CN113166736A - 具有改变的激动剂特异性和亲和性的基因改变的LysM受体 - Google Patents

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CN113166736A CN201980066803.8A CN201980066803A CN113166736A CN 113166736 A CN113166736 A CN 113166736A CN 201980066803 A CN201980066803 A CN 201980066803A CN 113166736 A CN113166736 A CN 113166736A
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Abstract

本公开的方面涉及基因改变的LysM受体。具体地，本公开涉及LysM2结构域中的疏水补丁，其可增加对LCO的亲和性和/或选择性，并且通过用来自供体LysM受体的LysM1结构域的相应区域替换LysM1结构域中的区域，供体LysM受体可改变对寡糖特别地对LCO的亲和性和/或选择性，并且当使用来自高亲和性和特异性LCO LysM受体比如豆类NFR1受体的区域时，可改变LCO之间的特异性。本公开还涉及基因改变植物中的LysM受体为包括疏水补丁或改变疏水补丁，以及涉及通过替换LysM2结构域中的区域来基因改变植物中的LysM受体。

Description

具有改变的激动剂特异性和亲和性的基因改变的LysM受体
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技术领域
本公开涉及基因改变的LysM受体。具体地，本公开涉及LysM2结构域中的疏水补丁，其可增加对LCO的亲和性和/或选择性，并且通过用来自供体LysM受体的LysM1结构域的相应区域替换LysM1结构域的区域可改变对寡糖，特别地对LCO的亲和性和/或选择性，并且当使用来自高亲和性和特异性LCO LysM受体比如豆类NFR1受体的区域时，可改变LCO之间的特异性。本公开还涉及基因改变植物中的LysM受体为包括疏水补丁或改变疏水补丁，以及涉及通过替换LysM2结构域中的区域来基因改变植物中的LysM受体。
背景技术
植物在其环境中暴露于良性和病原性的各种微生物。为了防御病原性微生物，植物具有通过大量受体识别微生物的特定分子信号的能力，并且取决于信号的模式，可启动适当的免疫应答。分子信号源自微生物的分泌材料、细胞壁组分和甚至胞质蛋白。壳寡糖(CO)是植物通过质膜上发现的几丁质受体CEBiP、CERK1、LYK5和CERK6(以前称为LYS6)识别的重要的真菌分子信号。这些受体在LysM类别的受体中，并且识别来自真菌的CO的尺寸和乙酰化。脂壳寡糖(LCO)是可在细菌和真菌中发现的另一重要的分子信号，其被其他LysM受体识别。
除了良性和病原性微生物外，一些微生物可通过缔合或共生对植物有益。与某些固氮细菌和真菌进入共生关系的植物需要能够识别特定的细菌或真菌物种以启动共生，同时仍能够激活其免疫系统以对其他细菌和真菌做出答应。使得植物识别这些特定的细菌或真菌的一种重要机制是通过特化的LysM受体，其对由特定的细菌或真菌产生的LCO形式具有高亲和性、高选择性和/或高特异性，而来自其他细菌和真菌的LCO不被这些特化的LysM受体识别。
实验和计算方法已经用于鉴定许多这些特化的LysM受体(也称为高亲和性和特异性LCO受体)。由于这些受体需要识别共生细菌和真菌物种并且启动共生，这些受体代表了任何植物工程化策略的重要的组分。然而，使用这些受体将不会特别地简单；将特化的LysM受体转移至目前没有受体的植物可能需要密码子优化、鉴定适当的启动子、使用靶向信号以及进一步工程化方法，是修改外源序列用于最佳表达所需要的。进一步，目前限制已经鉴定的这些受体的数量。
而且，已经特化的LysM受体的物种，例如豆类，不能轻易地用新的特化的LysM受体进行工程化。目前，豆类限于与它们形成共生缔合的特定的细菌或真菌物种。虽然豆类可具有存在共生缔合的益处，它们农业潜力是有限的。例如，豆类目前不能轻易地被工程化为对不同共生微生物物种具有不同特异性，这将允许豆类在不同土壤中与细菌或真菌物种更好形成缔合。而且，豆类不能轻易地被工程化为具有改进的特化的LysM受体。进一步，豆类目前不能被工程化为与其他与它们轮作生长的作物具有生长共生的要求。需要编辑方法用于将内源LysM受体修饰为能够感知共生细菌和真菌物种的特化的LysM受体，并且将特化的LysM受体修饰为具有共生细菌和真菌物种的不同的特定的识别的特化的LysM受体。
发明内容
为了满足这些需要，本公开提供了通过将疏水补丁引入LysM2结构域中来修饰LysM受体的互补方式，这可增加对LCO的亲和性和/或选择性，和通过用来自供体LysM受体的LysM1结构域的相应区域替换LysM1结构域中的区域，这可改变对寡糖，特别地对LCO的亲和性和/或选择性，并且当使用来自高亲和性和特异性LCO LysM受体比如豆类NFR1受体的区域时，可改变LCO之间的特异性。
本公开的某些方面涉及包括修饰为在LysM2结构域表面上包括疏水补丁的LysM2结构域的经修饰的植物LysM受体。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域结合脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以对LCO的更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的相互作用。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的脂质的相互作用。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种和其任何组合，或由选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体选自由以下项组成的组：LysM壳寡糖(CO)受体、LysM LCO受体和LysM肽聚糖(PGN)受体。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁邻近几丁质结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁是在几丁质结合基序的
Figure BDA0003013375720000041
或
Figure BDA0003013375720000042
内。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁邻近聚糖结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁是在聚糖结合基序的
Figure BDA0003013375720000043
或
Figure BDA0003013375720000044
内。在一些实施方式中，LysM受体不是胞外多糖(EPS)受体。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是与SEQ ID NO:34(即，莲属(Lotus)CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)具有至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的多肽。在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是具有氨基酸序列SEQ ID NO:34(即，莲属CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)的多肽。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，通过删除至少一个非疏水的氨基酸残基、用更疏水的氨基酸取代至少一个氨基酸残基或其组合来生成疏水补丁。在一些实施方式中，通过与来自天然地具有与LCO相互作用的疏水补丁的LysM高亲和性LCO受体的LysM2结构域进行氨基酸序列比对来鉴定至少一个氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以红色突出显示红色的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以红色突出显示红色的氨基酸或对应于图12A-12G和图13C中以红色突出显示红色的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以红色突出显示的红色氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以红色突出显示的红色氨基酸或对应于已知LCO受体的图12A-12G中以红色突出显示的红色氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸通过结构建模鉴定，以鉴定其中疏水补丁可被工程化的LysM2中的区域。在一些实施方式中，结构建模使用未经修饰的植物LysM氨基酸序列和具有已知疏水补丁的LysM结构域三维结构。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构是苜蓿属NFP胞外域。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构的已知疏水补丁氨基酸残基是或对应于苜蓿属NFP胞外域的L147、L151、L152、L154、T156、K157和V158。在一些实施方式中，至少一个氨基酸的α碳是在结构比对中已知疏水补丁氨基酸残基的α碳的
Figure BDA0003013375720000051
内。在一些实施方式中，使用SWISS-MODEL、PDB2PQR、APBS、PyMol和APBS工具2.1进行结构建模。
在一些方面中，本公开涉及经修饰的植物LysM受体，其包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域。在一些实施方式中，通过用第二LysM1结构域的第三部分取代第一LysM1结构域的第一部分和/或通过用第二LysM1结构域的第四部分取代第一LysM1结构域的第二部分来修饰第一LysM1结构域。在一些实施方式中，第一LysM1结构域和第二LysM1结构域对寡糖具有不同亲和性，选择性和/或特异性，并且第一LysM1结构域的修饰改变了亲和性、选择性和/或特异性为更像第二LysM1结构域。在一些实施方式中，第一部分和第三部分对应于SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI，SEQ ID NO:28[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；并且其中第二部分和第四部分对应于SEQ ID NO:31[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；SEQ ID NO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在一些实施方式中，第一LysM1结构域选自SEQ ID NO:32[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/26-95]、SEQ ID NO:33[LysM1结构域苜蓿LYK3；MtLYK3/25-95]或NFR1DLALASYYILPGVFILQNITTFMQSEIVSSNDAITSYNKDKILNDINIQSFQRLNIPFP的组：；并且第二LysM1结构域是CERK6：ALAQASYYLLNGSNLTYISEIMQSSLLTKPEDIVSYNQDTIASKDSVQAGQRINVPFP。在一些实施方式中，第一部分选自SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI；第二部分选自SEQ ID NO:28[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；第三部分选自SEQ ID NO:31[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；和第四部分选自SEQ ID NO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在一些实施方式中，用整个第二LysM1结构域替换整个第一LysM1结构域。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域结合由固氮菌或由菌根真菌产生的脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，LCO由选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种和其任何组合，或由选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；及其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域与未经修饰的LysM1结构域相比以改变的特异性结合LCO。在一些实施方式中，结构建模用于定义LysM1结构域并且用于鉴定用于取代的第一部分、第二部分、第三部分和/或第四部分。在一些实施方式中，以上实施方式的受体进一步包括含有经修饰以含有疏水补丁的LysM2结构域，如与修饰LysM2结构域有关的任何先前实施方式所述。
在一些方面中，本公开涉及基因改变的植物或其部分，其包括编码任何前述实施方式的经修饰的植物LysM受体的核酸序列。在一些实施方式中，经修饰的植物LysM受体比未经修饰的植物LysM受体对LCO具有更高亲和性、更高选择性和/或改变的特异性，并且经修饰的植物LysM受体的表达使得植物或其部分以高亲和性、高选择性和/或改变的特异性识别LCO。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种和其任何组合，或由选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；及其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中，植物细胞是根细胞。在一些实施方式中，根细胞是根表皮细胞。在一些实施方式中，经修饰的多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中，核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ ID NO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，植物选自由以下项组成的组：玉米、水稻、大麦、小麦、山黄麻属(Trema)物种、苹果、梨、李子、杏子、桃子、扁桃、胡桃、草莓、树莓、黑莓、红醋栗、黑醋栗、甜瓜、黄瓜、南瓜、倭瓜、葡萄、大豆、豌豆、鹰嘴豆、豇豆、木豆、扁豆、班巴拉花生、羽扇豆、干豆、苜蓿属物种、莲属物种、豆科牧草、槐蓝属、豆类树木或大麻。在一些实施方式中，植物部分是叶、茎、根、根原基、花、种子、果实、核、谷粒、细胞或其部分。
在一些方面中，本公开涉及基因改变的植物或其部分，其包括编码经修饰的植物LysM受体的第一核酸序列和编码经修饰的植物LysM受体的第二核酸序列，其中LysM1结构域已经如与对LysM1结构域的修饰有关的任何前述实施方式进行修饰，其中LysM2结构域已经如与对LysM2结构域的修饰有关的任何前述实施方式进行修饰以包括疏水补丁。在一些实施方式中，经修饰的植物LysM受体比未经修饰的植物LysM受体对LCO具有更高亲和性、更高选择性和/或改变的特异性并且经修饰的植物LysM受体的表达使得植物或其部分以高亲和性、高选择性和/或改变的特异性识别LCO。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种和其任何组合，或由选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；及其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中，植物细胞是根细胞。在一些实施方式中，根细胞是根表皮细胞。在一些实施方式中，经修饰的多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中，第一核酸或第二核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ ID NO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，植物选自由以下项组成的组：玉米、水稻、大麦、小麦、山黄麻属物种、苹果、梨、李子、杏子、桃子、扁桃、胡桃、草莓、树莓、黑莓、红醋栗、黑醋栗、甜瓜、黄瓜、南瓜、倭瓜、葡萄、大豆、豌豆、鹰嘴豆、豇豆、木豆、扁豆、班巴拉花生、羽扇豆、干豆、苜蓿属物种、莲属物种、豆科牧草、槐蓝属、豆类树木或大麻。在一些实施方式中，植物部分是叶、茎、根、根原基、花、种子、果实、核、谷粒、细胞或其部分。在一些实施方式中，植物部分是果实、核或谷粒。
在一些方面中，本公开涉及任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的花粉粒或胚珠。
在一些方面中，本公开涉及来自任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的原生质体。
在一些方面中，本公开涉及从来自任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的原生质体或细胞产生的组织培养物，其中细胞或原生质体从选自由以下项组成的组的植物部分产生：叶、花药、雌蕊、茎、叶柄、根、根原基、根尖、果实、种子、花、子叶、下胚轴、胚胎和分生组织细胞。
在一些方面中，本公开涉及产生任何一个以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的方法，其包括将基因改变引入包括核酸序列的植物。在一些实施方式中，核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ ID NO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子(KAY等，Science,236,4805,1987)、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，将核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列插入植物的基因组，以便核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列可操作地连接至内源启动子。在一些实施方式中，内源启动子是根特异性启动子。
本公开的另外方面涉及包括修饰为在LysM2结构域表面上包括疏水补丁的LysM2结构域的经修饰的植物LysM受体。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域结合脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以对LCO高选择性结合LCO。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的相互作用。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的脂质的相互作用。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体选自以下项的组：LysM壳寡糖(CO)受体、LysM LCO受体或aLysM肽聚糖(PGN)受体。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁邻近几丁质结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁是在几丁质结合基序的
Figure BDA0003013375720000121
Figure BDA0003013375720000122
或
Figure BDA0003013375720000123
内。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁邻近聚糖结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁是在聚糖结合基序的
Figure BDA0003013375720000124
或
Figure BDA0003013375720000125
内。在一些实施方式中，LysM受体不是胞外多糖(EPS)受体。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是与SEQ ID NO:34(即，莲属CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)具有至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的多肽。在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是具有氨基酸序列SEQ ID NO:34(即，莲属CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)的多肽。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，通过删除至少一个非疏水的氨基酸残基、用更疏水的氨基酸取代至少一个氨基酸残基或其组合来生成疏水补丁。在任何以上实施方式的一些实施方式中，通过修饰未经修饰的LysM受体中现有的疏水补丁来生成疏水补丁。在一些实施方式中，通过删除至少一个非疏水的氨基酸残基、用更疏水的氨基酸取代至少一个氨基酸残基、用另一个疏水的氨基酸残基取代至少一个疏水的氨基酸残基或其组合来修饰未经修饰的LysM受体。在一些实施方式中，通过与来自天然地具有与LCO相互作用的疏水补丁的LysM高亲和性LCO受体的LysM2结构域进行氨基酸序列比对来鉴定至少一个氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸或对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体下划线的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体下划线的氨基酸或对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体下划线的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸通过结构建模鉴定，以鉴定其中疏水补丁可被工程化的LysM2中的区域。在一些实施方式中，结构建模使用未经修饰的植物LysM氨基酸序列和具有已知疏水补丁的LysM结构域三维结构。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构是苜蓿属NFP胞外域。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构的已知疏水补丁氨基酸残基是或对应于苜蓿属NFP胞外域的L147、L151、L152、L154、T156、K157和V158。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构是莲属LYS11胞外域。在一些实施方式中，未经修饰的LysM受体是莲属LYS11受体并且经修饰的LysM结构域的现有疏水补丁氨基酸残基是或对应于莲属LYS11胞外域的K100、E101、G102、E103、S104、Y105、Y106、N128和Y129。在一些实施方式中，至少一个氨基酸的α碳是在结构比对中已知疏水补丁氨基酸残基的α碳的
Figure BDA0003013375720000131
内。在一些实施方式中，使用SWISS-MODEL、PDB2PQR、APBS、PyMol和APBS工具2.1进行结构建模。在任何以上实施方式的一些实施方式中，(i)未经修饰的LysM受体的LysM2结构域中80％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、40％或更少、30％或更少或者20％或更少的氨基酸残基被取代或删除以生成经修饰的植物LysM受体，和(ii)未经修饰的植物LysM受体中的整个LysM2结构域没有用另一整个LysM2结构域取代以生成经修饰的植物LysM受体的之一或二者。在任何以上实施方式的一些实施方式中，使用与包括其任何和所有实施方式的这种选择有关的本公开的任何一个方面的方法来选择未经修饰的植物LysM受体。
在一些方面中，本公开涉及经修饰的植物LysM受体，其包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域。在一些实施方式中，通过用第二LysM1结构域的第三部分取代第一LysM1结构域的第一部分和/或通过用第二LysM1结构域的第四部分取代第一LysM1结构域的第二部分来修饰第一LysM1结构域。在一些实施方式中，第一LysM1结构域和第二LysM1结构域对寡糖具有不同亲和性，选择性和/或特异性，并且第一LysM1结构域的修饰改变了亲和性、选择性和/或特异性为更像第二LysM1结构域。在一些实施方式中，第一部分和第三部分对应于SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI，SEQ ID NO:28[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；并且其中第二部分和第四部分对应于SEQ ID NO:31[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；SEQ ID NO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在一些实施方式中，第一LysM1结构域选自由以下项的组：SEQ ID NO:32[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/26-95]、SEQ ID NO:33[LysM1结构域苜蓿LYK3；MtLYK3/25-95]或NFR1 DLALASYYILPGVFILQNITTFMQSEIVSSNDAITSYNKDKILNDINIQSFQRLNIPFP；并且第二LysM1结构域是CERK6：ALAQASYYLLNGSNLTYISEIMQSSLLTKPEDIVSYNQDTIASKDSVQAGQRINVPFP。在一些实施方式中，第一部分选自SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI；第二部分选自SEQ ID NO:28[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；第三部分选自SEQ ID NO:31[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；和第四部分选自SEQ ID NO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域，通过用第二LysM1结构域的第六部分取代第一LysM1结构域的第五部分来进一步修饰第一LysM1结构域。在一些实施方式中，第一LysM1结构域是SEQ ID NO:115[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/32-89]或SEQ ID NO:106[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/31-89]并且第二LysM1结构域是SEQ ID NO:114[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/31-89]或SEQ ID NO:105[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/30-89]。在一些实施方式中，其中第五部分是SEQ ID NO:53[莲属NFR1区域III 59-62；LjNFR1/56-92]并且其中第六部分是SEQ ID NO:46[苜蓿属LYK3区域III 57-62；MtLYK3/57-62]。在一些实施方式中，通过用第二LysM1结构域的第八部分取代第一LysM1结构域的第七部分来修饰第一LysM1结构域，其中第七部分跨越第一LysM1结构域的第一部分、第一LysM1结构域的第二部分和第一LysM1结构域的第五部分，其中第八部分跨越第二LysM1结构域的第三部分、第二LysM1结构域的第四部分和第二LysM1结构域的第六部分。在一些实施方式中，第一LysM1结构域的第七部分是SEQ ID NO:51[莲属NFR1区域II-IV 41-82；LjNFR1/41-82]并且第二LysM1结构域的第八部分是SEQ ID NO:113[苜蓿属LYK3区域II-IV 40-82；MtLYK3/40-82]或SEQ ID NO:104[苜蓿属LYK3区域II-IV 41-82；MtLYK3/41-82]。在一些实施方式中，第一LysM1结构域是SEQ ID NO:33[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/31-89]并且第二LysM1结构域是SEQ ID NO:32[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/32-89]。在一些实施方式中，第五部分是SEQ ID NO:46[苜蓿属LYK3区域III 57-62；MtLYK3/57-62]，并且第六部分是SEQ IDNO:53[莲属NFR1区域III 59-62；LjNFR1/59-62]。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括第一LysM1结构域是SEQ ID NO:33并且第二LysM1结构域是SEQ ID NO:32，通过用第二LysM1结构域的第八部分取代第一LysM1结构域的第七部分来修饰第一LysM1结构域，其中第七部分跨越第一LysM1结构域的第一部分，第一LysM1结构域的第二部分，和第一LysM1结构域的第五部分，其中第八部分跨越第二LysM1结构域的第三部分，第二LysM1结构域的第四部分，和第二LysM1结构域的第六部分。在一些实施方式中，第一LysM1结构域的第七部分是SEQ ID NO:51[莲属NFR1区域II-IV 41-82；LjNFR1/41-82]，并且第二LysM1结构域的第八部分是SEQ ID NO:113[苜蓿属LYK3区域II-IV 40-82；MtLYK3/40-82]或SEQ ID NO:104[苜蓿属LYK3区域II-IV 41-82；MtLYK3/41-82]。
在任何以上实施方式的一些实施方式中包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域，用整个第二LysM1结构域替换整个第一LysM1结构域。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域，(i)第一LysM1结构域中80％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、40％或更少、30％或更少或者20％或更少的氨基酸残基用第二LysM1结构域的相应氨基酸残基取代或删除，和(ii)未经修饰的植物LysM受体中整个LysM1结构域没有用另一整个LysM2结构域取代的之一或二者以生成经修饰的植物LysM受体。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域结合由固氮菌或由菌根真菌产生的脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，LCO由选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobiummongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etliphaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphonpyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域与未经修饰的LysM1结构域相比以改变的特异性结合LCO。在一些实施方式中，结构建模用于定义LysM1结构域并且用于鉴定用于取代的第一部分、第二部分、第三部分和/或第四部分。在一些实施方式中，使用与包括其任何和所有实施方式的这种选择有关的本公开的任何一个方面的方法来选择未经修饰的植物LysM受体并且第二LysM2结构域来自供体植物LysM受体。在一些实施方式中，以上实施方式的受体进一步包括如与修饰LysM2结构域有关的任何先前实施方式的修饰为含有疏水补丁的LysM2结构域。
在一些方面中，本公开涉及基因改变的植物或其部分，其包括编码任何前述实施方式的经修饰的植物LysM受体的核酸序列。在一些实施方式中，经修饰的植物LysM受体比未经修饰的植物LysM受体对LCO具有更高亲和性、更高选择性和/或改变的特异性并且经修饰的植物LysM受体的表达使得植物或其部分以高亲和性、高选择性和/或改变的特异性识别LCO。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO通过选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中，植物细胞是根细胞。在一些实施方式中，根细胞是根表皮细胞。在一些实施方式中，经修饰的多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中，核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ ID NO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，植物选自由以下项组成的组：玉米、水稻、大麦、小麦、山黄麻属物种、苹果、梨、李子、杏子、桃子、扁桃、胡桃、草莓、树莓、黑莓、红醋栗、黑醋栗、甜瓜、黄瓜、南瓜、倭瓜、葡萄、菜豆、大豆、豌豆、鹰嘴豆、豇豆、木豆、扁豆、班巴拉花生、羽扇豆、干豆、苜蓿属物种、莲属物种、豆科牧草、槐蓝属、豆类树木或大麻。在一些实施方式中，植物部分是叶、茎、根、根原基、花、种子、果实、核、谷粒、细胞或其部分。
在一些方面中，本公开涉及基因改变的植物或其部分，包括编码经修饰的植物LysM受体的第一核酸序列，其中LysM1结构域已经如与对LysM1结构域修饰有关的任何前述实施方式进行修饰，并包括编码经修饰的植物LysM受体的第二核酸序列，其中LysM2结构域已经如与修饰LysM2结构域有关的任何前述实施方式进行修饰以包括疏水补丁。在一些实施方式中，经修饰的植物LysM受体比未经修饰的植物LysM受体对LCO具有更高亲和性、更高选择性和/或改变的特异性并且经修饰的植物LysM受体的表达使得植物或其部分以高亲和性、高选择性和/或改变的特异性识别LCO。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO通过选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中，植物细胞是根细胞。在一些实施方式中，根细胞是根表皮细胞。在一些实施方式中，经修饰的多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中，第一核酸或第二核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ ID NO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，植物选自以下项的组：玉米、水稻、大麦、小麦、山黄麻属物种、苹果、梨、李子、杏子、桃子、扁桃、胡桃、草莓、树莓、黑莓、红醋栗、黑醋栗、甜瓜、黄瓜、南瓜、倭瓜、葡萄、菜豆、大豆、豌豆、鹰嘴豆、豇豆、木豆、扁豆、班巴拉花生、羽扇豆、干豆、苜蓿属物种、莲属物种、豆科牧草、槐蓝属、豆类树木或大麻。在一些实施方式中，植物部分是叶、茎、根、根原基、花、种子、果实、核、谷粒、细胞或其部分。在一些实施方式中，植物部分是果实、核或谷粒。
在一些方面中，本公开涉及任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的花粉粒或胚珠。
在一些方面中，本公开涉及来自任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的原生质体。
在一些方面中，本公开涉及从来自任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的原生质体或细胞产生的组织培养物，其中细胞或原生质体从选自以下项的组的植物部分产生：叶、花药、雌蕊、茎、叶柄、根、根原基、根尖、果实、种子、花、子叶、下胚轴、胚胎和分生组织细胞。
在一些方面中，本公开涉及产生任何一个以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的方法，其包括将基因改变引入具有核酸序列的植物。在一些实施方式中，核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ ID NO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子(KAY等，Science,236,4805,1987)、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，将核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列插入植物的基因组，以便核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列可操作地连接至内源启动子。在一些实施方式中，内源启动子是根特异性启动子。
在进一步方面中，本公开涉及选择靶植物LysM受体用于将靶植物LysM受体修饰为具有期望的受体特点的方法，其中方法包括下述步骤：a)提供具有期望的受体特点的供体植物LysM受体和两种或更多种潜在靶植物LysM受体的结构模型、分子模型、表面特点模型和/或静电势模型；b)比较两种或更多种潜在靶植物LysM受体的每种与供体植物LysM受体的结构模型、分子模型、表面特点模型和/或静电势模型，和/或比较两种或更多种潜在靶植物LysM受体的每种与供体植物LysM受体，其中使用结构叠加；和c)选择与对供体植物LysM受体合适匹配的潜在靶植物LysM受体作为靶植物LysM受体。在一些实施方式中，用于确定步骤(c)中对供体植物LysM受体是合适匹配的潜在靶植物LysM受体的标准选自以下项的组：对模板结构拟合的良好性；相似性；系统发育关系；表面电势；对模板结构的覆盖率；来自SWISS-模型的GMQE、QMEAN和局部质量评估；或其任何组合。在一些实施方式中，供体植物LysM受体的结构模型是蛋白质晶体结构、分子模型、冷冻-EM结构和NMR结构。在一些实施方式中，供体植物LysM受体模型具有整个胞外域且两种或更多种潜在靶植物LysM受体模型具有整个胞外域。在一些实施方式中，供体植物LysM受体模型具有LysM1结构域、LysM2结构域、LysM3结构域或其任何组合且两种或更多种潜在靶植物LysM受体模型具有LysM1结构域、LysM2结构域、LysM3结构域或其任何组合。
在一些实施方式中，供体植物LysM受体是苜蓿属NFP、苜蓿属LYK3、莲属NFR1、莲属NFR5、莲属LYS11或拟南芥属CERK1。在一些实施方式中，另外，将两种或更多种靶植物LysM受体与莲属CERK6比较。在一些实施方式中，两种或更多种潜在靶植物LysM受体多肽都来自相同植物物种或植物品种。在一些实施方式中，期望的受体特点是对寡糖或寡糖的类别的亲和性、选择性和/或特异性。在一些实施方式中，期望的受体特点是对寡糖或寡糖的类的结合动力学，其中结合动力学包括解离速率和结合速率。在一些实施方式中，寡糖的类别选自由以下项的组：LCO、CO、β-葡聚糖、环-β-葡聚糖、外多糖或任选地LPS。在一些实施方式中，寡糖的类是LCO或CO。在一些实施方式中，寡糖的类是LCO，任选地通过任选地选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或任选地通过任选地选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。在一些实施方式中，LCO是百脉根中慢生根瘤菌LCO、苜蓿中华根瘤菌LCO-IV或苜蓿中华根瘤菌LCO-V。
在一些实施方式中，方法进一步包括步骤d)通过比较供体植物LysM受体中第一寡糖结合特征的氨基酸残基与靶植物LysM受体中相应的氨基酸残基，鉴定靶LysM受体中用于修饰的一个或多个氨基酸残基，和任选地通过比较供体植物LysM受体中第二寡糖结合特征的氨基酸残基与靶植物LysM受体中相应的氨基酸残基，鉴定靶LysM受体中用于修饰的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，方法进一步包括步骤e)生成经修饰的植物LysM受体，其中靶植物LysM受体的第一寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代；生成经修饰的植物LysM受体，其中靶植物LysM受体的第二寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代；或生成经修饰的植物LysM受体，其中靶植物LysM受体的第一寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代并且靶植物LysM受体的第二寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代。在一些实施方式中，第一寡糖结合特征是LysM2结构域的表面上的疏水补丁。在一些实施方式中，第二寡糖结合特征是供体植物LysM受体的LysM1结构域的部分。
在另外方面中，本公开涉及使用任何一个前述方法产生的经修饰的植物LysM受体，其中经修饰的植物LysM受体包括修饰为在LysM2结构域表面上包括疏水补丁的LysM2结构域。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域结合脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域对LCO以更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的相互作用。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的脂质的相互作用。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobiummongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etliphaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；及其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphonpyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体选自以下项的组：LysM壳寡糖(CO)受体、LysM LCO受体或LysM肽聚糖(PGN)受体。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁邻近几丁质结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁是在几丁质结合基序的
Figure BDA0003013375720000251
Figure BDA0003013375720000252
或
Figure BDA0003013375720000253
内。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁邻近聚糖结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁是在聚糖结合基序的
Figure BDA0003013375720000254
或
Figure BDA0003013375720000255
内。在一些实施方式中，LysM受体不是胞外多糖(EPS)受体。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是与SEQ ID NO:34(即，莲属CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)具有至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的多肽。在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是具有氨基酸序列SEQ ID NO:34(即，莲属CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)的多肽。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，通过删除至少一个非疏水的氨基酸残基、用更疏水的氨基酸取代至少一个氨基酸残基或其组合来生成疏水补丁。在任何以上实施方式的一些实施方式中，通过修饰未经修饰的LysM受体中现有的疏水补丁来生成疏水补丁。在一些实施方式中，通过删除至少一个非疏水的氨基酸残基、用更疏水的氨基酸取代至少一个氨基酸残基、用另一个疏水的氨基酸残基取代至少一个疏水的氨基酸残基或其组合来修饰未经修饰的LysM受体。在一些实施方式中，通过与来自天然地具有与LCO相互作用的疏水补丁的LysM高亲和性LCO受体的LysM2结构域进行氨基酸序列比对来鉴定至少一个氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸或对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体加下划线的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体加下划线的氨基酸或对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体加下划线的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸通过结构建模鉴定，以鉴定其中疏水补丁可被工程化的LysM2中的区域。在一些实施方式中，结构建模使用未经修饰的植物LysM氨基酸序列和具有已知疏水补丁的LysM结构域三维结构。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构是苜蓿属NFP胞外域。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构的已知疏水补丁氨基酸残基是或对应于苜蓿属NFP胞外域的L147、L151、L152、L154、T156、K157和V158。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构是莲属LYS11胞外域。在一些实施方式中，未经修饰的LysM受体是莲属LYS11受体并且经修饰的LysM结构域的现有疏水补丁氨基酸残基是或对应于莲属LYS11胞外域的K100、E101、G102、E103、S104、Y105、Y106、N128和Y129。在一些实施方式中，至少一个氨基酸的α碳是在结构比对中已知疏水补丁氨基酸残基的α碳的
Figure BDA0003013375720000261
内。在一些实施方式中，使用SWISS-MODEL、PDB2PQR、APBS、PyMol和APBS工具2.1进行结构建模。在任何以上实施方式的一些实施方式中，(i)未经修饰的LysM受体的LysM2结构域中80％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、40％或更少、30％或更少或者20％或更少的氨基酸残基被取代或删除以生成经修饰的植物LysM受体，和(ii)未经修饰的植物LysM受体中的整个LysM2结构域没有用另一整个LysM2结构域取代以生成经修饰的植物LysM受体的之一或二者。在可与任何前述实施方式组合的一些实施方式中，与基因改变的植物或其部分有关的本公开包括任何以上实施方式的经修饰的植物LysM受体。
在进一步方面中，本公开涉及使用任何一个前述方法产生的经修饰的植物LysM受体，其中经修饰的植物LysM受体包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域。在一些实施方式中，通过用第二LysM1结构域的第三部分取代第一LysM1结构域的第一部分和/或通过用第二LysM1结构域的第四部分取代第一LysM1结构域的第二部分来修饰第一LysM1结构域。在一些实施方式中，第一LysM1结构域和第二LysM1结构域对寡糖具有不同亲和性，选择性和/或特异性，并且第一LysM1结构域的修饰改变了亲和性、选择性和/或特异性为更像第二LysM1结构域。在一些实施方式中，第一部分和第三部分对应于SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI，SEQ IDNO:28[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；并且其中第二部分和第四部分对应于SEQID NO:31[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；SEQ ID NO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在一些实施方式中，第一LysM1结构域选自以下项的组：SEQ ID NO:32[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/26-95]，SEQ ID NO:33[LysM1结构域苜蓿LYK3；MtLYK3/25-95]，或NFR1 DLALASYYILPGVFILQNITTFMQSEIVSSNDAITSYNKDKILNDINIQSFQRLNIPFP；和第二LysM1结构域is CERK6：ALAQASYYLLNGSNLTYISEIMQSSLLTKPEDIVSYNQDTIASKDSVQAGQRINVPFP。在一些实施方式中，第一部分选自SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI；第二部分选自SEQ ID NO:28[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；第三部分选自SEQ ID NO:31[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；和第四部分选自SEQ IDNO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域，通过用第二LysM1结构域的第六部分取代第一LysM1结构域的第五部分来进一步修饰域第一LysM1结构域。在一些实施方式中，第一LysM1结构域是SEQ ID NO:115[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/32-89]或SEQ ID NO:106[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/31-89]和第二LysM1结构域is SEQ ID NO:114[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/31-89]或SEQ ID NO:105[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/30-89]。在一些实施方式中，其中第五部分是SEQ IDNO:53[莲属NFR1区域III 59-62；LjNFR1/59-62]，和其中第六部分是SEQ ID NO:46[苜蓿属LYK3区域III 57-62；MtLYK3/57-62]。在一些实施方式中，通过用第二LysM1结构域的第八部分取代第一LysM1结构域的第七部分来修饰第一LysM1结构域，其中第七部分跨越第一LysM1结构域的第一部分，第一LysM1结构域的第二部分，和第一LysM1结构域的第五部分，其中第八部分跨越第二LysM1结构域的第三部分，第二LysM1结构域的第四部分，和第二LysM1结构域的第六部分。在一些实施方式中，第一LysM1结构域的第七部分是SEQ ID NO:51[莲属NFR1区域II-IV 41-82；LjNFR1/41-82]，和第二LysM1结构域的第八部分是SEQ IDNO:113[苜蓿属LYK3区域II-IV 40-82；MtLYK3/40-82]或SEQ ID NO:104[苜蓿属LYK3区域II-IV 41-82；MtLYK3/41-82]。在一些实施方式中，第一LysM1结构域是SEQ ID NO:33[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/31-89]和第二LysM1结构域是SEQ ID NO:32[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/32-89]。在一些实施方式中，第五部分是SEQ ID NO:46[苜蓿属LYK3区域III 57-62；MtLYK3/57-62]，和第六部分是SEQ ID NO:53[莲属NFR1区域III 59-62；LjNFR1/59-62]。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括第一LysM1结构域是SEQ IDNO:33和第二LysM1结构域是SEQ ID NO:32，通过用第二LysM1结构域的第八部分取代第一LysM1结构域的第七部分来修饰第一LysM1结构域，其中第七部分跨越第一LysM1结构域的第一部分，第一LysM1结构域的第二部分，和第一LysM1结构域的第五部分，其中第八部分跨越第二LysM1结构域的第三部分，第二LysM1结构域的第四部分，和第二LysM1结构域的第六部分。在一些实施方式中，第一LysM1结构域的第七部分是SEQ ID NO:51[莲属NFR1区域II-IV 41-82；LjNFR1/41-82]，和第二LysM1结构域的第八部分是SEQ ID NO:113[苜蓿属LYK3区域II-IV 40-82；MtLYK3/40-82]或SEQ ID NO:104[苜蓿属LYK3区域II-IV 41-82；MtLYK3/41-82]。
在任何以上实施方式的一些实施方式中包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域，用整个第二LysM1结构域替换整个第一LysM1结构域。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域，(i)第一LysM1结构域中80％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、40％或更少、30％或更少或者20％或更少的氨基酸残基用第二LysM1结构域的相应氨基酸残基取代或删除，和(ii)未经修饰的植物LysM受体中整个LysM1结构域没有用另一整个LysM2结构域取代以生成经修饰的植物LysM受体的之一或二者。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域结合由固氮菌或由菌根真菌产生的脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，LCO由选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobiummongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etliphaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphonpyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域与未经修饰的LysM1结构域相比以改变的特异性结合LCO。在一些实施方式中，结构建模用于定义LysM1结构域并且用于鉴定用于取代的第一部分、第二部分、第三部分和/或第四部分。在一些实施方式中，以上实施方式的受体进一步包括如与修饰LysM2结构域有关的任何先前实施方式的修饰为含有疏水补丁的LysM2结构域。在可与任何前述实施方式组合的一些实施方式中，与基因改变的植物或其部分有关的本公开包括任何以上实施方式的经修饰的植物LysM受体。
