MX2007012755A

MX2007012755A - Metodos y composiciones para modular la adhesion y tolerancia al estres en bacterias.

Info

Publication number: MX2007012755A
Application number: MX2007012755A
Authority: MX
Inventors: Eric Altermann; B Logan Buck; Andrea Azcarate-Peril; Todd R Klaenhammer
Original assignee: Univ North Carolina State
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-14
Publication date: 2008-01-14
Also published as: BRPI0610609A2; WO2006113475A2; JP2008537885A; AU2006236629B2; EP1871868A2; WO2006113475A3; CN102212543A; EP2302032A1; CN101198689A; US20060269998A1; EP2305791A1; AU2006236629A1; CA2605162A1; ECSP077898A; NZ563246A

Abstract

Se proporcionan metodos y composiciones que mejoran la adhesion de una bacteria a sustratos objetivo y/o mejoran la tolerancia a estres de una bacteria. Los metodos comprende exponer la bacteria a condiciones adaptables de adhesion y de este modo incrementar la actividad de adhesion y/o la tolerancia a estres de la bacteria. Se proporcionan ademas bacterias que tienen una produccion modulada del autoinductor-2. Las composiciones incluyen bacterias recombinantes que expresan moleculas de acido nucleico comprendidas en la ruta de produccion del autoinductor-2. ademas se proporcionan proteinas de fusion relacionadas al autoinductor-2, peptidos antigenicos, anticuerpos y vectores. Se proporcionan ademas metodos para detectar compuestos o condiciones ambientales que estimularan la produccion del autoinductor-2 y/o produciran una respuesta adaptable de adhesion, como son los varios metodos de uso para la bacteria que tiene adhesion incrementada y/o tolerancia incrementada estres.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR LA ADHESIÓN Y TOLERANCIA AL ESTRÉS EN BACTERIAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a bacterias, particularmente a bacterias de ácido láctico y probióticas, y a métodos y construcciones para el control de la señalización celular en las mismas.

Antecedentes de la Invención En el intestino delgado, los lactobacilos representan un componente principal e importante de la microflora de los comensales. Se han usado varias especies de La ctoba cil l us como cultivos probióticos seleccionados para el uso en alimentos o adjuntos dietéticos basados en los beneficios específicos extraídos de ese organismo y las características de bioprocesamiento deseadas por el fabricante. No todos los cultivos probióticos exhiben las mismas características, haciendo suprema la selección de estas cepas y clarificación de sus beneficios. Las bacterias de ácido láctico, y los lactobacilos específicamente, son un género común incluido en los productos alimenticios para una variedad de factores prospectivos promotores de salud. Las bacterias de ácido láctico (LAB) se encuentran de forma natural en una variedad de nichos am REF. : 186952 donde existen como miembros de comunidades microbianas complejas. La supervivencia en cada nicho depende de la capacidad del organismo para percibir y responder a condiciones variables tal como temperatura, pH, disponibilidad de nutrientes, y densidad de población celular. Un nicho principal que ocupa frecuentemente las LAB es aquel del tracto gastrointestinal de mamífero (GIT) . Múltiples rutas de transduccion de señales controlan probablemente la expresión de factores de adhesión, genes de respuesta a estrés, y otros determinantes genéticos que promueven la supervivencia y competencia de LAB dentro de los varios compartimientos del GIT. Algunos lactobacilos intestinales, junto con bacterias patógenas gram-positivas y gram-negativas, tienen la capacidad de asociarse con el epitelio intestinal y las capas mucosas en el mismo. Se piensa que esta asociación es importante para la realización de ciertas propiedades probioticas que incluyen exclusión competitiva, inmunomodulacion, y la distribución de bioterapeuticos, entre otros. Aunque no se entienden los mecanismos moleculares comprendidos con esta asociación, es claro que el proceso es complejo, que comprende factores específicos de los hospedadores, específicos de las bacterias y factores ambientales. Algunos lactobacilos intestinales, junto con bacterias patógenas gram-positivas y gram-negativas, tienen la capacidad de asociarse con el epitelio intestinal y capas mucosas en el mismo. La capacidad para colonizar estas superficies puede dar a los probióticos una ventaja distinta con respecto a otra microflora patógena e indígena. De interés particular es el mecanismo a través del cual estas bacterias sobreviven y colonizan potencialmente el ambiente cinético del tracto intestinal. Se han estudiado ciertos factores ambientales que tienen influencia en la adhesión incluyendo pH, fase de crecimiento y la presencia de otros microorganismos. Los lactobacilos deben mantener un equilibrio entre satisfacer sus propios requerimientos de crecimiento y sobrevivir a las condiciones hostiles, incluyendo choque gástrico-ácido, prevenido por las defensas del hospedador y microflora competente (Tannock (2005) Appl . Environ . Mi crobiol . 71:8419-8425) . Sin embargo, se conoce poco acerca de cómo estos factores estresantes influyen en la capacidad de los lactobacilos para asociarse con los sustratos variados en el ambiente intestinal.

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan métodos y composiciones que mejoran la adhesión de una bacteria a sustratos objetivo y/o mejoran la tolerancia al estrés de una bacteria. Los métodos comprenden exponer a las bacterias a condiciones adaptables a la adhesión e incrementar de este modo la adhesión y/o tolerancia al estrés de las bacterias. Se proporcionan adicionalmente bacterias que tienen un nivel modulado de autoinductor-2 (AI-2). Las composiciones incluyen bacterias recombinantes que expresan moléculas de ácido nucleico comprendidas en la ruta de producción del autoinductor-2. Además se proporcionan proteínas de fusión relacionadas al autoinductor-2 , péptidos antihigiénicos, anticuerpos y vectores. Se proporcionan adicionalmente métodos para detectar compuestos o condiciones ambientales que estimularán la producción del autoinductor-2 y/o producirán una respuesta adaptable a la adhesión, puesto que hay varios métodos de uso para las bacterias que tienen adhesión incrementada y/o tolerancia incrementada al estrés. La presente invención se explica en detalle adicional en las figuras de la presente y la especificación expuesta más adelante.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras ÍA y IB demuestran la adhesión de L . a cidophil us NCFM a células Caco-2 in vi tro como se observa de manera microscópica. Las células bacterianas fueron ya sea (a) incubadas durante una hora a 37°C en condición no concentrada (1 x 108 CFU/ml) o (b) sedimentadas e incubadas en una condición concentrada 10 X (1 x 109 CFU/ml) (condiciones de AAR) durante 1 hora a 37°C. La Figura 2 representa el protocolo de adhesión. La Figura 3 demuestra las propiedades de adhesión de las cepas mutantes y la cepa de control NCFM: la cL a las células Caco-2 en condiciones normales de incubación (barra sólida) y condiciones adaptables de adhesión (barras ralladas). Las cuentas se expresan como bacterias promedio que se adhieren por campo microscópico y las barras de error representan una desviación estándar de la media. La Figura 4 muestra la ruta para la producción de AI-2 a partir de metionina en L . a cidophi l us NCFM. Los compuestos intermedios esenciales para la producción de AI-2 se representan en negritas, y los ORF se codifican para cada enzima se enlistan bajo el nombre de la enzima. La metiltransferasa dependiente de SAM se abrevia SAM-MT . El paso final comprende la circulización no enzimática de 4,5-dihidroxi-2, 3-pentanodiona en AI-2. La Figura 5 muestra la capacidad de adhesión de una cepa mutante LuxS" de L . a cidophi l us NCFM a células Caco-2 en comparación a la cepa de control NCFM: lacL . La Figura 6 muestra AI-2 producido durante la fase de crecimiento de L . a cidophil us NCFM, como se detecta del sobrenadante neutralizado estéril (barras rayadas) y expresado como luminiscencia media de la cepa de origen/luminiscencia media de la cepa mutante LuxS~. El crecimiento de L . a cidophi l us NCFM, representado por ODdoo (línea sólida con círculo) y la caída en el pH (línea de guiones con triángulos), coincide con la rápida producción de AI-2 durante la fase logarítmica de crecimiento. Cada valor representa la media de experimentos en triplicado y las barras de error son la desviación estándar de la media. La Figura 7 demuestra las propiedades de adhesión de la cepa de control y las cepas mutantes seleccionadas de L . a cidophi l us NCFM con y sin exposición a condiciones adaptables de adhesión. Las Figuras 8A-8C grafican la clasificación de COG de los ORF totales sobre expresados en la cepa tipo silvestre (panel A) o mutante LuxS- (panel B) . Los grupos de COG (panel C) se listan en gráficas pastel con el número de ORF sobre expresados en ese grupo (COG, # de ORF) . Las Figuras 9A y 9B muestran el número de ORF cuya expresión se incrementó (cortes) desde (A) fase logarítmica temprana o intermedia o (B) de fase logarítmica intermedia a tardía. El tipo silvestre se representa por barras blancas y la cepa mutante LuxS- representada por barras grises. La Figura 10 demuestra la tolerancia de bilis de L. acidophilus NCFM (sin corte) y la cepa mutante LuxS- (corte) recolectado en la fase de crecimiento temprana-logarítmica (OD6oo 0.2), intermedia-logarítmica (OD600 0.7), y tardía-logarítmica (OD60o 1.2). Las poblaciones bacterianas se dividieron y colocaron en placa en MRS complementado con ya sea 0.75 % (barras blancas), 1.0 % (barras grises) , o 2.0 % (barras negras) de Oxgall. Se calculó el por ciento de supervivencia por comparación a CFU/ml crecido en MRS no complementado. Las diferencias significativas detectadas por la prueba t de Student (P < 0.05) se representan por un asterisco (*) . Las barras de error representan una desviación estándar de la media. Las Figuras 11A-11B demuestran supervivencia de las poblaciones tipo silvestre (círculos abiertos) y de LuxS- (círculos cerrados) y después de estrés térmico a 55°C, cuando se recolecta en la fase de crecimiento (panel A) temprana-logarítmica, OD60o 0.2, (panel B) intermedia-logarítmica, OD60o 0.7, o (panel C) tardía-logarítmica, OD6oo 1.2. Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05) se ha detectado para este punto de tiempo. Las barras de error representan una desviación estándar de la media.

Descripción Detallada de la Invención Las presentes invenciones ahora se describirán más completamente más adelante en la presente con referencia a las figuras anexas, en las cuales algunas, pero no todas, las modalidades de la invención, se muestran. En realidad, estas invenciones se pueden incorporar en muchas formas diferentes y no se deben considerar como que se limitan a las modalidades expuestas en la presente; más bien, estas modalidades se proporcionan de modo que esta descripción satisface los requerimientos legales aplicables. Números similares se refieren a elementos similares por completo. Muchas modificaciones y otras modalidades de la invención expuestas en la presente vendrán a la mente de un experto en la técnica al cual corresponden estas invenciones que tienen el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y las figuras asociadas. Por lo tanto, se va a entender que las invenciones no se van a limitar a las modalidades específicas descritas y se propone que se incluyan estas modificaciones y otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque se emplean en la presente términos específicos, se usan en un sentido genérico y descriptivo únicamente y no para propósitos de limitación. Como se usa en la presente, "un", "una" y "el" pueden ser plurales o singulares como se usa a todo lo largo de la especificación y las reivindicaciones. Por ejemplo "una" célula puede significar una célula individual o una multiplicidad de células. También como se usa en la presente, "y/o" se refiere a y abarca cualquiera y todas las posibles combinaciones de uno o más de los puntos listados asociados, así como la carencia de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o") .

I. Apreciación Global Se proporcionan métodos y composiciones de la invención que mejoran la región de una bacteria a sustratos objetivos y/o mejoran la tolerancia al estrés de una bacteria. La adhesión incrementada de un organismo de comensal, tal como un probiótico, a células del tracto gastrointestinal o el tracto urogenital encuentra uso en la reducción del riesgo de infección del intestino, tracto urogenital, y sitios de vida. De manera similar, la mejora de la tolerancia al estrés de un organismo probiótico, tal que se incremente la proporción de supervivencia del probiótico en el duro ambiente del tracto intestinal, ayudará adicionalmente a reducir el riesgo de infección del intestino, tracto urogenital y sitios de vida. En una modalidad, la presente invención ha identificado "condiciones adaptables de adhesión". Como se usa en la presente, "condiciones adaptables de adhesión" comprenden cualquier condición física, química, biológica o similar que mejore la adhesión de bacterias a un sustrato. La presente invención ha demostrado que el preacondicionamiento de células bacterianas a estas condiciones adaptables de adhesión da por resultado un incremento en la adhesión y/o un incremento en la tolerancia al estrés. Como se usa en la presente, las propiedades mejoradas de adhesión de las bacterias se refieren como la "respuesta adaptable de adhesión" o "AAR". Los polipéptidos y polinucleótidos cuyos niveles y/o actividad se modulen bajo condiciones adaptables de adhesión se refieren en la presente como polipéptido o polinucleótidos "relacionados a la respuesta adaptable de adhesión" o "relacionados a AAR". Se describen en la presente varios polinucleótidos y polipéptidos relacionados a AAR. Ver Tablas 8 y 9 posteriores. Se exponen polipéptidos adicionales relacionados a AAR, y sus polipéptidos codificados, en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 33, 34, 35, 36, 37 y 38. Adicionalmente se proporcionan métodos y composiciones que modulan la ruta del autoinductor-2 de una bacteria, y de este modo modulan la adhesión y/o la tolerancia al estrés de las bacterias. De manera más específica, se proporcionan polinucleótidos y polipéptidos de la ruta de producción del autoinductor-2 (AI-2) en bacterias. Las células bacterianas frecuentemente se comunican mediante mecanismos de percepción de quorum, que comprenden el reconocimiento dependiente de la intensidad de un autoinductor seguido por cambios en la expresión génica. Un importante sistema de percepción de quorum que se puede usar para comunicarse entre y por medio de especies se basa en un furanosil-borato-diéster llamado autoinductor-2 (AI-2), producido en cuatro pasos enzimáticos a partir de metionina. El AI-2 regula la expresión de varios fenotipos que incluyen factores de virulencia, procesamiento de ADN, morfología celular, motilidad, formación de biopelículas, producción de toxinas, producción de luz y división celular en numerosas especies (Xavier et al. (2003) Curr . Opin . Microbiol . 6:191-197). Por consiguiente, se proporcionan métodos y composiciones que permiten la modulación del nivel y/o actividad de los polipéptidos en la ruta de AI-2 y de este modo se proporciona la capacidad para modular varios fenotipos bacterianos. Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de la ruta de AI-2 se exponen en SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 13, 14, 15, 16, 21 ó 22. Estas secuencias se refieren en la presente como "secuencias relacionadas a AI-2".

II. Polipéptidos y Polinucleótidos Relacionados a AI-2 y Relacionados a AAR Se proporcionan composiciones que emplean los varios polinucleótidos y polipéptidos relacionados a AAR y relacionados a AI-2, de la invención. La invención proporciona además fragmentos y variantes de estas secuencias relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR, que también se pueden usar para practicar los métodos de la presente invención. Como se usa en la presente, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un cuadro de lectura abierto, particularmente aquellos que codifican para proteínas comprendidas en la producción de AI-2 o en la AAR. Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención compren secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR expuestas en SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 34, 36 ó 38, las secuencias de ácido nucleico expuestas en SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 33, 35 ó 37 y variantes y fragmentos de las mismas. La presente invención también abarca moléculas antisentido de ácido nucleico, como se describe más adelante. Se abarcan polipéptidos aislados y proteínas comprendidas en la producción de AI-2 o en la AAR, y variantes y fragmentos de los mismos, así como métodos para producir estos polipéptidos. Para los propósitos de la presente invención, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan de manera indistinta. Los polipéptidos relacionados a AI-2 de ejemplo incluyen SEQ ID Nos: 2, 4, 14, 16, 22. Los polipéptidos relacionados a AAR de ejemplo incluyen SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 34, 36 y 38. La "producción de AI-2" o la "respuesta adaptada de adhesión (AAR) " se refieren a una actividad biológica o funcional como se determina in vivo o in vi tro de acuerdo a técnicas normales de ensayo. Por ejemplo, la producción de AI-2 se puede medir usando una cepa indicadora Vibrio harveyi y un bioensayo autoinductor ( DeKeersmaecker et al. (2003) Mi crobiology 149:1953-6). Los ensayos adicionales comprenden, por ejemplo, medición de la supervivencia bacteriana o crecimiento bajo las condiciones adaptables de adhesión descritas en otra parte de la presente. Las bacterias y métodos de la invención son útiles para fermentaciones bacterianas, por ejemplo donde se desee estimular la producción de AI-2, o para promover la adhesión o formación de biopelículas de las bacterias en un sustrato para llevar a cabo el proceso fermentativo. Las bacterias de la invención son útiles como bacterias probióticas, por ejemplo donde se desee estimular la producción de AI-2, o para promover la adhesión o formación de biopelículas de las bacterias en el intestino o pared intestinal para excluir competitivamente otras bacterias menos deseables del mismo. Los métodos para inducir señalización celular o una respuesta adaptable de adhesión en bacterias son útiles en la estimulación de la producción de AI-2, o en la promoción de la adhesión o formación de biopelículas de bacterias, incluyendo bacterias tipo silvestre no recombinantes y recombinantes, para estimular la producción de AI-2, o para promover la adhesión o formación de biopelículas por bacterias probióticas. Las composiciones de ácido nucleico y polipéptido abarcadas por la presente invención se aislan o purifican de manera sustancial. Por "aislada" o "sustancialmente purificadas" se propone que las moléculas de ácido nucleico o polipéptido, o fragmentos o variantes biológicamente activos, estén sustancial o esencialmente libres de los componentes normalmente encontrados en asociación con la molécula de ácido nucleico o proteína en su estado natural. Estos componentes incluyen otro material celular, medio de cultivo de la producción recombinante, y varios productos químicos usados al sintetizar químicamente las proteínas o ácidos nucleicos. De manera preferente, un ácido nucleico "aislado" de la presente invención está libre de secuencias de ácido nucleico que flanquean el ácido nucleico de interés en el ADN genómico del organismo del cual se derivó el ácido nucleico (tal como secuencias de codificación presentes en los extremos 5' ó 3' ) . Sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o porciones adicionales que no afecten de forma perjudicial las características básicas de la composición. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico contiene menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de secuencia de ácido nucleico normalmente asociada con el ADN genómico en las células de la cual se derivó. De manera similar, una proteína sustancialmente purificada tiene menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 % ó 1 % (por peso seco) de proteína contaminante, o proteína no relacionada a AI-2 o no relacionada a AAR. Cuando la proteína se produce de forma recombinante, de manera preferente el medio de cultivo representa menos de 30 %, 20 %, 10 % ó 5 % del volumen de la preparación de proteína, y cuando la proteína se produce de forma química, de manera preferente las preparaciones tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % ó 5 % (por peso seco) de los precursores químicos, o productos químicos no relacionados a la producción de AI-2 o a las condiciones adaptables de AI-2. i. Fragmentos y Variantes La invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR, así como las proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR codificadas de este modo. Los fragmentos y variantes de estas secuencias de nucleótidos o proteínas codificadas también se proporcionan. Por "fragmento" de una secuencia de nucleótidos o proteínas se propone una porción de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos.

Los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico descritos en la presente se pueden usar como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican para proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR, o se pueden usar como cebadores en amplificación por PCR o mutación de las moléculas de ácido nucleico relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR. Los fragmentos de ácidos nucleicos también se pueden unir a un sustrato físico para comprender lo que se puede considerar un macro o micro-arreglo (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,837,832; Patente de los Estados Unidos No. 5,861,242). Estos arreglos de ácido nucleico se pueden usar para estudiar la expresión génica o para identificar moléculas de ácido nucleico con suficiente identidad a las secuencias objetivo. La presente invención proporciona además un arreglo o trozo de ácido nucleico, es decir, una multitud de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) como sondas moleculares organizadas o arregladas de forma precisa en un soporte sólido, que permite la secuenciación de los genes, el estudio de mutaciones contenidas en los mismos y/o el análisis de la expresión de genes, puesto que estos arreglos y trozos son actualmente de interés dado su tamaño muy pequeño y su alta capacidad en términos de varios análisis. La función de estos arreglos/trozos de ácido nucleico se basa en sondas moleculares, principalmente oligonucleótidos, que se unen a un portador que tiene un tamaño en general de unos pocos centímetros cuadrados o más, como se desee. Para un análisis, el portador, tal como en un arreglo/trozo de ADN, se reviste con sondas de ADN (por ejemplo, oligonucleótidos) que se arreglan en una ubicación o posición predeterminada en el portador. Una muestra que contiene un ácido nucleico objetivo y/o fragmentos del mismo que se va a analizar, por ejemplo ADN o ARN o ADNc, que se ha marcado de antemano, se pone en contacto con el arreglo/trozo de ADN que conduce a la formación, a través de hibridación, de un dúplex. Después de un paso de lavado, el análisis de la superficie del trozo permite que se localice cualquier hibridación por medio de las señales emitidas por el objetivo marcado. Los resultados de la huella de hibridación que por procesamiento por computadora, permite la recuperación de información tal como la expresión de genes, la presencia de fragmentos específicos en la muestra, la determinación de secuencias y/o la identificación de mutaciones. En una modalidad de esta invención, la hibridación entre los ácidos nucleicos objetivo y los ácidos nucleicos de la invención, usados en la forma de sondas y depositados o sintetizados in si tu en un trozo/arreglo de ADN, se puede determinar por medio de fluorescencia, radioactividad, detección electrónica o similar, como es bien conocido en la técnica.

