CN102282156B - 能够代谢亚磷酸盐作为磷源的转基因植物和真菌 - Google Patents

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Abstract

用于制备和使用代谢亚磷酸盐作为磷源用于支持生长的转基因植物和/或转基因真菌的系统，包括方法和组合物。

Description

能够代谢亚磷酸盐作为磷源的转基因植物和真菌
对优先权申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)、巴黎公约优先权和任何及所有其它适用法律，本申请基于2008年11月19日提交的美国临时专利申请系列号61/199,784并要求其权益，该申请为了所有目的通过引用全文并入本文。
引言
磷是植物和真菌生长的必需元素。这种元素以氧化形式掺入植物或真菌细胞中的许多生物分子，诸如以提供除了其它以外，遗传材料、膜和分子信使。
无机磷酸盐(Pi)是植物的主要磷源。相应地，基于磷酸盐的肥料提供了强化植物生长的廉价且广泛使用的方法。然而，基于磷酸盐的肥料来自于不可再生的资源，已预计这种不可再生的资源将在下一个70年到100年中耗尽，或如果利用速率增加得比预期更快则耗尽时间更短。
由于多种重要原因，现代农业常用的基于磷酸盐的肥料通常不能被栽培植物有效利用。首先，磷酸盐是高度反应性的，并且可以与许多土壤组分形成不溶复合物，这减少了可利用的磷的量。其次，土壤微生物可以快速地将磷酸盐转化为植物通常不能有效代谢的有机分子，这进一步减少了可利用的磷的量。第三，基于磷酸盐的肥料能够刺激杂草的生长，这不仅更进一步减少了可利用的磷的量，而且还能鼓励杂草与栽培植物竞争空间和其它营养。由于磷酸盐转化为对于植物摄取和利用不易获得的无机形式和有机形式和与杂草竞争所致的损失意味着过量磷酸盐肥料的使用，这不仅增加了生产成本，而且导致严重的生态学问题。因此，对减少农业使用的磷酸盐肥料的量存在迫切需求。
磷酸盐的还原形式亚磷酸盐(Phi)也用在植物的栽培中。已经显示，用亚磷酸盐处理可增加鳄梨和柑橘果实的植物产量(以果实大小和生物量测量)。亚磷酸盐可利用与磷酸盐相同的运输系统运输到植物中，并且可在植物组织中积累延长的时间段。然而，明显没有植物中的任何酶能将亚磷酸盐代谢为植物中的主要磷源磷酸盐的报告。而且，即使在磷酸盐饥饿期间，亚磷酸盐明显不能满足植物的磷营养需求。因此，尽管与磷酸盐相似，亚磷酸盐是通常不能被植物直接代谢的磷形式，因此不是植物营养。尽管如此，亚磷酸盐“肥料”在市场出售，即使科学文献中似乎没有证据或甚至迹象表示植物能同化亚磷酸盐。
亚磷酸盐可间接地促进植物生长。例如，亚磷酸盐用作栽培植物的抗真菌剂(杀真菌剂)。认为亚磷酸盐阻止由卵菌(水霉)对不同植物如除了其它以外的马铃薯、烟草、鳄梨和番木瓜引起的疾病。如此，亚磷酸盐可能促进植物生长，不是直接作为植物营养，而是通过保护植物免受否则将影响植物生长的真菌病原体的影响。尽管如此，基于亚磷酸盐的杀真菌剂通常仍标为肥料。这种错贴标签可能是被政府规章鼓励的，如果制造商将杀真菌剂标为肥料，政府规章使得批准过程较短和较不复杂。
亚磷酸盐充当杀真菌剂的建议机制是多方面的。例如，亚磷酸盐可通过无机焦磷酸盐(PPi)的积累的增加抑制磷酸化反应来作用于真菌，这进而可阻断在代谢上关键的磷酸盐途径。可选地或此外，亚磷酸盐可诱导植物中的天然防御反应。在任何情况中，亚磷酸盐作为杀真菌剂的效力可受许多因素影响，包括环境、病原体类型、植物类型和浓度。
接触植物的亚磷酸盐的浓度可能是亚磷酸盐有效性的关键因素，因为太多亚磷酸盐可以对植物有毒。尤其是，亚磷酸盐可能与磷酸盐竞争进入植物细胞，因为亚磷酸盐可以经由磷酸盐运输系统运输到植物中。因此，亚磷酸盐的毒性可能是因为(1)植物对磷酸盐的同化减少，连同(2)不能通过氧化为磷酸盐而利用亚磷酸盐作为磷源，这导致亚磷酸盐在植物中积累。而且，亚磷酸盐可能被植物感知为磷酸盐，这阻止了植物诱导促进植物在低磷酸盐条件下存活的磷补救途径。亚磷酸盐毒性影响不同植物如黑芥(Brassica nigra)、洋葱(Allium cepa、onion)、玉米(Zea mays L.、corn)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。因此，可能需要非常小心地控制植物对亚磷酸盐的暴露。所以，需要更好的系统来利用亚磷酸盐对植物的益处，同时减少其缺点。
转基因植物的产生有助于创建改进的农业系统。已经建立了至少四种选择系统用于通过选择性生长鉴定转基因植物。每种选择系统是基于对抗生素(卡那霉素或潮霉素)或除草剂(草甘膦或草丁膦)的抗性。然而，每种选择系统都有缺陷。例如，每种选择系统可能具有毒性问题。而且，用抗生素选择可能是无效率的，因为植物可能具有替代的抗性机制。此外，除了利用草丁膦的选择系统以外，所有选择系统都不能提供对大多数或所有植物“通用的”选择性标记。因此，需要用于产生转基因植物的新的选择性标记。
概述
本公开提供用于制备和使用代谢亚磷酸盐作为磷源用于支持生长的转基因植物和/或转基因真菌的系统，包括方法和组合物。
附图简述
图1是示意根据本公开的各方面，如下示例方法的示意性流程图：(i)制备能够代谢还原形式的磷诸如亚磷酸盐作为磷源用于支持生长的转基因植物(或真菌)，和/或(ii)利用赋予代谢还原形式的磷诸如亚磷酸盐作为磷源用于支持生长的能力的核酸作为选择性标记。
图2是根据本公开的各方面，用于图1方法的示例核酸的示意图。
图3是根据本公开的各方面，利用从施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的ptxD和htxA基因表达的酶在细菌中将次磷酸盐氧化为磷酸盐的建议机制。
图4是根据本公开的各方面，用于产生将亚磷酸盐代谢为磷酸盐的转基因植物而构建的示例嵌合基因的示意图。
图5是根据本公开的各方面，产生图4的嵌合基因所遵循的策略的一部分的示意图。
图6是根据本公开的各方面，显示以图4的嵌合基因用作选择性标记，通过选择转基因植物在磷酸盐不存在时在含亚磷酸盐的培养基上生长的能力而获得的示例数据的一对照片。
图7是根据本公开的各方面，从有或没有亚磷酸盐(Phi)或磷酸盐(Pi)作为磷源的液体生长培养基中萌发和培育的对照和转基因(ptxD)拟南芥株系的生长试验获得的数据的一系列照片。
图8是根据本公开的各方面，从图7的拟南芥株系自其生长培养基中得到磷的能力的试验获得的数据的柱状图，该植物在含有不同浓度的亚磷酸盐(Phi)作为磷源的生长培养基中培育了45天。
图9是根据本公开的各方面，用于图10和11实验的对照(WT)和ptxD转基因(PTXD)拟南芥植物在生长基质上的分布的示意图。
图10是根据本公开的各方面，根据图9分布并且被检验在含有磷酸盐(Pi)作为磷源的基质上的生长的亲代和ptxD转基因植物的照片。
图11是根据本公开的各方面，根据图9分布并且被测试在含有亚磷酸盐(Phi)作为磷源的基质上的生长的亲代和ptxD转基因植物的照片。
图12是根据本公开的各方面，从在不存在或存在磷酸盐和/或亚磷酸盐作为磷源时培育的图7的拟南芥株系重量增加的能力试验获得的数据的柱状图。
图13是根据本公开的各方面，在磷酸盐或亚磷酸盐作为磷源存在时，萌发25天后烟草(Nicotiana tabacum，tobacco)的对照(WT)和ptxD转基因株系的一组照片。
图14是根据本公开的各方面，以图13的对照和转基因烟草株系进行的另一生长实验的一组照片。
详述
本公开提供用于制备和使用代谢亚磷酸盐作为磷源用于支持生长的转基因植物和/或转基因真菌的系统，包括方法和组合物。植物和/或真菌任选地还可代谢次磷酸盐作为磷源。本文公开的系统可实质上改变磷的更还原的形式(相对于磷酸盐)诸如亚磷酸盐用作肥料和/或杀真菌剂的方式。系统还可提供用于产生转基因植物和/或真菌的新的选择性标记。系统还可以实质上改变从废水诸如工业/城市污水中去除至少一种还原形式的磷的方式。
提供了核酸。核酸可用于产生转基因植物和/或真菌。核酸可称为构建体，可包括赋予植物细胞和/或真菌细胞将至少一种还原形式的磷代谢为磷酸盐的能力的至少一种嵌合基因。在一些实施方案中，核酸可包括表达亚磷酸盐脱氢酶的基因、表达次磷酸盐脱氢酶的基因、或二者。
核酸可包括包含编码区和转录启动子的嵌合基因。编码区可编码一种亚磷酸盐脱氢酶，除了其它以外，诸如来自施氏假单胞菌的PtxD、来自相同或另一细菌物种的PtxD同源物(homolog)、或两者中的任一种的衍生物。在一些实例中，编码区可与施氏假单胞菌的ptxD编码序列至少80％、90％或95％(或完全)相同。启动子可以是在植物、真菌、或二者中起作用的，并且可以可操作地连接于编码区。启动子可以是相对于编码区异源的。嵌合基因可以能够促进该酶在包含该核酸的植物细胞或真菌细胞中充分表达，以对所述细胞赋予代谢亚磷酸盐(Phi)作为磷源用于支持生长的能力，从而使得所述细胞在没有外部来源的磷酸盐(Pi)时能够生长。启动子可以是(或可以不是)植物启动子或植物病毒的病毒启动子，并且可以能够促进酶在植物细胞中的充分表达。例如，启动子，诸如从拟南芥PLDZ2基因获得的启动子是被低磷酸盐可用性可诱导的。可选地或此外，启动子可以是根特异性启动子。在其它情况中，启动子可以是组成型的，并且可对应于花椰菜花叶病毒的35S启动子。在一些实施方案中，核酸可包括在植物细胞和/或真菌细胞中是起作用的并可操作地连接于启动子和编码区的转录终止子。在一些实施方案中，启动子可以是能够促进酶在真菌细胞中充分表达的真菌启动子。
核酸可提供将至少一种还原形式的磷代谢为磷酸盐的一种或多种多肽的表达，使得转基因植物(或真菌)能够使用还原形式的磷作为营养。一种或多种多肽的表达可以是可遗传的。例如，该核酸可整合到植物(或真菌)基因组中。此外，除了其它以外，至少一种多肽的表达可处于组成型启动子或诱导型启动子控制下(如，可被低磷酸盐诱导，诸如通过使用来自拟南芥PLDZ2基因或植物高亲和力磷酸盐转运蛋白的AtPT1基因的启动子)，处于组织特异性启动子(如，叶特异性或根特异性)控制下、或其组合。
提供了从嵌合基因表达亚磷酸盐脱氢酶的植物细胞或真菌细胞。在多细胞结构(如，植物或菌丝体)中，该细胞可与其它细胞隔离，或可与其它细胞结合(associate)。细胞还可能(或可能不)从嵌合基因表达次磷酸盐脱氢酶。因此，细胞可代谢亚磷酸盐、次磷酸盐、或二者作为磷源用于支持生长。在一些实施方案中，细胞可以是植物细胞，并且亚磷酸盐脱氢酶、次磷酸盐脱氢酶(如果存在)、或二者的表达可被根特异性启动子控制。植物细胞可来自任何适合的物种。例如，植物细胞可以是真核藻类细胞，诸如衣藻属细胞。在其它情况中，植物细胞可以来自维管植物的物种。在一些实施方案中，细胞可以是属于木霉属(Trichoderma)物种或属于能够与植物形成共生关系的真菌的菌根物种的真菌细胞。
提供了从一种或多种嵌合基因表达亚磷酸盐脱氢酶和任选的次磷酸盐脱氢酶的转基因植物(或植物部分)。植物可以经由酶的表达来代谢亚磷酸盐和/或次磷酸盐作为磷源用于支持生长。植物可以是维管植物，诸如农作物，例如，选自玉米、大豆、水稻、马铃薯、番茄、甘蔗和小麦组成的组的农作物物种。还提供了萌发以产生转基因植物的种子。
提供了减少植物真菌感染的方法。多个真菌细胞可施加到植物的种子形式、植物本身、已布置(dispose)或将布置植物的土壤、或其组合。真菌细胞可从嵌合基因表达亚磷酸盐脱氢酶，并且可属于木霉属物种。