附图说明
图1显示具有标记的三个LysM结构域(LysM1、LysM2和LysM3)的NFP受体胞外域(NFP-ECD)的结构。LysM结构域内的基序也被标记：LysM1基序＝α1、α2、β1和β2；LysM2基序＝α3、α4、β3和β4；和LysM3基序＝α5、α6、β5和β6。显示了糖基化(二GlcNAc核心(上方从α1突出；邻近β2和β1的中心处以及在α4的左下方处可见的另外核心)，并且二硫桥用箭头指示且用残基数标记(C47-C166、C39-C104和C102-C164)。
图2A-2B显示苜蓿属NFP LysM2结构域中的疏水补丁以及使用疏水补丁内重要残基的突变体的结合测定测量。图2A显示CO4(命名为“配体”)通过静电表面电势而分子对接至加阴影的苜蓿属NFP。由黑色虚线圈出疏水补丁，且使用箭头显示了重要残基L147和L154的位置。用灰色虚线描绘了LCO脂肪酸的位置。图2B显示比较野生型(WT)NFP(“NFP WT”)与在残基147和154(“NFP L147D L154D”；粗体)处突变的NFP的结合测定测量。NFP WT显示的结果来自七次重复和NFP L147D L154D显示的结果来自四次重复。
图3显示用于突变体互补实验的构建体的总体示意图。命名如下：T-DNA左边界＝LB，T-DNA右边界＝RB，核定位三重黄色荧光蛋白质＝tYFPnls，缓冲区序列＝缓冲区，组成型泛素启动子＝pUbi，Nfr1启动子＝pNfr1，Cerk6启动子＝pCerk6。箭头指示基因转录的方向。
图4A-4B显示苜蓿属nfp突变体的互补测定。图4A显示用苜蓿中华根瘤菌菌株2011接种所测试的互补。图4B显示用药用中华根瘤菌接种测试的互补。柱表示平均结节数，而圆圈表示个体计数。空的圆圈＝苜蓿属A17野生型；实心圆圈＝苜蓿属nfp突变体；EVC＝空载体对照和WT＝野生型。误差线显示SEM。不同字母指示样品之间的显著差异(ANOVA，Tukey，P<0.05)。
图5A-5B显示使用百脉根(Lotus japonicus)(Lj)LCO受体NFR1和百脉根(Lj)CO受体CERK6之间交换结构域的功能研究测量结瘤和防御的结果。图5A显示莲属nfr1-1单个突变体与不同结构域-交换的蛋白质构建体的互补实验。在用百脉根中慢生根瘤菌R7A接种(dpi)后指示的天数之后在多毛根转化百脉根nfr1-1突变体根上计数结节。图5B显示用不同结构域-交换的蛋白质构建体对莲属cerk6单个突变体的互补。CO8和flg22引起的ROS峰值的比例根据设置为1的野生型样品(Gifu；用空载体转化)进行归一化而绘制。在图5A和5B二者中，黑点表示个体转化的植物，且误差线显示SEM。不同字母指示样品之间的显著差异(ANOVA，Tukey，P<0.01)。重组受体的组合物通过各个部分的阴影显示，用黑色指示LjNFR1衍生的序列和灰色指示LjCERK6衍生的序列。阴影线指示多个氨基酸长区域交换(黑色线是LjNFR1衍生的序列；黑色线LjCERK6衍生的序列)，而白色线指示将大的氨基酸(Trp)引入LysM结构的单个氨基酸突变。LysM结构域在重组受体的左侧(图5A中)或右侧(图5B中)处标记为LysM1、LysM2和LysM3，且跨膜和细胞内结构域在重组受体的的左侧(图5A中)或右侧(图5B中)处标记为TM+IC。
图6显示具有三个标记的LysM结构域(LysM1、LysM2和LysM3)的莲属CERK6胞外域的3D结构。LysM1中的区域II和区域IV以浅灰色标记且阴影。
图7显示图的底部处描绘的百脉根nfr1-1突变体与LjNFR1/MtLYK3嵌合体的互补。通过计数每个植物形成的结节测定互补，其在图7的顶部处显示。黑点表示个体植物，柱指示平均值，和误差线显示SEM。不同字母指示样品之间显著差异(ANOVA，Tukey，P<0.01)。测试的个体嵌合受体的示意图在图7底部处显示，其中白色指示LjNFR1结构域、灰色指示MtLYK3结构域和黑色指示LjCERK6结构域(对照)。LysM结构域被标记为LysM1、LysM2和LysM3；跨膜和近膜结构域被标记为TM和JM；和激酶结构域被标记为K。
图8A-8C显示从以下选择的LysM受体的比对：拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At；AT3G21630_CERK1(SEQ ID NO:75)、AT1G77630_LYP3(SEQ ID NO:80)、AT2G17120_LYP1(SEQ ID NO:82))、玉米(Zea mays)(Zm；ZM9_NP_001146346.1(SEQ ID NO:72))、大麦(Hordeum vulgare)(Hv；HvLysMRLK4_AK369594.1(SEQ ID NO:73))、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)(Mt或Medtr；Mt_LYK9_XP_003601376(SEQ ID NO:69)、Mt_LYK3_XP_003616958(SEQ ID NO:71)、Mt_LYK10_XP_003613165(SEQ ID NO:77)、Medtr5g042440.1(SEQ ID NO:79))、亚洲栽培稻(Oryza sativa)(Os；XP_015611967_OsCERK1(SEQ ID NO:74)、OsCeBiP(SEQ ID NO:81))和百脉根(Lotus japonicus)(Lj；BAI79273.1_CERK6(SEQ ID NO:34)、CAE02590.1_NFR1(SEQ ID NO:70)、BAI79284.1_EPR3(SEQ ID NO:76)、CAE02597.1_NFR5(SEQ ID NO:78))。NFR1和NFR5是Nod因子受体，EPR3是胞外多糖受体，AtLYP1和AtLYP3是肽聚糖受体，AtCERK1、OsCERK1、OsCeBIP、CERK6是壳寡糖受体。显示了三个LysM结构域的侧面的C(x)XXXC和CxC基序。显示了LysM1(黑线)、LysM2(灰线)和LysM3(灰线)。图8A显示包括全部LysM1结构域和部分LysM2结构域的比对的前两个部分。图8B显示包括剩余LysM2结构域和全部LysM3结构域的比对的第三和第四部分。图8C显示比对的第五部分。
图9A-9B显示从以下选择的LysM受体的比对：拟南芥(At；AT3G21630_CERK1(SEQID NO:75))、玉米(Zm；XP_020399958_ZM1(SEQ ID NO:20)、XP_008652982.l_ZM5(SEQ IDNO:21)、AQK73561.1_ZM7(SEQ ID NO:84)、NP_001147981.1_ZM3(SEQ ID NO:85)、NP_001147941.2_ZM6(SEQ ID NO:86)、AQK58792.1_ZM4(SEQ ID NO:87)、ZM9_NP_001146346.1(SEQ ID NO:72))、大麦(Hv；HORVU4Hr1G066170_HvLysMRLK10(SEQ ID NO:19)、AK357612_HvLysMRLK2(SEQ ID NO:17)、AK370300_HvLysmRLK1(SEQ ID NO:16)、AK372128_HvLysMRLK3(SEQ ID NO:18)、HvLysMRLK4_AK369594.1(SEQ ID NO:73))、亚洲栽培稻(Os；XP_015611967_OsCERK1(SEQ ID NO:74))、蒺藜苜蓿(Mt；XP_003613904.2_MtNFP(SEQ IDNO:83)、Mt_LYK3_XP_003616958(SEQ ID NO:71)、Mt_LYK9_XP_003601376(SEQ ID NO:69))和百脉根(Lj；CAE02590.1_NFR1(SEQ ID NO:70)、CAE02597.1_NFR5(SEQ ID NO:78)、BAI79273.1_CERK6(SEQ ID NO:34))。LjNFR1、LjNFR5、MtLYK3和MtNFP是功能Nod因子受体，AtCERK1、OsCERK1、LjCERK6是功能几丁质受体。显示了三个LysM结构域的侧面的C(x)XXXC和CxC基序。显示了LysM1(黑线)、LysM2(灰线)和LysM3(灰线)。位于LysM1之前的C(x)XXXC基序中“X”残基的数量在受体之间变化，因此在该图中和在连续的图中的比对中，LysM1的位置(黑线)相应地变化。图9A显示包括全部LysM1结构域和部分LysM2结构域的比对的第一和第二部分。图9B显示包括剩余LysM2结构域和全部LysM3结构域的比对的第三和第四部分。
图10A-10B显示从以下选择的LysM受体的比对：玉米(Zm；ONM41523.1_ZM8(SEQ IDNO:88)、XP_008657477.1_ZM2(SEQ ID NO:89)、Zm00001d043516ZM10(SEQ ID NO:91))、大麦(Hv；MLOC_5489.2_HvLysM-RLK9(SEQ ID NO:90)、MLOC_18610.1_HvLysM-RLK8(SEQ IDNO:92)、MLOC_57536.1_HvLysM-RLK6(SEQ ID NO:93))、蒺藜苜蓿(Mt；Mt_LYK10_XP_003613165(SEQ ID NO:77)、Mt_LYK3_XP_003616958(SEQ ID NO:71)、XP_003613904.2_MtNFP(SEQ ID NO:83))和百脉根(Lj；BAI79284.1_EPR3(SEQ ID NO:76)、CAE02590.1_NFR1(SEQ ID NO:70)、CAE02597.1_NFR5(SEQ ID NO:78))。LjNFR1、LjNFR5、MtLYK3和MtNFP是功能Nod因子受体，LjEPR3是功能EPS受体。显示了三个LysM结构域的侧面的C(x)XXXC和CxC基序。显示了LysM1(黑线)、LysM2(灰线)和LysM3(灰线)。图10A显示包括全部LysM1结构域和全部LysM2结构域的比对的第一、第二和第三部分。图10B显示包括全部LysM3结构域的比对的第四、第五和第六部分。
图11A-11B显示从以下选择的LysM受体的比对：拟南芥(At；AT1G21880.2_LYP2(SEQ ID NO:94)、AT1G77630_LYP3(SEQ ID NO:80)、AT2G17120_LYP1(SEQ ID NO:82))、亚洲栽培稻(Os；OsCeBiP(SEQ ID NO:81))和百脉根(Lj；LjLYP1(SEQ ID NO:95)、LjLYP2(SEQID NO:96)、LjLYP3(SEQ ID NO:97)、CAE02590.1_NFR1(SEQ ID NO:70)、CAE02597.1_NFR5(SEQ ID NO:78))。LjNFR1、LjNFR5是功能Nod因子受体，AtLYP2和AtLYP3是PGN受体，OsCeBiP是功能几丁质受体。显示了三个LysM结构域的侧面的C(x)XXXC和CxC基序。显示了LysM1(黑线)，LysM2(灰线)和LysM3(灰线)。图11A显示包括全部LysM1结构域、全部LysM2结构域和全部LysM3结构域的比对的第一、第二、第三和第四部分。图11B显示比对的第五、第六和第七部分。
图12A-12E显示先前已知的LCO受体和新鉴定的LCO受体的注释的氨基酸序列。图12A显示了注释关键；用下划虚线显示LysM1结构域，用下划实线显示LysM2结构域，以粗体显示疏水补丁残基和用斜体的残基显示LysM3结构域。显示了苜蓿属NFP(MtNFP/1-595；SEQID NO:1)、莲属NFR5(已知的LCO受体；LjNFR5/1-595；SEQ ID NO:2)、豌豆SYM10(已知的LCO受体；豌豆_SYM10/1-594；SEQ ID NO:3)和大豆NFR5α(已知的LCO受体；GmNFR5α/1-598max；SEQ ID NO:4)。图12B显示了鹰嘴豆NFR5(新的LCO受体；鹰嘴豆NFR5/1-557(鹰嘴豆(Cicerarietinum))；SEQ ID NO:5)、菜豆NFR5(新的LCO受体；BeanNFR5/1-597(菜豆(Phaseolusvulgaris))；SEQ ID NO:7)、花生NFR5(新的LCO受体；PeanutNFR5/1-595[花生亚种花生(Arachis hypogaea subsp.hypogaea)]；SEQ ID NO:9)和莲属LYS11(新的LCO受体；LjLys11/1-591；SEQ ID NO:11)。图12C显示了苜蓿属LYR1(新的LCO受体；MtLYR1/1-590；SEQ ID NO:12)、拟山黄麻属NFP1(新的LCO受体；PanNFP1/1-613；SEQ ID NO:13)、拟山黄麻属NFP2(已知的LCO受体；PanNFP2/1-582；SEQ ID NO:14)和大麦受体HvLysM-RLK1(新的LCO受体；HvLysM-RLK1(AK370300)；SEQ ID NO:16)。图12D显示了大麦受体HvLysM-RLK2(新的LCO受体；HvLysM-RLK2(AK357612)；SEQ ID NO:17)、大麦受体HvLysM-RLK3 AK372128(新的LCO受体；HvLysM-RLK3 AK372128；SEQ ID NO:18)、大麦受体HvLysM-RLK10(新的LCO受体；HvLysM-RLK10(HORVU4Hr1G066170)；SEQ ID NO:19)和玉蜀黍受体ZM1(新的LCO受体；ZM1(XP_020399958)；SEQ ID NO:20)。图12E显示了玉蜀黍受体ZM5(新的LCO受体；ZM5(XP_008652982.1)；SEQ ID NO:21)、苹果NFP5(新的LCO受体；XP_008338966.1PREDICTED：丝氨酸/苏氨酸受体样激酶NFP[苹果(Malus domestica)]；SEQ ID NO:22)和草莓NFR5(新的LCO受体；XP_004300586.2PREDICTED：蛋白质LYK5样[野草莓亚种草莓(Fragaria vescasubsp.vesca)]；SEQ ID NO:23)。
图13A-13C显示HvLysM-RLK2/37-247LysM1-3结构域的结构建模和用于修饰以引入疏水补丁的残基选择。图13A显示PyMol可视化的HvLysM-RLK2/37-247模型的LysM1-3结构域，其中LysM1结构域被标记且以深灰色、LysM2被标记且以浅灰色和LysM3被标记且以浅灰色。图13B显示结合槽内建模的具有几丁质的模型的静电表面电势。图13C具有HvLysM-RLK2/37-247LysM1-3结构域的氨基酸序列，其中LysM1结构域具有虚下划线、LysM2结构域具有实下划线和LysM3结构域不具有下划线，以及可被修饰以创建疏水补丁的残基以粗体。
图14显示百脉根(Lj)NFR1和百脉根(Lj)CERK6 LysM1结构域的比对。自上而下观察，在顶行中显示LjNFR1(NFR1_Lj2g2904690；SEQ ID NO:99)、在第二行中显示LjCERK6(CERK6_AB503687；SEQ ID NO:100)、在第三行中显示序列保守。LysM1结构域中的II区域和IV区域通过浅灰色箭头表示且标记为“II.”或“IV.”。
图15A-15F显示百脉根LjLYS11胞外域模型和晶体结构、修饰的LjLYS11胞外域和修饰的LjLYS11胞外域的测试。图15A显示LjLYS11胞外域模型(LYS11–模型；左侧)与LjLYS11胞外域的晶体结构(LYS11–晶体结构；右侧)的比较。图15B显示用于测试的修饰的LjLYS11胞外域(LjLYS11–LjNFR5嵌合体)的示意图。顶部示意性显示具有完全LjLYS11结构域(黑色)的胞外域，中部示意性显示其中用来自LjNFR5的LysM2结构域(灰色)替换来自LjLYS11的LysM2结构域的胞外域，和底部示意性显示其中用来自LjNFR5的关键残基(灰色)替换来自LjLYS11的关键残基的胞外域(N-末端＝N’；LysM1＝M1；LysM2＝M2；LysM3＝M3；用于纯化的6x组氨酸标签＝6xHIS；C-末端＝C’)。图15C显示用具有整个LjLYS11组分的胞外域的结合测定的结果(用黑色的LjLYS11结构域在顶部显示胞外域示意图；结合测定的结果在底部显示)。Kd显示在每幅图的标题中(CO5(Kd＝11.4μM)、百脉根中慢生根瘤菌LCO(Kd＝38.6μM)和苜蓿中华根瘤菌LCO(弱结合))。图15D显示其中用来自LjNFR5的LysM2替换来自LjLYS11的LysM2的胞外域的结合测定的结果(胞外域示意图在顶部显示，其中LjLYS11结构域是黑色的和LjNFR5结构域是灰色的；结合测定的结果在底部显示)。图15E显示其中用来自LjNFR5的关键残基替换来自LjLYS11的关键残基的胞外域的结合测定的结果(胞外域示意图在顶部显示，其中LjLYS11结构域是黑色的和LjNFR5残基是灰色的；结合测定的结果在底部显示)。对于图15C-15E，y-轴上显示了以nm的结合、x-轴上显示了以秒(s)的时间和图的标题中显示了测试的分子(CO5、百脉根中慢生根瘤菌LCO和苜蓿中华根瘤菌LCO)。图15F显示图的底部处描绘的百脉根nfr5(Ljnfr5)突变体与LjNFR5/LjLYS11嵌合体的互补。通过计数每个植物形成的结节测定互补，其在图15F的顶部显示。黑点表示个体植物，柱指示平均值和误差线显示SEM。不同字母指示样品之间显著差异(ANOVA，Tukey，P<0.01)。测试的个体嵌合胞外域的示意图在图15F的底部显示，用浅灰色指示LjNFR5结构域、灰色指示LjLYS11结构域和通过标签表示空载体(LysM1、LysM2和LysM3显示为方框；跨膜结构域显示为波浪形状；激酶结构域显示为椭圆形状)。以下受体示意图，提供了当用描绘的载体转化时植物的数量(植物)、不具有结节的植物的数量(neg)、具有结节的植物的数量(pos)和形成结节的植物的频率(freq)。
图16A-16H显示大麦RLK10受体(HvRLK10)胞外域和大麦RLK4受体(HvRLK4)胞外域的同源性建模以及使用HvRLK10胞外域和HvRLK4胞外域的结合实验的结果。图16A在顶部显示纯化的HvRLK10胞外域的示意图(N-末端＝N’；LysM1＝M1；LysM2＝M2；LysM3＝M3；用于纯化6x组氨酸标签＝6xHIS；C-末端＝C’)和在底部显示具有CO5的HvRLK10胞外域的结合测定的结果。图16B显示大麦受体RLK10(HvRLK10)胞外域的同源性建模，具有根据其静电电势对表面描绘加阴影。由黑色虚线圈出疏水补丁，且在疏水补丁的顶部处显示配体。图16C显示具有百脉根中慢生根瘤菌LCO的HvRLK10胞外域的结合测定的结果。图16D显示具有苜蓿中华根瘤菌LCO的HvRLK10胞外域的结合测定的结果。图16E在顶部显示纯化的HvRLK4胞外域的示意图(N-末端＝N’；LysM1＝M1；LysM2＝M2；LysM3＝M3；用于纯化的6x组氨酸标签＝6xHIS；C-末端＝C’)和在底部显示具有CO5的HvRLK4胞外域的结合测定的结果。图16F在顶部显示具有配体的HvRLK4胞外域的3D结构。图16G显示具有百脉根中慢生根瘤菌LCO的HvRLK4胞外域的结合测定的结果。图16H显示具有苜蓿中华根瘤菌LCO的HvRLK4胞外域的结合测定的结果。对于图16A、16C-16D、16E和16G-16H，y-轴上显示以nm的结合、x-轴上显示以秒(s)的时间和图的标题中显示测试的分子(CO5，百脉根中慢生根瘤菌LCO和苜蓿中华根瘤菌LCO)。
图17A-17B显示用LjNFR1/MtLYK3嵌合体对蒺藜苜蓿lyk3突变体的互补以及MtLYK3胞外域结构和LjNFR1/MtLYK3嵌合体的示意图。图17A显示在图的底部处描绘的用LjNFR1/MtLYK3嵌合体对苜蓿属lyk3突变体(Mtlyk3)的互补。包括用空载体转化的苜蓿野生型(WT)和用空载体转化的Mtlyk3对照。通过计数每个植物形成的结节测定互补，其在图17A的顶部处显示。黑点表示个体植物，柱指示平均值，和误差线显示SEM。不同字母指示样品之间显著差异(ANOVA，Tukey，P<0.01)。不同字母指示样品之间的显著差异(ANOVA，Tukey，P<0.01)。测试的个体嵌合受体的示意图在图17A的底部显示，灰色指示MtLYK3结构域、黑色指示LjNFR1结构域和通过标签表示空载体。以下受体示意图，提供了当用描绘的载体转化时形成结节的植物的频率(freq)。LysM结构域被标记为LysM1、LysM2和LysM3；跨膜结构域被标记为TM；和激酶结构域被标记为激酶。图17B显示具有标记的区域II(深灰色螺旋)、区域III(浅灰色螺旋)和区域IV(灰色连接体)的MtLYK3胞外域结构(顶部)；和具有来自MtLYK3胞外域的指示区域的工程化的LjNFR1胞外域(黑色)的示意性表示(灰色；来自MtLYK3胞外域的区域＝区域II-IV(“2至4”)，区域II、III和IV(“2,3,4”)，和区域II和IV(“2,4”))(底部)。
图18A-18F显示拟南芥属CERK1(AtCERK1)结合至壳五糖(CO5)和壳八糖(CO8)的BLI结合曲线，CO和LCO感知的模型和苜蓿属NFP、拟南芥属CERK1和莲属CERK6的胞外域的结构比对。图18A显示AtCERK1结合至壳五糖(几丁质(CO5))。图18B显示AtCERK1结合至壳八糖(几丁质(CO8))。对于图18A-18B，将七个2倍稀释系列的分析物(1.56–100μM)用于每个实验；以实线代表实验结合曲线，以虚线代表拟合曲线；拟合优度通过每个点的平均值的整体拟合R2描述的；指示使用独立蛋白质制备物(n)进行的重复数量并且显示动力学参数(kon和koff)。图18C显示通过CO受体(例如，CERK1、LYK5)感知CO的模型。图18D显示通过LCO受体(例如，NFP、LYK)感知LCO的模型。图18E显示通过疏水补丁突变体LCO受体(例如，NFP、LYK)感知LCO的模型。图18F显示苜蓿属NFP、拟南芥属CERK1和莲属CERK6的胞外域的结构比对。基于胞外域的结构重叠的分子拟合(RMSD值)以
Figure BDA0003013375720000381
(埃)显示。根据胞外域的示意性表示对结构(以上)(以下)加阴影。突出了苜蓿属NFP、拟南芥属CERK1和莲属CERK6之间的保守的二硫键连接性模式。
图19A-19D显示了WT NFP-ECD和疏水补丁突变体NFP-ECD(L147D/L154D)结合至苜蓿中华根瘤菌LCO-IV的BLI结合曲线和NFP受体的示意图。图19A显示了WT NFP-ECD结合至苜蓿中华根瘤菌LCO-IV。图19B显示了L147D/L154D NFP-ECD结合至苜蓿中华根瘤菌LCO-IV。对于图19A-19B，将七个2倍稀释系列的分析物(1.56–100μM)用于每个实验；和以实线代表实验结合曲线，以虚线代表拟合曲线。图19C显示了总结图19A-19B的动力学参数的表，其中拟合优度通过每个点的平均值上的整体拟合R2进行描述，和指示了使用独立蛋白质制备物进行的重复数量。图19D显示了具有LysM1、LysM2、LysM3、茎和跨膜(TM)和标记的激酶结构域的NFP受体的示意图，并且用灰色的柱指示LysM2中疏水补丁的位置。示意图下面的数字提供了相应的氨基酸残基，并且显示了在LysM结构域侧面的CxC基序的位置。
具体实施方式
以下描述陈述示例性方法、参数等。然而，应该认识到这种描述不旨在作为本公开的范围的限制，而是作为示例性实施方式的描述提供的。
经修饰的植物LysM受体
本公开的某些方面涉及经修饰的植物LysM受体，其包括修饰为在LysM2结构域表面上包括疏水补丁的LysM2结构域。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域结合脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的相互作用。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的脂质的相互作用。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；及其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体选自以下项的组：LysM壳寡糖(CO)受体、LysM LCO受体和LysM肽聚糖(PGN)受体。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁邻近几丁质结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁是在几丁质结合基序的
Figure BDA0003013375720000391
Figure BDA0003013375720000401
Figure BDA0003013375720000402
或
Figure BDA0003013375720000403
内。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁邻近聚糖结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁是在聚糖结合基序的
Figure BDA0003013375720000404
Figure BDA0003013375720000405
Figure BDA0003013375720000406
或
Figure BDA0003013375720000407
内。在一些实施方式中，LysM受体不是胞外多糖(EPS)受体。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是与SEQ ID NO:34(即，LotusCERK6；BAI79273.1_LjCERK6)具有至少70％序列同一性，至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％序列同一性的多肽。在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是具有氨基酸序列SEQ ID NO:34(即，莲属CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)的多肽。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，通过删除至少一个非疏水的氨基酸残基、用更疏水的氨基酸取代至少一个氨基酸残基或其组合来生成疏水补丁。在一些实施方式中，通过与来自天然地具有与LCO相互作用的疏水补丁的LysM高亲和性LCO受体的LysM2结构域进行氨基酸序列比对来鉴定至少一个氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以粗体的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以粗体的氨基酸或对应于图12A-12G和图13C中以粗体的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体的氨基酸或对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸通过结构建模鉴定，以鉴定其中疏水补丁可被工程化的LysM2中的区域。在一些实施方式中，结构建模使用未经修饰的植物LysM氨基酸序列和具有已知疏水补丁的LysM结构域三维结构。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构是苜蓿属NFP胞外域。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构的已知疏水补丁氨基酸残基是或对应于苜蓿属NFP胞外域的L147、L151、L152、L154、T156、K157和V158。在一些实施方式中，至少一个氨基酸的α碳是在结构比对中已知疏水补丁氨基酸残基的α碳的
Figure BDA0003013375720000411
内。在一些实施方式中，使用SWISS-MODEL、PDB2PQR、APBS、PyMol和APBS工具2.1进行结构建模。
在一些方面中，本公开涉及经修饰的植物LysM受体，其包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域。在一些实施方式中，通过用第二LysM1结构域的第三部分取代第一LysM1结构域的第一部分和/或通过用第二LysM1结构域的第四部分取代第一LysM1结构域的第二部分来修饰第一LysM1结构域。在一些实施方式中，第一LysM1结构域和第二LysM1结构域对寡糖具有不同亲和性和/或选择性，并且第一LysM1结构域的修饰改变了亲和性、选择性和/或特异性为更像第二LysM1结构域。在一些实施方式中，第一部分和第三部分对应于SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI，SEQ ID NO:28[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；并且其中第二部分和第四部分对应于SEQ ID NO:31[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；SEQ IDNO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在一些实施方式中，第一LysM1结构域选自以下项的组：SEQ ID NO:32[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/26-95]，SEQ ID NO:33[LysM1结构域苜蓿LYK3；MtLYK3/25-95]，或NFR1 DLALASYYILPGVFILQNITTFMQSEIVSSNDAITSYNKDKILNDINIQSFQRLNIPFP；并且第二LysM1结构域是CERK6：ALAQASYYLLNGSNLTYISEIMQSSLLTKPEDIVSYNQDTIASKDSVQAGQRINVPFP。在一些实施方式中，第一部分选自SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI；第二部分选自SEQ ID NO:31[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；第三部分选自SEQ ID NO:28[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；和第四部分选自SEQ ID NO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在一些实施方式中，用整个第二LysM1结构域替换整个第一LysM1结构域。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域结合由固氮菌或由菌根真菌产生的脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，LCO由选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；及其任何组合，或由选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；及其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域与未经修饰的LysM1结构域相比以改变的特异性结合LCO。在一些实施方式中，结构建模用于定义LysM1结构域并且用于鉴定用于取代的第一部分、第二部分、第三部分和/或第四部分。在一些实施方式中，以上实施方式的受体进一步包括修饰为含有如与修饰LysM2结构域有关的任何一个先前实施方式中的疏水补丁的LysM2结构域。
本公开的另外方面涉及经修饰的植物LysM受体，其包括修饰为在LysM2结构域表面上包括疏水补丁的LysM2结构域。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域结合脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM2结构域比未经修饰的LysM2结构域以更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的相互作用。在一些实施方式中，更高亲和性或更高选择性是由于疏水补丁与LCO的脂质的相互作用。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体选自以下项的组：LysM壳寡糖(CO)受体、LysM LCO受体或LysM肽聚糖(PGN)受体。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁邻近几丁质结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM CO受体或LysM LCO受体，疏水补丁是在几丁质结合基序的
Figure BDA0003013375720000441
Figure BDA0003013375720000442
Figure BDA0003013375720000443
或
Figure BDA0003013375720000444
内。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁邻近聚糖结合基序。在一些实施方式中，如果LysM受体是LysM PGN受体，疏水补丁是在聚糖结合基序的
Figure BDA0003013375720000445
Figure BDA0003013375720000446
Figure BDA0003013375720000447
或
Figure BDA0003013375720000448
内。在一些实施方式中，LysM受体不是胞外多糖(EPS)受体。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是与SEQ ID NO:34(即，莲属CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)具有至少70％序列同一性，至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％序列同一性的多肽。在任何以上实施方式的一些实施方式中，LysM受体是具有氨基酸序列SEQ ID NO:34(即，莲属CERK6；BAI79273.1_LjCERK6)的多肽。
在任何以上实施方式的一些实施方式中，通过删除至少一个非疏水的氨基酸残基、用更疏水的氨基酸取代至少一个氨基酸残基或其组合来生成疏水补丁。在任何以上实施方式的一些实施方式中，通过修饰未经修饰的LysM受体中现有的疏水补丁来生成疏水补丁。在一些实施方式中，通过删除至少一个非疏水的氨基酸残基、用更疏水的氨基酸取代至少一个氨基酸残基、用另一个疏水的氨基酸残基取代至少一个疏水的氨基酸残基或其组合来修饰未经修饰的LysM受体。在一些实施方式中，通过与来自天然地具有与LCO相互作用的疏水补丁的LysM高亲和性LCO受体的LysM2结构域进行氨基酸序列比对来鉴定至少一个氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸或对应于图12A-12G和图13C中以粗体下划线的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体加下划线的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体加下划线的氨基酸或对应于已知LCO受体的图12A-12G中以粗体加下划线的氨基酸的紧靠N-末端或C-末端的氨基酸。在一些实施方式中，至少一个氨基酸通过结构建模鉴定，以鉴定其中疏水补丁可被工程化的LysM2中的区域。在一些实施方式中，结构建模使用未经修饰的植物LysM氨基酸序列和具有已知疏水补丁的LysM结构域三维结构。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构是苜蓿属NFP胞外域。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构的已知疏水补丁氨基酸残基是或对应于苜蓿属NFP胞外域的L147、L151、L152、L154、T156、K157和V158。在一些实施方式中，LysM结构域三维结构是莲属LYS11胞外域。在一些实施方式中，未经修饰的LysM受体是莲属LYS11受体并且经修饰的LysM结构域的现有疏水补丁氨基酸残基是或对应于莲属LYS11胞外域的K100、E101、G102、E103、S104、Y105、Y106、N128和Y129。在一些实施方式中，至少一个氨基酸的α碳是在结构比对中已知疏水补丁氨基酸残基的α碳的
Figure BDA0003013375720000451
内。在一些实施方式中，使用SWISS-MODEL、PDB2PQR、APBS、PyMol和APBS工具2.1进行结构建模。在任何以上实施方式的一些实施方式中，(i)未经修饰的LysM受体的LysM2结构域中80％或更少、79％或更少、78％或更少、77％或更少、76％或更少、75％或更少、74％或更少、73％或更少、72％或更少、71％或更少、70％或更少、69％或更少、68％或更少、67％或更少、66％或更少、65％或更少、64％或更少、63％或更少、62％或更少、61％或更少、60％或更少、59％或更少、58％或更少、57％或更少、56％或更少、55％或更少、54％或更少、53％或更少、52％或更少、51％或更少、50％或更少、49％或更少、48％或更少、47％或更少、46％或更少、45％或更少、44％或更少、43％或更少、42％或更少、41％或更少、40％或更少、39％或更少、38％或更少、37％或更少、36％或更少、35％或更少、34％或更少、33％或更少、32％或更少、31％或更少、30％或更少、29％或更少、28％或更少、27％或更少、26％或更少、25％或更少、24％或更少、23％或更少、22％或更少、21％或更少或者20％或更少的氨基酸残基被取代或删除以生成经修饰的植物LysM受体，和(ii)未经修饰的植物LysM受体中的整个LysM2结构域没有用另一整个LysM2结构域取代以生成经修饰的植物LysM受体的之一或二者。在任何以上实施方式的一些实施方式中，使用与包括其任何和所有实施方式的这种选择有关的本公开的任何一个方面的方法来选择未经修饰的植物LysM受体。
在一些方面中，本公开涉及经修饰的植物LysM受体，其包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域。在一些实施方式中，通过用第二LysM1结构域的第三部分取代第一LysM1结构域的第一部分和/或通过用第二LysM1结构域的第四部分取代第一LysM1结构域的第二部分来修饰第一LysM1结构域。在一些实施方式中，第一LysM1结构域和第二LysM1结构域对寡糖具有不同亲和性、选择性和/或特异性，并且第一LysM1结构域的修饰改变了亲和性、选择性和/或特异性为更像第二LysM1结构域。在一些实施方式中，第一部分和第三部分对应于SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI，SEQ ID NO:28[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；并且其中第二部分和第四部分对应于SEQ ID NO:31[莲属CERK6区域IV 74-82]或ASKDSVQAG；SEQ ID NO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在一些实施方式中，第一LysM1结构域选自以下项的组：SEQ ID NO:32[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/26-95]，SEQ ID NO:33[LysM1结构域苜蓿LYK3；MtLYK3/25-95]，或NFR1 DLALASYYILPGVFILQNITTFMQSEIVSSNDAITSYNKDKILNDINIQSFQRLNIPFP；并且第二LysM1结构域是CERK6：ALAQASYYLLNGSNLTYISEIMQSSLLTKPEDIVSYNQDTIASKDSVQAGQRINVPFP。在一些实施方式中，第一部分选自SEQ ID NO:30[莲属CERK6区域II 43-53]或NGSNLTYISEI；第二部分选自SEQ ID NO:28[莲属CERK6区域IV74-82]或ASKDSVQAG；第三部分选自SEQ ID NO:31[莲属NFR1区域II 41-52]或PGVFILQNITTF；和第四部分选自SEQ ID NO:29[莲属NFR1区域IV 73-81]或LNDINIQSF。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括第一LysM1结构域修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分，通过用第二LysM1结构域的第六部分取代第一LysM1结构域的第五部分来进一步修饰第一LysM1结构域。在一些实施方式中，第一LysM1结构域是SEQ ID NO:115[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/32-89]或SEQ ID NO:106[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/31-89]和第二LysM1结构域是SEQ ID NO:114[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/31-89]或SEQ ID NO:105[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/30-89]。在一些实施方式中，其中第五部分是SEQ ID NO:53[莲属NFR1区域III 59-62；LjNFR1/56-92]，和其中第六部分是SEQ ID NO:46[苜蓿属LYK3区域III 57-62；MtLYK3/57-62]。在一些实施方式中，通过用第二LysM1结构域的第八部分取代第一LysM1结构域的第七部分来修饰第一LysM1结构域，其中第七部分跨越第一LysM1结构域的第一部分，第一LysM1结构域的第二部分，和第一LysM1结构域的第五部分，其中第八部分跨越第二LysM1结构域的第三部分，第二LysM1结构域的第四部分，和第二LysM1结构域的第六部分。在一些实施方式中，第一LysM1结构域的第七部分是SEQ ID NO:51[莲属NFR1区域II-IV 41-82；LjNFR1/41-82]，和第二LysM1结构域的第八部分是SEQ ID NO:113[苜蓿属LYK3区域II-IV 40-82；MtLYK3/40-82]或SEQ ID NO:104[苜蓿属LYK3区域II-IV 41-82；MtLYK3/41-82]。在一些实施方式中，第一LysM1结构域是SEQ ID NO:33[LysM1结构域苜蓿属LYK3；MtLYK3/31-89]和第二LysM1结构域是SEQ ID NO:32[LysM1结构域莲属NFR1；LjNFR1/32-89]。在一些实施方式中，第五部分是SEQ ID NO:46[苜蓿属LYK3区域III 57-62；MtLYK3/57-62]，和第六部分是SEQ ID NO:53[莲属NFR1区域III 59-62；LjNFR1/59-62]。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括第一LysM1结构域是SEQ ID NO:33和第二LysM1结构域是SEQ ID NO:32，通过用第二LysM1结构域的第八部分取代第一LysM1结构域的第七部分来修饰第一LysM1结构域，其中第七部分跨越第一LysM1结构域的第一部分，第一LysM1结构域的第二部分，和第一LysM1结构域的第五部分，其中第八部分跨越第二LysM1结构域的第三部分，第二LysM1结构域的第四部分，和第二LysM1结构域的第六部分。在一些实施方式中，第一LysM1结构域的第七部分是SEQ IDNO:51[莲属NFR1区域II-IV 41-82；LjNFR1/41-82]，和第二LysM1结构域的第八部分是SEQID NO:113[苜蓿属LYK3区域II-IV 40-82；MtLYK3/40-82]或SEQ ID NO:104[苜蓿属LYK3区域II-IV 41-82；MtLYK3/41-82]。
在任何以上实施方式的一些实施方式中包括第一LysM1结构域修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分，用整个第二LysM1结构域替换整个第一LysM1结构域。在任何以上实施方式的一些实施方式中包括第一LysM1结构域修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分，(i)第一LysM1结构域中80％或更少、79％或更少、78％或更少、77％或更少、76％或更少、75％或更少、74％或更少、73％或更少、72％或更少、71％或更少、70％或更少、69％或更少、68％或更少、67％或更少、66％或更少、65％或更少、64％或更少、63％或更少、62％或更少、61％或更少、60％或更少、59％或更少、58％或更少、57％或更少、56％或更少、55％或更少、54％或更少、53％或更少、52％或更少、51％或更少、50％或更少、49％或更少、48％或更少、47％或更少、46％或更少、45％或更少、44％或更少、43％或更少、42％或更少、41％或更少、40％或更少、39％或更少、38％或更少、37％或更少、36％或更少、35％或更少、34％或更少、33％或更少、32％或更少、31％或更少、30％或更少、29％或更少、28％或更少、27％或更少、26％或更少、25％或更少、24％或更少、23％或更少、22％或更少、21％或更少或者20％或更少的氨基酸残基用第二LysM1结构域的相应氨基酸残基取代或删除，和(ii)未经修饰的植物LysM受体的整个LysM1结构域没有用另一整个LysM2结构域取代以生成经修饰的植物LysM受体的之一或二者。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域结合由固氮菌或由菌根真菌产生的脂壳寡糖(LCO)。在一些实施方式中，LCO由选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高亲和性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域比未经修饰的LysM1结构域以更高选择性结合LCO。在一些实施方式中，经修饰的LysM1结构域与未经修饰的LysM1结构域相比以改变的特异性结合LCO。在一些实施方式中，结构建模用于定义LysM1结构域并且用于鉴定用于取代的第一部分、第二部分、第三部分和/或第四部分。在一些实施方式中，使用与包括其任何和所有实施方式的这种选择有关的本公开的任何一个方面的方法来选择未经修饰的植物LysM受体并且第二LysM2结构域来自供体植物LysM受体。在一些实施方式中，以上实施方式的受体进一步包括如与修饰LysM2结构域有关的任何先前实施方式的修饰为含有疏水补丁的LysM2结构域。
LysM受体是熟知的和很好了解的受体类型。LysM受体具有位于蛋白质的胞外域的三个特征结构域：LysM1、LysM2和LysM3，其在蛋白质序列上以该顺序存在。LysM1结构域朝向蛋白质序列的N-末端定位，并且先于N-末端信号肽以及C(x)xxxC基序。LysM1结构域通过CxC基序与LysM2结构域分开并且LysM2结构域也通过CxC基序与LysM3结构域分开。三个LysM基序以及C(x)xxxC和CxC基序在图8A-8C、图9A-9B、图10A-10B和图11A-11B中清楚地显示，这些图显示Nod因子(例如，LCO)LysM受体、EPS LysM受体和几丁质(CO)以及PGN LysM受体的个别比对，再次清楚地描绘了三个LysM基序以及C(x)xxxC和CxC基序。因此，LysM受体的分类对本领域技术人员是已知的。
如本公开中使用的，术语“亲和性”通常指对LCO的亲和性。本公开的LysM受体在其LysM2结构域中可含有疏水补丁。不希望受理论的约束，相信具有疏水补丁的LysM受体与不具有疏水补丁的LysM受体相比对LCO具有高亲和性，但是具有结构域-交换的LysM1结构域的LysM受体也将提供对LCO和其他激动剂的更高亲和性。亲和性可使用以下示例中描述的方法，以及使用本领域已知的测量结合动力学、缔合、解离和KD的其他方法测量。
如本公开中使用的，术语“选择性”指不同多糖配体之间，具体地脂壳寡糖(LCO)作为类别和其他多糖配体，优选地壳寡糖(CO)之间的差异。不希望受理论的约束，相信该疏水补丁赋予对LCO超过CO的选择性识别，并且因此具有疏水补丁的LysM受体与不具有疏水补丁的LysM受体相比具有增加选择性。另外，具有结构域-交换的LysM1结构域的LysM受体也具有更高的或改变的选择性，这取决于供体受体的选择。
如本公开中使用的，术语“特异性”指由不同固氮菌物种和/或菌根真菌产生的不同脂壳寡糖(LCO)之间的差异。本公开的LysM受体可含有LysM1结构域，其中已经用来自供体LysM受体的LysM1结构域的相应区域替换LysM1结构域中的区域(例如，部分、整个)。不希望受理论的约束，相信如果供体LysM受体是高亲和性和特异性LCO LysM受体比如豆类NFR1受体，该替换可改变LysM受体的特异性，但是在LysM2结构域中具有疏水补丁的LysM受体也可提供对特定的LCO的特异性。LysM1结构域在图14中清楚地显示，其显示莲属NFR1和莲属CERK6之间的比对，并且清楚地标注LysM1结构域内的区域II和区域IV。LysM1结构域替换可赋予对由特别的固氮菌物种和/或菌根真菌物种产生的LCO的高的特异性识别，并且因此具有替换的结构域的LysM受体与不具有替换的结构域的LysM受体相比可具有改变的特异性，这使得经修饰的受体识别不同固氮菌物种和/或菌根真菌物种。至少由于这些原因，本领域技术人员将容易理解本公开的高亲和性、高选择性和/或高特异性LysM受体。
基因改变的植物和种子
在一些方面中，本公开涉及基因改变的植物或其部分，其包括编码“经修饰的植物LysM受体”节中描述的任何一个实施方式的经修饰的植物LysM受体的核酸序列。在一些实施方式中，经修饰的植物LysM受体比未经修饰的植物LysM受体对LCO具有更高选择性和/或亲和性并且经修饰的植物LysM受体的表达使得植物或其部分以高选择性和/或亲和性识别LCO。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；及其任何组合，或由选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；及其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中，植物细胞是根细胞。在一些实施方式中，根细胞是根表皮细胞。在一些实施方式中，根细胞是根皮层细胞。在一些实施方式中，经修饰的多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中，核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ IDNO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，植物选自以下项的组：玉米(例如，玉蜀黍、玉米(Zea mays))，水稻(例如，亚洲栽培稻(Oryza sativa)、非洲栽培稻(Oryza glaberrima)、菰属(Zizania)物种，大麦(例如，大麦(Hordeum vulgare)，小麦(例如，普通小麦、斯卑尔脱小麦、硬粒小麦、普通小麦(Triticum aestivum)、斯卑尔脱小麦(Triticum spelta)、硬粒小麦(Triticum durum)、小麦属(Triticum)物种)，山黄麻属(Trema)物种(例如，光叶山黄麻(Trema cannabina)、Trema cubense、Trema discolor、Trema domingensis、Trema integerrima、Tremalamarckiana、小花山黄麻(Trema micrantha)、异色山黄麻(Trema orientalis)、Tremaphilippinensis、Trema strigilosa、山黄麻(Trema tomentosa))，苹果(例如，西洋苹果(Malus pumila)，梨(例如，西洋梨(Pyrus communis)、白梨(Pyrus×bretschneideri)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、新疆梨(Pyrus sinkiangensis)、川梨(Pyrus pashia)、梨属(Pyrus)物种)，李子(例如，西梅、西洋李子，布拉斯李、欧洲李(Prunus domestica)、中国李(Prunus salicina))，杏子(例如，山杏(Prunus armeniaca)、布里扬松杏(Prunusbrigantina)、东北杏(Prunus mandshurica)、梅(Prunus mume)、西伯利亚杏(Prunussibirica))，桃子(例如，油桃、桃(Prunus persica)，扁桃(例如，甜扁桃(Prunus dulcis)、扁桃(Prunus amygdalus))，胡桃(例如，波斯胡桃、英国胡桃、黑胡桃、胡桃(Juglansregia)、黑胡桃(Juglans nigra)、白胡桃(Juglans cinerea)、加州胡桃(Juglanscalifornica))，草莓(例如，草莓(Fragaria×ananassa)、智利草莓(Fragariachiloensis)、弗州草莓(Fragaria virginiana)、野草莓(Fragaria vesca))，树莓(例如，欧洲红树莓、黑树莓、覆盆子(Rubus idaeus)、美国黑树莓(Rubus occidentalis)、硬毛树莓(Rubus strigosus))，黑莓(例如，常青黑莓，喜马拉雅黑莓、黑莓(Rubus fruticosus)、北美黑莓(Rubus ursinus)、裂叶黑莓(Rubus laciniatus)、尖齿黑莓(Rubus argutus)、亚美尼亚黑莓(Rubus armeniacus)、露莓(Rubus plicatus)、榆叶黑莓(Rubus ulmifolius)、美国黑莓(Rubus allegheniensis))，红醋栗(例如，红丛茶蔍子(Ribes rubrum)、红茶藨子(Ribes spicatum)、高山茶藨子(Ribesbes alpinum)、Ribes schlechtendalii、多花茶藨子(Ribes multiflorum)、岩生茶藨子(Ribes petraeum)、伏生茶藨子(Ribes triste))，黑醋栗(例如，黑茶藨子(Ribes nigrum)，甜瓜(例如，西瓜、冬瓜、卡萨巴甜瓜、哈密瓜、白兰瓜、香瓜、西瓜(Citrullus lanatus)、冬瓜(Benincasa hispida)、罗马甜瓜(Cucumis melocantalupensis)、冬甜瓜(Cucumis melo inodorus)、网纹甜瓜(Cucumis meloreticulatus))，黄瓜(例如，切黄瓜、腌制黄瓜、英国黄瓜、黄瓜(Cucumis sativus))，南瓜(例如，美国南瓜(Cucurbita pepo)、笋瓜(Cucurbita maxima))，倭瓜(例如，葫芦、西葫芦(Cucurbita argyrosperma)、黑子南瓜(Cucurbita ficifolia)、笋瓜(Cucurbitamaxima)、中国南瓜(Cucurbita moschata))，葡萄(例如，葡萄(Vitis vinifera)、山葡萄(Vitis amurensis)、美洲葡萄(Vitis labrusca)、白亮葡萄(Vitis mustangensis)、河岸葡萄(Vitis riparia)、圆叶葡萄(Vitis rotundifolia))，菜豆(例如，菜豆(Phaseolusvulgaris)、小菜豆(Phaseolus lunatus)、赤豆(Vigna angularis)、红豆(Vignaradiate)、黑豆(Vigna mungo)、多花菜豆(Phaseolus coccineus)、米豆(Vignaumbellata)、Vigna acontifolia、宽叶菜豆(Phaseolus acutifolius)、蚕豆(Viciafaba)、蚕豆根尖马(Vicia faba equine)、菜豆属(Phaseolus)物种、豇豆属(Vigna)物种)，大豆(例如，大豆(soy)、大豆(soya bean)、大豆(Glycine max)、野生大豆(Glycinesoja))，豌豆(例如，豌豆属(Pisum)物种、豌豆变种(Pisum sativum var.sativum)、荷兰豆(Pisum sativum var.arvense))，鹰嘴豆(例如，鹰嘴豆(garbanzo)、鹰嘴豆(Bengalgram)、鹰嘴豆(Cicer arietinum))，豇豆(例如，豇豆(black-eyed pea)、豇豆(blackeyebean)、豇豆(Vigna unguiculata))，木豆(例如，Arhar/Toor、木豆(cajan pea)、树豆(Congo bean)、木豆(gandules)、木豆(Caganus cajan))，扁豆(例如，扁豆(Lensculinaris))，班巴拉花生(例如，花生(earth pea)、刚果落花生(Vigna subterranea))，羽扇豆(例如，羽扇豆属(Lupinus物种))，干豆(例如，小干豆(minor pulses)、Lablabpurpureaus、Canavalia ensiformis、Canavalia gladiate、Psophocarpustetragonolobus、Mucuna pruriens var.utilis、Pachyrhizus erosus)，苜蓿属物种(例如，苜蓿(Medicago sativa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、Medicago arborea)，莲属物种(例如，百脉根(Lotus japonicus))，豆科牧草(例如，银合欢属(Leucaena)物种、合欢属(Albizia)物种、瓜儿豆属(Cyamopsis)物种、田菁属(Sesbania)物种、笔花豆属(Stylosanthes)物种、三叶草属物种、蚕豆属物种)，槐蓝属(例如，槐蓝属Indigofera)物种、木蓝(Indigofera tinctoria)、Indigofera suffruticosa、Indigofera articulata、Indigofera oblongifolia、Indigofera aspalthoides、Indigofera suffruticosa、Indigofera arrecta)，豆类树木(例如，槐树(locust trees)、皂荚属(Gleditsia)物种、刺槐属(Robinia)物种、肯塔基州咖啡树(Kentucky coffeetree)、肯塔基州咖啡种子(Gymnocladus dioicus)、金合欢属植物(Acacia)物种、金链属(Laburnum)物种、紫藤属(Wisteria)物种)或大麻(例如，印度大麻、大麻(Cannabis sativa))。
