CN115215931A

CN115215931A - 抗蔓割病和软腐病相关蛋白IbC3H18或调控其表达的物质的应用

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Publication number: CN115215931A
Application number: CN202210628890.5A
Authority: CN
Inventors: 张欢; 何绍贞; 刘庆昌; 翟红; 贾礼聪; 赵宁; 高少培
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2042-06-06
Also published as: CN115215931B

Abstract

本发明公开了植物抗病性相关蛋白IbC3H18及其编码基因与应用。本发明所要解决的问题是如何提高植物的抗病性，可通过蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质来调控植物抗病性。所述蛋白质IbC3H18为如下任一所示蛋白质：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗病性的蛋白质；A3)在A1)或A2)的一端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。实验证明，IbC3H18基因具有正向调控植物抗病性的能力，在甘薯中过表达IbC3H18基因能够显著提高甘薯的抗病性。

Description

抗蔓割病和软腐病相关蛋白IbC3H18或调控其表达的物质的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗蔓割病和软腐病相关蛋白IbC3H18或调控其表达的物质的应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是双子叶植物纲、管状花目、旋花科、番薯属植物，是重要粮食、饲料，工业原料及新型能源作物，其地位显得尤为重要。甘薯蔓割病和软腐病是甘薯生产上和储藏过程中严重的真菌病害，严重影响甘薯的产量及品质，甚至造成绝收，一直是困扰甘薯产业发展的主要病害问题。

传统的育种方法难以对许多优良品种进行抗病性改良，抗病品种的抗性与丰产、优质性状难以达成有机统一；土地资源有限，轮作方法不易实施；化学农药的大量使用产生了环境污染、农药抗性和残留等问题。此外，由于甘薯种质资源较匮乏，难以找到高抗蔓割病和软腐病的甘薯育种材料，而且甘薯遗传基础复杂且高度杂合(2n＝B1B1B2B2B2B2＝6X＝90)、存在远缘杂交不亲和和自交不亲和性，许多品种开花困难，抗性性状与产量品质性状高度负相关，常规的甘薯抗性育种受到严重制约。运用基因工程技术改良甘薯品种能够克服常规育种中存在的生殖隔离和基因连锁等障碍，从分子水平上对甘薯的蔓割病和软腐病抗性进行高效、精确地定向改良。因此，克隆调控甘薯抗病相关的基因，创制高产优质高抗的甘薯新材料，对甘薯优质、高产、高抗育种工作具有非常重要的理论参考意义和应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性。

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗病性中的应用。

本发明所提供的应用为蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：

1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗病性中的应用；

2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育抗病性改变的植物中的应用；

4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育抗病性改变的植物的产品中的应用；

5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质可为如下任一所示蛋白质：

A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗病性的蛋白质，例如本领域技术人员可根据如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个以上氨基酸，得到与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性且具有调控植物抗病性的IbC3H18蛋白突变体；

A3)A1)-A2)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

上述A2)所述蛋白质的氨基酸序列可为SEQ ID No.2。

上述A1)所述蛋白质的名称为IbC3H18。A2)所述蛋白质为IbC3H18突变体。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述应用中所述的蛋白质来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质IbC3H18。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用或方法中，所述提高、增加或上调所述基因表达的物质和所述调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子，

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒，

B4)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体，

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物，

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系，

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织，

B8)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

C1)抑制或降低或沉默所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子，

C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因，

C3)含有C2)所述编码基因的表达盒，

C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体，

C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物，

C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系，

C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织，

C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：

B1)所述核酸分子为编码链的编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

B2)所述表达盒具体可为核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。其中，序列3自5′末端起第1至835位为CaMV35S启动子，第848至2545位为IbC3H18蛋白的编码基因，第2562至2814位为NOS终止子；

C1)所述核酸分子为shRNA分子，所述shRNA分子的茎的一条链序列为核苷酸序列是序列表中序列5的DNA片段转录得到的序列；

C2)所述编码基因如式(I)所示：SEQ正向-X-SEQ反向式(I)；

所述SEQ正向的序列为是序列表中序列5；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。

SEQ ID No.1所示的DNA分子(IbC3H18基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质IbC3H18。

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为蛋白质IbC3H18编码基因(CDS)的核苷酸序列。

B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

B1)所述核酸分子还可包括与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质IbC3H18的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质IbC3H18的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质IbC3H18且具有蛋白质IbC3H18功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pCAMBIA1300和/或载体pEASY-Blunt simple。

可用现有的植物表达载体构建含有IbC3H18基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用IbC3H18基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明还提供了提高植物抗病性的方法。

本发明提供的提高植物抗病性的方法可为提高和/或增加目的植物中上述所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高和/或增加上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，来增强植物的抗病性。

本发明还提供了一种降低植物抗病性的方法，其特征在于：所述方法可为抑制或降低或沉默目的植物中所述IbC3H18蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉所述IbC3H18蛋白的编码基因的表达量，来降低植物抗病性。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质IbC3H18的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质IbC3H18的编码基因活性下降或失活。