En otra modalidad, las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden usar en la forma de un arreglo/trozo de ADN para llevar a cabo análisis de la expresión de genes comprendidos en la producción de AI-2 o en la AAR. Este análisis se basa en el arreglo/trozo de ADN en el cual están presentes las sondas, elegidas por su especificidad para caracterizar una secuencia de nucleótidos o gen determinado. Las secuencias objetivo que se van a analizar se marcan antes de que se hibridicen en el trozo. Después del lavado, los complejos marcados se detectan y cuantifican, con las hibridaciones que se llevan a cabo al menos en duplicado. Los análisis comparativos de las intensidades de señales obtenidos con respecto a la misma sonda para diferentes muestras y/o para diferentes sondas con la misma muestra, permiten por ejemplo, la transcripción diferencial del ARN derivado de la muestra. En aún otra modalidad, los arreglos/trozos que contienen secuencias de nucleótidos de la invención pueden comprender secuencias de nucleótidos específicas para otros microorganismos, que permiten la prueba en serie y la rápida identificación de la presencia de un microorganismo en una muestra . En una modalidad adicional, el principio del arreglo/trozo de ADN también se puede usar para producir arreglos/trozos de proteína en los cuales se ha revestido el soporte con un polipéptido y/o un anticuerpo de esta invención, o arreglos del mismo, en lugar del ácido nucleico. Estos arreglos/trozos de proteína hacen posible, por ejemplo, analizar las interacciones biomoleculares inducidas por la captura por afinidad de objetivos en un soporte revestido, por ejemplo, con proteínas, o resonancia de plasma superficial (SPR) . Los polipéptidos o anticuerpos de esta invención, capaces de unirse específicamente a anticuerpos o polipéptidos derivados de la muestra que se va a analizar, se pueden usar en arreglos/trozos de proteína para la detección y/o identificación de proteínas y/o péptidos en una muestra. De esta manera, la presente invención proporciona un microarreglo o microtrozo que comprende varios ácidos nucleicos de esta invención en cualquier combinación, incluyendo repeticiones, así como un microarreglo que comprende varios polipéptidos de esta invención en cualquier combinación, incluyendo repeticiones. También se proporciona un microarreglo que comprende uno o más anticuerpos que reaccionan específicamente con varios polipéptidos de esta invención, en cualquier combinación, incluyendo repeticiones. Por "molécula de ácido nucleico" se proponen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de ADN o ARN generados usando análogos en nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de hebra individual o de doble hebra, pero de manera preferente es ADN de doble hebra. Un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR puede codificar para un fragmento de proteína que es biológicamente activo, o se puede usar como una sonda de hibridación o cebador de PCR como se describe más adelante. Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido descrito en la presente se puede preparar al aislar una porción de una de las secuencias de nucleótidos de la invención, que expresa la porción codificada de la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR (por ejemplo, por expresión recombinante in vi tro) , y valorar la actividad de la porción codificada de la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. Los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 nucleótidos o hasta el número total de nucleótidos presentes en la secuencia de nucleótidos de longitud completa relacionada a AI-2 o relacionada a AAR como se describe en la presente (por ejemplo, 693 para SEQ ID NO: 1 , 942 para SEQ ID NO: 3, 1116 para SEQ ID NO: 13, 471 para SEQ ID NO: 15, etc. ) . Los fragmentos de secuencias de aminoácidos incluyen fragmentos de polipéptidos adecuados para el uso como inmunógenos para formular anticuerpos contra polipéptidos comprendidos en la producción de AI-2 o en la AAR. Los fragmentos incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR, o proteína de longitud parcial, de la invención y que exhiben al menos una actividad de una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR, pero que incluyen menos aminoácidos que las proteínas de longitud completa relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR descritas en la presente. En una modalidad, los fragmentos pueden incluir polipéptidos que son biológicamente activos. Una porción biológicamente activa de un polipéptido es una que exhibe al menos una actividad (por ejemplo, una actividad asociada con la producción de AI-2 o la AAR) de la proteína de longitud completa de la invención. Una porción biológicamente activa es la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR puede ser un polipéptido que es, por ejemplo, de 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 aminoácidos contiguos de longitud, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína de longitud completa relacionada a AI-2 o relacionada a AAR de la presente invención (por ejemplo, 231 para SEQ ID NO: 2, 314 para SEQ ID NO: 4, 372 para SEQ ID NO: 14, 157 para SEQ ID NO: 16, etc.). Estas porciones biológicamente activas se pueden preparar por técnicas recombinantes y se evalúan para una o más de las actividades funcionales de una proteína nativa relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. Como se usa en la presente, un fragmento comprende al menos 5 aminoácidos contiguos de un SEQ ID Nos: 2-22, 34, 36 ó 38. La invención abarca otros fragmentos, sin embargo, tal como cualquier fragmento de la proteína mayor de 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 o mayor de 500 aminoácidos. Las secuencias relacionadas a AAR de la invención comprenden un SEQ ID NO: 19 y 20 que codifican para una proteína de unión a fibronectina; SEQ ID NO: 33, 34, 35 y 36 que codifica para proteínas comprendidas en la producción de exopolisacáridos ; y SEQ ID NO: 37 y 38 que codifica para una proteína comprendida en la esterificación de D-alanina de ácido lipoteicoico y ácido teicoico de barrera. En modalidades específicas, una variante o fragmento biológicamente activa de SEQ ID NO: 19 ó 20 continuará teniendo actividad de unión a la mucosa intestinal, incluyendo unión a fibronectina, mucina o moléculas de la matriz extracelular. Se conocen los métodos valorar esta actividad. Por ejemplo, se puede valorar la actividad de unión a fibronectina de la variante usando microesferas fluorescentes revestidas con FN-120, que es un fragmento quimiotríptico de unión a células de la fibronectina de plasma. Ver, por ejemplo Schultz y Armant (1995) J. Biol . Chem . 270 ( 19) : 11522-31. Una variante o fragmento biológicamente activo de SEQ ID NO: 33, 34, 35 ó 36 continuará estando comprendido en la producción de exopolisacáridos. La producción de exopolisacáridos se puede estimar por el método cuantitativo de fenol/ácido sulfúrico descrito en Mozi, et al. (2001) J. Appl . Mi crobiol . 91 ( 1 ): 160-167. Una variante o fragmento biológicamente activo de SEQ ID NO: 37 ó 38 continuará estando comprendido en la D-alanación de ácido lipotecoico en bacterias. Se puede medir la captación de D-alanina de acuerdo a los métodos descritos por O'Brien, et al., (1995) Mi crobios 83 (335) .-119-137. Otras secuencias relacionadas a AAR de la invención comprenden enzimas comprendidas en la producción de AI-2, incluyendo SEQ ID Nos: 1 y 2, que codifican para un nucleosido-fosforilasa (pfs ) ; SEQ ID Nos: 3 y 4, que codifican para una metil-transferasa dependiente de SAM (SAM-MT) ; SEQ ID Nos: 13 y 14, que codifican para una metionina-adenosiltransfesara (metE) ; SEQ ID Nos: 15 y 16, que codifican para una S-ribosilhomocisteinasa (luxS); y SEQ ID Nos: 21 y 22, que codifican para una metionina-adenosiltransferasa (metK) . En modalidades específicas, una variante o fragmento biológicamente activo de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 , 13, 14, 15, 16, 21, ó 22 continuará teniendo la actividad enzimática citada anteriormente, respectivamente. Se conocen los métodos para valorar la actividad para cada una de estas enzimas. Por ejemplo, se puede medir la actividad de metK al cuantificar la producción de S-adenosiltransferasa usando cromatografía líquida de alto desempeño de acuerdo a los métodos descritos en Posnick y Samson (1999) J. Ba cteria l . 181 (21 ): 6756-6762. La actividad donadora de metilo de SAM-MT se puede valorar de acuerdo a los métodos de Borchardt et al. (1974) J. Med. Chem . 19 (9) : 1104-1110. Se puede medir la actividad de MTA/SAH-nucleosido al seguir la conversión de 1C-metiltioadenosina a 14C-metiltioribosa, como se describe por Della-Ragione et al., (1995) Biochem . J. 232:335-341 y Cornell et al. (1996) Biochem . J. 317:285-290. La actividad de MetE se puede medir de acuerdo al ensayo descrito por Hondorp y Matthews (2004) PLoS Biol . 2(11) :e336. La actividad de LuxS se puede medir usando el ensayo indicador de Vibrio harveyi como se describe en otra parte de la presente. Las variantes de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se abarcan en la presente invención. Por "variante" se propone una secuencia suficientemente idéntica. Por consiguiente, la invención abarca moléculas aisladas de ácido nucleico que son suficientemente idénticas a las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR en a un SEQ ID Nos: 2-22, 34, 36 ó 38 o moléculas de ácido nucleico que hibridan a una molécula de acido nucleico de las SEQ ID Nos: 1-21, 33, 35 o 37 impares o un complemento de las mismas, bajo condiciones severas. Las variantes también incluyen polipéptidos variantes codificados por las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Además, los polipéptidos de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que es suficientemente idéntica a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID Nos: 2-22, 34, 36 ó 38 pares. Por "suficientemente idéntica" se propone una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que contiene un número mínimo suficiente de residuos y equivalentes o idénticos de aminoácidos, o nucleótidos, en comparación a una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, proporcionando de esta manera un dominio estructural común y/o indicando una actividad funcional común. Las variantes conservadoras incluyen aquellas secuencias de nucleótidos que difieren debido a la degeneración del código genético. En general, las secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente 45 %, 55 % ó 65 % de identidad, al menos aproximadamente 70 ó 75 % de identidad, al menos aproximadamente 80 %, 85 % ó 95 %, al menos aproximadamente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ó 99.5 % de identidad de secuencia a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 2-22, 34, 36 ó 38 pares, o cualquiera de las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOS: 1-21, 33, 35 ó 37 impares, reepectivamente , se definen en la presente como suficientemente idénticas. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir retienen la actividad biológica deseada de la proteína nativa. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de esa proteína por tan poco como 1-15 residuos de aminoácido, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tampoco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún un residuo de aminoácido . Las variantes que se presentan de forma natural pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población de bacterias de ácido láctico) . Estas variantes se pueden identificar al usar técnicas bien conocidas de biología molecular, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , e hibridación como se describe más adelante. Las secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas, por ejemplo, secuencias generadas por mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR que codifican aún para una proteína relacionada a AI-2 ó AAR, también se incluyen como variantes. Se pueden introducir una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos o aminoácidos en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos descritos en la presente, tal que las sustituciones, adiciones o supresiones se introduzcan en la proteína codificada. Las adiciones (inserciones) o supresiones (truncamientos) se pueden hacer en el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína nativa, o en uno o más sitios en la proteína nativa. De manera similar, se puede hacer una sustitución de uno o más nucleótidos o aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos previstos, preferentemente no esenciales. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia tipo silvestre de una proteína sin alterar la actividad biológica, en tanto que un aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácidos se reemplaza por un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. Se conocen en la técnica familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Estas sustituciones no serán de residuos conservados de aminoácido, o para residuos de aminoácido que residen dentro de un motivo conservado, donde estos residuos son esenciales para la actividad de la proteína. De manera alternativa, se pueden hacer mutaciones aleatoriamente junto con toda o parte de la longitud de la secuencia de codificación relacionada a AI-2 ó relacionada a AAR, tal como por mutagénesis de saturación. Los mutantes se pueden expresar de manera recombinante, y detectar para aquellas que retienen actividad biológica al valorar para la actividad protectora relacionada a AI-2 o relacionada a AAR usando técnicas normales de ensayo. Se conocen en la técnica los métodos para la mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati . Acad. Scí . USA 82-488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol . Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y referencias citadas en los mismos. Las mutaciones hechas en el ADN que codifica para la variante no deben interrumpir el cuadro de lectura y de manera preferente no crearán regiones complementarias que pueden producir estructuras secundaria de ARNm. Ver, Publicación de Solicitud de Patente EP No. 75,444. La guía con respecto a las sustituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado en la presente como referencia. Las supresiones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteína abarcadas en la presente no se espera que produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, donde es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción por adelantado de hacerlo, un experto en la técnica apreciará que el efecto se evaluará por ensayos de detección de rutina. Es decir, la actividad se puede evaluar al comparar la actividad de la secuencia modificada con la actividad de la secuencia original. Por ejemplo, la actividad de variantes y fragmentos de polipéptidos comprendidos de la producción de AI -2 o en la AAR se puede medir al valorar para la producción de AI-2 usando métodos descritos en otra parte de la presente. Las secuencias variantes de nucleótidos y de aminoácidos de la presente invención también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tal como transposición de ADN. Con este procedimiento, una o más regiones diferentes de codificación de proteína relacionada a AI -2 ó relacionada a AAR se pueden usar para crear una nueva proteína relacionada a AI -2 o relacionada a AAR que posee las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionados que comprenden regiones de secuencia que tienen identidad secuencial de secuencia y se pueden recombinar de manera homologa, in vi tro o in vi vo . Por ejemplo, usando este planteamiento, los motivos de secuencia que codifican para un dominio de interés se pueden trasponer entre el gen relacionado a AI-1 o relacionado a AAR de la invención y otros genes conocidos relacionados a AI-2 o relacionados a AAR para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como una K,. incrementada en el caso de una encima. Se conocen en la técnica estrategias para esta transposición de ADN. Ver por ejemplo Stemmer (1994) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al . (1997) Nature Biotech . 15:436-438; Moore et al . (1997) J. Mol . Biol . 272:336-347 ; Zhang et al . (1997) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 94:4504-4509; Crameri et al . (1998) Nature 391:288-291; y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,605,793 y 5,837,458. Las variantes de la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR de la invención se pueden identificar al detectar bibliotecas de combinación y mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de una proteína relacionada a AI-2 ó relacionada a AAR. En una modalidad, una biblioteca diversificada de variantes relacionadas a AI-2 y relacionadas a AAR se genera por mutagénesis de combinación a nivel de ácido nucleico y se codifica por una biblioteca génica diversificada. Una biblioteca diversificada de las variantes relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR se puede producir por ejemplo al ligar enzimáticamente un mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias génicas tal que sea expresable un conjunto degenerado de potencial de secuencias relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR como polipéptidos individuales, o de manera alternativa, como un conjunto de proteínas más grandes de fusión (por ejemplo, para visualización en fago) que contiene en el mismo el conjunto de secuencias relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR. Hay una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de variantes potenciales relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. Se puede realizar síntesis química de una secuencia génica degenerada en un sintetizador automático de ADN, y el gen sintético entonces se liga en el vector apropiado de expresión. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la provisión, de una mezcla, de todas las secuencias que codifican para el conjunto deseado de secuencias potenciales relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR. Se conocen en la técnica los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados (ver, por ejemplo Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al . (1984) Annu . Rev Biochem. 53:323; Itakura et al . (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res . 11:477). Además, las bibliotecas de fragmentos de una secuencia de codificación de proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR se pueden usar para generar una población diversificada de fragmentos relacionados a AI-2 o relacionada a AAR para detectar y para la selección subsiguiente de variantes de una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. En una modalidad, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencia de codificación al tratar un fragmento de PCR de doble hebra de una secuencia de codificación relacionada a AI -2 o relacionada a AAR con una nucleasa bajo condiciones en donde se presenta la mella solo aproximadamente una vez por molécula al desnaturalizar el ADN de doble hebra, al renaturalizar el ADN para formar ADN de doble hebra que puede incluir pares homosentido/antisentido de diferentes productos mellados, al remover las porciones de hebra individual de los dúplex reformados por tratamiento con nucleasa Sl y al ligar la biblioteca resultante de fragmentos en un vector de expresión. Por este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica para los fragmentos N-terminales e internos de varios tamaños de la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. Se conocen en la técnica varias técnicas para detectar productos génicos de bibliotecas de combinación hechas por mutaciones por punto o truncamiento o para detectar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Estas técnicas son adaptables para la detección rápida de las bibliotecas génicas generadas por las mutagénesis de combinación de las proteínas relacionadas a AI -2 o relacionadas a AAR. Las técnicas más ampliamente usadas, que son tratables a análisis de alto rendimiento, para detectar bibliotecas génicas grandes incluyen típicamente clonar la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresar los genes de combinación bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica para el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de conjunto recursivo (REM), una técnica que mejora la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación por los ensayos de detección para identificar variantes relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89:7811-7815; Delgrave et al . (1993) Protein Engineering 6(3) :327-331) . ii. Identidad de Secuencia Las secuencias relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR son miembros de una familia de moléculas con características funcionales conservadas. Por "familia" se propone una o más familias o moléculas de ácido nucleico que tienen suficiente identidad de secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos. Una familia que contiene grupos profundamente divergentes se puede dividir en subfamilias. Un clan es un grupo de familias que se piensa que se tienen un ancestro común. Los miembros de un clan tienen frecuentemente una estructura terciaria similar. Por "identidad de secuencia" se propone el nucleótido o residuos de aminoácido que son los mismos cuando se alinean dos secuencias para correspondencia máxima sobre al menos una ventana de comparación especificada. Por "ventana de comparación" se propone un segmento contiguo de las dos secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos para alineación óptima, en donde la segunda secuencia puede contener adiciones o supresiones (es decir, operaciones) en comparación a la primera secuencia. En general, para alineaciones de ácidos nucleicos, la ventana de comparación es al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga. Para alineaciones de la secuencia de aminoácidos, la ventana de comparación es al menos 6 aminoácidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 10, 15, 20, 30 o más larga. Aquellos expertos en la técnica entienden que para evitar una alta similitud debido a la inclusión de separaciones, se introduce típicamente una penalidad de separación y se sustrae del número de correspondencias. Los miembros de la familia pueden ser de la misma o diferente especie, y puede incluir homólogos, así como proteínas distintas. Frecuentemente, los miembros de una familia presentan características funcionales comunes. Se pueden aislar homólogos en base a su identidad a las secuencias de ácido nucleico relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR descritas en la presente usando el ADNc, o una porción del mismo, como una sonda de hibridación de acuerdo a técnicas normales de hibridación bajo condiciones de hibridación severa como se describe más adelante. Para determinar el por ciento de identidad de las dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos, se realiza una alineación. El por ciento de identidad de las dos secuencias es una función del número de residuos idénticos compartidos por las dos secuencias en la ventana de comparación (es decir, por ciento de identidad = número de residuos idénticos/número total de residuos x 100) . En una modalidad, las secuencias son de la misma longitud. Se pueden usar métodos similares a aquellos descritos más adelante para determinar el por ciento de identidad entre dos secuencias. Los métodos se pueden usar con o sin permisibilidad de separaciones. También se puede realizar la alineación manualmente por inspección. Cuando las secuencias de aminoácidos difieren en las sustituciones conservadoras, el por ciento de identidad se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Medios para hacer este ajuste se conocen en la técnica. Típicamente, la sustitución conservadora se clasifica como una parcial, en lugar de una mala correspondencia completa, incrementando de este modo el porcentaje de identidad de secuencia. Se pueden usar algoritmos matemáticos para determinar el por ciento de identidad de dos secuencias. Los ejemplos no limitantes de algoritmos matemáticos son el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 90:5873-5877; el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith et al . (1981) Adv. Appl . Math . 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wansch (1970) J. Mol . Biol . 48:443-453; y el método de alineación de búsqueda local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 85:2444-2448.

Se han designado varias implementaciones de computadora en base a estos algoritmos matemáticos para permitir la determinación de la identidad de secuencia. Los programas BLAST de Altschul et al . (1990) J. Mol . Biol . 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra . Las búsquedas para obtener secuencias de nucleótidos que son homologas a las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden usar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. Para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las secuencias que codifican para una proteína o polipéptido de la presente invención, se puede usar el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3. Las alineaciones separadas se pueden obtener al usar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al . (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389. Para detectar relaciones distantes entre moléculas, se puede usar PSI-BLAST. Ver Altschul et al . (1997) supra . Para todos los programas BLAST, los parámetros por defecto de los programas respectivos se pueden usar. Ver www . ncbi . nlm . nih . gov . También se puede realizar manualmente por inspección la alineación. Otro programa que se puede usar para determinar el por ciento de identidad de secuencia es el programa ALIGN (versión 2.0), que usa el algoritmo matemático de Myers y Miller (1988) supra . Una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de separación de dosis, y una penalidad de separación de 4 se pueden usar con este programa cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Además de los programas ALIGN y BLAST, los programas BESTFIT, GAP, FASTA y TFASTA son parte del paquete de Software GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Rd. , San Diego, California, EUA) , y se puede usar para realizar alineaciones de secuencia. El programa preferido es GAP versión 10, que usó el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) supra . A menos que se señale de otro modo, los valores de similitud de identidad de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido usando GAP Versión 10 con los siguientes parámetros: el % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando Peso de GAP de 50 y Peso de Longitud de 3 y la matriz de puntuación de nwsgapdna. cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando Peso de GAP de 8 y Peso de Longitud de 2 y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente . Por "programa equivalente" se propone cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera una alineación que tiene correspondencias idénticas de residuos de aminoácido o de nucleótidos y un por ciento idéntico de identidad de secuencia en comparación a la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.

