BR122018015957B1 - composição que não ocorre naturalmente e seu método de produção, caldo de fermentação, método de converter biomassa em açúcares e microrganismo transgênico - Google Patents

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Bradley R. Kelemen
Suzanne E. Lantz
Edmund A. Larenas
Colin Mitchinson
Steven Kim
William D. Hitz
Mark Emptage
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Abstract

A presente invenção refere-se a enzimas de glicosil hidrolase, composições compreendendo tais enzimas, e métodos de uso das enzimas e composições, por exemplo, para a sacarificação de materiais celulósicos e hemicelulósicos em açúcares.

Description

1. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade para os Pedidos Provisórios dos Estados Unidos 61/245.273, depositado em 23 de setembro de 2009, e 61/289.886, depositado em 23 de dezembro de 2009, as descrições dos quais são incorporadas aqui por referência.
2. CAMPO TÉCNICO
[0002] A presente invenção geralmente relativa a enzimas de glicosil hidrolase, composições compreendendo tais enzimas, e métodos de uso das enzimas e composições, por exemplo, para a sacarificação ou conversão de materiais celulósicos e hemicelulósicos em açúcares.
3. ANTECEDENTES
[0003] Bioconversão de biomassa lignocelulósica renovável em um açúcar fermentável que é subsequentemente fermentado para produzir álcool (por exemplo, etanol) como uma alternativa para combustíveis líquidos tem atraído a atenção intensiva de pesquisadores desde o ano de 1970, quando a crise de óleo ocorreu por que OPEC diminuiu a produção de petróleo (Bungay, H. R., "Energy: a biomassa options". NY: Wiley; 1981; Olsson L, Hahn-Hagerdal B. Enzima Microb Technol 1996,18:312-31; Zaldivar, J e outro, Appl Microbiol Biotechnol 2001, 56: 17-34; Galbe, M e outro, Appl Microbiol Biotechnol 2002, 59:618-28). Etanol foi amplamente usado como uma mistura a 10% à gasolina nos Estados Unidos ou como um combustível puro para para veículos no Brasil nas últimas duas décadas. A importância de combustível bioetanol aumentará em paralelo com preços em alta repentina para óleo e gradual esgotamento de suas fontes. Adicionalmente, açúcares fermentáveis são cada vez mais usados para produzir plásticos, polímeros e outros produtos biobaseados, e espera-se que esta indústria expanda-se substancialmente nos anos vindouros. Desse modo, a demanda para abundantes açúcares fermentáveis de baixo custo, que podem ser usados como uma carga de alimentação em lugar de cargas de alimentação com base em petróleo, continua a crescer.
[0004] Principalmente entre as cargas de alimentação renováveis úteis estão a celulose e hemicelulose (xilanas), que podem ser convertidas em açúcares fermentáveis. A conversão enzimática destes polissacarídeos em açúcares solúveis, por exemplo, glicose, xilose, arabinose, galactose, manose, e/ou outras hexoses e pentoses, ocorre devido a ações combinadas de várias enzimas. Por exemplo, endo-1,4- β-glucanases (EG) e exo-celobioidrolases (CBH) catalisam a hidrólise de celulose insolúvel em celooligossacarídeos (por exemplo, com celobiose sendo um produto principal),enquanto que as β-glucosidases (BGL) catalizam a conversão dos oligossacarídeos em glicose. Xilanases juntamente com outras proteínas auxiliares (exemplos não limitantes das quais incluem L-α-arabinofuranosidases, feruloíla e acetilxilano esterases, glucuronidases, e β-xilosidases) catalisam a hidrólise de hemiceluloses.
[0005] As paredes celulares de plantas são compostas de uma mistura heterogênea de polissacarídeos complexos que interagem por meio de métodos covalentes e não covalentes. Polissacarídeos complexos de paredes celulares de planta maior incluem, por exemplo, celulose (β-1,4 glucano), que geralmente constitui 35 a 50% de carbono encontrado em componentes da parede celular. Polímeros de celulose auto-associam-se por meio de ligação de hidrogênio, interações van der Waals e interações hidrofóbicas para formar microfibrilas de celulose semicristalina. Estas microfibrilas também incluem regiões não cristalinas, geralmente conhecidas como celulose amorfa. As microfibrilas de celulose são implantadas em uma matriz formada de hemiceluloses (incluindo, por exemplo, xilanas, arabinanas, e mananas), pectinas (por exemplo, galacturonanas e galactanas), e várias outras β-1,3 e β-1,4 glucanas. Estes polímeros matrizes são frequentemente substituídos por, por exemplo, resíduos de arabinose, galactose e/ou xilose para produzir altamente complexas arabinoxilanas, arabinogalactanas, galactomananas, e xiloglucanas. A matriz de hemicelulose é, por sua vez, circundada por lignina polifenólica.
[0006] A complexidade da matriz torna-a difícil de degradar-se por microorganismos visto que componentes de lignina e hemicelulose devem ser rompidos antes que as enzimas possam agir sobre as microfibrilas de celulose de núcleo. Usualmente, uma associação de diferentes atividade enzimáticas é requerida para romper os polímeros da parede celular para liberar os monossacarídeos constituintes. Para sacarificação de paredes de células de planta, a lignina deve ser permeabilizada e a hemicelulose rompida para permitir enzimas de degradação de celulose agirem sobre seu substrato.
[0007] Independente do tipo de carga de alimentação celulósica, o custo e eficiência hidrolítica de enzimas são os fatores principais que resfringem a comercialização de processos de bioconversão de biomassa. Os custos de produção de enzimas microbialmente produzidas são firmemente ligados com a produtividade da cepa de produção de enzima e o campo de atividade final no caldo de fermentação. A eficiência hidrolítica de um complexo de multienzima depende tanto das propriedades de enzimas individuais, da sinergia entre elas, quanto da relação na mistura de multienzima.
[0008] Neste contexto, existe uma necessidade na técnica de identificar misturas/composições de enzima e/ou enzimáticas que são capazes de converter materiais de planta e/ou outros celulósicos ou hemicelulósicos em açúcares fermentáveis com eficácia e campo melhorados.
4. SUMÁRIO
[0009] A descrição fornece certos peptídeos de glicosil hidrolase tendo atividade hemicelulolítica, incluindo, por exemplo, Xilanases (por exemplo, endoXilanases), xilosidases (por exemplo,β-xilosidases), arabinofuranosidases (por exemplo,L-α-arabinofuranosidases), ácidos nucléicos codificando estes polipeptídeos, e métodos para a preparação e o uso dos polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos. A descrição é baseada, em parte, na descoberta de novas enzimas e variantes tendo atividades de Xilanase, β-xilosidase, e/ou L-α-arabinofuranosidase. A invenção é também baseada na identificação de misturas (ou composições) de enzima que eficientemente catalisam a hidrólise de materiais celulósicos e hemicelulósicos. Para o propósito desta invenção, uma enzima pode ser definida ou como um polipeptídeo tendo a atividade enzimática particular ou como aquela enzima. Por exemplo, uma Xilanase pode ser referida como um polipeptídeo tendo atividade de xilanase ou como uma enzima Xilanase, e uma β-xilosidase pode ser referida como ou um polipeptídeo tendo atividade de β-xilosidase ou uma β-xilosidase.
[00010] As enzimas e/ou misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para produzir açúcares de biomassa. Os açúcares desse modo produzidos podem ser usados por microorganismos para produção de etanol ou podem ser usados para produzir outros bioprodutos em várias aplicações industriais. Portanto, a invenção também fornece aplicações industriais (por exemplo, processos de sacarificação em produção de etanol) usando as enzimas e/ou misturas/composições de enzima descritas aqui. As enzimas e/ou misturas/composições de enzima da presente invenção podem ser usadas para diminuir os custos da enzima em produção de biocombustível.
[00011] Em um aspecto, a invenção da descrição pertence a enzimas (incluindo variantes das mesmas), ou misturas/composições de enzima que são úteis para hidrolisar os principais componentes de uma biomassa lignocelulósica (incluindo, por exemplo, celulose, hemicelulose, e lignina) ou qualquer material compreendendo celulose e/ou hemicelulose. Tal biomassa lignocelulósica e/ou material compreendendo celulose e/ou hemicelulose incluem, por exemplo, sementes, grãos, tubérculos, resíduos de planta ou subprodutos de processamento de alimento ou processamento industrial (por exemplo, caules), milho (incluindo, por exemplo, sabugos, palha, e similares), grama (por exemplo, grama indiana, tal como Sorghastrum nutans; ou, switchgrass, por exemplo, espécies Panicum, tal como Panicum virgatum), madeira (incluindo, por exemplo, lascas de madeira, resíduos de processamento), papel, polpa, papel reciclado (por exemplo, jornal).
[00012] As misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para hidrolisar celulose compreendendo uma cadeia linear de porções de glicose β-1,4-ligadas, ou hemicelulose, de uma estrutura complexa que varia de planta para planta.
[00013] As misturas/composições de enzima da invenção podem compreender diversas diferentes enzimas, incluindo, por exemplo, celulases e/ou hemicelulases. Por exemplo, as misturas/composições de enzimas da invenção podem ser usadas para hidrolisar biomassa ou uma carga de alimentação adequada. As misturas/composições de enzima da invenção desejavelmente compreendem misturas de enzimas, selecionadas de, por exemplo, Xilanases, xilosidases, celobioidrolases, arabinofuranosidases, e/ou outras enzimas que podem digerir hemicelulose em açúcares monômeros. Uma mistura/composição de enzima da invenção pode compreender uma mistura de dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais enzimas selecionadas de uma ou mais Xilanases, uma ou mais xilosidases, uma ou mais celobioidrolases, uma ou mais arabinofuranosidases, e uma ou mais outras enzimas que são capazes de converter hemiceluose em açúcares monômeros. As outras enzimas que podem digerir hemicelulose em açúcares monoméricos incluem, sem limitação, a celulase, a hemicelulase, ou uma composição compreendendo uma celulase ou uma hemicelulase. Uma mistura/composição de enzima da invenção pode compreender uma mistura de dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais enzimas selecionadas de uma Xilanase, uma xilosidase, uma celobioidrolase, um arabinofuranosidase, e pelo menos uma outra enzima capaz de converter hemicelulose em açúcares monômeros. Um exemplo não limitante de uma mistura/composição de enzima da invenção compreende uma mistura de uma Xilanase, uma xilosidase, uma celobioidrolase, uma arabinofuranosidase, e uma betaglucosidase. A mistura/composição de enzima da invenção é adequadamente aquela que é que não ocorre naturalmente.
[00014] Como usado aqui, o termo "composição de ocorrência natural" refere-se a uma composição produzida por uma fonte de ocorrência natural, que compreende um ou mais atividades ou componentes enzimáticos, em que cada destes componentes ou atividades é encontrado na relação e nível produzido pela fonte de ocorrência natural como ele é encontrado na natureza, não tocado e não modificado pela mão humana. Consequentemente, a composição de ocorrência natural é, por exemplo, aquela que é produzida por um organismo não modificado com respeito às enzimas celulolíticas ou hemicelulolíticas de modo que a relação ou níveis das enzimas do componente não sejam alterados daqueles produzidos pelo organismo nativo em seu ambiente nativo. Uma "composição que não ocorre naturalmente," por outro lado, refere-se a uma composição produzida por: (1) combinação de enzimas celulolíticas ou hemicelulolíticas do componente ou em uma relação de ocorrência natural ou uma relação que não ocorre naturalmente, isto é, alterada; ou (2) modificação de um organismo para expressar, superexpressar ou subexpressar uma ou mais enzimas endógenas ou exógenas; ou (3) modificação de um organismo de modo que pelo menos um enzima endógena seja deletada. Uma "composição que não ocorre naturalmente" pode também referir-se a uma composição produzida por um organismo de ocorrência natural e não modificado, porém cultivado em um meio preparado pelo homem ou ambiente que é diferente do ambiente nativo do organismo, de modo que as quantidades ou relações de peso de enzimas particulares na composição difiram daquelas existentes em uma composição feita por um organismo nativo desenvolvido em seu ambiente nativo.
[00015] A mistura/composição de enzima da invenção descrita aqui é, por exemplo, um caldo de fermentação. O caldo de fermentação pode ser aquele de um fungo filamentoso, incluindo, por exemplo, a Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Um fungo exemplar de Trichoderma spp. é um Trichoderma reesei. Um fungo exemplar de Penicillium spp. é um Penicillium funiculosum. O caldo de fermentação pode ser, por exemplo, um caldo de fermentação livre de célula ou um caldo de célula total.
[00016] A mistura/composição de enzima da invenção descrita aqui é, em outro exemplo, uma composição de celulase. Uma composição de celulase é uma composição de celulase fúngica filamentosa, incluindo, por exemplo, uma Trichoderma, tal como uma composição de celulase, Trichoderma reesei. Uma composição de celulase pode ser produzida por um fungo filamentoso, por exemplo, um Trichoderma, tal  como um Trichoderma reesei.
[00017] Por exemplo, uma mistura/composição de enzima da invenção pode compreender (a) uma ou mais enzima(s) de Xilanase, em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de Xilanase é um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5; (b) uma ou mais enzima(s) de beta- xilosidase, em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de beta-xilosidase é uma beta-xilosidase de Grupo 1 ou uma beta-xilosidase de Grupo 2, em que a beta-xilosidase de Grupo 1 é um Fv3A ou um Fv43A, e a beta-xilosidase de Grupo 2 é um Pf43A, um Fv43D, um Fv39A, um Fv43E, um Fo43A, um Fv43B, a Pa51A, a Gz43A, ou a Trichoderma reesei Bxl1; (c) uma ou mais enzima(s) de L- alfa-arabinofuranosidase, em que pelo menos uma das referidas uma ou mais L-alfa-arabinofuranosidases é um Af43A, um Fv43B, a Pf51A, a Pa51A, ou um Fv51A; (d) um ou mais enzimas de celulase; e opcionalmente (e) um ou mais outros componentes. A mistura/composição de enzima é adequadamente aquela que é que não ocorre naturalmente. A uma ou mais enzima(s) de celulase de (d) é desejavelmente capaz de obter pelo menos fração de 0,00005 de produto por mg de proteína por grama de celulose dilatada de ácido fosfórico (PASC) como determinado por um ensaio de calcoflúor. Em um exemplo não limitante, o peso combinado de enzima(s) de Xilanase na composição pode representar ou constituir 5 %peso a 45 %peso (por exemplo, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 15 % peso, 10 %peso a 15 % peso) do peso de proteína total ou combinado na composição, ao passo que o peso combinado de enzima(s) de beta-xilosidase pode representar ou constituir 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) das proteínas totais na composição, ao passo que o peso combinado de enzima(s) de L-alfa-arabinofuranosidase pode representar ou constituir 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 2 %peso a 20 % peso, 5 %peso a 15 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total ou combinado na composição, ao passo que o peso combinado de enzima(s) de celulase pode representar ou constituir 30 %peso a 80 %peso (por exemplo, 40 %peso a 70 % peso, 50 %peso a 60 % peso) do peso de proteína total ou combinado na composição. A mistura/composição de enzima como descrito aqui é, por exemplo, uma composição de caldo de fermentação. O caldo de fermentação é, por exemplo, aquele de um fungo filamentoso, incluindo, sem limitação, um Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Um fungo exemplar de Trichoderma spp. é um Trichoderma reesei. Um fungo exemplar de Penicillium spp. é um Penicillium funiculosum. A fermentação pode ser, por exemplo, um caldo de fermentação livre de célula ou um caldo de célula total. A mistura/composição de enzima como descrito aqui pode também ser uma composição de celulase, por exemplo, uma composição de celulase fúngica filamentosa. Uma composição de celulase, por exemplo, pode ser produzida por um fungo filamentoso, tal como por um Trichoderma.
[00018] Por exemplo, uma mistura/composição de enzima da invenção pode compreender (a) uma ou mais enzima(s) de Xilanase em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de Xilanase é um Trichoderma reesei Xyn2, a Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5; (b) uma ou ambas as enzimas de beta- xilosidase de Grupo 1: Fv3A e Fv43A; (c) uma ou mais enzima(s) de beta-xilosidase de Grupo 2 selecionadas de Pf43A, um Fv43D, um Fv39A, um Fv43E, um Fo43A, um Fv43B, a Pa51A, a Gz43A, e/ou uma Bxl1 de Trichoderma reesei ; (d) uma ou mais enzima(s) de celulase; e opcionalmente (e) um ou mais outros componentes. A uma ou mais enzima(s) de celulase de (e) é desejavelmente capaz de obter pelo menos fração de 0,00005 de produto por mg de proteína por grama de celulose dilatada de ácido fosfórico (PASC) como determinado por um ensaio de calcoflúor. A mistura/composição de enzima é adequadamente aquela que é que não ocorre naturalmente. Em um exemplo não limitante, o peso combinado de enzima(s) de Xilanase na composição pode representar ou constituir 5 %peso a 45 %peso (por exemplo, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 15 % peso, 10 %peso a 15 % peso) do peso de proteína total ou combinado na composição, ao passo que o peso combinado das enzima(s) de beta-xilosidase de Grupo 1 pode constituir 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total na composição, ao passo que o peso combinado da(s) enzima(s) de beta-xilosidase de Grupo 2 pode constituir 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total na composição, e em que o peso combinado de a enzima(s) de celulase pode representar ou constituir 30 %peso a 80 %peso (por exemplo, 40 %peso a 70 % peso, 50 %peso a 60 % peso) do peso de proteína total ou combinado na composição. A relação do peso de enzimas de beta-xilosidase de Grupo 1 para o peso de enzimas de beta-xilosidase de Grupo 2 pode ser, por exemplo, 1:10 a 10:1 (por exemplo, 1:8 a 8:1, 1:6 a 6:1, 1:4 a 4:1, 1:2 a 2:1, ou 1:1). A mistura/composição de enzima pode também compreender componentes adicionais, que podem ser proteínas auxiliares ou outros componentes de proteína/não proteína. Os componentes adicionais podem constituir, por exemplo, 1 %peso a 50 %peso, 1 %peso a 10 % peso, 2 %peso a 5 % peso, 5 %peso a 10 % peso, ou 5 %peso a 20 %peso do peso total de proteínas na composição. A mistura/composição de enzima como descrito aqui é, por exemplo, uma composição de caldo de fermentação. O caldo de  fermentação é, por exemplo, aquele de um fungo filamentoso, incluindo, sem limitação, um Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Um fungo exemplar de Trichoderma spp. é um Trichoderma reesei. Um fungo exemplar de Penicillium spp. é um Penicillium funiculosum. A fermentação pode ser, por exemplo, um caldo de fermentação livre de célula ou um caldo de célula total. A mistura/composição de enzima como descrito aqui pode também ser uma composição de celulase, por exemplo, a composição de celulase fúngica filamentosa. a composição de celulase, por exemplo, podem ser produzida por um fungo filamentoso, tal como por um Trichoderma.
[00019] Em outros exemplos, uma mistura/composição de enzima da invenção pode compreender (a) uma ou mais enzima(s) de Xilanase em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de Xilanase é um Trichoderma reesei Xyn2, a Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5; (b) uma ou mais enzima(s) de beta-xilosidase em que pelo menos uma das uma ou mais enzima(s) de beta-xilosidase é uma enzima beta-xilosidase de Grupo 1 Fv3A ou Fv43A ou uma enzima beta-xilosidase de Grupo 2 Pf43A, uma Fv43D, uma Fv39A, uma Fv43E, uma Fo43A, uma Fv43B, uma Pa51A, uma Gz43A, e/ou a Trichoderma reesei Bxl1; (c) uma ou mais enzima(s) de L-alfa- arabinofuranosidase, em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de L-alfa-arabinofuranosidase é uma Af43A, uma Fv43B, uma Pf51A, ou uma Fv51A; (d) uma ou mais enzima(s) de betaglucosidase; e opcionalmente (e) um ou mais outros componentes. A mistura/composição de enzima é adequadamente aquela que é que não ocorre naturalmente. Em um exemplo não limitante, o peso combinado de enzima(s) de Xilanase na composição pode representar ou constituir 5 %peso a 45 %peso (por exemplo, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 15 % peso, 10 %peso a 15 % peso) do peso de proteína total ou combinado na composição, ao passo que o peso combinado da(s) enzima(s) de beta-xilosidase pode constituir 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total na composição, ao passo que o peso combinado da(s) enzima(s) de L-alfa-arabinofuranosidase pode constituir 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total na composição, e em que o peso combinado da(s) enzimas de beta-glucosidase pode constituir 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, até50 %peso, 2 %peso a 10 % peso, ou 3 %peso a 8 % peso) do peso de proteína total ou combinado na composição. Uma mistura/composição de enzima pode também compreender componentes adicionais, que podem ser proteínas auxiliares ou outros componentes de proteína/não proteína. Os componentes adicionais podem constituir, por exemplo, 1 %peso a 50 %peso, 1 %peso a 10 % peso, 2 %peso a 5 % peso, 5 %peso a 10 % peso, ou 5 %peso a 20 %peso do peso total de proteínas na composição. A mistura/composição de enzima como descrito aqui é, por exemplo, uma composição de caldo de fermentação. O caldo de fermentação é, por exemplo, aquele de um fungo filamentoso, incluindo, sem limitação, um Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Um fungo exemplar de Trichoderma spp. é um Trichoderma reesei. Um fungo exemplar de Penicillium spp. é um Penicillium funiculosum. A fermentação pode ser, por exemplo, um caldo de fermentação livre de célula ou um caldo de célula total. A mistura/composição de enzima como descrito aqui pode também ser uma composição de celulase, por exemplo, uma composição de celulase fúngica filamentosa. A composição de celulase, por exemplo, podem ser produzida por um  fungo filamentoso, tal como por um Trichoderma.
[00020] Uma mistura/composição de enzima da invenção pode também compreender, por exemplo, (a) uma ou mais enzima(s) de Xilanase em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de Xilanase é um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5; (b) uma ou ambas as enzimas de beta-xilosidase de Grupo 1: Fv3A e Fv43A; (c) uma ou mais enzima(s) de beta-xilosidase de Grupo 2 selecionadas de Pf43A, uma Fv43D, uma Fv39A, uma Fv43E, uma Fo43A, uma Fv43B, uma Pa51A, uma Gz43A, e/ou um Trichoderma reesei Bxl1; e (d) uma ou mais enzima(s) de beta-glucosidase; e opcionalmente (e) um ou mais outros componentes. A mistura/composição de enzima é adequadamente aquela que é que não ocorre naturalmente. Em um exemplo não limitante, o peso combinado de enzima(s) de Xilanase constitui 5 %peso a 45 %peso (por exemplo, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 15 % peso, 10 %peso a 15 % peso) do peso total de proteínas na composição, ao passo que o peso combinado de enzima(s) de beta-xilosidase de Grupo 1 constitui 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso total de proteínas na composição, ao passo que o peso combinado de enzima(s) de beta- xilosidase de Grupo 2 constitui 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso total de proteínas na composição, ao passo que o peso combinado de beta-glucosidase enzima(s) constitui 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso total de proteínas na composição. A relação do peso de enzimas de beta-xilosidase de Grupo 1 para o peso de enzimas de beta-xilosidase de Grupo 2 pode ser, por exemplo, 1:10 a 10:1, por exemplo, 1:8 a 8:1, 1:6 a 6:1, 1:4 a 4:1, 1:2 a 2:1, ou 1:1. Uma mistura/composição de enzima pode também compreender componentes adicionais, que podem ser proteínas auxiliares ou outros componentes de proteína/não proteína. Os componentes adicionais podem constituir, por exemplo, 1 %peso a 50 %peso, 1 %peso a 10 % peso, 2 %peso a 5 % peso, 5 %peso a 10 % peso, ou 5 %peso a 20 %peso do peso total de proteínas na composição. A mistura/composição de enzima como descrito aqui é, por exemplo, uma composição de caldo de fermentação. O caldo de fermentação é, por exemplo, aquele de um fungo filamentoso, incluindo, sem limitação, um Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Um fungo exemplar de Trichoderma spp. é um Trichoderma reesei. Um fungo exemplar de Penicillium spp. é um Penicillium funiculosum. A fermentação pode ser, por exemplo, um caldo de fermentação livre de célula ou um caldo de célula total. A mistura/composição de enzima como descrito aqui pode também ser uma composição de celulase, por exemplo, a composição de celulase fúngica filamentosa. A composição de celulase, por exemplo, podem ser produzida por um fungo filamentoso, tal como por um Trichoderma.
[00021] Além disso, uma mistura/composição de enzima da invenção pode compreender, por exemplo, (a) uma ou mais enzima(s) de Xilanase em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de Xilanase é um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5; (b) uma ou mais enzima(s) de beta- xilosidase em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de beta-xilosidase é uma beta-xilosidase de Grupo 1 ou um beta-xilosidase de Grupo 2, em que beta-xilosidase de Grupo 1 podem ser uma Fv3A ou uma Fv43A, e uma beta-xilosidase de Grupo 2 pode ser uma Pf43A, uma Fv43D, uma Fv39A, uma Fv43E, uma Fo43A, uma Fv43B, uma Pa51A, uma Gz43A, e/ou um Trichoderma reesei Bxl1; e (c) uma ou mais enzima(s) de L-alfa-arabinofuranosidase, em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de L-alfa- arabinofuranosidase é um Af43A, uma Fv43B, uma Pf51A, ou uma Fv51A; e opcionalmente (d) um ou mais outros componentes. A mistura/composição de enzima é adequadamente aquela que é que não ocorre naturalmente. Em um exemplo não limitante, o peso combinado da(s) enzima(s) de Xilanase constitui 5 %peso a 45 %peso (por exemplo, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 15 % peso, 10 %peso a 15 % peso) do peso de proteína total na composição, ao passo que o peso combinado da(s) enzima(s) de beta-xilosidase constitui 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total da composição, ao passo que o peso combinado de enzima(s) de L-alfa-arabinofuranosidase constitui 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total da composição. Uma mistura/composição de enzima pode também compreender componentes adicionais, que podem ser proteínas auxiliares ou outros componentes de proteína/não proteína. Os componentes adicionais podem constituir, por exemplo, 1 %peso a 50 %peso, 1 %peso a 10 % peso, 2 %peso a 5 % peso, 5 %peso a 10 % peso, ou 5 %peso a 20 %peso do peso total de proteínas na composição. A mistura/composição de enzima como descrito aqui é, por exemplo, uma composição de caldo de fermentação. O caldo de fermentação é, por exemplo, aquele de um fungo filamentoso, incluindo, sem limitação, a Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Um fungo exemplar de Trichoderma spp. é um Trichoderma reesei. Um fungo exemplar de Penicillium spp. é um Penicillium funiculosum. A fermentação pode ser, por exemplo, um caldo de fermentação livre de célula ou um caldo de célula total. A mistura/composição de enzima como descrito aqui pode também ser uma composição de celulase, por exemplo, a composição de celulase fúngica filamentosa. a composição de celulase, por exemplo, podem ser produzida por um fungo filamentoso, tal como por um Trichoderma.
[00022] Uma mistura/composição de enzima da invenção pode também be one that compreende (a) uma ou mais enzima(s) de Xilanase em que pelo menos uma das referidas uma ou mais enzima(s) de Xilanase é um Trichoderma reesei Xyn2, a Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5; (b) uma ou ambas as enzimas de beta- xilosidase de Grupo 1: Fv3A e Fv43A; (c) uma ou mais enzima(s) de beta-xilosidase de Grupo 2 selecionadas de Pf43A, um Fv43D, um Fv39A, um Fv43E, um Fo43A, um Fv43B, a Pa51A, a Gz43A, e/ou a Trichoderma reesei Bxl1; e opcionalmente (d) um ou mais outros componentes. A mistura/composição de enzima é adequadamente aquela que é que não ocorre naturalmente. Em um exemplo não limitante, o peso combinado de enzima(s) de Xilanase pode constituir 5 %peso a 45 %peso (por exemplo, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 15 % peso, 10 %peso a 15 % peso) do peso de proteína total na composição, ao passo que o peso combinado de enzima(s) de beta- xilosidase de Grupo 1 podem constituem 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total na composição, ao passo que o peso combinado de enzima(s) de beta-xilosidase de Grupo 2 pode constituir 2 %peso a 50 %peso (por exemplo, 2 %peso a 30 % peso, 5 %peso a 25 % peso, 5 %peso a 10 % peso) do peso de proteína total na composição. A relação do peso de enzimas de beta-xilosidase de Grupo 1 para o peso de enzimas de beta-xilosidase de Grupo 2 pode ser, por exemplo, 1:10 a 10:1, por exemplo, 1:8 a 8:1, 1:6 a 6:1, 1:4 a 4:1, 1:2 a 2:1, ou 1:1. A mistura/composição de enzima pode também compreender componentes adicionais, que podem ser proteínas  auxiliares ou outros componentes de proteína/não proteína. Os componentes adicionais podem constituir, por exemplo, 1 %peso a 50 %peso, 1 %peso a 10 % peso, 2 %peso a 5 % peso, 5 %peso a 10 % peso, ou 5 %peso a 20 %peso do peso total de proteínas na composição. A mistura/composição de enzima como descrito aqui é, por exemplo, uma composição de caldo de fermentação. O caldo de fermentação é, por exemplo, aquele de um fungo filamentoso, incluindo, sem limitação, um Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Um fungo exemplar de Trichoderma spp. é um Trichoderma reesei. Um fungo exemplar de Penicillium spp. é um Penicillium funiculosum. A fermentação pode ser, por exemplo, um caldo de fermentação livre de célula ou um caldo de célula total. A mistura/composição de enzima como descrito aqui pode também ser uma composição de celulase, por exemplo, a composição de celulase fúngica filamentosa. A composição de celulase, por exemplo, pode ser produzida por um fungo filamentoso, tal como por um Trichoderma.
[00023] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas na indústria alimentícia, por exemplo, para fermentação, para processamento de futo e vegetal, em rompimento de resíduos agrícolas, na fabricação de alimentação animal, em produção de polpa e papel, em fabricação de têxtil, ou em agentes de limpeza doméstica e industrial. As enzimas, e as enzimas nas misturas/composições de enzima da invenção são, por exemplo, cada independentemente produzida por um microorganismo, por exemplo, por um fungo ou uma bactéria.
[00024] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem também ser usadas como enzimas ou composições comerciais para digerir lignocelulose de quaisquer fontes adequadas, incluindo todas as fontes biológicas, tal como biomassas de planta, por exemplo, milho, grãos, grama (por exemplo, grama indiana, tal como Sorghastrum nutans; ou, switchgrass, por exemplo, espécies Panicum, tal como Panicum virgatum), ou, madeiras ou subprodutos de processamento de madeira, por exemplo, no processamento de madeira, indústria de polpa e/ou papel, em fabricação de têxtil, em agentes de limpeza doméstica e industrial, e/ou em processamento de resíduo de biomassa.
[00025] Em outro aspecto, a invenção fornece ácidos nucleicos isolados, sintéticos ou recombinantes tendo pelo menos cerca de 70%, por exemplo, pelo menos cerca de 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%; 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou complete (100%) de identidade de sequência para uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, ou 50, em uma região de pelo menos cerca de 10, por exemplo, pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, ou 2000, resíduos. Relacionadamente, a invenção fornece ácidos nucleicos isolados, sintéticos ou recombinantes que são capazes de hibridizar, sob condições de alta rigorosidade, para um complemento de 97%, 98%, 99%, ou complete (100%) de identidade de sequência para uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, ou 50, ou para um fragmento da mesma. O fragmento, por exemplo, pode ser pelo menos de 150 resíduos contíguos de comprimento, por exemplo, pelo menos 200, 250, ou 300 resíduos contíguos de comprimento. A presente invenção fornece ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo tendo atividade hemicelulolítica. Atividade hemicelulolítica exemplar inclui, sem limitação, atividade de Xilanase, β- xilosidase, e/ou L-α-arabinofuranosidase. Polipeptídeos exemplares tendo atividade hemicelulolítica incluem, sem limitação, uma Xilanase, uma β-xilosidase, e/ou uma L-α- arabinofuranosidase.
[00026] A invenção também fornece ácidos nucleicos isolados, sintéticos ou recombinantes codificando uma enzima da invenção, incluindo um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, ou 44, ou uma subsequência da mesma (por exemplo, um domínio catalítico ("CD") ou módulo de ligação de carboidrato ("CBM")), ou uma variante adequada do mesmo. Em algumas modalidades, um ácido nucleico da invenção codifica a porção madura de uma proteína de sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, ou 44, que é opcionalmente operavelmente ligada a uma sequência sinal heteróloga, por exemplo, uma sequência sinal de Trichoderma reesei CBHI. O ácido nucleico desejavelmente codifica um polipeptídeo tendo atividade hemicelulolítica, por exemplo, atividade de Xilanase, β- xilosidase, e/ou L-α- arabinofuranosidase. O ácido nucleico da invenção codifica uma hemicelulase, por exemplo, uma Xilanase, uma β- xilosidase, e/ou uma L-α- arabinofuranosidase, ou uma variante adequada da mesma. Outros ácidos nucleicos da invenção são descritos na Seção 6.2 abaixo.
[00027] A invenção adicionalmente fornece cassetes de expressão compreendendo um ácido nucleico da invenção ou uma subsequência da mesma. Por exemplo, o ácido nucleico compreende pelo menos cerca de 70%, por exemplo, pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, ou 50, em uma região de pelo menos cerca de 10 resíduos, por exemplo, pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 500 resíduos. Em outro exemplo, o ácido nucleico codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, ou 44, em que o ácido nucleico é opcionalmente operavelmente ligado a um promotor. O promotor pode ser, por exemplo, um promotor fúngico, viral, bacteriano, mamífero, ou de planta. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Um promotor adequado exemplar é expressável em fungos filamentosos, por exemplo, Trichoderma reesei. Um promotor adequado pode ser derivado de um fungo filamentoso, por exemplo, Trichoderma reesei, por exemplo, um promotor de gene de celobioidrolase I ("cbh1") de Trichoderma reesei.
[00028] A invenção também fornece uma célula recombinante construída para expressar um ácido nucleico da invenção ou um cassete de expressão da invenção. Por exemplo, o ácido nucleico compreende pelo menos cerca de 70%, por exemplo, pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, ou 50, em uma região de pelo menos cerca de 10, por exemplo, pelo menos cerca de 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, ou 500 resíduos de nucleotídeo. O ácido nucleico podem encode um polipeptídeo de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, ou 44, em que o ácido nucleico é opcionalmente operavelmente ligado a um promotor. O cassete de expressão pode compreender o ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) de identidade de sequência para a SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, ou 50, em uma região de pelo menos cerca de 10 resíduos de nucleotídeo. Por exemplo, o cassete de expressão pode compreender o ácido nucleico codificando um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, ou 44, em que o ácido nucleico é opcionalmente operavelmente ligado a um promotor. A célula recombinante é desejavelmente uma célula bacteriana recombinante, uma célula mamífera recombinante, uma célula fúngica recombinante, uma célula de levedura recombinante, uma célula de inseto recombinante, uma célula de alga recombinante, ou uma célula de planta recombinante. Por exemplo, a célula recombinante é uma célula fúngica filamentosa recombinante, tal como uma célula de Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium.
[00029] A invenção fornece plantas transgênicas compreendendo um ácido nucleico da invenção ou um cassete de expressão da invenção.
[00030] A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 80%, por exemplo, pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou complete (100%) de identidade de sequência to um polipeptídeo de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, ou 44, em uma região de pelo menos cerca de 10, por exemplo, pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, ou 350 resíduos, ou sobre o polipeptídeo imaturo de tamanho natural, o polipeptídeo maduro de tamanho natural, o CD de tamanho natural, ou o CBM de tamanho natural. Polipeptídeos exemplares incluem fragmentos de pelo menos cerca de 10, por exemplo, pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 resíduos de comprimento. Em modalidades específicas, os fragmentos compreendem um CD e/ou um CBM. Onde um fragmento compreende tanto um CD quanto um CBM de uma enzima da invenção, o fragmento opcionalmente inclui um ligador separando o CD e o CBM. O ligador pode ser um ligador nativo ou um ligador heterólogo. Em certas modalidades, o polipeptídeos da invenção têm uma ou mais atividades de hemicelulase. Sequências de polipeptídeos ou peptídeo da invenção incluem sequências codificadas pelos ácidos nucleicos da invenção. Polipeptídeos exemplares são descritos na Seção 6.1.
[00031] A invenção adicionalmente fornece uma proteína quimérica ou de fusão compreendendo pelo menos um domínio de um polipeptídeo da invenção (por exemplo, o CD, o CBM, ou ambos). O pelo menos um domínio podem ser operavelmente ligada a uma segunda sequência de aminoácido, por exemplo, uma sequência de peptídeo sinal.
[00032] Ao contrário, a invenção fornece uma proteína quimérica ou de fusão compreendendo uma sequência sinal de um polipeptídeo da invenção operavelmente ligada a uma segunda sequência, por exemplo, codificando uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo heterólogo que é não naturalmente associado com uma sequência sinal. Consequentemente, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante compreendendo resíduos 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, ou 1 a 40 de um polipeptídeo de, por exemplo, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, ou 44. Outros polipeptídeos quiméricos ou de fusão exemplares são  descritos na Seção 6.1.1.
[00033] A invenção também fornece métodos de produção de um polipeptídeo recombinante compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira construída para expressar um polipeptídeo da invenção; e (b) recuperar o polipeptídeo. A recuperação do polipeptídeo inclui, por exemplo, recuperação do caldo de fermentação compreendendo o polipeptídeo. Em certas modalidades, recuperação do polipeptídeo podem incluir outra(s) etapa(s) de purificação.
[00034] A invenção fornece métodos para hidrolisar, romper, ou quebrar um celooligossacarídeo, um oligômero de arabinoxilano, ou uma composição compreendendo glucano ou celulose compreendendo contatar a composição com uma enzima, mistura/composição de enzima da invenção sob condições adequadas, em que a enzima, ou mistura/composição de enzima hidrolisa, quebra, ou rompe o celooligossacarídeo, oligômero de arabinoxilano, ou composição compreendendo glucano ou celulose.
[00035] A invenção fornece "misturas" ou composições de enzima (também denominadas "mistura/composição de enzima" aqui), compreendendo um polipeptídeo da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção tem uma ou mais atividades selecionadas de atividades de Xilanase, β-xilosidase, e L-α- arabinofuranosidase. Em certas modalidades, as misturas/composições de enzima são usadas ou são úteis para despolimerização de polímeros celulósicos e hemicelulósicos para porções de carbono metabolizável. As misturas de enzima da invenção podem ser na forma de uma composição, por exemplo, como um produto de fabricação. A composição pode ser, por exemplo, uma formulação, e pode tomar a forma física de, por exemplo, um líquido ou um sólido. Em modalidades exemplares, uma mistura/composição de enzima da invenção inclui uma celulase compreendendo pelo menos três diferentes tipos de enzima selecionados de (1) uma endoglucanase, (2) uma celobioidrolase, e (3) uma β-glucosidase; ou pelo menos três diferentes atividades enzimáticas selecionadas de (1) uma atividade de endoglucanase catalisando a clivagem de ligações β-1,4 internas de materiais celulósicos ou hemicelulósicos, resultando em glicooligossacarídeos mais curtos, (2) uma atividade de celobioidrolase catalisando a clivagem e liberação, de uma maneira "exo", de unidades de celobiose (por exemplo, β-1,4 glicose-dissacarídeo de glicose), e (3) uma atividade de β-glucosidase catalisando a liberação de monômeros de glicose de celooligossacarídeos curtos (por exemplo, celobiose). Misturas/composições exemplares de enzima da invenção são descritas na Seção 6.3.4. abaixo.
[00036] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para processamento de um material de biomassa compreendendo lignocelulose compreendendo contatar uma composição compreendendo uma celulose e/ou um açúcar fermentável com um polipeptídeo da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da invenção, ou um mistura/composição de enzima (por exemplo, um produto de fabricação) da invenção. Material de biomassa adequado compreendendo lignocelulose pode ser derivado de uma colheita agrícola, um subproduto de uma produção de alimento ou alimentação, um produto de excreção lignocelulósico, um resíduo de planta, ou um papel usado ou produto de papel usado. Os polipeptídeos da invenção podem têm uma ou mais atividades enzimáticas selecionadas de celulase, endoglucanase, celobioidrolase, β-glucosidase, Xilanase, mannanase, β-xilosidase, arabinofuranosidase, e outras atividades de hemicelulase. Resíduo de planta adequado pode compreender grão, sementes, caules, folhas, cascas, cascas secas de frutos e legumes, espigas de milho, palha de milho, palhas, gramas, madeira, lascas de madeira, polpa de madeira e serragem. A grama pode ser, por exemplo, grama indiana, ou switchgrass. A grama pode também ser, por exemplo, Miscanthus. O resíduo de papel pode ser, por exemplo, papel de fotocópia descartado ou usado, papel de impressora de computador, papel de caderno de notas, papel de bloco de anotações, papel de máquina de escrever, jornais, revistas, papelão, e vários materiais de empacotamento com base em papel. O resíduo de papel pode também ser, por exemplo, polpa.
[00037] A invenção fornece composições (incluindo enzimas, misturas/composições de enzima, por exemplo, produtos de fabricação da invenção) compreendendo uma mistura de enzimas de hidrólise de hemicelulose e celulose, e pelo menos um material de biomassa. Opcionalmente um material de biomassa compreende um material lignocelulósico derivado de uma colheita agrícola. Alternativamente um material de biomassa é um subproduto de uma produção de alimento ou alimentação. Material de biomassa adequado pode também be um produto de excreção lignocelulósico, um resíduo de planta, um papel usado ou produto de papel usado, ou compreende um resíduo de planta. O resíduo de planta pode, por exemplo, ser um compreendendo grãos, sementes, caules, folhas, cascas, cascas secas de frutos e legumes, espigas de milho, palha de milho, gramas, palhas, madeira, lascas de madeira, madeira polpa, ou serragem. Gramas exemplares incluem, sem limitação, grama indiana ou switchgrass. Gramas exemplares podem também incluir Miscanthus.Resíduo de papel exemplar inclui, sem limitação, papel de fotocópia descartado ou usado, papel de impressora de computador, papel de caderno de notas, papel de bloco de anotações, papel de máquina de escrever, jornais, revistas, papelão e materiais de empacotamento com base em papel. Resíduo de papel exemplar pode também incluir, por exemplo, polpa.
[00038] Toda informação publicamente disponível como a partir da data de depósito, incluindo, por exemplo, publicações, patentes, pedidos de patente, sequências GenBank, e depósitos de ATCC citados aqui são pelo presente expressamente incorporados por referência.
5. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E TABELAS
[00039] Tabelas 1A-1B: Tabela 1A fornece um resumo dos identificadores de sequência usados na presente invenção para enzimas de glicosil hidrolase; A Tabela 1B fornece números de acessão para enzimas de glicosil hidrolase adicionais referidas nos exemplos.
[00040] Tabela 2: Atividade de proteínas expressas sobre substratos sintéticos pNPA e pNPX (como definido na Seção 7.1.6. abaixo) em termos com relação à Atividade de base de hospedeiro com deleção de Quad de Trichoderma reesei. A base de hospedeiro com deleção de Quad (ou "XQuad") é definida como a atividade das proteína(s) expressa(s) na cepa com deleção de Quad dividida pela atividade da linhagem de base com deleção de Quad sem a(s) proteína(s) expressa(s), por exemplo, um valor de >1 indica que a proteína expressa tem uma atividade maior do que aquela da base.
[00041] Tabela 3: Atividade de xilanase de endo-Xilanases candidatas purificadas xilano de birchwood, incubada a 50oC, pH 5.
[00042] Tabela 4: Conversão percentual de oligômero de arabinoxilanos de espiga de milho em produtos monômeros com base no açúcar total disponível, como determinado por hidrólise de ácido. Veja, o exemplo 4.