提供了与多个真菌细胞结合以形成菌根的植物。这些真菌细胞可从嵌合基因表达亚磷酸盐脱氢酶。通过将亚磷酸盐氧化为磷酸盐，这些真菌细胞可使得植物能够在作为磷源的亚磷酸盐(和/或次磷酸盐)上生长。
提供了利用次磷酸盐和/或亚磷酸盐作为磷源用于支持生长对农作物施肥的方法。农作物可表达亚磷酸盐脱氢酶、次磷酸盐脱氢酶、或二者。可选地或此外，农作物可与表达亚磷酸盐脱氢酶、次磷酸盐脱氢酶、或二者的多个真菌细胞形成菌根。可向植物和/或植物附近的土壤施加至少一种还原形式的磷诸如亚磷酸盐和/或次磷酸盐，以使该还原形式被植物和/或菌根代谢为磷酸盐以支持植物的生长和生产力。
提供了处理废液(如，污水)以降低其还原磷的含量的方法。接触是在(i)包含次磷酸盐和/或亚磷酸盐作为污染物的水与(ii)表达亚磷酸盐脱氢酶、次磷酸盐脱氢酶、或二者的多个植物细胞和/或真菌细胞之间进行，从而至少一部分的次磷酸盐和/或亚磷酸盐被氧化为亚磷酸盐和/或磷酸盐。在一些情况中，接触可在水与表达所述酶中的一种或两种的多个维管植物之间进行。该方法可提供由于工业生产而被污染的河流、水库、土壤、收集槽等等的生物除污系统。例如，亚磷酸盐是工业场所附近的河流和湖泊中的常见污染剂，诸如使用次磷酸盐来减少化学电镀工艺中的金属离子的光盘(如，DVD和CD)制造厂。因此，通过获取次磷酸盐和/或亚磷酸盐并将其转化为磷酸盐，本文公开的转基因植物和/或真菌可帮助从受污染的水去除次磷酸盐和/或亚磷酸盐。使用植物和/或真菌可比利用基于细菌的系统更有效。
提供了利用亚磷酸盐脱氢酶的编码序列作为选择性标记来产生转基因植物的方法。该方法可用于获得以编码亚磷酸盐脱氢酶的核酸转化的植物，所述亚磷酸盐脱氢酶可从作为选择性标记的核酸表达。植物细胞与包括该核酸的组合物可在促进所述核酸被引入植物细胞的条件下接触。植物细胞可在包含亚磷酸盐作为用于植物细胞生长的主要或唯一磷源的培养基中培养。可对通过接触步骤和培养步骤产生并且由在所述培养基中生长而证明表达亚磷酸盐脱氢酶的转化的植物细胞进行选择。可将至少一部分的转化的植物细胞再生为转基因植物。
本文公开的转基因植物可提供实质的益处。例如，在一些情况中，这些植物可利用NAD+作为电子受体来代谢亚磷酸盐以产生NADH和磷酸盐，这二者都是对植物有用的分子。转基因植物还可以或可选地可以提供基于亚磷酸盐的新农业系统的开发。亚磷酸盐在土壤中可能比磷酸盐反应性低，因此可能产生更少的植物不能利用的不溶化合物。而且，因为大多数土壤微生物不能代谢亚磷酸盐，较少的亚磷酸盐(相对于磷酸盐)被转化为植物不能利用的有机形式。此外，相对于磷酸盐，亚磷酸盐可对植物周围的细菌生态系统具有更小的影响。杂草竞争也可以大大地减少，因为杂草应该不能利用亚磷酸盐。因此，使用亚磷酸盐将减少肥料成本并减少肥料对环境的负面影响。
本文公开的转基因植物还可提供作为杀真菌剂同时作为肥料的亚磷酸盐对转基因植物的增加的效力。当用作非转基因植物的杀真菌剂时，亚磷酸盐通常需要非常小心地使用以避免植物毒性。然而，在本文公开的转基因植物中，亚磷酸盐可被植物代谢变得无毒。
本文公开的系统可提供用于产生转基因植物的实质优点。该系统的选择性标记可在植物中至少大幅普遍地起作用。此外，选择剂(如，次磷酸盐或亚磷酸盐)对转基因植物可以是无毒的，因为反应产物可以是无害的(如，NADH和磷酸盐)，并且还可以比其它选择方案廉价。
本公开的另外的方面在以下部分提供：(I)定义、(II)转基因植物和真菌的产生、(III)转基因植物和真菌的使用、和(IV)实施例。
I.定义
在本公开中使用的各种术语通常各自具有本领域技术人员公认的含义，与使用各术语的上下文一致。然而，如下所述，以下术语可具有另外和/或替代的含义。
植物-真核生物体的植物界成员，除了其它以外，可描述为树、灌木、草、矮树、草本、藤本、蕨类、藓类、真核藻类、或其组合。植物通常具备纤维素细胞壁并且能够进行光合作用。植物可以是维管植物。在一些实施方案中，植物可以是一年生或多年生的。植物可以是开花植物，诸如单子叶植物或双子叶植物。在一些实施方案中，除了其它以外，植物可产生谷粒、块茎、果实、蔬菜、果仁、种子、纤维、或其组合。此外，植物可以是可在田地里栽培的农作物。可适于根据本公开产生转基因植物的示例农作物包括烟草(如，N.tabacum)、马铃薯、玉米、水稻、小麦、苜蓿、大豆、番茄、甘蔗等等。
植物部分-少于完整植物并且包括至少一个植物细胞的植物任何部分。因此，植物部分可以是植物组织，除了其它以外，诸如叶组织、根组织、茎组织、芽组织、愈伤组织、花组织、或其任意组合。植物部分可以是分离的植物细胞或植物细胞的集落或组。除了其它以外，植物细胞可以是原生质体或可包括细胞壁。
转基因-包含核酸构建体。在生物体细胞的任何亚组或至少基本上所有的生物体细胞中，构建体可整合到生物体(和/或细胞)的基因组(如，核基因组或质体基因组)中。例如，构建体可存在于植物的种系中。因此，构建体可以是可遗传的，即，被生物体随后的代或细胞子代的至少一个或多个成员或至少基本上所有的成员遗传。被构建体“转化”的植物或真菌(或植物或真菌部分(如，细胞))已被修饰以便在该植物或真菌(或植物或真菌部分)的当前一代或任何前一代或前几代中包含构建体。转基因植物可由萌发形成转基因植物的种子提供。而且，转基因植物可产生一个或多个种子，这些种子萌发产生转基因后代植物。
核酸-包含核苷酸链的化合物。该链可主要由任何适合数目的核苷酸构成，除了其它以外，诸如至少约10、100或1000个。核酸可称为多核苷酸，并且例如，可以是单链、双链、或其组合。
基因-提供可表达单元以表达多肽和/或功能性RNA(除了其它以外，如，信使RNA、干扰RNA或酶RNA)的核酸或其区段。因此，基因可包括(a)界定多肽和/或功能性RNA的序列的编码区(还称为编码序列，可以是连续或间断的(诸如被一个或多个内含子间断))、(b)至少一个转录启动子(还称为启动子序列)、和(c)任选地，至少一个转录终止子(还称为终止序列)，转录启动子和转录终止子被可操作地连接于编码区。基因任选地可包括一个或多个其它控制区和/或非翻译区，除了其它以外，诸如至少一个5’非翻译区、3’非翻译区、内含子、或其任意组合。
启动子-控制(即，促进、调节和/或驱动)基因的转录以产生初级转录物和/或信使RNA的核酸区域。启动子可例如通过至少部分地决定基因被RNA聚合酶转录起始的速率来起作用。启动子还可以或可选地可以决定转录起始后转录伸长的速率。启动子可以是在植物和/或真菌中起作用的，因此可以是植物启动子和/或真菌启动子。
嵌合基因-具有对彼此异源的序列元件诸如转录启动子和编码区的基因。术语“异源”是指序列元件(如，启动子和编码区)来源于和/或衍生自各自不同的来源，诸如不同物种的生物体。嵌合基因还可包含转录终止子，该转录终止子可来源于与编码区不同的来源，来自与启动子相同的来源或不同的来源。嵌合基因中可使用的示例终止子包括花椰菜花叶病毒的35S终止子、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶终止子、或类似物。
构建体-至少部分地利用遗传工程的技术创建的核酸。因此，构建体可称为核酸构建体。
表达-从由核酸和/或基因提供的通常处于DNA形式的信息形成产物即RNA和/或多肽的过程。因此，核酸/基因可被表达以形成RNA和/或多肽，这表示RNA和/或多肽从核酸/基因表达。
还原形式的磷-其中磷具有小于+5的氧化态诸如+3或+1的任何含磷化合物和/或离子。因此，除了其它以外，还原形式的磷可例如包括亚磷酸盐和次磷酸盐。还原形式的磷可缩写为“RP”。
磷酸盐-磷酸(H3PO4)、其二元形式(H2PO4 1-)、其一元形式(HPO4 2-)、其三价离子形式(PO4 3-)、或其任意组合。磷酸盐可以任何适合的磷酸盐化合物或磷酸盐化合物的组合而提供。除了其它以外，磷酸盐的示例形式包括钠、钾、锂、铷、铯、铵、钙或镁的磷酸盐、或其任意组合。在磷酸盐中，四个氧原子与磷原子直接成键。磷酸盐还可以或可选地可以称为“正磷酸盐”和/或“无机磷酸盐”，并且可缩写为“Pi”。磷酸盐不同于“有机磷酸盐”，有机磷酸盐是磷酸盐的有机形式，其中一个或多个磷酸盐的氧与有机部分成键，通常形成磷酸酯。
亚磷酸盐-亚磷酸(H3PO3)、其共轭碱/单价离子形式(H2PO3 1-)、或其二价离子形式(HPO3 2-)、或其任意组合。在亚磷酸盐中，三个氧和一个氢与磷原子直接成键。亚磷酸盐可以任何适合的亚磷酸盐化合物或亚磷酸盐化合物的组合而提供。除了其它以外，亚磷酸盐的示例形式包括钠、钾、锂、铷、铯、铵、钙或镁的亚磷酸盐、或其任意组合。亚磷酸盐可氧化为磷酸盐。亚磷酸盐还可以或可选地可以称为“无机亚磷酸盐”，并且可缩写为“Phi”。亚磷酸盐不同于“有机亚磷酸盐”，有机亚磷酸盐是亚磷酸盐的有机形式，其中一个或多个亚磷酸盐的氧与有机部分成键，通常形成亚磷酸酯。
次磷酸盐-次磷酸(H3PO2)和/或其共轭碱(H2PO2 -)，次磷酸盐可以任何适合的次磷酸盐化合物或次磷酸盐化合物的组合而提供。在次磷酸盐中，两个氧和两个氢与磷原子直接成键。除了其它以外，次磷酸盐的示例形式包括钠、钾、锂、铷、铯、铵的次磷酸盐、或其组合。次磷酸盐可氧化为亚磷酸盐和/或磷酸盐。次磷酸盐还可以或可选地可以称为“无机次磷酸盐”，并且可缩写为“Hphi”。
营养-被代谢以促进生长和生殖、和/或是存活所需的任何物质。
肥料-包括用于植物(和/或与植物结合的真菌)的一种或多种营养的任何组合物。
外部来源-在植物之外并且通常可通过接触植物而为植物获取的供应。除了其它以外，可适于本文所述的转基因植物的示例外部来源可包括外部来源的磷、外部来源的磷酸盐、或外部来源的还原磷。
选择性标记-如下的构建体或其区段和/或基因：当通过与适合的培养基接触来检验植物或植物部分(和/或真菌和/或真菌细胞)的生长时，所述构建体或其区段和/或基因对包含所述构建体/基因的植物或植物部分(和/或真菌和/或真菌细胞)赋予生长优势。
污水-携带废料和/或与废料混合的水。污水可以是流动的或可以不是流动的。示例污水可以是，例如，可与较大水体诸如溪流、河流、池塘、湖泊、沼泽、湿地、或类似水体混合的工业垃圾和/或废水。
修复-将水(如，废水和/或污水)改良为更期望的组成的任何过程，诸如使得水毒性更小、更加环境友好、更符合政府标准等等。
对还原形式的磷进行氧化的酶-催化或促进还原形式的磷(如，氧化态为+1或+3)氧化到更高氧化态(如，+1到+3、+1到+5、和/或+3到+5)的酶。例如，除了其它以外，酶可将次磷酸盐氧化为亚磷酸盐，亚磷酸盐氧化为磷酸盐，和/或次磷酸盐氧化为磷酸盐。为了方便，酶可称为“氧化酶”，因为其催化/促进氧化反应，或可称为“磷氧化还原酶”或“还原磷代谢酶”，为了本文的方便，可缩写为“RP-OxRe”。对还原形式的磷进行氧化的示例酶可包括亚磷酸盐脱氢酶(例如，可称为NAD：亚磷酸盐氧化还原酶、膦酸盐脱氢酶、NAD-依赖性亚磷酸盐脱氢酶、或类似物)、次磷酸盐脱氢酶(如，次磷酸盐：2-氧代戊二酸盐氧化还原酶)、或类似物。酶可利用细胞中和/或细胞附近存在的任何适当的辅因子、辅酶、和/或底物来氧化还原形式的磷。此外，酶可来源于和/或衍生自细菌、真菌、植物或动物。
