ES2391351B1 - Plantas y hongos transgénicos capaces de metabolizar fosfito como fuente de fósforo. - Google Patents

Abstract

Plantas y hongos transgénicos capaces de metabolizar fosfito como fuente de fósforo.#Sistema, incluyendo métodos y composiciones, para preparar y utilizar plantas transgénicas y/u hongos transgénicos que metabolizan fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

Description

PLANTAS Y HONGOS TRANSGÉNICOS CAPACES DE METABOLIZAR FOSFITO COMO FUENTE DE FÓSFORO

5

Estado de la Técnica

El fósforo es un elemento esencial para el crecimiento vegetal y fúngico. Este

elemento, en forma oxidada, es incorporado en muchas de las biomoléculas en una célula

vegetal o fúngica, proporcionapara proporcionar material genético, membranas, y mensajeros

1 o

moleculares, entre otros.

El fosfato inorgánico (Pi) es la fuente primaria de fósforo para las plantas. Por

consiguiente, los fertilizantes a base de fosfato ofrecen un enfoque económico y ampliamente

utilizado para mejorar el crecimiento vegetal. Sin embargo, los fertilizantes a base de fosfato

proceden de recursos no renovables que se ha previsto que se agotarán en los próximos

15

setenta a cien años, o incluso antes si su tasa de utilización aumenta más rápido de lo

esperado.

Los fertilizantes a base de fosfato, comúnmente utilizados en la agricultura moderna

generalmente no pueden ser utilizados eficientemente por las plantas cultivadas, debido a

varios factores importantes. En primer lugar, el fosfato es altamente reactivo y puede formar

2 o

complejos insolubles con muchos componentes del suelo, lo cual reduce la cantidad de

fósforo disponible. En segundo lugar, los microorganismos del suelo pueden convertir

rápidamente el fosfato en moléculas orgánicas que generalmente no pueden ser metabolizadas

eficientemente por las plantas, lo cual reduce adicionalmente la cantidad de fósforo

disponible. En tercer lugar, el crecimiento de malas hierbas puede ser estimulado por los

2 5

fertilizantes a base de fosfato, lo cual no solo reduce la cantidad de fósforo disponible aún

más, sino que también puede fomentar que las malas hierbas compitan con las plantas

cultivadas por el espacio y por los nutrientes. Las pérdidas debidas a la conversión del fosfato

en formas inorgánicas y orgánicas que no están rápidamente disponibles para la captura y

utilización por parte de la planta, y la competencia por parte de las malas hierbas, implica el

3 O

uso de excesivas cantidades de fertilizante a base de fosfato, lo cual no sólo incrementa los

costos de producción sino que también ocasiona severos problemas ecológicos. Por lo tanto,

existe una necesidad urgente de reducir la cantidad de fertilizante a base de fosfato utilizados

en la agricultura.

Una forma reducida de fosfato, el fosfito (Phi), también se utiliza en el cultivo de

35

plantas. Se ha demostrado que el tratamiento con fosfito puede incrementar la producción

vegetal (medida como tamaño del druto y biomasa) en aguacate y frutas cítricas. El fosfito

puede ser transportado dentro de las plantas utilizando el mismo sistema de transporte que el

fosfato y puede acumularse en tejidos vegetales durante largos períodos de tiempo. Sin

embargo, aparentemente no hay evidencias de la existencia de ninguna enzima en plantas que

pueda metabolizar el fosfito en fosfato, la fuente primaria de fósforo en plantas. Más aún,

5

incluso durante la ausencia de fosfato, el fosfito no puede aparentemente satisfacer los

requerimientos nutricionales de fósforo de la planta. En consecuencia, a pesar de las

similitudes con el fosfato, el fosfito es una forma de fósforo que generalmente no puede ser

metabolizada directamente por las plantas, y por lo tanto no es un nutriente vegetal. No

obstante, los "fertilizantes" de fosfito se venden comercialmente, a pesar de que no parece

1 O

haber ninguna prueba, ni siquiera una indicación en la literatura científica de que las plantas

puedan asimilar el fosfito.

El fosfito puede promover el crecimiento vegetal indirectamente. Por ejemplo, el

fosfito es utilizado como un agente anti-fúngico (un fungicida) sobre plantas cultivadas. Se

piensa que el fosfito evita enfermedades causadas por oomycetes (mohos de agua) en plantas

15

tan diversas como patata, tabaco, aguacate, y papaya, entre otras. El fosfito por lo tanto,

puede promover el crecimiento vegetal, no directamente como un nutriente vegetal, sino

protegiendo a las plantas de los patógenos fúngicos que podrían de otro modo afectar el

crecimiento vegetal. No obstante, los fungicidas a base de fosfito son a menudo etiquetados

como fertilizantes. Este etiquetado erróneo puede estar fomentado por regulaciones

2 O

gubernamentales que hacen el proceso de aprobación más corto y menos complejo si los

fabricantes caracterizan los fungicidas como fertilizantes.

Los mecanismos propuestos para que el fosfito actúe como un fungicida son

múltiples. Por ejemplo, el fosfito puede actuar sobre los hongos inhibiendo las reacciones de

fosforilación a través de un incremento en la acumulación de pirofosfato inorgánico (PPi), el

2 5

cual a su vez puede interrumpir las rutas de fosfato que son metabólicamente críticas.

Alternativamente, o adicionalmente, el fosfito puede inducir una respuesta natural de defensa

en plantas. En cualquier caso, la eficacia del fosfito como fungicida puede estar influenciada

por varios factores, que incluyen el medioambiente, tipo de patógeno, tipo de planta y la

concentración.

3 O

La concentración de fosfito en contacto con las plantas puede ser un factor crítico

para la eficacia del fosfito ya que demasiado fosfito puede ser tóxico para las plantas. En

particular, el fosfito puede competir con el fosfato por la entrada en las células vegetales,

dado que el fosfito puede ser transportado dentro de las plantas mediante el sistema de

transporte del fosfato. La toxicidad del fosfito puede deberse por lo tanto, a (1) asimilación

35

reducida del fosfato por las plantas, en combinación con (2) una incapacidad de utilizar el

fosfito como fuente de fósforo mediante oxidación a fosfato, lo cual ocasiona la acumulación

de fosfito en las plantas. Además, el fosfito puede detectarse en las plantas como fosfato, lo

cual evita que las plantas induzcan una ruta de recuperación de fósforo que promueve la

supervivencia de la planta bajo condiciones de fosfato bajo. La toxicidad del fosfito afecta

plantas tan diversas como Brassica nigra, Allium cepa (cebolla), Zea mays L. (maíz), y

5

Arabidopsis thaliana. Por consiguiente, la exposición de las plantas al fosfito necesita ser

controlada muy cuidadosamente. Por lo tanto, se necesita un sistema mejor para explotar los

beneficios del fosfito en las plantas al tiempo que se reduzcan sus inconvenientes.

La generación de plantas transgénicas ha sido un instrumento en la creación de

sistemas mejorados para la agricultura. Al menos cuatro sistemas de selección se han

1 O

establecido para identificar plantas transgénicas mediante crecimiento selectivo. Cada sistema

de selección está basado en la resistencia a un antibiótico (kanamicina o higromicina) o un

herbicida (glifosato o fosfinotricina). Sin embargo, cada sistema de selección tiene

desventajas. Por ejemplo, cada sistema de selección puede tener problemas con la toxicidad.

Además, la selección con antibióticos puede ser ineficaz dado que las plantas pueden tener

15

mecanismos de resistencia alternativos. Por otra parte, a excepción del sistema de selección

que utiliza fosfinotricina, ninguno de los sistemas de selección proporciona un marcador de

seleccion"universal" de selección para la mayoría o todas las plantas. Por lo tanto, se necesita

un nuevo marcador de seleccionde selección para uso en la generación de plantas

transgénicas.

20

Breve descripción de la invención

La presente descripción proporcionaproporciona un sistema, incluyendo métodos y

composiciones, para preparar y utilizar plantas transgénicas y/u hongos transgénicos que

metabolizan fosfito como fuente de fósforo para favorecer al crecimiento.

25

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo esquemático de un ejemplo del método

para (i) preparar una planta transgénica (u hongo) que es capaz de metabolizar una forma

reducida de fósforo, tal como fosfito, como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento,

30

y/o (ii) utilizar, como un marcador de seleccion, un ácido nucleico que confiere capacidad

para metabolizar una forma reducida de fósforo, tal como fosfito, como fuente de fósforo

para favorecer el crecimiento, de acuerdo con aspectos descritos en la presente descripción.

La Figura 2 muestra una representación esquemática de un ejemplo de un ácido

nucleico para su uso en el método de la Fig. 1, de acuerdo con los aspectos descritos en la

3 5

presente descripción.

La Figura 3 muestra un mecanismo propuesto para la oxidación de hipofosfito a

fosfato en bacterias utilizando enzimas expresadas a partir de los genes ptxD y htxA de

Pseudomonas stutzeri, de acuerdo con los aspectos descritos en la presente descripción.

La Figura 4 muestra una representación esquemática de un ejemplo de un gen

quimérico construido para uso en la generación de una planta transgénica que metaboliza

5

fosfito a fosfato, de acuerdo con los aspectos descritos en la presente descripción.

La Figura 5 muestra un diagrama esquemático de una porción de una estrategia

seguida para crear el gen quimérico de la Fig. 4, de acuerdo con los aspectos descritos en la

presente descripción.

La Figura 6 muestra un par de fotografias que muestran ejemplos de los datos

1 O

obtenidos con el gen quimérico de la Fig. 4 utilizado como marcador de selección mediante la

selección de plantas transgénicas, por su capacidad para crecer sobre un medio que contiene

fosfito en ausencia de fosfato, de acuerdo con los aspectos descritos en la presente

descripción.

La Figura 7 muestra una serie de fotografias de datos obtenidos a partir de ensayos de

15

crecimiento de líneas control y transgénicas de (ptxD) Arabidopsis germinadas y cultivadas

en un medio de crecimiento líquido, con o sin fosfito (Phi) o fosfato (Pi) como fuente de

fósforo, de acuerdo con los aspectos descritos en la presente descripción.

La Figura 8 muestra un gráfico de barras con los datos obtenidos a partir de ensayos

realizados para medir la capacidad de las líneas de Arabidopsis de la Fig. 7 para extraer

2 O

fósforo a partir de su medio de crecimiento, con las plantas cultivadas durante 45 días en

medio de crecimiento que contiene diferentes concentraciones de fosfito (Phi) como fuente de

fósforo, de acuerdo con los aspectos descritos en la presente descripción.

La Figura 9 muestra una representación esquemática de la distribución de plantas

control (WT) y plantas ptxD transgénicas (PTXD) de Arabidopsis a través de un sustrato de

2 5

crecimiento, tal como se utilizó para los experimentos de las Figs. 1 O y 11, de acuerdo con los

aspectos descritos en la presente descripción.

La Figura 1 O muestra una fotografia de las plantas parentales y transgénicas ptxD

distribuidas de acuerdo con la Fig. 9 y analizando su crecimiento sobre un sustrato que

contiene fosfato (Pi) como fuente de fósforo, de acuerdo con los aspectos descritos en la

3 O

presente descripción.

La Figura 11 muestra una fotografia de las plantas parentales y transgénicas ptxD

distribuidas de acuerdo con la Fig. 9 y analizando su crecimiento sobre un sustrato que

contiene fosfito (Phi) como fuente de fósforo, de acuerdo con los aspectos descritos en la

presente descripción.

35

La Figura 12 muestra un gráfico de barras con los datos obtenidos a partir de ensayos

sobre la capacidad de las líneas de Arabidopsis de la Fig. 7 para incrementar su peso cuando

son cultivadas en ausencia o presencia de fosfato y/o fosfito como fuente de fósforo, de

acuerdo con los aspectos descritos en la presente descripción.

La Figura 13 muestra un conjunto de fotografias de las plantas de líneas control (WT)

y plantas ptxD transgénica de Nicotiana tabacum (tabaco), 25 días después de la germinación

5

en presencia de fosfato o fosfito como fuente de fósforo, de acuerdo con los aspectos

descritos en la presente descripción.

La Figura 14 muestra un conjunto de fotografias de otro experimento de crecimiento

llevado a cabo con las plantas de líneas de tabaco control y plnatas transgénica de la Fig. 13,

de acuerdo con los aspectos descritos en la presente descripción.

10

Descripción detallada de la invención

La presente descripción proporciona un sistema, que incluye métodos y

composiciones, para preparar y utilizar plantas transgénicas y/u hongos transgénicos que

metabolizan fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento. Las plantas y/u

15

hongos opcionalmente también pueden metabolizar hipofosfito como fuente de fósforo. El

sistema descrito en la presente invención puede cambiar sustancialmente el modo a una forma

más reducida de fósforo (relativa a fosfato), tal como fosfito, utilizándose como un

fertilizante y/o fungicida. El sistema también puede proporcionar un nuevo marcador de

seleccion para su uso en la generación de plantas y/u hongos transgénicos. El sistema,

2 O

adicionalmente, puede cambiar sustancialmente el modo en que al menos una forma reducida

de fósforo es eliminada del agua de desecho o residual, tales como los efluentes

industriales/municipales.

Se proporciona un ácido nucleico. El ácido nucleico puede utilizarse para generar una

planta y/u hongo transgénico. El ácido nucleico, puede denominarse un constructo, puede

25

comprender al menos un gen quimérico que confiere a una célula vegetal y/o a una célula

fúngica, capacidad para metabolizar al menos una forma reducida de fósforo a fosfato. En

algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender un gen que expresa una enzima

fosfito deshidrogenasa, un gen que expresa una enzima hipofosfito deshidrogenasa, o ambos.

El ácido nucleico puede comprender un gen quimérico que incluye una región

3 O

codificante y un promotor de la transcripción. La región codificante puede codificar para una

enzima fosfito deshidrogenasa, tal como PtxD de Pseudomonas stutzeri, un homólogo de

PtxD de la misma o de otra especie bacteriana, o un derivado de alguno de estos, entre otros.

En algunos ejemplos, la región codificante puede ser al menos 80%, 90%, o 95% (o

completamente) idéntica a la secuencia codificante de ptxD de Pseudomonas stutzeri. El

35

promotor puede ser funcional en plantas, hongos, o ambos y puede estar unido

operativamente a la región codificante. El promotor puede ser heterólogo con respecto a la

región codificante. El gen quimérico puede ser capaz de inducir la suficiente expresión de la

enzima, en una célula vegetal o fúngica que contiene el ácido nucleico, para conferir

lahabilidad a la célula para metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el

crecimiento, permitiendo así el crecimiento de la célula sin una fuente externa de fosfato (Pi).

5

El promotor puede (o no) ser un promotor vegetal o un promotor viral de un virus vegetal y

puede ser capaz de promover la suficiente expresión de la enzima en una célula vegetal. Por

ejemplo, el promotor, tal como un promotor obtenido a partir del gen PLDZ2 de Arabidopsis

thaliana, puede ser inducible mediante baja disponibilidad de fosfato. Alternativamente, o

adicionalmente, el promotor puede ser un promotor específico de raíz. En otros casos, el

1 O

promotor puede ser constitutivo y puede corresponder al promotor 35S del Virus del Mosaico

de la Coliflor. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede incluir un terminador de la

transcripción que es funcional en la célula vegetal y/o en la célula fúngica y que está unido

operativamente al promotor y a la región codificante. En algunas realizaciones, el promotor

puede ser un promotor fúngico capaz de promover la suficiente expresión de la enzima en una

15

célula fúngica.

El ácido nucleico puede proporciOnar expresión de uno o más polipéptidos que

metabolizan al menos una forma reducida de fósforo a fosfato, para permitir que una planta

(u hongo) transgénica/o utilice una forma reducida de fósforo como nutriente. La expresión

de uno o más polipéptidos puede ser hereditaria. Por ejemplo, el ácido nucleico puede estar

20

integrado dentro del genoma de la planta (u hongo). Más aún, la expresión de al menos uno

de los polipéptidos puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor

inducible (p.ej., inducible mediante baja concentración de fosfato, como por ejemplo,

mediante el uso de un promotor de un gen PLDZ2 de Arabidopsis o un gen AtPTl vegetal

para un transportador de fosfato de elevada afinidad), bajo control de un promotor específico

2 5

de tejido (p.ej., específico de hoja o específico de raíz), o una combinación de los mismos,

entre otros.

