CN102212543A - 调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物 - Google Patents

调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102212543A
CN102212543A CN2011100813287A CN201110081328A CN102212543A CN 102212543 A CN102212543 A CN 102212543A CN 2011100813287 A CN2011100813287 A CN 2011100813287A CN 201110081328 A CN201110081328 A CN 201110081328A CN 102212543 A CN102212543 A CN 102212543A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
bacterium
seq
identity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011100813287A
Other languages
English (en)
Inventor
B·L·巴克
A·阿斯卡拉特-佩里尔
T·R·克莱哈默
E·阿尔特曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
North Carolina State University
Original Assignee
North Carolina State University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by North Carolina State University filed Critical North Carolina State University
Publication of CN102212543A publication Critical patent/CN102212543A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/23—Lactobacillus acidophilus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

提供了改善细菌与靶基质的粘附和/或改善细菌的应激耐受力的方法和组合物。方法包括使细菌暴露于粘附适应性条件且从而增加细菌的粘附活性和/或应激耐受力。进一步提供的是具有调节生产的自诱导物-2的细菌。组合物包括表达涉及自诱导物-2生产途径的核酸分子的重组细菌。进一步提供的是自诱导物-2相关的融合蛋白、抗原肽、抗体和载体。进一步提供的是筛选将刺激自诱导物-2生产和/或产生粘附适应性应答的化合物或环境条件的方法，以及用于使细菌增加粘附和/或应激耐受力的各种方法。

Description

调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物
本申请是申请日为2006年4月14日、发明名称为“调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物”、申请号为200680021504.5的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及细菌，特别是益生菌和乳酸菌，以及用于控制其中的细胞信号传导的方法和构建体。
发明背景
在小肠中，乳酸杆菌代表共生微生物区系的主要和重要组分。各种乳酸杆菌(Lactobacillus)种类已用作益生菌培养物，基于需要来自那种生物的特定利益和制造商所需的生物工艺特征，选择用于在食物或饮食辅助物中使用。所有益生菌培养物并不显示相同的特征，使得选择这些菌株和澄清其利益是极为重要的。乳酸菌且特别是乳酸杆菌是为了一系列预期的健康促进因素包括在食品中的常见种类。
乳酸菌(LAB)在各种环境小生境中天然发现，在所述小生境中它们作为复杂的微生物群落的成员存在。在每种小生境中的存活取决于该生物对各种条件的感觉和应答能力，所述条件例如温度、pH、营养物可用性、和细胞群体密度。LAB经常占据的一种主要小生境是哺乳动物的胃肠道(GIT)。多重信号转导途径可能控制粘着因子、应激应答基因和其他遗传决定子的表达，它们促进LAB在GIT的各种区室内的存活和竞争。某些肠乳酸杆菌连同革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌一起具有与肠上皮和其中的粘膜层结合的能力。这种结合被认为对于实现某些益生特性是重要的，所述益生特性包括竞争排斥、免疫调节、和递送生物治疗药物。尽管这种结合中涉及的分子机制仍未明了，但显然该过程是复杂的，涉及宿主-特异性、细菌-特异性、和环境因素。
某些肠乳酸杆菌连同革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌一起具有与肠上皮和其中的粘膜层结合的能力。定居这些表面的能力可以使益生菌获得超过其他固有和病原性微生物区系的显著优点。特别感兴趣的是这些细菌借以存活且潜在定居肠道的动态环境的机制。影响粘附的某些环境因素已得到研究，所述环境因素包括pH、生长期、和其他微生物的存在。
乳酸杆菌必须维持满足其自身生长需求以及经受得住不利条件之间的平衡，所述不利条件包括胃酸冲击、被宿主防御呈递和竞争微生物区系(Tannock(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：8419-8425)。然而，关于这些应激物如何影响乳酸杆菌与肠环境中的各种基质结合的能力知之甚少。
发明简述
提供了改善细菌与靶基质的粘附和/或改善细菌的应激耐受力(stress tolerance)的方法和组合物。方法包括使细菌暴露于粘附适应性条件(adhesion adaptive condition)且从而增加细菌的粘附活性和/或应激耐受力。进一步提供的是具有被调节水平的自诱导物-2(AI-2)的细菌。组合物包括表达参与自诱导物-2生产途径的核酸分子的重组细菌。进一步提供的是自诱导物-2相关的融合蛋白、抗原肽、抗体和载体。进一步提供了筛选将刺激自诱导物-2生产和/或产生粘附适应性应答的化合物或环境条件的方法，以及使用具有增加的粘附和/或应激耐受力的细菌的各种方法。
本发明在本文的附图和下文所述说明书中进一步详细说明。
附图简述
图1表示如显微镜观察到的，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCFM在体外与Caco-2细胞的粘附。细菌细胞(a)在未浓缩的条件(1x108CFU/ml)下于37℃孵育1小时，或(b)形成团块且在10X浓缩的条件(1x109CFU/ml)(AAR条件)下于37℃孵育1小时。
图2描述了粘附方案。
图3表示在标准孵育条件(实心棒)和粘附适应性条件(条纹棒)下，突变株和NCFM：：lacL对照菌株对Caco-2细胞的粘附特性。计数表示为平均细菌粘附/显微镜视野，且误差棒表示相对于平均值的1个标准差。
图4显示在嗜酸乳杆菌NCFM中由甲硫氨酸生产AI-2的途径。对于AI-2生产必需的中间产物以粗体表示，且编码每种酶的ORF在酶名称下列出。SAM-依赖性甲基转移酶缩写为SAM-MT。最后步骤涉及4，5-二羟基-2，3-戊二酮非酶促环化成AI-2。
图5显示与NCFM：：lacL对照菌株比较，嗜酸乳杆菌NCFM的LuxS-突变株与Caco-2细胞的粘附能力。
图6显示如从无菌中和上清液(条纹棒)中检测的，在嗜酸乳杆菌NCFM的生长期间产生的AI-2，且表示为亲本株的平均荧光/LuxS-突变株的平均荧光。由OD600表示的嗜酸乳杆菌NCFM生长(带圆圈的实线)以及pH的下降(带三角的虚线)，与对数生长期间AI-2的快速生产一致。每个值表示一式三份实验的平均值，且误差棒是相对于平均值的1个标准差。
图7表示暴露和不暴露于粘附适应性条件的对照菌株和所选嗜酸乳杆菌NCFM突变株的粘附特性。
图8的图表是在野生型(图A)或LuxS-突变株(图B)中过表达的总ORF的COG分类。饼形图中列出了COG群(图C)以及那个群中过表达的ORF的编号(COG，ORF的#)。
图9显示从(A)对数早期到中期或(B)从对数中期到晚期表达增加(无斜杠)或减少(斜杠)的ORF的编号。野生型由白色棒表示且LuxS-突变株由灰色棒表示。
图10表示在对数生长早期(OD6000.2)、对数生长中期(OD6000.7)和对数生长晚期(OD6001.2)收获的嗜酸乳杆菌NCFM(无斜杠)和LuxS-突变株(斜杠)的胆汁耐受力。将细菌群体进行稀释并在补充0.75％(白色棒)、1.0％(灰色棒)或2.0％(黑色棒)牛胆汁(Oxgall)的MRS上铺板。存活百分比通过与在无补充的MRS上生长的CFU/ml比较来计算。通过斯氏t检验(Student’s t test)(P＜0.05)检测的显著差异由星号(*)表示。误差棒是相对于平均值的1个标准差。
图11表示在对数生长早期OD6000.2(图A)、对数生长中期OD6000.7(图B)和对数生长晚期OD6001.2(图C)收获时，于55℃热应激后野生型(开环)和LuxS-(闭环)群体的存活。星号(*)指示对于那个时间点已检测到统计学显著差异(P＜0.05)。误差棒表示相对于平均值的1个标准差。
发明详述
本发明现在将在下文中参考附图更充分地描述，其中显示了本发明的某些但并非全部实施方案。事实上，本发明可以以许多不同形式体现且不应被解释为限制于本文所述实施方案；更正确地，提供这些实施方案从而使得本公开内容将满足可应用的合法要求。自始至终相同的编号指相同的元件。
有前文说明书和附图中呈现的教导的帮助，本文所述的本发明的许多修改和其他实施方案对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。因此，应当理解本发明并不限于公开的具体实施方案，并且修改和其他实施方案预期包括在所附权利要求的范围内。尽管本文使用了特定术语，但它们仅以一般和描述性意义而不是为了限制性的目的使用。
如本文使用的，如说明书和权利要求自始至终所使用的，“a”、“an”和“the”可以是单数或复数的。例如细胞可以指单个细胞或多个细胞。
同样如本文使用的，“和/或”指包含一种或多种所列项目的任何和所有可能组合，以及当以选择性解释(“或”)时缺乏组合。
I.概况
提供了改善细菌与靶基质的粘附和/或改善细菌的应激耐受力的方法和组合物。共生生物例如益生菌对胃肠道或泌尿生殖道的细胞的粘附增加可以减少肠、泌尿生殖道和创伤部位的感染危险。类似地，改善益生生物的应激耐受力从而使得益生菌的存活率在肠道的苛刻环境中增加，将进一步帮助减少肠、泌尿生殖道和创伤部位的感染危险。
在一个实施方案中，本发明已鉴定“粘附适应性条件”。如本文使用的，“粘附适应性条件”包括改善细菌与基质的粘附的任何物理、化学、生物学或类似条件。本发明已证实用这些粘附适应性条件预处理细菌细胞导致粘附增加和/或应激耐受力增加。如本文使用的，改善的细菌粘附特性称为“粘附适应性应答(adhesion adaptiveresponse)”或“AAR”。其水平和/或活性在粘附适应性条件下被调节的多肽和多核苷酸在本文中称为“粘附适应性应答相关”或“AAR相关”多肽或多核苷酸。本文公开了各种AAR相关多核苷酸和多肽。参见下表8和9。另外的AAR相关多核苷酸及其编码的多肽在SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、33、34、35、36、37和38中列出。
进一步提供的是调节细菌的自诱导物-2途径、且从而调节细菌的粘附和/或应激耐受力的方法和组合物。更具体而言，提供了细菌中的自诱导物-2(AI-2)生产途径的多核苷酸和多肽。细菌细胞通常经由细胞密度感受机制(quorum sensing mechanisms)沟通，所述细胞密度感受机制涉及基因表达变化前的自诱导物的密度依赖性识别。可以用于在种类中和种类间沟通的一种重要的细胞密度感受系统基于称为自诱导物-2(AI-2)的呋喃硼酸二酯(furanosyl borate diester)，它通过4个酶促步骤由甲硫氨酸产生。AI-2调节众多种类中的各种表型表达，所述表型包括毒力因子、DNA加工、细胞形态、运动性、生物膜形成、毒素生产、光生产、和细胞分裂(Xavier等人(2003)Curr.Opin.Microbiol.6：191-197)。因此，提供了允许调节AI-2途径中的多肽水平和/或活性的方法和组合物，且从而提供了调节各种细菌表型的能力。AI-2途径的多核苷酸和多肽序列在SEQ ID NO：1、2、3、4、13、14、15、16、21或22中列出。此类序列在本文中称为“AI-2相关序列”。
II.AI-2相关和AAR相关多肽和多核苷酸
提供了使用本发明的各种AAR相关和AI-2相关多核苷酸和多肽的组合物。本发明进一步提供了这些AI-2相关或AAR相关序列的片段和变体，它们也可用于实践本发明的方法。如本文使用的，术语“基因”和“重组基因”指包含可读框的核酸分子，特别是编码涉及AI-2生产或ARR中的蛋白质的那些。本发明的分离核酸分子包含编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、34、36或38中列出的AI-2相关或AAR相关蛋白质的核酸序列，SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、33、35或37中列出的核酸序列，及其变体和片段。如下所述本发明还包含反义核酸分子。
还包括了AI-2生产或ARR中涉及的分离的多肽和蛋白质，及其变体和片段，以及用于生产那些多肽的方法。为了本发明的目的，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。示例性的AI-2相关多肽包括SEQID NO：2、4、14、16、22。示例性的AAR相关多肽包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、34、36和38。
“AI-2生产”或“粘附适应性应答(AAR)”指根据标准测定法技术在体内或体外测定的生物或功能活性。例如，AI-2生产可以使用报道菌株哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和自诱导物生物测定法进行测量(DeKeersmaecker等人(2003)Microbiology 149：1953-6)。另外的测定法涉及例如在本文其他地方描述的粘附适应性条件下测量细菌存活或生长。
本发明的细菌和方法对于细菌发酵有用，例如当希望刺激AI-2生产、或促进细菌在基质上的粘附或生物膜形成以进行发酵过程时。
本发明的细菌可用作益生菌，例如当希望促进AI-2生产、或促进细菌在肠或肠壁上的粘附或生物膜形成，以竞争性排斥其他较不需要的细菌。
诱导细菌中的细胞信号传导或粘附适应性应答的方法可用于刺激AI-2生产，或促进细菌粘附或生物膜形成(所述细菌包括重组和非重组的野生型细菌)，刺激AI-2生产、或促进益生菌的粘附或生物膜形成。
本发明包含的核酸和多肽组合物是分离的或基本上纯化的。“分离的”或“基本上纯化的”意指核酸或多肽分子，或生物学活性片段或变体，基本上或大体上不含在其天然状态下通常发现与所述核酸分子或蛋白质结合的组分。此类组分包括其他细胞材料，来自重组生产的培养基、和在蛋白质或核酸的化学合成中使用的各种化学药品。优选地，本发明的“分离的”核酸不含在核酸所来源的生物的基因组DNA中位于目的核酸侧翼的核酸序列(例如5’或3’末端处存在的编码序列)。然而，分子可以包括不会有害地影响组合物的基本特性的某些额外碱基或部分。例如，在各种实施方案中，分离的核酸分子包含在所述核酸分子所来源的细胞中通常与基因组DNA结合的少于5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列。类似地，基本上纯化的蛋白质具有少于约30％、20％、10％、5％或1％的(干重)污染蛋白质，或非AI-2相关或非AAR相关蛋白质。当蛋白质重组生产时，优选地培养基占少于30％、20％、10％或5％的蛋白质制剂体积，且当蛋白质化学生产时，优选地制剂具有少于约30％、20％、10％或5％的(干重)与AI-2生产或粘附适应性条件无关的化学前体或化学药品。
i.片段和变体
本发明提供了包含编码AI-2相关或AAR相关蛋白质的核苷酸序列的分离的核酸分子，以及由其编码的AI-2相关或AAR相关蛋白质。还提供了这些核苷酸序列以及编码的蛋白质的片段和变体。核苷酸序列或蛋白质的“片段”意指核苷酸或氨基酸序列的部分。
本文公开的核酸分子的片段可以用作杂交探针以鉴定编码AI-2相关或AAR相关蛋白质的核酸，或可以用作AI-2相关或AAR相关核酸分子的PCR扩增或突变中的引物。核酸片段还可以与物理基质结合以构建巨阵列或微阵列(例如，美国专利号5,837,832；美国专利号5,861,242)。此类核酸阵列可以用于研究基因表达或鉴定与靶序列具有充分同一性的核酸分子。
本发明进一步提供了核酸阵列或芯片，即作为分子探针精确组织或排列在固体支持体上的大量核酸(例如DNA)，这允许基因测序、研究其中包含的突变和/或分析基因表达，因为考虑到它们非常小的尺寸和就分析数目而言的高容量，此类阵列和芯片是目前感兴趣的。
这些核酸阵列/芯片的功能基于附着至载体的分子探针，主要是寡核苷酸，所述载体一般具有数平方厘米或需要时更大的尺寸。对于分析，例如DNA阵列/芯片中的载体用DNA探针(例如寡核苷酸)包被，所述DNA探针排列在载体上的预定场所或位置处。包含已预先标记的待分析靶核酸和/或其片段，例如DNA或RNA或cDNA的样品，与DNA阵列/芯片接触，导致通过杂交形成双链体。洗涤步骤后，芯片表面的分析允许通过标记的靶发出的信号定位任何杂交。通过计算机处理的杂交指纹结果允许取回下列信息：例如基因表达、样品中特定片段的存在、序列测定和/或突变鉴定。
在本发明的一个实施方案中，靶核酸和本发明核酸之间的杂交可以通过本领域众所周知的荧光、放射性、电子检测等进行检测，所述核酸以探针的形式使用且在DNA芯片/阵列上放置或原位合成。
在另一实施方案中，本发明的核苷酸序列可以以DNA阵列/芯片的形式使用，以进行AI-2生产或AAR中涉及的基因表达分析。这种分析基于在其上存在探针的DNA阵列/芯片，所述探针由于其特异性而选择以表征给定基因或核苷酸序列。待分析的靶序列在芯片上杂交前进行标记。洗涤后，检测和定量标记的复合物，杂交至少一式两份地进行。相对于相同探针用于不同样品和/或对于相同样品使用不同探针获得的信号强度的比较分析，允许例如来源于样品的RNA的差示转录。
在再一实施方案中，包含本发明核苷酸序列的阵列/芯片可以包含对其他微生物特异的核苷酸序列，这允许连续测试和快速鉴定样品中存在的微生物。
在一个进一步的实施方案中，DNA阵列/芯片的原理还可以用于生产蛋白质阵列/芯片，在其上支持体已用本发明的多肽和/或抗体或其阵列代替核酸而包被。这些蛋白质阵列/芯片使得能够例如通过表面等离子共振(SPR)分析由上的靶的亲和力捕获诱导的生物分子相互作用，所述载体用蛋白质包被。本发明的多肽或抗体能够特异性结合来源于待分析样品的抗体或多肽，可以在蛋白质阵列/芯片中用于检测和/或鉴定样品中的蛋白质和/或肽。
因此，本发明提供了包含以任何组合(包括重复)的本发明各种核酸的微阵列或微芯片，以及包含以任何组合(包括重复)的本发明各种多肽的微阵列。还提供的是包含以任何组合(包括重复)的一种或多种抗体的微阵列，所述抗体与本发明的各种多肽特异性反应。
“核酸分子”意指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)，以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选的是双链DNA。编码AI-2相关或AAR相关蛋白质的核酸分子片段可以编码蛋白质片段，所述蛋白质片段是生物学活性的，或它可以如下所述用作杂交探针或PCR引物。本文公开的多肽的生物学活性片段可以通过下列方法制备：分离本发明的核苷酸序列之一的一部分，表达AI-2相关或AAR相关蛋白质的编码的一部分(例如通过体外重组表达)，并评估AI-2相关或AAR相关蛋白质的编码的一部分的活性。编码AI-2相关或AAR相关蛋白质的核酸分子片段包含如本文公开的全长AI-2相关或AAR相关核苷酸序列中存在的至少约15、20、50、75、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600个核苷酸，或高达全长序列的核苷酸的总数目(例如对于SEQ ID NO：1为693个核苷酸，对于SEQ ID NO：3为942个核苷酸，对于SEQ ID NO：13为1116个核苷酸，对于SEQ IDNO：15为471个核苷酸等)。
氨基酸序列片段包括适合于用作免疫原的多肽片段，以产生针对AI-2生产或AAR中涉及的多肽的抗体。片段包括包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列充分同一于或来源于本发明的AI-2相关或AAR相关蛋白质或部分长度蛋白质，且显示AI-2相关或AAR相关蛋白质的至少一种活性，但包括比本文公开的全长AI-2相关或AAR相关蛋白质更少的氨基酸。在一个实施方案中，片段可以包括生物学活性的多肽。多肽的生物学活性部分是显示本发明全长蛋白质的至少一种活性(例如，与AI-2生产或AAR相关的活性)的部分。AI-2相关或AAR相关蛋白质的生物学活性部分可以是本发明的全长AI-2相关或AAR相关蛋白质中的长度为10、25、50、100、150、200、250、300、400、500个连续氨基酸，或高达其中存在的氨基酸总数目(例如，对于SEQ ID NO：2为231个氨基酸，对于SEQ ID NO：4为314个氨基酸，对于SEQ IDNO：14为372个氨基酸，对于SEQ ID NO：16为157个氨基酸等)的多肽。此类生物学活性部分可以通过重组技术制备并评估天然AI-2相关或AAR相关蛋白质的一种或多种功能活性。如本文使用的，包括偶数SEQ ID NOS：2-22、34、36或38的至少5个连续氨基酸。然而，本发明包含其他片段，例如蛋白质中超过6、7、8、9、10、20、50、100、200、300、400或超过500个氨基酸的任何片段。