亚磷酸盐脱氢酶-催化亚磷酸盐氧化为磷酸盐的酶。该酶通常催化氧化的效力足以使得植物细胞和/或真菌细胞能够在作为磷源支持生长的亚磷酸盐的存在下生长。该酶可为细菌来源的。该酶可以是PtxD多肽(即，PtxD或PtxD-样)，是能够催化亚磷酸盐氧化为磷酸盐的任何多肽，是(a)与施氏假单胞菌WM 88的PtxD(SEQ ID NO：1；GenBank：AAC71709.1)至少90％、95％、或完全相同，(b)SEQ ID NO：1的PtxD的衍生物，(c)来自相同或不同细菌物种的PtxD(SEQ ID NO：1)的同源物(即，旁系同源物或直系同源物)，或(d)(c)的衍生物。PtxD(SEQ ID NO：1)的同源物可与施氏假单胞菌的PtxD具有大致的相似性，该相似性可例如由blastp算法(如，程序BLASTP 2.2.18+)确定，如以下两个参考文献描述的，其通过引用并入本文：Stephen F.Altschul等(1997)，“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a newgeneration of protein database search programs(带缺口的BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白数据库搜索程序)，”Constructs Res.25：3389-3402；和Stephen F.Altschul等(2005)“Protein database searches using compositionally adjusted substitutionmatrices(利用组成调整的取代矩阵进行蛋白数据库搜索)，”FEBS J.272：5101-5109。利用blastp算法、以最佳比对并且如果需要则引入缺口，除了其它以外，大致的相似性的实例包括至少50％、60％、70％、或80％的序列同一性，至少200或250的相似性分数，和/或小于1e-40、1e-60或1e-80的E-值。
除了其它以外，施氏假单胞菌PtxD的示例同源物可由以下提供：抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)SK82(SEQ ID NO：2；GenBank EET83888.1)；粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)(SEQ ID NO：3；GenBank AAT12779.1)；蓝杆藻(Cyanothece sp.)CCY0110(SEQ ID NO：4；GenBank EAZ89932.1)；铁锈色披毛菌(Gallionella ferruginea)(SEQ ID NO：5；GenBank EES62080.1)；马赛紫色杆菌(Janthinobacterium sp.Marseille)(SEQ ID NO：6；GenBank ABR91484.1)；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(SEQ IDNO.7；Genbank ABR80271.1)；栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)(SEQ ID NO：8；GenBank EDM49754.1)；甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)(SEQ ID NO：9；NCBIYP_003066079.1)；念珠蓝细菌(Nostoc sp.)PCC 7120(SEQ ID NO：10；GenBankBAB77417.1)；产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)(SEQ ID NO.11；NCBI ZP_04579760.1)；斯维链霉菌(Streptomyces sviceus)(SEQ ID NO：12；GenBankEDY59675.1)；硫碱弧菌(Thioalkalivibrio sp.)HL-EbGR7(SEQ ID NO：13；GenBankACL72000.1)；和黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus)(SEQ ID NO：14；GenBankABG73582.1)。PtxD同源物的另外的方面描述于Metcalf等的美国专利申请公布号2004/0091985(“‘985出版物”)，其通过引用并入本文。亚磷酸盐脱氢酶可具有与SEQ ID NO：1-14的一种或多种有至少50％、60％、80％、90％或95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
可能适合的施氏假单胞菌PtxD的示例衍生物描述于‘985出版物和Zhao等的美国专利号7,402,419，其通过引用并入本文。衍生物可提供，例如，改变的辅因子亲和性/特异性和/或改变的热稳定性。
亚磷酸盐脱氢酶可包含与以下共有基序的任一种或任意组合具有序列相似性或同一性的序列区：NAD-结合基序，具有共有序列VGILGMGAIG(SEQ ID NO：15)；D-异构体特异性2-醇酸家族的保守特征序列，具有共有序列XPGALLVNPCRGSVVD(SEQ ID NO：16)，其中X是K或R，或具有SEQ ID NO：16中更短的共有序列RGSVVD(SEQ ID NO：17)；和/或可使得氢化酶能够利用亚磷酸盐作为底物的基序，一般的共有序列为GWQPQFYGTGL(SEQ ID NO：18)，但可更好地定义为GWX1PX2X3YX4X5GL(SEQ ID NO.19)，其中X1是R、Q、T或K，X2是A、V、Q、R、K、H或E，X3是L或F，X4是G、F或S，且X5是T、R、M、L、A或S。通过比较PtxD与PtxD同源物而发现的共有序列的另外的方面描述于Metcalf等的美国专利申请公布号2004/0091985，其通过引用并入本文。
亚磷酸盐脱氢酶可以是(或可以不是)对作为底物的亚磷酸盐具有高特异性(如，Km～50μM)和/或具有约36千道尔顿的分子量的NAD-依赖性酶。脱氢酶可以但不要求作为同二聚体起作用和/或在35℃和/或约7.25-7.75的pH具有最优活性。
次磷酸盐脱氢酶-催化次磷酸盐氧化为亚磷酸盐的酶。该酶可以是例如，细菌酶，诸如来自施氏假单胞菌WM 88的HtxA(SEQ ID NO：20；GenBankAAC71711.1)或粪产碱菌的HtxA(GenBankAAT12775.1)。
HtxA多肽可以是但不要求是对作为底物的次磷酸盐具有高特异性(如，Km～0.54-0.62mM)和/或具有约32千道尔顿的分子量的Fe-依赖性酶。HtxA多肽可以但不要求作为同二聚体起作用和/或在27℃和/或约7.0的pH具有最优活性。
ptxD或htxA编码区-分别编码PtxD多肽(即，亚磷酸盐脱氢酶)或HtxA多肽(即，次磷酸盐脱氢酶)的序列。示例ptxD编码区由施氏假单胞菌的ptxD提供(SEQ ID NO：21；GenBankAF061070.1)。在其它实例中，可利用与SEQ ID NO：21具有至少80％或90％序列同一性的ptxD-样编码区。在其它实例中，可利用编码与SEQ ID NO：1-14的一种或多种多肽具有至少50％、60％、80％、90％、95％或完全的同一性的多肽的编码区。
II.转基因植物和真菌的产生
本公开提供制备具有改良的磷代谢的转基因植物和转基因真菌的方法。作为主要目的，该方法可用于产生携带编码磷氧化酶的核酸构建体的转基因植物和/或真菌(或至少一个植物或真菌细胞)，诸如为了在农业中在亚磷酸盐和/或次磷酸盐肥料上更好地生长。可选地或此外，作为主要目的，该方法可用于产生携带包括另一目标基因的构建体的转基因植物和/或真菌，该构建体还包括编码磷氧化酶的基因，该磷氧化酶充当便于鉴定和/或分离转基因植物或真菌的选择性标记。在这一部分和本公开别处公开的方法步骤可以任何适当的组合、以任何适当的顺序进行，并且可重复任何适当的次数。
图1显示如下的示例方法20的示意流程图：(i)制备将至少一种还原形式的磷(“RP”)代谢为磷酸盐的转基因植物(和/或真菌)和/或(ii)利用赋予将还原形式的磷代谢为磷酸盐的能力的核酸作为选择性标记。
可获得至少一种构建体(或核酸)，如22所示。至少一种构建体23可包括至少一种第一基因24，其可以是对催化还原形式的磷的氧化诸如亚磷酸盐氧化为磷酸盐的至少一种酶(“RP-OxRe”)诸如亚磷酸盐脱氢酶进行编码的至少一种嵌合基因。构建体23还可包括至少一种第二基因26(“基因2”)，其也可以(或可以不)是嵌合基因。在一些实施方案中，该至少一种第一基因可以是编码各自催化至少一种还原形式的磷的氧化的至少两种不同多肽的一对基因。该至少两种多肽可起作用按顺序氧化磷底物(如，第一多肽催化次磷酸盐氧化为亚磷酸盐，然后第二多肽催化亚磷酸盐氧化为磷酸盐)。在一些实例中，除了其它以外，该至少一种第二基因可包括用于植物和/或真菌的选择性标记，和/或可包括主要目标基因。第一基因24和第二基因26可以被连接，诸如存在于同一多核苷酸中，或可存在于各自分离的多核苷酸上。每种基因可至少部分地在植物之外构建，诸如在体外和/或在微生物(如，细菌、酵母等等)中。此外，每种基因可能在包含该基因的植物、真菌、或二者中表达。
该至少一种基因(24和/或26)可被引入至少一种接受植物28(或真菌)、植物或真菌组织、和/或植物或真菌细胞中，以30表示。在引入该至少一种基因之前，该至少一种植物、组织或细胞可能至少大致上需要磷酸盐作为用于生长的外部磷源。换言之，该植物、组织或细胞可能至少大致上不能直接代谢还原形式的磷(诸如亚磷酸盐)作为营养。
该至少一种基因的引入可以在鼓励该核酸被引入植物、组织和/或细胞的条件下，通过使(a)该至少一种植物/真菌、组织和/或细胞与(b)包括含该至少一种基因的核酸的组合物(改性剂(modifying agent))接触而进行。接触步骤可通过在该至少一种植物/真菌、组织和/或细胞与该组合物之间产生接触的任何机制进行。例如，该组合物可包括含该至少一种基因的一种或多种多核苷酸，该多核苷酸在载体中和/或在载体上。可能适合的示例载体包括生物细胞(如，细菌细胞)、植物病毒、惰性颗粒、脂质(在胶束和/或脂质体中)、和/或类似物。以包括该基因的组合物产生的示例接触可包括使植物、植物组织或植物细胞与携带该至少一种基因的细菌(如，农杆菌物种，诸如根癌农杆菌或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes))接触，或与携带该至少一种基因的一种或多种发射体(如，用包括该至少一种基因的多核苷酸包被并且从基因枪向植物、组织或细胞发射的颗粒)接触。更通常地，引入该至少一种基因可通过感染、注射、颗粒轰击、电穿孔、细胞融合、脂质转染、磷酸钙介导的转染、其任何组合等对植物/真菌、植物组织或真菌组织、和/或植物细胞或真菌细胞进行。
如36所示，通过在植物、组织和/或细胞与组合物之间产生接触和/或在此之后，可产生转基因候选物34(还称为转化候选物)。转基因候选物可以是用于接触的植物/真菌、组织和/或细胞，或可衍生自植物/真菌、组织和/或细胞的任何后面的代(即，后代或分裂产物)。在任何情况中，转基因候选物可以是种子、植物、组织、外植体、分离的细胞、细胞集落/聚集体、和/或类似物。
