CN109182356A - 具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用。本发明克隆的亚磷酸脱氢酶PtxQ蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。通过遗传转化验证表明，转亚磷酸脱氢酶PtxQ基因的转基因植物明显提高了对亚磷酸脱氢酶活性，转基因植物获得了利用亚磷酸盐的能力。本发明的基因可在调控作物对亚磷酸盐利用能力中的应用。

Description

具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用，本发明通过突变筛选获得高催化活性的亚磷酸脱氢酶，然后利用人工设计和合成适宜于植物表达的PtxQ基因，以人工合成基因转入宿主细胞中，利用转基因技术获得转基因植物材料。本发明还涉及利用该基因使植物获得亚磷酸脱氢酶活性和利用亚磷酸盐的能力，在施用亚磷酸的条件下，达到对目标植物的施肥效果。
背景技术
我国的人均可耕地面积远远低于发达国家，保障国家粮食安全只能通过提高单位面积产量来实现。为了维持单位产量，我国农业生产中化肥和农药的用量极大，且逐年增长。磷是限制我国作物产量的主要因素之一，然而我国的磷肥当季利用率仅在10％—20％左右(程明芳, 何萍et al.2010)。磷肥的低利用效率一方面极大地加重了农业生产成本，另一方面大量没有被作物吸收的磷被土壤固定，通过水土流失作用流入附近水域，造成水体的富营养化，破坏生态环境。
磷肥的低利用率，主要是由于土壤对磷酸盐的固定效应极强，导致植物可利用的溶解性有效磷不足。为了解决这一问题，上世纪50年代，有学者曾提出以亚磷酸盐作为一种替代磷肥使用。亚磷酸盐作为磷肥的优势有以下三点：(1)亚磷酸盐在土壤中的溶解能力约为磷酸盐的1000倍；(2)亚磷酸盐能被植物有效吸收(Thao and Yamakawa 2009)；(3)很多微生物不能利用亚磷酸盐，因此间接提高植物对亚磷酸盐的利用效率。然而，多年研究表明，虽然植物能够有效吸收亚磷酸盐，但是进入植物体内的亚磷酸盐，并不能被代谢和利用，为植物提供磷营养，过量使用反而会抑制植物对磷的利用效率和生长。由于亚磷酸盐能够抑制多数作物病原卵菌及少数真菌，亚磷酸盐也被开发为绿色环保的杀菌剂广泛使用。
若能利用亚磷酸盐替代磷酸盐作为磷肥使用，可极大拓展亚磷酸盐的应用空间，真正实现磷肥的“药肥一体化”。现代分子育种技术的发展与亚磷酸脱氢酶的发现使这一设想成为可能。土壤和水系中，存在少量能够利用亚磷酸盐为唯一磷源的微生物。这些微生物编码亚磷酸脱氢酶(PtxD)，将吸收的亚磷酸氧化为磷酸盐，进而进行正常的代谢(Metcalfand Wolfe 1998,Martinez,Osburne et al.2012)。最近，来自墨西哥科学家LuisHerrera-Estrella等人在拟南芥中超表达一个假单胞菌属来源的PtxD基因后，转基因植物能够直接利用亚磷酸盐为磷源。在碱性缺磷土壤中，施亚磷酸盐的转基因植株与施磷酸盐的野生型植株相比，前者的总生物量高出16％-20％，表明亚磷酸盐作为磷肥使用的潜力巨大(Lopez-Arredondo and Herrera-Estrella 2012)。因此，培育能够利用亚磷酸盐的作物，推广“亚磷酸盐代谢作物+亚磷酸盐”生产模式，有望整合亚磷酸盐“施肥、控草、抗病”三重功效，真正实现磷肥的“药肥一体化”，提高作物对磷肥的利用率，从而为降低农业成产成本，保护农业生态环境提供全新的解决策略。通过生物技术在作物中超表达亚磷酸脱氢酶基因，进行分子育种研究有着非常良好的应用前景，但是国内还没有相关的专利和文献报道。
目前已报道的亚磷酸脱氢酶活性较低，无法满足作物中的应用需求，因此获得新型的高活性亚磷酸脱氢酶尤为重要。发明人前期研究中构建了突变体库，利用高通量体外筛选技术，意外获得一株催化活性显著提高的突变菌株。测序分析结果表明：突变株中的亚磷酸脱氢酶与野生型氨基酸序列相比，其第139位的酪氨酸被色氨酸替代，证实139位点为该酶核心催化位点。进一步对139位点氨基酸进行定点突变饱和突变库构建和体外筛选，发现该位点突变为谷氨酰胺(Q)时活性最高，其催化效率约为野生型的6倍，筛选获得的新基因被命名为PTDH-Q 基因。然而，发明人通过将该PTDH-Q基因通过构建载体并转入植物后，发现并不能赋予植物亚磷酸脱氢酶活性和亚磷酸盐的利用能力。为了获得具有植物亚磷酸脱氢酶活性的转基因植物，申请人对PTDH-Q基因进行了密码子优化等分子操作，同时通过人工合成了基因序列并命名为PtxQ。通过构建植物表达载体并进行不同植物的转基因，惊奇发现在拟南芥，水稻，玉米和油菜等不同植物中，PtxQ表达量较高的转基因材料均获得亚磷酸脱氢酶的活性，同时转基因植物也能有效利用亚磷酸盐作为唯一磷源。研究表明：重新设计的PtxQ基因酶活更稳定，在转基因植物中具有更好的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有亚磷酸脱氢酶活性的蛋白质及其基因序列，并且利用所述基因对作物进行转基因改良，由此获得的转基因植物能够利用亚磷酸盐作为唯一磷源。
本发明通过如下技术方案来实现：