[00043] Tabela 5: Resultados do experimento (como descrito no exemplo 7) definindo o nível de atividade de hemicelulase para hidrolisar espiga de milho tratada em açúcares monômeros. A coluna entitulada "ciclo #" indica a ordem experimental randomizada. A coluna entitulada "experiência #" indica a ordem de projeto experimental padrão. A coluna entitulada "Quad" indica fração da proteína total que é do sobrenadante de cultura para um crescimento da cepa de T. reesei com deleção de Quad. A coluna entitulada "Xyn3" indica fração da proteína total que é Trichoderma reesei Xyn3. A coluna entitulada "Fv43D" indica fração da proteína total que é Fv43D. A coluna entitulada "Fv51A" indica fração da proteína total que é Fv51A. A coluna entitulada "Fv43A" indica fração da proteína total que é Fv43A. A coluna entitulada "Fv43B" indica fração da proteína total que é Fv43B. A coluna entitulada "carga (ug/mg de carbo)" indica a proteína carregada na reação de sacarificação em unidades de microgramas de proteína por miligrama de carboidrato. As colunas entituladas "Xyl mg/mL, Glu mg/mL, Arab mg/mL, e G+X+A mg/mL" indicam a concentração de xilose, glicose, arabinose, e da combinação daqueles três produtos de açúcar que é detectgada ao final da reação de sacarificação. As colunas entituladas "Xyl % de teoria, Glu % de teoria, e Arab % de teoria" indicam o percentual de produção teórica de xilose, glicose, e arabinose obtidas no término da reação de sacarificação.
[00044] Tabela 6: As relações calculadas dos sete componentes enzimáticos para produção máxima predita de glicose, xilose e arabinose de hidrólise de espiga de milho. A coluna "carga total mg/gr de carb." indica a dose de enzima total na qual as predições são calculadas. As colunas entituladas "Total mg/ml G+X+A, % de Produção de Glicose, % de Produção de Xilose, e % de Produção de Arabinose" indicam a resposta para a qual o ideal foi calculado. A coluna entitulada "dados de r2 ajustam-se ao modelo (inclui ambas as cargas)" indica o parâmetro estatístico quadrado de r para o modelo ajustado aos dados apresentados na Tabela 5. As colunas entituladas "fração de Acelerase, fração de sup. com del. de Quad, fração purificada de Trichoderma reesei Xyn3, fração purificada de Fv43D, fração purificada de Fv51A, fração purificada Fv43A, e fração purificada Fv43B" indica a fração daquele componente que é calculada ser ideal pelo modelo ajustado aos dados na Tabela 5.
[00045] Tabela 7: Refinamento de cargas de enzima para conversão hidrolítica máxima de espiga de milho usando misturas incluindo as enzimas Fv3A e Fv43D em 1,06 g, 14% de reações de espiga de milho pré-tratada com sólidos secos. As condições para sacarificação foram como descrito no exemplo 7. As colunas marcadas com nomes de enzima indicam a mg de cada uma das enzimas listadas por grama de glucano ou xilano usado.
[00046] Tabela 8: Refinamento de cargas de enzima para conversão máxima de espiga de milho usando misturas contendo Fv51A como a única L-α-arabinofuranosidase em 1,06 gr, 14% reações de espiga de milho pré-tratada com sólidos secos. As condições usadas para sacarificação foram como descrito no exemplo 7. Colunas marcadas com nomes de enzima indicam o mg de cada das enzimas listadas por grama de glucano ou xilano usado. Colunas marcadas com carboidratos indicam o mg por mL de cada produto de carboidrato produzido com base nas medições feitas com cromatografia por exclusão de tamanho. A coluna >dp2 inclui todos os oligômeros maiores do que um dissacarídeo.
[00047] Tabela 9: As produções de açúcar obtidas das misturas A, B, C de hemicelulases purificadas testadas em 1,06 g, 14% de reações de espiga de milho pré-tratada com sólidos secos. As condições usadas para sacarificação foram como descrito no exemplo 7. Mistura A: 6 mg de Trichoderma reesei Xyn3, 4 mg de Fv3A, 1 mg de Fv51A por grama de xilano. Mistura B: 6 mg de Trichoderma reesei Xyn3, 1 mg de Fv43D, 3 mg de Fv43A, 3 mg de Fv43B por grama de xilano. Mistura C: 6 mg de Trichoderma reesei Xyn3, 3 mg de Fv3A, 1 mg de Fv43D, 1 mg de Fv51A por grama de xilano. Colunas marcadas com açúcares monoméricos indicam o % de produção de cada dos monômeros listados.
[00048] Tabela 10: Produções de açúcar de tratamento de preparações de hemicelulose feitas de espiga de milho, sorgo, switchgrass e bagaço de cana de açúcar por misturas de hemicelulase A, B, C. As reações foram realizadas a 100 DL de escala em tampão de acetato de sódio a 50 mM pH 5,0 durante 6 horas a 48°C como descrito no exemplo 8. O % de produção para cada açúcar monomérico é mostrado.
[00049] Tabela 11: Concentração da maioria das enzimas expressas por várias cepas de expressão integradas de T. reesei (designadas H3A, 39A, 69A, A10A, G6A, 102, 44A, 11A, G9A) como determinado por percentual da área de HPLC integrada.
[00050] Tabela 12: Lista de parâmetros de pré-tratamento de switchgrass e resultados de sacarificação dos vários pré-tratamentos.
[00051] Tabela 13: Resultados de sascarificação de uma polpa de madeira de lei com a composição de enzima produzida por uma cepa integrada de T. reesei, H3A, em reações com diferentes quantidades de sólidos, enzimas, e tempo de incubação.
[00052] Tabela 14: Sacarificação de uma polpa de madeira de lei com a composição de enzima produzida por uma cepa integrada H3A em uma faixa de temperatura e uma faixa de pH.
[00053] Sequências sinais listadas abaixo e nas figuras foram preditas. As predições foram feitas com o algoritmo SignalP (disponível em http:// www.cbs.dtu.dk). Predições de domínio foram feitas com base em uma ou mais das bases de dados Pfam, SMART, ou NCBI.
[00054] figuras 1A-1B: figura 1A: Sequência de nucleotídeo Fv3A (SEQ ID NO:1). figura 1B: sequência de aminoácido Fv3A (SEQ ID NO:2). SEQ ID NO:2 é uma sequência do Fv3A imatura. Fv3A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 23 de SEQ ID NO:2 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 24 a 766 de SEQ ID NO:2. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00055] figuras 2A-2B: figura 2A: Sequência de nucleotídeo de Pf43A (SEQ ID NO:3). figura 2B: Sequência de aminoácido Pf43A (SEQ ID NO:4). SEQ ID NO:4 é uma sequência do Pf43A imaturo. Pf43A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 20 de SEQ ID NO:4 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 21 a 445 de SEQ ID NO:4. O domínio conservado predito está em tipo negrito, o módulo de ligação de carboidrato predito ("CBM") está em tipo caixa alta, e o ligador predito separando o CD e CBM está em itálico.
[00056] figuras 3A-3B: figura 3A: Sequência de nucleotídeo Fv43E (SEQ ID NO:5). figura 3B: Sequência de aminoácido Fv43E (SEQ ID NO:6). SEQ ID NO:6 é uma sequência do Fv43E imaturo. Fv43E tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 18 de SEQ ID NO:6 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 19 a 530 de SEQ ID NO:6. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00057] figuras 4A-4B: figura 4A: Sequência de nucleotídeo Fv39A (SEQ ID NO:7). figura 4B: sequência de aminoácido Fv39A (SEQ ID NO:8). SEQ ID NO:8 é uma sequência do Fv39A imaturo. Fv39A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 19 de SEQ ID NO:8 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 20 to 439 de SEQ ID NO:8. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00058] figuras 5A-5B: figura 5A: sequência de nucleotídeo de Fv43A (SEQ ID NO:9). figura 5B: sequência de aminoácido Fv43A (SEQ ID NO:10). SEQ ID NO:10 é uma sequência do Fv43A imaturo. Fv43A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 22 de SEQ ID NO:10 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 23 a 449 de SEQ ID NO:10. O domínio conservado predito está em tipo negrito, o CBM predito está em tipo caixa alta, e o ligador predito separando o domínio conservado e CBM está em itálico.
[00059] figuras 6A-6B: figura 6A: Sequência de nucleotídeo Fv43B (SEQ ID NO:11). figura 6B: sequência de aminoácido de Fv43B (SEQ ID NO:12). SEQ ID NO:12 é uma sequência do immature Fv43B. Fv43B tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 16 de SEQ ID NO:12 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 17 a 574 de SEQ ID NO:12. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00060] figuras 7A-7B: figura 7A: Pa51A sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:13). figura 7B: sequência de aminoácido de Pa51A (SEQ ID NO:14). SEQ ID NO:14 é uma sequência do Pa51A imaturo. Pa51A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 20 de SEQ ID NO:14 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 21 a 676 de SEQ ID NO:14. O domínio conservado de L-α- arabinofuranosidase predito está em tipo negrito. Para os propósitos de expressão, o DNA genômico foi otimizado por códon para expressão em T. reesei (veja a figura 60B).
[00061] figuras 8A-8B: figura 8A: sequência de nucleotídeo de Gz43A (SEQ ID NO:15). figura 8B: sequência de aminoácido de Gz43A (SEQ ID NO:16). SEQ ID NO:16 é uma sequência do Gz43A imaturo. Gz43A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 18 de SEQ ID NO:16 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 19 a 340 de SEQ ID NO:16. O domínio conservado predito está em tipo negrito. Para os propósitos de expressão, a sequência sinal predita de Gz43A foi substituída pela sequência sinal de CBH1 de T. reesei (myrklavisaflatara (SEQ ID NO: 51)) em T. reesei (veja a figura 61).
[00062] figuras 9A-9B: figura 9A: sequência de nucleotídeo de Fo43A (SEQ ID NO:17). figura 9B: Fo43A sequência de aminoácido (SEQ ID NO:18). SEQ ID NO:18 é uma sequência do immature Fo43A. Fo43A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 20 de SEQ ID NO:18 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 21 a 348 de SEQ ID NO:18. O domínio conservado predito está em tipo negrito. Para os propósitos de expressão, a sequência sinal predita de Fo43A foi substituída pela sequência sinal de CBH1 de T. reesei (myrklavisaflatara (SEQ ID NO:51)) (veja a figura 62).
[00063] figuras 10A-10B: figura 10A: Af43A sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:19). figura 10B: sequência de aminoácido de Af43A (SEQ ID NO:20). SEQ ID NO:20 é uma sequência do Af43A imaturo. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00064] figuras 11A-11B: figura 11A: Pf51A sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:21). figura 11B: sequência de aminoácido de Pf51A (SEQ ID NO:22). SEQ ID NO:22 é uma sequência do Pf51A imaturo. Pf51A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 20 de SEQ ID NO:22 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 21 a 642 de SEQ ID NO:22. O domínio conservado de L-α-arabinofuranosidase predito está em tipo negrito. Para os propósitos de expressão, a sequência sinal de Pf51A predita foi substituída por uma otimizada por códon, a sequência sinal de CBH1 de T. reesei (myrklavisaflatara (SEQ ID NO:51)) (sublinhadas) e a sequência de nucleotídeo Pf51A foi otimizado por códon para  expressão em T. reesei (veja a figura 63).
[00065] figuras 12A-12B: figura 12A: sequência de nucleotídeo de AfuXyn2 (SEQ ID NO:23). figura 12B: sequência de aminoácido de AfuXyn2 (SEQ ID NO:24). SEQ ID NO:24 é uma sequência do AfuXyn2 imaturo. AfuXyn2 tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 18 de SEQ ID NO:24 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 19 a 228 de SEQ ID NO:24. O domínio conservado de GH11 predito está em tipo negrito.
[00066] figuras 13A-13B: figura 13A: sequência de nucleotídeo de AfuXyn5 (SEQ ID NO:25). figura 13B: sequência de aminoácido AfuXyn5 (SEQ ID NO:26). SEQ ID NO:26 é uma sequência do AfuXyn5 imaturo. AfuXyn5 tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 19 de SEQ ID NO:26 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 20 to 313 de SEQ ID NO:26. O domínio conservado de GH11 predito está em tipo negrito.
[00067] figuras 14A-14B: figura 14A: Fv43D sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:27). figura 14B: sequência de aminoácido de Fv43D (SEQ ID NO:28). SEQ ID NO:28 é uma sequência do Fv43D imaturo. Fv43D tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 20 de SEQ ID NO:28 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 21 a 350 de SEQ ID NO:28. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00068] figuras 15A-15B: figura 15A: sequência de nucleotídeo de Pf43B (SEQ ID NO:29). figura 15B: sequência de aminoácido de Pf43B (SEQ ID NO:30). SEQ ID NO:30 é uma sequência do Pf43B imaturo. Pf43B tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 20 de SEQ ID NO:30 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 21 a 321 de SEQ ID NO:30. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00069] figuras 16A-16B: figura 16A: sequência de nucleotídeo de Fv51A (SEQ ID NO:31). figura 16B: sequência de aminoácido de Fv51A (SEQ ID NO:32). SEQ ID NO:32 é uma sequência do Fv51A imaturo. Fv51A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 19 de SEQ ID NO:32 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 20 a 660 de SEQ ID NO:32. O domínio conservado de L-α-arabinofuranosidase predito está em tipo negrito.
[00070] figuras 17A-17B: figura 17A: Sequência de nucleotídeo de Cg51B (SEQ ID NO:33). figura 17B: sequência de aminoácido de Cg51B (SEQ ID NO:34). SEQ ID NO:34 é uma sequência do Cg51B imaturo. Cg51B tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 20 de SEQ ID NO:34 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 21 a 670 de SEQ ID NO:34. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00071] figuras 18A-18B: figura 18A: sequência de nucleotídeo de Fv43C (SEQ ID NO:35). figura 18B: sequência de aminoácido de Fv43C (SEQ ID NO:36). SEQ ID NO:36 é uma sequência do Fv43C imaturo. Fv43C tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 22 de SEQ ID NO:36 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 23 a 333 de SEQ ID NO:36. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00072] figuras 19A-19B: figura 19A: sequência de nucleotídeo de Fv30A (SEQ ID NO:37). figura 19B: sequência de aminoácido de Fv30A (SEQ ID NO:38). SEQ ID NO:38 é uma sequência do Fv30A imaturo.  Fv30A tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 19 de SEQ ID NO:38 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 20 a 537 de SEQ ID NO:38.
[00073] figuras 20A-20B: figura 20A: sequência de nucleotídeo de Fv43F (SEQ ID NO:39). figura 20B: sequência de aminoácido de Fv43F (SEQ ID NO:40). SEQ ID NO:40 é uma sequência do Fv43F imaturo. Fv43F tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 20 de SEQ ID NO:40 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 21 a 315 de SEQ ID NO:40.
[00074] figuras 21A-21B: figura 21A: sequência de nucleotídeo de Xyn3 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO:41). figura 21B: sequência de aminoácido de Xyn3 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO:42). SEQ ID NO:42 é uma sequência do Trichoderma reesei Xyn3 imaturo. Trichoderma reesei Xyn3 tem uma sequência sinal predita que corresponde às posições 1 a 16 de SEQ ID NO:42 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência que corresponde às posições 17 a 347 de SEQ ID NO:42. O domínio conservado predito está em tipo negrito.
[00075] figura 22: sequência de aminoácido de Trichoderma reesei Xyn2 (SEQ ID NO:43). A sequência sinal é sublinhada. O domínio conservado predito está em tipo negrito. A sequência de codificação pode ser encontrada em Tõrrõnen e outro Biotechnology, 1992, 10:1461-65.
[00076] figura 23: Sequência de aminoácido de Trichoderma reesei Bxl1 (SEQ ID NO:44). A sequência sinal é sublinhada. O domínio conservado predito está em tipo negrito. A sequência de codificação pode ser encontrada em Margolles-Clark e outro Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62(10): 3840-46.
[00077] figura 24: Sequência de aminoácido de Trichoderma reesei Bgl1 (SEQ ID NO:45). A sequência sinal é sublinhada. O domínio conservado predito está em tipo negrito. A sequência de codificação pode ser encontrada em Barnett e outro Bio-Technology, 1991, 9(6):562-567.
[00078] figura 25: Atividade de ensaio de celulase usando hidrólise PASC com detecção de calcoflúor.
[00079] figura 26: Perfil de eluição de xilanase.
[00080] figura 27: Detecção de SDS-PAGE da separação de duas etapas de AfuXyn 5. Faixa 1: Amostra bruta; Faixa 2: Eluato de coluna Fenila; Faixa 3: Eluato de coluna GF.
[00081] figura 28: plasmídeo pENTR/D-TOPO.
[00082] figura 29: pTrex3gM.
[00083] figuras 30A-30B: Desempenho de diferentes enzimas sobre substrato de espiga de milho. As barras de erro representam os erros experimentais associados com ensaios de espiga de milho triplicados. Os números em parênteses ao longo do eixo-x representam as doses de enzima em mg de proteína por g de celulose.
[00084] figura 31: Desempenho de diferentes misturas/composições de enzima sobre substrato de espiga de milho. As barras de erro representam os erros experimentais associados com ensaios de espiga de milho triplicados. Os números em parênteses ao longo do eixo-x representam as doses de enzima em mg de proteína por g de celulose.
[00085] figura 32: Desempenho de diferentes misturas/composições de enzima sobre substrato de espiga de milho. As barras de erro representam os erros experimentais associados com ensaios de espiga de milho triplicados. Os números em parênteses ao longo do eixo-x representam as doses de enzima em mg de proteína por g de celulose.
[00086] figura 33: Desempenho de diferentes misturas/composições de enzima sobre substrato de espiga de milho. As barras de erro  representam os erros experimentais associados com ensaios de espiga de milho triplicados. Os números em parênteses ao longo do eixo-x representam as doses de enzima em mg de proteína por g de celulose.
[00087] figura 34: Desempenho de diferentes misturas/composições de enzima sobre substrato de espiga de milho. As barras de erro representam os erros experimentais associados com ensaios de espiga de milho triplicados. Os números em parênteses ao longo do eixo-x representam as doses de enzima em mg de proteína por g de celulose.
[00088] figuras 35A-35C: Desempenho de diferentes misturas/composições de enzima sobre substrato de espiga de milho. As barras de erro representam os erros experimentais associados com ensaios de espiga de milho triplicados. Os números ao longo do eixo-x representam as doses de enzima em mg de proteína por g de celulose.
[00089] figura 36: Região de NMR de próton anomérico de oligômero curto de arabinoxilanos mostra clivagem por Fv43A plus Fv43B.
[00090] figura 37: Região de NMR de próton anomérico de oligômero curto de arabinoxilanos mostra clivagem de xilose β-1,2-ligada de arabinose por Fv3A.
[00091] figura 38: Alinhamento entre as sequências de aminoácido de Trichoderma reesei β-xilosidase e Fv3A.
[00092] figura 39: plasmídeo pENTR-TOPO-Bgl1 (943/942).
[00093] figura 40: vetor de expressão pTrex3g 943/942 Bgl1.
[00094] figura 41: plasmídeo pENTR-Trichoderma reesei Xyn3.
[00095] figura 42: vetor de expressão pTrex3g/Trichoderma reesei Xyn3.
[00096] figura 43: plasmídeo pENTR-Fv3A.
[00097] figura 44: vetor de expressão pTrex6g/Fv3A.
[00098] figura 45: plasmídeo TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D.
[00099] figura 46: plasmídeo TOPO Blunt/Pegl1-Fv51A.
[000100] figuras 47A-47D: Conversões de glucano (figura 47A) e xilano (figura 47B) em açúcares monoméricos por caldos de fermentação de enzima secretada de cepas de de expressão integradas de T. reesei. A amostra do dia 3 foi analisada quanto à extensão da conversão de glucano e xilano tanto em monômero quanto proedutos oligoméricos solúveis (figura 47C). A figura 47D mostra uma comparação cromatográfica de produto de enzima de três cepas de expressão integradas de T. reesei. As condições experimentais são descritas no exemplo 1. As relações de proteína diferem por meio dos transformantes e podem ser quantificadas como uma percentagem da área de pico integrada total. Os "EGLs" marcam a area somada de picos de endoglucanase. EndoH foi adicionado à amostra de proteína em pequenas quantidades como um reagente para análise de HPLC.
[000101] figuras 48A-48B: A sacarificação aumentou em produção de monômero de xilose em resposta à adição de hemicelulase à composição de enzima produzida por uma cepa integrada a 7 mg de proteína total por grama de glucano + xilano em espiga de milho pré- tratada com amônia. figura 48A: Hemicelulases de Fusarium verticillioides constituintes na composição de enzima produzida pela cepa integrada. figura 48B: Hemicelulases de outros fungos.
[000102] figuras 49A-49B: Sacarificação aumentou em de monômero de glicose yield em resposta à adição de hemicelulase to a composição de enzima produzida por uma cepa integrada at 7 mg proteína total por grama de glucano + xilano em espiga de milho pré-tratada com amônia. figura 49A: Constituent Fusarium verticillioides hemicelulases in a composição de enzima produzida pela cepa integrada. figura 49B: Hemicelulases de outros fungos.
[000103] figuras 50A-50B: Sacarificação aumentou em produção de monômero de arabinose em resposta à adição de hemicelulase à composição de enzima produzida por uma cepa integrada em 7 mg de proteína total por grama de glucano + xilano em espiga de milho pré- tratada com amônia. figura 50A: Constituent Fusarium verticillioides hemicelulases na composição de enzima produzida por uma cepa integrada. figura 50B: Hemicelulases de outros fungos.
[000104] figura 51: Uma apresentação gráfica do desempenho de sacarificação por meio das condições de pré-tratamento. O eixo-x corresponde aos Resultados experimentais listados na tabela 12. As produções são calculadas com base nas quantidades teóricas de glucano ou xilano disponível no switchgrass bruto. Todas as produções são com base na liberação de açúcares monoméricos após 3 dias de sacarificação com o coquetel de enzima.
[000105] figura 52: alinhamento de sequência de aminoácido de diversas β-xilosidases de GH39. Os resíduos sublinhados em negrito são os resíduos de base ácida geral catalíticos preditos (marcados com "A" acima do alinhamento) e resíduo de nucleófilo catalítico (marcado com "N" acima do alinhamento). Resíduos sublinhados em face normal na base de duas sequências incluem-se em 4 angstroms do substrate nos sítios ativos das respectivas estruturas 3D (pdb: 1uhv e 2bs9, respectivamente). Os resíduos sublinhados na sequência de Fv39A são preditos incluírem-se em 4 angstroms de um substrato ligado no sítio ativo.
[000106] figura 53: alinhamento de sequência de aminoácido de diversas hidrolases da família GH43. Resíduos de aminoácido altamente conservados entre os membros da family são mostrados sublinhados e em negrito.
[000107] figura 54: alinhamento de sequência de aminoácido de diversas enzimas da família GH51. Resíduos de aminoácido altamente conservados entre os membros da família são mostrados sublinhados e em tipo negrito.
[000108] figuras 55A-55B: alinhamentos de sequência de aminoácido de diversas endoxilanases da família GH10 e GH11. figura 55A;  Alinhamento de xilanases da família GH10. Resíduos sublinhados em negrito são os resíduos de nucleófilo catalíticos (marcadOs com "N" acima do alinhamento). figura 55B; Alinhamento de xilanases da família GH11. Resíduos sublinhados em negrito são os resíduos de nucleófilo catalíticos e resíduos de base ácida gerais (marcadas com "N" e "A", respectivamente, acima do alinhamento).
[000109] figuras 56A-56B: Sacarificação de switchgrasspré-tratado com amônia diluída com várias misturas/composições de enzima; figura 56A: conversão de glucano; figura 56B: conversão de xilano. Os números abaixo das figuras no eixo-x referem-se à quantidade de mg total de cada proteína em uma determinada mistura /composição por g de glucano ou xilano, como descrito no exemplo 13.
[000110] figuras 57A-57B: Sacarificação de switchgrasspré-tratado com amônia diluída com uma composição de enzima produzida pela cepa integrada H3A; figura 57A: conversão de glucano; figura 57B: conversão de xilano. As condições experimentais são descritas no exemplo 14.
[000111] figuras 58A-58C: Sacarificação de bagaço de cana-de- açúcar expandido por vapor com uma composição de enzima produzida pela cepa integrada H3A em diferentes doses de enzima; figura 58A: conversão de glucano; figura 58B: conversão de xilano; figura 58C: conversões de glucano e xilano de 3 dias. As condições experimentais são descritas no exemplo 17.
[000112] figuras 59A-59C: Sacarificação de fibra de milho pré-tratada com ácido diluído com várias enzimas ou misturas de enzima; figura 59A: conversão de glucano; figura 59B: conversão de xilano: figura 59C: conversão de glucano e xilanos de 5 dias. O açúcar ajustado (glicose ou xilose) refletiu o açúcar sendo produzido da etapa enzimática menos os níveis de açúcar de partida. As relações mostradas ao longo do eixo- x representam a dose de enzima em mg de proteína total por grama de  celulose. As condições experimentais são descritas no exemplo 18.
[000113] figuras 60A-60B: figura 60A: cDNA deduzido para Pa51A (SEQ ID NO:46). figura 60B: cDNA otimizado por códon para Pa51A (SEQ ID NO:47).
[000114] figura 61: Sequência de codificação para uma construção compreendendo uma sequência sinal de CBH1 (sublinhadas) a montante de DNA genômico codificando Gz43A maduro (SEQ ID NO:48).
[000115] figura 62: Sequência de codificação para uma construção compreendendo uma sequência sinal de CBH1 (sublinhadas) a montante de DNA genômico codificando Fo43A maduro (SEQ ID NO:49).
[000116] figura 63: Sequência de codificação otimizada por códon para uma construção compreendendo uma sequência sinal de CBH1 (sublinhadas) a montante de DNA otimizado por códon codificando Pf51A maduro (SEQ ID NO:50).
[000117] figura 64: Alinhamento de sequência de aminoácido de diversas hidrolases da família GH3. Resíduos de aminoácido altamente conservados entre os membros da família são mostrados sublinhados e em tipo negrito. A caixa marca o resíduo catalítico predito com resíduos de flanqueamento preditos estarem envolvidos em ligação de substrato.
[000118] figura 65: Alinhamento de sequência de aminoácido de duas hidrolases da família GH30 de Fusarium GH30. Resíduos de aminoácido que são conservados entre os membros da família são mostrados sublinhado e em tipo negrito.
6. DESCRIÇÃO DETALHADA
[000119] Enzimas foram tradicionalmente classificadas por especificidade de substrato e produtos de reação. Na era pré-genômica, a função foi considerada como a base mais receptiva (e talvez mais útil) para comparar enzimas e ensaios para várias atividades enzimáticas foram bem desenvolvidos durante muitos anos, resultando no esquema de classificação EC familiar. Celulases e outras glicosil hidrolases, que agem sobre as ligações glicosídicas entre duas porções de carboidrato (ou uma porção de carboidrato e não carboidrato - como ocorre em derivados de nitrofenol-glicosídeo) são, sob este esquema de classificação, designadas como EC 3.2.1.-, com o número final indicando o tipo exato de ligação clivada. Por exemplo, de acordo com este esquema uma celulase endo atuante (1,4-β-endoglucanase) é designada EC 3.2.1.4.
[000120] Com o advento de projetos de seqüenciamento de genoma difundidos, dados de seqüenciamento têm análises facilitadas e comparação de genes e proteínas relacionados. Adicionalmente, um número crescente de enzimas capazes de agir sobre porções de carboidrato (isto é, carboidrases) foi cristalizado e suas estruturas 3-D solucionadas. Tais analyses têm famílias de enzimas discretas identificadas com sequência relacionada, que contêm dobras tridimencionais conservadas que podem ser preditas com base em sua sequência de aminoácido. Além disso, foi mostrado que enzimas com as mesmas ou similares dobras tridimencionais exibem a mesma ou similar estereoespecificidade de hidrólise, mesmo quando catalisando diferentes reações (Henrissat e outro, 1998, FEBS Lett 425(2): 352-4; Coutinho e Henrissat, 1999, em Genetics, biochemistry and ecology of celulose degradation. T. Kimura. Tokyo, Uni Publishers Co: 15-23.).
[000121] Estas descobertas formam a base de uma classificação baseada em sequência de módulos de carboidrase, que está disponível na forma de uma base de dados de internet, o servidor de enzima ativa de carboidrato (CAZy), disponível em http://afmb.cnrs- mrs.fr/CAZY/index.html (enzimas ativas de carboidrato: um método de base de dados integrada. See Cantarel e outro, 2009, ácidos nucleicos Res. 37 (Database issue):D233-38).
[000122] CAZy define quatro classes principais de carboidrases distinguíveis pelo tipo de reação catalisada: Glicosil Hidrolases (GH's), Glicosiltransferases (GT's), Polissacarídeo Liases (PL's), e Carboidrato Esterases (CE's). As enzimas da invenção são glicosil hidrolases. GH's são um grupo de enzimas que hidrolizam a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos, ou entre uma porção de carboidrato e uma de não carboidrato. Um sistema de classificação para glicosil hidrolases, agrupado por similaridade de sequência, induziu a definição mais de 85 diferentes famílias. Esta classificação esta disponível no CAZy web site.
[000123] As enzimas da invenção pertencem, entre outras coisas, às famílias de glicosil hidrolase 3, 10, 11, 30, 39, 43, e/ou 51.
[000124] Família 3 de Glicosídeo hidrolase ("GH3") As enzimas incluem, por exemplo, β-glucosidase (EC:3.2.1.21); β-xilosidase (EC:3.2.1.37); N-acetil β-glucosaminidase (EC:3.2.1.52); glucano β-1,3- glucosidase (EC:3.2.1.58); celodextrinase (EC:3.2.1.74); exo-1,3-1,4- glucanase (EC:3.2.1); e β-galactosidase (EC 3.2.1.23). Por exemplo, enzimas GH3 podem ser aquelas que têm atividade de β-glucosidase, β-xilosidase, N-acetil β-glucosaminidase, glucano β-1,3-glucosidase, celodextrinase, exo-1,3-1,4-glucanase, e/ou β-galactosidase. Geralmente, enzimas GH3 são proteínas globulares e podem consistir em dois ou mais subdomínios. Um resíduo catalítico foi identificado como um resíduo de aspartato que, em β-glucosidases, localizou-se na terceira terminal N do peptídeo e ajustou-se dentro do fragmento de aminoácido SDW (Li e outro 2001, Biochem. J. 355:835-840). A correspondente sequência em Bgl1 de T. reesei é T266D267W268 (contagem da metionina na posição de partida), com o aspartato de resíduo catalítico sendo o D267. A sequência de hidroxila/aspartato é também conservada nas β-xilosidases de GH3 testadas. Por exemplo, a correspondente sequência em T. reesei Bxl1 é S310D311 e a correspondente sequência em Fv3A é S290D291.
[000125] Família de Glicosídeo hidrolase 39 ("GH39") As enzimas têm atividade de α-L-iduronidase (EC:3.2.1.76) ou β-xilosidase (EC:3.2.1.37). A estrutura tri-dimensional de duas β-xilosidases de GH39, de Thermoanaerobacterium saccharolyticum (Uniprot Acessão No. P36906) e Geobacillus stearothermophilus (Uniprot Acessão No. Q9ZFM2), foi resolvida (veja Yang e outro, J. Mol. Biol. 2004, 335(1):155-65 e Czjzek e outro, J. Mol. Biol. 2005, 353(4):838-46). As regiões mais altamente conservadas nestas enzimas são localizadas em suas seções de terminal N, que têm uma dobra de barril (α/β)8 TIM clássica com os dois ácidos glutâmicos de sítio ativo chave localizados nas extremidades de terminal C de ramificações β 4 (ácido/base) e 7 (nucleófilo). Os resíduos de Fv39A E168 e E272 são preditos funcionarem como base ácida catalítica e nucleófilo, respectivamente, com base em uma sequência de alinhamento as acima mencionadas β- xilosidases de GH39 de Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Geobacillus stearothermophilus com Fv39A.
[000126] Família de glicosídeo hidrolase 43 ("GH43") As enzimas incluem, por exemplo, L-α-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55); β- xilosidase (EC 3.2.1.37); endo-arabinanase (EC 3.2.1.99); e/ou galactan 1,3-β-galactosidase (EC 3.2.1.145). Por exemplo, GH43 enzimas podem têm atividade de L-α-arabinofuranosidase, atividade de β- xilosidase, atividade de endo-arabinanase, e/ou atividade de galactan 1,3-β-galactosidase. Enzimas da família GH43 exibem uma estrutura semelhante à hélice β de cinco pás. A estrutura semelhante à hélice é com base em uma repetição de cinco dobras de pás compostas de folhas β de quatro filamentos. A base geral catalítica, um aspartato, o ácido geral catalítico, um glutamato, e um aspartato que modulam o pKa da base geral foram identificados por meio da estrutura de cristal de Celvibrio japonicus CjAbn43A, e confirmada por mutagênese direcionada ao sítio (veja Nurizzo e outro Nat. Struct. Biol. 2002, 9(9) 665-8). Os resíduos catalíticos são dispostos em três blocos conservados amplamente difundidos por meio de uma sequência de aminoácido (Pons e outro Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 2004, 54:424-432). Entre as enzimas da família GH43 testadas quanto às atividades úteis em hidrólise de biomassa, os resíduos catalíticos preditos são mostrados como os resíduos em negrito e sublinhados nas sequências de figura 53. A estrutura de cristal da Geobacillus stearothermophylus xilosidase (Brux e outro J. Mol. Bio., 2006, 359:97-109) sugere diversos resíduos adicionais que podem ser importantes para ligação de substrato nesta enzima. Por que as enzimas da família GH43 testadas quanto à hidrólise de biomassa tiveram diferentes preferências de substrato, estes resíduos não são totalmente conservados nas sequências alinhadas na figura 53. Entretanto, entre as xilosidases testadas, diversos resíduos conservados que contribuem para a ligação de substrato, ou por meio de interação hidrofóbica ou por meio de ligação de hidrogênio, são conservados e são marcados por simples grifos na figura 53.
[000127] Família de glicosídeo hidrolase 51 ("GH51") As enzimas têm atividade de L-α-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) e/ou endoglucanase (EC 3.2.1.4). Estrutura de cristal de alta resolução de uma L-α- arabinofuranosidase de GH51 de Geobacillus stearothermophilus T-6 mostra que a enzima é um hexâmero, com cada monômero organizado em dois domínios: um sanduíche β de barril-8 (β/α) e um filamento-12 com topologia de cilindro de gelatina (veja Hovel e outro EMBO J. 2003, 22(19):4922-4932). Pode ser suposto que os resíduos catalíticos serão acídicos e conservados por meio de sequências de enzima na família. Quando as sequências de aminoácido de Fv51A, Pf51A, e Pa51A são alinhadas com enzimas de GH51 de sequência mais diversas, 8 resíduos acídicos permanecem conservados. Aquelas são mostradas em negrito e sublinhadas na figura 54.
[000128] Família de glicosídeo 10 ("GH10") As enzimas também têm uma estrutura de barril-8 (β/α). Elas hidrolisam de um modo endo com um mecanismo restante que usa pelo menos um resíduo catalítico acídico geralmente em um processo de catálise dse ácido/base (Pell e outro, J. Biol. Chem., 2004, 279(10): 9597-9605). Estruturas de cristal das Xilanases de GH10 de Penicillium simplicissimum (Uniprot P56588) e Thermoascus aurantiacus (Uniprot P23360) complexadas com substratos nos sítios ativos foram solucionadas (veja Schmidt e outro Biochem., 1999, 38:2403-2412; e Lo Leggio e outro FEBS Lett. 2001, 509: 303-308). Resíduos dse Trichoderma reesei Xyn3 que são importantes para a ligação de substrato e catálise podem ser derivados de um alinhamento com as sequências das acima mencionadas Xilanases de GH10 de Penicillium simplicissimum e Thermoascus aurantiacus (figura 55A). O resíduo E282 de Trichoderma reesei Xyn3 é predito ser o resíduo nucleofílico catalítico, ao passo que os resíduos E91, N92, K95, Q97, S98, H128, W132, Q135, N175, E176, Y219, Q252, H254, W312, e/ou W320 são preditos estarem envolvidos em ligação de substrato e/ou catálise.
[000129] Família de glicosídeo hidrolase 11 ("GH11") As enzimas têm uma estrutura de cilindro de β-gelatina. Elas hidrolisam de um modo endo com um mecanismo de retenção que usa pelo menos um resíduo catalítico acídico geralmente em um processo de catálisse de ácidobase. Diversos outros resíduos difundidos em todas sua estrutura podem contribuir para estabilizar as unidades dse xilose no substrato vizinho do par de monômeros de xilose que são clivados por hidrólise. Três endoxilanases da família GH11 foram testadas e suas sequências são alinhadas na figura 55B. E118 (ou E86 em T. reesei Xyn2 maduro) e E209 (ou E177 em T. reesei Xyn2 maduro) foram identificados como resíduos catalíticos de nucleófilo e gerais/base ácida em Trichoderma reesei Xyn2, respectivamente (veja Havukainen e outro Biochem., 1996,  35:9617-24).
[000130] Família 30 de glicosídeo hidrolase ("GH30") As enzimas são enzimas de retenção tendo atividade de glucosilceramidase (EC 3.2.1.45); β-1,6-glucanase (EC 3.2.1.75); β-xilosidase (EC 3.2.1.37); β- glucosidase (3.2.1.21). A primeira estrutura de cristal de GH30 foi a β- glucocerebrosidase humana relacionada com a doença de Gaucher solucionada por Grabowski, Gatt e Horowitz (Crit Rev Biochem Mol Biol 1990; 25(6) 385-414). GH30 têm uma dobra de barril (α/β)8 TIM com ácidos glutâmicos de sítio ativo chaves localizados nas extremidades de terminal C de 4 filamentos-β (acid/base) e 7 (nucleófilos) (Henrissat B, e outro Proc Natl Acad Sci U S A, 92(15):7090-4, 1995; Jordan e outro, Applied Microbiol Biotechnol, 86:1647, 2010). Glutamato 162 de Fv30A é conservado em 14 de 14 proteínas GH30 alinhadas (13 proteínas bacterianas e uma endo-b-Xilanase dos fungos BiosporaAcessão no. ADG62369) e glutamato 250 de Fv30A é conservado em 10 das mesmas 14, é um aspartato em outras três e não acídico em uma. Existem outros resíduos acídicos moderadamente conservados, porém nenhum outro é tão amplamente conservado.
6.1 Polipeptídeos da invenção
[000131] A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 80%, por exemplo, pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou completa (100%) identidade de sequência para um polipeptídeo de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, ou 45, em uma região de pelo menos cerca de 10, por exemplo, pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, ou 350 resíduos, ou em tamanho natural do polipeptídeo imaturo, o polipeptídeo maduro de tamanho natural, o tamanho nataural do domínio conservado, e/ou o CBM de tamanho natural. O domínio conservado podem ser um domínio catalítico predito ("CD"). Polipeptídeos exemplares também incluem fragmentos de pelo menos cerca de 10, por exemplo, pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ou 600 resíduos de comprimento. Os fragmentos podem compreender um domínio conservado e/ou um CBM. Onde um fragmento compreende um domínio conservado e um CBM de uma enzima, o fragmento opcionalmente inclui um ligador separando os dois. O ligador pode ser um ligador nativo ou um ligador heterólogo. Contempla-se que os polipeptídeos da invenção podem ser codificados por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, ou cerca de 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, ou 41, ou por uma sequência de ácido nucleico capaz de hidrolisar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, ou 41, ou para um fragmento da mesma. Ácidos nucléicos exemplares da invenção são descritos na Seção 6.2 abaixo.
[000132] Os polipeptídeos da invenção incluem proteínas tendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para pelo menos 50 resíduos de aminoácido contíguos das sequências de glicosil hidrolase de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, ou 45. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir sequências de aminoácido tendo pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para pelo menos 10, por exemplo, pelo menos 11,12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, ou 350 resíduos de aminoácido contíguos das sequências de glicosil hidrolase sequências de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, ou 45. A sequência contígua de aminoácido corresponde ao domínio conservado e/ou ao CBM e/ou uma sequência sinal.
[000133] Quaisquer das sequências de aminoácido descritas aqui podem ser produzidas junto ou em conjunto com pelo menos 1, por exemplo, pelo menos 2, 3, 5, 10, ou 20 aminoácidos heterólogos flanqueando cada das extremidades de terminal C e/ou N da sequência de aminoácido especificada, e ou deleções de pelo menos 1, por exemplo, pelo menos 2, 3, 5, 10, ou 20 aminoácidos das extremidades de terminal C e/ou N de uma enzima da invenção.
[000134] Outras variações também se incluem no escopo desta invenção. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido podem ser modificados para aumentar ou diminuir o pI de uma enzima. A mudança do valor de pI pode ser conseguida por remoção de um resíduo de glutamato ou substituindo-o com outro resíduo de aminoácido.
[000135] A invenção especificamente fornece um polipeptídeo Fv3A, um Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Af43A, um Pf51A, um AfuXyn2, um AfuXyn5, um Fv43D, um Pf43B, Fv43B, um Fv51A, um Trichoderma reesei Xyn3, um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Bxl1, e/ou um Trichoderma reesei Bgl1. Uma combinação de uma ou mais destas enzimas está adequadamente presente em uma mistura/composição de enzima da invenção, por exemplo, aquela que é que não ocorre naturalmente.
[000136] Fv3A: Uma sequência de aminoácido de Fv3A (SEQ ID NO:2) é mostrada nas figuras 1B, 38, e 64. SEQ ID NO:2 é uma sequência do Fv3A imatura. Fv3A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 23 de SEQ ID NO:2 (sublinhadas); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 24 a 766 de SEQ ID NO:2. Os domínios conservados preditos estão em tipo negrito na figura 1B. Fv3A foi mostrado ter atividade de β-xilosidase, por exemplo, em um ensaio enzimático usando p-nitrophenyl-β-xilopiranosida, xilobiose, xilo-oligômeros lineares mistos, oligômero de arabinoxilanos de hemicelulose ramificados, ou espiga de milho pré-tratada com amônia diluída como substratos. O resíduo catalítico predito é D291, enquanto que os resíduos de flanqueamento, S290 e C292, são preditos estarem envolvidos em ligação de substrato (figura 64). E175 e E213 são conservados por meio de outras enzimas de GH3 e são preditos terem funções catalíticas. Como usado aqui, "um polipeptídeo Fv3A" refere-se a um polipeptídeo e/ou a uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, por exemplo, pelo menos 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, ou 700 resíduos de aminoácido contíguos entre os resíduos 24 a 766 de SEQ ID NO:2. Um polipeptídeo Fv3A preferivelmente é inalterado quando comparado ao Fv3A nativo em resíduos D291, S290, C292, E175, e E213. Um polipeptídeo Fv3A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre Fv3A, Trichoderma reesei Bxl1 e/ou Trichoderma reesei Bgl1, como mostrado no alinhamento de figura 64. Um polipeptídeo Fv3A adequadamente compreende os domínios conservados preditos inteiros de Fv3A nativo como mostrado na figura 1B. Um polipeptídeo exemplar  Fv3A da invenção compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade para a sequência Fv3A madura como mostrado na figura 1B. O polipeptídeo Fv3A da invenção preferivelmente tem atividade de β-xilosidase.
[000137] Consequentemente, um polipeptídeo Fv3A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, ou para resíduos (i) 24-766, (ii) 73-321, (iii) 73-394, (iv) 395-622, (v) 24-622, ou (vi) 73-622 de SEQ ID NO:2. O polipeptídeo adequadamente tem atividade de β-xilosidase.
[000138] Pf43A: Uma sequência de aminoácido de Pf43A (SEQ ID NO:4) é mostrada nas figuras 2B e 53. A SEQ ID NO:4 é uma sequência do Pf43A imaturo. Pf43A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 20 de SEQ ID NO:4 (sublinhadas in figura 2B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 21 a 445 de SEQ ID NO:4. O domínio conservado predito está em tipo negrito, o CBM predito está em tipo caixa alta, e o ligador predito separando o CD e CBM está em itálico na figura 2B. Pf43A foi mostrado ter atividade de β-xilosidase, por exemplo, em um ensaio enzimático usando p-nitofenil-β-xilopiranosida, xilobiose, xilo-oligômeros lineares mistos, ou espiga de milho pré-tratada com amônia como substratos. Os resíduos catalíticos preditos incluem ou D32 ou D60, D145, e E206. A região de terminal C sublinhada na figura 53 é o CBM predito. Como usado aqui, "um polipeptídeo Pf43A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, ou 400 resíduos de aminoácido contíguos entre os resíduos 21 a 445 de SEQ ID NO:4. Um polipeptídeo Pf43A preferivelmente é inalterado quando comparado ao Pf43A nativo nos resíduos D32 ou D60, D145, e E206. Um Pf43A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são encontrados conservados por meio de uma família de proteínas incluindo Pf43A e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou todos as 8 de outras sequências de aminoácido no alinhamento de figura 53. Um polipeptídeo Pf43A da invenção adequadamente compreende dois ou mais ou todos os seguintes domínios: (1) o CBM predito, (2) o domínio conservado predito, e (3) o ligador de Pf43A como mostrado na figura 2B. Um polipeptídeo exemplar Pf43A da invenção compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade para uma sequência de Pf43A madura como mostrado na figura 2B. O polipeptídeo Pf43A da invenção preferivelmente tem atividade de β-xilosidase.
