CN118272259A - 一种将豆渣发酵成发酵液的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种将豆渣发酵成发酵液的菌株及其应用，其中，所述发酵液包括可溶性蛋白和可溶性糖，所述发酵液用于产氨基酸菌二次发酵生成相应的氨基酸，所述菌株属于金黄色杆菌属(Chryseobacterium),名为Chryseobacterium hispalense SD‑3，所述菌株于2024年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.29458。通过实验验证，所述豆渣在经过本发明菌株SD‑3发酵后，发酵液中含有较多的可溶性蛋白和可溶性糖，且后期通过氨基酸发酵试验发现经菌株SD‑3发酵的发酵液最适合用于精氨酸和鸟氨酸生产。本发明为豆渣作为工业发酵原料打下理论基础，为豆渣的高值化利用提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，尤其涉及一种将豆渣发酵成发酵液的菌株及其应用。
背景技术
在如豆浆、豆腐、腐竹等豆制品的加工过程中，会产生大量的副产物豆渣。据统计，大约每1kg大豆可产生湿豆渣1.2kg，现中国每年产生约2000万吨的湿豆渣，但是由于其含水量较高，易变质，腥味重，口感粗糙等特点，不易进行加工处理，导致豆渣被当作废物或饲料处理，这不仅仅会污染环境，同时也会造成资源的浪费。
豆渣的营养成分与大豆类似，含有丰富的蛋白质、脂质、膳食纤维、B族维生素。据统计，每100g干豆渣中含有约50％膳食纤维、25％粗蛋白、10％脂肪及一些低聚糖和氨基酸等营养素。目前豆渣加工的主要方法有物理法、化学法和微生物发酵法，还有以上几种方法结合的方法。以此来增加可溶性膳食纤维含量，改善豆渣口味；同时减少豆渣内挥发性物质消除豆腥味，改善豆渣风味。近年来，发酵技术的发展以及新技术的出现，提高了豆渣等副产物的再利用率。但目前发酵豆渣的研究也存在一定不足，如：将豆渣作为饲料仍是主要用途，这一定程度上限制了豆渣多样化利用和附加值的进一步提升。目前关于高附加值新型豆渣发酵产品的研究仍然不成熟，工业化利用仍需要进一步探讨。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种将豆渣发酵成发酵液的菌株及其应用，旨在解决现有豆渣发酵产品的附加值较低，工业化利用率较差的问题。
本发明的技术方案如下：
一种将豆渣发酵成发酵液的菌株，其中，所述发酵液包括可溶性蛋白和可溶性糖，所述发酵液用于产氨基酸菌二次发酵生成相应的氨基酸，所述菌株属于金黄色杆菌属(Chryseobacterium),名为Chryseobacterium hispalense SD-3，所述菌株于2024年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.29458。
所述将豆渣发酵成发酵液的菌株，其中，所述产氨基酸菌为产精氨酸钝齿棒杆菌和产鸟氨酸谷氨酸棒状杆菌中的一种或两种。
一种如本发明所述将豆渣发酵成发酵液的菌株的应用，其中，将所述菌株用于豆渣发酵生成包含可溶性蛋白和可溶性糖的发酵液。
所述菌株的应用，其中，将所述菌株用于豆渣发酵生成包含可溶性蛋白和可溶性糖的发酵液的步骤包括：
将豆渣和水按照1:10的质量比混合后进行灭菌处理，制得豆渣培养基；
将所述菌株在LB液体培养基中培养过夜作为种子液；
将所述豆渣培养基与所述种子液按照体积比50:1的比例混合进行发酵，得到发酵液。
所述菌株的应用，其中，所述灭菌处理的温度为115-125℃，时间为20-40min。
有益效果：本发明从传统豆渣发酵饼中筛选出属于Chryseobacteriumhispalense属的可发酵豆渣生成可溶性蛋白和可溶性糖的菌株，该菌株名为Chryseobacterium hispalense SD-3，所述菌株于2024年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.29458。通过实验验证，所述豆渣在经过本发明菌株SD-3发酵后，发酵液中含有较多的可溶性蛋白和可溶性糖，且后期通过氨基酸发酵试验发现经菌株SD-3发酵的发酵液最适合用于精氨酸和鸟氨酸生产。本申请为豆渣作为工业发酵原料打下理论基础，为豆渣的高值化利用提供新思路。
附图说明
图1为从霉豆渣中筛选得到的菌株在脱脂牛奶平板培养基上培养后形成的透明圈展示图。