在一些方面中，本公开涉及基因改变的植物或其部分，包括编码经修饰的植物LysM受体的第一核酸序列，其中LysM1结构域已经如与对LysM1结构域修饰有关的任何前述实施方式进行修饰，和编码经修饰的植物LysM受体的第二核酸序列，其中LysM2结构域已经如与LysM2结构域修饰有关的任何前述实施方式进行修饰以包括疏水补丁。在一些实施方式中，经修饰的植物LysM受体比未经修饰的植物LysM受体对LCO具有更高选择性和/或亲和性并且经修饰的植物LysM受体的表达使得植物或其部分以高选择性和/或亲和性识别LCO。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；及其任何组合，或由选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；及其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中，植物细胞是根细胞。在一些实施方式中，根细胞是根表皮细胞。在一些实施方式中，根细胞是根皮层细胞。在一些实施方式中，经修饰的多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中，第一核酸或第二核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ ID NO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，植物选自以下项的组：玉米(例如，玉蜀黍、玉米(Zea mays))，水稻(例如，亚洲栽培稻(Oryzasativa)、非洲栽培稻(Oryza glaberrima)、菰属(Zizania)物种，大麦(例如，大麦(Hordeumvulgare)，小麦(例如，普通小麦、斯卑尔脱小麦、硬粒小麦、普通小麦(Triticumaestivum)、斯卑尔脱小麦(Triticum spelta)、硬粒小麦(Triticum durum)、小麦属(Triticum)物种)，山黄麻属(Trema)物种(例如，光叶山黄麻(Trema cannabina)、Tremacubense、Trema discolor、Trema domingensis、Trema integerrima、Trema lamarckiana、小花山黄麻(Trema micrantha)、异色山黄麻(Trema orientalis)、Tremaphilippinensis、Trema strigilosa、山黄麻(Trema tomentosa))，苹果(例如，西洋苹果(Malus pumila)，梨(例如，西洋梨(Pyrus communis)、白梨(Pyrus×bretschneideri)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、新疆梨(Pyrus sinkiangensis)、川梨(Pyrus pashia)、梨属(Pyrus)物种)，李子(例如，西梅、西洋李子，布拉斯李、欧洲李(Prunus domestica)、中国李(Prunus salicina))，杏子(例如，山杏(Prunus armeniaca)、布里扬松杏(Prunusbrigantina)、东北杏(Prunus mandshurica)、梅(Prunus mume)、西伯利亚杏(Prunussibirica))，桃子(例如，油桃、桃(Prunus persica)，扁桃(例如，甜扁桃(Prunus dulcis)、扁桃(Prunus amygdalus))，胡桃(例如，波斯胡桃、英国胡桃、黑胡桃、胡桃(Juglansregia)、黑胡桃(Juglans nigra)、白胡桃(Juglans cinerea)、加州胡桃(Juglanscalifornica))，草莓(例如，草莓(Fragaria×ananassa)、智利草莓(Fragariachiloensis)、弗州草莓(Fragaria virginiana)、野草莓(Fragaria vesca))，树莓(例如，欧洲红树莓、黑树莓、覆盆子(Rubus idaeus)、美国黑树莓(Rubus occidentalis)、硬毛树莓(Rubus strigosus))，黑莓(例如，常青黑莓，喜马拉雅黑莓、黑莓(Rubus fruticosus)、北美黑莓(Rubus ursinus)、裂叶黑莓(Rubus laciniatus)、尖齿黑莓(Rubus argutus)、亚美尼亚黑莓(Rubus armeniacus)、露莓(Rubus plicatus)、榆叶黑莓(Rubus ulmifolius)、美国黑莓(Rubus allegheniensis))，红醋栗(例如，红丛茶蔍子(Ribes rubrum)、红茶藨子(Ribes spicatum)、高山茶藨子(Ribesbes alpinum)、Ribes schlechtendalii、多花茶藨子(Ribes multiflorum)、岩生茶藨子(Ribes petraeum)、伏生茶藨子(Ribes triste))，黑醋栗(例如，黑茶藨子(Ribes nigrum)，甜瓜(例如，西瓜、冬瓜、卡萨巴甜瓜、哈密瓜、白兰瓜、香瓜、西瓜(Citrullus lanatus)、冬瓜(Benincasa hispida)、罗马甜瓜(Cucumis melocantalupensis)、冬甜瓜(Cucumis melo inodorus)、网纹甜瓜(Cucumis meloreticulatus))，黄瓜(例如，切黄瓜、腌制黄瓜、英国黄瓜、黄瓜(Cucumis sativus))，南瓜(例如，美国南瓜(Cucurbita pepo)、笋瓜(Cucurbita maxima))，倭瓜(例如，葫芦、西葫芦(Cucurbita argyrosperma)、黑子南瓜(Cucurbita ficifolia)、笋瓜(Cucurbitamaxima)、中国南瓜(Cucurbita moschata))，葡萄(例如，葡萄(Vitis vinifera)、山葡萄(Vitis amurensis)、美洲葡萄(Vitis labrusca)、白亮葡萄(Vitis mustangensis)、河岸葡萄(Vitis riparia)、圆叶葡萄(Vitis rotundifolia))，菜豆(例如，菜豆(Phaseolusvulgaris)、小菜豆(Phaseolus lunatus)、赤豆(Vigna angularis)、红豆(Vignaradiate)、黑豆(Vigna mungo)、多花菜豆(Phaseolus coccineus)、米豆(Vignaumbellata)、Vigna acontifolia、宽叶菜豆(Phaseolus acutifolius)、蚕豆(Viciafaba)、蚕豆根尖马(Vicia faba equine)、菜豆属物种、豇豆属物种)，大豆(例如，大豆(soy)、大豆(soya bean)、大豆(Glycine max)、野生大豆(Glycine soja))，豌豆(例如，豌豆属(Pisum)物种、豌豆变种(Pisum sativum var.sativum)、荷兰豆(Pisum sativumvar.arvense))，鹰嘴豆(例如，鹰嘴豆(garbanzo)、鹰嘴豆(Bengal gram)、鹰嘴豆(Cicerarietinum))，豇豆(例如，豇豆(black-eyed pea)、豇豆(blackeye bean)、豇豆(Vignaunguiculata))，木豆(例如，Arhar/Toor、木豆(cajan pea)、树豆(Congo bean)、木豆(gandules)、木豆(Caganus cajan))，扁豆(例如，扁豆(Lens culinaris))，班巴拉花生(例如，花生(earth pea)、刚果落花生(Vigna subterranea))，羽扇豆(例如，羽扇豆属(Lupinus物种))，干豆(例如，小干豆(minor pulses)、Lablab purpureaus、Canavaliaensiformis、Canavalia gladiate、Psophocarpus tetragonolobus、Mucuna pruriensvar.utilis、Pachyrhizus erosus)，苜蓿属物种(例如，苜蓿(Medicago sativa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、Medicago arborea)，莲属物种(例如，百脉根(Lotusjaponicus))，豆科牧草(例如，银合欢属(Leucaena)物种、合欢属(Albizia)物种、瓜儿豆属(Cyamopsis)物种、田菁属(Sesbania)物种、笔花豆属(Stylosanthes)物种、三叶草属物种、蚕豆属物种)，槐蓝属(例如，槐蓝属Indigofera)物种、木蓝(Indigofera tinctoria)、Indigofera suffruticosa、Indigofera articulata、Indigofera oblongifolia、Indigofera aspalthoides、Indigofera suffruticosa、Indigofera arrecta)，豆类树木(例如，槐树(locust trees)、皂荚属(Gleditsia)物种、刺槐属(Robinia)物种、肯塔基州咖啡树(Kentucky coffeetree)、肯塔基州咖啡种子(Gymnocladus dioicus)、金合欢属植物(Acacia)物种、金链属(Laburnum)物种、紫藤属(Wisteria)物种)或大麻(例如，印度大麻、大麻(Cannabis sativa))。在一些实施方式中，植物部分是叶、茎、根、根原基、花、种子、果实、核、谷粒、细胞或其部分。在一些实施方式中，植物部分是果实、核或谷粒。
在一些方面中，本公开涉及任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的花粉粒或胚珠。
在一些方面中，本公开涉及来自任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的原生质体。
在一些方面中，本公开涉及从来自任何以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的原生质体或细胞产生的组织培养物，其中细胞或原生质体从选自由以下项组成的组的植物部分产生：叶、花药、雌蕊、茎、叶柄、根、根原基、根尖、果实、种子、花、子叶、下胚轴、胚胎和分生组织细胞。
产生和培养基因改变的植物的方法
本公开的某些方面涉及如“基因改变植物和种子”节中描述的任何一个以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物的方法，其包括将基因改变引入包括核酸序列的植物。在一些实施方式中，核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ ID NO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子(KAY等，Science,236,4805,1987)、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，将核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列插入植物的基因组，以便核酸序列、第一核酸序列和/或第二核酸序列可操作地连接至内源启动子。在一些实施方式中，内源启动子是根特异性启动子。
在一些方面中，本公开涉及产生能够识别LCO的基因改变的植物的方法，其包括步骤：将基因改变引入植物，包括提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO得到识别的能力，从而使植物能够识别LCO。
在一些方面中，本公开涉及产生能够识别LCO的基因改变的植物的方法，其包括步骤：将基因改变引入植物，包括提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO以高亲和性、高选择性和/或高特异性得到识别的能力，从而使植物能够以高亲和性、高选择性和/或高特异性识别LCO。
在一些方面中，本公开涉及产生能够识别由特定的固氮菌物种和/或特定的菌根真菌物种产生的LCO的基因改变的植物的方法，其包括步骤：将基因改变引入植物，包括提供由特定的固氮菌物种和/或特定的菌根真菌物种产生的LCO以改变的特异性得到识别的能力，从而使植物能够以改变的特异性识别LCO。在一些实施方式中，与不具有基因改变的植物相比，基因改变使得基因改变的植物识别不同的特定的固氮菌物种和/或特定的菌根真菌物种。在一些实施方式中，基因改变的植物能够在不同农业条件(例如，含有不同共生微生物物种的不同土壤等)中生长。在一些实施方式中，基因改变允许基因改变的植物在含有特定的细菌菌株的不同农业条件中生长，所述特定的细菌菌株产生经基因改变的植物以高特异性、敏感性和/或选择性检测的LCO。在一些实施方式中，添加细菌菌株作为种衣或作为土壤接种体。在一些实施方式中，基因改变的植物能够与不同作物物种生长(例如，不同作物轮作等)。
在一些方面中，本公开涉及培养具有识别LCO的能力的植物的方法，其包括步骤：提供具有一个或多个基因改变的种子，所述基因改变提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO得到识别的能力，其中种子产生具有识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力的植物；在一定条件下培养植物，其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物生长相比，识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中，植物在营养贫瘠的土壤中栽培。
在一些方面中，本公开涉及培养具有以高亲和性、高选择性和/或高特异性识别LCO的能力的植物的方法，其包括步骤：提供具有一个或多个基因改变的种子，所述基因改变提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO以高亲和性、高选择性和/或高特异性得到识别的能力，其中种子产生具有以高亲和性、高选择性和/或高特异性识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力的植物；在一定条件下培养植物，其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物相比，以高亲和性、高选择性和/或高特异性识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中，植物在营养贫瘠的土壤中栽培。
在一些方面中，本公开涉及培养具有以改变的特异性识别LCO的能力的植物的方法，其包括步骤：提供具有一个或多个基因改变的种子，提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO以改变的特异性得到识别的能力，其中种子产生具有以高特异性识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力的植物；在一定条件下培养植物，其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物相比，以改变的特异性识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中，植物在营养贫瘠的土壤中栽培。在一些实施方式中，与不具有基因改变的植物相比，基因改变使得基因改变的植物识别不同的特定的固氮菌物种和/或特定的菌根真菌物种。在一些实施方式中，基因改变的植物能够不同农业条件(例如，含有不同共生微生物物种的不同土壤等)中生长。在一些实施方式中，基因改变的植物能够与不同作物物种生长(例如，不同作物轮作等)。
在一些方面中，本公开涉及培养具有识别LCO的能力的植物的方法，其包括步骤：提供具有一个或多个基因改变的组织培养物或原生质体，所述基因改变提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO得到识别的能力；使组织培养物或原生质体再生为小植株；使小植株生长为植物，其中植物具有识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力；移植植物至一定的条件，其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物生长相比，识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中，植物在营养贫瘠的土壤中栽培。
在一些方面中，本公开涉及培养具有以高亲和性、高选择性和/或高特异性识别LCO的能力的植物的方法，其包括步骤：提供具有一个或多个基因改变的组织培养物或原生质体，所述基因改变提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO以高亲和性、高选择性和/或高特异性得到识别的能力；使组织培养物或原生质体再生为小植株；使小植株生长为植物，其中植物具有以高亲和性、高选择性和/或高特异性识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力；移植植物至一定的条件，其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物生长相比，以高亲和性、高选择性和/或高特异性识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中，植物在营养贫瘠的土壤中栽培。
在一些方面中，本公开涉及培养具有以改变的特异性识别LCO的能力的植物的方法，其包括步骤：提供具有一个或多个基因改变的组织培养物或原生质体，所述基因改变提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO以改变的特异性得到识别的能力；使组织培养物或原生质体再生为小植株；使小植株生长为植物，其中植物具有以高特异性识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力；移植植物至一定的条件，其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物生长相比，以改变的特异性识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的LCO的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中，植物在营养贫瘠的土壤中栽培。在一些实施方式中，与不具有基因改变的植物相比，基因改变使得基因改变的植物识别不同的特定的固氮菌物种和/或特定的菌根真菌物种。在一些实施方式中，基因改变的植物能够不同农业条件(例如，含有不同共生微生物物种的不同土壤等)中生长。在一些实施方式中，基因改变的植物能够与不同作物物种生长(例如，不同作物轮作等)。
在任何以上方法的一些实施方式中，识别LCO的能力由编码“经修饰的植物LysM受体”节中描述的任何一个实施方式的经修饰的植物LysM受体的核酸序列赋予。在一些实施方式中，经修饰的植物LysM受体比未经修饰的植物LysM受体对LCO具有更高选择性和/或亲和性并且经修饰的植物LysM受体的表达使得植物或其部分以高选择性和/或亲和性识别LCO。在一些实施方式中，LCO由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中，LCO由选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum phaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；及其任何组合，或由选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；及其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中，植物细胞是根细胞。在一些实施方式中，根细胞是根表皮细胞。在一些实施方式中，根细胞是根皮层细胞。在一些实施方式中，经修饰的多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中，核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中，启动子选自以下项的组：NFR1/LYK3/CERK6或NFR5/NFP启动子、莲属NFR5启动子(SEQ IDNO:24)和莲属NFR1启动子(SEQ ID NO:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍ZRP2启动子、番茄LeExtl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、RCC3启动子、水稻antiquitine启动子、LRR受体激酶启动子或拟南芥pCO2启动子。在一些实施方式中，启动子是任选地选自以下项的组的组成型启动子：CaMV35S启动子、CaMV35S启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥UBQ10启动子。在一些实施方式中，植物选自以下项的组：玉米(例如，玉蜀黍、玉米(Zea mays))，水稻(例如，亚洲栽培稻(Oryza sativa)、非洲栽培稻(Oryza glaberrima)、菰属(Zizania)物种，大麦(例如，大麦(Hordeum vulgare)，小麦(例如，普通小麦、斯卑尔脱小麦、硬粒小麦、普通小麦(Triticum aestivum)、斯卑尔脱小麦(Triticum spelta)、硬粒小麦(Triticum durum)、小麦属(Triticum)物种)，山黄麻属(Trema)物种(例如，光叶山黄麻(Trema cannabina)、Trema cubense、Trema discolor、Trema domingensis、Trema integerrima、Tremalamarckiana、小花山黄麻(Trema micrantha)、异色山黄麻(Trema orientalis)、Tremaphilippinensis、Trema strigilosa、山黄麻(Trema tomentosa))，苹果(例如，西洋苹果(Malus pumila)，梨(例如，西洋梨(Pyrus communis)、白梨(Pyrus×bretschneideri)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、新疆梨(Pyrus sinkiangensis)、川梨(Pyrus pashia)、梨属(Pyrus)物种)，李子(例如，西梅、西洋李子，布拉斯李、欧洲李(Prunus domestica)、中国李(Prunus salicina))，杏子(例如，山杏(Prunus armeniaca)、布里扬松杏(Prunusbrigantina)、东北杏(Prunus mandshurica)、梅(Prunus mume)、西伯利亚杏(Prunussibirica))，桃子(例如，油桃、桃(Prunus persica)，扁桃(例如，甜扁桃(Prunus dulcis)、扁桃(Prunus amygdalus))，胡桃(例如，波斯胡桃、英国胡桃、黑胡桃、胡桃(Juglansregia)、黑胡桃(Juglans nigra)、白胡桃(Juglans cinerea)、加州胡桃(Juglanscalifornica))，草莓(例如，草莓(Fragaria×ananassa)、智利草莓(Fragariachiloensis)、弗州草莓(Fragaria virginiana)、野草莓(Fragaria vesca))，树莓(例如，欧洲红树莓、黑树莓、覆盆子(Rubus idaeus)、美国黑树莓(Rubus occidentalis)、硬毛树莓(Rubus strigosus))，黑莓(例如，常青黑莓，喜马拉雅黑莓、黑莓(Rubus fruticosus)、北美黑莓(Rubus ursinus)、裂叶黑莓(Rubus laciniatus)、尖齿黑莓(Rubus argutus)、亚美尼亚黑莓(Rubus armeniacus)、露莓(Rubus plicatus)、榆叶黑莓(Rubus ulmifolius)、美国黑莓(Rubus allegheniensis))，红醋栗(例如，红丛茶蔍子(Ribes rubrum)、红茶藨子(Ribes spicatum)、高山茶藨子(Ribesbes alpinum)、Ribes schlechtendalii、多花茶藨子(Ribes multiflorum)、岩生茶藨子(Ribes petraeum)、伏生茶藨子(Ribes triste))，黑醋栗(例如，黑茶藨子(Ribes nigrum)，甜瓜(例如，西瓜、冬瓜、卡萨巴甜瓜、哈密瓜、白兰瓜、香瓜、西瓜(Citrullus lanatus)、冬瓜(Benincasa hispida)、罗马甜瓜(Cucumis melocantalupensis)、冬甜瓜(Cucumis melo inodorus)、网纹甜瓜(Cucumis meloreticulatus))，黄瓜(例如，切黄瓜、腌制黄瓜、英国黄瓜、黄瓜(Cucumis sativus))，南瓜(例如，美国南瓜(Cucurbita pepo)、笋瓜(Cucurbita maxima))，倭瓜(例如，葫芦、西葫芦(Cucurbita argyrosperma)、黑子南瓜(Cucurbita ficifolia)、笋瓜(Cucurbitamaxima)、中国南瓜(Cucurbita moschata))，葡萄(例如，葡萄(Vitis vinifera)、山葡萄(Vitis amurensis)、美洲葡萄(Vitis labrusca)、白亮葡萄(Vitis mustangensis)、河岸葡萄(Vitis riparia)、圆叶葡萄(Vitis rotundifolia))，菜豆(例如，菜豆(Phaseolusvulgaris)、小菜豆(Phaseolus lunatus)、赤豆(Vigna angularis)、红豆(Vignaradiate)、黑豆(Vigna mungo)、多花菜豆(Phaseolus coccineus)、米豆(Vignaumbellata)、Vigna acontifolia、宽叶菜豆(Phaseolus acutifolius)、蚕豆(Viciafaba)、蚕豆根尖马(Vicia faba equine)、菜豆属(Phaseolus)物种、豇豆属(Vigna)物种)，大豆(例如，大豆(soy)、大豆(soya bean)、大豆(Glycine max)、野生大豆(Glycinesoja))，豌豆(例如，豌豆属(Pisum)物种、豌豆变种(Pisum sativum var.sativum)、荷兰豆(Pisum sativum var.arvense))，鹰嘴豆(例如，鹰嘴豆(garbanzo)、鹰嘴豆(Bengalgram)、鹰嘴豆(Cicer arietinum))，豇豆(例如，豇豆(black-eyed pea)、豇豆(blackeyebean)、豇豆(Vigna unguiculata))，木豆(例如，Arhar/Toor、木豆(cajan pea)、树豆(Congo bean)、木豆(gandules)、木豆(Caganus cajan))，扁豆(例如，扁豆(Lensculinaris))，班巴拉花生(例如，花生(earth pea)、刚果落花生(Vigna subterranea))，羽扇豆(例如，羽扇豆属(Lupinus物种))，干豆(例如，小干豆(minor pulses)、Lablabpurpureaus、Canavalia ensiformis、Canavalia gladiate、Psophocarpustetragonolobus、Mucuna pruriens var.utilis、Pachyrhizus erosus)，苜蓿属物种(例如，苜蓿(Medicago sativa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、Medicago arborea)，莲属物种(例如，百脉根(Lotus japonicus))，豆科牧草(例如，银合欢属(Leucaena)物种、合欢属(Albizia)物种、瓜儿豆属(Cyamopsis)物种、田菁属(Sesbania)物种、笔花豆属(Stylosanthes)物种、三叶草属物种、蚕豆属物种)，槐蓝属(例如，槐蓝属Indigofera)物种、木蓝(Indigofera tinctoria)、Indigofera suffruticosa、Indigofera articulata、Indigofera oblongifolia、Indigofera aspalthoides、Indigofera suffruticosa、Indigofera arrecta)，豆类树木(例如，槐树(locust trees)、皂荚属(Gleditsia)物种、刺槐属(Robinia)物种、肯塔基州咖啡树(Kentucky coffeetree)、肯塔基州咖啡种子(Gymnocladus dioicus)、金合欢属植物(Acacia)物种、金链属(Laburnum)物种、紫藤属(Wisteria)物种)或大麻(例如，印度大麻、大麻(Cannabis sativa))。
分子生物方法以产生基因改变植物和植物细胞
本发明的一个实施方式提供了包括一个或多个修饰的内源植物基因的基因改变的植物或植物细胞。例如，本公开提供具有修饰为LysM2结构域中包括疏水补丁或改变疏水补丁的经基因改变的LysM受体植物和具有通过用相应的供体LysM1结构域区域替换LysM1结构域中的区域而修饰的基因改变的LysM受体的植物。具有这些修饰的受体的植物可具有对LCO增加的亲和性、选择性和/或特异性。
本公开的某些方面涉及选择靶植物LysM受体用于将靶植物LysM受体修饰为具有期望的受体特点的方法，其中方法包括下述步骤：a)提供具有期望的受体特点的供体植物LysM受体和两种或更多种潜在靶植物LysM受体的结构模型、分子模型、表面特点模型和/或静电势模型；b)比较两种或更多种潜在靶植物LysM受体的每种与供体植物LysM受体的结构模型、分子模型、表面特点模型和/或静电势模型，和/或比较两种或更多种潜在靶植物LysM受体的每种与供体植物LysM受体，其中使用结构叠加；和c)选择与对供体植物LysM受体合适匹配的潜在靶植物LysM受体作为靶植物LysM受体。在一些实施方式中，用于确定步骤(c)中对供体植物LysM受体合适匹配的潜在靶植物LysM受体的标准选自以下项的组：对模板结构拟合的良好性；相似性；系统发育关系；表面电势；对模板结构的覆盖率；来自SWISS-模型的GMQE、QMEAN和局部质量评估；或其任何组合。在一些实施方式中，供体植物LysM受体的结构模型是蛋白质晶体结构、分子模型、冷冻-EM结构和NMR结构。在一些实施方式中，供体植物LysM受体模型具有整个胞外域且两种或更多种潜在靶植物LysM受体模型具有整个胞外域。在一些实施方式中，供体植物LysM受体模型具有LysM1结构域、LysM2结构域、LysM3结构域或其任何组合且两种或更多种潜在靶植物LysM受体模型具有LysM1结构域、LysM2结构域、LysM3结构域或其任何组合。
在一些实施方式中，供体植物LysM受体是苜蓿属NFP、苜蓿属LYK3、莲属NFR1、莲属NFR5、莲属LYS11或拟南芥属CERK1。在一些实施方式中，另外，将两种或更多种靶植物LysM受体与莲属CERK6比较。在一些实施方式中，两种或更多种潜在靶植物LysM受体多肽都来自相同植物物种或植物品种。在一些实施方式中，期望的受体特点是对寡糖或寡糖的类别的亲和性、选择性和/或特异性。在一些实施方式中，期望的受体特点是对寡糖或寡糖的类别的结合动力学，其中结合动力学包括解离速率和结合速率。在一些实施方式中，寡糖的类别选自以下项的组：LCO、CO、β-葡聚糖、环-β-葡聚糖、外多糖或任选地LPS。在一些实施方式中，寡糖的类别是LCO或CO。在一些实施方式中，寡糖的类别是LCO，任选地通过任选地选自以下项的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种；或其任何组合，或由选自以下项的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；或其任何组合。在一些实施方式中，LCO是百脉根中慢生根瘤菌LCO、苜蓿中华根瘤菌LCO-IV或苜蓿中华根瘤菌LCO-V。
在一些实施方式中，方法进一步包括步骤d)通过比较供体植物LysM受体中第一寡糖结合特征的氨基酸残基与靶植物LysM受体中相应的氨基酸残基，鉴定靶LysM受体中用于修饰的一个或多个氨基酸残基，和任选地通过比较供体植物LysM受体中第二寡糖结合特征的氨基酸残基与靶植物LysM受体中相应的氨基酸残基，鉴定靶LysM受体中用于修饰的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，方法进一步包括步骤e)生成经修饰的植物LysM受体，其中已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代靶植物LysM受体的第一寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基；生成经修饰的植物LysM受体，其中已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代靶植物LysM受体的第二寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基；或生成经修饰的植物LysM受体，其中已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代靶植物LysM受体的第一寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基和已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代靶植物LysM受体的第二寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，第一寡糖结合特征是LysM2结构域的表面上的疏水补丁。在一些实施方式中，第二寡糖结合特征是供体植物LysM受体的LysM1结构域的部分。在一些实施方式中，经修饰的LysM受体是使用一个或多个基因编辑组分修饰的内源LysM受体。在一些实施方式中，一个或多个基因编辑组分靶向可操作地连接至编码内源LysM受体(例如，大豆LysM受体)的核酸的核基因组序列。该方面的进一步实施方式包括选自以下项的组的一个或多个基因编辑组分：靶向核基因组序列的核糖核蛋白复合物；包括TALEN蛋白质编码序列的载体，其中TALEN蛋白质靶向核基因组序列；包括ZFN蛋白质编码序列的载体，其中ZFN蛋白质靶向核基因组序列；寡核苷酸供体(ODN)，其中ODN靶向核基因组序列；或包括CRISPR/Cas酶编码序列和靶向序列的载体，其中靶向序列靶向核基因组序列。
本公开的另外方面涉及使用任何一个以上方法产生的经修饰的植物LysM受体，其中经修饰的植物LysM受体包括修饰为在LysM2结构域表面上包括疏水补丁的LysM2结构域。本公开的进一步方面涉及使用任何一个以上方法产生的经修饰的植物LysM，其中经修饰的植物LysM受体包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域。可使用本公开的经修饰的植物LysM受体以产生如“基因改变植物和种子”节中描述的任何一个以上与植物有关的实施方式的基因改变的植物
基因改变的单子叶植物和双子叶植物植物细胞的转化和生成是本领域熟知的。参见，例如，Weising等，Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)；美国专利5,679,558；Agrobacterium Protocols，ed：Gartland，Humana Press Inc.(1995)和Wang等ActaHort.461:401-408(1998)。方法的选择随着待转化的植物的类型、特别的应用和/或所需结果而变化。熟练的技术人员很容易选择适当的转化技术。
本领域已知的删除、插入或以其他的任何方法修饰细胞DNA(例如，基因组DNA和细胞器DNA)可用于实践本文公开的发明。例如，含有用于根癌农杆菌中靶基因的删除或插入的遗传构建体的非致瘤Ti质粒可用于转化植物细胞，并且其后，可使用本领域中，例如，EP0116718、EP 0270822、PCT公布WO 84/02913和公布的欧洲专利申请(“EP”)0242246中描述的方法从转化的植物细胞中再生转化的植物。Ti-质粒载体各自含有Ti-质粒的T-DNA的边界序列之间或至少位于右侧边界序列的左侧的基因。当然，其他类型的载体可用于转化植物细胞，使用如下过程比如直接基因转移(如例如EP 0233247中描述的)、花粉介导的转化(如例如EP 0270356、PCT公布WO 85/01856和US专利4,684,611中描述的)、植物RNA病毒介导的转化(如例如EP 0067553和US专利4,407,956中描述的)、脂质体介导的转化(如例如US专利4,536,475中描述的)和其他方法比如用于转化玉米(例如，US专利6,140,553；Fromm等，Bio/Technology(1990)8，833 839)；Gordon-Kamm等，The Plant Cell，(1990)2，603618)和水稻(Shimamoto等，Nature，(1989)338，274 276；Datta等，Bio/Technology，(1990)8，736 740)的某些系的方法和一般用于转化单子叶植物的方法(PCT公布WO 92/09696)。对于棉花转化，可使用PCT专利公开WO 00/71733中描述的方法。对于大豆转化，参考本领域已知的方法制造，例如，Hinchee等(Bio/Technology，(1988)6，915)和Christou等(TrendsBiotech，(1990)8，145)或WO 00/42207的方法。
本发明的基因改变的植物可用于常规的植物培育方案以产生更多具有相同特征的基因改变的植物或将基因改变引入其他品种的相同或相关植物物种中。从改变的植物获得的种子优选地含有基因改变作为在染色体或细胞器DNA中的稳定插入片段或者作为对内源基因或启动子的修饰。按照本发明的包括基因改变的植物包括包含或源自包含本发明的基因改变的植物，例如果树或观赏植物的根状茎的植物。因此，本发明中包括插入转化的植物或植物部分的任何非转基因嫁接植物部分。
无论是否在表达载体或表达盒中，引入的基因元件导致引入的基因的表达通常将痛楚利用植物可表达的启动子。如本文使用的“植物可表达的启动子”指确保植物细胞中本发明的基因改变的表达的启动子。指导植物中组成型表达的启动子的示例是本领域已知的并且其包括：黄瓜花叶病毒(CaMV)，例如，分离株CM 1841(Gardner等，Nucleic Acids Res，(1981)9，2871 2887)、CabbB S(Franck等，Cell(1980)21，285 294)和CabbB JI(Hull和Howell，Virology，(1987)86，482 493)的强组成型35S启动子(“35S启动子”)；泛素家族的启动子(例如，Christensen等，Plant Mol Biol，(1992)18，675-689的玉蜀黍泛素启动子)，gos2启动子(de Pater等，The Plant J(1992)2，834-844)，emu启动子(Last等，Theor ApplGenet，(1990)81，581-588)，肌动蛋白启动子比如通过An等(The Plant J，(1996)10，107)描述的启动子，通过Zhang等(The Plant Cell，(1991)3，1155-1165)描述的水稻肌动蛋白启动子；木薯静脉花叶病毒的启动子(WO 97/48819，Verdaguer等(Plant Mol Biol，(1998)37，1055-1067)，来自地下三叶草矮化病毒的启动子的pPLEX系列(WO 96/06932，特别地S4或S7启动子)，醇脱氢酶启动子，例如，pAdh1S(GenBank accession numbers X04049，X00581)以及分别驱动TDNA的1'和2'基因的表达的TR1'启动子和TR2'启动子(分别为“TR1'启动子”和“TR2'启动子”)(Velten等，EMBO J，(1984)3，2723 2730)。
可选地，植物可表达的启动子可以是组织特异性启动子，即，指导植物的一些细胞或组织中，例如，根表皮细胞或根皮层细胞中的更高水平表达的启动子。通常在植物细胞中使用的组成型启动子的示例是花椰菜花叶(CaMV)35S启动子(KAY等Science，236，4805，1987)和该启动子的各种衍生物、病毒启动子静脉花叶木薯(国际申请WO 97/48819)、玉蜀黍泛素启动子(CHRISTENSEN&QUAIL，Transgenic Res，5，213-8，1996)，三叶启动子(Ljubql,MAEKAWA等Mol Plant Microbe Interact.21，375-82，2008)和拟南芥UBQ10启动子(Norris等，Plant Mol.Biol.21，895-906，1993)。
在优选的实施方式中，将使用根特异性启动子。非限制性示例包括玉蜀黍甲硫氨酸启动子(DE FRAMOND等，FEBS 290，103-106，1991申请EP 452269)、几丁质酶启动子(SAMAC等，Plant Physiol 93，907-914，1990)、谷氨酰胺合酶大豆根启动子(HIREL等，Plant Mol.Biol.20，207-218，1992)、RCC3启动子(PCT申请WO 2009/016104)、水稻antiquitine启动子(PCT申请WO 2007/076115)、LRR受体激酶启动子(PCT申请WO 02/46439)，玉米ZRP2启动子(美国专利号5,633,363)、番茄LeExtl启动子(Bucher等，PlantPhysiol.128，911-923，2002)和拟南芥pCO2启动子(HEIDSTRA等，Genes Dev.18，1964-1969，2004)。这些植物启动子可与增强子元件组合，它们可与最小的启动子元件组合，或可包括重复元件以确保所需表达特征。
在一些实施方式中，可利用在植物细胞中增加表达的基因元件。例如，引入的基因的5’端或3’端处或者在编码引入的基因的序列中的内含子，例如，hsp70内含子。其他这种基因元件可包括但不限于启动子增强子元件、两次重复或三次重复的启动子区域、与另一转基因不同或与内源(植物宿主)基因前导序列不同的5’前导序列、与相同植物中使用的另一转基因不同或与内源(植物宿主)尾序列不同的3’尾序列。
本发明的引入的基因可被插入宿主细胞DNA，以便插入的基因部分是合适的3'端转录调节信号(例如，转录体形成和多腺苷酸化信号)的上游(即5')。这优选地通过将基因插入植物细胞基因组(细胞核或叶绿体)中完成。优选的多腺苷酸化和转录体形成信号包括胭脂氨酸合酶基因(Depicker等，J.Molec Appl Gen，(1982)1，561-573)、章鱼碱合酶基因(Gielen等，EMBO J，(1984)3:835 845)、SCSV或苹果酸酶末端(Schunmann等，Plant FunctBiol，(2003)30:453-460)和T DNA基因7(Velten和Schell，Nucleic Acids Res，(1985)13，6981 6998)的那些，其在转化的植物细胞中充当3'非翻译DNA序列。在一些实施方式中，将一个或多个引入的基因稳定地整合入细胞核基因组。当核酸序列保持整合入细胞核基因组且通过随后植物世代继续被表达(例如，产生可检测的mRNA转录体或蛋白质)，存在稳定的整合。可通过任何本领域已知的方法(例如，微粒轰击、农杆菌属介导的转化、CRISPR/Cas9、原生质体的电穿孔、微注射等)完成稳定整合入细胞核基因组和/或编辑细胞核基因组。
术语重组体或修饰的核酸指通过两个其他分开的序列区段的组合制造的多核苷酸，这是通过基因工程化技术或通过化学合成的由人工操作分离的多核苷酸的区段完成的。这样做可将所需功能的多核苷酸片段连接以生成所需功能的组合。
如本文使用的，术语“过度表达”和“上调”指作为基因修饰的结果相对于野生型生物体(例如，植物)中的表达增加的表达(例如，mRNA、多肽等)。在一些实施方式中，表达的增加比野生型中的表达略微增加约10％。在一些实施方式中，表达的增加相对于野生型中的表达增加50％或更多(例如，60％、70％、80％、100％等)。在一些实施方式中，内源基因是过度表达的。在一些实施方式中，外源基因由于被表达而过度表达。植物中基因的过度表达可通过任何本领域已知的方法实现，其包括但不限于组成型启动子、诱导型启动子、高表达启动子(例如，PsaD启动子)、增强子、转录和/或翻译调节序列、密码子优化、修饰的转录因子和/或控制待过度表达的基因的表达的经突变或经修饰基因的使用。
在重组核酸旨在用于特定序列的表达、克隆或复制时，用于引入宿主细胞而制备的DNA构建体通常将包括由宿主识别的复制系统(例如载体)，包括编码所需多肽的预期的DNA片段，并且还可包括可操作地连接至编码多肽的区段的转录和翻译启动调节序列。可选地，这种构建体可包括细胞定位信号(例如，质膜定位信号)。在优选的实施方式中，这种DNA构建体被引入宿主细胞的基因组DNA、叶绿体DNA或线粒体DNA。
在一些实施方式中，非整合的表达系统可用于诱导一个或多个引入的基因的表达。表达系统(表达载体)可包括，例如，复制或自主复制序列(ARS)的起点和表达控制序列、启动子、增强子和必要的加工信息位点，比如核糖体-结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点、转录终止子序列和mRNA稳定化序列。也可适当的包括来自相同或相关物种的分泌多肽的信号肽，其允许蛋白质跨过和/或嵌入细胞膜、细胞壁，或从细胞中分泌。
用于实践本文公开的发明的方法的可选择标志物可以是正向可选择标志物。典型地，正向选择指在仅在细胞内存在目标重组体多核苷酸时，基因改变的细胞可在有毒的物质存在下存活的情况。负向可选择标志物和可筛选标志物在本领域也是熟知的且是本发明考虑的。本领域技术人员将认识到，任何可获得的相关标志物可在实践本文公开的发明中利用。
本发明的重组株系的筛选和分子分析可利用核酸杂交技术进行。杂交方法用于鉴定多核苷酸，比如使用本文描述的技术修饰的那些，其与本文教导使用的主题调节序列具有足够的同源性。特别的杂交技术对本发明不是必需的。随着杂交技术中进行的改善，它们可由本领域技术人员容易地应用。杂交探针可用本领域技术人员已知的任何适当的标记物进行标记。可改变杂交条件和洗涤条件，例如温度和盐浓度，以改变检测阈值的严谨性。参见，例如，Sambrook等(1989)参见下文或Ausubel等(1995)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY，N.Y.，用于杂交条件的进一步指导。
可选地，基因改变的株系的筛选和分子分析以及所需分离的核酸的产生可使用聚合酶链式反应(PCR)进行。PCR是核酸序列的重复、酶促、引发合成。该方法对该领域的那些技术人员是熟知的和常用的(参见Mullis，美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159；Saiki等(1985)Science 230:1350-1354)。PCR基于目标DNA片段的酶促扩增，目标DNA片段的侧面是与靶序列的相对链杂交的两个寡核苷酸引物。引物以指向彼此的3’末端定向。模板的热变性、引物退火至它们互补的序列以及用DNA聚合酶延伸退火的引物的重复循环导致对由PCR引物的5’末端限定的区段的扩增。因为每个引物的延伸产物可用作其他引物的模板，每个循环实质上使前一个循环中产生的DNA模板的量加倍。这导致特定靶片段的指数积聚，在几小时内达到几百万倍。通过使用热稳定DNA聚合酶比如Taq聚合酶，其分离自嗜热性细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)，可完全自动化扩增过程。可使用的其他酶对本领域技术人员是已知的。
本发明的核酸和蛋白质也可涵盖具体地公开序列的同系物。同源性(例如，序列同一性)可以是50％-100％。在一些情况下，这种同源性大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。序列的任何预期用途需要的同源性或同一性的程度容易由本领域技术人员鉴定。如本文使用的两个核酸的序列同一性百分比使用本领域已知的算法，比如由Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268公开的，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中修饰的算法确定。这种算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:402-410的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索用NBLAST程序进行，评分＝100，字长＝12，以获得具有所需序列同一性百分比的核苷酸序列。为了获得用于比较的目的的间隙比对，如Altschul等(1997)Nucl.Acids.Res.25:3389-3402中描述的使用间隙BLAST。当利用BLAST和间隙BLAST程序时，使用各自方法(NBLAST和XBLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nih.gov。
优选的宿主细胞是植物细胞。在本上下文中，重组体宿主细胞是那些已经基因修饰以含有分离的核酸分子，含有在宿主细胞中通常存在和有功能的一个或多个删除的或其他非功能基因，或含有产生至少一种重组体蛋白质的一个或多个基因。本发明的编码蛋白质的核酸可通过任何本领域已知的对特定类型的细胞适当的方法引入，所述方法包括但不限于转化、脂质转染、电穿孔或本领域技术人员已知的任何其他方法。
已经一般地描述了本发明，本发明将通过参考某些具体的实施例更好的理解，所述具体的实施例包括在本文中以进一步示例说明本发明并且不旨在限制由权利要求限定的本发明的范围。
实施例
在以下实施例中进一步详细描述本公，这些实施例不旨在以任何方式限制所要求保护的本公开的范围。附图意在被认为是本公开的说明书和描述的组成部分。提供以下实施例以举例说明，但不限制要求保护的公开内容。
实施例1：苜蓿属NFP胞外域的结构特征
以下实施例描述了苜蓿属NFP蛋白质胞外域的结构特征。
材料和方法
苜蓿属NFP胞外域的表达和纯化：蒺藜苜蓿属NFP胞外域(残基28-246)经密码子优化用于昆虫细胞表达(Genscript，Piscataway，USA)并且克隆至pOET4杆状病毒转移载体(Oxford Expression Technologies)中。用AcMNPV gp67信号肽替换天然NFP信号肽(残基1-27，通过SignalP 4.1预测的)以促进分泌并且将六组氨酸标签添加至C-末端。用Lipofectin(ThermoFisher Scientific)作为转染试剂根据制造商的指导，使用FlashBacGold试剂盒(Oxford Expression technologies)在Sf9细胞(草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))中产生重组杆状病毒。蛋白质表达如下进行。在补充有1％Pen-Strep(10000U/ml，Life technologies)和1％CD脂质浓缩物(Gibco)的无血清MAX-XP(BD-Biosciences，停产)或HyClone SFX(GE Healthcare)培养基中，以299K摇动维持悬浮培养的Sf9细胞。一旦Sf9细胞达到1.0*10^6个细胞/ml的细胞密度，通过添加重组体3代病毒诱导蛋白质表达。在表达的5-7天后，通过离心收获含有NFP胞外域的培养基上清液。随后是在277K，针对50mM Tris-HCl pH 8，200mM NaCl的过夜透析步骤。通过Ni-IMAC纯化的两个随后步骤(HisTrap excel/HisTrap HP，都是GE Healthcare)来富集NFP胞外域。对于晶体学，使用内切糖苷酶PNGase F(1:15(w/w)，室温，过夜)去除N-聚糖。作为最后的纯化步骤，在补充至总计500mM NaCl(对于结合测定)或50mM Tris-HCl，200mM NaCl(对于晶体学)，在pH7.2的磷酸盐缓冲盐水中，在Superdex 200 10/300或HiLoad Superdex 200 16/600(都是GE Healthcare)上通过SEC纯化NFP胞外域。NFP胞外域作为对应于单体的单一均质峰洗脱。
结晶和结构测定：在0.2M醋酸钠、0.1M二甲胂酸钠pH 6.5和30％(w/v)PEG-8000中，以3-5mg/ml使用蒸汽扩散设定获得去糖基化的NFP胞外域的晶体。在液氮中速冻之前，通过补充5％(w/v)PEG-400在其结晶条件中对晶体进行冷冻保护。在MaxLab I911-3光束线处获得至
Figure BDA0003013375720000752
分辨率的完整的衍射数据。基于AtCERK1胞外域结构(PDB坐标为4EBZ)作为搜索模型，使用来自具有同源性模型的PHENIX套件的Phaser通过分子替换解决相问题。分别使用COOT和PHENIX套件进行模型构建和完善。生成了输出pdb填充的结构模型并且使用PDB2PQR和APBS webservers(PMID：21425296)计算其静电表面电势。使用APBS工具2.1在PyMol中显示结果(DeLano,W.L.(2002).PyMOL.DeLano Scientific,San Carlos,CA,700.)。
结果
使用基于AtCERK1的内部低B因子支架的同源性模型通过分子替换确定苜蓿属NFP的结构。以这种方式构建NFP的完整结构(残基33-233)，包括在
Figure BDA0003013375720000751
电子密度图中清楚分辨的四个N-糖基化。NFP形成致密结构，其中三种经典的βααβLysM结构域紧密地相互连接且通过3个保守的二硫桥(C3-C104、C47-C166和C102-C164)得到稳定(图1)。二硫化物连接方式和整个支架排列与几丁质防御信号传导中涉及的其他LysM-RLK蛋白质共享，支持这些类型的受体的共同进化起源。
实施例2：用于脂壳寡糖(LCO)感知的重要残基的鉴定
以下实施例描述了使用结构指导方法以鉴定用于LCO感知的NFP中的重要残基。在鉴定重要残基后，产生NFP点突变且使用配体-结合测定法进行测试。
材料和方法
结构指导残基鉴定：NFP胞外域在结构上与配体-结合CERK1对齐。然后，将静电表面电势映射到NFP胞外域的先前-开发的结构。在图2A中描绘了预测的配体-结合位置和静电表面电势。