本发明的AAR相关序列包含：编码纤连蛋白结合蛋白的SEQ ID NO：19和20；编码胞外多糖生产中涉及的蛋白质的SEQ ID NO：33、34、35和36；和编码脂磷壁酸和壁磷壁酸的D-丙氨酸酯化中涉及的蛋白质的SEQ ID NO：37和38。在具体实施方案中，SEQ ID NO：19或20的生物学活性变体或片段将仍具有与肠粘膜的结合活性，包括与纤连蛋白、粘蛋白或细胞外基质分子结合。测定这种活性的方法是已知的。例如，变体的纤连蛋白结合活性可以使用由FN-120包被的荧光微球体测定，所述FN-120是血浆纤连蛋白的糜蛋白酶的细胞结合片段。参见，例如，Schultz和Armant(1995)J.Biol.Chem.270(19)：11522-31。SEQ ID NO：33、34、35或36的生物学活性变体或片段将仍涉及胞外多糖的生产。胞外多糖生产可以通过Mozi，等人(2001)J.Appl.Microbiol.91(1)：160-167中描述的苯酚/硫酸定量方法来估计。SEQ ID NO：37或38的生物学活性变体或片段将仍涉及细菌中的脂磷壁酸的D-丙氨酸化(alanation)。D-丙氨酸摄取可以根据O’Brien，等人(1995)Microbios 83(335)：119-137描述的方法进行测量。
本发明的其他AAR相关序列包含涉及AI-2生产的酶，包括编码核苷磷酸化酶(pfs)的SEQ ID NOS：1和2；编码SAM依赖性甲基转移酶(SAM-MT)的SEQ ID NOS：3和4；编码甲硫氨酸腺苷基转移酶(metE)的SEQ ID NOS：13和14；编码S-核糖基同型半胱氨酸酶(luxS)的SEQ ID NOS：15和16；和编码甲硫氨酸腺苷基转移酶(metK)的SEQID NOS：21和22。在具体实施方案中，SEQ ID NOS：1、2、3、4、13、14、15、16、21或22的生物学活性变体或片段将仍分别具有上述酶活性。测定这些酶中每一种的活性的方法是已知的。例如metK活性可以通过根据Posnick和Samson(1999)J.Bacteriol.181(21)：6756-6762中描述的方法使用高效液相色谱定量S-腺苷基转移酶生产来测量。SAM-MT的甲基供体活性可以根据Borchardt等人(1974)J.Med.Chem.19(9)：1104-1110的方法来测定。MTA/SAH核苷活性可以通过如Della-Ragione等人(1995)Biochem.J.232：335-341和Cornell等人(1996)Biochem.J.317：285-290描述的，将14C-甲硫腺苷转变成14C-甲硫核糖后来测量。MetE活性可以根据Hondorp和Matthews(2004)PLoS Biol.2(11)：e336描述的测定法来测量。LuxS活性可以使用如本文其他地方描述的哈氏弧菌报道测定法来测量。
核苷酸和氨基酸序列的变体包含在本发明内。“变体”意指充分等同的序列。因此，本发明包含分离的核酸分子，所述核酸分子充分等同于编码偶数SEQ ID NOS：2-22、34、36或38中AI-2相关或AAR相关蛋白质的核苷酸序列，或在严格条件下与奇数SEQ ID NOS：1-21，33，35或37的核酸分子或其互补物杂交的核酸分子。变体还包括由本发明的核苷酸序列编码的变体多肽。另外，本发明的多肽具有的氨基酸序列充分等同于偶数SEQ ID NOS：2-22、34、36或38中所示的氨基酸序列。“充分等同的”意指一种氨基酸序列或核苷酸序列与第二种氨基酸序列或核苷酸序列比较，包含足够或最小数目的等价或相同氨基酸残基或核苷酸，从而提供共同的结构域和/或显示共同的功能活性。保守性变体包括由于遗传密码简并而不同的那些核苷酸序列。
一般而言，与偶数SEQ ID NOS：2-22、34、36或38中的任何氨基酸序列，或与奇数SEQ ID NOS：1-21、33、35或37中的任何核苷酸序列分别具有至少约45％、55％或65％的同一性，至少约70％或75％的同一性，至少约80％、85％或95％，至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的氨基酸序列或核苷酸序列在本文中定义为充分等同的。本发明包含的变体蛋白质是生物学活性的，即它们保留天然蛋白质的所需生物学活性。本发明的蛋白质的生物学活性变体与那种蛋白质的差别可以少至1-15个氨基酸残基、少至1-10，例如6-10，少至5、少至4、3、2、或甚至1个氨基酸残基。
天然存在的变体可以存在于群体内(例如，乳酸菌群体)。此类变体可以通过使用众所周知的分子生物学技术来鉴定，例如如下文描述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交。合成来源的核苷酸序列，例如由定点诱变或PCR介导的诱变产生、仍编码AI-2相关或AAP相关蛋白质的序列也作为变体。可以将一种或多种核苷酸或氨基酸置换、添加或缺失引入本文公开的核苷酸或氨基酸序列内，从而使得将置换、添加或缺失引入编码的蛋白质内。添加(插入)或缺失(截短)可以在天然蛋白质的N末端或C末端处进行，或在天然蛋白质内的一个或多个位点上进行。类似地，一个或多个核苷酸或氨基酸置换可以在天然蛋白质内的一个或多个位点上进行。
例如，保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的、优选非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以从蛋白质的野生型序列中改变而不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有类似侧链的氨基酸残基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。此类置换将不对保守氨基酸残基进行，或不对位于保守性基序内的氨基酸残基进行，在所述氨基酸残基对于蛋白质活性是必需的。
可替代地，突变可以沿着AI-2相关或AAR相关的编码序列长度的全部或部分随机进行，例如通过饱和诱变。突变型可以重组表达，且通过使用标准测定技术测定AI-2相关或AAR相关保护活性来筛选保留生物活性的那些。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，New York)以及其中引用的参考文献。在编码变体的DNA中进行的突变不应破坏可读框，且优选不会造成可以产生二级mRNA结构的互补区域。参见，EP专利申请公开号75,444。关于不影响目的蛋白质的生物活性的合适氨基酸置换的指导，可以在引入本文作为参考的Dayhoff等人(1978)Atlas ofProtein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型中找到。
本文包含的蛋白质序列的缺失、插入和置换不预期引起蛋白质特征中的根本变化。然而，当在进行置换、缺失或插入之前难以预测它们的确切效应时，本领域技术人员应当理解该效应将通过常规筛选测定法评估。即，活性可以通过比较修饰序列的活性与原始序列的活性来评估。例如，涉及AI-2生产或AAR的多肽的变体和片段活性可以通过使用本文其他地方公开的方法测定AI-2生产来测量。
本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还包含来源于诱变和重组基因操作例如DNA改组的序列。使用此类操作，一种或多种不同的AI-2相关或AAR相关蛋白质编码区可以用于制备具有所需特性的新AI-2相关或AAR相关蛋白质。以这种方式，重组多核苷酸文库由包含序列区域的相关序列多核苷酸群体产生，所述序列区域具有基本的序列同一性且可以在体外或体内同源重组。例如，使用这种方法，编码目的结构域的序列基序可以在本发明的A I-2相关或AAR相关基因和其他已知的AI-2相关或AAR相关基因之间改组，以获得编码具有改善的目的特性的蛋白质的新基因，例如在酶的情况下为Km增加。关于此类DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。
本发明的AI-2相关或AAR相关蛋白质的变体可以通过筛选AI-2相关或AAR相关蛋白质的突变体例如截短突变体组合文库来鉴定。在一个实施方案中，AI-2相关或AAR相关变体的多样化文库通过在核酸水平上的组合诱变来产生，且由多样化的基因文库编码。AI-2相关或AAR相关变体的多样化文库可以通过下列产生，例如，将合成寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列内，从而使得一组简并的潜在AI-2相关或AAR相关序列表达为多肽个体，或可替代地表达为在其中包含一组AI-2相关或AAR相关序列的一组较大的融合蛋白(例如，用于噬菌体展示)。存在各种方法可以用于由简并寡核苷酸序列产生潜在的AI-2相关或AAR相关变体文库。简并基因序列的化学合成可以在DNA自动合成仪中进行，且随后将合成基因连接到合适的表达载体内。一组简并基因的使用允许在一种混合物中供应编码所需潜在AI-2相关或AAR相关序列组的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见，例如，Narang(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。
另外，AI-2相关或AAR相关蛋白质编码序列的片段文库可以用于产生AI-2相关或AAR相关片段的多样化群体，用于筛选和随后选择AI-2相关或AAR相关蛋白质变体。在一个实施方案中，编码序列片段的文库可以通过下列产生：在其中每个分子只发生约1次缺口的条件下用核酸酶处理AI-2相关或AAR相关编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性以由不同的有缺口产物形成可以包括有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理从重新形成的双链体中去除单链部分，且将所得到的片段文库连接到表达载体内。通过这种方法，可以获得编码AI-2相关或AAR相关蛋白质的各种大小的N末端和内部片段的表达文库。
用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物，和用于在cDNA文库中筛选具有所选特性的基因产物的几种技术是本领域已知的。此类技术适合于快速筛选由AI-2相关或AAR相关蛋白质的组合诱变产生的基因文库。顺应高通量分析、用于筛选大型基因文库的最广泛使用的技术一般包括：将基因文库克隆到可复制的表达载体内，用所得到的载体文库转化合适的细胞，且在其中所需活性的检测促进载体分离的条件下表达组合基因，所述载体编码其产物被检测的基因。增强文库中的功能突变体频率的技术-递归总体诱变(Recursiveensemble mutagenesis)(REM)可以与筛选测定法组合使用，以鉴定AI-2相关或AAR相关变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering6(3)：327-331)。
ii.序列同一性
AI-2相关或AAR相关序列是具有保守功能特征的分子家族成员。“家族”意指具有充分的核苷酸序列或氨基酸序列同一性的2种或更多种蛋白质或核酸分子。包含高度多样性群体的家族可以分成亚家族。异种集团是被认为具有共同祖先的家族群体。异种集团成员通常具有类似的三级结构。“序列同一性”意指当在至少一个特定比对窗口比对2个序列的最大对应性时相同的核苷酸或氨基酸残基。“比对窗口”意指用于最佳比对的2个核苷酸序列或氨基酸序列的连续区段，其中与第一个序列比较起来第二个序列可以包含添加或缺失(即缺口)。一般地，对于核酸比对，比较窗口长度为至少20个连续核苷酸，且任选地可以是30、40、50、100或更长。对于氨基酸序列比对，比较窗口长度为至少6个连续氨基酸，且任选地可以是10、15、20、30或更长。本领域技术人员应当理解为了避免由于包括缺口造成的高度相似性，一般应引入缺口罚分且从匹配数目中减去。
家族成员可以来自相同或不同物种，且可以包括同源物以及不同蛋白质。通常，家族成员显示共同的功能特征。同源物可以基于其与本文公开的AI-2相关或AAR相关的核酸序列的同一性来分离，根据标准杂交技术在如下文公开的严格杂交条件下使用cDNA或其部分作为杂交探针。
为了测定2个氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比，进行比对。2个序列的同一性百分比是在比较窗口中由2个序列共有的相同残基数目的函数(即，同一性百分比＝相同残基数目/总残基数目x100)。在一个实施方案中，序列是相同的长度。类似于下文提及那些的方法可以用于测定2个序列之间的同一性百分比。方法可以伴随允许或不允许缺口而使用。比对还可以通过目视检查人工进行。
当氨基酸序列在保守置换方面不同时，同一性百分比可以向上调整以校正置换的保守性质。用于进行这种调整的方法是本领域已知的。一般地保守置换评分为部分而不是完全错配，从而增加序列的同一性百分比。
数学算法可以用于测定2个序列的同一性百分比。数学算法的非限制性例子是如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中修改的，Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法；Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Ady.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的总体比对算法；以及Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448的局部搜索比对法。
基于这些数学算法的各种计算机程序已设计为使得能够测定序列同一性。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法。获得与本发明的核苷酸序列同源的核苷酸序列的检索可以通过使用BLASTN程序，得分＝100，字长＝12来进行。为了获得与编码本发明蛋白质或多肽的序列同源的氨基酸序列，可以使用BLASTX程序，得分＝50，字长＝3。缺口比对可以使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中描述的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)来获得。为了检测分子之间的远缘关系，可以使用PSI-BLAST。参见Altschul等人(1997)同上。对于所有BLAST程序，可以使用各自程序的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。比对还可以通过目视检查人工进行。
可以用于测定序列同一性百分比的另一种程序是ALIGN程序(版本2.0)，它使用Myers和Miller(1988)同上的数学算法。当比较氨基酸序列时，对于这种程序可以使用PAM120加权残基表，缺口长度罚分12，和缺口罚分4。
除了ALIGN和BLAST程序外，BESTFIT、GAP、FASTA和TFASTA也是GCG Wisconsin Genetics Software Package，版本10(可从AccelrysInc.，9685 Scranton Rd.，San Diego，California，USA获得)的部分，且可以用于进行序列比对。优选程序是GAP版本10，它使用Needleman和Wunsch(1970)同上的算法。除非另有说明，本文提供的序列同一性相似性值指使用GAP版本10获得的值，其中使用下列参数：关于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；关于氨基酸序列的同一性％和相似性％，使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵；或任何等价程序。“等价程序”意指当与GAP版本10产生的相应比对进行比较时，对于所研究的任何2个序列，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配的比对和相同的序列同一性百分比的任何序列比较程序。
通过BLASTN、FASTA、BLASTP或类似算法产生的数据库中的序列与查询序列的比对通常描述为“命中”。通过BLASTN、FASTA、BLASTP或类似算法产生的查询序列与一个或多个数据库序列的命中比对且鉴定序列的相似部分。关于数据库序列的命中一般表示在查询序列的序列长度部分，即查询序列的部分或片段上的重叠。然而，重叠可以表示查询序列的全部长度。通过BLASTN、FASTA或BLASTP算法产生的查询序列与数据库中的序列比对中的命中通常按照相似性程度和序列重叠的长度的顺序排列。
通过BLASTN、FASTA或BLASTP算法与查询序列比对的多核苷酸和多肽命中产生“期望”值。期望值(E值)表示当搜索一定大小的数据库时，在一定数目的随机连续序列上可以“期望”看到的命中数目。期望值用作显著性阈值，用于确定与数据库例如或EMBL数据库的命中是否指示实际相似性。例如，对于多核苷酸命中指定的E值0.1理解为意味着在
Figure BDA0000053376120000181
数据库大小的数据库中，在具有类似得分的随机序列比对部分上可以期望看到0.1的匹配。通过这个标准，多核苷酸序列的比对和匹配部分随后具有95％的相同可能性。对于在比对和匹配部分上E值为0.01或更小的序列，使用BLASTN或FASTA算法在
Figure BDA0000053376120000182
数据库中随机发现匹配的可能性是1％或更小。
根据本发明的一个实施方案，本发明的“变体”多核苷酸和多肽包含当与本发明的多核苷酸或多肽序列比较时产生约0.01或更小的E值的序列。即，变体多核苷酸或多肽是当使用设定在本文描述的参数上的BLASTN、FASTA或BLASTP算法，以0.01或更小的E值测量时，具有至少99％的可能性与本发明的多核苷酸或多肽相同的任何序列。在其他实施方案中，变体多核苷酸是具有与本发明的多核苷酸相同或更少的核酸数目的序列，当使用设定在本文描述的参数上的BLASTN或FASTA算法，以0.01或更小的E值测量时，具有至少99％的可能性与本发明的多核苷酸相同。类似地，变体多肽是具有与本发明的多肽相同或更少的氨基酸数目的序列，当使用设定在本文描述的参数上的BLASTP算法，以0.01或更小的E值测量时，具有至少99％的可能性与本发明的多肽相同。
如上所述，同一性百分比通过下列测定：使用设定在本文描述的运行参数上的BLASTN、FASTA或BLASTP算法之一比对序列，且鉴定在比对部分上的相同核酸或氨基酸的数目；将相同核酸或氨基酸的数目除以本发明的多核苷酸或多肽序列的核酸或氨基酸总数目；并随后乘以100以测定同一性百分比。例如，具有220个核酸的本发明多核苷酸在通过使用本文描述的参数的BLASTN算法产生的比对中在23个核苷酸的片段上，具有与
Figure BDA0000053376120000183
数据库中具有520个核酸的多核苷酸序列的命中。这23个核苷酸的命中包括21个相同的核苷酸，1个缺口和1个不同的核苷酸。本发明的多核苷酸与文库中的命中的同一性百分比因此是21/220乘以100，或9.5％。
Figure BDA0000053376120000185
数据库中的该多核苷酸序列因此不是本发明多核苷酸的变体。
iii.同源序列的鉴定和分离
本发明包含基于其与本文所示AI-2相关或AAR相关核苷酸序列或其片段和变体的序列同一性鉴定的AI-2相关或AAR相关核苷酸序列。方法例如PCR或杂交可以用于鉴定来自cDNA或基因组文库的序列，例如，基本上等同于本发明序列的序列。参见，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：Laboratory Manual(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)和Innis，等人(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍知道的并且也在上文参考文献中公开。
在杂交技术中，杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，且可以由本文公开的已知核苷酸序列的全部或部分组成。另外，它们可以用可检测的基团例如32P，或任何其他可检测的标记，例如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子进行标记。用于杂交的探针可以基于本文公开的已知AI-2相关或AAR相关核苷酸序列，通过标记合成的寡核苷酸来制备。另外还可以使用基于已知的AI-2相关或AAR相关核苷酸序列或编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基设计的简并引物。杂交探针一般包含在严格条件下与本发明的AI-2相关或AAR相关核苷酸序列或其片段或变体的至少约10、优选约20、更优选约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。为了达到在各种条件下的特异性杂交，此类探针包括在AI-2相关或AAR相关蛋白质序列中独特的序列。用于制备用于杂交的探针的方法是本领域普遍知道的，且在引入本文作为参考的Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)中公开。
在一个实施方案中，编码AI-2相关或AAR相关蛋白质的完整核苷酸序列用作探针以鉴定新型AI-2相关或AAR相关序列和信使RNA。在另一实施方案中，探针是本文公开的核苷酸序列的片段。在某些实施方案中，在严格条件下与探针杂交的核苷酸序列长度可以是至少约300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸。
