CN105661008A - 苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，所述用于苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法包括以下步骤：1、粪肠球菌R-F菌液中的制备，包括菌种的活化、摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐培养。2、具体发酵步骤：将苹果渣、棉粕、麸皮混合，配以蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、轻质碳酸钙、糖蜜和粪肠球菌R-F菌液，加水调整物料含水量在30-45%，置于单向阀发酵袋中，在15-30℃发酵室中，发酵5-15天即可。本发明所提供的方法发酵后，饲料中活菌数达20亿/g，粗蛋白≥15%，小肽≥10%，果胶≤5%，单宁≤0.02%，游离棉酚含量≤25mg/kg。
Description
技术领域
本发明涉及生物饲料发酵领域，具体涉及一种粪肠球菌菌液制备及其发酵苹果渣和棉粕生产蛋白饲料的方法。
背景技术
我国是世界水果生产大国，总产量位居世界首位。1998年生产量达5452.9万吨，其中苹果1948.1万吨，位居世界第一位，加工能力只有5%左右。我国山东、河北、山西、陕西等省为苹果渣的主产区。2006年，我国苹果种植面积190万公顷，产量2600万吨，产世界产量的35%以上。
水果产业的迅速发展，加工产品种类繁多，加工能力不断提高，与此同时，苹果渣的排出量也日趋增加。据统计，2007年底，山西省苹果贮藏能力约为186万吨，大型浓缩苹果汁加工企业达12家，年加工能力22.6万吨。但是苹果渣的加工利用，并未收到重视，不仅对环境造成污染，而且还造成资源的浪费。苹果渣是高含水量物质，含有部分可溶性糖、维生素、矿物质及纤维素，具有丰富的营养物质，而大部分果品加工厂将果渣作为废弃物处理，造成资源的极大浪费，也严重影响环境。苹果渣中含有单宁、果胶等抗营养因子，限制了苹果渣的使用。
我国是产棉大国，棉籽饼粕产量大，每年产量约300万吨，是丰富的蛋白质来源。脱壳程度较高的棉粕粗蛋白可达到50%以上，普通棉花的棉籽含有带毒性的棉酚及其衍生物，俗称棉毒素，对单胃动物有害，而传统脱毒方法效率低，成本高，严重影响了棉粕在单胃动物饲料中的应用。
发明内容
本发明的目的在于经微生物的发酵，降解苹果渣和棉粕中的抗营养因子，同时提高饲料中蛋白质和小肽含量，生产一种蛋白饲料。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，包括以下步骤：
、粪肠球菌R-F菌液中的制备
（1）、菌种的活化：将斜面保存的粪肠球菌R-F在活化培养基上活化3次，挑取MRS平板上透明圈较大的单菌落，接入深层MRS液体试管，30-35℃培养12-16h后，以1%接种量接入MRS液体培养基，培养18-24h作为种子液；
（2）、摇瓶种子培养：
一级摇瓶种子培养：将活化好的粪肠球菌R-F按照5-10%的接种量接入一级摇瓶培养基中，30-35℃静置培养12-16h，作为一级摇瓶种子液；
二级摇瓶种子培养：将一级摇瓶种子液按照5-10%的接种量接入到二级摇瓶培养基中，在30-35℃培养箱中静置培养16-20h，作为二级摇瓶种子液；
（3）、种子罐培养：
一级种子罐培养：按照2-5%接种量将二级摇瓶种子液接到一级种子罐培养基中，培养温度30-35℃，罐压0.03-0.05MPa，搅拌100-200转/分条件下培养12-18h，待总菌数达到1-3×109CFU/ml以上时，转入二级种子罐培养基中培养；
二级种子罐培养：按照5-8%接种量将一级种子罐种子液接到二级种子罐培养基中，培养温度30-35℃，罐压0.03-0.05MPa，搅拌100-200转/分条件下培养14-20h，待总菌数达到4-7×109CFU/ml以上时，转入发酵罐进行培养；
（4）、发酵罐培养：
按照5-10%的接种量将二级种子罐种子液转入发酵罐的发酵基础培养基，在温度30-35℃，搅拌100-120转/分钟，罐压0.03-0.05MPa条件下进行发酵，发酵过程中，调节pH在6.0-6.5，培养时间为22-24小时；
其中，粪肠球菌R-F菌液制备步骤（1）中，活化培养基的成分包括：蛋白胨5-15g/L，牛肉膏5-15g/L,酵母浸粉3-10g/L，葡萄糖10-25g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。