Se proporciona una célula vegetal o una célula fúngica que expresa una enzima

fosfito deshidrogenasa a partir de un gen quimérico. La célula puede aislarse a partir de otras

células o puede estar asociada con otras células en una estructura multi-celular (p.ej., una

3 O

planta o un micelio). La célula puede (o no) expresar también una enzima hipofosfito

deshidrogenasa a partir de un gen quimérico. En consecuencia, la célula puede metabolizar

fosfito, hipofosfito, o ambos, como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento. En

algunas realizaciones, la célula puede ser una célula vegetal y la expresión de la enzima

fosfito deshidrogenasa, de la enzima hipofosfito deshidrogenasa (si está presente), o ambas,

3 5

pueden estar controlada por un promotor específico de raíz. La célula vegetal puede ser de

cualquier especie adecuada. Por ejemplo, la célula vegetal puede ser una célula eucariótica de

alga, como una célula de Chlamydomonas. En otros casos, la célula vegetal puede ser de una

especie de planta vascular. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula fúngica

que pertenece a una especie de Trichoderma o que pertenece a una especie de hongo

micorrizal capaz de formar una relación simbiótica con una planta.

5

Se proporciona una planta transgénica (o parte de planta) que expresa una enzima

fosfito deshidrogenasa, y, opcionalmente, una enzima hipofosfito deshidrogenasa a partir de

uno o más genes quiméricos. La planta puede, a través de la expresión de la/s enzima/s,

metabolizar fosfito y/o hipofosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento. La

planta puede ser una planta vascular, tal como una planta de cultivo, por ejemplo, una especie

1 O

de planta de cultivo seleccionada a partir del grupo que consiste en: maíz, soja, arroz, patata,

tomate, caña de azúcar y trigo. También se proporciona una semilla que germina para

producir la planta transgénica.

Se proporciona un método para reducir infecciones fúngicas en plantas. Una

pluralidad de células fúngicas puede aplicarse a una forma de semilla de plantas, las plantas

15

propiamente dichas, el suelo en el cual las plantas están o serán dispuestas, o una

combinación de los mismos. Las células fúngicas pueden expresar una enzima fosfito

deshidrogenasa a partir de un gen quimérico y pueden pertenecer a una especie de

Trichoderma.

Se proporciona una planta asociada con una pluralidad de células fúngicas para

2 O

formar micorrizas. Las células fúngicas pueden expresar una enzima fosfito deshidrogenasa a

partir de un gen quimérico. Las células fúngicas pueden dar lugar a una planta capaz de

crecer sobre fosfito (y/ o hipofosfito) como fuente de fósforo mediante la oxidación de fosfito

a fosfato.

Se proporciona un método para fertilizar una planta de cultivo utilizando hipofosfito

25

y/o fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento. La planta de cultivo puede

expresar una enzima fosfito deshidrogenasa, una enzima hipofosfito deshidrogenasa, o

ambas. Alternativamente, o adicionalmente, la planta de cultivo puede formar micorrizas con

una pluralidad de células fúngicas que expresan una enzima fosfito deshidrogenasa, una

enzima hipofosfito deshidrogenasa, o ambas. Al menos una forma reducida de fósforo, tal

3 O

como fosfito y/o hipofosfito, puede aplicarse a la planta y/o al suelo adyacente a la planta, de

modo que la forma reducida sea metabolizada a fosfato por parte de la planta y/o las

micorrizas para favorecer el crecimiento y la productividad de la planta.

Se proporciona un método para tratar líquido de desecho o residuos líquidos (p.ej., un

efluente) para disminuir su contenido en fósforo reducido. Se pone en contacto (i) agua que

35

contiene hipofosfito y/o fosfito como contaminante y (ii) una pluralidad de células vegetales

y/o células fúngicas que expresan una enzima fosfito deshidrogenasa, una enzima hipofosfito

deshidrogenasa, o ambas, de modo que al menos una porción del hipofosfito y/o fosfito es

oxidada a fosfito y/o fosfato. En algunos casos, se puede poner en contacto el agua con una

pluralidad de plantas vasculares que expresan una o ambas enzimas. El método puede

proporcionar un sistema de biorremediación para ríos, embalses, suelos, tanques de

5

contención, depósitos y similares, que están contaminados debido a fabricación industrial.

Por ejemplo, el fosfito es un agente contaminante común en ríos y lagos cercanos a las zonas

industriales, tales como fabricas de discos ópticos (p.ej., DVDs y CDs) que utilizan

hipofosfito para reducir los iones metálicos en procesos de recubrimientos químicos. Las

plantas y/u hongos transgénicos descritos en la presente invención pueden por lo tanto ayudar

1 O

a eliminar hipofosfito y/o fosfito de agua contaminada, tomando y convirtiendo el hipofosfito

y/o fosfito en fosfato. El uso de plantas y/u hongos puede ser más eficaz que utilizar un

sistema a base de bacterias.

Se proporciona un método para utilizar una secuencia que codifica para una enzima

fosfito deshidrogenasa como un marcador de selección para la producción de una planta

15

transgénica. El método puede ser utilizado para obtener una planta transformada con un ácido

nucleico que codifica para una enzima fosfito deshidrogenasa que se expresa a partir del

ácido nucleico como marcador de selección. Las células vegetales y una composición que

incluye el ácido nucleico pueden ser puestas en contacto bajo condiciones que promueven la

introducción del ácido nucleico en las células vegetales. Las células vegetales pueden ser

2 O

cultivadas en un medio que contiene fosfito como fuente primaria o exclusiva de fósforo para

el crecimiento de las células vegetales. La selección puede ser llevada a cabo sobre células

vegetales transformadas producidas mediante las etapas de puesta en contacto y cultivo, y que

expresan la enzima fosfito deshidrogenasa como se evidencia mediante el crecimiento en el

medio. Al menos una porción de las células vegetales transformadas pueden ser regeneradas

2 5

en una planta transgénica.

Las plantas transgénicas descriptas en la presente invención pueden proporcionar

beneficios sustanciales. Por ejemplo, en algunos casos, las plantas pueden metabolizar fosfito

utilizando NAD+ como aceptor de electrones, para generar NADH y fosfato, que son

moléculas útiles para la planta. Las plantas transgénicas también o, alternativamente, pueden

3 O

proporcionar el desarrollo de un nuevo sistema agronómico basado en fosfito. El fosfito

puede ser menos reactivo en el suelo que el fosfato y por lo tanto, puede crear menor cantidad

de compuestos insolubles que la planta no puede utilizar. Asimismo, dado que la mayoría de

los microorganismos del suelo son incapaces de metabolizar fosfito, menos del fosfito

(relativo al fosfato) es convertido en formas inorgánicas que las plantas no pueden utilizar.

3 5

Más aún, el fosfito puede tener menos impacto sobre el ecosistema bacteriano alrededor de

las plantas en relación al fosfato. La competencia de las malas hierbas también puede ser

reducida sustancialmente, dado que las malas hierbas no deberían ser capaces de utilizar

fosfito. El uso de fosfito por lo tanto debería disminuir los costes de los fertilizantes y reducir

el impacto negativo de los fertilizantes sobre el medioambiente.

Las plantas transgénicas descritas en la presente invención también pueden ofrecer

5

efectividad aumentada del fosfito como fungicida, al tiempo que actúa como fertilizante sobre

las plantas transgénicas. Cuando es utilizado como fungicida sobre plantas no transgénicas, es

necesario ser muy cuidadoso con el fosfito , para evitar toxicidad vegetal. Sin embargo, en las

plantas transgénicas descriptas en la presente invención, el fosfito puede ser metabolizado por

la planta para volverse no tóxico.

10

El sistema descrito en la presente invención puede proporcionar ventajas sustanciales

para generar plantas transgénicas. Un marcador de selección del sistema puede funcionar, al

menos sustancialmente, universalmente en plantas. Más aún, el agente selectivo (p.ej.,

hipofosfito o fosfito) puede ser no tóxico para plantas transgénicas, dado que los productos de

reacción pueden ser inocuos (p.ej., NADH y fosfato), y también puede ser menos costoso que

15

otros marcadores de selección.

Aspectos adicionales de la presente descripción se proporcionan en las siguientes

secciones: (I) definiciones, (II) generación de plantas y hongos transgénicos, (III) uso de

plantas y hongos transgénicos, y (IV) ejemplos.

20

l. Definiciones

Los diversos términos utilizados en la presente descripción generalmente tienen cada

uno un significado reconocido por aquellos expertos en el arte, en consonancia con el

contexto en el cual cada término es utilizado. Sin embargo, lo siguientes términos pueden

tener significados adicionales y/o alternativos, como se describe a continuación.

25

Planta -un miembro del reino Plantae de organismos eucarióticos, que puede ser

descripta como un árbol, arbusto, pasto, mata, hierba, enredadera, helecho, musgo, un alga

eucariótica, o una combinación de los mismos, entre otros. Una planta típicamente posee

paredes celulares de celulosa y es capaz de llevar a cabo fotosíntesis. La planta puede ser una

planta vascular. En algunas realizaciones, la planta puede ser anual o perenne. La planta

3 O

puede ser una planta que florece, tal como una monocotiledónea o una dicotiledónea. En

algunas realizaciones, la planta puede producir un grano, tubérculo, vegetal, nuez, semilla,

fibra o una combinación de los mismos, entre otros. Más aún, la planta puede ser una planta

de cultivo, la cual puede ser cultivada en un campo. Ejemplos de plantas de cultivo que

pueden ser adecuadas para la generación de plantas transgénicas de acuerdo con la presente

35

descripción incluyen: tabaco (p.ej., N tabacum), patata, maíz, arroz, trigo, alfalfa, soja,

tomate, caña de azúcar, y similares.

Parte de la planta -cualquier porción de una planta que es menos que una planta

entera y que incluye al menos una célula vegetal. Una parte de planta por lo tanto puede ser

un tejido vegetal, tal como tejido de hoja, tejido de raíz, tejido de tallo, tejido de brote, tejido

de callo, tejido de flor, o cualquier combinación de los mismos, entre otros. Una parte de

5

planta puede ser una célula vegetal aislada o una colonia o conjunto de células vegetales. Una

célula vegetal puede ser un protoplasto o puede incluir una pared celular, entre otros.

Transgénico -que comprende un constructo de ácido nucleico. El constructo puede

estar integrado dentro del genoma de un organismo (y/o de una célula) (p.ej., genoma nuclear

o de plástido ), en cualquier subconjunto o al menos sustancialmente de todas las células del

1 O

organismo. Por ejemplo, el constructo puede estar presente en una línea germinal de planta.

En consecuencia, el constructo puede ser hereditario, esto es, heredado por al menos uno o

más miembros, o al menos sustancialmente por todos los miembros, de una generación

subsiguiente del organismo, o en los descendientes de una célula. Una planta u hongo (una

parte de planta u hongo (p.ej., una célula)) que es "transformada" con un constructo ha sido

15

modificada para contener el constructo en la generación actual o en cualquier generación( es)

precedente(s) de la planta u hongo (o una parte de planta u hongo). Una planta transgénica

puede ser obtenida mediante una semilla que germina para formar la planta transgénica.

Asimismo, una planta transgénica puede producir una o más semillas que germinan para

producir plantas de progenie transgénica.

20

Ácido nucleico -un compuesto que comprende una cadena de nucleótidos. La cadena

puede estar compuesta de cualquier número adecuado de nucleótidos, tales como al menos

aproximadamente 1O, 100, o 1000, entre otros. Un ácido nucleico puede denominarse

polinucleótido, y puede, por ejemplo, ser de cadena simple, de cadena doble, o una

combinación de los mismos.

25

Gen -un ácido nucleico o segmento del mismo que proporciOna una unidad

expresable para la expresión de un polipéptido y/o un ARN funcional (p.ej., a ARN

mensajero, un ARN de interferencia, o un ARN enzimático, entre otros). Un gen puede por lo

tanto, incluir (a) una región codificante (también denominada una secuencia codificante, la

cual puede ser continua o interrumpida (por ejemlo por uno o más intrones)) para definir la

30

secuencia del polipéptido y/o ARN funcional, (b) al menos un promotor de la transcripción

(también denominada una secuencia promotora) y, (e) opcionalmente, al menos un

terminador de la transcripción (también denominado secuencia de terminación), con el

promotor de la transcripción y el terminador de la transcripción unido operativamente a la

región codificante. Un gen opcionalmente puede incluir una o más regiones de control y/o

35

regiones no traducibles, como por ejemplo, al menos una región 5' no traducible, una región

3' no traducible, un intrón, o cualquier combinación de los mismos, entre otros.

Promotor-una región de ácido nucleico que controla (es decir, promueve, regula y/o

dirige) la transcripción de un gen para producir un transcrito primario y/o un ARN mensajero.

Un promotor puede operar, por ejemplo, determinando, al menos en parte, la tasa de

iniciación de la transcripción de un gen por parte de la ARN polimerasa. El promotor también

5

o alternativamente puede determinar la tasa de elongación de la transcripción una vez que la

transcripción está iniciada. El promotor puede ser funcional en plantas y/u hongos y por lo

tanto, puede ser un promotor vegetal y/o un promotor fúngico.

Gen quimérico -un gen con elementos de secuencia, tal como un promotor de la

transcripción y una región codificante, que son heterólogos con respecto uno a otro. El

1 O

término "heterólogo" significa que los elementos de secuencia (p.ej., el promotor y la región

codificante) se originan y/o provienen de fuentes respectivas distintas, tales como especies

distintas de organismos. Un gen quimérico también puede comprender un terminador de la

transcripción, el cual puede originarse a partir de una fuente distinta de la región codificante,

y a partir de la misma fuente que, o una fuente distinta de, el promotor. Los terminadores de

15

ejemplo que pueden ser utilizados en los genes quiméricos incluyen el terminador 35S del

Virus del Mosaico de la Coliflor, el terminador de la nopalina sintasa de Agrobacterium

tumefaciens, o similares.

Constructo -un ácido nucleico creado, al menos en parte, utilizando técnicas de

ingeniería genética. Un constructo por lo tanto puede denominarse constructo de ácido

2 O

nucleico.

Expresión -un proceso mediante el cual un producto, a saber, un ARN y/o un

polipéptido, es formado a partir de información proporcionada por un ácido nucleico y/o gen,

generalmente en forma de ADN. Por lo tanto, el ácido nucleico/gen puede ser expresado para

formar un ARN y/o polipéptido, lo cual significa que el ARN y/o polipéptido se expresa a

2 5

partir del ácido nucleico/ gen.

Formas reducidas de fósforo-cualquier compuesto que contenga fósforo y/o iones

en los cuales el fósforo presente un estado de oxidación menor que +5, como por ejemplo + 3

o +l. Por lo tanto, las formas reducidas de fósforo pueden, por ejemplo, incluir fosfito e

hipofosfito, entre otros. Una forma reducida de fósforo puede ser abreviada "RP."

30

Fosfato-ácido fosfórico (H3P04), su forma dibásica (H2P04 1 -), su forma monobásica

(HPO/), su forma triplemente ionizada (P04 3 -), o cualquier combinación de las mismas. El

fosfato puede estar provisto como cualquier compuesto de fosfato adecuado o combinación

de compuestos de fosfato. Ejemplos de formas de fosfato incluyen: sales de fosfato de sodio,

de potasio, de litio, de rubidio, de cesio, de amonio, de calcio o de magnesio, o cualquier

3 5

combinación de las mismas, entre otras. En el fosfato, cuatro oxígenos están directamente

unidos a un átomo de fósforo. El fosfato también o alternativamente puede ser denominado

"ortofosfato" y/o "fosfato inorgánico" y puede ser abreviado como "Pi." El fosfato es distinto

del "organofosfato," el cual es una versión orgánica de fosfato en la cual uno o más de los

oxígenos de fosfato están unidos a estructuras orgánicas, generalmente para formar un éster

fosfato.

5

Fosfito -ácido fosforoso (H3P03), su base en forma conjugada /simplemente

ionizada (H2PO/), o su forma doblemente ionizada (HPOt), o cualquier combinación de las

mismas. En el fosfito, tres oxígenos y un hidrógeno están unidos directamente a un átomo de

fósforo. El fosfito puede estar provisto como cualquier compuesto adecuado de fosfito o

combinación de compuestos de fosfito. Ejemplos de formas de fosfito incluyen: sales de

1 O

fosfito de sodio, de potasio, de litio, de rubidio, de cesio, de amonio, de calcio o de magnesio,

o cualquier combinación de las mismas, entre otras. El fosfito puede ser oxidado a fosfato. El

fosfito también o alternativamente puede ser denominado "fosfito inorgánico" y puede ser

abreviado como "Phi." El fosfito es distinto del "organofosfito," el cual es una versión

orgánica de fosfito en la cual uno o más de los oxígenos del fosfito están unidos a estructuras

15

orgánicas, generalmente para formar un éster fosfito.

