BR102019023536A2 - coquetel enzimático contendo celulases, xilanases e mono-oxigenases de polissacarídeos e sua aplicação na hidrólise de biomassa lignocelulósica - Google Patents

Abstract

A presente invenção está relacionada às áreas de biologia molecular, biologia celular, microbiologia aplicada e bioquímica e fornece um processo otimizado de produção de celulases, como endoglicanases e celobiohidrolases, β-glicosidases e hemicelulases, por meio do cultivo de um fungo selvagem da espécie Penicillium rolfsii, e um processo de produção de xilanases e de mono-oxigenases de polissacarídeos, por meio do cultivo de fungos leveduriformes geneticamente modificados (Komagataella phaffii). São abordados processos de produção de extratos enzimáticos contendo as enzimas celulases, xilanases e mono-oxigenases. Também são apresentadas enzimas com atividade celulolítica e hemicelulolítica capazes de converter celulose e hemicelulose, presentes em biomassa lignocelulósica pré-tratada, em monômeros fermentescíveis, tais como glicose e xilose. Adicionalmente, a presente invenção trata de um coquetel enzimático composto por enzimas versáteis, mais especificamente celulases, xilanases e mono-oxigenases de polissacarídeos, para hidrólise de bagaçao de cana-se-açúcar prétratado.

Description

COQUETEL ENZIMÁTICO CONTENDO CELULASES, XILANASES E MONO-OXIGENASES DE POLISSACARÍDEOS E SUA APLICAÇÃO NA HIDRÓLISE DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA Campo da invenção

[1] A presente invenção está relacionada às áreas de biologia molecular, biologia celular, microbiologia aplicada e bioquímica. A invenção fornece um coquetel enzimático compreendendo extrato fúngico e enzimas acessórias versáteis, as quais podem ser aplicadas em processos de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica. Adicionalmente, a invenção fornece vetores e microrganismos geneticamente modificados compreendendo sequências nucleotídicas codificadoras de enzimas xilanases e mono-oxigenases de polissacarídeos. A invenção também fornece um extrato enzimático fúngico rico em enzimas celulolíticas, além do meio de cultura e do processo para a produção desse extrato. Também é fornecido processo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica por meio da aplicação do coquetel enzimático. O extrato enzimático fúngico rico em enzimas celulolíticas pode ser aplicado individualmente. O extrato enzimático fúngico e as enzimas acessórias, no coquetel ou de forma individual, podem ser aplicados nos setores alimentício, agrícola, na indústria química, têxtil, papel e celulose, na produção de ração animal ou de biocombustíveis.

Estado da técnica

[2] A natureza recalcitrante da biomassa lignocelulósica exige duas etapas principais de processamento para a liberação de açúcares fermentescíveis: o pré-tratamento e a hidrólise enzimática. O pré-tratamento aumenta o acesso das enzimas que catalisam a liberação dos açúcares. As condições aplicadas durante a realização da etapa de prétratamento, apesar de disponibilizarem o acesso aos açúcares presentes na biomassa para conversão nas etapas posteriores do processo, produzem secundariamente substâncias inibidoras da ação das enzimas. O processo de hidrólise enzimática geralmente ocorre em temperaturas em torno de 50°C e pH 5. Para que coquetéis enzimáticos sejam eficazes na liberação de açúcares nas condições de processo citadas, é fundamental que contenham todas as enzimas necessárias para a liberação dos açúcares presentes na biomassa e que estas permaneçam ativas e resistentes à inibição durante todo o processo de hidrólise.

[3] A biomassa lignocelulósica é constituída principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. Em geral, a celulose é o constituinte mais abundante, correspondendo de 34 a 50% da massa seca, seguida pela hemicelulose (19 a 34%) e lignina (11 a 30%).

[4] Celulose, hemicelulose e lignina podem ser degradadas por uma variedade de enzimas, as quais podem ser produzidas por diferentes microrganismos, como por exemplo, fungos e bactérias. Entretanto, esse processo é lento devido à recalcitrância da biomassa e, em condições ambientais, pode durar semanas.

[5] A conversão de cada um dos principais componentes da biomassa em monômeros pode ser alcançada utilizando diferentes grupos de enzimas. Por exemplo, para a conversão de celulose são necessárias enzimas celulolíticas, como endoglicanases, celobiohidrolases e β-glicosidases; para converter hemicelulose são necessárias as enzimas xilanases, β-xilosidases, α-arabinofuranosidase, e acetil esterase; e para converter lignina são necessárias lignina peroxidases, manganês peroxidases, peroxidases versáteis e lacases. Além dessas, outras enzimas também podem ser utilizadas para aumentar a eficácia da liberação dos monômeros. Um exemplo é a mono-oxigenase de polissacarídeo (do inglês PMO - polysaccharide monooxygenase, ou LPMO - lytic polysaccharide monooxygenase), a qual atua clivando as regiões cristalinas das cadeias de celulose e de outros polissacarídeos por um mecanismo oxidativo. As mono-oxigenases de polissacarídeos também são comumente denominadas Auxiliary Activity (AA), e pertencem a famílias com diferentes especificidades de substratos (AA9, AA10, AA11, AA12, AA13, AA14, entre outras), conforme definido pela base de dados Carbohydrate-Active Enzymes database (CAZy; http://www.cazy.org) (LOMBARD, V; GOLACONDA RAMULU. H; DRULA, E; COUTINHO, PM; HENRISSAT, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res, 42 (Database issue) (2014), pp. D490-D495).

[6] Um único microrganismo pode secretar várias enzimas de uma mesma classe. Por exemplo, o fungo ascomiceto Trichoderma reesei (espécie mais utilizada industrialmente para produção de celulases) pode secretar cinco endoglicanases, duas celobiohidrolases e duas β-glicosidases. Cada uma das enzimas produzidas por um mesmo microrganismo apresenta propriedades particulares como temperatura e pH ótimos, estabilidade e suscetibilidade à inibição.

[7] No entanto, um único microrganismo, em sua forma selvagem, não é capaz de secretar todos os tipos de enzimas (celulases, hemicelulases e ligninases) em quantidades necessárias para conversão completa da biomassa lignocelulósica. Para isso, é necessário que diferentes enzimas originadas de diferentes microrganismos atuem juntas, de forma que o sistema enzimático global seja eficaz para a desconstrução da biomassa. Portanto, para o desenvolvimento de um coquetel enzimático comercial é necessário definir a combinação de enzimas capaz de desconstruir a biomassa vegetal, sejam estas enzimas isoladas, produzidas artificialmente, através de microrganismos geneticamente modificados ou de outra forma, ou produzidas naturalmente por diferentes microrganismos, sendo os respectivos extratos posteriormente misturados para alcançar a composição enzimática desejada. Além disso, essas enzimas devem ser estáveis e apresentar o melhor desempenho em condições de temperatura e pH próximos, além de outras condições reacionais adequadas para que o processo de hidrólise seja realizado com êxito.

[8] Geralmente, extratos enzimáticos comerciais são aplicados para a desconstrução de biomassa em condições operacionais relativamente brandas, por exemplo, valores de pH entre 4 e 6, e temperatura entre 40 e 60°C. Vale ressaltar que, a inativação de uma das enzimas pode inviabilizar todo o processo de hidrólise dos polímeros da biomassa. Portanto, é importante selecionar enzimas cujo tempo de meia vida nas condições operacionais estabelecidas industrialmente seja adequado. Assim, para o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos comerciais, a produção de enzimas com propriedades similares é fundamental, para complementar e/ou suplementar extratos enzimáticos basais a fim de atingir um processo de desconstrução de biomassa eficaz e eficiente.

[9] A conversão da celulose em glicose é possível por meio da ação das seguintes classes de enzimas: 1) Endoglicanases, que catalisam a quebra aleatória de ligações internas em cadeias de celulose, liberando oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização e gerando novos pontos para a ação de exoglicanases; 2) Exoglicanases, que catalisam a hidrólise de celulose cristalina a partir das extremidades redutoras ou não redutoras da celulose, liberando oligossacarídeos; 3) β-glicosidases, que catalisam a hidrólise de oligossacarídeos a glicose.

[10] As classes de enzimas que atuam na conversão de hemicelulose em xilose são: 1) β-1,4-endoxilanases, que catalisam a hidrólise de cadeias lineares dos resíduos de xilose e liberam xilo-oligossacarídeos; 2) β-1,4-xilosidases, que catalisam a hidrólise de xilo-oligossacarídeos liberando xilose; 3) Xiloglicanases, que catalisam a hidrólise de hemicelulose contendo cadeias formadas pelos monômeros de glicose e xilose, sendo algumas destas enzimas específicas para a cadeia principal, e outras que atuam tanto sobre a cadeia principal quanto sobre as ramificações da cadeia; 4) β-1,4- endomananases, que catalisam a hidrólise da cadeia de manose com mais de três resíduos; 5) β-1,4-manosidases, que catalisam a hidrólise de manobiose e manotriose, liberando manose. Outras enzimas que atuam sobre a hidrólise de hemicelulose são feruloil esterase, xilana esterase, α-4-metil-glicuronosidases, p-coumaroil esterase e αarabinofuranosidase.

[11] As enzimas envolvidas na despolimerização de lignina são: 1) Ligninaperoxidases, que catalisam a oxidação de compostos fenólicos, não fenólicos, aminas, éteres aromáticos e compostos policíclicos aromáticos. Essas enzimas promovem a quebra de ligações do tipo C-C e C-O-C; 2) Manganês peroxidases, que catalisam a oxidação de Mn2+ a Mn3+, o qual forma um complexo com ácidos alfa-hidróxi para oxidar compostos fenólicos e não fenólicos; 3) Peroxidases versáteis, que catalisam tanto a oxidação de Mn+2 quanto de compostos aromáticos fenólicos e não fenólicos; 4) Lacases, que catalisam a oxidação de compostos fenólicos (mono, di ou polifenólicos) de lignina reduzindo oxigênio a água. Outros exemplos de oxidoredutases envolvidas em reações da lignina são a álcool arílico oxidase, a glioxal oxidase, a álcool arílico desidrogenase, a superóxido dismutase e a quinona redutase.

[12] A conversão da biomassa lignocelulósica de forma rápida, assim como é exigido em processos industriais, além de um coquetel enzimático completo, estável e resistente à inibição, necessita de um pré-tratamento que aumente o acesso das enzimas à estrutura lignocelulósica. Entretanto, se por um lado o pré-tratamento aumenta o acesso para as enzimas, por outro, ele gera inibidores que interferem reversível ou irreversivelmente na ação dessas enzimas. Desta maneira, as enzimas que compõem um coquetel devem ser resistentes à inibição causada pelos produtos de degradação da biomassa gerados durante o pré-tratamento.

[13] Para eliminar a recalcitrância da biomassa lignocelulósica, vários tipos de prétratamento vêm sendo sugeridos, como tratamentos químicos, físicos ou combinações destes. Dependendo do tipo e da severidade deste procedimento, efeitos positivos e negativos sobre a hidrólise enzimática podem ocorrer.

[14] Além de resistentes à inibição causada pelos produtos de degradação da biomassa gerados durante o pré-tratamento, ainda há necessidade de se reduzir o custo de produção dessas enzimas e aumentar a quantidade de açúcar produzido por quantidade de proteína (enzima) utilizada no processo de hidrólise enzimática. De modo geral, a obtenção de enzimas com maior atividade catalítica e estabilidade e de novas proteínas acessórias pode facilitar o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos para diferentes tipos de biomassa e pré-tratamento. O desenvolvimento de misturas enzimáticas complexas tem sido considerado uma estratégia promissora devido ao fato de que os coquetéis comerciais disponíveis apresentam muitas limitações para aplicação em diferentes tipos de biomassa, resultando em perda de eficiência do processo de hidrólise.

[15] A presente invenção fornece um extrato enzimático fúngico, que sozinho ou combinado com enzimas acessórias compondo um coquetel enzimático possuem eficácia para a hidrólise de biomassa lignocelulósica pré-tratada por diferentes métodos, além de serem de baixo custo. A invenção também apresenta processo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica através da aplicação do coquetel acima descrito. O extrato enzimático fúngico sozinho ou combinado com enzimas, compondo um coquetel enzimático, podem ser aplicados nos setores alimentício, agrícola, na indústria química, têxtil, papel, na produção de ração animal ou de biocombustíveis. Adicionalmente, a invenção fornece vetores e microrganismos geneticamente modificados compreendendo sequências nucleotídicas codificadoras de enzimas xilanases e mono-oxigenases de polissacarídeos. Adicionalmente é descrito meio de cultura, processo de produção e extrato fúngico rico em enzimas celulolíticas.

Sumário da invenção

[16] Em um primeiro aspecto, a presente invenção está relacionada com um coquetel enzimático que compreende extrato enzimático fúngico e enzimas acessórias selecionadas do grupo consistindo de xilanases, mono-oxigenases de polissacarídeos e combinação destas.

[17] Em outro aspecto a invenção apresenta vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar proteínas correspondentes a xilanases selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinações destas. Em um aspecto relacionado, a invenção descreve vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeo com especificidade de substrato classificadas nas famílias AA9 ou AA10. Em um aspecto adicional, a invenção descreve vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar proteínas correspondentes a mono-oxigenases de polissacarídeos selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32 e combinação destas.

[18] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um método de obtenção de microrganismo para expressão de xilanases e mono-oxigenases de polissacarídeos recombinantes compreendendo as etapas de: (a) síntese de uma construção gênica e sua clonagem em vetor de expressão, (b) inserção do plasmídeo recombinante sintetizado em células de Escherichia coli, (c) seleção e cultivo de um transformante, (d) extração e linearização do DNA plasmidial, (e) precipitação e inserção do DNA plasmidial linearizado nas células de microrganismo hospedeiro para produção da proteína recombinante. Em outro aspecto, a invenção descreve um microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de xilanases selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 e combinação destas. Adicionalmente, a invenção descreve, microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de xilanases compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas. Em um aspecto relacionado, a invenção descreve microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeos com especificidade de substrato classificadas nas famílias AA9 ou AA10. Adicionalmente, o microrganismo geneticamente modicado é caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de mono-oxigenases de polissacarídeos selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31 e combinação destas. A invenção ainda inclui, microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeos compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32 e combinação destas.

