаєувзастзсасвоа свою а
Фіг. І5А ЕС Ю МОГО Білкова послідовність РЕЗН шекхізруазусазідозізергічівйзаєрараіізквацууацЕспочпадтавзраєпьнкіїва хазірарерзичавзраічарітіткадусучтугвазаазівокаистдаатаєвроарукруйвачтаср ібдоадвідапстійазсіуєтукійспв1 й спрірітічстеайстручвріціійкаавідові ісвреії1івпоіууівЕвзпуустпууйсаузуаанійсрийкаварузріз кавові аруда дЕвтазЕктісвавіпузйзсдокаїївавіксавачутій
Фіг. 158
ЗЕЯН МО: Нуклеотнина нослідевністводля 51 А. ферменту СН 1 сімейства з Бизайьни хепіспйоїйех завісу ксаптссваксотаоевчстасоосттевосуввсот асан совоєсяасавсяазчесзасаз свачастчаазсустаствуслумсассазс ад естєтсеосчасеголкатсвасасяссаскзецаєяв. піспоасссаосікосвустаазасксаасваєесстозссехоусосавстасосесавессеакссясваводь пептуссвуатастассвачазасассоскккостствестодссацасссатосяівсдасусвавостсьсопг ода сетррвесоавсаситосесесесаасолссісосодскссакевассьсагосссовоаааудасаазассавота да штпезсесиссссвастакассчазтвасозасотовавазосязаадтасаєсоусвостьскузаствачазе зстрасваддассассттасвуєекстсусчдатстазстсовсствоовсато і одсячеяссвазоєсвауюо паазпссласавсавасачеьзчаевацсаспачтасплоевтасосотавсазавакессствасзуцєвеєяася пЕстсасквзсбасевночаєсеслачсдчасьвасязгсзазасьтозаестовосвеасассзасааюткясатоде пепазвсолацетстесозескосайсоковекадсевухтсосісстсвосствсаавоацссосязазасоцисвтодеу село цсосацосісссоазасукекевассстозавояссквсосвесссасч в сс уаасацкнуєтовоє кчкацазавлоаапесоосттостикиссосзугозкавсасцссодазоссивсяссадсвавзчастуччклвастаца зшесвуалосьодсасссстсссаасочі совок оссуавсяа с авокУазсьаосадсадавсевсаувеоа аптстсслваорасстесвакозаскоаччасяаввассотизазссаскаЗпостатаваассосачіча сту слеаросьвасясасіссацитоксочстевасьиесососсповсоасссссзкоасеосталадатсаво тепасосссобсаєсовсзасасосксзасовдагосдаахссвессдзачассссдтсастссвавчілодозавовач ссстлгалцстодоссоассссвацссввісачаєтсовеставо с тлазеросясповсцауаскауевоуєтєсьв Епдсассадстдовзастсттасавазаячкасозстссссанвзетостосадоствісвадавадсіслеросотвте гсаслпупсвесспотстсуєчиссюсастаєсосассазсавуавочасесссоєгтевасвстсескасвостзуа лес унетассасссскасодсзаассвчакчєьсттчекувочсачсссаавссссевпаєвасвандачсавза хсасвісетсдовсадахоусттстасссастосгесоосозавстозстодаскадсвасськакоссьвасосся зоатзсзсссоссотатачозвавоснхастосстоазлакивслачсасаасосодасоаса сопе оцнаєсє басгосесстахсстсяауаасодоаасоцктлосазсаосстассаспасексстзатуьсассоесуасковоєтає черево юескссавсачеваЧевсугссуасезсвсттсосадопсоасосозеласесвхасвсеостеасвоасоо сесвостодадоссскосассасуєтсдокачсвадаассаосасаазаваастссватогосавччлевасякас йаасассвосавсопкасстчасцкисссптакстетуссос оз ачотаксвачсостуєдевивадестазисває срок азссааозадуацаацуатссс есе ссаато сор сісзадсасвасавс асо акасрвада запаси тстовасоєсечасзсааадчадецекесвавегосавасттостаалстзавсасодспасвоюхчацнох згсзадаацесавазссєсавестазсьау фіг. ІА
ЗО МОЗ Білкона-послідовність ГУЗІ А: пекевехіазадсічачооупікУ еко зпа:запауУ і веаійпаоЗотіузвізпкагаувккури візцкхріпахіІвіптхйсрвьвзаірултпекракцкакеідбІіпедчуєстоуккцкуєавЕнУктаті чвесавісвпісОйУбозУкеаканкістиченесУтсрдкпариалиаеватїсУокавосла жі Бі ЕрросуксакквоікУйівзедіваійсзі БЕ Ерово т вай пкенкаи ках ісрукиходбеоУчп ус зібіізуїодмазітиівіії"оичуатізійдзУусрказіавіїілезетіпресвенокктавідно КрЕхізусаозпейніаоурконпзукеутіртЕіваї кКкайрае1ісуУївзаавійруцкквавіірарт іддуврукеротітезЕві апа кун ідотазспрподбоєвазвруричізуудеатаіссувипа агіростуаріклевхичнаїснічЕавізантсквЕанутиві Кадірвенс1іресааєдріуутаск пеакчеїіїчнкоавувсккавливівЕкоУкриваве к11іспкекоргаєварнкввУЕкКО и адзоксаєаєкіропївуауїекКкУкруза
Фіг. ІВ БЕ МО:33: Нуклеотидна поспідовність для СІВ; ферменту СН 1-сімейства з Спиеотие кісрозши акдасптпостксопекссадоєсскстсопеастоповеЕсасязоасстосадсочсва часов сапісспспзастттпоссясавзевчаєвсовсьселеовсясціатозсзссарувессаочувсатоваксв педесссзасозасоулоассчкава т сестаєссецевоссстовсавчо пог изсатотзаствава боесисвасктасоарсстатлоглактсосазссзаосопесактактацетоссьспводсскачасосчсояе плани свсьсесавудсоулаассисьдевсоеясьвсссавтососотостов сто кихваццке «осастосаавсосевазсоовУссвзаяузаспостовтассоловавспоасатссзіватаєсссаєя сецтасезсласацос коса сапзоасассрвсзасосвовог касове стссча спасає свсСсавасозвоавсестячпсасозссавазнссвалессвазі осьове очацетану тБсцясттєстпетойвссааовососЯдсдазстисвасласвноссостоастодадісстоасивсвдес всосачасолачспосачетсаасстсагосзосттсткссспесзасзтасвасаасноачессвасодеях цессссвсасстсзіаавчаачсводсадасстсавлоссачеекссоводцактпсалавиасавсває зтдтвацтасотосдасовазостачсячазекоассічадчадасвосва мч сязовазовасачечацчя певастасастіцсавсгастчзавсгтаасаласасаскодзоссаствасодасидвнсссудесусуа сачетсусмаспіассссазсасуасачеатсситссулссяатасатсстаслодоцеспатиасосо піна чтсовасостоатаск оса чесуессосацаостдсесстчзаснтивесинх осот чада девсеуоьесуб да соаввасоасьзевстачсксува с ссьсв дасться паследсосссотавчстсусевасоссеззссЯбудласатоват осо созав едоювасовщща засстослаачсассстстастосктвслазапстасевасідазсясссссбастастосатсазоадедча зевзсспсцеовістссакоссЕссутестасосасчачтксцкакасаноазачісаплосночасснися сеззсасвисоссвсицасласіссачсссвомссчапо ми тезасаасосацсссчасуссасосо «гово сакоссвовассвоасчаасудсовпесосасстсспосьваслосрляхссодаестчасацабе соесовзоцеасподасовіосасавсзасасопусвлостсдаотасатстасьпсвасуусссвасай свапссдессаастчоатспсоссосзіслесдадассочрстісатсстовазастовазасавсзосчає постовссусесассясстсізесзссчатсссосауавсстотаасваекиоспесозаста ал васах ссисасагассцубасссссаассссавссерсповевастивсстовастовопевстсадасавасови аастапстзосквасососсасасазасяаавовуєссввоставестссттсастпосаассосяусосас вссаспссосвмесусдівссспассабсеацеепебеаеслаедивооловисвуиасяокссосо фсазиздсдсевавсасстисдсесовосьвог уза ла ссаасенечасасосввсаосдосеое вових пессладосадсстсгсасаасадсвечоуаоцесадасвосцатслчпатосвах учас ча апзЕппастсатадцілуєчовадк аа сссоопзуазстдечаєзтовастуєтаастос вав ча ау часесовадисчеовдадетеначазаудедассасцюдевотодвосставозасоточеючаця уесосісоасасасвесасоославоавсветозота ово освсвогсвсвасостоввудссего задане сссе сад сатскуссачастьассуз досто очах ща
Фіг. 17А
ЗЕцІВ из Білкова послідовність Себ1 В тавізісвівіїзійсававуєівУувазЧапасарупузіте ей ів соіувнві і Ейкаїпизвіса чЕвууансівткварівів1рувУКУсЗІКокка з кпазуєстоудкиікувавєувучатаЧкгЕ кт тУзаіссетіатткіквтвУєнаксеикІезірвекзазизпиз уст Еровц вів і зе кХ ридтикеїюекладікраєіх грудпвівупуєтвуконвав ріс крумізснвуанеодідтовув Беузедічувуутахавсічіпсаууревеілпуєчейдіпеі1ої1пойувсросахсзкісуЮКрип Ку еудпезпічосісвукзувіКЕр ваїкакурійінієвврекчуксвТ ВИ кУустювучУВН ВІ ТОВ чадорорііідвуасічпокак1івдкандаркакиспнісеувевтві ідваакпаактна серій зуднараїїветапраассраувуріічіїавнкісцсіруягаазЕдурзумувахуаавовуїй1каату патодааурусудевацацачачоочавачазкакцкакоцечцецУккаайатісті каредрнанн репкдаУксЕсссікацкацутайвіраївуауїмсецек
Фіг. 178 ЗО МОЗ Нуклеотияна послідовність лля БоЯ3С, ферменту ОНАЗ-сімейства з Бичалити уетістсісв вгдспососстатсапеессаоссаксксскспеопсстесставсостсзавоавасстповкосссга споссавозазсзочакасесстксстосссосттосзоазсосассссвасассосозсуєстаєсва чЧасасзстасахстосостассвссдасаусксоалазсевасовссссавоцесстстастоазкоацага тосзазадчасскозсассаечазсвазовусоасааусса т вестоассотозакоцеасоваросайох кісопедачетасазухзасасотауасвсекасвсксзстастсосязаачевадтаствасстекасов тасіосоззіваксостосокоачечкгодосаразуловаєсозкчесзгосодстоаєсасостова чачесзадаавоцсвсасцаєсацесзавчаєсвадудеасвгстадесацоазнгтатевасавссваЯя сивисзасссосечостсуаадатсосозаассссаазсськіассоасидоуєзазасуведіссс сагтатсозаавосссввсоасодсксуцьстсгспсазвазевоцстоусвсзалахсзозаасвесва засртссуссатодтські с согсавстатсусовтазансасассасовословіоьокассореодася спирюетсзазазасрізксзсасчучсасостасадсяаакздососасттазосттваозсавтаєсовая Басіогестадазалодасоаасесвзазчоастаєіссьзстастсасясавсьссвгсявсаасаекосе дзаапочаксозаспосвивесссасатсат осяде ссатасссгосовгоосаацчочсвеватадодаци стасзаскзавазддсчсссассуасавочасасадаскорсусзавааогасцесоветікосадаф сакедзеосталосескокаає
Фіг. ІВА ЗЕСНЮ НО: Білкова послідовність РСЗС шкіру келавіві5КкЕаарудрдієтварпнівізаккУуу Ера седнаопу учи вкаіувискаакріїс1іпохпапуриатовачтарагаагказкуусупапраузідіквідватайпре дрикачакрі кос айевіувпувійраагейрекукнуїукупочтрітаєвіпійвуві каочрківоїч пікхезіїупухатупіствічйссвепуктдуасадпріоряєукоізіекаевкузїі«совазііпір Чедекуівуветвіраупоупкеєкійкурівкака ІгакУсртідя мархурі Фіг, яв
ЗЕСІЮ МО:37 Нуклеотидна послідовність пля РУ30А, ферменту СИНЯ 0 сімейства з Рихатн елітне віессосттисусссттсасосесескавсстусасссексвавоссвпесеочевстсовосоагасавосо ва сецессзсвосазссзазаастссадсссатедатачосекдстпостсвпаапоотвопсесасцесяя всвастссадавссссучесстодассзсазавадачудсесотатсттекосусавсастасвасозсо пепаочсхтасосптсатссдазасвачассопуссчозасвчсстосвасзсссзтоассачсассиасвсс атаасссабасавасадосьсккассаМсьсдасздетаєсчартласолісадовасезестазсзавсв. ЧЧсезсчадстасізтадасзстаєстясуєсса ат устав ссууєзсасаєсазавсяаос саззасакасассопісістасозбасасскдататзесувустсссстсовсаєсотачасаксовкася Есуаласрасзадствазсвостстосвасьасаядсапостлтавас соціо деасятучасссок сзазозопстовсопескоучастковкаскстсогасспсоставсасцстосачасчксассостьсскоїа сасапсаесстоасадсссазчсасстерісоазгаксавсасчасососсиєласзвсавттосвудааці сасапатосастатасснесзазстозствассеоусвсвазівестаьсьсвсатсасаєсоса очястастосзасацесосавссзасстаспавовстасалтоссавоссторзасчессчадочалохосє всбпассадзвовсвкчссзовсоукУчасассваслосауєсстаносавоеогасапочасачсса зенптсссасавозозесоксазедсочасосстоацисттакатевосспочавачолЕзасассавсах савитаасстовасстьвссссвссововсодасузсастевавирассаєвсссесаскскеуууєє вжрсогсастлессоспосатассодсостацечедевтааасспісзасстсачасУссавосялачата сдвихаст осно сссозсаасєттаточеачесавовсеооіодесаасьсотавоаснуєте ксятастятоутассстучокохстсоздавсеадеткстсавсвцессацосстиоассипсозасуєєцат Ччоздсвсасозссоакассзауатовскстзгостасоазесчеуссвадатсясаскссоозїдсастуу ксчесаскзставсетссасаасядсавазацстессааасслуєстсавттцовкстовастеавсовує сессловссзасьачучссаазсасассттсчастовссалаацистт ост сядсласастотодассуєє заздпсссаасстссасусадаввасстстоугацктаачтсзоссвацесоцуловаасявостяєвогос сезуалевессазпацатопосоааозус состава зацускассааоавоаассаскаслалч дах стсссассваєстосасяаасусссаезасастасьсзісоссдатчослосакодзацесасстссоваде сасртосассаассая
Фіг. ІА БЕ МО:38 Білкова послідовність ГРУЗОА шіхвічіссівксавівідбовУЄтаевскічі Ех ваусьзкаєцеїсрорчкезі апа апініїкпуіседавввісвспеапраксвутп апа азапзиткісдсрахасвеайяхвхуустх вечміптукдатірсввучтінезааайвстівсведзайзіріїгваічекоїочікВОСсОоВпЕо Каса утакіаеісувкутвісипеувварплютатт різне лакріадатасамупловнпестєсатківа чічсваі5ауїунестенлпказізво і ассЧЕКІтів і ІнаізпкахкіхрЧаплівсвсУЧОКіхну яеІевУудавУУтУ і спвцтавссУсчинаевЕвсадаг саван кУу вакуум Кістаквакрузлувацзар різу снеків стістаклренедесвутезаказкуртроуая КукекларекотАкісеккаповвВкалаакакусуповУкувстЙ