粪肠球菌R-F菌液制备步骤（2）中，一级摇瓶培养基的成分包括：蛋白胨5-15g/L，牛肉膏5-15g/L，酵母浸粉3-10g/L，葡萄糖10-25g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。二级摇瓶培养基的成分包括：豆饼粉15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖15-25g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。
粪肠球菌R-F菌液制备步骤（3）中，一级种子罐培养基的成分包括：豆饼粉25-35g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖15-25g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。二级种子罐培养基的成分包括：豆饼粉25-35g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖15-25g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。
粪肠球菌R-F菌液制备步骤（4）中，发酵基础培养基成分包括：豆饼粉25-35g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖15-25g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。并且，发酵至发酵基础培养基残糖含量在0.8%以下时，用发酵培养基补充培养基补糖，补糖后培养液中残糖控制在1-2%。发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液：所述葡萄糖溶液中葡萄糖含量为发酵液总量的2-4%
、具体发酵步骤：
将苹果渣、棉粕、麸皮混合，配以蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、轻质碳酸钙、糖蜜和粪肠球菌R-F菌液，加水调整物料含水量在30-45%，置于发酵容器中，在15-30℃发酵室中，发酵5-15天，饲料中活菌数达20亿/g以上，粗蛋白≥15%，小肽≥10%，果胶≤5%，单宁≤0.02%，游离棉酚含量≤25mg/kg。经微生物发酵后，单宁和果胶等抗营养因子降解率分别达到99.0%和66.1%，粗蛋白和小肽分别达到13-15%和8-10%，游离棉酚含量降低80%以上。通过发酵改善了苹果渣和棉粕的适口性，抗营养因子显著降低，最大限度提高苹果渣和棉粕的饲用价值。
优选的，步骤中，将苹果渣20-80份、棉粕1-40份、麸皮1-30份、轻质碳酸钙0.5-5份的比例混合后构成混合物，其中，苹果渣、棉粕、麸皮和轻质碳酸钙的总份数为100；再以混合物重量为计，加入纤维素酶0.05-0.07%、蛋白酶0.03-0.05%、果胶酶0.02-0.07%、糖蜜0.02-0.3%、粪肠球菌R-F菌液8-20%。
其中，所述活性酶为：
a、蛋白酶，酶活力≥105U/g，添加量为300~500g/t。
b、纤维素酶，酶活力≥105U/g，添加量500~700g/t。
c、果胶酶，酶活力≥30000U/g，添加量200~700g/t。
本发明采用采用单向阀发酵袋进行发酵，有效杜绝了发酵过程中杂菌的污染，粪肠球菌发酵过程中，利用含碳水化合物丰富的苹果渣和蛋白质丰富的棉粕，通过发酵降低了苹果渣中的单宁、果胶及棉粕中的棉酚等抗营养因子，同时粪肠球菌利用苹果渣、棉粕、麸皮、糖蜜进行增殖，有益菌的含量增加。同时，果渣与棉粕发酵后，乳酸含量增加，具有质地柔软、保存时间长、成本低廉，可以有效提高其利用率。
采用本发明生产的苹果渣发酵饲料，可使畜禽饲料转化率提高8-15%，粗蛋白提高3~5%，小肽提高50~80%，发酵饲料中所含的粪肠球菌，可有效调节畜禽肠道微生态平衡，预防动物腹泻、提高日增重，在畜禽全价料中添加量可达5-10%。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
实施例1
一种苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，包括以下步骤：
、粪肠球菌R-F菌液制备
（1）、菌种的活化：为提高菌种的活力，在接摇瓶前，需要对菌种进行活化。将斜面保存的粪肠球菌R-F用生理盐水稀释后，涂布于MRS固体（活化培养基）平板上，35℃培养24h，挑取透明圈较大的单菌落，进行平板分离划线，35℃培养24h，再挑取透明圈较大单菌落于MRS固体平板上，35℃培养24h，最后，挑取透明圈较大菌落接入深层MRS液体试管，35℃静止培养12h，按照1%接种量接入MRS液体培养基中，培养18h作为种子液。其中，粪肠球菌R-F活化培养基配方为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸镁0.25/L，一水硫酸锰0.2g/L，pH6.0-6.5。