Hipofosfito -ácido hipofosforoso (H3P02) y/o su base conjugada (H2P02-), el cual

puede ser provisto como cualquier compuesto de hipofosfito adecuado o combinación de

compuestos de hipofosfito. En el hipofosfito, dos oxígenos y dos hidrógenos están unidos

directamente a un átomo de fósforo. Ejemplos de formas de hipofosfito incluyen: sales de

2 O

sodio, potasio, litio, rubidio, cesio, amonio de hipofosfito o una combinación de las mismas,

entre otras. El hipofosfito puede ser oxidado a fosfito y/o a fosfato. El hipofosfito también o

alternativamente puede ser denominado "hipofosfito inorgánico" y puede ser abreviado como

"Hphi."

Nutriente -cualquier sustancia que es metabolizada para promover el crecimiento y

2 5

reproducción, y/ o es requerida para la supervivencia.

Fertilizante -cualquier composición que incluye uno o más nutrientes para plantas

(y/u hongos asociados con las plantas).

Fuente externa-un suministro que está por fuera de una planta y es accesible para la

planta, generalmente por contacto con la planta. Ejemplos de fuentes externas que pueden ser

3 O

adecuadas para las plantas transgénicas descritas en la presente invención pueden incluir: una

fuente externa de fósforo, una fuente externa de fosfato, o una fuente externa de fósforo

reducido, entre otras.

Marcador de selección-un constructo o segmento del mismo y/o un gen que confiere

una ventaja de crecimiento sobre una planta o parte de la planta (y/o un hongo o célula

35

fúngica) que contiene el constructo/gen, cuando el crecimiento de la planta o parte de la

planta (y/u hongo o célula fúngica) es ensayado mediante contacto con un medio de cultivo

adecuado.

Efluente-agua que lleva y/o está mezclada con material de desecho o residuos. Un

efluente puede o no estar fluyendo. Ejemplos de efluente pueden ser, por ejemplo, residuos

y/o aguas industriales, las cuales pueden estar combinadas con un cuerpo de agua mayor, tal

5

como un arroyo, río, estanque, lago, ciénaga, laguna, pantano, o similares.

Remediación-cualquier proceso que modifica el agua (p.ej., agua residual y/o un

efluente) hasta una composición más deseada, de modo de hace al agua menos tóxica, más

respetuosa con el medioambiente, en mayor conformidad con los estándares

gubernamentales, etc.

1 O

Enzima que oxide una forma reducida de fósforo -una enzima que cataliza o

promueve la oxidación de una forma reducida de fósforo (p.ej., con un estado de oxidación de

+ 1 o +3) hasta un estado más oxidado (p.ej.,+1 a +3, + 1 a +5, y/o +3 a +5). Por ejemplo, la

enzima puede oxidar hipofosfito a fosfito, fosfito a fosfato, y/o hipofosfito a fosfato, entre

otros. Por conveniencia, la enzima puede ser denominada una "oxidasa," dado que

15

cataliza/promueve una reacción de oxidación, o puede ser denominada una "oxidorreductasa

de fósforo" o "enzima de metabolismo de fósforo reducido," y puede ser abreviada, para

mayor comodidad en la presente invención, como "RP-OxRe." Ejemplos de enzimas que

oxidan una forma reducida de fósforo pueden incluir: una enzima fosfito deshidrogenasa (la

cual puede, por ejemplo, ser denominada NAD:fosfito oxidorreductasa, fosfonato

2 O

deshidrogenasa, fosfito deshidrogenasa NAD-dependiente, o similares), una hipofosfito

deshidrogenasa (p.ej., hipofosfito:2-oxoglutarato oxidorreductasa), o similares. La enzima

puede oxidar una forma reducida de fósforo utilizando cualquier cofactor(es), coenzima(s),

y/o sustrato(s) adecuados presentes en y/o cerca de una célula. Más aún, la enzima puede

originarse y/o estar derivada de bacterias, hongos, plantas, o animales.

25

Enzima fosfito deshidrogenasa -una enzima que cataliza la oxidación de fosfito a

fosfato. La enzima generalmente cataliza la oxidación con la eficacia suficiente para permitir

el crecimiento de una célula vegetal y/o célula fúngica en presencia de fosfito como fuente de

fósforo para favorecer el crecimiento. La enzima puede ser de origen bacteriano. La enzima

puede ser un polipéptido PtxD (es decir, PtxD o tipo PtxD), el cual es cualquier polipéptido

30

capaz de catalizar la oxidación de fosfito a fosfato y que es (a) al menos 90%, 95%, o

completamente idéntico a PtxD (SEQ ID N0:1; GenBank: AAC71709.1) de Pseudomonas

stutzeri WM 88, (b) un derivado de PtxD de SEQ ID N0:1, (e) un homólogo (es decir, un

parálogo u ortólogo) de PtxD (SEQ ID N0:1) de la misma especie o de una diferente, o (d)

un derivado de (e). Los homólogos de PtxD (SEQ ID N0:1) tienen similitud sustancial con

35

PtxD de Pseudomonas stutzeri, la cual puede, por ejemplo, estar determinada mediante el

algoritmo blastp (p.ej., programa BLASTP 2.2.18+ ), como se describe en las siguientes dos

referencias, las cuales están incorporadas en el presente documento como referencias:

Stephen F. Altschul, et al. (1997), "Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation of

protein database search programs," Constructs Res. 25:3389-3402; y Stephen F. Altschul et

al. (2005) "Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices,"

5

FEBS J. 272:5101-5109. Ejemplos de similitud sustancial incluyen al menos 50%, 60%, 70%,

u 80% de identidad de secuencia, una puntuación de similitud de al menos 200 o 250, y/o un

valor-E de menos de 1 e-40, 1 e-60, o 1 e-80, entre otros, utilizando el algoritmo blastp, con

alineamiento óptimo y, si es necesario, introducción de gaps.

Ejemplos de homólogos de PtxD de Pseudomonas stutzeri pueden ser provistos por

1 O

Acinetobacter radioresistens SK82 (SEQ ID N0:2; GenBank EET83888.1 ); Alcaligenes

faecalis (SEQ ID N0:3; GenBank AAT12779.1); Cyanothece sp. CCYOJJO (SEQ ID N0:4;

GenBank EAZ89932.1 ); Gallionella ferruginea (SEQ ID N0:5; GenBank EES62080.1 );

Janthinobacterium sp. Marseille (SEQ ID N0:6; GenBank ABR91484.1); Klebsiella

pneumoniae (SEQ ID N0.7; Genbank ABR80271.1); Marinobacter algicola (SEQ ID N0:8;

15

GenBank EDM49754.1); Methylobacterium extorquens (SEQ ID N0:9; NCBI

YP_003066079.1); Nostoc sp. PCC 7120 (SEQ ID N0:10; GenBank BAB77417.1);

Oxalobacter formigenes (SEQ ID NO.ll; NCBI ZP _ 04579760.1 ); Streptomyces sviceus

(SEQ ID N0:12; GenBank EDY59675.1); Thioalkalivibrio sp. HL-EbGR7 (SEQ ID N0:13;

GenBank ACL72000.1); y Xanthobacter jlavus (SEQ ID N0:14; GenBank ABG73582.1),

2 O

entre otros. Aspectos adicionales de homólogos de PtxD se describen en la Publicación de la

Solicitud de Patente U. S. No. 2004/0091985 ("la publicación '985") de Metcalf et al., la cual

está incorporada en el presente documento como referencia. La fosfito deshidrogenasa puede

tener una secuencia de aminoácidos con al menos 50%, 60%, 80%, 90% o 95% o 100% de

identidad de secuencia con una o más de las SEQ ID NOS:1-14.

2 5

Ejemplos de derivados de PtxD de Pseudomonas stutzeri que pueden ser adecuados

se describen en la publicación '985 y en la Patente U.S. No. 7402419 de Zhao et al., la cual

está incorporada en el presente documento como referencia. Los derivados pueden

proporcionar, por ejemplo, afinidad/especificidad a cofactor alterada y/o termoestabilidad

alterada.

30

La enzima fosfito deshidrogenasa puede contener una región de secuencm con

similitud o identidad de secuencia con cualquiera o cualquier combinación de los siguientes

motivos consenso: un motivo que se une a NAD que tiene una secuencia consenso de

VGILGMGAIG (SEQ ID N0:15); una secuencia distintiva conservada para la familia de 2-

hidroxiácido específica de D-isómeros con una secuencia consenso de

35

XPGALLVNPCRGSVVD (SEQ ID N0:16), donde X es K o R, o una secuencia consenso

más corta dentro de la SEQ ID N0:16 de RGSVVD (SEQ ID N0:17); y/o un motivo que

puede permitir a las hidrogenasas utilizar fosfito como un sustrato, con un consenso general

de GWQPQFYGTGL (SEQ ID N0:18), pero puede ser mejor definida como

GWX¡PX2X3YX4XsGL (SEQ ID N0.19), donde Xt es R, Q, T, o K, X2 es A, V, Q, R, K, H,

o E, X3 es L o F, ~ es G, F, o S, y X5 es T, R, M, L, A, o S. Aspectos adicionales de

5

secuencias consenso encontradas mediante comparación de homólogos de PtxD y PtxD se

describen en la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. No. 2004/0091985 de Metcalf et

al., la cual está incorporada en el presente documento como referencia.

Una enzima fosfito deshidrogenasa puede (o no) ser una enzima NAD-dependiente

con elevada especificidad por el fosfito como sustrato (p.ej., Km ~50 J.1M) y/o con un peso

1 O

molecular de aproximadamente 36 kilodaltons. La enzima deshidrogenasa puede, pero no se

requiere que, actúe como un homodímero, y/o tenga una actividad óptima a 35 oc y/o un pH

de aproximadamente 7,25-7,75.

Hipofosfito deshidrogenasa -una enzima que cataliza la oxidación de hipofosfito a

fosfito. La enzima puede, por ejemplo, ser una enzima bacteriana, tal como HtxA de

15

Pseudomonas stutzeri WM 88 (SEQ ID N0:20; GenBank AAC71711.1) o Alcaligenes

faecalis (GenBank AAT12775.1).

Un polipéptido HtxA puede, pero no se requiere que, sea una enzima Fe-dependiente

con elevada especificidad por hipofosfito como sustrato (p.ej., Km ~0.54-0.62 mM) y/o con

un peso molecular de aproximadamente 32 kilodaltons. El polipéptido HtxA puede, pero no

2 O

se requiere que, actúe como un homodímero, y/o tenga una actividad óptima a 27 oc y/o un

pH de aproximadamente 7,0.

Región codificante de ptxD o htxA-una secuencia que codifica para un polipéptido

PtxD (es decir, una enzima fosfito deshidrogenasa) o un polipéptido HtxA (es decir, una

enzima hipofosfito deshidrogenasa), respectivamente. Ejemplos de una región codificante de

25

ptxD proporcionada por ptxD de Pseudomonas stutzeri (SEQ ID N0:21; GenBank

AF061 070.1 ). En otros ejemplos, una región codificante de tipo ptxD con al menos un 80% o

90% de identidad de secuencia con SEQ ID N0:21 puede utilizarse. En otros ejemplos, una

región codificante que codifica para un polipéptido con al menos 50%, 60%, 80%, 90%, 95%

o completa identidad con uno o más de los polipéptidos de las SEQ ID NOS:1-14 puede

3 O

utilizarse.

11. Generación de plantas y hongos transgénicos

La presente descripción proporciona métodos para preparar plantas transgénicas y

hongos transgénicos que tienen un metabolismo de fósforo modificado. Los métodos pueden

3 5

utilizarse para crear, como objetivo principal, plantas y/u hongos transgénicos (o al menos

una célula vegetal o fúngica) que llevan un constructo de ácido nucleico que codifica para

una enzima de oxidación de fósforo, como por ejemplo, para un mejor crecimiento sobre un

fertilizante de fosfito y/o hipofosfito en agricultura. Alternativamente, o adicionalmente, los

métodos pueden ser utilizados para crear, como objetivo principal, plantas y/u hongos

transgénicos que llevan un constructo que incluye otro gen de interés, incluyendo también el

5

constructo un gen que codifica para una enzima de oxidación de fósforo que actúa como un

marcador de selección para facilitar la identificación y/o aislamiento de las plantas u hongos

transgénicos. Las etapas del método descrito en esta sección y a lo largo de la presente

descripción pueden ser llevadas a cabo mediante cualquier combinación adecuada, en

cualquier orden adecuado y repetidas cualquier número de veces que sea apropiado.

1 O

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo, esquemático, de un ejemplo de un método

20 para (i) preparar una planta transgénica (y/u hongo) que metaboliza al menos una forma

reducida de fósforo ("RP") a fosfato y/o (ii) que utiliza, como un marcador de selección, un

ácido nucleico que confiere una capacidad para metabolizar una forma reducida de fósforo a

fosfato.

15

Al menos un constructo (o ácido nucleico) puede ser obtenido, como se indica en 22.

Al menos elconstructo 23 puede incluir al menos un primer gen 24, el cual puede ser al

menos un gen quimérico que codifica para al menos una enzima ("RP-OxRe"), como por

ejemplo, una fosfito deshidrogenasa, que cataliza la oxidación de una forma reducida de

fósforo, como por ejemplo, la oxidación de fosfito a fosfato. El constructo 23 también puede

2 O

incluir al menos un segundo gen 26 ("Gen2"), el cual puede también (o no) ser un gen

quimérico. En algunas realizaciones, al menos el primer gen puede ser un par de genes que

codifican al menos dos polipéptidos distintos que catalizan cada uno la oxidación de al menos

una forma reducida de fósforo. Al menos los dos polipéptidos pueden actuar para oxidar

sustratos de fósforo en series (p.ej., catalizar la oxidación de hipofosfito a fosfito con un

2 5

primer polipéptido y luego catalizar la oxidación de fosfito a fosfato con un segundo

polipéptido). En algunos ejemplos, al menos un segundo gen puede incluir un marcador de

selección para su uso en plantas y/u hongos y/o puede incluir un gen( es) de interés primario,

entre otros. El primer gen 24 y el segundo gen 26 pueden estar unidos, como por ejemplo,

estando presentes en el mismo polinucleótido, o pueden estar presentes en los respectivos

3 O

polinucleótidos individuales. Cada gen puede ser construido, al menos en parte, fuera de las

plantas, como por ejemplo, in vitro y/o en un microorganismo (p.ej., bacterias, levaduras,

etc.). Además, cada gen puede ser capaz de expresarse en plantas, hongos, o en ambos que

contengan el gen.

Al menos uno de los genes (24 y/o 26) puede ser introducido en al menos una planta

35

receptora 28 (u hongo), tejido vegetal o fúngico, y/o célula vegetal o célula fúngica, como se

indica en 30. Al menos una planta, tejido, o célula, antes de la introducción de al menos un

gen, puede, al menos sustancialmente, requerir fosfato como fuente externa de fósforo para el

crecimiento. En otras palabras, la planta, tejido, o célula puede ser al menos sustancialmente

incapaz de metabolizar directamente una forma reducida de fósforo (como fosfito) como

nutriente.

5

La introducción del al menos un gen puede ser llevada a cabo poniendo en contacto

(a) al menos una planta/hongo, tejido, y/o célula y (b) una composición (un agente

modificante) que incluye un ácido nucleico que comprende al menos un gen, bajo

condiciones que favorecen la introducción del ácido nucleico dentro de la planta, tejido, y/o

célula. La etapa de poner en contacto puede ser llevada a cabo mediante cualquier mecanismo

1 O

que genere contacto entre al menos una planta/hongo, tejido, y/o célula y la composición. La

composición puede, por ejemplo, incluir uno o más polinucleótidos que contienen al menos

un gen, con los polinucleótidos en y/o sobre un portador. Ejemplos de portadores que pueden

ser adecuados incluyen: células biológicas (p.ej., células bacterianas), virus de plantas,

partículas inertes, lípidos (en micelas y/o liposomas), y/o similares. Ejemplos del contacto

15

creado con una composición que incluye el gen puede incluir: poner en contacto una planta,

tejido vegetal, o células vegetales con una bacteria (p.ej., una especie de Agrobacterium, tal

como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) que lleva al menos un gen, o

con uno o más proyectiles que llevan al menos un gen (p.ej., partículas recubiertas con un

polinucleótido que incluye al menos un gen y disparado a la planta, tejido o célula desde una

2 O

pistola de genes). De una manera más general, introducir al menos un gen puede ser llevado

a cabo sobre una planta/hongo, tejido vegetal o fúngico, y/o planta o células fúngicas puede

realizarse mediante infección, inyección, bombardeo de partículas, electroporación, fusión

celular, lipofección, transfección mediada por calcio-fosfato, cualquier combinación de los

mismos, o similares.