本发明还提供了培育抗病性植物的方法。

本发明提供的培育抗病性植物的方法，包括提高和/或增加出发植物中上述蛋白的编码基因的表达和/或上述蛋白的含量和/或活性，或/和提高和/或增加上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到抗病性植物。

上述培育方法中，所述增强或提高或上调目的植物中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，所述蛋白的编码基因的表达量可通过向受体植物中导入IbC3H18基因，得到植物抗病性高于所述受体植物的目的植物。所述IbC3H18基因编码所述IbC3H18蛋白。

在本发明的一个实施方案中，所述培育抗病性植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID NO.1所示DNA分子的重组表达载体；

(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或甘薯)中；

(3)经筛选和鉴定获得抗病性高于所述受体植物的抗病性植物。

所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。

上述抗病性具体可为抗蔓割病和/或抗软腐病。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的IbC3H18基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得抗病性提高的转基因细胞系及转基因植株。携带IbC3H18基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述重组载体具体可为重组载体pCB-IbC3H18，所述重组载体pCB-IbC3H18是将pCBGUS载体的XbaI和SacI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQID No.1的DNA片段，保持pCBGUS载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCB-IbC3H18表达序列表中SEQ ID No.2所示的IbC3H18蛋白。

所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/pCB-IbC3H18。

所述重组农杆菌EHA105/pCB-IbC3H18是将所述重组载体pCB-IbC3H18导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。

本发明中，所述植物育种的目的可包括培育抗病性植物。本文中所述植物可为如下中的任一种：c1)双子叶植物或单子叶植物；c2)管状花目植物；c3)旋花科植物；c4)番薯属植物；c5)甘薯。

本发明提供了一种IbC3H18蛋白及其编码基因，将该基因导入甘薯中，得到过表达IbC3H18基因的甘薯植株。将转基因甘薯植株接种蔓割病菌与软腐病菌，发现过表达株系与野生型甘薯相比，蔓割病抗性和软腐病抗性增强。结果表明，IbC3H18基因及其所编码的蛋白在植物抗病性能中起着重要的作用。本发明所提供的IbC3H18蛋白及其编码基因在提高植物抗病性研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1甘薯过表达转基因阳性植株PCR鉴定结果。

图2甘薯RNAi阳性植株PCR鉴定结果。

图3甘薯过表达阳性植株和RNAi阳性植株的IbC3H18表达量检测结果。

图4孢子法蔓割病接种鉴定试验。

图5菌片法蔓割病接种鉴定实验。

图6甘薯软腐病接种鉴定试验。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

甘薯突变体ND98记载于如下文献中：何绍贞.甘薯耐盐突变体的离体筛选及耐盐候选基因的克隆.中国农业大学博士学位论文，2008。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

栗子香(张欢，杨乃科，商丽丽，高晓茹，刘庆昌，翟红，高少培，何绍贞.甘薯抗旱相关基因IbNAC72的克隆与功能分析.作物学报,2020,Vol.46,Issue(11):1649-1658.)为一甘薯品种，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

克隆载体pMD19-T为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。载体pCAMBIA1300为Cambia公司产品。载体pBI121为Clontech公司产品。植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，目录号为DP432。pEASY-Blunt simple载体为北京全式金生物技术有限公司的产品。PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit为宝生物工程(大连)有限公司的产品，产品目录号为6110A。

载体pFGC5941记载于如下文献中：K Mcginnis，et al.Transgene-induced RNAinterference as a tool for plant functional genomics.Methods in Enzymology，2005，392:1-24，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

下述实施例中的甘薯蔓割病菌记载于如下文献中：Zhang,H.,Zhang,Q.,Zhai,H.,Gao,S.,Yang,L.,Wang,Z.,Xu,Y.,Huo,J.,Ren,Z.,Zhao,N.,Wang,X.,Li,J.,Liu,Q.,&He,S.(2020).IbBBX24 promotes the jasmonic acid pathway and enhances fusariumwilt resistance in sweet potato.The Plant Cell.32(4):1102-1123。

下述实施例中的甘薯软腐病菌记载于如下文献中：周锋,郭镇华,郭子灏,等.甘薯软腐病病原的rDNA-ITS分子鉴定及其对11种杀菌剂的敏感性测定[J].中国植保导刊,2020,40(2):22-25。

实施例1、利用IbC3H18基因在调控甘薯抗病性中的应用

IbC3H18基因来源于甘薯耐盐突变体ND98，其核苷酸序列(编码序列(CDS))如SEQID No.1，其编码的蛋白命名为IbC3H18蛋白或蛋白质IbC3H18，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一、重组质粒的构建

1.IbC3H18基因的获得

1)模板的获得

用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯耐盐突变体ND98的幼嫩叶片的总RNA，将该总RNA用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录出第一链cDNA。

