CN117070372A - 光孢青霉ha5-32及其在猴头菇多糖提取中的应用 - Google Patents

光孢青霉ha5-32及其在猴头菇多糖提取中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了光孢青霉HA5‑32及其在猴头菇多糖提取中的应用。本发明通过提供一种新的微生物菌株光孢青霉HA5‑32，并用光孢青霉HA5‑32在添加蔗糖的猴头菇粉中适度生长，产生多种水解酶，之后，经发酵的猴头菇粉加水保温，细胞壁中的纤维素等物质被水解，有助于结合态的猴头菇多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。本发明将光孢青霉HA5‑32应用于猴头菇多糖提取中，较水提醇沉的常规方法相比，多糖提取得率可以提高48.7%。

Description

光孢青霉HA5-32及其在猴头菇多糖提取中的应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及光孢青霉HA5-32及其在猴头菇多糖提取中的应用。
背景技术
猴头菇(Hericium erinaceus)，是齿菌科(Hydnaceae)猴头菇属真菌，能产生肉质子实体，外形呈头状或倒卵状，似猴子的头，故名“猴头菇”或“猴头菌”。猴头菇营养成分丰富，属于食药两用菌，在中医方面，其具有利五脏，助消化之功效，主治消化不良，神经衰弱、身体虚弱等。我国人民食用猴头菇已有三千多年的历史，古代属于珍惜食品，近些年来，由于人工栽培技术逐渐成熟，市场上供应的猴头菇增多，已成为人们餐桌上的普通菜肴。
猴头菇含有多种营养或活性成分，包括多糖、低聚糖、多肽、核苷酸、甾醇、脂肪酸、猴头菌素、猴头菌酮等，具有保肝护胃、降血糖、保护神经、增强人体免疫力、抗癌、抗氧化等功效。猴头菇所含有效成分中，最受关注的是可溶性多糖，其潜在的免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血脂作用，使得猴头菇被认为是目前最有开发前景、具有保健功能的食品和药品食用菌资源之一。
目前有较多关于猴头菇多糖提取方法的研究报道，常见的方法是热水提取乙醇沉淀法(简称“水提醇沉法”)。常规的热水提取法具有操作简单、成本低的优点，但存在提取时间长、提取次数多、提取效率及得率低等缺点。
近年来，酶解技术在天然活性物质的提取中有广泛应用，它具有条件温和，对活性成分结构破坏小，能显著提高产物提取得率等优点。酶解辅助提取方法中，使用最多的是纤维素酶，其次是果胶酶和蛋白酶，或者同时使用多种酶。植物或食用菌的细胞壁构成包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，所以单一使用一种酶，对提高产物提取得率非常有限，许多研究同时使用多种酶(复合酶)，如果酶的使用量较大，无疑增加了提取成本。
自然界中的天然物质都是靠微生物分解腐烂，这些微生物在生长过程中可以产生多种分解植物或食(药)用菌组织的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等。但依靠微生物的作用，提高从猴头菇中提取多糖的得率，目前尚未得到有效应用。
发明内容
目前从猴头菇中提取多糖物质的得率低，为了解决该技术问题，本发明提供了一种光孢青霉HA5-32及其在猴头菇多糖提取中的应用。
本发明目的之一在于，通过提供一株新的微生物菌株—光孢青霉(Penicilliumglabrum)HA5-32，以该菌株接种于猴头菇中进行微生物发酵，使得猴头菇中多糖的提取得率大大提高。
本发明另一目的在于，提供光孢青霉HA5-32在猴头菇多糖提取中应用的方法—控制好光孢青霉HA5-32的生长程度，达到产酶水解猴头菇的细胞壁，但又未分解可溶性多糖，从而促进猴头菇多糖溶出，使得提取得率最终得以提高。
本发明的具体技术方案为：
一方面，本发明提供了一株光孢青霉(Penicillium glabrum)HA5-32，其保藏编号为GDMCC No:63392。
本发明从猴头菇粉微生物富集培养物中分离到菌株HA5，经紫外线诱变后，筛选获得菌株HA5-32，即光孢青霉(Penicillium glabrum)HA5-32，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63392，保藏日期2023年4月24日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。本发明通过提供一株新的微生物菌株—光孢青霉(Penicillium glabrum)HA5-32，以该菌株接种于猴头菇中进行微生物发酵，使得猴头菇中多糖的提取得率大大提高。
其中，所述光孢青霉HA5-32的核糖体DNA内转录间隔区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本发明提供了上述光孢青霉HA5-32在猴头菇多糖提取中的应用。
本发明提供一种新的微生物菌株光孢青霉HA5-32，该菌株是针对能够水解猴头菇细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。光孢青霉HA5-32在生长过程中可以产生多种分解猴头菌细胞壁的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等。所以，在筛选得到应用于从猴头菇中提取多糖的优势菌株前提下，用该菌株直接发酵预处理猴头菇，只要控制好生长程度，达到产酶水解猴头菇的细胞壁，但又未分解可溶性多糖，从而促进猴头菇多糖溶出，提取得率就能得以提高。
具体地，本发明还提供了所述应用的方法，包括以下步骤：