因此，除了本文公开的AI-2相关或AAR相关核苷酸序列及其片段和变体外，本发明的分离的核酸分子还包含通过与从本文公开的AI-2相关或AAR相关核苷酸序列或其变体和片段获得的全部或部分序列杂交从其他生物或细胞中鉴定和分离的同源DNA序列。
基本上相同的序列将在严格条件下互相杂交。“严格条件”意指在其下探针将与其靶序列杂交至比其他序列更大的可检测程度(例如，超过背景至少2倍)的条件。一般地，严格条件包含在其下具有至少约60％、65％、70％，或至少约75％的序列同一性的核苷酸一般保持互相杂交的那些杂交和洗涤条件。严格条件是本领域已知的，且可以在Ausubel等人，eds.(1989)Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley & Sons，New York)中找到。杂交一般发生少于约24小时，通常为约4-约12小时。
严格条件是序列依赖性的且在不同环境下将不同。全长或部分核酸序列可以用于获得由本发明包含的同源物和直向同源物。“直向同源物”意指来源于共同祖先基因且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。在不同物种中发现的基因视为直向同源物，当其核苷酸序列和/或其编码的蛋白质序列共享如本文其他地方定义的基本同一性时。直向同源物的功能在物种中通常是高度保守的。
当使用探针时，严格条件将是下列这些条件：其中在pH 7.0-8.3时盐浓度少于约1.5M Na离子，一般为约0.01-1.0M的Na离子浓度(或其他盐)，且温度对于短探针(例如10-50个核苷酸)为至少约30℃，且对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。
杂交后洗涤有助于控制特异性。2个关键因素是离子强度和最终洗涤液的温度。为了检测与全长或大约全长的靶序列杂交的序列，在严格条件下选择的温度比限定离子强度和pH下特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，取决于如本文以其他方式限定的所需严格程度，严格条件将包含比Tm低1℃-20℃的温度。对于DNA-DNA杂交物，Tm可以使用Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式确定：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(GC％)-0.61(form％)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，GC％是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，form％是杂交液中甲酰胺的百分比，且L是以碱基对表示的杂交物的长度。Tm是其中50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。
检测具有各种同源性程度的序列的能力可以通过改变杂交和/或洗涤条件的严格性来获得。对于100％相同的靶序列(同源探测)，必须获得不允许错配的严格条件。通过允许核苷酸残基发生错配，可以检测具有较低相似性程度的序列(异源探测)。对于每1％的错配，Tm降低约1℃；因此可以操纵杂交和/或洗涤条件以允许具有目标同一性百分比的序列杂交。例如，如果具有≥95％序列同一性的序列是优选的，那么Tm可以降低10℃。2个核苷酸序列可以是基本上相同的，但在严格条件下不能杂交，如果它们编码的多肽是基本上相同的。例如，当使用遗传密码的最大密码子简并制备核酸拷贝时，可以出现这种情况。
示例性的低严格条件包括于37℃使用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液杂交，和于50-55℃在1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCI/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括于37℃在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，和于55-60℃在0.5X-1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60-65℃在0.1X SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％-约1％SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时，一般为约4小时-约12小时。关于核酸杂交的广泛指导在Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)和Ausubel等人，eds.(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York)中找到。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
在PCR方法中，寡核苷酸引物可以设计用于在PCR反应中用于从任何目的生物中提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。PCR引物优选长度为至少约10个核苷酸，且最优选长度为至少约20个核苷酸。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域普遍知道的且在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)中公开。还参见Innis等人，eds.(1990)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(AcademicPress，New York)；以及Innis和Gelfand，eds.(1999)PCR MethodsManual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于，使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
iv.反义核苷酸序列
本发明还包含反义核酸分子，即，与编码蛋白质的有义核酸互补的分子，例如与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA序列互补的分子。因此，反义核酸可以与有义核酸氢键键合。反义核酸可以与整个AI-2相关或AAR相关编码链互补，或只与其部分互补，例如蛋白质编码区的全部或部分(或可读框)互补。反义核酸分子可以与编码AI-2相关或AAR相关蛋白质的核苷酸序列的编码链的非编码区反义。非编码区是位于编码区侧翼且不翻译成氨基酸的5’和3’序列。反义核苷酸序列在破坏靶基因表达中有用。可以使用与相应序列具有70％、80％或85％序列同一性的反义构建体。
已知本文公开的编码AI-2相关或AAR相关蛋白质的编码链序列(例如奇数SEQ ID NOS：1-21、33、35或37)，可以根据沃森和克里克碱基配对规律设计本发明的反义核酸。反义核酸分子可以与AI-2相关或AAR相关mRNA的完整编码区互补，但更优选的是只对AI-2相关或AAR相关mRNA的编码或非编码区的部分反义的寡核苷酸。反义寡核苷酸的长度可以是例如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸，或它的长度可以是100、200个核苷酸或更大。本发明的反义核酸可以使用本领域已知的化学合成和酶促连接操作来构建。
本发明的反义核酸分子可以是α-异头核酸分子(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)FEBS Lett.215：327-330)。本发明还包含核酶，这是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切割与其具有互补区域的单链核酸，例如mRNA。本发明还包含形成三螺旋结构的核酸分子。一般参见Helene(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27；和Maher(1992)Bioassays 14(12)：807。
在某些实施方案中，本发明的核酸分子可以在碱基部分、糖部分或磷酸盐主链处进行修饰，以改善例如分子的稳定性、杂交或溶解性。如本文使用的，术语“肽核酸”或“PNA”指其中脱氧核糖磷酸盐主链由假肽(pseudopeptide)主链替换，且只保留4种天然碱基的核酸模拟物，例如DNA模拟物。PNA的中性主链已显示允许在低离子强度的条件下与DNA和RNA特异性杂交。PNA寡聚物的合成可以使用例如Hyrup等人(1996)同上；Perry-O′Keefe等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670中描述的标准固相肽合成方案来进行。
在另一实施方案中，AI-2相关或AAR相关分子的PNA可以进行修饰，例如以增强其稳定性、特异性或细胞摄取，所述修饰包括使亲脂性或其他辅助基团与PNA附着，形成PNA-DNA嵌合体，或使用脂质体或本领域已知的其他药物递送技术。PNA-DNA嵌合体的合成可以如Hyrup(1996)同上；Finn等人(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63；Mag等人(1989)Nucleic Acids Res.17：5973；和Peterson等人(1975)Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119中描述的进行。
v.融合蛋白
本发明还包括AI-2相关或AAR相关的嵌合或融合蛋白。AI-2相关或AAR相关“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与非AI-2相关或AAR相关多肽可操作地连接的AI-2相关或AAR相关多肽。“AI-2相关”或“AAR相关多肽”指具有对应AI-2生产或AAR中涉及的多肽的氨基酸序列的多肽，而“非AI-2相关”或“非AAR相关多肽”指多肽具有的氨基酸序列对应的蛋白质基本上不等同于AI-2生产或AAR中涉及的多肽，且来源于相同或不同生物。在AI-2相关或AAR相关融合蛋白内，AI-2相关或AAR相关多肽可以对应AI-2相关或AAR相关蛋白质的全部或部分，优选包括AI-2相关或AAR相关蛋白质的至少一个生物学活性部分。在融合蛋白内，术语“可操作地连接”意指AI-2相关或AAR相关多肽和非AI-2相关或AAR相关多肽按可读框互相融合。非AI-2相关或AAR相关多肽可以与AI-2相关或AAR相关多肽的N末端或C末端融合。
连接的编码序列的表达产生形成融合蛋白的2种连接的异源氨基酸序列。载体序列(非AI-2相关或AAR相关多肽)可以编码加强或增加细菌宿主中的融合蛋白表达的载体多肽。由载体序列编码的融合蛋白的那部分，即载体多肽，可以是蛋白质片段、完整的功能部分、或完整的蛋白质序列。载体区域或多肽可以另外被设计为在融合蛋白纯化中使用，所述纯化使用抗体或对那种载体多肽特异的亲和纯化。同样地，载体多肽的物理特性可以用于允许选择性纯化融合蛋白。
特别感兴趣的载体多肽包括超氧化物歧化酶(SOD)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、N末端组氨酸(His)标记等。这种列举不希望是限制性的，因为加强AI-2相关或AAR相关蛋白质作为融合蛋白表达的任何载体多肽都可以在本发明方法中使用。
在一个实施方案中，融合蛋白是GST-AI-2相关或AAR相关融合蛋白，其中AI-2相关或AAR相关序列与GST序列的C末端融合。在另一实施方案中，融合蛋白是AI-2相关或AAR相关-免疫球蛋白融合蛋白，其中AI-2相关或AAR相关蛋白质的全部或部分与来源于免疫球蛋白蛋白质家族成员的序列融合。本发明的AI-2相关或AAR相关-免疫球蛋白融合蛋白可以用作免疫原，以在受试者中产生抗AI-2相关或AAR相关抗体，纯化AI-2相关或AAR相关配体，且在筛选测定法中鉴定抑制AI-2相关或AAR相关蛋白质与AI-2相关或AAR相关配体的相互作用的分子。
本领域技术人员将认识到特定的载体多肽根据纯化方案而选择。例如，His标记、GST和麦芽糖结合蛋白质代表具有它们可以与其结合和洗脱的可容易获得的亲和柱的载体多肽。因此，当载体多肽是N末端His标记例如六组氨酸(His6标记)时，AI-2相关或AAR相关融合蛋白可以使用包含金属螯合树脂，例如氮川三乙酸镍(Ni-NTA)，亚氨二乙酸镍(Ni-IDA)和含钴树脂(Co-树脂)的基质进行纯化。参见，例如，整体引入本文作为参考的Steinert等人(1997)QIAGEN News 4：11-15。当载体多肽是GST时，AI-2相关或AAR相关融合蛋白可以使用包含谷胱甘肽-琼脂糖珠(Sigma或Pharmacia Biotech)的基质进行纯化；当载体多肽是麦芽糖结合蛋白质(MBP)时，AI-2相关或AAR相关融合蛋白可以使用包含由直链淀粉衍生的琼脂糖树脂的基质进行纯化。
优选地，本发明的嵌合或融合蛋白通过标准重组DNA技术产生。例如，编码不同多肽序列的DNA片段可以按可读框连接在一起，或融合基因可以使用例如DNA自动合成仪来合成。可替代地，基因片段的PCR扩增可以使用锚定引物来进行，所述锚定引物在2个连续基因片段之间产生互补突出端，所述基因片段随后可以进行退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参见，例如，Ausubel等人，eds.(1995)CurreatProtocols in Molecular Biology(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。此外AI-2相关或AAR相关编码核酸可以克隆到商购可得的表达载体内，从而使得它与现有的融合部分按可读框连接。
融合蛋白表达载体一般被设计为容易去除载体多肽以允许AI-2相关或AAR相关蛋白质保留与其相关的天然生物活性。用于切割融合蛋白的方法是本领域已知的。参见，例如，Ausubel等人，eds.(1998)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.)。融合蛋白的化学切割可以使用试剂例如溴化氰、2-(2-硝基苯硫基)-3-甲基-3’-溴代假吲哚(bromoindolenine)、羟胺或低pH来完成。化学切割通常在变性条件下完成以切割在其它条件下不能溶解的融合蛋白。
当AI-2相关或AAR相关多肽与载体多肽的分离是希望的，且这些融合多肽之间的接头处的切割位点不是天然存在的时，融合构建体可以被设计为包含特定蛋白酶切割位点以促进载体多肽的酶促切割和去除。以这种方式，包含肽的编码序列、具有对目的酶特异的切割位点的连接子序列可以在载体多肽(例如，MBP、GST、SOD、或N末端His标记)的编码序列与AI-2相关或AAR相关多肽的编码序列之间进行按可读框融合。具有对切割位点的特异性的合适酶包括但不限于，因子Xa、凝血酶、肠激酶、凝乳酶(remin)、胶原酶、和烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶。关于这些酶的切割位点是本领域众所周知的。因此，例如，当将因子Xa用于切割载体多肽与AI-2相关或AAR相关多肽时，融合构建体可以被设计为包含编码因子Xa敏感性切割位点的连接子序列，例如，序列IEGR(参见，例如，引入本文作为参考的Nagai和(1984)Nature 309：810-812，Nagai和(1987)Meth.Emzymol.153：461-481，以及Pryor和Leiting(1997)Protein Expr.Purif.10(3)：309-319)。当将凝血酶用于切割载体多肽与AI-2相关或AAR相关多肽时，融合构建体可以被设计为包含编码凝血酶敏感性切割位点的连接子序列，例如，序列LVPRGS或VIAGR(分别参见，例如，引入本文作为参考的Pryor和Leiting(1997)Protein Expr.Purif.10(3)：309-319，以及Hong等人(1997)Chin.Med.Sci.J.12(3)：143-147)。关于TEV蛋白酶的切割位点是本领域已知的。参见，例如，在整体引入本文作为参考的美国专利号5,532,142中描述的切割位点。还参见Ausubel等人，eds.(1998)CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.)，第16章中的讨论。
vi.抗体
本发明的分离的多肽可以用作免疫原，以产生特异性结合AI-2相关或AAR相关蛋白质的抗体，或在体内刺激针对AI-2相关或AAR相关多肽的抗体产生。全长AI-2相关或AAR相关蛋白质可以用作免疫原，或可替代地，可以使用如本文描述的AI-2相关或AAR相关蛋白质的抗原肽片段。AI-2相关或AAR相关蛋白质的抗原肽包含偶数SEQ IDNOS：2-22、34、36或38中所示氨基酸序列的至少8、优选10、15、20或30个氨基酸残基，且包含AI-2相关或AAR相关蛋白质的表位，从而使得针对肽产生的抗体与AI-2相关或AAR相关蛋白质形成特异性免疫复合物。由抗原肽包含的优选表位是位于蛋白质表面上的AI-2相关或AAR相关蛋白质区域，例如，亲水性区域。
vii.测定法
公开了检测所公开的多肽和/或核酸分子表达以及样品中的其公开的活性的测定法。用于检测样品中公开的核酸或包含所公开多肽的蛋白质的存在或缺乏的示例性方法包括：获得来自下列的样品：食物/饮食/饲料产品，起始培养物(母体、种子、批/组、浓缩、干燥、冷冻干燥、冷冻的)，培养的食物/饮食/饲料产品、饮食补充物、生物加工发酵物、或已摄入益生材料的受试者，且使样品与能够检测所公开的多肽或核酸(例如包含所公开的核酸或其片段的mRNA或基因组DNA)的化合物或试剂接触，从而使得检测样品中所公开序列的存在。使用来自食物、补充物、培养基、产品或受试者获得的结果可以与使用来自对照培养物、产品或受试者的样品获得的结果进行比较。
用于检测包含所公开核苷酸序列的mRNA或基因组DNA的一种试剂是能够与mRNA或基因组DNA的所公开的核苷酸序列杂交的标记核酸探针。核酸探针可以是例如所公开的核酸分子，例如奇数SEQ ID NOS：1-21、33、35、37的核酸或其部分，例如长度为至少15、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸，且在严格条件下足以与包含所公开核酸序列的mRNA或基因组DNA杂交的核酸分子。用于在本发明的测定法中使用的其他合适探针在本文中得到描述。
用于检测包含所公开多肽序列的蛋白质的一种试剂是能够与所公开的多肽结合的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选地是单克隆的。可以使用完整抗体，或其片段(例如Fab或F(abN)2)。术语“标记的”就探针或抗体而言意欲包含通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即物理连接)的探针或抗体的直接标记，以及通过与直接标记的另一种试剂反应的探针或抗体的间接标记。间接标记的例子包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体，和用生物素末端标记DNA探针，从而使得它可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。
术语“样品”意欲包括受试者中存在或从受试者中分离的组织、细胞和生物流体，以及来自起始培养物的细胞或携带此类培养物的食品，或来源于此类培养物的使用。即，本发明的检测方法可以用于在体外和体内检测样品中包含所公开序列的mRNA、蛋白质、或基因组DNA。用于检测包含所公开序列的mRNA的体外技术包括RNA杂交和原位杂交。用于检测包含所公开多肽的蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定法(ELI SA)、蛋白质印迹、免疫沉淀反应和免疫荧光。用于检测包含所公开核苷酸序列的基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。此外，用于检测包含所公开多肽的蛋白质的体内技术包括将针对所公开多肽的标记抗体引入受试者内。例如，抗体可以用放射性标记物标记，所述放射性标记物在受试者中的存在和定位可以通过标准成像技术来检测。
在一个实施方案中，样品包含来自已消费益生材料的测试受试者的蛋白质分子。可替代地，样品可以包含来自起始培养物的mRNA或基因组DNA。
本发明还包含用于检测样品中所公开核酸或包含所公开多肽的蛋白质存在的试剂盒。此类试剂盒可以用于测定表达本发明的特异性多肽的微生物是否存在于食品或起始培养物中，或已消费益生材料的受试者中。例如，试剂盒可以包含能够检测样品中的所公开多肽或mRNA的标记化合物或试剂，以及用于测定样品中所公开多肽的量的手段(例如，识别所公开多肽的抗体，或与编码所公开多肽的DNA结合的寡核苷酸探针，所述DNA例如奇数SEQ ID NOS：1-21、33、35或37)。试剂盒还可以包括详述此类化合物的使用的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包含例如：(1)与所公开多肽结合的第一种抗体(例如，附着至固体支持体)；和，任选地，(2)与所公开多肽或第一种抗体结合且与可检测试剂缀合的第二种不同抗体。对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包含例如：(1)与所公开核酸序列杂交的寡核苷酸，例如，可检测标记的寡核苷酸，或(2)用于扩增所公开核酸分子的引物对。
试剂盒还可以包含例如缓冲剂，防腐剂，或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包含对于可检测试剂的检测必需的组分(例如酶或底物)。试剂盒还可以包含对照样品或一系列对照样品，所述对照样品可以进行测定并与包含的测试样品比较。试剂盒的每种组分通常包装在单独容器内，且所有各种容器连同使用说明书一起在单个包装内。