[19] Em um aspecto relacionado, a presente invenção descreve o uso do coquetel enzimático da presente invenção na hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica.

[20] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um processo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica que utiliza o coquetel enzimático descrito anteriormente. O dito processo compreende as seguintes etapas:

• (a) adicionar a um reator, biomassa pré-tratada, solução tamponante e coquetel enzimático da presente invenção mantendo uma razão sólido:líquido de 1:2 a 1:20 e pH entre 3,0 a 8,0;
• (b) aquecer o reator da etapa (a) até a temperatura de 25 a 60°C;
• (c) agitar o conteúdo do recipiente em velocidade entre 100 a 400 rpm por um período de 12 a 120 h;
• (d) resfriar o reator até a temperatura ambiente e interromper a agitação do conteúdo;
• (e) coletar ou transferir o conteúdo contendo a biomassa lignocelulósica hidrolisada.

[21] Adicionalmente, a presente invenção também apresenta meio de cultura para cultivo do fungo Penicillium sp caracterizado por compreender água; bagaço de canade-açúcar pré-tratado por explosão a vapor; farelo de trigo; uréia; sulfato de amônio; fosfato de potássio dibásico; sulfato de magnésio; polietilenoglicol 6000 e sulfato de cobre. Em um aspecto relacionado, a invenção apresenta um processo de obtenção de extrato enzimático fúngico rico em enzimas celulolíticas caracterizado por compreender as etapas de:

• (a) cultivar uma alíquota estoque de Penicillium sp no meio de cultura sólido por 5 a 15 dias a 28°C para crescimento e esporulação;
• (b) fornecer um meio de cultura conforme definido anteriormente;
• (c) adicionar ao meio de cultura da etapa (b) discos extraídos do cultivo da etapa (a) contendo conídios em uma proporção de 8 discos para cada 100 mL de meio;
• (d) cultivar a cultura fúngica obtida em (c) por 3-8 dias, sob agitação orbital constante de 100 a 300 rpm, na faixa de temperatura de 30 a 34°C;
• (e) centrifugar o cultivo da etapa (d) para obtenção de sobrenadante essencialmente livre de partículas sólidas suspensas.

[22] Por fim, a invenção descreve um extrato enzimático fúngico de Penicillium rolfsii rico em enzimas celulolíticas caracterizado por ser produzido pelo processo acima descrito.

[23] Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tornarão evidentes, e a invenção será mais bem compreendida a partir da seguinte descrição detalhada, que prossegue com referência às figuras anexas.

Listagem de figuras

[24] Figura 1. Análise eletroforética em gel de agarose 1% do DNA plasmidial das colônias de Escherichia coli DH5α contendo os cassetes de expressão pGAPZαA: pGAPZαA GH10-3, pGAPZαA GH11-2 e pGAPZαA GH11-3, intactos ou submetidos à digestão com as enzimas de restrição XbaI e EcoRI que excisam os insertos, que possuem insertos com tamanho de 1.068 pb para GH10-3, 978 pb para GH11-2 e 630 pb para GH11-3. MM - marcador molecular GeneRuler 1Kb plus (Thermo Fisher Scientific).

[25] Figura 2. Análise eletroforética em gel de agarose 1% do produto da PCR de colônias de Komagataella phaffii X-33 transformadas com a construção pGAPZαA F43 GH11-3 para expressão da xilanase F43GH11-3 usando os primers 3’AOX (SEQ ID NO 33) e 5’pGAP (SEQ ID NO 34). Os clones 3 e 4 apresentaram o fragmento esperado de 1.118 pb. O controle positivo está indicado como Midi GH11-3. MM - marcador molecular GeneRuler 1Kb plus (Thermo Fisher Scientific).

[26] Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1% mostrando em (A) - resultado da extração de plasmídeo recombinante (pPICZB-TrCel61A) (poços 1 e 2). (B) - Perfil de restrição do plasmídeo pPICZB-TrCel61A obtido após clivagem com as endonucleases EcoRI e XbaI para confirmar a presença do gene de interesse. As setas indicam o tamanho esperado do fragmento de DNA correspondente ao gene. M - Marcador de peso molecular GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

[27] Figura 4. Eletroforese em gel de agarose 1% mostrando o resultado da PCR de colônia de transformantes de Komagataella phaffii X-33 contendo o gene codificador da LPMO TrCel61A de Trichoderma reesei. Foram utilizados os primers comerciais 5´AOX (SEQ ID NO 35) e 3´AOX (SEQ ID NO 33) para confirmar a integração dos genes no genoma de Komagataella phaffii X-33. M - Marcador de peso molecular GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

[28] Figura 5. Exemplo de análise por SDS-PAGE do sobrenadante do cultivo (após 96 horas) de transformantes de Komagataella phaffii X-33 contendo o plasmídeo recombinante pPICZB-TrCel61A. Poços 1 a 6: transformantes denominados 19, 20, 21, 22, 23 e 24. pPICZB: transformante denominado 1, contendo o vetor pPICZB vazio (controle). M - Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standard 250 a 10 kDa (BioRad).

[29] Figura 6. Representação do aumento da atividade celulolítica total (FPAse) em extratos de Penicillium rolfsii F1880 preparados com o uso do meio de cultura da presente invenção.

[30] Figura 7. Mostra a quantidade de glicose (Figura 7 esquerda) e de xilose (Figura 7 direita) liberadas quando bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor é hidrolisado somente com o extrato enzimático de Penicillium rolfsii F1880 (F1880), ou com extrato de Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com as enzimas acessórias (EA) do tipo xilanase e mono-oxigenase de polissacarídeos (LPMO) (F1880+EA), ou com extrato de Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com xilanase inativada e LPMO inativada (F1880+EA.IN), ou com extrato enzimático comercial Cellic CTec 3 (Cellic3).

[31] Figura 8. Mostra a quantidade de glicose liberada quando bagaço de cana-deaçúcar explodido a vapor é hidrolisado somente com o extrato enzimático de Penicillium rolfsii F1880 (F1880), ou com extrato de Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com a LPMO recombinante TrCel61A (F1880+LPMO), ou com extrato de Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com albumina do soro bovino, BSA (F1880+BSA).

[32] Figura 9. Mostra as quantidades de glicose e xilose liberadas após 48 h de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor, empregando apenas o extrato enzimático de Penicillium rolfsii F1880, e o extrato de Penicillium rolfsii F1880 adicionado de xilanases recombinantes F43-K GH 10-3 e F43-K GH 10-3 inativada.

[33] Figura 10. Demonstra o efeito da razão sólido:líquido sobre o rendimento de hidrólise enzimática de celulose, mantendo a razão enzima:biomassa constante de 15 FPU/g de biomassa (base seca).

Descrição detalhada da invenção

[34] Exceto quando especificamente definido de outra maneira, todos os termos técnicos ou científicos aqui utilizados apresentam o mesmo significado usualmente entendido por um indivíduo técnico no assunto ao qual pertence a presente invenção.

[35] A hidrólise enzimática dos biopolímeros contidos na biomassa é uma das etapas da conversão de biomassa lignocelulósica em combustíveis e produtos químicos renováveis por processos fermentativos. Devido à baixa eficiência e ao alto custo das enzimas usadas atualmente, especialmente quando são considerados os diferentes tipos de biomassa e de pré-tratamento aplicados, a busca por novas composições enzimáticas é um dos principais desafios para viabilizar essa rota de processamento de biomassa lignocelulósica para diferentes fins industriais.

[36] De acordo com a presente invenção “biomassa vegetal lignocelulósica” ou apenas “biomassa lignocelulósica” compreende qualquer tipo de planta, a saber: biomassa herbácea; plantas C4, como por exemplo aquelas pertencentes aos gêneros Lolium, Spartina, Panicum, Miscanthus e combinação dos mesmos; cana-de-açúcar, incluindo bagaço (oriundo de moenda e/ou difusor) e palha; palhas de cereais como trigo, arroz, centeio, cevada, aveia, milho e similares (por exemplo, capim-elefante “switchgrass”); madeira; troncos e talos de bananeira; cactáceas; capim, aqui compreendido como incluindo espécies da família Poaceae, também conhecidas como gramas ou relvas; forrageiras; e combinações das mesmas. Além disso, materiais lignocelulósicos podem ainda compreender papelão, serragem, jornal e resíduos agroindustriais ou municipais similares.

[37] Em um primeiro aspecto, a invenção está relacionada com um coquetel enzimático que compreende extrato enzimático fúngico e enzimas acessórias selecionadas do grupo consistindo de xilanases, mono-oxigenases de polissacarídeos e combinação destas. Esta composição do coquetel enzimático apresentou uma liberação de açúcares fermentescíveis a partir de biomassa lignocelulósica superior ao observado por celulases e hemicelulases obtidas a partir do cultivo de fungos selvagens.

[38] Na presente invenção, o termo “extrato enzimático fúngico” ou “extrato enzimático fúngico bruto” refere-se ao sobrenadante do cultivo em meio de cultura líquido de um fungo, obtido após centrifugação do cultivo para eliminar as matérias sólidas em suspensão.

[39] As “enzimas acessórias” referidas na presente invenção incluem polipeptídeos isolados, proteínas essencialmente puras, polipeptídeos e / ou proteínas produzidas por meio de síntese química, por meio de combinação de síntese biológica e química, e por meio de metodologia de DNA recombinante. Na presente invenção, essas “enzimas acessórias” incluem xilanases e mono-oxigenases de polissacarídeo. Essas “enzimas acessórias”, com extratos enzimáticos fúngicos, ou com outras enzimas, como coquetéis enzimáticos comerciais, apresentam atividade enzimática útil na hidrólise da biomassa lignocelulósica.

[40] As enzimas acessórias da presente invenção foram isoladas e caracterizadas em relação a atividade enzimática, tendo as suas sequências de aminoácidos (polipeptídeo) e nucleotídeos (polinucleotídeo) caracterizadas utilizando os procedimentos descritos nos Exemplos e podem ser produzidas utilizando técnicas de laboratório para cultivo de microrganismos, purificação de proteínas, metodologia de DNA recombinante e combinação destas. As técnicas para cultivo de microrganismos são amplamente conhecidas por um técnico na arte a qual pertence a presente invenção, estando aqui contempladas sem limitações. Dentre as técnicas conhecidas para purificação de proteínas estão incluídas, sem limitação, extração por salinificação, imunoprecipitação, cromatografia em coluna, cromatografia líquida em alta pressão ou eletroforese.

[41] A presente invenção também contempla sequências de aminoácidos análogas às sequências de aminoácidos das enzimas acessórias da presente invenção. “Sequências de aminoácidos análogas” se referem a sequências de aminoácidos com similaridade suficiente a qualquer uma das sequências das enzimas acessórias descritas na presente invenção de forma a possuírem atividade enzimática equivalente ou substancialmente idêntica. Os exemplos de tais modificações capazes de gerarem sequências de aminoácidos análogas incluem adições, deleções e substituições de aminoácidos das enzimas acessórias descritas na presente invenção. Preferencialmente, as modificações são conservativas, ou seja, são modificações que não afetam significativamente as propriedades enzimáticas e físico-químicas da sequência original, de forma que um perito na arte da química de peptídeos esperaria que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo não fossem substancialmente alteradas. Em geral, no caso de substituição, os grupos de aminoácidos a seguir representam alterações conservativas: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; e (5) phe, tyr, trp, his. As modificações podem ainda ou alternativamente, conter a deleção ou a adição de aminoácidos que possuem influência mínima sobre as propriedades enzimáticas, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma sequência sinal (ou líder) na extremidade N-terminal da proteína que direciona a sua transferência entre os espaços intracelulares ou a sua secreção para o meio extracelular. O polipeptídeo também pode ser conjugado com um ligante ou outra sequência para facilitar a síntese, a purificação ou a identificação do polipeptídeo (por exemplo cauda de poli-histidina) ou para aumentar a ligação do polipeptídeo com um suporte sólido. Em um aspecto da invenção, as variações dos polipeptídeos exibem preferencialmente pelo menos 70% de similaridade com as sequências aqui descritas. Mais preferencialmente, exibem pelo menos 90% e ainda mais preferencialmente exibem pelo menos 95% de similaridade as sequências aqui apresentadas. Sequências homólogas às apresentadas e com similaridade suficiente a qualquer uma das sequências das enzimas acessórias descritas na presente invenção de forma a possuírem atividade enzimática equivalente ou substancialmente idêntica, também estão contempladas na presente invenção.

[42] Também estão incluídos na presente invenção, os polipeptídeos análogos que exibem atividade enzimática melhorada, produzidos através de mutação de um ou mais resíduos de aminoácidos ou ácidos nucléicos das proteínas e sequências codificadoras das proteínas aqui descritas. Tais mutações podem ser realizadas utilizando os métodos descritos aqui e aqueles conhecidos na arte. Outras formas de polipeptídeos abrangidas pela presente invenção incluem aquelas que são “funcionalmente equivalentes”. Esse termo, como utilizado aqui, refere-se a qualquer sequência de nucleotídeo e seu aminoácido codificado, que imita a atividade enzimática dos polipeptídeos e dos seus domínios funcionais descritos na presente invenção.

[43] “Percentual ou porcentagem de identidade" se refere à quantidade de nucleotídeos ou de aminoácidos idênticos e em uma mesma posição de duas sequências nucleotídicas ou proteicas alinhadas e comparadas entre si. Como utilizado aqui, "percentual ou porcentagem de similaridade" se refere à quantidade de nucleotídeos ou de aminoácidos similares ou conservativos entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos, respectivamente (por exemplo, os aminoácidos glutamato e aspartato são considerados similares, uma vez que ambos são acídicos).