（2）、摇瓶种子培养：
一级摇瓶种子培养：按照5%的接种量，将活化好的粪肠球菌R-F接入一级摇瓶培养基中，250ml三角瓶装液量100ml，在35℃静止培养12h。一级摇瓶培养基配方为：蛋白胨12g/L，牛肉膏8g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，一水硫酸锰0.25g/L，pH6.0-6.5。
二级摇瓶种子培养：按照8%的接种量，将一级摇瓶种子液接入到二级摇瓶培养基中，500ml三角瓶装液量250ml，在33℃培养箱中静置培养16h。二级摇瓶种子培养基配方为：豆饼粉15g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖15g/L，碳酸钙0.5g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，一水硫酸锰0.25/L，pH6.0-6.5，摇瓶结束后作为一级发酵罐种子液。
（3）、种子罐培养：
一级种子罐种子培养：按照3%的接种量将二级摇瓶的种子液接入一级种子罐中，一级种子罐装液系数为50%，培养温度35℃，转速120转/分的，罐压0.03Mpa，在此条件下培养12h，待总菌数达到1.5×109CFU/ml以上时，转入二级种子罐培养。其中，一级种子罐培养基配方为：豆饼粉25g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖15g/L，碳酸钙1.0g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，一水硫酸锰0.25/L，pH6.0-6.5。
二级种子罐种子培养：按照5%的接种量将一级种子罐中的菌种接入二级种子罐中，二级种子罐装液系数为55%，培养温度为35℃，转速130转/分，罐压0.05Mpa，在此条件下培养16h，待总菌数达到5.0×109CFU/ml以上时，转入发酵罐进行培养。二级种子罐种子培养基配方为：豆饼粉25g/L，蛋白胨8g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，碳酸钙0.5g/L，柠檬酸铵3g/L，乙酸钠4g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁0.4g/L，一水硫酸锰0.25g/L，pH6.0-6.5。
（4）、发酵罐培养：
发酵罐高密度培养：按照10%接种量将二级种子罐菌液接入发酵罐中，发酵罐装液系数为60%，培养温度为35℃，转速120转/分，罐压0.05Mpa，在此条件下培养约3小时，发酵液残糖降到0.8%以下时，每小时补糖一次，补糖后，培养液残糖控制在2%以下，随着发酵的进行，粪肠球菌产酸，发酵液pH下降，当发酵液pH低于6.0时，自动流加2mol/L的NaOH，补充碱液调节pH到6.0-6.5，培养时间为22-24小时。发酵基础培养基配方为：豆饼粉30g/L，蛋白胨8g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，碳酸钙1.0g/L，柠檬酸铵3g/L，乙酸钠4g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁0.4g/L，一水硫酸锰0.25g/L。发酵培养基补料配方为：葡萄糖液总体积为发酵罐的4%，葡萄糖浓度为50%，使用前与发酵罐培养基按照同条件灭菌。
粪肠球菌R-F经过活化、摇瓶、种子罐到发酵罐进行培养，发酵过程中配合补料和调控pH，最终粪肠球菌R-F菌体浓度可达1.0×1010CFU/ml以上。
、苹果渣发酵工艺步骤：
（1）、粉碎：用粉碎机将干果渣、棉粕、麸皮粉碎成0.8mm的颗粒。
（2）将干苹果渣60份与棉粕30份，麸皮9份，轻质碳酸钙1份的比例混合，再将纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、糖蜜、粪肠球菌R-F菌液按照0.05%、0.05%、0.05%、0.05%、10%（占干物质重量比例）加入到水中，调节加水量使料水比为1:0.5，最后将水喷洒在物料上，均匀搅拌，最终物料水分含量为40%左右。其中，纤维素酶、蛋白酶、果胶酶酶活分别为10万U/g、10万U/g、3万U/g。
（3）、将搅拌好的物料加入到带有单向阀发酵袋中，然后在15℃的发酵室中发酵5-15天，72h取样一次，检测活菌数、粗蛋白、小肽及棉酚含量，以后每隔48h取样一次检测上述指标，待活菌数达20亿/g，粗蛋白≥13%，小肽≥8%，果胶≤5%，单宁≤0.02%，棉酚含量≤25mg/kg时，产品即为合格。
