CN103750011A - 一种含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发公开了一种含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，属于饲料酶制剂领域。所述含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，其特征在于，所述乳仔猪专用复合酶由以下重量份数的组分组成：中草药粉1-3份，木聚糖酶15-20份，纤维素酶5-10份，β-葡聚糖酶及其培养物10-20份，甘露聚糖酶3-5，蛋白酶2-10，中温α-淀粉酶2-5份。其中纤维素酶的生产菌种为里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，保藏编号为CCTCC M 2013540，制备方法如下：斜面菌株培养获得液体种子；发酵阶段采用低温、逐级接种相结合的方法；发酵液经离心，收集、浓缩、过滤、干燥获得纤维素酶。本产品中添加的纤维素酶、β-葡聚糖酶及其培养物含有益生菌和酶制剂，可有效提高饲料消化吸收效率且提高动物肠道健康。

Description

一种含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶及其制备方法

技术领域

本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种复合酶及其制备方法。 

背景技术

为了克服乳猪在断奶后所出现的种种问题，多数企业从断奶前补饲、诱食、日粮酸化、使用适口性好且易消化吸收的饲料原料、添加外源酶、降低日粮的抗原性、降低日粮的粗蛋白含量以及使用促进剂等多个方面进行了改善和优化，但实际效果参差不齐。 

考虑到仔猪在断奶时，其自身的蛋白酶、淀粉酶等酶活应激而大幅下降到断奶时的三分之一，而这些酶类对于仔猪获取营养和能量起着至关重要的作用。同时，饲料用酶在畜禽生产中具有不俗的效果，比如前苏联科学家在早期断奶仔猪日粮中添加淀粉糊精酶，使得日增重提高14.6%，碳水化合物消化率提高77.2%。 

添加酶制剂能补充蛋白酶和淀粉酶，是辅助分解日粮中的蛋白和淀粉，降解日粮中的抗营养因子，并能有效分解玉米/豆粕型日粮中的植物细胞壁，使细胞内的营养物质如淀粉、蛋白质等释放出来。同时分解可溶性纤维，降低植物纤维物质的吸水能力和肠道内容物的粘度。另外，大量的生产时间和科学实验也证明了中草药具有很多营养成分和生物活性物质，兼有药性和营养性的双重作用，既可以防病又可以提高生产性能。因此，我们经过多次饲喂实验，研制出了一种乳仔猪专用复合酶，其能有效地提高饲料的利用率、降低腹泻率、促进动物生长，针对性强，效果好，经济效益显著。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶活力高、抗腹泻效果显著的含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶及其制备方法。 

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 

一种含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，其特征在于，所述乳仔猪专用复合酶由以下重量份数的组分组成：中草药粉1-3份，木聚糖酶15-20份，纤维素酶5-10份，β-葡聚糖酶及其培养物10-20份，甘露聚糖酶3-5，蛋白酶2-10，中温α-淀粉酶2-5份。 

所述木聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白酶和中温α-淀粉酶均为湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司或市售产品； 

所述中草药为党参、麦冬和当归的混合物，党参、麦冬和当归的质量比为1:2:1-2。 

所述纤维素酶制备方法如下： 

所述纤维素酶的生产菌种为里氏木霉(Trichodema reesei)601-17，该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072），保藏编号为CCTCC NO：M2013540，分类命名为里氏木霉601-17Trichodema reesei601-17。里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-600orpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤、干燥获得纤维素酶。 

所述β-葡聚糖酶及其培养物制备方法如下： 

（1）种子培养 

将地衣芽孢杆菌斜面菌种经三级摇瓶发酵剂一级种子罐发酵； 

所述种子培养的培养基为：酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，海藻糖1-3%，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1-3g，不足部分纯净水补足，pH4.5-7.0，121-123℃灭菌30-40min。 

（2）发酵罐发酵 

将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45℃，搅拌速度200-300r/min，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养15-20h；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养10-15h； 

所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值4.5-7.0，121℃灭菌20min； 

所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值3-7，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH3-7，121-123℃灭菌30-40min备用。 

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30%； 

PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在3-7； 

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml； 

放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。 

（3）发酵液经离心分离、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶，离心所获得地衣芽孢杆菌菌体经清洗后冷冻干燥获得地衣芽孢杆菌菌体，将β-葡聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌体混合获得β-葡聚糖酶及其培养物。 

所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10-25。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072），保藏号为CCTCC NO：M2013538，分类命名为地衣芽孢杆菌β-10-25Βacillus licheniformisβ-10-25。 