(1)在猴头菇粉中加入光孢青霉HA5-32孢子液，混匀后进行发酵，得到猴头菇发酵物；
(2)向猴头菇发酵物中加入去离子水，搅匀后进行保温处理、超声处理，经过滤、浓缩后，得到猴头菇水提浓缩液；
(3)向猴头菇水提浓缩液中加入乙醇，得到沉淀物，沉淀物经洗涤、干燥，得到猴头菇多糖。
经过上述步骤(1)～(3)，能够显著提高猴头菇超声水提时多糖的提取得率。步骤(1)中，光孢青霉HA5-32在添加蔗糖的猴头菇粉中适度生长，产生多种水解酶；之后，步骤(2)中，经发酵的猴头菇粉加水保温，细胞壁中的纤维素等物质被部分水解，有助于结合态的猴头菇多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。具体而言：
步骤(1)中，猴头菇粉中接种光孢青霉HA5-32孢子液后，进行发酵使光孢青霉HA5-32生长刚好达到产酶适宜的程度。
步骤(2)中，向猴头菇发酵物中加入去离子水后进行保温处理、超声处理，使达到恰好水解猴头菇细胞壁中的纤维素等物质、但又未分解可溶性多糖的程度。
作为本发明上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述发酵的温度为28～32℃、时间为48～60h。
猴头菇粉中接种光孢青霉HA5-32孢子液后，在28～32℃下发酵48～60h，可以使光孢青霉HA5-32生长刚好达到产酶适宜的程度。
作为本发明上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述的去离子水体积加入量以发酵前猴头粉质量计为20～30mL/g；所述保温处理的温度为32～36℃、时间为3～5h。
向猴头菇发酵物中加入去离子水后于32～36℃保温3～5h，可以达到恰好水解猴头菇细胞壁中的纤维素等物质、但又未分解可溶性多糖的程度。
作为本发明上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述光孢青霉HA5-32孢子液的浓度为1×107～2×107个/mL。
作为本发明上述技术方案的优选，以猴头菇粉质量计，步骤(1)中，所述光孢青霉HA5-32孢子液的体积加入量为4～6mL/g。
作为本发明上述技术方案的优选，所述光孢青霉HA5-32孢子液的制备方法为：将光孢青霉HA5-32孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，于28～30℃恒温培养60～72h后得到培养物，然后加入无菌蔗糖水溶液于所述培养物中，搅动使孢子悬浮，得到孢子液。
作为本发明上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述超声的温度为75～85℃、功率为160～200W、时间为60～90min。
向猴头菇发酵物中加入去离子水进行保温处理后，进行超声处理，有助于从达到恰好水解猴头菇细胞壁中的纤维素等物质、但又未分解可溶性多糖的程度的发酵物中提取多糖。
作为本发明上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述浓缩的条件为：减压浓缩至原体积的1/25～1/20。
作为本发明上述技术方案的优选，步骤(3)为：向猴头菇水提浓缩液中加入4～5倍体积的无水乙醇，使体系的乙醇体积分数为80％～83.3％，然后在0～4℃条件下静置16～20h得到沉淀物，然后沉淀物经无水乙醇洗涤，真空干燥至恒重，得猴头菇多糖。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明提供了一种新的微生物菌株光孢青霉HA5-32，该菌株是针对能够水解猴头菇细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得，应用于提高猴头菇多糖提取的提取得率，效果显著。
本发明还该给出了光孢青霉HA5-32在猴头菇多糖提取中的应用方法，通过光孢青霉HA5-32在添加蔗糖的猴头菇粉中，优化发酵条件，使之适度生长，产生多种水解酶，达到产酶水解猴头菇的细胞壁，但又未分解可溶性多糖，最终使多糖提取得率得以提高。应用该方法，较不采用光孢青霉HA5-32发酵预处理的常规超声提取方法，猴头菇中的多糖提取得率可以提高48.7％。
附图说明
图1苯酚-硫酸法以葡萄糖为标准品测定多糖的标准曲线。
图2本发明实施例2中DNS法测定葡萄糖的标准曲线。
图3本发明实施例3中光孢青霉HA5-32在PDA上28℃培养3d的菌落形态照片。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明实施例及对比例所用的猴头菇是齿菌科(Hydnaceae)猴头菇属真菌Hericium erinaceus的子实体；猴头菇粉是猴头菇经85℃烘干后，粉碎过40目筛的细粉。
本发明实施例及对比例中，猴头菇多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：待测样品溶液用去离子做适当倍数稀释(估算样品中多糖的浓度在标准曲线测定范围内)；固体猴头菇多糖提取物用去离子配制成浓度为0.1mg/mL的样品溶液作为待样品。吸取样品溶液1mL于10mL具塞管中，加1mL体积浓度为5％的苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后置沸水浴中加热15min，冷却至室温。以1mL去离子作为空白对照的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A490)。以相同方法测定不同浓度葡萄糖样品的A490，绘制葡萄糖浓度—A490标准曲线，如图1所示，得回归方程y＝0.0124x+0.0057(R2＝0.9990)，由回归方程计算测定猴头菇多糖样品中多糖含量。