[44] A presente invenção também contempla “variações ou modificações” das sequências nucleotídicas codificadoras das enzimas acessórias descritas pela invenção. Uma "variação ou modificação" de nucleotídeo é uma sequência que difere da sequência de nucleotídeos citada por possuir uma ou mais deleções, substituições ou adições de nucleotídeos, mantendo similaridade suficiente a qualquer uma das sequências nucleotídicas codificadoras das enzimas acessórias descritas na presente invenção de forma a possuírem atividade enzimática equivalente ou substancialmente idêntica. As variações de nucleotídeos podem ser variações alélicas que ocorrem naturalmente ou variações que não ocorrem naturalmente, como por exemplo variações nucleotídicas relacionadas à otimização de códon para melhor expressão da proteína recombinante no organismo hospedeiro, o acréscimo ou deleção de sequências codificadoras de peptídeos de sinalização, ou ainda, modificações silenciosas, as quais não interferem na codificação da sequência de aminoácidos das enzimas acessórias da presente invenção, entre outros. Tais variações de sequências de nucleotídeos se hibridizarão geralmente com a sequência de nucleotídeos citadas em um escopo preferido da presente invenção sob condições estringentes. Em uma modalidade, "condições estringentes" se refere à pré-lavagem em uma solução de 6x SSC, 0,2% de SDS; hibridização a 65°C, 6x SSC, 0,2% de SDS durante a noite; seguida por duas lavagens de 30 minutos cada em lx SSC, 0,1% de SDS a 65°C e duas lavagens de 30 minutos cada em 0,2x SSC, 0,1% de SDS a 65°C.

[45] Em um aspecto da invenção, as variações dos nucleotídeos exibem preferencialmente pelo menos 70% de similaridade com as sequências aqui descritas. Mais preferencialmente, exibem pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente exibem pelo menos 90% e ainda mais preferencialmente exibem pelo menos 95% de similaridade das sequências aqui apresentadas. Sequências homólogas às apresentadas e com similaridade suficiente de forma a codificarem polipeptídeos com atividade enzimática equivalente ou substancialmente idêntica às enzimas acessórias aqui descritas também estão contempladas na presente invenção.

[46] As composições e os métodos da presente invenção também abrangem variações, modificações e sequências de aminoácidos análogas aos polipeptídeos e polinucleotídeos descritos como um escopo preferido da presente invenção.

[47] “Enzimas celulolíticas” referem-se às enzimas que apresentam atividade enzimática capaz de degradar a celulose, presente na biomassa lignocelulósica e convertê-la em glicose.

[48] “Atividade celulolítica” ou “atividade enzimática celulolítica total” refere-se à atividade enzimática de enzimas capazes de degradar a celulose da biomassa lignocelulósica e convertê-la em glicose. A atividade celulolítica total pode ser medida por diferentes metodologias e ser representada por diferentes unidades de medida. O ensaio de FPAse, conforme protocolo padronizado descrito no método clássico proposto pela International Union of Pure and Applied Chemistry - IUPAC (GHOSE, T.K. (1987) Measurement of Cellulase Activities. Pure & Appl. Chem. 59: 257-268), o qual emprega papel de filtro como substrato da reação, é uma metodologia amplamente aceita para medir a atividade celulolítica total de uma amostra, já que a celulose do papel de filtro necessita da atividade de 3 enzimas para ser hidrolisada (endoglicanases, exoglicanases e β-glicosidases). A atividade celulolítica total, geralmente, é apresentada como FPU/mL do extrato enzimático, sendo FPU as iniciais para Filter Paper Unit ou, Unidades em Papel de Filtro, em português, que representa a quantidade em micromol de açúcar redutor total liberado por minuto (FPU) por mL do extrato enzimático. O açúcar redutor total (ART) liberado pode incluir celobiose, xilose e oligossacarídeos, entre outros, os quais são capazes de reagir com ácido dinitrosalicílico (DNS). No caso de hidrólise de celulose, é assumido que o ART é constituído majoritariamente por glicose.

[49] Em particular, as xilanases presentes no coquetel enzimático compreendem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas. Sequências homólogas, variações e sequências de aminoácidos análogas às sequências das xilanases da presente invenção e que mantenham atividade enzimática idêntica ou equivalente estão contempladas no escopo da presente invenção. Dentre essas modificações estão alterações realizadas nas extremidades N e / ou C terminal que facilitem a purificação das enzimas ou a sua solubilidade nas soluções utilizadas nas reações de hidrólise enzimática. Em um aspecto particular, a xilanase é caracterizada por compreender sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 09 e SEQ ID NO 14.

[50] Em um aspecto relacionado, as xilanases são obtidas a partir de qualquer sequência nucleotídica capaz de codificar as enzimas acima descritas. Modificações nas sequências nucleotídicas necessárias para otimizar a sua expressão no organismo hospedeiro escolhido para produção das enzimas recombinantes como por exemplo otimização de códons, retirada de peptídeo sinal quando presente, além da adição de cauda de histidina e de sítios de enzimas de restrição, também estão contempladas no escopo da invenção. Em um escopo preferido, as xilanases são obtidas a partir das sequências nucleotídicas selecionadas de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 e SEQ ID NO 8 e combinação destas. Sequências homólogas e outras variações e modificações das sequências nucleotídicas definidas como preferidas também estão contempladas pela invenção, desde que codifiquem sequência polipeptídica similar o suficiente para manter atividade enzimática idêntica ou equivalente às enzimas descritas na invenção. Em um aspecto particular, a xilanase é obtida a partir da SEQ ID 06.

[51] Em uma concretização preferencial, as xilanases são provenientes do fungo do gênero Cladosporium. Preferencialmente, as xilanases usadas na presente invenção são provenientes do fungo da espécie Cladosporium cladosporioides. Em uma concretização ainda mais preferencial, as xilanases são provenientes do fungo da linhagem Cladosporium cladosporioides F43.

[52] Em um aspecto da invenção, as mono-oxigenases de polissacarídeos contidas no coquetel enzimático compreendem enzimas com especificidade de substrato classificadas nas famílias AA9 ou AA10. Em uma concretização preferencial, as monooxigenases de polissacarídeos compreendem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30 e SEQ ID NO 32 e combinação destas. Sequências homólogas, variações e sequências de aminoácidos análogas às sequências das mono-oxigenases de polissacarídeos da presente invenção e que mantenham atividade enzimática idêntica ou equivalente estão contempladas no escopo da presente invenção. São exemplos não limitantes de variações que não afetam a atividade enzimática das mono-oxigenases, modificações realizadas nas extremidades N e / ou C terminal que facilitem a purificação das enzimas ou a sua solubilidade nas soluções utilizadas nas reações de hidrólise enzimática, entre outras. Em um aspecto particular, a mono-oxigenase de polissacarídeo é caracterizada por compreender a SEQ ID NO 18.

[53] Em um aspecto relacionado, as mono-oxigenases de polissacarídeos são obtidas a partir de qualquer sequência nucleotídica capaz de codificar as enzimas recombinantes acima descritas. Modificações nas sequências nucleotídicas necessárias para otimizar a expressão das enzimas no organismo hospedeiro escolhido para produção recombinante como por exemplo otimização de códons, retirada de peptídeo sinal quando presente, além da adição de cauda de histidina e de sítios de enzimas de restrição, também estão contempladas no escopo da invenção. Em uma concretização ainda mais preferencial, as mono-oxigenases de polissacarídeos recombinantes são obtidas a partir das sequências nucleotídicas selecionadas de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29 e SEQ ID NO 31 e combinação destas. Sequências homólogas e outras variações e modificações das sequências nucleotídicas definidas como preferidas também estão contempladas, desde que codifiquem sequências polipeptídicas similares o suficiente para manter atividade enzimática idêntica ou equivalente às enzimas descritas na invenção. Em um aspecto particular, a mono-oxigenase de polissacarídeo é obtida a partir de SEQ ID 17.

[54] Em um aspecto relacionado, o coquetel enzimático é caracterizado por o extrato enzimático fúngico ser obtido do cultivo de fungo em meio de cultura que compreende: (a) bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor; (b) farelo de trigo; (c) uréia; (d) sulfato de amônio; (e) fosfato de potássio dibásico; (f) polietilenoglicol 6000; (g) sulfato de cobre. Preferivelmente, o extrato fúngico é obtido do cultivo de fungo em meio de cultura que compreende: (a) bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor em concentrações na faixa de 20 a 40 g/L; (b) farelo de trigo em concentrações na faixa de 5 a 15 g/L; (c) uréia em concentrações na faixa de 0,30 a 1,00 g/L; (d) sulfato de amônio em concentrações na faixa de 1,30 a 1,80 g/L; (e) fosfato de potássio dibásico em concentrações na faixa de 1,00 a 5,00 g/L; (f) polietilenoglicol 6000 em concentrações na faixa de 1,00 a 2,00 g/L; (g) sulfato de cobre em concentrações na faixa de 1,00 a 3,00 mg/L.

[55] Em um aspecto adicional, o cultivo do fungo é realizado na faixa de temperatura de 30-34°C, por um período de 3 a 8 dias, com agitação orbital constante de 100 a 300 rpm. Em uma concretização, o extrato enzimático do fungo é obtido pelo processo de produção de extrato fúngico conforme descrito pela presente invenção.

[56] Em uma concretização preferencial, o extrato enzimático fúngico é obtido do cultivo de fungo do gênero Penicillium. Em uma concretização mais preferencial, o fungo é Penicillium rolfsii. Em uma concretização ainda mais preferencial, o fungo é da linhagem Penicillium rolfsii F1880. Em uma concretização ainda mais preferencial, o fungo Penicillium rolfsii é da cepa depositada na Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) sob o código de acesso RGM 2791.

[57] Em um aspecto, o coquetel enzimático da presente invenção compreende carga enzimática definida para 1 (hum) grama de biomassa seca de:

• (a) 5 a 45 FPU do extrato do fungo Penicillium rolfsii;
• (b) 1 a 20 mg de proteína de mono-oxigenase de polissacarídeo;
• (c) 1000-1500 UI de xilanase.

[58] Mais preferencialmente, a carga enzimática do extrato de Penicillium rolfsii é de 10 a 20 FPU/g de biomassa (base seca). Em uma concretização ainda mais preferencial, a carga enzimática de mono-oxigenase de polissacarídeo é de 5 a 15 mg de proteína/g de biomassa (base seca). Em uma concretização ainda mais preferencial, a carga enzimática de xilanase é de 1200 a 1400 UI/g de biomassa (base seca). Ainda como um aspecto preferido, o extrato enzimático é obtido do fungo da linhagem Penicillium rolfsii F1880.

[59] Em uma modalidade, a presente invenção inclui vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos e suas variações que codificam as moléculas de polipeptídeos, suas sequências análogas e variações conforme descritas aqui. As células hospedeiras podem ser qualquer célula incluindo, por exemplo, a bactéria Escherichia coli, leveduras e outras. A presente invenção inclui adicionalmente sondas que se hibridizam sob condições de estringência com as moléculas de ácidos nucléicos descritas aqui, além de sequências de iniciadores de transcrição, as quais podem ser utilizadas para amplificação das sequências aqui descritas.

[60] Para fins da presente invenção, os vetores são compreendidos como qualquer entidade celular ou molecular que carrega nucleotídeos e outras sequências nucleotídicas acessórias para transferência para e/ou modificação de sequências de nucleotídeos de um organismo/célula “hospedeira”. Em geral são elementos genéticos extra cromossômicos, com tamanhos variados e que apresentam mecanismos próprios de replicação, além de elementos regulatórios que possibilitam a transferência e/ou integração das sequências nucleotídicas no organismo hospedeiro, e/ou a sua expressão. São exemplos não limitantes de vetores os plasmídeos bacterianos, plasmídeos de expressão, plasmídeos de clonagem, vírus, partículas virais, vetores lineares, entre outros. Os vetores adequados para uso em células eucarióticas e procarióticas são conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente ou são preparados por um perito na arte. Vetores adicionais também podem ser encontrados, por exemplo, em Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocol, 1994) e em Sambrook e outros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2- ED. (1989). Preferivelmente, a presente invenção contempla vetores de clonagem, para o isolamento, caracterização e replicação das sequências de nucleotídeos de interesse e vetores de expressão, utilizados para a inserção (integração) dessas sequências em organismos hospedeiros, para sua produção recombinante.

[61] Em uma modalidade, a invenção fornece vetores compreendendo uma ou mais das sequências nucleotídicas descritas na presente invenção. Adicionalmente às sequências da presente invenção, sequências de nucleotídeos que codificam moléculas capazes de serem utilizadas para marcação e seleção das células transformadas / transfectadas estão contempladas nos vetores, como por exemplo, sequências codificadoras de genes de resistência a antibiótico.

[62] Em um aspecto da invenção, é apresentado um vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais xilanases compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas. Preferivelmente, o vetor é caracterizado por as sequências nucleotídicas compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 e combinação destas. Diferentes tipos de vetores são incluídos dentro do escopo da presente invenção e são amplamente conhecidos por um técnico no assunto.

[63] Adicionalmente, a invenção descreve um vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais monooxigenases de polissacarídeos com especificidade de substrato classificadas nas famílias AA9 ou AA10. Preferivelmente, a invenção descreve um vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeos compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30 e SEQ ID NO 32 e combinação destas. Em um aspecto preferido, o vetor é caracterizado por as sequências nucleotídicas compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29 e SEQ ID NO 31 e combinação destas.

[64] Em uma modalidade, a presente invenção abrange células hospedeiras transformadas com os vetores descritos anteriormente. As sequências de ácidos nucléicos podem ser inseridas em um vetor que pode, opcionalmente, se replicar e/ou se integrar em uma célula hospedeira através de métodos conhecidos. Os exemplos de métodos adequados de transfecção ou de transformação das células hospedeiras incluem a precipitação com fosfato de cálcio, o choque térmico, a eletroporação, a microinjeção, a infecção, a lipofecção e a captação direta. "Transformação" ou "transfecção" como utilizado aqui se refere à aquisição de características genéticas novas ou alteradas através da incorporação de sequências nucleotídicas adicionais, por exemplo, ADN (ácido desoxirribonucleico). A "expressão" da informação genética de uma célula hospedeira é um termo da arte que se refere à transcrição direcionada do DNA para gerar RNA (ácido ribonucleico) que é traduzido em um polipeptídeo. Os métodos para a preparação de tais células hospedeiras recombinantes e para a incorporação dos ácidos nucléicos estão descritos em maiores detalhes em Sambrook e outros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição (1989) e em Ausubel e outros, "Current Protocols in Molecular Biology" (1992), por exemplo. A célula hospedeira contendo o vetor é então mantida sob condições adequadas para a expressão e para a recuperação do polipeptídeo da presente invenção.