2 5

Los candidatos transgénicos 34 (también denominados candidatos de transformación)

pueden ser generados, indicados en 36, mediante y/o después de poner en contacto la planta,

tejido, y/o células y la composición. Los candidatos trangénicos pueden ser la planta/hongo,

tejido, y/o células utilizadas para poner en contacto, o pueden ser derivados de cualquier otra

generación (es decir, productos de progenie o división) de la planta/hongo, tejido, y/o células.

3 O

En cualquier caso, los candidatos transgénicos pueden ser semillas, plantas, tejidos,

explantes, células aisladas, colonias celulares/agregados, y/o similares.

Puede llevarse a cabo la selección por crecimiento (es decir, una ventaja de

crecimiento) de los candidatos transgénicos 34 en un medio selectivo 3 7, indicado en 3 8. Los

candidatos 34 que poseen una ventaja de crecimiento sobre el medio selectivo, tal como las

3 5

plantas transgénicas 40, generalmente son sustancialmente más grandes que los otros

candidatos. En otros ejemplos, la selección puede ser llevada a cabo con células vegetales (o

fúngicas) transformadas y puede incluir cultivar las células vegetales (o fúngicas) en un

medio selectivo. En estos casos, cultivar las células puede permitir la selección y/o

aislamiento de una o más colonias de células formadas mediante la etapa de cultivo. Las

colonias pueden estar expresando una enzima, tal como una fosfito deshidrogenasa, que oxida

5

una forma reducida de fósforo, evidenciado mediante la formación de la colonia en el medio.

Cualquier medio selectivo adecuado 37 puede ser utilizado de acuerdo con un

marcador de selección provisto por al menos un primer gen y/o un marcador de selección

(segundo) del gen que fue introducido. Por ejemplo, el medio selectivo puede incluir una

forma reducida de fósforo, como hipofosfito y/o fosfito. La forma reducida de fósforo puede

1 O

ser una fuente externa primaria de fósforo y/o puede ser al menos sustancialmente el único

fósforo presente en el medio, lo cual significa que el medio está al menos sustancialmente sin

fosfato (es decir, un medio bajo en fosfato o sin fosfato). Alternativamente, o adicionalmente,

el medio selectivo puede incluir otro agente selectivo, como higromicina o fosfinotricina, si la

selección por crecimiento está basada en el segundo gen 26 (p.ej., hph o bar) introducido

15

dentro de la planta/hongo, tejido, y/ o célula. Si la selección está basada en el segundo gen 26,

pueden llevarse a cabo ensayos adicionales (p.ej., crecimiento en medio que contiene fosfito,

PCR, Southern blot, etc.) para analizar la introducción de al menos un primer gen que

codifica para al menos una RP-oxidorreductasa. En cualquier caso, el medio puede incluir o

ser predominantemente líquido y puede (o no) incluir una matriz o sustrato, como un gel

2 O

(p.ej., agar, agarosa, gelatina, etc.) o suelo, entre otros.

La selección para crecimiento puede ser llevada a cabo en cualquier recipiente

adecuado 42 (y/o contenedor) o puede ser llevada a cabo sin un recipiente o contenedor, tal

como en un campo. Ejemplos de los recipientes que pueden ser adecuados incluyen

recipientes cubiertos o no e incluyen placas o discos de único o múltiples pocillos (p.ej.,

2 5

discos de Petri), tarros, bandejas, cajas, etc.

La planta transgénica 40 puede ser aislada, como se indica en 44. La planta 40 puede

tener una ventaja de crecimiento conferida mediante el ácido nucleico 23 para el crecimiento

sobre una forma reducida de fósforo, en relación a una variedad no transgénica de la planta

(p.ej., planta 28) a partir de la cual se derivan las plantas transgénicas 40. Enunciado

3 O

diferentemente, el ácido nucleico 23 confiere una capacidad para metabolizar la forma

reducida de fósforo como nutriente. En algunas realizaciones, la planta transgénica 40 puede

ser regenerada a partir de células o tejido vegetal transformado. Por ejemplo, al menos una

porción de una colonia de células producidas cultivando las células vegetales en un medio

selectivo (p.ej., fosfito) puede ser utilizada para regenerar la planta transgénica. Aspectos

35

adicionales para la generalización de plantas y hongos transgénicos se describen en la

presente descripción, así como en los Ejemplos de la Sección IV.

La Figura 2 muestra una representación esquemática de un ácido nucleico 23 para su

uso en el método 20 (Fig. 1 ). El gen 24 puede denominarse un gen RP-OxRe 46 que se

expresa como se indica en 48, una oxidorreductasa de fósforo reducido 50 (p.ej., una fosfito

deshidrogenasa). El gen 24 incluye una región codificante 52 que codifica para una

5

oxidorreductasa. El gen 24 también puede incluir un promotor de la transcripción 54 unido

operativamente a la región codificante 52, y un terminador de la transcripción 56 unido

operativamente a la región codificante 52.

El promotor 54 y el terminador 56 pueden ser funcionales en plantas y/u hongos. Por

lo tanto, el promotor y/o el terminador pueden originarse a partir de una planta u hongo, o de

1 O

un virus o una bacteria que infecta plantas u hongos, entre otros. Ejemplos de promotores que

pueden ser adecuados para el uso en plantas incluyen: el promotor 35S del Virus del Mosaico

de la Coliflor. Otros promotores que pueden ser adecuados para el uso en plantas incluyen un

promotor PLDZ2 a partir del gen de la Fosfolipasa DZ2 (PLDZ2) (Modelo de gen

AT3G05630.1; TAiR accession Gene:2078036) deArabidopsis thaliana, el cual es inducible

15

en condiciones de baja disponibilidad de fosfato para la planta (Cruz-Ramírez et al., PNAS

2006, 103:6765-6770, cuya descripción está incorporada en el presente documento como

referencia). Alternativamente, o adicionalmente, el promotor puede ser un promotor

específico de raíz, tal como el Pht1 de Arabidopsis; el gen transportador de 2 fosfato (NCBI

NM_123703.1; GeneiD:834355) o el promotor del gen MtPTl o del gen MtPT2 (GenBank:

2 O

AF000354.1 y AF000355.1) de Medicago truncatula (Xiao, et al, Plant Biology, 2006, 8:439-

449, cuya descripción está incorporada en el presente documento como referencia).

Además, el primer gen 24 puede incluir regiones transcritas pero no traducidas, tales

como la secuencia líder 5' y/o la región 5' no traducida 58, una región 3' no traducida 60, y/o

uno o más intrones 62. El primer gen 24 puede ser proporcionado por un ácido nucleico 23

2 5

que incluye otras secuencias adecuadas, tales como al menos un segundo gen 26, secuencias

de control de la replicación para la replicación en bacterias u otras especies no vegetales, un

marcador de selección para otras especies (p.ej., bacterias), o cualquier combinación de los

mismos, entre otros. En algunas realizaciones, el ácido nucleico 23 puede ser cualquier

combinación de ADN o ARN lineal o circular (es decir, un bucle cerrado), al menos

3 O

mayoritariamente de doble cadena o al menos mayoritariamente de cadena simple.

La Figura 3 muestra un mecanismo propuesto 70 para la oxidación de hipofosfito a

fosfato en bacterias, catalizada mediante enzimas expresadas a partir de genes ptxD y htxA.

El mecanismo propuesto presentado aquí es únicamente para fines ilustrativos, y no pretende

limitar la definición de cualquiera de los componentes mostrados, tales como los genes ptxD

3 5

o htxA o los polipéptidos PtxD o HtxA, ni limitar el alcance de la invención.

El mecanismo 70 muestra que un ion hipofosfito 72 que puede ser oxidado a un ion

fosfito 74 mediante la acción de un polipéptido HtxA 76 (hipofosfito:2-oxoglutarato

dioxigenasa) codificada por un gen htxA. El polipéptido HtxA 76 puede utilizar Fe2 + 78 como

un cofactor y 2-oxoglutarato 80 como un donador de electrones. Adicionalmente, la enzima

76 puede convertir el 2-oxoglutarato 80 en succinato 82, y el oxígeno molecular 84 en

5

dióxido de carbono 86.

El ion fosfito 74, a su vez, puede ser oxidado a un ion fosfato 88 mediante la acción

de un polipéptido PtxD 90. El polipéptido 90 puede utilizar NAD+ 92 como un aceptor de

electrones que es reducido a NADH 94.

10

111. Uso de plantas y hongos transgénicos

Las plantas transgénicas descriptas en la presente invención pueden ser utilizadas

para cualquier propósito adecuado. Ejemplos de propósitos incluyen: la producción de un

producto comercial (p.ej., alimentos, madera, productos farmacéuticos, tinturas, colorantes,

aceites, lubricantes, tintas, goma, algodón, fibras, biocombustibles, etc.), y/o remediación de

15

agua. La remediación de agua, como se utiliza en la presente invención, incluye cualquier

eliminación de contaminación o al menos un contaminante desde una masa de agua y/o desde

un suelo que ha entrado en contacto con agua contaminada.

Se proporciona un método de remediación de agua. Cualquier planta transgénica,

hongos o ambos descritos en la presente pueden ser utilizados en el método. Las etapas del

2 O

método descrito en la presente sección y a lo largo de la presente descripción pueden ser

llevadas a cabo en cualquier orden adecuado, en cualquier combinación adecuada, con cada

etapa llevada a cabo cualquier número de veces adecuado.

Pueden obtenerse una o más plantas transgénicas. Las plantas transgénicas pueden

haber sido transformadas, en la generación actual o en una generación siguiente, con un

2 5

constructo que confiere una capacidad de oxidar al menos una forma reducida de fósforo.

Obtener una o más plantas transgénicas puede incluir cualquier procedimiento

adecuado. Por ejemplo, la etapa de obtener puede incluir introducir en la generación actual o,

más típicamente, en una generación anterior de las plantas transgénicas, uno o más

constructos que codifican para uno o más polipéptidos que oxidan una forma reducida de

3 O

fósforo a fosfato.

La(s) planta(s) transgénica(s) puede(n) ponerse en contacto con agua para su

remediación. Poner en contacto las plantas con agua puede incluir cualquier combinación de

traer el agua hacia las plantas, traer las plantas hacia el agua y germinar semillas para las

plantas en contacto con el agua. El agua puede ser sustancialmente estacionaria o puede estar

3 5

fluyendo con respecto a las plantas. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto

puede incluir poner en contacto las plantas con un efluente industrial y/o municipal.

IV. Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen aspectos y realizaciones seleccionados de la

presente descripción, como ejemplos de métodos para preparar plantas transgénicas

(incluyendo algas) y hongos transgénicos que metabolizan fosfito como fuente de fósforo,

5

ejemplos de plantas transgénicas y hongos transgénicos, y ejemplos de métodos para utilizar

un gen que codifica para una enzima fosfito deshidrogenasa como un marcador de selección

para la selección de plantas transgénicas y hongos transgénicos. Los ejemplos se presentan

para ilustración de la invención y no pretenden definir o limitar el alcance de la presente

descripción.

10

Ejemplo l. Generación de Plantas transgénicas que expresan una Enzima fOsfito

deshidrogenasa Bacteriana

Este ejemplo describe un ejemplo de un método para generar plantas transgénicas con

metabolismo de fósforo modificado; ver Figs. 4-6.

15

La Figura 4 muestra un ejemplo del ácido nucleico, un gen quimérico 100, construido

para su uso en la generación de una planta transgénica que metaboliza fosfito a fosfato, para

permitir el crecimiento sobre fosfito en ausencia de fosfato. El gen fue construido utilizando

el sistema Gateway® (Gateway® Technology, 2003, Invitrogen) como se describe en los

siguientes párrafos.

2 O

El gen 100 incluye una secuencia promotora 35S 102 del Virus del Mosaico de la

Coliflor (CaMV) unida operativamente a una secuencia codificante 104 (SEQ ID N0:21) de

ptxD de Pseudomonas stutzeri WM88. La expresión del gen 100, indicado en 106, para

producir el polipéptido PtxD (una enzima fosfito deshidrogenasa) está por lo tanto

controlada/dirigida por el promotor 35S 102. El gen 100 opcionalmente puede incluir una

25

secuencia de terminación 107, tal como un terminador 35S de CaMV, dispuesto corriente

debajo de y unido operativamente a la secuencia codificante (y secuencia promotora). El gen

puede adicionalmente incluir una secuencia 5' no traducida dispuesta entre la secuencia

promotora y la secuencia codificante ptxD, y/o una secuencia 3' no traducida dispuesta entre

la secuencia codificante ptxD y la secuencia de terminación. Además, el gen puede incluir un

3 O

intrón que es transcrito junto con la secuencia codificante ptxD y que es eliminado del

transcrito mediante splicing post-transcripcional.

La Figura 5 muestra un diagrama esquemático de parte de una estrategia utilizada

para crear el gen 100 de la Fig. 4. Se sintetizaron un cebador directo 108 (SEQ ID N0:22) y

un cebador reverso 110 (SEQ ID N0:23). Cada cebador tiene una región de hibridización

3 5

112, 114 que hibrida como se indica en 116, 118 en la parte inferior de la figura, ya sea en

orientación directa o reversa a los extremos de la región codificante de ptxD 104. Cada

cebador tiene un sitio attB 120, 122 (attB1 o attB2) ubicado en la región 5' previa a la región

de hibridización 112 o 114. Los cebadores fueron utilizados para amplificar la secuencia

codificante 104 a partir de un plásmido (pWM302) utilizando la reacción en cadena de la

polimerasa, para crear un producto amplificado de ptxD. Se generó un constructo del tamaño

5

esperado, de aproximadamente 1000 pares de bases, detectado mediante electroforesis en gel

y tinción del producto amplificado. Los cebadores alternativamente pueden ser diseñados

para amplificar secuencias no traducidas adicionales desde corriente arriba y/o corriente abajo

de la secuencia codificante de ptxD.

El producto amplificado de ptxD fue luego incorporado dentro de un vector

1 O

plasmídico utilizando la recombinación sitio-específica provista por el sistema Gateway®. El

producto amplificado fue recombinado con el plásmido pDONR221, vía los sitios attP1 y

attP2 de pDONR 221 y los sitios attB 1 y attB2 del producto amplificado, para crear un

derivado ptxD de pDONR221, "clon inicial" pDONR221. El clon inicial tiene la secuencia

codificante de ptxD de longitud completa flanqueada en lados opuestos por los sitios attLl y

15

attL2.

La secuencia ptxD del clon inicial fue luego mudada dentro de un vector aceptor

mediante recombinación sitio-específica adicional para producir un constructo de expresión,

pB7WG2D-ptxD. El vector aceptor fue pB7WG2D.1, el cual incluye, en orden alrededor del

vector, (1) un promotor 35S, (2) sitios attR1 y attR2 dispuestos corriente abajo del promotor

20

35S, (3) un terminador 35S, (4) un gen "bar" (confiere resistencia a fosfinotricina) como un

marcador de selección en plantas, (5) un gen, SmSpR, como un marcador de selección en

bacterias, particularmente Agrobacterium (confiere resistencia a espectinomicina (Sp) y

estreptomicina (Sm)), y (6) un gen EgtpER. La recombinación directa del sistema Gateway®

formó el clon de expresión (pB7WG2D-ptxD) que incluye el gen 100 (ver Fig. 4), bar,

2 5

SmSpR, y EgfPER.

El constructo de expresión fue utilizado para transformar Agrobacterium tumefaciens

electrocompetente mediante electroporación. Un clon de Agrobacterium transformado que

llevaba el constructo de expresión fue seleccionado para sub-cultivo.