猴头菇多糖提取得率按以下计算：
实施例1发酵猴头菇的微生物菌株分离和筛选
发酵猴头菇的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选获得：
(1)往250mL三角瓶中加入5g的猴头菇粉，再加入20mL无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养60h，期间，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养72h，得纯培养菌株9株，各菌株的编号见表1。其中，PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，于三角瓶中，用8层纱布扎口，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿20mL；
(2)往9种菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌蔗糖水溶液，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度，使不同菌株的孢子液浓度在1×107～2×107个/mL之间，得各菌株的孢子液。其中，无菌蔗糖水溶液的浓度为25g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min；
(3)9只经160℃、2h干热灭菌的100mL三角瓶中，分别加入2g猴头菇粉，再分别加入8mL步骤(2)制备的各霉菌孢子液(以猴头菇粉质量计，体积用量为4mL/g)，搅拌均匀后，三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养54h，获得猴头菇发酵物；
(4)步骤(3)经各菌株发酵的全部猴头菇粉中，各加入40mL去离子水(料液比为1g:20mL)，搅拌均匀于32℃水浴中保温5h，然后转入75℃的超声波清洗机中，160W超声提取90min。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，取1mL滤液于10mL离心管中，再加入5mL无水乙醇(溶液的乙醇体积分数为83.3％)，充分振荡后于0℃条件下静置16h后，4℃、8000r/min离心5min，弃上清液，加5mL去离子水溶解，采用苯酚-硫酸法测定水溶液中可溶性多糖含量。
按上述步骤(3)和(4)方法，2g猴头菇粉中加入8mL无菌蔗糖溶液(浓度25g/L)，做不接种霉菌的空白发酵对照；按上述步骤(4)方法，2g猴头菇加入40mL去离子水直接提取多糖，做未发酵提取对照。经不同菌株发酵的猴头菇以及对照的多糖提取得率见表1。
表1经不同菌株发酵的猴头菇以及对照的多糖提取得率
序号 菌株编号和对照 多糖提取得率(％) 提高率(％)
1 HA1 9.31 11.6
2 HA2 8.33 -0.12
3 HA3 9.70 16.3
4 HA4 9.06 8.63
5 HA5 10.3 23.5
6 HA6 8.49 1.80
7 HA7 8.82 5.76
8 HA8 9.46 13.4
9 HA9 8.37 0.36
10 空白发酵对照 8.55 2.52
11 未发酵的对照 8.34 /
由表1数据可以看出，加入无菌蔗糖水溶液但未接种霉菌的空白发酵对照，由于几乎没有霉菌生长，多糖的提取得率与未发酵对照没有显著性差异；多数菌株发酵猴头菇后，多糖的提取得率没有显著提高；猴头菇经HA5菌株发酵后，多糖提取得率为10.3％，较未经发酵对照的8.34％相比，提高了23.5％。因此，本发明选定HA5菌株作为发酵猴头菇的微生物菌种，以进行后续诱变选育进而提高多糖的提取得率。
实施例2发酵猴头菇的微生物菌株诱变选育
对菌株HA5进行诱变育种，筛选发酵性能更优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株HA5经PDA平板培养基30℃活化培养48h，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有20～30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团蓬松的脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对孢子液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子浓度为1.32×107个/mL；
(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子液和一枚无菌回形针于6只直径6cm的培养皿中，培养皿分别于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养48h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率；
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，28℃培养72h，获得50个菌株。各个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液2.5mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液(即为粗酶液)，测定各菌株粗酶液的纤维素酶活力。选择产酶活力较原菌株HA5提高较大的10菌株，再按实施例1方法，用这些菌株的孢子液接种猴头菇粉发酵，水提醇沉法提取多糖，突变菌株发酵的猴头菇以及对照的多糖提取得率见表2；