[65] A invenção ainda prevê um método de obtenção de microrganismo geneticamente modificado compreendendo as etapas de (a) síntese de uma construção gênica e sua clonagem em vetor de expressão, (b) inserção do vetor recombinante sintetizado em (a) em células de Escherichia coli, (c) seleção e cultivo de um transformante, (d) extração e linearização do vetor de expressão, (e) precipitação e inserção do vetor linearizado nas células do microrganismo hospedeiro para produção da proteína recombinante. A inserção de moléculas de DNA nas etapas (b) e (e) pode ser realizada por meio de eletroporação.

[66] Preferencialmente, no método de obtenção de microrganismo geneticamente modificado, a etapa (a) compreende uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de uma ou mais xilanases compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas. Preferivelmente, as sequências nucleotídicas da etapa (a) são caracterizadas por compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 e combinação destas.

[67] Alternativamente e ainda em uma modalidade preferencial, a etapa (a) do método acima escrito compreende uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de mono-oxigenase de polissacarídeo compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30 e SEQ ID NO 32 e combinação destas. Preferivelmente, o microrganismo é caracterizado por as sequências nucleotídicas compreenderem uma ou mais sequências nucleotídicas codificadora de mono-oxigenases de polissacarídeo selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31 e combinação destas.

[68] Preferencialmente, o método descrito é aplicado para obtenção de fungo geneticamente modificado. Em uma aplicação mais preferencial, o microrganismo geneticamente modificado ao qual o método é aplicado pertence à espécie Komagataella phaffii (anteriormente classificado como Pichia pastoris), o qual também é previsto na presente invenção.

[69] Em outro aspecto, a invenção descreve um microrganismo geneticamente modificado que compreende uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de xilanases compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas. Preferivelmente, o microrganismo é caracterizado por as sequências nucleotídicas compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 e combinação destas. Os métodos para geração dos microrganismos transgênicos são aqueles descritos no estado da técnica e conhecidos por um técnico no assunto.

[70] Em um aspecto relacionado, a invenção descreve um microrganismo geneticamente modificado que compreende uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeos compreendendo enzimas com especificidade de substrato classificadas nas famílias AA9 ou AA10. Em um aspecto preferido, a invenção descreve um microrganismo geneticamente modificado que compreende uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeos compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30 e SEQ ID NO 32 e combinação destas. Preferivelmente, o microrganismo é caracterizado por as sequências nucleotídicas compreenderem uma sequência nucleotídica codificadora de mono-oxigenase de polissacarídeo selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29 e SEQ ID NO 31 e combinação destas.

[71] Preferencialmente, as células hospedeiras empregadas são bactérias e fungos leveduriformes. Ainda mais preferencialmente, as células hospedeiras utilizadas para clonagem das sequências de nucleotídeos descritas na presente invenção são Escherichia coli. Adicionalmente e ainda em uma modalidade preferida, as células hospedeiras utilizadas para expressão das proteínas recombinantes são Komagataella phaffii ou Saccharomyces cerevisiae.

[72] Preferencialmente, os referidos microrganismos geneticamente modificados pertencem à espécie Komagataella phaffii. Em um aspecto relacionado, os microrganismos geneticamente modificados são obtidos por meio de método de obtenção da presente invenção.

[73] Em um aspecto particular da presente invenção, as enzimas acessórias aqui descritas são produzidas de forma recombinante utilizando uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, que foi inserida em um vetor de expressão. Os polipeptídeos recombinantes podem ser preparados partindo de uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas pelos peritos comuns na arte. Por exemplo, os sobrenadantes provenientes de sistemas de hospedeiro/vetor adequados que secretam a proteína recombinante no meio de cultura podem ser primeiramente centrifugados para separação da matéria sólida em suspensão, como por exemplo das células do hospedeiro, e alternativamente concentrados utilizando, por exemplo, um filtro disponível comercialmente. Após a centrifugação ou após a concentração, o extrato ou sobrenadante obtido pode ser diretamente utilizado em reações de hidrólise enzimática ou então pode ser aplicado em uma matriz de purificação adequada tal como uma matriz de afinidade ou uma resina de troca iônica. Adicionalmente, a depender da pureza desejada para a proteína recombinante, uma ou mais etapas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (do inglês “HPLC”) em fase inversa podem ser empregadas para purificação. Qualquer um de uma variedade de vetores de expressão conhecidos pelos peritos comuns na arte pode ser empregado para expressar os polipeptídeos recombinantes desta invenção. A expressão pode ser conseguida em qualquer célula hospedeira adequada que tenha sido transformada ou transfectada com um vetor de expressão contendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo recombinante.

[74] Em um outro aspecto, a presente invenção inclui composições enzimáticas caracterizadas por compreender o extrato enzimático fúngico e enzimas acessórias selecionadas do grupo consistindo de xilanases, mono-oxigenases de polissacarídeos e combinação destas, conforme aqui descritos, e pelo menos um carreador compatível para uso em reações de hidrólise enzimática. Dentre os exemplos de carreadores compatíveis com reações de hidrólise estão, tampões salinos, água, surfactantes, emulsificantes, entre outros. A composição pode ser líquida, sólida ou semi-sólida, apresentar os polipeptídeos solubilizados em soluções tampão ou soluções estabilizadoras, liofilizados sozinhos ou em conjunto com soluções estabilizadoras, congelados, incorporados em partículas, micropartículas ou nanopartículas ou ainda incorporados em emulsões ou microemulsões de forma a apresentar estabilidade (manutenção da atividade enzimática) por um período adequado para a sua estocagem antes da sua utilização em processos de hidrólise enzimática. Tais composições compreendem uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de uma ou mais xilanases compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas. Preferivelmente, as sequências nucleotídicas são caracterizadas por compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 e combinação destas. Alternativamente e ainda em uma modalidade preferencial, as composições compreendem uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de mono-oxigenases de polissacarídeos compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30 e SEQ ID NO 32 e combinação destas. Preferivelmente, o microrganismo é caracterizado por as sequências nucleotídicas compreenderem uma ou mais sequências nucleotídicas codificadora de mono-oxigenases de polissacarídeos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31 e combinação destas.

[75] Os polipeptídeos podem ser formulados em conjunto ou separadamente em tais composições. Por exemplo, as composições podem ser caracterizadas por compreender apenas uma ou mais sequências polipeptídicas de xilanases, ou uma ou mais sequências polipeptídicas de mono-oxigenases de polissacarídeos, ou ainda o extrato enzimático fúngico conforme descrito na presente invenção. Nesse caso, o coquetel enzimático conforme definido pela presente invenção pode ser obtido pela mistura dos seus componentes antes de administrá-lo ao reator de hidrólise enzimática ou ainda pela administração isolada de cada um deles diretamente no reator de hidrólise enzimática. Quando formulados em composições separadas, os componentes do coquetel enzimático, conforme previsto na presente invenção, podem compor um coquetel de hidrólise enzimática compreendendo extrato enzimático fúngico e enzimas acessórias selecionadas do grupo consistindo de xilanases, mono-oxigenases de polissacarídeos e combinação destas.

[76] Outro aspecto da invenção diz respeito ao uso do coquetel enzimático na hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica. Preferencialmente, a biomassa lignocelulósica é selecionada do grupo consistindo de bagaço de cana-de-açúcar, palha de cana-de-açúcar, madeira de eucalipto e capim. Ainda mais preferencial, a biomassa lignocelulósica é selecionada do grupo consistindo de bagaço e palha de cana-de-açúcar. Adicionalmente e em um aspecto ainda mais preferencial, a biomassa lignocelulósica é pré-tratada.

[77] Vários métodos de pré-tratamento de biomassas vegetais lignocelulósicas têm sido sugeridos ao longo das últimas décadas. Estes podem ser divididos em métodos físicos, químicos, biológicos ou combinações destes. Os métodos físicos (por exemplo moagem) convertem a biomassa em pós finos, incrementando a superfície específica da celulose, de modo que a hidrólise da mesma ocorre com relativa facilidade. A irradiação da fibra celulósica com raios gama promove uma cisão das ligações β-1,4 glicosídicas da celulose, promovendo o incremento da superfície específica e redução da cristalinidade da celulose, o que tende a incrementar a taxa de hidrólise da mesma. Já os processos físico-químicos de pré-tratamento utilizando ácido diluído, vapor de alta pressão ou água quente, possibilitam a remoção seletiva das hemiceluloses, produzindo soluções sacarídicas (pré-hidrolisadas) com elevado teor de pentoses e reduzido teor de lignina. Processos alcalinos tendem a promover maior dissolução da lignina e menos solubilização ou fragmentação das hemiceluloses.

[78] Em particular, pré-tratamentos utilizando vapor de água, ácido sulfúrico diluído, amônia e hidróxido de cálcio têm emergido dentre as opções mais promissoras. Existem similaridades entre os principais métodos de pré-tratamento ácido da biomassa (hidrotermólise - hot water; explosão a vapor - Steam explosion e hidrólise com ácido diluído), uma vez que os métodos estão fundamentados na ação combinada da água e do cátion hidrônio, sob diferentes proporções e severidades de processo. A hidrotermólise (“Hot Water”), também denominada solvólise não catalítica ou aquasolv, consiste no uso de água comprimida em contato com a biomassa durante 1-15 minutos sob temperaturas entre 170-230oC. Já o processo de hidrólise com ácido diluído atua através da remoção das hemiceluloses, produzindo polpas com elevada reatividade de fibras. Geralmente, utiliza-se ácido sulfúrico como agente hidrolítico, embora outros ácidos (por exemplo nítrico, clorídrico e fosfórico) possam ser utilizados. Os processos alcalinos de pré-tratamento geralmente utilizam condições moderadas de operação, em termos de temperaturas e pressões, em comparação aos sistemas ácidos. Geralmente, utiliza-se soda, cal, lime (hidróxido de cálcio) à temperatura ambiente ou à temperaturas superiores a 120°C, com tempos reacionais variados.

[79] O pré-tratamento com vapor (explosão a vapor - “Steam explosion”) consiste num dos métodos mais utilizados para transformar biomassas vegetais lignocelulósicas, originado do processo Masonite empregado na produção de aglomerados de madeira. O pré-tratamento com vapor atua química e fisicamente na transformação da lignocelulose, tendo-se as reações químicas como parâmetro dominante. A biomassa é tratada com vapor saturado a 160-240°C (cerca de 6-34 bar) durante um tempo reacional entre 1-15 minutos. Após este tempo, ocorre descompressão do sistema e o material é coletado (em um tanque de expansão, por exemplo, flash tank ou blow tank). Durante o tratamento da biomassa com vapor, ocorre hidrólise das hemiceluloses, além da cisão de algumas ligações entre celulose e lignina. A estrutura da biomassa torna-se mais susceptível à penetração pela água, ácidos e enzimas, de modo que o potencial hidrolítico da celulose é incrementado. A hidrólise nos tratamentos com vapor pode ser catalisada por ácidos orgânicos (por exemplo ácido acético) formados pela cisão dos grupos funcionais presentes nas hemiceluloses. Observa-se, neste caso, auto-hidrólise das hemiceluloses, caracterizando processo auto-catalítico. Catalisadores ácidos (SO2 e H2SO4) e ácidos de Lewis (FeCl3, ZnCl2) podem ser utilizados, resultando em incremento da recuperação de açúcares hemicelulósicos, além de facilitar a hidrólise da celulose presente na polpa pré-tratada em etapas posteriores. O processo AFEX (“Ammonia Fibre Explosion”) consiste na versão alcalina do processo de pré-tratamento de explosão a vapor. Basicamente, ocorre incremento da reatividade da fração celulósica devido ao inchamento da mesma, combinado com hidrólise das hemiceluloses e desintegração da fibra. Submete-se a biomassa à ação da amônia líquida (1-2 kg/kg de biomassa seca) a 160-180°C, sob pressão de 9-17 bar por um período de 10-20 minutos. Em seguida, a pressão do sistema é rapidamente liberada e o material “explodido” é coletado (por exemplo em um “flash tank”).

[80] De um modo preferencial, a biomassa lignocelulósica na presente invenção é pré-tratada por explosão a vapor.

[81] Os produtos resultantes dos processos de pré-tratamento podem ser utilizados em diversos processos tais como produção de enzimas, hidrólise enzimática, fermentação, dentre outros. Em uma modalidade da presente invenção, a biomassa lignocelulósica pré-tratada de cana-de-açúcar é utilizada em processo de produção de enzimas fúngicas celulolíticas. Nesse aspecto, a invenção descreve um meio de cultura para cultivo do fungo Penicillium rolfsii caracterizado por compreender água; bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor; farelo de trigo; uréia; sulfato de amônio; fosfato de potássio dibásico; sulfato de magnésio; polietilenoglicol 6000 e sulfato de cobre. Mais preferencialmente, o meio de cultura da invenção é usado para o cultivo do fungo Penicillium rolfsii F1880. Ainda mais preferencialmente, o meio de cultura é caracterizado por compreender (g/L):

• i) 20 a 40 g de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor;
• ii) 5 a 15 g de farelo de trigo;
• iii) 0,30 a 1,00 g de uréia;
• iv) 1,30 a 1,80 g de sulfato de amônio;
• v) 1,00 a 5,00 g de fosfato de potássio dibásico;
• vi) 0,25 g de sulfato de magnésio;
• vii) 1,00 a 2,00 g de polietilenoglicol 6000;
• viii) 0,001 a 0,003 g de sulfato de cobre, onde, o pH é ajustado para 6,0.