可对转基因候选物34在选择性培养基37中的生长(即，生长优势)进行选择，如38所示。具备在选择性培养基上的生长优势的候选物34，诸如转基因植物40，通常比其它候选物大得多。在其它实例中，选择可以用转化的植物(或真菌)细胞进行，并且可包括在选择性培养基中培养该植物(或真菌)细胞。在这些情形中，培养细胞可允许选择和/或分离由培养步骤形成的一个或多个细胞集落。集落可以表达对还原形式的磷进行氧化的酶诸如亚磷酸盐脱氢酶，如通过在培养基中形成集落而证明的。
可根据由引入的至少一种第一基因和/或选择性标记(第二)基因提供的选择性标记而利用任何适当的选择性培养基37。例如，选择性培养基可包括还原形式的磷，诸如次磷酸盐和/或亚磷酸盐。还原形式的磷可以是主要的外部磷源，和/或可以是培养基中存在的至少基本上仅有的磷，这表示培养基至少基本上没有磷酸盐(即，低磷酸盐或无磷酸盐培养基)。可选地或此外，如果对生长的选择是基于引入植物/真菌、组织、和/或细胞中的第二基因26(如，hph或bar)，那么选择性培养基可包括另一选择剂诸如潮霉素或草丁膦。如果选择是基于第二基因26，可进行另外的测试(如，在含亚磷酸盐的培养基中生长、PCR、DNA印迹等等)以检验编码至少一种RP-氧化还原酶的至少一种第一基因的引入。在任何情况中，培养基可包括或主要是液体，并且可(或可不)包括基质或底质，除了其它以外，诸如凝胶(如，琼脂、琼脂糖、明胶、等等)或土壤。
对生长的选择可在任何适当的器皿42(和/或容器)中进行，或可没有器皿或容器而进行，诸如在田地中。可能适合的示例器皿是带盖或不带盖的，并且包括单孔或多孔的板或皿(如，皮氏培养皿)、盆、盘、盒、等等。
可分离转基因植物40，如44所示。相对于转基因植物40所来自的植物非转基因品种(如，植物28)，植物40可具有由核酸23赋予的靠还原形式的磷生长的生长优势。换句话说核酸23可赋予将还原形式的磷代谢为营养的能力。在一些实施方案中，转基因植物40可从转化的植物细胞或组织再生。例如，在选择性(如，亚磷酸盐)培养基中培养植物细胞而产生的细胞集落的至少一部分可用于再生转基因植物。产生转基因植物和真菌的进一步方面在本公开别处描述，诸如在IV部分的实施例中。
图2显示用在方法20(图1)中的核酸23的示意图。基因24可称为RP-OxRe基因46，如48所示，其表达还原磷氧化还原酶50(如，亚磷酸盐脱氢酶)。基因24包括编码该氧化还原酶的编码区52。基因24还可包括可操作地连接于编码区52的转录启动子54、和可操作地连接于编码区52的转录终止子56。
启动子54和终止子56可以是在植物和/或真菌中起作用的。因此，除了其它以外，启动子和/或终止子可来源于植物或真菌、或感染植物或真菌的病毒或细菌。可适于植物中使用的示例启动子包括花椰菜花叶病毒的35S启动子。可适于植物中使用的其它启动子包括来自拟南芥磷脂酶DZ2(PLDZ2)基因(基因模型AT3G05630.1；TAiR登录基因：2078036)的PLDZ2启动子，其在植物低磷酸盐可用性条件下是可诱导的(Cruz-Ramírez等，PNAS 2006，103：6765-6770，其公开内容通过引用并入本文)。可选地或此外，启动子可以是根特异性启动子，诸如拟南芥Pht1；2磷酸盐转运蛋白基因(NCBI NM_123703.1；基因ID：834355)、或蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)MtPT1基因或MtPT2基因(GenBank：AF000354.1和AF000355.1)的启动子(Xiao等，Plant Biology，2006，8：439-449，其公开内容通过引用并入本文)。
此外，第一基因24可包括转录但不翻译的区域，诸如5’前导序列和/或5’非翻译区58、3’非翻译区60、和/或一个或多个内含子62。第一基因24可由核酸23提供，核酸23包括任何其它适当的序列，除了其它以外，诸如至少一个第二基因26、用于在细菌或另一非植物物种中复制的复制控制序列、用于另一物种(如，细菌)的选择性标记、或其任意组合。在一些实施方案中，核酸23可以是以下的任意组合：线性或环状(即，闭合环)的、至少大部分双链或至少大部分单链的、以及DNA或RNA。
图3显示在细菌中由从ptxD基因和htxA基因表达的酶催化次磷酸盐氧化为磷酸盐的建议机制70。此处展示的建议机制仅是为了阐述的目的，并且不意为限制显示的任何组分诸如ptxD基因或htxA基因或PtxD多肽或HtxA多肽的定义，或限制本发明的范围。
机制70显示，次磷酸盐离子72可被htxA基因编码的HtxA多肽76(次磷酸盐：2-氧化戊二酸盐双加氧酶)的作用氧化为亚磷酸盐离子74。HtxA多肽76可使用Fe2+78作为辅因子，且使用2-氧化戊二酸盐80作为电子供体。此外，酶76可将2-氧化戊二酸盐80转化为丁二酸盐82，并且将分子氧84转化为二氧化碳86。
亚磷酸盐离子74进而可被PtxD多肽90的作用氧化为磷酸盐离子88。多肽90可使用NAD+92作为被还原为NADH 94的电子受体。
III.转基因植物和真菌的使用
本文公开的转基因植物可用于任何适当的目的。示例目的包括产生商业产品(如，食品、木材、药物、染料、油、润滑剂、墨水、橡胶、棉、纤维、生物燃料等等)和/或水体修复。本文所用的水体修复通常包括从水体和/或从已接触污染水的土壤对污染或至少一种污染物的任何去除。
提供了水体修复的方法。本文公开的任何转基因植物、真菌、或二者可用于此方法。在这一部分和本公开别处公开的方法步骤可以按任何适当顺序、以任何适当组合进行，每个步骤可进行任何适当的次数。
可获得一种或多种转基因植物。转基因植物可以在当前代或在任何随后的代被赋予氧化至少一种还原形式的磷的能力的构建体转化。
获得一种或多种转基因植物可包括任何适当的方案。例如，获得步骤可包括向当前代转基因植物，或更通常地，向更早代的转基因植物中引入编码将还原形式的磷氧化为磷酸盐的一种或多种多肽的一种或多种构建体。
一种或多种转基因植物可接触待修复的水。植物与水接触可包括以下的任何组合：将水带到植物，将植物带到水，并且萌发与水接触的植物的种子。相对于植物，水可以是大致上静止的或可以是流动的。在一些实施方案中，接触步骤可包括植物与工业和/或城市污水接触。
IV.实施例
以下实施例描述本公开的精选方面和实施方案，诸如制备代谢亚磷酸盐作为磷源的转基因植物(包括藻类)和转基因真菌的示例方法、示例转基因植物和转基因真菌、和利用编码亚磷酸盐脱氢酶的基因作为选择性标记来选择转基因植物和转基因真菌的示例方法。实施例仅为了阐述的目的展示，并且不意为限定或限制本公开的范围。
实施例1.表达细菌亚磷酸盐脱氢酶的转基因植物的示例产生
本实施例描述了产生具有改良的磷代谢的转基因植物的示例方法；参见图4-6。
图4显示为了用于产生将亚磷酸盐代谢为磷酸盐的转基因植物以允许在磷酸盐不存在时依靠亚磷酸盐生长而构建的示例核酸，即嵌合基因100。如以下各段所述，利用系统( Technology，2003，Invitrogen)构建该基因。
基因100包括可操作地连接于来自施氏假单胞菌WM88的ptxD的编码序列104(SEQID NO：21)的来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子序列102。如106所示，从而产生PtxD多肽(亚磷酸盐脱氢酶)的基因100的表达被35S启动子102控制/驱动。基因100任选地可包括布置在编码序列(和启动子序列)的下游并可操作地连接于编码序列(和启动子序列)的终止序列107，诸如来自CaMV的35S终止子。该基因可进一步包括布置在启动子序列与ptxD编码序列之间的5’非翻译序列、和/或布置在ptxD编码序列与终止序列之间的3’非翻译序列。此外，基因可包括与ptxD编码序列一起转录并且通过转录后剪接从转录物去除的内含子。
图5显示用于产生图4的基因100的策略的一部分的示意图。合成正向引物108(SEQID NO：22)和反向引物110(SEQ ID NO：23)。每种引物具有杂交区112、114，所述杂交区以正向或反向与在图的下部标为116、118的ptxD编码区104的末端杂交。每种引物具有位于杂交区112或114的5’的attB位点120、122(attB1或attB2)。这些引物用于利用聚合酶链式反应从质粒(pWM302)扩增编码序列104，以产生ptxD扩增产物。产生预计大小为约1000个碱基对的构建体，如通过对扩增产物的凝胶电泳和染色检测的。可选地可将引物设计为从ptxD编码序列的上游和/或下游扩增其它的非翻译序列。
接下来利用由系统提供的位点特异性重组将ptxD扩增产物掺入质粒载体中。经由pDONR 221的attP1位点和attP2位点以及该扩增产物的attB1位点和attB2位点将该扩增产物与质粒pDONR221重组，以产生pDONR221的ptxD衍生物，即“初始克隆”pDONR221。该初始克隆具有两侧为相对的attL1位点和attL2位点的全长ptxD编码序列。
然后通过进一步的位点特异性重组将该初始克隆的ptxD序列移入接受载体中以产生表达构建体pB7WG2D-ptxD。该接受载体是pB7WG2D.1，其按照围绕载体的顺序包括：(1)35S启动子、(2)设置在35S启动子的下游的attR1位点和attR2位点、(3)35S终止子、(4)“bar”基因(赋予草丁膦抗性)作为植物中的选择性标记、(5)基因SmSpR作为细菌，尤其是农杆菌(赋予大观霉素(Sp)和链霉素(Sm)抗性)中的选择性标记、和(6)EgfpER基因。系统指导的重组形成包括基因100(参见图4)、bar、SmSpR和EgfpER的表达克隆(pB7WG2D-ptxD)。
该表达构建体用于通过电穿孔转化电感受态的根癌农杆菌。选择携带该表达构建体的转化的农杆菌克隆用于继代培养。
利用修改的蘸花(floral dip)方法，将转化的农杆菌克隆用于转化拟南芥(生态型Col-0)(通常在本文称为“野生型”(WT))。利用草丁膦抗性选择转化的T0后代。具体地，用含草丁膦(20mg/L)的MS 0.1×培养基进行筛选。通过PCR扩增ptxD基因而鉴定28株抗性株系。利用含草丁膦(20mg/L)的MS 0.1×培养基分析每株抗性株系的T1后代，以寻找T1后代的3∶1(抗性∶敏感)分离，以鉴定显示ptxD基因的孟德尔遗传的植物。从展现3∶1遗传的T1后代的T2后代建立10株纯合的ptxD转基因植物。
检验了ptxD转基因植物在仅含亚磷酸盐(如，约0.1至5mM)作为外部磷源的培养基中生长的能力。对照植物在这种培养基中显示无实质生长(即，显示的生长限于种子中积累的内部磷储备)，而转基因植物有效地生长，从而证明转基因植物能够代谢还原形式的磷(亚磷酸盐)作为磷源。
还使用ptxD表达构建体提供用于选择具有改良的磷代谢的转基因植物的选择性标记。利用包含ptxD表达构建体的农杆菌转化野生型Col-0植物。将T0后代(种子)种植在以亚磷酸盐(5mM)作为磷源的培养基上。图6显示T0后代相对于野生型植物在亚磷酸盐培养基上生长的示例数据。相对于野生型植物132(左图)和相对于明显未以表达构建体转化和/或没有从引入的构建体有效表达PtxD多肽的其它T0后代134，转基因植物130(右图圆圈中)具有实质的生长优势。