La alineación de una secuencia de una base de datos a una secuencia consultada producida por BLASTN, FASTA, BLASTP o algoritmo similar se describe comúnmente como un "acierto" . Los aciertos a una o más secuencias de base de datos por una secuencia consultada producida por BLASTN, FASTA, BLASTP o algoritmo similar, alinean e identifican porciones similares de una secuencia. Un acierto a una secuencia de base de datos representa en general un traslape sobre una fracción de la longitud de secuencia de la secuencia consultada, es decir, una porción o fragmento de la secuencia consultada. Sin embargo, el traslape puede representar la longitud completa de la secuencia consultada. Los aciertos en una alineación a una secuencia consultada producida por los algoritmos BLASTN, FASTA o BLASTP a las secuencias en una base de datos se arreglan comúnmente en el orden del grado de similitud y la longitud del traslape de secuencia . Los aciertos de polinucleótidos y polipéptidos alineados por los algoritmos BLASTN, FASTA o BLASTP a una secuencia consultada producen valores de "Anticipar" . El valor de Anticipar (valor E) indica el número de aciertos que puede "anticipar" verse sobre un cierto número de secuencias contiguas al azar cuando se busca una base de datos de un cierto tamaño. El valor de anticipar se usa como un umbral de significado para determinar si el acierto a una base de datos, tal como la base de datos GE^A ^ o EMBL, indica la similitud real. Por ejemplo, un valor E de 0.1 asignado a un acierto de polinucleótido se interpreta como que significa que en una base de datos en tamaño de la base de datos GENBANK8 se puede anticipar ver 0.1 correspondencias sobre la porción alineada de la secuencia con una puntuación similar al azar. Por este criterio, las porciones alineadas y correspondidas de las secuencias de polinucleótido entonces tienen una probabilidad de 95 % de ser las mismas. Para secuencias que tienen un valor E de 0.01 o menor sobre porciones alineadas o correspondidas, la probabilidad de encontrar una correspondencia al azar en la base de datos GENBANKMR es de 1 % menos, usando el algoritmo BLASTN o FASTA. De acuerdo a una modalidad de esta invención los polinucleótidos o polipéptidos "variantes" de esta invención, comprenden secuencias que producen un valor E de aproximadamente 0.01 o menos en comparación a las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención. Es decir, un polinucleótido o polipéptido variante es cualquier secuencia que tenga al menos una probabilidad de 99 % de ser la misma como el polinucleótido o polipéptido de la presente invención, medido como que tiene un valor de E de 0.01 o menos usando los algoritmos BLASTN, FASTA o BLASTP ajustados a los parámetros descritos en la presente. En otras modalidades, un polinucleótido variante es una secuencia que tiene el mismo número de, o menos ácidos nucleicos que un polinucleótido de la presente invención que tiene al menos una probabilidad de 99 % de ser la misma como el polinucleótido de la presente invención, medido como que tiene un valor E de 0.01 o menos usando los algoritmos BLASTN o FASTA ajustados a los parámetros descritos en la presente. De manera similar, un polipéptido variante es una secuencia que tiene el mismo número de, o menos aminoácidos que un polipéptido de la presente invención que tiene al menos una probabilidad de 99 % de ser la misma como un polipéptido de la presente invención, medida como que tiene un valor de 0.01 o menos usando el algoritmo BLASTP ajustado a los parámetros descritos en la presente. Como se señala anteriormente, el por ciento de identidad se determina al alinear secuencias usando uno de los algoritmos BLASTN, FASTA, o BLASTP, ajustados en los parámetros de corrida descritos en la presente, y al identificar el número de ácidos nucleicos o aminoácidos idénticos sobre las porciones alineadas; al dividir el número de ácidos nucleicos o aminoácidos idénticos por el número total de ácidos nucleicos o aminoácidos de la secuencia de polinucleótido o polipéptido de la presente invención; y luego al multiplicar por 100 para determinar el por ciento de identidad. Por ejemplo, un polinucleótido de la presente invención que tiene 220 ácidos nucleicos tienen acierto a una secuencia de polinucleótido en la base de datos GENBANKMR que tiene 520 ácidos nucleicos sobre un tramo de 23 nucleótidos en la alineación producida por el algoritmo BLASTN usando los parámetros descritos en la presente. El acierto de 23 nucleótidos incluye 21 nucleótidos idénticos, una separación y un nucleótido diferente. El por ciento de identidad del polinucleótido de la presente invención al acierto en la biblioteca GENBANKMR de esta manera es 21/220 veces 100, ó 9.5 %. La secuencia de polinucleótido en la base de datos GENBANKMR de esta manera no es una variante de un polinucleótido de la presente invención. iii. Identificación y Aislamiento de Secuencias Homologas Las secuencias de nucleótidos relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR identificadas en base a su identidad de secuencia a las secuencias de nucleótidos relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR expuestas en la presente o a fragmentos y variantes de los mismos se abarcan por la presente invención. Los métodos tal como PCR o hibridación se pueden usar para identificar secuencias de un ADNc de la biblioteca genómica, por ejemplo, que son sustancialmente idénticas a una secuencia de esta invención. Ver, por ejemplo, Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) y Innis, et al . (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applica tions (Academic Press, New York) . Se conocen en general en la técnica métodos para construcción de este ADNc y bibliotecas genómicas y también se describen en la referencia anterior. En las técnicas de hibridación, las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, o pueden consistir de toda o una parte de una secuencia conocida de nucleótidos descrita en la presente. Además, se pueden marcar con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor enzimático. Se pueden hacer sondas para hibridación al marcar oligonucleótidos sintéticos, en base a las secuencias conocidas de nucleótidos relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR descritas en la presente. Los cebadores degenerados diseñados en base a los nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en una secuencia conocida de nucleótidos relacionada a AI-2 o relacionada a AAR o secuencia codificada de aminoácidos se pueden usar de manera adicional. La zona de hibridación comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que hibridan bajo condiciones severas a al menos aproximadamente 10, de manera preferente aproximadamente 20, de manera más preferente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 350 ó 400 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos relacionada a AI-2 o relacionada a AAR de la invención o un fragmento variante de la misma. Para lograr hibridación específica bajo una variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de proteína relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación se conocen en general en la técnica y se describen en Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), incorporada en la presente como referencia. En una modalidad, la secuencia completa de nucleótidos que codifica para una proteína relacionada a AI-2 o relacionadas AAR se usa como una sonda para identificar nueva secuencia relacionada a AI -2 o relacionadas a AAR y ARN mensajeros. En otra modalidad, la sonda es un fragmento de una secuencia de nucleótidos descrita en la presente. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones severas a la sonda pueden ser al menos aproximadamente 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1500 o más nucleótidos de longitud. Por consiguiente, además de las secuencias de nucleótidos relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR descritas en la presente, y fragmentos y variantes de las mismas, las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención también abarcan moléculas homologas de ADN identificadas y aisladas de otros organismos o células por hibridación consecuencias completas o parciales obtenidas de las secuencias de nucleótidos relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR descritas en la presente, o variantes y fragmentos de las mismas . Las secuencias sustancialmente idénticas se hibridarán entre sí bajo condiciones severas. Por "condiciones severas" se proponen condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo a un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, al menos dos veces con respecto al fondo) . En general, las condiciones severas abarcan aquellas condiciones para hibridación y lavado bajo las cuales los nucleótidos que tienen al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 % o al menos 75 % de identidad de secuencia permanecerán típicamente hibridadas entre sí. Las condiciones severas se conocen en la técnica y se pueden encontrar en Ausubel et al . , eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York) . La hibridación se presenta típicamente durante menos de aproximadamente 24 horas, usualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y diferirán en diferentes circunstancias. Se pueden usar secuencias de ácido nucleico parciales o de longitud completa para obtener homólogos y ortólogos abarcados por la presente invención. Por "ortólogo" se proponen genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como resultado de la evolución de las especies. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias codificadas de proteína comparten identidad sustancial como se define en la otra parte de la presente. Las funciones de los ortólogos frecuentemente están altamente conservadas entre las especies. Cuando se usan sondas, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menos de aproximadamente 1.5 M de ion Na, típicamente concentración de ion de Na de aproximadamente 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos) . Los lavados de post-hibridación son instrumentales en el control de la especificidad. Los dos factores críticos son concentración iónica y temperatura de la solución final de lavado. Para la detección de secuencias que hibridan a una secuencia objetivo de longitud completa o aproximadamente longitud completa, a temperatura bajo condiciones severas se selecciona para que sea aproximadamente 5°C menor que la temperatura de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica o una concentración iónica definida y pH definido. Sin embargo, las condiciones severas abarcarán temperaturas en el intervalo de 1°C a 20°C menor que la Tm, dependiendo del grado deseado de severidad como se califica de otro modo en la presente. Para híbridos de ADN-ADN, la Tm se puede determinar usando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal . Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (logM) + 0.41 (% GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de los nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud de híbrido en pares de base. La Tm es la temperatura (bajo concentración iónica y pH definido) a la cual 50 % de una secuencia objetivo complementaria hibrida a una sonda perfectamente correspondida. La capacidad para detectar secuencias con grados variables de homología se puede obtener al variar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado. Para secuencias objetivo que son 100 % idénticas (sondeo homólogo) , se deben obtener condiciones de severidad que no permitan la mala correspondencia. Al permitir que se presente la mala correspondencia de los residuos de nucleótidos, las secuencias con un menor grado de similitud se pueden detectar (sondeo heterólogo) . Por cada 1 % de mala correspondencia, la Tm se reduce a aproximadamente 1°C; por lo tanto, las condiciones de lavado y/o hibridación se pueden manipular para permitir la hibridación de secuencias de un porcentaje objetivo de identidad. Por ejemplo, si se prefieren secuencias con = 95 % de identidad de secuencia, la Tm se puede disminuir por 10°C. Dos secuencias de nucleótidos pueden ser sustancialmente idénticas, pero fallan en hibridarce entre sí bajo condiciones severas, si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esta situación puede surgir, por ejemplo, si la degeneración máxima de codones del código genético se usa para crear una copia de un ácido nucleico. Las condiciones de baja severidad de ejemplo incluyen hibridación por una solución de amortiguador de 30-35 % de formamida, NaCl 1M, 1 % de SDS (dodecilsulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato trisódico 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderada de ejemplo incluyen hibridación en formamida al 40 a 45 %, NaCl 1.0 M, 1 % de SDS a 37 °C, y un lavado en 0.5 X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad de ejemplo incluyen hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1M, SDS al l % a 37°C, y un lavado en 0.1 X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, los amortiguadores de lavado comprenden aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación en general es menor de aproximadamente 24 horas, usualmente de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 12 horas . Una guía extensa a la hibridación de ácido nucleico se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridiza tion wi th Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al . , eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . Ver Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning : A Labora tory Manual (2d ed. ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . En un planteamiento de PCR, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótido para el uso en reacciones de PCR para amplificar las secuencias correspondientes de ADN a partir del ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los cebadores de PCR son de manera preferente de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y de manera más preferente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En general se conocen en la técnica métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación de PCR y se describen en Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . Ver también Innis, et al . , eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Stra tegies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) . Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no se limitan a, métodos usando cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos del vector, cebadores parcialmente mal correspondidos, y similares. iv. Secuencias de Nucleótido Antisentido La presente invención también abarca moléculas de ácido nucleico antisentido, es decir, moléculas que son complementarias a un ácido nucleico ho osentido que codifica para una proteína, por ejemplo, complementaria a la hebra de codificación de una molécula de ADNc de doble hebra, o complementaria a una secuencia de ARNm. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede ser enlace de hidrógeno a un ácido nucleico homosentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra completa de codificación relacionada a AI-2 o relacionada a AAR, o solo a una porción de la misma, por ejemplo toda o parte de la región de codificación de proteína (o cuadro de lectura abierta) . Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a una región de no codificación de la hebra de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. Las regiones no codificantes son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante y no se traducen en aminoácidos. Las secuencias antisentido de nucleótidos son útiles al interrumpir la expresión del gen objetivo. Se pueden usar construcciones antisentido que tienen 70 %, 80 % ú 85 % de identidad de secuencia a la secuencia correspondiente. Dada la secuencia de hebra codificante que codifica a una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR y relacionada descrita en la presente (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1-21, 33, 35 ó 37 impares), los ácidos nucleicos antisentido de la invención se pueden diseñar de acuerdo a las reglas de apareamiento de bases Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante completa del ARNm relacionado a AI-2 o relacionada a AAR, pero de manera más preferente es un oligonucléotido que es antisentido a solo una porción de la región codificante o no codificante del ARNm relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud, o puede ser de 100, 200 nucleótidos o mayor de longitud. El ácido nucleico antisentido de la invención se puede construir usando procedimientos de síntesis química y ligación enzimática conocidos en la técnica. Una molécula de ácido nucleico antisentido de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico a-anomérica (Gaultier et al . (1987) Nucleic Acids Res. La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2 ' -o-metilribonucleótido (Inoue et al . (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al . (1987) FEBS Lett . 215:327-330). La invención también abarca ribozimas, que son moléculas de ARN catalíticas con actividad de robonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico de hebra individual, tal como un ARNm, al cual tienen una región complementaria. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico que forman estructuras helicoidales triples. Ver, en general Helene (1991) Anticancer Drug Des 6(6):569; Helene (1992) Ann . N. Y. Acad. Sci . 660:27; y Maher (1992) Bioassays 14(12): 807. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden modificar en la porción base, porción de azúcar, o estructura de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad de la molécula. Como se usa en la presente, los términos "ácidos nucleicos de péptidos" o "P?A" se refiere a imitadores de ácido nucleico, por ejemplo, imitadores de AD?, en los cuales la estructura deoxiribosa-fosfato se reemplaza por una estructura de pseudopéptido y solo se retienen las cuatro nucleobases naturales. La estructura neutral de los PNA se ha mostrado que permite la hibridación específica a ADN y ARN bajo condiciones de baja concentración iónica. La síntesis de oligómeros de PNA se puede realizar usando protocolos normales de síntesis de péptidos en fase sólida como se describe, por ejemplo en Hyrup et al . (1996) supra; Perry-O'Keefe et al . (1996) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 93 :14670. En otra modalidad, los PNA de una molécula relacionada a AI-2 o relacionada a AAR se pueden modificar, por ejemplo, para mejorar su estabilidad, especificidad, o captación celular, al unir grupos auxiliares lipófilos u otros al PNA, por la formación de quimeras PNA-ADN, o por el uso de liposomas u otras técnicas de distribución de fármacos conocidas en la técnica. La síntesis de quimeras de PNA-ADN se puede realizar como se describe en Hyrup (1996) supra ; Finn et al . (1996) Nucleic Acids Res . 24 (17) : 3557-63 ; Mag et al . (1989) Nucleic Acids Res . 17:5973; y Peterson et al . (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett . 5:1119. v. Proteínas de Fusión La invención también incluye proteínas quiméricas o de fusión relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR. Una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" relacionada a AI-2 o relacionada a AAR comprende un polipéptido relacionado a AI-2 o relacionado a AAR enlazado operablemente a un polipéptido no relacionado a AI-2 o no relacionado a AAR. Un "polipéptido relacionado a AI-2" o "relacionado a AAR" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a un polipéptido que está comprendido en la producción de AI-2 o el AAR, en donde un "polipéptido no relacionado a AI-2" o "no relacionado a AAR" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente idéntica a un polipéptido que está comprendido en la producción de AI-2 o AAR, y que se deriva del mismo o diferente organismo. Dentro de una proteína de fusión relacionada a AI-2 o relacionada a AAR, el polipéptido relacionado a AI-2 o relacionado a AAR puede corresponder a toda o una porción de una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR, que incluye de manera preferente al menos una porción biológicamente activa de una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. Dentro de la proteína de fusión, el término "operablemente enlazado" se propone que indique q e el polipéptido relacionado a AI-2 o relacionado a AAR y el polipéptido no relacionado a AI-2 o no relacionado a AAR se fusionan en cuadro entre sí. El polipéptido no relacionado a AI-2 o no relacionado a AAR se puede fusionar al N-término o C-término del polipéptido relacionado a AI-2 o relacionado a AAR.

La expresión de las secuencias codificantes enlazadas da por resultado dos secuencias heterólogas enlazadas de aminoácidos que forman la proteína de fusión. La secuencia portadora (el polipéptido no relacionado a AI-2 o no relacionado a AAR) puede codificar para un polipéptido portador que potencia o incrementa la expresión de la proteína de fusión en el hospedador bacteriano. La porción de la proteína de fusión codificada por la secuencia portadora, es decir, el polipéptido portador, puede ser un fragmento de proteína, una porción funcional completa, o una secuencia de proteína completa. La región o polipéptido portador se puede diseñar adicionalmente para ser usado en la purificación de la proteína de fusión, ya sea con anticuerpos o con purificación por afinidad específica para ese polipéptido portador. Igualmente, se puede aprovechar las propiedades físicas del polipéptido portador para permitir la purificación selectiva de la proteína de fusión. Los polipéptidos portadores particulares de interés incluyen superóxido-dismutasa (SOD) , proteína de unión a maltosa (MBP) , glutationa-S- transferasa (GST) , una marca de histidina N-terminal (His) y similares. Esta lista no se propone que sea limitante, puesto que se puede usar, en los métodos de la invención, cualquier polipéptido portador que potencia la expresión de la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR como una proteína de fusión.

En una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión relacionada a AI-2 o relacionada a AAR -GST en la cual las secuencias relacionadas a AI -2 o relacionadas a AAR se fusionan al C-término de las secuencias de GST. En otra modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión de inmunoglobulina relacionada a AI-2 o relacionada a AAR en la cual toda o parte de una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR se fusiona a secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR de la invención se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos anti-relacionados a AI-2 o anti-relacionados a AAR en un sujeto, para purificar ligandos relacionados a AI-2 o relacionados a AAR, y en ensayos de detección para identificar moléculas que inhiben la interacción de una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR con un ligando relacionado a AI -2 o relacionado a AAR. Un experto en la técnica reconocerá que el polipéptido portador particular se elige con el esquema de purificación en mente. Por ejemplo, las marcas de His, GST, y la proteína de unión a maltosa representan polipéptidos portadores que tienen columnas de afinidad fácilmente disponibles a las cuales se pueden unir y eluir. De esta manera, donde el polipéptido o portador es una marca de His N-terminal como hexahistidina (marca His6) , la proteína de fusión relacionada a AI -2 o relacionada a AAR se puede purificar usando una matriz que comprende un metal-resina de quelación, por ejemplo, níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) , níquel-ácido iminodiacético (Ni-IDA) , y resina que contiene cobalto (Co-resina) . Ver, por ejemplo, Steinert et al . (1997) QIAGEN News 4:11-15, incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Cuando el polipéptido portador es GST, la proteína de fusión relacionada a AI-2 o relacionada a AAR se puede purificar usando una matriz que comprende cuentas de glutationa-agarosa (Sigma o Pharmacia Biotech) ; donde el polipéptido portador es una proteína de unión a maltosa (MBP) , la proteína de fusión relacionada a AI-2 o relacionada a AAR se pueden purificar usando una matriz que comprende una resina de agarosa derivatizada con amilasa . De manera preferente, se produce una proteína quimérica o de fusión de la invención por técnicas normales de ADN recombinante. Por ejemplo, se pueden ligar conjuntamente en cuadro fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptido, o se puede sintetizar el gen de fusión, tal como con sintetizadores automatizados de ADN. De manera alternativa, se puede llevar a cabo la amplificación por PCR de los fragmentos génicos usando cebadores de ancla que dan salientes complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos, que se fijan subsiguientemente y re-amplifican para generar una secuencia génica quimérica (ver, por ejemplo, Ausubel et al . , eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing and Wiley- Interscience, Nueva York) . Además se puede clonar un ácido quimérico de codificación relacionado a AI-2 o relacionado a AAR en un vector de expresión comercialmente disponible tal que se enlace en cuadro a una porción de fusión existente. El vector de expresión de la proteína de fusión se diseña típicamente para facilidad de remoción del polipéptido portador para permitir que la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR retenga la actividad biológica nativa asociada con el mismo. Se conocen en la técnica los métodos para la escisión de las proteínas de fusión. Ver, por ejemplo, Ausubel et al . , eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.) . La escisión química de la proteína de fusión se puede lograr con reactivos tal como bromuro de cianógeno, 2- (2-nitrofenilsulfenil) -3-metil-3 ' -bromoindolenina, hidroxilamina, o pH bajo. La escisión química frecuentemente se logra bajo condiciones desnaturalizantes para escindir de otro modo proteínas insolubles de fusión. Donde se desee la separación del polipéptido relacionado a AI-2 o relacionado a AAR del polipéptido portador y no se presente de forma natural un sitio de escisión en la unión entre estos polipéptidos fusionados, se puede diseñar la construcción de fusión para contener un sitio de escisión de proteasa específico para facilitar la escisión enzimática y la remoción del polipéptido portador. De esta manera, una secuencia ligadora que comprende una secuencia de codificación para un péptido que tiene un sitio de escisión específico para una enzima de interés se puede fusionar en cuadro entre la secuencia de codificación para el polipéptido portador (por ejemplo, MBP, GST, SOD, o una marca His N-terminal) y la secuencia de codificación para el polipéptido relacionado a AI-2 o relacionado a AAR. Las enzimas adecuadas que tienen especificidad para los sitios de escisión incluyen, pero no se limitan a, factor Xa, trombina, enterocinasa, remina, colagenasa, y proteasa de virus de grabación de tabaco (TEV) . Son bien conocidos en la técnica los sitios de escisión para estas enzimas. De esta manera, por ejemplo, donde el factor Xa se va a usar para escindir el polipéptido portador del polipéptido relacionado a AI-2 o relacionado a AAR, la construcción de fusión se puede diseñar para comprender una secuencia ligadora que codifique para un sitio de escisión sensible al factor Xa, por ejemplo, la secuencia IEGR (ver, por ejemplo, Nagai y Thogersen (1984) Nature 309:810-812, Nagai y Thogersen (1987) Meth . Enzymol . 153:461-481, y Pryor y Leiting (1997) Protein Expr . Purif. 10(3) : 309-319, incorporados en la presente como referencia) . Donde se va a usar trombina para escindir el polipéptido portador del polipéptido relacionado a AI-2 o relacionado a AAR, la construcción de fusión se puede diseñar para comprender una secuencia ligadora que codifica para un sitio de escisión sensible a trombina, por ejemplo, la secuencia LVPRGS o VIAGR (ver, por ejemplo, Pryor y Leiting (1979) Protein Expr. Purif. 10 (3) : 309-319, y Hong et al . (1997) Chin . Med. Sci . J. 12 (3) : 143-147, respectivamente, incorporados en la presente como referencia) . Se conocen en la técnica los sitios de escisión para TEV-proteasa. Ver, por ejemplo, los sitios de escisión descritos en la patente de los Estados Unidos número 5,532,142, incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Ver también el análisis en Ausubel et al . , eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.), Capítulo 16. vi. Anticuerpos Se puede usar un polipéptido aislado de la presente invención como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR, o para estimular la producción de anticuerpos contra los polipéptidos relacionados a AI-2 o relacionados a AAR in vivo. La proteína de longitud completa relacionada a AI-2 o relacionada a AAR se puede usar como un inmunógeno, o de manera alternativa, se pueden usar fragmentos de péptido antigénicos de las proteínas relacionadas a AI-2 o relacionada a AAR como se describe en la presente. El péptido antigénico de una proteína relacionada a AI -2 o relacionada a AAR comprende al menos 8, de manera preferente 10, 15, 20 ó 30 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en los SEQ ID NOS: 2-22, 34, 36 ó 38 pares y abarca un epítopo de una proteína relacionada a AI -2 o relacionada a AAR tal que un anticuerpo formulado contra el péptido forma un complejo inmunitario específico con la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. Los epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de una proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR que se localizan en la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas. vii. Ensayos Se describen ensayos de diagnóstico para detectar la expresión de los polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico descritas así como su actividad descrita en una muestra. Un método de ejemplo para detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico o proteína descrita que comprende el polipéptido descrito en una muestra comprende obtener una muestra de un producto de sangre/lechería/alimento, cultivo iniciador (madre, semilla, volumen/conjunto, concentrado, seco, liofilizado, congelado) , producto de alimento/lechería/alimentación cultivado, complemento dietético, fermentado de bioprocesamiento, o un sujeto que ha ingerido un material probiótico y poner en contacto la muestra con un compuesto o un agente capaz de detectar los polipéptidos o ácidos nucleicos descritos (por ejemplo, un ARNm o ADN genómico que comprende el ácido nucleico o fragmento descrito del mismo) tal que se detecte la presencia de la secuencia descrita en la muestra. Los resultados obtenidos con una muestra del alimento, complemento, cultivo, producto o sujeto se pueden comparar a los resultados obtenidos con una muestra de un cultivo, producto o sujeto de control. Un agente para detectar el ARNm o el ADN genómico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita es una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridar a la secuencia de nucleótidos descrita del ARNm o ADN genómico. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico descrita, tal como el ácido nucleico en las SEQ ID NOS: 1-21, 33, 35, 37 impares o una porción del mismo, tal como una molécula de ácido nucleico de al menos 15, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 o más nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente bajo condiciones severas al ARNm o ADN genómico que comprende la secuencia de ácido nucleico descrita. Se describen en la presente otras sondas adecuadas para el uso en los ensayos de diagnóstico de la invención. Un agente para detectar una proteína que comprende una secuencia de polipéptido descrita es un anticuerpo capaz de la unión al polipéptido descrito, de manera preferente un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o de manera más preferente, monoclonales. Se puede usar un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(abN)2). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, se propone que abarque marcación directa de la sonda o anticuerpo al acoplar (es decir, al enlazar físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como marcación indirecta de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivos que se marca directamente. Los ejemplos de marcación indirecta incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado y marcación terminal de una sonda de ADN con biotina tal que se pueda detectar con estreptavidina fluorescentemente marcada. El término "muestra" se propone que incluya tejidos, células y fluidos biológicos presentes en o aislados de un sujeto, así como células de cultivos iniciadores o productos alimenticios que tienen estos cultivos, o derivado del uso de estos cultivos. Es decir, el método de detección de la invención se puede usar para detectar ARNm, proteína o ADN genómico que comprende una secuencia descrita en una muestra tanto in vi tro como in vi vo. Las técnicas in vi tro para la detección de ARNm que comprenden una secuencia descrita incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in si tu . Las técnicas in vi tro para la detección de una proteína que comprende un polipéptido descrito incluyen ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzimas (ELISA) , transferencia Western, inmunoprecipitaciones, e inmunofluorescencia. Las técnicas in vi tro para detección de ADN genómico que comprenden las secuencias de nucleótidos descritas incluyen hibridaciones Southern. Adicionalmente, las técnicas in vi vo para detección de una proteína que comprende un polipéptido descrito incluyen introducción en un sujeto de un anticuerpo marcado contra el polipéptido descrito. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se pueda detectar por técnicas normales de formación de imágenes . En una modalidad, la muestra contiene moléculas de proteína de un sujeto de prueba que ha consumido un material probiótico. De manera alternativa, la muestra puede contener ARNm o ADN genómico de un cultivo iniciador. La invención también abarca equipos para detectar la presencia de ácidos nucleicos o proteínas descritos que comprenden polipéptidos descritos en una muestra. Estos equipos se pueden usar para determinar si está presente un microbio que expresa un polipéptido específico de la invención, en un producto alimenticio o cultivo iniciador, o en un sujeto que ha consumido un material probiótico. Por ejemplo, el equipo puede comprender un compuesto o agente marcado capaz de detectar un polipéptido o ARNm descrito en una muestra y un medio para determinar la cantidad del polipéptido descrito en la muestra (por ejemplo, un anticuerpo que reconoce el polipéptido descrito o una sonda de oligonucleótido que se une al AD? que codifica para un polipéptido descrito, por ejemplo, SEQ ID NOS: 1-21, 33, 35 ó 37 impares) . También los equipos pueden incluir instrucciones que detallan el uso de estos compuestos. Para equipos basados en anticuerpos, el equipo puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido descrito; y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une al polipéptido descrito o al primer anticuerpo y se conjuga a un agente detectable. Para equipos basados en oligonucleótidos, el equipo puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido detectablemente marcado, que hibrida a una secuencia de ácido nucleico descrita o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico descrita. El equipo también puede comprender, por ejemplo, un agente amortiguador, un conservador, o un agente estabilizador de proteína. El equipo también puede comprender componentes necesarios para detectar el agente detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato) . El equipo también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control que se valoran y comparan a la muestra de prueba contenida. Cada componente del equipo usualmente está encerrado dentro de un recipiente individual, y todos los varios recipientes están dentro de un envase individual junto con instrucciones para el uso. En una modalidad, el equipo comprende múltiples sondas en un formato de arreglo, tal como aquéllos descritos, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos números 5,412,087 y 5,545,531, y la publicación internacional número WO 95/00530, incorporadas en la presente como referencia. Las sondas para el uso en el arreglo se pueden sintetizar ya sea directamente en la superficie del arreglo, como se describe en la publicación internacional número WO 95/00530, o antes de la inmovilización en la superficie del arreglo (Gait, ed. (1984) , Oligonucleotide Synthesis a Practical Approach IRL Press Oxford, Inglaterra) . Las sondas se pueden inmovilizar sobre la superficie usando técnicas bien conocidas por aquéllos expertos en la técnica, tal como aquéllas descritas en la patente de los Estados Unidos número 5,412,087. Las sondas pueden ser unas secuencias de ácido nucleico o de péptidos, de manera preferente purificadas, o un anticuerpo. Los arreglos se pueden usar para detectar organismos, muestras o productos para diferencias en su contenido genómico, de ADNc, de polipéptido o de anticuerpo, incluyendo la presencia o ausencia de secuencias o proteínas específicas, así como la concentración de estos materiales. Se detecta la unión a una sonda de captura, por ejemplo, por la señal generada de una marca unida a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico descrita, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita, o un anticuerpo. El método puede incluir poner en contacto la molécula que comprende el ácido nucleico descrito, el polipéptido o anticuerpo por un primer arreglo que tiene una pluralidad de sondas de captura y un segundo arreglo que tiene una diferente pluralidad de sondas de captura. Los resultados de cada hibridación se pueden comparar para analizar diferencias en la expresión entre una primera y una segunda muestra. La pluralidad de sondas de captura puede ser de una muestra de control, por ejemplo, una bacteria de láctico tipo silvestre, o sujeto de control, por ejemplo un alimento, complemento dietético, muestra de cultivo iniciador o un fluido biológico. La segunda pluralidad de sondas de captura puede ser de una muestra experimental, por ejemplo, una bacteria de ácido láctico tipo mutante, o un sujeto que haya consumido un material prebiótico, por ejemplo, una muestra de cultivo iniciador, o un fluido biológico. Estos ensayos pueden ser especialmente útiles en los procedimientos de control de calidad y selección microbiana donde es esencial la detección de materiales indeseados. La detección de secuencia de nucleótidos particulares o polipéptidos particulares también puede ser útil en la determinación de la composición genética del alimento, productos de fermentación o microbios industriales, o microbios presentes en el sistema digestivo de animales o humanos que han consumido probióticos . Los ensayos para detectar la expresión de los polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico descritas también pueden incluir la detección y/o cuantificación de AI-2. Los métodos para la detección de AI-2 se describen en otra parte de la presente. Los métodos para medir la adherencia, por ejemplo, en respuesta a las condiciones adaptables de adhesión, también se pueden medir para evaluar la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Estos métodos también se describen en otra parte de la presente.