[000139] Consequentemente um polipeptídeo Pf43A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4, ou para resíduos (i) 21-445, (ii) 21-301, (iii) 21-323, (iv) 21-444, (v) 302-444, (vi) 302-445, (vii) 324-444, ou (viii) 324-445 de SEQ ID NO:4. O polipeptídeo adequadamente tem atividade de β- xilosidase.
[000140] Fv43E: A sequência de aminoácido de Fv43E (SEQ ID NO:6) é mostrada nas figuras 3B e 53. SEQ ID NO:6 é uma sequência de Fv43E imatura. Fv43E tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 18 de SEQ ID NO:6 (sublinhados na figura 3B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura  tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 19 a 530 de SEQ ID NO:6. O domínio conservado predito é marcado em tipo negrito na figura 3B. Fv43E mostrou ter atividade de β-xilosidase, em, por exemplo, ensaio enzimático usando 4-nitofenil-β-D-xilopiranosideo, xilobiose, e xilo-oligômeros lineares, misturados, ou espiga de milho pré- tratada com amônia como substratos. Os resíduos catalíticos preditos incluem D40 ou D71, D155, e E241. Como usado aqui, "um polipeptídeo Fv43E" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 500 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 19 a 530 de SEQ ID NO:6. Um polipeptídeo Fv43E é preferivelmente inalterado quando comparado ao Fv43E nativo nos resíduos D40 ou D71, D155, e E241. Um polipeptídeo Fv43E é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são constatados ser conservados entre uma família de enzimas incluindo Fv43E, e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou todas as outras 8 sequências de aminoácido no alinhamento da figura 53. Um polipeptídeo Fv43E adequadamente compreende o domínio conservado predito inteiro de Fv43E nativo como mostrado na figura 3B. Um polipeptídeo exemplar Fv43E compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Fv43E madura como mostrado na figura 3B. O polipeptídeo Fv43E da invenção tem preferivelmente atividade de β-xilosidase.
[000141] Consequentemente, um polipeptídeo Fv43E da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:6, ou para resíduos (i) 19-530, (ii) 29-530, (iii) 19-300, ou (iv) 29-300 de SEQ ID NO:6. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β-xilosidase.
[000142] Fv39A: A sequência de aminoácido de Fv39A (SEQ ID NO:8) é mostrada nas figuras 4B e 52. SEQ ID NO:8 é uma sequência de Fv39A imaturo. Fv39A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 19 de SEQ ID NO:8 (sublinhados na figura 4B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 20 a 439 de SEQ ID NO:8. O domínio conservado predito é mostrado em tipo negrito na figura 4B. Fv39A mostrou ter atividade de β-xilosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando p-nitofenil-e-xilopiranosídeo, xilobiose ou xilo-oligômeros lineares, misturados como substratos. Resíduos de Fv39A E168 e E272 são preditos funcionarem como ácido-base catalítico e nucleófilo, respectivamente, com base em um alinhamento de sequência de GH39 xilosidases acima mencionadas de Thermoanaerobacterium saccharolyticum (Uniprot Acesso No. P36906) e Geobacillus stearothermophilus (Uniprot Acesso No. Q9ZFM2) com Fv39A. Como usado aqui, "um polipeptídeo Fv39A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, ou 400 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 20 a 439 de SEQ ID NO:8. Um polipeptídeo Fv39A é preferivelmente inalterado quando comparado a Fv39A nativo nos resíduos E168 e E272. Um polipeptídeo Fv39A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre uma família ou enzimas incluindo Fv39A e xilosidases de Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Geobacillus stearothermophilus (veja acima). Um polipeptídeo Fv39A adequadamente compreende o domínio conservado predito inteiro de Fv39A nativo como mostrado na figura 4B. Um polipeptídeo exemplar Fv39A compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Fv39A madura como mostrado na figura 4B. O polipeptídeo Fv39A da invenção tem preferivelmente atividade de β-xilosidase.
[000143] Consequentemente, um polipeptídeo Fv39A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:8, ou para resíduos (i) 20-439, (ii) 20-291, (iii) 145-291, ou (iv) 145-439 de SEQ ID NO:8. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β-xilosidase.
[000144] Fv43A: A sequência de aminoácido de Fv43A (SEQ ID NO:10) é fornecida nas figuras 5B e 53. SEQ ID NO:10 é uma sequência de Fv43A imaturo. Fv43A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 22 de SEQ ID NO:10 (sublinhados na figura 5B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 23 a 449 de SEQ ID NO:10. Na figura 5B, o domínio conservado predito está em tipo negrito, o CBM predito está em tipo caixa alta, e o ligador predito separando o CD e CBM está em itálico. Fv43A mostrou ter atividade de β-xilosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando 4-nitofenil-e-D-xilopiranosídeo, xilobiose, xilo-oligômeros lineares, misturados, oligômero ramificado de arabinoxilanos de hemicelulose, e/ou xilo-oligômeros lineares como substratos. Os resíduos catalíticos preditos incluindo D34 ou D62, D148, e E209. Como usado aqui, "um polipeptídeo Fv43A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, ou 400 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 23 a 449 de SEQ ID NO:10. Um polipeptídeo Fv43A é preferivelmente inalterado, quando comparado a Fv43A nativo, nos resíduos D34 ou D62, D148, e E209, um polipeptídeo Fv43A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre uma família de enzimas incluindo Fv43A e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou todas as 9 outras sequências de aminoácido no alinhamento da figura 53. Um polipeptídeo Fv43A adequadamente compreende o CBM predito inteiro de Fv43A nativo, e/ou o domínio conservado predito inteiro de Fv43A nativo, e/ou o ligador de Fv43A como mostrado na figura 5B. Um polipeptídeo exemplar Fv43A compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Fv43A madura como mostrado na figura 5B. O polipeptídeo Fv45A da invenção tem preferivelmente atividade de β-xilosidase.
[000145] Consequentemente, um polipeptídeo Fv43A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:10, ou para resíduos (i) 23-449, (ii) 23-302, (iii) 23-320, (iv) 23-448, (v) 303-448, (vi) 303-449, (vii) 321-448, ou (viii) 321-449 de SEQ ID NO:10. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β- xilosidase.
[000146] Fv43B: A sequência de aminoácido de Fv43B (SEQ ID  NO:12) é mostrada nas figuras 6B e 53. SEQ ID NO:12 é uma sequência de Fv43B imatura. Fv43B tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 16 de SEQ ID NO:12 (sublinhados na figura 6B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 17 a 574 de SEQ ID NO:12. O domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 6B. Fv43B mostrou ter igualmente atividades de β- xilosidase e L-α-arabinofuranosidase, em, por exemplo, um primeiro ensaio enzimático usando 4-nitofenil-β-D-xilopiranosideo e p -nitrofenil- a-L-arabinofuranosídeo como substratos. Foi mostrado, em um segundo ensaio enzimático, catalisar a liberação de arabinose de arabino-xilooligômeros ramificados e catalisar a liberação de xilose aumentada de misturas de oligômero na presença de outras enzimas de xilosidase. Os resíduos catalíticos preditos incluem D38 ou D68, D151, e E236. Como usado aqui, "um polipeptídeo Fv43B" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, ou 550 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 17 a 574 de SEQ ID NO:12. Um polipeptídeo Fv43B é preferivelmente inalterado, quando comparado a Fv43B nativo, nos resíduos D38 ou D68, D151, e E236. Um polipeptídeo Fv43B é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre uma família de enzimas incluindo Fv43B e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou todas as 9 outras sequências de aminoácido no alinhamento da figura 53. Um polipeptídeo Fv43B adequadamente compreende o domínio conservado predito inteiro de Fv43B nativo como mostrado nas figuras 6B e 53. Um polipeptídeo exemplar Fv43B compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Fv43B madura como mostrado na figura 6B. O polipeptídeo Fv43B da presente invenção tem preferivelmente atividade de β-xilosidase, atividade de L-α-arabinofuranosidase, ou igualmente atividades de β- xilosidase e L-α-arabinofuranosidase.
[000147] Consequentemente, um polipeptídeo Fv43B da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:12, ou para resíduos (i) 17-574, (ii) 27-574, (iii) 17-303, ou (iv) 27-303 de SEQ ID NO:12. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β-xilosidase, atividade de L-α-arabinofuranosidase, ou igualmente atividades de β-xilosidase e L-α-arabinofuranosidase.
[000148] Pa51A: A sequência de aminoácido de Pa51A (SEQ ID NO:14) é mostrada nas figuras 7B e 54. SEQ ID NO:14 é uma sequência de Pa51A imatura. Pa51A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 20 de SEQ ID NO:14 (sublinhados na figura 7B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 21 a 676 de SEQ ID NO:14. O domínio conservado de L-α- arabinofuranosidase predito está em tipo negrito na figura 7B. Pa51A mostrou ter igualmente atividade de β-xilosidase e atividade de L-α- arabinofuranosidase em, por exemplo, ensaios enzimáticos usando substratos artificiais p-nitrofenil-e-xilopiranosídeo e p-nitofenil-α-L- arabinofuranosídeo. Foi mostrado para catalisar a liberação de arabinose de arabino-xilo oligômeros ramificados e catalisar a liberação de xilose aumentada de misturas de oligômero na presença de outras enzimas de xilosidase. Resíduos ácidos conservados incluem E43, D50, E257, E296, E340, E370, E485, e E493. Como usado aqui, "um  polipeptídeo Pa51A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência a pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, ou 650 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 21 a 676 de SEQ ID NO:14. Um polipeptídeo Pa51A é preferivelmente inalterado, quando comparado a Pa51A nativo, nos resíduos E43, D50, E257, E296, E340, E370, E485, e E493. Um polipeptídeo Pa51A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre um grupo de enzimas incluindo Pa51A, Fv51A, e Pf51A, como mostrado no alinhamento da figura 54. Um polipeptídeo Pa51A adequadamente compreende o domínio conservado predito de Pa51A nativo como mostrado na figura 7B. Um polipeptídeo exemplar Pa51A compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Pa51A madura como mostrado na figura 7B. O polipeptídeo Pa51A da invenção tem preferivelmente atividade de β- xilosidase, atividade de L-α-arabinofuranosidase, ou igualmente atividades de β-xilosidase e L-α-arabinofuranosidase.
[000149] Consequentemente, um polipeptídeo Pa51A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:14, ou para resíduos (i) 21-676, (ii) 21-652, (iii) 469-652, ou (iv) 469-676 de SEQ ID NO:14. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β-xilosidase, atividade de L-α-arabinofuranosidase, ou igualmente atividades de β-xilosidase e L-α-arabinofuranosidase.
[000150] Gz43A: A sequência de aminoácido de Gz43A (SEQ ID NO:16) é mostrada nas figuras 8B e 53. SEQ ID NO:16 é uma sequência de Gz43A imatura. Gz43A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 18 de SEQ ID NO:16 (sublinhados na figura 8B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 19 a 340 de SEQ ID NO:16. O domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 8B. Gz43A mostrou ter atividade de β-xilosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando p-nitofenil-β- xilopiranosídeo, xilobiose e/ou xilo-oligômeros lineares, misturados como substratos. Os resíduos catalíticos preditos incluem D33 ou D68, D154, e E243. Como usado aqui, "um polipeptídeo Gz43A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, ou 300 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 19 a 340 de SEQ ID NO:16. Um polipeptídeo Gz43A é preferivelmente inalterado, quando comparado a Gz43A nativo, nos resíduos D33 ou D68, D154, e E243. Um polipeptídeo Gz43A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre um grupo de enzimas incluindo Gz43A e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou todas as 9 outras sequências de aminoácido no alinhamento da figura 53. Um polipeptídeo Gz43A adequadamente compreende o domínio conservado predito de Gz43A nativo como mostrado na figura 8B. Um polipeptídeo exemplar Gz43A compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Gz43A madura como mostrado na figura 8B. O polipeptídeo Gz43A da invenção tem preferivelmente atividade de β- xilosidase.
[000151] Consequentemente, um polipeptídeo Gz43A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:16, ou para resíduos (i) 19-340, (ii) 53-340, (iii) 19-383, ou (iv) 53-383 de SEQ ID NO:16. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β-xilosidase.
[000152] Fo43A: A sequência de aminoácido de Fo43A (SEQ ID NO:18) é mostrada nas figuras 9B e 53. SEQ ID NO:18 é uma sequência de Fo43A imaturo. Fo43A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 20 de SEQ ID NO:18 (sublinhados na figura 9B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 21 a 348 de SEQ ID NO:18. O domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 9B. Fo43A mostrou ter atividade de β-xilosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando p-nitofenil-β- xilopiranosídeo, xilobiose e/ou xilo-oligômeros lineares, misturados como substratos. Os resíduos catalíticos preditos incluem D37 ou D72, D159, e E251. Como usado aqui, "um polipeptídeo Fo43A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, ou 300 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 18 a 344 de SEQ ID NO:18. Um polipeptídeo Fo43A é preferivelmente inalterado, quando comparado a Fo43A nativo, nos resíduos D37 ou D72, D159, e E251. Um polipeptídeo Fo43A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre um grupo de enzimas incluindo Fo43A e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou todas as 9 outras sequências de aminoácido no alinhamento da figura 53. Um polipeptídeo Fo43A adequadamente compreende o domínio conservado predito de Fo43A nativo como mostrado na figura 9B. Um polipeptídeo exemplar Fo43A compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Fo43A madura como mostrado na figura 9B. O polipeptídeo Fo43A da invenção tem preferivelmente atividade de β- xilosidase.
[000153] Consequentemente, um polipeptídeo Fo43A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:18, ou para resíduos (i) 21-341, (ii) 107-341, (iii) 21-348, ou (iv) 107-348 de SEQ ID NO:18. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β-xilosidase.
[000154] Af43A: A sequência de aminoácido de Af43A (SEQ ID NO:20) é mostrada nas figuras 10B e 53. SEQ ID NO:20 é uma sequência de Af43A imatura. O domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 10B. Af43A mostrou ter atividade de L-α- arabinofuranosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando p- nitofenil-a-L-arabinofuranosídeo como um substrato. Af43A foi mostrado para catalisar a liberação de arabinose do conjunto de oligômeros liberados de hemicelulose por meio da ação de endoxilanase. Os resíduos catalíticos preditos incluem D26 ou D58, D139, e E227. Como usado aqui, "um polipeptídeo Af43A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, ou 300 resíduos de aminoácido contíguo de SEQ ID NO:20. Um polipeptídeo Af43A é preferivelmente inalterado, quando comparado a Af43A nativo, nos resíduos D26 ou D58, D139, e E227. Um polipeptídeo Af43A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre um grupo de enzimas incluindo Af43A e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou todas as 9 outras sequências de aminoácido no alinhamento da figura 53. Um polipeptídeo Af43A adequadamente compreende o domínio conservado predito de Af43A nativo como mostrado na figura 10B. Um polipeptídeo exemplar Af43A compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO:20. O polipeptídeo Af43A da invenção tem preferivelmente a atividade de L-α-arabinofuranosidase.
[000155] Consequentemente, um polipeptídeo Af43A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:20, ou para resíduos (i)15-558, ou (ii)15-295 de SEQ ID NO:20. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de L-α- arabinofuranosidase.
[000156] Pf51A: A sequência de aminoácido de Pf51A (SEQ ID NO:22) é mostrada nas figuras 11B e 54. SEQ ID NO:22 é uma sequência de Pf51A imaturo. Pf51A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 20 de SEQ ID NO:22 (sublinhados na figura 11B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 21 a 642 de SEQ ID NO:22. O domínio conservado de L-α- arabinofuranosidase predito está em tipo negrito na figura 11B. Pf51A mostrou ter atividade de L-α-arabinofuranosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando 4-nitrofenil-a-L-arabinofuranosídeo como um  substrato. Pf51A foi mostrada para catalisar a liberação de arabinose do conjunto de oligômeros liberados de hemicelulose por meio da ação de endoxilanase. Os resíduos ácidos conservados preditos incluem E43, D50, E248, E287, E331, E360, E472, e E480. Como usado aqui, "um polipeptídeo Pf51A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ou 600 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 21 a 642 de SEQ ID NO:22. Um polipeptídeo Pf51A é preferivelmente inalterado, quando comparado a Pf51A nativo, nos resíduos E43, D50, E248, E287, E331, E360, E472, e E480. Um polipeptídeo Pf51A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre Pf51A, Pa51A, e Fv51A, como mostrado no alinhamento da figura 54. Um polipeptídeo Pf51A adequadamente compreende o domínio conservado predito de Pf51A nativo mostrado na figura 11B. Um polipeptídeo exemplar Pf51A compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Pf51A madura mostrada na figura 11B. O polipeptídeo Pf51A da invenção tem preferivelmente atividade de L-α- arabinofuranosidase.
[000157] Consequentemente, um polipeptídeo Pf51A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:22, ou para resíduos (i) 21-632, (ii) 461-632, (iii) 21-642, ou (iv) 461-642 de SEQ ID NO:22. O polipeptídeo tem atividade de L-α- arabinofuranosidase.
[000158] AfuXyn2: A sequência de aminoácido de AfuXyn2 (SEQ ID NO:24) é mostrada nas figuras 12B e 55B. SEQ ID NO:24 é uma sequência de AfuXyn2 imaturo. AfuXyn2 tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 18 de SEQ ID NO:24 (sublinhados na figura 12B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 19 to 228 de SEQ ID NO:24. O domínio conservado GH11 predito está em tipo negrito na figura 12B. AfuXyn2 mostrou ter atividade de endoxilanase indiretamente observando-se sua capacidade de catalisar a produção de monômero de xilose aumentada na presença de xilobiosidase quando as enzimas agem sobre a biomassa pré-tratada ou sobre a hemicelulose isolada. Os resíduos catalíticos conservados incluem E124, E129, e E215. Como usado aqui, "um polipeptídeo AfuXyn2" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, ou 200 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 19 a 228 de SEQ ID NO:24. Um polipeptídeo AfuXyn2 é preferivelmente inalterado, quando comparado ao AfuXyn2 nativo, nos resíduos E124, E129 e E215. Um polipeptídeo AfuXyn2 é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre AfuXyn2, AfuXyn5, e Trichoderma reesei Xyn2, como mostrado no alinhamento da figura 55B. Um polipeptídeo AfuXyn2 adequadamente compreende o domínio conservado inteiro predito de AfuXyn2 nativo mostrado na figura 12B. Um polipeptídeo exemplar AfuXyn2 compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de AfuXyn2 madura mostrada na figura 12B. O polipeptídeo AfuXyn2 da  invenção preferivelmente tem atividade de xilanase.
[000159] AfuXyn5: A sequência de aminoácido de AfuXyn5 (SEQ ID NO:26) é mostrada nas figuras 13B e 55B. SEQ ID NO:26 é uma sequência de AfuXyn5 imatura. AfuXyn5 tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 19 de SEQ ID NO:26 (sublinhados na figura 13B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 20 a 313 de SEQ ID NO:26. O domínio conservado GH11 predito está em tipo negrito na figura 13B. AfuXyn5 mostrou ter atividade de endoxilanase indiretamente observando-se sua capacidade de catalisar a produção de monômero de xilose aumentada na presença de xilobiosidase quando as enzimas agem sobre a biomassa pré-tratada ou sobre a hemicelulose isolada. Os resíduos catalíticos conservados incluem E119, E124, e E210. O CBM predito está próximo à extremidade C-terminal, caracterizada por numerosos resíduos hidrofóbicos e segue as séries ricas em serina, treonina longas de aminoácidos. A região é mostrada sublinhada na figura 55B. Como usado aqui, "um polipeptídeo AfuXyn5" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, ou 275 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 20 a 313 de SEQ ID NO:26. Um polipeptídeo AfuXyn5 é preferivelmente inalterado, quando comparado a AfuXyn5 nativo, nos resíduos E119, E120, e E210. Um polipeptídeo AfuXyn5 é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre AfuXyn5, AfuXyn2, e Trichoderma reesei Xyn2, como mostrado no alinhamento da figura 55B. Um polipeptídeo AfuXyn5 adequadamente compreende o CBM predito inteiro de AfuXyn5 nativo e/ou o domínio conservado inteiro predito de AfuXyn5 nativo (sublinhado) mostrado na figura 13B. Um polipeptídeo exemplar AfuXyn5 compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de AfuXyn5 madura mostrada na figura 13B. O polipeptídeo AfuXyn5 da invenção tem preferivelmente atividade de xilanase.
[000160] Fv43D: A sequência de aminoácido de Fv43D (SEQ ID NO:28) é mostrada nas figuras 14B e 53. SEQ ID NO:28 é uma sequência de Fv43D imaturo. Fv43D tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 20 de SEQ ID NO:28 (sublinhados na figura 14B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 21 a 350 de SEQ ID NO:28. O domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 14B. Fv43D mostrou ter atividade de β-xilosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando p-nitofenil-β-xilopiranosida, xilobiose, e/ou xilo-oligômeros lineares, misturados como substratos. Os resíduos catalíticos preditos incluem D37 ou D72, D159, e E251. Como usado aqui, "um polipeptídeo Fv43D" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, ou 320 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 21 a 350 de SEQ ID NO:28. Um polipeptídeo Fv43D é preferivelmente inalterado, quando comparado a Fv43D nativo, nos resíduos D37 ou D72, D159, e E251. Um polipeptídeo Fv43D é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre um grupo de enzimas incluindo Fv43D e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou todas as 9 outras sequências de aminoácido no alinhamento da figura 53. Um polipeptídeo Fv43D adequadamente compreende o CD predito inteiro de nativo Fv43D mostrado na figura 14B. Um polipeptídeo Fv43D exemplar compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Fv43D madura mostrada na figura 14B. O polipeptídeo Fv43D da invenção tem preferivelmente atividade de β-xilosidase.
[000161] Consequentemente, um polipeptídeo Fv43D da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:28, ou para resíduos (i) 20-341, (ii) 21-350, (iii) 107-341, ou (iv) 107-350 de SEQ ID NO:28. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β-xilosidase.
[000162] Pf43B: A sequência de aminoácido de Pf43B (SEQ ID NO:30) é mostrada nas figuras 15B e 53. SEQ ID NO:30 é uma sequência de Pf43B imaturo. Pf43B tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 20 de SEQ ID NO:30 (sublinhados na figura 15B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 21 a 321 de SEQ ID NO:30. O domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 15B. Resíduos ácidos conservados dentro do domínio conservado incluem D32, D61, D148, e E212. Pf43B mostrou ter atividade de β-xilosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando p-nitrofenil-β-xilopiranosida, xilobiose, e/ou xilo-oligômeros lineares, misturados como substratos. Como usado aqui, "um polipeptídeo Pf43B" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, ou 280 resíduos de aminoácido contíguo entre  os resíduos 21 a 321 de SEQ ID NO:30. Um polipeptídeo Pf43B é preferivelmente inalterado, quando comparado a Pf43B nativo, nos resíduos D32, D61, D148, e E212. Um polipeptídeo Pf43B é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre um grupo de enzimas incluindo Pf43B e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou todas as 9 outras sequências de aminoácido no alinhamento da figura 53. Um polipeptídeo Pf43B adequadamente compreende o domínio conservado predito de Pf43B nativo mostrado na figura 15B. Um polipeptídeo Pf43B exemplar compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Pf43B madura mostrada na figura 15B. O polipeptídeo Pf43B da invenção tem preferivelmente atividade de β-xilosidase.
[000163] Consequentemente, um polipeptídeo Pf43B da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β- xilosidase.
[000164] Fv51A: A sequência de aminoácido de Fv51A (SEQ ID NO:32) é mostrada nas figuras 16B e 54. SEQ ID NO:32 é uma sequência de Fv51A imaturo. Fv51A tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 19 de SEQ ID NO:32 (sublinhados na figura 16B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 20 a 660 de SEQ ID NO:32. O domínio conservado de L-α- arabinofuranosidase predito está em tipo negrito na figura 16B. Fv51A mostrou ter atividade de L-α-arabinofuranosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando 4-nitrofenil-a-L-arabinofuranosídeo como um  substrato. Fv51A foi mostrada para catalisar a liberação de arabinose do conjunto de oligômeros liberados de hemicelulose por meio da ação de endoxilanase. Resíduos conservados incluem E42, D49, E247, E286, E330, E359, E479, e E487. Como usado aqui, "um polipeptídeo Fv51A" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, ou 625 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 20 a 660 de SEQ ID NO:32. Um polipeptídeo Fv51A é preferivelmente inalterado, quando comparado a Fv51A nativo, nos resíduos E42, D49, E247, E286, E330, E359, E479, e E487. Um polipeptídeo Fv51A é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre Fv51A, Pa51A, e Pf51A, como mostrado no alinhamento da figura 54. Um polipeptídeo Fv51A adequadamente compreende o domínio conservado predito de Fv51A nativo mostrado na figura 16B. Um polipeptídeo exemplar Fv51A compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Fv51A madura mostrada na figura 16B. O polipeptídeo Fv51A da invenção tem preferivelmente atividade de L-α- arabinofuranosidase.
[000165] Consequentemente, um polipeptídeo Fv51A da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:32, ou para resíduos (i) 21-660, (ii) 21-645, (iii) 450-645, ou (iv) 450-660 de SEQ ID NO:32. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de L-α-arabinofuranosidase.
[000166] Xyn3: A sequência de aminoácido de Trichoderma reesei Xyn3 (SEQ ID NO:42) é mostrada na figura 21B. SEQ ID NO:42 é uma sequência de Trichoderma reesei Xyn3 imaturo. Trichoderma reesei Xyn3 tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 16 de SEQ ID NO:42 (sublinhados na figura 21B); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 17 a 347 de SEQ ID NO:42. O domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 21B. Trichoderma reesei Xyn3 mostrou ter atividade de endoxilanase indiretamente por observação de sua capacidade de catalisar a produção de monômero de xilose aumentada na presença de xilobiosidase quando as enzimas agem sobre a biomassa pré-tratada ou sobre a hemicelulose isolada. Os resíduos catalíticos conservados incluem E91, E176, E180, E195, e E282, como determinado por alinhamento com outra enzima da família GH10, o Xys1 delta de Streptomyces halstedii (Canals e outro, 2003, Act Crystalogr. D Biol. 59:1447-53), que tem 33% de identidade de sequência para Trichoderma reesei Xyn3. Como usado aqui, "a Trichoderma reesei Xyn3 polipeptídeo"refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, ou 300 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 17 a 347 de SEQ ID NO:42. Um polipeptídeo Xyn3 Trichoderma reeseié preferivelmente inalterado, quando comparado a Trichoderma reesei Xyn3 nativo, nos resíduos E91, E176, E180, E195, e E282. Um polipeptídeo Xyn3 Trichoderma reeseié preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre Trichoderma reesei Xyn3 e Xys1 delta. Um polipeptídeo Xyn3 Trichoderma reesei adequadamente compreende o domínio conservado inteiro predito de Trichoderma reesei Xyn3 nativo mostrado na figura 21B. Um polipeptídeo exemplar Xyn3 Trichoderma reesei compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Trichoderma reesei Xyn3 madura mostrada na figura 21B. O polipeptídeo Trichoderma reesei Xyn3 da invenção tem preferivelmente atividade de xilanase.
[000167] Xyn2: A sequência de aminoácido de Trichoderma reesei Xyn2 (SEQ ID NO:43) é mostrada nas figuras 22 e 55B. SEQ ID NO:43 é uma sequência de Trichoderma reesei Xyn2 imaturo. Trichoderma reesei Xyn2 tem a sequência de prepropeptídeo predita correspondendo aos resíduos 1 a 33 de SEQ ID NO:43 (sublinhados na figura 22); clivagem da sequência sinal predita entre as posições 16 e 17 é predita produzir um propeptídeo que é processado por protease semelhante à quexina entre as posições 32 e 33, gerando a proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 33 a 222 de SEQ ID NO:43. O domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 22. Trichoderma reesei Xyn2 mostrou ter atividade de endoxilanase indiretamente por observação de sua capacidade de catalisar uma produção de monômero de xilose aumentada na presença de xilobiosidase quando as enzimas agem sobre a biomassa pré-tratada ou sobre a hemicelulose isolada. Os resíduos ácidos conservados incluem E118, E123, e E209. Como usado aqui, "um polipeptídeo Trichoderma reesei Xyn2" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 33 a 222 de SEQ ID NO:43. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Xyn2 é preferivelmente inalterado, quando comparado ao Trichoderma reesei Xyn2 nativo, nos resíduos E118, E123, e E209. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Xyn2 é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre Trichoderma reesei Xyn2, AfuXyn2, e AfuXyn5, como mostrado no alinhamento da figura 55B. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Xyn2 adequadamente compreende o domínio conservado inteiro predito de Trichoderma reesei Xyn2 nativo mostrado na figura 22. Um polipeptídeo exemplar Trichoderma reesei Xyn2 compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Trichoderma reesei Xyn2 madura mostrada na figura 22. O polipeptídeo Trichoderma reesei Xyn2 da invenção tem preferivelmente atividade de xilanase.
[000168] Bxl1: A sequência de aminoácido de Trichoderma reesei Bxl1 (SEQ ID NO:44) é mostrada nas figuras 23 e 64. SEQ ID NO:44 é uma sequência de Trichoderma reesei Bxl1 imatura. Trichoderma reesei Bxl1 tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 18 de SEQ ID NO:44 (sublinhados na figura 23); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 19 a 797 de SEQ ID NO:44. Os domínios conservados preditos estão em tipo negrito na figura 23. Trichoderma reesei Bxl1 mostrou ter atividade de β-xilosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático usando p-nitofenil-β-xilopiranosida, xilobiose e/ou xilo-oligômeros lineares, misturados como substratos. Os resíduos ácidos conservados incluem E193, E234, e D310. Como usado aqui, "um polipeptídeo Trichoderma reesei Bxl1" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, ou 750 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 17 a 797 de SEQ ID NO:44. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Bxl1 é preferivelmente inalterado, quando comparado ao Trichoderma reesei Bxl1 nativo, nos resíduos E193, E234, e D310. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Bxl1 é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre Trichoderma reesei Bxl1, Fv3A, e Trichoderma reesei Bgl1, como mostrado no alinhamento da figura 64. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Bxl1 adequadamente compreende os domínios conservados inteiros preditos de Trichoderma reesei Bxl1 nativo mostrado na figura 23. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Bxl1 exemplar compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Trichoderma reesei Bxl1 madura mostrada na figura 23. O polipeptídeo Trichoderma reesei Bxl1 da invenção tem preferivelmente atividade de β-xilosidase.
[000169] Consequentemente, um polipeptídeo Trichoderma reesei Bxl1 da invenção adequadamente compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 44. O polipeptídeo tem adequadamente atividade de β-xilosidase.
[000170] Bgl1: A sequência de aminoácido de Trichoderma reesei Bgl1 (SEQ ID NO:45) é mostrada nas figuras 24 e 64. Trichoderma reesei Bgl1 tem uma sequência sinal predita correspondendo aos resíduos 1 a 19 de SEQ ID NO:45 (sublinhados na figura 24); a clivagem da sequência sinal é predita produzir uma proteína madura tendo uma sequência correspondendo aos resíduos 20 a 744 de SEQ ID NO:45. O  domínio conservado predito está em tipo negrito na figura 24. Trichoderma reesei Bgl1 mostrou ter atividade de β-glicosidase por observação de uma capacidade de catalisar a hidrólise de para- nitrofenil-β-D-glucopiranosideo para produzir para- nitrofenol, e uma capacidade de catalisar a hidrólise de celobiose. Os resíduos ácidos conservados incluem D164, E197, e D267. Como usado aqui, "um polipeptídeo Trichoderma reesei Bgl1" refere-se a um polipeptídeo e/ou uma variante do mesmo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para pelo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, ou 780 resíduos de aminoácido contíguo entre os resíduos 20 a 744 de SEQ ID NO:45. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Bgl1 é preferivelmente inalterado, quando comparado ao Bgl1 nativo, nos resíduos D164, E197, e D267. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Bgl1 é preferivelmente inalterado em pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácido que são conservados entre Trichoderma reesei Bgl1, Fv3A, e Trichoderma reesei Bxl1, como mostrado no alinhamento da figura 64. Um polipeptídeo Trichoderma reesei Bgl1 adequadamente compreende o domínio conservado inteiro predito de Trichoderma reesei Bgl1 nativo mostrado na figura 24. Um polipeptídeo exemplar Trichoderma reesei Bgl1 compreende uma sequência tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade à sequência de Trichoderma reesei Bgl1 madura mostrada na figura 24. O polipeptídeo Trichoderma reesei Bgl1 da invenção tem preferivelmente atividade de β-glicosidase.
[000171] Consequentemente, a presente invenção fornece diversos polipeptídeos ou variantes isolados, sintéticos, ou recombinantes, como descrito abaixo:
[000172] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 24 a 766 de SEQ ID NO:2; (ii) 73 a 321 de SEQ ID NO:2; (iii) 73 a 394 de SEQ ID NO:2; (iv) 395 a 622 de SEQ ID NO:2; (v) 24 a 622 de SEQ ID NO:2; ou (iv) 73 a 622 de SEQ ID NO:2; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de beta-xilosidase; ou
[000173] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 21 a 445 de SEQ ID NO:4; (ii) 21 a 301 de SEQ ID NO:4; (iii) 21 a 323 de SEQ ID NO:4; (iv) 21 a 444 de SEQ ID NO:4; (v) 302 a 444 de SEQ ID NO:4; (vi) 302 a 445 de SEQ ID NO:4; (vii) 324 a 444 de SEQ ID NO:4; ou (viii) 324 a 445 de SEQ ID NO:4; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de beta-xilosidase; ou
[000174] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 19 a 530 de SEQ ID NO:6; (ii) 29 a 530 de SEQ ID NO:6; (iii) 19 a 300 de SEQ ID NO:6; ou (iv) 29 a 300 de SEQ ID NO:6; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de beta-xilosidase; ou
[000175] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 20 a 439 de SEQ ID NO:8; (ii) 20 a 291 de SEQ ID NO:8; (iii) 145 a 291 de SEQ ID NO:8; ou (iv) 145 a 439 de SEQ ID NO:8; o polipeptídeo preferivelmente  tem atividade de beta-xilosidase; ou
[000176] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 23 a 449 de SEQ ID NO:10; (ii) 23 a 302 de SEQ ID NO:10; (iii) 23 a 320 de SEQ ID NO:10; (iv) 23 a 448 de SEQ ID NO:10; (v) 303 a 448 de SEQ ID NO:10; (vi) 303 a 449 de SEQ ID NO:10; (vii) 321 a 448 de SEQ ID NO:10; ou (viii) 321 a 449 de SEQ ID NO:10; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de beta-xilosidase; ou
[000177] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 17 a 574 de SEQ ID NO:12; (ii) 27 a 574 de SEQ ID NO:12; (iii) 17 a 303 de SEQ ID NO:12; ou (iv) 27 a 303 de SEQ ID NO:12; o polipeptídeo preferivelmente tem tanto atividade de beta-xilosidase quanto atividade de L-alfa-arabinofuranosidase; ou
[000178] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 21 a 676 de SEQ ID NO:14; (ii) 21 a 652 de SEQ ID NO:14; (iii) 469 a 652 de SEQ ID NO:14; ou (iv) 469 a 676 de SEQ ID NO:14; o polipeptídeo preferivelmente tem tanto atividade de beta-xilosidase quanto atividade de L-alfa-arabinofuranosidase; ou
[000179] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 19 a 340 de SEQ ID NO:16; (ii) 53 a 340 de SEQ ID NO:16; (iii) 19 a 383 de SEQ ID NO:16; ou (iv) 53 a 383 de SEQ ID NO:16; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de beta-xilosidase; ou
[000180] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 21 a 341 de SEQ ID NO:18; (ii) 107 a 341 de SEQ ID NO:18; (iii) 21 a 348 de SEQ ID NO:18; ou (iv) 107 a 348 de SEQ ID NO:18; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de beta-xilosidase; ou
[000181] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 15 a 558 de SEQ ID NO:20; ou (ii) 15 a 295 de SEQ ID NO:20; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de L-alfa-arabinofuranosidase; ou
[000182] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 21 a 632 de SEQ ID NO:22; (ii) 461 a 632 de SEQ ID NO:22; (iii) 21 a 642 de SEQ ID NO:22; ou (iv) 461 a 642 de SEQ ID NO:22; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de L-alfa-arabinofuranosidase; ou
[000183] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 20 a 341 de SEQ ID NO:28; (ii) 21 a 350 de SEQ ID NO:28; (iii) 107 a 341 de SEQ ID NO:28; ou (iv) 107 a 350 de SEQ ID NO:28; o polipeptídeo tem atividade de beta-xilosidase; ou
[000184] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido que corresponde às posições (i) 21 a 660 de SEQ ID NO:32; (ii) 21 a 645 de SEQ ID NO:32; (iii) 450 a 645 de SEQ ID NO:32; ou (iv) 450 a 660 de SEQ ID NO:32; o polipeptídeo preferivelmente tem atividade de L-alfa-arabinofuranosidase.
[000185] A presente invenção fornece também composições (por exemplo,composições de celulase, ou misturas/composições de enzima) ou caldos de fermentação enriquecidos com um ou mais dos polipeptídeos acima descritos. A mistura/composição de enzima é desse modo uma composição que não ocorre naturalmente. Uma composição de celulase pode ser, por exemplo, a composição de celulase fúngica filamentosa, tal como uma composição de celulase de Trichoderma. O caldo de fermentação pode ser um caldo de fermentação de um fungo filamentoso, por exemplo, um caldo de fermentação de Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Em particular, o caldo de fermentação pode ser, por exemplo, um de Trichoderma spp. tal como um Trichoderma reesei, ou Penicillium spp., tal como um Penicillium funiculosum. O caldo de fermentação pode também adequadamente ser um caldo de fermentação livre de célula.
[000186] Adicionalmente a presente invsenção fornece células hospedeiras que são recombinantemente construídas para expressar um polipeptídeo descrito acima. As células hospedeiras podem ser, por exemplo, célula hospedeira fúngica filamentosa, tal como células de Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, cochliobolus, Pyricularia, ou Chrysosporium. Em particular, as células hospedeiras podem ser, por exemplo, uma célula de Trichoderma spp. (tal como uma célula de Trichoderma reesei), ou uma célula de Penicillium (tal como uma célula de Penicillium funiculosum), uma célula de Aspergillus (tal como uma célula de Aspergillus oryzae ou Aspergillus nidulans), ou uma célula de Fusarium (tal como uma célula de Fusarium verticilloides ou Fusarium oxysporum).
6.1.1 Proteínas de Fusão
[000187] A presente invenção também fornece uma proteína de fusão que inclui um domínio de uma proteína da presente invenção ligada a um ou mais segmentos de fusão, que são tipicamente heterólogos à proteína (isto é, derivada de uma fonte diferente daquela da proteína da invenção). Segmentos de fusão adequados incluem, sem limitação, segmentos que podem realçar a estabilidade da proteína, fornecem outra atividade biológica desejável, e/ou facilitam a purificação da proteína (por exemplo, por cromatografia por afinidade). Um segmento de fusão adequados pode ser um domínio de qualquer tamanho que tenha a função desejada (por exemplo, confere estabilidade, solubilidade, ação ou atividade biológica aumentadas; e/ou simplifica a purificação de uma proteína). Segmentos de fusão podem ser unidos às terminações de amino e/ou carboxila do(s) domínio(s) de uma proteína da presente invenção. Os segmentos de fusão podem ser suscetíveis à clivagem. Pode existir alguma vantagem em ter esta suscetibilidade, por exemplo, pode possibilitar a franca recuperação da proteína de interesse. As proteínas de fusão são preferivelmente produzidas por cultura de uma célula recombinante transfectada com um ácido nucleico de fusão que codifica uma proteína, que inclui um segmento de fusão ligado à extremidade de terminal carboxila ou amino, ou segmentos de fusão ligados a ambas as extremidades de terminal carboxila e amino, de uma proteína, ou um domínio da mesma.
[000188] Consequentemente, proteínas da presente invenção também incluem produtos de expressão de fusões de gene (por exemplo, uma forma superexpressa, solúvel, e ativa de uma proteína recombinante), de genes mutageneizados (por exemplo, genes tendo modificações de códon para realçar a transcrição e translação de gene), e de genes truncados (por exemplo, genes tendo sequências sinais removidas ou substituídas por uma sequência sinal heteróloga).
[000189] Glicosil hidrolases que utilizam substratos insolúveis são frequentemente enzimas modulares. Elas compreendem módulos catalíticos anexos a um ou mais domínios de ligação de carboidrato não catalíticos (CBMs). Em natura, CBMs são supostos promoverem a interação de glicosil hidrolase com seu polissacarídeo substrato alvo. Desse modo, a invenção fornece enzimas quiméricas tendo especificidade de substrato alterada; incluindo, por exemplo, enzimas quiméricas tendo múltiplos substratos como um resultado de CBMs heterólogos "unidos". Os CBMs heterólogos das enzimas quiméricas da invenção podem também ser designados serem modulares, de modo que eles sejam anexados a um módulo catalítico ou domínio catalítico (um "CD", por exemplo, em um sítio ativo), que podem igualmente ser heterólogo ou homólogo à glicosil hidrolase.
[000190] Desse modo, a invenção fornece peptídeos e polipeptídeos consistindo em, ou compreendendo, módulos CBM/CD, que podem ser homologamente emparelhados ou juntados para formar pares CBM/CD quiméricos (heterólogos). Desse modo, estes polipeptídeos/peptídeos quiméricos podem ser usados para melhorar ou alterar a performance de um enzima de interesse. Consequentemente, a invenção fornece enzimas quiméricas compreendendo, por exemplo, pelo menos um CBM de uma enzima de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, ou 45. Um polipeptídeo da descrição, por exemplo, inclui uma sequência de aminoácido compreendendo o CD e/ou CBM da sequência de glicosil hidrolase de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, ou 45. O polipeptídeo da descrição pode desse modo adequadamente ser uma proteína de fusão compreendendo domínios funcionais de duas ou mais diferentes proteínas (por exemplo, um CBM de uma proteína ligada a um CD de outra proteína).
[000191] Os polipeptídeos da descrição podem adequadamente ser obtidos e/ou usados em forma "substancialmente pura". Por exemplo, um polipeptídeo do descrição constitui pelo menos cerca de 80 % peso (por exemplo, pelo menos cerca de 85 % peso, 90 % peso, 91 % peso, 92 % peso, 93 % peso, 94 % peso, 95 % peso, 96 % peso, 97 % peso, 98 % peso, ou 99 % peso) da proteína total em uma dada composição, que também inclui outros ingredientes tal como um tampão ou solução.
[000192] Também, os polipeptídeos da descrição podem adequadamente ser obtidos e/ou usados em caldos de cultura recombinantes (por exemplo, um caldo de cultura fúngica filamentosa). Os caldos de cultura recombinantes podem ser que não ocorre naturalmente; por exemplo, o caldo de cultura pode ser produzido por uma célula hospedeira recombinante que é construída para expressar um polipeptídeo heterólogo da descrição, ou por uma célula hospedeira recombinante que é construída para expressar um polipeptídeo endógeno da descrição em maiores ou menores quantidades do que os níveis de expressão endógena (por exemplo, em uma quantidade que é 1, 2, 3, 4, 5, ou mais vezes maior ou menor do que os níveis de expressão endógena). Além disso, os polipeptídeos da descrição podem adequadamente ser obtidos e/ou usados como caldos de cultura recombinantes produzidos por cepas de célula hospedeira "integradas" que foram construídas para expressar uma pluralidade de polipeptídeos da descrição em taxas desejadas. Taxas desejadas exemplares são descritas aqui, por exemplo, na Seção 6.3.4 abaixo.