Фіг. 198
ЕВ МО:39 Нуклеотидна послідовність для ЕМЯЗЕ, ферменту СНАЗ-сімейства З Ррваннтт уепісійоідев вечкдазазвсьссісотсаасоссека косо езиасосковосочосчецадсчопоаськаєсока. пассотшевссезтсовосспосдасастоЯвуєксвсоасссовосостооссавзчносвсссачезаваса ва сЕжаскуВстпави спос саветовусьсвацаскковосьзаесовасуссскоадазудасуєа ечЧечссуєсскососавозакоасасссразастасасеусасассавоотозасаодаасосогвосос ката сс помасовезаосцассазкастас стік астастососс стос озотозаодвасико «иа сьсеопсассвцпввдвосазруєтьссздевоцкопасовасоваоасзсовкоурсову кгссайсялвсвасагодастасавкассаткаасаснавитссоссвотедасьседвсодаазавачецоє кейси ерусосгео чор сарснаястсавсскастсроавсоссозазассзасаврвуєатсуя сісвацчспівстссстодеснаасчепавуєсгтссціеовзсасчсссптодацоспецктевксасс павососозавесвосповссвсоссточа чес вссцаосвадтсглаосавдастерастачсвочйко агбчссвізчисзавезуксосвасваасавкассоцрсситаєчтевсвачзстцсаласавчаєаєнє Спр дсаозвасудачетванмовоказссасачестесіврасоцвоспосовся Кайкасіявівсасї чківасчатосзй са стопонестасавгтассзсявкчасапозпозозчсаскасталосавсевУє васссзавсакцасзасоасточесвакозсока ва не;
Фіг. 20А. ВЕС МОхО Білкова послідовність ЕКАЗЕ шникіїчваізуавізсулааувнворУсоавкипЗреоУкорвзат 1арсосвУвікавахтанква зауїрозареиучУвкаоквімароївуппзсчуу і уувазвісаківаісіасекоудеовкпадекте вапилаувзійсзпівуадечакинівкусЕзеціввічІЯркс КЕ ввтувіаКкІдавевовиваввіє КЕкзазіууічсекакссосаазіутУуютухвазієсрутахачкоютачесіезтавви в уроплачй даЗаа»ічупууйпасивіідівіїхобадчруйу х ту
Фіг. 208
ЗЕ МОЯ МНуклеотидна послідовність я Жупі, СНІВ ксиланази з. Гловойстна сеї зідзаздсвазвосзесвитг р озкасескапесвесостуцісосеассвосвопсисодавастассисо течассосавсетрассастсксопусчссавсстесвссцеадеодаяасалссовоссссооапсвовоссаа врстсавашовтечасозасьсятевадчадаззадасаацевотастіт в овавчсснсо со тесту ссаасоооваазсаасчсачесассвтесазпоазаесосацокадотавцессовазасатев счазухчусачисоастодаовзсавссзадуєсвуєставасточацвчасносавсатн сяє аск тдссовасазазстосааатсавезсусєтоссасастстЗвельднсастоссвасквсссосевоанеа агсзатановгасвасолусаєасиссочсдасаадівиссзсвоссасо сс аста гео асекачцосааовісесічсесаЗабзасегстцвасассвсвоваосо Кок нупоєцесеКосго свсесстланссусеваначєзевасссвасасавсавесуасвичав ас аозакчасевскастаяво тест оздасааосзасаавг у цувсавіаватстесявсзаадаввавсаек аву Гсазсобтотосавасьссссочсчачаа сс вессоа с твсе те чскастобасв кою спиетчоессц тт асировасоазсвасавестсуассзодссаастахдасвада са воиьува пЕссуасвсссссааесоваксьсусазучичс с есса сте оцпілач спа совет ва шптрссскоаттацаи стен ссацазссавчЧесчаазссарісапстоастцаса слава е гасачусазуссвасиссассуснасаевчсввочссг касета ссадсате сода «сжфртасподіснсовачсислоассаствсосачсточасасссвизлцолсвсспаслвоссавсясвсте вапссзссопвссасвсстозссасевосзатвсцвсучсатовсецисооовссаздасзаяє «азгтасккопсекасссасостказксавссомааяседезасвасьса дено повчиокогвеацц вехсстчасососовосяосадосотевессаусвіпасуєазастссавсоссазцюасатаванову сасвессадсассстасавная
Фіг. 21А БОЮ МОХ Білкова посліневність для Хупа шкавніісізаріуааірсєкІівійреїіа«іхапісеркадінахозвавідча ік кукіувваєасу зіїдхеказаїїзачзічочУсравпашкчичаїівпвоцчівиовайуїтаєацавакніг ве ічначЕраєу ппіпопайтікЧУуїжсвпУувеУУЧЕУКОКіхакахуупеі ресів кіїдевтувіакгаакчайр закічіпоаупідзсануцкупаіксутакнівоурісцідвЧенізадоватісаіцдіаєтриєвіві твійічоввсуєдутцасівчаксеоісунсівакаанказквріїкавнепркраупвічоіа
Фіг. 218
ВЕС МОЗ Білкова послідовність хуй? ксиланази СНО сімейства з Гисподетра ее вшувікі зварезтазстразочуевуауєксідруєоуавлнуєузучпасвозу су кпорчачівуВ «вазопеуоокЧноросквичівізузупрадазуівчудезквріїеууічевіцсупрзсовгкідех тейдхчучіуктакУ Че іпкастудуєзУЮКПА КОВО пса Епанацоі Бус кто уча чалеу Уугзвавазісте
Фіг. 22 Ба Мова Білкова посліловність для ВХІЇ, Вксплозилязи СИЛ сімейства з ХпспоЧегим тесеех пупка інзівасііртасалопдітавузачопеіурекізкі с 1ів8хросепсрікпрісаззачух вЕсЧазівібК усі подезоротркіоірвудениваїнзійгапкзскодатввнаєалрирікева аівксі1їйЧівфіівеадкаєвпзокувійоуариупоєкзрінукочеєрцедактівзавуєувуїках чадтареніктавіткогаЧуйіепипадасічвізіісЧойічеуукруківаасузкзквівсвупаху пеурвсавзЕсідкіїкевиа редут азасдатупуєповауавичвававанікац а осо уюи нієбєветхуацехзунозетвУусхтіуапіУкьлутаккацуквінкйУтксовнпівусаасеці у Ел чЕірізкЕтТквіаіідрнава сову уевруї і аріеваккадуйувтвіасвівозаєвеваках «вакквбаїіузіззійвсзіецезайксаіокраваі Я 11кцізеткріттідтвозодудазаікваккУ пгїхночуоЧазаууі ЕвіївокгзрацкітУєвцураеучйчЕрцпанаїграцкапрціуічуєокр чуєкавієувсяЕкепіавнокЗикІпсвЗі1іаарпраубувечіру сс ісапіки зи сезрУваті є хеввасревувіинкіочкчгласікрЧизакізірірудаїатоавкайрічуркуйіа ек евикте хаітцееуєтєптріяено і киаераз
Фіг. 23 ЕС МОХ Біакова послідовність для ВЖИ, В-глюкозидази ОНЗ-сімейства з пісбовента есеї штуттаайіаізіавтакайвосвуавзасатууррадуриштауйкакавтакіпіцокУі вано Чрсудпеераєкізурнісідйорідтукуєвозсатсротчаваєніупіїхекодеідевукавоійчї ІвртуздріцксродахвнеЧЕЧуйруїєціануеівціснеуЧасаквузїіпечезптетівжпрайе тіпеїуєиргайааарча юс упйкувеснасвацусістікадівЕрууливінпазаєвудеавв зійоврусаспцалкікоразїсвауксзпаУрсвксаавепхі1занузтадаваурагпівепиоопв БепогаійакЗЧі с 11ікайанпі1ріккравізутовзавііспраєпереспакасавдаїчнучоввату руєчаруйаіпегавзудсаеківнкапсвхцазаахокауаіткікадвцедуіктеупаоакпп1йри Баопазїучачадапаруїєутупетоаї ііі аїрцукалунаоіредевуваїуйуїнаврвакіх УукізксроибупогіузоадвазівецітіауквІйазнігркуейсуцівуєктпувтівтівьвакзворак чаучтрабраі гонку івпвоцдутсяєхацітуісурсварЕтрризіхетакіпісразвованії піхві оилЕчіходавакітісввІБий
Фіг. 24
Се и Аналі ої актиВносх Аналіз нелюцпалної че в 50,3 години 253 о, То ВАВС, БОС, з тод сао 5 30 Що : з ух ВОЕУйх ОНАВ -к ї ою во « 0д965 й . ши в 06 5 000 7 І М білкат РАВО
ІЛ . ССигО Ми 6 к я
Фіг. 25 ДОН Мо ов нан ОО ОО КО ОО ок Ах о п ке о я ОКО ен КО КО Ох
5. Авіхувь як ПО о Ж иа хо ке ОКХ З ОО М п моя и о. Ос ПО о о щЕ ; с ПЕ я З о о
Фіг. 27 тпАВ'Я стентів то тити ОБІЗОСОБоНОЗа о ДМЕ бо нм 190 пннннннн ОБОВ ! 1ю0-ї В(о- вро 400 200 : і ВВ ду ск 2 діЕй до дз ле АБ ЛО А ВВ й АЮ АН А ВІоВЕ ВО ВЕ еВ ВВ Лід. Їй во 00 що 200
Фіг. 26 росоін Ше шо л ша , бу песо Та ІЙ В сн БРАВ ЛЯ і й Прямий праймер ди Міо і | Т л-ащи РЕМТЯЮТОРО Й оторо 2588 по. ре з вх сайт уіізіавання ї і й й х. у пд сторо «Х ; Ї сайтупізнавзння 7 в й ана Гев стійкостоде рен чу. я Ж Сайт прзймування каваміцнюу че «и зворотного праймера МІ
Фіг. 28 СЕЗ сті ат, о: Уолт Ар Її: ! 3. рітехзаіМ й Її 7896 по. Й сват ій тавения Ше Й сн) Промотов КУ й знн2 ке т ; і сеаВ кох Щ кт Я Рамха зчитування о КІ и я о Збт "ання
Фіг. 20
Гдбсяовенх Пес гдлнююта о Їдкекізк й ; ! Дурабінозя | й й ; ! ! 5 Й Я їй "ШИ: ШИ; я: ши шк шк ше ше Ше Пд чи Ще їй й я, В й МВ з т я ИН З й М А. ся і ї Й сс В: Я ІД ---- Я З ше 56 ий й Вк Б сн; шик Ям; нн НН МИ ЯН Н 2 -- ЯЖ5 Я- 7 з в ех: Бе: ше: ВИЩУ: ШО. я я й й її сш ши шк ше ше Ще г з В Кі в Е ї і Ї: і їх і 7 ІЗ в. ши ші ши ши ши ши щи шк ше ши ще щи: що ШО Й М й й й й ЗШИХ и Ї ОМ Во шк ще: ще ШЕ щу ще: ще Не В у з. З 5 ; ; її ЩЕ У; г ї Е ши ши ши ше ші ши ши ше ши ї с ше ше ше шк ши ши ши ше ; ше Ше: Шк Ще -к Я ікс м Ге їй Ні яв її іх: их та З ві їй Ме т сш и "ШЕ не; ше; ши ШЕ; ИН; Щ ЩІ: Шо: й - ю Ах ї сш ше ще ше ши шк що сш шк ще ще ще е я я й шк; Ш: ЩІ «Все; Шо ех В є т В В В ; З З В х у ; о Ї й ї ши ше шк ще: сш ши ше ще ще ЩЕ ЩЕ ще ще що х я й щи ши ше що 7 Ше Я: Й ЩЕ ЩЕ ще І ї ВОМ з ї я ї й КМ ї Е Я М 9 ж Я ЕЕ ще: ше ще ще ще ще г . ще. ; ши ще: шк що ще ще ви й й и І Я М і Я нн: ВЗ Я В Ой в й я й я "ши не ще ще шк шк що ше ши ше ши ши ще що ше; шк жо ШИ: щ, ШЕ: ще; ше ше я й є пи К ши ше ше ше ши ще ще с; Що її "ШХ ШЕ: Ше ШЕ Яном й Як й й її я ОВ М. НЕ й ік БО. ЙО ЯНоО У: У ІК Я и й й Я Ме ОО ІН; ВАК щи М ВІ ВИ ВО ВІ В Еш: Кк ЧІ Вл ВИ ВІ як во Ви Вл) ВИ Ви им ЕОМ ВИ Б Ви) вл) я кисневе вина БОБ б б п-ііж. ВН АБИ кі с пк ее чо, ше, оч зе - я «5 ко що 8 ща т В т ж «я я ж ж во в в и Ше « ж ЕЕ її й хх 5 5 в й й й Е Ж він я ї - се за за 12 М с г п г о й х 2 ІгеЯ я - Б СЯ 3 їх х. 8555 5555588 -щ во око, ї й Ку т ях я но їх є вк - с
Фіг. З0А В ехобіоза Дксинпдіозх - : Й І . Вгупакох з і й я я 60 ІВксилогя й й . й у Й бінаха. А. Є їн и! й Я ЮШдрквівоха й В й й З Й : я ! й а і, і я ; і й ІЗ їй ї Що ї М що и й и й дощ в й шк ши ши ши: ще: і Не Брно сш ше ЕЕ щи щи ши: ЩІ: В яе У (Я Н и КІ; я ії з НН: 8 "ши ше ши ще що "ши ши ши ще ши ши її і ЩО Я в Я ши: я: ше Я й й ще « нини -у Е пя (Й зх; ШЕ: «ШЕ ШЕ е Те Ше КІ: ЕМ Й - 5 гу ід м її І М І Не ГО й о Ге ЩА Я; х і ; я Я й ВЕНИ; ЕЕ є - Шо Й Мо х хі їй у у; Й й ре З І -ї Я Й Р 5 ИН с х іх Й Її: ме Ї Н й Й я Й ш ЩО Я в ою пом ще ШЕ ж ше: ши ше З ю с шк: Еш ще сш ше Е " ще: що ЩО 7 Шк: ши: ше шк Ше М ШЕ. й ч о Д що й М зи: Шк: ШВУ щх п ОО в Фе «ШИ: шо ше: ШЕ; ША Ще Ош К я м й юю 2 й Ух я; г МІ я г М з ГХ ї и сі Я ТЕ т щу й и М я і их М У Їй г Ко і Я М ях я я й пово Х І КЕ |: й ее т: м М МІ Ге я и Я й Є ЇВ щоє Ше: ши: ще: ши ше Ше Що ще ше ше ще: ШИ. НЕ ШЕ Шу: і В їй у й ШИ є її ВООЗ Я Й що ке ГІ щі й мя ру ії; Не І їн ре ИЙ ий де 5 ух я я й й сш: ШЕ. ши: Ще. й щ й й нини шшшшш то ши Б ен з В Е ії ІУ в 5, Ж г Е п М вн в Ух Щі Я Ше І в и І З В ЕН в ЩІ ВМ Я вій ї ії З Й З ЇЇ З г у х з я ЗА: В т - КЕЯ а й Кі он -х шо дай В В. ВІ Я тезах ак од вод я 5 ш ще я щ вм щ я у -х п жа ж - К Пд ув Е Б Б Е Є Б Є 5 Е 5 Б 5 Ж ЕВ 5855: 0882555 55588 З ові - - б їх й сх х ра ХЕ ї ЕЕ я Моск Е ФЕ - їй дю 5 то до реа « Я ж Би У м В з тогоГ «хх о Е Є Їе:
Фіг. 308
Деаавюза 1 й МКемнобнва Ділюкоза то: Дконлояк Параснхся її Бо- ; ; В Й я у й Н й р т й й в Е і й Ь " й м їй й А ки й і» К Я й є: Є: ЯК й їх ї Я М : й Й В ; М ява М 5, 5 ї Ех: з ї Ї ї Е - З ши ш ші ше ши ши ши ше ни ши ши ше ях 1 Я ЮК В шк й и НИ й їй й й Я, й ее 33а8585 7 ж но М й Я 0 я 5 й й В й ж й ше ше ши и ше ши ши ШЕ ш й ВХ: ЖЕ «НЕ х: ЖИ є: ЯК НК У З ЗВ У "УНН з НЕ Б жо ЯНА Є пз є З 6 ЗВ є ЗИ 5 Я Є: НИ 2: ЯКУ Кая ШЕ її в; ЗК» з кА ес НБУ МО М Ж я я Сх Ши: Я о: Я : ШИ Я НЯ: г т ї3. ї іх. ві и ех ШИ: г зве у Як ЗНУ Ше щ. НИ: ШК, Шк»: Ще ШЕ В ВХ ШИ я Я в. їй Де - ЗЕ х- ЯН: Я іх Ся; ї ;. ій Б щи и є їх її «В. ШИ Ше Я; ШИ ще А; ще; Що; Я Ще "ще: Що ше Ще. п «в: ще ще: жк: шк Ше: ще; ще що ще Ще; ЩО; ще: ще: ще ще ЩЕ НН рн ши шшшшшшшшшшшшшшш пав ни: З Я о З її Я «Ви Шк ЗИН т «МИ є З о ЗНА є с ВИ ВИН у З МИ «В 5 ше сш ше щ: ж: щ: Шк Я: Шк; не; ше ик ще, НН; ШО. Шк; ШЕ; Шо Ше: пи не ж ши ве: щи ще Шк щи ШИ Ши Не Не но: о: о ШИ СЕ Б ОО ї ее ВЕ Я Ще Ше шо; нн: Ши; ще ШЕ НН ОО ОО її М Я Кк І к ТЯ) ща рія НА їй м Як; Ні
Лв. но І ба ясен киев пекли вол нний кн
АБ. вий ян а) ЯН ев ен МТ ЯМ ел ям еп и а Яй т ви вип випав ли. Я й т ть ро важ Я Кале пики оно А 5 яп ж х пк ЕЕ Б с Б ВЕ Б 8 С В Б Є Б с БЕ ВВ х 5 хх 5 6 9 9 5 5 5 В 8 8 Б 5 5 Б БЕ Б ве «ще І: Б ЩЕ ЗЕ В З В ЗВ В НИ З с а В Я в вв в їй й Ж а й ко 5 я