III. Vectores de Expresión Recombinante y Células Hospedadoras Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden incluir en vectores, de manera preferente vectores de expresión. "Vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Los vectores de expresión incluyen una o más secuencias reguladores y dirigen la expresión de genes a los cuales se enlazan de forma operable. Por "enlazado de forma operable" se propone que la secuencia de nucleótidos de interés esté enlazada a las secuencias reguladoras tal que se permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vi tro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora) . El término "secuencia reguladora" se propone que incluya promotores trascripcionales controlables, operadores, intensificadores, terminadores de transcripción y otros elementos de control de expresión tal como secuencia de control transduccional (por ejemplo, secuencias de consenso de Shine-Dalgarno, codones de iniciación y terminación) . Estas secuencias reguladores diferirán, por ejemplo, dependiendo de la célula hospedadora que se use. Los vectores se pueden replicar de manera autónoma en una célula hospedadora (vectores episomales) , o se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora, y replicar junto con el genoma hospedador (vectores de mamífero no episomales) . Los vectores integrantes contienen típicamente al menos una secuencia homologa al cromosoma bacteriano que permite que se presente la recombinación entre el ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Los vectores integrantes también pueden comprender secuencias de transposones o bacteriófagos. Los vectores episomales, o plásmidos son asas circulares de ADN de doble hebra en las cuales se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Los plásmidos capaces de mantenimiento estable en un hospedador en general son la forma preferida de vectores de expresión cuando se usan técnicas de ADN recombinante . Las construcciones o vectores de expresión abarcados en la presente invención comprenden una construcción de ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. La expresión en células hospedadoras procarióticas se abarca en la presente invención. Se apreciará por aquéllos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tal como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células hospedadoras para producir de este modo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente (por ejemplo, proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR, formas mutantes para proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR, proteínas de fusión, etc . ) . Las secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva directa de una secuencia de nucleótidos así como aquéllas que dirigen la expresión inducible de la secuencia de nucleótidos sólo bajo ciertas condiciones ambientales. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de la unión de ARN-polimerasa bacteriana y del inicio de la transcripción en la dirección (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción, que usualmente está colocada próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción incluye típicamente un sitio de unión a ARN-polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio llamado un operador, que puede traslapare a un sitio adyacente de unión a ARN-polimerasa en el cual empieza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada negativa (inducible), puesto que una proteína represora génica puede unir el operador e inhibir de este modo la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede presentarse en la ausencia de elementos reguladores negativos, tal como el operador. Además, la regulación positiva se puede lograr por una secuencia de unión a la proteína activadora génica, que, si está presente usualmente está próxima (5') a la secuencia de unión a ARN-polimerasa . Un ejemplo de una proteína activadora génica es la proteína activadora de catabolito (CAP) , que ayuda a iniciar la transcripción del operon lac en Escherichia coli (Raibaud et al . (1984) Annu . Rev. Genet . 18:173). Por lo tanto, la expresión regulada puede ser ya sea positiva o negativa, ya sea mejorando o reduciendo de este modo la transcripción. Otros ejemplos de elementos reguladores positivos y negativos son bien conocidos en la técnica. Varios promotores que se pueden incluir en el sistema de expresión de proteínas incluyen, pero no se limitan a, un promotor híbrido T7/LacO, un promotor trp, un promotor T7 , un promotor lac, y un promotor bacteriófago lambda. Cualquier promotor adecuado se puede usar para llevar a cabo la presente invención, incluyendo el promotor nativo o un promotor heterólogo. Los promotores heterólogos pueden ser constitutivamente activos o inducibles. Un ejemplo no limitante de un promotor heterólogo se da en la patente de los Estados Unidos número 6,242,194 de Kullen y Klaenhammer. Las secuencias que codifican para enzimas de la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de azúcar, tal como galactosa, lactosa (lac) (Chang et al . (1987) Nature 198:1056), y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tal como triptofano (trp) (Goeddel et al . (1980) Nucleic Acids Res . 8:4057; Yelverton et al . (1981) Nucleic Acids Res . 9:731; patente de los Estados Unidos número 4,738,921; publicaciones EPO números 36,776 y 121,775). El sistema promotor de beta-lactamasa (bla) (Weissmann, (1981) "The Cloning of Inferieron and Other Mistakes", en Interferon 3 (ed. I. Gresser) ; bacteriófago lambda PL (Shimatake et al . (1981) Nature 292:128); el promotor araB inducible por arabinosa (patente de los Estados Unidos número 5,028,530); y sistemas promotores T5 (patente de los Estados Unidos número 4,689,406) también proporcionan secuencias promotoras útiles. Ver también Balbas (2001) Mol . Biotech . 19:251-267, donde se analizan sistemas de expresión de E. coli . Además, los promotores sintéticos que no se presentan en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago se pueden unir con las secuencias de operones de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético (patente de los Estados Unidos número 4,551,433) . Por ejemplo, los promotores tac (Amann et al . (1983) Gene 25:167; de Boer et al . (1983) -?-roc. Nati . Acad. Sci . 80:21) y trc (Brosius et al . (1985) J. Biol . Chem. 260:3539-3541) son promotores trp- lac híbridos comprendidos tanto del promotor trp como de las secuencias de operón lac que se regulan por el represor lac. El promotor tac tiene la característica adicional de ser un promotor regulador inducible. De esta manera, por ejemplo, la expresión de una secuencia de codificación, operablemente enlazada al promotor tac se puede inducir en un cultivo celular al adicionar isopropil-1-tio-ß-D-galactosido (IPTG) . Adicionalmente, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se presentan de forma natural de origen no bacteriano que tiene la capacidad para unirse a ARN-polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que se presenta de forma natural de origen no bacteriano también se puede acoplar con una AR?-polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas . El sistema de AR?-polimerasa/promotor de bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado (Studier et al . (1986) J. Mol . Biol . 189:113; Tabor et al . (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . 82:1074) . Además, también un promotor híbrido puede estar comprendido de un promotor de bacteriófago y una región operadora de E. coli (publicación EPO número 267,851) .

El vector puede contener adicionalmente un gen que codifique para el represor (o inductor) para ese promotor. Por ejemplo, un vector inducible de la presente invención puede regular la transcripción del operador Lac (LacO) al expresar el gen que codifica para la proteína represora Lacl. Otros ejemplos incluyen el uso del gen lexA para regular la expresión de pRecA, y el uso de trpO para regular ptrp . Se pueden emplear alelos de estos genes que incrementan el grado de represión (por ejemplo, laclq) o que modifican la manera de inducción (por ejemplo, lambda CI857, que vuelven al lambda pL termo- inducible, o lambda CI+, que vuelven lambda pL quimio-inducible) . Además de una secuencia promotora funcionante, también es útil un sitio eficiente de unión a ribosoma para la expresión de la construcción de fusión. En procariotas, el sitio de unión a ribosoma se llama la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos en la dirección 5' del codón de iniciación (Shine et al . (1975) Nature 254:34) . La secuencia SD se piensa que promueve la unión de ARNm al ribosoma por el apareo de bases entre la secuencia SD y el extremo 3 ' del ARNr 16S bacteriano (Steiz et al . (1979) "Genetic Signáis and Nucleotide Sequences in Messenger RNA, "en Biological Regulation and Development : Gene Expression (ed. R. F. Goldberger, Plenum Press, NY) . También se pueden segregar proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR de la célula al crear moléculas de ADN quiméricas que codifican para una proteína que comprende un fragmento de secuencia de polipéptido de señal que proporciona la secreción de los polipéptidos relacionados a AI-2 o relacionados a AAR en bacterias (patente de los Estados Unidos número 4,336,336). El fragmento de secuencia de señal codifica típicamente para un péptido en señal comprendido de aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína de la célula. La proteína ya sea se segrega en el medio de crecimiento (bacteria Gram-positiva) o en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interior y exterior de la célula (bacteria Gram-negativa) . De manera preferente, hay sitios de procesamiento, que se pueden escindir ya sea in vivo o in vi tro, codificados por el fragmento de péptido de señal y la proteína relacionada a AI-2 o relacionada a AAR. El ADN que codifica para secuencias de señal adecuada se puede derivar de genes para proteínas bacterianas segregadas, tal como el gen de proteína de membrana exterior E. coli (ompA) (Masui et al . (1983) FEBS Lett. 151(1) :159-164; Ghrayeb et al . (1984) EMBO J. 3:2437-2442) y la secuencia de señal de fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) (Oka et al . (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . 82:7212). Otras señales procarióticas incluyen, por ejemplo, la secuencia de señal de penicilinasa, Ipp, o las guías de enterotoxina II térmicamente estable. Las bacterias tal como L . acidophil us utilizan en general el codón de inicio ATG, que especifica el aminoácidos metionina (que se modifica a N-formilmetionina en organismos procarióticos) . Las bacterias también reconocen codones de inicio alternativos, tal como los codones GTG y TTG, que codifican para valina y leucina, respectivamente. Cuando se usan como el codón de iniciación, sin embargo, estos codones dirigen la incorporación de metionina en lugar del aminoácido que normalmente codifican. El Lactobacill us acidophil us NCFM reconoce estos sitios de inicio alternativos e incorpora metionina como el primer aminoácido. Típicamente, las secuencias de terminación de transcripción reconocidas por bacterias son regiones reguladoras localizadas 3' al sitio finalizador de traducción y de esta manera, junto con el promotor, flanquean la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN (de aproximadamente 50 nucleótidos) que son capaces de formar estructuras de asa de vastago que ayudan en la terminación de la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de transcripción derivadas de genes con fuertes promotores, tal como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos. Los vectores de expresión tendrán una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia relacionada a AI-2 o relacionada a AAR de modo que está bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. Los genes marcadores seleccionables que aseguran el mantenimiento del vector en la célula también se pueden incluir en el vector de expresión. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos tal como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina) , y tetraciclina (Davies et al . (1978) Annu . Rev. Microbiol . 32:469). Los marcadores seleccionables también permiten que una célula crezca en un medio mínimo, o en la presencia de metabolito tóxico y pueden incluir genes biosintéticos, tal como aquellos en las rutas biosintéticas de histidina, triptofano y leucina. Como se usa en la presente, "heterólogos" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina de una especie extraña, o si es de la misma especie, está sustancialmente modificada de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la cual se derivó el polinucleótido, o, si es de la misma especie o especie análoga, uno o ambos se modifican sustancialmente de su forma original y/o locus genómico, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido operablemente enlazado. Las regiones reguladoras pueden ser nativas (homologas) , o pueden ser extrañas (heterólogas) a la célula hospedadora y/o la secuencia de nucleótido de la invención. Las regiones reguladoras también pueden ser naturales o sintéticas. Donde la región es "extraña" o "heteróloga" a la célula hospedadora, se propone que la región no se encuentre en la célula nativa en la cual se introduce la región. Donde la región es "extraña" o "heteróloga" a la secuencia de nucleótidos relacionada a AI-2 o relacionada a AAR de la invención, se propone que la región no sea la región nativa o que se presenta de forma natural para la secuencia de nucleótidos operablemente enlazada, relacionada a AI-2 o relacionada a AAR de la invención. Por ejemplo, la región se puede derivar de fagos . En tanto que puede ser preferible expresar las secuencias usando regiones reguladoras heterólogas, o se pueden usar regiones nativas. Estas construccionee se esperarán en algunos casos que alteren los niveles de expresión de las proteínas relacionadas a AI-2 o relacionadas a AAR en la célula hospedadora. De esta manera, se puede alterar el fenotipo de la célula hospedadora.

Al preparar el cartucho de expresión, los varios fragmentos de ADN se pueden manipular, para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada, y como es apropiado, en el cuadro de lectura apropiado. Hacia este fin, se pueden emplear adaptadores o ligadores para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones se pueden comprender para proporcionar sitios convenientes de restricción, remoción del ADN superfluo, remoción de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, se puede comprender la mutagénesis in vi tro, reparación por cebadores, restricción, fijación, re-sustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones . La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN se enlaza operablemente a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm relacionado a AI -2 o relacionado AAR. Las secuencias reguladoras operablemente enlazadas a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido se pueden elegir para dirigir la expresión continua o inducible de la molécula de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido o fagómido recombinante en el cual se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, la actividad de la cual se puede determinar por el tipo celular en el cual se introduce el vector. Para un análisis de la regulación de la expresión génica usando genes antisentido, ver Weintraub et al . (1986) Reviews - Trends in Genetics , Vol. 1(1) . De manera alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente se pueden poner conjuntamente en vectores de transformación. Los vectores de transformación están comprendidos típicamente de un marcador seleccionable que ya sea se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se describe anteriormente.

IV. Células Hospedadoras Microbianas o Bacterianas Cualquier bacteria de interés se puede usar en los métodos y composiciones de la invención. En modalidades específicas de la invención, la bacteria empleada en los métodos es una bacteria probiótica. Por "probiótica" se propone un microorganismo vivo que sobrevive al paso a través del tracto gastrointestinal y tiene un efecto benéfico en el sujeto. Como se usa en la presente, "propiedades probióticas" comprenden función y estabilidad intestinal mejorada; protección mejorada contra enfermedades infecciosas y no infecciosas; modulación del sistema inmunitario; intolerancia a aliviar la lactosa; digestión de absorción de nutrientes mejorada; colesterol sanguíneo reducido; riesgo reducido de alergia; y riesgo reducido de infecciones del tracto urinario. En algunas modalidades, un incremento en la adhesión, tolerancia al estrés o producción de AI-2 en una bacteria da por resultado mejora de al menos una propiedad probiótica de la bacteria. En otras modalidades de la invención, la bacteria es una bacteria de ácido láctico. Como se usa en la presente, "bacteria de ácido láctico" se propone la bacteria de un género seleccionado de lo siguiente: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacill u , Leuconostoc, Oenocuccus, Pediococcus, Streptococcus , Melissococcus , Alloiococcus, Dolos igranul um, Lactosphaera, Tetragenococcus, Vagococcus, y Weissella (Holzapfel et al . (2001) Am. J. Clin . Nutr. 73 : 365S-373S ; Sneath, ed. (1986) Bergey 's Manual of Systema tic Bacteriology Vol 2, Lippincott, Williams y Wilkins, Hagerstown, MD) . En aún otras modalidades, se usa Lactobacill us. Por " Lactobacill us" se quiere decir cualquier bacteria de género Lactobacill us, incluyendo pero no limitados a L . casei , L . rhamnosus, L. johnsonni, L. gasseri , L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum, L. salivarius, L. bulgaricus, y numerosas especies diferentes resumidas por Wood et al . (Holzapfel and Wood, eds. (1995) The Genera of Lactic Acid Bacteria, Vol . 2. , Springer, Nueva York) . La producción de bacterias que contienen genes heterólogos, la preparación de cultivos iniciadores de eetas bacterias, y los métodos para fermentar los sustratos, particularmente sustratos alimenticios tal como leche, se pueden llevar a cabo de acuerdo con técnicas conocidas, que incluyen pero no se limitan a aquéllas descritas en Máyrá-M kinen y Briget (1993) Lactic Acid Bacteria . Salminen y vonWright eds. Marcel Dekker, Inc. Nueva York. 65-96; Sandine (1996) Dairy Starter Cul tures Cogan and Accolas eds. VCH Publishers, Nueva York. 191-206; Billiland (1985) Bacterial Starter Cul tures for Food. CRC Press, Boca Ratón, Florida. Por "fermentación" se propone la descomposición metabólica productora de energía de compuestos orgánicos por microorganismos que prosiguen en general bajo condiciones anaeróbicas y con la emisión de gas. Se pueden introducir moléculas de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos de la invención en células hospedadoras por métodos conocidos en la técnica. Por "introducción" se quiere decir introducción en células procarióticas mediante técnicas convencionales de transformación o transíección, o por infección mediada por fagos. Como se usa en la presente, los términos "transformación", "transducción", "conjugación", y "fusión de protoplastos" se propone que se refieran a una variedad de técnicas reconocidas para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de sodio, transfección mediada con DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Se pueden encontrar métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras en Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) y otros manuales de laboratorio. Las células bacterianas usadas para producir los polipéptidos relacionados a AI-2 o relacionados a AAR de esta invención se cultivan en medios adecuados, como se describe en general en Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) . Las cepas bacterianas abarcadas por la presente invención incluyen aquéllas que son cultivos biológicamente puros de una bacteria que comprende al menos una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la presente invención. Estas cepas pueden incluir pero no se limitan a: Lactobacill us acidophilus, L. gasseri, L. johnsonii, o L. plantarum. Se puede asociar operativamente un promotor o secuencia de control de expresión heteróloga con una secuencia deseada de nucleótidos de acuerdo con técnicas conocidas, tal como por inserción dirigida o "activación génica" por recombinación homologa. Ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 6,391,633 y 6,569,681. Una "bacteria o célula" es una en la cual se ha efectuado una alteración genética, tal como transformación, en cuanto a un gen de interés, una célula que es descendiente de una célula alterada de este modo y que comprende la alteración, o es una bacteria que se ha sometido a condiciones adaptables de adhesión. Un "control" o "célula de control" o "bacteria de control" proporciona un punto de referencia para medir cambios en el fenotipo de la bacteria. Una bacteria de control puede comprender, por ejemplo: (a) una bacteria tipo silvestre, es decir, del mismo genotipo como el material de inicio para la alteración genética que da por resultado la bacteria; (b) una bacteria del mismo genotipo como el material de inicio pero que se ha transformado con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto conocido en el rasgo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador) ; (c) bacterias genéticamente idénticas a la bacteria sujeto pero que no se exponen a condiciones adaptables de adhesión o condiciones o estímulos que modularán la producción de AI-2; o (d) la bacteria sujeto misma, bajo condiciones en las cuales no se expresa el gen de interés .