在一个实施方案中，试剂盒包含阵列形式的多重探针，例如在例如美国专利号5,412,087和5,545,531以及国际公开号WO 95/00530中描述的那些，所述专利引入本文作为参考。用于在阵列中使用的探针可以如国际公开号WO 95/00530中所公开的直接在阵列表面上合成，或固定在阵列表面上之前合成(Gait，ed.(1984)，OligonucleotideSynthesis a Practical Approach IRL Press Oxford，England)。探针可以使用本领域技术人员众所周知的技术固定在表面上，例如美国专利号5,412,087中描述的那些。探针可以是核酸或肽序列，优选是纯化的，或抗体。
阵列可以用于筛选生物、样品、或产品在其基因组、cDNA、多肽或抗体含量方面的差异，包括特异性序列或蛋白质的存在或缺乏，以及那些材料的浓度。与捕获探针的结合例如通过由标记产生的信号来检测，所述标记附着至包含所公开的核酸序列的核酸分子、包含所公开的氨基酸序列的多肽、或抗体。该方法可以包括使包含所公开的核酸、多肽或抗体的分子与具有多个捕获探针的第一种阵列以及具有不同的多个捕获探针的第二种阵列接触。每种杂交的结果可以进行比较以分析第一种和第二种样品之间表达的差异。第一种多个捕获探针可以来自对照样品，例如野生型乳酸菌，或对照受试者，例如食物、饮食补充物、起始培养物样品或生物流体。第二种多个捕获探针可以来自实验样品，例如突变型乳酸菌，或已消费益生材料的受试者，例如起始培养物样品或生物流体。
这些测定法可能在其中不需要的材料的检测是必需的微生物选择和质量控制操作中特别有用。特定核苷酸序列或多肽的检测也可能在测定食物、发酵产品、或工业微生物，或已消耗益生菌的动物或人消化系统中存在的微生物的遗传组成中有用。
检测所公开多肽和/或核酸分子的表达的测定法还可以包括AI-2的检测和/或定量。用于检测AI-2的方法在本文其他地方得到描述。测量例如响应粘附适应性条件的粘附的测定法也可以进行测量以评估本发明多肽的表达。此类方法也在本文其他地方得到描述。
III.重组表达载体和宿主细胞
本发明的核酸分子可以包括在载体优选表达载体中。“载体”指能够转运已与其连接的另一种核酸的核酸分子。表达载体包括一种或多种调节序列且指导它们与之可操作地连接的基因的表达。“可操作地连接”意指目的核苷酸序列与调节序列连接，从而使得允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体引入宿主细胞内时在宿主细胞中)。术语“调节序列”意欲包括可控制的转录启动子、操纵子、增强子、转录终止子、及其他表达控制元件例如翻译控制序列(例如，S-D(Shine-Dalgarno)共有序列，起始和终止密码子)。这些调节序列将例如取决于使用的宿主细胞而不同。
载体可以在宿主细胞中自主复制(游离型载体)，或可以整合到宿主细胞的基因组内，且连同宿主基因组一起复制(非游离型哺乳动物载体)。整合型载体一般包含与细菌染色体同源的至少一种序列，这允许在载体和细菌染色体中的同源DNA之间发生重组。整合型载体还可以包含噬菌体或转座子序列。游离型载体或质粒是额外的DNA区段可以连接到其中的环状双链DNA环。当使用重组DNA技术时，能够在宿主中稳定维持的质粒一般是优选形式的表达载体。
本发明中包含的表达构建体或载体包含适合于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明核酸构建体。在原核宿主细胞中的表达包含在本发明中。本领域技术人员应当理解表达载体的设计可以取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质表达水平等。本发明的表达载体可以引入宿主细胞内，以由此生产由本文所述核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽(例如，AI-2相关或AAR-相关蛋白质，突变型AI-2相关或AAR-相关蛋白质，融合蛋白等)。
调节序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的那些，以及指导只在一定环境条件下核苷酸序列的诱导型表达的那些。细菌启动子是能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如，结构基因)下游区(3’)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区域，它通常置于邻近编码序列的5’末端。这个转录起始区域一般包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子还可以具有称为操纵子的第二种结构域，它可以与RNA合成在其上开始的邻近RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子允许负调节(诱导)转录，因为基因阻遏蛋白可以结合操纵子且从而抑制特定基因的转录。组成型表达可以在负调节元件例如操纵子不存在的情况下发生。另外，正调节可以通过基因激活蛋白结合序列来完成，所述序列如果存在则通常邻近RNA聚合酶结合序列(位于其5′侧)。
基因激活蛋白的例子是分解代谢物激活物蛋白(CAP)，它帮助起始lac操纵子在大肠杆菌(Escherichia coli)中的转录(Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18：173)。可调型表达因此可以是正调节或负调节的，从而增强或减少转录。正调节和负调节元件的其他例子是本领域众所周知的。可以包括在蛋白质表达系统中的各种启动子包括但不限于，T7/LacO杂合启动子、trp启动子、T7启动子、lac启动子和λ噬菌体启动子。任何合适的启动子可以用于进行本发明，包括天然启动子或异源启动子。异源启动子可以是组成活性或诱导型的。异源启动子的非限制性例子在Kullen和Klaenhammer的美国专利号6,242,194中给出。
编码代谢途径酶的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括来源于糖代谢酶的启动子序列，例如半乳糖、乳糖(lac)(Chang等人(1987)Nature 198：1056)和麦芽糖。另外的例子包括来源于生物合成酶的启动子序列，例如色氨酸(trp)(Goeddel等人(1980)Nucleic Acids Res.8：4057；Yelverton等人(1981)Nucleic AcidsRes.9：731；美国专利号4,738,921；EPO公开号36,776和121,775)。β-内酰胺酶(b1a)启动子系统(Weissmann，(1981)″The Cloning ofInterferon and Other Mistakes，″in Interferon 3(ed.I.Gresser)；λ噬菌体PL(Shimatake等人(1981)Nature 292：128)；阿拉伯糖诱导型araB启动子(美国专利号5,028,530)；和T5(美国专利号4,689,406)启动子系统也提供了有用的启动子序列。还参见其中讨论了大肠杆菌表达系统的Balbas(2001)Mol.Biotech.19：251-267。
另外，在自然界中不存在的合成启动子也起细菌启动子的作用。例如，一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列可以与另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，产生合成的杂合启动子(美国专利号4,551,433)。例如，tac(Amann等人(1983)Gene 25：167；deBoer等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：21)和trc(Brosius等人(1985)J.Biol.Chem.260：3539-3541)启动子是包含trp启动子和lac操纵子序列(由lac阻遏子调节)的杂合trp-lac启动子。tac启动子具有成为可诱导调节序列的另外特征。因此，例如，与tac启动子可操作地连接的编码序列的表达可以在细胞培养物中通过添加异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)来诱导。此外，细菌启动子可以包括具有结合细菌RNA聚合酶且起始转录的能力的非细菌来源的天然存在的启动子。非细菌来源的天然存在的启动子还可以与可相容的RNA聚合酶偶联，以在原核生物中产生某些基因的高水平表达。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统是偶联的启动子系统的例子(Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189：113；Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：1074)。另外，杂合启动子还可以包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域(EPO公开号267,851)。
载体可以另外包含编码适合于那种启动子的阻遏子(或诱导物)的基因。例如，本发明的诱导型载体可以通过表达编码LacI阻遏蛋白的基因调节来自Lac操纵子(LacO)的转录。其他例子包括使用lexA基因调节pRecA的表达，和使用trpO调节ptrp。还可以使用增加阻遏程度(例如lacIq)或修改诱导方式(例如，给予λpL热诱导的λCI857，或给予λpL化学诱导的λCI+)的此类基因的等位基因。
除功能性启动子序列之外，有效的核糖体结合位点也对于融合构建体表达有用。在原核生物中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgarno(SD)序列，且包括起始密码子(ATG)和长度为3-9个核苷酸且位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的序列(Shine等人(1975)Nature254：34)。SD序列被认为通过SD序列和细菌16S rRNA的3’末端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合(Steitz等人(1979)″Genetic Signals and Nucleotide Sequences in Messenger RNA，″in Biological Regulation and Development：Gene Expression(ed.R.F.Goldberger，Plenum Press，NY)。
AI-2相关或AAR相关蛋白质还可以通过制备嵌合DNA分子从细胞中分泌，所述嵌合DNA分子编码包含信号肽序列片段的蛋白质，所述信号肽序列片段使AI-2相关或AAR相关多肽在细菌中分泌(美国专利号4,336,336)。信号序列片段一般编码包含疏水性氨基酸的信号肽，所述信号肽指导来自细胞的蛋白质分泌。蛋白质分泌到生长培养基(革兰氏阳性菌)或位于细胞的内膜和外膜之间的周质空间内(革兰氏阴性菌)。优选存在可以在体内或体外进行切割的加工位点，它在信号肽片段和AI-2相关或AAR相关蛋白质之间编码。
编码合适的信号序列的DNA可以来源于分泌细菌蛋白质的基因，例如大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)(Masui等人(1983)FEBS Lett.151(1)：159-164；Ghrayeb等人(1984)EMBO J.3：2437-2442)和大肠杆菌碱性磷酸酶信号序列(phoA)(Oka等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：7212)。其他原核信号包括例如来自青霉素酶的信号序列、Ipp、或热稳定肠毒素II前导序列。
细菌例如嗜酸乳杆菌一般利用编码氨基酸甲硫氨酸(它在原核生物中被修饰成N-甲酰甲硫氨酸)的起始密码子ATG。细菌还识别其它起始密码子，例如密码子GTG和TTG，它们分别编码缬氨酸和亮氨酸。然而，当它们用作起始密码子时，这些密码子指导甲硫氨酸而不是它们通常编码的氨基酸的掺入。嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM识别所述其它起始位点且掺入甲硫氨酸作为第一个氨基酸。
一般地，由细菌识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3’的调节区域，且因此与启动子一起位于编码序列的侧翼。这些序列指导mRNA的转录，所述mRNA可以翻译成由DNA编码的多肽。转录终止序列通常包括能够形成茎环结构的DNA序列(约50个核苷酸)，所述茎环结构帮助使转录终止。例子包括来源于含强启动子的基因的转录终止序列，例如大肠杆菌中的trp基因以及其他生物合成基因。
表达载体将具有多个限制性位点用于插入AI-2相关或AAR相关序列，从而使得它在调节区域的转录调节下。确保载体在细胞中维持的可选择的标记基因也可以包括在表达载体中。优选的可选标记包括赋予抗药性的那些，所述药物例如氨苄西林、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环素(Davies等人(1978)Annu.Rev.Microbiol.32：469)。可选标记还可以允许细胞在基本培养基上，或在毒性代谢产物的存在下生长，且可以包括生物合成基因，例如在组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些。
如本文使用的，“异源的”序列是起源于外源物种的序列，或当起源于相同物种时，通过故意的人类干预在组成和/或基因组基因座方面由其天然形式基本上修饰的序列。例如，与异源多核苷酸可操作地连接的启动子来自与该多核苷酸所来源的物种不同的物种，或当来自相同/类似物种时，一种或两种可以由其最初形式和/或基因组基因座基本上修饰，或者启动子不是关于可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。
调节区域对于宿主细胞和/或本发明的核苷酸序列可以是天然的(同源的)，或可以是外源的(异源的)。调节区域也可以是天然的或合成的。当区域对于宿主细胞是“外源的”或“异源的”时，这意指该区域在引入其的天然细胞中未发现。当区域对于本发明的AI-2相关或AAR相关核苷酸序列是“外源的”或“异源的”时，这意指该区域对于可操作地连接的本发明的AI-2相关或AAR相关核苷酸序列不是天然的或天然存在的区域。例如，该区域可以来源于噬菌体。尽管使用异源调节区域表达序列可能是优选的，但也可以使用天然区域。在某些情况下，此类构建体将预期改变宿主细胞中的AI-2相关或AAR相关蛋白质的表达水平。因此，可以改变宿主细胞的表型。
在表达盒的制备中，可以操纵各种DNA片段，以便提供在正确的方向上和适当时正确的可读框内的DNA序列。为了这个目的，可以使用接头或连接子来连接DNA片段，或可以涉及其他操纵以提供方便的限制性位点、去除多余DNA、去除限制性位点等。为了这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、重置换，例如转换和颠换。
本发明进一步提供了重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体内的本发明的DNA分子。即，DNA分子以允许RNA分子表达(通过DNA分子转录)的形式与调节序列可操作地连接，所述RNA分子对于AI-2相关或AAR相关mRNA是反义的。可以选择与以反义方向上克隆的核酸可操作地连接的调节序列，以指导反义RNA分子的连续或诱导型表达。反义表达载体可以是重组质粒或噬菌粒的形式，其中反义核酸在高效调节区域的控制下生产，所述调节区域的活性可以通过载体引入其中的细胞类型来测定。关于使用反义基因调节基因表达的讨论，参见Weintraub等人(1986)Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷。
可替代地，某些上述组分可以一起置于转化载体中。转化载体一般包含在复制子中维持的可选标记，或发展成如上所述的整合型载体。
IV.微生物或细菌宿主细胞
任何目的细菌可以在本发明的方法和组合物中使用。在本发明的具体实施方案中，方法中使用的细菌是益生菌。“益生菌”意指通过胃肠道时存活且对受试者具有有益影响的活微生物。如本文使用的，“益生特性”包含增强肠功能和稳定性；改善针对传染性和非传染性疾病的保护；免疫系统调节；减轻乳糖不耐受性；改善消化和营养素吸收；减少血胆固醇；减少过敏危险；和减少泌尿道感染危险。在某些实施方案中，细菌中的粘附、应激耐受性或AI-2生产的增加导致细菌的至少一种益生特性改善。
在本发明的其他实施方案中，细菌是乳酸菌。如本文使用的，“乳酸菌”意指来自选自下列的属的细菌：气球菌属(Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、差异球菌属(Alloiococcus)、狡诈球菌属(Dolosigranulum)、乳球形菌属(Lactosphaera)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)(Holzapfel等人(2001)Am.J.Clin.Nutr.73：365S-373S；Sneath，ed.(1986)Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology第2卷，Lippincott，Williams和Wilkins，Hagerstown，MD)。
在再其他的实施方案中，使用乳杆菌。“乳杆菌”意指来自乳杆菌属的任何细菌，包括但不限于，干酪乳杆菌(L.casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、约氏乳杆菌(L.johnsonnii)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)，以及由Wood等人(Holzapfel和Wood，eds.(1995)The Genera of Lactic Acid Bacteria，第2卷，Springer，New York)概述的众多其他物种。
包含异源基因的细菌的生产、此类细菌的起始培养物的制备、以及使底物特别是食物例如乳发酵的方法，可以依照已知技术来进行，包括但不限于在
Figure BDA0000053376120000371
和Bigret(1993)Lactic AcidBacteria.Salminen和vonWright eds.Marcel Dekker，Inc.New York.65-96.；Sandine(1996)Dairy Starter Cultures Cogan和Accolaseds.VCH Publishers，New York.191-206；Gilliland(1985)Bacterial Starter Cultures for Food.CRC Press，Boca Raton，Florida中描述的那些。
“发酵”意指有机化合物经由微生物产生能量、代谢降解，这一般在厌氧条件下进行且伴随气体的放出。
本发明的核酸分子或氨基酸序列可以通过本领域已知的方法引入宿主细胞内。“引入”意指经由常规转化或转染技术，或通过噬菌体介导的感染引入原核细胞内。如本文使用的，术语“转化”、“转导”、“接合”和“原生质融合”意指用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞内的各种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratoryManual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)及其他实验室手册中找到。
如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)中一般描述的，用于生产本发明的AI-2相关或AAR相关多肽的细菌细胞在合适的培养基中进行培养。
由本发明包含的细菌菌株包括细菌的生物学纯培养物，所述细菌包含本发明的至少一种核苷酸或氨基酸序列。这些菌株可以包括但不限于：嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌或植物乳杆菌。
异源表达控制序列或启动子可以依照已知技术与所需核苷酸序列可操作地结合，例如通过靶向插入，或通过同源重组的“基因激活”。参见，例如，美国专利号6,391,633和6,569,681。
“受试细菌或细胞”是其中已完成关于目的基因的遗传改变例如转化的细菌或细胞，源于如此改变的细胞且包含该改变的细胞，或已实施粘附适应性条件的细菌。“对照”或“对照细胞”或“对照细菌”提供了用于测量受试细菌表型中的变化的参考点。
对照细菌可以包含，例如：(a)野生型细菌，即具有与用于导致受试细菌的遗传改变的原材料相同的基因型；(b)具有与原材料相同的基因型但已用无效构建体(即已知对目的性状没有影响的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的细菌；(c)遗传学上等同于受试细菌但不暴露于粘附适应性条件或将调节AI-2生产的条件或刺激的细菌；或(d)处于目的基因不表达的条件下的受试细菌自身。
V.方法
i.粘附适应性应答的调节
在一个实施方案中，本发明已鉴定了“粘附适应性条件”。如本文使用的，“粘附适应性条件”包含改善细菌与基质的粘附的任何物理、化学、生物学或类似条件。粘附可以通过下列来调节：例如将细菌培养至所需细胞密度，且随后在增强细菌的粘附应答的条件下孵育细菌。为了本发明的目的，“培养”或“细胞培养”意欲描述在合成环境下生长的细胞。培养条件(例如生长培养基、pH、温度)对于每种细胞类型广泛不同，且对于具体细胞类型改变条件可以导致表达不同的表型。细胞一般在有利条件下培养以促进细胞生长。细胞可以在基本培养基(包含细菌生长所需的精确的营养素，包括任何生长因子)或复合培养基(通常包含可能是细菌生长所需的全范围的生长因子)中进行培养。还可以调整培养基的物理条件，例如pH和温度，以阻止某些生物的生长同时增强其他生物的生长。