Фіг. 31 Крневобіоча. ї НКеднобковд ІВ глюкоза й то Ікона ! Од абінрая ка ца Я 60 Й я: ! я й К ; й о М (9; й й з шк ше я . й В їх Ко ях й Я КЕ ши ше ши ши ши ше шо що ; ІЗ у я й ; й й й ві й / їй шини ще ши ши ше ше ше шк шк ще ! ке си ши ши ше шк шк ше ше ни ни в В г "ше: ше: ше: нище: ше: ше ше ше ше и: Ж У що ї ї : : ; й І ІК й. ї ши ши ши ши ше ши шк ше ше ше ше ши и ши ше ше ши шк ше шк ше ше ши ши ще пі й: як я я; гЯ ЯЕ т їй й з є ще Кі й у я 3 х й М ги? з Ме я Но хі и ! М и й ї. НЕ й; п д я ще и: В ї я Й ї й ; ї Й и; ше; Ше ни; ж; ше: ши: ниє ни, Мих МИ в; МЕ, пи ши ши ши ши шк ши ши ши ше кн ї ? Н В Я я З с Те То ік ТВ 45 Ще ; я. й і 5 й ді . ї і ! ї й з у; 5 Я зі Ше З Й Не вх (КЕ. у М НІ «МП. ВО ВО ян ай й ВИП Я ВК. ей зйн. БИ, ай пкх ся лезх с -к т -- 7оухях я те її 8 ЕЕ Б Б Є 6 6 в БЕ В Є В Б не ре «о с « то г її М е - -- - ЧЕ: Е є е- ЖЕ є Ге Ге 1» є ш Ге є т і сі : ж нш ни и и и и М Фіг; 32 курені й Кеклойкя у Д глюкоза 7 Й кснлата . П храбнноза і 4 г ше ше ШИ в В ; ше ше шк ин и ни і й й шк ши ше я в Й Й Й и Й й ї ях й ще М з і: В Б Й : и Й й й зї Ії я в Ко МЕ М 15 5550 З | ; ж ши шо ши ши ши ши ще Х я: і Ді ий ї я ї Я М й, з Нє. НШ; У що ві щ ЯЗ г В: МІ я МІ Я й Я й То я са ше ши: ШЕ ши Не: Не; НИ: Ше; Ши; ши; ние; ше ши жи ши ши ши ши ши ши ше ши ши ши ше - З їй й В ях 5 а є: я: мі М м м й ч ЩІ (у гі є я и 6 я 5; «5 і М ЩІ Ме ж Я я Кі (й як ві ту й ме КЕ я Кі у ге шик ши ши ши шк ши ши ши шк ши шо ши ши ни ши ши ши ши ши ши ше ши ши ше ши шк ж В я й Х М : ї у її у З к; В ши ши ши ши ше ши ши ше ши ше шк шк МО З 85 РА Ів Мк х З Я МВ М По з КІ, М вд. ТК як є М; У М Мй ЕК ме о їх й ІЙ Яр ! я Х У я ий 3 го Та й ЇВ ї й. З и го Ге б ин я К є ТЯ Ще к я ів я ги а М. х З. В я ме Я лі й » Ер шшшшшшшшшшшши Ще ! Ян | і БІ ов : ФРН ВИ! ий о Яй ня, мс не, зи ес ВН: ві з і з і ЯН се! СТЕК ІА НА; ИН: НН НН ОН, ен - ки - : ж -к - ее в. а Є вс зб ав. З. 5. 8 вс В ах Ба Ох жж ше -еж Бе ж шо У Б БЖ БЕЖ Б дя те, МЕ ет КЕ Ве Ми ше ше ше шою 5О 55 БО до ОБО ке же що Ме во ви вих сг бе в о вач си ши ФА б ех вч ша ер зе МБ За 55 Зце вже е В о ав дБ бак шас ек пЕ б Ян 8 бЕвзнКвОо Дню За Ве 5 55 дев ме я 55 58 Зо Уа А ВЖИ БО 55 Бо оо НЕ Й «в яд ча й ЖЕ Я ж ЖЖ й т Фіг, 33 Делобюви І Дртоннабюза Др лаккозі во Дкінясзя Парзбеюва й уз 7 їй ; й й х) » ! і : ; ! ; й ; й й зі й в ю й й й ЇВ й я. й Ж їх й га М ЯЗ я їз Ее й й 5; КЕ й й я х ж Ма М Ще Св р й ге р й й й р. р. х. у Я з и Й що и! ри. й м й и. И ю ! ке; 5 й Й я: т Ко і; і ї Ї ї ї ї ; мл й ; Її . г у й в ї. Й й Й її її й як М М М ЇВ ях о С г Як як ре Го Ме І б ї ї ї ї . ї я щ Я Я я: Я й я0- СЯ ТІ Я п Ге Ми. Кз м ІЗ Я М. ух го С йг о Ко х М й й й, гі п м ї м ГЕ Ї й Й. я я я Я Е. Ні е ме: ше: ЖІ 8-8. -- о« « чи ЩА но Ма че т а шк я дк р -. р що З пе З дк а шт Я ет 5 еая я В с ох З 85 55 ев 5. Бе 50 Зх шк Вк в ах зах дже Ба ій я я В ВЕ Жов о ше о ше Я: Са Оабув ях я ке ще я КУ ж
Фіг. 34
ТОО 1 пелюбтва Др кевлопима Я В Єлірвоча й ББЖ ІЙ Ксялозо: В ; ПАрабічезу й Е й і ; ; ; ї | ; А БК Й г ї у / Й ; Й у я! т - І й її й й ій тА Й Я (Я Не їй : й МЕ й | й й КЕ К Й і Ж й Й У й й й Я й, ше ше ше ши ши не ше ни и ни я - Ві и к Д чо й сш ше ше ще ше шо ше ни ни ни ни в шк -к Е : й її х ' Ї Є. : Б ни ні не кн н шк вк и в « ше К вЕ ї во І мо я її хо ї х З З утннтнншнншнлнншшнишшшшшш т "же: шк ши ше: ши: ше ше; ще: ще: ше нище Ши ШО ї "шк я: ши: ше: ши ше шк шк шк шк ше; и г . їй З їй Я ж їх із ї х. г Зі ї ши Ж "с ши ШЕ ї ШЕ: "шо; ше ше ри й р. й й й й ї ОВ й Б 1 во ні я я Щ яд я Я 15 Те Н кі Ж і "ше ! М З ; Й ! ! - ше ши ше ше ше ши ше що що ши ія ї ї їй : їЗ і. З Н В Я їн й ак і І З сій т. 5. ія Ї х х в кі вкл кі м в ел во кл кв ові ННІ ЯМІ ВМ) ей ВИ ВЛ ВИ в. А В в я Ви, досто 20: 20 20 29 20: 20. 28 90 28 га 20 20 20 70 Хупа. 5 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 5 5 5 ЕВ КІ 5 5 5 5 5 Е Те 8 5 5 5 Кг ЕЗ9А 4 2 а оч 1 ге ї кВ 7 2 ні УЗА 1 7 В
Фіг. З5А Пра ТВ делобюзх НО Канів Д глюкоза оо 8 Жовлозя Й Арабінося й «во ; В Й що и і ї З й Й Й ї у я ; й Й ; ; і ї й ! : й у й В З о в ння ванн и -я суша Шини жо Ж ії ще и і р В Й ? Ц ї ж В гі г и МВ ; Я 5 и и Й Й й Й я я в. х й я й Я ї и х Я Я ї Я и й Я Н Й МЕ у: Кв оди й В і я і Й й й ї й щ й Мі ши ши ши ше ши ше чи ни ши м ши не В В й й й в й й т ж й й й й З «й й Яся Я ме С я М нк Й я; з ЩІ зі
Е Н. я й в й й и То ї у; я з З в а в ай ч ле. 5 ЮК ЗІ КІ шли: ШЕ: Ше: Ше: ше; ж ние ше: жк; ж: ни: М и Зі Те М г я їх Гл ЖК ЕК; 55 Я хх ву ши ши ше ши ши ше ше ше ше ши ши ши ше шк: ше: ше шо ше ше ше; ше ше ше вм ЩЕ ре Я Ма щ Ма 23 3 рез ЩІ і ЯЗ их шим ше ши шк ши ши шк ше ши ше ши тА, М й вогй М М М пі й я и ї Р Ку Гу ц й й вт 3 й З Я ї І? р В Е ей Я т НЕ, Я. ее М Ши ФО; ВИШАХ НИ: І свій нив НИп ВИП ВАЛ ВИВ ВН виб ВИМ БНИ. БНО ве в Асі ак 26 га що 29 85 70 20 20 о 20 ?їх 20 о Хупе 5 а х е В а 5 З Ко й 5 5 З 5 Вхн 5 УЗА 1 2 5 ЕхЗОВ. 1 7 Б Буга З 7 5 УЗА ї 2 5 - ж
Фіг. 358
70 пелейсовв У Ксилобюза й 48 Єлюкоза в і
80.04 1 кенлюза Й . ї о раліно ї й я Й й ; ! ; Кб | Ше Ши ше ШИ п ше ше Ше що шо ше ни ши ШИ п ние нище я ни ще и и ни ПИ п 8 о Ден нн рт р рн ж ши ши: ще: ши ние ши пи: ЗИ п: и: ши: и: я В Є 5 и ше шк шк ши ши: ши: ши; з; Ше; ше, же» Я ши ши ше шк ши ши ши ши ше ше ші ши ше Би ше ши шк ши ше ше ше ше ни ше шо: ше і ; Її Я я Х ї ї і ї о з ше ши ше ше шк ши шк ши шк шк ше ше ши ше ши ши ши ше ше ше ши шк ши шк ше -к зов ит М и, з М ті є як о ги п й Й їй М й ІВ их у ЇЙ я Я ; я КІ Й ще ши шк ши ши ши и ши ше ши ши ши яЕ М М зх; г ї й. га й й; й В і я; Ге т з З я я З я я ТИ В ве ЩІ ЯЕ ІиХ Це ук їх СЯ м у бі 5 г їй у й Ку їв я й й 5 й й й й й ше ше ше шк і: ШИ, щи: щи: ши, ЯщщИ: мщщо не чи: ще ше: МИ: ЧК об. ий «Я.В. МОП. ЯМ МИ в вий ва вн і. І. ВИ. ен 20 За т р 6 2 2 2 20 го 20 то 20 20 Хупо З В 5 8 З Б 5 5 5 5 5 5 о 5
ВН. 5 й 5 З 5 6 5 5 5 8 5 в В иа 1 У 5 БУВ з 7 ня вУзВ 4 2 5 УЗА І! 2 5 щі й
Фіг. 352 хан Е | ху Тезіжтнянце вікі і склукуєчьк мих, ї Ї КЕ ! ! й - і Ме: Г Ж РУЯЗАЖУЯЗА КГ Її НН а и м ай и ж М я з НОЇ Має ні І Я ОСЬ. і ; відтих І нн ши чо Те вх і «3 МІ с ВІ хккх и, ЗВ МАН РЕЯ ЩА х ; я й р А-Хйз ххх ; й А і В ! дей з Е ' Агале-Н І й. ЖЕ АВ що ІВ) ої ХеА-Х ! Мох ! ІБ А М хжхх і Олігомери ці ем НІС КА кН да КУ М ' мя ХАН ів - я я - ст т і нт у жжх від Бо во за в Я4 42 0 36 36 34 32 А-ТИН ша В -е Уніан ліпний інн ний х- Ківі НИ: райрн. ІСНі-рийон ксизану
Фіг. 36 хуц-ні хунесні Ї Агео-НІ дів вні тРОАВТА ї дн Гени, МИША, чи АТ к-2а : себя | Ж РеЗА хихх хх УНН ння ЧО НО ННЯ М ох, ХХ д-Зид з ЕНИА і х-Нвг | І А | Ці д-Хи8 ББ ва 5 52 51 50 4В 48 47 Яб 45 4д Хотин урни Хеттттттн тт юний х -й кг) ве -райов ма. НІ: райо компкну х помомомо и неЧЛещих й
Фіг. 37 рея ПТЕеКРОСЕНОЕЬКУ ОКВОжрКТІАТІТ КР пече ТУАМЕПАОСОРВОХРК ТРЛоТКорІдЕ ОРТЛЕАОНХОТТАНЕ САТ сен я В Км . МГБААТВАССВІЛЬДОВ кі інди іже ТЕЖ ук, ВЕ -МУММАЛІ АХ ООБДЕДАТрУтТЬь : т і ез|виІ МУ шЕзОоьсоВЕлатТеу с оВАщ- Звіхтезез| вні МЬІХЬОУЛАВАЬСЬВОЬО Божі БОПЕМЕОУКНВАЦЮВЮВА ШИ пр ОвоеЗА.
МІХЬО ж ж уж ШО ОПОРОЮ ОПЕМо НОТА ССво ва ЕУжІі Ббо.овя ЗБЕТОЕЕТ ТЕ КТОМЗОРО ПІРАУЧИКИКАСНОТЬСИВ ТЕХ її ВОАБІДОЕТЬЕЕ КО ее ЯН : . пІВЗБАСКУВВАОАСІВЬКХ СЕКОС МИТІ ВЕВІСИ ші таки жк о.
Мис ВБАЄ ; тЕЕКИКСОМ У узі що ; Мих КАВА БИУДАСТРЕ ЩЕ - т ут п Іпеивезі МЕТИ ОТВБЗиВККААСИАД кож. сяє " Ага швВХСПЦОМТАРНУ тт 5 МотСтЕ жк ую; БІНОТАБТТИТОАНАРЕК рЕо ПОН ОНу ат! бек якій й ТАБОМЕТЬТНОТА БУ СТРАВА ЖТКОИВОУПЕИТ р ран ху ЕоМрІвттААКЕХ НУТ АВАЖТКО жк ТКСООБЕНАТЕКИМЕЇ ІЛЛІ ОВУУЄТВА вжи жіж,г - тТЕЛТКОСУВЕ Аа ЕРМВІ ЕМАХАКОССЬІВ ц лани УВІ се й ях активи хітів, КНЕАСТІВЬЕМИ вЕгтани| СКЕАОТЕ РІБАВТЕ ТРИМКИ по УПРЕНИТААТЧИНЕМсяс ни зх й ЧЕАОТ сушжкя жан ТО УПРЕНІТАА гухеМОгЕНИ гіЕваті кі ожжжж з ЛЕЖІТСТОТМИ АТ АСМОГКО піти г.
УК ЖІТСТ ІТ УВМЕСсЕНУМОМ ЕІ ях, що ПИАЕТЬДКАТЕУЕЖІТ а ПЕ МАКІЧУЕСКЕ ж т ока У ВТО ПК Соєжуек аку ПОРА МС ИЗАСОВТОЄЗ НУЗ-КІКВУТУВОМЕО- ПК ее я і го с КТК АСК аж: х ЗЕ, пбігзехвії КРЕКОРАНКОВЕТРОКОВ МОЛ ЕВ НО ТРОСА ВКМ ЗЕ | жевтЕ з еарою жкрю злаки НУАКОСВЛіМСАУМВУМе БАСАМСТМУТЬ ЯМІ ЕЖЕКК ти ЗБУТ ТЕОКТАЛЛНХАКЕВ, ІМНСАУМАУМСІ РАСА й о вовни я я КН МЕОЕККЗЕО ці ТРОПЬАВУТУКЕТОВСТВ Коржики ТУРКИ Зі|гвевеї! ПОРТКНОЕВАКТІРОВІ; зех я тт ЗБЕВАСТОТОСооТУвКНи ще но вужукї кіно ЖЖ дж жжжаЖЕЖ,, РЕКС педсетУКтТтРОМАВ Уваги тю у асп а МеВ маЕсАлУХ Емма швУ т у с ЗАВ й КУУКТКАКЧАЛИАКЕХ г х чн Ка у М ПІЖОМНКУУКТКАКОАТІ а ех ; ВЕЛИКЕ? ЧЕТБОСОАНСОТКОМНКУ кофрвия М сордхчвая сфтхажвей | ВсНниМУТВоНМИ тт реЗАНО року, ЕКО ЕАКТВО Е Вени І - ЗШ - й МКУ УКТОДИ т 4 Етехщі Шк ій 2 БР. тТИ т се неви Бе ТІ й ХЕДОПЬАІКОДУКСХ яерЕчетеї бен я ОУТВОТАМЬУВІСТЕД КИ НКОІЗРАОЮТКЕНОТЬХ уж впрхтФрвоц злдУ Ба КАК ЗАС жи КУДОКУСНІЕЛККОМТ ПНТ А ах НІ в УУАОКУЄ І БКБСКВЕЕЕСТУНТСВЕО ож я КАСУ УМЕЕ вувеева! УКОСЬЕТЕККНОВ питроку я ТУУПРАРУЄТУРІСААККАСУН хх й і ма ярах Ж, ЛЕТ КАКУСІВ ЕКО пі гЕуетві отв.
РІ» ЗГАТІСРНАНАТТОМОСТУ сов? РЕСНЕРІЖАЛЕМТІИЄ У ї "Ж вк ХК УЕЛЬНУ гри зтрІ ве ті т к " РІЗКУ ЗІ АТХ Й ЕК КЗОвАВЕ ку, ЗЕ ТЕЕІЗКА ТОКИАНО ТОК й Мк ки Й тб ККОУАНІСКИЕ ож вих ге сяк і КІЛ КТОУАМІ ж ож їх МРОХКОВІКО, зітгзевеії З СКИВОТТЕЕКНЕКК жужй як жерекя, зврки МБЕТВЕАНРОКОНОВІКО зііїхетві мевзаяжеккя Тов КеГАІТУБОСІПМТІвОвс, ЖЕККОНРЕСОМТ БІО ЗііЕх жк КАКАКАККЕМАТІУХ ЗААСЕСКОВЕКРОМЕЕ Н 7 Тр КАК АКА ІБК ОАдАДОВОЄ ж ЕК ож ОТЕТАОИТТТО й ХАККЗОТІБЕСЇ, ЖЖ оку ; ш сігавевії 1ЄтЕ Бак ОМистМАУА АК О Й паж ха Й - УЗККаКАСКі дх|хее і БІР ОМОВиНОМи вка які, ООУАТКОТГОЗКЕаЕМ чаї ЯК ТЦОМе жа вижх УСС оУАІ ОЇ сви | їшарті й ж мч КУН БУС КО ни УМІЛІ ТаРКВРКАСАТ шкІХмеКе жор, ПОТОКУ хе тАУМеСтОв й , і МК ОгК УМ вики ПЗКРІАЛОМОСООУОВ КК МОУ «секр.
Ії сЕМОДЕТАЛИ, ОТАК МУКУ я жж жд ккіка що ві БОМ перо ТА ки Ж, зркртрАсі? зі1хвевві! мпакртіУУтТОмрОУг я ук ужктія, ЕРИ БОПЕУТТЕКЕтвАНН У я еХеЛЬя ху й, ПЛУТОКРУХЕКАБОСЕХ МиРКеН- вів їй дить в. « Й ЗОРУ ТИТРУ й ПУТКРОВКТК піігчать! жа екікух, ПеКОМРОСТІУ ТОЇ ГРУСЕСТУТКРОАКХ чАТЕ яки ММА ВОСКОМ ЗВТ РУСЕЄТУ ха КАЕЖЧУНОКРОМОММИИЕ ОБРОВТуВИТае ТУ мисль НИ ЧУТКА УНОЄ они тА КРТ ; р Ж, Ж паз «Еігтеваті виді КЕ ВЕСТОМТИМОНеТ- Ко кхужа жк ЖЖ, УЕЗКТОКАСРАТУ? дхажлтеке ЕУТОТРЯКЕРКО жжуєж ЖЖ ях, ОКТЕЗРУТАМОКУАТ. вивув.
ІгЕуєх й кур, Й ІЕУЕТЕБАМІКНОЗКТЕЗЕХ т урІКе ЗЕУСРК Му Ж ї хх ТУТ КУКТРИАЕ суток ЧкІЕ, Й що " авт БАРНРОТТУВЕСІЕ тов УУКМТБНІТООКУЗ ктріогухя хх КБЕКЕМТОБТЬСАВ МАФУВрІСВСРЕТСУ ТВ ОХ рерРа" а кер . пан песо уУдІхе жа жя ОКоУКгев дізлназеїї КЕтЕріоКіокшеесеАо но тот ух ІЧТРЕКТЕБАТКТОЮОУК дк шк Й ек - ж ок Ще вик ЄС вт дете! лен» ЗІРТРОЗАСАК Лю ВОМКІ РСТу ТТ ІСЕРТВОККІ Як Ех Ех ХРОНБЗКЕБІЕТРИЗАЇ.
ІЕМСОВЬУМУЖЕСТЕИ ТТ, її : - ЕБРІАРІКРОНОЗКІВ ТЕС САЛТКРМСТІАУ гожожя с.