6.2 Ácidos Nucleicos e Células Hospedeiras
[000193] A presente invenção fornece ácidos nucleico codificando um polipeptídeo da descrição, por exemplo, um descrito na seção 6.1 acima.
[000194] A invenção fornece ácidos nucleicos recombinantes ou sintéticos, isolados compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 70%, por exemplo, pelo menos cerca de 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%; 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou identidade de sequência completa (100%) para um ácido nucleico de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, ou 50, sobre uma região de pelo menos cerca de 10, por exemplo, pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, ou 2000 nucleotídeos. A presente invenção também fornece ácidos nucleicos codificando pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade hemicelulolítica (por exemplo, uma atividade Xilanase, β-xilosidase, e/ou L-α- arabinofuranosidase).
[000195] Ácidos nucleicos da descrição também incluem ácidos nucleicos recombinantes ou sintéticos, isolados codificando uma enzima tendo a sequência de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, ou 45, e subsequências destas (por exemplo, um domínio conservado ou domínio de ligação de carboidrato ("CBM"), e variantes deste. Um ácido nucleico da descrição pode, por exemplo, codificar a porção madura de uma proteína de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, ou 45.
[000196] A invenção especificamente fornece um ácido nucleico codificando um Fv3A, a Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fv43A, um Fv43B, a Pa51A, a Gz43A, um Fo43A, um Af43A, a Pf51A, um AfuXyn2, um AfuXyn5, a Fv43D, a Pf43B, um Fv43B, um Fv51A, um Trichoderma reesei Xyn3, um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Bxl1, ou um polipeptídeo Bgl1 Trichoderma reesei.
[000197] Por exemplo, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada, em que a molécula de ácido nucleico codifica:
[000198] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 24 a 766 de SEQ ID NO:2; (ii) 73 a 321 de SEQ ID NO:2; (iii) 73 a 394 de SEQ ID NO:2; (iv) 395 a 622 de SEQ ID NO:2; (v) 24 a 622 de SEQ ID NO:2; ou (iv) 73 a 622 de SEQ ID NO:2; ou
[000199] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 21 a 445 de SEQ ID NO:4; (ii) 21 a 301 de SEQ ID NO:4; (iii) 21 a 323 de SEQ ID NO:4; (iv) 21 a 444 de SEQ ID NO:4; (v) 302 a 444 de SEQ ID NO:4; (vi) 302 a 445 de SEQ ID NO:4; (vii) 324 a 444 de SEQ ID NO:4; ou (viii) 324 a 445 de SEQ ID NO:4; ou
[000200] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 19 a 530 de SEQ ID NO:6; (ii) 29 a 530 de SEQ ID NO:6; (iii) 19 a 300 de SEQ ID NO:6; ou (iv) 29 a 300 de SEQ ID NO:6; ou
[000201] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 20 a 439 de SEQ ID NO:8; (ii) 20 a 291 de SEQ ID NO:8; (iii) 145 a 291 de SEQ ID NO:8; ou (iv) 145 a 439 de SEQ ID NO:8; ou
[000202] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 23 a 449 de SEQ ID NO:10; (ii) 23 a 302 de SEQ ID NO:10; (iii) 23 a 320 de SEQ ID NO:10; (iv) 23 a 448 de SEQ ID NO:10; (v) 303 a 448 de SEQ ID NO:10; (vi) 303 a 449 de SEQ ID NO:10; (vii) 321 a 448 de SEQ ID NO:10; ou (viii) 321 a 449 de SEQ ID NO:10; ou
[000203] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 17 a 574 de SEQ ID NO:12; (ii) 27 a 574 de SEQ ID NO:12; (iii) 17 a 303 de SEQ ID NO:12; ou (iv) 27 a 303 de SEQ ID NO:12; ou
[000204] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 21 a 676 de SEQ ID NO:14; (ii) 21 a 652 de SEQ ID NO:14; (iii) 469 a 652 de SEQ ID NO:14; ou (iv) 469 a 676 de SEQ ID NO:14; ou
[000205] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 19 a 340 de SEQ ID NO:16; (ii) 53 a 340 de SEQ ID NO:16; (iii) 19 a 383 de SEQ ID NO:16; ou (iv) 53 a 383 de SEQ ID NO:16; ou
[000206] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 21 a 341 de SEQ ID NO:18; (ii) 107 a 341 de SEQ ID NO:18; (iii) 21 a 348 de SEQ ID NO:18; ou (iv) 107 a 348 de SEQ ID NO:18; ou
[000207] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 15 a 558 de SEQ ID NO:20; ou (ii) 15 a 295 de SEQ ID NO:20; ou
[000208] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 21 a 632 de SEQ ID NO:22; (ii) 461 a 632 de SEQ ID NO:22; (iii) 21 a 642 de SEQ ID NO:22; ou (iv) 461 a 642 de SEQ ID NO:22; ou
[000209] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 20 a 341 de SEQ ID NO:28; (ii) 21 a 350 de SEQ ID NO:28; (iii) 107 a 341 de SEQ ID NO:28; ou (iv) 107 a 350 de SEQ ID NO:28; ou
[000210] um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido correspondendo às posições (i) 21 a 660 de SEQ ID NO:32; (ii) 21 a 645 de SEQ ID NO:32; (iii) 450 a 645 de SEQ ID NO:32; ou (iv) 450 a 660 de SEQ ID NO:32.
[000211] A presente invenção também fornece:
[000212] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:1, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:1, ou para um fragmento da mesma; ou
[000213] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:3, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:3, ou para um fragmento da mesma; ou
[000214] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:5, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:5, ou para um fragmento da mesma; ou
[000215] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:7, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:7, ou para um fragmento da mesma; ou
[000216] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:9, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:9, ou para um fragmento da mesma; ou
[000217] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:11, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:11, ou para um fragmento da mesma; ou
[000218] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:13, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:13, ou para um fragmento da mesma; ou
[000219] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:15, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:15, ou para um fragmento da mesma; ou
[000220] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:17, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:17, ou para um fragmento da mesma; ou
[000221] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:19, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:19, ou para um fragmento da mesma; ou
[000222] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:21, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:21, ou para um fragmento da mesma; ou
[000223] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:27, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:27, ou para um fragmento da mesma; ou
[000224] um ácido nucleico tendo pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência para SEQ ID NO:31, ou um ácido nucleico que é capaz de hibridizar sob condições de alta rigorosidade para um complemento de SEQ ID NO:31, ou para um fragmento da mesma.
[000225] A invenção também fornece cassetes e/ou vetores de expressão compreendendo os ácidos nucleicos descritos acima.
[000226] Adequadamente, o ácido nucleico codificando uma enzima da descrição é operativamente ligado a um promotor. Especificamente, onde expressão recombinante em um hospedeiro fúngico filamentoso é desejada, o promotor pode ser um promotor fúngico filamentoso. Os ácidos nucleicos podem estar, por exemplo, sob o controle de promotores heterólogos. Os ácidos nucleicos podem também ser expressos sob o controle de promotores constitutivos ou induzíveis. Exemplos de promotores que podem ser usados incluem, porém não são limitados a, um promotor celulase, um promotor Xilanase, o promotor 1818 (anteriormente identificado como uma proteína altamente expressa por mapeamento de EST de Trichoderma). Por exemplo, o promotor pode adequadamente ser um promotor de celobioidrolase, endoglucanase, ou β-glucosidase. Um promotor particularmente adequado pode ser, por exemplo, um promotor T. reesei celobioidrolase, endoglucanase, ou β-glucosidase. Por exemplo, o promotor é um promotor de celobioidrolase I (cbh1). Exemplos não limitantes de promotores incluem um promotor de cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, pki1, gpd1, xyn1, ou xyn2. Mais exemplos não limitantes de promotores incluem um promotor de T. reesei cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, pki1, gpd1, xyn1, ou xyn2.
[000227] A presente invenção fornece células hospedeiras que são construídas para expressar uma ou mais enzimas da descrição. Células hospedeiras adequadas incluem células de qualquer microorganismo (por exemplo,células de uma bactéria, um protista, uma alga, um fungo (por exemplo, uma levedura ou fungo filamentoso), ou outro micróbio), e são preferivelmente células de uma bactéria, uma levedura, ou um fungo filamentoso.
[000228] Células hospedeiras adequadas do gênero bacteriano incluem, porém não são limitadas a, células de Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, e Streptomyces. Células adequadas de espécies bacterianas incluem, porém não são limitadas a, células de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus brevis, Pseudomonas aeruginosa, e Streptomyces lividans.
[000229] Células hospedeiras adequadas do gênero de levedura incluem, porém não são limitadas a, células de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, e Phaffia. Células adequadas de espécies de levedura incluem, porém não são limitadas a, célulasde Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, P. canadensis, Kluyveromyces marxianus, e Phaffia rhodozyma.
[000230] Células hospedeiras adequadas de fungos filamentosos incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina. Células adequadas de gênero fúngico filamentoso incluem, porém não são limitadas a, células de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysoporium, Coprinus, Coriolus, Corynascus, Chaetomium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Hypocrea, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus,Scytaldium, Schizophyllum, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, e Trichoderma.Células adequadas podem também incluir células de várias formas anamorfas e teleomorfas deste  gênero fúngico filamentoso.
[000231] Células adequadas de espécies fúngicas filamentosas incluem, porém não são limitadas a, células de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Penicillium purpurogenum, Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiate, Pleurotus eryngii, Talaromyces flavus, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, e Trichoderma viride.
[000232] A invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante que é construída para expressar um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais de um polipeptídeo Fv3A, a Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Af43A, um Pf51A, um AfuXyn2, um AfuXyn5, um Fv43D, um Pf43B, e um Fv51A. A célula hospedeira recombinante é, por exemplo, uma célula hospedeira Trichoderma reesei recombinante. Em um exemplo particular, a invenção fornece um fungo recombinante, tal como uma Trichoderma reesei recombinante, que é construída para expressar um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais de um polipeptídeo Fv3A, a Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Af43A, a Pf51A, um AfuXyn2, um AfuXyn5, um Fv43D, um Pf43B, e um Fv51A. A invenção fornece uma célula hospedeira Trichoderma reesei recombinante construída para expressar 1, 2, 3, 4, 5, ou mais de um polipeptídeo Fv3A, um Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Af43A, um Pf51A, um AfuXyn2, um AfuXyn5, um Fv43D, um Pf43B, e um Fv51A.
[000233] A invenção fornece uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira fúngica recombinante ou um fungo filamentoso recombinante, construído para expressar recombinantemente pelo menos uma Xilanase, pelo menos uma β-xilosidase, e uma L-α- arabinofuranosidase. A invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante, por exemplo, uma célula hospedeira fúngica recombinante ou um fungo filamentoso recombinante tal como uma Trichoderma reesei recombinante, que é construída para expressar 1, 2, 3, 4, 5, ou mais de um polipeptídeo Fv3A, a Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Af43A, um Pf51A, um AfuXyn2, um AfuXyn5, um Fv43D, um Pf43B, e um Fv51A, além de um ou mais de Trichoderma reesei Xyn2, Trichoderma reesei Xyn3, Trichoderma reesei Bxl1 e/ou Trichoderma reesei Bgl1. A célula hospedeira recombinante é, por exemplo, uma célula hospedeira Trichoderma reesei. O fungo recombinante é, por exemplo, uma Trichoderma reesei recombinante. A invenção fornece uma célula hospedeira Trichoderma reesei, ou um fungo Trichoderma reesei recombinante, que é construído para recombinantemente expressar 1, 2, 3, 4, 5, ou mais de um polipeptídeo Fv3A, um Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Af43A, um Pf51A, um AfuXyn2, um AfuXyn5, um Fv43D, um Pf43B, e um Fv51A, além de recombinantemente expressar um ou mais de Trichoderma reesei Xyn2, Trichoderma reesei Xyn3, Trichoderma reesei Bxl1 e/ou Trichoderma reesei Bgl1.
[000234] A presente invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante por exemplo, uma célula hospedeira fúngica recombinante ou um organismo recombinante, por exemplo, um fungo filamentoso, tal como uma Trichoderma reesei recombinante, que é construída para recombinantemente expressar polipeptídeos Trichoderma reesei Xyn3, Trichoderma reesei Bgl1, Fv3A, Fv43D, e Fv51A. Por exemplo, a célula hospedeira recombinante é adequadamente uma célula hospedeira Trichoderma reesei. O fungo recombinante é adequadamente uma Trichoderma reesei recombinante. A invenção fornece, por exemplo, uma célula hospedeira Trichoderma reeseiconstruída para recombinantemente expressar polipeptídeos Trichoderma reesei Xyn3, Trichoderma reesei Bgl1, Fv3A, Fv43D, e Fv51A.
[000235] Adicionalmente a invenção fornece uma célula hospedeira recombinante ou fungo recombinante que é construído para expressar uma mistura de enzima compreendendo enzimas adequadas em taxas adequadas para sacarificação. A célula hospedeira recombinante é, por exemplo, uma célula hospedeira fúngica. O fungo recombinante é, por exemplo, uma Trichoderma reesei recombinante. Taxas/quantidades de enzima exemplares presentes em misturas de enzima adequadas são descritas na seção 6.3.4 abaixo.
[000236] A invenção também fornece plantas transgênicas compreendendo um ácido nucleico da descrição ou um cassete de expressão da descrição. A planta transgênica pode ser, por exemplo, uma planta de cereal, uma planta de milho, uma planta de batata, uma planta de tomate, uma planta de trigo, uma planta oleaginosa, uma planta de colza, uma planta de soja, um planta de arroz, uma planta de cevada, ou uma planta de tabaco.
6.3 Misturas de Enzima para Sacarificação
[000237] A presente invenção fornece uma composição compreendendo uma mistura/composição de enzima que é capaz de quebrar material de lignocelulose. Tal composição/mistura de multi- enzima compreende pelo menos um polipeptídeo da presente descrição, em combinação com um ou mais polipeptídeos adicionais da presente descrição, ou uma ou mais enzimas de outros microorganismos, plantas, ou organismos. Combinações de enzima sinérgicas e métodos relacionados são contemplados. A invenção inclui métodos para identificar as relações ideais das enzimas inclusas nas misturas/composições para degradar um material lignocelulósico particular. Estes métodos incluem, por exemplo, testes para identificar a mistura/composição de enzima ideal e taxas para conversão eficiente de um dado substrato lignocelulósico em seus açucares constituintes. Os exemplos abaixo incluem ensaios que podem ser usados para identificar relações ideais e misturas/composições de enzimas com que para degradar materiais lignocelulósicos.
6.3.1 Antecedentes
[000238] As paredes celulares de plantas maiores são compreendidas de uma variedade de componentes de polímero de carboidrato (CP). Estes CP interagem através de meios covalentes e não covalentes, fornecendo a integridade estrutural requerida para formar paredes celulares rígidas e resistir à pressão de turgor em plantas. O maior CP encontrado em plantas é celulose, que forma a espinha dorsal estrutural da parede celular. Durante biossíntese de celulose, cadeias de poli-β- 1,4-D-glicose auto-associam-se por meio de ligação de hidrogênio e interações hidrofóbicas para formar microfibrilas de celulose, que também auto-associam-se para formar fibrilas maiores. Microfibrilas de celulose são frequentemente irregulares estruturamente e contêm regiões de cristalinidade variável. O grau de cristalinidade de fibrilas de celulose depende de quão firmemente ordenada a ligação de hidrogênio está entre suas cadeias de celulose de componente. Áreas com ligações menos ordenadas, e portanto, mais cadeias de glicose acessíveis, são referidas como regiões amorfas.
[000239] O modelo geral para despolimerização de celulose em glicose envolve um mínimo de três atividades enzimáticas distintas. Endoglucanases clivam cadeias de celulose internamente em cadeias menores em um processo que aumenta o número de extremidades acessíveis, que são mais suscetíveis à atividade de exoglucanase do que as cadeias de celulose intactas. Estas exoglucanases (por exemplo, celobioidrolases) são específicas para extremidades de redução ou extremidades de não redução, liberando, na maior parte dos casos, celobiose, o dímero de glicose. A celobiose de acumulação é em seguida submetida à clivagem por celobiases (por exemplo, β-1,4- glucosidases) em glicose.
[000240] Celulose contém somente anidro-glicose. Ao contrário, hemicelulose contém diversos diferentes monômeros de açúcar. Por exemplo, asida de glicose, monômeros de açucar em hemicelulose podem também incluir xilose, manose, galactose, ramnose, e arabinose. Hemiceluloses principalmente contém açucares de D-pentose e ocasionalmente pequenas quantidades de L-açucares. Xilose está tipicamente presente em maior quantidade, porém ácido manurônico e ácido galacturônico também tendem a estar presentes. Hemiceluloses incluem xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano, e xiloglucano.
[000241] As composições de enzimas e multi-enzimas da descrição são úteis para sacarificação de materiais de hemicelulose, incluindo, por exemplo, xilano, arabinoxilano, e substratos contendo xilano ou arabinoxilano. Arabinoxilano é um polissacarídeo composto de xilose e arabinose, em que resíduos de L-α -arabinofuranose são ligados como pontos de ramificação a uma espinha dorsal polimérica de xilose ligada a β-(1,4).
[000242] A maior parte de fontes de biomassa são mais complexas, contendo celulose, hemicelulose, pectina, lignina, proteína, e cinza, entre outros componentes. Consequentemente, em certos aspectos, a presente invenção fornece misturas/composições de enzima contendo enzimas que transmitem um faixa ou variedade de especificidades de substrato quando trabalham juntar para degradar biomassa em açúcares fermentáveis da maneira mais eficiente. Um exemplo de uma composição/mistura de multi-enzima da presente invenção é uma mistura de celobioidrolase(s), xilanase(s), endoglucanase(s), β- glucosidase(s), β-xilosidase(s), e, opcionalmente, proteínas auxiliares. A mistura/composição de enzima é adequadamente a composição que não ocorre naturalmente.
[000243] Consequentemente, a invenção fornece misturas/composições de enzima (incluindo produtos de fabricação) compreendendo uma mistura de enzimas de hidrólise de xilano, hidrólise de hemicelulose e/ou celulose, que inclui pelo menos uma, diversas, ou todas de uma celulase, incluindo uma glucanase; uma celobioidrolase; uma L-α-arabinofuranosidase; uma xilanase; uma β- glucosidase; e uma β-xilosidase. Preferivelmente cada das misturas/composições de enzima da descrição compreende pelo menos uma enzima da descrição. A presente invenção também fornece misturas/composições de enzima que são composições que não ocorre naturalmente. Como usado aqui, o termo "misturas/composições de enzima" refere-se a:
[000244] uma composição feita combinando enzimas de componente, se na forma de um caldo de fermentação ou parcialmente ou completamente isolada ou purificada;
[000245] uma composição produzida por um organismo modificado para expressar uma ou mais enzimas de componente; em certas modalidades, o organismo usado para expressar uma ou mais enzimas de componente pode ser modificado para deletar um ou mais genes; em certas outras modalidades, o organismo usado para expressar uma ou mais enzimas de componente pode também compreender proteínas afetando hidrólise de xilano, hidrólise de hemicelulose, e/ou hidrólise de celulose;
[000246] uma composição feita combinando enzimas de componente simultaneamente, separadamente, ou sequencialmente durante a reação de sacarificação ou fermentação; e
[000247] uma mistura de enzima produzida in situ, por exemplo, durante a reação de sacarificação ou fermentação;
[000248] uma composição produzida de acordo com quaisquer ou todos dos acima (1)-(4).
[000249] O termo "caldo de fermentação"como usado aqui refere-se a uma preparação de enzima produzida por fermentação que sofre nenhuma ou mínima recuperação e/ou purificação subsequente à fermentação. Por exemplo, culturas microbianas são desenvolvidas para saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir síntese de proteína (por exemplo,expressão de enzimas). Em seguida, uma vez que as enzima(s) são secretadas no meio de cultura celular, os caldos de fermentação podem ser usados. Os caldos de fermentação da descrição podem conter conteúdos fracionados ou não fracionados dos derivados de materiais de fermentação na terminação da fermentação. Por exemplo, os caldos de fermentação da invenção são não fracionados e compreendem os detritos celulares e meio de cultura gastos presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) sofrerem um processo de fermentação. O caldo de fermentação pode adequadamente conter o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares, e células microbianas vivas ou mortas. Alternativamente, os caldos de fermentação podem ser fracionados para remover as células microbianas. Naqueles casos, os caldos de fermentação podem, por exemplo, compreender o meio de cultura celular gasto e as enzimas extracelulares.
[000250] Quaisquer das enzimas descritas especificamente aqui podem ser combinadas com qualquer uma ou mais das enzimas descritas aqui ou com quaisquer outras enzimas adequadas e disponíveis, para produzir uma composição/mistura de multi-enzima adequada. A invenção não é restrita ou limitada às combinações exemplares específicas listadas abaixo.
6.3.2 Biomassa
[000251] A invenção fornece métodos e processos para sacarificação de biomassa, usando enzimas, misturas/composições de enzima da descrição. O termo "biomassa," como usado aqui, refere-se a qualquer composição compreendendo celulose e/ou hemicelulose (opcionalmente também lignina em materiais de biomassa lignocelulósicos). Como usado aqui, biomassa inclui, sem limitação, sementes, grãos, tubérculos, resíduos de planta ou subprodutos de processo de alimento ou processo industrial (por exemplo, caules), milho (incluindo, por exemplo, sabugos, palha, e similares), grama (incluindo, por exemplo, grama indiana, tal como Sorghastrum nutans; ou, switchgrass, por exemplo,espécies Panicum, tal como Panicum virgatum), madeira (incluindo, por exemplo, lascas de madeira, resíduos de processamento), papel, polpa, e papel reciclado (incluindo, por exemplo, jornal, papel de impressora, e similares). Outros materiais de biomassa incluem, sem limitação, batatas, soja (por exemplo, colza), cevada, centeio, aveia, trigo, beterraba, e bagaço de cana-de-açucar.
[000252] A invenção fornece métodos de sacarificação compreendendo contatar uma composição compreendendo um material de biomassa, por exemplo, um material compreendendo xilano, hemicelulose, celulose, e/ou um açúcar fermentável, com um polipeptídeo do descrição, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da descrição, ou quaisquer uma das misturas/composições de enzima, ou produtos de fabricação da descrição.
[000253] A biomassa sacarificada (por exemplo, material lignocelulósico processado por enzimas da descrição) pode ser feita em alguns produtos com base em bio, por meio de processos tais como, por exemplo,fermentação microbiana e/ou síntese química. Como usado aqui, "fermentação microbiana" refere-se a um processo de crescimento e colheita de microorganismos de fermentação sob condições adequadas. O microorganismo de fermentação pode ser qualquer microorganismo adequado para uso em um processo de fermentação desejado para a produção de produtos com base em bio. Microorganismos de fermentação adequados incluem, sem limitação, fungos filamentosos, levedura, e bactéria. A biomassa sacarificada pode, por exemplo, ser feita em um combustível (por exemplo, um biocombustível tal como um bioetanol, biobutanol, biometanol, um biopropanol, um biodiesel, um combustível de avião, ou similares) por meio de fermentação e/ou síntese química. A biomassa sacarificada pode, por exemplo, também ser feita em uma química de mercadoria (por exemplo,ácido ascórbico, isopreno, 1,3-propanodiol), lipídios, aminoácidos, proteínas, e enzimas, por meio de fermentação e/ou síntese química.
6.3.3. Pré-tratamento
[000254] Antes da sacarificação, a biomassa (por exemplo, material lignocelulósico) é preferivelmente submetida a uma ou mais etapa(s) de pré-tratamento a fim de render xilano, hemicelulose, celulose e/ou material de lignina mais acessíveis ou suscetíveis às enzimas e desse modo mais receptível à hidrólise pelas enzima(s) e/ou misturas/composições de enzima da descrição.
[000255] Em uma modalidade exemplar, o pré-tratamento implicas submeter material de biomassa a um catalisador compreendendo uma solução diluída de um ácido forte e um sal de metal em um reator. O material de biomassa pode, por exemplo, ser um material bruto ou um material seco. Este pré-tratamento pode reduzir a energia de ativação, ou a temperatura, de hidrólise de celulose, fundamentalmente permitindo produções maiores de açúcares fermentáveis. Veja, por exemplo, patente dos Estados Unidos Nos. 6.660.506; 6.423.145.
[000256] Outro método de pré-tratamento exemplar implica em hidrolisar a biomassa submetendo o material de biomassa a uma primeira etapa de hidrólise em um meio aquoso em uma temperatura e uma pressão escolhidas para efetuar despolimerização primária de hemicelulose sem ativar despolimerização significante de celulose em glicose. Esta etapa produz uma suspensão em que a fase aquosa líquida contem monossacarídeos dissolvidos resultantes de despolimerização de hemicelulose, e uma fase sólida contendo celulose e lignina. A suspensão é em seguida submetida a uma segunda etapa de hidrólise sob condições que permitam uma maior porção da celulose ser despolimerizada, produzindo uma fase aquosa líquida contendo produtos de despolimerização dissolvidos/solúveis de celulose. Veja, por exemplo, patente dos Estados Unidos No. 5.536.325.
[000257] Um outro método exemplar envolve processar um material de biomassa por um ou mais estágios de hidrólise de ácido diluída usando cerca de 0,4% a cerca de 2% de um ácido forte; seguido por tratamento do componente lignocelulósico sólido não reagido do material hidrolisado por ácido com deslignificação alcalina. Veja, por  exemplo, patente dos Estados Unidos No. 6.409.841.
[000258] Outro método de pré-tratamento exemplar compreende pré- hidrolisar a biomassa (por exemplo, materiais lignocelulósicos) em um reator de pré-hidrólise; adicionar um líquido acídico ao material lignocelulósico sólido para preparar a mistura; aquecer a mistura para temperatura reacional; manter a temperatura reacional durante um período de tempo suficiente para fracionar o material lignocelulósico em uma porção solubilizada contendo pelo menos cerca de 20% da lignina do material lignocelulósico, e uma fração sólida contendo celulose; separar a porção solubilizada da fração sólida, e remover a porção solubilizada enquanto em ou próximo à temperatura reacional; e recuperar a porção solubilizada. A celulose na fração sólida é prestada mais receptível à digestão enzimática. Veja, por exemplo, patente dos Estados Unidos No. 5.705.369.
[000259] Outros métodos de pré-tratamento podem envolver o uso de peróxido de hidrogênio H2O2. Veja Gould, 1984, Biotech, e Bioengr. 26:46-52.
[000260] Pré-tratamento pode também compreender contatar um material de biomassa com quantidades estequiométricas de hidróxido de sódio e hidróxido de amônio em uma concentração muito baixa. Veja Teixeira e outro,1999, Appl. Biochem.and Biotech. 77-79:19-34.
[000261] Pré-tratamento pode também compreender contatar uma lignocelulose com uma química (por exemplo, uma base, tal como carbonato de sódio ou hidróxido de potássio) em um pH de cerca de 9 a cerca de 14 em temperatura, pressão, e pH moderados. Veja PCT Publication WO2004/081185.
[000262] Amônia é usada, por exemplo, em um método de pré- tratamento preferido. Tal método de pré-tratamento compreende submeter um material de biomassa à baixa concentração de amônia sob condições de sólidos elevados. Veja, por exemplo, Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20070031918 e publicação PCT WO 06110901.
6.3.4 Misturas de Enzima Exemplares
[000263] A presente invenção fornece misturas/composições de enzima compreendendo uma ou mais enzimas da descrição. Uma ou mais enzimas das misturas/composições de enzima podem ser produzidas por uma célula hospedeira recombinante ou um organismo recombinante. As misturas/composições de enzima são adequadamente composições que não ocorre naturalmente.
[000264] Uma mistura/composição de enzima da descrição pode adequadamente compreender um primeiro polipeptídeo tendo atividade de β-xilosidase, e também compreende 1, 2, 3, ou 4 de um segundo polipeptídeo tendo atividade de β-xilosidase, um ou mais polipeptídeos tendo atividade de L-α-arabinofuranosidase, um ou mais polipeptídeos tendo atividade de xilanase, e um ou mais polipeptídeos tendo atividade de celulase. O primeiro polipeptídeo tendo atividade de β-xilosidase é, por exemplo, um polipeptídeo Fv3A, um Pf43A, um Fv43E, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, ou um Fv39A. O segundo polipeptídeo tendo atividade de β-xilosidase, se presente, é, por exemplo, diferente do primeiro polipeptídeo tendo atividade de β- xilosidase, e é adequadamente um polipeptídeo Fv3A, um Pf43A, um Fv43E, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fv43D, um Fo43A, um Fv39A, ou um Trichoderma reesei Bxl1. Cada dos um ou mais polipeptídeos tendo atividade de L-α-arabinofuranosidase, se presente, é, por exemplo, um polipeptídeo Af43A, um Pf51A, um Pa51A, um Fv43B, ou um Fv51A. Cada dos um ou mais polipeptídeos tendo atividade de xilanase é, por exemplo, um Trichoderma reesei Xyn, um Trichoderma reesei Xyn2, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5. Cada dos um ou mais polipeptídeos tendo atividade de celulase, se presente, é, por exemplo, uma endoglucanase, por exemplo, um Trichoderma reesei  EG1 ou EG2, uma celobioidrolase, por exemplo, um Trichoderma reesei CBH1 ou CBH2, ou uma β-glucosidase, por exemplo, um Trichoderma reesei Bgl1.
[000265] Outra mistura/composição de enzima da descrição pode adequadamente compreender um primeiro polipeptídeo tendo atividade de L-α-arabinofuranosidase, e também compreende 1, 2, 3, ou 4 de um segundo polipeptídeo tendo atividade de L-α-arabinofuranosidase, um ou mais polipeptídeos tendo atividade de β-xilosidase, um ou mais polipeptídeos tendo atividade de xilanase, e/ou um ou mais polipeptídeos tendo atividade de celulase. A primeira L-α- arabinofuranosidase é um polipeptídeo Af43A, um Pf51A, ou um Fv51A. A segunda L-α-arabinofuranosidase é diferente da primeira L-α- arabinofuranosidase, e é, por exemplo, um polipeptídeo Af43A, um Pf51A, um Pa51A, um Fv43B, ou um Fv51A. Cada das um ou mais β- xilosidases é, por exemplo, um polipeptídeo Fv3A, um Pf43A, um Fv43E, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Fv43D, um Gz43A, um Fo43A, um Fv39A, ou um Trichoderma reesei Bxl1. Em certas modalidades, cada das uma ou mais xilanases é um polipeptídeo Trichoderma reesei Xyn3, um Trichoderma reesei Xyn2, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5. Em certas modalidades, cada das uma ou mais celulases é independentemente uma endoglucanase, por exemplo, um polipeptídeo Trichoderma reesei EG1 ou EG2, uma celobioidrolase, por exemplo, um polipeptídeo Trichoderma reesei CBH1 ou CBH2, ou uma β-glucosidase, por exemplo, um polipeptídeo Bgl1 Trichoderma reesei.
[000266] Xilanases: As xilanase(s) adequadamente constituem cerca de 0,05 % peso a cerca de 75 % peso das enzimas em uma mistura/composição de enzima da descrição (isto é, a percentagem de Xilanase(s) é uma percentagem de peso relativa ao peso de todas as proteínas na composição) ou uma base de peso relativa (isto é, em que a percentagem de Xilanase(s) é um percentagem de peso relativa ao  peso combinado de Xilanases, β-xilosidases, celulases, L-α- arabinofuranosidases, e proteínas auxiliares). A relação de qualquer par de proteínas relacionadas entre si pode ser prontamente calculada nas misturas/composições de enzima da descrição. Misturas/composições compreendendo enzimas em qualquer relação de peso derivada da percentagem de pesos descrita aqui são contempladas. O conteúdo de xilanase pode ser em uma faixa em que o limite inferior é de 0,05 % peso, 1 % peso, 2 % peso, 3 % peso, 4 % peso, 5 % peso, 6 % peso, 7 % peso, 8 % peso, 9 % peso, 10 % peso, 12 % peso, 15 % peso, 20 % peso, 25 % peso, 30 % peso, 40 % peso, 45 % peso, ou 50 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição de enzima, e o limite superior é de 10 % peso, 15 % peso, 20 % peso, 25 % peso, 30 % peso, 35 % peso, 40 % peso, 50 % peso, 55 % peso, 60 % peso, 65 % peso, 70 % peso, ou 75 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição de enzima. Uma ou mais xilanases em uma composição ou mistura de enzima podem representar, por exemplo, 5 % peso a 20 % peso, 10 % peso a 15 % peso, ou 15 % peso a 25 % peso do total de enzimas na mistura/composição de enzima. Xilanases adequadas exemplares para inclusão nas misturas/composições de enzima da descrição são descritas na seção 6.3.6 abaixo.
[000267] L-α-arabinofuranosidases: A(s) L-α-arabinofuranosidase(s) adequadamente constitui(em) cerca de 0,05 % peso a cerca de 75 % peso do peso total de todas as enzimas em uma determinada mistura/composição de enzima (isto é, em que a percentagem de L-α- arabinofuranosidase(s) é uma percentagem de peso relativa ao peso de todas as proteínas na mistura/composição) ou uma base de peso relativa (isto é, em que a percentagem de L-α-arabinofuranosidase(s) é uma percentagem de peso relativa ao peso combinado de Xilanases, β- xilosidases, celulases, L-α-arabinofuranosidases, e proteínas auxiliares). A relação de qualquer par de proteínas relacionadas entre si pode ser prontamente calculada com base na invenção. Misturas/composições compreendendo enzimas em qualquer relação de peso derivada das percentagens de peso descritas aqui são contempladas. O conteúdo de L-α-arabinofuranosidase pode ser em uma faixa em que o limite inferior é de 0,05 % peso, 1 % peso, 2 % peso, 3 % peso, 4 % peso, 5 % peso, 6 % peso 7 % peso, 8 % peso, 9 % peso, 10 % peso, 12 % peso, 15 % peso, 20 % peso, 25 % peso, 30 % peso, 40 % peso, 45 % peso, ou 50 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição, e o limite superior é de 10 % peso, 15 % peso, 20 % peso, 25 % peso, 30 % peso, 35 % peso, 40 % peso, 50 % peso, 55 % peso, 60 % peso, 65 % peso, 70 % peso ou 75 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição. Por exemplo, uma ou mais L-α- arabinofuranosidase(s) podem adequadamente representar 2 % peso a 25 % peso; 5 % peso a 20 % peso; ou 5 % peso a 10 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição. L-α-arabinofuranosidase(s) adequada(s) exemplar(es) para inclusão nas misturas/composições de enzima da descrição são descritas na seção 6.3.8 abaixo.
[000268] β-Xilosidases: A β-xilosidase(s) adequadamente constitui cerca de 0,05 % peso a cerca de 75 % peso do peso total de enzimas em uma mistura/composição de enzima. A relação de qualquer par de proteínas relacionadas entre si pode ser prontamente calculada com base na invenção aqui. Misturas/composições compreendendo enzimas em qualquer relação de peso derivada das percentagens de peso descritas aqui são contempladas. O conteúdo de β-xilosidase pode ser em uma faixa em que o limite inferior é de cerca de 0,05 % peso, 1 % peso, 2 % peso, 3 % peso, 4 % peso, 5 % peso, 6 % peso 7 % peso, 8 % peso, 9 % peso, 10 % peso, 12 % peso, 15 % peso, 20 % peso, 25 % peso, 30 % peso, 40 % peso, 45 % peso, ou 50 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição, e o limite superior é de cerca de 10% peso, 15 % peso, 20 % peso, 25 % peso, 30 % peso, 35 % peso, 40 % peso, 50 % peso, 55 % peso, 60 % peso, 65 % peso, 70 % peso, ou 75 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição. Por exemplo, a(s) β-xilosidase(s) podem representar cerca de 0,05 % peso a cerca de 75 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição. Também, a(s) β-xilosidase(s) podem representar 0,05 % peso a cerca de 70 % peso, cerca de 1 % peso a cerca de 65 % peso, cerca de 1 % peso a cerca de 60 % peso, cerca de 2 % peso a cerca de 55 % peso, cerca de 3 % peso a cerca de 50 % peso, cerca de 4 % peso a cerca de 45 % peso, ou cerca de 5 % peso a cerca de 40 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição. Em ainda um outro exemplo, a(s) β-xilosidase(s) adequadamente representa(m) 2 % peso a 30 % peso; 10 % peso a 20 % peso; ou 5 % peso a 10 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição. β-xilosidase(s) adequada(s) exemplar(es) são descritas na seção 6.3.7 abaixo.
[000269] Celulases: A(s) celulase(s) adequadamente constitui cerca de 0,05 % peso a cerca de 90 % peso do peso total de enzimas em uma mistura/composição de enzima. Relação de qualquer par de proteínas relacionadas entre si pode ser prontamente calculada com base na invenção aqui. Misturas/composições compreendendo enzimas em qualquer relação de peso derivada das percentagens de peso descritas aqui são contempladas. O conteúdo de celulase pode ser em uma faixa em que o limite inferior é de cerca de 0,05 % peso, 5 % peso, 10 % peso, 20 % peso, 30 % peso, 40 % peso, 50 % peso, 60 % peso, 70 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição, e o limite superior é de cerca de 20 % peso, 30 % peso, 40 % peso, 50 % peso, 60 % peso, 70 % peso, 80 % peso, ou 90 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição. Por exemplo, a(s) celulase(s) adequadamente representa 30 % peso a 80 % peso, 50 % peso a 70 % peso, ou 40 % peso a 60 % peso do peso total de enzimas na mistura/composição. Celulases adequadas exemplares são descritas  na seção 6.3.5 abaixo. Os componentes de celulase em uma mistura/composição de enzima da descrição são adequadamente capazes de ativar pelo menos cerca de 0,005 produto de fração por mg de proteína por grama de celulose dilatada de ácido fosfórico (PASC) como determinado por um ensaio de calcoflúor. Por exemplo, os componentes celulase em uma mistura/composição da descrição são capazes de ativar uma faixa de produto de fração por mg de proteína por grama de PASC, em que o limite inferior da faixa é cerca de 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,075, ou 0.1, e em que o limite superior da faixa é 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,075, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, ou 0,7. Os componentes de celulase em uma mistura/composição da descrição podem, por exemplo, ativar 0,00005 - 0,0001, 0,0005 - 0,001, 0,001- 0,005, 0,005- 0,03, 0,01-0,06, 0,02-0,04, 0,01-0,03, 0,020,05, 0,02-0,04, 0,01-0,05, 0,015-0,035, ou 0,015-0,075 produto de fração por mg de proteína por grama de PASC como determinado por um ensaio de calcoflúor. A celulase pode ser, por exemplo, uma celulase total. A celulase pode também, por exemplo, adequadamente ser enriquecida com uma β-glucosidase.
[000270] Proteínas Auxiliares: A mistura/composição de enzima pode adequadamente também compreender uma ou mais proteínas auxiliares. O conteúdo de proteína acessório de uma mistura/composição de enzima pode variar de cerca de 0 % peso a cerca de 60 % peso do peso total de proteínas em uma mistura/composição de enzima. Relação de qualquer par de proteínas relacionadas entre si pode ser prontamente determinada com base na invenção aqui. Misturas/composições compreendendo enzimas em qualquer relação de peso derivada das percentagens de peso descrita aqui são contempladas. O conteúdo de proteína acessório pode ser em uma faixa em que o limite inferior é de 0 % peso, 1 % peso, 2 % peso, 3 % peso, 4 % peso, 5 % peso, 6 % peso, 7 % peso, 8 % peso, 10 %  peso, 12 % peso, 15 % peso, 20 % peso, 25 % peso, ou 35 % peso do peso total de proteínas na mistura/composição de enzima, e o limite superior é de 2 % peso, 3 % peso, 4 % peso, 5 % peso, 6 % peso, 7 % peso, 8 % peso, 9 % peso, 10 % peso, 11 % peso, 12 % peso, 13 % peso, 14 % peso 15 % peso, 20 % peso, 30 % peso, 40 % peso, 50 % peso, ou 60 % peso do peso total de proteínas na mistura/composição de enzima. Por exemplo, a(s) proteína(s) acessória(s) pode adequadamente representar 0 % peso a 2 % peso, 5 % peso a 10 % peso, 20 % peso a 50 % peso, ou 2 % peso a 5 % peso na mistura/composição de enzima. Proteínas acessórias adequadas exemplares para inclusão nas misturas/composições de enzima da descrição são descritas na seção 6.3.9 abaixo.
[000271] A presente invenção fornece uma primeira mistura/composição de enzima para sacarificação de lignocelulose compreendendo:
[000272] cerca de 30 % peso a cerca de 80 % peso (por exemplo, 30 % peso a 80 % peso, 35 % peso a 75 % peso, 40 % peso a 70 % peso, 40 % peso a 60 % peso, 50 % peso a 70 % peso, etc.) de celulase(s), por exemplo, celulase total ou celulase total enriquecida por β- glucosidase ;
[000273] cerca de 3 % peso a cerca de 50 % peso (por exemplo, 5 % peso a 40 % peso, 10 % peso a 30 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 10 % peso a 15 % peso, 15 % peso a 25 % peso, etc.) de xilanase(s), por exemplo, um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, um AfuXyn5, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores;
[000274] cerca de 2 % peso a cerca de 40 % peso (por exemplo, 2 % peso a 35 % peso, 5 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 2 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc.) de β-xilosidase(s), por exemplo, um Fv3A, a Pf43A, um Fv43D, um Fv39A, um Fv43E, um Fv43A, um Fv43B, a Pa51A, um Fo43A, um Gz43A, um Trichoderma reesei Bxl1, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores;
[000275] cerca de 2 % peso a cerca de 40 % peso (por exemplo, 2 % peso a 35 % peso, 5 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 2 % peso a 25 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc) de L-α-arabinofuranosidase(s), por exemplo, um Af43A, um Fv43B, um Pa51A, um Pf51A, um Fv51A, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores; e
[000276] cerca de 0 % peso a cerca de 50 % peso (2 % peso a 40 % peso, 5 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 0 % peso a 2 % peso, 5 % peso a 10 % peso, 20 % peso a 50 % peso, 2 % peso a 5 % peso, etc) de proteína(s) acessória(s).
[000277] A presente invenção fornece uma segunda mistura/composição de enzima para sacarificação de lignocelulose compreendendo:
[000278] cerca de 30 % peso a cerca de 80 % peso (por exemplo, 30 % peso a 80 % peso, 35 % peso a 75 % peso, 40 % peso a 70 % peso, 40 % peso a 60 % peso, 50 % peso a 70 % peso, etc.) de celulase(s), por exemplo, celulase total ou celulase total enriquecida por β- glucosidase, ou cerca de 2 % peso a cerca de 10 % peso (por exemplo, 2 % peso a 8 % peso, 4 % peso a 6 % peso, 2 % peso a 4 % peso, 6 % peso a 8 % peso, 8 % peso a 10 % peso, 2 % peso a 10 % peso, etc) de β-glucosidase(s), por exemplo, um Trichoderma reesei Bgl1;
[000279] cerca de 3 % peso a cerca de 50 % peso (por exemplo, 5 % peso a 40 % peso, 10 % peso a 30 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 10 % peso a 15 % peso, 15 % peso a 25 % peso, etc.) de xilanase(s), por exemplo, um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, um AfuXyn5, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores;
[000280] cerca de 2 % peso a cerca de 40 % peso (por exemplo, 2 % peso a 35 % peso, 5 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 2 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc.) de pelo menos duas β-xilosidase(s), em que pelo menos uma β- xilosidase é selecionada do grupo 1 e pelo menos uma β-xilosidase é selecionada do grupo 2;
[000281] em que:
[000282] Grupo 1: um Fv3A, um Fv43A, ou uma mistura destes;
[000283] Grupo 2: um Fv43D, um Pa51A, um Gz43A, um Trichoderma reesei Bxl1, a Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fo43A, um Fv43B, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores;
[000284] (4) cerca de 2 % peso a cerca de 25 % peso (por exemplo, 2 % peso a 25 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc) de L-α-arabinofuranosidase(s), por exemplo, um Af43A, um Fv43B, um Pa51A, um Pf51A, Fv51A, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores; e
[000285] (5) cerca de 0 % peso a cerca de 50 % peso (2 % peso a 40 % peso, 5 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 0 % peso a 2 % peso, 5 % peso a 10 % peso, 20 % peso a 50 % peso, 2 % peso a 5 % peso, etc) de proteína(s) acessória(s).
