CN109957514A - 一种粗壮脉纹孢菌的新用途 - Google Patents

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邓泽元
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Abstract

本发明发酵工程领域，具体涉及一种粗壮脉纹孢菌的新用途，用于产蛋白水解酶。还涉及利用粗壮脉纹孢菌发酵豆渣产蛋白水解酶的方法，其主要包括下列步骤为：(1)粗壮脉纹孢菌菌株的活化、孢子化；(2)加入吐温‑80、无菌水制备孢子悬液；(3)固态发酵豆渣获得含蛋白水解酶的粗酶液。本发明涉及的粗壮脉纹孢菌是从我国传统发酵食品中提取并纯化得到的，安全无毒。因此，依据本发明获得的蛋白水解酶在食品和农产品加工中具有明显的优势。

Description

一种粗壮脉纹孢菌的新用途
技术领域
本发明发酵工程领域，具体涉及一种粗壮脉纹孢菌的新用途。
背景技术
蛋白酶被广泛应用于食品加工、饲料、加酶洗涤剂和医药等行业。近年来，利用微生物发酵生产蛋白酶的研究已成为国内外上述领域的研究热点之一。国外的研究报道主要集中于探索具有特殊性质的碱性蛋白酶并对产蛋白酶菌株进行基因重组使其产高活性蛋白酶。国内报道在利用基因工程技术提高碱性蛋白酶产量和活性上也取得了一定的进展。同时也开始致力于从我国传统的发酵豆制品(比如豆瓣酱、豆豉)中筛选、分离、纯化和鉴定出一些新的高产蛋白酶菌株，并通过单因素和响应面实验确定了底物类型和比例、接种量、培养温度、培养时间等最佳发酵工艺条件。
目前在菌株应用方面，固态发酵因高效和低能耗等优点已成为改良菜籽粕等优质植物蛋白源农副产品的营养价值和品质的研究重点之一。国内外研究团队在采用固态发酵豆粕、棉籽粕、菜籽粕等方面取得了良好效果，主要体现在可以降解蛋白质等大分子物质为游离氨基酸、肽类等易于被肠道吸收的小分子物质，以及有效减少或去除单宁等抗营养因子。
粗壮脉纹孢菌是本实验室从江西传统发酵食品中提取并纯化得到的菌株，具有产高活性纤维素酶和类胡萝卜素的优点。并且粗壮脉纹孢菌是从天然食品中分离得到，安全无毒，这在食品和农产品加工中具有明显的优势。而国内外对其所产蛋白酶研究甚少。因而本发明对粗壮脉纹孢菌蛋白酶进行研究，以期在其产纤维素酶和合成类胡萝卜素的基础上，为工业化应用于发酵食品和农副产品的综合开发提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是为提高粗壮脉纹孢菌在发酵食品和农副产品的综合开发的利用价值，提供了一种粗壮脉纹孢菌的新用途。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
粗壮脉纹孢菌的保藏号为CGMCC3088，用于产蛋白水解酶。
本发明还提供了一种利用粗壮脉纹孢菌固态发酵豆渣产蛋白水解酶的方法，步骤如下：
(1)将粗壮脉纹孢菌(CGMCC3088)菌株接种至活化培养基中培养活化；再将菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基中培养，使菌株全部孢子化；
(2)向PDA斜面培养基中加入吐温-80、无菌水，涡旋至菌液均匀，过滤，再加一定量灭菌水使孢子浓度为1～2×106个/mL，使固态发酵过程中菌体繁殖力和次级代谢产物的产量达到最大，制得孢子悬液。
(3)在豆渣中加入灭菌水，搅拌均匀，121℃灭菌20min，接种孢子悬液，用低浓度的盐酸和氢氧化钠调节豆渣初始pH至5.0，置于发酵罐中30℃培养72h，10000rpm离心5min即可获得含蛋白水解酶的粗酶液。
进一步地，所述步骤(3)中豆渣与灭菌水的质量比为10∶21。
进一步地，所述步骤(3)中豆渣与接种量的比例(g/mL)为5∶1。
进一步地，所述步骤(1)中活化培养基的培养条件为30℃、70％湿度、培养72h，马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基的培养条件为30℃、70％湿度、培养72h，使菌株全部孢子化，最大限度地提高发酵活力。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
以生产豆奶或豆腐过程中的副产品-豆渣为培养基原料，接种粗壮脉纹孢菌进行固态发酵，实现了其在发酵罐中高效产蛋白水解酶。本发明提供了最优化固态发酵工艺条件，豆渣与灭菌水的质量比为10∶21，豆渣与接种量的比例(g/mL)为5∶1、初始pH5.0、培养温度30℃、培养时间72h，此时蛋白酶活力可达1960U/g，与未优化前相比分别提高了232％。本发明在粗壮脉纹孢菌产纤维素酶和合成类胡萝卜素的基础上，为其所产高活力蛋白酶工业化应用于食品加工和农副产品的综合开发提供科学依据。
附图说明
图1：加水量对菌株产蛋白水解酶和可溶性蛋白质含量的影响；
图2：初始pH对菌株产蛋白水解酶和可溶性蛋白质含量的影响；
图3：培养温度对菌株产蛋白水解酶和可溶性蛋白质含量的影响；
图4：培养时间对菌株产蛋白水解酶和可溶性蛋白质含量的影响；
图5：接种量对菌株产蛋白水解酶和可溶性蛋白质含量的影响。
图6：加水量和初始pH交互影响蛋白酶活力的响应面与等高线图
图7：加水量和培养温度交互影响蛋白酶活力的响应面与等高线图
图8：初始pH和培养温度交互影响蛋白酶活力的响应面与等高线图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施例的范围。
一、实施例
粗壮脉纹孢菌为保藏号为CGMCC3088。
实施例1
称取10g的豆渣，加入21mL灭菌水，搅拌均匀，121℃灭菌20min，接种2mL的粗壮脉纹孢菌孢子悬液，用低浓度的盐酸和氢氧化钠调节培养基初始pH至5.0，置于发酵罐中30℃培养72h，10000rpm离心5min即可获得含高活力蛋白水解酶的粗酶液。
实施例2
称取10g的菜籽粕，加入21mL灭菌水，搅拌均匀，121℃灭菌20min，接种2mL的粗壮脉纹孢菌孢子悬液，用低浓度的盐酸和氢氧化钠调节培养基初始pH至5.0，置于发酵罐中30℃培养72h，10000rpm离心5min即可获得含高活力蛋白水解酶的粗酶液。
二、固态发酵条件优化实验
1.未优化固态发酵条件制备粗酶液