实施例2
一种苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，包括以下步骤：
、粪肠球菌R-F菌液制备
（1）、菌种的活化：为提高菌种的活力，在接摇瓶前，需要对菌种进行活化。将斜面保存的粪肠球菌R-F用生理盐水稀释后，涂布于MRS固体平板上，33℃培养24h，挑取透明圈较大的单菌落，进行平板分离划线，30℃培养24h，再挑取透明圈较大单菌落于MRS固体平板上，33℃培养24h，最后挑取透明圈较大菌落接入深层MRS液体试管，33℃静止培养14h，按照1%接种量接入MRS液体培养基中，培养20h作为种子液。其中，粪肠球菌R-F活化培养基配方为：蛋白胨5g/L，牛肉膏15g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖10g/L，柠檬酸二铵1g/L，乙酸钠7g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.45/L，一水硫酸锰0.3g/L，pH6.0-6.5。
（2）、摇瓶种子培养：
一级摇瓶种子培养：按照8%的接种量，将活化后的斜面菌种接到一级摇瓶培养基，250ml三角瓶装液量100ml，在33℃静止培养16h。一级摇瓶培养基配方为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖15g/L，柠檬酸二铵3g/L，乙酸钠4g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁0.40g/L，一水硫酸锰0.15g/L，pH6.0-6.5。
二级摇瓶种子培养：按照5%的接种量，将一级摇瓶种子接入到二级摇瓶培养基中，500ml三角瓶装液量250ml，在35℃培养箱中静置培养20h。二级摇瓶种子培养基配方为：豆饼粉20g/L，蛋白胨8g/L，酵母浸粉8g/L，葡萄糖20g/L，碳酸钙1.0g/L，柠檬酸二铵3g/L，乙酸钠4g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁0.40g/L，一水硫酸锰0.15/L，pH6.0-6.5，摇瓶结束后作为一级发酵罐种子液。
（3）、种子罐培养：
一级种子罐种子培养：按照5%的接种量将二级摇瓶的种子液接入一级种子罐中，一级种子罐装液系数为50%，培养温度33℃，转速100转/分，罐压0.05Mpa，在此条件下培养15h，待总菌数达到1.5×109CFU/ml以上时，转入二级种子罐培养。其中，一级种子罐培养基配方为：豆饼粉30g/L，蛋白胨8g/L，酵母浸粉8g/L，葡萄糖20g/L，碳酸钙0.5g/L，柠檬酸二铵3g/L，乙酸钠4g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁0.40g/L，一水硫酸锰0.1g/L，pH6.0-6.5。
二级种子罐种子培养：按照6%的接种量将一级种子罐中的菌种接入二级种子罐中，二级种子罐装液系数为55%，培养温度为33℃，转速200转/分，罐压0.04Mpa，在此条件下培养20h，待总菌数达到5.0×109CFU/ml以上时，转入发酵罐进行培养。二级种子罐种子培养基配方为：豆饼粉35g/L，蛋白胨6g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖15g/L，碳酸钙1.5g/L，柠檬酸铵1g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾5g/L，七水硫酸镁0.25g/L，一水硫酸锰0.1g/L，pH6.0-6.5。
（4）、发酵罐培养：
发酵罐高密度培养：按照5%接种量将二级种子罐菌液接入发酵罐中，发酵罐装液系数为60%，培养温度为33℃，转速100转/分，罐压0.03Mpa，在此条件下培养约3小时，发酵液残糖降到0.8%以下时，每小时补糖一次，补糖后，培养液残糖控制在2%以下。随着发酵的进行，粪肠球菌产酸，发酵液pH下降，当发酵液pH低于6.0时，自动流加2mol/L的NaOH，补充碱液调节pH到6.0-6.5，培养时间为22-24小时。发酵罐培养基配方为：豆饼粉25g/L，蛋白胨6g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖25g/L，碳酸钙0.5g/L，柠檬酸铵4g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.25g/L，一水硫酸锰0.1g/L。发酵培养基补料配方为：葡萄糖液总体积为发酵罐的4%，葡萄糖浓度为50%，使用前与发酵罐培养基按照同条件灭菌。