图2为从图1透明圈中挑取的3株菌株进行革兰氏染色后的结果图。
图3为3株菌株进行16sRNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
图4为3株菌株的进化树。
图5为3株菌株在对豆渣分别进行发酵后测得的可溶性蛋白质含量对比图。
图6为3株菌株在对豆渣分别进行发酵后测得的可溶性糖含量对比图。
图7为不同工程菌在3株菌株发酵豆渣后得到的发酵液中生长曲线对比图，其中，A为大肠杆菌在三种培养基中的生长曲线，B为谷氨酸棒状杆菌在三种培养基中的生长曲线，C为毕赤酵母在三种培养基中的生长曲线。
图8为产精氨酸钝齿棒杆菌接种到SD-1、SD-2、SD-3发酵豆渣液中培养后精氨酸含量对比图。
图9为产鸟氨酸谷氨酸棒状杆菌接种到SD-1、SD-2、SD-3发酵豆渣液中培养后精氨酸含量对比图。
具体实施方式
本发明提供一种将豆渣发酵成发酵液的菌株及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了提升豆渣多样化利用率和附加值，本发明从传统豆渣发酵饼中筛选出了能够产生蛋白质水解酶的菌株，该菌株对豆渣发酵后能得到包括可溶性蛋白和可溶性糖的发酵液，所述发酵液用于产氨基酸菌二次发酵生成相应的氨基酸，该菌株属于金黄色杆菌属(Chryseobacterium),名为Chryseobacterium hispalense SD-3，所述菌株于2024年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.29458。本发明通过实验验证，所述豆渣在经过本发明菌株SD-3发酵后，发酵液中含有较多的可溶性蛋白和可溶性糖，且后期通过氨基酸发酵试验发现经菌株SD-3发酵的豆渣液最适合用于精氨酸和鸟氨酸生产。本申请为豆渣作为工业发酵原料打下理论基础，为豆渣的高值化利用提供新思路。
本发明通过在不同温度和pH下水解圈试验摸索本发明菌株的最适蛋白质水解条件；通过革兰氏染色、16srRNA测序、数据库对比构建进化树，分析了菌株的亲缘关系；通过对菌株发酵豆渣后的可溶蛋白质和可溶糖含量分析，研究各菌株发酵对豆渣的影响；以豆渣发酵产物作为原料，培养大肠杆菌、酵母菌、谷氨酸棒状杆菌等常见工程菌，研究各工程菌的生长情况；最后，以发酵豆渣作为主要原料，进行产氨基酸发酵，为豆渣做为工业发酵原料打下理论基础，为豆渣的高值化利用提供新思路。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的解释说明：
1、高产蛋白酶菌株的筛选
称取0.2g酶豆渣(购自于南昌市广阳菜市场)，用1mL灭菌生理盐水浸泡并涡旋5min，取样品原液稀释成10、100和1000倍梯度菌悬液，各取200μL菌悬液涂布在脱脂奶粉固体培养基上，放置于30℃恒温培养2天，从脱脂牛奶平板培养基上挑取3株明显透明圈的菌株做进一步鉴定(分别命名为SD-1、SD-2、SD-3)，透明圈结果如图1所示。
2、菌株的鉴定
使用细菌基因组DNA提取试剂盒(索莱宝)提取菌株基因组DNA，以细菌基因组DNA为模板，用通用引物序列27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)扩增菌株的16S rRNA基因。PCR(polymerase chain reaction)反应体系：上下游引物(10umol/L)各1μL，DNA模板0.5μL，Taq酶10μL，无菌ddH2O补充至20μL。PCR程序为：(1)98℃预变性5min；(2)98℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；(3)72℃延伸5min。PCR完毕后跑琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物送往上海生工生物测序。测序结果在NCBI数据库比对，依据序列比对结果，利用MEGA 7.0构建系统发育树。将目的菌株划线接种于LB培养基，30℃培养2d，进行革兰氏染色。