Є НКньисЕОВІАрІВ РАВТКОТВІЕНТІЄМТААКСеНе скаут жо тідескві БАКУСДІНЕУВЕЯТИо а АН зм1лее - КЕЛАЛА ТК я, гу, пі Еуєк и ШОНя М «пАтрид що СЕУ ІКМНЕІЕВОСІКОАТЕЕ КУТІ К - : ЕБУСЕКУРІК ПРОВЕ дження Ко тзенві І талу ТІОКИРОВРКВА ях ТБТОККАХ й в зрЕНВткІ Фіг. 3 дн ТИВ ТЕ І о Ин де ПРАВА рус се ле т й Го 7дднннн: Ппряемнй праймер Ши ОК Мізса» я ро р га п ач Я я й й, г ій ще Й ап генні г вЕМТА-ТОРО-Вой (943942) Ген-стійкості де ко: й й ханамішщену: і І. 4817 по. Й Свйснраймування: і" Тева чзАзюагІ зворотного у 4 ж праймера МОЗ те Ж І; я вант Кох МЕ това- роту Сайт упізнавання 2
Фіг. 39 ди" ВЗЕЯЯ8О / Поліліякер ре й У с ра Ах А о й ох З сві Промотер й ок Г-й . м і М Й А свв / кА У аавВі Я й І ртгехЗа 43942 ! 10867 по й у й В Ак тен рецітяв М М те вом вла, Голіліцкею К вх ра й рем Кт га ч Я таз Маркер 47 «ке з й т Ж вкквнаннннння М Мн ЗЦВЯ -евВі 0 Термінатор
Фіг. 0 що рус дня ТКА ТИ висо і : Шо Ше пов ; МУ й Прямий праймер Й в - МІЗС тав / Ко іх й і і, 5 . ВЕМТВ-Хупз ; коонооох 5 В 3934 йо. й Ген-етійкосі до о 7 канамішину а й а а /; Хупі сайт праймування й / ззборатного щл ся праймера МІЗ У і м пкт о. Ще ; Поч ид и тОвРО Сайту упізканання 2 га і Фіг. 41 дин ДЯ ВО 0 Полізінкех р Соу» й ч ся У А «о» З лин ВН Промотор й ох 5 / с З / о Я САМ дл вив рттехзаХуєз 9984 по, і і З ; й й К Кк я й «Хуп3 реші1во / Полішкер в що й як р спін ВИ атаб Маркр 477 в шин он
Фіг. 42
, нка я слкжкнс- КЕЙ рус Огі шо ут ов ДН свиня гав те Ше я - Порячий пазйме пу тннною и Прямий праймер в Міо й ЕХ с отаця її о Бенстійкості до щі с канамішинну ! і й с РЕМТА РУЗА й 4 по. Й Сайт прабмування З зворотного. А Гр праймера МІЇ , й певузд ї ря Р а зо я р товао--- пЕед уж Сайх упізнавання 2
Фіг. 43 нт р 180 0 Тепілінкер ссеай ИН пн сп Е Ед шоу | че й Ох В дян СВ Промотор й й ся ху - / с З / Ка і рзіля80х Й ) Полідінкеро с Ї Ютгехбва-кУЗА Кб» 12393 по, | ; апа Ей Термінатор ; У / Ї/ ен гУЗА І зу Ь я Й - й ра ай лек В я . з а ДО зов. в ? дів Маркер шк Ше я й Шия сія Термінатор
Фіг. ча ре Промоторібпаратов іс ВО снід ли Зворотний праймер МІЗ Ши с - птн ВК я г ач (Прямий праймер) да І со й Про, ОКР стійкість да 6 сх із епі Нромотор і зезцпяву я Д/ ох х ле. ух ї КО ТОРО ВіооРеції ву М і! БО по, й м Й Бен стійкості до а ді Й канаміннну ве У | лі 430 чх І ки р Термінстор М сь пану или ЗК1297 (Зворотний праймер) Лехальний ген; Шин НИ АД люки ВИТ праймінту промотору 17 я Пенн МА З (20) Богчнані
Фіг. 45 з ПрозаоторіОнератор ійб рОС Окідій я яке Зворотний праймер МІЗ мир -які98 НЕ ейінхість ло ? 5 а | (Прямий праймер) зеодину пе» жд ФО «. вд Проматор й 4 «У к г о У / их 4 й о Торо вВІшпауреціЕА Ген стійкості ло Я : і А канаміцену , бВ29 по. Й о й і Й ву соєв Легальний іч й тен й у. жа мес Оря ШЕ Е зепнакі о нори Сайт праймангу промотору 7 я се ЗК1289 спаоротннй Мраймері є р ЕеБ1А Термінатор
Фіг. 46 ренфенАст БОЮ ран Суміш 100 снення «НІКА вд |: ОА Й сін ййА оддитлтя - во ил ; я 7й яилжи Ши ВО 7 я рудах х 5 Е - дя 2 ВО 20 104 нишштяяйлтшии о ? у г ; Дні Фіг 47А носіння ДОТ800 фееснірднннм КУМ чен НЯ ЕВ Я шен ни СеА пекар ЯАА 90 | паски В дитин ій роко ин нина : | | мкл ужиті Ба 504 Ше ; ПО ання ї ; джин и ит 5о п 5 аб. о 7 в 204 І В 0 1 8 З й 5 ї з Н Дн
Фіг. 478
Одігомев та ГІ Мономер І я то 03030100 Дідорнннтнннтн я н В й ОО і. пі й « Ю о. ! А тент ж ; і я ре є, і од і ІШш і ве ПЕНИНННИЙ в юна . щш Же пеЛеНИИНН і 2046 і | ! і я І Й ІІ Ці спол в ци в|в|з|в зінІвіві ЕЕ ВІКІВ ЕЕ ВЕ Їдствоюі Смеси | НЗА Р ОООА ЗАА ЗА
Фіг. 47С Одержані хроматограми «ВАТА, 842229, Кеїхой ІВІЮМАВООВОЇ ОЇ, лення, тА ОАОТА, Відт202.4 Мвітопй (ВІОМАВЕЗЮВОВОЇ о гояуХ 74 ВАВІА, бідхоое 4 песо (ВІОЮМАЗЗУЮЄТО ГонаА бо оо фнн-новд 4 КУА, сві! ! Буєзр 0 НІ ! о Епон Кк З 29 Е ваш 1 вуз РУТА ! , ! свно ї за о ва ДО я го а -20-4 у Ї Її | іх т яв яв 20 07 24980880 хв
Фіг. 47)
ЗО : шк : ; Е е В ВО дор канонюктінн нік соків ск ві пн х Я ТО Од рф
5 . - я ей Я Вод нн дження : ан он гі НН тент У і а хокнно- ДІЗА ко ВО зн БУВІА, х пен БУДА в -- 9430. а 00 ; т о 1 7 3 4 Ме піка ферменту на грам глюкози в коплози
Фіг. 48А Ол нанниииинннни " с --- БОЯЗА - шу я ВВ два й й оІаЗА Е а пон РАЗА 5 ра пох х ДІЯЗА, Її. Ж я Е тож сля те ні й р: тю х в' зт Я вод древня Е й в Вл лили х ре кв най істнн гз ПЕ пн й ж ко пана Е і 5 5 Н ЕЕ 40054 пениннте о 1 2: 3 4 Ме піка ферменту на грам глюкози: койлози
Фіг. В
РК ; - є З в З сяк 200 ВД урни
У . / ся сти т й: й р зе в Ж ОО лудеуі ну ет тт х. рай ! БЖ: дн й щі , З 8095 щ сити БО Ге НА т вок : шодо Буд в зенфекн БУЗА З --- Ех4303 5 а ! В 0 905 4 155 25 3 35 Меліка ферменту на трам'єлювози я Еснзотя
Фіг. 49А Ж о ВОЯИЬ : Е ВО ВД дер нта тання : соляний 5 пани линтаня 4 70 по я Бад п пек отак зни ку Й «й ам - ї т ; : Е з
Ес . ле нання в е я ОУАЗА Е стани РАЗА ОБО фран м я вк я МВА Б сенсу БАБА 8 птн ВОМ й 400 : : о 1 2 З 4 Ме піка ферменту на грам пяюкозисе ксилозн. Фіг; 4983 х ВО ОО тут тю еннтттттюнявеменкнття рн НА 5 рення БУЛА ЖЕ прот КУВА - Ах Я ще А їх ВОД а-Еч43О. 5 а
Х. 7 «В Кто ЕІ нам 5 ДВ Оу зонннн тіні сонккв т Я нінконнннткнт г ж х й ай ж коти - пу й шій
8. і Ка и З шт ра « ЗО Оу пд ш м т - бе У і Е 5 жООче о 085 41 5 7 56 3 35 Ме піка ферменту на грам глюкози є ксилази Фіг, 50А я бод БОЯХ пня шк Е нта - вгЗА В пон РИЗА ! з зве МАЗА о ОБО сю ВавтА рес р : і з ЗІВА тання 5 дент с Феднння й їоояооюнй ос х артрити няняян нот нк кни раров а мне в Ї 7 вит Й и га І-й " «Кожне Е 7 ; й ут пеки й У 8 й т що ї ЗО сту спини БУ 1 : І . до 200 ОДУ 1 5 2 25 З 85 Ме піка ферменту на грамоглокози є ксилози.
Фіг. ЗОВ г пюкоза вОче ї Гл Ксипоза ши кН -11п овен | спини нни я А в | й в ЗО тея я Я | й -ї р що 4-й. : ій А г г Й г г й , и Й й У я Й ТУ ТЯ ЙТИ ИЙ МІСИТИ я ННІ ВИНИ Фіг, 51 х 25 х 48 х 5 КУЗОА : МЕХАТІТТВУСАМТІМУВАОСОСТАТУСЬЗКМНИРАКДЬОВСРІ ОМИНУВ ОК г КО ОУКЕМІО МУМ до зол няитт ня МКУЮМУРЕМОВККРККМИ КОМ ОстоКО пр АТОКЕХОН- ВК я РІО ОХУМ овен няння МІКУВУРОТВОКИКВ ОВ ПСО ТОМІ КАВОВЕ ХІ КТ ЬКХ г Я Й ів я . й . І20 козоА : БУТОІКЕМОМАСООАВІКВІПИАВСКЕЦУ и КВ -КМОТЬЗМХЕЖУВКУМА ОО агЕМо ХМ с: УОБКІСКВУТВОНОЬооОпУСТУНЕМУЕТОСКМАРЕЖК утрати Хран-вМівРУ-ї т 98 ЕЗеЗОЄ МУМ с: УКЕМІОБИХІКОНСЬСОСОМИТЕАЕКУУЗСЕУКРЕХМЕВХІСВІБИЯЕрЕ ВІДЕР ло ЗВ Ж ї50 ж ІБ5 х 18о Ко3ЗА : БЕПЯ НОГО -- ОООМБУЕРСОчОМаТЕМА ЕК иМОг УМО вКАНММНЕОВО с го ОЗИЖМА ХУМ о: БЕСЕМЕКАБАЛООЦТУКУМКОМУКЕЗ ВАМИ УНК ЕЕУМТАЖИК о: 5 взеапЕ ММ ої: БІОРТМРЕККАЗОТОТУКУКЕСМУТЕ-РКБХУЕКИВОТУКАУТНВКІВВУСІВЕУЬК-МРЕВ : 136 В ж од х ре ж Зла КБІйА л УЖМЕРЕБОХІН ОРВК МКАТКвІКЕТЕКТВозоваМанЗрТБНО КИ її Та ОВеЕМО Ху З УКМЕРМЬУКНКООМКОВТККОУ КУТА ВАК рН еВА соя ВЕН ХТЮКЬ 317 вЗБЗОЄ ХУМ ої: ІНКШРМЬКХРИКОЛОВККУККОЖКУТАКАТКЕМУМЕМІКУЗОРАТОВОА не ПИМІЕОКІ: х ОТ І ші 5 х 25 Ж 105 кА : ВУДИМНУТУВ-ПІЇМИНОГОДин тн вив ПІ ТІ РОКІ ВА ОКУ о; йщЕ ОЗЕЛМе МЕМ с: НЕСВЕВЕУРУВКУЧАНАЕТВКАРНЕКТРЕУ ХО КРРЕПМОЕОРИТУКАаСІваерье 272 БІ5аоЄ ХУК с: БЕСУБШЕМУРУБРУЗННАТТЗК ОЗЕТТеНВІХО- ВІМРОБУМІМЕЕКТУКВІСЕМЕНЕВ по 269 Й я 328 ж 348 Ж 168 КУТА : ЕКРІПУКЕБУЛЕКОВОМРАМІУЕЖУ ВОСЕНИ КООНАМИООСЗНЬНМИМОМЬ КУТЯ т 304 ПОЖУМИ ХУМ с: НОРІНІЧЕУМТ--5УЗРІШРУНОТАІНААХІАКІ КОКОН МВТ ЕВОМЕЕВМОУВ з 330 РЗЕЗОВ ХЖМ ї МОРЕНІТЕУМІ с5ІВВОМРУуВОТРЕМВАХІВВІСЧЕОСОХУОПКВІИТР ВОКЕР ОУВ ЗЕ Й ж зво » 40о х 429 коза РО ЖОфИ ун яння я МОВИВ КУХААМАСОВ м юн вн нянні З СЕМ ХУМ Ос: БАПЕНОСЕССМАВОВІРКРТРНАКТЕРУАСОПРСЬУКрСВМІТТВВКрОВІААМЬКМЕУМ ї: 395 взБаоБ ХУМЮ ої БВОРНЕСТОСУВОКМІРКРЕКУТЕКЕЕНАМОВЕМЬХВОКВМіУТЕВррОВУВІТАНКВУМ : 367 х 148 Ж 160 я 48о гоЗаа : КАБЗБІКЕВУКАТКОЗЕКІКТІВСТАТУСАКИМІКІВСТВУВЕБЕКМОТУКЮУВТТКРОМА ло 50 ПеЖЕМО МВ о БКОЕСТТКЕУОСУХРУВЕЗАЧКІКВОІУМЕОТОМАНЕУВКОМОВРеКРОВОАУяТЬРЕеА І Я ВіЕоОЄ ЖЖМ її: ВКТЕКРОВОСБУрІРУКРКОУРІКВОВІСНЕНОЧРИЗТИТНМОВРЕХРИКВОУМТЬВЕУВ Я х БО. ж Бо х уза Роден ням ОКО СРМОССВККУ ХАТУ ЄЕРЕТ нти у ВЩЯ ОЗІЕМО ЖУМ ої РНУМТБОДКАТОСУТНЬЗІУСВАМЕУТЬТЕІКОМВОКТВТХ УМІВ т ОЗ РЗБЗОЄ МУМ 8 КРЕІМТЕОРУАМОСТІМІКЕКЬСХККУУВУВІЛІВІОВЕВТУТСЬООСКІМОї- т, Уа
Фіг. 32
КУЯЗО МИ ККОБЗАСЬОББТСКСАЛОТМОТРВОІТрЬКЗАОРБАНУКЕОКІ МТУ РЕВОТЕА Жо43А У МОПКРОБЗАБОКЗИТУКСВАОПТНОТРЕОІТОБИЗАВРЕАНУ КОКО ИУУ ВН ТЕА зщаЗА МКК Е- СЬКУ ОВКАТНОВОВІІТОВМИТАВОБАНУККНОТІ М УвЕНОТОМ РЕкЗА --МІОКРАХТЬРОАЦЬВМО-- УКАСНе- я РЕУОБІХТАЮКАВНУУМОоНУУМ Ер ЕТЯЗА ЗМИЛЯРО ЕАВТЬССПТЗУАТАрН РІО ВІХТАВРАВУУТМЗВУ ХТО МОЄ ттйі3В --МАУВМВІСтЬАМОВЗАТРЕТИТОТЕ ТУ ТМЕУрРснНеВрВо ОКО оБЕСУТЕТЕТЯ ДЕЯЗА сен ннннтеиМААРВКВУРТИ ОВУ ТРУ ВОКВОВВВОЛУМАВОТР КВУ КИ КІ РСЯЗ8 ----МЗКОІІЕТАХУКАТ ТТ ОСАТАЮЕ--- РІМОКЗОКРВРОБІЕТІ ВО УАКСТТОМСУ ТУЯЗЕ МЕУУКІМАНАТВЬТРОМЛОВІСНЕВАТТЕНИВІТУБОКРОМООКОРОМУ ХХ КОАСМЕНЯ ЕЯ3О МАЛЮЕТОСЛОУАМВВЕНТУУМКТІЖОКОРУТОНО АБУ РААКОЮМИАРОВАТЕ АНЯ БО43А МУУМСТОСАОУАМВОЖНТУ МИ ЖОКОРУУПНОУАНУ НУ ИАКООМИХРОДАНКА-М сейаЗА СеЕЕМОРОСОСОУАМНВУНУУВЕОКІОВЦО- УСНА УВОУРЯАЕВОМИАРОАВНК-УН ФЕФЗА сен АКУХВМТВКНІКЗВАРМАМНОЮ» НОТ РИБАМ ТНАМАМАНАРОУ ТИВ УМ ЖУЄЗА ня ВТОМИ ВАВМУНУ М НОУРМБ БК ЗНАВ НАНАСОУ АНЯ ЖеУйЗВ КР---ССІКУТАБВОБУМИКВІШНУМНКН КОРОТКА ОО МУ АВТ ВЕН-ЯХ АЕЯЗЗА АКБ СЬКЬУАЗИОСОМИКРАЗНІРНИР---ЗОГ1РОБВ- УМОВІ ВРТІКУНА-Е РЕЗЗВ Моне АЛУАВЕРИРИТИТ ОВТ. яння А ЕОЕКрЯМАВВРО І МАРВУ ТУКА ТУЯЗИ оре ОАРУСЕОКВБ МИСІ ОВТ РКО ООХОСеРОБн УВА СТМАКОГВУВКЕМ ТУЯ ОКУХОЄЕРАКА ВКА ПЕТРІ ОУАУБМКЕВОРИК-- АКА БМТВСТУВАВСАВЕУЮТНСЕ КОЗА ОКУТЕХЕРАКАОКУПЕХРАМІУАУЄМКРЕОРЕКк ех вк ЗИТРСТУВТОРАБУУСТЕ бе43А СКХУБУКРАКУВК-ВОТЕВІОУАНВРЕВОЗВКУуєия ОХ БИТРУТРВІВеАБЕУСОВЕК, РЕЯЗА ООБУЕТАРУВУНМ-ПОЗМАТСУЄУЄВТІТІРУН З ПАТОКРЕУЄММЕКОРТУКІЛОГОС ЕУ4ЗА СЕРУРУУРУВНАК-ТОСМАТОУЄУВТМІЬОвУТ--ЗАБОКРІУЕННЕІ ВРХ ПТО тУйЗВ СТІУУТСЕХЬОУО ОРІ ЗУТККТТМРИСВЯ ВИ еп еТЕКРМНІВВОЬЕНОГВОВИ АгЯЗА ОБУБІЧОХЬОВА ОТЕВЬНЕТОВОВУ ВСАА ОБО КЕАУБОЕВВОТЕНОНОСТ РЕ4ТВ ЗТХУМУРБАБААОПОСКНОСУСААТАТОРЕОРУТРУВЕАКАСТЬСОСОА ІВАНОВ ПТ тази ОПИУМІОСІН----- ЕНОТИУХУТАББЕЕСсСРНУ----МЕОНЕОСКМСХ ВМО ВОСТІ Яч43О ДУБТИОСПТ-МОБОБОАНОВИКТЕКЕВИ ОО КАЛРМУТНАБЗРОТАКЕЕКОМНКІТЕТЕВО Жо43А БІЦІЧОСІ- НОСКОМ НОКЕМЕНЕБМІСОКААРМКОТМАВОРОГТАКБЕКОМиКІТЕТРКО баазА АЗБАНОСІ МОСОБОВУИСОКНКУМВ ОПТ ЕВО МИ ТАМЬОВОТАКЕЕКОМИТОАБЕРЕО РЕВЗА ВУПШн тт кю тт кет тоне «МОРОК МОГМІВУВОВЕТО ЕУЯЗА ХУЙ» нн наванта пи ПРЗХУУКЬМОСМІОТгИВ НЕ ЖетаЗВ УУСДТКкОен я ІТВОВБОВІЖТ КО ОЕЕТМІВМОТОСУМеЕСеНІУКАОоУХТЬМІАКОСТ АЕЯЗА ТУТ КОУТЬОЬКТСВІЗРУВУИМОТОЗУВРЕСЕНІТККОсТХУДМІВЕССТ ВІЙ ІХУуйуКІр ення ниж тет кни ЗВ ЗО СТЕНЕРТРІМСОЮМЕАОТ ЖУаЗЕ МУУУТОВСЕУКУВОБВОрОВВОУКВОМОККК ТІВ ЕОМАМУК МО нн ння ВТК