在具体实施方案中，细菌培养条件包含在Mann-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基中于37℃或42℃厌氧培养。培养基可以进行修改以用半乳糖或其他合适的碳水化合物代替葡萄糖作为培养基中的糖来源。细胞可以在暴露于粘附适应性条件之前在对数生长早期(定义为在600nm处的光密度(OD600)高达0.4)，对数生长中期(OD600约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9)，或对数生长晚期(OD600大于0.9)收获。在具体实施方案中，收获OD600约0.6的细胞。细菌细胞例如通过在离心机或其他合适装置中沉降来收获并重悬浮于合适介质中。
收获的细菌细胞随后可以通过在粘附适应性条件下孵育(即，通过在粘附适应性条件孵育细菌细胞)进行预处理，这导致对靶基质的粘附增加。“孵育”指在特定条件(即，粘附适应性条件)下维持细菌群体以便促进特定反应(例如，粘附适应性应答)。粘附适应性条件可以包括例如，将细菌孵育一段足以增加细菌粘附的时间。在某些实施方案中，本发明的细菌孵育至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100或120分钟。在其他实施方案中，细菌在其中细胞已浓缩至密度为约1.5x108-约1x1010菌落形成单位/每毫升稀释剂(例如，MRS培养基)(cfu/ml)的条件下孵育，包括约2.0x108、3.0x108、4.0x108、5.0x108、6.0x108、7.0x108、8.0x108、9.0x108、1.0x109或更大cfu/ml。在特定实施方案中，浓度大于1.0x108cfu/ml。另外的实施方案包括在已调整至小于5的pH，包括4.5、4.0、3.5和3.0的培养基中孵育。在具体实施方案中，pH允许自然下降到约7.0-约4.5。取决于孵育条件，在使细菌与靶基质接触之前在这些或其他合适条件下孵育细菌细胞(“预处理”)可以增强或减少预处理细菌对靶基质的粘附。可以使用任何目的基质，包括例如胃肠道或泌尿生殖道的细胞。
粘附的增加包含与合适对照(例如，未暴露于粘附适应性条件的细菌)比较时与靶基质的粘附中任何统计学显著的增加。在具体实施方案中，增加可以包括但不限于，至少约90％、100％、120％、130％、140％、150％、200％、250％或更大。粘附的增加可以在体外通过例如使预处理细菌与合适靶(即上皮或粘膜细胞)接触并计数与靶基质粘附的细菌数目来测定。粘附的增加可以在体内通过监控针对预处理细菌的宿主应答来测定。例如，已在粘附适应性条件下预处理的益生菌的粘附可以通过监控益生特性的改善来评估，所述益生特性例如为：增强肠功能和稳定性；改善针对传染性和非传染性疾病的保护；免疫系统调节；减轻乳糖不耐受性；改善消化和营养素吸收；减少血胆固醇；减少过敏危险；和减少泌尿道感染危险。用于在体内测量细菌粘附的另外方法在Leffler，等人(1995)Methods Enzymol.253：206-220中描述。
在某些实施方案中，粘附的增加包含SEQ ID NO：19、20、33、34、35、36、37或38中的至少一种，或其变体或片段的表达调节。另外的实施方案包含这些序列中的2、3、4或更多种的表达调节。如本文其他地方定义的，粘附的调节可以通过比较本发明的多核苷酸在其中已引入该多核苷酸的细菌中的表达与对照细菌中相同多核苷酸的表达来测量。用于测量这些序列的表达的方法是本领域已知的且在本文其他地方讨论。
ii.AI-2生产的调节
本发明的组合物和方法可以用于调节细菌中的AI-2生产。“调节”、“改变”、或“修饰”意指靶生物活性的上调或下调，特别是活性的上调。本发明的核酸分子和多肽在乳酸菌的生物活性修饰中有用，特别是用于使具有营养或健康促进特征的食物发酵的乳酸菌。包含了来自本发明多核苷酸的表达的上调或下调。上调可以通过下列完成：提供多重基因拷贝，通过修饰调节元件来调节表达，促进转录或翻译机制，或其他方法。下调可以通过使用已知的反义和基因沉默技术来完成。
在具体实施方案中，本发明提供了包含至少一种异源AI-2相关核酸分子(即SEQ ID NO：1、3、13、15或21)，或其生物学活性变体或片段的细菌。另外的实施方案包括包含至少2种、至少3种、至少4种或至少5种如上所述的AI-2相关核酸分子的细菌。当与合适的对照细菌比较时，这些异源序列在细菌中的表达产生增加水平的自诱导物-2。如本文使用的，自诱导物-2的增加包含AI-2超过对照的任何显著增加。在具体实施方案中，增加可以包含但不限于，与合适对照比较时AI-2生产中至少约90％、100％、120％、130％、140％、150％、200％、250％或更大的增加。测定AI-2生产中的这种增加的方法在本文其他地方详细讨论。
具有AI-2生产增加的本发明细菌可以显示与靶基质的粘附增加和/或还显示应激耐受力改善。
表达本发明的多肽的微生物可用作饮食和发酵加工中的添加剂。多核苷酸序列、编码的多肽和表达它们的微生物在制备乳来源的产品中有用，所述产品例如乳酪、酸奶酪、发酵乳制品、酸乳和酪乳。表达本发明的多肽的微生物可以是益生生物，乳酸菌，或任何其他目的细菌宿主。
iii.应激耐受力和/或粘附的改善
如上文讨论的，本发明提供了具有改善的应激耐受力和/或粘附活性的细菌。如本文使用的，与靶基质的粘附中的改善包含与合适对照比较时与靶基质的粘附中的任何显著增加，包括但不限于，粘附中90％、100％、120％、130％、140％、150％、200％、250％或更大的增加。可以使用任何目的基质，包括例如胃肠道或泌尿生殖道的细胞。在具体实施方案中，细胞包含上皮细胞或粘膜细胞。进一步认识到细胞可以在体外或体内与细菌接触。
如本文使用的，细菌的应激耐受力改善包含与合适对照比较时在应激条件下细菌存活中的任何显著增加，包括但不限于，存活中约90％、100％、120％、130％、140％、150％、200％、250％或更大的增加。
具有改善的粘附和/或改善的应激耐受力的本发明益生菌可用于促进受试者健康。尽管不希望被任何作用机理限制，但具有这些增强特征的益生菌给受试者施用后可以阻断粘附并与病原体竞争；刺激宿主细胞免疫防御；和/或触发使来自病原体的毒力因子生产“沉默”的细胞信号传导事件。因此益生生物的应激耐受力和/或粘附活性改善将进一步帮助减少肠、泌尿生殖道和创伤位点的感染危险。
具有增加的应激耐受力和/或增加的粘附的益生菌可以给有此需要的任何受试者施用。例如，受试者可以包括哺乳动物、人、家畜或农业动物。施用可以是鼻、口、阴道或肛门的。在其中粘膜施用不是优选的情况中，细菌可以通过在本领域技术人员能力范围内的其他合适方法进行施用，即肠胃外途径(静脉内、腹膜内、皮下、肌内)。
应认识到具有改善的应激耐受力和/或改善的粘附的本发明细菌可以进一步表达具有治疗活性的至少一种多核苷酸和/或多肽。“治疗活性”意指当多肽递送给受试者时对那个受试者有利的生物效应。施用优选是足以显示对受试者的益处的“治疗有效量”。此类益处可以是至少一种症状的至少改善。在预防情况中，量可以足以减少对后续病原性攻击的个体的有害影响，例如通过增强免疫应答。施用的实际量、施用率和时间过程将取决于施用目的，例如考虑到攻击的性质和严重度所寻求的生物效应，且是常规优化的主题。治疗(包括预防接种)的处方，例如关于剂量的决定等在一般从业者和其他医生的职责内。
具有治疗活性且可以在具有改善的粘附活性或改善的应激耐受力的益生菌中表达的多核苷酸和/或多肽可以包括，例如胰岛素，生长激素，催乳素，降钙素，促黄体激素，甲状旁腺激素，生长抑素，促甲状腺激素，血管活性肠肽，采用反平行4α螺旋束结构的结构组1细胞因子例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL或IFN-α/β，TNF细胞因子家族例如TNFα、TNFβ、CI40、CD27或FAS配体，IL-1细胞因子家族，成纤维细胞生长因子家族，血小板衍生生长因子，转化生长因子β和神经生长因子，包含短链α/β分子的结构组3细胞因子，其作为大跨膜前体分子产生，所述前体分子各自在胞外区中包含至少一个EGF结构域，例如细胞因子的表皮生长因子家族，特征在于在保守半胱氨酸残基周围具有成群的氨基酸序列的趋化因子(C--C或C--X-C趋化因子亚群)或胰岛素相关细胞因子，显示镶嵌结构的结构组4细胞因子，例如包含不同结构域例如EGF、免疫球蛋白样和kringle结构域的调蛋白或神经调节蛋白(neuregulin)。可替代地，生物学活性多肽可以是关于如上定义的生物学活性多肽的受体或拮抗剂。在具体实施方案中，具有治疗活性的多肽包含抗原。对于可以在非病原性细菌中表达的其他治疗性多肽参见例如美国申请20030202991；Vandenbroucke等人(2004)Gastroenterology 127：667-8；Huyghebaert等人(2005)Eur J PharmBiopharm 59：9-15；Steidler等人(2000)Science 289：1352-1355；Steidler等人(2001)The Scientific World 1：215-217；美国申请号20020019043；所述文献各自整体引入本文作为参考。应认识到在具体应用中，治疗性多肽可以被改造以由益生菌分泌。
iv.筛选方法
提供了筛选增加细菌与基质的粘附的化学或环境条件的方法。该方法包括对细菌实施怀疑增加粘附和/或怀疑增加AI-2生产的环境条件；和使所述细菌与基质接触。与未实施环境条件的相同细菌的粘附比较，实施环境条件的细菌对基质的粘附增加表明该环境条件在增加细菌的粘附方面是有效的。
各种候选化学药品或环境条件可以用于这种筛选方法中。此类条件可以包括但不限于，AI-2的诱导物/抑制子或AI-2生产中涉及的任何基因、微生物因子(例如原核和真核生物)、温度、浓度、在粘附适应性条件中的孵育时间、孵育培养基的组成(例如，生长因子，碳水化合物，氨基酸，盐，矿物质等的存在、丰度和/或类型)、细胞密度、或pH。候选试剂可以是化学化合物，化学化合物的混合物，或生物大分子。此类候选试剂可以包含在各种试剂库中，包括例如，化合物文库、肽文库等。
通过这种方法鉴定的条件或化合物将刺激细菌，包括重组和非重组野生型细菌，以产生AI-2，或促进粘附或生物膜形成，用于发酵或益生菌中，或本文描述的任何其他方法中使用。
本发明在下文阐述的实施例中更详细地说明。
实验
实施例1
氨基酸序列的Gapped BlastP分析
本发明的序列使用Gapped BlastP比对法和本文公开的参数进行比对。表1概括了关于这些序列的最高Blast结果。
Gapped BlastP氨基酸序列比对显示SEQ ID NO：14(372个氨基酸，ORF LBA1080)与来自肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostocmesenteroides subsp.mesenteroides)的蛋白质在氨基酸11-371处具有约55％的同一性，所述蛋白质是甲硫氨酸合酶II(钴胺素非依赖性)蛋白质(登记号ZP_00064070.1)；与来自加氏乳杆菌的蛋白质在氨基酸5-372处具有约47％的同一性，所述蛋白质是甲硫氨酸合酶II(钴胺素非依赖性)蛋白质(登记号ZP_00046311.1)；与来自肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)的假定蛋白质(登记号NP_224351.1)在氨基酸7-372处具有约46％的同一性；与来自约氏乳杆菌的假定蛋白质(登记号NP_965623.1)在氨基酸4-372处具有44％的同一性；且与来自酒酒球菌(Oenococcus oeni)的蛋白质在氨基酸9-372处具有45％的同一性，所述蛋白质是甲硫氨酸合酶II(钴胺素非依赖性)蛋白质(登记号ZP_00069898.1)。
Gapped BlastP氨基酸序列比对显示SEQ ID NO：16(157个氨基酸，ORF LBA1081)与来自约氏乳杆菌的蛋白质在氨基酸1-157处具有约87％的同一性，所述蛋白质是自诱导物-2生产蛋白质LuxS(登记号NP_965624.1)；与来自加氏乳杆菌的蛋白质在氨基酸1-157处具有约87％的同一性，所述蛋白质是涉及自诱导物AI2合成的LuxS蛋白质(登记号ZP_00046310.1)；与来自牛链球菌(Streptococcusbovis)的蛋白质在氨基酸4-157处具有约76％的同一性，所述蛋白质是LuxS自诱导物2合酶(登记号dbj|BAD06876.1)；与来自植物乳杆菌的蛋白质在氨基酸1-157处具有77％的同一性，所述蛋白质是自诱导物生产蛋白质(登记号NP_784522.1)；且与来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的蛋白质在氨基酸4-157处具有73％的同一性，所述蛋白质是自诱导物-2生产蛋白质(登记号NP_269689.1)。
Gapped BlastP氨基酸序列比对显示SEQ ID NO：18(444个氨基酸，ORF LBA169)与来自嗜酸乳杆菌的蛋白质在氨基酸49-444处具有约95％的同一性，所述蛋白质是S层蛋白质前体(登记号sp|P35829|SLAP_LACAC)；与来自瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)的蛋白质在氨基酸49-443处具有约67％的同一性，所述蛋白质是表面层蛋白质(登记号emb|CAA62606.1)；与来自瑞士乳杆菌的蛋白质在氨基酸49-443处具有约67％的同一性，所述蛋白质是表面层蛋白质(登记号emb|CAB46984.1；AJ388558)；与来自瑞士乳杆菌的蛋白质在氨基酸49-443处具有66％的同一性，所述蛋白质是表面层蛋白质(登记号emb|CAB46985.1)；且与来自瑞士乳杆菌在蛋白质在氨基酸49-443处具有66％的同一性，所述蛋白质是表面层蛋白质(登记号emb|CAB46986.1)。
Gapped BlastP氨基酸序列比对显示SEQ ID NO：20(566个氨基酸，ORF LBA1148)与来自约氏乳杆菌的假定蛋白质(登记号NP_965038.1)在氨基酸4-564处具有约69％的同一性；与来自加氏乳杆菌的蛋白质在氨基酸4-564处具有约66％的同一性，所述蛋白质是与真核snRNP同源的预测的RNA结合蛋白(登记号ZP_00045959.1)，与来自屎肠球菌(Enterococcus faecium)的蛋白质在氨基酸4-566处具有约41％的同一性，所述蛋白质是与真核snRNP同源的预测的RNA结合蛋白(登记号ZP_00037499.1)；与来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的蛋白质在氨基酸4-566处具有约41％的同一性，所述蛋白质与纤连蛋白/纤维蛋白原结合蛋白同源(登记号NP_814975.1)；且与来自植物乳杆菌的蛋白质在氨基酸4-557处具有约41％的同一性，所述蛋白质是粘附蛋白(登记号NP_785358.1)。
Figure BDA0000053376120000461
氨基酸序列的PFAM分析
SEQ ID NO：2(231个氨基酸，ORF LBA820)包含来自大约氨基酸2-222的预测的PNP_UDP_1结构域，且是5’-甲基腺苷磷酸化酶(MTA磷酸化酶)家族成员(PFAM登记PF01048)。
SEQ ID NO：4(314个氨基酸，ORF LBA931)包含来自大约氨基酸6-312的PrmA结构域，且是核糖体蛋白L11甲基转移酶(PrmA)家族成员(PFAM登记PF06325)。
SEQ ID NO：14(372个氨基酸，ORF LBA1080)包含来自大约氨基酸11-369的预测的甲硫氨酸合酶结构域，且是维生素B12非依赖性甲硫氨酸合酶蛋白质家族成员(PFAM登记PF01717)。
SEQ ID NO：16(157个氨基酸，ORF LBA1081)包含位于大约氨基酸2-155的预测的LuxS结构域，且是LuxS蛋白质家族(LuxS)成员(PFAM登记PF02664)。
SEQ ID NO：20(566个氨基酸，ORF LBA1148)包含来自大约氨基酸1-425的预测的FbpA结构域，且是纤连蛋白结合蛋白A(FbpA)家族成员(PFAM登记PF05833)。
SEQ ID NO：22(399个氨基酸，ORF LBA1622)包含来自大约氨基酸2-102的预测的S-腺苷甲硫氨酸合成酶N末端结构域(PFAM登记00438)，来自大约氨基酸124-243的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中心结构域(PFAM登记02772)，和来自大约氨基酸245-384的S-腺苷甲硫氨酸合成酶C末端结构域(PFAM登记02773)。
细菌菌株和生长条件
乳杆菌菌株在MRS培养基(Difco Laboratories Inc.，Detroit，MI)中，或适当时在补充1.5％琼脂的MRS中，于37℃或42℃厌氧培养。大肠杆菌在Luria-Bertani(LB，Difco)培养基中或在补充1.5％琼脂的LB培养基上于37℃有氧繁殖。补充1.5％琼脂和150μg/ml红霉素(Em)的脑心浸液(BHI，Difco)培养基用于选择大肠杆菌转化株。自诱导物生物测定(AB)培养基(Bassler等人(1993)Mol.Microbiol.9：773-786)用于繁殖所有哈氏弧菌菌株。适当时，氯霉素(Cm，5.0μg/ml)和Em(5.0μg/ml或150μg/ml)用于选择。适当稀释并使用Whitley Automatic Spiral Plater(Don WhitleyScientific Limited，West Yorkshire，England)测定每毫升的菌落形成单位(CFU)。
表2.使用的细菌菌株和质粒
组织培养
只使用第40代和第50代之间的Caco-2(ATCC HTB-37，Rockville，MD)细胞。在Caco-2细胞维持中使用的所有试剂从Gibco(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)获得。细胞在补充20％(v/v)灭活的(56℃，30分钟)胎牛血清(FBS)、0.10mM非必需氨基酸和1.0nM丙酮酸钠的极限必需培养基(MEM)中，在95％空气-5％CO2大气中常规生长。单层受胰蛋白酶作用10分钟，使用血球计计数，且以1.3x105细胞/孔接种在2.0ml细胞培养基中。细胞在15mm Thermanox塑料盖玻片(Nalge Nunc International，Rochester，NY)上在Costar 12孔组织培养物处理的板(Corning Inc.，Acton，MA)中生长。培养基每2天更换，且所有粘附测定法在孵育14天后进行。
粘附测定法
乳杆菌菌株与Caco-2细胞的粘附根据先前描述的方法(Buck等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：8344-8351)进行检查。简言之，对数中期的细菌细胞(OD6000.6)在含3.0μg/ml Em的10mlMRS中制备以维持对整合体的选择压力。细胞通过在4000xg离心10分钟来取出且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次。细菌团块在粘附之前重悬浮于5ml新鲜MRS中。对于粘附适应性条件，来自对数中期培养物的细胞团块以～1.0x109cfu/ml重悬浮于1ml新鲜MRS中，并于37℃孵育1小时。细胞再次离心并在加入单层之前重悬浮于5ml新鲜MRS中。15天的Caco-2单层用PBS洗涤2次且用浓度为4x108CFU/ml的细菌悬浮液处理。细菌在MRS和细胞系培养基的混合物(1∶2v/v)中于37℃在单层上孵育1.5小时。孵育后，单层用PBS洗涤5次，在甲醇中固定并进行革兰氏染色。粘附的细菌细胞随后通过显微镜计数。对于每次实验计数一式两份的盖玻片。给出的最终数据共同表示一式两份的至少3次独立实验。使用关于每个盖玻片的总计数并且粘附表示为相对于对照菌株NCK1398(Russell和Klaenhammer(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：4361-4364)的百分比(％)，所述对照菌株NCK1398在lacL(β-半乳糖苷酶)基因中携带插入片段。使用这种对照，所有突变型培养物和亲本对照可以用Em制备以维持对LuxS-整合体的选择压力。粘附方案在图2中描述。
粘附适应性应答
10mL对数期(OD6000.7)细胞通过离心收获且重悬浮于1或10mL新鲜Mann-Rogosa Sharpe(MRS)生长培养基中且于37℃孵育1小时。重悬浮于10ml中的那些表示为“对照条件”(图1A)，而重悬浮于1ml中的那些是“粘附适应性条件”(图1B)。为了本发明的目的，孵育条件和在较少的(较浓缩的)培养基体积(例如，关于AAR组为1mlMRS，关于对照组为10ml MRS)中重悬浮视为粘附适应性条件。浓缩和孵育的细胞显示粘附显著增加(图1)。浓缩和孵育的细胞的粘附水平是未浓缩和孵育的对照细胞的至少20倍，尽管最初向每个孔中加入相同数目的细菌细胞。在每次实验中，细胞重悬浮于5ml新鲜MRS中且计数以确定加入Caco-2单层的细胞绝对浓度。只报告了由3.8x108-4.2x108CFU/ml的添加产生的粘附数据。细菌粘附中的类似增加在下列组中没有获得：10x浓缩而不孵育，或孵育(37℃，1小时)而在粘附之前不浓缩对数中期细胞，或孵育(37℃，1小时)而不在用乳酸调整至pH4.5的MRS中浓缩(数据未显示)。1小时孵育后，未浓缩细胞的pH是5.5，而浓缩细胞使pH降低至4.5。因此，细胞浓缩和pH减少的组合导致嗜酸乳杆菌细胞适应至明显更顺应粘附的状态。我们将这种现象命名为粘附适应性应答(AAR)。
图3显示暴露或不暴露于粘附适应性条件的对照菌株和所选突变株嗜酸乳杆菌NCFM的粘附特性。数据报告为单个盖玻片上的17个视野中的总细胞计数。每个数据点表示一式两份的至少2次实验。在β-半乳糖苷酶基因内包含整合的嗜酸乳杆菌NCFM充当“对照”，以便在所有突变型生长时维持Em选择。