本实施例通过革兰氏染色观察发现上述SD-1细菌为棒状革兰氏阳性菌，SD-2为球杆革兰氏阴性菌，SD-3为杆状革兰氏阴性菌(如图2所示)，用16sRNA通用引物27F和1492R对菌株进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到片段大小为1500bp左右的清晰特异性条带(如图3所示)。将PCR产物测序后，序列在NCBI比对，构建进化树(如图4所示)。进化树的情缘关系表明SD-1菌株为芽孢杆菌属(Bacillus.sp)，SD-2菌株为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas.sp)，SD-3菌株为金黄色杆菌属(Chryseobacterium.sp)。芽孢杆菌属属于革兰氏阳性菌，与本研究的SD-1的革兰氏染色结果相同，芽孢杆菌属通常具有较强的产蛋白酶能力，是商业化产蛋白酶常见菌株，现有较多对于芽孢杆菌产蛋白酶学相关研究。寡养单胞菌属和金黄色杆菌属均为革兰氏阴性菌，与本研究的革兰氏染色结果相同，寡养单胞菌属和金黄杆菌属广泛分布于土壤、水、植物根系、人或动物以及消化道中，研究表明有些寡养单胞菌属和金黄色杆菌属也具有较强的外分泌蛋白酶特性。
3、豆渣发酵
将豆渣和水按照1:10的质量比混合后进行灭菌处理，灭菌处理的温度为115-125℃，时间为20-40min，制得豆渣培养基；
将所述SD-1、SD-2、SD-3菌株分别在LB液体培养基中培养过夜作为种子液；
将所述豆渣培养基与所述种子液按照体积比50:1的比例混合进行发酵，期间每隔12h取样一次。
4、可溶性蛋白质和可溶性糖的测定
采用双缩脲法蛋白含量检测试剂盒(索莱宝)测定发酵液中的可溶性蛋白含量，以牛血清蛋白作为标准品，在540nm处测定其吸光值，以对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。吸取1ml适当稀释的蛋白提取液加入反应液，混匀后室温反应15min，于540nm比色，通过回归方程进行计算。采用总糖含量检测试剂盒(索莱宝)测定发酵液中的可溶性糖含量，以葡萄糖为标准品，在540nm处测定其吸光值，以对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
测试结果如图5所示，未经发酵的豆渣培养基的可溶蛋白质含量不到1mg/mL，经三种菌发酵后，可溶蛋白质含量均有所增加。其中，SD-1、SD-2发酵豆渣24h时，可溶性蛋白的含量最高，分别达4.32mg/mL、3.55mg/mL；SD-3在发酵豆渣84h时，可溶性蛋白的含量最高达2.75mg/mL。虽然SD-3在发酵豆渣后生成的可溶性蛋白含量相对SD-1和SD-2最少，但是后续实验发现SD-3发酵后生成的发酵液最适合工业菌生长并且更适合产氨基酸菌二次发酵生成氨基酸。
豆渣富含膳食纤维，细菌可以通过纤维素酶分解纤维素产生部分可溶性糖。如图6所示，经SD-1发酵84h的豆渣的可溶性糖达到最大值，为5.64mg/mL。经SD-2、SD-3发酵72h的豆渣的可溶性糖达到最大值，分别为4.60、5.82mg/mL。可溶性糖含量的增加，可以有效提升豆渣在工业发酵中的利用效率。
综上所述，本发明选择SD-3菌株对豆渣发酵84h后，能够获得含有相对较高含量的可溶性蛋白和可溶性糖，且该发酵液更适合工业菌生长以及产氨基酸菌二次发酵生成氨基酸。
5、工业菌培养
胞外分泌蛋白酶会消耗菌体大量能量，不利于目标产物生产，因此，大部分工业发酵菌株胞外分泌蛋白酶较少。而豆渣中的营养成分大部分为不可溶的大分子物质，所以工业发酵菌株很难利用。本研究中分离的三种菌可以水解豆渣产生可溶性的小分子营养物质，可以被工业菌利用。根据SD-1、SD-2、SD-3发酵豆渣产可溶性蛋白的含量，分别选择SD-1、SD-2发酵豆渣24后，SD-3在发酵豆渣84h后的发酵液作为工业菌的培养基。本研究分别选取了革兰氏阴性菌(大肠杆菌BL21)、革兰氏阳性菌(谷氨酸棒状杆菌S9114)、真菌(毕赤酵母GS115)三种菌株作为试验对象。如图7所示，其中，A为大肠杆菌在三种培养基中的生长曲线，B为谷氨酸棒状杆菌在三种培养基中的生长曲线，C为毕赤酵母在三种培养基中的生长曲线，从图中可以看出，所有菌在三种培养基中都能生长，然而，毕赤酵母在三种培养基中的OD值都没有超过1.5，大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌在经SD-3发酵的豆渣液中生长速率最快；大肠杆菌在经SD-2发酵的豆渣液中生长速率最慢。
6、发酵产氨基酸