本发明提供了一种亚磷酸脱氢酶蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种亚磷酸脱氢酶蛋白基因，该基因编码的蛋白质序列如SEQ IDNO：2所示。
本发明还提供一种包含利用上述核酸培育转基因植物的应用。
本发明还提供一种对亚磷酸脱氢酶进行改造的方法，所述的方法包括利用SEQ IDNO：1 所示的核苷酸序列转化水稻愈伤组织，再将转化后的愈伤组织通过遗传转化体系再生为完整的转基因植株。
进一步，本发明提供了一种经过密码子优化的亚磷酸脱氢酶基因PtxQ，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(1-1008bp)，其对应的氨基酸序列如1-1008bp所示。该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，属于亚磷酸脱氢酶基因。
本发明还提供一种利用PtxQ基因转化水稻的方法，即：提供了含有SEQ ID NO：1所示的序列的PtxQ基因的植物表达载体，该表达载体的图谱如图3所示，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的蛋白质。
本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物，使其获得亚磷酸脱氢酶活性和利用亚磷酸盐作为磷源的方法。
实现本发明的具体技术步骤如下：
(1)人工合成PtxQ基因
通过软件进行密码子优化后，人工合成PtxQ基因，通过PCR和无缝克隆等分子生物学技术将PtxQ基因构建到水稻转化表达载体中。构建步骤见图3。具体实施方法见见《具体实施方式》。
(2)水稻转基因
利用农杆菌介导水稻转基因受体的快速制备方法获得转基因水稻植株。
(3)调节PtxQ基因在水稻中的分子鉴定
通过转基因超表达PtxQ基因在水稻中的表达，获得超表达的转基因水稻，并通过常用的 PCR和RT-PCR等方法检测转基因植株的生物学功能。
(4)PtxQ基因功能初步鉴定
将所得转基因超表达PtxQ的材料和野生型(非转基因)水稻种子发芽后，培养于水稻液体培养基中，将生长至10天的幼苗在正常生长和供给亚磷酸盐条件下处理两周，测定所有植株的酶活性和生理表型。超表达PtxQ基因之后，转基因水稻材料获得亚磷酸脱氢酶活性，而对照植株(野生型水稻)没有该活性。与此相对应，当只有供应亚磷酸盐时，转基因植株生长良好，而对照植株生长则受到显著的抑制(见图6)。
本发明的有益效果：
磷矿石是开发磷肥最重要的自然资源，磷矿石一种不可再生的自然资源，国际上磷肥价格逐年上涨，磷矿石已经逐渐成为一种战略资源。目前我国是世界第一磷肥进口国，为了应对我国的磷肥危机并且保护生态环境，迫切需要提高作物对磷肥利用效率和培育耐低磷的作物。本发明通过转基因技术获得具有亚磷酸脱氢酶的超表达材料并且使其能够有效利用亚磷酸盐。相比之前报道，本发明首次赋予转基因植物利用亚磷酸盐的能力，提高了植物的磷利用效率，本发明可用于植物的磷高效转基因育种等方面。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的一种亚磷酸脱氢酶PtxQ蛋白基因的核苷酸序列 (1-1008bp)及其对应的氨基酸序列(1-1008bp)。
序列表SEQ ID NO:2是本发明克隆的一种亚磷酸脱氢酶PtxQ蛋白基因编码的蛋白质序列。编码336个蛋白质。
图1：是亚磷酸脱氢酶PtxQ蛋白基因的核苷酸序列。
图2：是亚磷酸脱氢酶PtxQ蛋白基因编码的氨基酸序列。
图3：是本发明构建的PtxQ基因的超表达载体的图谱。
图4：是本发明的转超表达载体Ubi-PtxD构建过程。附图标记说明：图4中的A图：PtxQ基因PCR 扩增电泳结果，其中泳道1号和2号泳道为PCR产物，3号泳道为阴性对照；图4中的B图： pTF101-ubi质粒BamH I酶切电泳结果，其中CK为对照pTF101-ubi质粒，泳道2和3为质粒的酶切样品；图4中的C图：连接转化大肠杆菌的克隆，并进行PCR验证结果，其中1-4号泳道为PCR 产物，5号泳道为阴性对照。
图5：是本发明的转PtxQ基因水稻植株分子鉴定结果。附图标记说明：图5中的A图：转基因水稻的PCR验证；利用PtxQ引物进行转基因水稻的PCR验证，其中阳性植株用于后续的RT-PCR验证和生理实验。图5中的B图：泳道1是野生型对照(非转基因)，泳道2–14是不同独立转基因株系，共13个超表达转基因株系，以水稻的ACTIN基因作为内参。
图6：是本发明的转PtxQ基因水稻亚磷酸盐利用能力分析。附图标记说明：图5中的PtxQ-2和 PtxQ-9分别代表独立的转基因事件。T1代转基因水稻分别在缺磷，加磷和亚磷酸盐供给条件下生长2周，然后取样拍照和进行表型分析，包括地上部干重(A)和地下部干重(B)，分蘖数(C)和植株无机磷含量(D)。
具体实施方式
实施例1、亚磷酸脱氢酶基因(PtxQ)的合成及超表达载体的构建
(1)亚磷酸脱氢酶基因(PtxQ)密码子优化和合成
利用金唯智公司的Codon OptimWiz软件，输入亚磷酸脱氢酶PtxQ的蛋白序列，选择水稻和玉米密码子偏好性进行密码子优化，对PtxQ基因序列进行设计改造，软件输出的PtxQ基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据软件优化后的序列(参见SEQ ID NO:1)，通过金唯智公司进行人工从头合成核苷酸序列。