El clon de Agrobacterium transformado fue utilizado para transformar plantas de

3 O

Arabidopsis thaliana (ecotipo Col-O) (generalmente descrito en la presente invención como

"tipo salvaje" (WT, del inglés wild type)) utilizando un método modificado de inmersión

floral. Las progenies TO transformadas fueron seleccionadas utilizando la resistencia a

fosfinotricina. En particular, la selección fue llevado a cabo con medio MS 0.1X conteniendo

fosfinotricina (20 mg/L). Veintiocho líneas resistentes fueron identificadas a través de

35

amplificación por PCR del gen ptxD. Cada línea resistente fue analizada vía la progenie T1

utilizando medio MS 0.1X conteniendo fosfinotricina (20 mg/L) para ver la segregación 3:1

(resistente:sensible) de la progenie Tl, para identificar plantas que mostraban transmisión

Mendeliana del gen ptxD. Diez plantas transgénicas ptxD homocigotas fueron establecidas a

partir de la progenie T2 de la progenie T1 exhibiendo la transmisión 3: l.

Las plantas transgénicas ptxD fueron evaluadas en cuanto a su capacidad para crecer

5

en medio conteniendo solamente fosfito (p.ej., aproximadamente 0,1 a 5 mM) como fuente

externa de fósforo. Las plantas control no mostraron crecimiento sustancial en este medio (es

decir, mostraron crecimiento limitado a las reservas de fósforo internas acumuladas en la

semilla), mientras que las plantas transgénicas crecieron eficientemente, demostrando así que

las plantas transgénicas son capaces de metabolizar una forma reducida de fósforo (fosfito)

1 O

como fuente de fósforo.

El constructo de expresión ptxD también fue utilizado para proporcionar un marcador

de selección para la selección de las plantas transgénicas con metabolismo de fósforo

modificado. Las plantas de tipo salvaje Col-O fueron transformadas utilizando Agrobacterium

que contenía el constructo de expresión ptxD. La progenie TO (semillas) fueron sembradas

15

sobre un medio con fosfito (5 mM) como la fuente de fósforo. La Figura 6 muestra datos de

crecimiento de la progenie TO, en relación a las plantas de tipo salvaje, sobre el medio de

fosfito. Las plantas transgénicas 130 (con un círculo en el panel de la derecha) tienen una

ventaja de crecimiento sustancial en relación a las plantas de tipo salvaje 132 (panel de la

izquierda) y en relación a otras progenies TO 134 que aparentemente no fueron transformadas

2 O

con el constructo de expresión y/o que no expresaron eficientemente el polipéptido PtxD a

partir del constructo introducido.

Aspectos adicionales para generar plantas transgénicas con metabolismo de fósforo

modificado se describen en la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. de serie 61/199,784,

presentada el 19 de Noviembre de 2008, la cual está incorporada en el presente documento

2 5

como referencia.

Ejemplo 2. Caracterización de plantas de Arabidopsis que expresan PtxD

Este ejemplo presenta una investigación de las características de crecimiento de la

línea parental de Arabidopsis ("tipo salvaje" (WT) o control), Col-O, y dos de las líneas de

3 O

Arabidopsis transgénicas descriptas en el Ejemplo 1 y que comprenden el constructo de

expresiónptxD del Ejemplo 1; verFigs. 7-12.

Dos líneas de Arabidopsis transgénicas, denominadas PTXD-3 y PTXD-5, fueron

preparadas y aisladas como se describe en el Ejemplo l. Cada línea es homocigota para el

constructo de expresión ptxD del Ejemplo l.

35

La línea parental y las líneas transgénicas PTXD-3 y PTXD-5 fueron evaluadas en

cuanto a la capacidad para crecer sobre un medio líquido, con o sin fosfato inorgánico (Pi)

como fuente de fósforo. Semillas de las líneas parental y transgénica fueron germinadas en

medio líquido y evaluadas en cuanto a crecimiento. En ausencia de fosfato (y fosfito ), ni la

línea parental ni las líneas transgénicas mostraron crecimiento significativo más allá de la

germinación. (Cada línea exhibía pobre crecimiento durante un corto tiempo, lo cual

5

aparentemente era permitido por los depósitos de fosfato en las semillas, los cuales eran

rápidamente agotados a partir de las semillas.). Por el contrario, tanto la línea parental (WT)

como las líneas transgénicas crecieron eficientemente en presencia de 50, 100, y 1000 J.1M de

fosfato.

La Figura 7 muestra fotografias de datos obtenidos a partir de ensayos del

1 O

crecimiento de la línea parental (WT) y las líneas transgénicas PTXD-3 y PTXD-5 sobre un

medio líquido para crecimiento, con o sin fosfito (Phi) o fosfato (Pi) como la fuente de

fósforo. En la Fig. 7, la ausencia o presencia de crecimiento vegetal sostenido (más allá de la

etapa de germinación) es identificada con un signo menos (-) o más ( +), respectivamente.

Tanto la línea parental como las líneas transgénicas crecieron eficientemente en presencia de

15

fosfato inorgánico 50 J.1M (fila inferior). Asimismo, ni la línea parental ni las líneas

transgénicas mostraron crecimiento detectable en ausencia de tanto fosfato como fosfito. Sin

embargo, ambas líneas transgénicas, pero no la línea parental, crecieron eficientemente en

presencia de 50, 100, y 1000 J.1M de fosfito inorgánico como fuente de fósforo. Por lo tanto,

las líneas transgénicas adquirieron la capacidad de metabolizar fosfito como fuente de fósforo

2 O

para favorecer el crecimiento vegetal.

La Figura 8 muestra un gráfico de barras con datos obtenidos a partir de ensayos de la

capacidad de las líneas de tipo salvaje y de Arabidopsis transgénicas de la Fig. 7 para reducir

la cantidad de fósforo total en un medio de crecimiento conteniendo diferentes

concentraciones de fosfito (50, 100, y 1000 J.1M) como fuente de fósforo.

25

Las líneas tipo salvaje y las dos transgénicas de Arabidopsis, PTXD-3 y PTXD-5,

fueron germinadas y cultivadas en contenedores plásticos de un litro con medio líquido

Murashige y Skoog 0.1X carente de fosfato y suplementado con 50, 100 o 1000 micromolar

de ácido fosforoso (H3P03). Se dejaron crecer cien plantas por contenedor plástico durante 45

días en una cámara de crecimiento con un ciclo 16:8 de luz:oscuridad para cada período de

3 O

24-horas. Las plantas fueron cubiertas para evitar la pérdida de humedad. Una doble capa de

malla plástica se ubicó donde las semillas fueron sembradas para que germinaran por encima

del medio líquido en cada contenedor plástico.

Después de la retirada de las plantas, utilizando un método de vanadio-molibdato,

transcurridos los 45 días de crecimiento, el contenido de fósforo total fue determinado en el

3 5

medio líquido. Brevemente, se digirieron 5 mL de medio líquido de cada muestra con ácido

nítrico:ácido perclórico (HN03:HC104; 5:1). A continuación, el contenido de fósforo fue

determinado con un método colorimétrico basado en la adición de una solución de molibdato

de amonio (20 mM) y metavanadato de amonio (1 O mM) en ácido perclórico 70%. Después

de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 400 nm

con un espectrofotómetro.

5

En la Fig. 8, las pnmeras tres barras etiquetadas como "inicial" representan la

concentración inicial de fósforo total en el medio sin plantas. Los conjuntos de barras

etiquetadas como WT (Col-O), PTXD-3, y PTXD-5 representan el contenido de fósforo total

en el medio (inicialmente 50 J.1M, 100 J.1M, o 1000 J.1M de fosfito) después de 45 días de

incubación en presencia de las correspondientes líneas de Arabidopsis. Las plantas

1 O

transgénicas (PTXD-3 y PTXD-5), pero no las plantas de tipo salvaje, disminuyeron el

contenido de fósforo en el medio por más del 50%. La disminución en el contenido de

fósforo, que representa una eliminación de fosfito del medio, se debe a la toma de fosfito por

parte de las plantas. Las líneas transgénicas tienen una elevada capacidad de eliminar fosfito

del medio porque son capaces de convertirlo en fosfato, lo cual sostiene el crecimiento

15

vegetal. Esta capacidad de eliminar fosfito desde un medio acuoso puede ser explotada para

eliminar fosfito de agua de desecho (residual), tal como efluentes producidos por las fábricas

deCD/DVD.

La Figura 9 muestra una representación esquemática de la distribución de plantas

parentales (WT) y transgénicas ptxD (PTXD) de Arabidopsis utilizadas para los experimentos

2 O

de las Figs. 1 O y 11.

Las Figuras 1 O y 11 muestran fotografías de plantas parentales y ptxD transgénicas

distribuidas de acuerdo con la Fig. 9 y evaluado su crecimiento sobre un sustrato que contiene

fosfato agregado (Pi)( Fig. 1 O) o fosfito (Phi)( Fig. 11) como fuente de fósforo. La presencia

o ausencia de crecimiento sostenido (más allá de la etapa de germinación) se indica mediante

2 5

un símbolo más ( +) o menos (-), respectivamente. La Figura 1 O muestra crecimiento similar

de las plantas de tipo salvaje y las plantas transgénicas sobre fosfato. Por el contrario, la Fig.

11 muestra que solamente las plantas transgénicas fueron capaces de mostrar crecimiento

sostenido sobre fosfito. Las plantas aquí descritas y las de la Fig. 11 fueron crecidas en una

mezcla de arena:venniculita (1: 1) y recibieron agua y soluciones de nutrientes (carente de

30

cualquier otra fuente de fósforo excepto como se indicó previamente) periódicamente.

La Figura 12 muestra un gráfico de barras de datos obtenidos a partir de ensayos

sobre la capacidad de las líneas vegetales de Arabidopsis de la Fig. 7 para aumentar de peso

cuando son cultivadas en presencia de diversas fuentes de fósforo. El peso seco de las tres

plantas cultivadas en arena:vermiculita (1: 1) como sustrato fue graficado en la figura con

35

respecto a cada línea vegetal particular y la(s) fuente(s) de fósforo. Las plantas de tipo salvaje

no crecieron sustancialmente con fosfito como fuente de fósforo, mientras que las líneas

transgénicas crecieron similarmente o mejor sobre fosfito (Phi) en relación a fosfato (Pi).

Ejemplo 3. Plantas transgénicas de Tabaco que expresan PtxD

Este ejemplo describe la creación y caracterización de Nicotiana tabacum (tabaco)

5

transgénico que comprende el constructo de expresión ptxD del Ejemplo 1; ver Fig. 13.

Nicotiana tabacum fue transformada con el constructo de expresión descrito en el

Ejemplo l. En particular, explantes de hojas de tabaco fueron ca-cultivadas con una cepa de

Agrobacterium que llevaba un constructo 35S::PtxD (Ejemplo 1) dentro de su T-DNA. Se

permitió que discos de hoja se regeneraran en medio MS conteniendo fosfito 1 mM como la

1 O

única fuente de fósforo. Las plantas regeneradas a partir de estos discos de hoja sobre medio

que contenía fosfito fueron transferidas a suelo y se las dejó establecer semilla bajo

condiciones de invernadero.

La Figura 13 muestra fotografias de semillas transgénicas T2 de tabaco, homocigotas

para el gen 35S::PtxD, y plantines control de tabaco tomados 25 días luego de la germinación

15

en medio MS conteniendo ya sea fosfato (1 mM Pi) o fosfito (1 mM Phi) como la única

fuente de fósforo. La presencia o ausencia de crecimiento (luego del agotamiento del fósforo

brindado por la semilla) se indica mediante un símbolo más(+) o menos(-), respectivamente.

Se puede observar que los plantines control germinaron pero fueron incapaces de sostener

crecimiento normal en medio conteniendo fosfito, comparado con cuando el fosfato es

2 O

suministrado como fuente de fósforo. En contraste, las plantas de tabaco de cada línea

transgénica mostraron crecimiento sostenido en presencia de fosfito o fosfato como la fuente

de fósforo. Estos experimentos demuestran la capacidad de modificar el metabolismo de

fósforo en tabaco.

La Figura 14 muestra fotografias de experimentos de crecimiento adicionales

2 5

llevados a cabo con las líneas control y transgénicas de tabaco de la Fig. 13. Los plantines

fueron germinados y mantenidos en medio MS suplementado con fosfito 1 mM como la

única fuente de fósforo durante 25 días. Los plantines fueron luego transferidos a recipientes

para cultivo de tejido conteniendo MS con fosfito 1 mM como la única fuente de fósforo y se

los dejó crecer durante 25 días adicionales en una cámara de crecimiento vegetal a 23 °C, con

3 O

un fotoperíodo de 18 h de luz, seguido de 6 h de oscuridad para cada período de 24 horas. Se

puede observar que las plantas transgénicas PTXD son capaces de sostener crecimiento

rápido en medio conteniendo fosfito como la única fuente de fósforo, mientras que la planta

control es incapaz de utilizar fosfito para su crecimiento y desarrollo.

3 5

Ejemplo 4. Algas transgénicas con metabolismo de fósforo modificado

Este ejemplo describe un método para crear una línea transgénica de algas que

expresa una enzima fosfito deshidrogenasa que permite el crecimiento de las algas sobre

fosfito como fuente de fósforo.

Las algas fotosintéticas han sido adaptadas transgénicamente para muchas

aplicaciones, tales como producción de biocombustibles, agentes farmacéuticos, antígenos, y

5

similares. Las algas pueden ser cultivadas en grandes tanques de fermentación que incorporan

un sistema de iluminación para favorecer la fotosíntesis y promover el crecimiento.

Generalmente, los tanques de fermentación deben estar protegidos contra la contaminación

con algas no deseadas (u otros organismos). Con este fin, las algas se hacen crecer bajo luz

artificial en lugar de luz solar, para reducir el riesgo de contaminación. En este sentido, el

1 O

crecimiento de las algas con exposición a luz solar en tanques abiertos o campos (p.ej., en

estanques), lo cual sería mucho más económico, no es factible actualmente debido al alto

riesgo de contaminación.

La presente descripción permite el uso de luz solar y campos abiertos para el

crecimiento de las algas diana, mediante la modificación de las algas diana para el

15

crecimiento sobre fosfito como fuente de fósforo. Las algas diana modificadas serían capaces

de sobrevivir en un medio conteniendo fosfito y carente de fosfato, que no asistiría al

crecimiento de algas no deseadas (contaminantes) debido a que ellas requerirían fosfato. De

la misma manera, la contaminación por algas no deseadas sería reducida o eliminada,

permitiendo que el alga diana sea cultivada a un bajo coste en un tanque abierto o en el

2 O

campo con la fotosíntesis dirigida por luz solar.

Se genera un constructo de expresión para la transformación de una especies de algas,

como Chlamydomonas reinhardtii. El constructo puede expresar cualquier fosfito

deshidrogenasa adecuada (y, opcionalmente, una hipofosfito deshidrogenasa, también). En la

presente ilustración, el constructo expresa PtxD a partir de la secuencia codificante de ptxD.

2 5

El constructo utiliza una secuencia promotora híbrida para dirigir la expresión al tiempo que

evita el silenciamiento del gen: el promotor HSP70A está fusionado corriente arriba del

promotor RBCS2 (cada promotor es provisto por C. reinhardtii)(Schroda et al, 2000, Plant J.

21: 121-131 ). La secuencia promotora híbrida dirige la expresión del primer intrón de RBS2

de C. reinhardtii, el cual está fusionado a la secuencia codificante del gen ptxD

3 O

(Pseudomonas stutzeri), el cual, a su vez, está fusionado a la secuencia de terminación de la

transcripción del gen RBS2. Para mejorar la expresión del polipéptido PtxD a partir del

constructo, la secuencia codificante ptxD puede ser modificada para tener una G o una C en

la tercera posición de codones que permiten este cambio (vía degeneración del código

genético), para optimizar la utilización del codón para la traducción en C. reinhardtii.

35

El constructo de expresión ptxD puede presentarse como un plásmido que contiene

un origen de replicación funcional en E. coli, un marcador de selección para E. coli (p.ej., un

gen de resistencia a ampicilina), y un marcador de selección funcional en C. reinhardtii, entre

otros. Un marcador de selección de ejemplo para C. reinhardtii codifica una proteína de

unión a zeomicina que confiere resistencia a zeomicina y fleomicina (Lumbreras et al., 1998,

Plant J. 14: 441-447).

5

El constructo de expresión ptxD es introducido dentro de C. reinhardtii mediante

cualquier mecanismo adecuado, tal como bombardeo de partículas (Debuchy et al., 1989,

EMBO J. 8: 2803-2809) o con la ayuda de perlas de vidrio (Kindle et al., 1991, PNAS 88:

1721-1725), entre otros.

