BR112021007997A2 - combinação de microalgas transgênicas e uso das mesmas, processo para a produção de uma mistura de enzimas, a referida mistura e uso das mesmas e uso de xilanase - Google Patents

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Abstract

MICROALGAS TRANSGÊNICAS PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS DEGRADADORAS DE PAREDE CELULAR VEGETAL TENDO UMA ATIVIDADE CELULOLÍTICA ESTÁVEL AO CALOR. A presente invenção se refere a microalgas transgênicas para a produção de enzimas degradadoras de parede celular tendo uma atividade celulolítica estável ao calor (HCWDEs) e seus usos relativos na biodegradação de fontes de celulose ou lignocelulose no campo industrial.

Description

MICROALGAS TRANSGÊNICAS PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS DEGRADADORAS DE PAREDE CELULAR VEGETAL TENDO UMA ATIVIDADE CELULOLÍTICA ESTÁVEL AO CALOR
[001] A presente invenção se refere a microalgas transgênicas para a produção de enzimas degradadoras de parede celular vegetal tendo uma atividade celulolítica estável ao calor (HCWDEs) e usos relativos na biodegradação de fontes de lignocelulose ou celulose no campo industrial.
[002] A lignocelulose é a fonte mais abundante de carbono orgânico do planeta e é um reservatório de carboidratos com um alto potencial de uso na produção de biocombustíveis. Infelizmente, sua natureza extremamente recalcitrante para conversão em açúcares simples limita enormemente sua exploração nesta área (Sanderson K., 2011; Saini JK et al. 2015).
[003] Métodos que incluem tratamentos físicos, físico-químicos, químicos e biológicos são comumente usados para reduzir a recalcitrância à hidrólise e promover a sacarificação (Harmsen PFH et al. 2010; Badiei M. et al. 2014; Kumar AK e Sharma S., 2017).
[004] O tratamento químico, entretanto, é prejudicial ao meio ambiente e se contrapõe à ideia de utilizar a lignocelulose para produzir uma forma de energia sustentável; além disso, esse tipo de tratamento gera derivados de reação que inibem o metabolismo microbiano, invalidando a conversão de açúcares simples em produtos bioenergéticos, como etanol, lipídios e metano (Jönsson L.J. e Martín C., 2016).
[005] Em contrapartida, embora os métodos físicos sejam relativamente não poluentes, sua aplicação em larga escala é dispendiosa (Kumar A.K. e Sharma S., 2017).
[006] Tratamento biológico envolve o uso de enzimas degradadoras de parede vegetal (CWDEs) de uma natureza microbiana, que, na maioria das vezes, são obtidas pelo cultivo de fungos mesófilos e bactérias com atividades lignocelulolíticas (Sánchez C., 2009). De modo geral, esses microrganismos secretam uma ampla gama de CWDEs, mas em pequenas quantidades, pois elas são necessárias para seus requisitos rígidos.
[007] Até o momento, o verdadeiro desafio biotecnológico consiste em selecionar cepas capazes de expressar grandes quantidades de CWDEs, que podem então ser exploradas na degradação da lignocelulose.
[008] As cepas mais promissoras devem ser caracterizadas pelas seguintes características: (i) capacidade de expressar a enzima selecionada (ii) alta produtividade (referente à quantidade de enzima produzida na unidade de tempo) e (iii) baixo custo de produção.
[009] Um organismo que é caracterizado por essas características fenotípicas é certamente um candidato válido para a produção em larga escala de CWDEs.
[010] Sob esse ponto de vista, as microalgas podem ser biofábricas promissoras, pois elas se caracterizam por uma alta taxa de crescimento e baixíssimos custos de produção (Brasil B. et al., 2017).
[011] Existem, no entanto, limitações no uso de microalgas como biofábricas de proteínas recombinantes; em primeiro lugar, um conhecimento limitado da microalga como um sistema de expressão heterólogo. A expressão nuclear de transgenes codificadores de CWDE bacterianos e fúngicos, por exemplo, já foi tentada no modelo de alga Chlamydomonas reinhardtii; o rendimento de expressão ficou abaixo das expectativas (Rasala BA et al. 2012), mesmo que a existência de um sistema celulolítico endógeno levasse a supor o oposto (Blifernez-Klassen et al., 2012).
[012] Entre os vários fatores que influenciam negativamente a expressão dos transgenes nas microalgas, o silenciamento de genes desempenha um papel predominante (Schroda M., 2006).
[013] Para evitar esse problema, os autores da presente invenção tentaram expressar pela primeira vez um conjunto de CWDEs com uma atividade estável ao calor (HCWDEs) no cloroplasto da microalga. O sucesso dessa abordagem era difícil de prever, pois a maior parte do metabolismo dos carboidratos está localizada no cloroplasto e, portanto, a expressão das celulases poderia teoricamente interferir nesse metabolismo.
[014] Por serem de origem bacteriana, as HCWDEs (abreviação para HCs) não requerem modificações pós-translacionais para seu correto funcionamento e, consequentemente, a natureza procariótica do cloroplasto é adequada para esse fim.
[015] A degradação da biomassa vegetal por meio do uso de enzimas HC estáveis ao calor tem várias vantagens em comparação com o uso de suas contrapartes enzimáticas com atividade termolábil (Anitori RP, 2012; Peng X. et al., 2015). A alta temperatura em que as HCs exercem sua atividade promove o desprendimento parcial da lignina das fibras de celulose, favorecendo a atividade das HCs, e ao mesmo tempo evita a contaminação por micróbios mesófilos (Sarmiento F. et al., 2015).
[016] Além disso, os inibidores de proteína de CWDE e as proteases de defesa de planta são inativadas por altas temperaturas e, como um resultado, quaisquer possíveis mecanismos inibitórios decorrentes dessas proteínas de defesa não podem ocorrer.
[017] A estrutura robusta das HCs, ao contrário, confere uma estabilidade enzimática marcada, mesmo na presença de reagentes químicos agressivos, detergentes iônicos e condições extremas de pH que, por sua vez, podem promover o enfraquecimento da lignocelulose, aumentando ainda mais a eficiência das reações de hidrólise enzimática.
[018] Como uma etapa adicional em direção à sustentabilidade, as microalgas que expressam HCs no cloroplasto (a seguir referidas como algas HC) também foram manipuladas para expressar o fosfito desidrogenase D (PTXD) de P. stutzeri no citoplasma, cuja expressão confere à microalga a capacidade de utilizar o íon fosfito como única fonte de fósforo, permitindo assim o crescimento da alga em meios de crescimento contendo íon fosfito, em vez do íon fosfato (Costas AMG et al., 2001; Loera-Quezada MM et al., 2016). As microalgas transgênicas duplas (a seguir referidas como algas HC-PTXD) podem ser cultivadas nesse tipo de solo sem a necessidade de usar procedimentos e materiais estéreis, pois o íon fosfito tem uma ação antifúngica e não pode ser metabolizado pela maioria das bactérias comuns.
[019] Ressalta-se que os procedimentos e materiais de esterilização têm um grande impacto no custo do cultivo de microalgas e, de fato, em alguns casos, podem representar até 50% do custo de produção final. Com referência aos preços de algumas empresas produtoras de microalgas, seu cultivo em condições de não esterilidade baixaria seus custos de produção em até € 5 kg -1 DW (Rodolfi L. et al., 2009); considerando que os produtos atualmente disponíveis no mercado à base de pós bacterianos com atividade celulolítica termolábil têm custos em torno de 30-40 € kg-1, está claro que produtos à base de microalgas transformadas com enzimas estáveis ao calor podem se provar muito competitivos.
[020] Um objetivo da presente invenção, portanto, se refere a uma combinação de microalgas transgênicas em que cada microalga transgênica expressa um fosfito desidrogenase D de origem bacteriana e uma enzima degradadora de parede celular vegetal estável ao calor selecionada a partir do grupo que consiste em endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 1), a porção com atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (SEQ ID NR: 3) e a beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NR: 5), em que a referida endoglucanase B de Thermotoga neapolitana é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para expressão de cloroplasto (SEQ ID Nr: 2), a referida porção do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para expressão de cloroplasto (SEQ ID Nr: 4), e a referida beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para expressão de cloroplasto (SEQ ID Nr: 6).