[82] Em uma modalidade relacionada, a invenção descreve um processo de produção de extrato enzimático fúngico rico em enzimas celulolíticas caracterizado por compreender as etapas de:

• (a) cultivar uma alíquota de cultura estoque de Penicillium sp. em meio de cultura sólido por 5 a 15 dias a 28°C para crescimento e esporulação;
• (b) fornecer um meio de cultura caracterizado por compreender água; bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor; farelo de trigo; uréia; sulfato de amônio; fosfato de potássio dibásico; sulfato de magnésio; polietilenoglicol 6000 e sulfato de cobre;
• (c) adicionar ao meio de cultura da etapa (b) discos extraídos do cultivo da etapa (a) contendo conídios em uma proporção de 8 discos para cada 100 mL de meio;
• (d) cultivar a cultura fúngica obtida em (c) por 3-8 dias, sob agitação orbital constante de 100 a 300 rpm, na faixa de temperatura de 30 a 34°C;
• (e) centrifugar o cultivo da etapa (d) para obtenção de sobrenadante essencialmente livre de partículas sólidas suspensas.

[83] O meio de cultura sólido da etapa (a), também denominada de pré-inóculo, compreende pelo menos uma fonte de carboidrato e ágar e, alternativamente, pelo menos uma fonte de proteína vegetal, adjuvantes químicos e nutrientes (uréia, sulfato de amônio, antibióticos, entre outros). Particularmente, o meio de cultura da etapa (a) compreende (g/L): 200,0 g de infusão de batata; 20,0 g de glicose; 15,0 g de ágar bacteriológico; água destilada; onde o pH do meio de cultura é ajustado para 6,0.

[84] Em uma modalidade preferencial, o processo de produção de extrato enzimático fúngico acima descrito é caracterizado pelo Penicillium sp. da etapa (a) ser Penicillium rolfsii.

[85] Extrato enzimático fúngico de Penicillium rolfsii rico em enzimas celulolíticas caracterizado por ser produzido pelo processo de produção de extrato enzimático fúngico acima descrito.

[86] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um processo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica que compreende as etapas de:

• (a) adicionar a um reator, biomassa pré-tratada, solução tamponante e coquetel enzimático, conforme definido pela presente invenção, mantendo uma razão sólido:líquido de 1:2 a 1:20 e pH entre 3,0 a 8,0;
• (b) aquecer o reator da etapa (a) até a temperatura de 25 a 60°C;
• (c) agitar o conteúdo do reator em velocidade entre 100 a 400 rpm por um período de 12 a 120 h;
• (d) resfriar o reator até a temperatura ambiente e interromper a agitação do conteúdo;
• (e) coletar ou transferir o conteúdo contendo a biomassa lignocelulósica hidrolisada.

[87] Preferencialmente, o processo de hidrólise enzimática utiliza carga enzimática (por grama de biomassa em base seca) de:

• (a) 5 a 45 FPU do extrato do fungo Penicillium rolfsii;
• (b) 1 a 20 mg de proteína mono-oxigenase de polissacarídeo;
• (c) 1000-1500 UI de xilanase.

[88] Mais preferencialmente, a carga enzimática do extrato de Penicillium rolfsii é de 10 a 20 FPU/g de biomassa (base seca). Em uma concretização ainda mais preferencial, a carga enzimática de mono-oxigenase de polissacarídeo é de 5 a 15 mg de proteína/g de biomassa (base seca). Em uma concretização ainda mais preferencial, a carga enzimática de xilanase é de 1200 a 1400 UI/g de biomassa (base seca). Ainda como um aspecto preferido, o extrato é obtido do fungo da linhagem Penicillium rolfsii F1880.

[89] Adicionalmente, em um aspecto preferido, a razão sólido:líquido da etapa (a) do processo acima descrito é de 1:4 a 1:10. Em outro aspecto ainda mais preferido, o processo de hidrólise enzimática ocorre na faixa de pH entre 5,0 a 7,0. Em outro aspecto ainda mais preferido, o processo de hidrólise enzimática ocorre na temperatura de 35 a 50°C. Em outro aspecto ainda mais preferido, o tempo de reação do processo de hidrólise enzimática é entre 24 e 48 h. Mais preferencialmente ainda, o processo é realizado em reator de batelada.

[90] Em uma concretização, a etapa (a) do processo de hidrólise compreende o uso de extrato de Penicillium obtido do cultivo de fungo em meio de cultura que compreende: (a) bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor ; (b) farelo de trigo; (c) uréia; (d) sulfato de amônio; (e) fosfato de potássio dibásico; (f) polietilenoglicol 6000; (g) sulfato de cobre. Em uma concretização, o extrato do fungo é obtido pelo processo de produção de extrato fúngico conforme descrito pela presente invenção.

[91] Em um aspecto preferido, a etapa (a) do processo de hidrólise compreende mono-oxigenases de polissacarídeos com especificidade de substrato classificadas nas famílias AA9 ou AA10. Ainda mais preferivelmente, as mono-oxigenases de polissacarídeos compreendem sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30 e SEQ ID NO 32 e combinação destas.

[92] Adicionalmente e ainda em uma modalidade preferida, a xilanase é caracterizada por compreender sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas.

[93] As xilanases e mono-oxigenases de polissacarídeos recombinantes apresentaram um efeito sinérgico com o extrato enzimático fúngico de Penicillium rolfsii na hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar, demonstrando, surpreendentemente, que, o coquetel enzimático é ainda mais eficiente que os seus componentes individuais para a hidrólise enzimática de biomassas lignocelulósicas.

[94] Adicionalmente, a invenção disponibiliza um coquetel enzimático caracterizado por compreender extrato fúngico e microrganismos geneticamente modificados caracterizados por compreender sequências nucleotídicas que codificam enzimas acessórias selecionadas do grupo consistindo de xilanases, mono-oxigenases de polissacarídeo e combinação destas.

[95] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais serão agora descritos. Os exemplos a seguir ilustram a presente invenção em maiores detalhes. Estes exemplos não limitam a presente invenção de modo algum. Eles servem apenas para clarificar o invento.

Exemplo 1: Organismos geneticamente modificados (OGM) para produção de xilanase.

[96] O isolamento de DNA plasmidial, a digestão por endonuclease de restrição, ligação e transformação, a eletroforese de agarose e outras técnicas de DNA recombinante foram levadas a cabo de acordo com os protocolos publicados [por exemplo, Sambrook et al., 1989 Molecular clonning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor. NY.] , ou as instruções do fabricante do respectivo reagente e são bem conhecidas do estado da técnica.

[97] Foram empregadas três cepas de Komagataella phaffii X-33 (previamente classificada como Pichia pastoris X-33) geneticamente modificadas para expressão heteróloga das xilanases F43 GH10.03 (SEQ ID NO 14), F43 GH11.02 (SEQ ID NO 15) e F43 GH11.03 (SEQ ID NO 16). Os genes utilizados para a modificação genética de Komagataella phaffii X-33 foram provenientes do fungo Cladosporium cladosporioides F43. Este fungo foi isolado de folhas de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) e seu transcriptoma foi obtido e minerado in silico para obtenção de sequências com similaridade a xilanases. Três destas sequências foram escolhidas para expressão heteróloga em Komagataella phaffii X-33. As sequências nucleotídicas codificadoras das xilanases F43 GH10-3, F43 GH11-2 e F43 GH11-3 representadas por SEQ ID NO 1; SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3, respectivamente, bem como as respectivas sequências proteicas representadas por SEQ ID NO 09; SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 e SEQ ID NO 16.

[98] Para expressão heteróloga eficiente em Komagataella phaffii X-33 e para facilitar a purificação destas enzimas, as sequências foram modificadas por otimização de códons, retirada de peptídeo sinal quando presente (as sequências SEQ ID NO 04 da F43 GH10-3 e SEQ ID NO 05 da F43 GH11-3) e adição de uma cauda contendo seis resíduos do aminoácido histidina na extremidade C-terminal, adicionalmente àquela codificada pelo vetor. Dentre as enzimas de restrição possíveis de serem utilizadas para a clonagem no vetor de expressão pGAPZαA (Thermo Fisher Scientific - SEQ ID NO 36), selecionou-se as sequências de EcoRI (GAATTC) e XbaI (TCTAGA) para serem inseridas nas extremidades 5' e 3', respectivamente. As sequências modificadas foram sintetizadas quimicamente (SEQ ID NO 06; SEQ ID NO 07 e SEQ ID NO 08, respectivamente) e, usando os sítios de restrição EcoRI e XbaI, foram clonadas no vetor pGAPZαA, sob o promotor constitutivo denominado pGAP (promotor do gene codificador da enzima gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase - GAP). Além do promotor pGAP, este vetor possui o sinal de secreção denominado α-MF e como marcador seletivo o gene de resistência ao antibiótico zeocina.

[99] Cada construção contendo as sequências codificadoras de xilanases no vetor foi conferida por sequenciamento. As cepas de Komagataella phaffii X-33 expressando as sequências codificadoras de xilanases F43 GH10-3, F43 GH11-2 e F43 GH11-3 foram obtidas por recombinação homóloga, seguindo o protocolo descrito no manual do kit pGAPA, B, and C pGAPαA, B and C Pichia expression vectors for constitutive expression and purification of recombinant proteins (Thermo Fisher Scientific).

[100] As construções sintetizadas e o vetor recombinante pGAPZαA foram inseridos por eletroporação em células de Escherichia coli DH5α. As reações de transformação foram semeadas em placas de Petri contendo meio Luria Bertani low salt acrescido de zeocina (25 µg/mL) e incubadas a 37°C overnight. Após a incubação, observou-se a formação de colônias resistentes à zeocina em todas as placas. Três colônias transformadas de cada uma das construções gênicas (pGAPZαA GH10-3 correspondente a sequência nucleotídica SEQ ID NO 37; pGAPZαA GH11-2 correspondente a sequência nucleotídica SEQ ID NO 38; pGAPZαA GH11-3 correspondente a sequência nucleotídica SEQ ID NO 39) e uma colônia transformada com o vetor vazio pGAPZαA (controle) foram inoculadas em meio líquido, submetidas a extração de DNA plasmidial (miniprep) e digeridas com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI. O produto de digestão foi analisado em gel de agarose 1% confirmandose que todas as colônias transformantes testadas possuíam o vetor com tamanho de 3.1 Kb, e os respectivos insertos de 1.068 pb para F43 GH10-3, 978 pb para F43 GH11-2 e 630 pb para F43 GH11-3, conforme mostrado na Figura 1.

[101] Para obter maior quantidade de DNA plasmidial, selecionou-se uma colônia transformada de Escherichia coli DH5α de cada construção (pGAPZαA, pGAPZαA GH10-3, pGAPZαA GH11-2 e pGAPZαA GH11-3) para extração plasmidial do tipo midiprep, usando o kit comercial GeneJet Plasmi Midiprep, seguindo as instruções do fabricante (Thermo Fisher Scientific). Após a extração do DNA plasmidial, as amostras foram quantificadas com auxílio de espectrofotômetro do tipo NanoDrop (NanoDrop ND 1000, Thermo Fisher Scientific) e 15 µg do DNA plasmidial extraído foram linearizados com a enzima de restrição AvrII e utilizados na transformação da levedura Komagataella phaffii X-33, seguindo o protocolo do kit previamente citado. O DNA plasmidial foi então precipitado e inserido por eletroporação em Komagataella phaffii X-33. Foram obtidas colônias transformadas de Komagataella phaffii X-33 positivas para todos os cassetes de expressão, segundo avaliação realizada pelo método de PCR de colônia. As reações de PCR de colônia foram montadas com o mix de PCR Iproof HF (BioRad) em concentração 1X e 1 µM de cada um dos primers pGAP Forward (SEQ ID NO 34) e 3´ AOX1 (SEQ ID NO 33). Com um palito estéril, tocou-se na colônia transformante desejada e misturou-se à reação de PCR. A PCR foi realizada no termociclador Veriti (Applied Biosystems) com as seguintes condições de amplificação: 96°C por 3 minutos, 35 ciclos de 95°C por 3 segundos, 54°C por 30 segundos e 72°C por 2 minutos; e uma extensão final a 72°C por 10 minutos.

[102] A Figura 2 mostra como exemplo o resultado de uma reação de PCR de colônia de cepas de Komagataella phaffii X-33 transformadas com a construção pGAPZαA F43 GH11-3 usando os primers 3’AOX (SEQ ID NO 33) e 5’pGAP (SEQ ID NO 34). Os clones transformantes 3 e 4 apresentaram o fragmento esperado de 1.118 pb, mostrando que o gene foi integrado no genoma do hospedeiro.

Exemplo 2: Organismos geneticamente modificados (OGM) para produção de mono-oxigenases de polissacarídeos.

[103] O fungo leveduriforme Komagataella phaffii X-33 foi geneticamente modificado para expressão heteróloga de mono-oxigenases de polissacarídeos (LPMOs). O gene utilizado para a modificação genética de Komagataella phaffii X-33 foi proveniente do fungo Trichoderma reesei. A sequência codificadora da monooxigenase de polissacarídeo foi selecionada na base de dados pública GenBankTM do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e seus números de acesso nesta base de dados são GenBankTM number CAA71999.1 (para aminoácidos) e GenBankTM number Y11113.1 (para nucleotídeos). Esta LPMO é denominada TrCel61A ou HjLPMO9A conforme literatura científica e contém dois domínios funcionais, sendo um domínio catalítico da família Auxiliary Activity 9 (AA9) de LPMOs e um domínio de ligação de carboidrato (do inglês Carbohydrate Binding Domain) do tipo CBM1. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos dessa proteína são denominadas SEQ ID NO 17 e SEQ ID NO 18, respectivamente.