产生具有改良的磷代谢的转基因植物的进一步方面描述在2008年11月19日提交的美国临时专利申请系列号61/199,784中，其通过引用并入本文。
实施例2.表达PtxD的拟南芥植物的表征
本实施例展示对亲代(“野生型”(WT)或对照)拟南芥株系Col-0和实施例1描述的包含实施例1的ptxD表达构建体的两种转基因拟南芥株系的生长特征的研究；参见图7-12。
称为PTXD-3和PTXD-5的两种转基因拟南芥株系按实施例1所述来制备和分离。每种株系对于实施例1的ptxD表达构建体是纯合的。
检验亲代株系和PTXD-3与PTXD-5转基因株系在有或没有无机磷酸盐(Pi)作为磷源的液体培养基上生长的能力。使来自亲代株系和转基因株系的种子在液体培养基中萌发并检验其生长。在磷酸盐(和亚磷酸盐)不存在时，亲代株系和转基因株系都不显示超出萌发的显著生长。(每种株系在短时间展现可忽略不计的生长，这显然是种子中的磷酸盐储备允许的，种子中的磷酸盐储备迅速地从种子中耗尽。)相反，亲代(WT)株系和转基因株系二者在50、100和1000μM磷酸盐存在下有效生长。
图7显示从亲代(WT)株系和转基因PTXD-3与PTXD-5株系在有或没有亚磷酸盐(Phi)或磷酸盐(Pi)作为磷源的液体生长培养基上生长的试验获得的数据的照片。图7中，不存在或存在持续的植物生长(超出萌发阶段)分别标为减号(-)或加号(+)符号。亲代株系和转基因株系在50μM无机磷酸盐存在时均有效地生长(底行)。而且，亲代株系和转基因株系在磷酸盐和亚磷酸盐二者不存在时都不显示可检测的生长。然而，两种转基因株系而不是亲代株系，在50、100和1000μM无机亚磷酸盐作为磷源存在时有效生长。因此，转基因株系获得了代谢亚磷酸盐作为磷源支持植物生长的能力。
图8显示了从图7的野生型和转基因拟南芥株系减少生长培养基中的总磷的量的能力试验获得的数据的柱状图，所述生长培养基含有不同浓度的亚磷酸盐(50、100和1000μM)作为磷源。
将野生型和两种转基因拟南芥株系PTXD-3与PTXD-5在含有缺少磷酸盐并补充50、100或1000微摩尔亚磷酸(H3PO3)的0.1×Murashige和Skoog液体培养基的一升塑料容器中萌发和培育。允许每个塑料容器100株植物在生长室的塑料容器中生长45天，每24小时期间的光：暗周期为16:8。覆盖植物以避免丧失水分。在种子被播种萌发的位置，即每个塑料容器的液体培养基顶部放置双层塑料网。
生长45天后，移去植物，利用钒-钼酸盐方法确定液体培养基中的总磷含量。简略地说，将来自每种样品的5mL液体培养基用硝酸∶高氯酸(HNO3∶HClO4；5∶1)消化。然后，基于70％高氯酸中的钼酸铵(20mM)和偏钒酸铵(10mM)的溶液的添加，用比色方法确定磷含量。在室温孵育20分钟后，用分光光度计测量400nm的吸光度。
在图8中，标为“初始”的前三个柱代表无植物的培养基中总磷的初始浓度。标为WT(Col-0)、PTXD-3和PTXD-5的柱的组代表在相应拟南芥株系存在时培养45天后培养基(最初50μM、100μM或1000μM亚磷酸盐)中的总磷含量。转基因植物(PTXD-3和PTXD-5)而不是野生型植物，减少培养基中的磷含量多于50％。磷含量的减少在这种情形中代表从培养基去除亚磷酸盐，是由于植物对亚磷酸盐的摄取。转基因株系具有从培养基去除亚磷酸盐的高能力，因为它们能够将亚磷酸盐转化成磷酸盐用于维持植物生长。可利用这种从含水培养基去除亚磷酸盐的能力以从废水中去除亚磷酸盐，所述废水诸如CD/DVD工厂产生的污水。
图9显示用于图10和11的实验的亲代(WT)和ptxD转基因(PTXD)拟南芥植物的分布的示意图。
图10和11显示按照图9分布并被检验在含有加入的磷酸盐(Pi)(图10)或亚磷酸盐(Phi)(图11)作为磷源的基质上的生长的亲代和ptxD转基因植物的照片。不存在或存在持续生长(超出萌发阶段)分别标为加号(+)或减号(-)符号。图10显示野生型和转基因植物依靠磷酸盐的相似生长。相反，图11显示只有转基因植物能够依靠亚磷酸盐持续生长。此处和图11中的植物生长在沙土∶蛭石混合物(1∶1)中，并且定期接受水和营养溶液(除了前面指明的以外，没有任何其它磷源)。
图12显示从图7的拟南芥植物株系在不同磷源存在下培养时增加重量的能力的试验获得的数据的柱状图。在该图中，将在作为基质的沙土∶蛭石(1∶1)中培养的三种植物的干重相对于每种具体植物株系和磷源绘图。野生型植物在以亚磷酸盐作为磷源时基本上不生长，而转基因株系在亚磷酸盐(Phi)上相对于磷酸盐(Pi)上生长得相似或更好。
实施例3.表达PtxD的转基因烟草植物
本实施例描述包含实施例1的ptxD表达构建体的转基因烟草(Nicotianatabacum，tobacco)的创建和表征；参见图13。
以实施例1所述的表达构建体转化烟草。具体地，将烟草叶片外植体与T-DNA中包含35S::PtxD构建体的农杆菌菌株(实施例1)一起共培养。允许叶盘在包含1mM亚磷酸盐作为唯一磷源的MS培养基中再生。将从含亚磷酸盐的培养基上的这些叶盘再生的植物转移到土壤，并且允许在温室条件下结籽。
图13显示35S::PtxD基因纯合的T2转基因烟草种子和对照烟草幼苗在含有磷酸盐(1mM Pi)或亚磷酸盐(1mM Phi)作为唯一磷源的MS培养基中萌发25天后拍摄的照片。存在或不存在生长(耗尽种子供应的磷之后)分别标为加号(+)或减号(-)符号。可观察到，与供应磷酸盐作为磷源时相比，对照幼苗在含亚磷酸盐的培养基中萌发但不能维持正常生长。相反，来自每种转基因株系的烟草植物在亚磷酸盐或磷酸盐作为磷源存在时显示持续生长。这些实验证明了改良烟草中的磷代谢的能力。
图14显示以图13的对照和转基因烟草株系进行的其它生长实验的照片。将幼苗在补充有1mM亚磷酸盐作为唯一磷源的MS培养基中萌发并保持25天。然后将幼苗转移到包含含有1mM亚磷酸盐作为唯一磷源的MS的组织培养瓶，允许其在植物生长室在23℃生长另外25天，光周期是每24小时期间18小时的光、随后6小时的黑暗。可以观察到，PTXD转基因植物能够在包含亚磷酸盐作为唯一磷源的培养基中维持快速生长，而对照植物不能利用亚磷酸盐用于其生长和发育。
实施例4.具有改良的磷代谢的转基因藻类
本实施例描述了产生表达亚磷酸盐脱氢酶的藻类转基因株系的方法，所述亚磷酸盐脱氢酶使得藻类能够依靠亚磷酸盐作为磷源而生长。
光合的藻类已经以转基因方式适用于许多应用，诸如产生生物燃料、药物、抗原等等。藻类可在包含光系统以支持光合作用并促进生长的大型发酵罐中培养。通常，发酵罐必须被保护免受不期望的藻类(或其它生物体)污染。为此，将藻类培养在人造光而不是日光下，以减少污染风险。因此，在开放的罐或旷野(如，池塘中)中靠暴露于日光而生长藻类要廉价得多，但因为高污染风险，目前是不可行的。
通过改良目标藻类以便依靠亚磷酸盐作为磷源而生长，本公开使得日光和开放的旷野用于生长目标藻类成为可能。改良的目标藻类将能够在包含亚磷酸盐而缺乏磷酸盐的培养基中茂盛地生长，这种培养基不能支持不需要的(污染物)藻类生长，因为它们将需要磷酸盐。因此，将减少或消除不需要的藻类的污染，允许目标藻类以较低成本在开放的罐或旷野中培养，且光合作用由日光驱动。
产生了用于转化藻类物种诸如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的表达构建体。该构建体可表达任何适当的亚磷酸盐脱氢酶(且任选地也表达次磷酸盐脱氢酶)。在本示例中，该构建体从ptxD编码序列表达PtxD。该构建体利用杂合启动子序列来驱动表达同时避免基因沉默：HSP70A启动子被融合到RBCS2启动子的上游(每种启动子由莱茵衣藻提供)(Schroda等，2000，Plant J.21：121-131)。该杂合启动子序列驱动融合到ptxD基因(施氏假单胞菌)的编码序列的莱茵衣藻RBS2的第一内含子的表达，该ptxD基因(施氏假单胞菌)的编码序列转而融合到RBS2基因的转录终止序列。为了增强PtxD多肽从该构建体表达，可修饰ptxD编码序列以在允许这一改变的密码子的第三位置中具有G或C(经由遗传密码的简并性)，来优化莱茵衣藻中的翻译的密码子利用。
除了其它以外，ptxD表达构建体可被提供为包含在大肠杆菌中起作用的复制起点、大肠杆菌的选择性标记(如，氨苄西林抗性基因)、和在莱茵衣藻中起作用的选择性标记的质粒。莱茵衣藻的示例选择性标记编码赋予对zeomycin和腐草霉素的抗性的zeomycin结合蛋白(Lumbreras等，1998，Plant J.14：441-447)。
通过任何适当的机制将ptxD表达构建体引入莱茵衣藻，所述机制除了其它以外，诸如颗粒轰击(Debuchy等，1989，EMBO J.8：2803-2809)或借助于玻璃珠(Kindle等，1991，PNAS 88：1721-1725)。
用玻璃珠转化莱茵衣藻可如Kindle(1990，PNAS 87：1228-1232)所述的进行。通过在室温下在未稀释的自溶素中孵育莱茵衣藻细胞30-60min而去除细胞壁。处理的有效性通过对0.004％Nonidet P-40去垢剂(Sigma)的敏感性来监测。通过离心从自溶素收集细胞，重悬在液体培养基中，且立即转化以避免细胞壁再生。用浓硫酸洗涤玻璃珠(0.45-0.52mm)，然后用蒸馏水彻底漂洗，干燥，并通过在250℃烘烤2-3h而灭菌。将玻璃珠(300mg)加到0.4mL细胞中，加入2微克质粒DNA，并且在Fisher Vortex Genie II混合器上在15-mL锥形一次性聚丙烯离心管中以最大速度搅动细胞。允许珠子静置，并且用玻璃涂布器将细胞涂布在选择性琼脂板上。为了直接选择zeomycin抗性转化子，将细胞与玻璃珠和DNA一起搅拌，在20mL TAP液体培养基中稀释，并且通过伴随轻柔摇动在光(80μEm-2s-1)中在25℃培养15-18h而使其表达ble基因。然后通过离心使细胞成团，重悬在包含0.5％熔化琼脂的5mLTAP中，并且倒在含有20mg/mLzeomycin的TAP/2％琼脂板的表面上。
然后将Zeomycin抗性集落涂布到缺乏任何磷酸盐来源、但补充1mM亚磷酸盐作为磷源的TAP培养基中。在光中在25℃培养平板18至24h，生长的集落能够利用亚磷酸盐作为磷源。
实施例5.表达亚磷酸盐脱氢酶的转基因木霉属
本实施例描述了产生如下的木霉属真菌的方法：被修饰表达亚磷酸盐脱氢酶，以使得该真菌能够依靠亚磷酸盐作为磷源而生长。
A.引言
木霉属物种是土壤和根生态系统中常见的独立生存真菌。最近的发现显示，它们表现为无毒的植物共生生物，以及是植物病原真菌(phytophatogenic fungi)的寄生生物。一些菌株建立了稳固和持久的根表面定植，并穿入外皮。作为广泛的土壤居民和根际促生(rhizosphere-competent)真菌，木霉属物种已经成功地用作控制植物病原体的生物控制剂。已经对木霉属提出了许多生物控制机制，包括竞争、真菌寄生、和由于植物根细胞内空间的定植而引入植物防御反应(Howell，2003；Yedidia等，1999)。被木霉属物种根定植还常常促进根的生长和发育、作物生产力、对非生物胁迫的抗性、以及营养的摄取和利用。