[021] Opcionalmente, uma microalga transgênica expressando um fosfito desidrogenase D de origem bacteriana e xilanase XynA de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 7) podem ser adicionadas à combinação supramencionada de microalgas transgênicas.
[022] A supramencionada xilanase XynA de Thermotoga neapolitana é preferencialmente codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID Nr: 8.
[023] De acordo com uma modalidade alternativa da presente invenção, uma microalga transgênica expressando um fosfito desidrogenase D de origem bacteriana e uma ligninase (em adição ou no lugar de xilanase), preferencialmente selecionada a partir de lacase de Thermus thermophilus (SEQ ID NR: 14) e polifenol oxidase de Thermus thermophilus (SEQ ID NR: 16), pode ser adicionada à combinação.
[024] Ainda de acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a referida enzima degradadora de parede celular vegetal estável ao calor é selecionada a partir do grupo que consiste em:
- endoglucanase B CelB de Thermotoga neapolitana (T-EG) tendo a sequência de aminoácidos:
MAEVVLTDIGATDITFKGFPVTMELNFWNVKSYEGETWLKFDGEKVQFYADIYNIV LQNPDSWVHGYPEIYYGYKPWAAHNSGTEILPVKVKDLPDFYVTLDYSIWYENDLPINLA METWITRKPDQTSVSSGDVEIMVWFYNNILMPGGQKVDEFTTTIEINGSPVETKWDVYF
APWGWDYLAFRLTTPMKDGRVKFNVKDFVEKAAEVIKKHSTRVENFDEMYFCVWEIGT EFGDPNTTAAKFGWTFKDFSVEIGEYPYDVPDYA (SEQ ID NO:1) com cauda de HA - porção com atividade de celobiohidrolase da celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (C-CBH) tendo a sequência de aminoácidos:
MGVTTSSPTPTPTPTVTVTPTPTPTPTPTVTATPTPTPTPVSTPATGGQIKVLYANKE TNSTTNTIRPWLKVVNSGSSSIDLSRVTIRYWYTVDGERAQSAVSDWAQIGASNVTFKFV KLSSSVSGADYYLEIGFKSGAGQLQPGKDTGEIQIRFNKSDWSNYNQGNDWSWLQSMT SYGENEKVTAYIDGVLVWGQEPSGATPAPTMTVAPTATPTPTLSPTVTPTPAPTQTAIPT PTLTPNPTPTSSIPDDTNDDWLYVSGNKIVDKDGRPVWLTGINWFGYNTGTNVFDGVW SCNLKDTLAEIANRGFNLLRVPISAELILNWSQGIYPKPNINYYVNPELEGKNSLEVFDIVVQ TCKEVGLKIMLDIHSIKTDAMGHIYPVWYDEKFTPEDFYKACEWITNRYKNDDTIIAFDLK NEPHGKPWQDTTFAKWDNSTDINNWKYAAETCAKRILNINPNLLIVIEGIEAYPKDDVT WTSKSSSDYYSTWWGGNLRGVRKYPINLGKYQNKVVYSPHDYGPSVYQQPWFYPGFTK ESLLQDCWRPNWAYIMEENIAPLLIGEWGGHLDGADNEKWMKYLRDYIIENHIHHTFW
CFNANSGDTGGLVGYDFTTWDEKKYSFLKPALWQDSQGRFVGLDHKRPLGTNGKNINIT TYYNNNEPEPVPASKYPYDVPDYA (SEQ ID NO:3) com cauda de HA - beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (P-BG) tendo a sequência de aminoácidos:
MAKFPKNFMFGYSWSGFQFEMGLPGSEVESDWWVWVHDKENIASGLVSGDLP ENGPAYWHLYKQDHDIAEKLGMDCIRGGIEWARIFPKPTFDVKVDVEKDEEGNIISVDVP ESTIKELEKIANMEALEHYRKIYSDWKERGKTFILNLYHWPLPLWIHDPIAVRKLGPDRAPA GWLDEKTVVEFVKFAAFVAYHLDDLVDMWSTMNEPNVVYNQGYINLRSGFPPGYLSFE AAEKAKFNLIQAHIGAYDAIKEYSEKSVGVIYAFAWHDPLAEEYKDEVEEIRKKDYEFVTILH SKGKLDWIGVNYYSRLVYGAKDGHLVPLPGYGFMSERGGFAKSGRPASDFGWEMYPEG LENLLKYLNNAYELPMIITENGMADAADRYRPHYLVSHLKAVYNAMKEGADVRGYLHW
SLTDNYEWAQGFRMRFGLVYVDFETKKRYLRPSALVFREIATQKEIPEELAHLADLKFVTR KYPYDVPDYA (SEQ ID NO:5) com cauda de HA - opcionalmente, xilanase XynA de Thermotoga neapolitana (T-XY) tendo a sequência de aminoácidos:
MATGALGFGGKGVSPFETVLVLSFEGNTDGASPFGKDVVVTASQDVAADGEYSLK VENRTSVWDGVEIDLTGKVNTGTDYLLSFHVYQTSDSPQLFSVLARTEDEKGERYKILADK VVVPNYWKEILVPFSPTFEGTPAKFSLIITSPKKTDFVFYVDNVQVLTPKEAGPKVVYETSFE KGIGDWQPRGSDVKISISPKVAHSGKKSLFVSNRQKGWHGAQISLKGILKTGKTYAFEAW VYQESGQDQTIIMTMQRKYSSDSSTKYEWIKAATVPSGQWVQLSGTYTIPAGVTVEDLT LYFESQNPTLEFYVDDVKVVDTTSAEIKLEMNPEEEIPALKDVLKDYFRVGVALPSKVFINQ KDIALISKHFNSITAENEMKPDSLLAGIENGKLKFRFETADKYIEFAQQNGMVVRGHTLV WHNQTPEWFFKDENGNLLSKEEMTERLREYIHTVVGHFKGKVYAWDVVNEAVDPNQP DGLRRSTWYQIMGPDYIELAFKFAREADPNAKLFYNDYNTFEPKKRDIIYNLVKSLKEKGLI DGIGMQCHISLATDIRQIEEAIKKFSTIPGIEIHITELDISVYRDSTSNYSEAPRTALIEQAHK MAQLFKIFKKYSNVITNVTFWGLKDDYSWRATRRNDWPLIFDKDYQAKLAYWAIVAPEV LPPLPKESKISEGEAVVVGMMDDSYMMSKPIEIYDEEGNVKATIRAIWKDSTIYVYGEVQ DATKKPAEDGVAIFINPNNERTPYLQPDDTYVVLWTNWKSEVNREDVEVKKFVGPGFRR YSFEMSITIPGVEFKKDSYIGFDVAVIDDGKWYSWSDTTNSQKTNTMNYGTLKLEGVMV ATAKYGTPVIDGEIDDIWNTTEEIETKSVAMGSLEKNATAKVRVLWDEENLYVLAIVKDPV LNKDNSNPWEQDSVEIFIDENNHKTGYYEDDDAQFRVNYMNEQSFGTGASAARFKTAV
KLIEGGYIVEAAIKWKTIKPSPNTVIGFNVQVNDANEKGQRVGIISWSDPTNNSWRDPSK FGNLRLIKYPYDVPDYA (SEQ ID NO:7) com cauda de HA - opcionalmente, lacase de Thermus thermophilus tendo a sequência de aminoácidos:
MLARRSFLQAAAGSLVLGLARAQGPSFPEPKVVRSQGGLLSLKLSATPTPLALAGQR ATLLTYGGSFPGPTLRVRPRDTVRLTLENRLPEPTNLHWHGLPISPKVDDPFLEIPPGESW TYEFTVPKELAGTFWYHPHLHGRVAPQLFAGLLGALVVESSLDAIPELREAEEHLLVLKDLA LQGGRPAPHTPMDWMNGKEGDLVLVNGALRPTLVAQKATLRLRLLNASNARYYRLALQ DHPLYLIAADGGFLEEPLEVSELLLAPGERAEVLVRLRKEGRFLLQALPYDRGAMGMMD MGGMAHAMPQGPSRPETLLYLIAPKNPKPLPLPKALSPFPTLPAPVVTRRLVLTEDMMA
ARFFINGQVFDHRRVDLKGQAQTVEVWEVENQGDMDHPFHLHVHPFQVLSVGGRPFP YRAWKDVVNLKAGEVARLLVPLREKGRTVFHCHIVEHEDRGMMGVLEVG (SEQ ID NR:14) - opcionalmente, polifenoloxidase de Thermus thermophilus tendo a sequência de aminoácidos:
MTLLRTPLPVPHGFTTREGGVSEGPFRSLNLSAATGDDPERVAENQRRVL AAFGHPPVAGLRQVHGTEVHPVEGPGLWEGDGLLTRTPGLLLRVGVADCYPLLLYHPKG AVGALHAGWRGVVGGILPKALERLEAVYRLDPTEVHLAIGPGIGGACYQVGEEVVARFAE AGLFTFREDPAAPGKYLLDLEKALLLQARRAGLREERIYRVGLCTHCAPNLFSHRRDRGRT
GRMWGLVMLPPR (SEQ ID NR:16).