Фіг. 53А
ЕУАЗО БИТІАРЕТОКЕСОДЕПМКВВЕ КЕДР не МНК ВОКОХ ТМ и няння Бо43А ТІТБАРЕТЯКТООВЕОМЕКВЕЕВО МІН КДОКОХУ ІМ тати сЕЯЗЗА МОІБТЕКТОКРЬСУЕРЕОВЕЕРВОВ-----МЕНКЕМКТ У Лув Тон няня ня РЕЗЗА ІВЬТТАОКОТКТОМАОКРТТЕЕВА Р МОУКАМОІХХ Ада яння ЕЧ43А УСЬТТАСЕСЕВРИВАОВКРЕТЕНЕСЕ З МОХЕВОМОУХМІ УАД яння вав ---тВЕРИАІТІАНАККІТОРУВАУНМИСІВТМВоТаБТК ОТ УЧНарька ЕКОН дЕЯЇЗА ---БІОНЕЕТМАВОДТВТОРХЕК УНР БЬБМКОТОВУРОТУВНАСЬРОСОМОМИВАУВ ВЕЯАВ «етТрТООРІОБІ АНІ ООРОВА ВА ЗМО КВ КОМ няння ЕчЧАЗЕ ПІОБРОСВОТИИКОКНИСРУВОКИБАДКУТРРІЗССМНВРНОСЕ ВІТ ЕМО Й я ЖЕУ430 -БТНТТУХУАТОКМ ен УОБУТ няння я я УК ВЕД ння КО ТНО Боі3А ЗТНЕБУУАТУКМН- ІТ УПР УТ я пянютняян УВК ОР МЕРНО бк43А ЗТТНУБУХАТОКТе ВЕУ Таня ЗАТЕ Отит РЕЗЗА ССЗБІЯКУЮТЕИТЕУ А ТООЩТ я тя няня ВМТ МИТО ШИ тин ЕТМНЕ ЕУЯЗА ССБОБІВУВТИРО--АТОВЦТ я яння нн ХВОСУМИМКАСКВ- яння РЕМНЕ ЕчаЗВ ПАТЕЇТАООУРМОРКАМКВО ТИМКО еК МО РУКСВМРОМІРЕРТК тт УР ВЕЯЗА ЕТНО КАВКМУРМОВЕ ТУ АРААНЕКОВКРУХ ЗРУВСОМОС-ВЕКЕРМНКК----УЕВОЕ РЕ43В ТУМТМУУОТЕТАУА ЗВІТ я не КОЗАВЖАВТІТ ЦИ те ТЕЦ ЕУ43Б ГМЕКТИАХРАСВЦВУВАВІ ТК нн ВОРІТ УКСАКОСМОВЕХРТЬООЇ БУФІВ ЗІУБУКООКУБЕТАВ-АНТООКОХВОУКАВКІЙХОКОдИ НКТ ЕЕК Тс КОбЗА ЗІУКУІКООНИКЕКА Пе АНТОСКОХ АСУ ВАККІЧУГКМО-- КІН Е нтняят СеаЗА ВІУКТОСОМЯСЕУНО АКТУ МИХ КАКК І ПОКО» ее КТК р нях КЛАЗА сСІТОКОМКОХКЕуУНМОЗКРОСОСУ ВУС КОН КЕМАВО я ІРР КМТ Аня ЕФ4ЗА ОТІОБЕМУБУРКУНМИАЦОСОВВУТА ВАК ККУ ння ВІРБТКМІ Ден тУйЗВ СРЕМАПРОМУМІКИТККІРНЕУННЕУВВОСВЕ ВК и ГВІМРОЕММУТОВУВРО АЖАЗА ЗБІРОК УВЕВЕЗСКІРАВЕОУМВУРЕТЕОЕ КОРЕНЕМ ТОВІТРОЕХУНЬТО» я РІЯЗВ ЗІ ЗАРОСАПЕВУОСЕКМЬКНАКЬНООпІшОСВАІКААЕ Я СТЕАВОМ ТЯ ЕУИЗЕ ПСУТКМЕТЕТОТЕКОСТЕЬАРЕМЕОМИМЕОУМЕЕТУММОВРІКТАВІВКОХОВЕМУ ян БУбі5 пн а а и и м п ин п п в Бо43А питне кю тк чн тю ре РК КД Тих КК АЖ РК лем рот т ЧЕ, те т Ті дя т тент тн тт тні т тет Же кжжя тн ння ж, пітон ня жжотю жи ння сх4ЗА пен а о и п по м п а БЕЙЗА синяка ВТОМУ УВОВАВТААНКОІТТЕУСВЕСТТОМЗКІММО ДУЯІА сення няння РАОБЕВЬМРУУКОВАКТІАЙДЕСІЕТЕУСЗВОСЬКУАРТОМО ЕеаЗВ ГЕТЕБОСОКОАРІСВКОТНТЬЕКУВУВІПЕКРКВВОДЕАСІТТЕВТОКОНІ СЬО УВО ДЕ4ЗА ТАВРО ООСЯЦОМККОТТЬ ТЕТУ ВУВКО КУА ЕЕАОУТУ ООН ОБОТ УТ рЕФТи ща аю аа аа о в п а а і і п и и п ДУЄ3В сек ин В ЗНЕТВОСНРТСІУКІ СЕЗ РМЕОЗОЛАСЬОАРКООВАТІО ТНК
Фіг. 538
ВУ смс іжиєтк ну нях ню да чк ке ще у ме ніс ян а КК ЗК КЕ КК ти ЧА КК ки коня Коня ох КК ня че Я ія ка тні нок тет кот Ко43а нн а м а а а п с а п перо жу шва ни а В п в и РЕДЗК ПУЇК-т ння КОМАР ОЯПАНЕРЗАВУАЗАНДОСТІАІНЬОВІ ТЯМ ОСТУ ЕУ4ЗА ПТК ення - ЧК ОИБВЕОДТОАКТКЗАКУАЗМОВОсКІ ЕВ КТа КУЄ тУ43В ТИОСЯМЕКОКІАРАТНАТОАОМИВАРЕНе МОВИ РОДИ КОМ ВІВТЕБАМАТНУМІАВ АЕФЗА ТТ ее ЗЬВЕБККРцУКОВОМУВОВТеКаТУРУВККМОСОГІ НИ ОВУВИТЕУУ КАХ ваз чна аа ка у а а м а а и п п ие вУ4ЗЕ РРІДЖееУКНОМЕМОКЯВОСТ Тр ОІКАТАМУРЗСВ ТІ ВЬСЬСТМРАСТОМТІВЯ ДШФУЯЙЗІ сен нкіювктю нак вк і ма ккд скх дів мі т жк осн жеах т дя дню жил Кіт кот нс у ЗА нію як кій мул жд сю мс кі уникне и ШЕ ЯЯД сани неностяеоія шті донні сів су ве тд жін НК я пет пен де нн пе тля шен ЗАЗ вето сМе Тит ТО БУВАВ ня ння я ПОВ УКОСУ ВЕД тин КВУ МА ЕУАЗА ТЕТОМИОТ УКХ РУ ВАТ няня ОРЕ УКРОВ ОБОВ М ян КМ МО ВВ ШтйаЗа З ШНИОКТОІАТАВКВСУЧООТОВЕ Вр МоКоБоУЕСРЕОВПОУУ РОМ АТАЗА БАВБНРАОВОТІВНАМЕЦІУОДОИТОРЕТОВЬ КУА ВО ДОТИ «А УТВВМНУЕ вЕзІВ. ро а а а а а ЕУЯІВ УВЯЮОУКУЕТТОРМЕК ХМ нн НАКРІАХАРОТЕМКАВТАО ВІКО КИ ФІЗ сення нетонння ЖоДЩД ст тт С:хг3А пит сжажиі няні коні ікон юю іюовю ню ік БЕДЗВ зняттю ЕЧАЗА сні неси ЖЯ3В РУАСКІВЕСУРУКАКЬ Аа СВООМІОРОЕСУЕВІ- РЕДЗВ З нннтяняя Е ІЗ Дня кож ред жі тя кот Фіг, 530 таій МІНЬЖВАКААНБАТТОСУВТОПУУКОВООМКТТОТМУПІМНЕВІМИЗСВОЗІХАЮТІЕЕ Ко5ів МУВЕЗВІКАКАВСЕ-УВУКЕОВІИУОчКОСМАТЕОЗНОТОКВНЕрІМНІОВООТІ ВЕК РЕБІід МОоКМУБЕТ БУТИ ОВУСиАХ ТІМ ОВОМК ККУ МРЕРІМНОКВОЗМУАЕрУНУ РВЗІА БАКОСВЕКЕРОМИСМИЕВУСОВТТІ КЕКВ АБРІУЗУМУВМКЕЗКОКОКОТКОКЕ Ж»5ІА КАБОТЗККТРОВВІОЧВКІКОАКООПКЕОО КЕ ОАВЕУ МНК ее рОКОМ хан КЕ БІБід КАКООЗТУУРАНЕОСУ УМОВІ БА БОМЕТНРІЗЕЗМРО ДІВ УДО и ЦЕ вачіА ЧСТАМАСКНОМОУККОКУ ТВЕН РСКУКСоОТЕУ В ВІАТТОВТТОККУУКОВЕККОСЕКТ Ко5іК УНК ОУКОМрУКЕОКЕ ТОВ ИКОАУКОНЕТАВОКОМЬКОПУКОВУКУКЕКАМККОМУ вЕчіВ ІОКАМЕСАОТЕУКРОВУАИВЕТ УВУ ПОКИ ПОБКОТОЕУ ОТАК БИКНЕТН ТтТачтА ЕКЕКЖТУВЕКОАЕНОННТ ЕХО вЕЛАКрОВІЬМ БК ЕРТЕКОВУ МО ПО ТМ.
АЦЕМ кче5ій ЕНЕКУВТЕМЕМАРМЕММТАМТХОРК АН СВЦОКМОІББЕВРТУКОККМНЬЕМОССАЕАЄ РЕНІ ОТКУВБУРКЕААСНТИМТКОІ ТЕКУ РОВІМЕМІІ5БЕВРТУЮНВ РМ ВІ ВІЛ КАЙ тТабій МЕЖ РТЕІВКрЧОМН ВНТУ ККМ ЕТО рКРИМАЗУНКУ ЮТЬ ОП МЕМ ЖУ51А вориреМшАКРОСММОВОоКТМКТиК ОККО ЕМКРОКЕ УМ ОЄтТНОВОоО БЕХ БОХ РЕА БЕПВОКРІВКРООЗСУЮВУЦАРЖКУКИЕТУ СО КОКУВАВЗАЙТУ ЕВ СТУ МУ ТаЗІА АВОМНЬЕРІУСУРАСЬАБООБЕУЕКВиМОЮУ ОВО ВКрУЄСрАКЕТКИсКУВАКЬСЯ яБІА АБІММОЬЕТТУСУХАНІЬВБрОВУТВЕВО БОРИ ООАСОЕТЕКІ НО УМ ТВКМСКЕКаВОСН РЕ5ІА СООМСЬЕВІСВУМОЗНУБЕМВУТВЕМВСОР ТЕО МО ТВКБМНОСАРОТЕУ ВНАУ тазі РЕРУКУКИУВІСКЕОНЕАСИРАСЕВЕУ І МТВЕРММИХАРМЕКУРВІ КАВОЮ ЖЕБІК ВИРОБУ МЕМ АСІ РОН ОМЕОВАТВААНОВЬТУ ГЕДОАБТСРОК вЕчІВ ВЕРИТІМУМВТСМЕРНОУО---СЬКТЕХІАУВКОВУУ АТАКУ РЕМ РУМЕЗНТЕМОО я ня РаЗ1А -еУММТІРАЄКСВННЕХІТВОЕТУВВИВК ОК КОМУТТЕСЕААЯТНЬМИ ---СХАКЕ ті КОАСЕВІБАРОТОГБУНРУВЕРІУВУВЕЕМОТОКВКУ- ТТ КУАВТНРМО о РЕБІА пжтке РАДАКЕРУВОТ ВТ ВОСКУ КМТ СОМРУ ТМ МОЖТАТУУРЮМОМЕУАНО Вазій СВОМРБРНКСЯЧАВАТЕЬІТЕВНССКІ ОВТ БРОБКОСОВИСИ МТУ ВААИРАСТ Ке8Ів КОМІРА ГОСУСВАУКЬСОУВКНАОВІРОТЕ ТАРІ КЕН НОНАТИОГААСЕКМ РЕБІА БЕЕРМЛУРИЙМІДУАЕАУКЬІСКВВНЕРКІ ПАКТ АРМЕВМІНМСКа ТТ АКОВОМУВУ Вачіх ЕЕЕТУНУУВ ТАМ ІІКЕЕ РУ ПАВАСКРИВОВОК УСЕ Ма ОКО ЕКААСТУНЕ НЕ кві тКБТОИХУК КАСІ ВрОвтА я -- ПЕДРО УХУАОКНавКоТЬТяКОВАХНТТКО ТЕБіВ 0 БНЕТОЯНУЄЮ ТЕТИКОТОКЬе ТИВИ ПТС УИОАСВМНОМТ ОМВК ААУХНЯ ТО вазі ТРУБКИ ХЬНЕВАУАНЬОСУТТОБЕ-ВРУПУМОРЕТОТМУУКЕКТТКТКАСКОЗКЕТЕ кеВів КОУРУХОВЕКОУКОСВОВЕСТТЬТВКЕКОРКАРНОВНКОММУУИТККТУЮВАрОКОАИНЕ ВЕБІВ кА ЗРУТТОКАССН-АКБАНЬТІБВВОВ-У МАМУ СЕКУУКТЕТОВУТАНВНИБЕКЕ Бабід.
ТЬРОТЕУВУБКТАрАЄКИСКОКСКОКОоКОМ Кенії КЬЕМОВУАМТ коти КОКРУНУ ВЕ ПОЬСМНІЗОАМЬКТЕ няння
Фіг: 54 з 20 х 40 х ХУПЗ 01 МКАМУТІСеЗПЬАРЕУАЙЬРТЕТІНЬОРЕБААЬВАКІТЕНТВОСИБВОВ 10047 ВВБЕЩЕ рості нію тет женні нер же т нил тоджю тю тю нені ткож жюсню ні яю тет жди уж я М рх БИВЯБО : МУВЕЖТБУТЗЬЬАРЕААДБрІн лети тя ту лтнни я БЕВОА КОЕВ Ж 30 ж 1020 хупЗ : ВОБІВОСІКВКОКИУЕОТАТрВОІ ОВЕС ККААІТОАОрЬСОУТВЕМЯМКЯ 0056 РОБІН : БУБІОСАНЕКАНСККУВУКІСОСХТУККМЕКМРАТЛЕАІТСОБТРЕМЗМЕМ 10052 РОЗЗБП : ДОБУТОБТКАВСКУХРОМА РОСИ КМАДІТОАСЕЗОМРРЕМЕМИМЙ : 77 х 150 х 140 я хуві ї фЗБЕНМОСОЬМНОраАВуСУМКАЦОМОКІВОНИВІ МАО ОАКУММІММА їх 1546 вЕБОВЯ : ПАТЕРМНООКТРЕСІрУСУМКАОЗКОКІІВНОНТОУМНЯОВРОМУВІТОК п 189 РЯЗІКО ії ПАТЕРЗОСМЕКЕАСВОУБУНИвОсоМоскрІВСЯ ТМ ОреЗеУВі ТОК с 7 ї6о й 150 х 200 хупі ї ОТЕВОУТВЕНУВТУУСВУКОКІВАЙРУУМЕІТМЕНОТЬВВОМЕЗВЬБОВВ п 1296 РЕБЗЕЗ : МТЕРІБУТКМНІТТУМТВУКСКІЇАНУЛМЕТЕМЕОСВІ ВМО КУММІсоКО 1 155 РЕЗБИ с: КТРТМЛЯКЕНІТТЬМТВІКОКІВАМНОМУМЕАЕМЕрСВБКОТУКЬМУТевО 1 177 Ж спе є 280 Ж куба ої ЕУБІЛЕВААВОАОЛРЕАНУХ МОКНЬОКАМУСКУМОТКТУУВАИТВОСУРІ : 246 РОБББВО : ТУКІАКЕТАВЗУОЕКАКЬТІКрУМЬОВАсВКУМОМУвНУККИСААВІРВІ її о БеЗЗБО : ХТРІАБОТАКЕАПРЕАКОУІМОУОВАВурРКТОАІУМВУКОмААаОИВІ ї 07 а) х З и Ж зо хуп о: ВаТСшОчНИВОСООБСТІСАСОСЬАТУРУТКІЛІТЕНОТОСЛЕТТОУТОМ : 995 ББББАВ з ПІСВОТЕОСЕСАОЗАУАНАТМАТАЗАСТККІВІТЕЬОІАСАВОТОУУМУ з 25 БОБИ 8 С ОСІОБОТНОАООВАБУВОМВПЕАБАСТРЕМУАІТЕВООАЗАШРЕрУУММ її 0 - Зо х зало , хуйЗ : чОоДсЬБУВКСУСІТУуСІВОКринКАВТМРОСКРАМЕМРКРАУМОТ УСІ її З4б ВИЯБЕВ ї УМАСІМОВКСУЗІТУЙЗУАОВОрОМНЗІЗВРЦЬКЕОМІМРЕВАУМАТАМАС 5 302 виЗ3еО її УМАСІШУСВСУсІТтуйОоарРОоВНвАЕТТВІСЕрОМЕВРЕВАУМАТУЮОВ лози? хупу іо 3 ЗУ КББЯВБЕ їн - РІЗ оо 328 У ше
Фіг. 55А ії БУБЕБВБХУВБАЇАСЯАІОоА ААУ ВВЕ ЕТ БЕЖ АГОХусе 1 БІБтЕШЕТВКОБАА:ІАТТАХА ВО КЕМСЬА ВсиХуву кт тс ААВваАвнквВсвгА ВЕУ УВМИ ВЕ Хуцу МЕТАН ЕЕАЕд ТУ тини ті АБОоКупи НБК я т няня с ТЕ ТТ ВО ТЕМ ЕМВ АЕоХує я : вот А « содкожшохк щодиот бод що нт тобто мнаттвтвтУиимр Ху і Ост тА М МЕМ ЕМ БЕОоХупе г папства сЕТУВНАВОХМОЮВЕ ТОВ АКОХуль с пневмо Хупу а КУ КРБОБВА-КтТІМУБвОИВнооМнамаАУ У АКОХУуЄе т моих хи ТЕО он нн я НН З НЯ оте т ша техн г кока Оо- НВ ТВвЕШВЕНВВНМАХ ВМ АгОЖуЄЬ з Вот КУуУІВкРЕшБВІУВОомМанІМ ХУ хи М ї тт ІЕЕ ХУУУЕО ОТУТ РМ АЕХУуВИ па тт КеВуЄУ І ЕКУ СВУ БВИМ НКТ М АгоКувО пЬЕ БЕН БІЖУчІУВнЕОТМВЕтТоАТКЬОКМ Хупй у пМтТбБесстІНІУВАУКУКАВВІВ КИТ ОХ АЕОХупо ме Баг ІрІУВвОооУМОАВІМО ТАТКО АсоХупо м теп жрІУдТОВУМОВЕІТИТАТЕУОУЙЯ ху 7 ву т)кКаАавссттТМАКнНЕМНА НОМ У АГОоХуви Ії ВІКО нКУВПпУТТАВННЕИКАНАЬОММ шт АДЕКупь зт УВЕнВЕНнНІ ААУ ТАМННЕНАМАЮОЮВІ Ті Хупо м! ВЕНУ ОІУАТЕоТОБвІББАВІТУХ АЕОХУпІ 2 ЕНТОІУБТЕСУЕВЗОТУТІТМБ ЗО АБОХуєо гі ВЗ тТЕМЕСУВЕОБАВІТУ Хупо зе БтихувіІ 232 вВлдесветтЕсп5арівоОвБваавсСсвА ТОК Какао 215 хула ВЕ дЕпХхуно г їде" НЕТ сваІвссоУВкаиВ ОСЬ АБрауть пи Кепх.