NFP点突变的产生：用天冬氨酸残基替换NFP亮氨酸残基L147和L154。天冬氨酸与亮氨酸尺寸是类似的，但带负电，而亮氨酸是疏水的。使用位点定向诱变工程化NFP的点突变体。特别地，双突变的NFP是工程化的，其中用天冬氨酸残基替换亮氨酸残基L147和L154以产生突变体NFP L147D L154D。如实施例中描述的表达和纯化NFP的点突变版本。
NFP突变体结合测定法：使用NFP野生型(WT)蛋白质的结合测定法重复七次，而使用NFP突变体NFP L147D L154D的结合测定法重复四次。结果的总结显示在图2B中。
生物层干涉法(BLI)：在Octet RED 96系统(Pall ForteBio)上测量NFP WT和NFPL147D/L154D突变体与苜蓿中华根瘤LCO-IV的结合。苜蓿中华根瘤LCO由四聚体/五聚体N-乙酰葡糖胺主链组成，所述四聚体/五聚体N-乙酰葡糖胺主链在还原末端残基上是O-硫酸化的，在非还原末端残基上是O-乙酰化的和由不饱和C16酰基进行单-N-酰化。将生物素化的配体缀合物以125-250nM的浓度固定在链霉抗生物素生物传感器(kinetic quality,Pall ForteBio)上5分钟。用于NFP WT的结合测定法重复7次，且用于NFP L147D/L154D突变体的结合测定法重复4次。在GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)中进行数据分析。通过对在针对蛋白质浓度绘制的平衡处的响应应用非线性回归(一个位点，特异性结合)来确定源自稳态的平衡解离常数。通过对减去数据的非线性回归(在解离之后缔合)来确定动力学参数。结果在图19A-19C中显示。以相同方式测量拟南芥属CERK1(AtCERK1)与壳五糖(CO5)和壳八糖(CO8)的结合。结果在图18A-18B中显示。
结果
图2A显示了对结合至具有预测的几丁质和LCO脂肪酸链位置的配体的NFP胞外域的建模。NFP胞外域与配体结合的CERK1的结构比对将几丁质定位在NFP的LysM2结合槽中，没有任何明显的碰撞。显著地，静电表面电势揭示了位于对接的几丁质分子的非还原部分附近的NFP胞外域上的疏水补丁，其潜在地可容纳LCO配体的脂肪酸链。两个亮氨酸残基(L147和L154)被鉴定为供给该补丁以疏水特征的残基。
为了测试这些两个残基对LCO结合的贡献，用大小相似但带负电的天冬氨酸残基替换两个残基以产生NFP L147D L154D。有趣地是，双突变的NFP L147D L154D胞外域以近似两倍更低的亲和性结合苜蓿中华根瘤菌LCO-IV；48.0±1.0μM的Kd(图2B)。仔细检查结合动力学揭示了，在双突变体中，缔合(Kon)几乎不受影响，而解离(Koff)更快约15倍。这些结果显示了NFP胞外域的疏水补丁稳定了LCO结合状态，并且该稳定化最可能经脂肪酸链发生。将LCO脂肪酸对接在该疏水补丁和几丁质主链在LysM2结合位点中(源自CERK1)会发生硫酸根和乙酰基侧面基团面对K141。
LCO结合至疏水补丁突变体的生物化学分析揭示了与WT NFP-ECD相比，纯化的L147D/L154D NFP-ECD以13倍更低的亲和性(166.7±4.2μM的Kd)结合苜蓿中华根瘤菌LCO-IV(图19A-19C)。与WT NFP-ECD相比，双突变体中缔合速率(kon)是更快4.5倍且解离速率(koff)明显增加59倍，提示了疏水补丁对由酰基链介导的LCO结合具有强的稳定效果。
测量AtCERK1结合至几丁质片段的结合动力学作为比较。如在图18A-18B中显示，看到快速缔合和解离速率。这些动力学是突变体L147D/L154D NFP-ECD观察到的动力学的回归(图19B)。AtCERK1对几丁质片段的结合动力学与NFP对LCO的结合动力学明显地不同(图19A)。
同时，数据提供了证据：NFP中的疏水补丁(图19D中显示)是对LCO感知和共生信号传导至关重要的保守结构特征。
实施例3：苜蓿属nfp突变体中的互补测试
为了确认在先前的实施例中描述的生物化学观察，接下来使用多毛根转化在苜蓿属nfp突变体中进行互补测试。
材料和方法
互补测定：如在Bozsoki等(2017)(Bozsoki Z,Cheng J,Feng F,Gysel K,VintherM,Andersen KR,Oldroyd G,Blaise M,Radutoiu S,Stougaard J(2017)Receptor-mediated chitin perception in legume roots is functionally separable from Nodfactor perception.Proc Natl Acad Sci 114:E8118–E8127)中描述一般地进行构建体组装、植物生长条件、多毛根转化、结瘤和ROS测定法。图3中提供了构建体的一般示意图。测试的转基因是实施例2中描述的突变的LysM受体。
结果
图4A-4B显示了互补测试的结果。图4A中显示的结果是互补测试，其中用苜蓿中华根瘤菌菌株2011接种植物。当用野生型Nfp基因转化苜蓿属nfp突变体时，看见互补，其定义为在用苜蓿中华根瘤菌菌株2011接种后6-7周平均每个植物10个结节。相反地，在用苜蓿中华根瘤菌菌株2011接种后6-7周，用双突变构建体(L147D/L154D)转化的根平均每个植物不发育任何结节。
使用药用中华根瘤菌接种重复这些互补实验，其已经报告以更高效率结瘤苜蓿属。图4B中显示的结果是互补测试，其中用药用中华根瘤菌接种植物。药用中华根瘤菌结果确认双突变构建体(L147D/L154D)互补不良。合起来看，这些结果显示NFP中的疏水补丁对于LCO识别和功能共生信号传导是需要的。
实施例4：使用结构域交换的CO和LCO受体的功能表征
以下实施例描述了莲属LCO受体NFR1和莲属CO受体CERK6的功能表征。这个使用结构域交换进行，并且通过测量结瘤和防御(反应性氧物质，ROS)反应以评估互补。
材料和方法
互补测定法：如在Bozsoki等(2017)(Bozsoki Z,Cheng J,Feng F,Gysel K,Vinther M,Andersen KR,Oldroyd G,Blaise M,Radutoiu S,Stougaard J(2017)Receptor-mediated chitin perception in legume roots is functionally separablefrom Nod factor perception.Proc Natl Acad Sci 114:E8118–E8127)中描述一般地进行构建体组装、植物生长条件、多毛根转化、结瘤和ROS测定法。图3中提供了构建体的一般示意图，由此pNfr1启动子用于结瘤测定法中测试的构建体，和pCerk6启动子用于ROS测定法中测试的构建体。对于nfr1和cerk6突变体的功能互补，使用来自转化对照的仅表达YFP标志物蛋白质的植物(图3)。对于结瘤测定法，在用百脉根中慢生根瘤菌R7A(图5A)的指示的接种后天数(dpi)(例如，44dpi、49dpi和50dpi)，在多毛根转化的百脉根nfr1-1突变体根上计数结节。对于ROS测定法，从个体植物收获转化的根，然后把根材料分为两半，测试每半对CO8或flg22的ROS应答。对于每个转化的植物，CO8和flg22引起ROS峰值的比例其后根据野生型样品进行归一化绘制，野生型样品设置为1(图5B)。测试的嵌合受体在图5A-5B中描绘为加阴影的方块图。
结果
图5A-5B显示莲属LCO受体NFR1和莲属CO受体CERK6之间使用结构域交换的测量结瘤和防御的功能研究结果。图5A显示具有在pNFR1启动子下表达的不同结构域-交换的蛋白质构建体的莲属nfr1单个突变体的互补实验。结瘤用于评估互补。图5B显示具有在pCerk6启动子下表达的不同结构域-交换的蛋白质构建体的莲属cerk6单个突变体的互补实验。引起ROS应答的水平用于评估互补。这些实验的结果显示NFR1胞外域的LysM1结构域对感知LCO(在NFR1的情况下)和CO(在CERK6的情况下)配体二者是重要的。
在图5A-5B中还描绘了另外的实验交换更小区段，其称为结构域的区域。这些实验显示两个区域，即区域II和区域IV，对配体的特异性识别是特别地重要的。合起来看，这些结果显示交换整个LysM1结构域或仅交换区域II和区域IV足以将CO受体转换为LCO受体。
实施例5：莲属CERK6胞外域的结构表征
以下实施例描述了莲属CERK6蛋白质胞外域的结构表征。
材料和方法
建模：将LysM受体氨基酸序列(莲属CERK6)与已知的受体序列(苜蓿属NFP)比对。然后，靶序列的LysM1-3结构域用作SWISS-MODEL(Biasini 2014)中的输入。苜蓿属NFP晶体结构的结构坐标文件(.pdb)作为SWISS-MODEL(Biasini 2014)中的模板文件，并且使用命令‘Build Model’运行建模程序。用SWISS-MODEL生成的输出靶(.pdb)模型的静电表面电势使用PDB2PQR&APBS webservers(PMID：21425296)计算并且在PyMol中使用APBS工具2.1(DeLano,W.L.2002)显示。莲属CERK6胞外域的3D结构在图6中描绘，并且对应于由Bozsoki等人(2017)(Bozsoki Z,Cheng J,Feng F,Gysel K,Vinther M,Andersen KR,Oldroyd G,Blaise M,Radutoiu S,Stougaard J(2017)Receptor-mediated chitin perception inlegume roots is functionally separable from Nod factor perception.Proc NatlAcad Sci 114:E8118–E8127)公布的。
结果
如图6中显示的，CERK6的3D结构显示区域II和区域IV位于邻近彼此。该指示潜在涉及在可能结合位点中这些两个区域。
实施例6：使用结构域交换的LCO受体的功能表征
以下实施例描述了莲属LCO受体NFR1和苜蓿属LCO受体LYK3的功能表征。这个使用结构域交换进行，并且通过测量结瘤以评估互补。
材料和方法
互补测定：如在Bozsoki等(2017)(Bozsoki Z,Cheng J,Feng F,Gysel K,VintherM,Andersen KR,Oldroyd G,Blaise M,Radutoiu S,Stougaard J(2017)Receptor-mediated chitin perception in legume roots is functionally separable from Nodfactor perception.Proc Natl Acad Sci 114:E8118–E8127)中描述一般地进行构建体组装、植物生长条件、多毛根转化、结瘤和ROS测定法。图3中提供了构建体的一般示意图，由此pNFR1启动子用于驱动嵌合构建体。莲属中测试的嵌合受体描绘为图7中图以下的方块图，其中NFR1结构域以白色显示且LYK3结构域以灰色显示，和跨越描绘LysM1结构域的方块的横线指示区段II和IV。未改变的莲属CERK6蛋白质用作阴性对照(零结瘤)。用百脉根中慢生根瘤菌R7A接种后35天在多毛根转化的百脉根nfr1-1突变体根上计数结节。百脉根中慢生根瘤菌R7A是百脉根的同源固氮菌菌株，并且不由蒺藜苜蓿识别。
苜蓿属中测试的嵌合受体在图17A-17B中描绘为方块图，其中NFR1结构域以黑色显示，LYK3结构域以灰色显示，和跨越描绘LysM1结构域的方块的横线指示区域II、III和IV。pLYK3启动子用于驱动嵌合构建体。用苜蓿中华根瘤菌接种后35天在多毛根转化的蒺藜苜蓿WT或蒺藜苜蓿lyk3突变体根上计数结节。苜蓿中华根瘤菌是蒺藜苜蓿的同源固氮菌菌株，并且不由百脉根识别。
结果
图7显示莲属LCO受体NFR1和苜蓿属LCO受体LYK3之间使用结构域交换的测量结瘤的功能研究结果。另外，包括LjCERK6作为阴性对照(零结瘤)。在莲属nfr1-1突变体中，两个重组受体能够补体。如图以下图表中显示的，NFR1(白色)和LYK3(灰色)蛋白质的结构域以不同嵌合构建体组装。跨越LysM1的横线显示区段II和IV来源的位置。CERK6蛋白质用作对照。当用百脉根中慢生根瘤菌接种时，仅含有LysM1结构域的区域II和IV或来自NFR1的整个LysM1结构域的嵌合受体互补nfr1突变体。这指示LysM1结构域对允许特异性百脉根中慢生根瘤菌LCO识别是重要的。区域II和区域IV的重要性通过除了LjNFR1区域II和区域IV之外完全由MtLYK3组成的重组受体显示，其能够功能上互补nfr1突变体，即使效率没有达到野生型水平。该嵌合MtLYK3受体显示区域II和IV的交换足以改变对百脉根中慢生根瘤菌LCO的特异性。合起来看，这些结果指示LysM1结构域对识别那些通过豆类物种的同源固氮菌菌株产生的LCO是重要的。而且，区域II和IV对该识别是特别地重要的，因为当它们被替换，识别缺失。
来自图7的结果显示具有区域II和IV交换的嵌合MtLYK3受体(图上最右侧的受体)足以改变其他完全MtLYK3蛋白质的特异性(其将一般地识别苜蓿中华根瘤菌LCO)至百脉根中慢生根瘤菌LCO。工程化LjNFR1受体与来自MtLyk3的区域II和IV导致受体不能识别百脉根中慢生根瘤菌LCO(从图左侧第三个受体和从图右侧第三个受体)。该嵌合受体显示区域II和IV的交换通过其他完全LjNFR1蛋白质足以取消对百脉根中慢生根瘤菌的识别。
图17A显示蒺藜苜蓿lyk3突变体中，含有来自MtLYK3的包括区域III的LysM1的区段的重组受体能够互补。区域III是位于区域II和区域IV之间的六个氨基酸(图17B)。当用苜蓿中华根瘤菌接种时，具有来MtLYK3的整个LysM1(例如，从左侧(空载体计数)第六个受体或从右侧第六个受体)，来自MtLYK3的跨越区域II至区域IV的LysM1的区段(例如，从左侧(空载体计数)第四个受体或从右侧第八个受体)，或来自MtLYK3的区域II、区域III和区域IV(例如，例如，从左侧(空载体计数)第五个受体或从右侧第七个受体)的工程化的受体全部能够与蒺藜苜蓿lyk3突变体的共生缺陷表型互补。相反地，仅含有来自MtLYK3的区域II和区域IV(例如，从左侧(空载体计数)第七个受体或从右侧第五个受体)的工程化的受体不能特异性地识别苜蓿中华根瘤菌LCO。观察到具有MtLYK3跨膜和激酶结构域的嵌合受体(从右侧第五个受体)具有非常低的互补能力(分析的15个中的3中植物具有1个或2个结节)，其被认为是由于来自MtLYK3的这些另外区域的高效率。该结果解释为区域III是对苜蓿中华根瘤菌LCO的特异性和有效的识别是需要的，但是区域II和IV是关键的。用来自LjNFR1的区域II至IV(从右侧第四个受体)，来自LjNFR1的区域II、III和IV(从右侧第四个受体)，来自LjNFR1的整个LysM1(从右侧第二个受体)，或来自LjNFR1的区域II和IV(最右侧受体)对MtLYK3受体进行工程化产生不能识别苜蓿中华根瘤菌LCO的受体。
总体上，这些结果指示LysM1结构域对识别由豆类物种的同源固氮菌菌株产生的那些LCO是关键的。当在蒺藜苜蓿中表达嵌合受体时，LysM1结构域的区域II、III和IV被鉴定为对该识别是特别地重要的。替换区域II和IV足以获得识别的缺失。需要替换区域II、III和IV以获得对苜蓿中华根瘤菌LCO识别的增加和受体的最佳功能性。
实施例7：工程化特异性LCO感知
以下实施例描述了特异性地对感知LCO的莲属受体LYS11(LjLYS11)的工程化。这使用结构域交换进行，通过测量配体结合和通过测量结瘤以评估互补。
材料和方法
LjLYS11胞外域产生和纯化：LjLYS11胞外域(残基26-234；SEQ ID NO:60)经密码子优化用于昆虫细胞表达(Genscript，Piscataway，USA)并且克隆至pOET4杆状病毒转移载体(Oxford Expression Technologies)中。用gp64信号肽(SEQ ID NO:59)替换天然LjLYS11信号肽以促进分泌并且将六组氨酸(6xHis；SEQ ID NO:61)标签添加至C-末端(LjLYS11-胞外(26-234)，N-端gp64，C-端6His＝SEQ ID NO:56)。用Lipofectin(ThermoFisher Scientific)作为转染试剂根据制造商的指导，使用FlashBac Gold试剂盒(Oxford Expression technologies)在Sf9细胞(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))中产生重组杆状病毒。蛋白质表达如下进行。在补充有1％Pen-Strep(10000U/ml，Lifetechnologies)和1％CD脂质浓缩物(Gibco)的无血清MAX-XP(BD-Biosciences，停产)或HyClone SFX(GE Healthcare)培养基中，以299K摇动维持悬浮培养的Sf9细胞。一旦Sf9细胞达到1.0*10^6个细胞/ml的细胞密度，通过添加重组体3代病毒诱导蛋白质表达。在表达的5-7天后，通过离心收获含有LjLYS11胞外域的培养基上清液。随后是在277K，针对50mMTris-HCl pH 8，200mM NaCl的过夜透析步骤。通过Ni-IMAC纯化的两个随后步骤(HisTrapexcel/HisTrap HP，都是GE Healthcare)来富集LjLYS11胞外域。对于晶体实验，使用内切糖苷酶PNGase F(1:15(w/w)，室温，过夜)去除N-聚糖。作为最后的纯化步骤，在补充至总计500mM NaCl(对于结合测定)或50mM Tris-HCl，200mM NaCl(对于晶体学)，在pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水中，在Superdex 200 10/300或HiLoad Superdex 200 16/600(都是GEHealthcare)上通过SEC纯化LjLYS11胞外域。
生物层干涉法(BLI)：在Octet RED 96系统(Pall ForteBio)上测量LjLYS11胞外域和结构域-交换版本的LjLYS11胞外域与配体的结合。使用的配体是CO5几丁质低聚物(对应于苜蓿中华根瘤菌LCO-V的主链)、百脉根中慢生根瘤菌LCO和苜蓿中华根瘤菌LCO。苜蓿中华根瘤菌LCO由四聚体/五聚体N-乙酰葡糖胺主链组成，所述四聚体/五聚体N-乙酰葡糖胺主链在还原末端残基上是O-硫酸化的，在非还原末端残基上是O-乙酰化的和由不饱和C16酰基进行单-N-酰化。百脉根中慢生根瘤菌LCO是五聚体N-乙酰葡糖胺，具有在非还原末端残基处的顺式-异油酸和氨基甲酰基与还原末端残基处的2,4-O-乙酰葡糖一起。将生物素化的配体缀合物以125-250nM的浓度固定在链霉抗生物素生物传感器(kineticquality,Pall ForteBio)上5分钟。在GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)中进行数据分析。通过对在针对蛋白质浓度绘制的平衡处的响应应用非线性回归(一个位点，特异性结合)来确定源自稳态的平衡解离常数。通过对减去数据的非线性回归(在解离之后缔合)来确定动力学参数。测试的嵌合受体在图15B中描绘为方块图，LjLYS11结构域以黑色显示和LjNFR5和以上结合测定法结果在图15C-15E中。
互补测定法：互补测定如在实施例6中进行。测试的嵌合受体在图15F中描绘为方块图，其中LjNFR5结构域以浅灰色显示，LjLYS11结构域以灰色显示，和跨越描绘LysM2结构域的方块的横线指示来自的区域QLGDSYD(SEQ ID NO:63)和GV(SEQ ID NO:64)。空载体和全长LjLYS11用作阴性对照(零结瘤)。用百脉根中慢生根瘤菌R7A结构后35天在多毛根转化的百脉根nfr5-2突变体根上计数结节。百脉根中慢生根瘤菌R7A是百脉根的同源固氮菌菌株。
结果
基于LjLYS11胞外域的建模和晶体结构测定(图15A)，预测受体可能是LCO受体。为了实验地验证该预测，进行结合实验。如图15C中显示，LjLYS11胞外域能够结合CO5(左侧图)、百脉根中慢生根瘤菌LCO(中间图；百脉根中慢生根瘤菌是百脉根的同源固氮菌菌株)和苜蓿中华根瘤菌LCO(右侧图；弱结合)。该结果指示鉴定LjLYS11胞外域中的疏水补丁允许其结合LCO。所以，疏水补丁是LCO-结合能力的先兆。
接下来，测试是否可以对严格的和特异性的LCO识别进行工程化。对于这些测试，LjLYS11胞外域被工程化为含有部分的LjNFR5受体。用来自LjNFR5的相应的区域QLGDSYD(SEQ ID NO:63)和GV(SEQ ID NO:64)替换来自LjLYS11的整个LysM2或来自LysM2疏水补丁的关键残基，并且测量这些嵌合胞外域的配体结合。如图15D中显示，替换整个LysM2导致改善对LCO(百脉根中慢生根瘤菌和苜蓿中华根瘤菌LCO)的亲和性，并且导致结合CO的能力的缺失。当仅替换LysM2的关键残基时，参见类似的结果(图15E)。
然后，在原位中测试嵌合受体。对于这些测试，使用相同嵌合LjLYS11胞外域(用来自LjNFR5的相应的区域替换来自LjLYS11的整个LysM2或来自LysM2的关键残基)或使用整个LjLYS11胞外域(LysM1、LysM2和LysM3)，并且这些被附着至LjNFR5的跨膜结构域(图15F的示意图中的波浪形)和激酶结构域(图15F的示意图中的椭圆形)。另外，测试全长LjNFR5和全长LjLYS11。如图15F中显示，具有这些修饰中任何一个的嵌合受体(从右侧第四个、从右侧第三个、从右侧第二个受体)保留它们感知百脉根中慢生根瘤菌Nod因子和以与LjNFR5类似的效率启动共生信号传导事件的能力。
有趣地，嵌合LjLYS11/LjNFR5胞外域具有与蒺藜苜蓿NFP的结合动力学类似的缓慢结合速率/解离速率的不同LCO结合动力学。如图18D中显示，缓慢结合速率/解离速率结合动力学被认为对功能共生信号传导是重要的。用疏水补丁突变体看见的快速结合速率/解离速率结合动力学不导致共生信号传导(图18E)。进一步，快速结合速率/解离速率动力学也似乎是CO感知的特点(图18C)。如图18F中显示，NFP共享半胱氨酸桥连接性模式和具有涉及几丁质-引起的防御信号传导的其他LysM受体激酶的支架的总体布置。该结果支持假设，尽管它们不同功能，这些LysM受体共享共同进化的起源(Zhang,X.-C.等，Molecularevolution of lysin motif-type receptor-like kinases in plants.PlantPhysiol.144,623–636(2007))。提供的LysM受体的共享的结构特征进一步支持工程化这些受体至具有不同结合动力学的能力。例如，用嵌合LjLYS11/LjNFR5胞外域观察到的改变的结合动力学指示受体可被工程化为具有功能共生信号传导的LCO结合动力学特点。
合起来看，用嵌合LjLYS11/LjNFR5胞外域看见的结果显示LysM2工程化可创建具有朝向LCO更高严格性以及朝向LCO更高特异性的受体。
实施例8：鉴定用于工程化的靶LysM受体
以下实施例描述了大麦(H.vulgare)中同源性建模以鉴定用于工程化中的靶LysM受体。
材料和方法
建模：用SWISS-MODEL进行同源性建模(Biasini,M.等，SWISS-MODEL:modellingprotein tertiary and quaternary structure using evolutionaryinformation.Nucleic Acids Res.42,W252–W258(2014))。对于大麦RLK10(HvRLK10)，苜蓿属NFP的晶体结构作用模板模型，在其上定位靶受体的氨基酸序列。对于大麦RLK4(HvRLK4)，苜蓿属LYK3的晶体结构作用模板模型，在其上定位靶受体的氨基酸序列。生成了输出pdb填充的结构模型并且使用PDB2PQR和APBS webservers(PMID：21425296)计算其静电表面电势。使用APBS工具2.1在PyMol中显示结果(DeLano,W.L.(2002).PyMOL.DeLanoScientific,San Carlos,CA,700.)。
胞外域的表达和纯化：HvRLK10胞外域(残基25-231；SEQ ID NO:66)经密码子优化用于昆虫细胞表达(Genscript，Piscataway，USA)且克隆至pOET4杆状病毒转移载体(Oxford Expression Technologies)中。用gp64信号肽(SEQ ID NO:59)替换天然HvRLK10信号肽以促进分泌并且将六组氨酸(6xHIS；SEQ ID NO:61)标签添加至C-末端(HvRLK10-胞外(25-231)，N-末端gp64，C-末端6His＝SEQ ID NO:65)。HvRLK4胞外域(残基27-228；SEQID NO:68)经密码子优化用于昆虫细胞表达(Genscript，Piscataway，USA)且克隆至pOET4杆状病毒转移载体(Oxford Expression Technologies)中。用gp64信号肽(SEQ ID NO:59)替换天然HvRLK4信号肽以促进分泌并且将六组氨酸(6xHIS；SEQ ID NO:61)标签添加至C-末端(RLK4-胞外(27-228)，N-末端gp64，C-末端6His＝SEQ ID NO:67)。用Lepofectin(ThermoFisher Scientific)作为转染试剂根据制造商的指导，使用FlashBac Gold试剂盒(Oxford Expression technologies)在Sf9细胞(草地夜蛾)中产生重组杆状病毒。
蛋白质表达如下进行。在补充有1％Pen-Strep(10000U/ml，Life technologies)和1％CD脂质浓缩物(Gibco)的无血清的MAX-XP(BD-Biosciences，停产)或HyClone SFX(GEHealthcare)培养基中，以299K摇动维持悬浮培养的Sf9细胞。一旦Sf9细胞达到1.0*10^6个细胞/ml的细胞密度，通过添加重组体3代病毒诱导蛋白质表达。在表达的5-7天后，通过离心收获含有HvRLK10胞外域或HvRLK4胞外域的培养基上清液。随后是在277K，针对50mMTris-HCl pH 8，200mM NaCl的过夜透析步骤。通过Ni-IMAC纯化的两个随后步骤(HisTrapexcel/HisTrap HP，都是GE Healthcare)来富集HvRLK10胞外域或HvRLK4胞外域。
生物层干涉法(BLI)：在Octet RED 96系统(Pall ForteBio)上测量HvRLK10胞外域或HvRLK4胞外域与配体的结合。使用的配体是CO5几丁质寡聚物(对应于苜蓿中华根瘤菌LCO-V的主链)、百脉根中慢生根瘤菌LCO和苜蓿中华根瘤菌LCO。苜蓿中华根瘤菌LCO由四聚体/五聚体N-乙酰葡糖胺主链组成，所述四聚体/五聚体N-乙酰葡糖胺主链在还原末端残基上是O-硫酸化的，在非还原末端残基上是O-乙酰化的和由不饱和C16酰基进行单-N-酰化。百脉根中慢生根瘤菌LCO是五聚体N-乙酰葡糖胺，具有在非还原末端残基处的顺式-异油酸和氨基甲酰基与在还原末端残基处的2,4-O-乙酰葡糖一起。将生物素化的配体缀合物以125-250nM的浓度固定在链霉抗生物素生物传感器(kinetic quality,Pall ForteBio)上5分钟。在GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)中进行数据分析。通过对在针对蛋白质浓度绘制的平衡处的响应应用非线性回归(一个位点，特异性结合)来确定源自稳态的平衡解离常数。通过对减去数据的非线性回归(在解离之后缔合)来确定动力学参数。
结果
使用苜蓿属NFP结构作为模板进行了所有十种大麦LysM受体样激酶(RLK)的同源性建模。在大麦LysM RLK中，HvRLK10是最接近苜蓿属NFP的受体，并且使用该方法建模最佳。图16B显示了HvRLK10的同源性建模结构，其揭示了疏水补丁确实存在于该受体的LysM2结构域的正下方的等同位置。该清楚的疏水补丁指示HvRLK10是NFP/NFR5类型的LCO受体。
为了在实验上验证该预测，表达且纯化HvRLK10胞外域用于结合实验(图16A的顶部处显示胞外域示意图)。显示HvRLK10胞外域结合百脉根中慢生根瘤菌LCO(图16C)和苜蓿中华根瘤菌LCO(图16D)二者。相反地，HvRLK10胞外域不结合CO5(图16A)。这些结果提供HvRLK10胞外域的功能表征，并且显示其结合LCO，但不结合CO。如已经通过同源性建模预测，结果确认HvRLK10受体是LCO受体。
另外，使用苜蓿属LYK3结构作为模板进行了所有十种大麦LysM RLK的同源性建模。HvRLK4是最接近苜蓿属LYK3的受体，并且使用该方法建模最佳。图16F显示HvRLK4的同源性建模结果。这些结果只是该受体是NFR1/LYK3类型的LCO受体。
为了在实验上验证该预测，表达且纯化HvRLK4胞外域用于结合实验(图16E的顶部处显示胞外域示意图)。显示HvRLK4胞外域结合百脉根中慢生根瘤菌LCO(图16G)和苜蓿中华根瘤菌LCO(图16H)。相反地，HvRLK4胞外域不结合CO5(图16E)。这些结果提供了对HvRLK4胞外域的功能表征，并且显示其结合LCO，但不结合CO。如已经通过同源性建模预测，结果确认HvRLK4受体是LCO受体。
HvRLK10和HvRLK4最初通过同源性建模鉴定，并且然后通过生物化学表征确认是LCO受体。因此，HvRLK10和HvRLK4代表用于在大麦中进行工程化的有希望的靶受体，特别是用于选择它们的供体受体(分别是苜蓿属NFP和苜蓿属LYK3)相似地识别LCO来工程化受体。
总体上，这些结果显示同源性建模方法具体地可用于鉴定NFP/NFR5类型和NFR1/LYK3类型二者的LCO受体并且该方法可用于鉴定好的靶LysM受体以修饰改变期望的受体特点至用于选择靶LysM受体的供体LysM受体。
实施例9：示例性结构比对，以鉴定靶残基用于插入疏水补丁的修饰
本领域技术人员将不困难地应用本公开的教导以基因改变LysM受体至包括疏水补丁或改变现有的疏水补丁。示例性步骤将是：
1.比对靶LysM受体氨基酸序列与一个或多个已知的LCO受体序列(参见，例如，图8A-8C、图9A-9B、图10A-10B、图11A-11B)以鉴定靶氨基酸序列中LysM1-3结构域的序列。
应用该步骤至以下氨基酸序列产生的HvLysM-RLK2/37-247序列：
>HvLysM-RLK2/37-247
SVEGFNCSANGTYPCQAYALYRAGLAGVPPDLSAAGDLFGVSRFMLAHANNLSTSAAPAAGQPLLVPLQCGCPSGSPNAYAPTQYQISSGDTFWIVSVTKLQNLTQYQAVERVNPTVVPTKLEVGDMVTFPIFCQCPTAAQNATALVTYVMQQGDTYASIAAAFAVDAQSLVSLNGPEQGTQLFSEILVPLRRQVPKWLPPIVTRNDASAT
2.使用LysM1-3结构域氨基酸序列作为输入序列来以适当的分子建模程序比如SWISS-MODEL(Biasini 2014)来建模。SWISS-MODEL可在swissmodel.expasy.org underinteractive#structure处容易访问。
3.输入结构模板至分子建模程序，例如来自结构坐标文件(例如，pdb模式文件)。
将HvLysM-RLK2/37-247LysM1-3结构域氨基酸序列输入SWISS-MODEL作为是苜蓿属NFP受体胞外域晶体结构.pdb文件(原子坐标是在说明书的结尾处重现)。SWISS-MODEL程序通过指令‘Build Model’运行。选择苜蓿属NFP受体胞外域晶体结构作为其具有已知疏水补丁。基于本说明书中的教导，本领域技术人员可容易选择其他。
4.任选地创建靶模型的静电表面电势和用几丁质(或聚糖)结合至LysM2结构域的结构进行结构比对以比对配体结合槽。
用SWISS-MODEL生成的输出靶(.pdb)模型的静电表面电势使用PDB2PQR&APBSwebservers(PMID：21425296)计算并且使用APBS工具2.1(DeLano,W.L.2002)在PyMol中显示。结构中具有结合的几丁质的AtCERK1胞外域结构(PDB坐标4EBZ)与PyMol中的靶模型比对。本领域技术人员将容易地理解几丁质结合结构域的位置作为LysM几丁质结合基序是在关于AtCERK1的Liu等Science 2012中结构上定义的。这比对了靶模型的LysM2配体结合槽中的几丁质(CO4)配体。图13A-13B显示了具有标记的LysM1、LysM2，和LysM3结构域的HvLysM-RLK2/37-247模型的LysM1-3结构域的PyMol显示(图13A)，和结合槽中建模的具有几丁质的模型的静电表面电势(图13B)。
5.选择来自用已知疏水补丁比对的靶模型中比对的残基。
来自序列比对(1)，鉴定靶模型与苜蓿属NFP的晶体结构的结构比对和静电表面电势信息(5)疏水补丁(用来自AtCERK1的放置的几丁质作为参考定位CO结合槽，如(图13B)中显示。对应于苜蓿属NFP胞外域疏水补丁(L147、L151、L152、L154、T156、K157和V158)的热点残基基于已知疏水补丁氨基酸残基(苜蓿属NFP L147、L151、L152、L154、T156、K157和V158)的α碳内
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的氨基酸以结构比对鉴定。如本领域技术人员将认识到，像赖氨酸(K)和精氨酸(R)的残基不被典型地表征为疏水的，与Calpha、Cbeta、Cgamma、Cdelta和Cepsilon原子有关的含有疏水的特性对LCO结合性、选择性、杂交性、严格性和亲和性可能是重要的并且因此仍是潜在地重要的(例如，苜蓿属NFP疏水补丁的K157)。HvLysM-RLK2/37-247模型中鉴定的残基(图13C中粗体)可以是突变的，优选地用另外建模以获得工程化的LCO结合性、LCO/CO选择性、LCO杂交性、LCO严格性、LCO亲和性。本领域技术人员将认识到类似的结构建模可用于结构上比对LysM1结构域以鉴定区域II和IV，以便取代和改变用于激动剂的靶LysM受体的特异性、亲和性和选择性。
苜蓿属NFP胞外域晶体结构
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Figure BDA0003013375720001541
Figure BDA0003013375720001551
Figure BDA0003013375720001561
Figure BDA0003013375720001571
Figure BDA0003013375720001581
Figure BDA0003013375720001591
Figure BDA0003013375720001601
Figure BDA0003013375720001611
Figure BDA0003013375720001621
Figure BDA0003013375720001631
Figure BDA0003013375720001641
序列表
<110> 奥尔胡斯大学
<120> 具有改变的激动剂特异性和亲和性的基因改变的LysM受体
<130> 79454-20004.40
<140> 未分配
<141> 同此
<150> US 62/718,282
<151> 2018-08-13
<160> 106
<170> Windows版本4.0的FastSEQ
<210> 1
<211> 595
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 1
Met Ser Ala Phe Phe Leu Pro Ser Ser Ser His Ala Leu Phe Leu Val
1 5 10 15
Leu Met Leu Phe Phe Leu Thr Asn Ile Ser Ala Gln Pro Leu Tyr Ile
20 25 30
Ser Glu Thr Asn Phe Thr Cys Pro Val Asp Ser Pro Pro Ser Cys Glu
35 40 45
Thr Tyr Val Ala Tyr Arg Ala Gln Ser Pro Asn Phe Leu Ser Leu Ser
50 55 60
Asn Ile Ser Asp Ile Phe Asn Leu Ser Pro Leu Arg Ile Ala Lys Ala
65 70 75 80
Ser Asn Ile Glu Ala Glu Asp Lys Lys Leu Ile Pro Asp Gln Leu Leu
85 90 95
Leu Val Pro Val Thr Cys Gly Cys Thr Lys Asn His Ser Phe Ala Asn
100 105 110
Ile Thr Tyr Ser Ile Lys Gln Gly Asp Asn Phe Phe Ile Leu Ser Ile
115 120 125
Thr Ser Tyr Gln Asn Leu Thr Asn Tyr Leu Glu Phe Lys Asn Phe Asn
130 135 140
Pro Asn Leu Ser Pro Thr Leu Leu Pro Leu Asp Thr Lys Val Ser Val
145 150 155 160
Pro Leu Phe Cys Lys Cys Pro Ser Lys Asn Gln Leu Asn Lys Gly Ile
165 170 175
Lys Tyr Leu Ile Thr Tyr Val Trp Gln Asp Asn Asp Asn Val Thr Leu
180 185 190
Val Ser Ser Lys Phe Gly Ala Ser Gln Val Glu Met Leu Ala Glu Asn
195 200 205
Asn His Asn Phe Thr Ala Ser Thr Asn Arg Ser Val Leu Ile Pro Val
210 215 220
Thr Ser Leu Pro Lys Leu Asp Gln Pro Ser Ser Asn Gly Arg Lys Ser
225 230 235 240
Ser Ser Gln Asn Leu Ala Leu Ile Ile Gly Ile Ser Leu Gly Ser Ala
245 250 255
Phe Phe Ile Leu Val Leu Thr Leu Ser Leu Val Tyr Val Tyr Cys Leu
260 265 270
Lys Met Lys Arg Leu Asn Arg Ser Thr Ser Ser Ser Glu Thr Ala Asp
275 280 285
Lys Leu Leu Ser Gly Val Ser Gly Tyr Val Ser Lys Pro Thr Met Tyr
290 295 300
Glu Ile Asp Ala Ile Met Glu Gly Thr Thr Asn Leu Ser Asp Asn Cys
305 310 315 320
Lys Ile Gly Glu Ser Val Tyr Lys Ala Asn Ile Asp Gly Arg Val Leu
325 330 335
Ala Val Lys Lys Ile Lys Lys Asp Ala Ser Glu Glu Leu Lys Ile Leu
340 345 350
Gln Lys Val Asn His Gly Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Val Ser Ser
355 360 365
Asp Asn Asp Gly Asn Cys Phe Leu Val Tyr Glu Tyr Ala Glu Asn Gly
370 375 380
Ser Leu Glu Glu Trp Leu Phe Ser Glu Ser Ser Lys Thr Ser Asn Ser
385 390 395 400
Val Val Ser Leu Thr Trp Ser Gln Arg Ile Thr Ile Ala Met Asp Val
405 410 415
Ala Ile Gly Leu Gln Tyr Met His Glu His Thr Tyr Pro Arg Ile Ile
420 425 430
His Arg Asp Ile Thr Thr Ser Asn Ile Leu Leu Gly Ser Asn Phe Lys
435 440 445
Ala Lys Ile Ala Asn Phe Gly Met Ala Arg Thr Ser Thr Asn Ser Met
450 455 460
Met Pro Lys Ile Asp Val Phe Ala Phe Gly Val Val Leu Ile Glu Leu
465 470 475 480
Leu Thr Gly Lys Lys Ala Met Thr Thr Lys Glu Asn Gly Glu Val Val
485 490 495
Ile Leu Trp Lys Asp Phe Trp Lys Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asn Arg
500 505 510
Glu Glu Arg Leu Arg Lys Trp Met Asp Pro Lys Leu Glu Ser Phe Tyr
515 520 525
Pro Ile Asp Asn Ala Leu Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Asn Cys Thr
530 535 540
Ala Asp Lys Ser Leu Ser Arg Pro Thr Ile Ala Glu Ile Val Leu Cys
545 550 555 560
Leu Ser Leu Leu Asn Gln Pro Ser Ser Glu Pro Met Leu Glu Arg Ser
565 570 575
Leu Thr Ser Gly Leu Asp Ala Glu Ala Thr His Val Val Thr Ser Val
580 585 590
Ile Ala Arg
595
<210> 2
<211> 595
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 2
Met Ala Val Phe Phe Leu Thr Ser Gly Ser Leu Ser Leu Phe Leu Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Leu Phe Thr Asn Ile Ala Ala Arg Ser Glu Lys Ile Ser
20 25 30
Gly Pro Asp Phe Ser Cys Pro Val Asp Ser Pro Pro Ser Cys Glu Thr
35 40 45
Tyr Val Thr Tyr Thr Ala Gln Ser Pro Asn Leu Leu Ser Leu Thr Asn
50 55 60
Ile Ser Asp Ile Phe Asp Ile Ser Pro Leu Ser Ile Ala Arg Ala Ser
65 70 75 80
Asn Ile Asp Ala Gly Lys Asp Lys Leu Val Pro Gly Gln Val Leu Leu
85 90 95
Val Pro Val Thr Cys Gly Cys Ala Gly Asn His Ser Ser Ala Asn Thr
100 105 110
Ser Tyr Gln Ile Gln Leu Gly Asp Ser Tyr Asp Phe Val Ala Thr Thr
115 120 125
Leu Tyr Glu Asn Leu Thr Asn Trp Asn Ile Val Gln Ala Ser Asn Pro
130 135 140
Gly Val Asn Pro Tyr Leu Leu Pro Glu Arg Val Lys Val Val Phe Pro
145 150 155 160
Leu Phe Cys Arg Cys Pro Ser Lys Asn Gln Leu Asn Lys Gly Ile Gln
165 170 175
Tyr Leu Ile Thr Tyr Val Trp Lys Pro Asn Asp Asn Val Ser Leu Val
180 185 190
Ser Ala Lys Phe Gly Ala Ser Pro Ala Asp Ile Leu Thr Glu Asn Arg
195 200 205
Tyr Gly Gln Asp Phe Thr Ala Ala Thr Asn Leu Pro Ile Leu Ile Pro
210 215 220
Val Thr Gln Leu Pro Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ser Asn Gly Arg Lys
225 230 235 240
Ser Ser Ile His Leu Leu Val Ile Leu Gly Ile Thr Leu Gly Cys Thr
245 250 255
Leu Leu Thr Ala Val Leu Thr Gly Thr Leu Val Tyr Val Tyr Cys Arg
260 265 270
Arg Lys Lys Ala Leu Asn Arg Thr Ala Ser Ser Ala Glu Thr Ala Asp
275 280 285
Lys Leu Leu Ser Gly Val Ser Gly Tyr Val Ser Lys Pro Asn Val Tyr
290 295 300
Glu Ile Asp Glu Ile Met Glu Ala Thr Lys Asp Phe Ser Asp Glu Cys
305 310 315 320
Lys Val Gly Glu Ser Val Tyr Lys Ala Asn Ile Glu Gly Arg Val Val
325 330 335
Ala Val Lys Lys Ile Lys Glu Gly Gly Ala Asn Glu Glu Leu Lys Ile
340 345 350
Leu Gln Lys Val Asn His Gly Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Val Ser
355 360 365
Ser Gly Tyr Asp Gly Asn Cys Phe Leu Val Tyr Glu Tyr Ala Glu Asn
370 375 380
Gly Ser Leu Ala Glu Trp Leu Phe Ser Lys Ser Ser Gly Thr Pro Asn
385 390 395 400
Ser Leu Thr Trp Ser Gln Arg Ile Ser Ile Ala Val Asp Val Ala Val
405 410 415
Gly Leu Gln Tyr Met His Glu His Thr Tyr Pro Arg Ile Ile His Arg
420 425 430
Asp Ile Thr Thr Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser Asn Phe Lys Ala Lys
435 440 445
Ile Ala Asn Phe Ala Met Ala Arg Thr Ser Thr Asn Pro Met Met Pro
450 455 460
Lys Ile Asp Val Phe Ala Phe Gly Val Leu Leu Ile Glu Leu Leu Thr
465 470 475 480
Gly Arg Lys Ala Met Thr Thr Lys Glu Asn Gly Glu Val Val Met Leu
485 490 495
Trp Lys Asp Met Trp Glu Ile Phe Asp Ile Glu Glu Asn Arg Glu Glu
500 505 510
Arg Ile Arg Lys Trp Met Asp Pro Asn Leu Glu Ser Phe Tyr His Ile
515 520 525
Asp Asn Ala Leu Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Asn Cys Thr Ala Asp
530 535 540
Lys Ser Leu Ser Arg Pro Ser Met Ala Glu Ile Val Leu Ser Leu Ser
545 550 555 560
Phe Leu Thr Gln Gln Ser Ser Asn Pro Thr Leu Glu Arg Ser Leu Thr
565 570 575
Ser Ser Gly Leu Asp Val Glu Asp Asp Ala His Ile Val Thr Ser Ile
580 585 590
Thr Ala Arg
595
<210> 3
<211> 594
<212> PRT
<213> 豌豆
<400> 3
Met Ala Ile Phe Phe Leu Pro Ser Ser Ser His Ala Leu Phe Leu Ala
1 5 10 15
Leu Met Phe Phe Val Thr Asn Ile Ser Ala Gln Pro Leu Gln Leu Ser
20 25 30
Gly Thr Asn Phe Ser Cys Pro Val Asp Ser Pro Pro Ser Cys Glu Thr
35 40 45
Tyr Val Thr Tyr Phe Ala Arg Ser Pro Asn Phe Leu Ser Leu Thr Asn
50 55 60
Ile Ser Asp Ile Phe Asp Met Ser Pro Leu Ser Ile Ala Lys Ala Ser
65 70 75 80
Asn Ile Glu Asp Glu Asp Lys Lys Leu Val Glu Gly Gln Val Leu Leu
85 90 95
Ile Pro Val Thr Cys Gly Cys Thr Arg Asn Arg Tyr Phe Ala Asn Phe
100 105 110
Thr Tyr Thr Ile Lys Leu Gly Asp Asn Tyr Phe Ile Val Ser Thr Thr
115 120 125
Ser Tyr Gln Asn Leu Thr Asn Tyr Val Glu Met Glu Asn Phe Asn Pro
130 135 140
Asn Leu Ser Pro Asn Leu Leu Pro Pro Glu Ile Lys Val Val Val Pro
145 150 155 160
Leu Phe Cys Lys Cys Pro Ser Lys Asn Gln Leu Ser Lys Gly Ile Lys
165 170 175
His Leu Ile Thr Tyr Val Trp Gln Ala Asn Asp Asn Val Thr Arg Val
180 185 190
Ser Ser Lys Phe Gly Ala Ser Gln Val Asp Met Phe Thr Glu Asn Asn
195 200 205
Gln Asn Phe Thr Ala Ser Thr Asn Val Pro Ile Leu Ile Pro Val Thr
210 215 220
Lys Leu Pro Val Ile Asp Gln Pro Ser Ser Asn Gly Arg Lys Asn Ser
225 230 235 240
Thr Gln Lys Pro Ala Phe Ile Ile Gly Ile Ser Leu Gly Cys Ala Phe
245 250 255
Phe Val Val Val Leu Thr Leu Ser Leu Val Tyr Val Tyr Cys Leu Lys
260 265 270
Met Lys Arg Leu Asn Arg Ser Thr Ser Leu Ala Glu Thr Ala Asp Lys
275 280 285
Leu Leu Ser Gly Val Ser Gly Tyr Val Ser Lys Pro Thr Met Tyr Glu
290 295 300
Met Asp Ala Ile Met Glu Ala Thr Met Asn Leu Ser Glu Asn Cys Lys
305 310 315 320
Ile Gly Glu Ser Val Tyr Lys Ala Asn Ile Asp Gly Arg Val Leu Ala
325 330 335
Val Lys Lys Ile Lys Lys Asp Ala Ser Glu Glu Leu Lys Ile Leu Gln
340 345 350
Lys Val Asn His Gly Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Val Ser Ser Asp
355 360 365
Asn Asp Gly Asn Cys Phe Leu Val Tyr Glu Tyr Ala Glu Asn Gly Ser
370 375 380
Leu Asp Glu Trp Leu Phe Ser Glu Ser Ser Lys Thr Ser Asn Ser Val
385 390 395 400
Val Ser Leu Thr Trp Ser Gln Arg Ile Thr Val Ala Val Asp Val Ala
405 410 415
Val Gly Leu Gln Tyr Met His Glu His Thr Tyr Pro Arg Ile Ile His
420 425 430
Arg Asp Ile Thr Thr Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser Asn Phe Lys Ala
435 440 445
Lys Ile Ala Asn Phe Ser Met Ala Arg Thr Ser Thr Asn Ser Met Met
450 455 460
Pro Lys Ile Asp Val Phe Ala Phe Gly Val Val Leu Ile Glu Leu Leu
465 470 475 480
Thr Gly Lys Lys Ala Ile Thr Thr Met Glu Asn Gly Glu Val Val Ile
485 490 495
Leu Trp Lys Asp Phe Trp Lys Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asn Arg Glu
500 505 510
Glu Ser Leu Arg Lys Trp Met Asp Pro Lys Leu Glu Asn Phe Tyr Pro
515 520 525
Ile Asp Asn Ala Leu Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Asn Cys Thr Ala
530 535 540
Asp Lys Ser Leu Ser Arg Pro Ser Ile Ala Glu Ile Val Leu Cys Leu
545 550 555 560
Ser Leu Leu Asn Gln Ser Ser Ser Glu Pro Met Leu Glu Arg Ser Leu
565 570 575
Thr Ser Gly Leu Asp Val Glu Ala Thr His Val Val Thr Ser Ile Val
580 585 590
Ala Arg
<210> 4
<211> 598
<212> PRT
<213> 大豆
<400> 4
Met Ala Val Phe Phe Pro Phe Leu Pro Leu His Ser Gln Ile Leu Cys
1 5 10 15
Leu Val Ile Met Leu Phe Ser Thr Asn Ile Val Ala Gln Ser Gln Gln
20 25 30
Asp Asn Arg Thr Asn Phe Ser Cys Pro Ser Asp Ser Pro Pro Ser Cys
35 40 45
Glu Thr Tyr Val Thr Tyr Ile Ala Gln Ser Pro Asn Phe Leu Ser Leu
50 55 60
Thr Asn Ile Ser Asn Ile Phe Asp Thr Ser Pro Leu Ser Ile Ala Arg
65 70 75 80
Ala Ser Asn Leu Glu Pro Met Asp Asp Lys Leu Val Lys Asp Gln Val
85 90 95
Leu Leu Val Pro Val Thr Cys Gly Cys Thr Gly Asn Arg Ser Phe Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Tyr Glu Ile Asn Gln Gly Asp Ser Phe Tyr Phe Val Ala
115 120 125
Thr Thr Ser Tyr Glu Asn Leu Thr Asn Trp Arg Ala Val Met Asp Leu
130 135 140
Asn Pro Val Leu Ser Pro Asn Lys Leu Pro Ile Gly Ile Gln Val Val