微阵列分析
单个20mL嗜酸乳杆菌培养物在MRS中生长至OD6000.6，分成2个10ml的等分试样，且通过在3,150xg离心8分钟来收获。一个等分试样重悬浮于10ml新鲜MRS中，另一个重悬浮于1ml新鲜MRS中。2种培养物随后于37℃孵育1小时。孵育后，细胞通过离心收获且立刻冷冻于干冰-乙醇浴中。RNA分离使用TRIzol(LifeTechnologies，Rockville，MD)根据先前描述的方案(Azcarate-Peril等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：5794-5804)进行。RNA纯度和浓度通过在琼脂糖凝胶上电泳和标准分光光度计测量法来测定。
等量(25μg)总RNA使用Superscript II逆转录酶(ClontechLaboratories，Inc.，Mountain View，CA)在氨基烯丙基dUTP(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)的存在下用随机六聚物于42℃进行逆转录作用过夜以进行氨基烯丙基标记，随后为用N-羟基琥珀酰亚胺活化的Cy3或Cy5酯(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)荧光标记氨基烯丙基化的cDNA。标记的cDNA探针使用PCRPurification Kit(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。Cy3和Cy5染料与AA-dUTP标记的cDNA的偶联以及样品与微阵列的杂交使用标准方案进行。关于这些方案的另外信息可以在www.tigr.org/tdb/microarray/protocolsTIGR.shtml的TIGR网站上找到。荧光强度使用Packard Bioscience ScanArray 4000微阵列扫描仪(Global Medical Instruments，Inc，Ramsey，MN)获得并加工成TIFF图像。信号强度使用GSI Luminomics QuantArray 3.0软件包(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Inc.，Boston，MA)进行定量。每次实验有2个载玻片(各自包含一式三份的阵列)相反地与Cy3-和Cy5-标记的探针杂交(染料交换)。斑点通过适当量化(Azcarate-Peril等人，2005，同上)进行分析。局部背景随后从记录的斑点强度中减去。数据进行中值标准化。每种基因记录6个比率的中值。关于使用或不使用处理的每种基因重复斑点的平均绝对像素值之间的比率表示基因表达中的倍数变化。同时借助于双样品t检验计算关于倍数变化的置信区间和P值。0.05或更小的P值视为显著的(表3)。
表3.在粘附适应性条件下所选ORFs的差异表达a
Figure BDA0000053376120000511
Figure BDA0000053376120000521
Figure BDA0000053376120000531
a表2中以斜体显示的ORFs显示出与暴露于酸化至pH 4.5(3)的MRS的嗜酸乳杆菌NCFM的先前微阵列分析类似的表达模式。
暴露于粘附适应性条件的嗜酸乳杆菌NCFM的微阵列分析(表3)暗示种间信号-自诱导物-2(AI-2)的生产增加。在由甲硫氨酸生产AI-2的途径中开始(metK)和最后(luxS)的基因(参见图4)明显被诱导。另外，推定涉及AI-2输出的ABC转运体簇被诱导。
自诱导物-2生物合成途径
嗜酸乳杆菌NCFM基因组的进一步分析显示4个ORF(LBA1622、LBA0931、LBA0820、LBA1081)，该ORF显示出与由甲硫氨酸生产AI-2的生物合成途径中每种基因的同源性(图4)。MetK使甲硫氨酸转变成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)且推定由LBA1622(SEQ ID NO：21)编码。通过SAM依赖性甲基转移酶(由LBA931，SEQ ID NO：3编码)从SAM中去除甲基形成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，所述SAH随后通过MTA/SAH核苷酶Pfs(由LBA820，SEQ ID NO：1编码)解毒形成S-核糖基同型半胱氨酸(SRH)和腺嘌呤。LuxS(由LBA1081，SEQ ID NO：15编码)使SRH转变成同型半胱氨酸和4，5-二羟基-2，3-戊二酮，所述4，5-二羟基-2，3-戊二酮掺入硼进行环化以形成AI-2(Winzer等人(2002)Microbiology 148：909-922)。同型半胱氨酸最后通过MetE(由LBA1080，SEQ ID NO：13编码)甲基化回到甲硫氨酸，所述MetE正好位于luxS同源物LBA1081上游。2个ORF之间含-16.2千卡自由能的终止子暗示LBA1080和LBA1081分别表达。
表4列出了可获得基因组序列数据的其他乳杆菌，以及由甲硫氨酸生产AI-2的完整途径。
列出编码的蛋白质显示与由甲硫氨酸合成AI-2途径中每种酶的类似性的预测ORF数目是关于嗜酸乳杆菌NCFM(Altermann等人，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：3906-3912)，加氏乳杆菌、约氏乳杆菌NCC533(Pridmore等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：2512-2517)，和植物乳杆菌WCFS1(Kleerebezum等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：1990-1995)。嗜酸乳杆菌NCFM预测具有2个luxS拷贝，但ORF之一不包含表达信号例如启动子或核糖体结合区域。
AI-2生产
来自所选细菌菌株上清液的自诱导物-2的检测如先前所述(DeKeersmaecker和Vanderleyden，2003，同上)进行，同时进行了如下修改。由乳酸菌生产的AI-2的检测可能是有疑问的，由于耗尽的培养上清液pH减少，以及经由报道菌株哈氏弧菌BB170中lux操纵子的葡萄糖的降解物阻遏(DeKeersmaecker和Vanderleyden，2003，同上)。因此，用于检测自诱导物-2的所有乳杆菌群体在包含1％半乳糖而不是葡萄糖的改良MRS(mMRS)中生长。在指定时间点，收集4ml等分试样，测量OD600，且通过在4,000xg离心10分钟分离无细胞的上清液。上清液的pH用2N NaOH中和至pH 6.5且通过0.2μm膜过滤。制备的上清液贮存于4℃直至实验的时间过程结束时，且来自每种培养物的所有样品在分开的96孔微量滴定板中一起测定。报道菌株哈氏弧菌BB170(Azcarate-Peril，2005，同上)在自诱导物生物测定(AB)培养基中生长过夜，用新鲜AB洗涤并重悬浮于新鲜AB中至OD6000.5。10μl无菌上清液与90μl 1/1000稀释的报道菌株BB170在96孔板的每个孔中混合。发光在荧光微量滴定板阅读器(FLOUStar Optima，BMG Technologies，Durham，NC)中于30℃每10分钟测量一次，共6小时。诱导倍数通过下列计算：对至少6个标准时间点求平均值，且用由LuxS-突变型获得的平均值除以由野生型获得的平均值。每个样品在至少3个独立孔中进行测量且每个数据点表示3个独立样品。
为了测定AI-2在嗜酸乳杆菌NCFM生长期间的何时产生，在0、3、6、9、12、16、20、24、36和48小时由一式三份的培养物中收获上清液。在嗜酸乳杆菌生长期间的AI-2生产显示于图5中。与pH的快速下降一致，在对数生长期自始至终存在AI-2生产的显著增加。进入稳定期后，上清液中的AI-2活性维持恒定水平高达48小时(图5)。
luxS基因的插入失活
使用嗜酸乳杆菌NCFM染色体DNA作为模板，LBA1081(luxS)的471bp内部片段使用PCR与引物1081-IF(5’-GATCA GATCT AAGTTAAGGC ACCTT ACG-3’，SEQ ID NO：23)和1081-IR(5’-GATCT CTAGATTTCG AATGG GTCAT CAC-3’，SEQ ID NO：24)扩增。将内部片段克隆到整合型载体pORI28(Law，等人(1995)J.Bacteriol.177：7011-7018)内且随后通过电穿孔转化到嗜酸乳杆菌NCFM内，所述NCFM包含温度敏感性辅助质粒pTRK669(Russell和Klaenhammer，2001，同上)。随后根据Russell和Klaenhammer，2001，同上，进行用于选择整合体的步骤。质粒的成功整合通过连接片段的PCR和DNA杂交分析使用标准方案进行证实。
使用来自对数生长中期的细菌细胞和暴露于AAR条件的细胞测试LuxS-突变株NCK 1765与Caco-2细胞粘附的能力。当对数中期的细胞直接加入来自对数中期的Caco-2细胞时，与对照比较对于LuxS-突变株(图6)观察到粘附减少58％(斯氏t检测，P＜0.001)。在β-半乳糖苷酶中具有整合的嗜酸乳杆菌NCFM(NCK1398)衍生物用作对照，从而使得可以对突变型和对照维持抗生素压力。
结论
嗜酸乳杆菌NCFM在体外以显著增加该生物与肠上皮细胞的粘附能力的方式响应环境条件。暴露于这些粘附适应性条件的群体的转录微阵列分析暗示信号传导分子AI-2的生产增加。嗜酸乳杆菌NCFM的基因组分析鉴定了由甲硫氨酸生产AI-2所需的所有基因。来自嗜酸乳杆菌NCFM的AI-2生产使用哈氏弧菌报道菌株证实。在途径中的最后基因即luxS灭活后，与对照比较，在对数期细胞中观察到粘附减少，但在LuxS-突变株的粘附适应性应答中没有观察到差异。这些数据暗示乳杆菌与肠上皮的粘附可能涉及各种因素的直接相互作用。尽管AI-2介导的信号传导促进嗜酸乳杆菌NCFM的粘附能力，但这并不是群体内负责粘附适应性应答的唯一沟通方式。这些数据暗示乳杆菌与肠上皮的粘附可能涉及各种因素的直接相互作用。尽管AI-2介导的信号传导促进嗜酸乳杆菌NCFM的粘附能力，但这并不是群体内负责粘附适应性应答的唯一沟通方式。
实施例2
由LuxS和AI-2影响的基因表达的微阵列分析已对众多不同微生物种类进行，以便确定LuxS对细胞过程的功能。AI-2对在葡萄糖的存在和缺乏下生长的大肠杆菌K-12的影响显示与lsr操纵子、甲硫氨酸代谢和碳利用有关的基因的基因表达改变(12，32)。使用大肠杆菌微阵列的另一项研究表明LuxS生产与涉及细胞生长和分裂的基因相关(9)。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的LuxS-突变型及其野生型的转录微阵列分析暗示LuxS参与那种生物的应激应答(36)。除病原性细菌菌株之外，几种非病原性菌株已显示与AI-2生产相关的表型。例如，罗伊氏乳杆菌(LactobacilluS reuteri)在鼠类胃肠道中的生态性能在LuxS-突变型中改变(28)。这项研究利用完整基因组微阵列以鉴定在嗜酸乳杆菌NCFM中由LuxS影响的基因表达。涉及应激应答、生长和代谢的多个基因在LuxS-突变株中差异表达。LuxS-突变株的表型分析检查了luxS突变对嗜酸乳杆菌NCFM的热和胆汁耐受力的影响。
细菌菌株和生长条件
乳杆菌菌株在MRS培养基(Difco Laboratories Inc.，Detroit，MI)中，或适当时在补充1.5％琼脂的MRS中，于37℃或42℃厌氧培养。为了检测AI-2，乳杆菌在改良的MRS中生长，除了用1％w/v半乳糖代替葡萄糖之外，所述改良MRS采取MRS的成分。大肠杆菌在Luria-Bertani(LB，Difco)培养基中或在补充1.5％琼脂的LB培养基上于37℃有氧生长。补充1.5％琼脂和150μg/ml红霉素(Em)的脑心浸液(BHI，Difco)培养基用于选择大肠杆菌转化株。自诱导物生物测定(AB)培养基(5)用于繁殖所有哈氏弧菌菌株。适当时，氯霉素(Cm，5.0μg/ml)和Em(5.0μg/ml或150μg/ml)用于选择。每毫升的菌落形成单位(CFU)在10％MRS中使用Whitley AutomaticSpiral Plater(Don Whitley Scientific Limited，West Yorkshire，England)经适当稀释进行测定。
表5.使用的细菌菌株和质粒
Figure BDA0000053376120000571
DNA操纵技术
乳杆菌基因组总DNA根据Walker和Klaenhammer的方法进行分离(31)。对于核酸内切酶限制性切割、连接、DNA修饰和转化使用标准方案(23)。用于筛选大肠杆菌转化株用途的质粒制备遵照Zhou等人的方法(37)。大规模质粒制备使用QIAprep Spin试剂盒根据制造商的说明书(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)来进行。PCR根据制造商的建议使用Taq DNA聚合酶PCR系统(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)来进行。PCR引物由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成，且适当时，将限制性位点设计在引物的5’末端内以促进随后的克隆步骤。DNA片段使用Zymoclean Gel DNARecovery试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)从1.0％琼脂糖凝胶中提取。电感受态的乳杆菌细胞如Walker等人所述进行制备(30)。基因组DNA的DNA杂交使用标准方案进行。
表6.在这项研究中使用的引物
Figure BDA0000053376120000581
a有下划线的是用于克隆的限制性酶位点。
LuxS的无标记灭活
嗜酸乳杆菌NCFM的LuxS-突变株根据先前所述方案通过luxS(LBA1081)内的97bp缺失来构建(2，6)。简言之，包含luxS的1,243bp片段使用引物LuxS-EF和LuxS-ER进行扩增(表6)。随后将该片段在XbaI和BglII位点与pORI28连接。转化体在大肠杆菌EC1000中选择且分离pORI：：LuxSbig。使用各自在5’末端包含EcoRI酶识别位点的引物LuxS-delF和LuxS-delR(表6)对那种质粒进行反向PCR(Expand High Fidelity PCR system，Roche Applied Science，Indianapolis，IN)。所得到的2.7kbp PCR产物使用Qiagen PCR纯化试剂盒净化且用EcoRI于37℃消化18小时。用Zymoclean Gel DNARecovery Kit(Zymogen)凝胶纯化后，使产物于16℃自身连接16小时。随后将所得到的质粒pTRK884转化到大肠杆菌EC1000内，且周PCR扩增证实质粒结构。包含温度敏感性辅助质粒pTRK669的嗜酸乳杆菌NCFM随后用pTRK884电转化，并根据Russell和Klaenhammer先前所述方法选择整合体(22)。选择的整合体在非选择性培养基中传代6次，以允许发生第二次交换事件，并随后在缺乏抗生素的MRS上铺板。筛选菌落的Em敏感性，且使用位于缺失区域侧翼的引物LuxS-delNF和LuxS-delNR进行菌落PCR。缺失区域的PCR扩增和使用luxS的内部片段作为探针的DNA杂交测定法证实了NCK1818中经由基因替代造成的缺失。
直到最近，乳杆菌中的位点特异性基因失活才使用质粒整合策略进行。质粒整合的维持需要在选择性培养基中生长。然而，质粒整合和选择性生长都可以影响通过微阵列分析获得的基因表达结果。因此，使用双交换同源重组方法使用无标记策略来灭活嗜酸乳杆菌NCFM中的luxS(LBA1081)。所得到的突变株NCK1818的luxS基因缺乏97bp内部区域，且包含另外的EcoRI限制性位点。选择该缺失区域是为了破坏可读框并产生无功能的基因产物。基因替代通过缺失区域的PCR分析和DNA杂交(使用luxS的内部片段作为探针)来证实。如通过哈氏弧菌报道物测定法测定的，NCK1818是Em敏感性的，且不产生AI-2(5)。嗜酸乳杆菌NCFM的AI-2表达模式预先使用luxS整合突变型作为阴性对照来测定(8)。使用NCK1818作为阴性对照观察到在嗜酸乳杆菌NCFM生长时AI-2生产的相同模式。
AI-2检测
来自所选细菌菌株上清液的自诱导物-2的检测如先前所述进行(8)。简言之，来自在每个指定时间点收获的细菌群体的上清液用2N NaOH调整至pH 6.5且通过0.2μm膜过滤。报道菌株哈氏弧菌BB170(3)在自诱导物生物测定(AB)培养基中生长过夜，用新鲜AB洗涤并重悬浮于新鲜AB中至OD6000.5。来自测试培养物的10μl无菌上清液与90μl 1/1000稀释的报道菌株BB170在96孔板的每个孔中混合。发光在荧光微量滴定板阅读器(FLOUStar Optima，BMGTechnologies，Durham，NC)中于30℃每10分钟测量一次，共6小时。诱导倍数通过下列计算：对来自哈氏弧菌发光曲线的至少6个标准时间点求平均值，且将由野生型获得的平均值除以由LuxS-突变型获得的平均值。在报道菌株对其自身产生的AI-2应答之前在发光处于恒定水平时选择时间点。每个样品在至少3个独立孔中进行测量且每个数据点表示2次独立实验(表7)。
RNA分离
嗜酸乳杆菌NCFM和NCK1818由冷冻贮存培养物在半限定培养基中转移2次，使用半乳糖作为主要碳源以阻止经由哈氏弧菌报道菌株中lux操纵子的葡萄糖的降解物阻遏。来自稳定期(16小时)的2种菌株的400ml培养物以1％接种且允许于37℃生长。在OD6000.2时，获得5ml样品用于CFU测定和pH测量。每种菌株的6个10ml样品在干冰上快速冷却，且于4℃通过在3,150xg离心10分钟收获细胞团块。在每个时间点离心后来自每种菌株的上清液被保留用于AI-2检测。在最后2个取样点(OD6000.7和OD6001.2)，从每种培养物收集5ml样品用于铺板和pH测定；随后从每种培养物收获2个10ml样品并如上所述进行处理。来自细胞团块的RNA分离如先前所述(3)使用TRIzol(Invitrogen Life Technologies，Rockville，MD)进行。RNA纯度和浓度通过在1.0％琼脂糖凝胶上电泳和标准分光光度计测量法来测定。RNA从2种菌株的2次生物学重复中分离。
表7收获的用于微阵列分析的细胞群体的培养条件a
Figure BDA0000053376120000601
a所有值表示在3次独立实验中由嗜酸乳杆菌NCFM和NCK1818获得的组合数据计算的平均值和1个标准差。
cDNA生产和微阵列杂交
在3个所选取样点的每一个上LuxS-突变株和野生株的基因表达分析使用完整基因组DNA微阵列进行(3)。来自嗜酸乳杆菌NCFM基因组的1,889个预测的ORF的PCR产物(1)一式三份地置于ULTRA GAPS玻璃盖玻片(Corning Inc.，Acton，MA)上。第一链cDNA合成和标记使用SuperScript Indirect cDNA Labeling System(Invitrogen)进行。简言之，等量(20μg)RNA使用Superscript II逆转录酶用随机六聚物通过逆转录作用在氨基修饰的核苷酸的存在下于42℃进行氨基烯丙基标记3小时。第一链cDNA使用S.N.A.P柱纯化，沉淀，用N-羟基琥珀酰亚胺活化的Cy3或Cy5酯(GE Healthcare LifeSciences，Piscataway，NJ)标记，并再次使用S.N.A.P柱纯化。所得到的标记cDNA在微阵列载玻片上根据TIGR(www.tigr.org/tdb/microarray/protocolsTIGR.shtml)概述的方案进行杂交。杂交根据单循环模式进行，从而使得所有可能的直接成对比较在不平衡设计中进行。在3个不同取样点(OD6000.2、0.7和1.2)和2种不同菌株(嗜酸乳杆菌NCFM和NCK1818)中总共进行15次不同杂交。
微阵列数据分析
荧光强度使用General Scanning ScanArray 4000 MicroarrayScanner(Packard Biochip BioScience，Biochip Technologies LLC，Mass.)获得并加工成TIFF图像。信号强度进行定量，包括减除背景，且重复斑点使用QuantArray 3.0软件包(Packard BioScience)求平均值。所得到的原始强度数据输入SAS(SAS Institute，Cary，NC)，进行log2转换，且对标准化的混合模型变量分析(ANOVA)拟合，以便将数据聚集成平均强度。随后对标准化数据进行基因特异性的混合模型ANOVA，其中染料、菌株和时间视为固定效应，且阵列效应视为随机效应(34)。关于2种不同处理的最小二乘法估计值之间得到的差异类似于那2种处理之间基因表达的log2转换比率。计算关于染料效应、菌株效应、时间效应、以及菌株和时间的组合效应(菌株*时间)的差异。使用这些差异及其标准误进行t检验，而P＜0.05视为显著的。使用估计值和-Log10(P值)与JMP 5.0(SAS Institute)对每种比较构建火山(Volcano)图，以便显现处理和结果的统计学显著性之间的对照。
为了研究响应LuxS生产而差异表达的基因，开发了微阵列设计以检查在指数生长早期、中期或晚期中在野生型和LuxS-突变型之间的表达差异。预先测定关于嗜酸乳杆菌NCFM在生长时的AI-2生产(8)。由那种数据，选择3个生长点用于RNA分离：OD6000.2，在AI-2积聚前；OD6000.7，在AI-2快速生产时；和OD6001.2，在AI-2生产减慢且上清液中的AI-2水平保持升高的但恒定时。在每个时间点从2种菌株中一式两份地分离RNA，且使用哈氏弧菌报道物测定法测定AI-2活性。总的来说，6个点在每种可能的成对比较中互相比较(15次组合)。表达数据的分析使用2步混合模型ANOVA进行，且最小均方比率在1.8的倍数变化和P＜0.05时视为显著的(表9)。