ОСдівамери і мономери слюкачи в день 3 вер (Коди некнонко зво ! ЇЇ Ояююва СОТ КІН нн и и и и и и ня дахом ЦО сн ОО О0ЛЯК шкур жук С т то ВХ В «00 ! Сак І ! в - і | г», щ ооо : х 1Бав ше -і м і; я 537 даті балт| |2ояа БЖ І 252. зва | к- їз вові -- ї не - не В ода - - 25 25 20 25 35 зе 25 35 ! 25 З АЮ в з 15 а я Бе в г 8 1005 імехи б з 1 зв о о 36 за о 38 В 35 БЕА Те 91 в З о З а З з з рек а же ни ще ШЕ І а , з 4 ор ечазо
Фіг. З6А Одігомери і мономери конлозив'день 3 4000 п-янтння нтииинаоинлвтлшннннни люком ЗОН Т дряпазь пнииттнтнжчнлинтниш Зо Я АТ с, Що І КЕ Гео Е - стю с і Н
Б. ОК Мк КУ Б ПОО0ОВО ОД ння - кн - Е я Ж СЯ с І Ме В : ВО ЯБДО рення ня м | 509 блю заса| вк; фая5і азам амю! 126 4 - 5 ша З І ! Я Я 10,09. Пен НИ це У шк - 2 Ух чо | ! ав і
5.20» -1 вв | Ов ВО шк г. рузас | І Й ! | зас Ї 009 в ние я - ЕНН МЕН УК МВ ЯН МНН М і 25 25 25 28 25 28 25 28 25 св дяБОЮ я 8 я її 5 а З 8 З е 9 гМЕХИ п зв | а о 1 зв 1 з8 в зв зя | ТУЗА вв о во з ра з в 3 З з ема ЕЯ | о й о 1 Раш ше: 1 | ' то зо нн пн пн нн нон нн нн
Фіг. 508
Онукрювання поперелньо обробленого розбадленим амійкам проса прутаподійного ря їй їй сл с с до ших ПИ шо 0 конлодної упігом но 465 о Олігочі лю (501 5 г Глюкоза (| 1 "Ши 4728 во яв сні жк РО
ЕЕ. я 16 Е і Ст : : щ Колба, ЗУ сухих речовин, жень Колобов, тут сухих речовин день 7
Фіг. 57А Оцукрюваннвя лопереляиво обробленого розбавленим. амізком проса прутоподійного Є вд нта КС рееонек ОО оч ках К х їз К Оліго-глючову й 40: | | І гу зо : ши Ксилоза (95) ж о аа 5 : сотня 5 50 В ! Ж 8 ох р Еш Кола: за сухих речовня; депо Капба 2505 сухих речовин, день 7
Фіг. 578
Перетворення глюкану то - -е і Дрттлттеттазіводокаквовавккунккнажентчкк тет ечетс чехи Бо Б покатіадкеккісвсв ей ств спваннннн дронннентіння й як БО; оди жити і Еся : сша | п ин й во -9 ш доти кіеківнчявнх ер ; гово ве одн : 1055 ТТ пре пкт ранюнососстоеноснсоснотсг у в -ь г 05 ї8 дк 25 5 -о2- 0) мії? - м сов ОО) МИТ ниж МО зноврення БО ЖИ ехіке ВО ЗА ся ВО мот зелен АЗУЮ 20 мг Фіг, 58А Перетворення косихану 10055 , піні веною снення ог; я МКК коти етститен нн тО9а дили пи ТТ То У 5 воль В ; вот пня о ення
Во. Ши З «р дня - шлях дню ЗО Сен житт оо 105 ! се » ; я я нн Й
0.5 1.5 Дні 2.8 8.8 стнноянння ЗО МІЙ як р ТО МІЙ нннофення ТОМІ я мн» ЗО МИТ поенчфоня БК МІЙ нку ВО МЕ терня ВО МОГ печеня 150020 мої 5 дини птн нитка анатомічно іден ііі коноткніеосніЙ Фіг, 588
Виходи в день З вою - Греновівза; Ко люоноза ; Щ УЧИ води якої Й ШК! ов Бобукоихоза нини З ще С нн Об Ї х З аб ; Ши нн нн нн і Кн Б и 1зхва втру зада КОНИВ я Здав ін хе зош ще: В зо н- йь т А о ть о КУТІ в х. пси х. І х. І ши ши ш: ш: ш: щ: що я п ше ше: ше ще що і і с г о і. і із ТАНЯ су Ж Ех пе ку Я Бо |. 100 ех в зи о о о оо ох о . х іх ших ших щих й ще ще. М. В х . ше. оо МК и ек ШУМ Ще Шик . с лом лем 20 мит ЗО ми ЗО ме Во чи ВО мит дівою Доза АссеНегане (мг ос Пегавет Глюкану) б м нн и
Фіг. 58С
Кукурудзжне волокно, 1595 сухих речовий, 13120760 хв., 0162550; Глюкоза (скоректозана) 4500 : пряна ТЕ : ою 74 год її : ЗДО І я АВ год пиши З Ж 30.00- фа водіння Х т ВО ; ЛИЛТ едноленнндеомід печиттттннн " петненті я раження Я ше о хх у 5-Х Е ЗО ДИ тині ню щі винний питні З шо ООЖВОденння І : щ- ! к тою» їх її х шт ке шк КХ : п. х мг «Б ме 2УЗ ВІЙ а АСлАмУЮ АСІБОЮ ТАЄ 1500 МЕ) (АС ОВ МЕ
Фіг. 59А Кукурудзяне волокно Зб сухих речовин, 121 СН) хв. (3о96 НУБОх Ксилоза іскоректованаї ой слисвивана во ЇЇ зягод 7 КТ 7 ва я 4АВтодо фесту тнуеттнттетто т еутттнттнттня З ж БО КК або : ЗШ; фе Х вже 7 ро шИРБА- А А « « Я ОС і-- - т Є КК Тости нкнтнннненн Дт -яКкКи і ! в. Ж нк по : е і що М . З ск де во о вк о, Я Б ем 20 мит ЯЗ м ЖУВ І г ни сн АС лБОй АС АСТВОЮ МЕ (АС ЛО я МЕ;
Фіг. 598
Кукурулляне важекно, 1555 сухих речовин, 12560 хво ЗБ НВО М Перетворення 576, а, 150 год. тобою р) ретвор пане . 5; і Нерстворення кснланх, М 120 год: х і я воове мкідоіннтінннтнтнн У - і з ТОД --Х ПОН пу нн --к ; Я ВОД ння есрстднтнннтінічн претнннтнннй Вик ж і ня о З зов м -мх Ж : пси Е Е Ж ; З с зо ЖК -- тк т х 4 Е Ж зоджчня х хх м -ЯЯЯХ х сода - - КК 5 шини вен пк Ши Все : 160665 М ! х пкт « - нь абті-К 1 С я-- В мис 5 мит 25 2УЖИ важки де 1500 АСО1500 АСОМ (АС ТВОВ Я МР
Фіг. 59С ЗБОНО МО Нуклеотидна послізовність для Раз А, ферменту СИ 51-сімейства з Родозрога вляегна акздтспаситсазтосачохоксазсапочвут оче єсозсссзессгасластарсавуссовстотсвя соска лусзазкаацаєуасецтагсасцтакоуєсттастсвосазоаяваксалсадовосресасууврасстасплосоацикаа кекссазссососсгткосавоздачесласаауисоссосстасстссасезстаапесесассапссоаотпоскраносио сацзашесстусваауссостстсовикоолрооптвхстссчковат ці вусспасссовлодазсаадустазатасавоуй сасопадуйтіІйасазассьзсткішесаастесиов і лиха споесусзазалцсвйаастасаєсвотайсьвсенся ткастуугзаугасазццусззесскедадуксаастхзсоясячссаасічсоцаанини с тоисвлазатихочічяяуєоє «чІдасгзалагачачвачеусясслацазочассссчачсссо посох сгаячакчслоссзатадеазтяаасвось сот дсацтазувЕдседасиассзаваласоласстесичатоксавстовесвоссіов осот оражсастсадспдхоцалтя зеачастазазакклаєтсссасззаєваєтахховасссзадсотасобісткдедессссссязсввсгаася се спадот засассткотасастісаювазкудсводадассаєводесстскчааоуатсдесссоосоатуетчет ства асяя цеавасессвоасевеЕцачеЕсучатозататастчзчтядасосаєчасзечаась даси реверс веусера брдесстсдакачспечетострсосазатсосавасодцавочувсатссласзвастссолаєсдааатозацутсосесассоце частсктаздессвссахахатачьсссоосодеседайчокЕодксаксттвянососкослааодссвасточассазчастоузеяа сшаачатсспетлустічасассосостссокоовсвопевсатсавстеасопопохсосвхоасопвсоначтоссвсвасзава. забаспредасахсвасассавсотстсзоссптолаєостесоуасалсвоуетазсссосасуслороссостсаєсаєтасост рапскЕчастссоратадасттавосауєзатводсплацтссязізасстслаусаатузаасовозодстеасоашсчадчстує чессасасаксстазсочтопьатолсьтуєасадзууазавсьсатчссстк чеснота кскоовлозасасєуатачадасоуєвасалаасса попу ува ссусосогевиоовасттавдастастузсвасиу зжсасчассталпогзсазсакосссстансслоостсасововеусіспІссацс ткачі свасалаатсскодессвоса сактакзедтаззсцстсоссдточасосессстзеслпсавулогавскссуассетстиккста св слесоаавацаЗсзада песусассоабабсккодзопскпсстьсуаставзсссовссоватсазооссттьцксьсечазаторвахотостовасчацах ссцоскЕдоваашскузсаутосттасссдчесопацлаєссявакузатасаасчвоссосттсастлохвсса тя йазпассасетсссавсаадохсоива оо евацкевостусяксосстьасочуаст туз скссьз ак Спливд соте асасозксалувлеадсзазсоугадлуссззасттазатазаацуцкайс кий ях -
Фіг. 60А чан МО Колонеоптимизована КДНК. для РаХ1А, фермент 751 сімейства з Родовурога злвсмох втшассрассьсавесесусесссдусдесессупаодостоваивсосовалтасдтепесаводатско седіслачассацеччсудсавсаатасслсеасагссатсотасодсосесардсасоазасассвасяа сацесспсчосасазсадесакстасасслазеслассвзосаасоосасстіссспуслевааоавачевосою пдосласиссзасзаттоукопосодсзусазорсасосссасосисовувачоводесайастистує шсксцрвюсоссоствекосурсавсзсуссаавсссі зво узадаз задо свадчасвосва шстсслацавузесочассссуссавадесаавссспедосахтодастесаавсассачакаєасасецус зпотирссвтиссассадсчачтасаачецчасипсзвао т саасьососалодссаєкассцасуааа сотидоаслаззатогсоу саадачсозсадсаасакодораазоовассзгвазачь соло пссесссаачойсссссссзасачевасайсассспоусса тосола ксдесавазсуссазучає часвасстспасетсаассссаксадсековіссозсстасессссааодуссосзодавсоусстьссусва бсдасскезсссаассвіздакезачсізавдеосасоткссроссссстосссЗасодевасавасосуа аезсезсасоесьссасвостоЧі учас ассадвосатлоадосссстазавчасоавесьацевия Зссацесесссоччваса западає стозаствсозоставесдчавтасв аа ссцавчася солассьсзассссаг спосо осуге сс осідосстудссссодасаосвассві ад косссзхдаета. чЗаїісзчестасдьсявкосадчпалассесссзаслаца сову сспевсодасчвосассайзассассяац Сосбососвсотеососспсазасьсцуєсассстлатовссотваадосслласодовсоадавссасласа засассзасоусасеочпесЧасскчесоцесісЗалазатасауєсавосівсодсекссссасцакааютьий спусесссвастачазасаєссксяаовсавоассвукасовасссосвосаветтсоуасаасавчастаєії ссовассдсцчесосстасчассяаосвосвстаюстсвоссссвасдаатесіплодачедесеуєссавУє кссясаастссаосалоцасазсуссасссьсаєсаодакусодосадласосассссаасудецосах шспшсспдсаподечасесовечесессвессоюаусдаласачсадсокофсеаачесасокесосесвео пшеасссзусосвзссусаасавчатса с спсуссвостаспеосстодссусевавсревсдасово злоздтазайвсдапсавсссоаасссаосведєсдссозосссасокпассвеледсадєсассвує Уч суссьачсасатлоредессвокаскита систе ассстссссавсшавусвсесосзсодоєхауссо авптсопапссростсвкстаєдкезстозсаазксозазадспосасосасассттісеавдцерчесчеся возасадсассдачассакссссувсазесьсаває т опвозасстсласоозайсоссоредуєсазсех «вссдтсоссасоспсссечацдасссссаслоровсваовзавосссоссассуусаневаса сере чазаздассасстрсатсазоауссяуслвоачсуосавотгсасесвтвасссіссссдестевстурет содксосодзачассоссаастссаравазацсдасвазцоваваавав асани
Фіг. 6083
ЗЕО НІ МОВ Нуклеотидна послідовність ля С243А, ферменту СОНЯ З сімейства з СПВБегена геио акзтазспавадпеулесоссяссвопсостеосеососсксявсгсстдсєвсозасозсластсосто тсалсастасізвсародасолезпатсссосачетсасосототвасдчасасстсалтопепобвосетео сгаззасастсдчаслесззасскасвахчасссоувіссастосазчсастссатавувЧчаствозвкато таттоватссасвечасстасизитесстуєстоєзаєситстувасодесептуєтвос пава песадчдчоессксозсихдасатоолевесттасоосчессасвзтаасачсааатястаєствтасвтссе тдссавазасвастласчатаєстісатавсозсссскостоксксасозассссезасчаассавсстьо сесдасвазачеіпоачакссспоасастсісвзсавсоасссодесааЕпосчестасазлата сах сехасттодеасччсколоьзссаточотодссадсксісвассті часа зсвадазедаззсавсоя аЕСПичоастозассяуднавсзовсстаосіедаосстсавяткоссавсстазасаасавсато сасветсковсачадвацисісостазасостасссосдазсссватаскчасаадессяетоссвео вчтзаклазадассозасчсхевксцаволассстацастсасаавсопсзасвачаєтрастасстсасста сбсрассоадсасавссосассатстсстстатостастісаазавсесссвасцєсьтасазсовассая спосапзаєтотесачесаасьлатодесоспастзсвосассссзасаксуссазасасесздастоосв ач птссакЕЕсассвстаоассхвіасвастссзповаозасьв т соссачуваваасіавзвеоаво Чегведаєачсазадузасчасстсодасазачавусстсита
Фіг. 61 БЕСІО МОх45 Куклеотидна послідовність для РоЗ3А; ферменту СНАЗУ-сімейства з Кивайии охуролі зедсагсолазасідлосчтсеассреддесттсстасслаланстосвоссозазвовсгаятчасатьсо се таєсвосчассвстцчиссясацакосоюсоосипав кс сдаачусавасосткика песаїстєсзсдасакславассзавскіатсоввесчийсвсзадалесчстсвасасдесах валове пасвоскасоссасчвачацеасстьзідувавуаксосатічвссассасдаєдесеоекетесватия зкчасоаккссстсзуспаззсадсазаасопесоскдасосазсксасвядЧазспуєзтавкаєтя го зтассьусссспосзадчисавсзасчазасостсаззассолачі паті уєсссодасавуєсовосот семтссзазпесовсввовасплатссссодсводеасаутавсовісскуєтаденагоссцивастя зтаасчачусатаслісзвсіпзузаласасссозачоузсласссссвадсетазсаадавапаанадаа ссксвасчайцссдхаваикдаохосавозссотооьвасодовогавтооссоєзисессюсва вот «азставчсвацузсвсцсасавчассассзавасасосссудасєсссуєсаєссьсяоовсставасає чезачсстсттсачзусссвозасвасаазсцалазкссестоачавссекоацевсспсавуєчодосяа чЧесекзессавстсвиякассоввсоцостаєвоссастсостічеставастаськесвеазаататство чехссокаивесевоспосоасавоасосттаноос ас тлатлпатадастасьсведоааЧч воски зсовізазадасвоастасадертсти спе воакзсзсвтасоссстваацоввексссксовеяау є чазсасцазозадаєсскоутасцасвазавссзсаядавсттосксасосувнтог са
Фів. 02
ЗЕО 0 МО:5О Нуклеотияна послідовність для РЕУТА; ферменту СНІ -сімейства з РезасіНнт Заліспіохам агзугзссуаалостслесуєдавосасопесьсосоадоасідеоссссосеассассяксасстивиео асидсалезсозасвзачассвусссвссгосзатвслорексаглетсаасавсаєстзассасоасодасса счасачсстгізсрисвоссзаросзавасозаассспосаиусаслсосаорасостиссааоИтоо часаостасізвстсптзаастзозепахостопсасестачвассковсосвасссоавісазесеоааса тлессссдісдсовесцісустазссссхсовасвасзасалеассодускксчссввстачовокя пишчоапоцваЧцеезадосчесапезс волоса оозпеутотасатосацудоЧасстассвичцечастве батарсачесстссачезсвечсксвоссазачцеехспоссаоучкчаачссучесчадососааци асозудвстчудресазкасазпевспзсстастсссузасазацесасозусавсассязсавсвосої сасстабсасстссчасаосваочсотсвазовсосалееховасвьсяассссагесваевоосвесод поцзсскзсавсваєсучосозаставстсстевтозовсясчесазчуссавадецаааскосацаася зазслесвесоестссесчосудерспозсохсоачечіосадусассдассодіасватчкадавоспа чпзссщтсчусцасстсазсцассоутвастовзоеаацюескоадзссгведацзадвосавспасвке посестсасєсстетрасасовастзсьсссастасассеслисьссвассаве стос стадпаодато астасесбсауесаасчазчтсаїсвоссвовасоасствсасроскасасссчасаасасоестовассатох сзайшйсестусасчоацочссссузасасвессгасзоцасссповачонсьячесссуаокасссоватост косассяксзастасукссачаксссосазвотасоасвасстствсппоауссісувувени новости ассячкессатестсаестаєчесцссахсасоспосвачсатовосзевечаситксакацевнусомови сдачакесесчасссспскупезспасуссодасеассассавтассодасаоссзаецастосаковає састесаастассссзассадесассодсраскавсостасчесоазодаєчацексуссаоезоотавс всазсаассотаєссвасвсеЗзоозочеЧаччсазопсчееЕсосцесетасссууз аа сс чЧчисудвузссЯьсекостеассдсоаооассовасачсосовасаєсяксачеассечсвасвовсоси акт косасавсветвасаастздсао сов сяавосоовкевосскВозодессвсадева сова сеабсцслевсасстоскучсаспісаксааосьсстсадозсватзадассасссауавсскоросас звичка ссчачачсчаосавсотуессслессеалізачеодесчасооцазсовсвасвоссулеассяає звикстеслаєтесолсцістасавсзссассло асо всодассвевуєсесацьссуссузсиуганся тезасазцсозссайссьсассвісСстатизсслпассатлисивасчесатоваствстспусасесеопв, ччЕсчтсавчасссасассовчазодстасстоалеадсооссатсчскесес са аестссозаас екавоччсочессєпетозвачасучаснин