[025] A sequência nucleotídica acima de endoglucanase B de Thermotoga neapolitana é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 2; a supramencionada porção CBM3GH5 do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 4; a supramencionada beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 6; a supramencionada xilanase XynA de Thermotoga neapolitana é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ
ID NR: 8; a supramencionada lacase de Thermus thermophilus é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 15 e a supramencionada oxidase de polifenol de Thermus thermophilus é codificada pela sequência nucleotídica otimizada com uso de códon para expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 17.
[026] De acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção, as microalgas transgênicas pertencem à espécie Chlamydomonas reinhardtii.
[027] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a referida fosfito desidrogenase D provém de Pseudomonas stutzeri (PTXD) e tem a seguinte sequência de aminoácidos:
MLPKLVITHRVHDEILQLLAPHCELMTNQTDSTLTREEILRRCRDAQAMMAFMPD RVDADFLQACPELRVVGCALKGFDNFDVDACTARGVWLTFVPDLLTVPTAELAIGLAVGL GRHLRAADAFVRSGEFQGWQPQFYGTGLDNATVGILGMGAIGLAMADRLQGWGATL QYHEAKALDTQTEQRLGLRQVACSELFASSDFILLALPLNADTQHLVNAELLALVRPGALL
VNPCRGSVVDEAAVLAALERGQLGGYAADVFEMEDWARADRPRLIDPALLAHPNTLFTP HIGSAVRAVRLEIERCAAQNIIQVLAGARPINAANRLPKAEPAACEF (SEQ ID NR:11)
[028] A sequência de aminoácidos supramencionada da fosfito desidrogenase D de Pseudomonas stutzeri (PTXD) é codificada pela seguinte sequência nucleotídica otimizada:
ATGCTGCCGAAGCTGGTCATCACCCACCGCGTCCACGACGAGATCCTGCAGCTG CTGGCCCCGCACTGCGAGCTGATGACGAACCAGACCGACTCGACCCTGACGCGCGAG GAGATCCTGCGCCGCTGCCGCGACGCGCAGGCTATGATGGCCTTCATGCCGGACCGC GTGGACGCTGACTTCCTGCAGGCTTGCCCGGAGCTGCGCGTGGTCGGCTGCGCTCTG AAGGGCTTCGACAACTTCGACGTGGACGCTTGCACCGCTCGCGGCGTGTGGCTGACG TTCGTCCCGGACCTGCTGACCGTGCCGACGGCTGAGCTGGCCATCGGCCTGGCTGTC GGCCTGGGCCGCCACCTGCGCGCCGCGGACGCTTTCGTGCGCTCCGGCGAGTTCCAG GGCTGGCAGCCGCAGTTCTACGGCACCGGCCTGGACAACGCTACGGTCGGCATCCTG GGCATGGGCGCTATCGGCCTGGCTATGGCTGACCGCCTGCAGGGCTGGGGCGCTAC CCTGCAGTACCACGAGGCTAAGGCCCTGGACACCCAGACGGAGCAGCGCCTGGGCC TGCGCCAGGTGGCTTGCAGCGAGCTGTTCGCCTCGTCCGACTTCATCCTGCTGGCTCT GCCGCTGAACGCTGACACCCAGCACCTGGTCAACGCTGAGCTGCTGGCTCTGGTGCG CCCCGGCGCTCTGCTGGTCAACCCGTGCCGCGGCTCTGTGGTGGACGAGGCTGCCGT GCTGGCTGCTCTGGAGCGCGGCCAGCTGGGCGGCTACGCCGCGGACGTCTTCGAGA TGGAGGACTGGGCGCGCGCTGACCGCCCGCGCCTGATCGACCCGGCTCTGCTGGCTC ACCCGAACACCCTGTTCACGCCGCACATCGGCAGCGCCGTGCGCGCGGTCCGCCTGG
AGATCGAGCGCTGCGCTGCCCAGAACATCATCCAGGTGCTGGCCGGCGCCCGCCCGA TCAACGCTGCCAACCGCCTGCCGAAGGCTGAGCCGGCTGCTTGCGAATTCTAA (SEQ ID NR: 12).
[029] A presente invenção também se refere ao uso de uma combinação de microalgas transgênicas, conforme definido acima, para a produção de uma mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor em um meio de cultura contendo o íon fosfito como uma fonte de fósforo.
[030] A presente invenção também se refere a um processo para a produção de uma mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estável ao calor, compreendendo as seguintes etapas: a) cultivo de uma combinação de microalgas transgênicas conforme definido acima em um meio de cultura compreendendo o íon fosfito como única fonte de fósforo, em um fotobiorreator; b) secar as microalgas, preferencialmente por meio de liofilização, a - 80 °C; c) extração das enzimas alternativamente por meio de sonicação, curto tratamento de calor a 80 °C, condições não desnaturantes ou condições desnaturantes.
[031] A possibilidade de crescimento de microalgas em grandes volumes graças ao uso do íon fosfito permite evitar o uso de processos de esterilização que, em larga escala, seriam economicamente insustentáveis. A título de exemplo, a mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor produzidas pela combinação de microalgas transgênicas de acordo com a presente invenção pode ser vantajosamente usada em plantas de produção de biogás para degradar o substrato celulósico nos monossacarídeos constituintes correspondentes. Isso é realizado em biorreatores a 30-40 °C, onde as bactérias presentes produzem metano. O pó liofilizado compreendendo enzimas celulolíticas estáveis ao calor pode ser usado diretamente no substrato em quantidades que variam de 1 Kg:1 tonelada de substrato a 5 Kg:1 tonelada de substrato, em tanques de tratamento apropriados a temperaturas que variam de 70 a 100 °C antes de entrar no biorreator.
[032] A presente invenção também se refere a uma mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor que pode ser obtida de acordo com o processo descrito acima, caracterizada por compreender endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 1), a porção com atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (SEQ ID NR: 3), a beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NR: 5), em uma razão [endoglucanase B de cepa g : porção de celobiohidrolase de cepa g do celulossoma CelB : beta-glicosidase de cepa g] de 20:50:30, o que corresponde a uma razão enzimática molar [mol de endoglucanase B : mol de porção de celobiohidrolase do celulossoma CelB: mol de beta-glicosidase] de 5:65:30. Essa mistura é caracterizada por uma atividade específica (unidades de Enzima por g de peso seco de mistura de algas) variando de 10 a 30 U em relação ao substrato CMC e de 8 a 24 U em relação ao substrato pNPG.