[000286] A presente invenção fornece uma terceira mistura/composição de enzima para sacarificação de lignocelulose compreendendo:
[000287] cerca de 3 % peso a cerca de 50 % peso (por exemplo, 5 % peso a 40 % peso, 10 % peso a 30 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 10 % peso a 15 % peso, 15 % peso a 25 % peso, etc.) de xilanase(s), por exemplo, um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, um AfuXyn5, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores; e
[000288] cerca de 2 % peso a 40 % peso (por exemplo, 2 % peso a 35  % peso, 5 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 2 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc.) de pelo menos duas β-xilosidase(s), em que pelo menos uma β-xilosidase é selecionada do grupo 1 e pelo menos uma β-xilosidase é selecionada do grupo 2; em que:
[000289] Grupo 1: um Fv3A, um Fv43A, ou uma mistura destes;
[000290] Grupo 2: um Fv43D, um Pa51A, um Gz43A, um Trichoderma reesei Bxl1, a Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fo43A, um Fv43B, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores.
[000291] A presente invenção fornece uma quarta mistura/composição de enzima para sacarificação de lignocelulose compreendendo:
[000292] cerca de 5 % peso a cerca de 25 % peso (por exemplo, 2 % peso a 25 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc) de xilanase(s), por exemplo, um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, um AfuXyn5, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores;
[000293] cerca de 2 % peso a cerca de 30 % peso (por exemplo, 2 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc.) de β-xilosidase(s), por exemplo, um Fv3A, a Pf43A, um Fv43D, um Fv39A, um Fv43E, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Trichoderma reesei Bxl1, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores; e
[000294] cerca de 2 % peso a cerca de 50 % peso (por exemplo, 2 % peso a 5 % peso, 5 % peso a 45 % peso, 10 % peso a 40 % peso, 15 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 15 % peso a 40 % peso, etc) de β-glucosidase(s), por exemplo, um Trichoderma reesei Bgl1.
[000295] A presente invenção fornece uma quinta mistura/composição de enzima para sacarificação de lignocelulose  compreendendo:
[000296] cerca de 5 % peso a cerca de 25 % peso (por exemplo, 2 % peso a 25 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc) de xilanase(s), por exemplo, um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, um AfuXyn5, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores; e
[000297] cerca de 2 % peso a cerca de 30 % peso (por exemplo, 2 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc.) de β-xilosidase(s), por exemplo, um Fv3A, a Pf43A, um Fv43D, um Fv39A, um Fv43E, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Trichoderma reesei Bxl1, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores.
[000298] A presente invenção fornece uma sexta mistura/composição de enzima para sacarificação de lignocelulose compreendendo:
[000299] cerca de 2 % peso a cerca de 50 % peso (por exemplo, 2 % peso a 5 % peso, 5 % peso a 45 % peso, 10 % peso a 40 % peso, 15 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 15 % peso a 40 % peso, etc) de β-glucosidase(s), por exemplo, um Bgl1;
[000300] cerca de 3 % peso a cerca de 50 % peso (por exemplo, 5 % peso a 40 % peso, 10 % peso a 30 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 10 % peso a 15 % peso, 15 % peso a 25 % peso, etc.) de xilanase(s), por exemplo, um Trichoderma reesei Xyn2, um Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, um AfuXyn5, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores;
[000301] cerca de 2 % peso a 40 % peso (por exemplo, 2 % peso a 35 % peso, 5 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 25 % peso, 2 % peso a 30 % peso, 10 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc.) de β- xilosidase(s), por exemplo, um Fv3A, a Pf43A, um Fv43D, um Fv39A, um Fv43E, um Fv43A, um Fv43B, um Pa51A, um Gz43A, um Fo43A, um Trichoderma reesei Bxl1, ou uma mistura de duas ou mais das  enzimas anteriores; e
[000302] cerca de 2 % peso a cerca de 25 % peso (por exemplo, 2 % peso a 25 % peso, 5 % peso a 20 % peso, 5 % peso a 10 % peso, etc) de L-α-arabinofuranosidase(s), por exemplo, um Af43A, um Fv43B, um Pa51A, um Pf51A, Fv51A, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores.
[000303] A sexta mistura/composição de enzima para sacarificação de lignocelulose acima pode, por exemplo, compreender cerca de 2 % peso a cerca de 40 % peso de pelo menos duas β-xilosidase, em que pelo menos uma β-xilosidase é selecionada do grupo 1 e pelo menos uma β- xilosidase é selecionada do grupo 2; em que:
[000304] Grupo 1: um Fv3A, um Fv43A, ou uma mistura destes;
[000305] Grupo 2: um Fv43D, um Pa51A, um Gz43A, um Trichoderma reesei Bxl1, um Pf43A, um Fv43E, um Fv39A, um Fo43A, um Fv43B, ou uma mistura de duas ou mais das enzimas anteriores.
[000306] Onde uma mistura/composição de enzima da descrição contém tanto grupo 1 quanto grupo 2 de β-xilosidases, a relação do grupo 1 para grupo 2 de β-xilosidases é preferivelmente 1:10 a 10:1. Por exemplo, a relação é adequadamente 1:2 a 2:1, 2:5 a 5:2, 3:8 a 8:3, 1:4 a 4:1, 1:5 a 5:1, 1:7 a 7:1, ou qualquer faixa entre qualquer par das finalidades anteriores (por exemplo, 1:10 a 2:1, 4:1 a 2:5, 3:8 a 5:1, etc.). Um exemplo particular de uma relação adequada é aproximadamente 1:1.
[000307] Onde uma mistura/composição de enzima da descrição contém um Fv43A como uma β-xilosidase, a mistura/composição pode também conter Fv43B como uma L-α-arabinofuranosidase.
[000308] Uma mistura/composição de enzima da descrição é, por exemplo, adequadamente parte da mistura de reação de sacarificação contendo biomassa além dos componentes da mistura/composição de enzima. Por exemplo, a mistura de reação de sacarificação pode ser  caracterizada por 1, 2, 3 ou todas as 4 das seguintes características:
[000309] o peso total de xilanase(s) por kg de hemicelulase na referida mistura de reação de sacarificação é em uma faixa sem que o limite inferior seja cerca de 0,5 g, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 7 g, ou 10 g, e o limite superior seja de independentemente cerca de 5 g, 7 g, 10 g, 15 g, 20 g, 30 g, ou 40 g; por exemplo, o peso total de xilanase(s) por kg de hemicelulase na mistura reacional pode ser 0,5 g a 40 g, 0,5 g a 30 g, 0,5 g a 20 g, 0,5 a 10 g, 0,5 a 5 g, 1 g a 40 g, 2 g a 40 g, 3 g a 40 g, 5 g a 40 g, 7 g a 30 g, 10 g a 30 g, 5 g a 20 g, ou 5 g a 30 g.
[000310] o peso total de β-xilosidase(s) por kg de hemicelulase na referida mistura de reação de sacarificação é em uma faixa sem que o limite inferior seja cerca de 0,5 g, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 7 g, ou 10 g e o limite superior seja de independentemente cerca de 5 g, 7 g, 10 g, 15 g, 20 g, 30 g, 40 g, ou 50 g; por exemplo, o peso total de β-xilosidase(s) por kg de hemicelulase na mistura reacional pode ser 0,5 g a 40 g, 0,5 a 50 g, 0,5 g a 30 g, 0,5 g a 20 g, 0,5 g a 10 g, 0,5 g a 5g, 1 g a 40 g, 2 g a 40 g, 3 g a 40 g, 5 g a 40 g, 7 g a 30 g, 10 g, to 30 g, 5 g a 30 g, 5 g a 20 g.
[000311] o peso total de L-α-arabinofuranosidase(s) por kg de hemicelulase na referida mistura de reação de sacarificação é em uma faixa sem que o limite inferior seja cerca de 0,2 g, 0,5 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 2,5 g, 3 g, 4 g, ou 5 g e o limite superior seja de independentemente cerca de 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 7 g, 10 g, 15 g, ou 20 g; por exemplo, o peso total de L-α-arabinofuranosidase(s) por kg de hemicelulase na mistura reacional pode ser 0,2 g a 20 g, 0,5 g a 20 g, 1 g a 20 g, 2 g a 20 g, 2,5 g a 20 g, 3 g a 15 g, 4 g a 20 g, 5 g a 15 g, 5 g a 10 g, 5 g a 20 g, ou 2,5 g a 15 g.
[000312] o peso total de celulase(s) por kg de celulase na referida mistura de reação de sacarificação é em uma faixa sem que o limite inferior seja cerca de 1 g, 3 g, 5 g, 7 g, 10 g, 12 g, 15 g, 18 g, ou 20 g, e o limite superior seja de independentemente cerca de 10 g, 15 g, 18 g,  20 g, 25 g, 30 g, 50 g, 75 g, ou 100 g; por exemplo, o peso total de celulase(s) por kg de celulase na referida mistura reacional pode ser 1 g a 100 g, 3 g a 100 g, 5 g a 100 g, 7 g a 100 g, 12 g a 100 g, 15 g a 100 g, 18 g a 100 g, 3 g a 75 g, 5 g a 50 g, 7 g a 75 g, 10 g a 75 g, 10 g a 50 g, 12 g a 75 g, 12 g a 50 g, 15 g a 75 g, 15 g a 50 g, 18 g a 30 g, 18 g a 75 g.
6.3.5. Celulases
[000313] As misturas/composições de enzima da invenção podem compreender um ou mais celulases. As celulases são enzimas que hidrolizam celulose (ligações β-1,4-glucano ou β-D-glucosidicas) resultando na formação de glicose, celobiose, celooligossacarídeos, e similares. Celulases têm sido tradicionalmente divididas em três classes principais: endoglucanases (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanases ou celobioidrolases (EC 3.2.1.91) ("CBH") e β-glucosidases (β -D- glicosídeo glucoidrolase; EC 3.2.1.21) ("BG") (Knowles e outro, 1987, Trends in Biotechnology 5(9):255-261; Shulein, 1988, Métodos in Enzymology, 160:234-242). Endoglucanases agem principalmente nas partes amorfas da fibra de celulose, ao passo que celobioidrolases são também capazes de degradarem celulose cristalina.
[000314] Celulases para uso de acordo com os métodos e composições da invenção podem ser obtidass de, ou produzidas recombinantemente de, entre outras coisas, um ou mais dos seguintes organismos: Crinipellis scapella, Macrophomina phaseolina, Myceliophthora thermophila, Sordaria fimicola, Volutella colletotrichoides, Thielavia terrestris, Acremonium sp., Exidia glandulosa, Fomes fomentarius, Spongipellis sp., Rhizophlyctis rosea, Rhizomucor pusillus, Phycomyces niteus, Chaetostylum fresenii, Diplodia gossypina, Ulospora bilgramii, Saccobolus dilutellus, Penicillium verruculosum, Penicillium chrysogenum, Thermomyces verrucosus, Diaporthe syngenesia, Colletotrichum lagenarium, Nigrospora sp., Xylaria hypoxilon, Nectria pinea, Sordaria macrospora, Thielavia thermophila, Chaetomium mororum, Chaetomium virscens, Chaetomium brasiliensis, Chaetomium cunicolorum, Syspastospora boninensis, Cladorrhinum foecundissimum, Scytalidium thermophila, Gliocladium catenulatum, Fusarium oxysporum ssp. lycopersici, Fusarium oxysporum ssp. passiflora, Fusarium solani, Fusarium anguioides, Fusarium poae, Humicola nigrescens, Humicola grisea, Panaeolus retirugis, Trametes sanguinea, Schizophyllum commune, Trichothecium roseum, Microsphaeropsis sp., Acsobolus stictoideus spej., Poronia punctata, Nodulisporum sp., Trichoderma sp. (por exemplo, Trichoderma reesei) e Cylindrocarpon sp.
[000315] Por exemplo, uma celulase para uso no método e/ou composição da invenção é um celulase total e/ou é capaz de obter pelo menos produto de fração 0,1 (por exemplo 0,1 a 0,4) como determinado para o ensaio de calcoflúor descrito na Seção 7.1.10 abaixo.
6.3.5.1 β-Glucosidase
[000316] As misturas/composições de enzima da invenção podem opcionalmente compreender uma ou mais β-glucosidases. O termo "β- glucosidase"como usado aqui refere-se a uma β-D-glicosideo glucoidrolase classificada como EC 3.2.1.21, e/ou membros de certas famílias GH, incluindo, sem limitação, membros de famílias GH 1, 3, 9 ou 48, que catalisam a hidrólise de celobiose para liberar β-D-glicose.
[000317] B-glucosidase adequada pode ser obtidas de diversos microorganismos , por métodos recombinantes, ou ser adquiridas de fontes comerciais. Exemplos de β- glucosidases de microorganismos incluem, sem limitação, aquelas de bactérias e fungos. Por exemplo, uma β-glucosidase da presente invenção é adequadamente obtida de um fungo filamentoso.
[000318] As β-glucosidases podem ser obtidas, ou produzidas recombinantemente, de, entre outras coisas, Aspergillus aculeatus  (Kawaguchi e outro Gene 1996, 173: 287-288), Aspergillus kawachi (Iwashita e outro Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65: 5546-5553), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Celulomonas biazotea (Wong e outro Gene, 1998, 207:79-86), Penicillium funiculosum (WO 2004/078919), Saccharomycopsis fibuligera (Machida e outro Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54: 3147-3155), Schizosaccharomyces pombe (Wood e outro Nature 2002, 415: 871-880), ou Trichoderma reesei (por exemplo, β-glucosidase 1 (Patente dos Estados Unidos No. 6.022.725), β-glucosidase 3 (Patente dos Estados Unidos No. 6.982.159), β- glucosidase 4 (Patente dos Estados Unidos No. 7.045.332), β- glucosidase 5 (Patente dos Estados Unidos No. 7,005,289), β- glucosidase 6 (Publicação dos Estados Unidos No. 20060258554), β- glucosidase 7 (Publicação dos Estados Unidos No. 20060258554)).
[000319] A β-glucosidase pode ser produzida expressando um gene endógeno ou exógeno codificando uma β-glucosidase. Por exemplo, β- glucosidase pode ser secretada no espaço extracelular, por exemplo, por organismos Gram-positivos (por exemplo, Bacillus ou Actinomycetes), ou eukaryotic hosts (por exemplo, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces, ou Pichia). A β-glucosidase pode ser, em algumas circunstâncias, superexpressa ou subexpressa.
[000320] A β-glucosidase pode também ser obtida de fontes comerciais. Exemplos de preparação de β-glucosidase comercial adequada para uso na presente invenção incluem, por exemplo, Trichoderma reesei β-glucosidase em Accelerase® BG (Danisco US Inc., Genencor); NOVOZYM™ 188 (a β-glucosidase de Aspergillus niger); Agrobacterium sp. β-glucosidase, e Thermatoga maritima β- glucosidase de Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Ireland.).
[000321] Além disso, a β-glucosidase pode ser um componente de uma celulase total, como descrito na Seção 6.3.5.4 abaixo.
[000322] A atividade de β-glucosidase podem ser determinada por diversos métodos adequados conhecidos na técnica, tal como o ensaio descrito por Chen e outro, em Biochimica et Biophysica Acta 1992, 121:54-60, em que 1 pNPG denota 1 μmoL de Nitrophenol liberado de 4-nitrophenyl-β-D-glucopiranosida em 10 minutos a 50°C (122°F) e pH 4,8.
6.3.5.2 Endoglucanases
[000323] As misturas/composições de enzima da invenção opcionalmente compreendem um ou mais endoglucanase. Qualquer endoglucanase (EC 3.2.1.4) pode ser usada nos métodos e composições da presente invenção. Uma endoglucanase pode ser produzida expressando um gene de endoglucanase endógeno ou exógeno. A endoglucanase pode ser, em algumas circunstâncias, superexpressa ou subexpressa.
[000324] Por exemplo, Trichoderma reesei EG1 (Penttila e outro, Gene 1986, 63:103-112) e/ou EG2 (Saloheimo e outro, Gene 1988, 63:11-21) são adequadamente usados nos métodos e composições da presente invenção.
[000325] Uma endoglucanase de Thielavia terrestris termoestável (Kvesitadaze e outro, Applied Biochem. Biotech. 1995, 50:137-143) é, em outro exemplo, usada nos métodos e composições da presente invenção. Além disso, uma Trichoderma reesei EG3 (Okada e outro Appl. Environ. Microbiol. 1988, 64:555-563), EG4 (Saloheimo e outro, Eur. J. Biochem. 1997, 249: 584-591), EG5 (Saloheimo e outro, Molecular Microbiology 1994, 13:219-228), EG6 (Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 20070213249), ou EG7 (Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 20090170181), um Acidothermus celulolyticus EI endoglucanase (Patente dos Estados Unidos No. 5.536.655), a Humicola insolens endoglucanase V (EGV) (Proteína Data Bank entry 4ENG), uma endoglucanase de Staphylotrichum coccosporum  (Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 20070111278), uma endoglucanas F1-CMC de Aspergillus aculeatus (Ooi e outro, ácido nucleico Res. 1990, 18:5884), uma endoglucanase CMCase-1 de Aspergillus kawachii IFO 4308 (Sakamoto e outro Curr. Genet. 1995, 27:435-439), uma endoglucanase de Erwinia carotovara (Saarilahti e outro Gene 1990, 90:9-14); ou uma Acremonium thermophilum ALKO4245 (Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 20070148732) pode também ser usada. Endoglucanases adequadas adicionais são descritas em, por exemplo, WO 91/17243, WO 91/17244, WO 91/10732, Patente dos Estados Unidos No. 6.001.639.
6.3.5.3 Celobioidrolases
[000326] Qualquer celobioidrolase (EC 3.2.1.91) ("CBH") pode ser opcionalmente usada nos métodos e misturas/composições da presente invenção. A celobioidrolase podem ser produzida expressando um gene de celobioidrolase endógena ou exógena. A celobioidrolase pode ser, em algumas circunstâncias, superexpressa ou subexpressa.
[000327] Por exemplo, Trichoderma reesei CBHI (Shoemaker e outro Bio/Technology 1983, 1:691-696) e/ou CBHII (Teeri e outro Bio/Technology 1983, 1:696-699) pode ser adequadamente usados nos métodos e misturas/composições da presente invenção.
[000328] CBHs adequados pode ser selecionados de um Agaricus bisporus CBH1 (Acessão de Prot. Suíço No. Q92400), um Aspergillus aculeatus CBH1 (Acessão Prot. Suíço No. O59843), um Aspergillus nidulans CBHA (Acessão GenBank No. AF420019) ou CBHB (Acessão GenBank No. AF420020), um Aspergillus niger CBHA (Acessão GenBank No. AF156268) ou CBHB (Acessão GenBank No. AF156269), a Claviceps purpurea CBH1 (Acessão Prot. Suíço No. O00082), a Cochliobolus carbonarum CBH1 (Acessão Prot. Suíço No. Q00328), a Cryphonectria parasitica CBH1 (Acessão Prot. Suíço No. Q00548), a Fusarium oxysporum CBH1 (Cel7A) (Acessão Prot. Suíço No. P46238), a Humicola grisea CBH1.2 (Acessão GenBank No. U50594), a Humicola grisea var. thermoidea CBH1 (Acessão GenBank No. D63515) a CBHI.2 (Acessão GenBank No. AF123441), ou um exo1 (Acessão GenBank No. AB003105), a Melanocarpus albomyces Cel7B (Acessão GenBank No. AJ515705), a Neurospora crassa CBHI (Acessão GenBank No. X77778), a Penicillium funiculosum CBHI (Cel7A) (Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 20070148730), a Penicillium janthinellum CBHI (Acessão GenBank No. S56178), a Phanerochaete chrysosporium CBH (Acessão GenBank No. M22220), ou a CBHI-2 (Cel7D) (Acessão GenBank No. L22656), a Talaromyces emersonii CBH1A (Acessão GenBank No. AF439935), a Trichoderma viride CBH1 (Acessão GenBank No. X53931), ou a Volvariella volvacea V14 CBH1 (Acessão GenBank No. AF156693).
6.3.5.4 Celulases Totais
[000329] Uma mistura/composição de enzima da invenção pode também compreender uma celulase total. Como usado aqui, uma "celulase total" refere-se a ou uma composição contendo celulase de ocorrência natural ou uma que não ocorre naturalmente compreendendo pelo menos 3 diferentes tipos de enzima: (1) uma endoglucanase, (2) uma celobioidrolase, e (3) uma β-glucosidase, ou compreendendo pelo menos 3 diferentes atividades enzimáticas: (1) uma atividade de endoglucanase, que catalisa a clivagem de ligações β-1,4 internas, resultando em glicooligossacarídeos mais curtos, (2) uma atividade de celobioidrolase, que catalisa uma liberação do tipo "exo" de unidades de celobiose (β-1,4 glicose-dissacarídeo de glicose), e (3) uma atividade de β-glucosidase, que catalisa a liberação de de monômero de glicose de celooligossacarídeos curtos (por exemplo, celobiose).
[000330] Uma composição "contendo celulase de ocorrência natural" é aquela produzida por uma fonte de ocorrências natural, que compreende um ou mais componentes ou atividades do tipo celobioidrolase, um ou mais to tipo endoglucanase, e um ou mais do tipo β-glucosidase, em que cada destes componentes ou atividades é encontrado na relação e nível produzido em natura, não tocado pela mão humana. Consequentemente, uma composição contendo celulase de ocorrência natural é, por exemplo, aquela que é produzida por um organismo não modificado com respeito às enzimas celulolíticas de modo que a relação ou níveis das enzimas do componente não sejam alterados daqueles produzidos pelo organismo nativo em natura. Uma "composição contendo celulase que não ocorre naturalmente" refere-se a uma composição produzida por: (1) combinando enzimas celulolíticas de componesnte ou em uma relação de ocorrência natural ou uma relação que não ocorre naturalmente, isto é, alterada; ou (2) modificação de um organismo para superexpressar ou subexpressar um ou mais enzimas celulolíticas; ou (3) modificação de um organismo de modo que pelo menos uma enzima celulolítica seja deletada. Uma composição "contendo celulase que não ocorre naturalmente" pode também referir- se a uma composição resultando em ajustar as condições de cultura para um organismo de ocorrência natural, de modo que o organismo de ocorrência natural desenvolve-se sob uma condição não nativa, e produz um nível ou relação alterada de enzimas. Consequentemente, em algumas modalidades, a preparação de celulase total da presente invenção pode ter um ou mais EGs e/ou CBHs e/ou β-glucosidases deletadas e/ou superexpressas.
[000331] Na presente invenção, uma preparação de celulase total pode ser de qualquer microorganismo que é capaz de hidrolisar um material celulósico. Em algumas modalidades, a preparação de celulase total é uma celulase total fúngica filamentosa. Por exemplo, a preparação de celulase total pode ser de uma espécie Acremonium, Aspergillus, Emericela, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Scytalidium, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma. A preparação de celulase total é, por exemplo, uma celulase total de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae. Além disso, a preparação de celulase total podem ser uma preparação de celulase total de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. A preparação de celulase total pode também ser uma preparação de celulase total de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Penicillium funiculosum, Scytalidium thermophilum, ou Thielavia terrestris. Além disso, a preparação de celulase total podem ser um Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei (por exemplo, RL-P37 (Sheir-Neiss G e outro Appl. Microbiol. Biotechnology, 1984, 20, pp.46-53), QM9414 (ATCC No. 26921), NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56466, 56767), ou uma preparação de celulase total de Trichoderma viride (por exemplo, ATCC 32098 e 32086) .
[000332] A preparação de celulase total pode, em particular, adequadamente ser uma preparação de celulase total de Trichoderma reesei RutC30, que é disponível da American Type Culture Collection como Trichoderma reesei ATCC 56765. Por exemplo, a preparação de celulase total pode também adequadamente ser uma celulase total de Penicillium funiculosum, que é available do American Type Culture Collection como Penicillium funiculosum ATCC Número: 10446.
[000333] A preparação de celulase total pode também ser obtida de fontes comerciais. Exemplos de preparações de celulase comercial adequadas para uso nos métodos e composições da presente invenção incluem, por exemplo, CELUCLAST™ e Celic™ (Novozymes A/S) e LAMINEX™ BG, IndiAge™ 44L, Primafast™ 100, Primafast™ 200, Spezyme™ CP, Accelerase® 1000 e Accelerase® 1500 (Danisco US. Inc., Genencor).
[000334] Preparações de celulase total adequadas podem ser preparadas usando quaisquer métodos de cultivo de microorganismo conhecidos na técnica, especialmente fermentação, resultando na expressão de enzimas capazes de hidrolisar um material celulósico. Como usado aqui, "fermentação"refere-se a cultivo em frasco de agitação, fermentação de pequena ou grande escala, tal como contínua, batelada, batelada alimentada, ou fermentações em estado sólido em laboratório ou fermentadores industriais realizadas em um meio adequado e sob condições que permitem uma celulase e/ou enzimas de interesse ser expressa e/ou isolada.
[000335] Geralmente, o microorganismo é cultivado em um meio de cultura celular adequado para a produção de enzimas capazes de hidrolisar um material celulósico. O cultivo ocorre em um meio de nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos e variações conhecidos na técnica. Meios de cultura adequados, faixas de temperatura e outras condições para o crescimento e produção de celulase são conhecidos na técnica. Como um exemplo não limitante, uma faixa de temperatura típica para a produção de celulases por Trichoderma reeseié 24°C a 28°C
[000336] A preparação de celulase total pode ser usada como ela é produzida por fermentação com nenhuma ou mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, assim que as celulases são secretadas no meio de cultura celular, o meio de cultura celular contendo as celulases podem ser usado diretamente. A preparação de celulase total pode compreender o teor de material de fermentação não fracionado, incluindo o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares e células. Por outro lado, a preparação de celulase total pode também ser submetida a outro processamento em diversas etapas de rotina, por exemplo, precipitação, centrifugação, cromatografia por afinidade, filtração, ou similares. Por exemplo, a preparação de celulase total pode ser concentrada, e em seguida usada sem outra purificação. A preparação de celulase total pode, por exemplo, ser formulada para compreender certos agentes químicos que diminuem a viabilidade celular ou mata as células após a fermentação. As células podem, por exemplo, ser lisadas ou permeabilizadas usando métodos conhecidos na técnica.
[000337] A atividade de endoglucanase da preparação de celulase total podem ser determinada usando carboximetil celulose (CMC) como um substrato. Um ensaio adequado mede a produção de extremidades de redução criadas pela mistura de enzima agindo sobre CMC em que 1 unidade é a quantidade de enzima que libera 1 μmoL de produto/min (Ghose, T. K., Pure & Appl. Chem. 1987, 59, pp. 257-268).
[000338] A celulase total pode ser uma celulase enriquecida por β- glucosidase. uma celulase total enriquecida por β-glucosidase geralmente compreende uma β-glucosidase e uma preparação de celulase total. As composições de celulase total enriquecidas por β- glucosidase podem ser produzidas por métodos recombinantes. Por exemplo, tal preparação de celulase total pode ser obtida expressando uma β-glucosidase em um microorganismo capaz de produzir uma celulase total. uma celulase total enriquecida por composição de β- glucosidase pode também, por exemplo, compreender uma preparação de celulase total e uma β-glucosidase. , por exemplo, a composição de celulase total enriquecida por β-glucosidase pode adequadamente compreender pelo menos 5 % peso, 7 % peso, 10 % peso, 15 % peso ou 20 % peso, e até 25 % peso, 30 % peso, 35 % peso, 40 % peso, ou 50 %peso de β-glucosidase com base no peso total de proteínas naquela mistura/composição.
6.3.6 Xilanases
[000339] As misturas/composições de enzima da invenção, por exemplo, podem compreender uma ou mais Xilanases de Grupo A, que podem ser um Trichoderma reesei Xyn2, a Trichoderma reesei Xyn3, um AfuXyn2, ou um AfuXyn5. Adequado Trichoderma reesei Xyn2, Trichoderma reesei Xyn3, AfuXyn2, ou polipeptídeo AfuXyn5s são descritos na Seção 6.1 acima.
[000340] As misturas/composições de enzima da invenção opcionalmente compreendem uma ou mais Xilanases em adição a ou em lugar de uma ou mais Xilanases de Grupo A. Qualquer Xilanase (EC 3.2.1.8) pode ser usada como a adicional uma ou mais Xilanases. As Xilanases adequadas incluem, por exemplo, uma Caldocelum saccharolyticum Xilanase (Luthi e outro 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56(9):2677-2683), uma Thermatoga maritima Xilanase (Winterhalter & Liebel, 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61(5):1810-1815), uma Xilanase FJSS-B.1 da Cepa Thermatoga Sp. (Simpson e outro 1991, Biochem. J. 277, 413-417), uma Bacillus circulans Xilanase (BcX) (Patente dos Estados Unidos No. 5,405,769), uma Aspergillus niger Xilanase (Kinoshita e outro 1995, Journal de Fermentação e Bioengineering 79(5):422-428), uma Streptomyces lividans Xilanase (Shareck e outro 1991, Gene 107:75-82; Morosoli e outro 1986 Biochem. J. 239:587-592; Kluepfel e outro 1990, Biochem. J. 287:45-50), uma Bacillus subtilis Xilanase (Bernier e outro 1983, Gene 26(1):59-65), uma Cel ulomonas fimi Xilanase (Clarke e outro, 1996, FEMS Microbiology Letters 139:2735), uma Pseudomonas fluorescens Xilanase (Gilbert e outro 1988,  Journal de General Microbiology 134:3239-3247), uma Clostridium thermocelum Xilanase (Dominguez e outro, 1995, Nature Structural Biology 2:569-576), uma Bacillus pumilus Xilanase (Nuyens e outro Applied Microbiology e Biotechnology 2001, 56:431-434; Yang e outro 1998, ácidos nucleicos Res. 16(14B):7187), a Clostridium acetobutylicum P262 Xilanase (Zappe e outro 1990, ácidos nucleicos Res. 18(8):2179), ou a Trichoderma harzianum Xilanase (Rose e outro 1987, J. Mol. Biol.194(4):755-756).
[000341] A Xilanase pode ser produzida expressando um gene endógeno ou exógeno codificando a Xilanase. A Xilanase pode ser, em algumas circunstâncias, superexpressa ou subexpressa.
6.3.7 β-Xilosidases
[000342] As misturas/composições de enzima da invenção, por exemplo, podem adequadamente compreender um ou mais β- xilosidases. Por exemplo, a β-xilosidase é uma enzima β-xilosidase de grupo 1 (por exemplo, uma Fv3A ou uma Fv43A) ou uma enzima β- xilosidase de grupo 2 (por exemplo, uma Pf43A, uma Fv43D, uma Fv39A, uma Fv43E, uma Fo43A, uma Fv43B, uma Pa51A, uma Gz43A, ou uma Trichoderma reesei Bxl1). Estes polipeptídeos são descritos na Seção [000130] acima. Por exemplo, Uma mistura/composição de enzima da invenção podem adequadamente compreender uma ou mais β-xilosidases de grupo 1 e uma ou mais β-xilosidases de grupo 2.
[000343] As misturas/composições de enzima da invenção podem opcionalmente compreender um ou mais β-xilosidases, além de ou no lugar de β-xilosidases de grupo 1 e/ou grupo 2 acima. Qualquer β- xilosidase (EC 3.2.1.37) pode ser usada como as β-xilosidases adicionais. β-xilosidases adequadas incluem, por exemplo, uma Talaromyces emersonii Bxl1 (Reen e outro 2003, Biochem Biophys Res Commun. 305(3):579-85), uma Geobacillus stearothermophilus β- xilosidases (Shallom e outro 2005, Biochemistry 44:387-397), uma  Scytalidium thermophilum β-xilosidases (Zanoelo e outro 2004, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:170-176), uma Trichoderma lignorum β- xilosidases (Schmidt, 1998, Methods Enzymol. 160:662-671), uma Aspergillus awamori β-xilosidases (Kurakake e outro 2005, Biochim. Biophys. Acta 1726:272-279), um Aspergillus versicolor β-xilosidases (Andrade e outro 2004, Process Biochem. 39:1931-1938), uma Streptomyces sp. β-xilosidases (Pinphanichakarn e outro 2004, World J. Microbiol. Biotechnol. 20:727-733), uma Thermotoga maritima β- xilosidases (Xue e Shao, 2004, Biotechnol. Lett. 26:1511-1515), uma Trichoderma sp. SY β-xilosidases (Kim e outro 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14:643-645), um Aspergillus niger β-xilosidases (Oguntimein e Reilly, 1980, Biotechnol. Bioeng. 22:1143-1154), ou uma Penicillium wortmani β-xilosidases (Matsuo e outro 1987, Agric. Biol. Chem. 51:2367-2379).
[000344] A β-xilosidase pode ser produzida por expressão de um gene endógeno ou exógeno que codifica uma β-xilosidase. A β-xilosidase pode ser, em algumas circunstâncias, superexpressa ou subexpressa.
L-α-Arabinofuranosidases
[000345] As misturas/composições de enzima da invenção podem, por exemplo, adequadamente compreender uma ou mais L-α- arabinofuranosidases. A L-α-arabinofuranosidase é, por exemplo, um Af43A, um Fv43B, um Pf51A, um Pa51A, ou um Fv51A. Os polipeptídeos Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, e Fv51A são descritos na Seção 6.1 acima.
[000346] As misturas/composições de enzima da invenção opcionalmente compreendem uma ou mais L-α-arabinofuranosidases além de ou no lugar de L-α-arabinofuranosidases antecedentes. L-α- arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) de qualquer organismo adequado podem ser usadas com as L-α-arabinofuranosidases adicionais. L-α- arabinofuranosidases adequadas incluem, por exemplo, um L-α-  arabinofuranosidases de Aspergillus oryzae (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), Aspergillus sojae (Oshima e outro J. Appl. Glycosci. 2005, 52:261-265), Bacillus brevis (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), Bacillus stearothermophilus (Kim e outro, J. Microbiol. Biotechnol. 2004,14:474482), Bifidobacterium breve (Shin e outro, Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69:7116-7123), Bifidobacterium longum (Margolles e outro, Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69:5096-5103), Clostridium thermocelum (Taylor e outro, Biochem. J. 2006, 395:31-37), Fusarium oxysporum (Panagiotou e outro, Can. J. Microbiol. 2003, 49:639-644), Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), Geobacillus stearothermophilus T-6 (Shallom e outro, J. Biol. Chem. 2002, 277: 43667-43673), Hordeum vulgare (Lee e outro, J. Biol. Chem. 2003, 278:5377-5387), Penicillium chrysogenum (Sakamoto e outro, Biophys. Acta 2003, 1621:204-210), Penicillium sp. (Rahman e outro, Can. J. Microbiol. 2003, 49:58-64), Pseudomonas celulosa (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247260), Rhizomucor pusillus (Rahman e outro, Carbohydr. Res. 2003, 338:1469-1476), Streptomyces chartreusis, Streptomyces thermoviolacus, Thermoanaerobacter etanolicus, Thermobacillus xylanilyticus (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), Thermomonospora fusca (Tuncer e Ball, Folia Microbiol. 2003, (Praha) 48:168-172), Thermotoga maritima (Miyazaki, Extremophiles 2005, 9:399-406), Trichoderma sp. SY (Jung e outro Agric. Chem. Biotechnol. 2005, 48:7-10), Aspergillus kawachii (Koseki e outro, Biochim. Biophys. Acta 2006, 1760:1458-1464), Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Chacon-Martinez e outro, Physiol. Mol. Plant Pathol. 2004,64:201-208), Thermobacillus xylanilyticus (Debeche e outro, Protein Eng. 2002, 15:21-28), Humicola insolens, Meripilus giganteus (Sorensen e outro, Biotechnol. Prog. 2007, 23:100-107), ou  Raphanus sativus (Kotake e outro J. Exp. Bot. 2006, 57:2353-2362).
[000347] A L-α-arabinofuranosidase pode ser produzida por expressão de um gene endógeno ou exógeno codificando uma L-α- arabinofuranosidase. a L-α-arabinofuranosidase pode ser, em algumas circunstâncias, superexpressa ou subexpressa.
6.3.9 Proteínas Auxiliares
[000348] As misturas/composições de enzima da invenção pode, por exemplo, adequadamente também compreender uma ou mais proteínas auxiliares. Exemplos de proteínas acessórias incluem, sem limitação, mananases (por exemplo, endomananases, exomananases, e β- manosidases), galactanases (por exemplo, endo- e exo-galactanases), arabinases (por exemplo, endo-arabinases e exo-arabinases), ligninases, amilases, glicuronidases, proteases, esterases (por exemplo, esterases de ácido ferúlico, acetil xilano esterases, esterases de ácido cumárico ou pectin metil esterases), lipases, 61 polipeptídeos da família glicosídeo hidrolase, xiloglucanases, CIP1, CIP2, suolenina, expansinas, e proteínas de rompimento de celulose. Exemplos de proteínas pode também incluem proteínas tipo CIP1, proteínas tipo CIP2, celobiose desidrogenases e manganese peroxidases. Em modalidades particulares, as proteínas de rompimento de celulose são moléculas de ligação de celulose.
6.4 Outras Aplicações
[000349] Além de sacarificação de biomassa, as enzimas e/ou misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas em processos industriais, agrícolas, alimentícios e alimentação, bem como de processamento de suplemento alimentícios e alimentação. Aplicações exemplares são descritos abaixo.
6.4.1 Tratamentos de Madeira, Papel e Polpa
[000350] As enzimas, composições/misturas de enzimas, e métodos da invenção podem ser usados em madeira, produto de madeira, resíduos de madeira ou subproduto, papel, produto de papel, polpa de papel ou polpa de madeira, polpa de Kraft, ou madeira ou tratamento de reciclagem de papel ou processo industrial. Estes processos incluem, por exemplo, tratamentos de madeira, madeira polpa, resíduos de papel, papel, ou polpa, ou descoloração de madeira ou papel. As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser, por exemplo, usadas para tratar/pré-tratar a polpa de papel, ou papel reciclado ou polpa de papel, e similares. As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para aumentar o "brilho" do papel quando elas são incluídas no tratamento/pré-tratamento de papel, polpa, papel reciclado ou polpa de papel. Pode-se apreciar que quanto maior o grau de papel, maior o brilho; o brilho pode impactar a capacidade de varredura de equipamento de varredura ótica. Tal como, as enzimas, composições/misturas de enzimas, e métodos/processos podem ser usados para preparar papéis "brilhosos", de alto grau, incluindo papel de qualidade para impressão a jato de tinta, laser e foto.
[000351] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para processo ou tratar diversos outros materiais celulósicos, incluindo, por exemplo, fibras de madeira, algodão, cânhamo, linho ou pano de linho.
[000352] Consequentemente, a invenção fornece processos de tratamento de madeira, polpa de madeira, papel, polpa de papel, resíduo de papel ou madeira ou reciclagem de papel usando uma enzima, mistura/composição de enzima da invenção.
[000353] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para descolorar papel usado impresso, tal como jornal, ou descolorir papel usado impresso sem contato, por exemplo, papel impresso a laser e xenográfico, e misturas de papel usado impresso com contato e sem contato, como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 6.767.728 ou 6.426.200; Neo, J. Wood Chem. Tech. 1986, 6(2): 147. Elas podem também ser usadas para produzir xilose de uma polpa de madeira-de-lei de grau de papel em um processo que envolve extrair xilano contido na polpa em uma fase líquida, submetendo o xilano contido na fase líquida obtida às condições suficientes para hidrolisar xilano em xilose, e recuperar a xilose. A etapa de extração, por exemplo, pode incluir pelo menos um tratamento de uma suspensão aquosa de polpa ou um material solúvel em álcali por uma enzima ou um mistura/composição de enzima (veja, Patente dos Estados Unidos n° 6.512.110). As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para dissolver a polpa de fibras celulósicas tal como produtos de papel reciclado feitos de fibra de madeira-de-lei, uma mistura de fibra de madeira-de-lei e fibra de madeira macia, papel usado, por exemplo, de envelopes não impressos, envelopes descoloridos, papel ledger não impresso, papel ledger descolorado, e similares, como descrito na, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 6.254.722.
6.4.2 Tratamento de Fibras e Têxteis
[000354] A invenção fornece métodos de tratamento de fibras e tecidos usando um ou mais enzimas, misturas/composições de enzima da invenção. As enzimas, misturas/composições de enzima podem ser usadas em qualquer método de tratamento de fibra ou tecido, que são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.261.828; 6.077.316; 6.024.766; 6.021.536; 6.017.751; 5.980.581; Publicação de Patente dos Estados Unidos n° 20020142438 A1. Por exemplo, enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas em desengomagem de fibra e/ou tecido. A sensação e aparência de um tecido podem ser, por exemplo, melhoradas por um método compreendendo contatar o tecido com uma enzima ou mistura/composição de enzima da invenção em uma solução.  Opcionalmente, o tecido é tratado com a solução sob pressão. As enzimas, misturas/composição de enzima da invenção pode também ser usadas para remover manchas.
[000355] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para tratar diversos outros materiais celulósicos, incluindo fibras (por exemplo, fibras de algodão, cânhamo, linho ou pano de linho), tecidos costurados e não costurados, por exemplo, malhas, trançados, brins, fios, e atoalhados, feitos de algodão, misturas de algodão ou celulósicos naturais ou feitos pelo homem ou misturas dos mesmos. Os processos de tratamento de têxtil podem ser usados em conjunção com outros tratamentos de têxtil, por exemplo, lavagem e/ou branqueamento. Lavagem, por exemplo, é a remoção de material não celulósico da fibra de algodão, por exemplo, a cutícula (consistindo principalmente em ceras) e parede celular primária (consistindo principalmente em pectina, proteína e xiloglicano).
6.4.3 Tratamento de Alimentos e Processamento Alimentício
[000356] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção têm numerosas aplicações em indústria de processamento alimentício. Elas podem, por exemplo, ser usadas para melhorar a extração de óleo de material de planta rico em óleo, por exemplo, sementes ricas em óleo. As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para extrair óleo de soja de sojas, azeite de oliva de olivas, óleo de colza, ou óleo de girassol de sementes de girassol.
[000357] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção pode também ser usados para separar componentes de materiais de célula de planta. Por exemplo, elas podem ser usadas para separar as células de planta em componentes. As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção pode também ser usadas para separar colheitas em frações de proteína, óleo e casca. O processo de separação pode ser realizado usando métodos conhecidos.
[000358] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem, além dos usos acima, ser usadas para aumentar a produção na preparação de extratos, xaropes, sucos de fruta ou vegetais e similares. Elas podem também ser usadas no tratamento enzimático de vários materiais derivados de parece celular de planta ou materiais de excreção de, por exemplo, cereais, grãos, vinho ou produção de suco, ou resíduos agrícolas tais como, por exemplo, cascas de vegetais, cascas de cascas, polpa de beterraba açucareira, polpa de oliva, polpa de batata, e similares. Além disso, elas podem ser usadas para modificar a consistência e/ou aparência de frutas e vegetais processados. Adicionalmente, elas podem ser usadas para tratar matéria de planta a fim de facilitar o processamento de material de planta (incluindo alimentos), purificação ou extração de componentes de planta. As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas para melhorar o valor alimentício, diminuir a capacidade de ligação de água, melhorar a degradabilidade em plantas de água de excreção e/ou melhorar a conversão de material de planta para ensilagem, e similares.
[000359] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem também ser usadas em aplicações de cozimento. Em algumas modalidades, elas são usadas para criar massas não pegajosas que não são difíceis de trabalhar em máquinas e para reduzir os tamanhos do biscoito. Elas podem também ser usadas para hidrolisar arabinoxilanas para impedir rápida reidratação do produto cozido que pode induzir à perda de crocância e vida de prateleira reduzida. Por exemplo, elas são usadas como aditivos em processamento de massa.