本实施例将产精氨酸钝齿棒杆菌和产鸟氨酸谷氨酸棒状杆菌接种到SD-1、SD-2、SD-3发酵豆渣液中培养，如图8和图9所示，SD-3发酵豆渣液中精氨酸产量在摇瓶发酵108h和120h时显著高于其它两种豆渣发酵液，在120h时精氨酸产量达到15.8g/L；SD-3豆渣发酵液中鸟氨酸产量在摇瓶发酵48h后，显著高于SD-2发酵豆渣液，84h后，显著高于SD-1发酵豆渣液中的鸟氨酸；SD-3豆渣发酵液中鸟氨酸产量最高达27.4g/L。SD-2发酵豆渣液中产的鸟氨酸最少。综上所述，经SD-3发酵的豆渣液最适合用于精氨酸和鸟氨酸生产。大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌在经SD-3发酵的豆渣液的生长速率也是最高(如图7所示)，说明SD-3发酵的豆渣液中有较多的营养物质提供给工业菌，利于其生长和工业生产。
总而言之，从霉豆渣中分离3株具有水解蛋白质特性的菌株(分别命名为SD-1、SD-2、SD-3)，SD-1细菌为棒状革兰氏阳性菌，SD-2为球杆革兰氏阴性菌，SD-3为杆状革兰氏阴性菌。经16sRNA测序表明SD-1菌株为芽孢杆菌属(Bacillus.sp)，SD-2菌株为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas.sp)，SD-3菌株为金黄杆菌属(Chryseobacterium.sp)。根据试验结果SD-1为中性蛋白酶，SD-2和SD-3为碱性蛋白酶。经三种菌发酵后，豆渣中的可溶蛋白质含量均有所增加。其中，SD-3在发酵豆渣84h时，可溶性蛋白和可溶性糖的含量均较高。分别选取革兰氏阴性菌(大肠杆菌BL21)、革兰氏阳性菌(谷氨酸棒状杆菌S9114)、真菌(毕赤酵母GS115)三种菌株在豆渣发酵液中培养。培养过程中，毕赤酵母的OD值都没有超过1.5；大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌在经SD-3发酵的豆渣液中生长速率最快；大肠杆菌在经SD-2发酵的豆渣液中生长速率最慢。通过氨基酸发酵试验发现经SD-3发酵的豆渣液最适合用于精氨酸和鸟氨酸生产。本发明为豆渣做为工业发酵原料打下理论基础，为豆渣的高值化利用提供新思路。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种将豆渣发酵成发酵液的菌株，其特征在于，所述发酵液包括可溶性蛋白和可溶性糖，所述发酵液用于产氨基酸菌二次发酵生成相应的氨基酸，所述菌株属于金黄色杆菌属(Chryseobacterium),名为Chryseobacterium hispalense SD-3，所述菌株于2024年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.29458。
2.根据权利要求1所述将豆渣发酵成发酵液的菌株，其特征在于，所述产氨基酸菌为产精氨酸钝齿棒杆菌和产鸟氨酸谷氨酸棒状杆菌中的一种或两种。
3.一种如权利要求1或2所述将豆渣发酵成发酵液的菌株的应用，其特征在于，将所述菌株用于豆渣发酵生成包含可溶性蛋白和可溶性糖的发酵液。
4.根据权利要求3所述菌株的应用，其特征在于，将所述菌株用于豆渣发酵生成包含可溶性蛋白和可溶性糖的发酵液的步骤包括：
将豆渣和水按照1:10的质量比混合后进行灭菌处理，制得豆渣培养基；
将所述菌株在LB液体培养基中培养过夜作为种子液；
将所述豆渣培养基与所述种子液按照体积比50:1的比例混合进行发酵，得到发酵液。
5.根据权利要求4所述菌株的应用，其特征在于，所述灭菌处理的温度为115-125℃，时间为20-40min。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410360125.9A CN118272259A (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 一种将豆渣发酵成发酵液的菌株及其应用 |
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| CN202410360125.9A CN118272259A (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 一种将豆渣发酵成发酵液的菌株及其应用 |
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2024
- 2024-03-27 CN CN202410360125.9A patent/CN118272259A/zh active Pending
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