[033] Em uma modalidade adicional particularmente preferencial, a mistura de enzimas degradadoras de parede de célula vegetal que podem ser obtidas de acordo com o processo descrito acima, é caracterizada por compreender endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 1), a porção com atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (SEQ ID NR: 3), da beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NR: 5), e da xilanase XynA de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 7), em uma razão [endoglucanase B de cepa g: porção de celobiohidrolase de cepa g do celulossoma CelB: beta-glicosidase de cepa g: xilanase de cepa g] de 20:40:20:20. A adição de xilanase XynA à mistura ternária acima resulta em uma razão enzimática molar [mol. de endoglucanase B: mol. de porção de celobiohidrolase do celulossoma CelB: mol. de beta- glicosidase: mol. de xilanase] igual a 5:60:25:10. Nesse caso, a atividade específica varia de 8 a 24 U em relação ao substrato CMC, de 6 a 18 U em relação ao substrato pNPG e de 1 a 3 U em relação ao substrato xilano.
[034] As misturas de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor, de acordo com a invenção definida acima, podem, ainda, ser caracterizadas por compreenderem, adicional ou alternativamente (à xilanase), uma ligninase selecionada a partir de lacase de Thermus thermophilus (SEQ ID NR: 14) e polifenoloxidase de Thermus thermophilus (SEQ ID NR: 16).
[035] De acordo com uma modalidade particularmente preferencial, a mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estável ao calor da invenção, está na forma de um pó liofilizado.
[036] Por fim, a invenção se refere ao uso de xilanase XynA de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 7) em mistura com enzimas degradáveis de parede celular vegetal estáveis ao calor do tipo hemicelulase compreendendo endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 1), a porção com uma atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (SEQ ID NR: 3) e beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NR: 5) como tratamento preventivo para a biodegradação de substratos à base de lignocelulose.
[037] Um objetivo adicional da presente invenção se refere ao uso das misturas de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estável ao calor definidas acima para a biodegradação de substratos à base de celulose (ou seja, polpa de papel) ou lignocelulose (por exemplo, na produção de biocombustíveis). Neste último caso, é obviamente necessário fornecer a inclusão de microalgas na mistura, uma microalga transformada para expressar enzimas do tipo ligninase.
[038] A presente invenção será agora descrita para fins ilustrativos, mas não limitantes, de acordo com uma modalidade preferencial com referência particular às figuras anexas, em que: - a Figura 1 mostra uma representação gráfica da célula de C. reinhardtii como uma biofábrica de enzimas HC. a) Lista de enzimas que compõem a maquinaria celulolítica [T-EG = Endoglucanase, C-CBH = Celobiohidrolase, P-BG = beta-glicosidase, T-XY = Xilanase]. b) Cada cepa co-expressa a enzima fosfito desidrogenase (PTXD) e uma das enzimas HC mostradas em a). - a Figura 2 mostra os resultados da avaliação da condição homoplasmática em algas HC. O amplicon de 404 e 350 pb indica a presença da região repetida invertida (IR) do tipo selvagem (WT) e de plasmídeo de cloroplasto recombinante, respectivamente. O DNA da cepa 1a+ e o plasmídeo pLM20 foram utilizados como controle negativo e positivo da condição homoplasmática, respectivamente. A análise de quatro transformantes da alga expressando T-EG (nº 1-4) é mostrada como um resultado representativo. - a Figura 3 mostra a expressão do cloroplasto das HCs. a) Avaliação da atividade das várias HCs nos extratos de célula de C. reinhardtii obtidos por ruptura mecânica (sonicação + esferas), por tratamento com detergentes aniônicos (2% SDS), com detergentes não iônicos e tratamento térmico (0,3% Tween20 + calor), e com tratamento de calor por si só (calor). b) Análise de imunodecoração realizada em extratos de célula de C. reinhardtii usando tratamento com detergente não iônico e calor.
A atividade enzimática é expressa em Unidades de Enzima (µmols min-1) por grama (DW = peso seco) de alga e foi avaliada a um pH de 5,5 e 75 °C. [T-EG: Endolgucanase de Thermotoga neapolitana, CBH-100; Celobiohidrolase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, P-BG: beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus, T-XY: Endoxilanase de Thermotoga neapolitana]. - a Figura 4 mostra os resultados da determinação das atividades específicas. a) Atividade de HC em frações eluídas (fx) de cromatografia de troca aniônica expressa como atividade relativa (%). O gradiente de eluição ao lado também é indicado. b) Análise SDS-PAGE (esquerda) e imunodecoração (direita) realizada nas frações que apresentaram a maior atividade. [T-EG: Endoglucanase de Thermotoga neapolitana, CBH-100; Celobiohidrolase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, P-BG: beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus, T-XY: Endoxilanase de Thermotoga neapolitana]. - a Figura 5 mostra o crescimento de algas HC (cepa HC) e algas HC-PTXD (cepa HC-PTXD) em condições de mixotrofia usando um meio de crescimento em que o íon fosfato foi substituído pelo íon fosfito. - a Figura 6 mostra os histogramas que ilustram os resultados da otimização das condições de expressão em algas C-CBH-PTXD. a) Atividade enzimática de extratos de célula de culturas de algas cultivadas por sete dias em condições fotoautotróficas usando três diferentes intensidades de luz. b) Atividade enzimática de extratos de célula de culturas de algas cultivadas por sete dias a 50 µmol m-2 s-1 usando diferentes meios de crescimento [TAP: Meio Tris-Acetato-Fosfato; TA-Phi: Meio TAP em que o fosfato foi substituído por fosfito a 1 mM; T10A-Phi: TA-Phi com 10% de Tris; T10A-Phi NS: T10A-Phi obtido com materiais e condições não estéreis]. c) Atividade enzimática de extratos de célula de culturas de algas crescidas por sete dias em T10A-Phi NS usando diferentes intensidades de luz.
Os números acima das colunas indicam a biomassa produzida (DW = peso seco) por litro de cultura.
Os valores foram calculados como a média de duas replicatas biológicas diferentes.
A concentração do inóculo inicial foi de 2,5x105 célula mL-1. d) Crescimento de C- CBH-PTXD nos dois fotobiorreatores com uma coluna de 60 L cada, usando materiais e condições não estéreis. - a Figura 7 mostra os dados de conversão da celulose PASC com extratos de proteína de diferentes misturas de HC-PTXD. a) Conversão de celulose PASC (0,6% p/v) em extremidades redutoras (barra branca) e açúcares (barra cinza) após 24 horas de incubação com os extratos de proteína de diferentes misturas de HC-PTXD (nº 1-11). Os números indicam a porcentagem (p/p) da cepa HC- PTXD correspondente usada em cada mistura. b) Conversão de celulose PASC (0,6% p/v) em extremidades redutoras e açúcares após 24 horas de incubação com o extrato proteico da mistura de HC-PTXD nº 8. Celulose PASC fresca (0,6%, p/v) foi adicionada à mesma mistura de reação a cada 24 horas.
Cada porcentagem de conversão se refere à última adição de celulose PASC. c) Avaliação da atividade na mistura de HC-PTXD (à qual também foi adicionada a alga T-XY, 20%, p/p) contra CMC (barra cinza), pNPG (barra branca) e xilano (barra preta) antes (Mistura HC-PTXD) e após liofilização e armazenamento por 1 mês à temperatura ambiente (mistura liofilizada de HC-PTXD). - a Figura 8 mostra os resultados de uma comparação da hidrólise por meio de celulase (mistura CC = Celluclast + Cellobiase) e com a mistura da invenção também compreendendo xilanase (mistura HH = αAF + βG + ManB/5A XynA + GghA) para a conversão dos substratos de lignocelulose. Os painéis A e B mostram a liberação de açúcares da palha de cevada após tratamento alcalino (A) e farelo de milho após tratamento alcalino (B) após vários tratamentos enzimáticos. O teor de glicose (barra preta) e açúcares totais (barra cinza) em filtrados tratados com ácido foram determinados por GO-POD e testes com ácido fenol-sulfúrico, respectivamente. O painel C mostra a análise da composição de monossacarídeos nos filtrados tratados com ácidos de palha de cevada (barra preta) e palha de trigo (barra cinza) após o tratamento com a mistura HH, conforme determinada por HPAEC-PAD. +/- indicam tratamento com mistura enzimática ativa/autoclavada. Os dados são expressos como média ± SD, n = 3. Os valores indicados com as mesmas letras (a-e) não são significativamente diferentes (teste ANOVA, P <0,05). - a Figura 9 mostra a análise da composição de monossacarídeos dos filtrados tratados com ácidos, provenientes de palha de cevada e farelo de milho após tratamento alcalino após a reação enzimática conforme determinada por HPAEC-PAD. O painel (C) mostra a análise cromatográfica de monossacarídeos padrão (HPAEC-PAD) de filtrados de palha de cevada (A) e farelo de milho (B) após o tratamento com misturas HH (mistura HH = αAF + βG + ManB/5A + XynA + GghA) e CC (Mistura CC = Celluclast + Cellobiase).