145 150 155 160
Phe Pro Leu Phe Cys Lys Cys Pro Ser Lys Asn Gln Leu Asp Lys Glu
165 170 175
Ile Lys Tyr Leu Ile Thr Tyr Val Trp Lys Pro Gly Asp Asn Val Ser
180 185 190
Leu Val Ser Asp Lys Phe Gly Ala Ser Pro Glu Asp Ile Met Ser Glu
195 200 205
Asn Asn Tyr Gly Gln Asn Phe Thr Ala Ala Asn Asn Leu Pro Val Leu
210 215 220
Ile Pro Val Thr Arg Leu Pro Val Leu Ala Arg Ser Pro Ser Asp Gly
225 230 235 240
Arg Lys Gly Gly Ile Arg Leu Pro Val Ile Ile Gly Ile Ser Leu Gly
245 250 255
Cys Thr Leu Leu Val Leu Val Leu Ala Val Leu Leu Val Tyr Val Tyr
260 265 270
Cys Leu Lys Met Lys Thr Leu Asn Arg Ser Ala Ser Ser Ala Glu Thr
275 280 285
Ala Asp Lys Leu Leu Ser Gly Val Ser Gly Tyr Val Ser Lys Pro Thr
290 295 300
Met Tyr Glu Thr Asp Ala Ile Met Glu Ala Thr Met Asn Leu Ser Glu
305 310 315 320
Gln Cys Lys Ile Gly Glu Ser Val Tyr Lys Ala Asn Ile Glu Gly Lys
325 330 335
Val Leu Ala Val Lys Arg Phe Lys Glu Asp Val Thr Glu Glu Leu Lys
340 345 350
Ile Leu Gln Lys Val Asn His Gly Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Val
355 360 365
Ser Ser Asp Asn Asp Gly Asn Cys Phe Val Val Tyr Glu Tyr Ala Glu
370 375 380
Asn Gly Ser Leu Asp Glu Trp Leu Phe Ser Lys Ser Cys Ser Asp Thr
385 390 395 400
Ser Asn Ser Arg Ala Ser Leu Thr Trp Cys Gln Arg Ile Ser Met Ala
405 410 415
Val Asp Val Ala Met Gly Leu Gln Tyr Met His Glu His Ala Tyr Pro
420 425 430
Arg Ile Val His Arg Asp Ile Thr Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser
435 440 445
Asn Phe Lys Ala Lys Ile Ala Asn Phe Ser Met Ala Arg Thr Phe Thr
450 455 460
Asn Pro Met Met Pro Lys Ile Asp Val Phe Ala Phe Gly Val Val Leu
465 470 475 480
Ile Glu Leu Leu Thr Gly Arg Lys Ala Met Thr Thr Lys Glu Asn Gly
485 490 495
Glu Val Val Met Leu Trp Lys Asp Ile Trp Lys Ile Phe Asp Gln Glu
500 505 510
Glu Asn Arg Glu Glu Arg Leu Lys Lys Trp Met Asp Pro Lys Leu Glu
515 520 525
Ser Tyr Tyr Pro Ile Asp Tyr Ala Leu Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val
530 535 540
Asn Cys Thr Ala Asp Lys Ser Leu Ser Arg Pro Thr Ile Ala Glu Ile
545 550 555 560
Val Leu Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Pro Ser Pro Ala Thr Leu Glu
565 570 575
Arg Ser Leu Thr Ser Ser Gly Leu Asp Val Glu Ala Thr Gln Ile Val
580 585 590
Thr Ser Ile Ala Ala Arg
595
<210> 5
<211> 557
<212> PRT
<213> 鹰嘴豆
<400> 5
Met Ser Val Phe Phe Leu Pro Ser Arg Ser His Val Leu Phe Leu Ala
1 5 10 15
Leu Met Leu Phe Leu Thr Asn Ile Ser Ala Gln Ser Gln His Leu Ser
20 25 30
Gly Thr Asn Phe Ser Cys Pro Val Asp Ser Pro Pro Ser Cys Glu Thr
35 40 45
Tyr Val Thr Tyr Ile Ala Gln Ser Pro Asn Phe Leu Ser Leu Thr Asn
50 55 60
Ile Ser Asp Leu Phe Asp Ile Ser Pro Leu Ser Ile Ala Arg Ala Ser
65 70 75 80
Asn Ile Asp Asp Glu Asp Lys Glu Leu Ile Pro Gly Gln Val Leu Leu
85 90 95
Val Pro Val Thr Cys Gly Cys Thr Lys His Arg Ser Phe Ala Asn Asn
100 105 110
Thr Tyr Thr Ile Lys Leu Gly Asp Ser Tyr Ile Leu Val Ser Thr Thr
115 120 125
Ser Tyr Gln Asn Leu Thr Asn Tyr Leu Glu Met Glu Asp Ser Asn Pro
130 135 140
Gly Leu Asn Pro Asn Leu Ile Pro Pro Phe Ile Lys Val Val Val Pro
145 150 155 160
Ile Phe Cys Arg Cys Pro Ser Lys Thr Gln Leu Asn Lys Gly Ile Lys
165 170 175
Tyr Leu Ile Thr Tyr Val Trp His Ala Asn Asp Asn Val Ser Thr Val
180 185 190
Ser Ser Lys Phe Gly Ala Ser Gln Val Asp Ile Leu Thr Glu Asn Asn
195 200 205
Tyr Asn Gln Asn Phe Ala Ser Ala Ala Asn Leu Pro Val Leu Ile Pro
210 215 220
Val Thr Arg Leu Pro Ile Leu Ala Gln Pro Ser Ser Asn Gly Arg Lys
225 230 235 240
Arg Ser Ile Gln Leu Pro Val Ile Ile Asp Lys Leu Leu Ser Gly Val
245 250 255
Ser Gly Tyr Val Ser Lys Pro Thr Met Tyr Glu Met Asp Val Ile Met
260 265 270
Glu Ala Thr Met Asn Leu Ser Asp Gln Cys Lys Ile Gly Glu Ser Val
275 280 285
Tyr Lys Ala Asn Ile Asp Gly Lys Val Leu Ala Val Lys Lys Thr Lys
290 295 300
Lys Asp Ala Ser Glu Glu Leu Lys Ile Leu Gln Lys Val Asn His Gly
305 310 315 320
Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Val Ser Ser Asp Asn Glu Gly Asn Cys
325 330 335
Phe Leu Val Tyr Glu Tyr Ala Glu Asn Gly Ser Leu Asp Glu Trp Leu
340 345 350
Phe Leu Glu Ser Ser Lys Thr Ser Asp Ser Thr Val Ser Leu Thr Trp
355 360 365
Ser Gln Arg Ile Gly Ile Ala Val Asp Val Ala Val Gly Leu Gln Tyr
370 375 380
Met His Glu His Thr Tyr Pro Arg Ile Ile His Arg Asp Ile Thr Thr
385 390 395 400
Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ala Asn Phe Lys Ala Lys Ile Ala Asn Phe
405 410 415
Ser Met Ala Arg Thr Ser Thr Asn Pro Met Met Pro Lys Ile Asp Val
420 425 430
Phe Ala Phe Gly Val Val Leu Ile Glu Leu Leu Thr Gly Lys Lys Gly
435 440 445
Val Thr Thr Lys Glu Asn Gly Glu Val Val Ile Met Trp Lys Asp Phe
450 455 460
Trp Met Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asn Lys Glu Glu Arg Leu Arg Lys
465 470 475 480
Trp Met Asp Pro Lys Leu Glu Asn Phe Tyr Pro Ile Asp Asn Ala Leu
485 490 495
Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Asn Cys Thr Ala Asp Lys Ser Leu Ser
500 505 510
Arg Pro Thr Ile Glu Glu Ile Val Leu Cys Leu Asn Leu Leu Asn Gln
515 520 525
Pro Ser Ser Glu Pro Thr Leu Glu Arg Ser Leu Thr Phe Gly Leu Asp
530 535 540
Val Glu Asp Thr Gln Ile Val Thr Ser Ile Ala Ala Arg
545 550 555
<210> 6
<211> 2144
<212> DNA
<213> 鹰嘴豆
<400> 6
ttgaaccttc gagctcttgc atataactta ttcaatgtca ctagccaaat tactactgag 60
atttaaacat aagtaatcta tttttttata tgacaggact ttttgataga ggaagaaaat 120
gattggtatg cgaaaagata ttttattgac aacaaatgct ccatatcacc aatgctaagt 180
tcctgcatta agaaacactc ttctctcttc ccctcataat aacttccatt tcttcacaac 240
tttcacaaaa tgtctgtctt ctttcttccc tctagatctc atgttctttt tcttgcactc 300
atgttgtttc tcactaacat ctcagctcaa tcacaacacc tcagtggaac aaacttttca 360
tgccctgtgg attcacctcc ttcatgtgaa acttatgtga catacattgc tcagtctcca 420
aattttttaa gcctaacaaa catatctgat ttatttgata tcagtccttt atccatcgca 480
agagcgagta acatagacga cgaggataaa gagctgatac caggtcaagt cttattagta 540
cctgtaactt gtggctgcac taaacatcgc tctttcgcca ataacaccta cacgatcaag 600
ctcggcgaca gctacattct agtttcaacc acttcatatc agaatctcac caattatctt 660
gaaatggaag attccaaccc tggtctaaat cctaatctta ttccaccatt catcaaagtt 720
gtagtcccaa tattctgcag gtgcccttca aagactcagc tgaacaaagg aataaagtat 780
ctgataactt acgtgtggca cgctaacgac aatgtttcaa ctgtaagttc caaatttggt 840
gcatcacaag ttgatatatt gactgaaaac aattacaatc aaaactttgc ttctgcagcc 900
aaccttccag ttttgattcc tgtgacaagg ttacctattc tagctcaacc gtcttcgaat 960
ggaagaaaga gaagcattca acttcctgtt ataattggta ttagtatagg aagtgctttt 1020
ttcgttacag ttttaacagt atcacttgtg tatttatact gtctgaaaat gaagagattg 1080
aataggactg cttctttatc tgagactgca gataagttac tttcaggagt ttcgggttac 1140
gtaagcaagc caacaatgta tgaaatggat gtgatcatgg aagctacaat gaacctgagt 1200
gaccaatgta agattggtga atcagtttat aaggctaata tagatggtaa agttttagca 1260
gtgaaaaaaa ctaagaaaga tgcttctgag gagctgaaaa ttctgcagaa ggtaaatcat 1320
ggaaatctgg tgaaactaat gggtgtgtct tcggacaacg agggtaactg ttttctggtt 1380
tatgagtatg ctgaaaatgg ttctcttgat gaatggttgt tcttggaatc ttcgaaaact 1440
tcggattcga cagtctccct tacatggtct cagagaatag gcatagcagt ggatgttgca 1500
gttggtctgc aatacatgca tgaacatact tatccaagga taatccacag agacatcaca 1560
acaagtaata tccttctcga cgcgaacttt aaggccaaga tagcgaattt ttcgatggct 1620
agaacttcaa ccaacccgat gatgccgaaa atagatgttt tcgcttttgg ggtggttctg 1680
atagagttgc taaccggaaa aaaaggcgta acaacgaaag aaaatggtga ggttgttatt 1740
atgtggaagg atttttggat gatttttgat ctagaaggga ataaagaaga gaggctaaga 1800
aaatggatgg atcctaagtt agaaaacttt tatcctatag ataatgctct tagtttggct 1860
tctttggcag tgaattgcac tgctgataaa tcattgtcaa gaccaactat tgaagaaatt 1920
gttctttgtc ttaaccttct caatcaacca tcatctgaac caacattaga aagatctttg 1980
acatttgggt tagatgttga agatactcaa attgttactt ctatagcagc tcgttgatca 2040
agtgaagata atattaattc tgttttcttt catattgaag atggtacttt gtttacatga 2100
taactatatt tttatgcgtg gaagtatatg gttagtttaa ttaa 2144
<210> 7
<211> 597
<212> PRT
<213> 菜豆
<400> 7
Met Ala Val Phe Phe Val Ser Leu Thr Leu Gly Ala Gln Ile Leu Tyr
1 5 10 15
Val Val Leu Met Phe Phe Thr Cys Ile Glu Ala Gln Ser Gln Gln Thr
20 25 30
Asn Gly Thr Asn Phe Ser Cys Pro Ser Asn Ser Pro Pro Ser Cys Glu
35 40 45
Thr Tyr Val Thr Tyr Ile Ser Gln Ser Pro Asn Phe Leu Ser Leu Thr
50 55 60
Ser Val Ser Asn Ile Phe Asp Thr Ser Pro Leu Ser Ile Ala Arg Ala
65 70 75 80
Ser Asn Leu Gln His Glu Glu Asp Lys Leu Ile Pro Gly Gln Val Leu
85 90 95
Leu Ile Pro Val Thr Cys Gly Cys Thr Gly Asn Arg Ser Phe Ala Asn
100 105 110
Ile Ser Tyr Glu Ile Asn Gln Gly Asp Ser Phe Tyr Phe Val Ala Thr
115 120 125
Thr Leu Tyr Gln Asn Leu Thr Asn Trp His Ala Val Met Asp Leu Asn
130 135 140
Pro Gly Leu Ser Pro Phe Thr Leu Pro Ile Gly Ile Gln Val Val Ile
145 150 155 160
Pro Leu Phe Cys Lys Cys Pro Ser Lys Asn Gln Leu Asp Arg Gly Ile
165 170 175
Lys Tyr Leu Ile Thr His Val Trp Gln Pro Asn Asp Asn Val Ser Phe
180 185 190
Val Ser Asn Lys Leu Gly Ala Ser Pro Gln Asp Ile Leu Ser Glu Asn
195 200 205
Asn Tyr Gly Gln Asn Phe Thr Ala Ala Ser Asn Leu Pro Val Leu Ile
210 215 220
Pro Val Thr Leu Leu Pro Asp Leu Ile Gln Ser Pro Ser Asp Gly Arg
225 230 235 240
Lys His Arg Ile Gly Leu Pro Val Ile Ile Gly Ile Ser Leu Gly Cys
245 250 255
Thr Leu Leu Val Val Val Ser Ala Ile Leu Leu Val Cys Val Cys Cys
260 265 270
Leu Lys Met Lys Ser Leu Asn Arg Ser Ala Ser Ser Ala Glu Thr Ala
275 280 285
Asp Lys Leu Leu Ser Gly Val Ser Gly Tyr Val Ser Lys Pro Thr Met
290 295 300
Tyr Glu Thr Gly Ala Ile Leu Glu Ala Thr Met Asn Leu Ser Glu Gln
305 310 315 320
Cys Lys Ile Gly Glu Ser Val Tyr Lys Ala Asn Ile Glu Gly Lys Val
325 330 335
Leu Ala Val Lys Arg Phe Lys Glu Asp Val Thr Glu Glu Leu Lys Ile
340 345 350
Leu Gln Lys Val Asn His Gly Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Val Ser
355 360 365
Ser Asp Asn Asp Gly Asn Cys Phe Val Val Tyr Glu Tyr Ala Glu Asn
370 375 380
Gly Ser Leu Gln Glu Trp Leu Phe Ala Lys Ser Cys Ser Glu Thr Leu
385 390 395 400
Asn Ser Arg Thr Ser Leu Thr Trp Cys Gln Arg Ile Ser Ile Ala Val
405 410 415
Asp Val Ser Met Gly Leu Gln Tyr Met His Glu His Ala Tyr Pro Arg
420 425 430
Ile Val His Arg Asp Ile Thr Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser Asn
435 440 445
Phe Lys Ala Lys Ile Ala Asn Phe Ser Met Ala Arg Thr Phe Thr Asn
450 455 460
Pro Met Met Ser Lys Ile Asp Val Phe Ala Phe Gly Val Val Leu Ile
465 470 475 480
Glu Leu Leu Thr Gly Arg Lys Ala Met Thr Thr Lys Glu Asn Gly Glu
485 490 495
Val Val Met Leu Trp Thr Asp Ile Trp Lys Ile Phe Asp Gln Glu Glu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Arg Leu Arg Lys Trp Met Asp Pro Lys Leu Asp Asn
515 520 525
Tyr Tyr Pro Ile Asp Tyr Ala Leu Ser Leu Ala Ser Leu Ala Met Asn
530 535 540
Cys Thr Ala Asp Lys Ser Leu Ser Arg Pro Thr Ile Ala Glu Ile Val
545 550 555 560
Leu Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Pro Ser Pro Ala Thr Leu Glu Arg
565 570 575
Ser Leu Thr Ser Ser Gly Leu Asp Val Glu Ala Thr Gln Ile Val Thr
580 585 590
Ser Ile Ser Ala Arg
595
<210> 8
<211> 2192
<212> DNA
<213> 菜豆
<400> 8
ggaaatttag ttaaagctaa tgacacaaac aggaccatat ttttatatta agccaaaaga 60
tatttttatt gacaaagaac tacatatcaa caacgacgat tgccagtgat agtagactgc 120
ctcataactt tcatttgttc acaacttcac atcaatggct gtcttctttg tttctcttac 180
tcttggtgct cagattcttt atgtggtact catgtttttc acttgtattg aagctcaatc 240
acaacagacc aatggaacaa acttttcatg cccttccaat tcacctcctt catgtgaaac 300
ctatgtgaca tacatatccc agtcgccaaa ttttttgagt ctgaccagcg tatctaatat 360
atttgacacg agtcctttgt caattgccag agccagcaac ttacagcatg aggaagacaa 420
gttgattcca ggccaagtct tactgatacc agtaacctgt ggttgcactg gaaaccgctc 480
tttcgccaac atctcctatg agatcaacca aggtgatagc ttctactttg ttgcgaccac 540
tttataccag aatctcacaa attggcatgc agtgatggat ttaaacccag gtctaagtcc 600
atttactttg ccaataggca tccaagttgt aattccttta ttctgcaagt gtccttcaaa 660
gaaccagctg gatagaggga taaagtacct gatcactcac gtctggcagc ccaatgacaa 720
tgtttccttt gtaagtaaca agttaggtgc atcaccacag gacatattga gtgaaaacaa 780
ctatggtcaa aacttcactg ccgcaagcaa ccttccagtt ttgatcccag ttacactctt 840
gccagatctt attcaatctc cttcagatgg aagaaaacac agaattggtc ttccagttat 900
aattggtatc agcctgggat gcacactact ggttgtggtt tcagcaatat tactggtgtg 960
tgtatgttgt ctgaaaatga agagtttgaa taggagtgct tcatcagctg aaactgcaga 1020
taaactactt tctggagttt caggctatgt aagtaagcct acaatgtatg aaactggtgc 1080
aatattggaa gctactatga acctcagtga gcagtgcaag attggggaat cagtgtacaa 1140
ggctaacata gagggtaagg ttttagcagt aaaaagattc aaggaagatg tcacggagga 1200
gctgaaaatt ctgcagaagg tgaatcatgg aaatctggtg aaactaatgg gtgtctcatc 1260
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ttatccaaga atagtccaca gggacatcac aagcagtaat atccttcttg actccaactt 1500
taaggccaag atagcaaatt tctccatggc cagaactttt accaacccca tgatgtcaaa 1560
aatagatgta tttgcttttg gggtggttct gatagaattg cttactggca ggaaagccat 1620
gacaaccaaa gaaaatggtg aggtggttat gctgtggacg gacatttgga agatctttga 1680
tcaagaagag aatagagagg agaggctcag aaaatggatg gatcctaagt tagataatta 1740
ttatcctatt gattatgctc tcagcttggc ctccttggca atgaattgca ctgcagacaa 1800
gtctttgtcc agaccaacca tagcagaaat tgtccttagt ctctcccttc tcactcaacc 1860
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agatggtact tttttttaaa taatgattgc accttagtca ataatgatga acttggggag 2040
ttttcaacat ttagtgtttc catccctgtt gttctttatg tttgaggtag agttcgtaaa 2100
acgaatagca attgcagttc tcctcagact aaatttgctt atttctctgt acttctttta 2160
tatgacaatt gaaagtgaat caaatgatgg ag 2192
<210> 9
<211> 595
<212> PRT
<213> 花生亚种花生
<400> 9
Met Ala Phe Phe Leu Pro Ser Leu Ser Ser Ser Ile Phe Leu Ala Phe
1 5 10 15
Met Leu Phe Ser Val Thr Ser Ile Pro Thr Gln Ser Gln Gln Val Asn
20 25 30
Gly Thr Asp Phe Ser Cys Pro Val Asp Ser Pro Ser Ser Cys Gly Thr
35 40 45
Tyr Val Thr Tyr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Phe Leu Ser Leu Ser Asn
50 55 60
Ile Ser Asp Ile Phe Asp Thr Ser Pro Leu Ser Ile Ala Arg Ala Ser
65 70 75 80
Asn Ile Lys Asn Glu Gly Asp Lys Leu Val Pro Gly Gln Val Leu Leu
85 90 95
Ile Pro Val Thr Cys Gly Cys Thr Gln Asn Gln Ser Phe Ala Asn Ile
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Thr Tyr Glu Leu Arg Gln Gly Asp Val Tyr Asp Ile Val Ser Lys Thr
115 120 125
Thr Tyr Glu Asn Leu Thr Asn Trp Arg Ala Val Asn Asn Ser Asn Pro
130 135 140
Asp Leu Asn Pro Val Leu Leu Pro Ile Gly Val Lys Val Leu Phe Pro
145 150 155 160
Leu Phe Cys Arg Cys Pro Ser Lys Lys Gln Leu Gln Lys Gly Ile Glu
165 170 175
Tyr Met Ile Thr Tyr Val Trp Gln Asn Asn Asp Asn Val Ser Ser Val
180 185 190
Ala Ala Lys Phe Gly Ala Ser Pro Val Asp Ile Leu Ser Glu Asn Asn
195 200 205
Tyr Gly Gly Asn Phe Thr Ala Ala Thr Tyr Leu Pro Val Leu Ile Pro
210 215 220
Val Thr Lys Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Glu Ala Ser His Gly Arg
225 230 235 240
Lys Arg Ser Ile Gln Ile Pro Val Ile Ile Ser Ile Ser Leu Gly Phe
245 250 255
Thr Leu Val Val Ala Val Ile Val Ile Ser Met Val Tyr Ala Tyr Leu
260 265 270
Tyr Gln Arg Lys Arg Thr Leu Asn Arg Gly Asp Leu Ser Ala Gly Thr
275 280 285
Ala Asp Lys Leu Leu Ser Gly Val Ser Gly Tyr Val Ser Lys Pro Thr
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Val Tyr Glu Ala Asn Glu Val Ile Lys Ala Thr Met Asn Leu Ser Gly
305 310 315 320
Gln Cys Lys Leu Gly Gly Thr Val Tyr Lys Ala Lys Ile Glu Gly Gln
325 330 335
Val Leu Ala Val Lys Lys Val Asn Gln Val Val Ser Glu Glu Leu Asn
340 345 350
Ile Leu Gln Lys Val Asn His Gly Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Val
355 360 365
Ser Ser Asp Ser Asp Gly Asn His Phe Leu Val Tyr Glu Tyr Ala Asp
370 375 380
Asn Gly Ser Leu Asp Gly Trp Leu Phe Ser Lys Leu Ser Leu Lys Ala
385 390 395 400
Ser Leu Thr Trp Tyr Gln Arg Ile Asn Ile Ala Leu Asp Val Ala Met
405 410 415
Gly Leu Gln Tyr Leu His Glu His Thr Tyr Pro Arg Ile Val His Arg
420 425 430
Asp Ile Thr Thr Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser Asn Phe Lys Ala Lys
435 440 445
Ile Gly Asn Phe Ser Met Val Arg Thr Thr Thr Asn Pro Met Ile Ser
450 455 460
Lys Ile Asp Val Phe Ala Phe Gly Ala Val Leu Ile Glu Leu Leu Thr
465 470 475 480
Gly Met Lys Ala Met Thr Thr Lys Ala Asp Gly Glu Val Val Met Leu
485 490 495
Trp Lys Asp Ile Arg Lys Met Phe Glu Val Glu Asp Glu Lys Glu Lys
500 505 510
Glu Glu Cys Leu Arg Arg Trp Met Asp Pro Lys Leu Glu Cys Leu Tyr
515 520 525
Pro Val Asp Tyr Ala Leu Ser Leu Ala Thr Leu Ala Ala Asn Cys Thr
530 535 540
Ala Asp Val Ser Leu Ser Arg Pro Thr Met Ala Glu Val Val Leu Gly
545 550 555 560
Leu Ser Leu Leu Thr Gln Pro Ser Gln Ala Ala Leu Glu Arg Ser Leu
565 570 575
Thr Ser Ser Ala Leu Glu Ala Glu Val Thr His Val Ala Thr Ser Ile
580 585 590
Thr Ala Arg
595
<210> 10
<211> 2683
<212> DNA
<213> 花生亚种花生
<400> 10
atctttctct taacagtagt agctagatta cagaatctct tattctattg ttttcgatta 60
gattagatgg aatcacgtat atgaaccgac accgtgaagc atgaaagccg cactcaaata 120
ttcaagaagg ctatttcaaa aatatgaaac cagggaaaaa atgcaagtgt aaaataatgc 180
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cttttagcac gtataaatct tgtggagaca ctacatttta aggcgtggtc tagtgataga 300
tagacatgga attggcatca gaattttctc ttatgatgtc tcaaattgga gattctttgc 360
atataagtta aaaatgacca tcctggaatc ttcattggca ttttattata ctctgctgtg 420
cgcatgaata gcatactatt gatatatgta aagtcaatgt tttccttaac atataatctt 480
agacttactt ggaaatttga tatcactgca taaataatta ggaatagata tggtaaaaca 540
gtataccaat aactcttctg ttaaaccaaa gggtatttta ttgacaaaga atcctccata 600
tcaccaaaaa tcctgagtgt ctttgacttc tgataataaa agtttccttt atgttctttc 660
cctccttctc aacttcagaa aaatggcttt ctttctaccc tctctctcaa gtagtatttt 720
tcttgtattc atgttctcca tcaccagcat cccaactcaa tcacaacagg ttaatggaac 780
agacttttca tgcccagtgg attcaccttc ttcctgtgga acatatgtga catacatcgc 840
taaatctcca aacttcttga gcctttctaa catatctgac atatttgaca ccagcccttt 900
atccattgca agagcaagta acataaagaa tgagggtgac aagctggttc caggccaagt 960
cttactgata cctgtcactt gtggttgcac tcaaaaccaa tctttcgcca atatcaccta 1020
tgagctaagg cagggtgata tgtacgactt tgtctcaaaa acaacatatg agaatctcac 1080
aaattggcgt gctgtcaacg attcaaaccc agatttgaat ccagttctgc tgccagtagg 1140
tgtgaaagta ttgttccctt tattctgcag gtgcccttct aagaagcagt tacaaaaagg 1200
gatagaatat atgatcacct atgtgtggca gaacaatgac aatgtttcct ctgtagcagc 1260
caagtttggt gcatcggcag tggacatatt gtccgaaaac aactatggtg gaaacttcac 1320
agctgcaacc tatcttccgg ttttgattcc tgtgacgaag ttgccggttc ttactcaacc 1380
cgagccttca catggaagaa agagaagcat tcaaatccct gttataatca gtattagcct 1440
ggggttcacc cttgttgttg ctgttatagt aatatcaatg gtttatgctt atctttatca 1500
gagaaagagg actttgaata ggagagactc atctgctggg acagcagata agctactctc 1560
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caccatgaat ctcagcgaac agtgcaagct tgggggcaca gtttacaagg ccaaaataga 1680
agggcaggtc ttggcagtga aaaaagtgaa tcaagtagtt tctgaggagc tgaatattct 1740
gcagaaggtg aatcatggaa acctggtgaa actgatgggt gtatcttcag acagtgatgg 1800
aaaccatttc ctggtttatg agtatgctga taacgggtcc cttgatgggt ggctcttctc 1860
caagttgtct ttgaaggcct cgcttacatg gtatcagagg attaacatag cattggatgt 1920
tgccatgggt ctgcaatact tgcatgagca cacttatcca agaatagtcc atagggacat 1980
cacaacaagt aacatccttc ttgactccaa cttcaaggcc aagataggga acttctccat 2040
ggtcagaact actacaaatc ccatgatttc caagatcgat gtctttgctt tcggggttgt 2100
tctgattgag ttgcttacag gcaggaaagc catgacaaca aaggcagatg gtgaggtagt 2160
aatgctgtgg aaggatatta ggaagatgtt tgaagtggaa gatgaaaagg aaaaggagga 2220
atgtctgaga agatggatgg atcctaagct agagtgcctt taccctgtgg attatgctct 2280
cagcttggcc acgttggccg cgaattgcac ggcggatgta tcattgtcta gaccaaccat 2340
ggcagaagtt gttcttggcc tctcccttct cactcaacca tctcaagctg cactagagag 2400
atcattgact tcttctgcgt tggaagcaga ggttactcat gtggctactc ccatagcagc 2460
acgttaattg gtgacgaaag taattcagtt tctcaggttc aagagagtgt tttcttcaca 2520
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tttgtttcat cccttatatt ctttatctgt ttgtagtcga ggaatgactg cttatttctc 2640
tcaagttgac atatatgata tatataacaa aaagaatatt ttg 2683
<210> 11
<211> 591
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 11
Met Thr Ser Phe Phe Leu Phe Thr Asn Thr Leu Phe Leu Ala Leu Met
1 5 10 15
Met Phe Phe Ser Thr Thr His His Ile Leu Ala Gln Leu Ser His Thr
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Asn Gly Thr Asn Phe Ser Cys Pro Val Asp Ser Pro Pro Ser Cys Asp
35 40 45
Thr Tyr Val Thr Tyr Phe Ala Gln Ser Pro Asn Phe Leu Thr Leu Thr
50 55 60
Ser Ile Ser Asp Leu Phe Asp Thr Ser Pro Leu Ser Ile Ala Arg Ala
65 70 75 80
Ser Asn Ile Lys Asp Glu Asn Gln Asn Leu Val Pro Gly Gln Leu Leu
85 90 95
Leu Val Pro Val Thr Cys Ala Cys Ser Gly Ser Asn Ser Phe Ser Asn
100 105 110
Ile Ser His Met Ile Lys Glu Gly Glu Ser Tyr Tyr Tyr Leu Ser Thr
115 120 125
Thr Ser Tyr Glu Asn Leu Thr Asn Trp Glu Thr Val Gln Asp Ser Asn
130 135 140
Pro Asn Tyr Asn Pro Tyr Leu Leu Pro Val Gly Ile Lys Val Val Ile
145 150 155 160
Pro Leu Phe Cys Lys Cys Pro Ser Asn Tyr His Leu Asn Lys Gly Ile
165 170 175
Glu Tyr Leu Ile Thr Tyr Val Trp His Asn Asn Asp Asn Val Ser Leu
180 185 190
Val Ala Ser Lys Phe Gly Val Ser Thr Gln Asp Ile Ile Ser Glu Asn
195 200 205
Asn Phe Ser His Gln Asn Phe Thr Ala Ala Thr Asn Phe Pro Ile Leu
210 215 220
Ile Pro Val Thr Gln Leu Pro Ser Leu Ser Gln Ser Tyr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Glu Arg Lys Arg Ser Asn His Ile His Ile Ile Ile Ser Ile Gly Ile
245 250 255
Ser Leu Gly Ser Thr Leu Leu Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Ser Val
260 265 270
Thr Cys Leu Arg Lys Arg Lys Ser Ser Glu Asn Lys Ser Leu Leu Ser
275 280 285
Val Glu Ile Ala Gly Lys Lys Leu Ile Ser Gly Val Ser Asn Tyr Val
290 295 300
Ser Lys Ser Ile Leu Tyr Glu Phe Arg Leu Ile Met Glu Ala Thr Leu
305 310 315 320
Asn Leu Asn Glu Gln Cys Lys Ile Gly Glu Ser Val Tyr Lys Ala Lys
325 330 335
Leu Asp Gly Gln Val Leu Ala Val Lys Lys Val Lys Glu Asp Val Thr
340 345 350
Glu Glu Val Met Ile Leu Gln Lys Val Asn His Leu Asn Leu Val Lys
355 360 365
Leu Met Gly Val Ser Ser Gly His Asp Gly Asn His Phe Leu Val Tyr
370 375 380
Glu Phe Ala Glu Asn Gly Ser Leu His Asn Trp Leu Phe Ser Asn Ser
385 390 395 400
Ser Thr Gly Ser Arg Phe Leu Thr Trp Ser Gln Arg Ile Ser Ile Ala
405 410 415
Val Asp Val Ala Met Gly Leu Gln Tyr Met His Glu His Thr Gln Pro
420 425 430
Ser Ile Val His Arg Asp Ile Thr Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser
435 440 445
Asn Phe Lys Ala Lys Ile Ala Asn Phe Ser Val Ala Arg Thr Ser Ile
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Asn Pro Met Ile Leu Lys Val Asp Val Phe Gly Tyr Gly Val Val Leu
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Leu Glu Leu Leu Ser Gly Lys Lys Ser Leu Thr Asn Asn Glu Ile Asn
485 490 495
His Ile Arg Glu Ile Phe Asp Leu Lys Glu Lys Arg Glu Glu Arg Ile
500 505 510
Arg Arg Trp Met Asp Pro Lys Ile Glu Ser Leu Tyr Pro Ile Asp Asp
515 520 525
Ala Leu Ser Leu Ala Phe Leu Ala Met Asn Cys Thr Ser Glu Lys Pro
530 535 540
Leu Ser Arg Pro Thr Met Gly Glu Val Val Leu Ser Leu Ser Leu Leu
545 550 555 560
Met Thr Gln His Ser Pro Thr Thr Leu Glu Arg Ser Trp Thr Cys Gly
565 570 575
Leu Asp Val Asp Val Thr Glu Met Gln Thr Leu Ile Ala Ala Arg
580 585 590
<210> 12
<211> 590
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 12
Met Val Ser Ser Phe Phe His Thr Leu Ile Phe Phe Ser Ala Thr His
1 5 10 15
Ile Leu Leu Gln Leu Pro Gln Ala Asn Gly Lys Asn Phe Ser Cys Thr
20 25 30
Leu Asn Ser Ser Pro Ser Cys Asp Thr Tyr Val Ala Tyr Phe Ala Asn
35 40 45
Ser Pro Asn Phe Leu Thr Leu Thr Ala Ile Ser Asp Ile Phe Asp Thr
50 55 60
Ser Pro Gln Ser Ile Ala Arg Ala Ser Asn Ile Lys Asp Glu Asn Met
65 70 75 80
Asn Leu Ile His Gly Gln Leu Leu Leu Ile Pro Ile Thr Cys Gly Cys
85 90 95
Asn Gly Asn Gly Asn Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser His Leu Ile Lys
100 105 110
Glu Ser Glu Ser Tyr Tyr Tyr Leu Ser Thr Ile Ser Tyr Gln Asn Leu
115 120 125
Thr Asn Trp Gln Thr Val Glu Asp Ser Asn Pro Asn Leu Asn Pro Tyr
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Leu Leu Lys Ile Gly Thr Lys Ile Asn Ile Pro Leu Phe Cys Arg Cys
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Pro Ser Asn Tyr Phe Ala Lys Gly Ile Glu Tyr Leu Ile Thr Tyr Val
165 170 175
Trp Gln Pro Asn Asp Asn Leu Thr Leu Val Ala Ser Lys Leu Gly Ala
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Ser Pro Lys Asp Ile Ile Thr Ala Asn Thr Asn Asn Phe Gly Gln Asn
195 200 205
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Pro Ala Leu Ser Gln Ser Tyr Tyr Ser Ser Ser Glu Arg Lys Arg Ile
225 230 235 240
Asn His Phe Ser Ile Ile Ile Ser Ile Gly Ile Cys Leu Gly Cys Thr
245 250 255
Ile Leu Ile Ser Leu Leu Leu Leu Leu Phe Tyr Val Tyr Cys Leu Arg
260 265 270
Lys Arg Lys Ala Cys Glu Asn Lys Cys Val Pro Ser Val Glu Ile Thr
275 280 285
Asp Lys Leu Ile Ser Glu Val Ser Asn Tyr Val Ser Lys Pro Thr Val
290 295 300
Tyr Glu Val Gly Met Ile Met Lys Ala Thr Met Asn Leu Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Lys Ile Gly Lys Ser Val Tyr Lys Ala Lys Ile Asp Gly Leu Val
325 330 335
Leu Ala Val Lys Asn Val Lys Gly His Ile Thr Val Thr Glu Glu Leu
340 345 350
Met Ile Leu Gln Lys Val Asn His Ala Asn Leu Val Lys Leu Val Gly
355 360 365
Val Ser Ser Gly Tyr Asp Gly Asn His Phe Leu Val Tyr Glu Tyr Ala
370 375 380
Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Asn Trp Leu Leu Ser Glu Phe Cys Thr Leu
385 390 395 400
Ser Trp Ser Gln Arg Leu Ser Ile Ala Val Asp Ile Ala Ile Gly Leu
405 410 415
Gln Tyr Leu His Glu His Thr Gln Pro Cys Ile Val His Arg Asn Ile
420 425 430
Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser Lys Phe Lys Ala Lys Ile Ala
435 440 445
Asn Phe Ser Val Ala Arg Thr Thr Lys Asn Pro Met Ile Thr Lys Val
450 455 460
Asp Val Leu Gly Tyr Gly Met Val Leu Met Glu Leu Ile Thr Gly Lys
465 470 475 480
Lys Phe Leu Ser Tyr Ser Glu His Ser Glu Val Asn Met Leu Trp Lys
485 490 495
Asp Phe Lys Cys Val Phe Asp Thr Glu Gln Lys Arg Glu Glu Ile Val
500 505 510
Arg Arg Trp Met Asp Pro Lys Leu Gly Arg Phe Tyr Asn Val Val Glu
515 520 525
Ala Leu Ser Leu Phe Thr Leu Ala Val Asn Cys Ile Glu Glu Gln Pro
530 535 540
Leu Leu Arg Pro Thr Met Gly Glu Val Val Leu Ser Leu Ser Leu Leu