可改良木霉属物种以表达PtxD或其直向同源物或衍生物，以使得木霉属能够依靠亚磷酸盐生长。任选地，还可改良木霉属以表达次磷酸盐脱氢酶(如，HtxA)。在任何情况中，这些转基因木霉属可置于多种用途。例如，它们可用于生物除污目的，诸如从CD和DVD工业的废水排放中消除亚磷酸盐(和/或次磷酸盐)。转基因木霉属可单独用于生物除污，或与转基因植物(如，实施例1)联合用于生物除污。使用联合的转基因植物/真菌系统来去除亚磷酸盐(和/或次磷酸盐)可比单独使用任一种更有效。可选地，转基因木霉属可与植物结合以保护植物不受病原真菌侵害。在这种情形下，植物可以是非转基因的，从而它们要求磷酸盐作为磷源，或可以是能够依靠亚磷酸盐作为磷源而生长的转基因植物(如，实施例1)。在任何情况中，转基因木霉属可作为强有力的杀真菌剂发挥作用，因为木霉属本身及其对亚磷酸盐的利用均可保护植物。
B.方案
深绿木霉(Trichoderma atroviride)(IMI 206040)原生质体的转化利用本领域已知的方法进行，所述方法除了其它以外，诸如PEG-CaCl2方法(Herrera-Estrella等，1990；Baek & Kenerley，1998)、生物射弹法(Lorito等，1993)、或电穿孔(Goldman等，1990)。转化DNA是携带处于里氏木霉(Trichoderma reesei)pki启动子或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)trpC启动子、以及深绿木霉blu17或构巢曲霉trpC终止子的控制下的编码亚磷酸盐脱氢酶(如，PtxD)的基因的质粒或PCR产物。利用Qiagen Plasmid Midi试剂盒或氯化铯梯度纯化质粒。对于选择而言，利用包含1.2M山梨醇和200mM H3PO3作为唯一磷源的琼脂覆层将100、200和500μL的等份铺板，在处理后立即进行，或在原生质体在1.2M山梨醇中2-4小时的培养阶段后进行。在28℃培养三至四天后，能够依靠亚磷酸盐作为磷源而生长的集落将出现在平板上。转化子应只在以携带ptxD编码序列的构建体转化时才出现。对转化子进行三轮单孢子培养以获得同核体。可选地，木霉属转化子可通过利用用于选择的抗生素抗性标记(诸如赋予潮霉素抗性的hph)联合携带ptxD基因的构建体共转化而获得。在后一种策略中，首先选择携带ptxD基因的潮霉素抗性转化子，并且如上所述可在后面的阶段选择能够利用亚磷酸盐作为磷源的菌株，或在通过检验ptxD基因的表达的筛选中鉴定能够利用亚磷酸盐作为磷源的菌株。
携带亚磷酸盐利用盒的转化子的分生孢子通过本领域已知的固态或深层发酵工艺产生(Cavalcante等，2008)。除了其它以外，可将分生孢子施加于植物、其种子、或施加于土壤。例如，除了其它以外，可将分生孢子施加于种子(如，利用胶乳粘着物(sticker)诸如Rhoplex B-15J)，以孢子悬液直接施加于植物根(如，利用粘着物)，或在水中作为孢子悬液或以小麦麸/泥灰制品混合物(0.5％，w/w)施加于土壤。
以下参考文献通过引用并入本文：
Baek，J.M.& Kenerley，C.M.(1998).The arg2 gene of Trichoderma virens：cloning and development of a homologous transformation system(绿木霉的arg2基因：同源转化体系的克隆和开发).Fungal Genet.Biol.23：34-44.
Cavalcante，R.S.，Lima，H.L.S.，Pinto，G.A.S.，Gava，C.A.T.，和Rodrigues，S.(2008).Effect of Moisture on Trichoderma Conidia Production on Corn and WheatBran by Solid State Fermentation(水分对固态发酵时玉米和小麦麸上的木霉菌属分生孢子的产生的作用).Food Bioprocess.Technol.1：100-104.
Goldman，G.H.，Van Montagu，M.，和Herrera-Estrella，A.(1990).Transformation of Trichoderma harzianum by high-voltage electric pulse(由高压电脉冲转化哈茨木霉).Curr.Genet.17：169-174.
Herrera-Estrella，A.，Goldman，G.H.，和Van Montagu，M.(1990).Highefficiency transformation system for the biocontrol agents，Trichoderma spp.(用于生物控制剂木霉属物种的高效转化体系)Mol.Microbiol.4：839-843.
Howell，C.R.(2003)Mechanisms employed by Trichoderma species in thebiological control of plant diseases(木霉属物种在植物疾病的生物控制中采用的机制).Plant Dis.87：4-10.
Lorito，M.，Hayes，C.K.，Di Pietro，A.，和Harman，G.E.(1993).Biolistictransformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmidand genomic DNA(利用质粒和基因组DNA对哈茨木霉和绿粘帚霉的生物射弹法转化).Curr.Genet.24：349-356.
Yedidia，I.，Benhamou，N.，和Chet，I.(1999).Induction of defense responsesin cucumber plants(Cucum is sativus L.)by the biocontrol agent Trichodermaharzianum(由生物控制剂哈茨木霉在黄瓜植物(Cucumis sativus L.)中诱导防御反应).Appl.Environ.Microbiol.65：1061-1070.
实施例6.与表达细菌亚磷酸盐脱氢酶的真菌形成菌根
本实施例描述了产生以转基因方式改良以表达亚磷酸盐脱氢酶(和/或细菌次磷酸盐脱氢酶)的菌根型真菌的方法，所述亚磷酸盐脱氢酶(和/或细菌次磷酸盐脱氢酶)使得该转基因真菌能够依靠亚磷酸盐(和/或次磷酸盐)作为磷源生长。还公开了通过将该转基因真菌与植物结合而形成菌根的方法。这些转基因真菌与植物形成的菌根可向植物供应磷酸盐用于生长。因此，植物本身不需要是转基因的，因为菌根将完成将亚磷酸盐(和/或次磷酸盐)转化为磷酸盐的所有工作。
A.引言
磷(P)是自然生态系统和农业生态系统中可限制植物生产力的必需的营养。植物可与菌根真菌形成天然共生关系，菌根真菌作为植物根系的延伸起作用，为植物提供矿物营养，尤其是磷酸盐，以交换植物光合活性产生的含碳分子(Smith和Read，1997)。菌根真菌穿入植物的根细胞，真菌的质膜与植物的质膜建立紧密的联系以形成所谓的丛枝结构。丛枝结构中，矿物营养，尤其是磷酸盐可从真菌细胞转移到植物细胞。除了矿物营养以外，菌根还可改进植物摄取水的能力，并可保护植物不受重金属侵害(Khan，A.G.，2006；Forbes等，1998)。
菌根必须与其它微生物竞争磷酸盐可用性。因此，表达编码能够将亚磷酸盐转化为磷酸盐的亚磷酸盐脱氢酶的基因的转基因菌根菌株可用于向植物供应磷酸盐。在这种情形，菌根真菌将把亚磷酸盐转化为磷酸盐，然后磷酸盐可转移到不能代谢亚磷酸盐的非转基因植物的根。可选地，为了使得该系统更有效，可使用都表达编码亚磷酸盐脱氢酶的基因的转基因菌根真菌和转基因植物的联合。转基因菌根真菌与非转基因或转基因植物的联合可用于利用其中磷酸盐已被亚磷酸盐代替的肥料来增强植物生产力，或可用于生物修复来自CD或DVD生产工厂的污水或其中亚磷酸盐用作杀真菌剂的土壤(Ohtake，H.，1995)。
B.方案
本实施例利用来自施氏假单胞菌的ptxD编码序列。然而，可利用任何适当的亚磷酸盐脱氢酶编码序列。
通过将ptxD编码序列放置在构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶(trpC)基因的转录终止子区的控制下，产生基因构建体。在转化分子中还包括选择性标记，诸如来自大肠杆菌、赋予对潮霉素的抗性的aph基因，或赋予对腐草霉素的抗性的ble基因(Barrett等，1990)。
对于转化，按照Barrett等(1990)的方案获得菌根真菌(如，双色蜡蘑(Laccariabicolor)、土生空团菌(Cenococcumgeophilum)、Hebeloma cylindrosporium、银盘菌(Paxillus involotus)、玫瑰红巨孢囊霉(Gigaspora rosea)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、聚丛球囊霉(Glomus aggregatum)、根内球囊霉(Glomus intraradices)、彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)等等)的原生质体。为了分离原生质体，收集菌丝体，并用无菌水洗涤几次，然后用渗透溶液(PDB；含有0.8M甘露醇或0.6M蔗糖的马铃薯-葡萄糖-肉汤)中的水解酶(纤维素酶、几丁质酶和蛋白酶的混合物，每种酶5至10mg/mL)处理以降解细胞壁。伴随恒定搅动(100rpm)，将菌丝体与酶在32℃孵育1至3小时。过滤原生质体悬液，并用渗透溶液洗涤。通过在800rpm离心10min回收原生质体，并将原生质体小团重悬在PDB缓冲液中，通过在显微镜下计数来确定原生质体的数目。
将原生质体(250μL中1-3×107个)与5至20微克基因构建体混合，并且在4℃在PEG转化溶液(25-60％聚乙二醇4000、10-25mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH 7.5)中孵育45分钟。加入另外的1mL PEG转化溶液，并且在室温继续孵育20分钟。允许原生质体在液体培养基中再生细胞壁，并在固体培养基中选择转化子。取决于用于转化的选择性标记，固体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂)包含100μg/mL潮霉素或100μg/mL腐草霉素。将生长的集落转移到固体培养基三次以分离稳定转化的菌丝体。选择性标记以及ptxD基因的存在由PCR证实。分离稳定的转化子之后，将菌丝体的2mm部分转移到缺乏磷酸盐并且补充有1mM亚磷酸盐的PDA培养基以鉴定表达ptxD基因构建体的集落。DNA印迹分析用于证实相应基因的存在。
为了证实转基因真菌可向植物提供磷酸盐，对土壤接种ptxD-转化真菌的菌丝体，并且在该土壤中萌发烟草种子。对土壤施以正常浓度的氮和钾，以亚磷酸盐作为磷源。将烟草植物在接种ptxD转基因真菌的土壤中从种子的生长与在未被接种的对照土壤中的生长进行比较。
以下参考文献通过引用并入本文：
Barrett，V.，Dixon，R.K.，和Lemke，P.A.(1990)Genetic transformation of amycorrhizal fungus(菌根真菌的遗传转化).Appl.Micobiol.Biotechnol.33：313-316.