其中，产酶培养基组成为：小麦麸皮50g/L，(NH4)2SO46g/L，蛋白胨4g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl20.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250mL三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
表2突变菌株发酵的猴头菇以及对照的多糖提取得率
由表2数据可以看出，在筛选的10个菌株中，编号为HA5-32的菌株，发酵产纤维素酶的活力为45.2U/mL，较野生菌株HA5的32.7U/mL提高了38.2％。用该菌株发酵猴头菇后，多糖提取得率为12.2％，较野生菌株HA5的10.3％提高了18.5％，较未发酵的对照8.34％提高了46.3％。因此，本发明选定HA5-32菌株作为发酵猴头菇的微生物菌株，优化提取条件以提高多糖的提取得率。
其中，纤维素酶活力测定方法为：10mL刻度试管中分别加入1.5mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL的DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，搅拌均匀；用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长540nm处吸光度(A540)，由葡萄糖标准曲线(如图2所示)计算样品中的葡萄糖浓度，再计算纤维素酶活力(U/mL)。纤维素酶活力的定义：在pH 6.0、50℃条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
纤维素酶活力计算公式为：U＝(CV1)/(TV2)。其中，C为由标准曲线计算得到的葡萄糖浓度(μmol/mL)；V1为酶反应体系体积，即2mL；T为反应时间，即30min；V2为粗酶液体积，即0.5mL。
其中，葡萄糖标准曲线的绘制：7支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为5μmol/mL的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL，混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，搅拌均匀，用不含葡萄糖的试管中显色液为参比，于分光光度计测定A540，以葡萄糖浓度为横坐标，A540为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示，回归方程为y＝0.25246x+0.01487(R2＝0.9995)。
其中，DNS试剂的配制方法为：6.3g的3，5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。
实施例3菌株HA5-32的分类鉴定
菌株HA5-32划线接种在PDA平板培养基上，28℃条件下培养，初期菌丝为白色，菌落平坦，质地绒状至颗粒状，表面有大量分生孢子，灰绿色，无渗出液；反面呈淡黄褐色，无可溶性色素；孢子梗茎壁平滑，顶端膨大；帚状枝单轮生，偶有梗基状分枝；小梗瓶状，每轮8～16个，大小8.0～11μm×2.5～3.0μm；分生孢子呈球形或近球形，直径2.5～3.5μm，壁光滑或近于平滑；其中，光孢青霉HA5-32在PDA上28℃培养3d的菌落形态照片见图3。其中，PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
测得菌株HA5-32的核糖体DNA内转录间隔区核苷酸序列(rDNA-ITS)为SEQ IDNO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与已知的典型菌株Penicillium glabrumCBS125543和Penicillium bussumense CBS138160的rDNA-ITS序列具有大于99.8％的同源性，依据菌株HA5-32菌落形态特征，其更加符合Penicillium glabrum(光孢青霉)的形态特征，所以，可以确定菌株HA5-32的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，青霉属(Penicillium)，光孢青霉(Penicillium glabrum)。
所述菌株HA5-32的rDNA-ITS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述菌株HA5-32的rDNA-ITS核苷酸序列如下：
CCACCCGTGTTTATTGTACCTTGTTGCTTCGGTGCGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGG
CTTCTGCCCCCGGGTCCGCGCGCACCGGAGACACTATTGAACTCTGTCTGAAGATTGCA
GTCTGAGCATAAACTAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATC
GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGT
CATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCCGTCCCCCCGGGGACGGGTCCG
AAAGGCAGCGGCGGCACCGAGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCT
GTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACAACCAATCATCCTTTTTTCAGGTTGACCTCGGAT
CAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAGACGCAGTATGAAGTCAGGTG
GGATTACC。
综上，从猴头菇粉微生物富集培养物中分离到菌株HA5，经紫外线诱变后，筛选获得菌株HA5-32，即光孢青霉(Penicillium glabrum)HA5-32，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63392，保藏日期2023年4月24日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4光孢青霉HA5-32应用于猴头菇多糖的提取
光孢青霉HA5-32应用于猴头菇中多糖的提取，按以下步骤操作：
(1)4℃保存的光孢青霉HA5-32的PDA平板菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃恒温培养66h。加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为1.55×107个/mL，得光孢青霉HA5-32孢子液。PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；无菌蔗糖水溶液的浓度为20g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min；
(2)10g猴头菇粉于经160℃、2h干热灭菌的250mL三角瓶中，加入50mL步骤(1)制备的光孢青霉HA5-32孢子液(以猴头菇粉质量计，体积用量为5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养54h，获得猴头菇发酵物；
(3)步骤(2)的全部猴头菇发酵物转入500mL烧杯中，加250mL的去离子水(料液比为1g:25mL)，搅拌均匀后，于34℃水浴中保温4h。之后，烧杯转入水温80℃的超声波清洗机中，180W超声提取75min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得猴头菇水提浓缩液；
(4)向步骤(3)获得的全部猴头菇水提浓缩液中，加入40mL的无水乙醇(4倍浓缩液的体积，体系的乙醇体积分数为80％)，2℃条件下静置18h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀加入20mL的无水乙醇(以猴头菇粉质量计，体积用量为2mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，得猴头菇多糖提取物。
实施例5光孢青霉HA5-32应用于猴头菇多糖的提取
光孢青霉HA5-32应用于猴头菇中多糖的提取，按以下步骤操作：
(1)4℃保存的光孢青霉HA5-32的PDA平板菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃恒温培养72h。加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为1.85×107个/mL，得光孢青霉HA5-32孢子液。PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；无菌蔗糖水溶液的浓度为25g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min；
(2)10g猴头菇粉于经160℃、2h干热灭菌的250mL三角瓶中，加入40mL步骤(1)制备的光孢青霉HA5-32孢子液(以猴头菇粉质量计，体积用量为4mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于32℃条件下培养48h，获得猴头菇发酵物；
(3)步骤(2)的全部猴头菇发酵物转入500mL烧杯中，加200mL的去离子水(料液比为1g:20mL)，搅拌均匀后，于32℃水浴中保温5h。之后，烧杯转入水温75℃的超声波清洗机中，160W超声提取90min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/20)，获得猴头菇水提浓缩液；
(4)向步骤(3)获得的全部猴头菇水提浓缩液中，加入40mL的无水乙醇(4倍浓缩液的体积，体系的乙醇体积分数为80％)，0℃条件下静置16h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀加入15mL的无水乙醇(以猴头菇粉质量计，体积用量为1.5mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，得猴头菇多糖提取物。
实施例6光孢青霉HA5-32应用于猴头菇多糖的提取
光孢青霉HA5-32应用于猴头菇中多糖的提取，按以下步骤操作：