Фіг. 63
КЕУЗА МЕС ОМААБА ВЕ ТІ ВАВААЛ ЕХ в тннкткятюю тут тях ня и ЕПС Е Вкії "«МУММЕАТВТАЛЬСАСЕРТАСВОММОТУАМУСАОООРОУРЕТЬАТУТООКРОСВИЧРЬКИ вчі1 МЕЖ еЕТАВАБАБАТО я нн ни РЕДНЛТИОВ Ве не В ВАДА яння нет тенти ЖКУЗА ЖМСПІВБВРАКНАААСУААЦИРЕККУ МІ ОМАТОВЕВІРАХ ВИ МЕВ оно пвО вкїї МЗС ВАСЖУВКАСМ ТО ЦЕТЬЕВНТМТОМОСрРОЗТВЬС ЕХ ОУНМЕКВО ОВ ва "ВАСТРИСТАХОЕЛКАВЬАКОМІСрКуУСІУОМОЮМООКСУЄМТЕВАЗКІВУРНОЮО РУЗА СЕКАБТЕ-РУВААТВЕРМРІ МААЛЕВОВІ КВТ ОМУМСТВАНАКТКО СИНУ ВЕМТРНо вкії КАТОК МАТЕЕРИРЕСТТААЬМЕКІЕНОТАФІ І БТОАВАКЕМВОВХСЬВТАРНУ
841. не РЬСУВУШТОВТАЕЕРОУСААКИОЧМИ ВЕВСОК КЕ КАВСІНУ ТС К КУЗА МРЕХОРЕЖОВОВЕТЕОВОАТЬНУВ ВУАБУ ТВО ВЕКОВВІУАТСКНУАЄМОСЯ ВОЮ вхІх МОКАВРБИСВСОКТВОВОАРЕСоБАЖТУвУ ТО То Со БРЕНЬКУДАТУКНЕАСУ ВЕНИ Ват ТРОССВМАБСМ- СУМ УПВСТАМООТІ МОТО УШУОДТВКНХІБЧКОВОМ КУЗА БОКТН тн НОЕВАКІТРО ЕЕ УМНеКОКОСТЕНАКУСВІ МОВІ ВАХМОТРАСА ВЖії ВМО ШЕ- сне ОТ ОАТІВОООЬВЕТ ТО ТЬАААВУАКЕВБМСАУНЗУМОУ РА ва френч няння ЕІ ЗЕРОВ КАРАХОАММАВУМСВІВКУМТТНАСЕ ЕУЗА нЗУЦЦКТІЬНОНИМЧТВОМК І таВСсАМОрТНОМИКУУКЕМАВАОУАКЕМНОМОВЯСВХ вкїї МОЕКНОТЬЕВЕсВеРЕ-ЕНОИУВБОСОАУУМУЄМРНОХ АНОДА ВВА АВТВІ ВОК ва ПОУТОВУ КОДЕК МОВА БОМ МР ТО ЕМОВНЕ ВА тУЗА ТІТЕІСВВОУКОСТОТЕКЬМОВОБКВКЕЕЦЬУН ТИ КЕДИ нт вхії ТУРКИ ОМВеРУАОВУ КОВІ УТПЬТАМСУВВОЖЕВ КО кн нен тня ва ЬТНАУЦОНОУВТОЕУВОМУТВІБААНТ ТО ООАСУРВЕМІ б тня ТУЗА «ББЗКАБУМТКЕЛОТЬАІВАУВСАУ ЕКО ТОВ ЦКІКЕКОИМАМ ІЗ КААН НЯ я вхії «ВТК УКТОАНМІ З УВААУЮСІ ЕКО ТЬРЕВККУВ ЗТ АВІЗЕКАМ з ваїї яжюня КИ ОПННИТМУВАТАКОСІУБДЕЧОАМІСВІККРАВІАУУВВАВІ ОМАН ЕУЗА шееніюн шия З-ЗА РЕНИИРІХААЕКОСЬОТМУАТРТТ МОВИВ ТТ Вхії пжтнсня я ТРОС МУХОВАВУЦІРЕВКАКНАСУВУНЕЕНОТКІ АСОМ ЕД вті зеМриссросаісМоноволуУМме ву КУАРУрАЇМЕВАВНОСТ- ОУТЬВМТОМТОене ВО рРУЗА. АМАААККВОЧРПУТОВрОДЕ ее ААДЕВЕОКЕМІ Перо БОКІВ РОУМ ОЇ; вхії АІАВАККБОАЛІ ТУШ І ОБОВ ВІДНО МО СВІ КОКОБУСКЕВУУ ОМ ваї1 КВААВШКВУАІМЕТТАСВСВОУ СТОБОКАСВЕММСО ВУ НМОКАТ ОА УВОАМЕМ ТЕ ЕУЗА 00 Я-ВОУРВОТАБЦКМККІМНОТ УМ РООрОСТАУМОВОТОВКОРАСВОВУ ТУ В няятяя вхії Содом КЕУМО УМО ВО СИ ЕОТІ ВОК АРАЯВОУ ТТ воії БАЗАТІБЕСТЬАСЕОУКАУУНАВ ВОК ОВМАНУВУЦН УВО КОУХТІАКОВМОУМТ Фіг, ЯМА
КУЗА нення КУТ КОМІ МО ЕТ Бе СВТУРвКУвТРУГСРЕСРОЬНУ ТКУ вх1ї тт жтв нт ю ВЕТО КРОМОММОНРООКИМРООТІ ТК ТОККУХЕКОВОЬЕИ ТЕ зерня І Улишо тет нен ОКО ВСЕГО КНЕВСА М нят ТЕКХЕКОУОЬБІ ТЕ УЗА ФАКЕКВМУ КЕКВ ОКО ЕКО ВВС понят нка мете тт тет те мн ти ет тен вхїї ЕЕТЦАБПОКОКЕМЕИТБаАВИ ВО УТ В зе т тенет тт тя тестілктет тет ваїх МУКУ ГОТАКО ОРАТОКУ МЕ и я нов нією ув хет ні й Хе ождюня зв дитя как Пакт чютю хх КУЗА я КТ ЖИЛЕ Кі ТЕ тю твітюття тити ж пт тт т тю т петкттт юн т ОВЕС ККТОВ, вхії плетіння ут Кая нан пк я тем тк тт тю те кт нютю ню ік я ВЕУ КРАНІВ К вті1 птн Ж т КІ т т жменя чт клон те няню мя ЕК ОПО ОМ УА УТУВЕАМНОВО БУЗА ІТ5ВЕУВІУКІКЕ-ЕУСВКРУ ІКТ КАЖСВІНОСАВЕОТКІІ НЕ ТІ ПИЛ АВЕСЕКОЮ вхії ТЕБРЖТАМСТУКРОМАСРАВУРМКНГСУСЕСВЬВВТКРОВОВВОЗТРІ ВУСА ОВНОВ Ваті УТОАКУ ТУ ВИ КАВВОТЕЕКОПВУКАКІМ-СТРООСОТАТЕМІ ВНАУ ВИТАМО БУЗА ТАТ ЕСТУТВІ ОБОВ ТОК МА ОККАТЬОКН ОПІКА сля я Вхії ВІЗУРСКУЕЦВБМТЕЕУКІ ЕТО ТІНИ БЕКООІКОАТВОА Ваїї КИХУВБСВЕСІВБУСАВЕВИ КИТ ЕТ уд тн жену тот птн
Фіг. 648 везОвВ.рло МКЕБОББОБАВІЧВКИМУМИУААРЕТОВКЗ КЕН ВУВСНУ КНУ са АКИНАКНМ КОСОВО Зо Еидодаюто МЕККА ОТ ТУ ОК І ЕКО МЕ КАЛОВІ ом ИИ Сх ЩЕ Кезонов) вБЕКОТВАЗЕЗКОВМОг ЗВИКНЕ ЕВЕР РОАК ОНИ КВУ оттпакваРШУМ ІБ РУТА. ШЕ ЗИМІТІЯАВВ ІМК ан ВЕ ЕБТРЯРЕКО АЕН ння нинняииню Ії ЕмзЗйвортє КІМН У ОА АВОСНКОД АСТМИ МУКУ КК УКОТМ ОК МЕРОЕААВЕНОМОЕМСВОАвКЕІРАК 24 рУзаду.юч с АВС ТУПИМ АК УКОАиТвуННУЄККЕОО оВІЕ- МЕ тАкОКАрМІ во 18 желОоВ.шКО КОІНКНОІ яв МК ККО ес КП ШМАСОСАСьЕВАрМУ ВИС ТИНсУУВеЕМи ВТК Я в»ЗпАсрре ЗАМЕКЦЬОІ КМТ іх АК НАЖОВУМ КУ СІМКИ ВНКХ ОВО СМ МК ААМІНАКА 25 тОМІОН.Бтго БУТКУКННОсВОМІКАСНІ АВМ УК В В САНИ КЕ ВРІНИІООКУ ТЕКИ ИИАаеВВеоКицвЕНЬ І85 килад,юка Тео УКІДЮСТУММО ВАХ ЕКЗ ЕМОКОК ВН ІКТ БІ КАТАНИКЕКА КРАНУ т35 кУпВ.БкОо ЗАТЗБУКІАЖУЮЕЕЬМ МК ЕМАТО МОУ АНУ УДО тенет илюнтняс Я ЕФІЙдУувко БРЗОСУМОПІАЕЕМІПОВУЧМУВтМВОсТавеТ УВС н ТО ТКАНВОМИУНТКУТОВОПЕУКУТМрУВОМИ. Я ШОЗДН.ржо снення ВМРЕ ТИМОМОКТВИКНО КАТОК ОРІ КРУ Етенннменянняжи ЯН
Кей. ро ТАТКО ККУЮТАХВВОсАрТеТВУКНо тт БІВКАКЕВ ТИ БеУВВаКАКХ РОКУ КОННИТАК Зах ЕМ дЕф стю ніє кн нєнієк інт і іі пеіютиі же ж ж тс екннттню я ав їУ3ав.ско КАСТКАТЕТККОВНОЗЗКУЗАТНККСВНОсХКАСИСТМ ат
Фіг. 65
UAA201204936A 2009-09-23 2010-09-22 Глікозилгідролазні ферменти і їх застосування UA115219C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24527309P 2009-09-23 2009-09-23
US28988609P 2009-12-23 2009-12-23
PCT/US2010/049849 WO2011038019A2 (en) 2009-09-23 2010-09-22 Novel glycosyl hydrolase enzymes and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA115219C2 true UA115219C2 (uk) 2017-10-10

Family

ID=43796468

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201204936A UA115219C2 (uk) 2009-09-23 2010-09-22 Глікозилгідролазні ферменти і їх застосування

Country Status (16)

Country Link
US (3) US20130177947A1 (uk)
EP (2) EP2480660B1 (uk)
JP (2) JP5932648B2 (uk)
KR (1) KR20120115206A (uk)
CN (1) CN102791853B (uk)
AU (3) AU2010298308A1 (uk)
BR (2) BR112012006571B1 (uk)
CA (1) CA2774776A1 (uk)
CO (1) CO6630115A2 (uk)
DK (2) DK2480660T5 (uk)
IN (1) IN2012DN01492A (uk)
MX (2) MX2012003091A (uk)
RU (1) RU2012116081A (uk)
UA (1) UA115219C2 (uk)
WO (1) WO2011038019A2 (uk)
ZA (1) ZA201201147B (uk)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012003091A (es) 2009-09-23 2012-04-30 Danisco Us Inc Enzimas de glicosil hidrolasa novedosas y usos de las mismas.
CN107287250A (zh) * 2009-12-23 2017-10-24 丹尼斯科美国公司 提高同步糖化发酵反应效率的方法
JP2013533737A (ja) 2010-06-03 2013-08-29 ダニスコ・ユーエス・インク 糸状菌宿主株及びｄｎａ構築物並びにその使用方法
JP5707494B2 (ja) 2010-08-25 2015-04-30 ダニスコ・ユーエス・インク 粘性の表現型を変化させた糸状菌
SG192098A1 (en) 2011-03-17 2013-08-30 Danisco Us Inc Method for reducing viscosity in saccharification process
RU2013146240A (ru) * 2011-03-17 2015-04-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Ферменты гликозил-гидролазы и их применение для гидролиза биомассы
BR112014008493A2 (pt) * 2011-11-11 2019-09-24 Novozymes Inc polipeptídeo isolado, composição, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo, de um mutante ou célula de origem, e de uma proteína, planta transgênica, parte da planta ou célula vegetal, molécula de rna inibidora de fita dupla, método para inibir a expressão de um polipeptídeo, processos para degradar um material celulósico ou contendo xilano, para produzir um produto de fermentação, e para fermentação de um material celulósico ou contendo xilano, e, formulação de caldo completo ou composição de cultura de células
DK2785732T3 (en) 2011-12-01 2017-06-19 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH BETA-XYLOSIDASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
WO2013188305A2 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Codexis, Inc. Fungal beta-xylosidase variants
CA2880776A1 (en) * 2012-08-03 2014-02-06 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method
WO2014047520A1 (en) 2012-09-20 2014-03-27 Danisco Us Inc. Microtiter plates for controlled release of culture components to cell cultures
WO2014049138A1 (en) * 2012-09-28 2014-04-03 Dsm Ip Assets B.V. Process for the digestion of organic material
EP2914717A1 (en) 2012-10-31 2015-09-09 Danisco US Inc. Beta-glucosidase from magnaporthe grisea
CA2889193A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Danisco Us Inc. Beta-glucosidase from neurospora crassa
JP2015533293A (ja) 2012-10-31 2015-11-24 ダニスコ・ユーエス・インク 組成物及び使用方法
BR112015012968A2 (pt) 2012-12-07 2017-09-12 Danisco Us Inc composições e métodos de uso
EP3290515A1 (en) 2012-12-12 2018-03-07 Danisco US Inc. Variants of cellobiohydrolases
US8846357B2 (en) 2012-12-20 2014-09-30 E I Du Pont De Nemours And Company Stabilized chlorine dioxide for contamination control in Zymomonas fermentation
CN103146725B (zh) * 2013-02-07 2014-07-02 广西大学 热稳定β-葡萄糖苷酶基因及其应用
US8759040B1 (en) * 2013-02-12 2014-06-24 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US20140273105A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 E I Du Pont De Nemours And Company Gradient pretreatment of lignocellulosic biomass
WO2015017256A1 (en) 2013-07-29 2015-02-05 Danisco Us Inc. Variant enzymes
US20150087041A1 (en) 2013-09-26 2015-03-26 E I Du Pont De Nemours And Company Production of ethanol with reduced contaminants in a cellulosic biomass based process
US20150087040A1 (en) 2013-09-26 2015-03-26 E I Du Pont De Nemours And Company Production of ethanol and recycle water in a cellulosic fermentation process
US9873846B2 (en) 2013-10-10 2018-01-23 E I Du Pont De Nemours And Company Fuel compositions containing lignocellulosic biomass fermentation process syrup
US9499451B2 (en) 2013-10-10 2016-11-22 E I Du Pont De Nemours And Company Soil conditioner compositions containing lignocellulosic biomass fermentation process syrup
US9725363B2 (en) 2013-10-10 2017-08-08 E I Du Pont De Nemours And Company Lignocellulosic biomass fermentation process co-product fuel for cement kiln
US10227623B2 (en) 2013-11-24 2019-03-12 E I Du Pont De Nemours And Company High force and high stress destructuring of cellulosic biomass
JP2015136324A (ja) * 2014-01-22 2015-07-30 本田技研工業株式会社 糖化酵素組成物
GB201401680D0 (en) * 2014-01-31 2014-03-19 Dupont Nutrition Biosci Aps Compositions and methods comprising a xylanase enzyme variant
JP2017530702A (ja) * 2014-09-26 2017-10-19 ザイレコ，インコーポレイテッド 可溶化された酵素およびその使用
JP6346853B2 (ja) * 2014-12-04 2018-06-20 本田技研工業株式会社 麹菌変異株、形質転換体及び糖化酵素の生産方法
MX2017016625A (es) 2015-07-07 2018-05-15 Danisco Us Inc Induccion de la expresion genica usando una mezcla de azucar de alta concentracion.
WO2017103159A2 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP3438262B1 (en) * 2016-03-31 2021-12-01 Toray Industries, Inc. Method for producing protein
WO2018053058A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Danisco Us Inc. Lignocellulosic biomass fermentation-based processes
KR102593668B1 (ko) 2016-10-04 2023-10-24 다니스코 유에스 인크. 유도 기질 부재 하의 사상 진균 세포에서의 단백질 생산
WO2018106656A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Danisco Us Inc Truncated lpmo enzymes and use thereof
US20190330577A1 (en) 2016-12-21 2019-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods of using thermostable serine proteases
US20200109354A1 (en) * 2017-04-04 2020-04-09 Novozymes A/S Polypeptides
WO2018185267A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2019074828A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Danisco Us Inc CELLOBIOSE DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE
CN108342400B (zh) * 2018-03-05 2021-04-06 武汉康复得生物科技股份有限公司 重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用
US20210071134A1 (en) 2018-04-23 2021-03-11 Dupont Nutrition Biosciences Aps Increasing activity of 2'fucosyllactose transporters endogenous to microbial cells
WO2019209241A1 (en) 2018-04-23 2019-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Increasing export of 2' fucosyllactose from microbial cells through the expression of a heterologous nucleic acid
CN109370995B (zh) * 2018-12-11 2021-05-25 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 锰过氧化物酶CsMnP及其编码基因和应用
CN109957514A (zh) * 2019-01-25 2019-07-02 南昌大学 一种粗壮脉纹孢菌的新用途
US20220232855A1 (en) * 2019-06-05 2022-07-28 Danisco Us Inc Methods for improving the amino acid content of animal feed products
CN110862976B (zh) * 2019-12-11 2021-04-27 云南师范大学 一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体k321dh328d及其应用
WO2024137389A1 (en) * 2022-12-20 2024-06-27 International N&H Denmark Aps Use of a fungal protein comprising an over expressed native polypeptide to provide a plant-based meat alternative

Family Cites Families (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
US4797361A (en) 1983-10-24 1989-01-10 Lehigh University Microorganism and process
CA1333777C (en) 1988-07-01 1995-01-03 Randy M. Berka Aspartic proteinase deficient filamentous fungi
US5536655A (en) 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
DK16490D0 (da) 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
US5326477A (en) 1990-05-07 1994-07-05 Bio-Sep, Inc. Process for digesting solid waste
ES2068586T5 (es) 1990-05-09 2004-12-01 Novozymes A/S Una preparacion de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa.