La transformación de C. reinhardtii con perlas de vidrio puede ser llevada a cabo

10

como se describe en Kindle (1990, PNAS 87: 1228-1232). Las paredes celulares son

eliminadas de las células de C. reinhardtii incubándolas en autolisina no diluida durante 30-

60 min a temperatura ambiente. La efectividad del tratamiento es controlada mediante la

sensibilidad frente a detergente Nonidet P-40 0,004% (Sigma). Las células son cosechadas de

la autolisina mediante centrifugación, resuspendidas en medio líquido y transformadas

15

inmediatamente para evitar la regeneración de la pared celular. Las perlas de vidrio (0,45-

0,52 mm) se lavan con ácido sulfúrico concentrado, posteriormente se enjuagan

profundamente con agua destilada, se secan, y se esterilizan mediante horneado a 250 oc

durante 2-3 h. Las perlas de vidrio (300 mg) se agregan a 0,4 mL de células, se agregan 2

microgramos de ADN de plásmido, y las células son agitadas a máxima velocidad en un

2 O

mezclador Fisher Vortex Genie II en tubos cónicos de centrífuga descartables de

polipropileno de 15-mL. Se deja que las perlas decanten, y las células se dispersan sobre

placas de agar selectivo con un anza de vidrio. Para la selección directa de transformantes

resistentes a zeomicina, las células son agitadas con perlas de vidrio y ADN, diluidas en 20

mL de medio líquido T AP y se dejan para que expresen el gen ble incubando a 25 oc en la

25

luz (80 ¡.tE m-2 s-1 ) durante 15-18 h con agitación suave. Las células son posteriormente

agrupadas mediante centrifugación, resuspendidas en 5 mL de T AP conteniendo agar fundido

0,5%, y son volcadas sobre la superficie de una placa de TAP/ agar 2% conteniendo

zeomicina a 20 mg/mL.

Las colonias resistentes a Zeomicina son luego dispersadas en medio TAP carente de

3 O

cualquier fuente de fosfato, pero suplementado con fosfito 1 mM como fuente de fósforo. Las

placas son incubadas durante 18 a 24 h a 25 oc a la luz y las colonias que crecen son capaces

de utilizar fosfito como fuente de fósforo.

Ejemplo 5. Trichoderma transgénico que expresa una fosfito deshidrogenasa

35

Este ejemplo describe un método para crear un hongo del género Trichoderma

modificado para expresar una enzima fosfito deshidrogenasa, para rendir el hongo capaz de

crecer sobre fosfito como fuente de fósforo.

A. Introducción

Las espec1es de Tridwderma son hongos de vida libre que son comunes en

ecosistemas de suelo y raíz. Descubrimientos recientes muestran que se han compmiado

5

como simbiontes vegetales no virulentos, así como también son parásitos de hongos

fitopatogénicos. Algunas cepas establecen una colonización robusta y duradera de las

superficies de la raíz y penetran dentro de la epidennis. Como habitantes permanentes del

suelo y hongos competentes con la rizosfera, las especies de Trichoderma han sido utilizadas

exitosamente como agentes de control biológíco para el manejo de patógenos vegetales.

1 O

Varios mecanismos de biocontrol han sido propuestos para Trichodenna, incluyendo

competencia, micoparasitismo y la inducción de respuestas de defensa en la planta debido a la

colonización de los espacios intercelulares de la raíz vegetal (Howell, 2003: Yedidia et al.,

1999). La colonización de la raíz por especies de Trichoderma también mejora

frecuentemente el crecimiento y desarrollo de la raíz, la productividad del cultivo, la

15

resistencia a estreses abióticos, y la toma y utilización de nutrientes.

Las especies de Trichoderma pueden ser modificadas para expresar PtxD o un

ortólogo o derivado del mismo, para dar lugar a Trichoderma capaz de crecer sobre fosfito.

Opcionalmente, Trichoderma también puede ser modi:ficada para expresar una hipofosüto

deshidrogenasa (p.ej., HtxA). En cualquier caso, estas Trichoderma transgénicas pueden

2 O

producirse para diversos usos. Por ejemplo, pueden ser utilizadas para f1nes de

biorremediación, tales como para eliminar fosfito (y/o hipofosfito) de agua de desecho de la

industria de CD y DVD. Las Trichoderma transgénicas pueden ser utilizadas para

biorremediación solas o en combinación con una planta transgénica (p.ej., Ejemplo 1 ). El uso

de un sistema combinado de planta transgénica/hongo para la eliminación de fosfito (y/o

2 5

hipofosfito) puede ser más eficiente que el uso de alguno de estos sólo. Alternativamente, la

Trichoderma transgénica puede estar asociada con plantas para protegerlas de hongos

patógenos. En este caso, las plantas puede ser no transgénicas de modo que requieran fosfato

como fuente de fósforo, o pueden ser plantas transgénicas que puedan crecer sobre fosfito

como fuente de fósforo (p.ej., Ejemplo 1). En cualquier caso, la Trichoderma transgénica

3 O

puede funcionar como un poderoso fungicida, dado que tanto la Trichoderma en sí misma

como su utilización del fosfito puede proteger las plantas.

B. Protocolo

La transformación de protoplastos de Trichoderma atroviride (IMI 206040) es

llevada a cabo utilizando métodos conocidos en el arte, tales como el método PEG-CaCb

35

(Herrera-Estrella et al., 1990; Baek & Kenerley, 1998), biolística (Lorito et al., 1993), o

electroporación (Goldman et al., 1990), entre otros. El ADN transformante es un plásmido o

un producto de PCR que lleva un gen que codifica una enzima fosfito deshidrogenasa (p.ej.,

PtxD) bajo el control del promotor pki de Trichoderma reesei o el promotor trpC de

Aspergillus nidulans, y el terminador blu17 de T. atroviride o el trpC de A. nidulans. Los

plásmidos son purificados utilizando el kit Qiagen Plasmid Midi Kit o gradientes de cloruro

5

de cesio. Para la selección, se plaquean alícuotas de 100, 200, y 500 JlL utilizando una capa

de agar que contiene sorbitol 1,2 M y H3P03200 mM como única fuente de fósforo,

inmediatamente después del tratamiento o a continuación de un período de incubación de 2-

4 horas de los protoplastos en sorbitol 1,2 M. Después de tres o cuatro días de incubación a

28 °C, las colonias capaces de crecer sobre fosfito como fuente de fósforo deberían aparecer

1 O

sobre las placas. Las transformantes deberían aparecer solamente cuando son transformadas

con constructos que llevan las secuencias codificantes ptxD. Las transformantes son

sometidas a tres rondas de cultivo monoespórico para obtener homocariones.

Alternativamente, las transformantes de Trichoderma pueden ser obtenidas mediante co-

transformación utilizando un marcador de resistencia a antibiótico para selección (tal como

15

hph, el cual confiere resistencia a higromicina), en combinación con un constructo que lleva

el gen ptxD. Esta última estrategia, las transformantes resistentes a higromicina que llevan el

gen ptxD son seleccionadas primero, y las cepas capaces de utilizar fosfito como fuente de

fósforo pueden ser seleccionadas en una etapa posterior como se mencionó anteriormente, o

son identificadas en un ensayo de expresión del gen ptxD.

20

Se producen conidios de transformantes que llevan un cassette de utilización de

fosfito mediante procesos sólidos o de fermentación sumergida, conocidos en el arte

(Cavalcante et al., 2008). Los conidios pueden ser aplicados a plantas, semillas de las

mismas, o a suelo, entre otros. Por ejemplo, los conidios pueden ser aplicados a semillas

(p.ej., con una tira de látex, tal como Rhoplex B-15J), directamente a raíces de plantas como

25

una suspensión de esporas (p.ej., con una tira), o a suelo en agua como una suspensión de

esporas o en una mezcla de preparación de salvado de trigo/turba (0,5%, p/p ), entre otros.

Ejemplo 6. Micorrizas formadas con un hongo que expresa una Enzima fosfito

deshidrogenasa bacteriana

3 O

Este ejemplo describe un método para crear un hongo de tipo micorrizal modificado

transgénicamente para expresar una enzima fosfito deshidrogenasa (y/o una enzima

hipofosfito deshidrogenasa bacteriana), la cual proporciona al hongo transgénico la capacidad

de crecer sobre fosfito (y/ o hipofosfito) como fuente de fósforo. También se describe un

método para formar micorrizas mediante asociación del hongo transgénico con una planta.

3 5

Las micorrizas formadas con estos hongos transgénicos y la planta pueden suministrar a la

planta fosfato para crecimiento. En este caso particular, la planta en sí misma no necesitaría

ser transgénica, dado que las m1cornzas harían todo el trabajo de convertir fosfito (y/ o

hipofosfito) en fosfato.

A. Introducción

El fósforo (P) es un nutriente esencial que puede limitar la productividad vegetal en

5

ecosistemas naturales y agronómicos. Una planta puede formar una relación simbiótica

natural con un hongo micorrizal, el cual actúa como una extensión del sistema radicular de la

planta para proporcionar a la planta con los nutrientes minerales, particularmente fosfato, a

cambio de moléculas que contienen carbono derivadas de la actividad fotosintética de la

planta (Smith and Read, 1997). Los hongos micorrizales penetran en las células de la raíz de

1 O

la planta, estableciendo las membranas plasmáticas del hongo y la planta una asociación

cercana para formar las así denominadas estructuras arbusculares. Los nutrientes minerales,

particularmente fosfato, pueden ser transferidos desde células fúngicas a células vegetales en

las estructuras arbusculares. Adicionalmente a los nutrientes minerales, las micorrizas

también pueden mejorar la capacidad de la planta de tomar agua y pueden protegerla de

15

metales pesados (Khan, AG., 2006; Forbes et al., 1998).

Las micorrizas tienen que competir con otros microorganismos por la disponibilidad

de fosfato. Por lo tanto, las cepas micorrizales transgénicas que expresan un gen que codifica

una enzima fosfito deshidrogenasa capaz de convertir fosfito en fosfato pueden ser utilizadas

para suministrar a las plantas fosfato. En este caso, el hongo micorrizal convertirá fosfito en

2 O

fosfato, el cual luego puede ser transferido a las raíces de plantas no transgénicas incapaces

de metabolizar fosfito. Alternativamente, para hacer el sistema más eficiente, puede utilizarse

una asociación de hongos micorrizales transgénicos y plantas transgénicas ambos expresando

un gen que codifica fosfito deshidrogenasa. La asociación de hongos micorrizales

transgénicos con plantas no transgénicas o transgénicas puede ser utilizada para mejorar la

2 5

productividad de la planta utilizando fertilizantes en los cuales el fosfato ha sido reemplazado

por fosfito, o para biorremediar efluentes de fábricas productoras de CD o DVD o suelos en

los cuales el fosfito ha sido utilizado como fungicida (Ohtake, H., 1995)

B. Protocolo

Este ejemplo utiliza la secuencia codificante de ptxD de Pseudomonas stutzeri. Sin

3 O

embargo, puede explotarse cualquier secuencia codificante adecuada para una fosfito

deshidrogenasa.

Se crea un constructo de gen ubicando la secuencm codificante de ptxD bajo el

control del promotor de la gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa (gpd) de Aspergillus

nidulans y la región terminadora de la transcripción del gen de la triptófano sintetasa (trpC)

35

de A. nidulans. También se incluye un marcador de selección tal como el gen aph de E. coli,

el cual confiere resistencia a higromicina, o el gen ble, el cual confiere resistencia a la

fleomicina, en la molécula transformante (Barrett et al., 1990).

Para la transformación, se obtienen protoplastos de un hongo micorrizal (p.ej.,

Laccaria bicolor, Cenococcum geophilum, Hebeloma cylindrosporium, Paxillus involotus,

Gigaspora rosea, Glomus mosseae, Glomus aggregatum, Glomus intraradices, Pisolithus

5

tinctorius, etc.) de acuerdo con el protocolo de Barrett et al. (1990). Para aislar protoplastos,

los micelios son recolectados y lavados varias veces con agua estéril y luego son tratados con

enzimas hidro líticas (una mezcla de celulasa, quitinasa, y proteasas, con 5 a 1 O mg/mL de

cada enzima) en una solución osmótica (PDB; papa-dextrosa-caldo con manitol 0,8 M o

sacarosa 0,6 M) para degradar las paredes celulares. Los micelios son incubados con las

1 O

enzimas durante 1 a 3 horas a 32 oc con agitación constante (1 00 rpm). La suspensión de

protoplastos es filtrada y lavada con la solución osmótica. Los protoplastos se recuperan

mediante centrifugación durante 1 Omin a 800 rpm y el pellet de protoplastos es resuspendido

en buffer PDB y se determina el número de protoplastos mediante conteo bajo un

o omiCrOSCOpiO.

15

Los protoplastos (1-3x107 en 250 JlL) son mezclados con 5 a 20 microgramos del

constructo de gen y son incubados en solución de PEG para transformación (25-60%

polietilenglicol4000, CaCb10-25 mM, Tris-HC110 mM, pH 7,5) durante 45 minutos a 4 °C.

Un mL adicional de solución de PEG para transformación es agregado y se continúa la

incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se deja que los protoplastos

2 O

regeneren las paredes celulares en medio líquido y se seleccionan los transformantes en

medio sólido. El medio sólido (patata dextrosa agar) contiene 100 Jlg/mL de higromicina o

100 Jlg/mL de fleomicina, dependiendo del marcador de selección utilizado para la

transformación. Las colonias que crecen son transferidas a medio sólido tres veces para aislar

micelios establemente transformados. La presencia del marcador de selección así como

2 5

también del gen ptxD es confirmada mediante PCR. Una vez que los transformantes estables

son aislados, se transfiere una porción de 2 mm de micelio a medio PDA carente de fosfato y

suplementado con fosfito 1 mM para identificar colonias que expresan el constructo de gen

ptxD. Se utiliza análisis de Southern blot para confirmar la presencia de los genes

correspondientes.

30

Para confirmar que el hongo transgénico puede proporcionar fosfato a las plantas, se

inocula el suelo con micelios del hongo transformado con ptxD, y se germinan semillas de

tabaco en el suelo. El suelo es fertilizado con una concentración normal de nitrógeno y

potasio, con fosfito como la fuente de fósforo. Se compara el crecimiento de las plantas de

tabaco a partir de la semilla en suelo inoculado con el hongo transgénico ptxD, con el

3 5

crecimiento en suelo control que no ha sido inoculado.

Ejemplo 7. Realizaciones seleccionadas I Este ejemplo describe realizaciones seleccionadas de la invención, presentadas como una serie de párrafos indexados.

A. Una planta transgénica capaz de utilizar al menos una forma reducida de

5 fósforo como un fertilizante de fósforo. La planta transgénica descrita aquí puede ser adicionalmente caracterizada como sigue: (Al) en donde la planta expresa una secuencia codificante bacteriana que codifica una enzima capaz de oxidar fosfito a fosfato, permitiendo así el uso de fosfito como un fertilizante de fósforo (y una fuente de fósforo); (A2) en donde la secuencia codificante bacteriana de Al es ptxD de Pseudomonas stutzeri, Alcaligenes

1 O faecalis, o Xanthobacter flavus; (A3) en donde la planta transgénica de Al o A2 expresa secuencias codificantes htxA y ptxD, permitiendo así el uso de hipofosfito y/o fosfito como un fertilizante de fósforo; (A4) en donde cada una o ambas de las secuencias codificantes bacterianas de A3 es de Pseudomonas stutzeri, Alcaligenes faecalis, o Xanthobacter flavus; (AS) en donde al menos una de la(s) secuencia(s) codificante(s) bacteriana(s) de cualquiera

15 de Al a A4 está bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor específico de hoja, un promotor específico de tejido, un promotor específico de raíz, un promotor inducible en condiciones de baja concentración de fosfato, o el promotor 3SS del Virus del Mosaico de la Coliflor; o (A6) cualquier combinación de Al a AS.

B. El uso de una planta transgénica capaz de oxidar hipofosfito a fosfato, y/o 2 O fosfito a fosfato, para eliminar hipofosfito y/o fosfito de un efluente industrial o municipal.

C. El uso de una o más secuencias codificantes bacterianas que oxidan hipofosfito a fosfato, y/o fosfito a fosfato, como un marcador de selección para la producción de plantas transgénicas.

D. El uso de moléculas de ADN recombinante compuestas de una o más

2 5 secuencias codificantes bacterianas que codifican enzimas que oxidan hipofosfito a fosfato, y/o fosfito a fosfato, y de una secuencia promotora funcional en plantas como un marcador de selección para la producción de plantas transgénicas.