该菌株由一株本公司实验室保藏的产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌经原始出发菌种地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10→试管活化→紫外线（UV）-氯化锂（LiCl）-硫酸二乙酯（DES）复合诱变→平板初筛(高产)→摇瓶复筛(高产)→热稳定性测定→传代稳定性试验等步骤筛选获得，特点如下： 

所述菌株在固体平板上菌落为白色，边缘不整齐，表面干燥不透明，镜检为革兰氏阳性细菌，细胞形态呈短杆状，芽孢中生，椭圆形，不膨大。 

所述菌株生理生化特征：V-P试验（+），淀粉水解（+），酪素水解（+），明胶水解（+），硝酸盐还原（+），吲哚试验（-），利用柠檬酸盐（+），硝酸还原（+），甘露醇（+），木糖（+）。 

优选的，一种乳仔猪专用复合酶按如下重量份数组成：中草药粉2份，木聚糖酶18份，纤维素酶8份，β-葡聚糖酶及其培养物15份，甘露聚糖酶4，蛋白酶8，中温α-淀粉酶4份。中草药粉的组成为党参、麦冬和当归的质量比为1:2:1。 

所述乳仔猪专用复合酶适用于饲料加工厂和养殖场自配饲料，使用时应与饲料中的其它原料混合均匀，可事先将本发明与少量饲料混合均匀，再混合到大批饲料中，直接饲喂。建议每吨全价料添加量为80-150g。 

有益效果： 

本发明根据乳仔猪消化生理特点，并经过动物实验筛选复合配方，设置复合酶酶谱，有效补充乳仔猪消化道内源酶的不足，有效提高乳仔猪对饲料的消化利用率，防止营养性腹泻的产生。针对玉米、豆粕等植物性饲料原料抗营养因子的特点，合理添加非淀粉多糖类酶制剂，高效降解饲料中的抗营养因子。并且本发明所使用纤维素酶活力高、作用条件宽泛、热稳定性强、适于工业化生产。采用专为饲用酶开发的微生物菌株生产的酶制剂，动物适应性好，生物学效价高，在动物体温（37-40℃）和消化道较宽的pH范围内发挥较高活性的作用。本发明中添加了中草药粉剂，其具有天然抗菌和增强免疫力的作用，可以有效的提乳仔猪的抗应激能力、免疫功能以及抗病防御机能。另外，中草药粉剂中添加了具有抗热应激原作用的 黄芩、柴胡，使得本发明产品具有更好的稳定性和保存活性，较没有添加中草药粉剂的产品在长时间高温条件下的保存活性提高了11%。产品中添加的纤维素酶、β-葡聚糖酶及其培养物含有益生菌和酶制剂可有效提高饲料消化吸收效率且提高动物肠道健康。 

具体实施方式

所述纤维素酶的生产菌种为里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，该菌株于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013540，分类命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)，保藏地址：武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编430072。 

所述菌株产纤维素酶的最适pH3.0-6.0；最适温度为23～35℃。 

所述菌株生理生化特征： 

该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.1-0.75mm，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48h菌落直径达1.0-8.5mm,72h达30-50mm；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2-5ūm。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。分生孢子梗呈瓶状，直立，无色，孢子呈球形，绿色，直径20-100ūm。 

该菌株可在麦麸上生长，主要代谢产物为纤维素酶（内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖苷酶）。根据《An Introduction industrial mycology》（George Smith1954）、《真菌鉴定手册》（魏景超1982）、《常见与常用真菌》（中科院微生物研究所1973)，鉴定该菌株为：里氏木霉。 

利用里氏木霉菌株，通过紫外诱变、培养、发酵生产纤维素酶的方法如下。 

菌种初筛：原始菌株里氏木霉HYX01采自津市市保河堤食用菌培植基地中的土样筛选分离出。里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；适当稀释将孢子浓度调节为10³个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。（所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下：纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。 

复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％（v/v），30℃、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。（所述复筛培养基组成如下：纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。 

复筛选出菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M2013540。 

培养特征：该菌株产纤维素酶的最适pH3.0-6.0；最适温度为23～35℃。 

遗传稳定性试验：将该菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。 

放大试验 

种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。 

种子罐培养：将种子液以10%（v/v）接种量接入装有7.5L发酵培养基的10L发酵罐中，控制pH值恒定为5.0±0.2，培养温度27±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量（v/v）1:0.8-1.2,培养时间104h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基制备方法为：纤维素粉10%、硫酸铵0.5%、硫酸镁0.025%、磷酸二氢钾0.1%、氯化钠0.01%、其余为水，pH值5-6，121℃灭菌20min。 

发酵结束后，取发酵上清液（粗酶液）进行酶活力检测，经测定，外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。 