2)构建cDNA-AFLP差减库，获得EST序列。根据EST序列的核苷酸序列，设计并人工合成引物，以步骤1获得的cDNA为模板，利用RACE方法扩增获得约900bp的3′-RACE片段，将3′-RACE片段和克隆载体pMD19-T连接，得到重组质粒2。将重组质粒2进行测序，获得3′-RACE片段的核苷酸序列。

3)根据EST序列的核苷酸序列，设计并人工合成引物，以步骤1获得的cDNA为模板，利用RACE方法扩增获得约1600bp的5′-RACE片段，将5′-RACE片段和克隆载体pMD19-T连接，得到重组质粒3。将重组质粒3进行测序，获得5′-RACE片段的核苷酸序列。

4)根据步骤2获得的3′-RACE片段的核苷酸序列和步骤3获得的5′-RACE片段的核苷酸序列，利用DNAMAN 6.0软件拼接候选的IbC3H18基因。依据拼接候选的IbC3H18基因序列进一步设计并人工合成引物O-F(5′-ATGGATAAATTTGATGCAGTGAG-3′)和O-R(5′-CTACATAACTGCGGAGATGCTG-3′)。

5)完成步骤4后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤4合成的O-F和O-R为引物，进行PCR扩增，获得约1698bp的PCR扩增产物并测序。

上述GSP-1、GSP-2、GSP-3、GSP-4、O-F和O-R的核苷酸序列信息详见表2。

结果表明，步骤5获得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将该序列所示的基因命名为IbC3H18基因，其编码的蛋白命名为IbC3H18蛋白或蛋白质IbC3H18，氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2.重组质粒的构建

A、重组质粒pCB-IbC3H18的构建

1)人工合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以OE-F-XbaI：5′-GCTCTAGAATGGATAAATTTGATGCAGTGAA-3′(下划线为限制性内切酶XbaI的识别序列)和OE-R-SacI：5′-CGAGCTC CTACATAACTGCGGAGATGCTG-3′(下划线为限制性内切酶SacI的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到一端端含有限制性内切酶XbaI和另一端端含有限制性内切酶SacI的双链DNA分子。

2)将1)的双链DNA分子连接至pEASY-Blunt simple载体，得到重组质粒pEASY-IbC3H18。

3)完成步骤2后，用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切重组质粒pEASY-IbC3H18，回收约1700bp的片段1。

4)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pCAMBIA3301，回收约11256bp的载体骨架1。

5)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pBI121，回收包含约3032bp的片段2。

6)将片段2与载体骨架1连接，得到重组质粒pCBGUS。用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切重组质粒pCBGUS，回收约12388bp的载体骨架2。

7)将片段1与载体骨架2连接，得到重组质粒pCB-IbC3H18。

根据测序结果，对重组质粒pCB-IbC3H18进行结构描述如下：将重组质粒pCBGUS的限制性内切酶XbaI和SacI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pCB-IbC3H18表达序列表中序列2所示的IbC3H18蛋白。

重组质粒pCB-IbC3H18具有一个表达盒，该表达盒的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中序列表中序列3自5′末端起第1至835位为CaMV35S启动子，第848至2545位为IbC3H18蛋白的编码基因，第2562至2814位为NOS终止子。

B、重组质粒pFGC5941-IbC3H18的构建

1)人工合成序列表的序列5所示的双链DNA分子(序列5是IbC3H18基因的3′非编码区)。以该双链DNA分子为模板，以IbC3H18-Ri-DF(BamHI)：5′-CGGGATCCGCCAAATGACACATAACAAGTCG-3′(下划线为限制性内切酶BamHI的识别序列)和IbC3H18-Ri-DR(XbaI)：5′-GCTCTAGAACCATTCATGTTAAGTTATTCAGCG-3′(下划线为限制性内切酶XbaI的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到DNA片段甲。

2)完成步骤1后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切DNA片段甲，回收445bp的片段1。

3)用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切载体pFGC5941，回收约10kb的载体骨架1。

4)将片段1与载体骨架1连接，得到重组质粒pFGC5941-D。

5)用限制性内切酶XhoI和SwaI双酶切重组质粒pFGC5941-D，回收约10kb的载体骨架2。

6)人工合成序列表的序列5所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以IbC3H18-Ri-UF(XhoI)：5′-CCGCTCGAGACCATTCATGTTAAGTTATTCAGCG-3′(下划线为限制性内切酶XhoI的识别序列)和IbC3H18-Ri-UR(SwaI)：5′-GCGATTTAAATGCCAAATGACACATAACAAGTCG-3′(下划线为限制性内切酶SwaI的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到DNA片段乙。

7)完成步骤6后，用限制性内切酶XhoI和SwaI双酶切DNA片段乙，回收约445bp的片段2(序列5的反向互补序列)。

8)将片段2与载体骨架2连接，得到重组质粒pFGC5941-IbC3H18。

根据测序结果，对重组质粒pFGC5941-IbC3H18进行结构描述如下：将载体pFGC5941的限制性内切酶BamHI和XbaI识别序列间的小片段替换为序列5，将限制性内切酶XhoI和SwaI识别序列间的小片段替换为序列表中序列5的反向互补序列。

