CN106578348A - 一种溶菌酶饲料添加剂的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种溶菌酶饲料添加剂的制备方法及应用。该制备方法包括以下步骤：(1)在麦芽汁‑蚕蛹粉基础生长培养基/麦芽汁高温浸提液培养基中发酵含人溶菌酶胞内表达载体的毕赤酵母X‑33工程菌，甲醇诱导表达48h后，收集酵母菌体；其中，摇瓶发酵条件为：接种量3％，生长阶段pH6.0，诱导阶段甲醇添加量1％；所述的麦芽汁‑蚕蛹粉基础生长培养基/麦芽汁高温浸提液培养基中蚕蛹粉占比40％，营养盐含量170ug/mL；(2)以5％蔗糖溶液作为保护剂，工程菌菌泥和保护剂按1:3混匀，‑20℃冰箱冷冻过夜，‑55℃真空条件下进行冻干，制成干粉。本发明得到了成本大幅降低的培养基，适用于工业化大规模生产。

Description

一种溶菌酶饲料添加剂的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物饲料领域，涉及一种溶菌酶饲料添加剂的制备方法及应用。
背景技术
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶可分为三型：C型(鸡卵清溶菌酶chicken egg-white lysozyme，cly)、g型(鹅卵清溶菌酶gooseegg-white lysozyme，gly)、噬菌体溶菌酶。大部分溶菌酶都属于c型，从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶也属于c型。人溶菌酶(human lysozyme，hLY)属于c型溶菌酶，由130个氨基酸残基组成，相对分子质量14700。国内外有很多关于hLY基因克隆，表达的报道。Takaki报道用基因化学合成方法合成hLY的全基因(包括hLY前体信号肽的18个氨基酸残基)，并将它转至酵母菌中表达，获得高效表达的hLY。
酵母饲料是指利用酵母菌的新陈代谢和繁殖菌体，经过发酵和干燥等特殊工艺制成的含有活菌和酵母细胞代谢产物的安全、无污染、无残留的优质饲料。酵母饲料又称酵母蛋白粉属于饲料添加剂的一种产品。
目前在饲料中使用的溶菌酶主要为不同纯度的酶制剂，作为添加剂直接添加到饲料中。由于生产需时长、劳动量大、产量低、成本高，导致产品价格较高，难以在饲料行业得到普遍的推广与应用。另一方面，虽然溶菌酶在畜禽养殖业上应用可使用未经纯化的粗制品，但缺点是提取后的粗酶制剂不易保存，且酶活力低，添加量过大。因此，开发新的溶菌酶资源和适合饲料添加的新剂型，降低生产成本，才能促使溶菌酶在实践中的广泛应用。从目前国内生产溶菌酶的现状及饲料行业的规模，以重组hLYZ酵母作为饲料添加剂可以充分发挥溶菌酶的功效，避免质量、产量、价格、稳定性方面存在的问题，具备较好的产业化前景。实验室条件下甲醇诱导培养毕赤酵母用的培养基主要是BMGY/MMMY培养基，其成本较高，不适应与大规模工业化的生产。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种溶菌酶饲料添加剂的制备方法及应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种溶菌酶饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)工程菌发酵：在麦芽汁-蚕蛹粉基础生长培养基/麦芽汁高温浸提液培养基中发酵含人溶菌酶胞内表达载体的毕赤酵母X-33工程菌，甲醇诱导表达48h后，收集酵母菌体；其中，摇瓶发酵条件为：接种量3％，生长阶段pH6.0，诱导阶段甲醇添加量1％；所述的麦芽汁-蚕蛹粉基础生长培养基/麦芽汁高温浸提液培养基中蚕蛹粉占比40％，营养盐含量170ug/mL；
(2)发酵培养物处理：以5％蔗糖溶液作为保护剂，工程菌菌泥和保护剂按1:3混匀，-20℃冰箱冷冻过夜，-55℃真空条件下进行冷冻干燥，制成干粉。