545 550 555 560
Thr Gln Pro Ser Pro Thr Leu Leu Glu Val Ser Trp Thr Tyr Gly Leu
565 570 575
Asp Val Glu Val Ala Glu Met Val Thr Pro Ile Ile Ala Arg
580 585 590
<210> 13
<211> 613
<212> PRT
<213> Parasponia andersonii
<400> 13
Met Ala Ile Ser Leu Tyr Leu Leu Leu Phe Phe Ile Thr His Ile Ser
1 5 10 15
Ala Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ala Thr Asn Phe Ser Cys Ser Thr Asn
20 25 30
Ser Ser Gln Pro Ser Cys Lys Thr Tyr Val Ala Tyr Phe Ala Gln Pro
35 40 45
Pro Leu Phe Met Asp Leu Lys Ser Ile Ser Asn Leu Phe Gly Val Ser
50 55 60
Pro Ser Ser Ile Ser Glu Ala Ser Asn Leu Val Ser Glu Ser Thr Lys
65 70 75 80
Leu Thr Arg Gly Gln Leu Leu Leu Ile Pro Leu Ser Cys Ser Cys Asn
85 90 95
Gly Ser His Tyr Phe Ser Asn Val Thr Tyr Asn Ile Thr Met Gly Asp
100 105 110
Ser Tyr Tyr Leu Val Ser Ile His Ser Phe Glu Asn Leu Thr Asn Trp
115 120 125
Pro Leu Val Arg Asp Thr Asn Pro Thr Leu Asn Pro Asn Leu Leu Gln
130 135 140
Ile Gly Thr Lys Val Ile Phe Pro Leu Tyr Cys Gly Cys Pro Ser Lys
145 150 155 160
Ser His Ser Lys Asn Gly Ile Lys Tyr Leu Ile Thr Tyr Val Trp Gln
165 170 175
Pro Ser Asp Asp Ile Tyr Arg Val Ser Ala Met Phe Asn Ala Ser Glu
180 185 190
Val Asp Ile Ile Ile Glu Asn Asn Tyr Gln Asp Phe Lys Ala Ala Val
195 200 205
Gly Tyr Pro Val Leu Ile Pro Val Ser Arg Met Pro Ala Leu Ser Gln
210 215 220
Pro Pro Tyr Pro Ser His Ser His His Arg Ser Gln Leu Lys His Arg
225 230 235 240
Trp Phe Leu Ile Ala Val Ile Ser Ser Ala Gly Ala Leu Leu Ile Leu
245 250 255
Phe Leu Ala Thr Phe Leu Val His Ser Ile Gly Leu Tyr Glu Lys Lys
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Lys Asn Leu Ser His Glu Glu Ser Ser Leu Glu Thr Thr Asp Leu Ile
275 280 285
Gln Val Lys Asn Phe Ser Lys Ser Asp Thr Leu Glu Leu Gln Ala Lys
290 295 300
His Asp Lys Leu Leu Pro Gly Val Ser Val Tyr Leu Gly Lys Pro Ile
305 310 315 320
Met Tyr Glu Ile Lys Met Ile Met Glu Ala Thr Met Asn Phe Asn Asp
325 330 335
Gln Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Val Tyr Arg Ala Met Ile Asn Gly Ser
340 345 350
Phe Leu Ala Val Lys Lys Ala Lys Glu Asn Val Thr Glu Glu Leu His
355 360 365
Ile Leu Gln Lys Val Asn His Gly Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Ile
370 375 380
Ser Leu Asp Arg Asp Gly Asn Cys Phe Phe Val Tyr Glu Tyr Ala Glu
385 390 395 400
Asn Gly Ser Leu Asp Lys Trp Leu Asn Pro Gln Ser Ser Thr Ser Thr
405 410 415
Ser Ser Ser Val Gly Ile Leu Ser Trp Ser Gln Arg Leu Asn Ile Ala
420 425 430
Leu Asp Val Ala Asn Gly Leu Gln Tyr Met His Glu His Thr Gln Pro
435 440 445
Ser Ile Val His Lys Glu Ile Arg Thr Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser
450 455 460
Arg Phe Lys Ala Lys Ile Ala Asn Phe Ser Met Ala Arg Ser Ala Ala
465 470 475 480
Ser Ala Gly Met Thr Lys Val Asp Val Phe Ala Phe Gly Val Val Leu
485 490 495
Leu Lys Leu Leu Ser Gly Arg Lys Ala Met Ala Thr Arg Glu Asn Gly
500 505 510
Glu Ile Val Met Leu Trp Lys Glu Ala Lys Ala Val Leu Glu Glu Glu
515 520 525
Glu Lys Arg Ala Glu Lys Val Arg Glu Trp Ile Asp Pro Lys Leu Glu
530 535 540
Ser Phe Tyr Pro Ile Asp Gly Ala Leu Ser Leu Met Thr Leu Ala Lys
545 550 555 560
Ala Cys Thr Gln Glu Lys Ala Ser Ala Arg Pro Ser Ile Gly Glu Val
565 570 575
Val Phe Ser Leu Cys Val Leu Thr Gln Ser Phe Ser Glu Thr Leu Glu
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595 600 605
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<213> Parasponia andersonii
<400> 14
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50 55 60
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65 70 75 80
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325 330 335
Glu Val Phe Ala Val Lys Lys Thr Lys Gln Asp Ile Thr Asp Glu Leu
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Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Val Gln Phe Leu Ser Trp Ser Gln
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Met Asp Pro Asn Leu Gln Ser Phe Tyr Pro Ile Asp Gly Ala Leu Ser
530 535 540
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000
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<213> 大麦
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Leu Ala Leu Leu Ala Ile Leu Ala Val Ala Arg Gly Gln Gln Gln Tyr
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Ile Ser Tyr Leu Leu Gly Ser Asp Pro Glu Ala Val Ala Asp Ala Asn
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<213> 大麦
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Gln Ala Val Leu Arg Ala Asn Arg Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ile Tyr
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Gln Gln Pro Leu Pro Thr Gly Gly Ser Gly Ser Gly Lys Gly Val Ala
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Gly Leu Met Phe Leu Cys Val Arg Arg Arg Arg Arg Leu Arg Pro Gly
305 310 315 320
Val Gly Glu Asn Gly His Pro Gly Lys Val Val Ile Asp Val Pro Ser
325 330 335
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355 360 365
Ala Ala Val Glu Ser Leu Thr Val Tyr Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Lys
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Ala Thr Ala Gly Phe Ser Glu Asp Arg Arg Val Lys Asp Ala Ser Val
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Tyr Arg Ala Val Ile Asn Gly Asp Thr Ala Ala Val Lys Arg Val Ala
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Ser Leu Val Arg Leu Ser Gly Leu Cys Val His His Gly Asp Thr Tyr
435 440 445
Leu Val Phe Glu Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Ser Asp Trp Leu His
450 455 460
Gly Gly Gly Ala Thr Leu Val Trp Lys Gln Arg Val Gln Ala Ala Phe
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<213> 大麦
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515 520 525
Val Gly Ala Glu Ile Gly Met Leu Trp Arg Asp Ile Arg Ala Val Leu
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Glu Ala Gly Asp Lys Arg Asp Ala Lys Leu Arg Lys Trp Met Asp Pro
545 550 555 560
Ala Leu Gly Asp Glu Tyr Tyr Leu Asp Ala Ala Leu Ser Leu Ala Gly
565 570 575
Met Ala Arg Ala Cys Thr Glu Glu Asp Ala Ala Arg Arg Pro Lys Met
580 585 590
Ala Asp Val Val Phe Ser Leu Ser Met Leu Val Gln Pro Leu Pro Val
595 600 605
Gly Asp Ala Phe Glu Lys Leu Trp Gln Pro Ser Ser Glu Glu Asn Ile
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Arg Ile Val Asn Glu Val Ala Ala Arg
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<210> 20
<211> 638
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 20
Met Glu Pro Arg His Phe Cys Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Phe Arg Arg Ala Gly Ala Gln Asp Ser Thr Asn Tyr
20 25 30
Thr Val Pro Ala Arg Phe Ala Cys Asn Val Ser Ser Pro Cys Asp Thr
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Tyr Val Val Tyr Arg Thr Gln Ser Pro Gly Tyr Leu Asp Leu Gly Ser
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Ile Ser Asp Leu Phe Gly Thr Ser Gln Ala Arg Ile Ala Ser Ala Asn
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Tyr Pro Ile Arg Gln Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Leu Ala Arg Leu
115 120 125
Ser Tyr Glu Asn Leu Thr Glu Tyr His Leu Ile His Asp Leu Asn Pro
130 135 140
Arg Ser Glu Pro Thr Ser Leu Gln Ile Gly Gln Glu Val Thr Val Pro
145 150 155 160
Leu Leu Cys Arg Cys Pro Pro Ala Arg Ala Val Gln Ser Phe Ile Thr
165 170 175
Tyr Val Trp Gln Pro Gly Asp Thr Leu Ser Gln Val Ser Lys Leu Met
180 185 190
Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ile Ala Glu Ala Asn Asn Val Thr Ser Ser
195 200 205
Ser Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Gly Leu Pro Met Leu Ile Pro Val
210 215 220
Gln Gln Arg Pro Arg Leu Pro Pro Leu Leu Tyr Ala Ala Ser Ala Gly
225 230 235 240
Glu Gly Arg Ser Ser Arg Ser Arg Arg Arg Ala Leu Ile Ile Ile Gly
245 250 255
Ala Ser Val Ser Gly Ser Leu Val Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Ala
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Ile Met Ala Gln Arg Arg Tyr Arg Arg Lys Lys Pro Ser Met Arg Leu
275 280 285
Gly Ser Pro Phe Ala Val Asn Thr Lys Leu Ser Trp Ser Val Asn Gln
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Tyr Gly His Gly Ser Ser Asn Ser Phe Ala His Val Met Lys Gly Gly
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Lys Leu Leu Thr Gly Val Ser Gln Phe Ile Asp Lys Pro Ile Ile Phe
325 330 335
Val Glu Glu Glu Ile Val Glu Ala Thr Met Asn Leu Asp Glu Arg Cys
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Ala Lys Leu Asp Gly Glu Val Phe
355 360 365
Ala Val Lys Pro Ala Lys Gly Asp Val Ser Ala Glu Leu Arg Met Met
370 375 380
Gln Met Val Asn His Ala Asn Leu Ile Lys Leu Ala Gly Ile Ser Ile
385 390 395 400
Gly Ala Asp Gly Asp Tyr Ala Phe Leu Val Tyr Glu Phe Ala Glu Lys
405 410 415
Ala Ser Leu Asp Lys Trp Leu Tyr His Asn His Gln Lys Pro Pro Ser
420 425 430
Ala Leu Leu Pro Ser Ser Ser Cys Thr Val Pro Thr Thr Leu Ser Trp
435 440 445
Gly Gln Arg Leu Ser Ile Ala Leu Asp Val Ala Asn Gly Leu Leu Tyr
450 455 460
Met His Glu His Thr Gln Pro Ser Met Val His Gly Asp Ile Arg Ala
465 470 475 480
Arg Asn Ile Leu Leu Thr Ala Asp Phe Arg Ala Lys Ile Ser Ser Phe
485 490 495
Ser Leu Ala Lys Pro Ala Thr Ala Asp Ala Ala Ala Thr Ser Ser Asp
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Val Phe Ala Phe Gly Leu Leu Leu Leu Glu Leu Met Ser Gly Arg Arg
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Ala Met Glu Ala Arg Ile Gly Ser Glu Ile Gly Met Leu Trp Arg Glu
530 535 540
Ile Arg Ala Val Leu Glu Ala Gly Asp Lys Arg Glu Ala Lys Leu Arg
545 550 555 560
Lys Trp Met Asp Pro Ala Leu Gly Ser Glu Tyr Gln Met Asp Ala Ala
565 570 575
Leu Ser Leu Ala Gly Met Ala Arg Ala Cys Thr Asp Glu Asp Ala Ala
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Arg Arg Pro Asn Met Thr Glu Val Val Phe Ser Leu Ser Met Leu Ala
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610 615 620
Ser Glu Asp Asn Ile Arg Ile Ala Gly Ser Val Ala Ala Arg
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<212> PRT
<213> 玉米
<400> 21
Met Glu Leu Arg His Phe Arg Cys Cys Ala Ser Arg Leu Leu Leu Leu
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Val Thr Leu Leu Leu Gly Phe Arg Arg Ala Gly Ala Gln Asp Ser Thr
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85 90 95
Leu Leu Val Pro Val Arg Cys Gly Cys Ala Gly Ala Trp Ser Phe Ala
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Pro Met Leu Ile Pro Val Arg Gln Arg Pro Arg Leu Pro Ala Pro Leu
225 230 235 240
Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Asp Gly Lys Ser Arg Ser Arg Arg Arg Ala
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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370 375 380
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Ile Ser Ile Gly Ala Asp Gly Asp Tyr Ala Phe Leu Val Tyr Glu Phe
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435 440 445
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465 470 475 480
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Ala Lys Pro Ala Met Val Asp Ala Ala Ala Thr Ser Ser Asp Val Phe
500 505 510
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515 520 525
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<211> 620
<212> PRT
<213> 苹果
<400> 22
Met Ala Ile Ser Phe Leu Cys Ser Lys Pro Leu Cys Ile Leu Leu Leu
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<211> 624
<212> PRT
<213> 野草莓亚种草莓
<400> 23
Met Ala Val Ser Phe Leu Cys Ser Ser Met Val Cys Ile Leu Leu Leu
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245 250 255
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Gly Val Ser Ser Tyr Leu Gly Lys Ala Ile Leu Tyr Asp Val Lys Thr
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<212> DNA
<213> 百脉根
<400> 24
ggacatgaga ttgaagctcc aaaattagct cttttttctg atgaatactt aatgctttgt 60
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atgattgtca tttcttaaat tattattggt tgtttccgtt tctttaatta tctgttttaa 240
tcttgcaggt catacaaatt aaaatactag ccaccaccca agacatacta aatggggtag 300
tagagggaag ggtaaggtcg ataaggatga ctttttattc tataaaattt aggagaattt 360
gagcttaagt ggcaaggcaa acgacattac tatacgaatt ggctttgtac cagaaacagg 420
gaacaaataa tattttacaa ataagctatt atcatgtcag ctcatttgtt caactttgat 480
ttgattaaaa attaaatgaa gttgaatttg ttgagctgct ttattatata tgccactgga 540
tgtttccgca ttctaagtgc atgtttgaaa acatttctac aattgattac gaaggaaaaa 600
ttaatcatgg agagaagctt atgtgcgtag cttctgtatt tctgaattga ttctatctgt 660
acagtagcat ttagataatg aatgatcttg gttctcgcta agcatcaaac caatctctac 720
ccttttaaaa ttgcaagaat tataagtcat gcattgaccc aaatccttct gtggttatgc 780
cccttaaaaa tccggcaaga catcaagtta gttggtcatt agggttccac cagctagctg 840
acaccttgta caacaactgg ccgtcctaaa gttgggtaag cattacaata ctaaatgcca 900
ttttattata ttttgcgcat ggttatatac ctaagtagga tttgtccaca gtttctttga 960
ttcggaaagg aaaaaatatt tagttgacac tgacagaagc agattttata tacatatatt 1020
atgaaatgac tcctacatga gatacacgaa tctcatcccc atgagttgca gtttgacaga 1080
gtacacactt atcaacttgc tggaatatag gaaagtctaa ccaatgatgt cgatccgtat 1140
tgccttaatt ttggtaaatt tagtattaca tgatcattat tgatatacta aaccacagga 1200
tattttattg acaatgtgaa tgttccatat tttcaacaat gctgattccc tctgataaag 1260
aacaagttcc ttttctcttt ccctgttaac tatcatttgt tccccacttc acaaaca 1317
<210> 25
<211> 1317
<212> DNA
<213> 百脉根
<400> 25
ggacatgaga ttgaagctcc aaaattagct cttttttctg atgaatactt aatgctttgt 60
tgtattcact tgattaagtg ctagaaatca tctttgcatg atcatagatt aaatgaattt 120
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tagagggaag ggtaaggtcg ataaggatga ctttttattc tataaaattt aggagaattt 360
gagcttaagt ggcaaggcaa acgacattac tatacgaatt ggctttgtac cagaaacagg 420
gaacaaataa tattttacaa ataagctatt atcatgtcag ctcatttgtt caactttgat 480
ttgattaaaa attaaatgaa gttgaatttg ttgagctgct ttattatata tgccactgga 540
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<210> 26
<211> 61
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
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<213> 百脉根
<400> 27
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<213> 百脉根
<400> 29
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<212> PRT
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<213> 百脉根
<400> 31
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<211> 67
<212> PRT
<213> 百脉根
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<213> 蒺藜苜蓿
<400> 33
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<211> 622
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 34
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Pro Thr Glu Asp Leu Arg Lys Leu Val Asp Gln Arg Leu Gly Asp Asn
545 550 555 560
Tyr Pro Val Asp Ser Val Arg Lys Met Ala Gln Leu Ala Lys Ala Cys
565 570 575
Thr Gln Asp Asn Pro Gln Leu Arg Pro Ser Met Arg Ser Ile Val Val
580 585 590
Ala Leu Met Thr Leu Ser Ser Thr Thr Asp Asp Trp Asp Val Gly Ser
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Phe Tyr Glu Asn Gln Asn Leu Val Asn Leu Met Ser Gly Arg
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<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 35
Met Asn Leu Lys Asn Gly Leu Leu Leu Phe Ile Leu Phe Leu Asp Cys
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Val Phe Phe Lys Val Glu Ser Lys Cys Val Lys Gly Cys Asp Val Ala
20 25 30
Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Gln Leu Arg Asn Ile Ser
35 40 45
Asn Phe Met Gln Ser Lys Ile Val Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Ile
50 55 60
Met Ser Tyr Asn Arg Asp Val Val Phe Asp Lys Ser Gly Leu Ile Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Arg Ile Asn Val Pro Phe Pro Cys Glu Cys Ile Gly Gly Glu
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Asp Leu Ile Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Leu Thr Thr Val Glu Leu
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Leu Lys Lys Phe Asn Ser Tyr Asp Pro Asn His Ile Pro Val Lys Ala
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Lys Ile Asn Val Thr Val Ile Cys Ser Cys Gly Asn Ser Gln Ile Ser
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Lys Asp Tyr Gly Leu Phe Val Thr Tyr Pro Leu Arg Ser Asp Asp Thr
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Leu Ala Lys Ile Ala Thr Lys Ala Gly Leu Asp Glu Gly Leu Ile Gln
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Asn Phe Asn Gln Asp Ala Asn Phe Ser Ile Gly Ser Gly Ile Val Phe
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Ile Pro Gly Arg
210
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<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 36
Met Lys Leu Lys Thr Gly Leu Leu Leu Phe Phe Ile Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
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Ile Pro Gly Arg
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
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<220>
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
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<220>
<223> 合成构建体
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1
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210
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
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<213> 人工序列
<220>
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<223> 合成构建体
<400> 57
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
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Ser Ala Phe Ala
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<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
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Pro Ser Asn Tyr His Leu Asn Lys Gly Ile Glu Tyr Leu Ile Thr Tyr
130 135 140
Val Trp His Asn Asn Asp Asn Val Ser Leu Val Ala Ser Lys Phe Gly
145 150 155 160
Val Ser Thr Gln Asp Ile Ile Ser Glu Asn Asn Phe Ser His Gln Asn
165 170 175
Phe Thr Ala Ala Thr Asn Phe Pro Ile Leu Ile Pro Val Thr Gln Leu
180 185 190
Pro Ser Leu Ser
195
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
His His His His His His
1 5
<210> 62
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Ala Gly Asn His Ser Ser Ala Asn Thr Ser Tyr Gln Ile Gln Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Tyr Asp Phe Val Ala Thr Thr Leu Tyr Glu Asn Leu Thr Asn
20 25 30
Trp Asn Ile Val Gln Ala Ser Asn Pro Gly Val Asn Pro Tyr Leu Leu
35 40 45
Pro Glu Arg Val Lys Val Val Phe Pro Leu Phe
50 55
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Gln Leu Gly Asp Ser Tyr Asp
1 5
<210> 64
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Gly Val
1
<210> 65
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His
1 5 10 15
Ser Ala Phe Ala Gln Gly Gly Ala Gly Asn Gly Thr Gly Arg Phe Ala
20 25 30
Cys Val Val Pro Ala Pro Cys Asp Thr Phe Val Leu Tyr Arg Thr Gln
35 40 45
Ser Pro Gly Ser Leu Asp Leu Gly Ala Ile Ser Asp Leu Phe Gly Val
50 55 60
Ser Arg Ala Met Ile Ala Ala Ala Asn Asn Leu Ser Leu Ile Asp Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Leu Leu Pro Asp Gln Pro Leu Leu Val Pro Val Arg Cys
85 90 95
Gly Cys Thr Gly Asn Arg Ser Phe Val Asn Val Thr Tyr Pro Ile His
100 105 110
Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Ala Leu Ala Leu Thr Gly Tyr Glu Asn Leu
115 120 125
Thr Thr Pro Asp Val Ile Gln Glu Leu Asn Pro Gln Ala Val Phe Asn
130 135 140
Lys Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Thr Val Pro Leu Phe Cys Arg Cys
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Glu Arg Ser Ala Gly Val Leu Gln Gln Ile Thr Tyr
165 170 175
Met Trp Arg Pro Val Asp Thr Met Ser Arg Val Ser Lys Leu Met Gly
180 185 190
Ser Asp Ala Ser Ala Ile Ala Ala Ala Asn Asn Val Ser Ala Asp Phe
195 200 205
Thr Ser Thr Thr Met Leu Pro Met Leu Ile Pro Val Ala Arg Pro Pro
210 215 220
Val Leu Pro His His His His His His
225 230
<210> 66
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Gln Gly Gly Ala Gly Asn Gly Thr Gly Arg Phe Ala Cys Val Val Pro
1 5 10 15
Ala Pro Cys Asp Thr Phe Val Leu Tyr Arg Thr Gln Ser Pro Gly Ser
20 25 30
Leu Asp Leu Gly Ala Ile Ser Asp Leu Phe Gly Val Ser Arg Ala Met
35 40 45
Ile Ala Ala Ala Asn Asn Leu Ser Leu Ile Asp Glu Asp Ala Ala Leu
50 55 60
Leu Pro Asp Gln Pro Leu Leu Val Pro Val Arg Cys Gly Cys Thr Gly
65 70 75 80
Asn Arg Ser Phe Val Asn Val Thr Tyr Pro Ile His Ser Gly Asp Thr
85 90 95
Phe Tyr Ala Leu Ala Leu Thr Gly Tyr Glu Asn Leu Thr Thr Pro Asp
100 105 110
Val Ile Gln Glu Leu Asn Pro Gln Ala Val Phe Asn Lys Leu Asn Val
115 120 125
Ser Gln Leu Val Thr Val Pro Leu Phe Cys Arg Cys Pro Thr Pro Ala
130 135 140
Glu Arg Ser Ala Gly Val Leu Gln Gln Ile Thr Tyr Met Trp Arg Pro
145 150 155 160
Val Asp Thr Met Ser Arg Val Ser Lys Leu Met Gly Ser Asp Ala Ser
165 170 175
Ala Ile Ala Ala Ala Asn Asn Val Ser Ala Asp Phe Thr Ser Thr Thr
180 185 190
Met Leu Pro Met Leu Ile Pro Val Ala Arg Pro Pro Val Leu Pro
195 200 205
<210> 67
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His
1 5 10 15
Ser Ala Phe Ala Gly Asp Gly Cys Ser Arg Gly Cys Asp Leu Ala Leu
20 25 30
Ala Ser Tyr Tyr Ile Ala Pro Asn Gln Asn Val Thr Tyr Ile Ala Ser
35 40 45
Leu Phe Gly Phe Ser Glu Tyr Arg Val Leu Gly Gln Tyr Asn Pro Gly
50 55 60
Val Asn Asn Leu Asp Tyr Val Val Ala Gly Asp Arg Leu Asn Val Ser
65 70 75 80
Leu Thr Cys Lys Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ala Pro Ala Ser Thr Phe
85 90 95
Leu Ala Ala Ser Ile Pro Tyr Lys Val Ala Thr Gly Glu Thr Tyr Leu
100 105 110
Arg Ile Ala Asp Asn Tyr Asn Asn Leu Thr Thr Ala Asp Trp Leu Val
115 120 125
Ala Thr Asn Thr Tyr Pro Ala Asn Asn Ile Pro Asp Val Ala Thr Val
130 135 140
Asn Ala Thr Val Asn Cys Ser Cys Gly Asp Ala Gly Ile Ser Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Phe Leu Thr Tyr Pro Leu Arg Asp Arg Glu Thr Leu Ala
165 170 175
Ser Val Ala Ala Asn His Gly Phe Ser Ser Pro Glu Lys Met Asp Leu
180 185 190
Leu Lys Lys Tyr Asn Pro Gly Met Asp Gly Val Thr Gly Ser Gly Ile
195 200 205
Val Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Pro Asn Gly Ser Tyr Arg Pro His His
210 215 220
His His His His
225
<210> 68
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Gly Asp Gly Cys Ser Arg Gly Cys Asp Leu Ala Leu Ala Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Ile Ala Pro Asn Gln Asn Val Thr Tyr Ile Ala Ser Leu Phe Gly Phe
20 25 30
Ser Glu Tyr Arg Val Leu Gly Gln Tyr Asn Pro Gly Val Asn Asn Leu
35 40 45
Asp Tyr Val Val Ala Gly Asp Arg Leu Asn Val Ser Leu Thr Cys Lys
50 55 60
Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ala Pro Ala Ser Thr Phe Leu Ala Ala Ser
65 70 75 80
Ile Pro Tyr Lys Val Ala Thr Gly Glu Thr Tyr Leu Arg Ile Ala Asp
85 90 95
Asn Tyr Asn Asn Leu Thr Thr Ala Asp Trp Leu Val Ala Thr Asn Thr
100 105 110
Tyr Pro Ala Asn Asn Ile Pro Asp Val Ala Thr Val Asn Ala Thr Val
115 120 125
Asn Cys Ser Cys Gly Asp Ala Gly Ile Ser Thr Asp Tyr Gly Leu Phe
130 135 140
Leu Thr Tyr Pro Leu Arg Asp Arg Glu Thr Leu Ala Ser Val Ala Ala
145 150 155 160
Asn His Gly Phe Ser Ser Pro Glu Lys Met Asp Leu Leu Lys Lys Tyr
165 170 175
Asn Pro Gly Met Asp Gly Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ile Pro
180 185 190
Ala Lys Asp Pro Asn Gly Ser Tyr Arg Pro
195 200
<210> 69
<211> 621
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 69
Met Glu His Gln Pro Arg Phe Thr Ser Phe Ile Ser Leu Pro Leu Phe
1 5 10 15
Ser Ile Phe Leu Ala Ser Ile Pro Phe Ile Thr Glu Ser Lys Cys Thr
20 25 30
Lys Gly Cys Ser Leu Ala Leu Ala Asn Phe Tyr Val Ser Gln Gly Ser
35 40 45
Asn Leu Thr Tyr Ile Ser Ser Ile Met Arg Ser Asn Ile Gln Thr Arg
50 55 60
Pro Glu Asp Ile Val Glu Tyr Ser Arg Glu Ile Ile Pro Ser Lys Asp
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Gly Gln Arg Leu Asn Val Pro Phe Pro Cys Asp Cys
85 90 95
Ile Asp Gly Gln Phe Leu Gly His Lys Phe Ser Tyr Asp Val Glu Thr
100 105 110
Gly Asp Thr Tyr Glu Thr Val Ala Thr Asn Asn Tyr Ala Asn Leu Thr
115 120 125
Asn Val Glu Trp Leu Arg Arg Phe Asn Thr Tyr Pro Pro Asn Asp Ile
130 135 140
Pro Asp Thr Gly Thr Leu Asn Val Thr Val Asn Cys Ser Cys Gly Asp
145 150 155 160
Ala Asp Val Gly Asn Tyr Ala Leu Phe Val Thr Tyr Pro Leu Arg Pro
165 170 175
Gly Glu Thr Leu Val Ser Val Ala Asn Ser Ser Lys Val Asp Ser Ser
180 185 190
Leu Leu Gln Arg Tyr Asn Pro Gly Val Asn Phe Asn Gln Gly Ser Gly
195 200 205
Ile Val Phe Val Pro Gly Lys Asp Gln Asn Gly Ser Phe Val Phe Leu
210 215 220
Gly Ser Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Ala Ile Gly Gly Ile Ala Val
225 230 235 240
Gly Ile Val Val Val Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ile Tyr Phe Gly
245 250 255
Tyr Phe Arg Lys Lys Lys Ile Gln Lys Glu Glu Leu Phe Ser Arg Asp
260 265 270
Ser Thr Ala Leu Phe Ser Gln Asp Gly Lys Asp Glu Asn Ser His Gly
275 280 285
Ala Ala Asn Val Thr Gln Arg Pro Gly Val Met Thr Gly Ile Thr Val
290 295 300
Asp Lys Ser Val Glu Phe Ser Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ser Asp
305 310 315 320
Asn Phe Ser Met Ala Asn Lys Ile Gly Gln Gly Gly Phe Gly Ser Val
325 330 335
Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg Gly Glu Lys Ala Ala Ile Lys Lys Met Asp
340 345 350
Met Gln Ala Thr Lys Glu Phe Leu Ala Glu Leu Lys Val Leu Thr Arg
355 360 365
Val His His Leu Asn Leu Val Arg Leu Ile Gly Tyr Ser Ile Glu Gly
370 375 380
Ser Leu Phe Leu Val Tyr Glu Tyr Ile Glu Asn Gly Asn Leu Ser Gln
385 390 395 400
His Leu Arg Gly Ser Gly Arg Asp Pro Leu Pro Trp Ala Thr Arg Val
405 410 415
Gln Ile Ala Leu Asp Ser Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Ile His Glu His
420 425 430
Thr Val Pro Val Tyr Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Ala Asn Ile Leu
435 440 445
Ile Asp Lys Asn Phe Arg Gly Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Thr Lys
450 455 460
Leu Thr Glu Val Gly Ser Ser Ser Leu Pro Thr Gly Arg Leu Val Gly
465 470 475 480
Thr Phe Gly Tyr Met Pro Pro Glu Tyr Ala Gln Tyr Gly Asp Val Ser
485 490 495
Pro Lys Val Asp Val Tyr Ala Phe Gly Val Val Leu Tyr Glu Leu Ile
500 505 510