E. Un gen quimérico funcional en una célula vegetal, cuyo gen quimérico comprende: (1) una secuencia promotora capaz de expresarse en plantas; (2) una secuencia 3 O señal de terminación; y (3) una región codificante de un gen bacteriano que oxida fosfito a fosfato, cuya región codificante: codifica una enzima NAD:fosfito oxidorreductasa funcional, y está ubicada entre dicha secuencia promotora que se expresa en plantas y dicha secuencia señal de terminación, donde la expresión de dicha región codificante en una célula vegetal confiere la capacidad de utilizar fosfito como fuente de fósforo sobre dicha célula vegetal y

3 5 en donde dicha capacidad para utilizar fosfito como fuente de fósforo es capaz de proporcionar una base para la selección de dicha célula vegetal. El gen quimérico de este

párrafo puede ser adicionalmente caracterizado como sigue: (El) en donde la región

codificante es del gen ptxD de Pseudomonas stutzeri, Alcaligenes faecalis, o Xanthobacter

flavus; (E2) en donde la secuencia promotora es un promotor constitutivo; (E3) en donde la

secuencia promotora es el promotor 3SS del Virus del Mosaico de la Coliflor; (E4) en donde

5

la secuencia señal de terminación es una secuencia señal de terminación de nopalina

sintetasa; (ES) en donde la secuencia señal de terminación es una secuencia señal de

terminación del Virus del Mosaico de la Coliflor; o (E6) cualquier combinación de El a ES.

F. Una planta transgénica que expresa al menos una enzima foránea en un nivel

que permite a la planta metabolizar una forma reducida de fósforo como un fertilizante de

10

fósforo.

Ejemplo 8. Realizaciones seleccionadas JI

Este ejemplo describe realizaciones seleccionadas de la invención, presentadas como

una serie de párrafos indexados.

15

A. Una planta transgénica que comprende un constructo que confiere (1) una

ventaja de crecimiento sobre la planta para el crecimiento utilizando una forma reducida de

fósforo como nutriente y/o (2) una capacidad para metabolizar al menos una forma reducida

de fósforo. La planta transgénica descrita aquí puede ser adicionalmente descripta como

sigue: (Al) en donde el constructo confiere una ventaja de crecimiento sobre la planta si

2 O

fosfito es una fuente externa de fósforo al menos sustancialmente exclusiva para la planta;

(A2) en donde el constructo confiere una ventaja de crecimiento sobre la planta si hipofosfito

es una fuente externa de fósforo al menos sustancialmente exclusiva para la planta; (A3) en

donde el constructo confiere una ventaja de crecimiento sobre la planta si el fosfito es una

fuente externa de fósforo al menos sustancialmente exclusiva para la planta y si hipofosfito es

25

una fuente externa de fósforo al menos sustancialmente exclusiva para la planta; (A4) en

donde la planta transgénica es capaz de crecer sin fosfato como una fuente externa de fósforo,

y en donde una variedad no transgénica de la planta transgénica que carece del constructo es

al menos sustancialmente incapaz de crecer sin fosfato como una fuente externa de fósforo;

(AS) en donde la planta transgénica fue transformada inicialmente con el constructo en un

3 O

progenitor de la planta transgénica; (A6) en donde el constructo codifica la expresión de uno

o más polipéptidos que confieren a la planta una capacidad para metabolizar al menos una

forma reducida de fósforo a fosfato, y, opcionalmente, en donde al menos uno de los

polipéptidos oxida fosfito a fosfato, y, opcionalmente, en donde al menos uno de los

polipéptidos es capaz de utilizar nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) y/o nicotinamida

35

adenina dinucleótido fosfato (NADP+) como un aceptor de electrones, y, opcionalmente, en

donde uno o más polipéptidos incluye un polipéptido PtxD, el cual, opcionalmente, está

codificado mediante una región codificante que se origina al menos sustancialmente a partir de Pseudomonas stutzeri, Alcaligenes faecalis, o Xanthobacter flavus; (A7) en donde uno o más polipéptidos de A6 incluye un polipéptido HtxA; (A8) en donde la expresión de al menos uno de los polipéptidos de A6 o A7 es inducible; (A9) en donde la expresión de al menos uno 5 de los polipéptidos seleccionados de entre cualquiera de A6 a A8 es inducible mediante bajo fosfato; (Al O) en donde la expresión de al menos uno de los polipéptidos seleccionados de entre cualquiera de A6 a A9 está bajo el control de un promotor constitutivo; (All) en donde la expresión de al menos uno de los polipéptidos seleccionados de entre cualquiera de A6 a Al O está bajo el control de un promotor específico de hoja; (Al2) en donde la expresión de al

1 O menos uno de los polipéptidos seleccionados de entre cualquiera de A6 a All está bajo el control de un promotor específico de raíz; (A13) en donde la expresión de al menos uno de los polipéptidos seleccionados de entre cualquiera de A6 a Al2 está bajo el control de un promotor que no es específico de tejido; o (Al4) cualquier combinación de Al a A13.

B. Una planta transgénica que comprende un constructo que codifica un

15 polipéptido bacteriano que confiere a la planta la capacidad para metabolizar fosfito en fosfato.

C. Una semilla que germina para producir, o cualquier parte de planta utilizada para producir o reproducirse vegetativamente, la planta transgénica del párrafo A o B.

D. Un ácido nucleico para la generación de una planta transgénica, que

2 O comprende: un gen quimérico capaz de conferir sobre una planta (1) una ventaja de crecimiento para crecer utilizando una forma reducida de fósforo como nutriente y/o (2) una capacidad para metabolizar al menos una forma reducida de fósforo. El ácido nucleico descrito aquí puede ser adicionalmente descrito como sigue: (D 1) en donde el gen quimérico incluye un promotor unido operativamente a una región codificante, y en donde el promotor

2 5 es capaz de controlar la expresión de la región codificante en una planta, y, opcionalmente, en donde la región codificante codifica uno o más polipéptidos que oxidan fosfito a fosfato, y, opcionalmente, en donde la región codificante está provista al menos sustancialmente mediante un gen ptxD; (D2) en donde el gen quimérico incluye un promotor unido operativamente a una región codificante, y en donde el promotor se originó al menos

30 sustancialmente en una planta y/o un virus vegetal, y, opcionalmente, en donde el promotor incluye un promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor; (D3) que adicionalmente comprende un terminador de la transcripción que es funcional en una planta y está unido operativamente al promotor y la región codificante de Dl o D2; (D4) en donde la región codificante de cualquiera de Dl a D3 codifica un polipéptido que oxida fosfito a fosfato; (D5)

3 5 en donde el ácido nucleico está dispuesto en un microorganismo; (D6) en donde el ácido nucleico es aislado a partir de células; (D7) en donde el ácido nucleico está dispuesto en una planta transgénica; o (D8) cualquier combinación de Dl a D7.

E. Un método para generar una planta transgénica, que comprende: seleccionar por transformación de una planta o parte de planta utilizando, como un marcador de selección, un ácido nucleico que confiere una capacidad para metabolizar una forma reducida

5 de fósforo. El método descrito aquí puede ser adicionalmente descrito como sigue: (El) en donde la etapa de seleccionar por transformación incluye una etapa de seleccionar por una ventaja de crecimiento de la planta o parte de planta, en relación a otras plantas o partes de plantas, con una o más formas reducidas de fósforo como una fuente externa de fósforo para las plantas o partes de plantas; (E2) en donde la etapa de seleccionar por una ventaja de

1 O crecimiento en El es llevada a cabo con las plantas o partes de plantas en contacto con un medio que contiene fosfito, hipofosfito, o ambos; (E3) en donde la etapa de seleccionar por una ventaja de crecimiento de El o E2 es llevada a cabo con el medio que no contiene fosfato al menos sustancialmente; (E4), que adicionalmente comprende una etapa de poner en contacto la planta o parte de planta, un progenitor de la misma, o ambos, con un agente

15 modificante que incluye un constructo que proporciona el marcador de selección; (ES) en donde el agente modificante de E4 incluye células de Agrobacterium que contienen el constructo; (E6) en donde el constructo de E4 o ES codifica un polipéptido que oxida fosfito a fosfato; (E7) en donde el constructo de cualquiera de E4 a E6 codifica un polipéptido que oxida hipofosfito a fosfato; (E8) en donde la etapa de poner en contacto de cualquiera de E4 a

2 O E7 incluye una etapa de disparar proyectiles a la planta o parte de planta, un progenitor de la misma, o ambos; (E9) en donde la etapa de seleccionar por transformación es llevada a cabo con una parte de planta, y en donde la parte de planta es un explante de tejido o una célula vegetal aislada; o (El O) cualquier combinación de El a E9.

F. Un método para fertilizar la planta transgénica del párrafo A o B, en donde

2 5 una forma reducida de fósforo es utilizada como fertilizante foliar o es agregada para corregir la composición del suelo para proporcionar una fuente de fosfato para favorecer el crecimiento y reproducción vegetal.

G. Un método para remediación de agua, que comprende: poner en contacto (i) un efluente que incluye fosfito y (ii) una planta transgénica que comprende un constructo que

3 O confiere una capacidad para metabolizar fosfito en fosfato, reduciendo así el nivel de fosfito en el efluente.

Ejemplo 9. Realizaciones seleccionadas !JI

Este ejemplo describe realizaciones seleccionadas de la invención, presentadas como 3 5 una serie de párrafos indexados.

A. Un ácido nucleico, que comprende: un gen quimérico que incluye (a) una

región codificante que codifica para una enzima fosfito deshidrogenasa y (b) un promotor de

la transcripción unido operativamente a la región codificante, en donde el promotor es

heterólogo con respecto a la región codificante y es funcional en plantas, hongos, o ambos, y

en donde el gen quimérico proporciona suficiente expresión de la enzima, en una célula

5

vegetal o fúngica que contiene el gen quimérico, para conferir una capacidad sobre la célula

para metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento,

permitiendo así el crecimiento de la célula sin una fuente externa de fosfato (Pi). El ácido

nucleico de este párrafo puede ser descrito adicionalmente como sigue: (Al) en donde la

enzima fosfito deshidrogenasa es de origen bacteriano; (A2) en donde la enzima fosfito

1 O

deshidrogenasa es PtxD de Pseudomonas stutzeri (SEQ ID NO: 1 ), un análogo o derivado de

PtxD (SEQ ID NO:l), o un homólogo tipo PtxD de otra especie bacteriana; (A3) en donde la

enzima fosfito deshidrogenasa bacteriana tiene una secuencia de aminoácido con al menos

50%, 60%, 80%, 90%, o 95% identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID

NOS:l-14; (A4) en donde la enzima fosfito deshidrogenasa tiene una secuencia de

15

aminoácido que incluye una primera región de secuencia que tiene un motivo que se une a

NAD con similitud o identidad de secuencia con VGILGMGAIG (SEQ ID NO:l5), una

segunda región de secuencia que tiene similitud o identidad de secuencia con

XPGALL VNPCRGSVVD (SEQ ID NO:l6), donde X es K o R, una tercera región de

secuencia que tiene similitud o identidad de secuencia con GWX1PX2X3YX4X5GL (SEQ ID

20

NO.l9), donde X1 es R, Q, T, o K, X2 es A, V, Q, R, K, H, o E, X3 es Lo F, ~es G, F, o S, y

X5 es T, R, M, L, A, o S, o incluye cualquier combinación de las regiones de secuencia

primera, segunda y tercera; (AS) en donde la enzima fosfito deshidrogenasa tiene una

secuencia de aminoácido que es al menos 90% idéntica a PtxD de Pseudomonas stutzeri

(SEQ ID NO:l); (A6) en donde el gen quimérico adicionalmente incluye un terminador de la

2 5

transcripción que está unido operativamente a la región codificante y es heterólogo con

respecto a la región codificante; (A7) en donde el promotor es un promotor vegetal o un

promotor viral de un virus vegetal y es capaz de promover la suficiente expresión de la

enzima en una célula vegetal; (A8) en donde el promotor de A7 corresponde al promotor 35S

del Virus del Mosaico de la Coliflor; (A9) en donde el promotor de A 7 es inducible mediante

3 O

baja disponibilidad de fosfato; (Al O) en donde el promotor de A9 corresponde a un promotor

del gen PLDZ2 de Arabidopsis thaliana; (All) en donde el gen quimérico es capaz de

promover la suficiente expresión de la enzima tanto en una célula vegetal como en una célula

fúngica cada una conteniendo el gen quimérico; (Al2) en donde el promotor es un promotor

fúngico capaz de promover la suficiente expresión de la enzima en una célula fúngica; (A13)

3 5

en donde uno o más codones de la región codificante han sido cambiados in vitro para

mejorar la eficiencia de la traducción en plantas y/u hongos; (Al4) que adicionalmente

comprende un intrón conectado a la región codificante y está configurado para ser transcrito con la región codificante y eliminado por splicing una vez realizada la transcripción, en donde el intrón está opcionalmente dispuesto dentro de la región codificante; (A15) en donde la región codificante tiene al menos 90% identidad de secuencia con la SEQ ID N0:21; o

5 (A16) cualquier combinación de Al a A15.

B. Una célula vegetal que comprende un ácido nucleico que expresa una enzima fosfito deshidrogenasa en la célula vegetal y es capaz de metabolizar fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento. Opcionalmente, el ácido nucleico es de acuerdo al párrafo A. La célula vegetal descrita aquí puede ser adicionalmente descripta como sigue:

1 O (B 1) que adicionalmente comprende un otro ácido nucleico que expresa una enzima hipofosfito deshidrogenasa que, opcionalmente puede ser de origen bacteriano, en la célula vegetal; (B2) la célula vegetal de Bl en donde los ácidos nucleicos colectivamente confieren una capacidad sobre la célula para metabolizar hipofosfito (Hphi) como fuente de fósforocomo fuente de fósforo para favorecer el crecimiento; (B3) en donde el otro ácido

15 nucleico de B 1 o B2 codifica un polipéptido con al menos 95% de identidad de secuencia con HtxA de Pseudomonas stutzeri (SEQ ID N0:20); (B4) la célula vegetal de cualquiera de Bl a B3, en donde los ácidos nucleicos están integrados adyacentes uno del otro en el genoma de la célula vegetal; (B5) en donde la expresión de la enzima fosfito deshidrogenasa, la enzima hipofosfito deshidrogenasa, o ambas están controladas por un promotor específico de raíz;

2 O (B6) en donde la célula vegetal es homocigota para el ácido nucleico; (B7) en donde la célula vegetal es una célula eucariótica de alga; (B8) en donde la célula de alga de B7 es una célula de Chlamydomonas; (B9) en donde la célula vegetal es de una especie de planta vascular; o (Blü) cualquier combinación de Bl a B9.

C. Una planta compuesta de una pluralidad de células vegetales de acuerdo con

25 el párrafo B. La planta de este párrafo puede ser descrita adicionalmente como sigue: (Cl) en donde la planta es una planta vascular, tal como una especie de planta de cultivo, (C2) en donde la especie de planta de cultivo de Cl es seleccionada a partir del grupo que consiste de maíz, soja, arroz, patata, tomate, caña de azúcar y trigo.

D. Una célula fúngica que comprende un ácido nucleico que expresa una enzima

3 O fosfito deshidrogenasa en la célula fúngica y es capaz de metabolizar fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento. Opcionalmente, el ácido nucleico es de acuerdo con el párrafo A. La célula fúngica de este párrafo puede ser adicionalmente descripta como sigue: (D 1) que adicionalmente comprende un ácido nucleico que expresa una enzima hipofosfito deshidrogenasa bacteriana en la célula fúngica; (D2) la célula fúngica de Dl, en donde los

3 5 ácidos nucleicos colectivamente confieren una capacidad sobre la célula para metabolizar hipofosfito (Hphi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento de la célula fúngica; (D3) en donde la célula fúngica es de una especie de Trichoderma; (D4) en donde la célula fúngica es un miembro de una especie de hongo micorrizal capaz de formar una relación simbiótica con una planta; o (D5) cualquier combinación de Dl a D4.

E. Un método para reducir infecciones fúngicas en plantas, que comprende:

5 aplicar una pluralidad de las células fúngicas del párrafo D a una forma de semilla de plantas, las plantas en sí mismas, suelo en el cual las plantas están dispuestas, o una combinación de las mismas. En algunos casos, las células fúngicas pueden ser esporas.