其中，所述的含人溶菌酶胞内表达载体的毕赤酵母X-33工程菌是通过将人溶菌酶目的基因hLYZ连接至毕赤酵母胞内表达载体pPICZA上，再电转化至毕赤酵母X-33中得到的阳性转化子。
所述的制备方法还包括将所述的干粉制备成粉剂或颗粒剂。
按照所述的方法制备的溶菌酶饲料添加剂在制备饲料中的应用。
一种制备动物饲料，其特征在于包含按照所述的方法制备的溶菌酶饲料添加剂。
一种含溶菌酶饲料的制备方法，其特征在于包括按照本发明所述的制备方法制备溶菌酶饲料添加剂，以及将溶菌酶饲料添加剂添加到饲料中的步骤。
有益效果：
实验室培养毕赤酵母主要用BMGY/BMMY培养基，其生产成本较高，不适用于大规模生产，工厂化生产希望寻找廉价优质的培养基。有报道使用豆粕作为酵母培养基，但是其蛋白质含量较高，酵母转化率不高。本发明使用麦芽汁和蚕蛹粉作为碳氮源，发酵培养获得高密度菌体，且麦芽粉和蚕蛹粉成本较低，该优化得到的培养基价格较低，成本为2.033元/g，实验室所用的BMGY/BMMY培养基成本是49.77元/g，节约了27倍左右，适用于工业化大规模生产(表1)。
表1培养基成本
以麦芽汁和蚕蛹粉作为碳氮源，通过单因素实验和正交试验优化培养基成分和摇瓶发酵条件。单因素试验结果表明蚕蛹粉占比40％，营养盐含量170ug/mL时最合适菌体生长。正交实验结果R值的顺序为：生长阶段pH＞诱导阶段甲醇含量＞接种量，即最佳摇瓶发酵条件为生长阶段pH6.0，诱导阶段甲醇添加量1％，接种量3％。经摇瓶培养的酵母工程菌以5％蔗糖溶液为保护剂，菌泥和保护剂按比例1:3混匀，放入-20℃冰箱冷冻过夜，-55℃进行真空冷冻干燥，制成白色粉末，复水后测定菌体存活率达到88.1％，符合国际标准。溶菌酶活力为1320U，是冷冻前的76.7％。该酵母活性冻干粉可直接作为动物饲料添加剂使用。
附图说明
图1重组酵母胞内蛋白的western blot
M：14.4kD protein maker；1：野生型酵母X-33菌株胞内蛋白；2：转空载的酵母胞内蛋白；3.转pPICZA-hLYZ表达载体的酵母胞内蛋白。
图2比浊法测定的溶菌酶酶活
图3蚕蛹浸提物含量对活菌数的影响
图4酵母营养盐含量对活菌数的影响
图5接种量对活菌数的影响
图6诱导阶段甲醇添加量对活菌数的影响
图7生长阶段pH对活菌数的影响
图8酵母冻干粉成品
图9比浊法测定的溶菌酶活力
1：BMGY/BMMY培养基培养酵母测定的酶活；2：麦芽汁-蚕蛹粉基础培养基/麦芽汁高温浸提液培养基培养酵母测定的酶活；3：麦芽汁-蚕蛹粉基础培养基/麦芽汁高温浸提液培养基培养的酵母制成干粉测定的酶活。
具体实施方式
实施例1
本发明从人胎盘中提取人溶菌酶编码基因hLYZ，全长447bp(图1)。由于载体本身含有信号肽，目的基因所带的信号肽会对基因的分泌产生影响，故设计引物时除去目的基因本身的信号肽(1-54碱基)，获得成熟肽序列(55-447碱基)，基因大小为393bp。
将人溶菌酶目的基因hLYZ连接至毕赤酵母胞内表达载体pPICZA上，再电转化至毕赤酵母X-33中，将转化子挑出，以表达载体通用引物进行PCR验证，转空载的重组酵母扩增出大小约为287bp左右的条带，而转表达载体pPICZA-hLYZ的重组酵母扩增出大小约为680bp左右的条带，说明重组载体成功整合进酵母基因组中。
将筛选出的高拷贝转化子进行甲醇诱导表达72h后，收集菌体，进行玻璃珠破碎，提取胞内蛋白，然后进行western blot检测蛋白是否表达，结果如图1所示，野生型酵母菌株X-33和转空载的酵母菌株胞内蛋白中皆未检测到溶菌酶条带，而转重组载体的酵母菌株检测到溶菌酶的表达，说明重组酵母菌株成功表达了人溶菌酶。
活力单位定义：在25℃和pH6.2条件下,OD450每分钟下降0.001为1个酶活力单位(1U)。由此得酶活力计算公式为：
每升培养基的酶活力单位＝{OD450(零时)-OD450(60s时)]×1000}/培养基体积(L)