6.4.4 Alimentações e Alimento ou Aditivos de Alimentações e Alimento de Animal
[000360] A invenção fornece métodos para tratamento de alimentações e alimentos e aditivos de alimentação ou alimento de animal (suplementos) usando enzimas, misturas/composições de enzima da invenção. Animais incluindo mamíferos (por exemplo, humanos), pássaros, peixe, e similares. A invenção fornece alimentações, alimentos, e aditivos de animal (suplementos) compreendendo enzimas, misturas/composições de enzima da invenção. Tratamento de alimentações, alimentos e aditivos de animal usando enzimas da invenção podem auxiliar na disponibilidade de nutrientes, por exemplo, amido, proteína, e similares, no alimento ou aditivo (suplementos). Por quebra dificultam a digestão de proteínas direta ou indiretamente revelando o amido (ou outros nutrientes), as enzimas, misturas/composições de enzima podem tornam os nutrientes mais acessíveis às outras enzimas endógenas ou exógenas. Elas podem simplesmente causar a liberação de nutrientes e açúcares facilmente digeríveis ou facilmente absorvidos.
[000361] Quando adicionadas à alimentação de animal, enzimas, misturas/composições de enzima da invenção melhoram a decomposição in vivo de material de parede celular de planta parcialmente reduzindo a viscosidade intestinal (veja, por exemplo, Bedford e outro, Proceedings da 1aSymposium on Enzymes in Animal Nutrition, 1993, páginas 73 a 77), pelo qual uma melhor utilização dos nutrientes de planta pelo animal é obtido. Desse modo, usando enzimas, misturas/composições de enzima da invenção em alimentos, a taxa de desenvolvimento e/ou relação de conversão de alimento (isto é, o peso de alimento ingerido com relação ao ganho de peso) do animal podem ser melhoradas.
[000362] O aditivo de alimento de animal da invenção pode ser um produto de amida granulado que pode ser facilmente misturado com os componentes de alimento. Alternativamente, aditivos de alimento da invenção podem formar um componente de uma pré-mistura. O produto de enzima granulado da invenção pode ser revestido ou não revestido.  O tamanho de partícula dos granulados de enzima pode ser compatível com aquele dos componentes de alimento e/ou da pré-mistura. Isto fornece um método seguro e conveniente de incorporar as enzimas nos alimentos. Alternativamente, o aditivo de alimento de animal da invenção pode ser uma composição líquida estabilizada. Esta pode ser uma suspensão aquosa ou com base em óleo. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 6,245,546.
[000363] Uma enzima, mistura/composição de enzima da invenção pode ser fornecida por expressão das enzimas diretamente in transgenic feed crops (por exemplo, como plantas transgênicas, sementes e similares), tal como grãos, cereais, milho, feijão, semente de colza, lupina e similares. Como descrito acima, a invenção fornece plantas transgênicas, partes de plantas e células de planta compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção. O ácido nucléico é expresso de modo que a enzima da invenção seja produzida em quantidades recuperáveis. A xilanase pode ser recuperada de qualquer planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de uma alimentação ou alimento, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.
[000364] A invenção fornece métodos para remoção de oligossacarídeos de alimento antes do consumo por um indivíduo animal usando uma enzima, mistura/composição de enzima da invenção. Neste processo um alimento é formado para ter um valor energético metabolizável aumentado. Além de enzimas, misturas/composições de enzima da invenção, galactosidases, celulases, e combinações das mesmas podem ser usadas.
[000365] A invenção fornece métodos para utilizar uma enzima, uma mistura/composição de enzima da invenção como um suplemento nutricional nas dietas de animais preparando um suplemento nutricional contendo uma enzima recombinante da invenção, e administrando o suplemento nutricional a um animal para aumentar a utilização de hemicelulase contida em alimento ingerido pelo animal.
6.4.5 Tratamento de Resíduos
[000366] As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem ser usadas em uma variedade de outras aplicações industriais, por exemplo, em tratamento de resíduo. Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece um processo de digestão de resíduo sólido usando as enzimas, misturas/composições de enzima da invenção. Os métodos podem compreender redução da massa e volume de substancialmente resíduo sólido não tratado. Resíduo sólido pode ser tratado com um processo digestivo enzimático na presença de uma solução enzimática (incluindo as enzimas, misturas/composições de enzima da invenção) em uma temperatura controlada. Isto resulta em uma reação sem fermentação bacteriana apreciável de micro-organismos adicionados. O resíduo sólido é convertido em um resíduo liquefeito e qualquer resíduo sólido residual. O resíduo liquefeito resultante pode ser separado do referido qualquer resíduo solidificado residual. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.709.796.
6.4.6 Composições de Detergente, Desinfetantes e Limpeza
[000367] A invenção fornece composições de detergente, desinfetantes ou limpadoras (limpeza ou purificação) composições compreendendo um ou mais enzimas, misturas/composições de enzima da invenção, e métodos de preparação e uso estas composições. A invenção incorpora todos os métodos de preparação e uso composições de detergente, desinfetantes ou limpadoras. Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.413.928; 6.399.561; 6.365.561; 6.380.147.
[000368] Em modalidades específicas, as composições de detergente, desinfetantes ou limpadoras podem ser uma composição aquosa de uma e duas partes, uma composição líquida não aquosa, um sólido de fusão, uma forma granular, uma forma particulada, um comprimido prensado, uma forma de gel e/ou pasta e suspensão. As enzimas, misturas/composições de enzima da invenção podem também ser usadas como produto aditivo de detergente, desinfetante, ou limpador em uma forma líquida ou sólida. Tais produtos aditivos destinam-se a suplementar ou reforçar o desempenho de composições de detergente convencionais, e podem ser adicionadas em qualquer estágio do processo de limpeza.
[000369] A presente invenção fornece composições de limpeza incluindo composições de detergente para limpeza de superfícies duras, composições de detergente para limpeza de tecidos, composições de lavagem de prato composições, composições de limpeza oral, composições de limpeza oral, e soluções de limpeza de lentes de contato.
[000370] Quando as enzimas da invenção são componentes de composições adequadas para uso em um método de lavagem em máquina de lavanderia, as composições podem compreender, além de uma enzima, mistura/composição de enzima da invenção, tanto um composto de tensoativo quanto construtor. Elas podem adicionalmente compreender um ou mais componentes de detergente, por exemplo, compostos poliméricos orgânicos, agentes de branqueamento, enzimas adicionais, supressores de espumas, dispersantes, lime-soap dispersants, soil suspension e agentes antirredeposição, e inibidores de corrosão.
[000371] Composições de lavanderia da invenção podem também conter agentes amaciantes, como componentes de detergente adicionais. Tais composições contendo carboidrase podem fornecer limpeza de tecido, remoção de mancha, manutenção de brancura, amaciamento, aparência de cor, inibição de transferência de tintura e sanitização quando formuladas como composições de detergente de lavanderia.
[000372] A invenção, desse modo, também fornece um processo de sacarificação um material de biomassa compreendendo hemicelulose. Tal material de biomassa pode opcionalmente compreender celulose. Materiais de biomassa exemplares incluem, sem limitação, sabugo de milho, switchgrass, sorgo, e/ou bagaço. Consequentemente a invenção fornece um processo de sacarificação, compreendendo tratar um material de biomassa aqui compreendendo hemicelulose e opcionalmente celulose com uma mistura/composição de enzima como descrito aqui. A mistura/composição de enzima usada em um tal processo da invenção inclui 0,5 g a 40 g (por exemplo, 0,5 g a 20 g, 0,5 g a 30 g, 0,5 g a 40 g, 0,5 g a 15 g, 0,5 g a 10 g, 0,5 g a 5 g, 0,5 g a 7 g, etc) de polipeptídeos tendo atividade de xilanase por kg de hemicelulose no material de biomassa. A mistura/composição de enzima usada em tal processo da invenção pode também incluem 1 g a 40 g (por exemplo, 2 g a 20 g, 3 g a 7 g, 1 g a 5 g, ou 2 g a 5 g, etc.) de polipeptídeos tendo atividade de xilanase por kg de hemicelulose no material de biomassa. A mistura/composição de enzima usada em tal processo podem incluem 0,5 g a 50 g (por exemplo, 0,5 g a 50 g, 0,5 g a 45 g, 0,5 g a 40 g, 0,5 g a 30 g, 0,5 g a 25 g, 0,5 g a 20 g, 0,5 g a 15 g, 0,5 g a 10 g, etc) de polipeptídeos tendo atividade de beta-xilosidase por kg de hemicelulose no material de biomassa. A mistura/composição de enzima usada em tal processo pode também incluem 1 g a 50 g (por exemplo, 2 g a 40 g, 4 g a 20 g, 4 g a 10 g, 2 g a 10 g, 3 g a 7 g, etc.) de polipeptídeo tendo atividade de beta-xilosidase por kg de hemicelulose no material de biomassa. A mistura/composição de enzima usada em tal processo da invenção podem incluem 0.2 g a 20 g (por exemplo, 0.2 g a 18 g, 0.2 g  a 15 g, 0.3 g a 10 g, 0.2 g a 8 g, 0.2 g a 5 g, etc) de polipeptídeos tendo atividade de L-alfa-arabinofuranosidase por kg de hemicelulose no material de biomassa. A mistura/composição de enzima usada em tal processo da invenção podem incluem 0,5 g a 20 g (por exemplo, 1 g a 10 g, 1 g a 5 g, 2 g a 6 g, 0,5 g a 4 g, ou 1 g a 3 g, etc) de polipeptídeos tendo atividade de L-alfa-arabinofuranosidase por kg de hemicelulose no material de biomassa. A mistura/composição de enzima pode também incluem 1 g a 100 g (por exemplo, 1 g a 100 g, 2 g a 80 g, 3 g a 50 g, 5 g a 40 g, 2 g a 20 g, 10 g a 30 g, ou 12 g a 18 g, etc) de polipeptídeos tendo atividade de celulase por kg de celulose no material de biomassa. Opcionalmente, a quantidade de polipeptídeos tendo atividade de beta-glicosidase pode constituir até 50% do peso total de polipeptídeos tendo atividade de celulase.
[000373] Um processo adequado da invenção preferivelmente produz 60% a 90% de xilose da hemicelulose xilano de um material de biomassa tratado. Materiais de biomassa adequados incluem um ou mais de, por exemplo, espiga de milho, switchgrass, sorgo, e/ou bagaço. Tal como, um processo da invenção preferivelmente produz pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%) xilose de hemicelulose xilano de um ou mais destes materiais de biomassa. Por exemplo, o processo produz 60% a 90% de xilose de hemicelulose xilano de um material de biomassa compreendendo hemicelulose, incluindo, sem limitação, espiga de milho, switchgrass, sorgo, e/ou bagaço.
[000374] O processo da invenção opcionalmente também compreende recuperar os monossacarídeos.
[000375] A invenção é também ilustrada pelos seguintes exemplos. Os exemplos são fornecidos apenas para propósitos ilustrativos. Eles não devem ser construídos como limitantes do escopo ou teor da invenção de modo algum.
7. EXEMPLO 1: MÉTODOS REPRESENTATIVOS EXPERIMENTAIS 7.1 Materiais e Métodos
[000376] Os seguintes métodos/ensaios foram usados no exemplo 1 e exemplos subsequentes. Quaisquer desvios dos protocolos fornecidos abaixo são indicados.
7.1.1 Preparação de Hemicelulose de Tecidos de Planta
[000377] Preparações de hemicelulose foram preparadas usando uma modificação do procedimento de NaOH/sonicação descrita por Erbringerova e outro (Carbohydrate Polymers 1998, 37:231). Material de planta seco foi moído \para passar em uma peneira de 1 mm e 10 g deste material foram suspensos em 250 mL de 5% (peso/volume) de NaOH. A suspensão foi aquecida para 80 °C sem agitação durante 30 minutos em seguida sonicada durante 15 minutos em temperatura ambiente usando sonicador de sonda em fixação elevada. A suspensão foi retornada para 80 °C durante mais 30 minutos em seguida deixada resfriar para temperatura ambiente. Os sólidos foram removidos da suspensão por centrifugação a 3000 x g durante 15 minutos e o sobrenadante resultante foi decantado em 1 L de etanol que foi resfriado em gelo. Após 30 minutos o precipitado resultante foi recuperado decantando-se primeiro o líquido claro acima o precipitado em seguida filtração sem permitir o precipitado secar ao ar totalmente. A massa filtrante foi primeiro lavada com 200 mL de etanol a 80% frio em seguida removida do filtro sem deixá-la secar ao ar. A massa filtrante foi re- dissolvida em 200 mL de água e o pH da solução foi ajustado para 5,5 com ácido acético. O carboidrato extraído foi reprecipitado por adição de 1 L de etanol em gelo e o precipitado resultante foi novamente recuperado por filtração como acima. A massa filtrante foi congelada e o solvente e água restantes foram removidos por liofilização. A produção de carboidrato recuperado variou de 6 a 23% do material de planta de partida dependendo do tecido e da preparação.
7.1.2 Pré-tratamento de amônia diluída de substratos de biomassa
[000378] Espiga de milho e switchgrass foram pré-tratados antes de hidrólise enzimática de acordo com os métodos e faixas de processamento descritos no WO06110901A (a menos que de outro modo observado).
7.1.3 Ánalise composicional de biomassa
[000379] Os métodos de hidrólise de ácido de 2 etapas descritos em "Determination of structural carbohydrates and lignin in the biomass" (National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO 2008, disponível em http://www. nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf) foram usados para avaliar a composição de substratos de biomassa. Os resultados de hidrólise enzimática são reportados em termos de porcentagem de conversão com respeito à produção teórica do teor de glicano e xilano de partida do substrato.
7.1.4 Preparação de oligômeros crus de espiga de milho pré-tratado com amônia
[000380] Oligômeros crus para análise de hemicelulases foram preparados a partir de espiga de milho pelo seguinte procedimento. Espiga de milho moída por martelo (~1/4 em diâmetro médio) mais 6% de amônia (peso/peso) foram aquecidos para 145°C com injeção direta de vapor em um reator de pressão agitado. Após 20 minutos, o excesso de amônia foi extraído do reator em um vácuo final de ~0,1 bar. A espiga de milho tratada por amônia foi em seguida colocada em um reator agitado estéril para sacarificação de enzima. Água suficiente foi adicionada para obter uma carga de sólidos total final de 25% (peso/peso) após todas as adições serem feitas. O pH do reator foi mantido em pH 5,3 com ácido sulfúrico a 4 N e a temperatura controlada a 47°C. Spezyme® CP, Multifect® Xilanase (Danisco US Inc., Genencor), e Novo 188 (Novozymes, Denmark) foram adicionados em cargas de 20, 10 e 5 mg/g de celulose, respectivamente, e deixados sacarificar a espiga de milho pré-tratada em açúcares e oligômeros durante 116 horas. O material foi em seguida resfriado para 33°C e o pH ajustado para 5.8 com 4 N NaOH. A glicose e xilose foram em seguida fermentadas em etanol adicionando a cultura semeada de uma cepa de Zymomonas mobilis recombinante (10% de volume total, acesso de ATCC n° PTA-1798) como descrito em U.S. 7.354.755. O processo de fermentação foi seguido até toda a glicose e ~95% da xilose serem consumidos. Uma alíquota de 0,5 L do caldo de fermentação foi clarificada por centrifugação (21,000 x g) durante 20 minutos seguido por filtragem do sobrenadante através de uma unidade de filtragem de 0,2 mícron (Nalgene). O etanol foi removido do caldo de fermentação filtrado em um rotovapor mantido a 35oC sob vácuo local. O volume total do licor final foi reduzido em ~4x pelo procedimento posterior.
7.1.5 Ensaios de Proteína Total
[000381] Diferentes métodos de determinação de proteína total foram empregados dependendo da natureza da amostra de proteína (isto é, produto comercial de caldo de fermentação purificado, etc.). O ensaio de proteína BCA é um exemplo de um ensaio colorimétrico que avalia a concentração de proteína com um espectrofotômetro.
[000382] Reagentes: Kit de ensaio de proteína BCA (Pierce Chemical, Produto #23227), tampão de acetato de sódio a 50 mM pH 5,0, ácido tricloroacético a 15 % (TCA), NaOH a 0,1 N, solução de matéria prima de BSA, Reagente A, Reagente B (de kit de ensaio de proteína)
[000383] Procedimento: Diluições de enzima foram preparadas em tubos de teste usando tampão de acetato de sódio a 50 mM. Solução de enzima diluída (0,1 mL) foi adicionada a tubos de centrífuga de 2 mL Eppendorf contendo 1 mL de TCA a 15%. Os tubos foram turbilhonados e colocados em um banho de gelo durante 10 minutos. As amostras foram em seguida centrifugadas a 14.000 rpm durante 6 minutos. O sobrenadante foi vertido, a pélete ressuspensas em 1 mL de NaOH a 0,1 N, e os tubos turbilhonados até a pélete dissolver-se. Soluções padrões de BSA foram preparadas a partir de uma solução de matéria prima de 2 mg/mL. Solução de trabalho de BCA foi preparada misturando 0,5 mL de Reagente B com 25 mL de Reagente A. A proteína ressuspensa (0,1 mL cada) foi adicionada a 3 tubos de centrífuga Eppendorf. Dois mL de solução de trabalho de Pierce BCA foram adicionados a cada amostra e tubos Eppendorfpadrões de BSA serialmente diluído. Todos os tubos foram incubados em um banho de água a 37°C durante 30 minutos. As amostras foram em seguida resfriadas para temperatura ambiente (15 minutos) e a absorvência avaliada a 562 nm em um espectrofotômetro.
[000384] Cálculos: Valores médios para cada absorvência padrão de proteína BSA foram calculados e plotados, a absorvência no eixo x e concentração (mg/mL) no eixo y. Um ajustamento de curva linear foi aplicado e a equação para o cálculo de linha usando a fórmula: y=mx +b
[000385] A concentração bruta das amostras de enzima foi calculada substituindo a absorvência para o valor de x. A concentração de proteína total foi calculada multiplicando-se o fator de diluição.
[000386] A proteína total de amostras purificadas foi determinada por A280 (veja, por exemplo, Pace e outro, Protein Science, 1995, 4:2411).
[000387] Algumas amostras de proteína foram avaliadas usando o método Biuret como modificado por Weichselbaum e Gornall usando albumina de soro bovino como um calibrador (Biuret modificado) (Weichselbaum, Amer. J. Clin. Path. 1960, 16:40; Gornall e outro, J. Biol. Chem. 1949, 177:752).
[000388] O teor de proteína total de produtos de fermentação foi também algumas vezes avaliado como nitrogênio total por combustão, captura e avaliação de nitrogênio liberado, por Kjeldahl (rtech laboratories, www.rtechlabs. com) ou locais pelo método DUMAS (TruSpec CN, www.leco.com ) (SADER, e outro Archives de Veterinary Science, 9(2):73-79, 2004). Para amostras contendo proteína complexa, por exemplo, caldos de fermentação, um teor de N a 16% médio e um fator de conversão de 6,25 para nitrogênio em nitrogênio foi usado. Em alguns casos, proteína precipitável total foi avaliada remover nitrogênio de não proteína interferente. Uma concentração de TCA final de 12,5 % foi usada e a pélete de TCA contendo proteína foi ressuspensa em NaOH a 0,1 M.
[000389] Em outros casos, Coomassie Plus- the Better Bradford Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL product #23238) foi usado de acordo com a recomendação de fabricante.
7.1.6 Ensaios de atividade de substrato sintético (substrato de para - nitrofenila
[000390] A proteína ativa de expressão de T. reesei de genes clonados foi confirmada com ensaios de substrato modelo. Atividades de celulase e hemicelulase nos substratos sintéticos, tal como 4- nitrofenil a-L-arabinofuranosíeo (pNPA, Sigma N3641) e 4-nitrofenil β- D-glicopiranosídeo (pNPG, Sigma N7006), e 4-nitrofenil β-D- xilopiranosídeo (pNPX, Sigma N2132) foram avaliados como segue: Solução de substrato foi preparada dissolvendo 30 mg de substrato sintético em 100 mL tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 4,8. Carbonato de sódio (1 M) foi preparado para saciamento da reação. Solução de substrato (100 μL) foi dispensada em placas de 96 cavidades Costar 96 (Cat no. 9017). 20 μL de amostra de enzima foram dispensadas em uma cavidade placa de microtítulo. A placa de microtítulo foi incubada a 50°C durante 10 minutos usando agitador de aquecimento e resfriamento Thermomixer R (Eppendorf). 50 μL de carbonato de sódio a 1 M foram adicionados a cada cavidade para saciar a reação. Absorvência a comprimento de onda de 400 nm foi lida com Espectrofotômetro de Microplaca SpectraMax 340C384 (Molecular Devices). Unidades por mL foram determinadas usando uma curva padrão de p-nitrofenol. Um hospedeiro de Trichoderma de deleção de Quad, do qual os genes cbh1, cbh2, egl1 e egl2 foram deletados (veja WO 05/001036), foi analisado com as amostras de enzima como um controle para a atividade de enzimas expressas nesta base.
7.1.7 Ensaio de sacarificação de espiga
[000391] Tipicamente, sacarificação de espiga de milho em um formato de placa de microtítulo foi realizada de acordo com os seguintes procedimentos. um substrato de biomassa, espiga de milho, foi diluída em água e pH ajustado com ácido sulfúrico para criar um pH 5, 7% de suspensão de celulose que foi usada diretamente no ensaio. As enzimas testadas incluíram: produtos de celulase comerciais, por exemplo, Accelerase® 1000, Accelerase® 1500 (Danisco US Inc., Genencor), caldos de fermentação T. reesei, e enzimas. As enzimas purificadas foram carregadas com base em mg de proteína total por grama de celulose (como determinado por análise composicional) no substrato de espiga de milho. As enzimas foram diluídas em acetato de sódio a 50 mM pH 5.0 para obter a concentração de carga desejada no volume requerido. Quarenta microlitros de solução de enzima foram adicionados em 70 mg de espiga de milho pré-tratado por amônia diluída a 7% celulose por cavidade (equivalente a 4,5% de celulose final). A placa de ensaio foi incubada em temperatura ambiente durante 10 minutos. As placas de ensaio foram revestidas com seladores de placa de alumínio e as placas incubadas a 50°C, 200 rpm, durante três dias. No término do período de incubação, a reação de sacarificação foi saciada adicionando 100 μL de tampão de glicina 100 mM, pH10,0 por cavidade e a placa foi centrifugada durante 5 minutos a 3.000 rpm. Dez microlitros do sobrenadante foram adicionados a 200 μL de água MilliQ em placa de HPLC de 96 cavidades e os açúcares solúveis foram avaliados por HPLC.
[000392] Isto descreve um método típico que foi usado em múltiplos exemplos aqui. Em certos exemplos, a sacarificação de espiga de milho foi avaliada usando um protocolo modificado. As modificações são descritas com os exemplos individuais.
7.1.8 Análise de açúcar por HPLC
[000393] Tipicamente, amostras hidrólise de sacarificação de espiga foram preparadas por centrifugação para limpar o material insolúvel, filtração através de um filtro de náilon de 0,22 μm (filtro de tubo de centrífuga Spin-X, Corning Incorporated, Corning, NY) e diluição para uma concentração apropriada de açúcares insolúveis com água destilada. Monômeros de açúcares foram determinados em um Shodex Sugar SH-G SH1011, 8x300 mm com uma coluna de guarda 6x50 mm SH-1011P (www.shodex.net). O solvente foi H2SO4 a 0,01 N conduzido em 0,6 mL/min. A temperatura de coluna foi de 50 °C e detecção foi feita usando um detector de índice refrativo. Padrões externos de glicose, xilose e arabinose foram conduzidos com cada grupo de amostra. Certos exemplos aqui usam um protocolo para alcançar a mesma finalidade como um grupo de protocolos um tanto modificado. As modificações específicas aos protocolos são descritas com exemplos individuais.
[000394] Açúcares oligoméricos foram separados por cromatografia de exclusão por tamanho usando uma coluna Tosoh Biosep G2000PW 7,5 mm x 60 cm (www.tosohbioscience.de). O solvente foi água destilada a 0,6 mL/minuto e a coluna foi conduzida em temperatura ambiente. Seis padrões de açúcar de carbono usados para calibragem de tamanho foram: estaquiose, rafinose, celobiose e glicose; e 5 açúcares de carbono foram: xilohexose, xilopentose, xilotetrose, xilotriose, xilobiose e xilose. Xilo-oligômeros foram obtidos de Megazyme (www.megazyme.com). Detecção foi por índice refrativo e quando resultados quantitativamente reportados são como unidades de área de pico ou áreas de pico relativas por porcentagem.
[000395] Açúcares solúveis totais foram determinados por hidrólise de ácido das amostras centrifugadas e clarificadas por filtro descrito acima. A amostra clarificada foi diluída 1:1 com H2SO4 a 0,8 N e a solução resultante foi autoclivada em um frasconete tampado durante um tempo de ciclo total de 1 hora a 121°C. Os resultados são reportados sem correção quanto à perda de açúcar monômero durante a hidrólise.
7.1.9 Análise de Proteína por HPLC
[000396] Para separar e quantificar as enzimas contidas em caldo de 14 L de fermentações das cepas de expressão integradas, cromatografia líquida (LC) e espectroscopia de massa (MS) foram realizadas. Amostras de enzima foram primeiro tratadas com uma endoH glicosidase recombinantemente expressa de S. plicatus (por exemplo, NEB P0702L). EndoH foi usada em uma relação de 0,01-0,03 μg de proteína de endoH por μg de proteína total de amostra e incubada durante 3 h a 37 °C, pH 4,5-6,0 para enzimaticamente remover gicosilação ligada a N antes da análise por HPLC. Aproximadamente 50 μg de proteína foram em seguida injetados para cromatografia de interação hidrofóbica usando um Agilent 1100 HPLC system com uma coluna HIC-fenila e um gradiente de sal elevado a baixo durante 35 minutos foi realizado sobre amostras de caldo de fermentação concentrado. O gradient foi ativado usando tampão de sal elevado A: sulfato de amônio a 4 M contendo fosfato de potássio a 20 mM pH 6,75 e tampão de sal baixo B: fosfato de potássio a 20 mM pH 6,75. Picos foram detectados com luz UV a 222 nm e frações foram coletadas e identificadas por espectroscopia de massa.
7.1.10 Ensaio de Atividade de Celulase usando Calcoflúor Branco
[000397] Atividade de celulase foi avaliada em PASC usando um método de detecção de calcoflúor branco (Appl. Biochem. Biotechnol. 161:313-317). Todas as químicas usadas foram de grau analítico. Avicel PH-101 foi adquirido de FMC BioPolymer (Philadelphia, PA). Calcoflúor branco foi adquirido de Sigma (St. Louis, MO). Celulose dilatada de ácido fosfórico (PASC) foi preparada de Avicel PH-101 usando um protocolo adaptado de Walseth, TAPPI 1971, 35:228 e Wood, Biochem. J. 1971, 121:353-362. Em síntese, Avicel foi solubilizado em ácido fosfórico concentrado em seguida precipitado usando água deionizada fria. Após a celulose ser coletada e lavada com mais água para neutralizar o pH, ela foi diluída para 1% de sólidos em tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0.
[000398] Todas as diluições de enzima foram feitas em tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0. GC220 Celulase (Danisco US Inc., Genencor) foi diluída para 2,5, 5, 10, e 15 mg de proteína/g de PASC, para produzir uma curva de calibração linear. Amostras para serem testadas foram diluídas para incluírem-se na faixa da curva de calibração, isto é para obter uma resposta de 0,1 a 0,4 de produto de fração. 150 μL de PASC a 1% frio foram adicionados a 20 μL de solução de enzima em placas de microtítulo de 96 cavidades. A placa foi coberta e incubada durante 2 h a 50 °C, 200 rpm em um incubador/agitador Innova. A reação foi saciada com 100 μL de 50 μg/mL de calcoflúor em Glicina a 100 mM, pH 10. Fluorescência foi lida em uma leitora de microplaca de fluorescência (SpectraMax M5 by Molecular Devices) em comprimento de onda de excitação Ex = 365 nm e comprimento de onda de emissão Em = 435 nm. O resultado (mostrado na figura 25) é expresso como o produto de fração de acordo com a equação: FP = 1 - (amostra Fl - tampão Fl)/( enzima Fl zero - tampão Fl),
[000399] em que FP é produto de fração, e Fl = unidades de fluorescência.
7.1.11 Cultivação de Fusarium verticillioides e purificação de maiores atividades de hemicelulase detectadas na proteína extracelular
[000400] Fonte de Fusarium verticillioides tipo selvagem foi como descrito na Tabela 1 de Fuchs e outro, Fungal Genetics e Biology 2004, 41:852-863. Os fungos foram desenvolvidos usando fibra de grão de milho desengomado usando uma modificação do método descrito em Li e outro, Applied Biochemistry e Biotechnology 2005, (121-124):321-334.
[000401] Amido foi removido da fração de pericarpo de milho seco de um fracionamento de moagem seca de milho suspendendo 200 g de pericarpo de milho em 3 L de água de torneira e aquecendo para 80 °C com 5 mL (500 mg) de amilase Liquozyme SC DS em alta temperatura (Novozymes, Denmark). A mistura foi agitada ocasionalmente com uma espátula e mantida a 80 °C durante 30 minutos emseguida deixada resfriar para temperatura ambiente durante cerca de 2 h. A suspensão resultante foi decantada sobre uma peneira de 20 malhas para parcialmente desidratar. Os sólidos sobre a peneira foram também lavados com 4 L de água de torneira em seguida secados ao ar durante a noite antes da secagem final em um forno a 60 °C. O material secado foi moído para passar uma peneira a 1 mm em uma moagem de faca antes do uso.
[000402] A cultura de F. verticillioides foi mantida sobre ágar de dextrose de batata (Sigma P6685) e um meio de desenvolvimento rico de 24 g/L de dextrose de batata foi inoculado com micélia da placa. A cultura de desenvolvimento foi incubada durante 3 dias a 30°C com agitação a 130 rpm. Após 3 dias de desenvolvimento os 150 mL da massa celular resultante e meio gasto foram usados para inocular um meio de indução de pericarpo de milho. O meio de indução era 80 g de pericarpo de milho desengomado em 1 L de meio de base (15 g de KH2PO4, 5 g de sulfato de amônio, 20 g de extrato de levedura, 0,5 g de sulfato de magnésio e 1 g de Tween 80 em pH 4,8). A cultura foi mantida a 30 °C com agitação a 130 rpm durante 7 dias.
[000403] Extracelular proteína foi separada do grão gasto e a massa cellular fúngica por centrifugação a 2,000 x G durante 20 minutos. O sobrenadante parcialmente clarificado foi passado através de um filtro de 0,45 μm e em seguida através de um filtro de 0,22 μm. O filtrado clarificado foi armazenado a 4°C até ser usado. O filtrado foi concentrado aproximadamente 14 vezes com filtros centrífugos Amicon ultra-4 com um corte de 30 kD (Millipore).
[000404] Atividades de L-α-arabinofuranosidase (LARF) e β- xilosidase (BXL) foram purificadas do sobrenadante fúngico primeiro permutando as proteínas em tampão de ácido (N- morfolino)etanossulfônico-NaOH a 50 mM de pH 6,3 (MES), em seguida aplicando a proteína sobre uma coluna de permuta de ânion de amina quaternária GE Health Sciences Q-Sepharose Fast Flow (20 mL de volume de leito equilibrado com tampão de MES). O sistema de purificação de proteína usado foi um sistema GH Health Sciences Akta usando o software Unicorn. As proteínas foram eluídas com um gradiente de NaCl a 0 - 0,5 M em tampão de MES.
[000405] A atividade em frações de coluna foi monitorada usando ou 4-nitrophenyl β-D-xilopiranosida (for BXL activity) ou 4-nitrofenila a-L- arabinofuranosida (quanto à atividade de LARF). Em ambos os casos, 2 μL da fração de coluna foram adicionadosa 95 μL de tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0 e 5 μL do substrato de p-nitrofenila, misturado e incubado 2 minutos a 23°C. 100 μL de solução de interrupção de carbonato de sódio a 1 N foram adicionados e a absorção a 405 nm foi lida.
[000406] Frações de enzima ativa do sistema de permute de anion foram coletadas, concentradas em filtração Amicon Centriprep, e aplicadas a uma coluna de permuta de cátio de sulfopropila GE Health Sciences SP-Sepharose Fast Flow (20 mL de leito equilibrado com tampão de acetato de sódio) usando o mesmo sistema de purificação de proteína descrito acima. As proteínas foram eluídas com um gradiente de NaCl a 0-1 M em tampão de acetato de sódio, e a atividade bas frações foi monitorada como descrito acima. As frações ativas foram então coletadas, agrupadas e concentradas se necessário. As proteínas em frações ativas foram identificadas por MS-MS.
7.1.12 Identificação de Proteína MS-MS
[000407] A identificação de um grupo representativo de L-α-arabinofu- ranosidase da família GH54 de Fusarium verticillioides (LARF), família GH51 LARF, duas β-xilosidases da família GH3 e uma β-xilosidase da família GH30 (BXL) é descrita abaixo.
[000408] Para a identificação de GH54 LARF, 200 μL de HCl a 1 N (EM Industries, Hawthorne, NY) foram adicionados a 250 μL de "Fração B3" (0,35 mg de proteína) do procedimento de purificação descrito acima e a amostra congelada durante 10 minutos. A seguir, 200 μL de 50% de TCA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram adicionados e as amostras foram congeladas durante mais 10 minutos para precipitar a proteína. As amostras foram centrifugadas durante 2 minutos a 16,000 rcf e os sobrenadantes foram descartados. A proteína peletizada foi lavada com 90% de acetona fria (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), em seguida centrifugada durante 1 minuto a 16,000 rcf. O sobrenadante foi descartado e a pélete foi deixada secar ao ar. Primeiro, 30 μL de ureia a 8 M (MP Biomedicals, Solon, OH) foram adicionados à pélete, em seguida 4 μL de 0,2 M de DTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A amostra foi incubada a 52°C durante 30 minutos e em seguida 4 μL de 0,44 M de iodoacetamida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram adicionados e a solução incubada em temperatura ambiente no escuro durante 30 minutos. A seguir, 120 μL de 0,1% de água de n-octil B-D- glucopiranosida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram adicionados lentamente, e em seguida a amostra foi dividida em duas partes iguais. À metade da amostra, 7,5 μg de Tripsina (Promega Corp., Madison, WI) foram adicionados, e à outra metade, 4 μg de AspN (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foram adicionados. Ambas as amostras foram incubadas a 37°C durante 1 hora. As amostras foram saciadas com 10%  de Ácido Trifluoroacético (Thermoscientific, Waltham, MA) para um volume final de 0,1% de TFA. Ambas as amostras foram conduzidas em um espectrômetro de massa de captura de íon por ionização por eletrovaporização (ESI) LCQ-Deca Thermofinnigan (San Jose, CA). Uma coluna Vydac C18 (5 u, 300A, 0.2 x 150 mm, Michrom Bioresources, Auburn, CA) foi conduzida em uma taxa de fluxo de 200 μL/min. Os volumes de injeção foram de 50 μL, e foram filtrados por meio de um cartucho de captura on-line (Peptide CapTrap, Michrom Bioresources, Auburn, CA) antes da carga sobre a coluna. Separação do digesto foi realizada com um gradiente como segue (Solvente A: 0,1% de ácido trifluoroacético em H2O (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), Solvente B: 0,08% de ácido trifluoroacético em acetonitrilo (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)). Para a identificação de GH51 LARF, as duas β- xilosidases de GH3, e a β-xilosidase de GH30, o método descrito acima foi usado, exceto que as amostras foram digeridas com Quimiotripsina (7,5 Dg, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em adição à Tripsina e AspN. A máquina de pesquisa TurboSequest em Bioworks 3.31 (Thermo, San Jose) foi usada para identificar proteínas da base de dados da proteína de Fusarium verticillioides. A base de dados da proteína foi baixada do BROAD Institute em http://www.broadinstitute.org/annotation/ genome/fusarium_verticillioides/ MultiDownloads.html.
7.1.13 Indução de Enzimas de Fusarium verticillioides por Switchgrass Pré-tratado por Amônia Aquosa Diluída
[000409] Para indução de enzimas de Fusarium verticillioides em resposta a switchgrass pré-tratado por amônia aquosa diluída, switchgrass foi moído para <1 mm de diâmetro, em seguida pré-tratado com amônia a 6% com base em peso seco a 50% de matéria seca inicial a temperatura máxima de 160 °C durante 90 minutos. O material resultante foi de 43,3% de sólidos e continha 0,336 % de amônia residual.
[000410] Cultura de F. verticillioides do tipo selvagem foi mantida em ágar de dextrose de batata (Sigma P6685) e um meio de crescimento rico de 24 g/L de dextrose de batata foi inoculado com micélios da placa. A cultura de crescimento foi incubada durante 3 dias a 24 °C com agitação a 140 rpm, durante cujo tempo ela se torno turva com células Fusarium. Após crescimento de 3 dias, 4 frascos cada qual contendo 100 mL de meio Christakapoulos de base (0,1% de KH2PO4, 0,03% de CaCl2, 0,03% de MgSO4 x 7 H2O, 2,61% de Na2HPO4 x 7 H20, 0,134% de NaH2PO4 x 1 H2O, 1,0% de fosfato de amônio anidroso) foram inoculados com 4 mL da suspensão de célula resultante. À suspensão, dois gramas de matéria seca de switchgrass pré-tratado por amônio aquoso diluído como a fonte de carbono exclusiva.
[000411] Após adição de switchgrass pré-tratado, o pH foi ajustado para 6,5 e o frasco foi agitado a 180 rpm a 23 °C durante 168 horas. Antes da cromatografia de exclusão por tamanho, as amostras foram analisadas em pontos de tempo diferentes por ensaio de Bradford quanto às atividades de, p-nitrofenil arabinofuranosidase, p-nitrofenil xilosidase e p-nitrofenil glicosidase, e por géis SDS-PAGE para indução de enzimas. Switchgrass não tratado intacto, 2% de glicose e nenhuma fonte de carbono foram incluídos como controles paralelos e foram descobertos induzir a níveis de indução de enzima muito menores do que aqueles do que foi o caso para fonte de carbono de switchgrass pré-tratado por amônia aquosa diluída.
7.1.14 Fracionização por cromatografia de exclusão por tamanho do caldo de cultura de Fusarium verticillioides
[000412] Os meios de cultura de Fusarium verticillioides contendo as enzimas expressas da indução de 168-h descrita acima foram centrifugados a 3,500 x g para remover resíduos e células. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,4 μm produzindo um líquido claro amarelo escuro. O líquido foi concentrado (~4X) duas vezes em um concentrador de corte Amicon ultra 10K MW grande (UFC901024). Uma amostra concentrada de 1,7 mL foi excluída por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e ensaiada quanto ao teor de proteína por ensaio de BCA como descrito anteriormente. A amostra de proteína concentrada foi carregada em um coluna Superdex 16/60 SEC equilibrada com tampão de acetato de sódio a 50 mM pH 5,0. A coluna foi eluída a 1 mL/minuto a 4°C. A absorvência da amostra a 214 nm e 280 nm foi monitorada. Após eluição do volume vazio, frações de 1 mL foram coletadas em uma laca de microtítulo de polipropileno de cavidade profunda. As frações contendo a proteína foram agregadas em uma placa de cavidade profunda e todas as frações foram avaliadas quanto à concentração de proteína total por ensaio de BCA, e atividades de p-nitrofenil arabinosidase, p-nitrofenil xilosidase, e p-nitrofenil glicosidase como descrito no exemplo 1 (Ensaios de atividade de substrato sintético).
7.1.15 Purificação de diversos homógolos de GH43, GH51 e GH3 (Seção 8.1 abaixo) de fermentação de T. reesei por cromatografia de permuta de cátion
[000413] Produção de enzima de escala de frasco agitado de culturas Trichoderma reesei do tipo selvagem foi realizada como descrito na WO 2005/001036. As preparações de enzima extracelular foram concentradas por filtração de Amicon Centriprep, se necessário, e aplicadas a uma coluna de permuta de cátion de sulfopropila GE Health Sciences SP-Sepharose Fast Flow (20 mL de leito equilibrado com tampão de acetato de sódio) usando um sistema de purificação GE Health Sciences Akta usando software Unicorn. As proteínas foram eluídas com um gradiente de NaCl a 0-1 M em tampão de acetato de sódio e atividade nas frações foi monitorada como descrito acima. As frações ativas foram em seguida coletadas, agrupadas e concentradas, se necessário. Atividade em frações de coluna foi monitorada usando 4-nitrofenil β-D-xilopiranosideo (quanto à atividade de BXL) ou 4-nitrofenil a-L-arabinofuranosídeo (quanto à atividade de LARF). Em ambos os casos, 2 μL da fração de coluna forma adicionados a 95 μL de tampão de acetato de sódio a 50 mM pH 5,0 e 5 μL do substrato de p-nitrofenil, misturados e incubados 2 minuto a 23 °C. Cem microlitros de solução de interrupção de carbonato de sódio a 1 N foram adicionados e a absorvência foi avaliada a 405 nm. Em alguns casos uma etapa de purificação de proteína de permuta de ânion foi útil antes da permuta de cátion. Neste caso, as frações de enzima foram permutadas em tampão de ácido (N-morfolino) etanossulfônico-NaOH (MES) a 50 mM pH 6,3, e em seguida a amostra de proteína foi aplicada em uma coluna de permuta de ânion de amina quaternária GE Health Sciences Q-Sepharose Fast Flow (20 mL de volume de leito equilibrado com tampão de MES). O sistema de purificação de proteína Akta como descrito para a etapa de permuta de cátion foi usado. As proteínas foram eluídas com um gradiente de NaCl a 0 a 0,5 M em tampão de MES. As enzimas ativas foram em seguida permutadas em tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0 antes de cromatografia de permuta de cátion.
7.1.16 Purificação de Xilanases
[000414] A purificação de xilanase foi conduzida em dois estágios:
[000415] Estágio 1: Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). (NH4)2 SO4 foi adicionado ao sobrenadante de fermentação para obter uma concentração final de 1 M. A coluna de separação usada foi um uma Hiprep Fenil (highsub), 16/10, 20 mL. Tampão A: fosfato de sódio a 20 mM, pH 6,0. Tampão B: Tampão A + 1 M (NH4)2SO4. Eluição em etapas: 45% de B; 0% de B; água+10% de glycerol.
[000416] Estágio 2: Filtração de gel (GF). Eluído de 0% B da coluna de HIC foi coletado e carregado em uma coluna de grau preparativo HiLoad 26/60 Superdex 75 (320 mL, GE Healthcare). A fase móvel foi fosfato de sódio a 20 mM, pH 6,8, contendo NaCl a 0,15 M. O perfil de eluição é mostrado na figura 26. A figura 27 mostra a detecção de SDS- PAGE da separação de duas etapas de AfuXyn 5.
[000417] O Applied Biosycaules BIOCAD® Vision e Amersham Pharmacia Biotech AKTA Explorer foram usados para purificação de proteína de T. reesei XYN3. Aproximadamente 150 mL de Xilanase 3, de um concentrado de ultrafiltração, foram carregados em uma coluna de dessalinização Sephadex G-25M (total volume ~ 525 mL) equilibrada em tampão de TES a 10 mM, pH 6,8. 300 a 400 mL desta amostra dessalinizada foi em seguida carregada em uma coluna de permuta de ânion (resina de amina quaternária de densidade elevada; Applied Biosycaules Inc.). A proteína de ligação foi em seguida eluída usando um gradiente de sal entre 0 a 1 M de cloreto de sódio usando volumes de 8 colunas de tampão de TES a 25 mM. A eluição da proteína ocorreu entre 0 a 250 mM de cloreto de sódio, e foi detectada usando 10% de Bis-Tris NUPAGE® SDS-PAGE (Novex).
[000418] As amostras contendo Xilanase 3 eluída foram concentradas para 10 mL com concentradores de membrana Vivaspin 5,000 MWCO (corte de peso molecular) (Vivascience; GE Healthcare). O concentrado foi em seguida carregado em um High Load 26/60 Superdex 200 (ID no 17-1071-01; GE Healthcare). A coluna foi equilibrada com tampão de TES a 25 mM, pH 6,8, contendo cloreto de sódio a 100 mM, e a proteína de ligação foi eluída em volumes de 8 colunas do tampão de TES com cloreto de sódio.