(2)利用亚磷酸脱氢酶基因PtxQ构建超表达载体Ubi-PtxD
根据PtxQ基因核苷酸序列(参见SEQ ID NO:1)设计并合成PCR扩增引物，序列如下：
PtxD-F:5’tgcaggtcgactctagagATGAAGCCGAAGGTGGTCCT 3’，
PtxD-R:5’tcgagctcggtacccgggTTAGGCGGCCTTCACGCCTGGGT 3’；
以上述合成的PtxQ基因为模板，PCR扩增PtxQ基因，PCR体系和扩增条件见表1。
表1 PtxQ基因PCR反应体系与扩增条件
将获得的PCR产物进行凝胶电泳，对目的条带进行切割，利用北京康为世纪生物科技有限公司提供的凝胶回收试剂盒回收PtxQ基因的PCR产物。利用BamH I酶切pTF101-ubi质粒，进行凝胶电泳，对目的条带进行切割，再利用北京康为世纪生物科技有限公司提供的凝胶回收线性化pTF101-ubi质粒。利用苏州神洲基因有限公司提供的无缝克隆试剂盒，将PtxQ基因PCR产物克隆至pTF101-ubi质粒中转化大肠杆菌DH5α菌株。挑选阳性克隆进行PCR验证，验证阳性克隆进行测序，测序正确即为超表达载体Ubi-PtxQ，最后将该超表达载体导入农杆菌 EHA101中备用。超表达载体Ubi-PtxQ的具体构建步骤见图4。
实施例2、水稻转基因
(1)试验材料野生型(即非转基因)水稻品种中花11(又称ZH11，来自中国农业科学院作物科学研究所)。
(2)水稻转基因方法
1)水稻成熟胚愈伤组织的准备
水稻品种中花11成熟种子脱壳后，挑选饱满光洁无菌斑的种子放入烧杯中，用70％乙醇消毒1min。倒去乙醇，加入20％(v/v)NaClO溶液(有效氯约1～1.2％)消毒90min。倒去NaClO 溶液，用无菌水清洗5遍，最后1遍在无菌水中浸泡30min。倒去无菌水，将种子置于无菌滤纸上吸干。用镊子将种子转入诱导培养基中，28℃暗培养10-14d。在超净工作台上打开培养皿，用镊子将小芽和米粒壳去掉，留下胚性愈伤组织(外观为淡黄色，致密不规则)，置入粳稻愈伤组织继代培养基中，28℃暗培养5-10d。
2)农杆菌的培养
将保存的农杆菌菌株贮备液在YEP固体培养基(蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L,NaCl 5g/L,Agar 12g/L，50mg/L卡那霉素，50mg/L链霉素)上划线活化，28℃培养1-1.5天。用无菌牙签挑取农杆菌单克隆于5ml YEP液体培养基中(蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L,NaCl 5g/L,50mg/L卡那霉素，50mg/L链霉素)，28℃，250rpm振荡培养36h至菌液饱和，从中吸取农杆菌菌液50μl于30ml YEP液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养约12h至菌液OD600值＝0.8-1.0。将培养的农杆菌液低速离心(4000rpm，10min)，弃上清，用适量的细胞培养基AAM培养液(含200μM As，购自上海冠道生物工程有限公司)重悬，稀释成OD600值＝0.3-0.5的菌悬液。
3)共培养及抗性愈伤组织的筛选
将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，切割成粒状，放入农杆菌菌悬液，振荡培养30分钟。将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min。然后将愈伤组织置于共培养基上。 25℃暗培养2.5d后，将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含250mg/L 羧苄青霉素钠的无菌水清洗1～2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2h。将晾干的愈伤组织转入含 250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14d。将长大的初始愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素钠和80mg/L潮霉素选择培养基上进行第二轮选择，28℃，暗培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。如果三周结束未长出抗性愈伤组织，需转入相同成分的选择培养基上进行第三轮选择。
4)抗性愈伤组织的分化及成苗培养
挑取从同一愈伤组织得到的抗性愈伤组织2-3颗置于分化培养基上，28℃光照培养[14h 光照/10h黑暗的光周期，光照强度为2000lx]。分化培养20-50d后愈伤组织会分化出小苗。当绿芽长至3-5cm左右，转入生根培养基中，28℃光照培养[14h光照/10h黑暗的光周期，光照强度为2000lx]。
5)转基因苗的移栽