[039] Os exemplos a seguir serão agora fornecidos para melhor ilustrar a invenção, os quais devem ser considerados ilustrativos e não limitativos da mesma. EXEMPLO 1: Síntese e clonagem in vitro de genes que codificam HCs
MATERIAIS E MÉTODOS Expressão de cloroplasto de enzimas celulolíticas em C. reinhardtii
[040] Endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (T-EG) (Bok JD et al.,
1998), a porção com uma atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus conhecida como CBM3GH5 (C-CBH; Park JI et al., 2011; US 9.624.482 B2) e beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (P-BG) Kengen SWM et al., 1993; Kado Y. et al., 2011) foram selecionados como os principais componentes da máquina celulolítica a serem expressos no cloroplasto da microalga.
[041] Além disso, a xilanase XynA de T. neapolitana (T-XY) (Zverlov et al., 1996) foi incluída como uma enzima de suporte para a degradação de substratos mais complexos (Hu J. et al. 2011) como xilano, um substrato de XynA, é uma das hemiceluloses mais abundantes e sua presença pode inibir a atividade da celulase. As quatro HCs foram expressas individualmente no cloroplasto de C. reinhardtii de forma a compartimentar e, ao mesmo tempo, maximizar sua expressão (Rochaix JD et al., 2014). A co-expressão das HCs na mesma célula foi evitada, pois uma reação de hidrólise eficiente requer quantidades precisas de cada enzima e, no caso de co-expressão, isso não pode ser gerenciado pelo operador.
[042] Em particular, as seguintes sequências de proteína CelB de T. neapolitana (UniprotKB: P96492, aa 18-274) (SEQ ID NR: 1; SEQ ID NR: 2), a porção CBM3GH5 do celulossoma CelB de C. saccharolyticus (UniprotKB: P10474, aa 380-1039) (SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 4), a beta-glicosidase de P. furiosus (UniprotKB: Q51723, aa 1-472) (SEQ. ID NR: 5, SEQ ID NR: 6) e xilanase XynA de T. neapolitana (UniprotKB: Q60042, aa 30-1055) (SEQ. ID NR: 7, SEQ ID NR: 8) foram convertidas em sequências de nucleotídeos otimizada com uso de códon para expressão de cloroplasto em C. reinhardtii usando o programa OPTIMIZER.
[043] As sequências que codificam as enzimas que compõem a máquina celulolítica (Figura 1) foram otimizadas para a expressão de cloroplasto de C.
reinhardtii e fundidas em 3’ com a sequência que codifica o epítopo de HA (C- terminal da sequência de proteína) o que permitiu que elas fossem detectadas por análise de imunodecoração. Os genes foram posteriormente clonados em um vetor de expressão otimizado para expressão de cloroplasto (Day A. e Goldschmidt-Clermont M. 2011; Michelet L. et al., 2011) e introduzidos individualmente em C. reinhardtii por bombardeamento de arma de biolística (Purton S., 2007). Os transformantes obtidos foram submetidos a ciclos de seleção repetidos para promover a condição de homoplasmia que foi então confirmada por análise de PCR no DNA dos transformantes (Figura 2).
[044] A possível presença de peptídeos sinais para secreção em um ambiente extracelular foi excluída através do uso do programa Signal IP 4.1 Server. A sequência que codifica o epítopo HA (YPYDVPDYA) foi adicionada a 3’ de cada sequência. As sequências contendo os sítios de restrição NcoI e SphI foram fundidas em 5’ e 3', respectivamente, de cada sequência. As sequências intragênicas contendo os sítios de restrição NcoI, SphI, ClaI e SmaI foram cuidadosamente mutadas a fim de eliminar a presença do sítio de restrição sem alterar a sequência de proteína resultante. Os genes foram então sintetizados in vitro pela GeneArt (Life Technologies). Os genes sintéticos foram clonados separadamente a jusante do promotor que regula a expressão do gene psaA dentro do vetor pCLE (SEQ ID NR: 9) usando os sítios de restrição NcoI e SphI. O cassete de expressão incluindo o transgene e o gene aadA que confere resistência à espectinomicina foi subsequentemente excisado do vetor pCLE usando os sítios de restrição ClaI e SmaI e transferido para o vetor de expressão pLM20 (Michelet L. et al. 2011) (SEQ ID NR: 10). A cepa de E. coli XL10gold (Agilent Technologies) foi transformada com esses constructos e usada para a propagação do DNA recombinante. Transformação e seleção das cepas HC-PTXD
[045] As quatro cepas de algas HC foram posteriormente modificadas para a expressão do gene PTXD Pseudomonas stutzeri que codifica uma oxidorredutase (Costas AMG, 2001), cuja expressão confere à microalga a capacidade de metabolizar o íon fosfito como única fonte de fósforo (López- Arredondo D. e Herrera-Estrella L., 2012; Loera-Quezada MM et al., 2015; US 2012/0295303 A1). A cepa de C. reinhardtii usada é a 1a+. Para a transformação de cloroplasto de genes que expressam as enzimas HC, a 1a+ foi transformada usando os mesmos procedimentos e instrumentações descritos em Faè et al., 2017. A seleção de transformantes homoplasmáticos foi conduzida como indicado em Goldschmidt-Clermont, 1991.
[046] Para expressão nuclear de PTXD (SEQ ID NR. 11; SEQ ID NR: 12), as algas HC foram eletroporadas usando o mesmo constructo usado em (Loera- Quezada MM et al., 2016) (SEQ ID NR: 13) e os transformantes obtidos (denominados algas HC-PTXID) foram analisados quanto à sua capacidade de crescimento em meios de cultura contendo o íon fosfito em vez do íon fosfato. Em particular, a seleção de transformantes que expressam PTXD foi realizada monitorando o crescimento de transformantes em um meio de crescimento consistindo apenas em TA (Tris Acetato) e íon fosfito em uma concentração de 0,3 mM, a uma temperatura de 25 °C e uma intensidade de 50 µmol m -2 s-1. Os transformantes capazes de crescer nessas condições foram inoculados em meios de crescimento com uma concentração aumentada de íon fosfito (até 5 mM) e então selecionados como algas HC-PTXD (Figura 5). Crescimento de C. reinhardtii
[047] Em uma pequena escala, C. reinhardtii foi propagado em um sistema do tipo multicultivador (Photon System Instruments) a uma temperatura de 25 °C, uma intensidade luminosa de 50 µmol m-2 s-1 e ar borbulhante. O crescimento das algas HC-PTXD foi realizado em versões modificadas dos meios de crescimento HS e TAP em que a fonte de fósforo consiste em diferentes concentrações de íon fosfito de 0,3 a 5 mM. O meio de crescimento T10A-Phi consiste em 10% da concentração normal de Tris usado na preparação do meio de crescimento TAP (ou seja, 0,2 g L-1) O crescimento de C. reinhardtii em um meio de crescimento não estéril envolveu o uso de água corrente da torneira. Para o crescimento de C. reinhardtii em larga escala, foi adotado um fotobiorreator de coluna de 60 L (produzido pela SCUBLA srl), no qual foram usadas as condições de crescimento que permitiram a maior produtividade em uma pequena escala (sistema de multicultivadores). Otimização da expressão de cloroplasto na microalga HC-PTXD
[048] Com o objetivo de determinar as condições de crescimento que permitiram um maior acúmulo da enzima HC, a atividade do C-CBH, indicada na presente invenção como uma expressão de uma enzima HC de referência, foi avaliada pelo cultivo da microalga em diferentes condições de luz e meios de crescimento (Figura 6, painéis a-c). O fato de o crescimento da cepa C-CBH- PTXD em condições de não esterilidade (por exemplo, usando água corrente não estéril) não ter afetado os níveis de expressão da enzima C-CBH (Figura 6, painel b) é notável. Entre as várias condições de luz testadas, a biomassa de algas inferior obtida em condições de luz igual a 50 µmol m-2 s-1 (0,7 g L-1) foi, no entanto, equilibrada por um nível de expressão mais alto da enzima (15,3 U gr-1) indicando que a intensidade da luz de 50 µmol m-2 s-1 é ótima para a expressão de enzimas HC em condições de mixotrofia (10,7 U L-1) (Figura 6, painel c). A mesma produtividade de C-CBH também foi obtida em fotobiorreatores de coluna de 60 L usando uma versão mais econômica do meio de crescimento TAP, consistindo em 10% da concentração de Tris comumente usada, bem como íon fosfito em vez de íon fosfato e água corrente não estéril (Figura 6, painel d).