[104] Além da LPMO TrCel61A do fungo Trichoderma reesei, outros genes codificadores de LPMOs da família AA9 (de fungos filamentosos) e da família AA10 (de bactérias) foram selecionados na base de dados pública GenBankTM do NCBI e utilizados para modificação genética de Komagataella phaffii X-33. As LPMOs da família AA9 de fungos são provenientes das espécies Colletotrichum graminicola (GenBankTM number CAQ16278 - SEQ ID NO 19 e SEQ ID NO 20), Coniophora puteana (GenBankTM number EIW77477 - SEQ ID NO 21 e SEQ ID NO 22) e Pyrenochaeta lycopersici (GenBankTM number AEV53599 - SEQ ID NO 23 e SEQ ID NO 24). As LPMOs da família AA10 de bactérias são provenientes das espécies Agarivorans albus (GenBankTM number WP_016400467 - SEQ ID NO 25 e SEQ ID NO 26), Halomicrobium mukohataei (GenBankTM number WP_015762339.1 - SEQ ID NO 27 e SEQ ID NO 28), Pseudomonas chlororaphis (GenBankTM number WP_009050797.1 - SEQ ID NO 29 e SEQ ID NO 30) e Xylanimonas cellulosilytica (GenBankTM number ACZ31262 - SEQ ID NO 31 e SEQ ID NO 32).

[105] A sequência de DNA codificadora da LPMO TrCel61A do fungo Trichoderma reesei (SEQ ID NO 17) foi sintetizada comercialmente e clonada no vetor de expressão comercial pPICZB (Life Technologies), cujo promotor é o AOX1, induzível por metanol. Esse vetor também contém gene de resistência ao antibiótico zeocina. A construção gênica sintética foi obtida com a sequência codificadora de DNA nativa, bem como com o sinal de secreção nativo da proteína TrCel61A (peptídeo sinal nativo). Além disso, o códon de parada (stop codon) nativo da proteína fúngica foi mantido. Nas extremidades 5’ e 3’ da sequência codificadora da LPMO TrCel61A foram incluídos os sítios de reconhecimento das endonucleases EcoRI e XbaI, respectivamente. Essa construção permite que a proteína madura não contenha em sua região C-terminal o peptídeo composto pelo epítopo myc e cauda de afinidade por histidina (cauda de polihistidina) presente no vetor pPICZB. O mesmo tipo de construção gênica foi obtido para os genes codificadores das LPMOs da família AA9 dos fungos Colletotrichum graminicola, Coniophora puteana e Pyrenochaeta lycopersici. Com relação aos genes codificadores das LPMOs bacterianas da família AA10 (Agarivorans albus, Halomicrobium mukohataei, Pseudomonas chlororaphis, Xylanimonas cellulosilytica), os mesmos foram sintetizados comercialmente e clonados no vetor de expressão comercial pPICZαA, também sob controle do promotor induzível por metanol AOX1. Esse vetor também contém gene de resistência a zeocina. A construção gênica sintética foi obtida com a sequência codificadora de DNA nativa e com o sinal de secreção denominado α-factor de Saccharomyces cerevisiae existente no vetor pPICZαA. Além disso, o códon de parada (stop codon) nativo da proteína foi mantido. Nas extremidades 5’ e 3’ da sequência codificadora das LPMOs bacterianas foi incluído os sítio de reconhecimento da endonuclease XhoI. Esse tipo de construção gênica leva a produção de uma proteína madura secretada que não contém em sua região C-terminal o peptídeo composto pelo epítopo myc e cauda de afinidade por histidina (cauda de poli-histidina) presente no vetor pPICZαA.

[106] As etapas seguintes são detalhadas para a construção gênica contendo a LPMO TrCel61A de Trichoderma reesei (plasmídeo recombinante pPICZB-TrCel61A correspondente a sequência nucleotídica sintética SEQ ID NO 40), mas foram também realizadas para todas as construções gênicas de LPMOs citadas anteriormente.

[107] O plasmídeo recombinante sintetizado pPICZB-TrCel61A (SEQ ID NO 40) liofilizado e contendo 2 μg de DNA foi ressuspendido em 20 µL de água ultrapura estéril livre de nucleases e armazenado a uma concentração estoque de 100 ng/µL. O DNA plasmidial foi diluído para uso na concentração de 10 ng/µL e em seguida transformado por eletroporação em células de Escherichia coli DH5α. O vetor de expressão vazio (pPICZB) também foi inserido em Escherichia coli DH5α por eletroporação para posterior uso como controle experimental. O protocolo utilizado para transformação de Escherichia coli DH5α foi adaptado de SAMBROOK JF, RUSSELL DW, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Vols 1,2 and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 2100 pp.

[108] Dois transformantes de Escherichia coli DH5α resistentes a zeocina selecionados foram inoculados em 3 mL de meio de cultura Luria Bertani (triptona 2%, extrato de levedura 0,5% e cloreto de sódio 0,5%) contendo o antibiótico zeocina (50 µg/mL). As culturas foram incubadas sob agitação de 200 rpm a 37°C, por um período de 16-20 horas. A extração de DNA plasmidial foi realizada utilizando o kit PureYieldTM Plasmid Miniprep System (Promega), segundo instruções do fabricante.

[109] O DNA plasmidial purificado foi avaliado por eletroforese em gel de agarose 1%, conforme mostrado na Figura 3a. Para confirmar se os plasmídeos continham o gene de interesse, o DNA plasmidial foi submetido à clivagem com enzimas de restrição específicas (EcoRI na extremidade 5´e XbaI na extremidade 3´), cujos sítios de restrição haviam sido incluídos nas respectivas posições para a síntese da sequência da LPMO TrCel61A. Um fragmento de DNA de aproximadamente 1.035 pb, correspondente ao tamanho do gene sintetizado TrCel61A foi visualizado em gel de agarose 1%, conforme mostrado na Figura 3b. Esse mesmo procedimento de clivagem com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI também foi realizado para os plasmídios recombinantes do tipo pPICZB contendo os genes codificadores das LPMOs dos fungos Colletotrichum graminicola, Coniophora puteana e Pyrenochaeta lycopersici. Para a clivagem dos plasmídios recombinantes do tipo pPICZαA contendo as LPMOs das bactérias Agarivorans albus, Halomicrobium mukohataei, Pseudomonas chlororaphis, e Xylanimonas cellulosilytica foi utilizada a enzima de restrição XhoI.

[110] Em seguida, o transformante selecionado de Escherichia coli DH5α foi cultivado em 35 mL de meio Luria Bertani Low Salt contendo 50 µg/µL de zeocina (37°C por 16-20 horas). A extração de DNA plasmidial foi realizada utilizando kit comercial QIAGEN Plasmid Midi Kit (Qiagen), obtendo-se quantidade suficiente do vetor recombinante para linearização, purificação e transformação do fungo leveduriforme Komagataella phaffii X-33. A linearização do plasmídio recombinante e do plasmídio controle foi realizada com a enzima de restrição PmeI. Após a linearização, os plasmídeos foram purificados por precipitação por etanol e ressuspendidos em 10 µL de água ultrapura estéril. O material foi armazenado em freezer (-20°C) até o momento da transformação de Komagataella phaffii X-33.

[111] Para a transformação de Komagataella phaffii X-33, células eletrocompetentes desta levedura foram obtidas conforme descrito pelo manual pPICZα A, B, and C Pichia expression vectors for selection on ZeocinTM and purification of secreted, recombinant proteins (Thermo Fisher Scientific). Alíquotas de 80 µL de células competentes em microtubos de 1,5 mL foram mantidas em gelo até o momento da transformação (no mesmo dia). Aproximadamente 10 µL do DNA plasmidial previamente precipitado (contendo em torno de 5 µg de plasmídeo linearizado) foram misturados às células competentes. A mistura foi colocada em cubeta de eletroporação de 0,2 cm e incubada por 5 minutos em gelo. Antes da eletroporação de Komagataella phaffii X-33, foram adicionados 320 µL de solução de sorbitol 1M à cubeta. A eletroporação foi realizada com os seguintes parâmetros: 1500 V, 25 µF, 400 Ω. Imediatamente após o choque, 1 mL de sorbitol 1M gelado foi adicionado na cubeta e o conteúdo foi transferido para um tubo de 15 mL estéril. A incubação ocorreu a 30°C, sem agitação, por 2 horas. Alíquotas de 50 µL, 100 µL e o pellet (células restantes) foram centrifugadas a 3,000 x g por 5 minutos e ressuspendidas em 100 µL de sorbitol 1M gelado em meio de cultura YPDS (Yeast Extract Peptone Dextrose Sorbitol; composição: extrato de levedura 10 g/L, peptona bacteriológica 10 g/L, sorbitol 182,2 g/L, glicose 20 g/L) contendo 200 µg/mL de zeocina. As placas foram incubadas por 4 a 5 dias em estufa a 30°C e avaliadas quanto ao crescimento de células transformadas.

[112] Ao todo foram obtidos 41 transformantes de Komagataella phaffii X-33 contendo o vetor pPICZB-TrCel61A e 3 transformantes contendo o vetor controle pPICZB. Todos os transformantes obtidos foram repicados para placas de Petri contendo meio de cultura sólido YPD ágar (Yeast Extract Peptone Dextrose Agar; composição: extrato de levedura 10 g/L, peptona bacteriológica 20 g/L, glicose 20 g/L, ágar bacteriológico 15 g/L) acrescido de 200 µg/mL de zeocina. As placas foram incubadas em estufa a 30°C por 24-48 horas.

[113] Em seguida, 10 transformantes foram analisados por PCR de colônia utilizando primers específicos (5´AOX - SEQ ID NO 35 e 3´AOX - SEQ ID NO 33) para confirmar a integração do gene no genoma da levedura. Sete transformantes foram confirmados quanto à inserção do gene, conforme mostrado na Figura 4. Para os transformantes do tipo Mut+ (que utilizam unicamente metanol como fonte de carbono) são esperados dois produtos de amplificação na PCR, sendo um de 2.200 pb (referente ao promotor AOX1) e outro do tamanho do gene TrCel61A acrescido de 323 pb (proveniente do vetor pPICZB). No caso, a Figura 4 mostra a amplificação de um fragmento de aproximadamente 1.400 pb para alguns transformantes contendo o gene da LPMO TrCel61A (SEQ ID NO 17). Os transformantes de Komagataella phaffii X-33 confirmados por PCR foram inoculados em 3 mL de meio de cultura líquido YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose; composição: extrato de levedura 10 g/L, peptona bacteriológica 20 g/L, glicose 20 g/L) contendo 200 µg/mL de zeocina. Após incubação a 30°C e 250 rpm por 24 horas, as células recombinantes foram preservadas em glicerol 30% em ultrafreezer.

[114] Seis transformantes de Komagataella phaffii X-33 foram selecionados para cultivo em condições indutoras da expressão gênica (presença de metanol), com o objetivo de avaliar a secreção da proteína heteróloga no sobrenadante. Cada transformante foi inoculado em 10 mL de meio de cultura líquido BMGY (Buffered Glycerol-complex Medium) em tubos de 50 mL estéreis. Após a incubação por 16-20 horas a 30°C sob agitação de 250 rpm, as células foram coletadas por centrifugação (1500 x g por 5 minutos) e ressuspendidas em 5 mL de meio de cultura líquido BMMY com metanol (Buffered Methanol-complex Medium). Em seguida, as células foram inoculadas (após ajuste para uma densidade ótica DO600nm final igual a 1.0) em frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo 30 mL de meio BMMY. O cultivo ocorreu a 30°C sob agitação de 250 rpm por 96 horas, sendo adicionado metanol a uma concentração final de 0,5%, a cada 24 horas. Os resultados de produção de proteína heteróloga pelos transformantes avaliados são mostrados na Figura 5.

Exemplo 3: Produção de xilanase recombinante por meio do cultivo do fungo leveduriforme Komagataella phaffii em biorreator.

[115] A produção da xilanase recombinante SEQ ID NO 14 em biorreator foi realizada em meio de cultura UAB [M. MAURER; M. KÜHLEITNER; B. GASSER; D. MATTANOVICH (2006) Versatile modeling and optimization of fed-batch processes for the production of secreted heterologous proteins with Pichia pastoris. Microb Cell Fact, 5, p. 37] nas temperaturas de 26˚C, 28˚C e 30˚C. Inicialmente, o transformante de Komagataella phaffii X-33 produtor da xilanase recombinante SEQ ID NO 14 (vetor pGAPZαA) foi crescido em meio de cultura sólido YPD ágar (composição por litro: 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona bacteriológica, 20 g de ágar bacteriológico, 20 g de glicose) contendo 0,1 mg/mL de zeocina, a 30˚C por 72 horas. Em seguida, uma colônia isolada foi coletada da superfície do ágar e inoculada em 200 mL de meio líquido YPD, em frascos de 1 L de capacidade, para obtenção do pré-inóculo. As seguintes condições de processo foram utilizadas: 200 rpm, 30°C por 24 horas. Após esta etapa, as células foram inoculadas em três dornas de biorreator de bancada agitado mecanicamente, com volume nominal de 3,6 L, contendo 1,5 L de meio UAB [M. MAURER; M. KÜHLEITNER; B. GASSER; D. MATTANOVICH (2006) Versatile modeling and optimization of fed-batch processes for the production of secreted heterologous proteins with Pichia pastoris. Microb Cell Fact, 5, p. 37] em pH 5,5, com concentração de glicose de 40 g/L e densidade ótica (DO600nm) inicial da fermentação de 2,0, nas temperaturas de 26, 28 e 30 °C. Os níveis de aeração do sistema foram definidos por: 20% de pO2, 1 vvm (volume de ar / por volume de meio / por minuto) e sistema de agitação fixo em 800 rpm até esgotamento da fonte de carbono. Após esta etapa, foi acionado o modo cascata (400 a 1200 rpm) para manutenção do pO2 em 20%. Após a etapa de crescimento celular e esgotamento da glicose, iniciou-se a fase de alimentação do cultivo em sistema de pulsos. Os cultivos foram alimentados por pulsos de 40 g/L de glicose, respeitando o período de consumo total da fonte de carbono adicionada. O tempo de fermentação foi de aproximadamente 45 horas.