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实施例7.精选的参考文献
本实施例展示了与本公开各方面相关的一组参考文献。每篇参考文献为了所有目的通过引用并入本文。
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实施例8.精选的实施方案I
本实施例描述本发明的精选的实施方案，展示为一系列索引的段落。
A.一种能够利用至少一种还原形式的磷作为磷肥的转基因植物。本段的转基因植物可被进一步表征如下：(A1)其中该植物表达编码能够将亚磷酸盐氧化为磷酸盐的酶的细菌编码序列，从而允许利用亚磷酸盐作为磷肥(和磷源)；(A2)其中A1的细菌编码序列是来自施氏假单胞菌、粪产碱菌或黄黄色杆菌的ptxD；(A3)其中A1或A2的转基因植物表达htxA和ptxD编码序列，从而允许利用次磷酸盐和/或亚磷酸盐作为磷肥；(A4)其中A3的细菌编码序列的每种或二种来自施氏假单胞菌、粪产碱菌或黄黄色杆菌；(A5)其中A1至A4任何之一的细菌编码序列的至少一种处在组成型启动子、叶特异性启动子、组织特异性启动子、根特异性启动子、低磷酸盐可诱导的启动子或来自花椰菜花叶病毒的35S启动子的控制下；或(A6)A1至A5的任何组合。
B.能够将次磷酸盐氧化为磷酸盐、和/或将亚磷酸盐氧化为磷酸盐的转基因植物从工业污水或城市污水消除次磷酸盐和/或亚磷酸盐的用途。
C.将次磷酸盐氧化为磷酸盐、和/或将亚磷酸盐氧化为磷酸盐的一种或多种细菌编码序列作为用于产生转基因植物的选择性标记的用途。
D.主要由编码将次磷酸盐氧化为磷酸盐、和/或将亚磷酸盐氧化为磷酸盐的酶的一种或多种细菌编码序列和在植物中起作用的启动子序列构成的重组DNA分子作为用于产生转基因植物的选择性标记的用途。
E.一种在植物细胞中起作用的嵌合基因，该嵌合基因包括：(1)植物可表达的启动子序列；(2)终止子信号序列；和(3)将亚磷酸盐氧化为磷酸盐的细菌基因的编码区，该编码区：编码功能性NAD：亚磷酸盐氧化还原酶，并且位于这种植物可表达的启动子序列和这种终止子信号序列之间，从而是可表达的，其中这种编码区在植物细胞中的表达对这种植物细胞赋予利用亚磷酸盐作为磷源的能力，且其中这种利用亚磷酸盐作为磷源的能力能够提供用于选择这种植物细胞的基础。本段的嵌合基因可被进一步表征如下：(E1)其中该编码区来自施氏假单胞菌、粪产碱菌或黄黄色杆菌的ptxD基因；(E2)其中该启动子序列是组成型启动子；(E3)其中该启动子序列是来自花椰菜花叶病毒的35S启动子；(E4)其中该终止子信号序列是胭脂碱合成酶终止子信号序列；(E5)其中该终止子信号序列是花椰菜花叶病毒终止子信号序列；或(E6)E1至E5的任何组合。
F.表达至少一种外源酶的转基因植物，其表达水平使得该植物能够代谢还原形式的磷作为磷肥。
实施例9.精选的实施方案II
本实施例描述本发明的精选的实施方案，展示位一系列索引的段落。
A.一种包含构建体的转基因植物，该构建体赋予植物(1)利用还原形式的磷作为营养用于生长的生长优势和/或(2)代谢至少一种还原形式的磷的能力。本段的转基因植物可被进一步描述如下：(A1)其中如果亚磷酸盐是植物至少大致上唯一的外部磷源，则该构建体对植物赋予生长优势；(A2)其中如果次磷酸盐是植物至少大致上唯一的外部磷源，则该构建体对植物赋予生长优势；(A3)其中如果亚磷酸盐是植物至少大致上唯一的外部磷源和如果次磷酸盐是植物至少大致上唯一的外部磷源，则该构建体对植物赋予生长优势；(A4)其中没有磷酸盐作为外部磷源时该转基因植物能够生长，且其中没有磷酸盐作为外部磷源时转基因植物的缺少该构建体的非转基因品种至少大致上不能生长；(A5)其中该转基因植物最初在该转基因植物的祖先中用该构建体转化；(A6)其中该构建体编码赋予植物将至少一种还原形式的磷代谢为磷酸盐的能力的一种或多种多肽的表达，且任选地，其中至少一种该多肽将亚磷酸盐氧化为磷酸盐，且任选地，其中至少一种该多肽能够利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)作为电子受体，且任选地，其中该一种或多种多肽包括PtxD多肽，PtxD多肽任选地由至少大致上来源于施氏假单胞菌、粪产碱菌或黄黄色杆菌的编码区编码；(A7)其中A6的一种或多种多肽包括HtxA多肽；(A8)其中A6或A7的一种或多种多肽的至少一种的表达是可诱导的；(A9)其中A6至A8任何之一的至少一种多肽的表达是低磷酸盐可诱导的；(A10)其中A6至A9任何之一的至少一种多肽的表达处于组成型启动子的控制下；(A11)其中A6至A10任何之一的至少一种多肽的表达处于叶特异性启动子的控制下；(A12)其中A6至A11任何之一的至少一种多肽的表达处于根特异性启动子的控制下；(A13)其中A6至A12任何之一的至少一种多肽的表达处于非组织特异性的启动子的控制下；或(A14)A1至A13的任何组合。
B.包含编码赋予植物将亚磷酸盐代谢为磷酸盐的能力的细菌多肽的构建体的转基因植物。
C.萌发产生段落A或B的转基因植物的种子、或用于产生或无性繁殖段落A或B的转基因植物的任何植物部分。
D.用于产生转基因植物的核酸，包括：能够赋予植物以下特性的嵌合基因：(1)利用还原形式的磷作为营养用于生长的生长优势和/或(2)代谢至少一种还原形式的磷的能力。本段的核酸可被进一步描述如下：(D1)其中该嵌合基因包括可操作地连接于编码区的启动子，且其中该启动子能够控制该编码区在植物中的表达，且任选地，其中该编码区编码将亚磷酸盐氧化为磷酸盐的一种或多种多肽，且任选地，其中该编码区至少大致上由ptxD基因提供；(D2)其中该嵌合基因包括可操作地连接于编码区的启动子，且其中该启动子至少大致上来源于植物和/或植物病毒，且任选地，其中该启动子包括来自花椰菜花叶病毒的35S启动子；(D3)还包括在植物中起作用的并可操作地连接于D1或D2的启动子和编码区的转录终止子；(D4)其中D1至D3任何之一的编码区编码将亚磷酸盐氧化为磷酸盐的多肽；(D5)其中该核酸被布置在微生物中；(D6)其中该核酸是从细胞分离的；(D7)其中该核酸被布置在转基因植物中；或(D8)D1至D7的任何组合。
E.产生转基因植物的方法，包括：利用赋予代谢还原形式的磷的能力的核酸作为选择性标记来选择植物或植物部分的转化。本段的方法可被进一步描述如下：(E1)其中选择转化的步骤包括选择植物或植物部分相对于其它植物或植物部分以一种或多种还原形式的磷作为该植物或植物部分的外部磷源的生长优势的步骤；(E2)其中E1中选择生长优势的步骤以该植物或植物部分接触含亚磷酸盐、次磷酸盐或二者的培养基来进行；(E3)其中E1或E2中选择生长优势的步骤以至少大致上不含磷酸盐的培养基进行；(E4)还包括将植物或植物部分、其祖先、或二者与包括提供选择性标记的构建体的改性剂接触的步骤；(E5)其中E4的改性剂包括含该构建体的农杆菌细胞；(E6)其中E4或E5的构建体编码将亚磷酸盐氧化为磷酸盐的多肽；(E7)其中E4至E6任何之一的构建体编码将次磷酸盐氧化为磷酸盐的多肽；(E8)其中E4至E7任何之一的接触步骤包括向植物或植物部分、其祖先、或二者发射发射体的步骤；(E9)其中选择转化的步骤是对植物部分进行的，且其中该植物部分是组织外植体或分离的植物细胞；或(E10)E1至E9的任何组合。
F.一种对段落A或B的转基因植物施肥的方法，其中还原形式的磷用作叶面肥料或被加入以修改土壤组成，从而提供磷酸盐来源以维持植物生长和生殖。
G.一种水体修复的方法，包括：将(i)包括亚磷酸盐的污水与(ii)包括赋予将亚磷酸盐代谢为磷酸盐的能力的构建体的转基因植物接触，从而减少污水中亚磷酸盐的水平。
实施例10.精选的实施方案III
本实施例描述本发明的精选的实施方案，展示为一系列索引的段落。
A.一种核酸，包括：包含以下的嵌合基因：(a)编码亚磷酸盐脱氢酶的编码区和(b)可操作地连接于该编码区的转录启动子，其中该启动子相对于该编码区是异源的，并且在植物、真菌、或二者中是起作用的，且其中该嵌合基因提供该酶在包含该嵌合基因的植物或真菌细胞中的充分表达，以赋予该细胞代谢亚磷酸盐(Phi)作为磷源用于支持生长的能力，从而使得该细胞在没有外部来源的磷酸盐(Pi)时能够生长。本段的核酸可被进一步描述如下：(A1)其中该亚磷酸盐脱氢酶是细菌来源的；(A2)其中该亚磷酸盐脱氢酶是施氏假单胞菌的PtxD(SEQ ID NO：1)、PtxD(SEQID NO：1)的类似物或衍生物、或来自另一细菌物种的PtxD-样同源物；(A3)其中该细菌亚磷酸盐脱氢酶具有与SEQ ID NO：1-14的至少一种具有至少50％、60％、80％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列；(A4)其中该亚磷酸盐脱氢酶具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括：第一序列区，所述第一序列区含与VGILGMGAIG(SEQ ID NO：15)具有序列相似性或同一性的NAD-结合基序，第二序列区，所述第二序列区与XPGALLVNPCRGSVVD(SEQ ID NO：16)具有序列相似性或同一性，其中X是K或R，第三序列区，所述第三序列区与GWX1PX2X3YX4X5GL(SEQID NO.19)具有序列相似性或同一性，其中X1是R、Q、T或K，X2是A、V、Q、R、K、H或E，X3是L或F，X4是G、F或S，且X5是T、R、M、L、A或S，或者包括第一序列区、第二序列区与第三序列区的任何组合；(A5)其中该亚磷酸盐脱氢酶具有与来自施氏假单胞菌的PtxD(SEQ IDNO：1)至少90％相同的氨基酸序列；(A6)其中该嵌合基因还包括可操作地连接于该编码区并相对于编码区异源的转录终止子；(A7)其中该启动子是植物启动子或植物病毒的病毒启动子，并且能够促进该酶在植物细胞中的充分表达；(A8)其中A7的启动子对应于花椰菜花叶病毒的35S启动子；(A9)其中A7的启动子是由低磷酸盐可用性可诱导的；(A10)其中A9的启动子对应于拟南芥PLDZ2基因的启动子；(A11)其中该嵌合基因能够促进该酶在各自包含该嵌合基因的植物细胞和真菌细胞二者中的充分表达；(A12)其中该启动子是能够促进该酶在真菌细胞中的充分表达的真菌启动子；(A13)其中该编码区的一个或多个密码子已被体外改变以改进在植物和/或真菌中的翻译效率；(A14)还包含与该编码区连接且被构造为与该编码区一起转录且在转录后被剪接去除的内含子，其中该内含子任选地设置在该编码区中；(A15)其中该编码区与SEQ ID NO：21具有至少90％的序列同一性；或(A16)A1至A15的任何组合。