二、重组农杆菌的获得和甘薯转基因植株的再生

A、甘薯转基因阳性植株的再生

1)将重组质粒pCB-IbC3H18转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pCB-IbC3H18。

2)剥取长约0.5mm的栗子香的茎尖分生组织，置于胚性愈伤组织诱导固体培养基(含2.0mg/L 2，4-D，3.0％蔗糖的MS固体培养基，又称MS+2.0mg/L 2，4-D+3.0％蔗糖固体培养基)上，27±1℃培养8周，得到胚性愈伤组织，然后将胚性愈伤组织置于胚性愈伤组织诱导液体培养基(含2.0mg/L 2，4-D和3.0％蔗糖的MS液体培养基，又称MS+2.0mg/L 2，4-D+3.0％蔗糖液体培养基)中，水平摇床上振荡光暗交替培养3d(具体条件为：100r/min；27℃；光暗交替培养的周期为：每天光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)，得到直径为0.7-1.3mm的胚性细胞团。

3)完成步骤2后，采用农杆菌介导的方法将EHA105/pCAMBIA1300-IbC3H18转化胚性细胞团，然后置于共培养基(含30mg/L AS、2.0mg/L 2，4-D的MS固体培养基，又称MS+2.0mg/L 2，4-D+30mg/L AS固体培养基)上，28℃暗培养3d。

4)完成步骤3后，将胚性细胞团用含900mg/L头孢噻肟钠(cefotaxime sodium，CS)和2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基(又称MS+900mg/L CS+2.0mg/L 2,4-D)洗涤2次，然后置于选择培养基(含2.0mg/L 2,4-D、300mg/L CS和0.5mg/L草铵膦(phosphinothricin，PPT)的固体MS培养基)上，27±1℃暗培养10-12周(每2周需更换一次选择培养基)。

5)完成步骤4后，将胚性细胞团置于体细胞胚诱导培养基(含有1.0mg/L ABA、300mg/L CS和0.5mg/L PPT的MS固体培养基)上，27±1℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)2-4周，得到抗性愈伤组织。

6)完成步骤5后，将抗性愈伤组织置于MS固体培养基上，27±1℃光暗交替培养(光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)4-8周，即获得25株甘薯拟转基因植株，依次命名IbC3H18-OE1至IbC3H18-OE326。

7)分别提取步骤6获得的甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以35S-F：5′-GAGGCTTACGCAGCAGGTC-3′和IbC3H18-T-R：5′-CCTAAAGGAAGGGTCTGAAATG-3′为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有1220bp的条带，则相应的甘薯拟转基因植株即为甘薯转基因阳性植株。用等体积水代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为空白对照(W)。用甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶片的基因组DNA代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阴性对照(WT)。用重组质粒pCB-IbC3H18代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的IbC3H18基因组DNA，进行PCR扩增，作为阳性对照。

实验结果见图1，M为DNA分子Marker，W为空白对照，P为阳性对照，WT为阴性对照，L代表line。结果表明，编号为L161至L326的植株均为甘薯转基因阳性植株。

B、甘薯RNAi阳性植株的再生

1)将重组质粒pFGC5941-IbC3H18转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌乙，将重组农杆菌乙命名为EHA105/pFGC5941-IbC3H18。

2)按照步骤A中2)至6)方法，将EHA105/pCB-IbC3H18替换为EHA105/pFGC5941-IbC3H18，其它步骤均不变，获得甘薯拟RNAi植株。

3)分别提取步骤2获得的甘薯拟RNAi植株的幼嫩叶片的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，LR即RNAi line，以int-F:5′-CAACCACAAAAGTATCTATGAGCCT-3′(对应于pFGC5941质粒CHSA intron片段)和int-R:5′-TTCACATGTCAGAAACATTCTGATG-3′(对应于pFGC5941质粒CHSA intron片段)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有888bp的条带，则相应的甘薯拟RNAi植株即为甘薯RNAi阳性植株。实验结果见图2，M为DNA分子Marker，W为空白对照，P为阳性对照，WT为阴性对照，L代表line。结果表明编号为LR-1和LR-36的植株均为甘薯RNAi阳性植株。

采用无性繁殖的方法扩繁甘薯转基因阳性植株和甘薯RNAi阳性植株，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系。

三、RT-qPCR

分别提取甘薯转基因阳性植株、甘薯RNAi阳性植株的总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以野生型甘薯(栗子香)植株为对照。利用组成性表达的甘薯肌动蛋白(Actin)基因为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用IbC3H18基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CTmethod.Methods.25:402-408)分析IbC3H18基因的表达情况，每组样品重复3次。