(1)菌株的活化及孢子的制备：在无菌操作条件下使用接种环将本实验室筛选并保藏的粗壮脉纹孢菌株(Neurospora crassa CGMCC3088)接种至活化培养基中，并置于恒温恒湿培养箱中30℃、70％湿度下培养72h。随后将菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基中，再次放置于恒温恒湿培养箱中30℃、70％湿度下培养72h，使之全部孢子化后取出备用。
(2)孢子悬浮液的制备：向PDA斜面培养基中加入10mL吐温-80(0.1％，v/v)，在无菌条件下刮下孢子至一个已灭菌的离心管中，并加入35mL无菌水，涡旋至菌液均匀，三层纱布过滤，然后加一定量灭菌水，摇匀，用血球计数板计数得孢子浓度为1～2×106个/mL。
(3)固态发酵：在培养罐中加入10g已粉碎好、过40目的干燥豆渣，加入16mL灭菌水，搅拌均匀，121℃灭菌20min，接种4mL的孢子悬液，搅拌均匀，于温度35℃的发酵罐中培养72h。
(4)粗酶液的提取及蛋白酶活力的测定
粗酶液的提取：准确称取充分研细的成曲样品与蒸馏水(g∶mL)比例1∶6混合，在水浴锅40℃间断搅拌1h，10000rpm离心5min，过滤得到粗酶液，用0.1mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释粗酶液进行蛋白酶活力的测定。
蛋白酶活力的测定：参照SB/T 10317-1999测定粗酶液的蛋白酶活力。蛋白酶活力的表示如下：每g粗酶(干物质基础)所显示的酶活力单位(U/g)，其中在40℃每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸即为1个蛋白酶活力单位。粗酶液中可溶性蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法进行测定，以牛血清蛋白作为标准品。
最终测得未优化固态发酵条件制备粗酶液蛋白酶活力为591U/g。
2.发酵条件的单因素优化实验
(1)加水量与菌株产蛋白水解酶关系的测定
固体培养基中豆渣质量10g，调节豆渣与水(g/mL)的比例分别为1∶1.25、1∶1.5、1∶1.9、1∶2.3、1∶3、1∶4，混匀灭菌后加入4mL孢子悬浮液，初始pH为自然pH，35℃培养72h，测定发酵后蛋白酶活力，实验结果见图1，确定最佳加水量为1∶1.9。
(2)初始pH与菌株产蛋白水解酶关系的测定
在优化加水量的基础上，用低浓度的盐酸和氢氧化钠调节培养基初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接种量为4mL，35℃培养72h，测定发酵后蛋白酶活力，实验结果见图2，确定最适初始pH为5。
(3)培养温度与菌株产蛋白水解酶关系的测定
在优化的加水量及初始pH基础上，培养温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，接种量为4mL，测定发酵后蛋白酶活力，实验结果见图3，确定培养最佳培养温度30℃。
(4)培养时间与菌株产蛋白水解酶关系的测定
在确定了加水量、初始pH和培养温度后，接种量为4mL，发酵84h，从第24h开始取样，时间间隔为12h，测定发酵后蛋白酶活力，实验结果见图4，确定最佳时间为72h。
(5)接种量与菌株产蛋白水解酶关系的测定
在其它四个发酵条件确定后，发酵罐分别接入不同体积孢子悬浮液(1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL)，测定发酵后蛋白酶活力，实验结果见图5，确定最佳接种量为2mL。
3.响应面Box-Behnken法优化固态发酵条件
3.1 Box-Behnken试验设计
根据单因素实验结果，用Box-Behnken法优化菌株的发酵条件，采用三因素三水平设计中心组合试验，选取加水量(X1)、初始pH(X2)、培养温度(X3)作为响应面优化的自变量，以蛋白酶活力(Y)为响应值，实验所用因素及水平如表1所示，响应面设计方案及结果见表2。
表1 Box-Behnken分析因素及水平设计
表2 Box-Behnken实验设计及结果
3.2蛋白酶活力拟合模型的建立与分析
利用响应面统计软件分析表2的数据，得到加水量(X1)、初始pH(X2)、培养温度(X3)与蛋白酶活力(Y)之间的二次多项回归方程：
Y＝1960.47+131.93X1-26.18X2+133.85X3+72.07X1X2-104.55X1X3-40.52X2X3-167.11X1 2-478.28X2 2-1153.56X3 2；
利用Design Expert 7.1软件对该回归模型和模型的相关系数进行显著性分析，结果见表3。发现一次项X1、X3影响极显著，X2影响不显著，二次项影响均极显著，交互项X1X3影响极显著；X1X2影响显著，X2X3影响不显著。模型的校正R2为0.9961，P值小于0.0001，说明模型极显著；其中失拟项的户值分别为0.0518，影响不显著，说明模型不失拟；C.V.值为3.81，表示本实验所得数据真实可信。这些结果表明，该模型成功有效，且拟合程度很好，能够准确反映各因素与响应值变化的关系，可以用于蛋白酶活力的理论预测。
表3回归模型的方差分析结果
注：**差异极显著(P＜0.01)；*差异显著(P＜0.05)。
3.3响应曲面交互作用及最佳固态发酵工艺条件
对X1、X2、X3三因素之间的交互作用进行响应面分析，得到两两因素间的蛋白酶活力的响应面曲线和等高线图，结果见图6-8。响应面的最高点是等高线中最小椭圆的中心点，通过观察响应面曲线可以观察出响应值最大值相对应的因素水平。由图可知，加水量、初始pH值、培养温度之间的交互作用对蛋白酶活力影响显著，三个响应面均为开口向下的凸形曲面，均有最高值，并基本出现在等高线的圆心处。根据所得模型，预测最优产蛋白酶的培养条件为：加水量20.50mL，pH 5.0，温度30℃，在此条件下蛋白酶活力的理论值可达到1988.39±10.22U/g。
为了进一步验证上述模型与预测的可靠性，设计三组平行实验，对实验结果进行验证。考虑到实验操作的便利性，将发酵条件确定为：豆渣10g，加水量21mL，起始pH5.0，发酵温度30℃，接种量2mL，发酵时间72h，得到的蛋白酶活力为1959.82±9.54U/g，与理论值相近，此蛋白酶活力与未优化前相比提高了231.42％。
最终确定最优化固态发酵工艺条件为：加水量21mL、初始pH5.0、培养温度30℃、培养时间72h、接种量2mL。