例1：一种乳仔猪专用复合酶按如下重量份数组成：中草药粉2份，木聚糖酶18份，纤维素酶8份，β-葡聚糖酶及其培养物15份，甘露聚糖酶4，蛋白酶8，中温α-淀粉酶4份。所述中草药为党参、麦冬和当归的混合物，党参、麦冬和当归的质量比为1:2:1。 

例2：所述乳仔猪专用复合酶由以下重量份数的组分组成：中草药粉3份，木聚糖酶20份，纤维素酶10份，β-葡聚糖酶及其培养物10份，甘露聚糖酶3，蛋白酶8，中温α-淀粉酶3份；所述中草药为党参、麦冬和当归的混合物，党参、麦冬和当归的质量比为1:2:2。 

例3一种含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，中草药粉3份，木聚糖酶20份，纤维素酶5份，β-葡聚糖酶及其培养物20份，甘露聚糖酶5，蛋白酶10，中温α-淀粉酶5份。 

所述中草药为党参、麦冬和当归的混合物，党参、麦冬和当归的质量比为1:2:2。 

例4中草药粉1份，木聚糖酶15份，纤维素酶10份，β-葡聚糖酶及其培养物15份，甘露聚糖酶5，蛋白酶2，中温α-淀粉酶2份。 

所述中草药为党参、麦冬和当归的混合物，党参、麦冬和当归的质量比为1:2:1。 

实施例5效果对比实验 

选取120头断奶仔猪，按体重、血统及性别无差异分为实验组和对照组，每组3个重复，每个重复20头猪。实验期为28天，实验期间所饲喂的日粮组成见下表：实验组和对照组每 吨饲料均添加复合酶制剂120g，实验组所用复合酶制剂为实施例2所述复合酶制剂，对照组所用复合酶制剂为市售同类产品。本发明产品，相对对照组，实验组日增重达到432g，比对照组提高了27g，料重比显著增加为1.77，对照组为1.85；腹泻率也极大减少，实验组为8次，对照组为10次，五分制皮肤和毛色评分（5分为最高），实验组达到4.0分，而对照组为3.0分，以上数据结果表明本发明饲料产品具有良好饲喂价值。可以有效提高饲喂效果和效益。 

实施例6中草药粉剂对酶保存活性的影响 

以实施例2中所述的制备方法获得的乳仔猪专用复合酶为样品1，以去除实施例2中所有的中草药粉剂的制备方法获得的小麦日粮酶为样品2，比较两种样品的保存活性。在45℃下保存上述样品18h，之后测定酶活，结果表明：样品1的残余酶活在76%以上，样品2的残余酶活保持在60%左右。 

Claims (8)

1.一种含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，由以下重量份数的组分组成：中草药粉1-3份，木聚糖酶15-20份，纤维素酶5-10份，β-葡聚糖酶及其培养物10-20份，甘露聚糖酶3-5，蛋白酶2-10，中温α-淀粉酶2-5份。

2.根据权利要求1所述含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，所述中草药为党参、麦冬和当归的混合物，党参、麦冬和当归的质量比为1:2:1-2。

3.根据权利要求1所述含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，所述纤维素酶制备方法如下：

生产菌种为里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M2013540，里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-600orpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤、干燥获得纤维素酶。

4.根据权利要求1所述含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，按如下重量份数组成：中草药粉2份，木聚糖酶18份，纤维素酶8份，β-葡聚糖酶及其培养物15份，甘露聚糖酶4，蛋白酶8，中温α-淀粉酶4份。

5.根据权利要求1所述含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，按如下重量份数组成：中草药粉2份，木聚糖酶18份，纤维素酶8份，β-葡聚糖酶及其培养物15份，甘露聚糖酶4，蛋白酶8，中温α-淀粉酶4份。

6.根据权利要求1所述含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶，由以下重量份数的组分组成：中草药粉3份，木聚糖酶20份，纤维素酶10份，β-葡聚糖酶及其培养物10份，甘露聚糖酶3，蛋白酶8，中温α-淀粉酶3份。

7.根据权利要求1-6所述含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶的制备方法，由以下组分混合组成：中草药粉，木聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶及其培养物，甘露聚糖酶，蛋白酶，中温α-淀粉酶；所述纤维素酶制备方法如下：生产菌种为里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M2013540，里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-600orpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤、干燥获得纤维素酶。

8.根据权利要求7所述含有纤维素酶的乳仔猪专用复合酶的制备方法，所述β-葡聚糖酶及其培养物制备方法如下：发酵液经离心分离、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶，离心所获得地衣芽孢杆菌菌体经清洗后冷冻干燥获得地衣芽孢杆菌菌体，将β-葡聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌体混合获得β-葡聚糖酶及其培养物；地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10-25保藏号为CCTCC NO：M2013538。