(1)4℃保存的光孢青霉HA5-32的PDA平板菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于30℃恒温培养60h。加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为1.43×107个/mL，得光孢青霉HA5-32孢子液。PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；无菌蔗糖水溶液的浓度为15g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min；
(2)10g猴头菇粉于经160℃、2h干热灭菌的250mL三角瓶中，加入60mL步骤(1)制备的光孢青霉HA5-32孢子液(以猴头菇粉质量计，体积用量为6mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养60h，获得猴头菇发酵物；
(3)步骤(2)的全部猴头菇发酵物转入500mL烧杯中，加300mL的去离子水(料液比为1g:30mL)，搅拌均匀后，于36℃水浴中保温3h。之后，烧杯转入水温85℃的超声波清洗机中，200W超声提取60min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至12mL(原滤液体积的1/25)，获得猴头菇水提浓缩液；
(4)向步骤(3)获得的全部猴头菇水提浓缩液中，加入48mL的无水乙醇(4倍浓缩液的体积，体系的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置20h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀加入20mL的无水乙醇(以猴头菇粉质量计，体积用量为2mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，得猴头菇多糖提取物。
对比例1
与实施例4的主要区别在于：水提醇沉前不进行光孢青霉HA5-32发酵预处理，按以下步骤操作：
(1)10g猴头菇粉于500mL烧杯中，加250mL的去离子水(料液比为1g:25mL)，搅拌均匀后，于34℃水浴中保温4h。之后，烧杯转入水温80℃的超声波清洗机中，180W超声提取75min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得猴头菇水提浓缩液；
(2)向步骤(1)获得的全部猴头菇水提浓缩液中，加入40mL的无水乙醇(4倍浓缩液的体积，体系的乙醇体积分数为80％)，2℃条件下静置18h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀加入20mL的无水乙醇(以猴头菇粉质量计，体积用量为2mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，得猴头菇多糖提取物。
对比例2
与实施例4的主要区别在于：步骤(2)中发酵温度为25℃。其他步骤与实施例4相同，步骤(2)按以下方法操作：
10g猴头菇粉于经160℃、2h干热灭菌的250mL三角瓶中，加入50mL步骤(1)制备的光孢青霉HA5-32孢子液(以猴头菇粉质量计，体积用量为5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于25℃条件下培养54h，获得猴头菇发酵物。
对比例3
与实施例4的主要区别在于：步骤(2)中发酵温度为35℃。其他步骤与实施例4相同，步骤(2)按以下步方法操作：
10g猴头菇粉于经160℃、2h干热灭菌的250mL三角瓶中，加入50mL步骤(1)制备的光孢青霉HA5-32孢子液(以猴头菇粉质量计，体积用量为5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于35℃条件下培养54h，获得猴头菇发酵物。
对比例4
与实施例4的主要区别在于：步骤(2)中发酵时间为42h。其他步骤与实施例4相同，步骤(2)按以下步骤操作：10g猴头菇粉于经160℃、2h干热灭菌的250mL三角瓶中，加入50mL步骤(1)制备的光孢青霉HA5-32孢子液(以猴头菇粉质量计，体积用量为5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养42h，获得猴头菇发酵物。
对比例5
与实施例4的主要区别在于：步骤(2)中发酵时间为66h。其他步骤与实施例4相同，步骤(2)按以下步骤操作：10g猴头菇粉于经160℃、2h干热灭菌的250mL三角瓶中，加入50mL步骤(1)制备的光孢青霉HA5-32孢子液(以猴头菇粉质量计，体积用量为5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养66h，获得猴头菇发酵物。
对比例6
与实施例4的主要区别在于：步骤(3)中保温温度为28℃。其他步骤与实施例4相同，步骤(3)按以下步骤操作：
步骤(2)的全部猴头菇发酵物转入500mL烧杯中，加250mL的去离子水(料液比为1g:25mL)，搅拌均匀后，于28℃水浴中保温4h。之后，烧杯转入水温80℃的超声波清洗机中，180W超声提取75min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得猴头菇水提浓缩液。
对比例7
与实施例4的主要区别在于：步骤(3)中保温温度为40℃。其他步骤与实施例4相同，步骤(3)按以下步骤操作：
步骤(2)的全部猴头菇发酵物转入500mL烧杯中，加250mL的去离子水(料液比为1g:25mL)，搅拌均匀后，于40℃水浴中保温4h。之后，烧杯转入水温80℃的超声波清洗机中，180W超声提取75min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得猴头菇水提浓缩液。