利用比浊法测定溶菌酶活力，结果如图2所示，重组酵母菌株胞内蛋白质酶活力为1920U，溶菌酶标准样品的酶活是2010U，说明该重组酵母菌株胞内表达了具有生物活性的人溶菌酶。
实施例2
实验室条件下用BMGY/BMMY培养基培养毕赤酵母工程菌，其成本较高，不适合工业化生产，故优化培养基成分，为酵母生长寻找廉价的培养基。而酵母生长经过两个阶段即生长阶段和诱导阶段，分别选定麦芽汁-蚕蛹粉基础生长培养基和麦芽汁高温浸提液培养基来培养酵母细胞，通过单因素实验确定麦芽汁-蚕蛹浸提物生长培养基的配比和营养盐含量。由图3-图4可知，蚕蛹浸提物占麦芽汁-蚕蛹粉基础生长培养基的40％，酵母营养盐含量为170ug/mL时菌体生长状况最好，活菌个数数量级达到109cfu/ml。
分别以接种量、诱导阶段甲醇添加量和生长时期pH为影响因子进行单因素实验，结果表明随着接种量的增加，活菌个数先增加后减少，当接种量为3％时，活菌数最多(图5)。酵母活菌个数随着诱导时期甲醇添加量的增加而减少，甲醇添加量1％活菌数最多(图6)。随着生长阶段pH的增加，酵母活菌数呈先增加后减少的趋势(图7)，当pH为6.0时酵母活菌数最多。
在单因素的基础上，以接种量、甲醇添加量、生长时期的pH为参试因子，采用L9(33)正交试验设计，以确定最佳的培养条件并进行验证。正交试验(表2)结果表明，各因素的最优组合为A2B1C2，即接种量3％，甲醇添加量1％，生长阶段pH6.0。R值的大小顺序是C>B>A，即生长阶段pH对酵母活菌数影响最大，其次是甲醇添加量，最后是接种量。以A2B1C2为组合，其他培养条件不变，经五次验证试验，测得平均活菌数为(8.35±0.14)×109cfu/ml，说明以A2B1C2为组合最合适该酵母工程菌的摇瓶培养，达到优化目的。
表2正交试验结果与分析
实施例3酵母冻干粉及酶活力
本发明为获得酵母工程菌的干粉，利用麦芽汁-蚕蛹粉基础生长培养基/麦芽汁高温浸提液培养基培养酵母工程菌，甲醇诱导表达48h后，收集酵母菌体，提取胞内蛋白测定溶菌酶活力为1720U，以5％蔗糖溶液作为保护剂，菌泥和保护剂按1:3混匀，-20℃冰箱冷冻过夜，-55℃真空条件下进行冷冻干燥，制成干粉产品(图8)，复水后测得菌体存活率为88.1％，比浊法测得溶菌酶活力为1320U(图9)，其酶活力是冷冻干燥前的76.7％。

Claims (6)

1.一种溶菌酶饲料添加剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)工程菌发酵：在麦芽汁-蚕蛹粉基础生长培养基/麦芽汁高温浸提液培养基中发酵含人溶菌酶胞内表达载体的毕赤酵母X-33工程菌，甲醇诱导表达48h后，收集酵母菌体；其中，摇瓶发酵条件为：接种量3％，生长阶段pH6.0，诱导阶段甲醇添加量1％；所述的麦芽汁-蚕蛹粉基础生长培养基/麦芽汁高温浸提液培养基中蚕蛹粉占比40％，营养盐含量170ug/mL；
(2)发酵培养物处理：以5％蔗糖溶液作为保护剂，工程菌菌泥和保护剂按1:3混匀，-20℃冰箱冷冻过夜，-55℃真空条件下进行冷冻干燥，制成干粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的含人溶菌酶胞内表达载体的毕赤酵母X-33工程菌是通过将人溶菌酶目的基因hLYZ连接至毕赤酵母胞内表达载体pPICZA上，再电转化至毕赤酵母X-33中得到的阳性转化子。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的制备方法还包括将所述的干粉制备成粉剂或颗粒剂。
4.按照权利要求1所述的方法制备的溶菌酶饲料添加剂在制备饲料中的应用。
5.一种制备动物饲料，其特征在于包含按照权利要求1所述的方法制备的溶菌酶饲料添加剂。
6.一种含溶菌酶饲料的制备方法，其特征在于包括按照权利要求1所述的制备方法制备溶菌酶饲料添加剂，以及将溶菌酶饲料添加剂添加到饲料中的步骤。
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