V. Métodos i. Modulación de la Respuesta Adaptable de Adhesión En una modalidad, la presente invención ha identificado "condiciones adaptables de adhesión". Como se usa en la presente, "condiciones adaptables de adhesión" comprenden cualquier condición física, química, biológica o similar que mejore la adhesión de bacterias a un sustrato. Se puede modular la adhesión, por ejemplo, al cultivar una bacteria a una densidad celular deseada, y luego al incubar la bacteria bajo condiciones que mejorarán la respuesta de adhesión de la bacteria. Para los propósitos de la presente invención, "cultivar" o un "cultivo celular" se propone para describir células que se cultivan en un ambiente sintético. Las condiciones de cultivo (por ejemplo, medio de crecimiento, pH, temperatura) varían ampliamente para cada tipo de célula, y la variación de las condiciones para un tipo particular de célula puede dar por resultado que se expresen diferentes fenotipos. Las células típicamente se cultivan en condiciones favorables para promover el crecimiento celular. Las células se pueden cultivar en medio mínimo (que contiene los nutrientes exactos, incluyendo cualquier factor de crecimiento, necesitado por las bacterias para el crecimiento) o medio complejo (que contiene usualmente la variedad completa de factores de crecimiento que se puede requerir para el crecimiento de las bacterias) .

También se pueden ajustar las condiciones físicas de un medio de cultivo, tal como pH y temperatura, para prevenir el crecimiento de algunos organismos en tanto que se mejora el crecimiento de otros. En modalidades específicas, las condiciones de cultivo bacteriano comprenden cultivar anaeróbicamente a 37 °C o 42 °C en el medio de Mann-Rogosa-Sharpe (MRS) . El medio se puede modificar para sustituir galactosa u otros carbohidratos adecuados por glucosa como la fuente de azúcar en el medio. Las células se pueden recolectar en la fase de crecimiento logarítmica temprana (definida como que tiene una densidad óptica a 600 nm (OD600) hasta 0.4), fase de crecimiento logarítmica intermedia (OD600 aproximadamente 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, ó 0.9), o fase de crecimiento logarítmica tardía (OD600 mayor de 0.9) antes de la expresión a las condiciones adaptables de adhesión. En modalidades específicas, las células se recolectan a una OD600 de aproximadamente 0.6. Se recolectan células bacterianas, por ejemplo, por sedimentación en una centrífuga u otro dispositivo apropiado, y se resuspenden en medio adecuado. Las células bacterianas recolectadas entonces se pueden preacondicionar por incubación bajo condiciones adaptables de adhesión (es decir, al incubar las células bacterianas bajo condiciones adaptables de adhesión) que da por resultado un incremento en la adhesión a un sustrato objetivo. "que incuba" o "incubación" se refiere a mantener una población de bacterias bajo condiciones específicas (es decir, condiciones adaptables de adhesión) a fin de promover una reacción particular (por ejemplo, una respuesta adaptable de adhesión) . Las condiciones adaptables de adhesión pueden incluir, por ejemplo, incubación de bacterias durante un tiempo suficiente para incrementar la adhesión de la bacteria. En algunas modalidades, las bacterias de la presente invención se incuban durante al menos aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100 ó 120 minutos. En otras modalidades, las bacterias se incuban bajo condiciones en las cuales las células se han concentrado a una densidad de aproximadamente 1.5 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro (cfu/ml) de diluyente (por ejemplo, medio MRS), incluyendo aproximadamente 2.0 x 108, 3.0 x 108, 4.0 x 108, 5.0 x 108, 6.0 x 108, 7.0 x 108, 8.0 x 108, 9.0 x 108, 1.0 x 109, o mayor cfu/ml. En modalidades específicas, la concentración es mayor de 1.0 x 108 cfu/ml. Las modalidades adicionales incluyen incubación en un medio que se ha ajustado a un pH de menos de 5, incluyendo 4.5, 4.0, 3.5, y 3.0. En modalidades específicas, se permite que el pH caiga de forma natural a través de un intervalo de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 4.5. La incubación de células bacterianas bajo éstas u otras condiciones adecuadas antes del contacto de las bacterias a un sustrato objetivo ("preacondicionamiento") puede ya sea mejorar o disminuir, dependiendo de las condiciones de incubación, la adhesión de las bacterias preacondicionadas al sustrato objetivo. Se puede emplear cualquier sustrato de interés incluyendo, por ejemplo, una célula del tracto gastrointestinal o del tracto urogenital . Un incremento en la adhesión comprende incremento estadísticamente significativo en la adhesión a un sustrato objetivo en comparación a un control apropiado (por ejemplo, bacterias que no se han expuesto a condiciones adaptables de adhesión). En modalidades específicas, el incremento puede comprender, pero no se limita a, al menos aproximadamente 90 %, 100 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 200 %, 250 % o mayor. Un incremento en la adhesión se puede valorar in vi tro por ejemplo al poner en contacto las bacterias preacondicionadas a un objetivo adecuado (es decir, células epiteliales o mucosas) y al contar el número de bacterias que se adhieren al sustrato objetivo. Se puede valorar un incremento en la adhesión in vi vo al monitorizar la respuesta del hospedador a la expresión a bacterias preacondicionadas. Por ejemplo, la adhesión de una bacteria probiótica que se ha preacondicionado bajo condiciones adaptables de adhesión se puede valorar al monitorizar la mejora de las propiedades probióticas tal como función estabilidad intestinal mejorada; protección mejorada contra enfermedades infecciosas y no infecciosas; modulación del sistema inmunitario; intolerancia aliviada a lactosa; digestión mejorada y absorción mejorada de nutrientes; colesterol sanguíneo reducido; riesgo reducido a alergias; y riesgo reducido de infecciones de tracto urinario. Los métodos adicionales para medir la adhesión bacterias in vi vo se describen en Leffler et a-Z . (1995) Methods Enzymol . 253:206-220. En algunas modalidades, un incremento en la adhesión comprende la modulación de la expresión de al menos uno de SEQ ID NO: 19, 20, 33, 34, 35, 36, 37 ó 38, o variantes y fragmentos de los mismos. Las modalidades adicionales comprenden modulación de la expresión de 2, 3, 4 o más de estas secuencias. Se puede medir una modulación en la adhesión al comparar la expresión de los polinucleótidos de la invención en una bacteria en la cual se han introducido los polinucleótidos a la expresión de los mismos polinucleótidos en una bacteria de control como se define en otra parte de la presente . Se conocen en la técnica y se analizan en otra parte de la presente los métodos para medir la expresión de estas secuencias. ii. Modulación de la Producción de AI-2 Las composiciones y métodos de la presente invención se pueden usar para modular la producción de AI-2 en bacterias. Por "modular", "alterar", o "modificar" se propone la regulación favorecida o desfavorecida de una actividad biológica objetivo, particularmente la regulación favorecida de la actividad. Las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos de la invención son útiles en la modificación de las actividades biológicas de las bacterias de ácido láctico, especialmente bacterias de ácido láctico que se usan para fermentar alimentos con características nutricionales o promotoras de salud. La regulación favorecida o desfavorecida de la expresión de un polinucleótido de la presente invención se abarca. Se puede lograr la regulación favorecida al proporcionar múltiples copias génicas, al modular la expresión al modificar los elementos reguladores, al promover los mecanismos transcripcionales o transduccionales , u otros medios. Se puede lograr la regulación desfavorecida al usar técnicas de silenciamiento génico y antisentido conocidas. En modalidades específicas, la invención proporciona una bacteria que comprende al menos una molécula heteróloga de ácido nucleico relacionada a AI-2 (es decir, SEQ ID NO: 1, 3, 13, 15 ó 21) o variantes biológicamente activas o fragmentos de la misma. Las modalidades adicionales incluyen una bacteria que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos cinco moléculas de ácido nucleico relacionadas a AI-2 como se describe anteriormente. La expresión de estas secuencias heterólogas en la bacteria produce un nivel incrementado del autoinductor-2 que en comparación a una bacteria de control apropiada. Como se usa en la presente, un incremento en el autoinductor-2 comprende cualquier incremento significativo en AI-2 con respecto al control. En modalidades específicas, el incremento puede comprender, pero no se limita a, al menos aproximadamente 90 %, 100 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 200 %, 250 % o mayor incremento en la producción de AI-2 en comparación a un control apropiado. Se analizan en detalle en otra parte de la presente los métodos para valorar este incremento en la producción de AI-2. Las bacterias de la invención que tienen el incremento en la producción de AI-2 pueden presentar adhesión incrementada a un sustrato objetivo y/o también presentan tolerancia mejorada a estrés. Los microbios que expresan los polipéptidos de la presente invención son útiles como aditivos en procesos de fermentación y de lechería. La secuencia de nucleótido, los polipéptidos codificados y los microorganismos que los expresa son útiles en la elaboración de productos derivados de leche, tal como quesos, yogurt, productos fermentados de leche, leches acidas, y suero de leche. Los microorganismos que expresan los polipéptidos de la invención pueden ser organismos probióticos, una bacteria de ácido láctico, o cualquier otro hospedador bacteriano de interés . iii. Mejora de la Tolerancia al Estrés y/o de la Adhesión Como se analiza anteriormente, la presente invención proporciona bacterias que tienen tolerancia mejorada al estrés y/o actividad mejorada de adhesión. Como se usa en la presente, una mejora en la adhesión a un sustrato objetivo comprende cualquier incremento significativo en la adhesión al sustrato objetivo incluyendo, pero no limitado a un incremento de aproximadamente 90 %, 100 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 200 %, 250 % o mayor en la adhesión en comparación a un control apropiado. Se puede emplear cualquier sustrato de interés incluyendo, por ejemplo, una célula del tracto gastrointestinal o del tracto urogenital. En modalidades específicas, la célula comprende una célula epitelial o una célula mucosa. Si además se reconoce que las células se pueden poner en contacto con la bacteria ya sea in vi tro o in vivo. Como se usa en la presente, una tolerancia mejorada al estrés de una bacteria comprende cualquier incremento significativo en la supervivencia de la bacteria bajo condiciones estresantes, incluyendo, pero no limitado a, aproximadamente un incremento de 90 %, 100 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 200 %, 250 % o mayor en la supervivencia en comparación a un control apropiado.

Una bacteria probiótica de la invención que tiene adhesión mejorada y/o tolerancia mejorada al estrés encuentra uso en la promoción de la salud de un sujeto. En tanto que no se propone que se limite por ningún mecanismo de acción, las bacterias probióticas que tienen estas características mejoradas en la administración a un sujeto pueden bloquear la adhesión y competir con patógenos; estimular las defensas inmunitarias de la célula hospedador; y/o activar eventos de señalización celular que "silencien" la producción de factores de virulencia de los patógenos. La mejora de esta manera a la tolerancia al estrés y/o actividad de adhesión de un organismo probiótico ayudará adicionalmente en la reducción del riesgo de infección del intestino, tracto urogenital, y sitios de heridas. Las bacterias probióticas que tienen la tolerancia incrementada al estrés y/o adhesión incrementada se pueden administrar a cualquier sujeto en necesidad del mismo. Por ejemplo, el sujeto puede comprender un mamífero, un humano, un animal doméstico o un animal agrícola. La administración puede ser nasal, oral, vaginal o anal. En contextos donde no se prefiere la administración mucosa, la bacteria se puede administrar por otros medios adecuados dentro de la capacidad de aquéllos expertos en la técnica, es decir, rutas parentales (i.v., i.p., s.c., i.m.). Se reconoce que las bacterias de la invención que tienen la tolerancia mejorada al estrés y/o adhesión mejorada pueden expresar adicionalmente al menos un polinucleótido y/o polipéptido que tiene actividad terapéutica. Por "actividad terapéutica" se propone que el efecto biológico cuando el polipéptido se distribuye a un sujeto sea benéfico a ese sujeto. La administración es preferentemente en una "cantidad terapéuticamente efectiva", que es suficiente para mostrar beneficio al sujeto. Este beneficio puede ser al menos mejora de al menos un síntoma. En un contexto profiláctico, la cantidad puede ser suficiente para reducir los efectos perjudiciales en el individuo de un estímulo patógeno subsiguiente, por ejemplo, al mejorar la respuesta inmunitaria. La cantidad real administrada, la velocidad y curso de tiempo de administración, dependerán de la finalidad de la administración, por ejemplo, el efecto biológico buscado en vista de la naturaleza y severidad del estímulo, y es el sujeto de optimización por rutina. La prescripción del tratamiento, incluyendo vacunación profiláctica, por ejemplo, decisiones en la dosis, etc., está dentro de la responsabilidad de los practicantes generales y otros doctores médicos. Los polinucleótidos y/o polipéptidos que tienen actividad terapéutica y se pueden expresar en las bacterias probióticas que tienen actividad mejorada de adhesión o tolerancia mejorada al estrés pueden incluir, por ejemplo, insulina, hormona de crecimiento, prolactina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona paratiroides , somatostatina, hormona estimuladora de tiroides, polipéptido intestinal vasoactivo, citosina de grupo 1 estructural que adopta una estructura de fajo helicoidal 4-alfa antiparalela tal como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-?, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL o IFN-a/ß, la familia de TNF de citocinas, por ejemplo, TNFa, TNFß, CD40, CD27 o ligandos de FAS, la familia de IL-1 de citocinas, la familia de factores de crecimiento de fibroblastos, los factores de crecimiento derivados de plaquetas, factor beta de crecimiento de transformación y factores de crecimiento de nervios, citosina de grupo 3 estructural que comprende a/ß-moléculas de cadena corta, que se producen grandes moléculas precursoras transmembrana que contienen cada una al menos un dominio EGF en la región extracelular, por ejemplo, la familia de factores de crecimiento epidérmicos de citocinas, las quimiocinas caracterizadas por su posesión de secuencias de aminoácidos agrupadas alrededor de residuos conservados de cisteína (los subgrupos de quimiocinas C-C o C-X-C) o las citocinas relacionadas a insulina, una citosina del grupo 4 estructural que exhiba estructuras de mosaico tal como las heregulinas o neuregulinas compuestas de diferentes dominios, por ejemplo, EGF, dominios peptídicos homólogos o tipo inmunoglobulina.

De manera alternativa, el polipéptido biológicamente activo puede ser un receptor o antagonista para polipéptidos biológicamente activos como se define anteriormente. En modalidades específicas, el polipéptido que tiene actividad terapéutica comprende un antígeno. Para polipéptidos terapéuticos adicionales que se pueden expresar en bacterias no patógenas ver, por ejemplo, solicitud de patente de los Estados Unidos número 20030202991; Vandenbroucke et al . (2004) Gastroenterology 127:667-8; Huyghebaert et al . (2005) Eur J Pharm Biopharm 59:9-15; Steidler et al . (2000) Science 289:1352-1355; Steidler et al . (2001) The Scientific World 1:215-217; solicitud de patente de los Estados Unidos número 20020019043; cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Se reconoce que en aplicaciones particulares, el polipéptido terapéutico se puede manejar para que se segregue de las bacterias probióticas . iv. Método de Detección Se proporciona un método de detección de productos químicos o condiciones ambientales que incrementan la adhesión de una bacteria o un sustrato. El método comprende someter la bacteria a una condición ambiental sospechosa de incrementar la adhesión y/o sospechosa de incrementar la producción de AI-2; y, poner en contacto con la bacteria al sustrato. Un incremento en la adhesión de la bacteria sometida a la condición ambiental al sustrato en comparación a la adhesión de la misma bacteria que no se ha sometido a las condiciones ambientales indica que la condición ambiental es efectiva en el incremento de la adhesión de la bacteria. Se puede emplear en este método de detección una variedad de productos químicos o condiciones ambientales candidatas. Estas condiciones pueden incluir, pero no se limitan a, inductores/supresores de AI-2 o cualquier gen comprendido en la producción de AI-2, agentes microbiológicos (por ejemplo, organismos procarióticos y eucarióticos), temperatura, concentración, tiempo de incubación en condiciones adaptables de adhesión, composición del medio de incubación (por ejemplo, presencia, abundancia y/o tipo de factores de crecimiento, carbohidratos, aminoácidos, sal, minerales y similares), densidad celular, o pH. Un agente candidato puede ser un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, o una macromolécula biológica. Estos agentes candidatos pueden estar contenidos en varios bancos de agentes que incluyen, por ejemplo, bibliotecas de compuestos, bibliotecas de péptidos y similares. Las condiciones o compuestos identificados por este proceso estimularán las bacterias, incluyendo bacterias de tipo silvestre recombinantes y no recombinantes, para producir AI-2, o para promover la adhesión o formación de biopelícula para el uso en la fermentación o bacteriae probióticas, o en cualquier otro método descrito en la presente . La presente invención se explica en mayor detalle en los ejemplos expuestos a continuación.

Parte experimental Ejemplo 1 Análisis BlastP con Separación de Secuencias de Aminoácidos Las secuencias de la invención se alinearon usando el método de alineación BlastP con separación y los parámetros descritos en la presente. La Tabla 1 resume los resultados Blast superiores para estas secuencias. Una alineación de secuencia de aminoácidos BlastP con separación mostró que SEQ ID NO: 14 (372 aminoácidos, ORF LBA1080) tiene aproximadamente 55 % de identidad de los aminoácidos 11-371 con una proteína de Leuconos toc mesenteroides subesp. mesen teroides que es una proteína de metionina-sintasa II (independiente de cobalamina) (Acceso Número ZP_00064070.1 ) , aproximadamente 47 % de identidad de los aminoácidos 5-372 con una proteína de Lactoba cil l us gasseri que es una proteína de metionina-sintasa II (independiente de cobalamina) (Acceso Número ZP_00046311.1 ) , aproximadamente 46 % de identidad de los aminoácidos 7-372 con una proteína hipotética de Chlamydophila pneumoniae (Acceso Número NP_224351.1 ) , 44 % de identidad de los aminoácidos 4-372 con una proteína hipotética de Lactoba ci l l us j ohnsonii (Acceso Número NP_965623.1) , y 45 % de identidad de los aminoácidos 9-372 con una proteína de Oenococcus oeni que es una proteína de metionina-sintasa II (independiente de cobalamina) (Acceso Número ZP_00069898.1 ) . Una alineación de secuencia de aminoácidos BlastP con separación mostró que SEQ ID NO: 16 (157 aminoácidos ORF LBA1081) tiene 87 % de identidad de los aminoácidos 1-157 con una proteína de La ctoba cill us j ohnsonii que es una proteína de producción de auto-inductor-2 , LuxS (Acceso Número NP_965624.1) aproximadamente 87 % de identidad de los aminoácidos 1-157 con una proteína de La ctoba ci l l us ga sseri que es una proteína LuxS comprendida en la síntesis del auto-inductor AI2 (Acceso Número ZP_00046310.1) , aproximadamente 76 % de identidad de los aminoácidos 4-157 con una proteína de Streptococcus bovis que es una LuxS-autoinductor-2-sintasa (Acceso Número dbj | BAD06876.1 ) , 77 % de identidad de los aminoácidos 1-157 con una proteína de Lactobacill us plan tarum que es una proteína de producción de autoinductor (Acceso Número NP_784522.1 ) , y 73 % de identidad de los aminoácidos 4-157 con una proteína de Streptococcue pyogenes que es una proteína de producción de auto-inductor-2 (Acceso Número NP_269689.1) . Una alineación de secuencias de aminoácidos BlastP con separación mostró que SEQ ID NO: 18 (444 aminoácidos, ORF LBA169) tiene aproximadamente 95 % de identidad de los aminoácidos 49-444 con una proteína de La ctoba cil lus a cidophi l us que es un precursor de proteína de la capa S (Acceso Número sp | P35829 I SLAP_LACAC) , aproximadamente 67 % de identidad de los aminoácidos 49-443 con una proteína de La ctoba cil l us helveti cus que es una proteína de capa superficial (Acceso Número emb I CAA62606.1 ) , aproximadamente 67 % de identidad de los aminoácidos 49-443 con una proteína de La ctobacillus helveti cus que es una proteína de capa superficial (Accesos Números emb | CAB 6984.1 ; AJ388558), 66 % de identidad de los aminoácidos 49-443 con una proteína de Lactobacillus helveticus que es una proteína de capa superficial (Acceso Número emb | CAB46985.1 ) , y 66 % de identidad de los aminoácidos 49-443 con una proteína de La ctoba cill us helveti cus que es una proteína de capa superficial (Acceso Número emb | CAB 6986.1 ) . Una alineación de secuencia de aminoácidos BlastP con separación mostró que SEQ ID NO: 20 (566 aminoácidos, ORF LBA1148) tiene aproximadamente 69 % de identidad de los aminoácidos 4-564 con una proteína hipotética de La ctoba ci l l us j ohnsonii (Acceso Número NP_965038.1) , aproximadamente 66 % de identidad de los aminoácidos 4-564 con una proteína de La ctoba cill us ga sseri que es una proteína prevista de unión a ARN homologa a snRNP eucariótico (Acceso Número ZP_00045959.1 ) , aproximadamente 41 % de identidad de los aminoácidos 4-566 con una proteína de En terococcus faeci um que es una proteína prevista de unión a ARN homologa a snRNP eucariótica (Acceso Número ZP_00037 99.1 ) , aproximadamente 41 % de identidad de los aminoácidos 4-566 con una proteína de Enterococcus faecalis que es homologa a una proteína de unión a fibronectina/fibrinógeno (Acceso Número NP_814975.1 ) , y aproximadamente 41 % de identidad de los aminoácidos 4-557 con una proteína de La ctoba ci l l us plan tarum que es una proteína de adherencia (Acceso Número NP 785358.1) .