粪肠球菌R-F经过活化、摇瓶、种子罐到发酵罐进行培养，发酵过程中配合补料和调控pH，最终粪肠球菌R-F菌体浓度可达1.0×1010CFU/ml以上。
、苹果渣发酵工艺步骤：
（1）、粉碎：用粉碎机将干果渣、棉粕、麸皮粉碎成1.0mm的颗粒。
（2）、将干苹果渣25份与棉粕40份，麸皮30份，轻质碳酸钙5份的比例混合，再将纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、糖蜜、粪肠球菌R-F菌液按照0.06%、0.03%、0.02%、0.1%、12%（占干物质重量比例）加入到水中，调节加水量使料水比为1:0.5，最后将水喷洒在物料上，均匀搅拌，最终物料水分含量为40%左右。其中，纤维素酶、蛋白酶、果胶酶酶活分别为10万U/g、10万U/g、3万U/g。
（3）、将搅拌好的物料加入到带有单向阀发酵袋中，然后在30℃的发酵室中发酵5-15天，72h取样一次，检测活菌数、粗蛋白、小肽及棉酚含量，以后每隔48h取样一次检测上述指标，待活菌数达20亿/g，粗蛋白≥15%，小肽≥10%，果胶≤5%，单宁≤0.02%，游离棉酚含量≤25mg/kg时产品合格。
实施例3
一种苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，包括以下步骤：
、粪肠球菌R-F菌液制备
（1）、菌种的活化：为提高菌种的活力，在接摇瓶前，需要对菌种进行活化。将斜面保存的粪肠球菌R-F用生理盐水稀释后，涂布于MRS固体平板上，33℃培养24h，挑取透明圈较大的单菌落，进行平板分离划线，30℃培养24h，再挑取透明圈较大单菌落于MRS固体平板上，33℃培养24h，最后挑取透明圈较大菌落接入深层MRS液体试管，30℃静止培养16h，按照1%接种量接入MRS液体培养基中，培养24h作为种子液。其中，粪肠球菌R-F活化培养基配方为：蛋白胨15g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖25g/L，柠檬酸二铵4g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾5g/L，七水硫酸镁0.65/L，一水硫酸锰0.1g/L，pH6.0-6.5。
（2）、摇瓶种子培养：
一级摇瓶种子培养：按照10%的接种量，将活化后的斜面菌种接到一级摇瓶培养基，250ml三角瓶装液量100ml，在30℃静止培养14h。一级摇瓶培养基配方为：蛋白胨15g/L，牛肉膏15g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖25g/L，柠檬酸二铵4g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾5g/L，七水硫酸镁0.25g/L，一水硫酸锰0.3g/L，pH6.0-6.5。
二级摇瓶种子培养：按照10%的接种量，将一级摇瓶种子接入到二级摇瓶培养基中，500ml三角瓶装液量250ml，在30℃培养箱中静置培养18h。二级摇瓶种子培养基配方为：豆饼粉25g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉15g/L，葡萄糖25g/L，碳酸钙1.5g/L，柠檬酸二铵4g/L，乙酸钠7g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.65g/L，一水硫酸锰0.3/L，pH6.0-6.5，摇瓶结束后作为一级发酵罐种子液。
（3）、种子罐培养：
一级种子罐种子培养：按照2%的接种量将二级摇瓶的种子液接入一级种子罐中，一级种子罐装液系数为50%，培养温度30℃，转速200转/分，罐压0.04Mpa，在此条件下培养18h，待总菌数达到1.5×109CFU/ml以上时，转入二级种子罐培养。其中，一级种子罐培养基配方为：豆饼粉35g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉15g/L，葡萄糖25g/L，碳酸钙1.5g/L，柠檬酸二铵4g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.25g/L，一水硫酸锰0.3g/L，pH6.0-6.5。