对比例8
与实施例4的主要区别在于：步骤(3)中保温时间为2h。其他步骤与实施例4相同，步骤(3)按以下步骤操作：
步骤(2)的全部猴头菇发酵物转入500mL烧杯中，加250mL的去离子水(料液比为1g:25mL)，搅拌均匀后，于34℃水浴中保温2h。之后，烧杯转入水温80℃的超声波清洗机中，180W超声提取75min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得猴头菇水提浓缩液。
对比例9
与实施例4的主要区别在于：步骤(3)中保温时间为6h。其他步骤与实施例4相同，步骤(3)按以下步骤操作：
步步骤(2)的全部猴头菇发酵物转入500mL烧杯中，加250mL的去离子水(料液比为1g:25mL)，搅拌均匀后，于34℃水浴中保温6h。之后，烧杯转入水温80℃的超声波清洗机中，180W超声提取75min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得猴头菇水提浓缩液。
发酵结果评价
实施例4～6及对比例1～9从10g猴头菇中提取获得的多糖提取物质量、猴头菇多糖质量、猴头菇多糖百分含量及猴头菇多糖提取得率见表3。其中，猴头菇多糖百分含量为猴头菇多糖质量在获得的多糖提取物质量中的百分占比。
表3实施例4～6及对比例1～9提取猴头菇多糖的得率
由表3数据可知：
①由对比例1与实施例4相比，在常规水提醇沉前进行光孢青霉HA5-32发酵预处理，多糖提取得率大大提高，说明在水提醇沉前进行光孢青霉HA5-32发酵预处理对提高多糖提取得率的优异效果。分析其原因，光孢青霉HA5-32可以产生多种水解酶，水解猴头菇的细胞壁，最终使多糖提取得率得以显著提高。进行了光孢青霉HA5-32发酵预处理的实施例4提取得率为12.8％，相较于不作处理的对比例1提高了48.7％。
②由对比例2～5及实施例4对比分析可知，对比例2～5的发酵温度或时间与实施例不同，其多糖提取得率降低，说明在将光孢青霉HA5-32应用于猴头菇的多糖提取中时，猴头菇粉中添加光孢青霉HA5-32孢子液后，在28～32℃下发酵48～60h，对于提高猴头菇的多糖提取有较好的效果。分析其原因，猴头菇粉中添加光孢青霉HA5-32孢子液后，在28～32℃下发酵48～60h，可以使光孢青霉HA5-32生长刚好达到产酶适宜的程度，多糖提取效果较好。
③由对比例6～9及实施例4对比分析可知，对比例6～9水提的温度或时间与实施例4不同，其多糖提取得率降低，说明在将光孢青霉HA5-32应用于猴头菇的多糖提取中时，向猴头菇发酵物中加入去离子水后于32～36℃保温3～5h进行水提取，对于提高猴头菇的多糖提取有较好的效果。分析其原因可能为，向猴头菇发酵物中加入去离子水后于32～36℃保温3～5h进行水提取，可以达到恰好水解猴头菇细胞壁中的纤维素等物质、但又未分解可溶性多糖的程度，因此多糖提取效果较好。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一株光孢青霉HA5-32，其特征在于：保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 63392，保藏日期为2023年4月24日，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.如权利要求1所述的光孢青霉HA5-32，其特征在于：其核糖体DNA内转录间隔区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的光孢青霉HA5-32在猴头菇多糖提取中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用的方法包括以下步骤：
（1）在猴头菇粉中加入光孢青霉HA5-32孢子液，混匀后进行发酵，得到猴头菇发酵物；
（2）向猴头菇发酵物中加入去离子水，搅匀后进行保温处理、超声处理，经过滤、浓缩后，得到猴头菇水提浓缩液；
（3）向猴头菇水提浓缩液中加入乙醇，得到沉淀物，沉淀物经洗涤、干燥，得到猴头菇多糖。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：以猴头菇粉质量计，步骤（1）中，所述光孢青霉HA5-32孢子液的加入量为4～6 mL/g，所述光孢青霉HA5-32孢子液的浓度为1×107～2×107个/mL。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤（1）中，所述发酵的温度为28～32℃，所述发酵的时间为48～60 h。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：以猴头菇粉质量计，步骤（2）中，所述的去离子水的加入量为20～30 mL/g。
8. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，所述保温处理的温度为32～36℃，所述保温处理的时间为3～5 h。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，所述超声的温度为75～85℃、功率为160～200 W、时间为60～90 min。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，浓缩至原体积的1/25～1/20，浓缩的方式为减压浓缩。
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