甘薯肌动蛋白(Actin)基因的特异引物序列为：

IbActin-F：5′-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3′

IbActin-R：5′-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3′

IbC3H18特异引物序列为：

IbC3H18-Q-F：5′-AAGCCTGCCATTATTTCAGCAAA-3′，

IbC3H18-Q-R：5′-AACGCATTAGAGCCATACATCCC-3′。

过表达和RNAi的检测结果如图3所示，结果表明甘薯转基因阳性植株OE161、OE326表达较WT显著上调，甘薯RNAi阳性植株Ri-1、Ri-36表达较WT显著下调。将甘薯转基因阳性植株OE161、OE326进行组织培养(无性繁殖)扩繁，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系，得到IbC3H18过表达转基因株系L161、L326；将甘薯RNAi阳性植株Ri-1、Ri-36进行组织培养(无性繁殖)扩繁，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系，得到IbC3H18弱表达转基因株系(简称RNAi株系)Ri-1或Ri-36，进行后续抗病性试验。

四、抗病性鉴定

1.蔓割病抗性鉴定

1)孢子法蔓割病抗性鉴定

待测甘薯株系为甘薯品种栗子香的野生型(WT)、IbC3H18过表达转基因株系L161、L326、RNAi株系Ri-1或Ri-36。

实验重复三次，每个株系每次种植3株，每次重复的步骤如下：

a、将甘薯蔓割病菌接种于PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，高压灭菌)，28℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：每天光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)3d，然后28℃暗培养7d，得到菌丝。

b、完成步骤a后，将菌丝转移至三角瓶，加入100mL无菌蒸馏水，100r/min振荡30min，然后用双层无菌纱布过滤，用血球计数板在显微镜下计数，得到甘薯蔓割病菌孢子含量为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液。

c、将长势基本一致的待测甘薯植株的幼苗剪口，对齐后置于孢子悬浮液中30min，然后种植于装有无菌沙土的盆池中(每个盆池种植3株)，然后正常培养。分别于种植的第0d、种植的第3d、种植的第5d、种植的第7d、种植的第9d观察甘薯植株的生长状态。

甘薯植株在盆池的部分生长状态见图4(0dpi为种植的第0d，3dpi为种植的第3d，5dpi为种植的第5d，7dpi为种植的第7d，9dpi为种植的第9d)。实验结果如下：与对照WT相比，Ri-1和Ri-36植株的叶片枯萎脱落，茎段褐化，整株死亡；而过表达L-161和L-326的部分叶片变黄，植株仍能正常生长。与对照WT相比，过表达植株茎段的褐化长度显著变短，而RNAi植株茎段的褐化长度显著增加。

因此，在甘薯中过表达IbC3H18基因可提高甘薯的蔓割病抗性，干涉IbC3H18基因则可降低甘薯的蔓割病抗性。

2)菌片法蔓割病抗性鉴定

实验重复三次，每个株系每次种植18株，每次重复的步骤如下：

1)取驯化于温室中的转基因植株和野生型植株的茎段，茎段为长约10cm、带有5片左右展开叶片的薯蔓，移栽于盆池中，蛭石和营养土按照1：1比例混匀，用喷壶浇透水。

(2)在薯蔓基部用消毒刀片制造1cm长的伤口。

(3)从已活化菌种的PDA平板(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，高压灭菌)菌落边缘用打孔器打孔(直径0.5cm)，挑取相应的菌片贴到伤口处，每株一个菌片的接种量。

(4)在菌片外加一保湿棉球，用封口膜缠住。观察植株的生长情况并记录，甘薯植株的部分生长状态见图5。实验结果如下：相较于WT，Ri-1和Ri-36植株的茎段褐化严重，植株死亡；而过表达L-161和L-326的茎段褐化程度显著降低，植株仍能正常生长。

2、软腐病抗性鉴定

待测株系为甘薯品种栗子香的野生型植株(WT)、IbC3H18过表达转基因株系L161、L326、RNAi的株系Ri-1或Ri-36。

实验重复三次，每个株系每次接种20块，每次重复的步骤如下：

a、将甘薯软腐病菌接种于PDA培养基，28℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：每天光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)3d待菌落长满2/3皿，然后28℃暗培养7d，促使分生孢子产生，得到菌丝。

b、将步骤a的菌丝转移至500mL三角瓶，加入100mL无菌蒸馏水，100r/min振荡30min，然后用双层无菌纱布过滤，用血球计数板在显微镜下计数，得到甘薯软腐病菌孢子含量为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液。

c、取每个株系20个植株。利用打孔器在薯块打直径为1cm小孔，用消毒打孔器在块根表面打孔深入薯块内部，并将1mL软腐病病菌孢子悬浮液接种到孔中，用打孔下来的薯块柱、消毒棉球、石蜡和封口膜将打孔封住，保证不漏菌液。

d、28℃恒温培养4周后观察薯块的发病情况，计算腐烂重量(未腐烂始重-未腐烂终重)，并用Image J软件分析薯块的相对腐烂面积。

甘薯薯块接种软腐病后发病情况见图6，WT的薯块上菌丝明显扩张至薯块中间部位；而过表达株系的薯块则只在接种区附近有菌丝，软腐病蔓延得到有效的控制，RNAi薯块染病严重，菌丝几乎蔓延至整个切面，整个薯块几乎呈腐烂状态。因此，在甘薯中过表达IbC3H18基因可提高甘薯的软腐病抗性，干涉IbC3H18基因则可降低甘薯的蔓割病抗性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 抗蔓割病和软腐病相关蛋白IbC3H18或调控其表达的物质的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1698