Ser Ala Lys Glu Ala Ile Val Lys Ser Ser Glu Ser Val Ala Asp Ser
515 520 525
Lys Gly Leu Val Gly Leu Phe Glu Gly Val Leu Ser Gln Pro Asp Pro
530 535 540
Thr Glu Asp Leu Arg Lys Ile Val Asp Pro Arg Leu Gly Asp Asn Tyr
545 550 555 560
Pro Ala Asp Ser Val Arg Lys Met Ala Gln Leu Ala Lys Ala Cys Thr
565 570 575
Gln Glu Asn Pro Gln Leu Arg Pro Ser Met Arg Ser Ile Val Val Ala
580 585 590
Leu Met Thr Leu Ser Ser Thr Thr Asp Asp Trp Asp Val Gly Ser Phe
595 600 605
Tyr Glu Asn Gln Asn Leu Val Asn Leu Met Ser Gly Arg
610 615 620
<210> 70
<211> 623
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 70
Met Lys Leu Lys Thr Gly Leu Leu Leu Phe Phe Ile Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
His Val Cys Phe His Val Glu Ser Asn Cys Leu Lys Gly Cys Asp Leu
20 25 30
Ala Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Leu Pro Gly Val Phe Ile Leu Gln Asn
35 40 45
Ile Thr Thr Phe Met Gln Ser Glu Ile Val Ser Ser Asn Asp Ala Ile
50 55 60
Thr Ser Tyr Asn Lys Asp Lys Ile Leu Asn Asp Ile Asn Ile Gln Ser
65 70 75 80
Phe Gln Arg Leu Asn Ile Pro Phe Pro Cys Asp Cys Ile Gly Gly Glu
85 90 95
Phe Leu Gly His Val Phe Glu Tyr Ser Ala Ser Lys Gly Asp Thr Tyr
100 105 110
Glu Thr Ile Ala Asn Leu Tyr Tyr Ala Asn Leu Thr Thr Val Asp Leu
115 120 125
Leu Lys Arg Phe Asn Ser Tyr Asp Pro Lys Asn Ile Pro Val Asn Ala
130 135 140
Lys Val Asn Val Thr Val Asn Cys Ser Cys Gly Asn Ser Gln Val Ser
145 150 155 160
Lys Asp Tyr Gly Leu Phe Ile Thr Tyr Pro Ile Arg Pro Gly Asp Thr
165 170 175
Leu Gln Asp Ile Ala Asn Gln Ser Ser Leu Asp Ala Gly Leu Ile Gln
180 185 190
Ser Phe Asn Pro Ser Val Asn Phe Ser Lys Asp Ser Gly Ile Ala Phe
195 200 205
Ile Pro Gly Arg Tyr Lys Asn Gly Val Tyr Val Pro Leu Tyr His Arg
210 215 220
Thr Ala Gly Leu Ala Ser Gly Ala Ala Val Gly Ile Ser Ile Ala Gly
225 230 235 240
Thr Phe Val Leu Leu Leu Leu Ala Phe Cys Met Tyr Val Arg Tyr Gln
245 250 255
Lys Lys Glu Glu Glu Lys Ala Lys Leu Pro Thr Asp Ile Ser Met Ala
260 265 270
Leu Ser Thr Gln Asp Gly Asn Ala Ser Ser Ser Ala Glu Tyr Glu Thr
275 280 285
Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Thr Ala Ser Ala Thr Gly Leu Thr Ser
290 295 300
Ile Met Val Ala Lys Ser Met Glu Phe Ser Tyr Gln Glu Leu Ala Lys
305 310 315 320
Ala Thr Asn Asn Phe Ser Leu Asp Asn Lys Ile Gly Gln Gly Gly Phe
325 330 335
Gly Ala Val Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg Gly Lys Lys Thr Ala Ile Lys
340 345 350
Lys Met Asp Val Gln Ala Ser Thr Glu Phe Leu Cys Glu Leu Lys Val
355 360 365
Leu Thr His Val His His Leu Asn Leu Val Arg Leu Ile Gly Tyr Cys
370 375 380
Val Glu Gly Ser Leu Phe Leu Val Tyr Glu His Ile Asp Asn Gly Asn
385 390 395 400
Leu Gly Gln Tyr Leu His Gly Ser Gly Lys Glu Pro Leu Pro Trp Ser
405 410 415
Ser Arg Val Gln Ile Ala Leu Asp Ala Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Ile
420 425 430
His Glu His Thr Val Pro Val Tyr Ile His Arg Asp Val Lys Ser Ala
435 440 445
Asn Ile Leu Ile Asp Lys Asn Leu Arg Gly Lys Val Ala Asp Phe Gly
450 455 460
Leu Thr Lys Leu Ile Glu Val Gly Asn Ser Thr Leu Gln Thr Arg Leu
465 470 475 480
Val Gly Thr Phe Gly Tyr Met Pro Pro Glu Tyr Ala Gln Tyr Gly Asp
485 490 495
Ile Ser Pro Lys Ile Asp Val Tyr Ala Phe Gly Val Val Leu Phe Glu
500 505 510
Leu Ile Ser Ala Lys Asn Ala Val Leu Lys Thr Gly Glu Leu Val Ala
515 520 525
Glu Ser Lys Gly Leu Val Ala Leu Phe Glu Glu Ala Leu Asn Lys Ser
530 535 540
Asp Pro Cys Asp Ala Leu Arg Lys Leu Val Asp Pro Arg Leu Gly Glu
545 550 555 560
Asn Tyr Pro Ile Asp Ser Val Leu Lys Ile Ala Gln Leu Gly Arg Ala
565 570 575
Cys Thr Arg Asp Asn Pro Leu Leu Arg Pro Ser Met Arg Ser Leu Val
580 585 590
Val Ala Leu Met Thr Leu Ser Ser Leu Thr Glu Asp Cys Asp Asp Glu
595 600 605
Ser Ser Tyr Glu Ser Gln Thr Leu Ile Asn Leu Leu Ser Val Arg
610 615 620
<210> 71
<211> 620
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 71
Met Asn Leu Lys Asn Gly Leu Leu Leu Phe Ile Leu Phe Leu Asp Cys
1 5 10 15
Val Phe Phe Lys Val Glu Ser Lys Cys Val Lys Gly Cys Asp Val Ala
20 25 30
Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Gln Leu Arg Asn Ile Ser
35 40 45
Asn Phe Met Gln Ser Lys Ile Val Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Ile
50 55 60
Met Ser Tyr Asn Arg Asp Val Val Phe Asp Lys Ser Gly Leu Ile Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Arg Ile Asn Val Pro Phe Pro Cys Glu Cys Ile Gly Gly Glu
85 90 95
Phe Leu Gly His Val Phe Glu Tyr Thr Thr Lys Glu Gly Asp Asp Tyr
100 105 110
Asp Leu Ile Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Leu Thr Thr Val Glu Leu
115 120 125
Leu Lys Lys Phe Asn Ser Tyr Asp Pro Asn His Ile Pro Val Lys Ala
130 135 140
Lys Ile Asn Val Thr Val Ile Cys Ser Cys Gly Asn Ser Gln Ile Ser
145 150 155 160
Lys Asp Tyr Gly Leu Phe Val Thr Tyr Pro Leu Arg Ser Asp Asp Thr
165 170 175
Leu Ala Lys Ile Ala Thr Lys Ala Gly Leu Asp Glu Gly Leu Ile Gln
180 185 190
Asn Phe Asn Gln Asp Ala Asn Phe Ser Ile Gly Ser Gly Ile Val Phe
195 200 205
Ile Pro Gly Arg Asp Gln Asn Gly His Phe Phe Pro Leu Tyr Ser Arg
210 215 220
Thr Gly Ile Ala Lys Gly Ser Ala Val Gly Ile Ala Met Ala Gly Ile
225 230 235 240
Phe Gly Leu Leu Leu Phe Val Ile Tyr Ile Tyr Ala Lys Tyr Phe Gln
245 250 255
Lys Lys Glu Glu Glu Lys Thr Lys Leu Pro Gln Thr Ser Arg Ala Phe
260 265 270
Ser Thr Gln Asp Ala Ser Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Thr Ser Gly Ser
275 280 285
Ser Gly His Ala Thr Gly Ser Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ile Met Val
290 295 300
Ala Lys Ser Thr Glu Phe Thr Tyr Gln Glu Leu Ala Lys Ala Thr Asn
305 310 315 320
Asn Phe Ser Leu Asp Asn Lys Ile Gly Gln Gly Gly Phe Gly Ala Val
325 330 335
Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Lys Met Asp
340 345 350
Val Gln Ala Ser Ser Glu Phe Leu Cys Glu Leu Lys Val Leu Thr His
355 360 365
Val His His Leu Asn Leu Val Arg Leu Ile Gly Tyr Cys Val Glu Gly
370 375 380
Ser Leu Phe Leu Val Tyr Glu His Ile Asp Asn Gly Asn Leu Gly Gln
385 390 395 400
Tyr Leu His Gly Ile Gly Thr Glu Pro Leu Pro Trp Ser Ser Arg Val
405 410 415
Gln Ile Ala Leu Asp Ser Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Ile His Glu His
420 425 430
Thr Val Pro Val Tyr Ile His Arg Asp Val Lys Ser Ala Asn Ile Leu
435 440 445
Ile Asp Lys Asn Leu Arg Gly Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Thr Lys
450 455 460
Leu Ile Glu Val Gly Asn Ser Thr Leu His Thr Arg Leu Val Gly Thr
465 470 475 480
Phe Gly Tyr Met Pro Pro Glu Tyr Ala Gln Tyr Gly Asp Val Ser Pro
485 490 495
Lys Ile Asp Val Tyr Ala Phe Gly Val Val Leu Tyr Glu Leu Ile Thr
500 505 510
Ala Lys Asn Ala Val Leu Lys Thr Gly Glu Ser Val Ala Glu Ser Lys
515 520 525
Gly Leu Val Gln Leu Phe Glu Glu Ala Leu His Arg Met Asp Pro Leu
530 535 540
Glu Gly Leu Arg Lys Leu Val Asp Pro Arg Leu Lys Glu Asn Tyr Pro
545 550 555 560
Ile Asp Ser Val Leu Lys Met Ala Gln Leu Gly Arg Ala Cys Thr Arg
565 570 575
Asp Asn Pro Leu Leu Arg Pro Ser Met Arg Ser Ile Val Val Ala Leu
580 585 590
Met Thr Leu Ser Ser Pro Thr Glu Asp Cys Asp Asp Asp Ser Ser Tyr
595 600 605
Glu Asn Gln Ser Leu Ile Asn Leu Leu Ser Thr Arg
610 615 620
<210> 72
<211> 617
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 72
Met Ala Arg Ile Leu Met Arg Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Val Ala Ala Gly Asp Gly Cys Leu Asn Ser Gly Cys Val Ala Leu Gly
20 25 30
Ser Tyr Leu Val Ala Arg Asn Gln Asn Leu Thr Tyr Ile Ala Ser Leu
35 40 45
Phe Gly Ile Gly Asp Tyr His Ala Leu Ala Arg Tyr Asn Pro Gly Thr
50 55 60
Thr Asn Leu Asp Tyr Ile Gln Ala Gly Gln Ser Val Asn Ile Ser Phe
65 70 75 80
Thr Cys Gly Cys His Thr Phe Pro Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Leu Gly
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Gly Ser Phe Pro His Lys Val Val Thr Gly Asp Thr Tyr Gly Gly Ile
100 105 110
Ala Gln Asn Tyr Asn Asn Leu Thr Ser Ala Ala Trp Leu Ala Val Thr
115 120 125
Asn Pro Tyr Pro Thr Asn Asn Ile Pro Asp Thr Asn Thr Val Val Asn
130 135 140
Val Thr Val Asn Cys Thr Cys Gly Asp Pro Lys Ile Ser Ser Asp Tyr
145 150 155 160
Gly Phe Phe Leu Thr Tyr Pro Leu Met Gly Gln Thr Leu Ala Ala Val
165 170 175
Ala Ala Asn Tyr Ser Phe Asn Ser Ser Ser Gln Leu Asp Leu Leu Arg
180 185 190
Lys Tyr Asn Pro Gly Met Asp Thr Ala Thr Ser Gly Leu Val Phe Ile
195 200 205
Pro Val Lys Asp Gly Asn Gly Ser Tyr His Pro Leu Lys Pro Pro Gly
210 215 220
Asn Gly Gly Ser Ile Gly Ala Ile Val Gly Gly Val Val Gly Gly Val
225 230 235 240
Ala Ile Leu Val Leu Gly Val Leu Leu Tyr Ile Met Phe Tyr Arg Arg
245 250 255
Lys Lys Ala Asn Lys Ala Ala Leu Leu Pro Ser Ser Glu Asp Ser Thr
260 265 270
Gln Leu Ala Thr Thr Ser Met Asp Lys Ser Ala Leu Ser Thr Ser Gln
275 280 285
Ala Asp Ser Ser Ser Gly Val Pro Gly Ile Thr Val Asp Lys Ser Val
290 295 300
Glu Phe Ser Tyr Glu Glu Leu Phe Asn Ala Thr Glu Gly Phe Ser Met
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ile Gly Gln Gly Gly Phe Gly Ala Val Tyr Tyr Ala Glu
325 330 335
Leu Arg Gly Glu Lys Ala Ala Ile Lys Lys Met Asp Met Gln Ala Ser
340 345 350
His Glu Phe Leu Ala Glu Leu Lys Val Leu Thr His Val His His Leu
355 360 365
Asn Leu Val Arg Leu Ile Gly Phe Cys Thr Glu Ser Ser Leu Phe Leu
370 375 380
Val Tyr Glu Phe Ile Glu Asn Gly Asn Leu Ser Gln His Leu Arg Gly
385 390 395 400
Thr Gly Tyr Glu Pro Leu Ser Trp Ala Ala Arg Val Gln Ile Ala Leu
405 410 415
Asp Ser Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Ile His Glu His Thr Val Pro Val
420 425 430
Tyr Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Ala Asn Ile Leu Ile Asp Lys Asn
435 440 445
Tyr Arg Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Thr Lys Leu Thr Glu Val
450 455 460
Gly Asn Thr Ser Leu Pro Thr Arg Gly Ile Val Gly Thr Phe Gly Tyr
465 470 475 480
Met Pro Pro Glu Tyr Ala Arg Tyr Gly Asp Val Ser Pro Lys Val Asp
485 490 495
Val Tyr Ala Phe Gly Val Val Leu Tyr Glu Leu Ile Ser Ala Lys Asp
500 505 510
Ala Ile Val Arg Ser Thr Glu Ser Ser Ser Asp Ser Lys Gly Leu Val
515 520 525
Tyr Leu Phe Glu Glu Ala Leu Asn Thr Pro Asp Pro Lys Glu Gly Leu
530 535 540
Gln Arg Leu Ile Asp Pro Ala Leu Gly Glu Asp Tyr Pro Ile Asp Ser
545 550 555 560
Ile Leu Lys Met Thr Val Leu Ala Arg Ala Cys Thr Gln Glu Asp Pro
565 570 575
Lys Ala Arg Pro Thr Met Arg Ser Ile Val Val Ala Leu Met Thr Leu
580 585 590
Ser Ser Thr Ser Glu Phe Trp Asp Met Asn Ala Ile Gln Glu Asn Gln
595 600 605
Gly Val Val Asn Leu Met Ser Gly Arg
610 615
<210> 73
<211> 626
<212> PRT
<213> 大麦
<400> 73
Met Glu Ala Pro Leu His Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly Pro Lys Thr Ala Ala Ala Val Gly Asp Gly Cys Ser Arg
20 25 30
Gly Cys Asp Leu Ala Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Ala Pro Asn Gln Asn
35 40 45
Val Thr Tyr Ile Ala Ser Leu Phe Gly Phe Ser Glu Tyr Arg Val Leu
50 55 60
Gly Gln Tyr Asn Pro Gly Val Asn Asn Leu Asp Tyr Val Val Ala Gly
65 70 75 80
Asp Arg Leu Asn Val Ser Leu Thr Cys Lys Cys Leu Ala Ser Leu Ser
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100 105 110
Thr Gly Glu Thr Tyr Leu Arg Ile Ala Asp Asn Tyr Asn Asn Leu Thr
115 120 125
Thr Ala Asp Trp Leu Val Ala Thr Asn Thr Tyr Pro Ala Asn Asn Ile
130 135 140
Pro Asp Val Ala Thr Val Asn Ala Thr Val Asn Cys Ser Cys Gly Asp
145 150 155 160
Ala Gly Ile Ser Thr Asp Tyr Gly Leu Phe Leu Thr Tyr Pro Leu Arg
165 170 175
Asp Arg Glu Thr Leu Ala Ser Val Ala Ala Asn His Gly Phe Ser Ser
180 185 190
Pro Glu Lys Met Asp Leu Leu Lys Lys Tyr Asn Pro Gly Met Asp Gly
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Ile Ala Gly Gly Val Val Ala Gly Val Val Ala Leu Val Leu Gly Val
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Val Leu Phe Leu Phe Tyr Arg Arg Arg Lys Ala Lys Lys Asp Ala Leu
260 265 270
Leu Pro Ser Ser Glu Glu Ser Thr Arg Leu Ala Ser Ala Ile Ser Met
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<212> PRT
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<400> 79
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385 390 395 400
Ile Glu Pro Glu Glu Ser Asn Cys Tyr Leu Val Tyr Glu Tyr Val Glu
405 410 415
Asn Gly Ser Leu Tyr Ser Trp Leu His Glu Asp Lys Asn Glu Lys Leu
420 425 430
Asn Trp Val Thr Arg Leu Arg Ile Ala Val Asp Ile Ala Asn Gly Leu
435 440 445
Leu Tyr Ile His Glu His Thr Arg Pro Lys Val Val His Lys Asp Ile
450 455 460
Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser Asn Met Arg Ala Lys Ile Ala
465 470 475 480
Asn Phe Gly Leu Ala Lys Ser Gly Ile Asn Ala Ile Thr Met His Ile
485 490 495
Val Gly Thr Gln Gly Tyr Ile Ser Pro Glu Tyr Leu Ala Asp Gly Ile
500 505 510
Val Ser Thr Lys Met Asp Val Phe Ser Phe Gly Ile Val Leu Leu Glu
515 520 525
Leu Ile Ser Gly Lys Glu Val Ile Asp Glu Glu Gly Asn Val Leu Trp
530 535 540
Ala Ser Ala Ile Lys Thr Phe Glu Val Lys Asn Glu Gln Glu Lys Ala
545 550 555 560
Arg Arg Leu Lys Glu Trp Leu Asp Arg Thr Met Leu Lys Glu Thr Cys
565 570 575
Ser Met Glu Ser Leu Met Gly Val Leu His Val Ala Ile Ala Cys Leu
580 585 590
Asn Arg Asp Pro Ser Lys Arg Pro Ser Ile Ile Asp Ile Val Tyr Ser
595 600 605
Leu Ser Lys Cys Glu Glu Ala Gly Phe Glu Leu Ser Asp Asp Gly Phe
610 615 620
Gly Ser Glu Arg Leu Val Ala Arg
625 630
<210> 80
<211> 423
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 80
Met Lys Asn Pro Glu Lys Pro Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Leu Ala Ser Met Ala Thr Ala Lys Ser Thr Ile Glu Pro Cys Ser
20 25 30
Ser Lys Asp Thr Cys Asn Ser Leu Leu Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr Asp
35 40 45
Leu Lys Val Thr Glu Val Ala Ser Leu Phe Gln Val Asp Pro Val Ser
50 55 60
Met Leu Leu Ser Asn Ser Ile Asp Ile Ser Tyr Pro Asp Val Glu Asn
65 70 75 80
His Val Leu Pro Ala Lys Leu Phe Leu Lys Ile Pro Ile Thr Cys Ser
85 90 95
Cys Val Asp Gly Ile Arg Lys Ser Leu Ser Thr His Tyr Lys Thr Arg
100 105 110
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115 120 125
Val Ser Pro Glu Gln Ile Gln Val Ala Asn Ser Glu Thr Asp Leu Ser
130 135 140
Val Leu Asp Val Gly Thr Lys Leu Val Ile Pro Leu Pro Cys Ala Cys
145 150 155 160
Phe Asn Gly Thr Asp Glu Ser Leu Pro Ala Leu Tyr Leu Ser Tyr Val
165 170 175
Val Arg Gly Ile Asp Thr Met Ala Gly Ile Ala Lys Arg Phe Ser Thr
180 185 190
Ser Val Thr Asp Leu Thr Asn Val Asn Ala Met Gly Ala Pro Asp Ile
195 200 205
Asn Pro Gly Asp Ile Leu Ala Val Pro Leu Leu Ala Cys Ser Ser Asn
210 215 220
Phe Pro Lys Tyr Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ile Ile Pro Asn Gly Ser
225 230 235 240
Tyr Ala Leu Thr Ala Gly His Cys Val Gln Cys Ser Cys Val Leu Gly
245 250 255
Ser Arg Ser Met Tyr Cys Glu Pro Ala Ser Ile Ser Val Ser Cys Ser
260 265 270
Ser Met Arg Cys Arg Asn Ser Asn Phe Met Leu Gly Asn Ile Thr Ser
275 280 285
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305 310 315 320
Arg Cys Pro Gly Pro Gln Gln Leu Ala Pro Leu Ile Ala Pro Pro Asp
325 330 335
Asn Val Pro Lys Glu Leu Met Tyr Leu Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro
340 345 350
Ser Pro Glu Phe Asp Asp Ile Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ile Ala Ala
355 360 365
Val Pro Ala Ala Ser Pro Gly Gly Ala Thr Val Ser Ser Ser Asn Ser
370 375 380
Ile Pro Gly Asn Pro Ala Asn Gly Pro Gly Gly Ser Ile Ser Ile Ala
385 390 395 400
Ser Cys Pro Leu Ser Tyr Tyr Ser Phe Ile Ala Leu Leu Ile Pro Ile
405 410 415
Gly Ser Cys Phe Phe Val Phe
420
<210> 81
<211> 382
<212> PRT
<213> Oryza sativa Japonica Group
<400> 81
Pro Ala Pro Val Ser Thr Arg Gln Ser Asn Lys His Gln Ala Ser His
1 5 10 15
Ser His Leu Ser Arg Arg Ala Phe Pro Thr Met Ala Ser Leu Thr Ala
20 25 30
Ala Leu Ala Thr Pro Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ser Ala Ala Asn Phe Thr Cys Ala Val Ala Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Gly Asn Leu Val Ala Arg Phe Asn Thr Thr Thr Leu Pro Asp Leu
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Asp Gly Leu Asp Ala Ile Ala Arg Asn Val Phe Asn Ala Phe Val Thr
145 150 155 160
Tyr Gln Glu Ile Ala Ala Ala Asn Asn Ile Pro Asp Pro Asn Lys Ile
165 170 175
Asn Val Ser Gln Thr Leu Trp Ile Pro Leu Pro Cys Ser Cys Asp Lys
180 185 190
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195 200 205
Glu Asn Thr Ser Ala Ile Ala Ala Lys Tyr Gly Val Thr Glu Ser Thr
210 215 220
Leu Leu Thr Arg Asn Lys Ile Asp Asp Pro Thr Lys Leu Gln Met Gly
225 230 235 240
Gln Ile Leu Asp Val Pro Leu Pro Val Cys Arg Ser Ser Ile Ser Asp
245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
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340 345 350
Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gln Phe Ala Arg Ser Met Trp Ser Met Ser
355 360 365
Val Ile Ser Phe His Met Val Leu Ile Ile Ile Cys Phe Leu
370 375 380
<210> 82
<211> 350
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 82
Met Glu Thr Ser Cys Phe Thr Leu Leu Gly Leu Leu Val Ser Leu Ser
1 5 10 15
Phe Phe Leu Thr Leu Ser Ala Gln Met Thr Gly Asn Phe Asn Cys Ser
20 25 30
Gly Ser Thr Ser Thr Cys Gln Ser Leu Val Gly Tyr Ser Ser Lys Asn
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Leu Val Thr Tyr Glu Lys Ile Ser Glu Val Asn Lys Ile Pro Asp Pro
130 135 140
Asn Lys Ile Glu Ile Gly Gln Lys Phe Trp Ile Pro Leu Pro Cys Ser
145 150 155 160
Cys Asp Lys Leu Asn Gly Glu Asp Val Val His Tyr Ala His Val Val
165 170 175
Lys Leu Gly Ser Ser Leu Gly Glu Ile Ala Ala Gln Phe Gly Thr Asp
180 185 190
Asn Thr Thr Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ile Ile Gly Asp Ser Gln Leu
195 200 205
Leu Ala Asp Lys Pro Leu Asp Val Pro Leu Lys Ala Cys Ser Ser Ser
210 215 220
Val Arg Lys Asp Ser Leu Asp Ala Pro Leu Leu Leu Ser Asn Asn Ser
225 230 235 240
Tyr Val Phe Thr Ala Asn Asn Cys Val Lys Cys Thr Cys Asp Ala Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asn Ala Ser Cys Arg Gln Pro Arg Asp Cys Val Tyr Ala Gly Tyr Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Pro Asp Asn Tyr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Ser Phe Asn Phe Val
325 330 335
Ile Val Leu Ile Gln Cys Ala Leu Leu Cys Leu Cys Leu Leu
340 345 350
<210> 83
<211> 632
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 83
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Asn Leu Ser Ile Gly Asp Asn Ala Val Phe Pro Ile Phe Cys Lys Cys
165 170 175
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195 200 205
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Thr Ile Val Pro Ser Pro Ala Pro Arg Gly Asn Ser Asp Asp Gly Asp
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Gly Ile Leu Gly Phe Leu Leu Ile Leu Val Ile Val Phe Trp Phe Tyr
275 280 285
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290 295 300
Gly Asp Lys Gly Tyr Lys Gly Asn Asp Glu Lys Lys Lys Lys Met Asp
305 310 315 320
Val Asn Phe Met Ala Asn Val Ser Asp Cys Leu Asp Lys Tyr Arg Val
325 330 335
Phe Gly Phe Asp Glu Leu Val Glu Ala Thr Asp Gly Phe Asp Glu Arg
340 345 350
Phe Leu Ile Gln Gly Ser Val Tyr Lys Gly Glu Ile Asp Gly Gln Val
355 360 365
Tyr Ala Ile Lys Lys Met Lys Trp Asn Ala Tyr Glu Glu Leu Lys Ile
370 375 380
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385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Asn Phe Gly Leu Ala Lys Ser Gly Ile Asn Ala Ile Thr Met His Ile
485 490 495
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500 505 510
Val Ser Thr Lys Met Asp Val Phe Ser Phe Gly Ile Val Leu Leu Glu
515 520 525
Leu Ile Ser Gly Lys Glu Val Ile Asp Glu Glu Gly Asn Val Leu Trp
530 535 540
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545 550 555 560
Arg Arg Leu Lys Glu Trp Leu Asp Arg Thr Met Leu Lys Glu Thr Cys
565 570 575
Ser Met Glu Ser Leu Met Gly Val Leu His Val Ala Ile Ala Cys Leu
580 585 590
Asn Arg Asp Pro Ser Lys Arg Pro Ser Ile Ile Asp Ile Val Tyr Ser
595 600 605
Leu Ser Lys Cys Glu Glu Ala Gly Phe Glu Leu Ser Asp Asp Gly Phe
610 615 620
Gly Ser Glu Arg Leu Val Ala Arg
625 630
<210> 84
<211> 647
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 84
Met Arg Pro Pro Ala Leu Arg Leu Ser Ala Leu Leu Leu Phe Leu Cys
1 5 10 15
Leu Tyr Ala Ala Pro Ala Arg Ser Gln Asn Ala Thr Thr Val Thr Ala
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Ala Pro Ala Ser Val Glu Gly Phe Asn Cys Ser Val Asn Arg Thr Tyr
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Pro Cys Gln Ala Tyr Ala Leu Tyr Arg Ala Gly Phe Ala Gly Val Pro
50 55 60
Leu Asn Leu Ala Ala Ile Gly Asp Leu Phe Ala Ala Ser Arg Phe Met
65 70 75 80
Val Ala His Ala Asn Asn Leu Ser Thr Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly
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100 105 110
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130 135 140
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180 185 190
Ser Thr Ile Ala Ala Ala Phe Ser Val Asp Ala Gln Ser Leu Val Ser
195 200 205
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210 215 220
Pro Leu Arg Arg Gln Val Pro Gly Trp Leu Pro Pro Ile Val Leu Arg
225 230 235 240
Asn Asn Ala Ser Ala Thr Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ser Ala Ser Pro
245 250 255
Asn Ala Thr Val Val Arg Asn Asp Arg Asn Gly Val Val Thr Gly Leu
260 265 270
Ala Val Gly Leu Gly Val Val Gly Ala Leu Trp Leu Leu Gln Met Leu
275 280 285
Leu Leu Ala Cys Leu Cys Arg Arg Leu Arg Ala Asn Gly Arg Arg Gly
290 295 300
Asp Ala Val Leu Ser Gly Asp Gly Val Glu Gly Gly Val Phe Ala Lys
305 310 315 320
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Glu Arg Phe Leu Val Ser
325 330 335
Asp Met Ser Glu Trp Leu Asp Lys Tyr Arg Val Phe Thr Val Glu Glu
340 345 350
Leu Glu Arg Gly Thr Gly Gly Phe Asp Asp Ala His Leu Val Asn Gly
355 360 365
Ser Val Tyr Lys Ala Asn Ile Asp Gly Leu Val Phe Ala Val Lys Lys
370 375 380
Met Lys Trp Asp Ala Cys Glu Glu Leu Lys Ile Leu Gln Lys Val Asn
385 390 395 400
His Ser Asn Leu Val Lys Leu Glu Gly Phe Cys Ile Asp Ser Ala Thr
405 410 415
Gly Asp Cys Tyr Leu Val Tyr Glu Tyr Val Glu Asn Gly Ser Leu Asp
420 425 430
Leu Trp Leu Leu Asp Arg Asp His Ala Arg Arg Leu Asn Trp Arg Ala
435 440 445
Arg Leu His Ile Ala Leu Asp Leu Ala His Gly Leu Gln Tyr Ile His
450 455 460
Glu His Thr Trp Pro Arg Val Val His Lys Asp Met Lys Ser Ser Asn
465 470 475 480
Val Leu Leu Asp Ala Arg Met Arg Ala Lys Ile Ala Asn Phe Gly Leu
485 490 495
Ala Lys Thr Gly His Asn Ala Ile Thr Thr His Ile Val Gly Thr Gln
500 505 510
Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Leu Ala Asp Gly Leu Val Thr Thr Lys
515 520 525
Ile Asp Val Phe Ala Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Val Ser Gly
530 535 540
Arg Glu Ala Ala Asp Glu Ser Gly Glu Pro Leu Trp Ala Asp Ala Glu
545 550 555 560
Asp Arg Val Phe Arg Gly Arg Asp Glu Arg Leu Glu Ala Arg Val Ala
565 570 575
Ala Trp Met Asp Pro Ala Leu Ala Glu Gln Thr Cys Pro Leu Gly Ser
580 585 590
Val Ala Thr Val Val Ser Val Ala Arg Ala Cys Leu His Lys Asp Pro
595 600 605
Ser Lys Arg Pro Ser Met Val Asp Val Ala Tyr Thr Leu Ser Lys Ala
610 615 620
Asp Glu His Phe Ala Asp Tyr Ser Gly Glu Ser Val Ser Val Asp Gly
625 630 635 640
Ser Gly Glu Ile Ala Ala Arg
645
<210> 85
<211> 680
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 85
Met Ala Pro Pro Pro Gln Pro Glu Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Leu Ala Ala Ala Val Pro Ala Arg Ala Gln Gln Glu
20 25 30
Tyr Glu Ala Asn Lys Gln Asn Ala Cys Tyr Ala Thr Asn Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Gly Tyr Thr Cys Asn Ala Thr Ala Ala Ser Thr Pro Ala Cys
50 55 60
Glu Ser Tyr Leu Ile Phe Arg Ser Ser Pro Ser Tyr Tyr Asn Thr Pro
65 70 75 80
Val Ser Ile Ser Tyr Leu Leu Asn Ser Ser Pro Ala Thr Val Ala Ala
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Ala Asn Ala Val Pro Thr Val Ser Pro Leu Ala Ala Ser Ser Leu Val
100 105 110
Leu Val Pro Val Pro Cys Ala Cys Thr Pro Gly Gly Tyr Tyr Gln His
115 120 125
Asn Ser Ser Tyr Thr Ile Glu Phe Gln Ser Glu Thr Tyr Phe Ile Ile
130 135 140
Ala Asn Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Thr Thr Cys Gln Ala Leu Ile Ala
145 150 155 160
Gln Asn Pro Leu His Asp Ser Arg Gly Leu Val Ala Gly Asn Asn Leu
165 170 175
Thr Val Pro Leu Arg Cys Ala Cys Pro Ser Pro Ala Gln Ala Ala Lys
180 185 190
Gly Phe Arg Tyr Leu Leu Ser Tyr Leu Val Met Trp Gly Asp Gly Val
195 200 205
Pro Ser Ile Ala Ala Arg Phe Arg Val Asp Pro Gln Ala Val Leu Asp
210 215 220
Ala Asn Ser Leu Thr Ala Asp Asp Ile Ile Phe Pro Phe Thr Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ile Pro Leu Lys Ala Ala Pro Thr Pro Asp Met Leu Ala Ser Pro
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Gly Gly Ser Gly Ser Gly Lys Trp Val Gly Val Gly Val Gly Leu Gly
275 280 285
Cys Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ile Leu Gly Leu Leu Phe Leu Arg
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Thr Arg Arg Arg Arg Gly Gln Arg Phe Ala Asp Gly Glu Ser Val Arg
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325 330 335
Ala Leu Ala Ser Gly Lys Gln Thr Ser Asn Thr Thr Thr Ser Thr Thr
340 345 350
Ser Ser Ala Thr Arg Ser Leu Val Ala Ser Asp Val Arg Gly Ala Val
355 360 365
Glu Ser Leu Thr Val Tyr Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Lys Ala Thr Ala
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Gly Phe Ala Glu Glu Arg Gln Val Pro Gly Thr Ser Val Phe Arg Ala
385 390 395 400
Val Ile Asn Gly Asp Ala Ala Ala Val Lys Leu Val Ala Gly Asp Val
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Arg Leu Ser Gly Leu Cys Val His Arg Gly Asp Thr Tyr Leu Val Phe
435 440 445
Glu Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Ser Asp Trp Ile His Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Thr Leu Arg Trp Arg Gln Arg Val Gln Val Ala Phe Asp Val
465 470 475 480
Ala Asp Gly Leu Asn Tyr Leu His His Tyr Thr Asn Pro Pro Cys Val
485 490 495
His Lys Asn Leu Lys Ser Ser Asn Val Leu Leu Asp Ala Asp Leu Arg
500 505 510
Ala Lys Val Ser Ser Phe Gly Leu Ala Arg Thr Val Ala Ala Ser Asp
515 520 525
Gly Gly Ala Gln Leu Thr Arg His Val Ala Gly Thr Gln Gly Tyr Leu