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
US6103464A (en) 1990-12-10 2000-08-15 Genencor International, Inc. Method of detecting DNA encoding a β-glucosidase from a filamentous fungus
ES2182818T5 (es) 1990-12-10 2015-07-06 Danisco Us Inc. Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de beta-glucosidasa de Trichoderma reesei
ATE166386T1 (de) 1991-03-18 1998-06-15 Gist Brocades Nv Klonierung und expression einer acetylxylanesterase aus fungi
US6021536A (en) 1993-03-04 2000-02-08 Wasinger; Eric Mechanical desizing and abrading device
US5405769A (en) 1993-04-08 1995-04-11 National Research Council Of Canada Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase
DK81293D0 (da) 1993-07-06 1993-07-06 Novo Nordisk As Enzym
DK83993D0 (uk) 1993-07-13 1993-07-13 Novo Nordisk As
US5437992A (en) 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
US6099844A (en) 1994-08-22 2000-08-08 Triarco Industries, Inc. Increasing yield of extractable substances from botanicals with an enzyme composition
US6426200B1 (en) 1994-09-15 2002-07-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods for enzymatic deinking of waste paper
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
DE69617641T3 (de) 1995-01-26 2009-10-22 Novozymes A/S Xylanase beinhaltende futterzusätze für tiere
CN102080070B (zh) 1995-03-17 2016-01-20 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
JPH11507837A (ja) 1995-06-23 1999-07-13 ダニスコ・イングレディエンツ・アー／エス（ダニスコ・アー／エス） 新規β−キシロシダーゼ、それをコードするヌクレオチド配列、およびそれらの使用
AU6513096A (en) 1995-07-19 1997-02-18 Novo Nordisk A/S Treatment of fabrics
JP3626203B2 (ja) 1995-11-15 2005-03-02 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 染色されたデニムの複合糊抜及び「ストーンウォッシュ」方法
CN1209838A (zh) 1996-01-29 1999-03-03 诺沃挪第克公司 纤维素织物的脱浆方法
US6254722B1 (en) 1996-03-27 2001-07-03 North Carolina State University Method for making dissolving pulp from paper products containing hardwood fibers
US5811381A (en) 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
US6069122A (en) 1997-06-16 2000-05-30 The Procter & Gamble Company Dishwashing detergent compositions containing organic diamines for improved grease cleaning, sudsing, low temperature stability and dissolution
EP0988402A1 (en) 1997-06-10 2000-03-29 Xyrofin Oy Process for the production of sylose from a paper-grade, hardwood pulp
ATE277184T1 (de) 1997-07-11 2004-10-15 Genencor Int Trichoderma reesei swollenin protein und dafür kodierende dns sequenz
DE69812403T2 (de) 1997-11-10 2004-01-29 Procter & Gamble Verfahren zur herstellung einer waschmitteltablette
US6187580B1 (en) 1997-11-24 2001-02-13 Novo Nordisk A/S Pectate lyases
WO1999057360A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Novo Nordisk A/S Enhancers such as n-hydroxyacetanilide
DE19824705A1 (de) 1998-06-03 1999-12-09 Henkel Kgaa Amylase und Protease enthaltende Wasch- und Reinigungsmittel
US5980581A (en) 1998-09-08 1999-11-09 The Virkler Company Process for desizing and cleaning woven fabrics and garments
US20020084046A1 (en) 1998-09-29 2002-07-04 Jay Chiehlung Hsu Enzymatic paper and process of making thereof
KR100618495B1 (ko) 1998-10-06 2006-08-31 마크 아론 에말파브 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서
US6024766A (en) 1999-01-27 2000-02-15 Wasinger; Eric M. Process for enzymatic desizing of garments and enzyme deactivation
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
DK1242601T3 (da) 1999-12-30 2005-06-13 Genencor Int Trichoderma reesei-xylanase
US7354755B2 (en) 2000-05-01 2008-04-08 Midwest Research Institute Stable zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
DE10043662A1 (de) 2000-08-30 2001-02-22 Saechsisches Inst Fuer Angewan Verfahren zur enzymatischen Aktivierung von lignocellulosen Faserstoffen zur Herstellung von Werkstoffen
WO2002095014A2 (en) 2001-05-18 2002-11-28 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiase activity and polynucleotides encoding same
US6982159B2 (en) 2001-09-21 2006-01-03 Genencor International, Inc. Trichoderma β-glucosidase
US7056721B2 (en) 2001-12-18 2006-06-06 Genencor International, Inc. EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7045331B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. EGVII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7049125B2 (en) 2001-12-18 2006-05-23 Genencor International, Inc. EGVIII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7045332B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. BGL4 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7005289B2 (en) 2001-12-18 2006-02-28 Genencor International, Inc. BGL5 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US20040005674A1 (en) 2002-04-30 2004-01-08 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose
EP2295559B1 (en) 2002-08-16 2015-09-16 Danisco US Inc. Novel variant Hyprocrea jecorina CBH1 cellulases with increase thermal stability comprising substitution or deletion at position T255
CN102604916A (zh) 2002-09-10 2012-07-25 金克克国际有限公司 使用高浓度糖混合物诱导基因表达
MXPA05003382A (es) 2002-10-04 2005-06-22 Du Pont Proceso para la produccion biologica de 1,3-propanodiol con alto rendimiento.
WO2004043980A2 (en) 2002-11-07 2004-05-27 Genencor International, Inc. Bgl6 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7407788B2 (en) 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7449550B2 (en) 2003-02-27 2008-11-11 Alliance For Sustainable Energy, Llc Superactive cellulase formulation using cellobiohydrolase-1 from Penicillium funiculosum
US20040231060A1 (en) 2003-03-07 2004-11-25 Athenix Corporation Methods to enhance the activity of lignocellulose-degrading enzymes
JP2007534294A (ja) 2003-03-21 2007-11-29 ジェネンコー・インターナショナル・インク Ｃｂｈ１相同体及び変異体ｃｂｈ１セルラーゼ
US7459299B2 (en) 2003-04-01 2008-12-02 Danisco A/S, Genencor Division Variant Humicola grisea CBH1.1
EP1862540B1 (en) 2003-05-29 2011-09-14 Genencor International, Inc. Novel trichoderma genes
ES2501190T3 (es) 2003-09-15 2014-10-01 Danisco Us Inc. Enzimas modificadas, métodos para producir enzimas modificadas y usos de las mismas
ES2575526T3 (es) 2003-12-03 2016-06-29 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Endoglucanasa STCE y preparación de celulasa que contiene la misma
US7361495B2 (en) 2004-01-30 2008-04-22 Novozymes, Inc. Polypeptide from a cellulolytic fungus having cellulolytic enhancing activity
EP1733033B1 (en) 2004-02-06 2012-06-20 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US7413882B2 (en) 2004-03-25 2008-08-19 Novozymes, Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides
JP5114194B2 (ja) 2004-03-25 2013-01-09 ジェネンコー・インターナショナル・インク セルラーゼ融合タンパク質及びこれをコードする異種セルラーゼ融合構築体
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
CA2567570C (en) 2004-05-27 2014-07-08 Genencor International, Inc. Aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
CA2586779A1 (en) 2004-06-03 2005-12-15 Novozymes A/S Mashing process and enzyme composition useful therein
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
DK2302049T3 (en) 2004-12-30 2017-05-01 Danisco Us Inc CBH2 CELLULASE VARIETIES OF HYPOCREA JECORINA
EP1869197A2 (en) 2005-04-12 2007-12-26 E.I. Dupont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain ethanol
US7781191B2 (en) 2005-04-12 2010-08-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical
EP1877568B9 (en) 2005-04-26 2021-05-12 Novozymes A/S Hydrolysis of arabinoxylan
CN101321857A (zh) 2005-09-30 2008-12-10 诺维信股份有限公司 用于增强纤维素材料降解或转化的方法
US7256032B2 (en) 2005-12-22 2007-08-14 Ab Enzymes Oy Enzymes
FI120045B (fi) 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
EP2420570B1 (en) 2006-02-10 2013-12-04 Verenium Corporation Arabinofuranosidase enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2008008793A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Dyadic International Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
US8017373B2 (en) 2006-08-31 2011-09-13 Iogen Energy Corporation Process for enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulosic feedstocks
CA2663711C (en) 2006-09-22 2017-02-28 Danisco Us Inc. Acetolactate synthase (als) selectable marker from trichoderma reesei
US7993884B2 (en) * 2006-10-10 2011-08-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Beta-xylosidase for conversion of plant cell wall carbohydrates to simple sugars
BRPI0718641B1 (pt) 2006-11-13 2017-09-12 Danisco Us Inc., Genencor Division Method for converting a cellulosic material into glucose or cellobiose
BRPI0811465A2 (pt) 2007-05-10 2014-10-14 Novozymes Inc Composição de enzima celulolítica, e, métodos para degradação ou conversão de um material centendo celulose e para produção de um produto de fermentação
DK2152892T3 (da) 2007-05-21 2013-07-22 Danisco Us Inc Genencor Div Fremgangsmåde til indføring af nukleinsyrer i fungale celler
US9969993B2 (en) 2007-05-31 2018-05-15 Novozymes, Inc. Filamentous fungal host cells and methods of recombinantly producing proteins
KR101507402B1 (ko) 2007-05-31 2015-04-02 노보자임스 인코포레이티드 폴리펩티드의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 증가시키는 방법
EA201300048A1 (ru) 2007-06-08 2013-09-30 ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН Система экспрессии гетерологичных и гомологичных целлюлаз
JP5731194B2 (ja) 2007-06-27 2015-06-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 発酵製品を生産するための方法
EP2175714A4 (en) 2007-07-10 2011-01-26 Monsanto Technology Llc TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS
US7819976B2 (en) * 2007-08-22 2010-10-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Biomass treatment method
MX2010002474A (es) 2007-09-07 2010-03-29 Danisco Us Inc Composiciones de celulasa completa fungica filamentosa mejoradas de beta-glucosidasa y metodos de uso.
EP2197893B1 (en) 2007-09-07 2013-07-24 Dyadic International, Inc. Novel fungal enzymes
EP2708602B1 (en) * 2007-10-03 2019-02-27 BP Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
JP5599104B2 (ja) 2007-10-12 2014-10-01 ダニスコ・ユーエス・インク 発酵微生物からの有機物質の生成を高める方法
MY174318A (en) 2007-12-12 2020-04-07 Novozymes As Enzymatic degradation of biomass substrates comprising mannan
SG191671A1 (en) 2007-12-13 2013-07-31 Danisco Us Inc Cultured cells that produce isoprene and methods for producing isoprene
CN101970471A (zh) 2007-12-19 2011-02-09 诺维信公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CA2716806A1 (en) 2008-02-29 2009-09-03 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Production and use of plant degrading materials
KR101768225B1 (ko) 2008-03-07 2017-08-14 다니스코 유에스 인크. 트리코데르마에서의 카탈라아제 발현
RU2536256C2 (ru) 2008-03-21 2014-12-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Композиция ферментной смеси для гидролиза смеси целлюлозных и гемицеллюлозных материалов (варианты) и способы ее использования (варианты)
WO2009132008A2 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Chromatin, Inc. Methods and materials for processing a feedstock
WO2009134878A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Danisco Us Inc. Swollenin compositions and methods of increasing the efficiency of a cellulase
WO2009149202A2 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Danisco Us Inc., Genencor Division Compositions and methods comprising cellulase variants with reduced affinity to non-cellulosic materials
EP2358872A2 (en) 2008-11-18 2011-08-24 Novozymes Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
DK2398889T3 (en) 2009-02-20 2018-07-30 Danisco Us Inc FERMENTATION BOUILLON FORMULATIONS
MX2011009009A (es) 2009-02-27 2011-09-15 Iogen Energy Corp Enzimas de celulosa resistentes a lignina.
AU2010253848C1 (en) 2009-05-29 2015-02-19 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
CN104862293A (zh) 2009-06-03 2015-08-26 丹尼斯科美国公司 具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体,及其用途
WO2010148148A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Codexis, Inc. β-GLUCOSIDASE VARIANTS
MX2012003091A (es) 2009-09-23 2012-04-30 Danisco Us Inc Enzimas de glicosil hidrolasa novedosas y usos de las mismas.
CN105316303B (zh) 2009-11-20 2019-05-31 丹尼斯科美国公司 具有改善的特性的β-葡萄糖苷酶I变体
CN107287250A (zh) * 2009-12-23 2017-10-24 丹尼斯科美国公司 提高同步糖化发酵反应效率的方法
US8647850B2 (en) * 2009-12-23 2014-02-11 E I Du Pont De Nemours And Company Process for simultaneous saccharification and fermentation for production of ethanol
US8721794B2 (en) 2010-04-28 2014-05-13 E I Du Pont De Nemours And Company Production of high solids syrup from lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth
US8906235B2 (en) * 2010-04-28 2014-12-09 E I Du Pont De Nemours And Company Process for liquid/solid separation of lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth
US8962295B2 (en) 2010-06-01 2015-02-24 California Institute Of Technology Stable, functional chimeric cellobiohydrolase class I enzymes
EP2397491A1 (en) 2010-06-21 2011-12-21 Technische Universität Wien LeaA from Trichoderma reesei
WO2012030845A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US8476048B2 (en) 2010-12-17 2013-07-02 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilizing zymomonas mobilis with improved ethanol production in biomass hydrolysate medium
RU2013146240A (ru) 2011-03-17 2015-04-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Ферменты гликозил-гидролазы и их применение для гидролиза биомассы
SG192098A1 (en) 2011-03-17 2013-08-30 Danisco Us Inc Method for reducing viscosity in saccharification process
RU2013146341A (ru) 2011-03-17 2015-04-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК Композиции целлюлазы и способы их применения для улучшенного превращения лигноцеллюлозной биомассы в ферментируемые сахара
WO2012154735A2 (en) 2011-05-10 2012-11-15 Danisco Us Inc. Thermostable carbonic anhydrases and methods of use thereof
WO2013028701A1 (en) 2011-08-22 2013-02-28 Codexis, Inc. Gh61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance gh61 activity
AU2012352763A1 (en) 2011-12-13 2014-04-24 Danisco Us Inc. Enzyme cocktails prepared from mixed cultures
EP2914717A1 (en) 2012-10-31 2015-09-09 Danisco US Inc. Beta-glucosidase from magnaporthe grisea
JP2015533293A (ja) 2012-10-31 2015-11-24 ダニスコ・ユーエス・インク 組成物及び使用方法
EP3290515A1 (en) 2012-12-12 2018-03-07 Danisco US Inc. Variants of cellobiohydrolases
BR112015029081A2 (pt) 2013-05-20 2017-09-19 Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologias Sa Célula hospedeira myceliophthora thermophila expressando uma enzima beta-xilosidase recombinante, enzima beta-xilosidase recombinante expressada por meio da mesma, composição, uso de célula hospedeira, enzima beta-xilosidase ou composição e métodos de produção de açúcares fermentescíveis e de produção de bioproduto a partir de biomassa
WO2015017256A1 (en) 2013-07-29 2015-02-05 Danisco Us Inc. Variant enzymes
CN105829530A (zh) 2013-12-04 2016-08-03 丹尼斯科美国公司 包含β-葡萄糖苷酶多肽的组合物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP5932648B2 (ja) 2016-06-15
EP2480660B1 (en) 2020-08-05
AU2016202018A1 (en) 2016-04-21
US20130177947A1 (en) 2013-07-11
EP2480660A2 (en) 2012-08-01
BR112012006571B1 (pt) 2024-02-06
JP2016174612A (ja) 2016-10-06
BR112012006571A8 (pt) 2018-10-02
WO2011038019A2 (en) 2011-03-31
CO6630115A2 (es) 2013-03-01
DK3296394T3 (da) 2020-12-21
EP3296394A1 (en) 2018-03-21
US10273465B2 (en) 2019-04-30
AU2010298308A1 (en) 2012-03-01
EP3296394B1 (en) 2020-11-04
DK2480660T5 (da) 2020-11-09
DK2480660T3 (da) 2020-11-02
CN102791853A (zh) 2012-11-21
US20190169585A1 (en) 2019-06-06
AU2017272287A1 (en) 2018-01-04
BR112012006571A2 (pt) 2015-09-08
IN2012DN01492A (uk) 2015-06-05
CA2774776A1 (en) 2011-03-31
US20160177279A1 (en) 2016-06-23
KR20120115206A (ko) 2012-10-17
CN102791853B (zh) 2015-08-12
BR122018015957B1 (pt) 2021-01-12
MX353237B (es) 2018-01-08
WO2011038019A3 (en) 2011-12-01
JP2013505722A (ja) 2013-02-21
RU2012116081A (ru) 2013-10-27
ZA201201147B (en) 2013-05-29
MX2012003091A (es) 2012-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA115219C2 (uk) Глікозилгідролазні ферменти і їх застосування
KR20140027154A (ko) 글리코실 가수분해효소 및 바이오매스 가수분해를 위한 그의 용도
EP2955221A1 (en) Talaromyces transformants
KR20150113170A (ko) 탄수화물 분해 폴리펩티드 및 이의 용도
EA021855B1 (ru) Штаммы talaromyces и ферментные композиции
CN106460020A (zh) 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
CA2709367A1 (en) Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EA023558B1 (ru) ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЙ ПОЛИПЕПТИД С АКТИВНОСТЬЮ β-ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА САХАРОВ ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО МАТЕРИАЛА
WO2009033071A2 (en) Novel fungal enzymes
BRPI0600409B1 (pt) processo de produção de etanol a partir de materiais celulósicos ou ligno-celulósicos
CN106488982A (zh) 酶组合物及其用途
CN103958672A (zh) Gh61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸
MX2013008766A (es) Celobiohidrolasa mutante.
CN103958675A (zh) 具有木聚糖酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN105861469A (zh) 具有纤维素分解增强活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN104870639A (zh) 具有纤维素分解增强活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
US20210171993A1 (en) Polysaccharide-oxidizing composition and uses thereof
CN108368530A (zh) β-葡糖苷酶及其用途
CN108884481A (zh) β-葡糖苷酶及其用途
CN103930438A (zh) 具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽和对其进行编码的多核苷酸
CN108368529A (zh) β-葡糖苷酶及其用途
BR102019023536A2 (pt) coquetel enzimático contendo celulases, xilanases e mono-oxigenases de polissacarídeos e sua aplicação na hidrólise de biomassa lignocelulósica
DK2450438T3 (en) The cellulase composition containing endoglucanases from two different types of micro-organisms
徐韻涵 Studies on mannan-degrading enzymes from termite symbionts and a filamentous fungus
CN103189496B (zh) 改进的真菌菌株