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas ）

<400> 1

atggataaat ttgatgcagt gaaaaaagtg catgagagaa tcttgaaatt ggaaccagaa 60

agtgtaacaa tgaagattat agggtatatg tacttgaggg actatcctga ccaggaaatt 120

attaggttgg ctatggggcc tgatactttg atctatgaac tgatacacaa ggcaaaaatt 180

gcacttaaac tcccctcaac ctcatgtctt tcgcccccga tttcgccttc tatgaaccaa 240

gtccccattt cagacccttc ctttaggcta ccctctatcg cgcccccatt ggcacgcccc 300

ttcccatccc cggcttcgtt tcgtgtcaca gctccttttt gggagccccc ggtgcctgag 360

cagcagcagc agatagttta caattctgag ttttcgcatt tgcccttttc tgattcgccc 420

cacgatgatt atggacccca caagcagcag cagcagccgc agctcgtgcc attcgaggaa 480

tcgagtgatt ttgtttaccc ggagcccggc tttagtgtga gggggcgcag gaattctccg 540

gctgttattg aatttccacc caaagcctgt cattatttca gcaaagggtt ctgcaagcat 600

ggcagtaact gtaggtattt acatggacac cccttcccgg acaactatcc ccgggggata 660

tatggctcta atgcgttcga taatggtaat gatgatcaag ttttctcccc cgggtccctc 720

gagaaattag agctcgagat aacggagctc ttgaaatcca ggagaggcag cccggtctca 780

attgcgtctc tgcctatgat gtactacgag aaatatggaa gaacccttca ggccgaaggg 840

tacctaactg agagccagag acatggtaaa gctggctata atttgactaa acttcttgct 900

cggttgaaga acagtattcg tttgattgac aggcctcacg ggcagcattc tgtaatactg 960

gctgaagatg cgtccaagta cattgaattc cggggtgaaa gaaacgatcc cggtcctatt 1020

gtcagtggct ctcgccaaat atatttaact ttcccggctg agagcacttt tacggaggaa 1080

gatgtctcca attacttcaa tgccttcggg cctgttcagg atgtgagaat tccttgccag 1140

cagaaacgga tgtttggctt tgttactttt gcgagttctg atactgtgaa gacggttttg 1200

cacaagggaa acccgcattt tgtgtgtggg gctcgtgttc ttgtgaaacc atatagagaa 1260

aagtcaaagc ctattgaaag gaaatttcaa gacaaaattg atccatcaat gaattacagc 1320

tctcacaacg attttgaatc tgagaatcaa tcaagattgg attccaaatt tctaaggaga 1380

ttcgaggaac aacacgctct tgaactcgag ataaggcaac tctcgcagct tcagttagcc 1440

cgaaagcctc tgttgtctaa tcattccttc tttggccatt ccatggacga gctgaaaatg 1500

tctgaagagt attccaagct cacgtctgca gatgatttct accagttgga tggtccaagt 1560

ggcggctcct caagtgatga taataaccaa atacattcag gcacaaaata ccatgatcac 1620

gacagcaatt caggaattaa tctcccggac agcccctttg cgtctgcatt accgaccagc 1680

atctccgcag ttatgtag 1698

<210> 2

<211> 565

<212> PRT

<213> 甘薯（Ipomoea batatas ）

<400> 2

Met Asp Lys Phe Asp Ala Val Lys Lys Val His Glu Arg Ile Leu Lys

1 5 10 15

Leu Glu Pro Glu Ser Val Thr Met Lys Ile Ile Gly Tyr Met Tyr Leu

20 25 30

Arg Asp Tyr Pro Asp Gln Glu Ile Ile Arg Leu Ala Met Gly Pro Asp

35 40 45

Thr Leu Ile Tyr Glu Leu Ile His Lys Ala Lys Ile Ala Leu Lys Leu

50 55 60

Pro Ser Thr Ser Cys Leu Ser Pro Pro Ile Ser Pro Ser Met Asn Gln

65 70 75 80

Val Pro Ile Ser Asp Pro Ser Phe Arg Leu Pro Ser Ile Ala Pro Pro

85 90 95

Leu Ala Arg Pro Phe Pro Ser Pro Ala Ser Phe Arg Val Thr Ala Pro

100 105 110

Phe Trp Glu Pro Pro Val Pro Glu Gln Gln Gln Gln Ile Val Tyr Asn

115 120 125

Ser Glu Phe Ser His Leu Pro Phe Ser Asp Ser Pro His Asp Asp Tyr

130 135 140

Gly Pro His Lys Gln Gln Gln Gln Pro Gln Leu Val Pro Phe Glu Glu

145 150 155 160

Ser Ser Asp Phe Val Tyr Pro Glu Pro Gly Phe Ser Val Arg Gly Arg

165 170 175

Arg Asn Ser Pro Ala Val Ile Glu Phe Pro Pro Lys Ala Cys His Tyr

180 185 190

Phe Ser Lys Gly Phe Cys Lys His Gly Ser Asn Cys Arg Tyr Leu His

195 200 205

Gly His Pro Phe Pro Asp Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Ser Asn