[116] Os resultados da produção da xilanase recombinante SEQ ID NO 14 em biorreator mostraram que os cultivos realizados na temperatura de 28°C apresentaram maior valor de atividade enzimática: 12,7 UI/mL. A quantidade máxima de proteína secretada foi de 0,68 g/L (mensurada pelo método de BCA, ou ácido bicinconínico). Cada 500 mL do cultivo foi dialisado 5 vezes em água e, posteriormente, concentrado 10 vezes por ultrafiltração em membrana de polietersulfona de 10 kDa. Após a concentração e diálise, a atividade de xilanase foi de 236,26 ± 4,68 UI/mL. O extrato proteico contendo a xilanase recombinante foi adicionado ao coquetel basal a ser utilizado para hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado.

Exemplo 4: Produção de mono-oxigenase de polissacarídeo recombinante por meio do cultivo do fungo leveduriforme Komagataella phaffii em biorreator de bancada.

[117] O transformante Komagataella phaffii Cel61A-T19 produtor da mono-oxigenase de polissacarídeo (LPMO) recombinante SEQ ID NO 18 foi cultivado em meio de cultura sólido YPD ágar (composição por litro: 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona bacteriológica, 20 g de ágar bacteriológico, 20 g de glicose) contendo zeocina 0,1 mg/mL, a 30˚C por 72 horas. Em seguida, uma colônia isolada foi coletada da superfície do ágar e inoculada em 200 mL de meio líquido YPD em frasco de 1 L de capacidade, para obtenção do pré-inoculo. As seguintes condições de processo foram utilizadas: 200 rpm, a 30°C por 24 horas.

[118] Após esta etapa, as células foram inoculadas em dornas de biorreator de bancada com volume nominal de 3,6 L, contendo 2,0 L de meio UAB [M. MAURER; M. KÜHLEITNER; B. GASSER; D. MATTANOVICH (2006) Versatile modeling and optimization of fed-batch processes for the production of secreted heterologous proteins with Pichia pastoris. Microb Cell Fact, 5, p. 37] . Os parâmetros da fermentação foram: pH 5,5 e temperatura de 30 °C. A quantidade inicial de glicerol foi de 40 g/L. Os níveis de aeração do sistema foram definidos como: 20% de pO2, 1 vvm (1 litro de ar / 1 minuto / litro de meio) e sistema de agitação em modo cascata (400 a 1200 rpm). A densidade ótica (DO600nm) inicial da fermentação foi 2,0. A fase de crescimento celular teve duração de 18 horas. Após esta etapa, iniciou-se a fase de transição com glicerol/metanol com duração de 4 horas em sistema de pulsos, e em seguida, foi iniciada a fase de indução de expressão por metanol em sistema de pulsos, com duração de 30 horas. A quantidade máxima de proteína secretada nas fermentações foi de 0,43 g/L (mensurada pelo método de BCA, ou ácido bicinconínico).

[119] Para avaliar o consumo de glicerol e metanol durante a fermentação, as amostras coletadas foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por cromatografia líquida com detecção por índice de refração. A determinação da quantidade de glicerol e de metanol foi realizada em coluna cromatográfica Aminex HPX-87H (BioRad), a 45°C, com H2SO4 (0,005 mol/L) como fase móvel a uma vazão de 0,6 mL/min. O tempo de corrida para cada amostra foi de 24 minutos. Os resultados obtidos mostraram que em 18 horas, o glicerol (40 g/L) já havia se esgotado, portanto, foi iniciada a fase de transição para expressão da LPMO recombinante. Nesta etapa foi adicionado gradativamente metanol (1 a 6 g/L) até concentração máxima de 6 g/L. Após 4 horas de transição, foi iniciada a indução da expressão da proteína, utilizando-se níveis de metanol que variaram entre 10 e 25 g/L. Os resultados obtidos mostraram que houve consumo de metanol durante todo o processo de indução da expressão gênica e síntese proteica. Após 30 horas de indução, o cultivo foi centrifugado a 5.500 x g por 30 minutos. O sobrenadante obtido foi analisado por eletroforese do tipo SDS-PAGE 12% para avaliação da expressão das proteínas de interesse, e uma banda proteica de aproximadamente 60 kDa foi observada, correspondendo à proteína recombinante de interesse. Cada 500 mL do cultivo foi dialisado 5 vezes em água e, posteriormente, concentrado 10 vezes por ultrafiltração em membrana de polietersulfona de 10 kDa. Após a concentração e diálise, a quantidade de proteína total foi medida, apresentando 10 mg/mL. O extrato proteico contendo a LPMO recombinante foi adicionado ao coquetel basal a ser utilizado para hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado.

Exemplo 5: Produção otimizada de extrato enzimático fúngico rico em enzimas celulolíticas pelo fungo ascomiceto Penicillium rolfsii F1880 (cepa selvagem).

[120] Extrato enzimático fúngico foi produzido a partir do cultivo do fungo filamentoso Penicillium rolfsii F1880, que foi isolado da biodiversidade brasileira, especificamente de ambiente agrícola de cultivo de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum). Tal microrganismo foi depositado na Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), autoridade de depósito internacional (IDA) sob o Tratado de Budapeste, em 24 de julho de 2019, e recebeu o código de acesso RGM 2791. Inicialmente, o meio de cultura denominado ágar batata dextrose foi preparado, esterilizado e distribuído em placas de Petri. Os componentes desse meio de cultivo são infusão de 200 g de batata, glicose (20,0 g), ágar bacteriológico (15,0 g), água destilada (volume completado para 1 L), pH 6,0. A cepa Penicillium rolfsii F1880 foi inoculada nas placas, a partir do estoque mantido em glicerol 30% em ultrafreezer (-80°C). As placas foram incubadas a 28°C durante 10 dias. Em seguida, discos de ágar extraídos do meio sólido contendo os conídios foram inoculados em meio de cultivo em uma proporção de 8 discos para cada 100 mL de meio líquido. Os discos foram extraídos utilizando a parte anterior de uma ponteira descartável tipo P200 (de 200 microlitros) e o processo de inoculação foi realizado em condições estéreis (capela de fluxo laminar).

[121] A produção de extrato enzimático fúngico pelo fungo Penicillium rolfsii F1880 foi realizada em frascos cônicos do tipo Erlenmeyer (125 mL) contendo 25 mL de meio de cultivo. Dois meios foram usados: a) meio de cultivo modificado de MANDELS, M.; WEBER, J. (1969) The production of cellulases. In Cellulases and their Applications, Advances in Chemistry Series 95, pp. 391-413. Edited by E. J. Hajny & E. T. Reese. Washington: American Chemical Society, o qual foi denominado meio controle, e (b) meio otimizado por meio de planejamento experimental, conforme mostra a Tabela 1. O meio de cultivo otimizado foi preparado pela mistura dos seguintes componentes (em parênteses a quantidade do componente para 1 L): ureia (0,75 g), sulfato de amônio (1,6 g), fosfato de potássio dibásico (3,5 g), sulfato de magnésio (0,25 g), polietilenoglicol 6000 (1,125 g), sulfato de cobre (2 mg), bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor e lavado exaustivamente com água (29,2 g), farelo de trigo (12 g), e após o preparo dessa solução, o pH foi ajustado para 6,0 com adição de ácido clorídrico 1 mol/L e esta foi esterilizada a 121°C e 1 atm de pressão, por 20 minutos em autoclave. O cultivo foi realizado em frascos do tipo Erlenmeyer (25 mL de meio em frascos com capacidade para 125 mL) por 5 dias, sob agitação constante de 180 rpm a 32°C. Ao final do cultivo, o conteúdo dos frascos foi centrifugado em tubos do tipo Falcon, a 7800 x g por 10 minutos, para obtenção do extrato enzimático fúngico bruto. A atividade celulolítica total dos extratos brutos foi determinada por microensaio de FPAse, segundo protocolo padronizado descrito no método clássico proposto pela International Union of Pure and Applied Chemistry - IUPAC (GHOSE, T.K. (1987) Measurement of Cellulase Activities. Pure & Appl. Chem. 59: 257-268).

[122] A atividade enzimática de celulases totais foi aumentada de 1,80±0,05 UI/mL para 2,86±0,16 UI/mL de extrato enzimático após a otimização, conforme apresentado na Figura 6. Estes valores mostram que houve um aumento de 66% na atividade enzimática. Além do aumento de atividade, a otimização possibilitou a redução de 14 para 8 componentes do meio de cultivo (Tabela 1), dentre os quais foram eliminados componentes de alto custo, como o extrato de levedura e a peptona bacteriológica. O cultivo também foi realizado em frascos cônicos de 1000 mL contendo 200 mL dos meios de cultivo controle e otimizado. Os valores obtidos foram 1,16±0,06 UI/mL e 2,46±0,06 UI/mL, respectivamente.
Tabela 1. Composição do meio de cultivo modificado de MANDELS, M.; WEBER, J. (1969) The production of cellulases. In Cellulases and their Applications, Advances in Chemistry Series 95, pp. 391-413. Edited by E. J. Hajny & E. T. Reese. Washington: American Chemical Society, denominado meio controle, e do meio otimizado de produção de celulases por Penicillium rolfsii F1880 desenvolvido na presente invenção.

Exemplo 6: Processo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica prétratada utilizando o coquetel enzimático desenvolvido.

[123] No processo de hidrólise enzimática a razão sólido:líquido deve ser de 1:2 a 1:20, preferencialmente entre 1:4 e 1:10, sendo o sólido a biomassa lignocelulósica prétratada, considerando base seca, e o líquido uma mistura de solução tamponante, coquetel enzimático e água contida na biomassa pré-tratada. O pré-tratamento aplicado à biomassa pode ser autohidrólise, ácido, alcalino, explosão a vapor, organosolv, entre outros. Esse processo pode ser realizado em qualquer recipiente que possa ser fechado a pressão ambiente, e mantido sob agitação orbital. A temperatura para o processo de hidrólise enzimática deve ser mantida de 25°C a 60°C, preferencialmente, 35°C a 50°C. O tempo de reação deve ser entre 12 h e 120 h, preferencialmente, entre 24 h e 48 h. A agitação deve ser orbital de 100 rpm a 400 rpm, preferivelmente cerca de 200 rpm.

[124] Os ensaios de hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor utilizando extrato enzimático do fungo Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com duas enzimas acessórias (xilanase e LPMO) foi realizado da seguinte maneira: i) quantidade de biomassa - 1,26 g com 60% de umidade; ii) quantidade de extrato do fungo Penicillium rolfsii F1880 de 7,5 FPU; iii) quantidade de LPMO recombinante (SEQ ID NO 18) produzida por Komagataella phaffii X-33, 6,5 mg; quantidade de xilanase recombinante SEQ ID NO 14 produzida por Komagataella phaffii X-33, 686,5 U. Tampão citrato de sódio (0,1 mol/L; pH 5) foi adicionado ao meio reacional até que o volume final de líquido no sistema atingisse 5 mL total (incluindo as soluções de enzimas e água contida na biomassa). O processo de hidrólise foi realizado em uma placa contendo 24 poços, sendo que cada poço tem capacidade para 10 mL.

[125] O pH do meio reacional foi ajustado com tampão citrato, podendo ser utilizado também o tampão acetato, para um valor entre 3,0 e 8,0, preferencialmente, entre 5,0 e 7,0.

[126] Dois controles experimentais visando destacar o aumento da liberação de açúcares quando enzimas acessórias são adicionadas ao extrato bruto do fungo P. rolfsii F1880 foram inseridos nesse ensaio: 1) Extrato de Penicillium rolfsii F1880 sem a adição de enzimas acessórias, e nesse caso o volume das soluções contendo enzimas acessórias foi substituído por tampão; e 2) Extrato de Penicillium rolfsii F1880 contendo enzimas acessórias inativadas. As demais condições do processo de hidrólise enzimática foram: 48 h e 50°C.

[127] A Figura 7 apresenta o resultado do experimento em termos da concentração dos açúcares glicose e xilose liberados, quantificados por cromatografia líquida (HPLC/RID). Como referência, utilizou-se o coquetel enzimático comercial Cellic CTec 3 (Novozymes), que é o coquetel referência no mercado para hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica.

[128] As concentrações de glicose e xilose liberadas utilizando o coquetel base foram de 18 g/L e 7 g/L, respectivamente, contra 28 g/L e 13 g/L do coquetel enzimático comercial (Cellic CTec 3). Considerando a biomassa utilizada e o teor de sólidos empregado, a concentração máxima (teórica) de glicose é de 42 g/L. O extrato bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880 contém celulases e xilanases, porém, nota-se nesse experimento que a inclusão de enzimas acessórias ainda promove um incremento de cerca de 20% de glicose liberada, demonstrando que há complementariedade entre as enzimas do fungo e aquelas enzimas recombinantes adicionadas.

Exemplo 7: Processo de hidrólise enzimática de biomassa pré-tratada em frascos cônicos utilizando extrato enzimático de Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com mono-oxigenase de polissacarídeo (LPMO) recombinante.

[129] Os ensaios de hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor utilizando extrato enzimático fúngico bruto de Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com LPMO recombinante SEQ ID NO 18 (produzida por Komagataella phaffii X-33) foram realizados da seguinte maneira: i) quantidade de biomassa - 0,63 g com 60% de umidade; ii) quantidade de extrato bruto de Penicillium rolfsii F1880 de 1,25 FPU; iii) quantidade de LPMO, 1,25 mg. Tampão citrato de sódio 0,1 mol/L, pH 5, foi adicionado ao meio reacional até que o volume final de líquido no sistema atingisse 5 mL total (incluindo a solução de LPMO e água contida na biomassa).

[130] Dois controles experimentais visando destacar o aumento da liberação de açúcares quando LPMO foi adicionada ao extrato enzimático fúngico bruto de Penicillium rolfsii F1880 foram inseridos nesse ensaio: 1) Extrato bruto de Penicillium rolfsii F1880 sem a adição de LPMO, e nesse caso, o volume da solução contendo LPMO foi substituído por tampão; e 2) Extrato do fungo Penicillium rolfsii F1880 contendo albumina de soro bovino - BSA (1,25 mg), uma proteína sem atividade catalítica usada para simular a presença de LPMO inativada. As demais condições do processo de hidrólise enzimática foram: 48 h e 50°C.