[000419] A pureza da proteína eluída foi avaliada usando 10% de BisTris NUPAGE® SDS-PAGE (Novex), e determinada a ser maior do que 95% puro.
7.1.17 Purificação de Fv43D
[000420] O concentrado de ultrafiltragem (UFC) de Fusarium verticillioides 43D foi permutado por tampão e dialisado em comparação com o tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 4,0, durante a noite. O material dialisado foi passado através de uma coluna HiTrap de 1 mL pré-empacotada com resina de fluxo rápido de sulfopropil sefarose (GE Healthcare) designada para uso com uma seringa. O Fv43D purificado foi eluído com tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 4,0, com cloreto de sódio a 250 mM. O UFC e tampão de acetato de sódio foram purgados através da coluna usando um seringa de 5 mL ajustada com um conector GE Healthcare. O Fv43D purificado foi dialisado durante a noite em comparação com tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 4.0. A proteína purificada foi ensaiada por SDS-PAGE, HPLC, e espectroscopia de massa para demonstrar homogeneidade.
7.1.18 Purificação de Fv51A
[000421] O concentrado de ultrafiltragem (UFC) de Fusarium verticillioides 51A foi permutado por tampão e dialisado em comparação com o tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0, durante a noite. O material dialisado foi passado através de uma coluna RESOURCE 15 6 mL pré-empacotado com meios de sulfonato de metila (GE Healthcare). O UFC foi carregado a 1 mL/minuto em comparação com tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5.0, e eluído a 5 mL/minuto em comparação com tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0, usando um gradiente de cloreto de sódio a 0 a 250 mM. As frações eluídas foram coletadas e ensaiadas por SDS-PAGE. As frações com
[000422] Fv51A purificado foram concentradas usando um concentrador 10,000 MWCO Vivaspin de Sartorius Stemdim Biotech. O Fv51A purificado foi dialisado em comparação com o tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,0, durante a noite. A proteína purificada foi ensaiada por SDS-PAGE, HPLC, e espectroscopia de massa para demonstrar homogeneidade. O sistema AKTA Explorer 100 de GE Healthcare foi usado para a purificação de Fv51A.
8. EXEMPLO 2: EXPRESSÃO DE GENES HEMICELULASE  INDIVIDUAIS DE VÁRIAS ESPÉCIES EM TRICHODERMA REESEI 8.1 Genes Fusarium verticillioides
[000423] A sequência para Fv51A foi obtida pesquisando o genoma Fusarium verticillioides no bando de dados de Broad Institute (http://www. broadinstitute.org/) para homólogos de GH51 arabinofuranosidase.
[000424] Os seguintes genes de Fusarium verticillioides foram expressos em Trichoderma reesei: Fv3A, Fv43A, Fv43B, Fv43D, Fv51A, Fv3B, Fv43C, Fv39A, Fv43E, Fv30A, Fv30B, e Fv43F. A sequência de Fv3A foi obtida pesquisando quanto os homólogos de GH3 β-xilosidase em genoma Fusarium verticillioides. A sequência anotada carecia de uma sequência sinal e o programa de previsão de Augustus (http://augustus.gobics.de/) foi usado para identificar a sequência a montante que continha uma sequência de sinal. Sequências para Fv39A, Fv43A, Fv43B, Fv43D, Fv43E, e Fv30A foram obtidas pesquisando o genoma Fusarium verticillioides para homólogos de GH39, GH30, e GH43 β-xilosidase.
[000425] Estruturas de leitura aberta dos genes de hemicelulase de interesse foram ampliadas por PCR usando DNA genômico purificado/extraído de Fusarium verticillioides como o padrão. O termociclizador PCR usado foi DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BioRad Laboratories). A polimerase de DNA usado foi PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase (Stratagene). Os iniciadores usados para ampliar as estruturas de leitura aberta foram como segue: Fv3A: Iniciador dianteiro MH124 (5'- CACCCATGCTGCTCAATCTTCAG-3') (SEQ ID NO:52) Iniciador inverso MH125 (5'-TTACGCAGACTTGGGGTCTTGAG-3') (SEQ ID NO:53) Fv43A:  Iniciador dianteiro MH075 (5'-CACCATGTGGCTGACCTCCCCATT-3') (SEQ ID NO:54) Iniciador inverso MH076 (5'- TTAGCTAAACTGCCACCAGTTGAAGTTG -3') (SEQ ID NO:55) Fv43B: Iniciador dianteiro MH077 (5'-CACCATGCGCTTCTCTTGGCTATTGT- 3') (SEQ ID NO:56) Iniciador inverso MH078 (5'-CTACAATTCTGATTTCACAAAAACACC- 3') (SEQ ID NO:57) Fv43D: Iniciador dianteiro MH081 (5'-CACCATGCAGCTCAAGTTTCTG-3') (SEQ ID NO:58) Iniciador inverso MH082 (5'-CTAAATCTTAGGACGAGTAAGC-3') (SEQ ID NO:59) Fv51A: Iniciador dianteiro SK1159 (5’- CACCATGGTTCGCTTCAGTTCAATCCTAG-3') (SEQ ID NO:60) Iniciador inverso SK1160 (5’-CTAGCTAGAGTAAGGCTTTCC-3‘) (SEQ ID NO:61) Fv39A: Dianteiro: MH116 (5’-CACCATGCACTACGCTACCCTCACCAC-3') (SEQ ID NO:62) Inverso: MH117 (5’-TCAAGTAGAGGGGCTGCTCACC-3') (SEQ ID NO:63) Fv3B: Iniciador dianteiro MH126 (5'- CAC CAT GAA ACT CTC TAG CTA CCT CTG -3') (SEQ ID NO:64) Iniciador inverso MH127 (5'- CTA CGA AAC TGT GAC AGT CAC GTT G -3') (SEQ ID NO:65) Fv30A:  Iniciador dianteiro MH112 (5’-CAC CAT GCT CTT CTC GCT CGT TCT TCC TAC-3') (SEQ ID NO:66) Iniciador inverso MH113 (5’-TTA GTT GGT GCA GTG GCC ACG-3’) (SEQ ID NO:67) Fv30B: Iniciador dianteiro MH114 (5’-CAC CAT GAA TCC TTT ATC TCT CGG CCT TG-3’) (SEQ ID NO:68) Iniciador inverso MH115 (5’-CAG CCC TCA TAG TCG TCT TCT TC-3’) (SEQ ID NO:69) Fv43C: Iniciador dianteiro MH079 (5'- CAC CAT GCG TCT TCT ATC GTT TCC -3') (SEQ ID NO:70) Iniciador inverso MH080 (5'- CTA CAA AGG CCT AGG ATC AA -3') (SEQ ID NO:71) Fv39A: Iniciador dianteiro MH116 (5’-CAC CAT GCA CTA CGC TAC CCT CAC CAC-3’) (SEQ ID NO:72) Iniciador inverso MH117 (5’-TCA AGT AGA GGG GCT GCT CAC C-3’) (SEQ ID NO:73) Fv43E: Iniciador dianteiro MH147 (5’-CAC CAT GAA GGT ATA CTG GCT CGT GG-3’) (SEQ ID NO:74) Iniciador inverso MH148 (5’-CTA TGC AGC TGT GAA AGA CTC AAC C-3’) (SEQ ID NO:75) Fv43F: Iniciador dianteiro MH149 (5’-CACCATGTGGAAACTCCTCGTCAGC- 3’) (SEQ ID NO:76) Iniciador inverso MH150 (5’-CTA ATA AGC AAC AGG CCA GCC ATT G-3’) (SEQ ID NO:77)
[000426] Os iniciadores dianteiros incluíram quarto nucleotídeos adicionais (sequências - CACC) na extremidade 5’ para facilitar a clonagem direcional em pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) (Figure 28). As condições de PCR para ampliar as estruturas de leitura aberta foram como segue (exceto para Fv51A): Etapa 1: 94°C durante 2 minutos. Etapa 2: 94°C durante 30 segundos. Etapa 3: 57°C durante 30 segundos. Etapa 4: 72°C durante 30 a 45 segundos. Etapas 2, 3 e 4 foram repetidas durante mais 29 ciclos. Etapa 5: 72°C durante 2 minutos. Durante Fv51A, as seguintes condições foram usadas: Etapa 1: 94°C durante 2 minutos. Etapa 2: 94°C durante 30 segundos. Etapa 3: 56°C durante 30 segundos. Etapa 4: 72°C durante 45 segundos. As etapas 2, 3, 4 foram repetidas durante mais 25 ciclos. Etapa 5:retenção a 4°C.
[000427] Os produtos de PCR das correspondentes estruturas de leitura aberta de hemicelulase foram purificados usando um Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA). Os produtos de PCR purificados foram clonados no vetor pENTR/D-TOPO, transformado-se em células de E. coli quimicamente competentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e semeados em placas de LA com 50 ppm de canamicina. DNA de plasmídeo foi obtido das transformações de E. coli usando um kit de preparação de plasmídeo QIAspin (Qiagen). Dados de sequência para o DNA inserido no vetor pENTR/D-TOPO foram obtidos usando M13 dianteiro e iniciadores reversos (Sequetech, Mountain View, CA). Um vetor pENTR/D-TOPO com a sequência de DNA correta da correspondente estrutura de leitura aberta de hemicelulase foi recombinado com o vetor de destino de pTrex3gM (WO 05/001036, figura 29) usando mistura reacional de LR clonase (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O produto da reação de LR clonase foi subsequentemente transformado em células de E. coli quimicamente competentes TOP10 que foram semeadas em LA contendo 50 ppm de carbenicilina. Os vetores de expressão resultante eram plasmídeos de pTrex3gM contendo as correspondentes estruturas de leitura aberta de hemicelulase que resultaram do evento de recombinação entre os sítios attR1 e attR2 de pTrex3gM e os sítios attL1 e attL2 de pENTR/D-TOPO; e o marcador de seleção de Aspergillus nidulans acetamidase (amdS). O DNA dos vetores de expressão contendo as correspondentes estruturas de leitura aberta de hemicelulase foi isolado usando um kit Qiagen miniprep e usado para transformação por biobalística de esporos de Trichoderma reesei.
[000428] A transformação por biobalística de Trichoderma reesei com o vetor de expressão de pTrex3gM contendo a correspondente estrutura de leitura aberta de hemicelulose foi realizada usando o protocolo seguinte. A transformação da cepa de deleção de quad de celulase de Trichoderma reesei (Δcbh1, Δcbh2, Δeg1, Δeg2) por bombardeio de hélio foi realizada usando um Sistema de Liberação de Partícula Biolistic® PDS-1000/He de Bio-Rad (Hercules, CA) seguindo as instruções do fabricante (veja as publicações de patente WO 05/001036 e US 2006/0003408). As transformações foram transferidas para placas de seleção de acetamida frescas (veja a publicação de patente WO 2009114380). As transformações estáveis foram inoculadas em placas de microtítulo de filtro (Corning), contendo 200 μL/cavidade de meio mínimo de glicina (6,0 g/L de glicina; 4,7 g/L de (NH4)2 SO4; 5,0 g/L de KH2PO4; 1,0 g/L de MgSO-7H:2O; 33,0 g/L de PIPPS; pH 5,5) com pós- adição estéril de ~2% de mistura de glicose/soforose (US 7,713,725) como a fonte de carbono, 10 mL/L de 100 g/L de CaCl2, 2,5 mL/L de elementos de traço de T. reesei (400X): 175 g/L de ácido cítrico anidroso; 200 g/L de FeSO-7H:2O; 16 g/L de ZnSO-7H:2O; 3,2 g/L de CuSO-5H:2O; 1,4 g/L de MnSO-H:2O; 0,8 g/L de HβBoa). As transformações foram cultivadas em cultura líquida durante 5 dias em uma câmara rica em O2 alojada em um incubador a 28°C. As amostras de sobrenadante da placa de microtítulo de filtro foram coletadas em um manifold a vácuo. As amostras de sobrenadante foram executadas em 4 a 12% de geis de NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante para verificar quanto à expressão. O gel foi manchado com pigmento de Azul simplesmente (Invitrogen, Carlsbad, CA). A purificação de enzimas GH43, GH51 e GH3 de fermentações de T. reesei foi realizada por cromatografia de permuta de cátion como descrito no exemplo 1.
8.2 Genes de outras espécies
[000429] As sequências de Pf43A e Pf51A foram obtidas pelo sequenciamento do genoma de Penicillium funiculosum. As indagações usadas para as pesquisas do genoma de P. funiculosum foram outros homólogos de GH43 e GH51 fúngicos disponíveis nos genomas públicos. Um programa de previsão de gene chamado Augustus (http://augustus.gobics.de/) foi usado para verificar as sequências de íntrons, junto com o códon de partida. A sequência de Fv43D foi usada para levantar dúvida quanto aos genomas de Gibberella zeae (Fusarium graminearum) e Fusarium oxysporum disponíveis na base de dados do Broad Institute e recuperar as sequências para Gz43A e Fo43A respectivamente. Os genes de Gz43A e Fo43A foram sintetizados por GeneArt (Geneart GmbH, Regensburg, Germany) com a sequência de sinal de CBH1 em vez da sequência de sinal negativa. Nenhum gene conteve íntrons. O gene de Pf51A foi otimizado por códon e sintetizado por GeneArt com a sequência de sinal de CBH1 em vez da sequência de sinal positiva.
[000430] Pf43A e Pf51A foram clonadas e expressas em Trichoderma reesei usando os seguintes iniciadores: Pf43A: MH151 (5'-CACCATGCTTCAGCGATTTGCTTATATTTTACC-3') (SEQ ID NO:78) Pf43A: MH152 (5'-TTATGCGAACTGCCAATAATCAAAGTTG-3') (SEQ ID NO:79) Pf51A: SK1168 (5'-CACCATGTACCGGAAGCTCGCCGTG-3’) (SEQ ID  NO:80) Pf51A: SK1169: (5'-CTACTCCGTCTTCAGCACAGCCAC-3’) (SEQ ID NO:81)
[000431] Três genes foram clonados a partir de Aspergillus fumigatus para expressão em Trichoderma reesei: GH11 Xilanase 2 (AfuXyn2), GH11 Xilanase 5 (AfuXyn5), e Af43A de GH43. Os iniciadores para iniciadores de clonagem de AfuXyn2, AfuXyn5, e Af43A são mostrados abaixo: AfuXyn2: A.fumi-Q4WG11-F: (5’-CCGCGGCCGCACCATGGTTTCTTTCTCCTACCTGCTGCTG-3’) (SEQ ID NO:82) A.fumi-Q4WG11-R: (5’-CCGGCGCGCCCTTACTAGTAGACAGTGATGGAAGCAGATCCG-3’) (SEQ ID NO:83) AfuXyn5: A.fumi-Q4WFZ8-F: (5’- CCGCGGCCGCACCATGATCTCCATTTCCTCGCTCAGCT-3’) (SEQ ID NO:84) A.fumi-Q4WFZ8-R: (5’-CCGGCGCGCCCTTATCACTTGGATATAACCCTGCAAGAAGGTA-3’) (SEQ ID NO:85) Af43A: SK1203: (5'-CACCATGGCAGCTCCAAGTTTATCC-3’) (SEQ ID NO:86) SK1204 - (5 TCAGTAGCTCGGGACCACTC-3’) (SEQ ID NO:87)
[000432] Os métodos usados para clonagem e expressão de todos estes genes foram similares ao procedimento descrito para clonagem dos genes de Fusarium. Os genes adicionais incluindo aqueles listados na Tabela 1B foram clonados de uma maneira similar.
9. EXEMPLO 3: TESTE PARA ATIVIDADE DE NOVAS HEMICELULASES EM SUBSTRATOS SINTÉTICOS
[000433] As atividades de Fv3A, Fv43A, Fv43B, Fv43D e várias outras proteínas, por exemplo, na Tabela 2, foram testadas em substratos sintéticos pNPX e pNPA como descrito no ensaio de atividade de substrato sintético no Exemplo 1. Bxl1 de T. reesei foi usada em 0,7 g/L. As outras amostras de enzima, e o controle de hospedeiro de deleção de quad, foram adicionados em volume de culturas de crescimento (placa de microtítulo ou escala de frasco de agitação). Portanto, a atividade absoluta não pode ser comparada através de amostras, porém é uma indicação de uma proteína expressa ativa com a atividade de pNPX e pNPA relativa mostrada na Tabela 2. A atividade em substratos de para-nitrofenila não é usada como um prognosticador de Desempenho em sacarificação de biomassa.
10. EXEMPLO 4: HIDRÓLISE DE ESPIGA DE MILHO PRÉ-TRATADA POR PREPARAÇÕES DE CELULASE E HEMICELULASE 10.1 Desempenho de sacarificação de proteínas de expressão
[000434] O desempenho de sacarificação de proteínas expressas como adições a uma mistura de enzima com uma deficiência de L-α- arabinofuranosidase foi avaliado. Os candidatos de L-α- arabinofuranosidase foram avaliados em um ensaio de sacarificação de espiga de 4 dias por adição a uma mistura de enzima Xyn3 de Accelerase® 1500/T. reesei/Fv3A. A análise foi conduzida como descrito no ensaio de sacarificação de espiga de milho (Exemplo 1) com as seguintes enzimas e quantidades/concentrações: • Accelerase® 1500, TP (Nitrogênio total) 54,2 mg/mL • Xyn3 de Trichoderma reesei, 2,9 mg/mL de TP (purificado) • Fv3A, 3,2 mg/mL de TP (purificado) • Fv51A, 7,8 mg/mL de TP (purificado) • Mg51A, 6,8 mg/mL de TP (TCA/BCA) • At51A, 6,7 mg/mL de TP (TCA/BCA) • Pt51A, 3,3 mg/mL de TP (TCA/BCA)  • Ss51A, 3,0 mg/mL de TP (TCA/BCA) • Vd51A, 6,8 mg/mL de TP (TCA/BCA) • Cg51B, 3,6 mg/mL de TP (TCA/BCA) • Af43A, 2,6 mg/mL de TP (TCA/BCA) • Pf43A, 2 mg/mL de TP (TCA/BCA) • Fv43E, 1,37 mg/mL de TP (TCA/BCA)
[000435] A proteína total (TP) de amostras purificadas foi determinada por A280 a menos que de outro modo observado. A proteína total de amostras não purificadas foi determinada por BCA de acordo com as instruções do fabricante, a menos que de outro modo observado. Accelerase® 1500 foi adicionado a 20 mg de proteína/g de celulose; Xyn3 de Trichoderma reesei foi adicionada a 5 mg de proteína/g de celulose; Fv3A foi adicionada a 5 mg de proteína/g de celulose. Fv51A, Mg51A, At51A, Pt51A, Ss51A, Vd51A, Cg51B, Af43A, Pf43A, ou Fv43E foi adicionada a 1, 3, e 5 mg de proteína/g de celulose. Seguindo 4 dias de incubação, 50°C, 200 rpm, a placa de ensaio foi saciada e analisada por HPLC quanto aos açúcares solúveis.
[000436] As enzimas foram descobertas realçarem a produção de glicose ou xilose ou arabinose, ou concentração de celobiose ou xilobiose reduzida nesta mistura de enzima. Os resultados são mostrados nas figuras 30A e 30B.
[000437] O desempenho de sacarificação de proteínas expressas foi também avaliado como adições à mistura de enzima com uma deficiência de L-α-arabinofuranosidase e β-xilosidase. Os candidatos de β-xilosidase foram avaliados em um ensaio de sacarificação de espiga de 3 dias por adição a uma mistura de enzima Xyn3 de Accelerase® 1500/T. reesei. A análise foi conduzida como descrito no ensaio de sacarificação de espiga de milho (Exemplo 1) com as seguintes enzimas e quantidades/concentrações: • Accelerase® 1500, TP (nitrogênio total) 54,2 mg/mL  • Xyn3 de Trichoderma reesei, 2,9 mg/mL (purificado) • Fv3A, 3,2 mg/mL (purificado) • Fv43D, 6,8 mg/mL (purificado) • Pf43A, 2 mg/mL de TP (BCA) • Pf43B, 2,7 mg/mL de TP (BCA) • Fv43E, 1,37 mg/mL de TP (BCA) • Fv43F, 2,8 mg/mL de TP (BCA) • Fv30A, 2,7 mg/mL de TP (BCA)
[000438] Accelerase® 1500 foi adicionado a 17,9 mg de proteína/g de celulose; Xyn3 de T. reesei foi adicionada a 5 mg de proteína/g de celulose. Fv3A, Fv43D, Pf43A, Pf43B, Fv43E, Fv43F, ou Fv30A foi adicionada a 1, 3, e 5 mg de proteína/g de celulose (Fv43E foi apenas adicionado a 1 e 3 mg/g). Seguindo 3 dias de incubação, 50°C, 200 rpm, a placa de ensaio foi saciada e analisada por HPLC quanto aos açúcares solúveis. Os resultados são mostrados na figura 31. As enzimas foram descobertas realçarem a glicose, ou a xilose ou a arabinose produzida, ou a concentração de celobiose ou xilobiose reduzida nesta mistura de enzima.
[000439] O desempenho de sacarificação de proteínas expressas foi também avaliado como adições à mistura de enzima com uma deficiência de xilanase. Durante a construção das cepas de expressão integradas de Trichoderma reesei (descritas no exemplo 9 abaixo), uma cepa de T. reesei (cepa # 44) foi isolada, o que super-expressou as proteínas Bgl1, Fv3A, Fv51A, Fv43D, porém não super-expressou endo-Xilanase. Esta cepa foi usada como a base à qual as xilanases candidatas foram adicionadas para análise de performace. Os candidados de endo-Xilanase foram avaliados em um ensaio de sacarificação de espiga de 3 dias por adição ao produto de enzima de cepa #44. A análise foi conduzida como descrito no ensaio de sacarificação de espiga de milho (Exemplo 1) com as seguintes enzimas  e quantidades/concentrações: • Produto de enzima de cepa #44, 78,6 mg/mL de TP (Biureto modificado) • Trichoderma reesei Xyn, 3 2,9 mg/mL de TP (purificado) • AfuXyn2, 3,3 mg/mL de TP (purificado) • AfuXyn3, 5,8 mg/mL de TP (purificado) • AfuXyn5, 14,8 mg/mL de TP (purificado) • PfuXyn1, 1,9 mg/mL de TP (purificado) • SspXyn1, 1,2 mg/mL de TP (purificado)
[000440] A composição de enzima produzida por cepa #44 foi adicionada a 20 mg de proteína/g de celulose; as enzimas de Xilanase candidatas foram adicionadas a 3 e 7 mg de proteína/g de celulose. Seguindo 3 dias de incubação, a 50°C, 200 rpm, a placa de ensaio foi saciada e analisada por HPLC quanto aos açúcares solúveis. As enzimas foram descobertas realçarem a xilose, ou glicose, ou arabinose produzida, ou concentração de celobiose ou xilobiose reduzida nesta mistura de enzima. Os resultados são mostrados na figura 32.
[000441] O desempenho de sacarificação de proteínas Fv51A e Pa51A expressas em misturas de enzima com deficiência de L-α- arabinofuranosidase foi avaliado e comparado. Fv51A e Pa51A foram avaliadas em um ensaio de sacarificação de espiga de 3 dias por adição a uma mistura de enzima de Accelerase® 1000/Xyn2 de T. reesei /Bxl1 ou Fv3A. A análise foi conduzida como descrito no ensaio de sacarificação de espiga de milho (Exemplo 1) com as seguintes enzimas e quantidades/concentrações: • Accelerase® 1000, 60,6 mg/mL de TP (nitrogênio total) • Xyn2 de Trichoderma reesei, 4,1 mg/mL de TP (purificado) • Bxl1 de Trichoderma reesei, 69 mg/mL de TP (TCA/ nitrogênio total)  • Fv3A, 65 mg/mL de TP (TCA/nitrogênio total) • Fv51A, 43 mg/mL de TP (TCA/BCA) • Pa51A, 85,4 mg/mL de TP (TCA/nitrogênio total)
[000442] Accelerase® 1000 foi adicionada a 20 mg de proteína/g de celulose; Xyn2 de Trichoderma reesei foi adicionada a 5 mg de proteína/g de celulose; Bxl1 de Trichoderma reesei ou Fv3A foi adicionada a 5 mg de proteína/g de celulose. Fv51A foi adicionada a 5 mg de proteína/g de celulose. Pa51A foi adicionada a 1, 2, ou 5 mg de proteína/g de celulose. Seguindo 3 dias de incubação, a 50°C, 200 rpm, a placa de ensaio foi saciada e analisada por HPLC quanto aos açúcares solúveis. As combinações de enzima foram descobertas realçarem a xilose, ou glicose, ou arabinose produzida, ou concentração de celobiose ou xilobiose reduzida nesta mistura de enzima. Os resultados são mostrados na figura 33.
[000443] Fv51A e Pa51A também foram avaliadas em um ensaio de sacarificação de espiga de 3 dias por adição a uma mistura de enzima de Accelerase® 1000/ Xyn2 de Trichoderma reesei. Fv51A (29 mg/mL TP) e Pa51A (29 mg/mL) purificadas foram usadas nesta parte do estudo. Accelerase® 1000 foi adicionada a 17,5 mg de proteína/g de celulose; Xyn2 de Trichoderma reesei foi adicionada a 4,4 mg de proteína/g de celulose. Fv51A foi adicionada a 4,4 mg de proteína/g de celulose. Pa51A foi adicionada a 0,9, 1,8, e 4,4 mg de proteína/g de celulose. Seguindo 3 dias de incubação, a 50°C, 200 rpm, a placa de ensaio foi saciada e analisada por HPLC quanto aos açúcares solúveis. As combinações de enzima foram descobertas realçarem a xilose, ou glicose, ou arabinose produzida nesta mistura de enzima. Os resultados são mostrados na figura 34.
[000444] O desempenho de sacarificação de proteínas expressas foi também avaliado como adições à mistura de enzima com deficiência de β-xilosidase. Os candidatos de β-xilosidase foram avaliados em um ensaio de sacarificação de espiga de 3 dias por adição a uma mistura de enzima de Accelerase® 1000/ Xyn2 de Trichoderma reesei/Fv51A. A análise foi conduzida como descrito no ensaio de sacarificação de espiga de milho (Exemplo 1) com as seguintes enzimas e quantidades/concentrações: • Accelerase® 1000, TP (TCA/Nitrogênio total) 60,6 mg/mL • Xyn2 de Trichoderma reesei, 4,1 mg/mL de TP (purificado) • Fv3A, 65 mg/mL de TP (TCA/Nitrogênio total) • Fv3B, 62,9 mg/mLTP (TCA/Nitrogênio total) • Fv39A, 47,5 mg/mL de TP (TCA/Nitrogênio total) • Fv30B, 62,9 mg/mL de TP (TCA/Nitrogênio total) • Fv51A, 43 mg/mL de TP (TCA/BCA)
[000445] Accelerase® 1000 foi adicionada a 20 mg de proteína/g de celulose; Xyn2 de Trichoderma reesei foi adicionada a 5 mg de proteína/g de celulose; Fv51A foi adicionada a 5 mg de proteína/g de celulose. Fv39A, Fv30B, Fv3A, ou Fv3B foi adicionada a 1, 2, ou 5 mg de proteína/g de celulose. Seguindo 3 dias de incubação, a 50°C, 200 rpm, a placa de ensaio foi saciada e analisada por HPLC quanto aos açúcares solúveis. As enzimas e combinações foram descobertas realçarem a produção de glicose ou xilose ou arabinose, ou concentração de celobiose ou xilobiose reduzida nesta mistura de enzima, com ou sem outra β-xilosidase (T. reesei Bxl1). Os resultados são mostrados nas figuras 35A-35C.
10.2 Atividade de endo-Xilanases candidatas com xilano de birchwood
[000446] A atividade de endo-Xilanases candidatas foi avaliada usando xilano de birchwood como um substrato usando o ensaio seguinte. Noventa microlitros de uma solução de matéria-prima (Sigma X0502) de xilano de birchwood a 1% (peso/volume) foram adicionadas a cavidades em uma placa de microlitro de 96 cavidades e pré-  incubadas a 50°C durante 10 minutos. As diluições de enzima e padrões de xilose foram adicionados (10 μL) à placa de microlitro e as placas incubadas a 50°C durante 10 minutos. Enquanto isso, 100 μL de solução de DNS foram adicionados a tubos de PCR. Seguindo os 10 minutos de incubação, 60 μL da reação de enzima foram transferidos para os tubos de PCR contendo a solução de DNS. Os tubos foram incubados em um termociclizador a 95°C durante 5 minutos, e em seguida resfriados para 4°C. Cem microlitros da mistura reacional foram transferidos para uma placa de 96 cavidades, e a absorvência a 540 nm foi medida. Uma curva padrão de xilose foi gerada e usada para calcular a atividade. Uma unidade de xilanase é definida como a quantidade de enzima requerida para gerar 1 μmol de equivalentes de açúcar redutores de xilose por minuto sob as condições do ensaio. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
10.3 Hidrólise de enzima de oligômeros de arabinoxilano de espiga de milho sacarificada
[000447] Neste estudo, a hidrólise de enzima dos oligômeros de arabinoxilano que permanecem após a digestão de espiga de milho pré- tratada com amônia diluída com preparações de celulase e hemicelulase foi monitorada. A preparação de oligômeros crus é descritas no exemplo 1. Os açúcares de oligômero totais foram determinados por HPLC (veja Exemplo 1) após hidrólise de ácido dos oligômeros crus com ácido sulfúrico a 2% (volume/volume) em um frasconete selado a 121°C durante 30 minutos. As concentrações de açúcar foram corrigidas quanto a uma quantidade pequena de degradação de açúcar como determinado por amostras de controle de misturas de açúcar conhecidas tratadas pelo mesmo procedimento. A concentração de açúcares totais na preparação de oligômero bruto determinada por este método foi 45 g/L de glicose, 168 g/L de xilose, e 46 g/L de arabinose. Quando responsável pelo açúcar monomérico presente em oligômeros crus antes da hidrólise de ácido, 86% da glicose, 90% da xilose, e 43% da arabinose estavam presentes em forma oligomérica. Várias β-xilosidases, arabinofuranosidases, e misturas das mesmas foram testadas quanto à conversão aumentada de monômero de arabinose da preparação de oligômeros crus. A preparação de oligômero bruto foi diluída 20 vezes para 12 g/L de oligômeros em 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 5,0, e mantida a 50°C em um bloqueio de aquecimento em tubos de Eppendorf de 1,5 mL tampados. As enzimas foram adicionadas a concentrações finais de 0,06-0,09 g/L e incubadas durante 24 horas para alcançar a conclusão. As amostras foram em seguida removidas para análise de HPLC de açúcares monoméricos como descrito no Exemplo 1. Os resultados são listados na Tabela 4 como % de conversão em açúcar monomérico com base no açúcar total como determinado por hidrólise de ácido.
[000448] Para obter os rendimentos mais elevados (44-71%) de arabinose a partir dos oligômeros de arabinoxilano restantes na mistura de oligômero bruta, os dados na Tabela 4 mostram que as combinações binárias de Fv3A+Fv51A, Fv3A+Fv43B, e Fv43A+Fv43B fornecem os melhores resultados. A partir das famílias de sequência e atividade em substratos artificiais, deduz-se que a Fv3A é uma β-xilosidase e Fv51A é uma L-α-arabinofuranosidase.
[000449] Sabe-se que os açúcares de arabinose em arabinoxilano de espiga de milho são frequentemente ligados à xilose em ambas as posições de carbono 2 e 3 do açúcar de arabinose. Desse modo, a atividade de Fv3A é possível hidrolisar a ligação xil(1-2)ara que em seguida torna disponível a ligação ara(1-3) xila à hidrólise pela L-α- arabinofuranosidase. Das β-xilosidases testadas, apenas Fv3A e Fv43A pareceram ter esta atividade. Além disso, nesta análise apenas, apenas Fv43B pareceu ter atividade de L-α-arabinofuranosidase entre os 43 membros de família de Fusarium verticillioides. Os resultados são  mostrados na Tabela 4.
11. EXEMPLO 5: FAIXA DE SUBSTRATO DE B-XILOSIDASES PARA HIDRÓLISE DE ESPIGA DE MILHO EFICAZ
[000450] Neste exemplo, a faixa de substrato de 3 β-xilosidases e sua relação com a conversão eficaz de oligômeros de espiga de milho em açúcares monoméricos foram determinadas. A preparação de hidrolisado de espiga de milho contendo açúcares oligoméricos e ensaio de açúcares monoméricos foi realizada como descrito no Exemplo 1. Os espectros de NMR de próton de açúcares oligoméricos com grau de polimerização (DP) maiores do que 2 quando separado por cromatografia de exclusão por tamanho em Bio-Gel P2 foram determinados (figura 36 e figura 37). Os espectros de oligômeros antes do tratamento de enzima são rotulados "oligômeros de MD07" no painel de controle de figura 36 e espectros do mesmo oligo contendo frações após tratamentos de enzima estão nos paineis restantes de figura 36 e figura 37 rotulados com a enzima de tratamento.
[000451] As frações de Bio-gel P2 contendo oligômeros maiores do que DP2 (5-10 mg) foram liofilizadas, em seguida dissolvidas em 0,7 mL de uma solução de D2O contendo 0,5 mM de 2,2-dimetil-2-silapentano- 5-fulfonato (DSS) como padrão interno. As alíquotas de 0,55 mL foram usadas para as amostras de NMR para otimizar a supressão do pico de água residual. As versões padrões das sequências de pulso de correlação de Varian 2D foram usadas, com otimização da amplitude espectral de 13C para os experimentos heteronucleares. Os espectros foram adquiridos em uma Varian Unity Inova usando uma criosonda de alta sensibilidade operando a 500 MHz. A elucidação de estrutura foi feita identificando-se as correlações que caracterizam o sistema de spin para os resíduos de açúcar individuais e em seguida identificando-se as correlações interglicosídicas.
[000452] A arabinose contendo oligômeros, como determinado por NMR, é dominada por uma ou mais estruturas ramificadas em que a arabinose é ligada β- 1^3 a um resíduo de xilose em um fragmento de polímero. O resíduo de arabinose na ramificação resultante é também substituído por um resíduo de xilose ligado β-1 ^2 à arabinose. Pouca arabinose sem esta segunda substituição está presente nos xilo- oligômeros restantes. T. reesei Bxl1 não é muito eficaz em clivagem da xilose 1 ^>2 mais distante para ligação de arabinose como evidenciado pelos sinais restantes a 5,5 a 5,55 ppm nos espectros. A combinação da Fv43A que é eficaz em oligômeros de xilose de cadeia mais longa e a Fv43B de L-α-arabinofuranosidase remove mais, porém não todas, das espécies ramificadas com sinais na faixa de 5,5 ppm e o tratamento diferente com uma Bxl1 de T. reesei não deixa nenhum do sinal em 5,35, que é atribuível à arabinose restante ramificada para oligômero de xilose.
[000453] A região de próton anomérica dos espectros do xilo- óligômeros restantes após tratamento com Fv51A apenas ou em combinação com a Fv3A mostra resultados diferentes. A L-alfa- arabinofuranosidase apenas não é eficaz na redução da complexidade de sinais na região. A Fv3A beta-xilosidase remove essencialmente toda a xilose subentendendo a ramificação de arabinose deixando na maioria das vezes simplesmente estruturas de oligômero de arabinose 1^3 xilose ligadas. A adição da L-alfa-arabinofuranosidase à beta-xilosidase resulta em uma conversão razoavelmente completa em açúcares monoméricos como evidenciado pelo aumento em sinal vindo dos prótons anoméricos α e β de açúcares de redutores.
[000454] Pode, desse modo, ser calculado que a eficácia aumentada de uma β-xilosidase sobre outra é provável ser devido à faixa de substrato em termos da complexidade estrutural do aglicona admissível como substrato.
12. EXEMPLO 6: COMPARAÇÃO DE SEQUÊNCIA E RESÍDUOS  CRÍTICOS NA DETERMINAÇÃO DA FAIXA DE SUBSTRATO EM B- XILOSIDASES DE GH3
[000455] A β-xilosidase de T. reesei (Bxl1) é 61% similar ao ortólogo de F. verticillioides (Fv3A) e compartilha 42% da identidade de sequência como mostrado no alinhamento de figura 38. A Fv3A tem uma faixa de substrato muito mais ampla do que Bxl1, o que é provável ser atribuído aos aminoácidos não conservados entre as duas proteínas.
13. EXEMPLO 7: DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE HEMICELULASE DEFINIDA PARA HIDRÓLISE DE ESPIGA DE MILHO PARA AÇÚCARES MONOMÉRICOS
[000456] A espiga de milho pré-tratada como descrito no Exemplo 1 foi usada como suspensão de água ajustada para cerca de pH 5 com H2SO4 em água a 18,6 g de sólidos de espiga de milho secos/100 g de polpa total. 0,78 g da suspensão foi adicionado a frasconetes de vidro de 4 mL e pH 5,0 suficiente, 50 mM de tampão de acetato de sódio foram adicionados para fornecer para fornecer um peso total de reação de 1,06 g após as adições de enzima. As hemicelulases foram adicionadas como as preparações purificadas descritas no exemplo 1. O sobrenadante da cepa de T. reesei de deleção de quad (Quad nas tabelas 5 e 6) é o concentrado de proteínas antecedentes expressas pela cepa de T. reesei deletada em 4 atividades de celulase principais (descritas no WO 05/001036). A Accelerase® 1000 é uma mistura de celulase total com alta atividade de β-glucosidase. Os frasconetes foram incubados a 230 rpm em um agitador orbital a 48°C durante 72 horas, em seguida 2 mL de água foram adicionados. Uma sub-amostra foi tomada e também diluída, centrifugada e filtrada para análise de HPLC quanto a açúcares monoméricos como descrito no Exemplo 1. Os resultados experimentais definindo as quantidades úteis de atividade de hemicelulase definida para hidrolisar a espiga de milho pré-tratada para  açúcares monoméricos são mostrados na Tabela 5.
[000457] Os resultados dos experimentos de planejamento (DoE) foram ajustados a um modelo de superfície e usados para determinar as melhores relações dos sete componentes de enzima para melhor rendimento de glicose, xilose e arabinose nas duas concentrações de proteína total testadas. Os resultados das relações para os sete componentes de enzima são mostrados na Tabela 6.
[000458] Outra exploração das relações (Tabela 7) foi conduzida incluindo Fv3A, e novamente incluindo Fv43D e sustentando aquela constante atividade em um nível baixo. Os parâmetros de reação e condições de reação foram idênticos àqueles descritos para o experimento de DoE completo.
[000459] As reações (números de execução) 20, 21, e 22 contêm apenas uma mistura de enzima total de celulose e nas 21 mg/g de carga de glicano monomerizaram cerca de 48% da glicose presente na espiga e 24% da xilose. A adição da endo-Xilanase, Xyn3 de Trichoderma reesei permitiu o aumento da carga de proteína total de celulase ao mesmo tempo em que retendo aproximadamente a produção de monômero de glicose e aumentou a produção de monômero de xilose para cerca de 40% (execução# 1). Todas as combinações que fornecem produções de arabinose acima de 40% exigiram a combinação de Fv43D, Fv43A e Fv43B ou Fv51A ou de Fv3A e Fv51A ou Fv43B. Aquelas combinações também tendem a ter maior liberação de xilose para açúcar monomérico.
[000460] Outro conjunto de reação reivindicado na refinação da mistura exigida de hemicelulases foi executado mantendo tanto a constante de carga de celulase total quanto à carga do endo-Xilanase. A preparação de Accelerase® 1000 celulase total foi mantida constante a 12 mg/g de glicano e a Xyn3 endo-Xilanase T. reesei foi mantida a xilano 6 mg/g. Fv51A foi a L-α-arabinofuranosidase apenas na mistura, em doses diferentes. Outras condições de reação permaneceram as mesmas, porém o hidrolisado foi analisado por cromatografia de exclusão por tamanho como descrito no Exemplo 1. A quantificação de açúcares individuais foi realizada por área de pico apenas e os resultados são mostrados na Tabela 8.
[000461] Todas as combinações liberaram quantidades de glicose similares e aproximadamente a mesma quantidade de xilose solúvel total. O grau de redução para xilose monomérica variou por tratamento. Sem atividade adicionada para converter oligômero em monômero, cerca de 50% da xilose solubilizada permaneceram oligoméricas, a menos que pelo menos uma β-xilosidase fosse adicionada. Fv3A a 2 mg de proteína de Fv3A/g de xilano reduziu >DP2 oligômeros a 3,6 mg/mL. A adição de 2 mg de proteína de Fv51A/g de xilano a 2 mg de proteína de Fv3A/g de xilano também diminuiu os >DP2 oligômeros para 1,5 mg/mL. Cerca de 2 mg de Fv51A/g de xilano pareceram ser suficientes para reduzir os >DP2 oligômeros a um mínimo quando as 2 mg/g de Fv3A exigidas estavam presentes (Tabela 8).
[000462] Uma mistura de 6 mg/g de Xyn3 de T. reesei de xilano, 2 mg/g de Fv3A e 1 ou 2 mg/g de Fv51A é uma carga adequada para reduzir o arabinoxilano de espiga total a açúcares monoméricos. A adição de Fv43D à mistura ajuda na obtenção da xilobiose ou outros oligômeros de DP2 para monômero. A hidrólise de arabinose para monômero não foi medida neste experimento.
14. EXEMPLO 8: EFICÁCIA DE HEMICELULASES NA PRODUÇÃO DE AÇÚCARES MONOMÉRICOS A PARTIR DE ESPIGA DE MILHO
[000463] Neste exemplo, a eficácia de um conjunto de atividades de hemicelulases purificada na produção de xilose monomérica e açúcares de arabinose quando agindo sozinha sobre a espiga de milho pré- tratada com amônia diluída é demonstrada. Três misturas (Misturas A, B, & C) de hemicelulases purificadas foram preparadas e usadas para hidrolisar hemicelulose em espiga pré-tratada em 1 g total, 14% de reações de sólidos preparadas como no Exemplo 1 e executadas sob as condições descritas no exemplo 1. Os açúcares monoméricos foram analisados por HPLC como descrito no Exemplo 1 após 72 horas de reação e as quantidades obtidas são mostradas na Tabela 9. • Mix A: 6 mg de Xyn3 de Trichoderma reesei; 4 mg de Fv3A; 1 mg de Fv51A/g de xilano • Mix B: 6 mg de Xyn3 de Trichoderma reesei; 1 mg de Fv43D; 3 mg de Fv43A; 3 mg de Fv43B/g de xylan • Mix C: 6 mg de Xyn3 de Trichoderma reesei; 3 mg de Fv3A; 1 mg de Fv43D; 1 mg de Fv51A/g de xilano
[000464] Neste experimento, os grupos de hemicelulase definidos produziram levemente menos açúcar monomérico do que visto em experimentos anteriores que incluíram atividades para solubilizar a celulose. Os rendimentos foram ainda maiores do que aqueles observados com adição de endo-Xilanase apenas às preparações de celulase total. As atividades de hemicelulase são eficazes na obtenção de xilano para monômero.
[000465] O mesmo conjunto de misturas foi usado em preparações de hemicelulose feitas a partir de espiga de milho, palha total a partir de sorgo grão, switchgrass e bagaço de cana de açúcar usando os procedimentos nos métodos gerais de acordo com o Exemplo 1. As suspensões de matéria-prima de cada preparação de hemicelulose a 100 mg/mL em tampão de acetato de sódio pH 5,0 a 50 mM foram feitas e o pH foi verificado. Cada uma delas foi diluída em 10 mg de preparação por mL com mais 50 mM de tampão de acetato. As alíquotas de cada mistura de enzima foram adicionadas a 100 μL dos 10 mg/mL de suspensão e as reações foram executadas em duplicata, incubadas a 48°C durante 6 horas com agitação. As reações foram diluídas com 100 μL de água, centrifugadas e filtradas antes da análise de HPLC quanto aos açúcares monoméricos como descrito no Exemplo 1.200 μL de cada suspensão de hemicelulose foram diluídos com 200 μL de H2SO4 a 0,8 N, autoclavados a 121°C durante 30 minutos em ciclo líquido, em seguida filtrados e os açúcares analisados por HPLC como descrito no Exemplo 1. Os resultados mostrados na Tabela 10 são relatados como o açúcar monomérico médio liberado pela mistura de enzima como uma porcentagem do açúcar hidrolisável por ácido presente na reação.