二级种子罐种子培养：按照8%的接种量将一级种子罐中的菌种接入二级种子罐中，二级种子罐装液系数为55%，培养温度为30℃，转速100转/分，罐压0.03Mpa，在此条件下培养20h，待总菌数达到5.0×109CFU/ml以上时，转入发酵罐进行培养。二级种子罐种子培养基配方为：豆饼粉30g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉15g/L，葡萄糖25g/L，碳酸钙1.0g/L，柠檬酸二铵4g/L，乙酸钠7g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.65g/L，一水硫酸锰0.3g/L，pH6.0-6.5。
（4）、发酵罐培养：
发酵罐高密度培养：按照8%接种量将二级种子罐菌液接入发酵罐中，发酵罐装液系数为60%，培养温度为30℃，转速100转/分，罐压0.04Mpa，在此条件下培养约3小时，发酵液残糖降到0.8%以下时，每小时补糖一次，补糖后，培养液残糖控制在2%以下。随着发酵的进行，粪肠球菌产酸，发酵液pH下降，当发酵液pH低于6.0时，自动流加2mol/L的NaOH，补充碱液调节pH到6.5-7.0，培养时间为22-24小时。发酵罐培养基配方为：豆饼粉35g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉15g/L，葡萄糖15g/L，碳酸钙1.5g/L，柠檬酸二铵1g/L，乙酸钠7g/L，磷酸氢二钾5g/L，七水硫酸镁0.65g/L，一水硫酸锰0.3g/L。发酵培养基补料配方为：葡萄糖液总体积为发酵罐的4%，葡萄糖浓度为50%，使用前与发酵罐培养基按照同条件灭菌。
粪肠球菌R-F经过活化、摇瓶、种子罐到发酵罐进行培养，发酵过程中配合补料和调控pH，最终粪肠球菌R-F菌体浓度可达1.0×1010CFU/ml以上。
、苹果渣发酵工艺步骤：
（1）、粉碎：用粉碎机将干果渣、棉粕、麸皮粉碎成1.0mm的颗粒。
（2）、将干苹果渣80份与棉粕10份，麸皮9.5份，轻质碳酸钙0.5份的比例混合，再将纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、糖蜜、粪肠球菌R-F菌液按照0.07%、0.04%、0.07%、0.3%、20%（占干物质重量比例）加入到水中，调节加水量使料水比为1:0.5，最后将水喷洒在物料上，均匀搅拌，最终物料水分含量为40%左右。其中，纤维素酶、蛋白酶、果胶酶酶活分别为10万U/g、10万U/g、3万U/g。
（3）、将搅拌好的物料加入到带有单向阀发酵袋中，然后在33℃的发酵室中发酵5-15天，72h取样一次，检测活菌数、粗蛋白、小肽及棉酚含量，以后每隔48h取样一次检测上述指标，待活菌数达20亿/g，粗蛋白≥15%，小肽≥10%，果胶≤5%，单宁≤0.02%，游离棉酚含量≤25mg/kg时产品合格。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。
Claims (10)
1.一种苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：包括以下步骤：
、粪肠球菌R-F菌液中的制备
（1）、菌种的活化：将斜面保存的粪肠球菌R-F在活化培养基上活化3次，挑取MRS平板上透明圈较大的单菌落，接入深层MRS液体试管，30-35℃培养12-16h后，以1%接种量接入MRS液体培养基，培养18-24h作为种子液；
（2）、摇瓶种子培养：
一级摇瓶种子培养：将活化好的粪肠球菌R-F按照5-10%的接种量接入一级摇瓶培养基中，30-35℃静置培养12-16h，作为一级摇瓶种子液；
二级摇瓶种子培养：将一级摇瓶种子液按照5-10%的接种量接入到二级摇瓶培养基中，在30-35℃培养箱中静置培养16-20h，作为二级摇瓶种子液；
（3）、种子罐培养：
一级种子罐培养：按照2-5%接种量将二级摇瓶种子液接到一级种子罐培养基中，培养温度30-35℃，罐压0.03-0.05MPa，搅拌100-200转/分条件下培养12-18h，转入二级种子罐培养基中培养；
二级种子罐培养：按照5-8%接种量将一级种子罐种子液接到二级种子罐培养基中，培养温度30-35℃，罐压0.03-0.05MPa，搅拌100-200转/分条件下培养14-20h，转入发酵罐进行培养；
（4）、发酵罐培养：
按照5-10%的接种量将二级种子罐种子液转入发酵罐的发酵基础培养基，在温度30-35℃，搅拌100-120转/分钟，罐压0.03-0.05MPa条件下进行发酵，发酵过程中，调节pH在6.0-6.5，培养时间为22-24小时；
、具体发酵步骤：
将苹果渣、棉粕、麸皮、轻质碳酸钙混合，配以蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、糖蜜和粪肠球菌R-F菌液，加水调整物料含水量在30-45%，置于发酵容器中，在15-30℃发酵室中，发酵5-15天，饲料中活菌数达20亿/g以上，粗蛋白≥15%，小肽≥10%，果胶≤5%，单宁≤0.02%，游离棉酚含量≤25mg/kg。