在最初2个时间点每种差异表达的ORF根据其COG分类进行归类(图8)。在NCFM中具有最高量的过度表达基因的2种COG分类占总体的42％，是翻译核糖体结构和生物发生(J)，以及复制、重组和修复(L)。相反，LuxS-突变型中40％的过度表达的基因分类为功能未知的(S)。与LuxS-突变型比较，NCFM中与正常生长和代谢有关的基因的表达增加暗示，LuxS直接或间接地正面影响这些基因中的多种的表达。由这些数据无法了解表达受到LusX负面影响的基因的功能。在测试条件下在NCFM或LuxS-突变型中在对数晚期(OD6001.2)没有显著差异表达的基因，这时培养基中的AI-2水平不再增加。
与混合模型分析组合的单循环微阵列设计用于比较对于嗜酸乳杆菌NCFM基因表达的菌株效应、时间效应以及菌株和时间的组合效应(菌株*时间)。菌株对菌株的比较显示在AI-2开始在培养基中略微积聚前(OD6000.2)，在NCFM中有84个ORF明显过度表达(表8a)，而在LuxS-突变型中只有13个ORF明显过度表达(表8b)。在对数早期(OD6000.2)，与突变型比较，NCFM中最高诱导的基因是推定与信号转导相关的relA(3.14倍)，和推定的翻译起始因子IF-2(3.14倍)。在对数中期(OD6000.7)，随着AI-2快速积聚，在NCFM中只有3个ORF(LBA1497、LBA1796、LBA1798)明显过度表达，且在LuxS-突变型中只有4个ORF(LBA0026、LBA0089、LBA0568和LBA1596)过度表达。有趣的是，在最初2个时间点都明显差异表达的唯一ORF是labT(LBA1796)-先前涉及细菌素输出的ABC转运体(10)。与突变型LuxS-比较，在对数早期labT在NCFM中2.53倍过度表达，而在对数中期它2.10倍过度表达。与突变型比较，在对数中期邻近的二组分调节系统的应答调节物(LBA1798)在NCFM中也过度表达。在这点上，分析LuxS-菌株的细菌素生产且发现其引起与野生型相同水平的细菌素生产。另外，测试同基因的labT突变株的AI-2生产且发现AI-2的生产水平与野生型相同。
表8a.差异表达基因的COG分类
Figure BDA0000053376120000631
Figure BDA0000053376120000651
Figure BDA0000053376120000661
a通过对那种基因或ORF的人工注解的推定鉴定
b野生型嗜酸乳杆菌NCFM和LuxS-突变株之间的log2估计值的最小均方比率。倍数差异的截止比率是1.8且P＜0.05。
表8b.差异表达基因的COG分类
Figure BDA0000053376120000662
Figure BDA0000053376120000671
a通过对那种基因或ORF的人工注解的推定鉴定
b野生型嗜酸乳杆菌NCFM和LuxS-突变株之间的log2估计值的最小均方比率。倍数差异的截止比率是1.8且P＜0.05。
表9.微阵列结果
Figure BDA0000053376120000681
Figure BDA0000053376120000691
Figure BDA0000053376120000701
Figure BDA0000053376120000711
Figure BDA0000053376120000721
与LuxS-突变株比较在对数早期NCFM中海藻糖水解酶treC(LBA1014)2.56倍过度表达。先前研究报告了嗜酸乳杆菌TreC-突变型在海藻糖上的缺陷生长(11)。因此，测量嗜酸乳杆菌NCFM和LuxS-突变型在包含各种糖的mMRS培养基上的最大生长速率，以便确定luxS突变对糖利用的可能影响(表10)。当菌株在包含葡萄糖或海藻糖的MRS或mMRS上生长时，生长不受luxS突变的影响。然而，在乳糖和蔗糖上，与NCFM比较，LuxS-突变型显示较低的最大生长速率。
表10各种糖源的最大比生长速率(specific growth rate)(μ小时-1)
*如通过斯氏t检验测定，鉴定了显著差异的生长速率(P＜0.01)
a培养基组成如上所述
还检查了每种菌株从对数早期到晚期的转录特征(图9)。在2种菌株中有类似数目的基因(在NCFM中27种和在LuxS-突变型中41种)，从对数早期到中期表达增加。在2种菌株中有12种基因表达增加，且包括糖代谢基因(LBA0874、LBA1012、LBA1812和LBA1974)，和假定的肌球蛋白交叉反应抗原(LBA555)。与突变株中的97种基因比较，在野生株中只有24种基因从对数早期到中期表达减少。再次，从对数中期到晚期，在2种菌株中有类似数目的基因表达增加，但在这个生长期间在野生型中有45种基因表达减少，而在LuxS-突变型中只有15种。这些结果暗示AI-2在生长早期阶段可能负责增加或维持基因的表达。当AI-2在培养基中缺陷时，在对数早期大量基因的表达似乎减少。
应激实验
嗜酸乳杆菌NCFM和NCK1818在MRS培养基中于37℃生长直至群体达到OD6000.2、0.7和1.2，在所述点收集细胞用于应激耐受力实验。
胆汁耐受力。在预定取样点，每种培养物进行稀释并一式两份地铺板在补充0.75、1.0或2.0％w/w牛胆汁(Oxgall)(BDBiosciences，San Jose，CA)的MRS琼脂上。板厌氧孵育48小时，且计算CFU/ml和存活百分比。每次测定一式三份地进行。
热耐受力。每种菌株在250ml MRS培养基中生长，且在每个取样点，通过在3,150xg于21℃离心10分钟收获来自每种群体的10ml细胞。离心后，弃去上清液并将细胞团块重悬浮于10ml预孵育至55℃的新鲜MRS中。在0、10、20、30和45分钟时取样、稀释并一式两份地铺板。每次测定一式三份地进行。
统计分析。由上述实验获得的数据使用斯氏t检验进行分析，而P＜0.05视为显著的。
测试了LuxS对嗜酸乳杆菌NCFM的各种应激应答的参与。当细菌群体在OD6000.2时铺板，与NCFM比较，在补充2.0％牛胆汁(Oxgall)(脱水的新鲜胆汁)的MRS琼脂上生长显著减少LuxS-突变型的生长。当细胞由OD6000.7的群体铺板时，在补充1.0％牛胆汁(Oxgall)的MRS上的LuxS-菌株中观察到生长显著减少。由最后时间点OD6001.2收获的细胞显示对于牛胆汁(Oxgall)在生长方面没有差异(图10)。这些结果表明在对数中期AI-2生产与胆汁耐受力关联，但随着LuxS-群体到达稳定期，由于缺乏AI-2而造成的对胆汁的敏感性不存在。
另外，当由OD6000.2和OD6000.7收获的群体暴露于55℃热应激时，LuxS-突变型更敏感(图11)。由最后时间点OD6001.2收获的LuxS-突变型的细胞群体当与NCFM比较时没有显示出显著减少。这种热应激存活模式进一步暗示在对数生长早期和中期AI-2涉及应激应答，但当群体达到细胞固有地更耐热的稳定生长期时，则不是。
细菌素生产
将5μl嗜酸乳杆菌NCFM和NCK1818置于MRS琼脂上，且在厌氧培养室中于37℃过夜孵育。第二天，将100μl指示菌株德氏乳杆菌(NCK235)加入10ml熔化的MRS覆层琼脂(0.75％w/v)且均匀地倾倒在琼脂平板表面上。24小时孵育后，评估指示乳酸菌素(lactacin)B拮抗活性的抑制带。
生长曲线
嗜酸乳杆菌NCFM和NCK1818由冷冻贮存培养物在MRS和改良的MRS(mMRS)中转移3次。在这项研究中使用的mMRS培养基采取商购可得的MRS(Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD)的成分，其中用1％w/v的葡萄糖、乳糖、海藻糖或蔗糖替换右旋糖。生长曲线在包含200μl各自补充的半限定培养基或MRS培养基的96孔板(Corning)中于37℃进行。允许培养物生长16小时且在一式三份的孔中每15分钟测量一次OD600。板于37℃进行孵育，且使用FLUOStarOPTIMA微量滴定板阅读器(BMG Labtech)通过测定作为时间函数的A600中的变化自动监测生长。最大比生长速率由在指数生长时的直线回归线的斜率计算，使用0.99的相关系数(r2)。每个点表示3次独立培养的平均值。
结论
本申请首次报告了在不同生长阶段时LuxS调节的转录分析。先前通过AI-2调节的基因表达的微阵列研究已研究了LuxS-突变株对外源性AI-2的应答(DeLisa，等人(2001)Journal of Bacteriology183：5239-5247)，或鉴定了单个生长点且分析插入突变型和野生型之间的转录差异(Merritt，等人(2003)Infect Immun 71：1972-9；Wang，等人(2005)Journal of Bacteriology 187：8350-8360；Yuan，等人(2005)Infect.Immun.73：4146-4154)。尽管这些方法可以成功地鉴定在单个点由AI-2调节的基因，但表达谱只代表LuxS调节的简单印象。为了获得受LuxS影响的基因表达的更全面了解，我们选择了贯穿嗜酸乳杆菌NCFM生长期的3个时间点用于转录分析。在第一个取样点OD6000.2时，在生长培养基中检测的AI-2活性是最小的，因为群体处于对数生长期的早期阶段。在对数生长中期(OD6000.7)的第二个取样点在培养基中的AI-2快速积聚时获取。对于最后取样点，细胞在OD6001.2的对数晚期收获，这是培养基中的AI-2水平达到其峰值后大约30分钟。选择这些点以代表如上所述的AI-2生产之前、之时和之后。这项研究中使用的LuxS-菌株是基因缺失型突变体，且因此预期免于由所选外源组分整合或添加到培养基引起的任何多效效应。
最大量的差异表达基因在对数生长中期被鉴定。与LuxS-菌株比较，在野生型中相对大量的基因被诱导，表明在生长早期AI-2促进了某些基因的表达。这些基因中的大多数与转录、翻译和复制有关。编码F1F0-ATP酶的操纵子的3种基因(LBA772、LBA773和LBA775)(Kullen和Klaenhammer(1999)Mol.Microbiol.33：1152-1161)(LBA772-LBA779)在野生株中过度表达。海藻糖水解酶(treC，LBA1014)也显示在野生型中增加表达，尽管在培养基中不存在海藻糖。AI-2的缺乏不影响NCFM在海藻糖上的生长(表5)，而TreB-(转运体)或TreC-突变株都不能在海藻糖上生长(Duong，等人，(2006)Appl.Environ.Microbiol.72：1218-1225)。这些推定的能量生产系统的差异表达进一步使LuxS与生长和代谢关联。由DeLisa等人(2001，Journal of Bacteriology 183：5239-5247)获得的类似结果暗示AI-2调节细胞分裂、DNA加工和形态学过程。
除正常生长和代谢过程之外，LuxS影响各种细胞表面因子的表达。假定的胞外多糖(EPS)操纵子的2种基因(LBA1735和LBA1736)在对数早期在野生型中也是差异表达的。先前显示参与与Caco-2细胞的粘附的假定纤连蛋白结合蛋白(Buck，等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：8344-8351)在对数早期也由AI-2诱导。纤连蛋白是人肠细胞外基质(ECM)的组分且可以是细菌细胞在肠环境中的粘附靶(Kapczynski等人(2000)Curr.Microbiol.41：136-41)。罗伊氏乳杆菌的LuxS-突变株显示在鼠类胃肠道中的生态性能减少(Tannock，2005，同上)。在生长早期细胞表面因子表达的调节可以使细菌预适应与不同微生物群落的相互作用或肠道中的生态性能。
肠微生物的细胞表面相关分子由宿主识别且在炎症应答和肠内环境稳定维持中可能是重要的(Rakoff-Nahoum，等人(2004)Cell 118：229-241)。这些细菌表面分子之一即脂磷壁酸与细胞膜结合且延伸通过细胞壁将其自身呈现在细菌环境中。负责乳杆菌中脂磷壁酸的正确D-丙氨酸化的dlt操纵子成员即dltD基因(LBA1923)在对数生长早期在LuxS的存在下被诱导。当植物乳杆菌的Dlt-突变型暴露于外周血单核细胞(PBMC)时，促炎细胞因子TNFα和IL-12的分泌减少(Grangette，等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A102：10321-10326)。在暴露于Dlt-突变型后由PBMC表达的IL-10增加，使细胞因子谱偏向抗炎应答。这些脂磷壁酸结构经由AI-2的调节可以在肠道的宿主-微生物相互作用中起作用。
AI-2还被认为参与细菌中的应激应答调节(Wen，等人(2004)J.Bacteriol.186：2682-91；Xavier，等人(2005)J.Bacteriol.187：238-248)。因此，假定与应激应答相关的多重基因的表达受到AI-2的影响，包括涉及去除在热应激时产生的错折叠蛋白质以及未成熟多肽的dnaK(LBA1247)、grpE(LBA1248)和clpX(LBA847)。AI-2对热应激存活的影响分析显示当与野生株比较时，嗜酸乳杆菌NCFM的LuxS-突变株对55℃热应激更敏感(图11)。这种敏感性只在来自对数生长早期或中期的细菌群体接受应激时观察到。这些结果与生长早期阶段时热休克应答基因的表达增加相一致。在牙龈卟啉单胞菌的新近研究中，LuxS-突变株比野生型对热应激更有抵抗力(Xavier，2005，同上)，暗示经由AI-2的应激应答的菌株依赖性改变。
肠细菌必须经过胃肠道的苛刻条件存活以便在肠中持续。必须克服的障碍之一是暴露于胃区中的胆汁。推定的胆盐水解酶(LBA0892)在对数早期由LuxS诱导。测试LuxS-突变株对胆汁的耐受力且发现当培养物从对数生长早期或中期收获时更为敏感。从对数晚期收获的培养物在胆汁耐受力方面没有显示出与野生型的任何差异。这些结果表明AI-2通过正面影响基因表达可以用于使细胞适应应激条件，所述基因在不同环境条件中具有对生长和存活的功能。
AI-2被报道为细胞密度感受因子，它随着细胞密度增加在环境中积聚，尽管其中AI-2影响基因表达的生长期仍未报道。我们的结果暗示在AI-2的可感知积聚之前AI-2在对数生长早期阶段中对细胞群体起作用。与野生型比较，LuxS-突变株中从对数生长早期到中期大量基因的表达减少的事实支持LuxS在生长早期正面影响基因表达的论点。在生长期自始至终检查基因表达时，LuxS似乎使群体为在漂浮生长时天然遇到的应激和相互作用条件作准备。很显然AI-2影响与嗜酸乳杆菌NCFM的快速生长和应激应答有关的基因表达，并且可能影响宿主-微生物相互作用。
Figure IDA0000053376180000011
Figure IDA0000053376180000021
Figure IDA0000053376180000031
Figure IDA0000053376180000041
Figure IDA0000053376180000051
Figure IDA0000053376180000061
Figure IDA0000053376180000091
Figure IDA0000053376180000111
Figure IDA0000053376180000121
Figure IDA0000053376180000131
Figure IDA0000053376180000151
Figure IDA0000053376180000161
Figure IDA0000053376180000171
Figure IDA0000053376180000181
Figure IDA0000053376180000211
Figure IDA0000053376180000231
Figure IDA0000053376180000241
Figure IDA0000053376180000251
Figure IDA0000053376180000261
Figure IDA0000053376180000271
Figure IDA0000053376180000281

Claims (18)

1.一种诱导或增强细菌中的自诱导物-2的生产的方法，其包括将至少2种异源核酸分子引入所述细菌中，所述异源核酸分子选自：
(a)(i)包含如SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(a)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；
(iii)与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；或
(iv)编码与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；
(b)(i)包含如SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(b)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1X SSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；或
(iv)编码与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；
(c)(i)包含如SEQ ID NO：15中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(c)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：15中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；或
(iv)编码与SEQ ID NO：16具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；
(d)(i)包含如SEQ ID NO：21中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(d)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：21中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；或
(iv)编码与SEQ ID NO：22具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；和
(e)(i)包含如SEQ ID NO：13中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(e)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：13中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；
(iv)编码与SEQ ID NO：14具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；
其中所述细菌比相应的对照细菌产生更多量的自诱导物-2。
2.权利要求1的方法，其进一步包括使所述细菌暴露于粘附适应性条件，所述粘附适应性条件包括使所述细胞以至少1x109cfu/ml的浓度孵育足以增加所述乳酸菌的粘附的时间。
3.权利要求2的方法，其中所述粘附适应性条件包括约1x109cfu/ml浓度的所述细胞，时间为约1小时。
4.权利要求1的方法，其中所述细菌是乳酸菌。
5.权利要求1的方法，其中所述细菌是益生菌。
6.权利要求5的方法，其中所述增加的粘附改善所述细菌的至少一种益生特性。
7.权利要求4的方法，其中所述乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌和植物乳杆菌。
8.权利要求4的方法，其中所述乳酸菌表达治疗性多肽。
9.权利要求8的方法，其中所述治疗性多肽对所述细菌是异源的。
10.权利要求4的方法，其中所述乳酸菌的应激耐受力被改善。
11.一种细菌，其包含至少2种异源核酸分子，所述异源核酸分子选自：
(a)(i)包含如SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(a)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；或
(iv)编码与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；
(b)(i)包含如SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(b)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；或
(iv)编码与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；
(c)(i)包含如SEQ ID NO：15中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(c)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：15中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；或
(iv)编码与SEQ ID NO：16具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；
(d)(i)包含如SEQ ID NO：21中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(d)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：21中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；或
(iv)编码与SEQ ID NO：22具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；和
(e)(i)包含如SEQ ID NO：13中所示核苷酸序列的核酸分子；