Tabla 1. Resultados Blast superiores para secuencias de proteína de la invención Análisis de PFAM de Secuencias de Aminoácidos SEQ ID NO: 2 (231 aminoácidos, ORF LBA820) contiene un dominio previsto PNP_UDP_1 de aproximadamente aminoácidos 2 a 22, y es miembro de la familia de 5 ' -metiladenosina- fosforilasa (MTA-fosforilasa) (acceso PFAM PF01048) . SEQ ID NO: 4 (314 aminoácidos, ORF LBA931) contiene un dominio PrmA de aproximadamente aminoácidos 6 a 312, y es miembro de la familia de metiltransferasa Lll de proteína ribosomal (PrmA) (Acceso FAM PF06325) . SEQ ID NO: 14 (372 aminoácidos, ORF LBA1080) contiene un dominio previsto de metionina_synt de aproximadamente aminoácidos 11 a 369, y es miembro de la familia de proteínas de metionma-sintasa independiente de vitamina B12 (Acceso PFAM PF01717) . SEQ ID NO: 16 (157 aminoácidos ORF LBA1081) contiene un dominio previsto LuxS localizado de aproximadamente aminoácidos 2 a 155, y es miembro de la familia de proteínas LuxS (LuxS) (Acceso PFAM PF02664). SEQ ID NO: 20 (566 aminoácidos, ORF LBA1148) contiene un dominio previsto FbpA de aproximadamente aminoácidos 1 a 425, y es un miembro de la familia de proteína A de unión a Fibronectina (FbpA) (Acceso PFAM PF05833) . SEQ ID NO: 22 (399 aminoácidos, ORF LBA1622) contiene un dominio N-terminal de S-adenosilmetionina-sintetasa previsto de aproximadamente aminoácidos 2-102 (Acceso PFAM 00438), un dominio central de S-adenosilmetionina-sintetasa de aproximadamente aminoácidos 124-243 (Acceso PFAM 02772), y un dominio C-terminal de S-adenosilmetionina-sintetasa de aproximadamente aminoácidos 245-384 (Acceso PFAM 02773) .

Cepas Bacterianas y Condiciones de Crecimiento Las cepas de La ctoba cill us se cultivaron anaeróbicamente a 37°C o 42°C en caldo MRS (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI) o, cuando es apropiado, en MRS complementado con 1.5 % de agar. Se propagó Escheri chia coli aeróbicamente en el medio Luria-Bertani (LB, Difco) o en el medio LB complementado con 1.5 % de agar a 37CC. Se usó el medio de infusión de cerebro-corazón (BHI, Difco) complementado con 1.5 % de agar y 150 µg/ml de eritromicina (Em) para la selección de los transformantes E . col i . Se usó el medio de Bioensayo de Autoinductor (AB) (Bassler et al . (1993) Mol . Mi crobiol . 9:773-786) para la propagación de todas las cepas de Vibrio harveyi . Cuando es apropiado, se usaron cloranfenicol (Cm, 5.0 µg/ml) y Em (5.0 µg/ml ó 150 µg/ml) para la selección. Se determinaron las unidades formadoras de colonias (CFU) con diluciones apropiadas usando un Whitley Automatic Spiral Plater (Don Whitley Scientific Limited, West Yorkshire, Inglaterra) .

Tabla 2. Cepas bacterianas y plásmidos usados Cepas Origen o características pertinentes Fuente de referencia acidophilus NCFM Aislado intestinal humano (31) NCK 1377 NCFM: :pTRK826 (integrante slpA) (1) NCK 1392 NCFM que contiene pTRK669 (29) NCK 1398 NCFM: :pTRK685 (integrante lacL) (29) NCK 1661 NCFM:: pTRK833 (integrante fbpA) (9) NCK 1765 NCFM: :pTRK854 (integrante l uxS) Este estudio V. harvey i BB170 luxN: :Tn5 AI-1 sensor AI-2 sensor+ ¡35) coli EC1000 RepA+ MC1000, Kmr, que tiene una copia (25) individual del pWVOl repA; hospedador para plásmidos basados en pOR128 Cepas Origen o características pertinentes Fuente de referencia Plásmidos PORI28 Emr, ori (pWVOl) , replica sólo con repA (25) provisto en trans pTRK669 ori(pWVOl), Cmr, RepA4* (29) pTRK854 Región interna de 471 bp de luxS Este estudio (LBA1081) clonado en sitios BglII-Xbal de pORI28 Cultivo de Tejido Las células Caco-2 (ATCC HTB-37, Rockville, MD) se usaron solamente entre el 40-ésimo y 50-ésimo paso. Todos los reactivos usados en mantenimiento de las células Caco-2 se obtuvieron de Gibco (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . Las células se cultivaron por rutina en atmósfera de 95 % de aire - 5 % de C02 en medio esencial mínimo (MEM) complementado con 20 % (v/v) de suero bovino fetal (FBS) inactivado (56°C, 30 min), aminoácidos no esenciales 0.10 mM y piruvato de sodio 1.0 mM. Las monocapas se tripnizaron durante 10 minutos, se contaron usando un hemocitómetro, y se sembraron a 1.3 x 105 células/concavidad en 2.0 ml de medio de cultivo de célula. Las células se cultivaron en cubreobjetos plásticos Thermanox de 15 mm (Nalge Nunc International, Rochester, NY) en placas tratadas con cultivo de tejido de 12 concavidades Costar (Corning Inc., Acton, MA) . El medio se reemplazó cada dos días y se realizaron todos los ensayos de adherencia después de 14 días de incubación.

Ensayo de Adherencia La adhesión de las cepas de La ctoba cill us a las células Caco-2 se examinó de acuerdo al método descrito anteriormente (Buck et al . (2005) Appl . Environ . Microbiol . 71:8344-8351). De forma breve, las células bacterianas de fase logarítmica intermedia (OD60o 0.6) se prepararon en 10 ml de MRS con 3.0 µg/ml de Em para mantener la presión selectiva en los integrantes. Las células se removieron por centrifugación durante 10 minutos a 4000 x g, y se lavaron dos veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en 5 ml de MRS fresco antes de la adherencia. Para las condiciones adaptables de adhesión, se resuspendieron los sedimentos celulares de los cultivos de fase logarítmica intermedia en 1 ml de MRS fresco a aproximadamente 1.0 x 109 cfu/ml y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Las células se centrifugaron nuevamente y se resuspendieron en 5 ml de MRS fresco antes de la adición a las monocapas. Se lavaron monocapas Caco-2 quince días dos veces con PBS y se trataron con una suspensión bacteriana a una concentración de 4 x 108 CFU/ml. Las bacterias se incubaron a la monocapa durante 1.5 horas a 37°C en una mezcla (1:2 v/v) de MRS y medio de cultivo de líneas celulares. Después de la incubación, las monocapas se lavaron cinco veces con PBS, se fijaron en metanol y se tiñeron Gram. Las células bacterianas adherentes entonces se enumeraron de manera microscópica. Se cubrieron los cubreobjetos en duplicado para cada experimento. Los datos finales presentados colectivamente representan al menos 3 experimentos independientes en duplicado. Se usaron cuentas totales para cada cubreobjeto y la adhesión se expresa como por ciento (%) de la cepa de control NCK1398 (Russell y Klaenhammer (2001) Appl . Environ .

Mi crobiol . 67:4361-4364) que tiene un inserto en el gen la cL (ß-galactosidasa). Usando este control, todos los cultivos mutantes y el control parental se pueden preparar con Em para mantener la presión selectiva en el integrante LuxS". El protocolo de adhesión se representa en la Figura 2.

Respuesta Adaptable de Adhesión Se recolectaron 10 mL de fase logarítmica (ODgoo 0.7) por centrifugación y se resuspendieron en ya sea 1 ó 10 mL del medio de crecimiento fresco de Mann-Rogosa Sharpe (MRS) y se incubó durante 1 hora a 37°C. Aquéllos resuspendidos en 10 ml se representan como "condiciones de control" (Figura ÍA) en tanto que aquéllos resuspendidos en 1 ml son las "condiciones adaptables de adhesión" (Figura IB). Para los propósitos de la presente invención, tanto las condiciones de incubación como la resuspensión en el volumen más pequeño (más concentrado) de medio (por ejemplo, 1 ml de MRS del grupo AAR versus 10 ml de MRS para el grupo de control) se consideran condiciones adaptables de adhesión. Las células concentradas e incubadas exhibieron un incremento significativo en la adhesión (Figuras 1A-1B) . El nivel de adherencia para las células concentradas e incubadas fue al menos 20 veces mayor que las células de control no concentradas e incubadas, aunque el mismo número de células bacterianas se adicionó inicialmente a cada concavidad. En cada experimento, se resuspendieron células en 5 ml de MRS fresco y se enumeraron para determinar la concentración absoluta de células adicionadas a la monocapa Caco-2. Únicamente se reportan los datos de adherencia que resultan de la adición de 3.8 x 108 - 4.2 x 108 CFU/ml. No se obtuvieron incrementos similares en la adherencia bacteriana ya sea por concentración 10 X sin incubación, o incubación (37°C, 1 hora) sin concentración de las células logarítmicas intermedias antes de la adherencia, o por incubación (37°C, 1 hora) sin concentración en MRS ajustado a pH 4.5 con ácido láctico (datos no mostrados). Después de la incubación de una hora, el pH de las células no concentradas fue de 5.5, en tanto que las células concentradas disminuyeron el pH a 4.5.

Por lo tanto, una combinación de concentración de célula y pH disminuido dio por resultado una adaptación de las células de L . acidophilus a un estado significativamente más tratable a la adherencia. Se designó este fenómeno una Respuesta Adaptable de Adhesión (AAR) . La Figura 3 muestra las propiedades de adhesión de la cepa de control y las cepas mutantes seleccionadas de L . a cidophil us NCFM con y sin exposición a las condiciones adaptables de adhesión. Se reportan datos como la cuenta total de células en 17 campos en un cubreobjeto individual. Cada punto de datos representa al menos dos experimentos en duplicado. El L . a cidophil us NCFM que contiene una integración en el gen de ß-galactosidasa actúa como el "control" a fin de mantener la selección por Em durante el crecimiento de todos los mutantes.

Análisis de Microarreglo Un cultivo individual de 20 mL de L . a cidophil us se cultivó en MRS a OD600 de 0.6, dividido en dos alícuotas de 10 ml, y se recolectó por centrifugación durante 8 min a 3,150 x g. Se resuspendió una alícuota en 10 ml de MRS fresco, la otra se resuspendió en 1 ml de MRS fresco. Ambos cultivos entonces se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron inmediatamente en un baño de hielo seco-etanol.

Se llevó a cabo el aislamiento de ARN usando TRIzol (Life Technologies, Rockville, MD) de acuerdo al protocolo descrito anteriormente (Azcarate-Peril et al . (2005) Appl . Environ . Microbiol . 71:5794-5804). Se determinaron la concentración y pureza de ARN por electroforesis en geles de agarosa y mediciones normales con espectrofotómetros . Cantidades idénticas (25 µg) del ARN total se marcaron con aminoalilo por trascripción inversa con hexámeros aleatorios en la presencia de amino-alil-dUTP (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) , usando transcriptasa inversa Superscript II (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) a 42°C durante la noche, seguido por marcación con fluorescencia de ADNc aminoalilado con esteres Cy3 o Cy5 activados con N-hidroxisuccinimida (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . Las sondas de ADNc marcadas se purificaron usando el equipo de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA) . El acoplamiento de los tintes de Cy3 y Cy5 al ADNc marcado con AA-dUTP y la hibridación de las muestras a los microarreglos se realizó usando protocolos normales. Se puede encontrar información adicional de estos protocolos en el sitio web de TIGR en www. tigr . org/tdb/microarray/protocolsTIGR. shtml . Se adquirieron las intensidades de fluorescencia usando un escáner de microarreglo Packard Bioscience ScanArray 4000 (Global Medical Instruments, Ine, Ramsey, MN) y se procesaron como imágenes TIFF. Se cuantificaron las intensidades de las señales usando el paquete de software GSI Luminomics QuantArray 3.0 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Inc., Boston, MA) . Se hibridaron dos portaobjetos (cada uno que contiene arreglos en triplicado) recíprocamente a sondas marcadas con Cy3 y Cy5 por experimento (cambio de tinte) . Se analizaron los puntos por cuantificación adaptable (Azcarate- Peril et al . , 2005, supra ) . El fondo local se sustrajo subsiguientemente de las intensidades registradas de los puntos. Los datos se normalizaron a la media. La media de las seis relaciones por gen se registró. La relación entre los valores de píxeles absolutos promedio para los puntos replicados de cada gen con y sin tratamiento, representan las veces de cambio en la expresión génica. También se calcularon los intervalos de confianza y los valores P en las veces de confianza con el uso de una prueba t de dos muestras. Los valores P de 0.05 o menores se consideraron significativos (Tabla 3) . Tabla 3. ORF diferencialmente expresados, seleccionados bajo condiciones adaptables de adhesión" a ORF mostrados en negrita en la Tabla 2 exhiben un patrón similar de expresión a un análisis de microarreglo anterior de L . acidophilus NCFM expuesto a MRS acidificado a pH 4.5 (3) .

El análisis de microarreglo de L . a cidophi l us NCFM expuesto a condiciones adaptables de adhesión (Tabla 3) sugiere producción incrementada de una señal interespecie, del autoinductor-2 (AI-2) . Los genes inicial (metK) y final ( l uxS) en la ruta para la producción de AI-2 de metionina (ver Figura 4) se indujeron de manera significativa. Adicionalmente, se indujo una agrupación del transportador ABC comprendido putativamente con la exportación de AI-2.

Ruta Biosintética de Autoinductor-2 El análisis adicional del genoma de L . a cidophilus NCFM reveló cuatro ORF (LBA1622, LBA0931, LBA0820, LBA1081) que muestran homología a cada gen en la ruta biosintética para la producción de AI-2 a partir de metionina (Figura 4) . MetK convierte metionina a S-adenosilmetionina (SAM) y se codifica putativamente por LBA1622 (SEQ ID NO: 21) . Se remueve un grupo metilo de SAM por una metiltransferasa dependiente de SAM (codificada por LBA931, SEQ ID NO: 3) formando S-adenosilhomocisteína (SAH) que subsecuentemente se destoxifica por una MTA/SAH nucleosidasa, Pfs (codificada- por LBA820, SEQ ID NO: 1), formando S-ribosilhomocisteína (SRH) y adenina. LuxS (codificado por LBA1081, SEQ ID NO: 15) convierte SRH a homocisteína y 4 , 5-dihidroxi-2 , 3-pentanodiona que circulariza, incorporando boro, para formar AI-2 (Winzer et al . (2002) Mi crobiology 148:909-922). La homocisteína finalmente se metila de regreso a metionina por MetE (codificado por LBA1080, SEQ ID NO: 13) localizado directamente en la dirección 5' del homólogo d l uxS, LBA1081. Un terminador entre los dos ORF con una energía libre de -16.2 kcal sugiere que se expresa de manera separada LBA 1080 y LBA1081. La Tabla 4 lista otros lactobacilos, para los cuales están disponibles datos de la secuencia genómica, con la ruta completa para la producción de AI-2 a partir de metionina .

El número de ORF previstos que codifican para proteínas que exhiben similitud a cada enzima en la ruta para la síntesis de AI-2 a partir de metionina se listan para L. acidophilus NCFM (Altermann et al. (2005) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 102:3906-3912), Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii NCC533 (Pridmore et al. (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 101:2512-2517), y Lactobacillus plantarum WCFS1 (Kleerebezum et al. (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 100:1990-1995). L. acidophilus NCFM se predice que tiene dos copias de luxS, pero uno de los ORF n o contiene señales de expresión tal como regiones de unión ribosomal o promotoras.

Producción de AI-2 La detección del autoinductor-2 del sobrenadante de cepas bacterianas seleccionadas se realizó como se describe anteriormente ( DeKeersmaecker y Vanderleyden, 2003, supra) con modificaciones como sigue. La detección de AI-2 producido por bacterias de ácido láctico puede ser problemática debido al pH disminuido de los sobrenadantes de cultivo agotados, y la represión catabólica por glucosa del operón lux en la cepa indicadora V. harveyi BB170 (DeKeersmaecker y Vanderleyden, 2003, supra) . Por consiguiente, todas las poblaciones de Lactobacillus usadas para la detección del autoinductor-2 se cultivaron en MRS modificado (mMRS) que contiene 1 % de galactosa en lugar de glucosa. En los puntos de tiempo especificados, se recolectaron alícuotas de 4 ml, se midió la OD6oor y los sobrenadantes libres de célula se aislaron por centrifugación a 4,000 x g durante 10 minutos. El pH del sobrenadante se neutralizó a pH 6.5 con NaOH 2N y se filtró a través de una membrana de 0.2 µm. Los sobrenadantes preparados se almacenaron a 4°C hasta el final de los experimentos de curso de tiempo y todas las muestras de cada cultivo se valoraron conjuntamente en placas separadas de microtítulo de 96 concavidades. La cepa indicadora V. harveyi BB170 (Azcarate-Peril, 2005, supra ) se cultivó durante la noche en el medio de bioensayo autoinductor (AB) , se lavó con y resuspendió en AB fresco a OD6oo 0.5. Se mezclaron 10 µl de sobrenadante estéril con 90 µl de una dilución 1/1000 de la cepa indicadora BB170 en cada concavidad de una placa de 96 concavidades. Se midió la luminiscencia a 30°C cada 10 minutos durante 6 horas en un lector de placas de microtítulo fluorescente (FLOUStar Óptima, BMG Technologies, Durham, NC) . Se calculó las veces de inducción al promediar al menos 6 puntos de tiempo normales y al dividir el valor promedio obtenido del tipo silvestre por el valor promedio obtenido del mutante LuxS". Cada muestra se midió en al menos 3 concavidades independientes y cada punto de tiempo representa 3 muestras independientes. A fin de determinar cuándo se produjo AI-2 durante la fase de crecimiento de L . a cidophil us NCFM, los sobrenadantes se recolectaron a las 0, 3, 6, 9, 12, 16, 20, 24, 36, y 48 horas de cultivos en triplicado. La producción de AI-2 durante el crecimiento de L . a cidophilus se muestra en la Figura 5. Coincidiendo con una rápida caída en el pH, se presenta un incremento notable en la producción de AI-2 a través de la fase logarítmica de crecimiento. En la entrada a la fase estacionaria, la actividad de AI-2 en el sobrenadante mantiene un nivel constante hasta 48 horas ( Figura 5) .

Inactivación Insercional del Gen l uxS Usando el ADN cromosómico de L . a cidophil us NCFM como una plantilla, se amplificó un fragmento interno de 471 pb de LBA1081 ( l uxS) usando PCR con cebadores 1081-IF (51-GATCA GATCT AAGTT AAGGC ACCTT ACG-3', SEQ ID NO: 23) y 1081-IR (5'-GATCT CTAGA TTTCG AATGG GTCAT CAC-3', SEQ ID NO: 24). El fragmento interno se clonó en el vector integrativo pORI28 (Law, et a l . (1995) J. Bacteriol . 177:7011-7018) y se transformó de manera subsiguiente por electroporación en L . a cidophil us NCFM que contiene el plásmido auxiliar sensible a temperatura pTRK669 (Russell y Klaenhammer, 2001, supra ) . Entonces se llevaron a cabo los pasos de acuerdo a Russell y Klaenhammer, 2001, supra para la selección de los integrantes. Se confirmó la integración exitosa del plásmido por PCR y análisis de hibridación Southern de los fragmentos de unión usando protocolos normales. La cepa mutante LuxS-, NCK 1765, se probó para la capacidad para adherirse a células Caco-2 usando células bacterianas de la fase logarítmica intermedia de crecimiento y células expuestas a condiciones de AAR. Cuando las células de la -fase logarítmica intermedia se adicionaron directamente a las células Caco-2 desde la fase logarítmica intermedia, se observó una disminución de 58 % en la adhesión (prueba t de Student, P < 0.001) para la cepa mutante LuxS" (Figura 6) en comparación al control. Un derivado de L . a cidophi l ue NCFM (NCK1398) que tiene una integración en una ß-galactosidasa se usó como el control de modo que se puede mantener la presión antibiótica en el mutante y en el control.

Conclusiones L . a cidophi l us NCFM responde a condiciones ambientales de una manera que incrementa dramáticamente la capacidad del organismo para adherirse a las células epiteliales intestinales, in vi tro . El análisis de arreglo transcripcional de una población expuesta a estas condiciones adaptables de adhesión sugiere que la producción de una molécula de señalización, AI-2, se incrementa. El análisis del genoma de L . a cidophi l us NCFM identificó todos los genes necesarios para la producción de AI-2 a partir de metionina. La producción de AI-2 a partir de L . a cidophi l us NCFM se confirmó usando una cepa indicadora de V. harveyi . En la inactivación del gen final en la ruta, l uxS, se observó una disminución en la adhesión en las células de la fase logarítmica, pero no se observó diferencia en la respuesta adaptable de adhesión de la cepa mutante LuxS- en comparación al control. Estos datos sugieren que la adhesión de los lactobacilos al epitelio intestinal puede comprender una interacción íntima de varios factores. En tanto que la señalización mediada por AI-2 contribuye a la capacidad adhesiva de L . a cidophi l us NCFM, no es el medio exclusivo de comunicación dentro de la población sensible a la respuesta adaptable de adhesión. Estos datos sugieren que la adhesión de lactobacilos al epitelio intestinal puede comprender una interacción íntima de varios factores. En tanto que la señalización mediada por AI-2 contribuye a la capacidad adhesiva de L . a cidophil us NCFM, no es el medio exclusivo de comunicación dentro de la población sensible para la respuesta adaptable de adhesión.