Claims (5)

1.一种粗壮脉纹孢菌的新用途，其特征在于，所述粗壮脉纹孢菌的保藏号为CGMCC3088，用于产蛋白水解酶。
2.一种利用粗壮脉纹孢菌固态发酵豆渣产蛋白水解酶的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将粗壮脉纹孢菌(CGMCC3088)菌株接种至活化培养基中培养活化；再将菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基中培养，使菌株全部孢子化；
(2)向PDA斜面培养基中加入吐温-80、无菌水，涡旋至菌液均匀，过滤，再加一定量灭菌水使孢子浓度为1～2×106个/mL，制得孢子悬液；
(3)在豆渣中加入灭菌水，搅拌均匀，121℃灭菌20min，接种孢子悬液，用低浓度的盐酸和氢氧化钠调节豆渣初始pH至5.0，置于发酵罐中30℃培养72h，10000rpm离心5min即可获得含蛋白水解酶的粗酶液。
3.根据权利要求2所述一种利用粗壮脉纹孢菌固态发酵豆渣产蛋白水解酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中豆渣与灭菌水的质量比为10∶21。
4.根据权利要求2所述一种利用粗壮脉纹孢菌固态发酵豆渣产蛋白水解酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中豆渣与接种量的比例(g/mL)为5∶1。
5.根据权利要求2所述一种利用粗壮脉纹孢菌固态发酵豆渣产蛋白水解酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中活化培养基的培养条件为30℃、70％湿度、培养72h，马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基的培养条件为30℃、70％湿度、培养72h。
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