生根培养10-15d后，将转基因苗根部和茎叶分化得较完整的植株挑出，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，在培养室炼苗2-3d后，洗去琼脂，转入水稻营养液(成分见表13) 中培养2周。利用200mg/L的除草剂草丁磷涂抹转基因植株的叶片，选择出有抗性的转基因阳性苗移入大田或盆栽，从转基因植株上收获种子。
6)水稻转基因相关培养基配方见表2至表12。
表2 N6大量培养基母液(20倍)
20X Molecular Weigh Stored concentration(g/L)
KNO<sub>3</sub> 101.10 56.6
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 147.03 3.32
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 246.47 3.7
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 136.09 8.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 132.14 9.26
表3 B5微量母液(100倍)
1000X Molecular Weigh Stored concentration(g/L)
KI 166 0.750
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 62 3
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 169 10
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 288 2
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 242 0.25
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 250 0.025
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 238 0.025
表4有机溶液配制
烟酸 1mg/ml 盐酸硫胺素(VB1) 10mg/ml
盐酸吡哆醇(VB6) 1mg/ml 肌醇 10mg/ml
表5 AA大量元素母液(每升含量)
Molecular Weigh Stored concentration(g/L)
KCl 75 2.95g
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 147 0.15g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 246 0.25g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 156 0.15g
表6粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(每升含量)
表7粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基(每升含量)
表8粳稻共培养培养基(每升含量)
表9粳稻选择培养基(每升含量)
N6大量元素 50ml B5微量 1ml 铁盐 10ml
烟酸 1ml 盐酸吡哆醇 1ml 盐酸硫胺素 1ml
肌醇 10ml L-Glu 0.5g L-pro 0.5g
CH 0.3g 2,4-D 8ml 蔗糖： 30g
Phytagel 4.0g pH 5.8
灭菌后再加：
表10粳稻分化培养基配方(每升含量)
表11粳稻生根培养基配方(每升含量)
N6大量元素 25ml B5微量 0.5ml 铁盐 5ml
烟酸 0.5ml 盐酸吡哆醇 0.5ml 盐酸硫胺素 0.5ml
肌醇 5ml 蔗糖 20g agar 6g
表12悬浮农杆菌感染愈伤组织团的培养基配方(AAM)每升含量
实施例3：
转基因超表达PtxQ基因的材料和野生型(非转基因)水稻种子中花11用1％硝酸溶液室温下处理16小时，用清水反复冲洗掉硝酸，于37℃培养箱中黑暗下培养两天至露白。催芽完成后，用水稻营养液(表13)培养。温室光照周期为12h光照/12h黑暗，光照强度为3000lux，白天培养温度为30℃，夜间培养温度为22℃。将生长至10天的幼苗在供给磷酸盐和亚磷酸盐的条件下处理两周，测定所有植株的酶活性和生长表型。水稻营养液配方见表13。
表13水培条件下水稻营养液配方
表13注：*营养液用2M盐酸调节至pH5.5。
实施例4转基因水稻的分子鉴定
1、PCR分析：
取2～3cm长鲜嫩的转基因水稻的叶片于1.5ml离心管中，加入500μl TPS溶液(100mM Tris·HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，1M KCl)，盖紧盖子，磨碎机研磨15～20秒。65℃水浴20分钟，每5分钟摇匀一次。在13200rpm下离心10分钟，取上清400μl，加入等体积的异丙醇，混匀。再在12000rpm下离心10分钟，弃上清，加入1ml 70％的乙醇洗涤2次，短暂离心，吸弃多余的乙醇，37℃烘干20分钟，加入20μl含RNase H2O溶解。以该DNA为模板，利用PtxD 基因引物(PtxQ-F:5’GCGGGAGCGTGGATGAGAA和 PtxQ-R:5’CCAGATGCGGGGTGAAGAAGGTC3’)进行PCR，PCR体系和扩增条件见表14。