Extração de proteína de C. reinhardtii e ensaios enzimáticos
[049] A extração de proteína foi realizada usando diferentes métodos e condições das células liofilizadas de C. reinhardtii. Após liofilização, o pó resultante foi armazenado à temperatura ambiente por 1 mês ou, por períodos mais longos, a -80 °C. As algas liofilizadas foram ressuspensas em uma razão [1 mL de tampão de extração : 6 mg de peso seco de microalgas]. A extração em condições não desnaturantes foi realizada usando um tampão de lise consistindo em citrato a 10 mM, pH 5,5 e 0,3% de Tween20. As amostras ressuspensas foram incubadas sob agitação moderada por 1 h a 70 °C. Para extração por ruptura mecânica, as células foram incubadas por 30 minutos em banho Ultrassônico (Sigma-Aldritch), na presença de esferas de vidro com um diâmetro de 425-600 µm (Sigma-Aldritch). A extração em condições desnaturantes foi realizada usando um tampão de lise consistindo em Tris-HCl a 20 mM, pH 7,0, 2% de SDS e EDTA a 10 mM. A ressuspensão da amostra foi realizada em uma razão [1 mL de tampão de extração : 6 mg de peso seco de microalgas]. Após a extração, a amostra foi centrifugada (14.000r x 10 minutos) e o sobrenadante usado para a análise. As proteínas totais de 60 µg de peso seco de biomassa de algas foram analisadas por SDS-PAGE ou por ensaio enzimático; um anticorpo monoclonal AbHA (clone HA7, Sigma-Aldritch) foi usado para a análise de imunodecoração.
[050] Para os ensaios enzimáticos, os extratos de proteína (1/10 do volume total de reação) foram incubados em um tampão consistindo em Acetato de Sódio a 50 mM, pH 5,5, e substrato nas seguintes concentrações: CMC a 1% (para avaliar a atividade de endoglucanase de T-EG e celobiohidrolase de C-CBH), pNPG a 5 mM (para avaliar a atividade de beta- glicosidase de P-BG) e de xilano a 1% (para avaliar a atividade de xilanase de T- XY). Todos os substratos foram adquiridos da Sigma-Aldritch. As condições ideais de pH e temperatura para as reações enzimáticas foram estabelecidas com base nas caracterizações enzimáticas indicadas previamente em Kengen S.W.M. et al. 1993; Zverlov V. et al., 1996; Bok J.D. et al. 1998; Park J.I. et al. 2011, escolhendo um único valor de temperatura e pH para a condução de todas as reações (ou seja, 75 °C e pH 5,5).
[051] A atividade foi expressa como Unidades de Enzima (µmols de extremidades de redução min-1 ou µmols de p-nitrofenol min-1) por grama (g) de peso seco (DW) de microalga. A determinação dos micromols de extremidades de redução após a hidrólise enzimática foi realizada como em (Lever M., 1972) usando diferentes quantidades de glicose como uma curva de calibração. A determinação dos µmols de p-nitrofenol liberado após a hidrólise foi realizada usando diferentes quantidades de p-nitrofenol como uma curva de calibração. Os valores das Unidades de Enzimas foram calculados como a média de dois tempos de reação diferentes; a mesma reação realizada usando extratos de célula autoclavados foi usada como controle negativo. Purificação de HCs e determinação da atividade específica
[052] Para a purificação das HCs, a extração em condições não desnaturantes foi realizada a partir de 100 mg de C. reinhardtii liofilizado usando um tampão modificado (Tris-HCl a 10 mM, pH 7,5, Tween20 a 0,3%) em uma razão [1 mL de tampão de extração : 6 mg de peso seco de microalgas]. Após 1 hora de incubação a 70 °C, seguida pela centrifugação da amostra (14.000r x 10 minutos), o sobrenadante foi carregado sobre uma coluna cromatográfica de Q-sepharose (Amersham) pré-equilibrada com Tris-HCl a 20 mM, pH 7,5. A eluição foi realizada usando um gradiente escalonado de NaCl. As frações eluídas da coluna Q-sepharose foram analisadas por ensaio de atividade. As frações que apresentaram maior atividade foram analisadas por SDS-PAGE para determinar a concentração de enzima usando diferentes quantidades de BSA como curva de calibração.
[053] A determinação da concentração foi realizada por meio do programa Quantity-One (Biorad). A identidade das bandas foi confirmada por análise de imunodecoração. A atividade específica foi usada para determinar os níveis de expressão de cada enzima para cada cepa de algas HCG. A atividade específica das várias HCs foi avaliada em 75 °C e pH 5,5. Avaliação da atividade enzimática de HCs
[054] A atividade enzimática das HCs foi então avaliada em extratos de célula de C. reinhardtii; diferentes métodos de extração, tais como sonicação na presença de esferas de vidro ou tratamento com detergentes aniônicos e não iônicos, foram usados para determinar qual método seria o mais adequado para a extração das enzimas. As HCs foram extraídas de forma eficiente ao incubar as células em 70 °C na presença de 0,3% (v/v) de Tween20, como mostrado pelos níveis de atividade comparáveis aos obtidos por ruptura mecânica de célula (Figura 3, painel a).
[055] É notável o fato de que as enzimas T-EG e C-CBH foram resistentes ao tratamento de SDS, sugerindo sua possível aplicação em tampões de reação contendo detergentes aniônicos (Li Y. et al., 2016). A análise de imunodecoração confirmou a presença das quatro enzimas nos lisados de célula que, como indicado pelas diferentes intensidades de sinal, foram expressas em diferentes níveis (Figura 3, painel b). Neste caso, os inibidores de protease não foram adicionados ao tampão de extração a fim de simular as condições de extração e reação reais.
[056] Um procedimento de purificação que consiste em um enriquecimento térmico (Patchett ML et al., 1989) seguido por uma cromatografia de troca aniônica (AEC) permitiu que as quatro enzimas fossem purificadas; como elas são proteínas com ponto isoelétrico ácido, elas foram retidas pela coluna cromatográfica em condições de pH neutro e fora eluídas com concentrações de NaCl variando de 0,3 a 0,6 M.
[057] A atividade das várias enzimas foi usada para verificar a sua presença nas diferentes frações eluídas da cromatografia AEC (Figura 4, painel a). As frações que apresentaram maiores atividades foram avaliadas por análise de SDS-PAGE e análise de imunodecoração; o último confirmou as bandas com o peso molecular esperado para cada enzima isolada (Figura 4, painel b).
[058] Depois de determinar a concentração de cada enzima nas várias frações, a atividade específica (expressa como Unidades de Enzima por mg de enzima) foi calculada (Figura 4, painel c) que, por sua vez, permitiu que o nível nos extratos de célula iniciais fosse estimado.