[131] A Figura 8 apresenta a concentração de glicose obtida ao final das 48 h de reação empregando o extrato enzimático de Penicillium rolfsii F1880 adicionado da LPMO recombinante SEQ ID NO 18. Para fins comparativos, a Figura 8 apresenta também a concentração de glicose obtida em processo em que foi empregado apenas o extrato enzimático bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880, sem a adição da LPMO recombinante, e este mesmo extrato celulolítico adicionado de albumina do soro bovino (BSA), na mesma dosagem da enzima LPMO, ou seja, 1,25 mg.

[132] A concentração de glicose obtida utilizando o extrato enzimático bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880 sem adição de LPMO e adicionado de BSA foi de cerca de 7 g/L. Quando a LPMO recombinante SEQ ID NO 18 (produzida por Komagataella phaffii X-33) foi adicionada ao extrato, foi possível obter uma concentração de cerca de 11 g/L de glicose. Considerando a biomassa de partida e o teor de sólidos empregado, a concentração máxima teórica de glicose é de 21 g/L. Sendo assim, verificou-se que a adição da enzima acessória resultou em um aumento de 53% na concentração de glicose obtida ao final do processo de hidrólise.

Exemplo 8: Processo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica prétratada em frascos cônicos utilizando extrato enzimático de Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com xilanase recombinante.

[133] Os ensaios de hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor utilizando extrato enzimático fúngico bruto de Penicillium rolfsii F1880 enriquecido com a xilanase recombinante SEQ ID NO 14 (produzida por Komagataella phaffii X-33) foi realizado da seguinte maneira: i) quantidade de biomassa - 0,63 g com 60% de umidade; ii) quantidade de extrato bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880 de 3,75 FPU; iii) quantidade da xilanase recombinante SEQ ID NO 14, 366 U. Tampão citrato de sódio 0,1 mol/L, pH 5, foi adicionado ao meio reacional até que o volume final de líquido no sistema atingisse 5 mL total (incluindo a solução de xilanase e água contida na biomassa).

[134] Dois controles experimentais visando destacar o aumento da liberação de açúcares quando xilanase é adicionada ao extrato enzimático bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880 foram inseridos nesse ensaio: 1) Extrato bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880 sem a adição de xilanase, e nesse caso o volume da solução contendo xilanase foi substituído por tampão; e 2) Extrato bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880 contendo xilanase inativada a 105°C por 20 h. As demais condições do processo de hidrólise enzimática foram: 48 h; 50°C. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 9.

[135] Considerando os teores de glicana e xilana presentes no bagaço de cana-deaçúcar pré-tratado por explosão a vapor, as máximas concentrações teóricas de glicose e xilose que poderiam ser obtidas nos ensaios seriam de aproximadamente 21,0 g/L e 9,5 g/L, respectivamente. A partir dos dados apresentados na Figura 9, foi possível observar uma contribuição da xilanase recombinante SEQ ID NO 14 para o aumento de aproximadamente 65% na liberação de xilose.

Exemplo 9: Processo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica prétratada utilizando diferentes razões sólido:líquido.

[136] Este exemplo foi realizado com base na descrição geral do exemplo 6, mas usando apenas o extrato enzimático fúngico de Penicillium rolfsii F1880 como catalisador. Desta forma, os ensaios de hidrólise enzimática de bagaço de cana-deaçúcar pré-tratado por explosão a vapor utilizando extrato bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880 foram realizados da seguinte maneira: i) quantidade de biomassa (razão sólido:líquido) - 0,13 g (1:100); 0,63 g (1:20); 1,26 g (1:10); 1,89 g (1:6,7) ou 2,52 g (1:5); ii) quantidade de extrato bruto do fungo Penicillium rolfsii F1880 de 0,77 FPU para 0,13 g de biomassa; 3,75 FPU para 0,63 g de biomadda, 7,5 FPU para 1,26 g de biomassa, 11,25 FPU para 1,89 g de biomadda ou 15,0 FPU para 2,52 g de biomassa. Tampão citrato de sódio (0,1 mol/L; pH 5) foi adicionado ao meio reacional até que o volume final de líquido no sistema atingisse 5 mL total (incluindo as soluções de enzimas e água contida na biomassa). Os ensaios de hidrólise foram conduzidos a 50°C por 48 h.

[137] A Figura 10 apresenta o resultado do experimento em termos do rendimento de hidrólise, o qual foi calculado dividindo-se a concentração de glicose medida no sobrenadante do meio reacional após o ensaio de hidrólise pela concentração de glicose teórica nesse meio caso toda a celulose fosse convertida em glicose. O resultado da divisão foi multiplicado por 100.

[138] De acordo com os dados apresentados na Figura 10, há uma tendência para redução do rendimento em função da razão sólido:líquido, mesmo mantendo a proporção entre enzima e biomassa em todos os ensaios. Esse efeito é devido à menor eficiência de agitação, e consequentemente do acesso de enzimas ao substrato que é sólido, e à elevada concentração de inibidores no meio, os quais inibem a ação de enzimas. O mesmo efeito é observado quando enzimas acessórias são adicionadas ao extrato bruto, como nos exemplos 6, 7 e 8, ou seja, em ensaios com menor razão sólido:líquido o efeito de adição das enzimas acessórias é acentuado, enquanto em ensaios com alta razão sólido:líquido o efeito positivo sobre a liberação dos açúcares é sensivelmente atenuado.

[139] Assim, este resultado auxilia na comparação dos resultados obtidos nos exemplos 6, 7 e 8: como a razão sólido:líquido no exemplo 6 é o dobro das razões utilizadas nos exemplos 7 e 8, é esperado que o desempenho das enzimas seja menos pronunciado no experimento do exemplo 6.

Claims (45)

1. Coquetel enzimático caracterizado por compreender extrato enzimático fúngico e enzimas acessórias selecionadas do grupo consistindo de xilanases, monooxigenases de polissacarídeo e combinação destas.
2. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as xilanases serem provenientes do fungo do gênero Cladosporium.
3. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o fungo do gênero Cladosporium ser da espécie Cladosporium cladosporioides.
4. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o fungo do gênero Cladosporium ser da linhagem Cladosporium cladosporioides F43.
5. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as xilanases compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas.
6. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as xilanases serem obtidas a partir das sequências nucleotídicas selecionadas de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 e SEQ ID NO 8 e combinação destas.
7. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as monooxigenases de polissacarídeo compreenderem enzimas com especificidade de substrato classificadas nas famílias selecionadas de AA9 e AA10.
8. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as monooxigenases de polissacarídeo compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30 e SEQ ID NO 32 e combinação destas.
9. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as monooxigenases de polissacarídeo serem obtidas a partir das sequências nucleotídicas selecionadas de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29 e SEQ ID NO 31 e combinação destas.
10. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o extrato enzimático fúngico ser produzido a partir de fungo do gênero Penicillium.
11. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação10 caracterizado por o fungo ser da espécie Penicillium rolfsii.
12. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação11 caracterizado por o fungo Penicillium rolfsii ser da cepa depositada na Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) sob o código de acesso RGM 2791.
13. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o extrato enzimático fúngico ser obtido do cultivo de fungos em meio de cultura caracterizado por compreender:

    • (a) bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor em concentrações na faixa de 20 a 40 g/L;
    • (b) farelo de trigo em concentrações na faixa de 5 a 15 g/L;
    • (c) ureia em concentrações na faixa de 0,30 a 1,00 g/L;
    • (d) sulfato de amônio em concentrações na faixa de 1,30 a 1,80 g/L;
    • (e) fosfato de potássio dibásico em concentrações na faixa de 1,00 a 5,00 g/L;
    • (f) polietilenoglicol em concentrações na faixa de 1,00 a 2,00 g/L;
    • (g) sulfato de cobre em concentrações na faixa de 1,00 a 3,00 mg/L.
14. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por o cultivo ser realizado na faixa de temperatura de 30-34 °C.
15. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por o cultivo ser realizado por um período de 3 a 8 dias.
16. Coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por o cultivo ser realizado com agitação orbital constante de 100 a 300 rpm.
17. Vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais xilanases heterólogas compreendendo sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinações destas.
18. Vetor de acordo com a reivindicação 17 caracterizado por as sequências nucleotídicas compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 e SEQ ID NO 8 e combinações destas.
19. Vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeo com especificidade de substrato classificadas nas famílias AA9 ou AA10.
20. Vetor caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas capazes de codificar uma ou mais mono-oxigenase de polissacarídeo heterólogas compreendendo sequências protéicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32 e combinações destas.
21. Vetor de acordo com a reivindicação 20 caracterizado por as sequências nucleotídicas compreenderem sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31 e combinações destas.
22. Método de obtenção de microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender as etapas de:

    • (a) síntese de uma construção gênica contendo sequências de xilanases e/ou mono-oxigenases de polissacarídeo recombinantes e sua clonagem em vetor de expressão;
    • (b) inserção do vetor recombinante sintetizado em (a) em células de Escherichia coli;
    • (c) seleção e cultivo de um transformante;
    • (d) extração e linearização do DNA plasmidial;
    • (e) precipitação e inserção do DNA linearizado nas células do microrganismo.
23. Método de obtenção de microrganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por as xilanases recombinantes de (a) serem obtidas a partir das sequências nucleotídicas selecionadas de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3.
24. Método de obtenção microrganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por as xilanases recombinantes de (a) serem obtidas a partir das sequências nucleotídicas otimizadas selecionadas de SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 e/ou SEQ ID NO 8.
25. Método de obtenção de microrganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por as mono-oxigenases de polissacarídeo recombinantes serem expressas a partir das sequências nucleotídicas selecionadas do grupo SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29 e SEQ ID NO 31.
26. Método de obtenção de microrganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por a inserção de moléculas de ácido nucléico em (b) e (e) ocorrerem por meio do método de eletroporação.
27. Método de obtenção de microrganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por o microrganismo ser um fungo.
28. Método de obtenção de microrganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 27 caracterizado por o fungo pertencer à espécie Komagataella phaffii.
29. Microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de xilanases selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 e combinação destas.
30. Microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de xilanases compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e combinação destas.
31. Microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeo com especificidade de substrato classificadas nas famílias AA9 ou AA10.
32. Microrganismo geneticamente modicado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de mono-oxigenase de polissacarídeo selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31 e combinação destas.
33. Microrganismo geneticamente modificado caracterizado por compreender uma ou mais sequências nucleotídicas codificadoras de uma ou mais mono-oxigenases de polissacarídeo compreendendo sequências polipeptídicas selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32 e combinação destas.
34. Microrganismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33 caracterizado por ser da espécie Komagataella phaffii.
35. Microrganismo geneticamente modificado caracterizado por ser obtido por meio do método descrito em qualquer uma das reivindicações 22 a 28.
36. Uso do coquetel enzimático conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 caracterizado por ser na hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica.
37. Uso de coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 36 caracterizado por a biomassa lignocelulósica ser selecionada do grupo consistindo de bagaço de cana de açúcar, palha de cana-de-açúcar, madeira de eucalipto e capim.
38. Uso de coquetel enzimático de acordo com a reivindicação 36 caracterizado por a biomassa lignocelulósica ser pré-tratada.
39. Processo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica caracterizado por compreender as etapas de:

    • (a) adicionar a um reator, biomassa pré-tratada, solução tamponante e coquetel enzimático, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, mantendo uma razão sólido:líquido de 1:2 a 1:20 e pH entre 3,0 e 8,0;
    • (b) aquecer o reator da etapa (a) até a temperatura de 25 a 60 °C;
    • (c) agitar o conteúdo do recipiente em velocidade entre 100 a 400 rpm por um período de 12 a 120h;
    • (d) resfriar o reator até a temperatura ambiente e interromper a agitação do conteúdo;
    • (e) coletar ou transferir o conteúdo contendo a biomassa lignocelulósica hidrolisada.
40. Processo de hidrólise enzimática de acordo com a reivindicação 39 caracterizado por o coquetel enzimático da etapa (a) compreender carga enzimática por grama de biomassa seca de:

    • a. 5 a 45 FPU do extrato do fungo Penicilium rolfsii;
    • b. 1 a 20 mg de proteína mono-oxigenase de polissacarídeo;
    • c. 1000-1500 UI de xilanase.
41. Meio de cultura para cultivo do fungo Penicillium sp caracterizado por compreender água; bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor; farelo de trigo; uréia; sulfato de amônio; fosfato de potássio dibásico; sulfato de magnésio; polietilenoglicol 6000 e sulfato de cobre.
42. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 41 caracterizado por compreender (g/L):

    • i) 20 a 40 g de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor;
    • ii) 5 a 15 g de farelo de trigo;
    • iii) 0,30 a 1,00 g de ureia;
    • iv) 1,30 a 1,80 g de sulfato de amônio;
    • v) 1,00 a 5,00 g de fosfato de potássio dibásico;
    • vi) 0,25g de sulfato de magnésio
    • vii) 1,00 a 2,00 g de polietilenoglicol 6000
    • viii) 0,001 a 0,003 g sulfato de cobre, onde o pH do meio é ajustado para 6,0.
43. Processo para a produção de extrato enzimático fúngico rico em enzimas celulolíticas caracterizado por compreender as etapas de:

    • (a) cultivar uma alíquota estoque de Penicillium sp em meio de cultura sólido por 5 a 15 dias a 28°C para crescimento e esporulação;
    • (b) fornecer um meio de cultura de acordo com a reivindicação 40;
    • (c) adicionar ao meio de cultura da etapa (b) discos extraídos do cultivo da etapa (a) contendo conídios em uma proporção de 8 discos para cada 100 mL de meio.
    • (d) cultivar a cultura fúngica obtida em (c) por 3-8 dias, sob agitação orbital constante de 100 a 300 rpm, na faixa de temperatura de 30 a 34 °C;
    • (e) centrifugar o cultivo da etapa (d) para obtenção de sobrenadante essencialmente livre de partículas sólidas suspensas.
44. Processo de acordo com a reivindicação 43 caracterizado por Penicillium sp ser Penicillium rolfsii.
45. Extrato enzimático fúngico de Penicillium rolfsii rico em enzimas celulolíticas caracterizado por ser produzido pelo processo da reivindicação 43.

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