表14 PCR验证反应体系与条件
PCR产物进行凝胶电泳检测，结果见图5。
2、RT-PCR分析
取50-100mg样品组织用液氮充分研磨，加入1ml Trizol试剂，继续研磨至完全粉末。放置片刻至溶解后，将组织匀浆转移到干净的离心管中。加入200ml氯仿，剧烈震荡15秒，于4 ℃，12000g离心10分钟。上清转入一个新的离心管中，再次加入200ml氯仿，剧烈震荡15秒，于4℃，12000g下离心10min。取上清至新离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温放置10min，于4℃，12000g离心10min。弃上清，用75％乙醇(需用RNAse Free水配置)充分洗涤两次。室温干燥后，用20-40μl RNAse Free水溶解。RNA样品保存在-80℃超低温冰箱中。
本发明的逆转录过程均采用Promega公司的逆转酶(M-MLV ReverseTranscriptase， Promega)，总RNA的制备按照试剂盒提供的操作说明进行逆转录。逆转录完成后，将样品置于75℃处理10min，冰上冷却。短暂离心后，于-20℃保存样品。
先将模板稀释5-10倍后再进行RT-PCR分析。RT-PCR过程中，首先对OsACTIN进行PCR 分析，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。通过控制PCR产物的上样量，将所有样品调节一致后，然后按照此水平对目标基因进行分析。
以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有的可替换方案，均应认为是本发明的保护范围。主要参考文献：
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&lt;110&gt; 华中农业大学
&lt;120&gt; 具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用
&lt;141&gt; 2018-08-27
&lt;160&gt; 2
&lt;170&gt; SIPOSequenceListing 1.0
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 1008
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 水稻(Oryza sativa)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; gene
&lt;222&gt; (1)..(1008)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CDS
&lt;222&gt; (1)..(1008)
&lt;400&gt; 1
atg aag ccg aag gtg gtc ctc acc cac tgg gtg cac ccg gag atc atc 48
Met Lys Pro Lys Val Val Leu Thr His Trp Val His Pro Glu Ile Ile
1 5 10 15
gag ctc ctc agc gcc tcc gcc gac gtg atc ccg aat acc acg cgc gag 96
Glu Leu Leu Ser Ala Ser Ala Asp Val Ile Pro Asn Thr Thr Arg Glu
20 25 30
acg ctc cca cgc tcc gaa gtc att gcc agg gcc aag gac gcc gat gcg 144
Thr Leu Pro Arg Ser Glu Val Ile Ala Arg Ala Lys Asp Ala Asp Ala
35 40 45
ctg atg gcg ttc atg ccg gac agc atc gat agc gcg ttc ctc gag gag 192
Leu Met Ala Phe Met Pro Asp Ser Ile Asp Ser Ala Phe Leu Glu Glu
50 55 60
tgt ccg aag ctc agg gtc atc ggc gcc gcc ctg aag ggc tac gac aac 240
Cys Pro Lys Leu Arg Val Ile Gly Ala Ala Leu Lys Gly Tyr Asp Asn
65 70 75 80
ttc gac gtg aac gcg tgc acc agg cat ggc gtc tgg ctc acc att gtg 288