[059] A Tabela 1 a seguir mostra os resultados da atividade específica das várias HCs em relação aos substratos de carboximetilcelulose (CMC) a 1%, paranitrofenilglucosídeo (pNPG) a 5 mM e xilano (Xylan) a 1%. Tabela 1 U T-EG P-BG C-CBH T-XY mg-1 CMC 384 ± 12 - 23,8 ± 0,1 - pNPG 99,8 ± 1,4 - xilano - - - 52,6 ± 2,1
[060] O maior rendimento foi obtido para a celobiohidrolase C-CBH (0,8-1 mg g-1 DW alga), seguido por beta-glicosidase P-BG (0,3-0,4 mg g-1 DW alga) e xilanase T-XY (0,2-0,3 mg g-1 DW alga). O rendimento de endoglucanase foi o mais baixo (0,02-0,03 mg g-1 DW alga) de acordo com o baixo sinal detectado pela análise de imunodecoração nos extratos de célula (Figura 3, painel b).
[061] Deve-se ressaltar, entretanto, que quaisquer contaminantes nos extratos de célula brutos podem interferir na atividade enzimática, resultando em uma subestimação do nível de expressão real da enzima. Pré-tratamento de celulose PASC com pó à base de algas
[062] A celulose pré-tratada com ácido fosfórico (PASC) foi preparada conforme descrito em Cannella D. et al., 2016. A celulose PASC obtida após este procedimento é caracterizada por um teor de açúcar (glicose) maior do que 90% (p/p). 0,6 g de mistura liofilizada de HC-PTXD foi ressuspensa em 100 mL de tampão de extração não desnaturante e incubada em 70 °C por 1 hora. Ao final da incubação, a amostra foi centrifugada (14.000r x 10 min) e o sobrenadante usado para ensaios enzimáticos. Por esta razão, celulose PASC foi adicionada ao sobrenadante (0,3 ppure 0,6%, p/v) e a reação foi incubada em 75 °C durante 24 horas. A fim de testar a resistência térmica das HCs, a mistura de reação foi adicionada com celulose PASC fresca a cada 24 horas. A reação à qual nenhuma nova PASC foi adicionada foi usada como um controle negativo da reação à qual PASC foi adicionada. Este procedimento foi repetido por um total de 4 ciclos de 24 horas cada. Antes da análise dos açúcares solúveis, a amostra foi centrifugada (4.000r x 5 min) e o sobrenadante utilizado para análises subsequentes. A conversão (%) se refere à porcentagem em peso (extremidades de redução e açúcares totais) liberada pela celulose PASC. Determinação de carboidratos em celulose PASC
[063] A determinação dos µmols de extremidades de redução libertadas após hidrólise enzimática foi efetuada de acordo com (Lever M., 1972) usando diferentes quantidades de glicose como uma curva de calibração. Os açúcares totais foram determinados pelo ensaio colorimétrico de ácido fenol-sulfúrico (Dubois M. et al., 1956). Os açúcares totais contidos na celulose PASC foram determinados após hidrólise ácida do substrato realizada seguindo o procedimento descrito pelo Procedimento Analítico de Laboratório do Laboratório Nacional de Energia Renovável: a amostra foi primeiramente dissolvida em 72% de ácido sulfúrico (v/v) a uma temperatura de 30 °C por 1 hora e foi então diluída para uma concentração final de ácido sulfúrico de 4% (v/v) e incubada a uma temperatura de 120 °C por 1 hora. O sobrenadante foi então testado para determinar a quantidade de açúcares solubilizados. Os açúcares foram então determinados pelo teste colorimétrico de ácido fenol- sulfúrico. Os valores registrados são uma média de três replicatas independentes (Dubois M. et al., 1956). Otimização da mistura de HC-PTXD
[064] A fim de otimizar o produto à base de algas para a degradação do material lignocelulósico, diferentes misturas das várias cepas que expressam as enzimas HC (ou seja, HC-PTXD-algas) foram testados e também sua estabilidade após armazenamento de longo prazo. Deve-se ressaltar que as enzimas selecionadas são todas caracterizadas por um pH ótimo variando de 5 a 6, o que permitiu seu uso simultâneo sem perdas de atividade significativas (Kengen SWM et al. 1993; Zverlov V. et al., 1996; Bok JD et al. al. 1998; Park JI et al. 2011). A capacidade degradadora dos extratos obtidos a partir de 11 diferentes misturas das quatro algas HC-PTXD foi testada usando, como substrato, celulose pré-tratada com ácido fosfórico, cuja sigla é PASC. Após 1 dia de incubação em 75 °C, a maior conversão do substrato de PASC em açúcares solúveis (expressa como agentes de redução e açúcares totais) foi obtida a partir da mistura nº 8 (Figura 7, painel a), cuja composição [T-EG: C- CBH: P-BG] é 20:50:30 (p/p/p).
[065] A formulação HC-PTXD nº 8, a seguir referida como mistura de HC- PTXD, é caracterizada por um teor de enzima celulolítica de 0,1% (p/p: 5% T- EG, 66% C-CBH, 29% P-BG correspondendo a 0,01 mg de T-EG, 0,5 mg de C-CBH e 0,15 mg de P-BG para g DW alga).
[066] Para determinar também a resistência térmica das enzimas HC,
PASC fresca foi adicionada aos extratos de célula a cada 24 horas por um período total de quatro dias. A atividade enzimática permaneceu inalterada até a terceira adição de PASC, indicando que as enzimas permaneceram estáveis até o terceiro dia de reação (Figura 7, painel b).
[067] Nesses experimentos, foram utilizados pós de algas da mistura de HC-PTXD, obtidos por liofilização, e que foram armazenados em temperatura ambiente por um mês antes de serem utilizados. Nem o procedimento de liofilização nem as condições de armazenamento alteraram a funcionalidade das enzimas, indicando que o cloroplasto de C. reinhardtii é um compartimento eficaz para a preservação de enzimas celulolíticas com atividade estáveis ao calor (Figura 7, painel c).
[068] Uma análise mais aprofundada da especificidade de substrato da mistura de HC-PTXD mostrou que a mistura também é ativa contra a celulose microcristalina, mesmo se em um nível inferior (ou seja, Avicell PH101).
[069] A seguinte Tabela 2 indica a atividade específica da mistura de HC- PTXD em relação aos diferentes substratos de celulose CMC 1% (p/v), celulose PASC 0,6% (p/v) e Avicell 2,5% (p/v). A atividade enzimática é expressa como Unidades de Enzima (µmols min-1) por grama (dw) de mistura de HC-PTXD e é calculada a pH 5,5 e 75 °C. Tabela 2 Unidades de Enzima gr-1 CMC PASC AVICELL Mistura HC-PTXD 16,1 ± 3,25 3,1 ± 0,21 0,6 ± 0,04 EXEMPLO 2: A atividade da xilanase XynA aumenta a atividade de celulase em substratos lignocelulósicos Materiais e métodos
[070] A palha da cevada (Hordeum vulgare) foi fornecida pelo Prof. Felice Cervone (Departamento de Biologia e Biotecnologia, Università La Sapienza,
Roma). O farelo de milho (Zea mays) foi fornecido pelo Prof. David Bolzonella (Departamento de Biotecnologia, Universidade de Verona). Em ambos os casos, o material lignocelulósico foi pré-tratado com uma solução alcalina moderada. O material foi homogeneizado em nitrogênio líquido e misturado com 0,1 g de NaOH por g de substrato em um volume apropriado de água para render uma solução de NaOH a 4%. As amostras foram incubadas em 75 °C por 2 horas e a fração sólida insolúvel foi lavada várias vezes com água ultrapura antes da liofilização e armazenamento em temperatura ambiente. Para os ensaios enzimáticos, esta fração sólida insolúvel (1,5% p/v) foi incubada em um tampão de citrato-fosfato a 50 mM (pH 6) com uma mistura de 0,5% (v/v) de Celuclast/Celobiase (mistura CC) ou com uma mistura de 0,1 mg mL-1 de hemicelulase suplementada com 0,02% de NaN3 (Mistura HH). A mistura CC compreende 0,4% (v/v) de celulase de Trichoderma reseei (Celuclast) e 0,1% (v/v) de celobiase de Aspergillus niger (Cellobiase) de Sigma-Aldrich. A mistura HH compreende quantidades equimolares de cada enzima hemicelulase termofílica de T. neapolitana e, em particular, αAF: alfa-arabinofuranosidase, degrada arabinose de polissacarídeos, tais como galactano e xilano βG: beta-endogalactanase, degrada galactano (consistindo em galactose) ManB/5A: beta-endomananase, degrada manana (consistindo em manose) XynA: beta-endoxilanase, degrada xilano (consistindo em xilose) GghA: beta-glicano glicohidrolase, degrada alguns dissacarídeos
[071] Uma degradação de enzima de duas etapas também foi realizada em que a amostra foi incubada primeiramente em 75 °C por 24 horas com a mistura HH e depois em 37 °C por mais 24 horas com a mistura CC.