Ejemplo 2 Se ha realizado análisis de microarreglo de la expresión génica afectada por LuxS y AI-2 en varias especies microbianas diferentes a fin de determinar la función de LuxS en los procesos celulares. La influencia de AI-2 en E . col i K-12 cultivado en la presencia y ausencia de glucosa reveló expresión génica alterada de genes relacionados al operón l sr, metabolismo de metionina, y utilización de carbono (12, 32) . Otro estudio enlazó la producción de LuxS con genes comprendidos en el crecimiento celular y división celular usando microarreglos de E . col i (9) . Los análisis de microarreglo transcripcionales de un mutante de LuxS" de Porphyromona s gingi va l i s y su tipo silvestre implicaron la participación de LuxS con la respuesta a estrés de ese organismo (36). Además de las cepas bacterianas patógenas, varias cepas no patógenas han demostrado un fenotipo asociado con la producción de AI-2. Por ejemplo, el desempeño ecológico de La c toba ci l l us reu teri en el tracto gastrointestinal murino se alteró en un mutante LuxS" (28) . Este estudio utilizó un microarreglo de genoma entero para identificar la expresión génica influenciada por LuxS en L . a ci dophi l us NCFM. Múltiples genes comprendidos con la respuesta al estrés, crecimiento y metabolismo se expresaron de manera diferencial en una cepa mutante LuxS". El análisis fenotípico de una cepa mutante LuxS" examinó la influencia de una mutación l uxS en la tolerancia a calor y bilis de L . a ci dophi l us NCFM.

Cepas Bacterianas y Condiciones de Crecimiento Se cultivaron cepas de La c t oba ci l l us de forma anaeróbica a 37°C o 42°C en caldo MRS (Difco Laboratories Inc., Detroit MI) o, cuando es apropiado, en MRS complementado con 1.5 % de agar. Para la detección de AI-2, los lactobacilos se cultivaron en MRS modificado, siguiendo los ingredientes para MRS excepto sustituyendo galactosa al 1 % p/v en lugar de glucosa. E . col i se cultivó aeróbicamente en el medio Luria-Bertani (LB, Difco) o en el medio LB completado con 1.5 % de agar a 37°C. El medio de infusión de cerebro-corazón (BHI, Difco) complementado con 1.5 % de agar y 150 µg/ml de eritromicima (Em) se usó para la selección de transformantes de E . col i . Se usó el medio de bioensayo de autoinductor (AB) (5) para la propagación de todas las cepas de Vibri o ha rveyi . Cuando es apropiado, se usaron para la selección cloranfenicol (Cm, 5.0 µg/ml) y Em (5.0 µg/ml o 150 µg/ml) . Se determinaron las unidades formadoras de colonia (CFU) por ml con diluciones apropiadas en caldo de MRS al 10 % usando un Whitley Automatic Spiral Plater (Don Whitley Scientific Limited, West Yorkshire, Inglaterra) .

Tabla 5. Cepas bacterias y plásmidos usados Cepas Origen o características pertinentes Fuente de referencia L. acidophilus NCFM Aislado intestinal humano (24) NCK 1392 NCFM que contiene pTRK669 (22) NCK 1818 NCFM que contiene supresión luxS Este estudio NCK 1758 NCFM con labT msercionalmente inactivado (10) NCK 235 Lactobacillus delbruekn usado como una ATCC 4797 cepa indicadora en ensayo de bactepocma V. harvey i BB170 luxN::Tn5 AI-1 sensor AI-2 sensor* (26) col i EC1000 RepA+ MC1000, Kmr, que tiene una copia : i 8 ) individual del pWVOl repA; hospedador para plasmidos basados en pOR128 Plásmidos pORI28 Emr, orí (pWVOl) , replica solo con repA ;i8) provisto en trans pTRK669 or?(pWVOl), Cmr, RepA+ (22) Cepas Origen o características pertinentes Fuente de referencia pTRK8584 pORI28 ligado a luxS que contiene una Este supresión de 97 pb y sitio de restricción estudio de EcoRI introducido Técnicas de Manipulación de ADN Se aisló el ADN genómico total de La ctoba cil l us de acuerdo a un método de Walker y Klaenhammer (31) . Se usaron protocolos normales para restricción con endonucleasa, ligación, modificación o transformación de ADN (23). Las preparaciones de plásmidos para el propósito de detectar transformantes E . col i siguieron el método de Zhou et a l . (37) . Se realizaron preparaciones de plásmidos a gran escala con el equipo QIAprep Spin de acuerdo a las instrucciones del fabricante (QIAGEN Inc., Valencia, CA) . Se llevaron a cabo PCR de acuerdo a las recomendaciones del fabricante usando el sistema de PCR Tag-ADN-polimerasa (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Se sintetizaron cebadores de PCR por tecnologías de ADN integrado (Coralville, IA) y, cuando es apropiado, se diseñaron sitios de restricción en el extremo 5' de los cebadores para facilitar pasos futuros de clonación. Los fragmentos de ADN se extrajeron de geles de agarosa al 1.0 % usando el equipo de recuperación de ADN Zymoclean Gel (Zymo Research, Orange, CA) . Se prepararon células electrocompetentes de La ctoba ci l l us como se describe por Walker et al. (30). Se llevó a cabo la hibridación Southern de ADN genómico usando protocolos normales.

Tabla 6. Cebadores usados en este estudio Cebador Secuencia0 LuxS-EF 5 ' -GATCTCTAGATGACAGAAGACGATGAATG-3 ' (SEQ ID NO: 25) LuxS-ER 5 ' -GATCAGATCTATTGCGACTAAGTTCAGAC-3 ' (SEQ ID NO: 26) LuxS-delF 5 ' -GATCGAATTCTCGTTCGGTTGAACTAAACGTAAGTC-3 ' (SEQ ID NO: 27) LuxS-delR 5 ' -GATCGAATTCCGAACAGGATTCCACCTAATCGTTTG-3 ' (SEQ ID NO: 28) LuxS-XXF 5 ' -GCCAACTTAGCCTTAAGCACTC-3 ' (SEQ ID NO: 29) LuxS-XXR 5'-TTGTTCCTGCTCCTCAGCCTTC-3' (SEQ ID NO: 30) LuxS-delNF 5 ' -TGCTTTAGCAACTTCAGTAG-3 ' (SEQ ID NO: 31) LuxS-delNR 5 ' -TAAAGTTAAGGCACCTTACG-3 ' (SEQ ID NO: 32) aSitios de enzima de restricción usados para clonación están subrayados .

Inactivación Libre de Marcador de LuxS Una cepa mutante de LuxS- de L . acidophil us NCFM se construyó por supresión de 97 pb con l uxS (LBA1081) de acuerdo a los protocolos descritos anteriormente (2, 6) . De forma breve, se amplificó un fragmento de 1,243 pb que contiene luxS usando los cebadores LuxS-EF y LuxS-ER (Tabla 6) . Los fragmentos se ligaron de manera subsiguiente a pORI28, en los sitios Xbal y Bglll. Se seleccionaron transformantes en E . coli EC1000 y se aisló pORI : : LuxSbig . Se realizó la PCR inversa (Expand High Fidelity PCR system, Roche Applied Science, Indianápolis, IN) en ese plásmido usando los cebadores LuxS-delF y LuxS-delR (Tabla 6) que contienen cada uno los sitios de restricción de enzima EcoRI en el extremo 5'. El producto resultante de PCR de 2.7 kpb se limpió usando el equipo de purificación de PCR Qiagen y se digirió durante 18 horas a 37°C con EcoRI . Después de la purificación en gel con el equipo de recuperación de ADN Zymoclean Gel (Zymogen), el producto se ligó por sí mismo durante 16 horas a 16°C. El plásmido resultante, pTRK884, entonces se transformó en E . coli EC1000, y la construcción del plásmido se confirmó con amplificación por PCR. El L . acidophi l us NCFM que contiene el plásmido auxiliar sensible a temperatura, pTRK669, entonces se electrotransformó con pTRK884 y los integrantes se seleccionaron de acuerdo al método descrito anteriormente por Russell y Klaenhammer (22) . Los integrantes seleccionados se pasaron seis veces en medio no selectivo, para permitir que se presente el evento de segunda cruzada, y luego se colocaron en placa en MRS desprovisto de antibióticos. Se detectaron colonias para la sensibilidad a Em y la PCR de las colonias se llevó a cabo usando los cebadores LuxS-delNF y LuxS-delNR, que flanquean la región suprimida. La amplificación por PCR de la región de supresión y los ensayos de hibridación Southern usando un fragmento interno de luxS como la sonda confirmó la supresión mediante el reemplazo génico en NCK1818. Hasta recientemente, se ha realizado la inactivación génica específica del sitio en lactobacilo usando estrategias de integración de plásmido. El mantenimiento de la integración de plásmidos requiere crecimiento en medio selectivo. Sin embargo, tanto la integración de plásmido como el crecimiento selectivo pueden influenciar en los resultados de la expresión génica obtenidos por análisis de microarreglo. Como tales, se usó una estrategia libre de marcador para inactivar l uxS (LBA1081) en L . a cidophi l us NCFM usando un planteamiento de recombinación homologa de doble cruce. El gen l uxS de la cepa mutante resultante, NCK1818, careció de una región interna de 97 pb y contuvo un sitio adicional de restricción de EcoRI . La región de supresión se seleccionó para interrumpir el cuadro de lectura y dio por resultado un producto génico no funcional. Se confirmó el reemplazo génico por análisis de PCR de la región suprimida e hibridación Southern usando un fragmento interno de l uxS como la sonda. NCK1818 fue sensible a Em y no produce AI-2 como se determina por el ensayo indicador de V. harveyi (5) . Anteriormente, el patrón de expresión de AI-2 por L. acidophilus NCFM se determinó usando un mutante de integración luxS como el control negativo (8) . El mismo patrón de producción de AI-2 durante el crecimiento de L . a cidophi l us NCFM se observó usando NCK1818 como el control negativo .

Detección de AI-2 Se realizó como se describe anteriormente (8) la detección del autoinductor-2 del sobrenadante de cepas bacterianas seleccionadas. De forma breve, los sobrenadantes de las poblaciones bacterianas recolectadas en cada punto de tiempo específico se ajustaron a pH 6.5 con NaOH 2N y se filtraron a través de una membrana de 0.2 µm. La cepa indicadora Vibrio harveyi BB170 (3) se cultivó durante la noche en el medio de bioensayo de autoinductor (AB) , se lavó con y resuspendió en AB fresco a OD600 0.5. Se mezclaron diez µl de sobrenadante estéril del cultivo de prueba con 90 µl de una dilución 1/1000 de la cepa indicadora BB170 en cada concavidad de una placa de 96 concavidades. Se midió la luminiscencia a 30CC cada 10 minutos durante 6 horas en un lector de placa de microtítulo fluorescente (FLOUStar Óptima, BMG Technologies, Durham, NC) . Se calculó las veces de inducción al promediar al menos 6 puntos de tiempo normales de la curva de luminiscencia de V. harveyi y al dividir el valor promedio obtenido del tipo silvestre por el valor promedio obtenido del mutante LuxS-. Se seleccionaron puntos de tiempo cuando la luminiscencia estaba a un nivel constante antes de que la cepa indicadora respondiera a la producción de su propio AI-2. Cada muestra se midió en al menos 3 concavidades independientes y cada punto de tiempo representa 2 experimentos independientes (Tabla 7).

Aislamiento de ARN Se transfectaron tanto L . a cidophil us NCFM y NCK1818 dos veces de cultivos concentrados, congelados en medio semi-definido usando galactosa como la fuente primaria de carbono para impedir la represión de catabolitos por glucosa del operón l ux en la cepa indicadora V. harveyi . Se inoculó un cultivo de 400 ml de ambas cepas a 1 % de un cultivo de fase estacionaria (16 horas) y se dejó crecer a 37°C. A OD6oo 0.2, se obtuvo una muestra de 5 ml para la determinación de CFU y medición de pH . Entonces se enfriaron rápidamente seis muestras de 10 ml de cada cepa en hielo seco, y los sedimentos celulares se recolectaron a 4°C por centrifugación durante 10 minutos a 3,150 x g. El sobrenadante de cada cepa después de la centrifugación en cada punto de tiempo se retuvo para la detección de AI-2. En los dos puntos finales de muestreo (OD6oo 0.7 y ODßoo 1-2) se recolectaron muestras de 5 ml de cada cultivo de la placa y determinación de pH; entonces se recolectaron dos muestras de 10 ml de cada cultivo y se trataron como se describe anteriormente. Se llevó a cabo el aislamiento de ARN de los sedimentos celulares como se describe anteriormente (3) usando TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD) . Se determinaron la concentración y pureza de ARN por electroforesis en geles de agarosa al 1.0 % y mediciones normales con espectrofotómetro. Se aisló el ARN de dos replicados biológicos de ambas cepas.

Tabla 7. Condiciones de cultivo de poblaciones celulares recolectadas de análisis de microarreglo3 OD6oo CFU/ml (± SD) Actividad de AI-2 pH (± SD) 0.2 3.26 x 106 (± 4.27 x 105) 2.27 (± 0.09) 6.08 (± 0.04) 0.7 2.67 x 107 (± 3.13 x 106) 10.78 (± 0.60) 5.35 (± 0.13) 1.2 7.81 x 107 (± 1.22 x 107) 30.13 (± 0.25) 4.89 (± 0.12) ar Todos los valores representan la media y una desviación estándar calculada de los datos combinados obtenidos tanto de L . a cidophi l us NCFM como de NCK1818 en tres experimentos independientes . Producción de ADNc e Hibridación de Microarreglo El análisis de expresión génica de la cepa mutante LuxS" y la cepa tipo silvestre en cada uno de los tres puntos seleccionados de muestreo se realizó usando un microarreglo (3) de ADN de genoma entero. Los productos de PCR de 1,889 ORF previstos del genoma de L . a cidophil us NCFM (1) se graficaron en triplicado en portaobjetos de vidrio ULTRA GAPS (Corning Inc., Acton, MA) . Se realizó la síntesis de ADNc de primera hebra y la marcación con el sistema de marcación de ADNc indirecto SuperScript (Invitrogen) . De forma breve, se marcaron con aminoalilo cantidades iguales (20 µg) de ARN por transcripción inversa con hexámeros aleatorios en la presencia de nucleótidos amino-modif icados, usando transcriptasa inversa SuperScript III a 42°C durante 3 horas. Se purificó el ADNc de primera hebra con columnas de S.N.A.P., se precipitó, se marcó con los esteres Cy3 o Cy5 activados con N-hidroxisuccinimida (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) , y se purificaron nuevamente con columnas en S.N.A.P. El ADNc marcado resultante se híbrido en portaobjetos de microarreglo de acuerdo a los protocolos resumidos por TIGR (www. tigr. org/tdb/microarray/protocolsTIGR. shtml) . Se realizaron hibridaciones de acuerdo a un patrón de turno giratorio individual, de modo que se llevaron a cabo todas las posibles comparaciones directas en forma de pares en un diseño no equilibrado. Se realizó un total de quince diferentes hibridaciones en tres diferentes puntos de muestreo (OD6oo 0.2, 0.7, y 1.2) y dos diferentes cepas (L. acidophilus NCFM y NCK1818 ) .

Análisis de Datos de Microarreglo Se adquirieron intensidades de fluorescencia usando un escáner de microarreglo General Scanning ScanArray 4000 (Packard Biochip BioScience, Biochip Technologies LLC, Mass.) y se procesaron como imágenes TIFF. Las intensidades de señal se cuantificaron, incluyendo la sustracción de fondo, y las réplicas de puntos se promediaron usando el paquete de software QuantArray 3.0 (Packard BioScience). Los datos de intensidad al natural, resultantes se importaron en SAS (SAS Institute, Cary, NC), se transformaron por log2 y se ajustaron al análisis de varianza de modelo mezclado de normalización (ANOVA) a fin de centrar los datos a la intensidad media. Entonces se realizó un ANOVA de modelo mezclado específico del gen en los datos normalizados en el cual se consideraron el tinte, cepa y tiempo como efectos fijos y el efecto del arreglo se consideró un efecto aleatorio (34). La diferencia resultante entre los estimados de mínimos cuadrados para dos diferentes tratamientos es análoga a la relación transformada por log2- de la expresión génica entre estos dos tratamientos. Se calcularon las diferencias para el efecto del tinte, el efecto de la cepa, efecto de tiempo y el efecto combinado de la cepa y tiempo, cepa * tiempo. Se realizó una prueba t usando estas diferencias y sus errores estándar, con P < 0.05 considerado significante. Se construyeron gráficas Volcano para cada comparación usando el estimado y -Logio (valor P) con JMP 5.0 (SAS Institute) a fin de visualizar el contraste entre los tratamientos y significado estadístico de los resultados. A fin de estudiar los genes diferencialmente expresados en respuesta a la producción de LuxS, se desarrolló un diseño de microarreglo que examinó las diferencias en la expresión entre el tipo silvestre y el mutante LuxS- en la fase de crecimiento exponencial temprana, intermedia o tardía. La producción de AI-2 durante el crecimiento se determinó anteriormente para L . a cidophil us NCFM (8) . De esos datos, se seleccionaron tres puntos de crecimiento para el aislamiento de ARN: OD60o 0.2, antes de que AI-2 se haya acumulado; ODdoo 0.7, durante la rápida producción de AI-2; y OD60o 0.2, cuando la producción de AI-2 se desacelera y el nivel de AI-2 en el sobrenadante permanece elevado pero constante. Se aisló el ARN de ambas cepas en cada punto de tiempo, en duplicado, y la actividad de AI-2 se determinó usando el ensayo de indicador de V. harveyi . En total, se compararon seis puntos entre sí en cada par posible de comparaciones (15 hibridaciones). El análisis de los datos de expresión se realizó usando un modelo mezclado de dos etapas, ANOVA y relaciones medias de mínimos cuadrados consideradas significantes en un cambio en veces de 1.8 y P < 0.05 (Tabla 9) . Cada OFR diferencialmente expresada en los primeros dos puntos de tiempo, se agrupó de acuerdo a su clasificación de COG (Figuras 8A-8C) . Las dos clasificaciones de COG con el número más alto de genes sobreexpresados en NCFM, que da cuenta de 42 % del total, fueron la estructura ribosomal de traducción y biogénesis (J), y replicación, recombinación, y reparación (L) . En contraste, 40 % de los genes sobreexpresados en el mutante LuxS" se categorizó como función desconocida (S) . La expresión incrementada de genes relacionados al crecimiento normal y metabolismo en NCFM en comparación al mutante LuxS" sugiere que LuxS influye positivamente en la expresión de muchos de estos genes ya sea de manera directa o indirecta. No es claro de estos datos la función de los genes cuya expresión se vio influenciada negativamente por LuxS. No hubo significativamente genes diferencialmente expresados bajo las condiciones probadas en ya sea NCFM o el mutante LuxS- en la fase logarítmica tardía (ODdoo 1-2), cuando el nivel de AI-2 en el medio no se incrementa por más tiempo. Se usó un diseño de microarreglo de torno giratorio combinado con análisis de modelo mezclado para comparar el efecto de la cepa, tiempo y el efecto combinado tanto de la cepa como el tiempo (cepa*tiempo) en la expresión génica de L . a cidophil us NCFM. Una comparación cepa a cepa reveló que, antes de que el AI-2 empieza acumularse apreciablemente en el medio (OD60o 0.2), se sobreexpresaron significativamente 84 ORF en NCFM (Tabla 8a) en tanto que sólo se sobreexpresaron significativamente 13 ORF en el mutante LoxS" (Tabla 8b) . Los genes más altamente inducidos en NCFM en comparación al mutante en la fase logarítmica temprana (OD6oo 0.2) fueron relA (3.14 veces), relacionado putativamente a la transducción de señales, e IF-2 (3.14 veces), un factor de inicio de traducción putativo. En la fase logarítmica intermedia (OD6oo 0.7), conforme se fue acumulando rápidamente AI-2, sólo se sobreexpresaron significativamente 3 OFR en NCFM (LBA1497, LBA1796, LBA1798) y 4 ORF (LBA0026, LBA0089, LBA0568, y LBA1596) sobreexpresados en el mutante LuxS-. De manera interesante, el único ORF que se expresó de una manera significativamente diferencial en ambos de los primeros dos puntos de tiempo fue labT (LAB1796) , un ABC-transportador anteriormente implicado con la exportación de bacteriocina (10) . En la fase logarítmica temprana, labT se sobreexpresó en NCFM 2.53 veces, y en la logarítmica intermedia se sobreexpresó 2.10 veces en comparación al mutante LuxS". Un regulador de respuesta (LBA1798), de un sistema vecino regulador de dos componentes, también se sobreexpresó en NCFM en comparación al mutante en la fase logarítmica intermedia. A este respecto, la cepa LuxS" se analizó para la producción de bacteriocina y se encontró que produce el mismo nivel de producción de bacteriocina como el tipo silvestre. Adicionalmente, se probó una cepa mutante de labT isogénica para la producción de AI-2 y se encontró que produce AI-2 al mismo nivel como el tipo silvestre.

Tabla 8a. Clasificación de COG de genes diferencialmente expresados a Identificación putativa por anotación manual para ese gen u ORF b Relación media de mínimos cuadrados de estimados de log2 entre L. acidophilus NCFM tipo silvestre y la cepa mutante LuxS". La relación de corte para la diferencia en veces fue 1.8 y P < 0.05.

Tabla 8b. Clasificación de COG de genes diferencialmente expresados Genes inducidos en L . a cidophi l us NCFM en comparación a NCK1818 en fase logarítmica intermedia (ODgoo 0.7) Anotación de ORF Relación13 Gena Con trol de ciclo cel ular , división cel ular, divi sión cromosómi ca desconocido LBA 1.94 1497 Tra scripción Identificación putativa por anotación manual para ese gen u ORF b Relación media de mínimos cuadrados de estimados de log2 entre L . a cidophil us NCFM tipo silvestre y la cepa mutante LuxS". La relación de corte para la diferencia en veces fue 1.8 y P < 0.05.

Tabla 9. Resultados de Microarreglo La treholasa-hidrolasa, treC (LBA1014), se sobre- expresó 2.56 veces en NCFM en comparación a la cepa mutante LuxS" en la fase logarítmica temprana. La investigación anterior reportó crecimiento deficiente en trehalosa de un mutante treC" de L . a cidophi l us (11) . Por lo tanto, la velocidad máxima de crecimiento de L . a cidophil us NCFM y el mutante LuxS- en el medio MRS que contiene varios azúcares se midió a fin de determinar la posible influencia de una mutación de l uxS en la utilización de azúcares (Tabla 10) . No se afectó el crecimiento por la mutación de l uxS cuando las cepas se cultivaron en MRS o mMRS que contiene glucosa o trehalosa. Sin embargo, el mutante luxS" exhibió una velocidad máxima inferior de crecimiento en comparación a NCFM tanto en lactosa como en sacarosa.