(ii)在严格条件下与(e)(i)的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和于60℃-65℃在0.1XSSC中洗涤；和
(iii)与SEQ ID NO：13中所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸分子；
(iv)编码与SEQ ID NO：14具有至少90％同一性的多肽的核酸分子；
其中所述细菌比相应的野生型细菌产生更多量的自诱导物-2。
12.权利要求11的细菌，其中所述细菌是乳酸菌。
13.权利要求11的细菌，其中所述细菌是益生菌。
14.权利要求12的细菌，其中所述乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌和植物乳杆菌。
15.权利要求12的细菌，其中所述乳酸菌表达治疗性多肽。
16.权利要求15的细菌，其中所述治疗性多肽对所述细菌是异源的。
17.权利要求12的细菌，其中所述乳酸菌的应激耐受力被改善。
18.一种细菌培养物，其包含权利要求11的细菌。
CN2011100813287A 2005-04-15 2006-04-14 调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物 Pending CN102212543A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67188705P 2005-04-15 2005-04-15
US60/671,887 2005-04-15

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800215045A Division CN101198689A (zh) 2005-04-15 2006-04-14 调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102212543A true CN102212543A (zh) 2011-10-12

Family

ID=37028280

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011100813287A Pending CN102212543A (zh) 2005-04-15 2006-04-14 调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物
CNA2006800215045A Pending CN101198689A (zh) 2005-04-15 2006-04-14 调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800215045A Pending CN101198689A (zh) 2005-04-15 2006-04-14 调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20060269998A1 (zh)
EP (3) EP2302032A1 (zh)
JP (1) JP2008537885A (zh)
CN (2) CN102212543A (zh)
AU (1) AU2006236629B2 (zh)
BR (1) BRPI0610609A2 (zh)
CA (1) CA2605162A1 (zh)
EC (1) ECSP077898A (zh)
MX (1) MX2007012755A (zh)
NZ (1) NZ563246A (zh)
WO (1) WO2006113475A2 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1567868A4 (en) * 2002-12-02 2008-02-06 Biosynexus Inc TEICHOIC ACID WALL AS A TARGET FOR THERAPIES AND ANTI-STAPHYLOCOCCAL VACCINES
WO2010075424A2 (en) * 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
JP5612269B2 (ja) * 2009-04-24 2014-10-22 花王株式会社 歯周病マーカー
US8445226B2 (en) 2010-02-01 2013-05-21 Microbios, Inc. Process and composition for the manufacture of a microbial-based product
US7888062B1 (en) 2010-02-01 2011-02-15 Microbios, Inc. Process and composition for the manufacture of a microbial-based product
CN103275920B (zh) * 2013-05-16 2015-04-15 江南大学 一种提高乳酸菌粘附肠道上皮细胞能力的方法
WO2018089924A2 (en) 2016-11-11 2018-05-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for fabricating water-responsive actuators
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
CN110684685B (zh) * 2019-10-14 2021-03-30 广西大学 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4及其应用
CN110669690B (zh) * 2019-10-16 2021-04-06 衡阳师范学院 一种表达群体感应信号分子ai-2的植物乳杆菌菌株及其应用
CN111304121A (zh) * 2020-02-24 2020-06-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一株致病性海洋哈氏弧菌及其应用
CN111518741B (zh) * 2020-04-27 2022-11-08 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种提高乳酸菌口腔粘附能力的方法
JPWO2022080246A1 (zh) * 2020-10-12 2022-04-21

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4336336A (en) 1979-01-12 1982-06-22 President And Fellows Of Harvard College Fused gene and method of making and using same
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4551433A (en) 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
JPS59166086A (ja) 1983-03-09 1984-09-19 Teruhiko Beppu 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法
US4689406A (en) 1983-08-10 1987-08-25 Amgen Enhancement of microbial expression of polypeptides
US4738921A (en) 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
SE463598B (sv) * 1984-11-08 1990-12-17 Chemical Dynamics Sweden Ab Preparat, avsett att oeka vidhaeftningen av bakterier till mag-tarmkanalen hos maenniskor och djur, samt ett framstaellningsfoerfarande foer detta
US5028530A (en) 1985-01-28 1991-07-02 Xoma Corporation AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques
JPS63123383A (ja) 1986-11-11 1988-05-27 Mitsubishi Kasei Corp ハイブリツドプロモ−タ−、発現調節ｄｎａ配列および発現ベクタ−
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
US5861242A (en) 1993-06-25 1999-01-19 Affymetrix, Inc. Array of nucleic acid probes on biological chips for diagnosis of HIV and methods of using the same
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
EP0705271B1 (en) 1993-06-25 2002-11-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Hybridization and sequencing of nucleic acids
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
GB9521568D0 (en) 1995-10-20 1995-12-20 Lynxvale Ltd Delivery of biologically active polypeptides
FR2753202A1 (fr) * 1996-09-06 1998-03-13 Agronomique Inst Nat Rech Bacteries multiresistantes, procedes d'obtention et utilisation
US6391633B1 (en) 1997-07-23 2002-05-21 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
DE69914932T2 (de) 1998-10-20 2004-12-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Verwendung eines zytokine-produzierenden lactococcus stammes zur behandlung von kolitis
US6720415B2 (en) * 1998-12-02 2004-04-13 Princeton University Compositions and methods for regulating bacterial pathogenesis
CA2354054C (en) * 1998-12-11 2011-04-12 Urex Biotech, Inc. Oral administration of lactobacillus for the treatment and prevention of urogenital infection
WO2000078922A2 (en) 1999-06-21 2000-12-28 North Carolina State University Acid-inducible promoters for gene expression
JP4603116B2 (ja) * 1999-12-02 2010-12-22 わかもと製薬株式会社 乳酸菌含有組成物、医薬及び食品
US6569681B1 (en) 2000-03-14 2003-05-27 Transkaryotic Therapies, Inc. Methods of improving homologous recombination
JP5041651B2 (ja) * 2001-09-28 2012-10-03 ティーエヌティーギャンブル・インコーポレーテッド 生物体成分の送達系
JP3919635B2 (ja) * 2002-09-05 2007-05-30 明治乳業株式会社 プロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法
AU2003224355A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-25 Axcel Photonics, Inc. Lactobacillus fermentum strain and uses thereof
EP1658303A4 (en) * 2003-04-25 2008-07-16 Univ North Carolina State LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SURFACE PROTEIN HOMOLOGUES AND USES THEREOF
US20050019379A1 (en) * 2003-07-22 2005-01-27 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Wipe and methods for improving skin health

Also Published As

Publication number Publication date
ECSP077898A (es) 2008-01-23
NZ563246A (en) 2011-09-30
JP2008537885A (ja) 2008-10-02
EP2302032A1 (en) 2011-03-30
MX2007012755A (es) 2008-01-14
US20060269998A1 (en) 2006-11-30
CA2605162A1 (en) 2006-10-26
WO2006113475A3 (en) 2007-03-29
EP2305791A1 (en) 2011-04-06
AU2006236629A1 (en) 2006-10-26
BRPI0610609A2 (pt) 2010-07-06
WO2006113475A2 (en) 2006-10-26
EP1871868A2 (en) 2008-01-02
AU2006236629B2 (en) 2012-04-19
CN101198689A (zh) 2008-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102212543A (zh) 调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物
Jakava-Viljanen et al. Isolation of surface (S) layer protein carrying Lactobacillus species from porcine intestine and faeces and characterization of their adhesion properties to different host tissues
Van Hemert et al. Identification of Lactobacillus plantarum genes modulating the cytokine response of human peripheral blood mononuclear cells
Kosin et al. Microbial and processing criteria for production of probiotics: a review
Ramiah et al. Surface-bound proteins of Lactobacillus plantarum 423 that contribute to adhesion of Caco-2 cells and their role in competitive exclusion and displacement of Clostridium sporogenes and Enterococcus faecalis
Pennacchia et al. Isolation of Saccharomyces cerevisiae strains from different food matrices and their preliminary selection for a potential use as probiotics
US6506389B2 (en) Adherence factors of non pathogenic microorganisms and applications thereof for screening microorganisms for specific probiotic properties; novel pharmaceutical compositions and food additives comprising such microorganisms and adherence factors
CN102317311B (zh) 鼠李糖乳杆菌菌毛多肽和产生它们的方法
Savijoki et al. Growth mode and carbon source impact the surfaceome dynamics of Lactobacillus rhamnosus GG
KR102332867B1 (ko) 유산균, 그 유산균 유래의 자연 면역 활성화제, 감염증 예방 치료제 및 음식품
Waśko et al. Variability of S-layer proteins in Lactobacillus helveticus strains
Valledor et al. Exploring beneficial properties of the bacteriocinogenic Enterococcus faecium ST10Bz strain isolated from boza, a Bulgarian cereal-based beverage
CA2632826A1 (en) Bacteriocin inducer peptides
Choi et al. Antimicrobial peptides (bacteriocins) produced by Lactococcus lactis and Pediococcus pentosaceus strains with activity against clinical and food-borne pathogens
US20030165505A1 (en) Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
JP6531893B2 (ja) 濾胞性ヘルパーｔ細胞増加剤
US20100196524A1 (en) Novel peptides and methods for producing them
AU727676B2 (en) Novel adherence factors of non pathogenic microorganisms and applications thereof for screening microorganisms for specific probiotic properties; novel pharmaceutical compositions and food additives comprising such microorganisms and adherence factors
Cherdyntseva et al. The isolation, identification and analyses of Lactobacillus genus bacteria with probiotic potential
Kawahara et al. Characterization of multiple bacteriocin-producing Lactiplantibacillus plantarum PUK6 isolated from misozuke-tofu
Abdelfatah et al. Identification of lactic acid bacteria in raw milk and kariesh cheese with special reference to Lactococcus garvieae
CN101225381A (zh) 一种乳酸杆菌的转化方法
Novik et al. Probiotics
Landry et al. Bile salt hydrolase and antimicrobial activities of three bile resistant probiotics Lactobacillus plantarum strains isolated from Cameroonian artisanal fermented milk
Ibarra Romero Bacteriocins: Identification, structural elucidation, and mechanisms of resistance

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20111012