210 215 220

Ala Phe Asp Asn Gly Asn Asp Asp Gln Val Phe Ser Pro Gly Ser Leu

225 230 235 240

Glu Lys Leu Glu Leu Glu Ile Thr Glu Leu Leu Lys Ser Arg Arg Gly

245 250 255

Ser Pro Val Ser Ile Ala Ser Leu Pro Met Met Tyr Tyr Glu Lys Tyr

260 265 270

Gly Arg Thr Leu Gln Ala Glu Gly Tyr Leu Thr Glu Ser Gln Arg His

275 280 285

Gly Lys Ala Gly Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ala Arg Leu Lys Asn

290 295 300

Ser Ile Arg Leu Ile Asp Arg Pro His Gly Gln His Ser Val Ile Leu

305 310 315 320

Ala Glu Asp Ala Ser Lys Tyr Ile Glu Phe Arg Gly Glu Arg Asn Asp

325 330 335

Pro Gly Pro Ile Val Ser Gly Ser Arg Gln Ile Tyr Leu Thr Phe Pro

340 345 350

Ala Glu Ser Thr Phe Thr Glu Glu Asp Val Ser Asn Tyr Phe Asn Ala

355 360 365

Phe Gly Pro Val Gln Asp Val Arg Ile Pro Cys Gln Gln Lys Arg Met

370 375 380

Phe Gly Phe Val Thr Phe Ala Ser Ser Asp Thr Val Lys Thr Val Leu

385 390 395 400

His Lys Gly Asn Pro His Phe Val Cys Gly Ala Arg Val Leu Val Lys

405 410 415

Pro Tyr Arg Glu Lys Ser Lys Pro Ile Glu Arg Lys Phe Gln Asp Lys

420 425 430

Ile Asp Pro Ser Met Asn Tyr Ser Ser His Asn Asp Phe Glu Ser Glu

435 440 445

Asn Gln Ser Arg Leu Asp Ser Lys Phe Leu Arg Arg Phe Glu Glu Gln

450 455 460

His Ala Leu Glu Leu Glu Ile Arg Gln Leu Ser Gln Leu Gln Leu Ala

465 470 475 480

Arg Lys Pro Leu Leu Ser Asn His Ser Phe Phe Gly His Ser Met Asp

485 490 495

Glu Leu Lys Met Ser Glu Glu Tyr Ser Lys Leu Thr Ser Ala Asp Asp

500 505 510

Phe Tyr Gln Leu Asp Gly Pro Ser Gly Gly Ser Ser Ser Asp Asp Asn

515 520 525

Asn Gln Ile His Ser Gly Thr Lys Tyr His Asp His Asp Ser Asn Ser

530 535 540

Gly Ile Asn Leu Pro Asp Ser Pro Phe Ala Ser Ala Leu Pro Thr Ser

545 550 555 560

Ile Ser Ala Val Met

565

<210> 3

<211> 2814

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60

cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120

ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180

aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240

acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300

aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360

aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420

tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480

gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540

cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600

atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780

cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga 840

ctctagaatg gataaatttg atgcagtgaa aaaagtgcat gagagaatct tgaaattgga 900

accagaaagt gtaacaatga agattatagg gtatatgtac ttgagggact atcctgacca 960

ggaaattatt aggttggcta tggggcctga tactttgatc tatgaactga tacacaaggc 1020

aaaaattgca cttaaactcc cctcaacctc atgtctttcg cccccgattt cgccttctat 1080

gaaccaagtc cccatttcag acccttcctt taggctaccc tctatcgcgc ccccattggc 1140

acgccccttc ccatccccgg cttcgtttcg tgtcacagct cctttttggg agcccccggt 1200

gcctgagcag cagcagcaga tagtttacaa ttctgagttt tcgcatttgc ccttttctga 1260

ttcgccccac gatgattatg gaccccacaa gcagcagcag cagccgcagc tcgtgccatt 1320

cgaggaatcg agtgattttg tttacccgga gcccggcttt agtgtgaggg ggcgcaggaa 1380

ttctccggct gttattgaat ttccacccaa agcctgtcat tatttcagca aagggttctg 1440

caagcatggc agtaactgta ggtatttaca tggacacccc ttcccggaca actatccccg 1500

ggggatatat ggctctaatg cgttcgataa tggtaatgat gatcaagttt tctcccccgg 1560

gtccctcgag aaattagagc tcgagataac ggagctcttg aaatccagga gaggcagccc 1620

ggtctcaatt gcgtctctgc ctatgatgta ctacgagaaa tatggaagaa cccttcaggc 1680

cgaagggtac ctaactgaga gccagagaca tggtaaagct ggctataatt tgactaaact 1740

tcttgctcgg ttgaagaaca gtattcgttt gattgacagg cctcacgggc agcattctgt 1800

aatactggct gaagatgcgt ccaagtacat tgaattccgg ggtgaaagaa acgatcccgg 1860

tcctattgtc agtggctctc gccaaatata tttaactttc ccggctgaga gcacttttac 1920

ggaggaagat gtctccaatt acttcaatgc cttcgggcct gttcaggatg tgagaattcc 1980

ttgccagcag aaacggatgt ttggctttgt tacttttgcg agttctgata ctgtgaagac 2040