2.根据权利要求1所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤中，将苹果渣20-80份、棉粕1-40份、麸皮1-30份、轻质碳酸钙0.5-5份的比例混合后构成混合物，其中，苹果渣、棉粕、麸皮和轻质碳酸钙的总份数为100；再以混合物重量为计，加入纤维素酶0.05-0.07%、蛋白酶0.03-0.05%、果胶酶0.02-0.07%、糖蜜0.02-0.3%、粪肠球菌R-F菌液8-20%。
3.根据权利要求2所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：蛋白酶，酶活力≥105U/g，添加量为300-500g/t；纤维素酶，酶活力≥105U/g，添加量500-700g/t；果胶酶，酶活力≥30000U/g，添加量200-700g/t。
4.根据权利要求1或2或3所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述菌种活化培养基配方为，蛋白胨5-15g/L，牛肉膏5-15g/L，酵母浸粉3-10g/L，葡萄糖10-25g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。
5.根据权利要求1或2或3所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述一级摇瓶培养基配方为：蛋白胨5-15g/L，牛肉膏5-15g/L，酵母浸粉3-10g/L，葡萄糖10-25g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5；
所述二级摇瓶培养基配方为：豆饼粉15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖15-25g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。
6.根据权利要求1或2或3所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述一级种子罐培养基的配方为：豆饼粉25-35g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖15-25g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5；
所述二级种子罐培养基的配方为：豆饼粉25-35g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖15-25g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。
7.根据权利要求1或2或3所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述发酵基础培养基配方为：豆饼粉25-35g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖15-25g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，柠檬酸二铵1-4g/L，乙酸钠2-7g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，七水硫酸镁0.25-0.65g/L，一水硫酸锰0.1-0.3g/L，pH6.0-6.5。
8.根据权利要求7所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤（4）中，发酵至发酵基础培养基残糖含量在0.8%以下时，用发酵培养基补充培养基补糖，补糖后培养液中残糖控制在1-2%。
9.根据权利要求8所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：所述发酵培养基补充培养基配方为葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液中葡萄糖含量为发酵液总量的2-4%。
10.根据权利要求1所述的苹果渣和棉粕混合发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于：步骤中，发酵容器选择单向阀发酵袋。
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