530 535 540
Ala Pro Glu Tyr Leu Glu Asp Gly Leu Ile Thr Pro Lys Leu Asp Val
545 550 555 560
Phe Ala Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Leu Ser Gly Lys Glu Ala
565 570 575
Ala Phe Ala Asp Ala Gly Thr Gly Glu Glu Thr Leu Leu Trp Glu Ala
580 585 590
Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Asp Gly Gly Glu Asp Val Asp Arg Ala
595 600 605
Lys Val Arg Ala Phe Met Asp Pro Arg Leu His Gly Asp Phe Pro Ile
610 615 620
Asp Leu Ala Leu Ala Met Ala Ala Leu Ala Leu Arg Cys Val Ala Thr
625 630 635 640
Glu Pro Arg Ala Arg Pro Ala Met Asp Glu Val Phe Val Ser Leu Thr
645 650 655
Ala Val His Asn Ser Thr Leu Asp Trp Asp Pro Ser Asp Tyr Gly Thr
660 665 670
Ser Gly Ser Ser Met Val Gly Arg
675 680
<210> 86
<211> 684
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 86
Met Met Ala Ser Pro Pro Gln Thr Glu Leu Gln Ala Val Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Pro Ala Arg Ala Gln Gln
20 25 30
Glu Tyr Glu Ala Asn Lys Gln Asn Ala Cys Tyr Ala Thr Asn Ala Ser
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Ser Val Leu Gly Tyr Thr Cys Asn Ala Thr Thr Ala Ser Thr Pro Ala
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Pro Val Ser Ile Ser Tyr Leu Leu Asn Ser Ser Val Ser Ala Thr Ala
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Ala Ala Asn Ala Val Pro Ser Val Ser Pro Leu Ala Pro Ser Ser Leu
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Val Leu Val Pro Val Pro Cys Ala Cys Thr Pro Gly Gly Tyr Tyr Gln
115 120 125
His Asn Ser Ser Tyr Thr Ile Gln Phe Arg Gly Glu Thr Tyr Phe Ile
130 135 140
Ile Ala Asn Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Thr Thr Cys Gln Ala Leu Ile
145 150 155 160
Ala His Asn Pro Leu His Asp Ser Arg Gly Leu Val Ala Gly Asn Asn
165 170 175
Leu Thr Val Pro Leu Arg Cys Ala Cys Pro Ser Pro Ala Gln Ala Ala
180 185 190
Lys Gly Phe Lys Tyr Leu Leu Ser Tyr Leu Ile Met Trp Gly Asp Asp
195 200 205
Val Thr Ser Ile Ala Ala Arg Phe Arg Ala Asp Pro Gln Ala Val Leu
210 215 220
Asp Ala Asn Ser Leu Thr Ala Asp Asp Ile Ile Phe Pro Phe Thr Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ile Pro Leu Lys Thr Ala Pro Thr Leu Asp Met Leu Ala Ser
245 250 255
Thr Ala Pro Pro Pro Ala Pro Thr Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro
260 265 270
Ser Gly Arg Ser Gly Ser Gly Lys Leu Val Gly Phe Gly Val Gly Leu
275 280 285
Gly Cys Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Ile Leu Gly Leu Leu Phe Leu
290 295 300
Arg Ala Arg Arg Arg Gln Arg Leu Pro Val Gly Glu Ser Val Arg Gln
305 310 315 320
Gly Ser Lys Val Val Ile Asp Val Ser Ser Ser Ala Asp Tyr Gly Ala
325 330 335
Leu Ala Ser Gly Lys Lys Ile Thr Asn Thr Thr Thr Ser Ser Met Ser
340 345 350
Ser Ala Ala Trp Ser Leu Val Ala Ser Asp Val Arg Gly Ala Val Glu
355 360 365
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370 375 380
Phe Ala Glu Glu His Gln Val Pro Gly Thr Ser Val Tyr Arg Ala Val
385 390 395 400
Ile Asn Gly Asp Ala Ala Ala Val Lys Arg Leu Ala Gly Asp Val Ser
405 410 415
Gly Glu Val Gly Ile Leu Met Arg Val Asn His Ser Cys Leu Val Arg
420 425 430
Leu Ser Gly Leu Cys Val His Arg Gly Asp Thr Tyr Leu Val Phe Glu
435 440 445
Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Ser Asp Trp Ile His Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Cys Ser Gly Ser Asn Thr Leu Arg Trp Arg Gln Arg Val Gln Val
465 470 475 480
Ala Phe Asp Ile Ala Asp Gly Leu Asn Tyr Leu His His Tyr Thr Asn
485 490 495
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Gln Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Leu Glu Asp Gly Leu Ile Thr Pro
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Lys Leu Asp Val Phe Ala Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Leu Ser
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Leu Cys Glu Ser Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Asp Gly Gly Glu Asp
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Met Asp Arg Ala Lys Val Arg Ala Phe Met Asp Pro Arg Leu His Gly
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485 490 495
Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Leu Arg Ser Asn
500 505 510
Asp Ala Glu Ala Ser Val Thr Lys Val Val Gly Thr Phe Gly Tyr Leu
515 520 525
Ala Pro Glu Tyr Leu Arg Asp Gly Leu Ala Thr Ala Lys Cys Asp Val
530 535 540
Tyr Ala Phe Gly Val Val Leu Phe Glu Leu Ile Ser Gly Lys Glu Ala
545 550 555 560
Ile Thr Lys Ala Asp Ala Val Gly Ala Ser Ser Asn Ser Glu Arg Arg
565 570 575
Ser Leu Ala Ser Val Val Ser Phe Leu Thr Cys Thr Gln Ala Val Ile
580 585 590
Gln Ser Thr Ala Cys Val Phe Ala Val Ile Ser Leu Pro Lys Val Tyr
595 600 605
Ile Gly Ile Ser Ser Thr Ser Phe Tyr Thr Ser Asn Leu Lys Asp Leu
610 615 620
Ser Arg Phe Gly Leu Thr Gly Gln Met Leu Thr Ala Leu Arg Asn Cys
625 630 635 640
His Asp Pro Thr Cys Val Gly Ser Leu Lys Asp Cys Ile Asp Pro Asn
645 650 655
Leu Met Asp Leu Tyr Pro His Asp Cys Ile Tyr Gln Met Ala Met Leu
660 665 670
Ala Lys Gln Cys Ala Asp Glu Asp Pro Val Leu Arg Pro Asp Met Lys
675 680 685
Gln Ala Val Ile Thr Leu Ser Gln Ile Leu Leu Ser Ser Ile Glu Trp
690 695 700
Glu Ala Thr Leu Gly Gly Asn Ser Gln Val Phe Ser Gly Leu Val Ala
705 710 715 720
Gly Arg
<210> 93
<211> 613
<212> PRT
<213> 大麦
<400> 93
Met Pro Pro Pro Pro Ala Tyr His His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Arg Leu His Gly Ala Ile Ala Ser Ala Thr Gly Phe Thr Cys
20 25 30
Thr Lys Pro Ser Thr Cys Gln Ser Ala Val Ile Gly Tyr Val Val Pro
35 40 45
Asn Thr Ile Thr Tyr Lys Glu Leu Ile Ser Gln Phe Ser Pro Thr Thr
50 55 60
Leu His Asp Val Val Ala Ala Asn Gln Leu Pro Phe Asn Thr Ala Thr
65 70 75 80
Lys Gln Val Ile Pro Pro Lys Thr Thr Leu Thr Ile Pro Phe Arg Cys
85 90 95
Arg Cys Thr Gly Asn Gly Ile Gly Gln Ser Gly Leu Tyr Ile Ala Gln
100 105 110
Asn Lys Leu Asp Asp Gly Leu Ala Thr Tyr Gln Pro Glu Ile Val Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Ile Ala Asp Asn Ala Ala Asn Trp Lys Gly Trp Ile Pro
130 135 140
Leu Pro Cys Ser Cys Asp Gly Ala Asp Val Thr His Phe Pro Tyr Ile
145 150 155 160
Val Arg Ser Gly Asp Ser Ala Leu Ala Ile Ala Ala Lys Tyr Gly Val
165 170 175
Leu Leu Ser Val Leu Leu Glu Ile Asn Asn Ile Thr Asn His Ala Ser
180 185 190
Leu Tyr Gln Gly Gln Val Leu Asp Ile Pro Leu Gln Gly Lys Val Gly
195 200 205
Glu Glu Leu Ser Ser Met Gly Arg Trp Ser Arg Val Tyr Tyr Ile Ser
210 215 220
Gly Tyr Arg Lys Arg Arg Leu Gly Trp Phe Asn Ser Ala Ala Ala Glu
225 230 235 240
Gln Ser Ala His Ala Ala Ala Glu Ala Val Ala Ala Thr Lys Glu Ala
245 250 255
Ala Glu Asn Ser His Tyr Ser Pro Glu Ala Ala Asp Thr Val Val Lys
260 265 270
Arg Val Leu Val Leu Leu Leu Ile Ile Ile Ile Leu Ser Leu Leu Tyr
275 280 285
Phe Thr Phe Tyr Tyr Trp Lys Ser Ala Cys Glu Ser Leu Ser Ser Arg
290 295 300
Thr Asn Gly Val Ile Gln Phe Tyr Tyr Ser Asp Leu Ala Arg Ala Thr
305 310 315 320
His Arg Phe Ser Lys Glu Ser Lys Ile Gly Glu Gly Gln Tyr Gly Thr
325 330 335
Val Tyr Lys Ala Thr Ile Lys Gly His Glu Met Ala Val Lys Lys Leu
340 345 350
Lys Ala Glu Gly Glu Thr Lys Glu Leu His Arg Glu Leu Gln Thr Ile
355 360 365
Ser Asn Thr Lys His Thr Asn Leu Val Ser Leu Lys Gly Trp Cys Gly
370 375 380
Arg Leu Arg Leu Ile Asp Gly Lys Ser Cys Trp Lys Arg Gln Ile Lys
385 390 395 400
Val Glu Leu Leu Leu Val Phe Glu Trp Ile Pro Asn Gly Asn Leu Ala
405 410 415
Asp His Leu His Asn Arg Glu Gln Val Leu Ser Trp Glu Lys Arg Tyr
420 425 430
Lys Ile Val Lys Gly Ile Gly Ser Ala Leu Arg Tyr Leu His His Glu
435 440 445
Cys Lys Pro Ser Ile Leu His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Ile Leu
450 455 460
Leu Asp Tyr His Phe Asn Ala Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ser Met
465 470 475 480
Ile Thr Asp Gln Asn Gly Ala Thr Val Phe Thr Ile Ala Ile Gly Pro
485 490 495
Arg Arg Tyr Met Asp Pro Gln Leu Met Lys Glu Gly Glu Phe Arg Phe
500 505 510
Asn His Lys Ser Asp Ile Tyr Ser Phe Gly Ile Val Leu Leu Glu Ile
515 520 525
Ala Cys Thr Gly Lys Ser Arg Glu Asn Ile Leu His Ile Leu Gly Gly
530 535 540
Gly Ser Gly Gln His Val Gln Val Asp Gly Leu Ala Asp His Arg Leu
545 550 555 560
Ser Ile Phe Asp Arg Thr Glu Met Ala Arg Val Val Val Leu Gly Leu
565 570 575
Gln Cys Ser His Pro Asp Glu Arg Gln Arg Pro Ser Met Tyr Met Ala
580 585 590
Met Arg Phe Leu Glu Glu Gly Ile Glu Leu Pro Ile Ala Ser His Asn
595 600 605
Arg Arg Glu Arg Leu
610
<210> 94
<211> 416
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 94
Met Lys Ile Pro Glu Lys Pro Ile Phe Leu Ile Phe Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Ser Ser Leu Thr Phe Thr Ala Thr Ala Lys Ser Thr Ile Glu
20 25 30
Pro Cys Ser Ser Asn Asp Thr Cys Asn Ala Leu Leu Gly Tyr Thr Leu
35 40 45
Tyr Thr Asp Leu Lys Val Ser Glu Val Ala Ser Leu Phe Gln Val Asp
50 55 60
Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ala Asn Ala Ile Asp Ile Ser Tyr Pro Asp
65 70 75 80
Val Glu Asn His Ile Leu Pro Ser Lys Leu Phe Leu Lys Ile Pro Ile
85 90 95
Thr Cys Ser Cys Val Asp Gly Ile Arg Lys Ser Val Ser Thr His Tyr
100 105 110
Lys Thr Arg Pro Ser Asp Asn Leu Gly Ser Ile Ala Asp Ser Val Tyr
115 120 125
Gly Gly Leu Val Ser Ala Glu Gln Ile Gln Glu Ala Asn Ser Val Asn
130 135 140
Asp Pro Ser Leu Leu Asp Val Gly Thr Ser Leu Val Ile Pro Leu Pro
145 150 155 160
Cys Ala Cys Phe Asn Gly Thr Asp Asn Ser Leu Pro Ala Val Tyr Leu
165 170 175
Ser Tyr Val Val Lys Glu Ile Asp Thr Leu Val Gly Ile Ala Arg Arg
180 185 190
Tyr Ser Thr Thr Ile Thr Asp Leu Met Asn Val Asn Ala Met Gly Ala
195 200 205
Pro Asp Val Ser Ser Gly Asp Ile Leu Ala Val Pro Leu Ser Ala Cys
210 215 220
Ala Ser Lys Phe Pro Arg Tyr Ala Ser Asp Phe Gly Leu Ile Val Pro
225 230 235 240
Asn Gly Ser Tyr Ala Leu Ala Ala Gly His Cys Val Gln Cys Ser Cys
245 250 255
Ala Leu Gly Ser Arg Asn Leu Tyr Cys Glu Pro Ala Ser Leu Ala Val
260 265 270
Ser Cys Ser Ser Met Gln Cys Arg Asn Ser Asn Leu Met Leu Gly Asn
275 280 285
Ile Thr Val Gln Gln Thr Ser Ala Gly Cys Asn Val Thr Thr Cys Asp
290 295 300
Tyr Asn Gly Ile Ala Asn Gly Thr Ile Leu Thr Met Leu Thr Arg Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Arg Cys Pro Gly Pro Gln Gln Phe Ala Pro Leu Leu Ala
325 330 335
Pro Pro Asp Thr Val Pro Arg Asp Val Met Tyr Ala Pro Ala Pro Ser
340 345 350
Pro Asp Phe Asp Gly Pro Gly Ser Ile Ala Ser Ser Pro Arg Ser Ser
355 360 365
Met Leu Pro Gly Gly Gly Ile Leu Pro Gly Asn Pro Ala Asn Gly Pro
370 375 380
Ala Gly Ser Ile Ser Thr Ala Ser Ala Ser Ser Val Ser Tyr Phe Phe
385 390 395 400
Ile Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ala Ser Phe Ser Leu Ala Leu Ser Ser
405 410 415
<210> 95
<211> 415
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 95
Met Arg Met Gln Gln Gln Gln Ser Thr Leu Leu Phe Leu Val Val Leu
1 5 10 15
Leu Phe His Ser Leu Thr Thr Thr Thr Cys Lys Ser Thr Ile Glu Pro
20 25 30
Cys Thr Asn Ser Asp Ser Cys Asn Ala Leu Leu Gly Tyr Thr Leu Tyr
35 40 45
Thr Asp Leu Lys Val Ser Glu Val Ala Ser Leu Phe Gly Ile Asp Pro
50 55 60
Ile Ser Leu Leu Thr Ala Asn Ala Ile Asp Ile Ser Tyr Pro Asp Ala
65 70 75 80
Glu His His Ile Leu Pro Pro Lys Leu Phe Leu Lys Ile Pro Ile Ser
85 90 95
Cys Ser Cys Val Asp Gly Ile Arg Lys Ser Val Ser Thr Ser Tyr Lys
100 105 110
Thr Arg Pro Ser Asp Thr Leu Ser Ser Ile Ala Asp Ser Val Tyr Gly
115 120 125
Gly Leu Val Ser Ala Asp Gln Leu Thr Asp Pro Ser Val Leu Asp Val
130 135 140
Gly Gln Ser Leu Val Val Pro Leu Pro Cys Thr Cys Phe Asn Gly Ser
145 150 155 160
Asp Asn Ser Leu Pro Ala Ile Tyr Leu Ser Tyr Val Val Gln Pro Val
165 170 175
Asp Ser Leu Ala Ala Ile Ala Ala Arg Tyr Leu Thr Thr Leu Thr Asp
180 185 190
Leu Met Asn Val Asn Ala Met Gly Ser Thr Ala Ile Ser Asp Gly Asp
195 200 205
Ile Leu Ala Val Pro Ile Pro Ala Cys Ala Ser Asn Phe Pro Lys Ser
210 215 220
Ala Ser Asp Phe Gly Leu Leu Val Pro Asn Gly Ser Tyr Ala Ile Thr
225 230 235 240
Ala Gly His Cys Val Gln Cys Ser Cys Gly Pro Arg Asn Leu Asn Leu
245 250 255
Tyr Cys Met Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Cys Ser Ser Met Gln Cys
260 265 270
Lys Asn Ser Asn Leu Met Leu Gly Asn Val Thr Ala Gln Gln Ser Ser
275 280 285
Ala Gly Cys Asn Val Ser Ser Cys Ser Tyr Asp Gly Leu Val Asn Gly
290 295 300
Thr Ile Ala Thr Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gln Pro Arg Cys Pro Gly
305 310 315 320
Leu Gln Glu Phe Pro Pro Leu Val Ala Pro Pro Thr Ser Val Glu Lys
325 330 335
Asp Pro Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Pro Gln Ser
340 345 350
His Gly Ser Gly Leu Pro Ser Pro Lys Ser Ser Gly Met Pro Gly Leu
355 360 365
Pro Gly Phe Ser Pro Ala Asn Gly Pro Val Ser Gly Ile Ser Ser Gly
370 375 380
Ala Ser Ala Ala Cys Ser Leu Val Lys Pro Ser Pro Thr Leu Thr Ser
385 390 395 400
Ala Leu Val Leu Leu Leu Ala Met Leu Val Ile Pro Val Ala Leu
405 410 415
<210> 96
<211> 394
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 96
Met Arg Asn His Leu Gln Phe Leu Trp Arg His Ile Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Val Ser Tyr Gln Val Glu Ala Lys Ser Thr Ile Glu Pro
20 25 30
Cys Ser Ser Gly Phe Pro Cys Pro Ser Leu Leu Ser Tyr Ile Leu Pro
35 40 45
Trp Asp Ser Lys Leu Ser Glu Ile Ala Thr Arg Phe Ser Val Asn Val
50 55 60
Ser Asn Ile Leu Ala Ala Asn Ser Val Phe Pro Ile Thr Pro Ser Ser
65 70 75 80
Gly His Gln Ile Leu Ser Ala Lys Ser Ile Val Lys Ile Pro Phe Ser
85 90 95
Cys Pro Cys Val Asp Gly Ile Arg Arg Ser Ile Ser Thr Ile Tyr Asn
100 105 110
Val Glu Ala Ser Asp Thr Leu Ala Ser Ile Ser Glu Gly Tyr Gly Gly
115 120 125
Leu Val Ser Ala Glu Gln Ile Lys Thr Met Asn Ser Ile Asn Glu Thr
130 135 140
Asn Pro Leu Thr Tyr Gly Ser Ser Ile Val Ile Pro Leu Pro Cys Lys
145 150 155 160
Cys Leu Asn Asn Val Asn Asn Gly Asp Thr Thr Val Tyr Met Ser Tyr
165 170 175
Val Val Gln Lys Gly Gln Ser Leu Gly Ser Ile Ala Thr Met Tyr Gly
180 185 190
Thr Thr Val Ser Asp Leu Glu Ser Val Asn Gly Leu Gly Gln Asn Ala
195 200 205
Val Asp Pro Gly Asp Ile Leu Ser Val Pro Val Ala Ala Cys Ser Ser
210 215 220
Ala Thr Leu Asn Trp Tyr Ser Glu Asn Leu Ile Val Pro Asn Gly Ser
225 230 235 240
Tyr Ile Leu Thr Ala Ser Asn Cys Ile Gln Cys Thr Cys Thr Pro Arg
245 250 255
Asp Leu Lys Met Glu Cys Leu Pro Ser Gly Met Asp Val Pro Cys Tyr
260 265 270
Asn Leu His Cys Lys Gly Ser Asn Leu Ile Ile Gly Asn Glu Tyr Val
275 280 285
Glu His Ser Gln Thr Ser Cys Asn Val Ser Gln Cys Val Tyr Arg Gly
290 295 300
His Arg Gly Gly Lys Ile Leu Ser Ser Ile Ile Asn Ser Ser Tyr Leu
305 310 315 320
Gln Cys Pro Asp Asn Gln Ser Tyr Ser Gly Pro Ser Arg Trp Pro Ser
325 330 335
Leu Thr Pro Tyr Ala Ala Glu Tyr Pro Phe Asp Ile Ser Pro Ser Pro
340 345 350
Ser Ser Pro Pro Leu Pro Val Ser Glu Ala Ala Leu Arg Thr Arg Ala
355 360 365
Ser Gly Gly Trp Gln Gly Gln Ser Leu Ile Asn Val Met Gln Leu Phe
370 375 380
Leu Ile Lys Leu Ile Leu Tyr Phe Ile Met
385 390
<210> 97
<211> 370
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 97
Met Gly Thr Val Trp Leu Ser Lys Leu Val Ala Thr Thr Met Leu Val
1 5 10 15
Ala Val Leu Gly Leu Leu Ala Glu Ala Gln Ile Glu Ala Lys Phe Lys
20 25 30
Cys Ile Ser Glu Asn Ala Pro Cys His Ala Leu Ala Asp Tyr Ser His
35 40 45
Pro Asn Gly Thr Thr Leu Arg Arg Ile Gln Thr Leu Phe Thr Val Lys
50 55 60
Tyr Leu Pro Asp Ile Leu Gly Ala Asn Asn Leu Pro Ala Asn Thr Thr
65 70 75 80
Arg Val Ala Pro Asp Gln Val Ile Lys Val Pro Phe Pro Cys Arg Cys
85 90 95
Ser Asn Gly Thr Gly Leu Ser Asn Lys Val Pro Arg Tyr Lys Ile Lys
100 105 110
Lys Gly Asp Thr Leu Tyr Asp Ile Ala Thr Thr Val Phe Ala Gly Leu
115 120 125
Val Lys Tyr Pro Gln Ile Gln Val Ala Asn Glu Ile Pro Asp Ala Asn
130 135 140
Asn Ile Thr Ala Gly Asp Thr Ile Trp Ile Pro Leu Pro Cys Ser Cys
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Gly Ser Ser Val Val His Tyr Ala His Leu Val Gln
165 170 175
Asp Gly Ser Ser Val Glu Ser Ile Ala Gln Glu Tyr Gly Ser Thr Gln
180 185 190
Gln Ile Leu Leu Ser Leu Asn Gly Ile Ser Asp Pro Lys Leu Leu Gln
195 200 205
Ala Arg Gln Leu Leu Asp Val Pro Leu Gln Ala Cys Ser Ser Ser Val
210 215 220
Lys Asn Asp Ser Pro Asp Tyr Pro Leu Leu Val Pro Asn Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Val Tyr Thr Ala Lys Glu Cys Val Lys Cys Lys Cys Asp Ser Ser Asn
245 250 255
Asn Phe Arg Leu Gln Cys Glu Pro Ser Gln His Lys Pro Ile Asn Asp
260 265 270
Trp Ser Val Cys Pro Ser Met Glu Cys Ser Lys Asn Val Leu Ile Gly
275 280 285
Asn Thr Thr Ser Thr Asp Ser Cys Asn Arg Thr Ile Cys Asp Tyr Ala
290 295 300
Gly Tyr Ser Asn Ser Lys Ile Ser Thr Ile Leu Ala Thr Gln Asn Thr
305 310 315 320
Cys Ala Val Pro Pro Ser Gly Ser Gly Thr Ser Ser Gly Ser Gly Ser
325 330 335
Gly Asp Ser Gly Ser Gly Ala Ser Arg Ser Asn Leu His Gly Trp Val
340 345 350
Trp Ser Ser Pro Leu Ile Val Ile His Phe Leu Leu Phe Val Val Phe
355 360 365
Leu Leu
370
<210> 98
<211> 211
<212> PRT
<213> 大麦
<400> 98
Ser Val Glu Gly Phe Asn Cys Ser Ala Asn Gly Thr Tyr Pro Cys Gln
1 5 10 15
Ala Tyr Ala Leu Tyr Arg Ala Gly Leu Ala Gly Val Pro Pro Asp Leu
20 25 30
Ser Ala Ala Gly Asp Leu Phe Gly Val Ser Arg Phe Met Leu Ala His
35 40 45
Ala Asn Asn Leu Ser Thr Ser Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln Pro Leu
50 55 60
Leu Val Pro Leu Gln Cys Gly Cys Pro Ser Gly Ser Pro Asn Ala Tyr
65 70 75 80
Ala Pro Thr Gln Tyr Gln Ile Ser Ser Gly Asp Thr Phe Trp Ile Val
85 90 95
Ser Val Thr Lys Leu Gln Asn Leu Thr Gln Tyr Gln Ala Val Glu Arg
100 105 110
Val Asn Pro Thr Val Val Pro Thr Lys Leu Glu Val Gly Asp Met Val
115 120 125
Thr Phe Pro Ile Phe Cys Gln Cys Pro Thr Ala Ala Gln Asn Ala Thr
130 135 140
Ala Leu Val Thr Tyr Val Met Gln Gln Gly Asp Thr Tyr Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ala Phe Ala Val Asp Ala Gln Ser Leu Val Ser Leu Asn Gly
165 170 175
Pro Glu Gln Gly Thr Gln Leu Phe Ser Glu Ile Leu Val Pro Leu Arg
180 185 190
Arg Gln Val Pro Lys Trp Leu Pro Pro Ile Val Thr Arg Asn Asp Ala
195 200 205
Ser Ala Thr
210
<210> 99
<211> 274
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 99
Met Lys Leu Lys Thr Gly Leu Leu Leu Phe Phe Ile Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
His Val Cys Phe His Val Glu Ser Asn Cys Leu Lys Gly Cys Asp Leu
20 25 30
Ala Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Leu Pro Gly Val Phe Ile Leu Gln Asn
35 40 45
Ile Thr Thr Phe Met Gln Ser Glu Ile Val Ser Ser Asn Asp Ala Ile
50 55 60
Thr Ser Tyr Asn Lys Asp Lys Ile Leu Asn Asp Ile Asn Ile Gln Ser
65 70 75 80
Phe Gln Arg Leu Asn Ile Pro Phe Pro Cys Asp Cys Ile Gly Gly Glu
85 90 95
Phe Leu Gly His Val Phe Glu Tyr Ser Ala Ser Lys Gly Asp Thr Tyr
100 105 110
Glu Thr Ile Ala Asn Leu Tyr Tyr Ala Asn Leu Thr Thr Val Asp Leu
115 120 125
Leu Lys Arg Phe Asn Ser Tyr Asp Pro Lys Asn Ile Pro Val Asn Ala
130 135 140
Lys Val Asn Val Thr Val Asn Cys Ser Cys Gly Asn Ser Gln Val Ser
145 150 155 160
Lys Asp Tyr Gly Leu Phe Ile Thr Tyr Pro Ile Arg Pro Gly Asp Thr
165 170 175
Leu Gln Asp Ile Ala Asn Gln Ser Ser Leu Asp Ala Gly Leu Ile Gln
180 185 190
Ser Phe Asn Pro Ser Val Asn Phe Ser Lys Asp Ser Gly Ile Ala Phe
195 200 205
Ile Pro Gly Arg Tyr Lys Asn Gly Val Tyr Val Pro Leu Tyr His Arg
210 215 220
Thr Ala Gly Leu Ala Ser Gly Ala Ala Val Gly Ile Ser Ile Ala Gly
225 230 235 240
Thr Phe Val Leu Leu Leu Leu Ala Phe Cys Met Tyr Val Arg Tyr Gln
245 250 255
Lys Lys Glu Glu Glu Lys Ala Lys Leu Pro Thr Asp Ile Ser Met Ala
260 265 270
Leu Ser
<210> 100
<211> 275
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 100
Met Glu His Pro Arg Leu Gly Phe Pro Ile Thr Leu Leu Leu Phe Ser
1 5 10 15
Phe Ile Leu Leu Pro Ser Thr Ser Gln Ser Lys Cys Thr His Gly Cys
20 25 30
Ala Leu Ala Gln Ala Ser Tyr Tyr Leu Leu Asn Gly Ser Asn Leu Thr
35 40 45
Tyr Ile Ser Glu Ile Met Gln Ser Ser Leu Leu Thr Lys Pro Glu Asp
50 55 60
Ile Val Ser Tyr Asn Gln Asp Thr Ile Ala Ser Lys Asp Ser Val Gln
65 70 75 80
Ala Gly Gln Arg Ile Asn Val Pro Phe Pro Cys Asp Cys Ile Glu Gly
85 90 95
Glu Phe Leu Gly His Thr Phe Gln Tyr Asp Val Gln Lys Gly Asp Arg
100 105 110
Tyr Asp Thr Ile Ala Gly Thr Asn Tyr Ala Asn Leu Thr Thr Val Glu
115 120 125
Trp Leu Arg Arg Phe Asn Ser Tyr Pro Pro Asp Asn Ile Pro Asp Thr
130 135 140
Gly Thr Leu Asn Val Thr Val Asn Cys Ser Cys Gly Asp Ser Gly Val
145 150 155 160
Gly Asp Tyr Gly Leu Phe Val Thr Tyr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Thr
165 170 175
Leu Gly Ser Val Ala Ser Asn Val Lys Leu Asp Ser Ala Leu Leu Gln
180 185 190
Lys Tyr Asn Pro Asn Val Asn Phe Asn Gln Gly Ser Gly Ile Val Tyr
195 200 205
Ile Pro Ala Lys Asp Gln Asn Gly Ser Tyr Val Leu Leu Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Ala Val Cys Leu Leu Leu Leu Ala Gly Phe Ile Tyr Val Gly Tyr Phe
245 250 255
Arg Lys Lys Arg Ile Gln Lys Glu Glu Leu Leu Ser Gln Glu Thr Arg
260 265 270
Ala Ile Phe
275
<210> 101
<211> 43
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 101
Pro Ser Ile Gln Leu Arg Asn Ile Ser Asn Phe Met Gln Ser Lys Ile
1 5 10 15
Val Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Ile Met Ser Tyr Asn Arg Asp Val
20 25 30
Val Phe Asp Lys Ser Gly Leu Ile Ser Tyr Thr
35 40
<210> 102
<211> 59
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 102
Val Ala Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Gln Leu Arg Asn
1 5 10 15
Ile Ser Asn Phe Met Gln Ser Lys Ile Val Leu Thr Asn Ser Phe Asp
20 25 30
Val Ile Met Ser Tyr Asn Arg Asp Val Val Phe Asp Lys Ser Gly Leu
35 40 45
Ile Ser Tyr Thr Arg Ile Asn Val Pro Phe Pro
50 55
<210> 103
<211> 58
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 103
Leu Ala Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Leu Pro Gly Val Phe Ile Leu Gln
1 5 10 15
Asn Ile Thr Thr Phe Met Gln Ser Glu Ile Val Ser Ser Asn Asp Ala
20 25 30
Ile Thr Ser Tyr Asn Lys Asp Lys Ile Leu Asn Asp Ile Asn Ile Gln
35 40 45
Ser Phe Gln Arg Leu Asn Ile Pro Phe Pro
50 55
<210> 104
<211> 42
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 104
Ser Ile Gln Leu Arg Asn Ile Ser Asn Phe Met Gln Ser Lys Ile Val
1 5 10 15
Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Ile Met Ser Tyr Asn Arg Asp Val Val
20 25 30
Phe Asp Lys Ser Gly Leu Ile Ser Tyr Thr
35 40
<210> 105
<211> 60
<212> PRT
<213> 蒺藜苜蓿
<400> 105
Asp Val Ala Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Gln Leu Arg
1 5 10 15
Asn Ile Ser Asn Phe Met Gln Ser Lys Ile Val Leu Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Asp Val Ile Met Ser Tyr Asn Arg Asp Val Val Phe Asp Lys Ser Gly
35 40 45
Leu Ile Ser Tyr Thr Arg Ile Asn Val Pro Phe Pro
50 55 60
<210> 106
<211> 59
<212> PRT
<213> 百脉根
<400> 106
Asp Leu Ala Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Leu Pro Gly Val Phe Ile Leu
1 5 10 15
Gln Asn Ile Thr Thr Phe Met Gln Ser Glu Ile Val Ser Ser Asn Asp
20 25 30
Ala Ile Thr Ser Tyr Asn Lys Asp Lys Ile Leu Asn Asp Ile Asn Ile
35 40 45
Gln Ser Phe Gln Arg Leu Asn Ile Pro Phe Pro
50 55

Claims (20)

1.一种选择靶植物LysM受体用于将靶植物LysM受体修饰为具有期望的受体特点的方法，其包括：
(a)提供具有期望的受体特点的供体植物LysM受体和两种或更多种潜在靶植物LysM受体的结构模型、分子模型、表面特点模型和/或静电势模型；
(b)比较两种或更多种潜在靶植物LysM受体的每种与供体植物LysM受体的结构模型、分子模型、表面特点模型和/或静电势模型，和/或比较两种或更多种潜在靶植物LysM受体的每种与供体植物LysM受体，其中使用结构叠加；和
(c)选择与对供体植物LysM受体合适匹配的潜在靶植物LysM受体作为靶植物LysM受体。
2.权利要求1的方法，其中用于确定步骤(c)中对供体植物LysM受体合适匹配的潜在靶植物LysM受体的标准选自由以下项组成的组：对模板结构拟合的良好性；相似性；系统发育关系；表面电势；对模板结构的覆盖率；来自SWISS-模型的GMQE、QMEAN和局部质量评估；及其任何组合。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中供体植物LysM受体的结构模型是蛋白质晶体结构、分子模型、冷冻-EM结构和NMR结构。
4.权利要求1-3的任一项的方法，其中供体植物LysM受体模型具有整个胞外域且两种或更多种潜在靶植物LysM受体模型具有整个胞外域。
5.权利要求1-3的任一项的方法，其中供体植物LysM受体模型具有LysM1结构域、LysM2结构域、LysM3结构域或其任何组合；和两种或更多种潜在靶植物LysM受体模型具有LysM1结构域、LysM2结构域、LysM3结构域或其任何组合。
6.权利要求1-6的任一项的方法，其中供体植物LysM受体是苜蓿属NFP、苜蓿属LYK3、莲属NFR1、莲属NFR5、莲属LYS11或拟南芥属CERK1。
7.权利要求6的方法，其中另外地将两种或更多种靶植物LysM受体与莲属CERK6比较。
8.权利要求1-7的任一项的方法，其中两种或更多种潜在靶植物LysM受体多肽全部来自相同的植物物种或植物品种。
9.权利要求1-8的任一项的方法，其中期望的受体特点是对寡糖或寡糖的类别的亲和性、选择性和/或特异性。
10.权利要求1-9的任一项的方法，其中期望的受体特点是对寡糖或寡糖的类别的结合动力学，其中结合动力学包括解离速率和结合速率。
11.权利要求9或权利要求10的方法，其中寡糖的类别选自由以下项组成的组：LCO、CO、β-葡聚糖、环-β-葡聚糖、外多糖和任选地LPS。
12.权利要求11的方法，其中寡糖的类别是LCO或CO。
13.权利要求12的方法，其中寡糖的类别是LCO，任选地由任选地选自由以下项组成的组的固氮菌产生：百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆埃特里根瘤菌(Rhizobium etli phaseoli)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(R.leguminosarum trifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarum viciae)和菜豆豌豆根瘤菌(R.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(Burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、药用中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)费氏中华(Sinorhizobium)NGR234、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、辽参慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaonginense)、弗兰克氏菌属(Frankia)物种，和其任何组合；或任选地由任选地选自由以下项组成的组的菌根真菌产生：无柄孢子科(Acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(Diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)物种、平囊霉科(Pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(Funneliformis)物种、球囊霉属(Glomus)物种、球囊霉属(Rhizophagus)物种、硬囊霉属(Sclerocystis)物种、Septoglomus属物种、Claroideoglomus属物种、Ambispora属物种、原囊霉属(Archaeospora)物种、Geosiphon pyriformis属物种、类球囊霉属(Paraglomus)属物种、球囊霉门(Glomeromycota)中的其他物种；及其任何组合。
14.权利要求13的方法，其中LCO是百脉根中慢生根瘤菌LCO、苜蓿中华根瘤菌LCO-IV或苜蓿中华根瘤菌LCO-V。
15.权利要求1-14的任一项的方法，其进一步包括步骤(d)：通过比较供体植物LysM受体中第一寡糖结合特征的氨基酸残基与靶植物LysM受体中相应的氨基酸残基，鉴定靶LysM受体中用于修饰的一个或多个氨基酸残基，和任选地通过比较供体植物LysM受体中第二寡糖结合特征的氨基酸残基与靶植物LysM受体中相应的氨基酸残基，鉴定靶LysM受体中用于修饰的一个或多个氨基酸残基。
16.权利要求15的方法，其进一步包括步骤(e)：生成经修饰的植物LysM受体，其中靶植物LysM受体的第一寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代；生成经修饰的植物LysM受体，其中靶植物LysM受体的第二寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代；或生成经修饰的植物LysM受体，其中靶植物LysM受体的第一寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代和靶植物LysM受体的第二寡糖结合特征中一个或多个氨基酸残基已经用来自供体LysM的相应的氨基酸残基取代。
17.权利要求16的方法，其中第一寡糖结合特征是LysM2结构域的表面上的疏水补丁。
18.权利要求16的方法，其中第二寡糖结合特征是供体植物LysM受体的LysM1结构域的部分。
19.一种使用权利要求1-18的任一项所述的方法产生的经修饰的植物LysM受体，其中经修饰的植物LysM受体包括修饰为在LysM2结构域表面上包括疏水补丁的LysM2结构域。
20.一种使用权利要求1-18的任一项所述的方法产生的经修饰的植物LysM受体，其中经修饰的植物LysM受体包括修饰为用第二LysM1结构域的至少部分替换第一LysM1结构域的至少部分的第一LysM1结构域。
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