[000466] Misturas de A e C funcionaram bem sobre hemicelulose de espiga de milho e como observado em outros experimentos sobre espiga de milho pré-tratada total. Misturas contendo Fv3A aumentam a conversão de arabinose em monômero e fornecem uma ligeira vantagem na conversão de xilose em monômero. Todas as 3 misturas funcionam bem sobre a hemicelulose purificada de outros monocotiledôneos. A mistura de uma endoxilanase, ou uma ou duas β- xilosidases, uma das quais tem especificidade de substrato além de duas ou três unidades de xilose ligadas β V>4 e uma L α- arabinofuranosidase resulta em uma mistura de hemicelulase efetiva em comparação com a hemicelulose monocotiledônea.
15. EXEMPLO 9: CONSTRUÇÃO DA CEPA DE EXPRESSÃO INTEGRADA DE TRICHODERMA REESEI
[000467] Uma cepa de expressão integrada de Trichoderma reesei foi construída, que coexpressou cinco genes: gene de β-glucosidase de T. reesei bgl1, um gene xyn3 de endoxilanase de T. reesei, gene fv3A de β-xilosidase de F. verticillioides, gene fv43D de β-xilosidase de F. verticillioides, e gene fv51A de α-arabinofuranosidase de F. verticillioides.
[000468] A construção dos cassetes de expressão para estes diferentes genes e a transformação da cepa de T. reesei são descritas abaixo.
15.1 Construção do cassette de expressão de beta-glucosidase
[000469] A porção de terminal N do gene bgl1 de β-glucosidase de T. reesei nativo foi otimizado por códon por DNA 2.0 (Menlo Park, USA). Esta porção sintetizada compreendida das primeiras 447 bases da região de codificação. Este fragmento foi amplificado por PCR usando os iniciadores SK943 e SK941. A região restante do gene bgl1 nativo foi amplificada por PCR de uma amostra de DNA genômico extraída da cepa RL-P37 de T. reesei, usando o iniciador SK940 e SK942. Estes dois fragmentos de PCR do gene bgl1 foram fundidos um ao outro em uma reação de PCR de fusão, usando os iniciadores SK943 e SK942:
[000470] Iniciador dianteiro SK943: (5’- CACCATGAGATATAGAACAGCTGCCGCT-3’) (SEQ ID NO:88) Iniciador inverso SK941: (5’-CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG-3’) (SEQ ID NO:89)) Iniciador dianteiro SK940: (5’-CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGGCGGTCG- 3’) (SEQ ID NO:90) Iniciador inverso SK942: (5’- CCTACGCTACCGACAGAGTG-3’) (SEQ ID NO:91)
[000471] Os fragmentos de PCR de fusão resultantes foram clonados no Gateway ® Entry vetor pENTR™/D-TOPO® , e transformados em células quimicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) resultando no vetor intermediário, pENTRY-943/942 (figura 39). uma sequência de nucleotídeo do DNA inserido foi determinada. O vetor pENTRY-943/942 com uma sequência de bgl1 correta foi recombinado com pTrex3g usando um protocolo de reação de LR clonase® delineado pela Invitrogen. A mistura de reação de LR clonase foi transformada em células quimicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen), resultando no vetor de expressão final,  pTrex3g 943/942 (figura 40). O vetor também contêm o gene de Aspergillus nidulans amdS codificando acetamidase como um marcador selecionável para a transformação de T. reesei. O cassete de expressão foi amplificado por PCR os com iniciadores SK745 e SK771 para gerar o produto para transformação da cepa, usando o método de eletlroporação descrito no WO 08153712. Iniciador dianteiro SK771: (5’ - GTCTAGACTGGAAACGCAAC -3’) (SEQ ID NO:94) Iniciador inverso SK745: (5’ - GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC -3’) (SEQ ID NO:95)
15.2 Construção do cassete de expressão de endoxilanase
[000472] O gene xyn3 de endoxilanase de T. reesei nativo foi amplificado por PCR de uma amostra de DNA genômico de T. reesei, usando iniciadores xyn3F-2 e xyn3R-2. Iniciador dianteiro xyn3F-2: (5’-CACCATGAAAGCAAACGTCATCTTGTGCCTCCTGG-3’) (SEQ ID NO:94) Iniciador inverso (xyn3R-2): (5’-CTATTGTAAGATGCCAACAATGCTGTTATATGCCGGCTTGGGG- 3’) (SEQ ID NO:95)
[000473] Os fragmentos de PCR resultantes foram clonados no Gateway® Entry vetor pENTR™/D-TOPO®, e transformados em células quimicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) resultando no vetor intermediário, pENTR/Xyn3 (figura 41). uma sequência de nucleotídeo do DNA inserido foi determinada. O vetor pENTR/Xyn3 com uma sequência de xyn3 correta foi recombinado com pTrex3g usando um protocolo de reação LR clonase® delineado pela Invitrogen. A mistura de reação de LR clonase foi transformada em células quimicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen), resultando no vetor de expressão final, pTrex3g/Xyn3 (figura 42). O vetor também contêm o gene Aspergillus nidulans amdS codificando acetamidase como um marcador selecionável para a transformação de T. reesei. O cassete de expressão foi amplificado por PCR com os iniciadores SK745 e SK822 para gerar o produto para transformaçãoda cepa, usando o método de eletroporação. Iniciador dianteiro SK745: (5’ - GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC-3’) (SEQ ID NO:96) Iniciador inverso SK822: (5’ - CACGAAGAGCGGCGATTC-3’) (SEQ ID NO:97)
15.3 Construção do cassette de expressão de β-xilosidase Fv3A
[000474] O gene fv3A de β-xilosidase de F. verticilloides foi amplificado de uma amostra de DNA genômico de F. verticilloides usando os iniciadores MH124 e MH125. Iniciador dianteiro MH124: (5’ - CAC CCA TGC TGC TCA ATC TTC AG -3’) (SEQ ID NO:98) Iniciador inverso MH125: (5’ - TTA CGC AGA CTT GGG GTC TTG AG -3’) (SEQ ID NO:99)
[000475] Os fragmentos de PCR foram clonados no Gateway ® Entry vetor pENTR™/D-TOPO®, e transformada em células quimicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) resultando no vetor intermediário, pENTR-Fv3A (figura 43). uma sequência de nucleotídeo do DNA inserido foi determinada. O vetor pENTRY-Fv3A com uma sequência de fv3A correta foi recombinado com pTrex6g usando um protocolo de reação LR clonase® delineado pela Invitrogen. A mistura de reação de LR clonase foi transformada em células quimicamente competentes E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen), resultando no vetor de expressão final, pTrex6g/Fv3A (figura 44) . O vetor também contêm um mutante resistente a clorimuron etila do gene de acetolactato sintase (als) de T.reesei nativo, designado alsR, que é usado juntamente com seu promotor e terminador nativo como um marcador selecionável para a transformação de T. reesei (WO2008/039370 A1). O cassete de expressão foi amplificado por PCR com os iniciadores SK1334, SK1335 e SK1299 para gerar o produto para transformação de T. reesei, usando o método de eletroporação (veja, por exemplo, WO2008153712 A2). Iniciador dianteiro SK1334: (5’ - GCTTGAGTGTATCGTGTAAG -3’) (SEQ ID NO:100) Iniciador dianteiro SK1335: (5’ - GCAACGGCAAAGCCCCACTTC -3’) (SEQ ID NO:101) Iniciador inverso SK1299: (5’ - GTAGCGGCCGCCTCATCTCATCTCATC CATCC -3’) (SEQ ID NO:102)
15.4 Construção do cassette de expressão Fv43D de β-xilosidase
[000476] Para a construção do cassete de expressão Fv43D de β - xilosidase de F. verticilloides, o produto do gene fv43D foi amplificado de DNA genômico de F.verticilloides usando os iniciadores SK1322 e SK1297. Uma região do promotor do gene egl1 de endoglucanase foi amplificada por PCR de DNA genômico de T. reeseiextraído da cepa RL-P37, usando os iniciadores SK1236 e SK1321. Estes dois fragmentos de DNA amplificados por PCR DNA foram subsequentemente fundidos entre si em uma reação de PCR de fusão usando os iniciadores SK1236 e SK1297. O fragmento de PCR de fusão resultante foi clonado em vetor pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) para fornecer o plasmídeo TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D (figura 45) e células quimicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) foram transformadas usando este plasmídeo. O DNA de plasmídeo foi extraído de diversos clones de E.coli e confirmado por digestão de restrição. Iniciador dianteiro SK1322: (5’-CACCATGCAGCTCAAGTTTCTGTC- 3’) (SEQ ID NO:103) Iniciador inverso SK1297: (5’-GGTTACTAGTCAACTGCCCGTTCTGTAGCGAG-3’) (SEQ ID  NO:104) Iniciador dianteiro SK1236: (5’-CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3‘) (SEQ ID NO:105) Iniciador inverso SK1321: (5’-GACAGAAACTTGAGCTGCATGGTGTGGGACAACAAGAAGG-3’) (SEQ ID NO:106)
[000477] O cassete de expressão foi amplificado por PCR de TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D com os iniciadores SK1236 e SK1297 para gerar o produto para transformação de T. reesei, usando o método de eletroporação como descrito no WO2008153712A2.
15.5 Construção do cassete de expressão de α-arabinofuranosidase
[000478] Para a construção do cassete de expressão do gene fv51A de α-arabinofuranosidase de F. verticilloides, o produto de gene fv51A foi amplificado de DNA genômico de F.verticilloides usando os iniciadores SK1159 e SK1289. Uma região do promotor do gene egl1 de endoglucanase foi amplificado por amostra de PCR de DNA genômico de T. reeseiextraída da cepa RL-P37, usando os iniciadores SK1236 e SK1262. Estes dois fragmentos de DNA amplificados por PCR foram subsequentemente fundidos entre si em uma reação de PCR de fusão usando os iniciadores SK1236 e SK1289. O fragmento de PCR de fusão resultante foi clonado em vetor pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) para fornecer o plasmídeo TOPO Blunt/Pegl1-Fv51A (figura 46) e células quimicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) foram transformadas usando este plasmídeo. Iniciador dianteiro SK1159: (5’- CACCATGGTTCGCTTCAGTTCAATCCTAG-3’) (SEQ ID NO:107) Iniciador inverso SK1289: (5’-GTGGCTAGAAGATATCCAACAC-3’) (SEQ ID NO:108) Iniciador dianteiro SK1236: (5’-CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3‘) (SEQ ID NO:109)  Iniciador inverso SK1262: (5’-GAACTGAAGCGAACCATGGTGTGGGACAACAAGAAGGAC-3‘) (SEQ ID NO:110)
[000479] O cassete de expressão foi amplificado por PCR com os iniciadores SK1298 e SK1289 para gerar o produto para transformação de T. reesei usando o método de eletroporação. Iniciador dianteiro SK1298: (5’-GTAGTTATGCGCATGCTAGAC-3’) (SEQ ID NO:111) Iniciador inverso SK1289: (5’-GTGGCTAGAAGATATCCAACAC-3’) (SEQ ID NO:112)
15.6 Cotransformação de T. reesei com os cassetes de expressão de β-glucosidase e endoxilanase
[000480] Uma cepa mutante de Trichoderma reesei, derivada de RL- P37 (Sheir-Neiss, G e outro Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984, 20:46-53) e selecionada para alta produção de celulase foi co-transformada com o cassete de expressão de β-glucosidase (promotor cbh1, gene de β- glucosidase 1 de T.reesei, terminador cbh1, e marcador amdS), e o cassete de expressão de endoxilanase (promotor cbh1, T.reesei xyn3, e terminador cbh1) usando transformação mediada por PEG (Penttila, M e outro Gene 1987, 61(2):155-64). Numerosos transformantes foram isolados e examinados quanto à produção de β-glucosidase e endoxilanase. Um transformante chamado cepa #229 de T. reesei foi usado para transformação com os outros cassetes de expressão.
15.7 Cotransformação da cepa N°229 de T. reesei com dois cassetes de expressão de β-xilosidase e α-arabinofuranosidase
[000481] A cepa N° 229 de T. reesei foi co-transformada com o cassete de expressão fv3A de β-xilosidase (promotor cbh1, gene fv3A, terminador cbh1, e marcador alsR), o cassete de expressão fv43D de β- xilosidase (promotor egl1, gene fv43D, terminador fv43D), e o cassete de expressão de fv51A α-arabinofuranosidase (promotor egl1, gene fv51A, terminador nativo fv51A) usando eletroporação. Os transformantes foram selecionados em plagas de ágar Vogels contendo clorimuron etila (80 ppm). Agar Vogels foi preparado como segue, por litro. Solução de Estoque 50 x Vogels (abaixo) 20 mL Ágar BBL 20 g Com H2O desionizada trazendo para após adição estéril: 980 mL 50% de Glicose 20 mL Solução de Estoque 50 x Vogels (WO 2005/001036), por litro: Em 750 mL de H2O desionizada, dissolver sucessivamente: Citrato de Na3* 2H2O 125,00 g KH2PO4 (Anidroso) 250,00 g NH4NO3 (Anidroso) 100 g MgSO4*7H2O 10,00 g CaCl2*2H2O 5,00 g Solução de Elemento de Traço Vogels 5,0 mL Solução de Biotina Vogels 2,5 mL
[000482] Com H2O desionizada, trazendo para 1 L
[000483] Numerosos transformantes foram isolados e examinados quanto à produção de β-xilosidase e L-α-arabinofuranosidase. Os transformantes foram também analisados quanto ao desempenho de conversão de biomassa de acordo com o ensaio de sacarificação de espiga descrito no exemplo 1. Exemplos de cepa de expressão de T. reesei integradas descritas aqui são H3A, 39A, A10A, 11A, e G9A, que expressam todos os genes para β-glucosidase 1 de T. reesei, T. reesei Xyn3, Fv3A, Fv51A, e Fv43D, em diferentes relações (Tabela 11). Exemplos de cepa de expressão de T. reesei integrados descritos aqui também incluem 44A, 69A, G6A e 102, e cada qual inclui a maioria dos genes para β-glucosidase 1 de T. reesei, T. reesei XYN3, Fv3A, Fv51A, e Fv43D, expressos em diferentes relações. A cepa 44A deficiente superexpressa T. reesei XYN3; a cepa 69A deficiente Fv51A (confirmada por Western Blot, não mostrada); cepas G6A e Fv3A deficientes 102 (Tabela 11), como determinado por análise de proteína por HPLC (Exemplo 1).
16. EXEMPLO 10: DESEMPENHO DE SACARIFICAÇÃO DE CEPA DE EXPRESSÃO T. REESEI INTEGRADA SOBRE ESPIGA DE MILHO PRÉ-TRATADA COM AMÔNIA
[000484] O desempenho de sacarificação de composições de enzima produzidas pela cepa de expressão de T. reesei integrada sobre espiga de milho pré-tratada com amônia diluída foi avaliada. Amostras de enzima de T. reesei foram geradas como ou concentrados de ultrafiltração (UFC) ou centrado. Para a geração de UFC, caldos de fermentação de T. reesei (escala 14L) foram obtidos após separação celular por centrifugação, concentrados usando ultrafiltração de membrana por meio de uma membrana de corte de peso molecular de 10 kD Millipore. Em seguida o pH foi ajustado para 4,8. O caldo separado da célula lfoi em seguida polido por filtração, usando filtração FW6 Buchner. Cada amostra de enzima foi ensaiada para concentração de proteína total usando o método Biuret modificado.
[000485] O desempenho de sacarificação foi avaliado em frasconetes ou em frascos de agitação. Cada preparação de enzima foi ensaiada quanto ao desempenho de sacarificação sobre carga de sólidos secos a 20% (DS) de espiga de milho pré-tratada com amônia diluída (veja, WO2006/110901). Todas as reações de sacarificação foram então tituladas com ácido sulfúrico para pH 5,0 e azida de sódio foi adicionada para uma concentração final de 0,01% (peso/volume), para controle da contaminação microbiana. Cada reação de sacarificação foi em seguida dosada com 20 mg de preparação de enzima de proteína total (TP) por g de glucano de substrato ou xilano, como apropriado. Accelerase® 1500 (Ac1500) e a cepa integrada UFC’s foram dosadas a 20 mg proteína total/g de glucano. Uma mistura de enzima foi preparada em uma relação de 25:9:4:3:1 Accelerase® 1500:Xyn3:Fv3A:Fv51A: FV43D. Na mistura, Accelerase® 1500 foi dosado em 20 mg de proteína total/g de glucano e as hemicelulases foram dosadas por g de xilano (4,3 mg de Xyn3/g de xilano, 1,7 mg de Fv3A/g de xilano, 1,4 mg de Fv51A/g de xilano, 0,5 mg de Fv43D/g de xilano). Cada reação de sacarificação foi incubada a 50°C em uma agitadora giratória estabelecida a 200 rpm, em seguida amostrada e diluída 10 x (v/v) antes da concentração de açúcar monomérica ser determinada usando análise de HPLC (detalhada na Seção 16.1 abaixo, sob a seção "análise de HPLC monomérica") após 1, 2, 3 e 7 dias de sacarificação (figuras 47A, 47B). No dia 3 de sacarificação, cada reação foi também amostrada por peso (peso/peso) para concentração de açúcar oligomérico por análise de HPLC (Seção 16.1, figura 47C). Estes resultados mostram que as composições de enzima produzidas pelas cepas integradas H3A e G9A fornecem melhores produções de glicose e xilose do que as misturas de Accelerase®1500 ou enzima criadas de enzimas individualmente expressas.
[000486] Uma comparação cromatográfica da composição de enzima produzida por três diferentes cepas integradas é mostrada na figura 47D.
16.1 Análise de HPLC
[000487] Análise de HPLC de Açúcar Monomérico: cada amostra foi analisada por HPLC usando uma coluna de exclusão de íon BioRad Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm). Todo dia 1, 2, 3, e 7 amostras foram diluídas 10 x volumetricamente com 5 mM de ácido sulfúrico, filtradas por meio de um filtro de 0,2 μm antes da injeção na HPLC e conduzidas sob as especificações de fabricação.
[000488] Análise de HPLC de Açúcar Oligomérico (hidrólise de ácido): Dia 3 as amostras de sacarificação foram diluídas 10 x por peso com água Milli-Q, em seguida ácido sulfúrico foi adicionado à concentração final de 4% (peso/peso). Um padrão de xilose e glicose (padrão de recuperação de açúcar - "SRS") de concentração conhecida foi também preparado e medido para análise de HPLC de açúcar monomérico como acima estabelecido, análise de HPLC de açúcar oligomérica. Amostras de HPLC oligoméricas foram então autoclavadas a 121°C durante 15 minutos, e filtradas por meio de um filtro de 0,2 μm antes da injeção na coluna de exclusão de íon HPLC BioRad Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm), e conduzidas sob as especificações do fabricante. Concentração de açúcar oligomérico foi determinada multiplicando o percentual de concentração de xilose e glicose retida do padrão de recuperação de açúcar (SRS) após hidrólise ácida, pelas concentrações de açúcar de HPLC de hidrólise ácida, em seguida subtraindo a concentração de açúcar monomérico determinada na Seção "Análise de HPLC de Açúcar Monomérico" acima.
17. EXEMPLO 11: IDENTIFICAÇÃO DE CLASSES DE ENZIMA FILOGENETICAMENTE AMPLAS QUE PODEM MELHORAR O DESEMPENHO DE SACARIFICAÇÃO DE CEPA DE T. REESEI DE EXPRESSÃO INTEGRADA
[000489] Neste exemplo, atividades de enzima que limitam a eficácia de composições de enzima produzidas por uma cepa de T. reesei de expressão integrada foram identificadas e enzimas de diferentes espécies que podem compensar aquelas atividades limitantes ou que poderiam substituir os componentes de cepa integrada são exemplificas.
[000490] 0,95 g de espiga de milho pré-tratada como descrito no exemplo 1 foi adicionado a frasconetes de vidro de 20 mL. Suficiente tampão de acetate de sódio a 50 mM, pH 5,0, e H2SO4 a 1 N foram adicionados para fornecer um peso de reação total de 3,00 g a 22 g de sólidos de espiga de milho seca / 100 g de suspensão total, pH 5,0 após adições de enzima. A composição de enzima T. reesei produzida pela cepa integrada H3A (figuras 48A, 49A, e 50A) foi adicionada como um concentrado ultrafiltrado (isto é,livre de célula) para 7 mg de proteína total por g de glucano e xilano combinado na carga de alimentação para todos os frasconetes. Além disso, hemicelulases candidate foram adicionadas como as preparações ultrafiltradas de 14 L de culturas de fermentação expressas pela cepa Quad de T. reesei (descrita no WO 05/001036). As hemicelulases candidate foram adicionadas a 0, 0,5, 1,0 ou 3,0 mg de proteína de enzima por g de glucano e xilano combinadas. As hemicelulases incluíram constituintes da composição de enzima produzida pela própria cepa integrada incluindo: • Fusarium verticillioides Fv3A • Fusarium verticillioides Fv51A • Fusarium verticillioides Fv43D Bem como enzimas de diferentes fungos • Fusarium oxysporum Fo43A • Gibberella zeae Gz43A • Penicillium funiculosum Pf43A • Aspergillus fumigatus Af43A • Podospora anserina Pa51A • Penicillium funiculosum Pf51A
[000491] Os frasconetes foram incubados a 180 rpm em uma agitadora orbital a 48°C durante 72 horas. Em seguida, 12 mL de água foram adicionados. Uma sub-amostra foi tirade e também diluída, centrifugada e filtrada por análise de HPLC para açúcares monoméricos como descrito no exemplo 1.
[000492] Os resultados mostrados na figura 48A e figura 48B demonstram que a adição de atividades de β-xilosidase tal como Fusarium verticillioides Fv43D e Fusarium oxysporum Fo43A expressivamente melhorou a liberação de xilose monomérica com relação a 7 mg de proteína total de cepa integrada de T. reesei por g de Glucano e Xilano combinados. Melhoras significantes foram ainda observadas nas baixas adições de 0,5 e 1,0 mg/g.
[000493] Os resultados mostrados na figura 49A e figura 49B demonstram que a adição de todas as hemicelulases induziu a um significante aumento em glicose monomérica, ainda >10% em cargas de hemicelulase de 1-3 mg por g de Glucano e Xilano combinados.
[000494] Os resultados mostrados na figura 50A e figura 50B demonstram que a adição de enzimas GH51 tal como Fv51A de Fusarium verticillioides, e especialmente Pa51A de Podospora anserine e Pfu51A de Penicillium funiculosum, induziu a um aumento em nível de arabinose monomérica.
18. EXEMPLO 12: SACARIFICAÇÃO DE SWITCHGRASS VARIAVELMENTE PRÉ-TRATADO POR PREPARAÇÕES DE CELULASE E HEMICELULASE
[000495] O desempenho de sacarificação de celulases e hemicelulases expressas sobre switchgrass bruto pré-tratado foi avaliado. Uma faixa de condições para pré-tratamento de switchgrass com amônia diluída foi avaliada quanto ao desempenho de sacarificação com um coquetel de enzima composto de enzimas descritas aqui. As condições de pré-tratamento variam e a eficácia do pré-tratamento afeta o desempenho da hidrólise enzimática.
[000496] Pré-tratamento de switchgrass bruto foi realizada em tubos de aço inoxidável, selados, 6" x 1/4", que foram imersos em um banho de areia quente. Uma suspensão de switchgrass bruto, água, e hidróxido de amônio (~28% de solução) foi misturada aos sólidos percentuais desejados e amônia percentual e em seguida carregados em um tubo de pré-tratamento. Os tubos foram então mantidos na temperature desejada (+/- 2°C) durante o tempo desejado e em seguida saciados em água gelada durante aproximadamente 1 minuto antes de serem trazidos para a temperatura ambiente. A suspensão pré-tratada foi removida dos tubos e deixada secar durante a noite na coifa (> 90% de sólidos obteníveis).
[000497] Os sólidos pré-tratados secos foram em seguida sacarificados a 10% de sólidos, pH 5, 50oC, 200 rpm usando Accelerase® 1500, Xyn 3, Fv3A, Fv51A, e Fv43D (25, 9, 7, 3, 1 mg de proteína total / g de glucano ou xilano respectivamente). Um volume de hidrolisado total de 5 mL em frasconetes de cintilação de 20 mL foi usado.
[000498] Produções de glucano e xilano foram com base na glicose e xilose monoméricas liberadas comparadas ao glucano ou xilano disponível para a biomassa bruta. Concentrações de açúcar monomérico foram medidas por HPLC (coluna BioRad Aminex HPX 87-H).
[000499] Tempo de pré-tratamento, temperatura, sólidos percentuais, e NH3 percentual, foram variados em uma ampla faixa a fim de otimizar os resultados de sacarificação. Cada condição de pré-tratamento que tinha ambas as produções de glucano e xilano melhor do que ~ 50% é considerada um forte executor. Os parâmetros de pré-tratamento que funcionaram fortemente são listados na tabela 12 juntamente com suas respectivas produções glucan, xilano, e percentuais totais. As conversões de Glucano e Xilano são baseadas em açúcares monoméricos liberados durante a sacarificação quando comparadas ao glucano ou xilano teoricamente disponível no switchgrass bruo. A conversão total é glicose e xilose apenas (figura 51).
19. EXEMPLO 13: SACARIFICAÇÃO DE SWITCHGRASSPRÉ- TRATADO POR PREPARAÇÕES DE CELULASE E HEMICELULASE
[000500] Além dos exemplos acima, o desempenho de sacarificação de misturas de enzima e composições de enzima produzidas por uma cepa integrada foi testado sobre diversos substratos, pré-tratamentos e condições. Estes experimentos mostram a faixa de desempenho usando a mistura de enzima ou um produto de cepa integrada. Eles demonstram bom desempenho através de uma faixa de substratos e pré-tratamentos, pH, e temperaturas.
[000501] Switchgrasspré-tratado com ammonia diluída foi preparado de acordo com os métodos e faixas de processo em WO06110901A: Switchgrass (38,7% de glucano, 22,2% de xilano, 2,5% de arabinano, 23,2% de lignina) foi moído por martelo para passar através de uma peneira de 1 mm, em seguida pré-tratado a 160oC durante 90 minutos com 6% de NH3 (peso / peso de DM, adicionado como NH4OH). Este substrato pré-tratado foi tratado com misturas de enzima contendo Accelerase® 1500, Multifect® Xilanase (ambos os produtos comerciais de Danisco A/S, Genencor Division, Palo Alto, CA), Fv3A, Fv51A, e Fv43D em uma massa de reação total de 50 g a 15% de sólidos. A proteína total (TP) dos produtos comerciais foi determinada pelo ensaio Biuret. As outras enzimas foram concentrados de ultra-filtração (UFCs) seguindo a expressão em cepas deletadas de Quad de celulase de T. reesei, com TP determinada por análise de Nitrogênio Total de proteína precipitável de TCA. Todas as reações foram dosadas com Accelerase® 1500 a 25 mg de TP/g de glucano e Multifect® Xilanase (MF Xyl) a 9 mg de TP/g de Xilano, e Fv3A, Fv51A, e Fv43D foram adicionados como indicado na figura 56A-56B a 3,6 mg de TP/g de Xilano, 3,0 mg de TP/g de Xilano e 1,0 mg de TP/g de Xilano, respectivamente. Todas as enzimas foram dosadas com relação ao teor de carboidrato de partida do switchgrass antes do pré-tratamento. As reações de sacarificação foram realizadas a 47°C e 33°C em pH 5,3 durante três dias.
[000502] Os resultados a 33°C mostraram que a adição de Fv3A, Fv51A, e Fv43D aumentou a conversão de glucano (figura 56A) e mais do que duplicaram a conversão de xilano (figura 56B). Os resultados a 47°C mostraram que a adição de Fv3A, Fv51A, e Fv43D forneceu alguma conversão de glucano aumentada (figura 56A) e mais do que duplicou a conversão de xilano (figura 56B). Adições de Fv51A ou Fv43D, sozinhas, forneceram grandes aumentos em conversão de xilano, especialmente para xilo-oligômeros ou monômeros de xilose, respectivamente. A adição de Fv3A sozinha aumentou as produções de xilose, porém em combinação com Fv51A forneceu um grande aumento em conversão de xilano em monômero.
20. EXEMPLO 14: SACARIFICAÇÃO DE SWITCHGRASSPRÉ- TRATADO POR UMA CEPA DE T. REESEI INTEGRADA
[000503] O desempenho de sacarificação de uma composição de enzima produzida por uma cepa de T. reesei integrada (H3A) foi avaliado em switchgrass pré-tratado com amônia diluída preparado de acordo com os métodos e faixas de processo em WO 06110901A. Switchgrass (37% de glucano, 21% de xilano, 5% de arabinano, 18% de lignina) foi moído com martelo para passer através de uma peneira de 1 mm, em seguida pré-tratado a 160oC durante 90 minutos com 10,0% de NH3 (peso / peso de DM, adicionado como NH4OH). Em frascos Erlenmeyer de vidro de 500 mL duplicados, 50 g de suspensão pré- tratada a 25% de sólidos foram sacarificados a 48°C, pH 5,3 durante 7 dias, com sobrenadante da cepa integrada que foi dosada a 14 mg de TP/g de carboidrato (glucano mais xilano). TP de H3A foi determinada por análise de Nitrogênio Total de proteína precipitável de TCA. Enzimas foram dosadas com relação ao teor de carboidrato de partida do switchgrass antes do pré-tratamento.
[000504] Ao término de 7 dias, altos níveis de conversão de glucano (52 a 55%, figura 57A) e conversão de xilano (51% a 53%, (figura 57B) foram medidos por HPLC. Estes resultados mostram que a composição de enzima produzida por uma cepa integrada pode sacarificar switchgrass pré-tratado com amônia diluída em sólidos elevados (25% de matéria seca).
21. EXEMPLO 15: SACARIFICAÇÃO DE POLPA DE MADEIRA DE LEI POR UMA CEPA DE T. REESEI INTEGRADA
[000505] O desempenho de sacarificação de uma composição de enzima produzida pela cepa H3A de T reesei integrada foi avaliado em polpa não branqueada de madeira de lei industrial (derivada de processo Kraft e deslignificação de oxigênio, Smurfit Kappa Celulose Du Pin, Biganos, France) com a seguinte composição: Glucano a 75,1%, Xilano a 19,1%, lignina solúvel em ácido a 2,2%. Os estudos de sacarificação enzimática foram realizados usando o método de ensaio padrão de NREL LAP-009 "Enzymatic Sacarificação de Lignocelulosic Biomass" (http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42629.pdf), exceto que a carga de celulose foi diferente (variando de 9,3 a 20%) e uma massa total de 100 g foi usada. A condição experimental foi de 200 rpm e pH 5,0, 50°C. A enzima foi dosada a 20 mg de TP/g de glucano (com base na matéria seca final) no início do experimento. Amostras foram tiradas em intervalos de tempo se elas foram liquefeitas, e em seguida analisadas por HPLC quanto à concentração de açúcar. A concentração de glicose, xilose, e celobiose foi determinada usando um sistema Waters HPLC (Alliance system, Waters Corp., Milford, MA). A coluna de HPLC usada para análise de açúcar foi de BioRad (coluna de exclusão de íon Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm), BioRad Inc., Hercules, CA). Todas as amostras foram diluídas 10 x com 5 mM de ácido sulfúrico, filtradas por meio de um filtro de 0,2 μm antes da injeção na HPLC. Como indicado (TABELA 13) dois experimentos foram realizados em modo de "batelada alimentada": Polpa de madeira de lei pré-tratada para um teor de matéria seca inicial de 7,0% no Tempo 0 e o resto do substrato foi adicionado em tempos discretos em quatro porções iguais durante as primeiras 24 horas para trazer a carga de sólidos secos final para 20%.
[000506] Os resultados mostraram níveis elevados de conversão de glucano e xilano em monômeros (até 89% e 90%, respectivamente) com a composição de enzima produzida pela cepa H3A integrada. As conversões aumentaram com cargas de enzima maiores e tempos de sacarificação maiores. A conversão foi menor Quando os sólidos foram a 20% do que a 15%, porém esta menor concentração a 20% poderia ser parcialmente mitigada usando um processo de batelada alimentada.
22. EXEMPLO 16: SACARIFICAÇÃO DE POLPA DE MADEIRA DE LEI POR UMA CEPA DE T. REESEI INTEGRADA EM UMA FAIXA DE TEMPERATURA E PH
[000507] O desempenho de sacarificação de uma composição de enzima produzida por uma cepa de T. reesei integrada (H3A) em polpa não branqueada de madeira de lei industrial (como usada no exemplo precedente) a 7% de carga de celulose e 20 mg de TP/g de glucano de sobrenadante de cepa integrada (com base na matéria seca final e composição do substrato pré-tratado) foi testado em temperaturas de 45°C - 60°C e pH’s de 4,65 - 5,4 (tamponado em citrato de sódio a 0,1 M). Os resultados após 2 dias de sacarificação são mostrados na TABELA 14 e mostraram boas conversões de glucano e xilano na faixa total de condições testadas. Estes resultados sugeriram condições ideais para sacarificação deste substrato como pH 4,9 e 50oC porém boas conversões são observadas mesmo em pH 5,0, 60oC. Em um experimento de acompanhamento a 50oC, incluindo pH’s menores (e de outro modo condições experimentais inalteradas) boas sacarificações foram observadas em pH 3,8, pH 4,0 e pH 4,25, com títulos de glicose & xilose de 45,1 & 9,7 g/L; 50,0 & 11,4 g/L; e 57,2 & 13.2 g/L, respectivamente.
23. EXEMPLO 17: SACARIFICAÇÃO DE BAGAÇO DE CANA-DE- AÇÚCAR EXPANDIDO POR VAPOR COM UMA COMPOSIÇÃO DE ENZIMA PRODUZIDA POR UM CEPA INTEGRADA EM DIFERENTES DOSES DE ENZIMA
[000508] O desempenho de sacarificação de uma composição de enzima produzida por uma cepa T reesei integrada (H3A) sobre bagaço de cana-de-açúcar expandido por vapor foi avaliado a 7% de carga de celulose. O bagaço foi pré-tratado por injeção de vapor em um reator StakeTech a 210 psig, 200oC com um tempo de residência de 4 minutos. O material pré-tratado tinha a seguinte composição: Glucano a 40,9%, Xilano a 20,8%, Lignina a 27%. Um sobrenadante de cepa integrada foi dosado a 10, 20, 30, 50 ou 80 mg de TP / g de glucano (com base na matéria seca final e composição do substrato pré-tratado). A sacarificação foi realizada em um volume de reação de 5 mL a 50oC, pH 5 durante 3 dias. Os resultados (figura 58A-C) mostraram que um produto de cepa integrada funcionou super bem Accelerase® 1500 (20 mg de proteína /g de glucano) em conversão de glucano em glicose (figura 58A e figura 58C) e, especialmente, conversão de xilano em xilose (figura 58B e figura 58C) mesmo em metade da dose de Accelerase® 1500. A conversão de glucano, especialmente no Dia 1, aumentou significantemente quando a dose de proteína total de H3A aumentou (figura 58A e figura 58C), ao passo que a conversão de xilano foi mais rápida, com pequeno aumento do Dia 1 ao Dia 3, e muito elevado, mesmo na menor dose de proteína total de H3A (figura 58B e figura 58C).
24. EXEMPLO 18: SACARIFICAÇÃO DE FIBRA DE MILHO PRÉ- TRATADA COM ÁCIDO DILUÍDO COM VÁRIAS ENZIMAS
[000509] O desempenho de sacarificação de misturas de enzima em figra de milho pré-tratada com ácido sulfúrico diluído foi avaliado em um frasco agitado de 250 mL. Em um experimento típico, fibra de milho (composição inicial a 38% de C6 açúcares e 27% de C5 açúcares) foi ajustada para 15% de DS (sólidos secos) e 0,.36% (peso/peso%) de ácido sulfúrico foi adicionado. Suspensão de fibra de milho foi então autoclavada a 121°C durante 60 minutos. A suspensão foi então ajustada para pH 5,0 usando NaOH a 6 N. O teor de açúcar da amostra pré-tratada foi de 21 g/L de glicose e 12 g/L de xilose. Enzimas foram adicionadas ao substrato pré-tratado como segue (como indicado na figura 59A, 59B, 59C); Accelerase® 1500 (AC 1500): 20 mg de TP/g de glucano e 45 mg de TP/g de glucano; Accelerase® 1500 + Multifect® Xilanase (MF): (25 mg/g de glucano + 9 mg de TP/g de xilano) e (25 mg de TP/g de glucano + 20 mg de TP/g de xilano); Accelerase® 1500 +Xyn 3+ Fv3A+ Fv51A + Fv43D: (25 mg de TP/g de glucano + 9 mg de TP/g de xilano + 7 mg de TP/g de xilano + 3 mg de TP/g de xilano + 1 mg de TP/g de xilano) (a "mistura" de enzima total). A proteína total (TP) dos produtos comerciais (Accelerase® 1500 e Multifect® Xilanase: Danisco US Inc., Genencor) foi determinada por ensaio Biuret. As outras enzimas foram concentrados de ultra-filtração (UFCs) seguindo a expressão em cepas deletadas de celulase Quad de T. reesei (como descrito anteriormente) - sua TP foi determinada por análise de Nitrogênio Total de proteína precipitável por TCA. Todas as enzimas foram dosadas com relação ao teor de carboidrato de partida do fibra de milho antes do pré-tratamento. Sacarificação enzimática foi realizada em 200 rpm e 50°C durante 24 horas, 48 horas e 120 horas. Amostras foram tiradas em diferentes intervalos de tempo e analisadas para a formação de açúcares de glicose e xilose por HPLC. O açúcar ajustado (glicose ou xilose) refletiu o açúcar sendo produzido da etapa enzimática, com os açúcares de partida subtraídos.
[000510] Os resultados mostram que a mistura de enzima total realizou super bem a (Accelerase® 1500 + Multifect® Xilanase) ("AC 1500 + MF") em conversão de glucano e em conversão de xilano, mesmo quando ambos foram dosados na mesma proteína total. A mistura de enzima total forneceu quase completa conversão de glucano deste substrato após 5 dias de sacarificação.
25. MODALIDADES ESPECÍFICAS E INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[000511] Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e outros documentos citados neste pedido são pelo presente incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos na mesma extensão como se cada publicação individual, patente, pedido de patente ou outro documento fosse individualmente indicado para ser incorporado por referência para todos os propósitos.
[000512] Ao mesmo tempo em que várias modalidades específicas foram ilustradas e descritas, será aprecisado que várias alterações possam ser feitas sem afastar-se do espírito e escopo da invenção.

Claims (32)

1. Composição que não ocorre naturalmente, caracterizada pelo fato de que compreende: a. um primeiro polipeptídeo Fv3A compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2; e b. um segundo polipeptídeo selecionado de: (i) um polipeptídeo Xyn3 de Trichoderma reesei compreendendo SEQ ID NO:42,; (ii) um polipeptídeo Xyn2 de Trichoderma reesei compreendendo SEQ ID NO:43; (iii) um polipeptídeo AfuXyn2 compreendendo SEQ ID NO:24; e (iv) um polipeptídeo AfuXyn5 compreendendo SEQ ID NO:26.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um terceiro polipeptídeo selecionado de (a) o polipeptídeo Fv43B compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12; (b) o polipeptídeo Pa51A compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14; (c) o polipeptídeo Fv51A compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:32; (d) o polipeptídeo Af43A compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20; ou (e) o polipeptídeo Pf51A compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:22.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polipeptídeo Fv43D compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais polipeptídeos selecionados do grupo consistindo em componentes independentes de uma celulase total; uma beta-glucosidase, uma endoglucanase, e uma celobioidrolase.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a celulase total é uma celulase total enriquecida por beta-glicosidase.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a celulase total é uma celulase fúngica filamentosa total.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a celulase fúngica filamentosa total é uma preparação de uma espécie de Acremonium, Aspergillus, Emericela, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Scytalidium, Thielavia, Chrysosporium, Phanerochaete,Tolypocladium, ou Trichoderma.
8. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a celulase total é uma celulase total de Chrysosporium lucknowense, Phanerochaete chrysosporium,Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, ou Pencillium funiculosum.
9. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a beta-glucosidase é um polipeptídeo Bgl1 de Trichoderma reesei, compreendendo SEQ ID NO:45 que constitui até 50 % em peso do peso total de enzimas de celulase na composição.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de beta-glucosidase constitui 2 % em peso a 50 % em peso do peso total de proteínas na composição.
11. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o um ou mais polipeptídeos tendo atividade de celulase constituem 30 % em peso a 80 % em peso do peso total de proteínas na composição.
12. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que, compreende ainda uma ou mais proteínas auxiliares selecionadas de mannanases, galactanases, arabinases, ligninases, amilases, glucuronidases, proteases, esterases, lipases, xiloglucanases, polipeptídeos 61 da família glicosídeo hidrolase, proteína ligante de celulose 1 (CIP1), proteína ligante de celulose 2 (CIP2), proteínas tipo proteína ligante de celulose 1 (CIP1), proteínas tipo proteína ligante de celulose 2 (CIP2), celobiose desidrogenases, e manganês peroxidases, suolenina, e expansinas.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais proteínas auxiliares constituem 1 % em peso a 50 % em peso do peso total de proteínas na composição.
14. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a biomassa é espiga de milho, palha de milho, fibra de milho, switchgrass, sorgo, papel, polpa, Miscanthus ou bagaço de cana-de-açúcar.
15. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma biomassa.
16. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que: (i) o peso combinado do segundo polipeptídeo é de 1 g a 40 g por 1 kg de hemicelulose na biomassa; (ii) o peso combinado do primeiro polipeptídeo de 1 g a 50 g por 1 kg de hemicelulose na biomassa; e/ou (iii) o peso combinado do terceiro polipeptídeo é de 0,5 g a 20 g por 1 kg de hemicelulose na biomassa.
17. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o peso combinado do segundo polipeptídeo é de 0,5 g de 40 g por 1 kg de hemicelulose na biomassa.
18. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais polipeptídeos tendo atividade de celulase, em que o peso combinado de polipeptídeos tendo atividade de celulase é de 1 g a 100 g por 1 kg de celulose na biomassa.
19. Caldo de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende a composição como definida na reivindicação 1.
20. Caldo de fermentação de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é o caldo de fermentação de um fungo filamentoso.
21. Caldo de fermentação de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o fungo filamentoso é um Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, Phanerochaete, ou Chrysosporium.
22. Caldo de fermentação de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é um caldo de fermentação livre de célula.
23. Método de converter biomassa em açúcares, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a biomassa com uma composição que não ocorre naturalmente como definida na reivindicação 1.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o material compreendendo hemicelulose é espiga de milho, palha de milho, fibra de milho, switchgrass, sorgo, papel, polpa, Miscanthus ou bagaço de cana-de-açúcar.
25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda recuperar monossacarídeos.
26. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que expressa um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, em que o polipeptídeo é expresso a partir de um cassete de expressão heterólogo.
27. Microrganismo transgênico de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é uma célula de um fungo filamentoso ou de uma bactéria.
28. Microrganismo transgênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o fungo filamentoso é Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, Phanerochaete, ou Chrysosporium.
29. Microrganismo transgênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a bactéria é um Streptomyces, um Thermomonospora, um Bacillus, ou um Celulomonas.
30. Método, caracterizado pelo fato de que é para produzir a composição como definida na reivindicação 1.
31. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que: (i) o material compreendo hemicellulose compreende ainda celulose; (ii) a quantidade do segundo polipeptídeo é de 1 g a 40 g por kg de hemicelulose no material; (iii) a quantidade do primeiro polipeptídeo é de 1 g a 50 g por kg de hemicelulose no material; e/ou (iv) a quantidade do terceiro polipeptídeo é de 0,5 g a 20 g por kg de hemicelulose no material.
32. Método de acordo a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que (i) a quantidade de polipeptídeos tendo atividade de celulase é de 1 g a 100 g por kg de celulose no material compreendendo hemicelulose; e/ou (ii) a quantidade de polipeptídeos tendo atividade de beta-glucosidase é de 50% ou menos do peso total de polipeptídeos tendo atividade de celulase.
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