Tabla 10.- velocidad máxima específica de crecimiento (µ hr"1) en varias fuentes de carbohidrato Medio NCFM (µ ± SD) LuxS" (µ ± SD) MRS 0. 45 (± 0. 005 0.42 (± 0.006) mMRSa Glucosa 0 .34 (± 0 .04) 0.32 (± 0.05) mMRSa Trehalosa 0. 28 (± 0. 003 0.29 (± 0.02) mMRSa Lactosa 0. 28 (± 0. 004 * 0.19 (± 0.006) mMRSa Sacarosa 0. ,33 (± 0. ,003 * 0.23 (+ 0.003) * Identifica velocidades significativamente diferentes del crecimiento como se determina por la prueba t de Student' s ( P < 0.01) a Composición de medio descrita anteriormente El perfil trascripcional de cada cepa de la fase logarítmica temprana a tardía también se examinó (Figuras 9A- 9B) . Un número similar de genes, 27 en NCFM y 41 en el mutante LuxS-, se incrementó en expresión de la fase logarítmica temprana a intermedia en ambas cepas. La expresión de 12 genes se incrementó en ambas cepas e incluyó genes de metabolismo de azúcar (LBA0874, LBA1012, LBA1812, y LBA1974), y un antígeno de reactividad cruzada con miosina putativa (LBA555). Sólo 24 genes en la cepa tipo silvestre, en comparación a 97 genes en la cepa mutante, disminuyó la expresión de la fase logarítmica temprana a intermedia. Nuevamente, de la fase logarítmica intermedia a tardía, la expresión de un número similar de genes se incrementó en ambas cepas, pero 45 genes disminuyeron en la expresión durante esta fase de crecimiento en el tipo silvestre, y sólo 15 en el mutante LuxS-. Estos resultados sugieren que AI-2 puede ser responsable de incrementar o mantener la expresión de genes durante las etapas tempranas de crecimiento. Cuando AI-2 es deficiente en los medios, la expresión de un número significativo de genes parece que disminuye durante la fase logarítmica temprana.

Experimentos de Estrés Tanto L . a cidophil us NCFM como NCK1818 se cultivaron en caldo MRS a 37°C hasta que la población alcanzó ODßoo 0.2, 0.7 y 1.2, punto en el cual las células se recolectaron para experimentos de tolerancia de estrés. Tolerancia a bil i s . En los puntos de muestreo predeterminados, cada cultivo se diluyó y colocó en placa en duplicado en agar MRS complementado con Oxgall al 0.75, 1.0 ó 2.0 % p/p (BD Biosciences, San José, CA) . Las placas se incubaron anaerobicamente durante 48 horas y se calcularon CFU/ml y por ciento de supervivencia. Cada ensayo se realizo en triplicado. Tolerancia a calor. Cada cepa se cultivo en 250 ml de caldo MRS y en cada punto de muestro, 10 ml de células se recolectaron de cada población por centrifugación a 3,150 x g durante 10 min a 21°C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se descartó y los sedimentos celulares se re-dispersaron en 10 ml de MRS fresco, se preincubaron a 55°C. Las muestras se tomaron a 0, 10, 20, 30 y 45 min, se diluyeron y colocaron en placa en duplicado. Cada ensayo se realizó en triplicado. Anál i si s estadí s ti co . Los datos obtenidos de los experimentos anteriores se analizaron usando la prueba t de Student's con P < 0.05 considerado significante. Se probó la implicación de LuxS con varias respuestas a estrés de L . a cidophil us NCFM. El crecimiento en agar MRS complementado con Oxgall al 2.0 % (bilis fresca deshidratada) disminuyó significativamente el crecimiento del mutante LuxS- en comparación a NCFM cuando las poblaciones bacterianas se colocaron en placas a OD6oo 0.2. Cuando las células se colocaron en placa de poblaciones con OD60o 0.7, se observo una disminución significativa en el crecimiento en la cepa LuxS- en MRS complementado con Oxgall al 1.0 %. Las células recolectadas del punto del tiempo final OD6oo 1.2, no mostraron diferencia en el crecimiento en Oxgall (Figura 10). Estos resultados indican que la producción de AI-2 correlaciona con la tolerancia a bilis a través de la fase logarítmica intermedia, pero conforme la población de LuxS- alcanza fase estacionaria, no está presente la sensibilidad a bilis debido a la ausencia de AI-2.

Adicionalmente, cuando las poblaciones recolectadas de OD6oo 0.2 y ODßoo 0.7 se expusieron a esfuerzo térmico de 55°C, el mutante LuxS" fue más sensible (Figura 11) . Las poblaciones celulares del mutante LuxS" recolectadas del punto de tiempo final, OD6oo 1-2 no mostraron una disminución significativa en comparación a MCFM. Este patrón de supervivencia a calor-estrés implica adicionalmente la implicación de AI-2 con la respuesta a estés durante las fases logarítmicas temprana y tardía de crecimiento, pero no conforme la población alcanza la fase estacionaria de crecimiento donde las células fueron inherentemente más tolerantes al calor.

Producción de Bacteriocina Se colocaron cinco µl tanto de L . a ci doph i l u s NCFM y NCK1818 en agar MRS y se incubaron a 37°C durante la noche en una cámara anaeróbica. El siguiente día, se adicionaron 100 µl de la cepa indicadora La c t oba ci l l u s delbrue cki i (NCK235) a 10 ml de agar sobrepuesto MRS fundido (0.75 % p/v) y se vertieron uniformemente en la superficie de la placa de agar. Después de 24 horas de incubación, se evaluaron las zonas de inhibición que indican actividad antagonista de lactacina B.

Curvas de Crecimiento L . a cidophi l us NCFM y NCK1818 se transfirieron ambos tres veces de cultivos concentrados congelados en MRS y MRS modificado (mMRS) . El medio mMRS usado en este estudio siguió los ingredientes para el MRS comercialmente disponible (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) , remplazando dextrosa con 1 % p/v de ya sea glucosa, lactosa, trehalosa o sacarosa. Se realizaron las cuervas de crecimiento de 37°C en placas de 96 concavidades (Corning) que contienen 200 µl de cada medio complementado semi-definido o caldo de MRS. Los cultivos se dejaron crecer durante 16 horas y se midió ODgoo cada 15 minutos en concavidades triplicadas. Las placas se incubaron a 37°C, y el crecimiento se monitorizó automáticamente al determinar los cambios en Adoo como una función del tiempo usando un lector de placa de microtítulo FLUOStar ÓPTIMA (BMG Labtech) . La velocidad máxima específica de crecimiento se calculó de la pendiente de una línea de regresión lineal durante el crecimiento exponencial con un coeficiente de correlación (r2) de 0.99. Cada punto representó la media de tres cultivos independientes.

Conclusiones Esta solicitud es la primera en reportar un análisis trascripcional del reguión LuxS en diferentes etapas de crecimiento. Los estudios anteriores de microarreglo de la expresión génica modulados por AI-2 habían ya sea estudiado la respuesta de una cepa mutante LuxS" a AI-2 exógeno (DeLisa, et a l . (2001) Journal of Ba cteriology 183:5239-5247) o identificado un punto individual de crecimiento y analizado en la diferencia trascripcional entre un mutante de inserción y el tipo silvestre (Merritt, et al . (2003) Infect Immun 71:1972-9; Wang, et al . (2005) Journa l of Ba cteriology 187:8350-8360; Yuan, et al . (2005) Infect . Immun . 73:4146-4154) . En tanto que estos planteamientos pueden identificar exitosamente los genes regulados por AI-2 en puntos individuales, el perfil de expresión representa solo una instantánea del reguión LuxS. A fin de obtener un entendimiento más completo de la expresión génica influenciada por LuxS, se seleccionaron tres puntos de tiempo a todo lo largo de la fase de crecimiento de L . acidophilus NCFM para análisis trascripcional. En el primer punto de muestreo, OD60o 0.2, la actividad de AI-2 detectado en el medio de crecimiento fue mínima puesto que las poblaciones estuvieron en las etapas tempranas de la fase logarítmica de crecimiento. El segundo punto de muestreo, durante el crecimiento logarítmico intermedio (ODeoo 0.7), se tomó durante la acumulación rápida de AI-2 en los medios. Las células se recolectaron a OD600 1.2, fase logarítmica tardía, para el punto final de muestreo, que fue aproximadamente 30 minutos después de que los niveles de AI-2 alcanzaron su pico en el medio. Estos puntos se eligieron para representar la expresión génica antes, durante y después de la producción de AI-2 como se describe anteriormente. La cepa LuxS" usada en este estudio fue un mutante de supresión génica y por lo tanto se esperó que esté libre de cualquier efecto pleiotrópico provocado por integraciones o adición de componentes exógenos seleccionados a los medios. El número más grande de genes diferencialmente expresados se identificó durante la fase logarítmica temprana de crecimiento. Se indujeron un número relativamente grande de genes en el tipo silvestre en comparación a la cepa LuxS", indicando que AI-2 facilita la expresión de ciertos genes durante las fases tempranas de crecimiento. La mayoría de estos genes se relacionó a la trascripción, traducción y replicación. Tres genes (LBA772, LBA773, y LBA775) del operón que codifica para F?F0-ATPasa (Kullen y Klaenhammer (1999) Mol . Mi crobiol . 33:1152-1161) (LBA772-LBA779) se sobreexpresaron en la cepa tipo silvestre. La trehalosa-hidrolasa ( treC, LBA1014) también mostró expresión incrementada en el tipo silvestre, aunque no está presente trehalosa en el medio. La ausencia de AI-2 no afecta el crecimiento de NCFM en trehalosa (Tabla 5), en tanto que ni una cepa mutante TreB~ (transportador) o TreC" fue capaz de crecer en trehalosa (Duong, et al (2006) Appl . Environ . Mi crobiol . 72:1218-1225). La expresión diferencial de estos sistemas putativos de producción de energía asocia adicionalmente a LuxS con el crecimiento y el metabolismo. Resultados similares obtenidos por DeLisa et al . (2001, Journal of Ba ctepology 183:5239-5247) implicaron a AI-2 con la regulación de la división celular, procesamiento de ADN y procesos morfológicos. Además de los procesos metabólicos y de crecimiento normales, LuxS afectó la expresión de varios factores de superficie celular. Dos genes (LBA1735 y LBA1736) de un operón de exopolisacárido putativo (EPS) también se expresaron diferenc almente en el tipo silvestre en la fase logarítmica temprana. Una proteína putativa de unión a fíbronectma, anteriormente mostrada que participa con adhesión a células Caco-2 (Buck, et al . (2005) Appl . Environ . Mi crobiol . 71:8344-8351), también se mdupo durante la fase logarítmica temprana por AI-2. La fibronectma es un componente de la matriz extracélular intestinal humana (ECM) y puede ser un objetivo para la adhesión de células bacterianas en el ambiente intestinal (Kapczynski et al . (2000) Curr. Microbiol . 41:136-41). Una cepa mutante LuxS" de La ctoba ci ll us reutep exhibió desempeño ecológico disminuido en el tracto gastrointestinal disminuido (Tannock, 2005, supra ) . La regulación en la expresión de los factores de superficie celular de manera temprana en la fase de crecimiento puede pre-adaptar a la bacteria para la interacción con una comunidad microbiana diversa o desempeño ecológico en el tracto intestinal. Las moléculas asociadas con la superficie celular de los microorganismos intestinales se reconocen por el hospedador y pueden ser importantes tanto en la respuesta inflamatoria como en el mantenimiento de la homeostasis intestinal (Rakoff-Nahoum, et al . (2004) Cell 118:229-241). Una de esta moléculas de superficie bacteriana, el ácido lipoteicoico, se une a la membrana celular y se extiende a través de la pared celular para presentarse por si mismo en el ambiente de las bacterias. El gen de dl tD (LBA1923), un miembro del operón dlt responsable de la D-alanación apropiada de ácidos lipoteicoicos en lactobacilus, se indujo en la presencia de LuxS en la fase de crecimiento logarítmica temprana. Cuando un mutante de Dlt~ de La ctoba cill us plan tarum se expuso a células mononucleares de sangre periférica (PMBC), la secreción de la citocinas proinflamatorias TNFa e IL-12 se disminuyó (Grangette, et al . (2005) Proc . Na ti . Acad. Sci U. S . A 102:10321-10326). La expresión de IL-10 por las PBMC se incrementó después de la exposición a mutante de Dlt~, sesgando el perfil de citocinas a una respuesta anti-inflamatoria. La regulación por AI-2 de la estructura de estos ácidos lipoteicoicos puede jugar un papel en las interacciones hospedador-microbio en el tracto intestinal.

También se piensa que AI-2 participa en la regulación de las respuestas a estrés en bacterias (Wen, et al . (2004) J. Ba cteriol . 186:2682-91; Xavier, et al . (2005) J. Ba cteriol . 187:238-248). Por consiguiente, la expresión de múltiples genes putativamente relacionados con las respuestas a estrés se vio influenciada por AI-2, incluyendo dnaK (LBA1247), grpE (LBA1248), y clpX (LBA847) comprendidos con la remoción de las proteínas desplegadas y polipéptidos premaduros producidos durante el estrés térmico. El análisis de la influencia de AI-2 en la supervivencia al estrés térmico reveló que en comparación a la cepa tipo silvestre, la cepa mutante LuxS- de L . a cidophil us NCFM, fue sensible a estrés térmico de 55°C (Figuras 11A-11C) . Esta sensibilidad sólo se observó en tanto que las poblaciones bacterianas se estresaron de la fase de crecimiento logarítmica temprana o intermedia. Estos resultados son consistentes con la expresión incrementada de los genes de respuesta a choque térmico en las etapas tempranas de crecimiento. En un reciente estudio de Porphyromonoas gingivi tis, una cepa mutante LuxS", resistente que el tipo silvestre al estrés térmico (Xavier, 2005 supra ) , sugiriendo alteración dependiente de la cepa de la respuesta a estrés por AI-2. Las bacterias intestinales deben sobrevivir al paso a través de las duras condiciones del tracto gastrointestinal a fin de persistir en el intestino. Uno de los obstáculos que deben ser superados es la exposición a bilis en la región gástrica. Se indujo una hidrolasa putativa de sales biliares (LBA0892) por LuxS en la fase logarítmica temprana. La cepa mutante LuxS- se probó para su tolerancia a bilis y se encontró que es más sensible cuando los cultivos se recolectaron de ya sea la fase de crecimiento logarítmica temprana o intermedia. Los cultivos recolectados de la fase logarítmica tardía no exhibieron ninguna diferencia en la tolerancia a bilis del tipo silvestre. Estos resultados indican que AI-2 puede actuar para preparar a la célula para condiciones estresantes al influenciar positivamente la expresión de genes que tiene una función con el crecimiento o supervivencia en diferentes condiciones ambientales. Se reportó que AI-2 es un factor de percepción de quorum que se acumula en el ambiente conforme se incrementa la densidad celular, aunque no se ha reportado la fase de crecimiento en la cual AI-2 afecta la expresión génica. Los presentes resultados sugieren que AI-2 actúa en poblaciones celulares en las etapas tempranas del crecimiento logarítmico, antes de la acumulación apreciable de AI-2. El alto número de genes que disminuyó la expresión de la fase decrecimiento logarítmica temprana o intermedia en la cepa mutante LuxS" en comparación al tipo silvestre soporta la hipótesis que LuxS influye positivamente en la expresión génica de forma temprana en la fase de crecimiento. Cuando la expresión génica se examinó a todo lo largo de la fase de crecimiento, LuxS parece preparar la población para el estrés y las condiciones interactivas encontradas de forma natural durante el crecimiento planctónico. Es claro que AI-2 tiene impacto la expresión de genes relacionados al crecimiento rápido y respuesta a estrés de L . acidophil us NCFM, así como que influencia posiblemente las interacciones de hospedador-microbio . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Método para incrementar la adhesión en una bacteria de ácido láctico, caracterizado porque comprende exponer la bacteria a condiciones adaptables de adhesión que comprenden incubar las células a una concentración de al menos 1 x 109 cfu/ml durante un tiempo suficiente para incrementar la adhesión de la bacteria de ácido láctico. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las condiciones adaptables de adhesión comprenden una concentración de aproximadamente 1 x 109 cfu/ml de esta células durante aproximadamente 1 hora. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las condiciones adaptables de adhesión incrementan la expresión de al menos un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 19, 33, 35 ó 37 o de un polinucleótido que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de SEQ ID NO: 19, 33, 35 ó 37. 4. Método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además poner en contacto la bacteria de ácido láctico a un sustrato. 5. Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el sustrato comprende una célula del tracto gastrointestinal o el tracto urogenital. 6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula comprende una célula epitelial o una célula mocosa. 7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la adhesión incrementada mejora al menos una propiedad probiótica de la bacteria de ácido láctico. 8. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria se selecciona del grupo que consiste de La ctoba cill us a cidophi l us , L . ga sseri , L . j ohnsoni i , y L . plan tarum . 9. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria de ácido láctico expresa un polipéptido terapéutico. 10. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polipéptido terapéutico es heterólogo a la bacteria. 11. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula del tracto gastrointestinal o el tracto urogenital es de un humano, un animal doméstico o un animal agrícola. 12. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la tolerancia a estrés de la bacteria de ácido láctico se mejora. 13. Bacteria de ácido láctico, caracterizada porque se produce por el método de la reivindicación 1. 14. Bacteria de ácido láctico, caracterizada porque se produce por el método de la reivindicación 2. 15. Cultivo de bacterias, caracterizado porque comprende la bacteria de ácido láctico de la reivindicación 13. 16. Método para distribuir un polipéptido terapéutico a un sujeto, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una bacteria de ácido láctico que tiene un ácido nucleico que codifica para un polipéptido terapéutico; b) exponer la bacteria de ácido láctico a condiciones adaptables de adhesión que comprenden incubar las células a una concentración de al menos 1 x 109 cfu/ml durante un tiempo suficiente para incrementar la adhesión en las bacterias de ácido láctico; c) administrar las bacterias de ácido láctico del paso (b) al sujeto. 17. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las condiciones adaptables de adhesión comprenden una concentración de aproximadamente 1 x 109 cfu/ml de las células durante aproximadamente 1 hora. 18. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la bacteria se selecciona del grupo que consiste de La ctoba cill us a cidophil us , L . gasseri , L . j ohnsoni i , y L . plan tarum . 19. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el sujeto comprende un humano, un animal doméstico o un animal agrícola. 20. Método para inducir o mejorar la producción de autoinductor-2 en una bacteria, caracterizado porque comprende introducir en la bacteria al menos dos moléculas heterólogas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste de: (a) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 1; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (a) (i) bajo condiciones severas, las condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 2; (b) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 3; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (b) (i) bajo condiciones severas, estas condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 4 ; (c) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 15; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (c) (i) bajo condiciones severas, estas condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 15; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 16; (d) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 21; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (d) (i) bajo condiciones severas, las condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 21; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 22; y (e) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 13; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (e) (i) bajo condiciones severas, las condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 13; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 14; en donde la bacteria produce grandes cantidades del autoinductor-2 que la bacteria de control correspondiente. 21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque además comprende exponer la bacteria a condiciones adaptables de adhesión que comprenden incubar las células a una concentración de al menos 1 x 109 cfu/ml durante un tiempo suficiente para incrementar la adhesión de las bacterias de ácido láctico. 22. Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque las condiciones adaptables de adhesión comprenden una concentración de aproximadamente 1 x 109 cfu/ml de estas células durante aproximadamente 1 hora. 23. Método de conformidad con la 20, caracterizado porque la bacteria es una bacteria de ácido láctico. 24. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la bacteria es probiótica. 25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la adhesión incrementada mejora al menos una propiedad probiótica de la bacteria. 26. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria de ácido láctico se selecciona del grupo que consiste de La ctoba ci ll us acidophilus , L. gasseri , L. johnsonii , y L. plantarum. 27. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria de ácido láctico expresa un polipéptido terapéutico. 28. Método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el polipéptido terapéutico es heterólogo a la bacteria. 29. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la tolerancia a estrés de la bacteria de ácido láctico se mejora. 30. Bacteria, caracterizada porque comprende al menos dos moléculas heterólogas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste de: (a) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 1; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (a) (i) bajo condiciones severas, las condiciones severas que comprenden hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 2; (b) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 3; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (b) (i) bajo condiciones severas, las condiciones severas que comprenden hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 4; (c) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 15; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (c) (i) bajo condiciones severas, estas condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 15; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 16; (d) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 21; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (d) (i) bajo condiciones severas, las condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 21; o, (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 22; y (e) (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 13; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (e) (i) bajo condiciones severas, las condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; y (iii) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 13; (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 14; en donde la bacteria produce grandes cantidades del autoinductor-2 que la bacteria de control correspondiente. 31. Bacteria de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque es una bacteria de ácido láctico. 32. Bacteria de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la bacteria es probiótica. 33. Bacteria de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la bacteria de ácido láctico se selecciona del grupo que consiste de La ctoba ci ll us a cidophil us , L . gasseri , L . j ohnsonii , y L . plan tarum . 34. Bacteria de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la bacteria de ácido láctico expresa un polipéptido terapéutico. 35. Bacteria de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el polipéptido terapéutico es heterólogo a la bacteria. 36. Bacteria de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la bacteria la tolerancia a estrés de la bacteria de ácido láctico se mejora. 37. Cultivo de bacteria, caracterizado porque comprende la bacteria de la reivindicación 30. 38. Método para detectar condiciones ambientales que incrementan la adhesión de una bacteria de ácido láctico a un sustrato, caracterizado porque comprende: a) someter a la bacteria para una condición ambiental sospechosa de incrementar la adhesión; y b) poner en contacto la bacteria al sustrato; en donde un incremento en adhesión de la bacteria es sometida a la condición ambiental al sustrato en comparación a la adhesión de una bacteria de control que no se ha sometido a las condiciones ambientales indica que la condición ambiental es efectiva en el incremento de la adhesión de la bacteria. 39. Método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Lactobacillus acidophilus , L . gasseri , L . j ohnsonii , y L . plan tarum . 40. Método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el sustrato comprende una célula del tracto gastrointestinal o el tracto urogenital. 41. Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la célula comprende una célula epitelial o una célula mucosa. 42. Método para modular la adhesión en una bacteria, caracterizado porque comprende introducir en la bacteria al menos una molécula heteróloga de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 1, 3 ó 21; (b) una molécula de ácido nucleico que hibrida al complemento del ácido nucleico de (a) bajo condiciones severas, las condiciones severas que comprende hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60°C a 65°C; (c) una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 3 ó 21; o, (d) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad a SEQ ID NO: 2, 4 ó 22; en donde la adhesión en la bacteria se modula en comparación a la adhesión en una bacteria que no comprende la molécula heteróloga de ácido nucleico de (a) , (b) , (c) o (d) . 43. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Lactobacillus acidophilus , L. gasseri, L. johnsonii , y L. plantarum. 44. Método de conformidad con la 42, caracterizado porque el sustrato comprende una célula del tracto gastrointestinal o el tracto urogenital. 45. Método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la célula comprende una célula epitelial o una célula mucosa.