ggttttgcac aagggaaacc cgcattttgt gtgtggggct cgtgttcttg tgaaaccata 2100

tagagaaaag tcaaagccta ttgaaaggaa atttcaagac aaaattgatc catcaatgaa 2160

ttacagctct cacaacgatt ttgaatctga gaatcaatca agattggatt ccaaatttct 2220

aaggagattc gaggaacaac acgctcttga actcgagata aggcaactct cgcagcttca 2280

gttagcccga aagcctctgt tgtctaatca ttccttcttt ggccattcca tggacgagct 2340

gaaaatgtct gaagagtatt ccaagctcac gtctgcagat gatttctacc agttggatgg 2400

tccaagtggc ggctcctcaa gtgatgataa taaccaaata cattcaggca caaaatacca 2460

tgatcacgac agcaattcag gaattaatct cccggacagc ccctttgcgt ctgcattacc 2520

gaccagcatc tccgcagtta tgtaggagct cgaatttccc cgatcgttca aacatttggc 2580

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 2640

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 2700

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 2760

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatc 2814

<210> 4

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgccttcggg cctgttcagg atgtgagaat tccttgccag cagaaacgga tgtttggctt 60

tgttactttt gcgagttctg atactgtgaa gacggttttg cacaagggaa acccgcattt 120

tgtgtgtggg gctcgtgttc ttgtgaaacc atatagagaa aagtcaaagc ctattgaaag 180

gaaatttcaa gacaaaattg atccatcaat gaattacagc tctcacaacg attttgaatc 240

tgagaatcaa tcaagattgg attccaaatt tctaaggag 279

<210> 5

<211> 445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccaaatgac acataacaag tcgtttcgtc cgataggtaa gactagttga aaaggcagcc 60

atctgatctt acgtttgaca caagatacag aactattttc cctgtgaagt tctcggtttg 120

cgagttttag agattgattt caccccctgc aaagtacata cggctaaaga agaatgtgag 180

gcttatcttc ccgcctttta cctgggcgag aagaatacat aggaaagaac atggtaacag 240

aaaggttttt ttttcttaga cagcataaaa aaaggatgtc ttttgttttt ctttcaaaaa 300

aaaaaaagaa tctttagaga tgaatgtaca gggtagtgat gaaagaaagt agtggttaca 360

tattatggca atggttcaga gactaatata tctctgtaac accgaaaaat caaggtttag 420

cgctgaataa cttaacatga atggt 445

Claims

1.应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育抗病性改变的植物中的应用；

4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育抗病性改变的植物的产品中的应用；

5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗病性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；所述基因编码权利要求1所述的蛋白质；

所述基因编码所述蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于甘薯。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子，

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒，

B4)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体，

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物，

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系，

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织，

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官；

C1)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子，

C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因，

C3)含有C2)所述编码基因的表达盒，

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为编码链的编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子。

5.一种提高植物抗病性的方法，其特征在于：所述方法包括步骤M，所述步骤M为增强、提高或上调目的植物中权利要求1或2中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调权利要求1或2中所述蛋白的编码基因的表达量，来提高植物抗病性。

6.一种降低植物抗病性的方法，其特征在于：所述方法包括步骤P，所述步骤P为抑制或降低或沉默目的植物中权利要求1或2中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白的编码基因的表达量，来降低植物抗病性。

7.一种培育抗病性植物的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建包含权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；

(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或甘薯)中，获得抗病性高于所述受体植物的抗病性植物。

8.一种培育感病性植物的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建包含抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子的重组表达载体；

(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或甘薯)中，获得抗病性弱于所述受体植物的感病性植物。

9.如权利要求1-4中任一权利要求所述的应用，权利要求3或4的生物材料，和/或，权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述抗病性为抗蔓割病和/或抗软腐病。

10.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的应用，或，权利要求5-8中任一所述的方法、权利要求9或所述的应用或方法，其特征在于：所述植物是如下任一种：

C1)双子叶植物或单子叶植物；

C2)管状花目植物，

C3)旋花科植物，

C4)番薯属植物，

C5)甘薯。