[072] Misturas enzimáticas inativadas foram adicionadas ao mesmo tempo que os controles negativos. O rendimento de açúcares solúveis foi avaliado ao final da reação pelo ensaio de ácido fenol-sulfúrico. (Dubois M. et al., 1956). A hidrólise do substrato foi indicada como uma quantidade de açúcares (g) liberada em proporção ao peso do material lignocelulósico insolúvel tratado com álcalis (g) e expressa em termos percentuais. A glicose nos filtrados neutralizados com ácido foi quantificada usando o kit de ensaio de glicose oxidase/peroxidase (GOPOD) da Megazyme.
[073] A composição dos monossacarídeos dos materiais lignocelulósicos tratados com álcalis e dos filtrados de reação foi determinada em amostras neutralizadas com ácidos por meio de cromatografia de troca aniônica de alto desempenho acoplada à detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Resultados
[074] A Figura 8 mostra os dados de comparação da hidrólise de substratos de lignocelulose por meio de uma mistura de celulases (mistura CC = Celuclast + Cellobiase) e com uma mistura de hemicelulases compreendendo também xilanase XynA (mistura HH = αAF + βG + ManB/5A + XynA + GghA).
[075] Esta análise mostra que o pré-tratamento com hemicelulases é capaz de potencializar a ação das celulases; isso pode ser deduzido na Figura 8, painéis AB comparando a liberação de glicose (barra preta) pelas celulases quando o material foi pré-tratado com hemicelulases (+, +) em comparação com aquela liberada quando o material foi tratado apenas com celulases (-, +).
[076] Na Figura 8, painel C, os açúcares liberados pelo pré-tratamento com hemicelulase são analisados e há uma prevalência marcada de xilose (o produto final da degradação da xilano, o substrato de XynA) em ambos os substratos lignocelulósicos (palha de cevada e farelo de milho)
[077] A Figura 9, por outro lado, mostra os resultados da análise qualitativa e quantitativa por meio da cromatografia HPAEC-PAD dos hidrolisados de materiais lignocelulósicos (palha de cevada e farelo de milho) após tratamento com hemicelulase e celulase. A análise mostra que a liberação aumentada de glicose (produto da degradação das celulases) está sempre associada a uma liberação marcada de xilose (o constituinte do xilano, substrato de XynA) em ambos os substratos lignocelulósicos tratados com misturas enzimáticas.
[078] Esses resultados, em geral, mostram como o aumento da liberação de glicose pelas celulases pode ser atribuído à ação sinérgica da adição de xilanase. Bibliografia - Anitori RP (2012). Extremophiles: microbiology and biotechnology. Caister Academic Press. - Badiei M, Asim N, Jahim JM, Sopian K (2014). APCBEE Procedia 9:170–
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Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Uma combinação de microalgas transgênicas em que cada microalga transgênica expressa uma fosfito desidrogenase D de uma origem bacteriana e uma enzima degradadora de parede celular vegetal estável ao calor selecionada a partir do grupo que consiste em endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 1), a porção com uma atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (SEQ ID NR: 3) e beta- glicosidase de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NR: 5), em que a referida endoglucanase B de Thermotoga neapolitana é codificada pela sequência de nucleotídeo otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 2, a referida porção do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus é codificada pela sequência de nucleotídeo otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 4, e a referida beta- glicosidase de Pyrococcus furiosus é codificada pela sequência de nucleotídeos otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 6.
2. A combinação de microalgas transgênicas de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda uma microalga transgênica expressando uma fosfito desidrogenase D de origem bacteriana e xilanase XynA de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 7).
3. A combinação de microalgas transgênicas de acordo com a reivindicação 2, em que a referida xilanase XynA de Thermotoga neapolitana é codificada pela sequência de nucleotídeos otimizada com uso de códon para a expressão de cloroplasto SEQ ID NR: 8.
4. A combinação de microalgas transgênicas de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, compreendendo ainda uma microalga transgênica que expressa uma fosfito desidrogenase D de origem bacteriana e uma ligninase selecionada a partir de lacase de Thermus thermophilus (SEQ ID NR: 14) e polifenoloxidase de Thermus thermophilus (SEQ ID NR: 16).
5. A combinação de microalgas transgênicas de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, pertencendo à espécie Chlamydomonas reinhardtii.
6. A combinação de microalgas transgênicas de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida fosfito desidrogenase D advém de Pseudomonas stutzeri (SEQ ID NR: 11) e é codificada pela sequência de nucleotídeo SEQ ID NR: 12
7. Uso de uma combinação de microalgas transgênicas de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, para a produção de uma mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor em um meio de cultura compreendendo o íon fosfato como única fonte de fósforo.
8. Um processo para a produção de uma mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor, compreendendo as seguintes etapas: a) cultivo de uma combinação de microalgas transgênicas de acordo com qualquer das reivindicações 1-6 em um meio de cultura compreendendo o íon fosfato como única fonte de fósforo, em um fotobiorreator; b) liofilização das microalgas; c) extração das enzimas alternativamente por sonicação, curto tratamento de calor a 80 °C, condições não desnaturantes ou condições desnaturantes.
9. Uma mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor que podem ser obtidas de acordo com o processo da reivindicação 8, a referida mistura sendo caracterizada pelo fato de que compreende endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 1), a porção com uma atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (SEQ ID NR: 3), beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NR: 5), em uma razão [endoglucanase B de cepa g :
porção de celobiohidrolase de cepa g do celulossoma CelB : beta-glicosidase de cepa g] de 20:50:30.
10. Uma mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor que podem ser obtidas de acordo com o processo da reivindicação 8, a referida mistura sendo caracterizada pelo fato de que compreende endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 1), a porção com uma atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (SEQ ID NR: 3), beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NR: 5), e xilanase XynA de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 7), em uma razão [endoglucanase B de cepa g : porção de celobiohidrolase de cepa g do celulossoma CelB : beta-glicosidase de cepa g : xilanase de cepa g] de 20:40:20:20.
11. A mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor de acordo com a reivindicação 9 ou 10, ainda caracterizada pelo fato de que compreende adicional ou alternativamente uma ligninase selecionada a partir de lacase de Thermus thermophilus (SEQ ID NR: 14) e polifenoloxidase de Thermus thermophilus (SEQ ID NR: 16).
12. A mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor de acordo com qualquer das reivindicações 9-11, na forma de pó liofilizado.
13. Uso da mistura de enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor de acordo com qualquer das reivindicações 9-12, para a biodegradação de substratos à base de celulose ou à base de lignocelulose.
14. Uso de xilanase XynA de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 7) em uma mistura com enzimas degradadoras de parede celular vegetal estáveis ao calor compreendendo endoglucanase B de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NR: 1), a porção com atividade de celobiohidrolase do celulossoma CelB de
Caldicellulosiruptor saccharolyticus (SEQ ID NR: 3) e beta-glicosidase de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NR: 5) como tratamento preventivo para a biodegradação de substratos à base de lignocelulose.
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