F. Una planta asociada con una pluralidad de células fúngicas de acuerdo con el párrafo D para formar micorrizas. Opcionalmente, las células fúngicas hacen que la planta

1 O sea capaz de crecer sobre un medio que contiene fosfito (Phi), hipofosfito (Hphi), o ambos, como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

G. Un método para fertilizar una planta de cultivo que utiliza hipofosfito y/o fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, la planta de cultivo (a) que incluye una pluralidad de células que comprenden el ácido nucleico del párrafo A, (b) que

15 forma micorrizas con un hongo micorrizal que comprende el ácido nucleico del párrafo A, y/o (e) que está asociada con un hongo Trichoderma que comprende el nucleico de la reivindicación 1, comprendiendo el método: aplicar al menos una forma reducida de fósforo a la planta y/o al suelo adyacente a la planta, de modo que la forma reducida sea metabolizada a fosfato por parte de la planta y/o el hongo, para favorecer el crecimiento y productividad de la

20 planta.

H. Un método para fertilizar la planta del párrafo C, comprendiendo el método: aplicar al menos una forma reducida de fósforo a la planta y/o al suelo adyacente a la planta, de modo que la forma reducida sea metabolizada a fosfato por parte de la planta para favorecer el crecimiento y productividad de la planta. Opcionalmente, la forma reducida

2 5 pueda ser aplicada como fertilizante foliar o agregada para corregir el suelo para proporcionar una fuente de fosfato para sostener el crecimiento y productividad.

I. Un método para tratar agua para disminuir su contenido de fósforo reducido, comprendiendo el método: poner en contacto agua que contiene hipofosfito y/o fosfito con una pluralidad de las células vegetales y/o células fúngicas que comprende el ácido nucleico

30 del párrafo A, de modo que al menos una porción del hipofosfito y/o fosfito es oxidada a fosfito y/o fosfato. Opcionalmente, la etapa de poner en contacto incluye una etapa de poner en contacto el agua con una pluralidad de plantas vasculares compuestas de células vegetales que comprenden el ácido nucleico del párrafo A.

J. Un método para tratar desechos (residuos) líquidos para disminuir su

35 contenido de fósforo reducido, comprendiendo el método: poner en contacto (i) agua que contiene hipofosfito y/o fosfito como un contaminante y (ii) una pluralidad de las células vegetales y/o células fúngicas que comprenden el nucleico del párrafo A, de modo que al menos una porción del hipofosfito y/o fosfito es oxidado a fosfito y/o fosfato.

K. Un método para utilizar el ácido nucleico del párrafo A para la producción de una planta transgénica, que comprende: seleccionar por crecimiento de células vegetales que

5 comprenden el ácido nucleico del párrafo A como marcador de selección durante la producción de una planta transgénica.

L. Un método para obtener una planta transformada con un ácido nucleico que codifica una enzima fosfito deshidrogenasa que se expresa a partir del ácido nucleico como marcador de selección, que comprende: poner en contacto células vegetales y una

1 O composición que incluye el ácido nucleico bajo condiciones que promueven la introducción del ácido nucleico dentro de al menos un subconjunto de las células vegetales; cultivar las células vegetales en un medio que contiene fosfito como fuente de fósforo primaria o exclusiva para el crecimiento; seleccionar células vegetales transformadas producidas mediante las etapas de poner en contacto y cultivar, y expresar la enzima fosfito

15 deshidrogenasa evidenciada por el crecimiento en el medio; y regenerar al menos una porción de las células vegetales transformadas dentro de una planta transgénica. El método descrito aquí puede ser descrito adicionalmente como sigue: (Ll) en donde la composición incluye células de Agrobacterium que suministran el ácido nucleico durante la etapa de poner en contacto; o (L2) en donde la composición incluye proyectiles que son disparados a las células

2 O vegetales en la etapa de poner en contacto.

M. Una planta, que comprende: un ácido nucleico que incluye un gen quimérico que expresa una enzima fosfito deshidrogenasa de modo que la planta es capaz de metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, permitiendo así el crecimiento de la planta sin una fuente externa de fosfato (Pi). La planta descrita aquí

25 puede ser adicionalmente descrita como sigue: (Ml) en donde el ácido nucleico está establemente integrado dentro del genoma de la planta; (M2) en donde la planta es una planta vascular; (M3) en donde la planta es una especie de alga; (M4) en donde la enzima fosfito deshidrogenasa tiene cualquiera de las características del párrafo A; o (M5) cualquier combinación de Ml a M4.

3 O N. Un hongo, que comprende: un ácido nucleico que incluye un gen quimérico que expresa una enzima fosfito deshidrogenasa de modo que el hongo es capaz de metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, permitiendo así el crecimiento del hongo sin una fuente externa de fosfato (Pi). El hongo de este párrafo puede ser adicionalmente descrito como sigue: (Nl) en donde el ácido nucleico está

35 establemente integrado dentro del genoma del hongo; (N2) en donde el hongo es una especie de Trichoderma; (N3) en donde el hongo es una especie micorrizal capaz de formar una

relación simbiótica con una planta; (N4) que adicionalmente comprende una planta asociada

con el hongo para formar micorrizas; (N5) en donde la enzima fosfito deshidrogenasa tiene

cualquiera de las características del párrafo A; o (N6) cualquier combinación de Nl a N5.

La

descripción establecida anteriormente puede abarcar múltiples invenciones

5

distintas con utilidad independiente. A pesar de que cada una de estas invenciones ha sido

descrita en su/s forma/s preferida/s, las realizaciones específicas de las mismas tal como se

describen e ilustran en la presente invención, no están consideradas en un sentido limitante,

dado que numerosas variaciones son posibles. El objeto de las invenciones incluye todas las

combinaciones y sub-combinaciones novedosas

y no obvias de los diversos elementos,

1 O

características, funciones y/o propiedades descritas en la presente invención. Las siguientes

reivindicaciones particularmente destacan ciertas combinaciones

y sub-combinaciones

consideradas como novedosas y no obvias. Las invenciones abarcadas en otras

combinaciones y sub-combinaciones de características, funciones, elementos y/o propiedades

pueden ser reivindicadas en solicitudes que invocan prioridad sobre esta o de solicitudes

15

relacionadas. Dichas reivindicaciones, ya sea dirigidas a una invención diferente o a la misma

invención,

y ya sea más amplia, más estrecha, igual o diferente en alcance a las

reivindicaciones originales, también están consideradas como incluidas dentro del objeto de

las invenciones de la presente descripción.

Bibliografía

5

Este apartado presenta un conjunto de referencias pertinentes a aspectos de la presente descripción. Cada una de las referencias está incorporada en el presente documento como referencia para todo propósito.

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Claims (38)

1. REIVINDICACIONES

   l. Un ácido nucleico que comprende: un gen quimérico que incluye (a) una región codificante que codifica para una enzima 5 fosfito deshidrogenasa y (b) un promotor de transcripción unido operativamente a la región codificante, donde el promotor es heterólogo con respecto a la región codificante y es funcional en plantas, hongos, o ambos, y en donde el gen quimérico proporciona suficiente expresión de la enzima, en una

   1 O célula vegetal o fúngica que contiene el gen quimérico, para conferir una capacidad a la célula para metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, permitiendo así el crecimiento de la célula sin una fuente externa de fosfato (Pi).
2. 2. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde la enzima fosfito 15 deshidrogenasa es de origen bacteriano.
3. 3. El ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la enzima fosfito deshidrogenasa es PtxD de Pseudomonas stutzeri (SEQ ID NO:l), un análogo o derivado de la PtxD de SEQ ID NO:l, o un homólogo similar a PtxD de otra especie bacteriana.
4. 4. El ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la enzima fosfito deshidrogenasa bacteriana tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs:l-14.

   25 5. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde la enzima fosfito deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una primera región que tiene un motivo de unión a NAD con similitud o identidad de secuencia con VGILGMGAIG (SEQ ID N0:15), una segunda región que tiene similitud o identidad de secuencia con XPGALL VNPCRGSVVD (SEQ ID N0:16), donde X es K o R, y una tercera región que

   3 O tiene similitud o identidad de secuencia con GWX1PX2X3~X5GL (SEQ ID N0.19), donde X1 es R, Q, T, o K, X2 es A, V, Q, R, K, H, o E, X3 es Lo F, ~es G, F, o S, y X5 es T, R, M, L,A, oS.
5. 6. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde la enzima fosfito

   3 5 deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a PtxD de Pseudomonas stutzeri (SEQ ID NO:l).
6. 7. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el gen quimérico incluye además un terminador de la transcripción que está unido operativamente a la región codificante y es heterólogo con respecto a dicha región codificante.

   5 8. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el promotor es un promotor vegetal o un promotor viral de un virus vegetal y es capaz de inducir la suficiente expresión de la enzima en una célula vegetal.
7. 9. El ácido nucleico según la reivindicación 8, donde el promotor es el 1 O promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor.

   1O. El ácido nucleico según la reivindicación 8, donde el promotor es inducible mediante baja disponibilidad de fosfato.

   15 11. El ácido nucleico según la reivindicación 8, donde el promotor es un promotor del gen PLDZ2 de Arabidopsis thaliana.
8. 12. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el gen quimérico es capaz

   de inducir la suficiente expresión de la enzima tanto en una célula vegetal como en una célula 2 O fúngica que contengan el gen quimérico.
9. 13. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el promotor es un promotor fúngico capaz de inducir la suficiente expresión de la enzima en una célula fúngica.

   25 14. Una célula vegetal que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y que es capaz de metabolizar fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.
10. 15. La célula vegetal según la reivindicación 14, que adicionalmente comprende

    3 O un ácido nucleico que expresa una enzima hipofosfito deshidrogenasa bacteriana en la célula vegetal.
11. 16. La célula vegetal según la reivindicación 15, donde los ácidos nucleicos

    colectivamente confieren una capacidad a la célula para metabolizar hipofosfito (Hphi) como 3 5 fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

12. 17.

    La célula vegetal según la reivindicación 16, donde la expresión de la enzima fosfito deshidrogenasa, la enzima hipofosfito deshidrogenasa bacteriana, o ambas están controladas mediante un promotor específico de raíz.

13. 18.

    La célula vegetal según la reivindicación 14, donde la célula vegetal es una célula de alga eucariótica.

14. 19.

    La célula vegetal según la reivindicación 18, donde la célula de alga es una célula Chlamydomonas.

15. 20.

    La célula vegetal según la reivindicación 14, donde la célula vegetal es de una especie de planta vascular.

16. 21.

    Una planta compuesta de una pluralidad de células vegetales según la reivindicación 14.

17. 22.

    Una planta compuesta de una pluralidad de células vegetales según la reivindicación 20.

18. 23.

    La planta de la reivindicación 22, donde la planta es de una especie de planta de cultivo.

19. 24.

    La planta de la reivindicación 23, donde la especie de la planta de cultivo se selecciona a partir del grupo que consiste en: maíz, soja, arroz, patata, tomate, caña de azúcar, y trigo.

20. 25.

    Una célula fúngica que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 12, y 13 y que es capaz de metabolizar fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

21. 26.

    La célula fúngica según la reivindicación 25, que adicionalmente comprende un ácido nucleico que expresa una enzima hipofosfito deshidrogenasa bacteriana en la célula fúngica.

22. 27.

    La célula fúngica según la reivindicación 26, donde los ácidos nucleicos colectivamente confieren una capacidad a la célula para metabolizar hipofosfito (Hphi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

    5 28. La célula fúngica según la reivindicación 25, en donde la célula fúngica es de una especie de Trichoderma.
23. 29. Un método para reducir infecciones fúngicas en plantas, que comprende: aplicar una pluralidad de las células fúngicas de la reivindicación 25 a una forma de

    1 O semilla de plantas, a las plantas en sí mismas, al suelo en el cual las plantas están o estarán dispuestas, o a una combinación de las mismas.
24. 30. La célula fúngica según la reivindicación 25, donde dicha célula fúngica es

    un miembro de una especie de hongo micorrizal capaz de formar una relación simbiótica con 15 una planta.
25. 31. Una planta asociada con una pluralidad de células fúngicas según la reivindicación 30 para formar micorrizas.

    20 32. La planta según la reivindicación 31, donde las células fúngicas hacen a la planta capaz de crecer sobre un medio que contiene fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.
26. 33. Un método para fertilizar una planta de cultivo utilizando hipofosfito y/o 2 5 fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, incluyendo la planta de cultivo

    (a) una pluralidad de células que comprenden el ácido nucleico de la reivindicación 1, (b) formando micorrizas con un hongo micorrizal que comprende el nucleico de la reivindicación 1, y/o (e) estando asociada con un hongo Trichoderma que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1, donde el método comprende:

    3 O aplicar al menos una forma reducida de fósforo a la planta y/o al suelo adyacente a la planta, de modo que la forma reducida sea metabolizada a fosfato por la planta y/o que el hongo favorezca el crecimiento y productividad de la planta.
27. 34. Un método para fertilizar la planta según la reivindicación 22, que 35 comprende:

    aplicar al menos una forma reducida de fósforo a la planta y/o al suelo adyacente a la planta, de modo que la forma reducida sea metabolizada a fosfato por la planta para favorecer el crecimiento y productividad de la planta.

    5 35. Un método para tratar residuos líquidos para disminuir su contenido en

    fósforo reducido, que comprende: poner en contacto (i) agua que contiene hipofosfito y/o fosfito como contaminante y

    (ii) una pluralidad de las células vegetales y/o células fúngicas que comprenden el nucleico

    de la reivindicación 1, de modo que al menos una porción del hipofosfito y/ o fosfito sea 1 O oxidado a fosfito y/o fosfato.
28. 36. El método según la reivindicación 35, donde la etapa de poner en contacto incluye una paso de poner en contacto el agua y una pluralidad de plantas vasculares compuestas de células vegetales que comprenden el ácido nucleico de la reivindicación l.
29. 37. Un método para aislar células transformadas que contienen el ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende: poner en contacto células seleccionadas a partir de células vegetales y células fúngicas con una composición que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1; y

    2 O hacer proliferar selectivamente una o más de las células que han sido transformadas mediante el ácido nucleico cultivando las células en un medio que contiene fosfito y que carece de suficiente fosfato para favorecer el crecimiento.
30. 38. Un método para utilizar el ácido nucleico de la reivindicación 1 para la 2 5 producción de una planta transgénica, que comprende:

    seleccionar por crecimiento células vegetales que comprenden el ácido nucleico de la reivindicación 1 como un marcador de selección durante la producción de una planta transgénica.

    30 39. Un método para obtener una planta transformada con un ácido nucleico que codifica para una enzima fosfito deshidrogenasa que se expresa a partir del ácido nucleico como un marcador de selección, que comprende:

    poner en contacto células vegetales y una composición que incluye el ácido nucleico bajo condiciones que promueven la introducción del ácido nucleico en al menos un 3 5 subconjunto de las células vegetales;

    cultivar las células vegetales en un medio que contiene fosfito como una fuente primaria o exclusiva de fósforo para crecimiento; seleccionar células vegetales transformadas producidas mediante las etapas de poner en contacto y cultivar, y expresar la enzima fosfito deshidrogenasa como evidenciada por 5 crecimiento en el medio; y regenerar al menos una porción de las células vegetales transformadas, en una planta transgénica.
31. 40. El método según la reivindicación 39, donde la composición incluye células 1 O de Agrobacterium que suministran el ácido nucleico durante la etapa de poner en contacto.
32. 41. El método según la reivindicación 39, donde la composición incluye proyectiles que son disparados a las células vegetales en la etapa de poner en contacto.

    15 42. Una planta, que comprende: un ácido nucleico que incluye un gen quimérico que expresa una enzima fosfito deshidrogenasa de modo que la planta es capaz de metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, permitiendo así el crecimiento de la planta sin una fuente externa de fosfato (Pi).
33. 43. La planta según la reivindicación 42, donde el ácido nucleico está establemente integrado dentro del genoma de la planta.
34. 44. La planta de la reivindicación 42, según donde la planta es una planta 2 5 vascular.
35. 45. La planta de la reivindicación 42, según donde la planta es una especie de alga.

    30 46. Un hongo, que comprende: un ácido nucleico que incluye un gen quimérico que expresa una enzima fosfito deshidrogenasa de modo que el hongo es capaz de metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, permitiendo así el crecimiento del hongo sin una fuente externa de fosfato (Pi).
36. 47. El hongo según la reivindicación 46, donde el ácido nucleico está establemente integrado dentro del genoma del hongo.
37. 48. El hongo según la reivindicación 46, donde el hongo es una especie de 5 Trichoderma.
38. 49. El hongo según la reivindicación 46, donde el hongo es de la especie micorrizal capaz de formar una relación simbiótica con una planta.

    10 50. El hongo según la reivindicación 46, que adicionalmente comprende una planta asociada con el hongo para formar micorrizas.