Phe Asp Val Asn Ala Cys Thr Arg His Gly Val Trp Leu Thr Ile Val
85 90 95
ccg gat ctc ctc acc atc ccg acc gcc gag ctc acg att ggc ctg ctc 336
Pro Asp Leu Leu Thr Ile Pro Thr Ala Glu Leu Thr Ile Gly Leu Leu
100 105 110
ctg ggc ctc acc agg cac atg ctg gaa ggc gac agg cag atc cgc tcc 384
Leu Gly Leu Thr Arg His Met Leu Glu Gly Asp Arg Gln Ile Arg Ser
115 120 125
ggc cac ttc cag ggc tgg agg cca acc ctc caa ggc agc ggc ctc acc 432
Gly His Phe Gln Gly Trp Arg Pro Thr Leu Gln Gly Ser Gly Leu Thr
130 135 140
ggc aaa acc ctg ggc att att ggc atg ggc gcc gtg ggc agg gcc atc 480
Gly Lys Thr Leu Gly Ile Ile Gly Met Gly Ala Val Gly Arg Ala Ile
145 150 155 160
gcc cag cgc ctg gcg ggc ttc gag atg aac ctc ctc tac tgc gac ccg 528
Ala Gln Arg Leu Ala Gly Phe Glu Met Asn Leu Leu Tyr Cys Asp Pro
165 170 175
atc cca ctc aac gcc gag cag gag aag gcc tgg cac gtg cag agg gtc 576
Ile Pro Leu Asn Ala Glu Gln Glu Lys Ala Trp His Val Gln Arg Val
180 185 190
acc ctc gac gag ctg ctg gag aag tgc gac tac gtg gtc cca atg gtg 624
Thr Leu Asp Glu Leu Leu Glu Lys Cys Asp Tyr Val Val Pro Met Val
195 200 205
ccg atg gcc gcg gag acc ctc cac ctg att gac gcc acc gcc ctc gcc 672
Pro Met Ala Ala Glu Thr Leu His Leu Ile Asp Ala Thr Ala Leu Ala
210 215 220
aag atg aag acc ggc tcc tac ctc atc aac gcc tgt cgc ggg agc gtg 720
Lys Met Lys Thr Gly Ser Tyr Leu Ile Asn Ala Cys Arg Gly Ser Val
225 230 235 240
gtg gat gag aac gcg gtc att gcc gcg ctc gcc agc ggc aaa ctc gcc 768
Val Asp Glu Asn Ala Val Ile Ala Ala Leu Ala Ser Gly Lys Leu Ala
245 250 255
ggc tat gcc gcg gac gtg ttc gag atg gaa gag tgg atc cgc gcg gat 816
Gly Tyr Ala Ala Asp Val Phe Glu Met Glu Glu Trp Ile Arg Ala Asp
260 265 270
agg cca cag gcc atc ccg aaa gcc ctc ctc gac aac acg gcc cag acc 864
Arg Pro Gln Ala Ile Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Thr Ala Gln Thr
275 280 285
ttc ttc acc ccg cat ctg ggc tcc gcc gtg aag gag gtg agg ctc gag 912
Phe Phe Thr Pro His Leu Gly Ser Ala Val Lys Glu Val Arg Leu Glu
290 295 300
att gag agg caa gcc gcc atg aac atc att cag gcc ctc gcg ggc gag 960
Ile Glu Arg Gln Ala Ala Met Asn Ile Ile Gln Ala Leu Ala Gly Glu
305 310 315 320
aag ccg atg ggg gcc atc aac cag ccg tac cca ggc gtg aag gcc gcc 1008
Lys Pro Met Gly Ala Ile Asn Gln Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ala Ala