B.一种植物细胞，其包含在该植物细胞中表达亚磷酸盐脱氢酶的核酸，并能够代谢亚磷酸盐作为磷源用于支持生长。任选地，该核酸是根据段落A的核酸。本段的植物细胞可被进一步描述如下：(B1)还包含在该植物细胞中表达次磷酸盐脱氢酶的核酸，该次磷酸盐脱氢酶任选地为细菌来源的；(B2)B1的植物细胞，其中这些核酸共同地赋予该细胞代谢次磷酸盐(Hphi)作为磷源用于支持生长的能力；(B3)其中B1或B2的其它核酸编码与施氏假单胞菌的HtxA(SEQ ID NO：20)具有至少95％序列同一性的多肽；(B4)B1至B3任何之一的植物细胞，其中这些核酸彼此相邻地整合到该植物细胞的基因组中；(B5)其中亚磷酸盐脱氢酶、次磷酸盐脱氢酶、或二者的表达被根特异性启动子控制；(B6)其中该植物细胞对于该核酸是纯合的；(B7)其中该植物细胞是真核藻类细胞；(B8)其中B7的藻类细胞是衣藻属细胞；(B9)其中该植物细胞来自维管植物的物种；或(B10)B1至B9的任何组合。
C.一种主要由多个根据段落B的植物细胞构成的植物。本段的植物可被进一步描述如下：(C1)其中该植物是维管植物，诸如农作物物种，(C2)其中C1的农作物物种选自以下组成的组：玉米、大豆、水稻、马铃薯、番茄、甘蔗和小麦。
D.一种真菌细胞，其包含在该真菌细胞中表达亚磷酸盐脱氢酶的核酸并且能够代谢亚磷酸盐作为磷源用于支持生长。任选地，该核酸是根据段落A的核酸。本段的真菌细胞可被进一步描述如下：(D1)还包含在该真菌细胞中表达次磷酸盐脱氢酶的核酸；(D2)D1的真菌细胞，其中这些核酸共同地赋予细胞代谢次磷酸盐(Hphi)作为磷源用于支持该真菌细胞生长的能力；(D3)其中该真菌细胞来自木霉属的物种；(D4)其中该真菌细胞是能够与植物形成共生关系的菌根真菌物种的成员；或(D5)D1至D4的任何组合。
E.一种减少植物真菌感染的方法，包括：向植物的种子形式、植物本身、布置植物的土壤、或其组合施加多个段落D的真菌细胞。在一些情况中，该真菌细胞可以是孢子。
F.一种与多个根据段落D的真菌细胞结合以形成菌根的植物。任选地，该真菌细胞使得该植物能够在包含亚磷酸盐(Phi)、次磷酸盐(Hphi)、或二者作为磷源用于支持生长的培养基上生长。
G.一种利用次磷酸盐和/或亚磷酸盐作为磷源用于支持生长的对农作物施肥的方法，所述农作物(a)包括多个含段落A的核酸的细胞，(b)与含段落A的核酸的菌根真菌形成菌根，和/或(c)与包含权利要求1所述的核酸的木霉属真菌结合，所述方法包括：向该植物和/或向该植物附近的土壤施加磷的至少一种还原形式，从而该还原形式被该植物和/或该真菌代谢为磷酸盐以支持该植物的生长和生产力。
H.一种对段落C的植物施肥的方法，该方法包括：向该植物和/或向该植物附近的土壤施加磷的至少一种还原形式，从而该还原形式被该植物代谢为磷酸盐以支持该植物的生长和生产力。任选地，该还原形式可作为叶面肥料施加或被加入以修改土壤，从而提供磷酸盐来源以维持植物生长和植物生殖。
I.一种处理水以降低其还原磷的含量的方法，该方法包括：将包含次磷酸盐和/或亚磷酸盐的水与多个包含段落A的核酸的植物细胞和/或真菌细胞接触，从而至少一部分的次磷酸盐和/或亚磷酸盐被氧化为亚磷酸盐和/或磷酸盐。任选地，该接触步骤包括将水与多个主要由包含段落A的核酸的植物细胞构成的维管植物接触的步骤。
J.一种处理废液以降低其还原磷的含量的方法，该方法包括：将(i)包含次磷酸盐和/或亚磷酸盐作为污染物的水与(ii)多个包含段落A的核酸的植物细胞和/或真菌细胞接触，从而至少一部分的次磷酸盐和/或亚磷酸盐被氧化为亚磷酸盐和/或磷酸盐。
K.一种利用段落A的核酸来产生转基因植物的方法，包括：在转基因植物产生期间选择包含段落A的核酸作为选择性标记的植物细胞的生长。
L.一种获得用编码亚磷酸盐脱氢酶的核酸转化的植物的方法，该酶可从作为选择性标记的核酸表达，该方法包括：将植物细胞与包括该核酸的组合物在促进该核酸被引入至少一小组(subset)所述植物细胞中的条件下接触；在包含亚磷酸盐作为主要或唯一磷源用于生长的培养基中培养所述植物细胞；选择由接触步骤和培养步骤产生并由在所述培养基中生长而证明表达该亚磷酸盐脱氢酶的转化的植物细胞；并将至少一部分的转化的植物细胞再生为转基因植物。本段的方法可被进一步描述如下：(L1)其中该组合物包括在接触步骤期间供应核酸的农杆菌细胞；或(L2)其中该组合物包括在接触步骤中向该植物细胞发射的发射体。
M.一种植物，包含：包含表达亚磷酸盐脱氢酶的嵌合基因的核酸，从而该植物能够代谢亚磷酸盐(Phi)作为磷源用于支持生长，从而使得该植物在没有外部来源的磷酸盐(Pi)时能够生长。本段的植物可被进一步描述如下：(M1)其中该核酸稳定地整合到该植物的基因组中；(M2)其中该植物是维管植物；(M3)其中该植物是藻类的物种；(M4)其中亚磷酸盐脱氢酶具有段落A的任何特征；或(M5)M1至M4的任何组合。
N.一种真菌，包含：包含表达亚磷酸盐脱氢酶的嵌合基因的核酸，从而所述真菌能够代谢亚磷酸盐(Phi)作为磷源用于支持生长，从而使得所述真菌在没有外部来源的磷酸盐(Pi)时能够生长。本段的真菌可进一步被描述如下：(N1)其中该核酸稳定地整合到该真菌的基因组中；(N2)其中该真菌是木霉属的物种；(N3)其中该真菌是能够与植物形成共生关系的菌根物种；(N4)还包括与该真菌结合以形成菌根的植物；(N5)其中所述亚磷酸盐脱氢酶具有段落A的任何特征；或(N6)N1至N5的任何组合。
以上列出的公开内容可涵盖具有独立用途的多种不同发明。尽管这些发明的每一种已经以其优选形式被公开，在本文公开和阐述的其具体实施方案不应被认为是限制意义，因为可以有许多变化。这些发明的主题包括本文公开的各种要素、特征、功能和/或性质的所有新颖且非显而易见的组合和亚组合。以下权利要求书具体地指出了被认为新颖和非显而易见的某些组合和亚组合。以特征、功能、要素、和/或性质的其它组合和亚组合实现的发明可在要求本申请或相关申请优先权的申请中要求保护。这样的权利要求书，无论是针对不同发明还是相同发明，无论范围比最初的权利要求书更宽、更窄、相等还是不同，也被认为包括在本公开的发明的主题中。

Claims (15)

1.一种利用亚磷酸盐作为磷源用于支持生长的对农作物施肥的方法，所述农作物包括多个细胞，所述细胞包含含有嵌合基因的核酸，所述嵌合基因包括：(a)编码催化亚磷酸盐氧化成磷酸盐的酶的编码区，其中所述酶是亚磷酸盐脱氢酶；和(b)可操作地连接于所述编码区的转录启动子，其中所述启动子相对于所述编码区是异源的并且在植物中是起作用的，并且其中所述嵌合基因提供所述酶在包含所述嵌合基因的植物中的充分表达，以对所述植物赋予代谢亚磷酸盐作为磷源用于支持生长的能力，从而使得所述植物在没有外部来源的磷酸盐时能够生长，所述方法包括：向所述植物和/或向所述植物附近的土壤施加亚磷酸盐，从而所述亚磷酸盐被所述植物代谢为磷酸盐以支持所述植物的生长和生产力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述农作物在足以选择性促进所述植物相对于所述植物附近的杂草的生长的亚磷酸盐的存在下生长。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚磷酸盐作为叶面肥料施加。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚磷酸盐作为土壤改良剂施加。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述农作物的物种选自由玉米、大豆、水稻、马铃薯、番茄、甘蔗和小麦组成的组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述农作物生产商业用油。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶是细菌来源的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚磷酸盐脱氢酶是施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的PtxD。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶具有包括第一序列区、第二序列区和第三序列区的氨基酸序列，所述第一序列区具有NAD-结合基序，所述基序具有序列VGILGMGAIG(SEQ ID NO:15)，所述第二序列区具有序列XPGALLVNPCRGSVVD(SEQ ID NO:16)，其中X是K或R，所述第三序列区具有序列GWX1PX2X3YX4X5GL(SEQ ID NO:19)，其中X1是R、Q、T或K，X2是A、V、Q、R、K、H或E，X3是L或F，X4是G、F或S且X5是T、R、M、L、A或S。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶由包括可操作连接于所述酶的编码序列的植物启动子的核酸构建体表达。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸构建体包含通过低磷酸盐条件诱导的植物启动子。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶由包括可操作连接于所述酶的编码序列的病毒启动子的核酸构建体表达。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述病毒启动子对应于花椰菜花叶病毒的35S启动子。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述农作物与菌根真菌形成菌根，所述菌根真菌被转基因修饰为表达能够催化亚磷酸盐氧化成磷酸盐的亚磷酸盐脱氢酶。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述农作物与木霉属(Trichoderma)真菌结合，所述木霉属真菌被转基因修饰为表达能够催化亚磷酸盐氧化成磷酸盐的亚磷酸盐脱氢酶。
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