325 330 335
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 336
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 水稻(Oryza sativa)
&lt;400&gt; 2
Met Lys Pro Lys Val Val Leu Thr His Trp Val His Pro Glu Ile Ile
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ser Ala Ser Ala Asp Val Ile Pro Asn Thr Thr Arg Glu
20 25 30
Thr Leu Pro Arg Ser Glu Val Ile Ala Arg Ala Lys Asp Ala Asp Ala
35 40 45
Leu Met Ala Phe Met Pro Asp Ser Ile Asp Ser Ala Phe Leu Glu Glu
50 55 60
Cys Pro Lys Leu Arg Val Ile Gly Ala Ala Leu Lys Gly Tyr Asp Asn
65 70 75 80
Phe Asp Val Asn Ala Cys Thr Arg His Gly Val Trp Leu Thr Ile Val
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Thr Ile Pro Thr Ala Glu Leu Thr Ile Gly Leu Leu
100 105 110
Leu Gly Leu Thr Arg His Met Leu Glu Gly Asp Arg Gln Ile Arg Ser
115 120 125
Gly His Phe Gln Gly Trp Arg Pro Thr Leu Gln Gly Ser Gly Leu Thr
130 135 140
Gly Lys Thr Leu Gly Ile Ile Gly Met Gly Ala Val Gly Arg Ala Ile
145 150 155 160
Ala Gln Arg Leu Ala Gly Phe Glu Met Asn Leu Leu Tyr Cys Asp Pro
165 170 175
Ile Pro Leu Asn Ala Glu Gln Glu Lys Ala Trp His Val Gln Arg Val
180 185 190
Thr Leu Asp Glu Leu Leu Glu Lys Cys Asp Tyr Val Val Pro Met Val
195 200 205
Pro Met Ala Ala Glu Thr Leu His Leu Ile Asp Ala Thr Ala Leu Ala
210 215 220
Lys Met Lys Thr Gly Ser Tyr Leu Ile Asn Ala Cys Arg Gly Ser Val
225 230 235 240
Val Asp Glu Asn Ala Val Ile Ala Ala Leu Ala Ser Gly Lys Leu Ala
245 250 255
Gly Tyr Ala Ala Asp Val Phe Glu Met Glu Glu Trp Ile Arg Ala Asp
260 265 270
Arg Pro Gln Ala Ile Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Thr Ala Gln Thr
275 280 285
Phe Phe Thr Pro His Leu Gly Ser Ala Val Lys Glu Val Arg Leu Glu
290 295 300
Ile Glu Arg Gln Ala Ala Met Asn Ile Ile Gln Ala Leu Ala Gly Glu
305 310 315 320
Lys Pro Met Gly Ala Ile Asn Gln Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ala Ala
325 330 335

Claims (5)

1.一种亚磷酸脱氢酶基因PtxQ在作物对亚磷酸盐的利用能力中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种亚磷酸脱氢酶基因PtxQ在作物对亚磷酸盐的利用能力中的应用，其特征在于，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。
3.包含权利要求1所述基因的转化载体。
4.包含权利要求2所述基因的转化载体。
5.如权利要求1或2所述的基因在调控作物亚磷酸盐的利用能力中的应用，其特征是：用于构建转基因植物，所述转基因植物提高了亚磷酸脱氢酶活性，获得了利用亚磷酸盐的能力。
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