CN106456678A - 氨氧化型亚硝化单胞菌菌株d23 - Google Patents

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Abstract

本公开尤其提供了亚硝化单胞菌的优化菌株，其被命名为D23、D23‑100或AOB D23‑100。本申请中所公开的亚硝化单胞菌细菌具有理想的特性(例如，优化的特性)，诸如抑制致病性细菌生长的能力以及增强的产生一氧化氮和一氧化氮前体的能力。本文中的亚硝化单胞菌可以用于例如治疗与低亚硝酸盐水平有关的疾病、皮肤疾病以及由致病性细菌引起的疾病。

Description

氨氧化型亚硝化单胞菌菌株D23
本申请要求2014年4月15日提交的希腊专利申请第20140100217号、2014年5月22日提交的美国临时申请第62/002084号、2014年6月16日提交的美国临时申请第62/012811号、2014年9月22日提交的美国临时申请第62/053588号和2015年3月13日提交的希腊专利申请第20150100115号的优先权，这些申请的内容通过引用整体并入本文中。
序列表
本申请包含序列表，其已经通过电子方式以ASCII格式提交并以引用的方式整体并入本文中。所述ASCII拷贝创建于2015年4月13日，命名为N2060-7001WO.txt，且大小为3,590,980字节。
背景
可以使用有益细菌来抑制致病性细菌的生长。细菌和其它微生物在环境中无处不在。致病性细菌的发现和疾病的病菌理论对于健康和疾病状况具有极大的影响。细菌是所有生物的环境内的一个正常部分。在肠道内，这些细菌在正常条件下是不会致病的，并且实际上它们通过使正常的肠内容物较不适于致病生物体存活来促进健康。由多种途径实现疾病预防：消耗营养物，留给病原体较少的营养物；产生不适于病原体存活的条件，如pH和氧张力；产生对病原体有毒性的化合物；病原体被这些微生物作为食物消耗掉；给病原体留有更小的物理空间；以及占据特异性结合位点，给病原体留下更少的可用结合位点。这些有益细菌的存在被视为可有效预防疾病状况。
在本领域中需要可以抑制致病性细菌的生长的改良的有益细菌。
概述
本公开尤其提供了亚硝化单胞菌(N.eutropha)的优化菌株，其被命名为D23、D23-100或AOB D23-100，这些术语可以在本公开的全文中互换使用。
亚硝化单胞菌属的氨氧化细菌是普遍存在的革兰氏阴性专性化能自养菌，其具有只从氨转化为亚硝酸盐产生能量的独特能力。
本申请中所公开的亚硝化单胞菌细菌具有理想的(例如，优化的)特性，诸如抑制致病性细菌生长的能力以及增强的产生一氧化氮(NO)和一氧化氮前体(NO2 -)的能力。本文中的亚硝化单胞菌，例如优化的亚硝化单胞菌，例如优化的亚硝化单胞菌的纯化制剂，可以用于例如治疗疾病，例如与低亚硝酸盐水平有关的疾病、皮肤病症以及由致病性细菌引起的疾病。当在本公开的全文中提及亚硝化单胞菌时，它可以指亚硝化单胞菌的优化菌株或优化的亚硝化单胞菌的纯化制剂。
本公开尤其提供了亚硝化单胞菌细菌，例如优化的亚硝化单胞菌，例如优化的亚硝化单胞菌的纯化制剂，其具有选自下列的至少一种特性：
优化的生长速率；
优化的NH4 +氧化速率；和
优化的铵离子(NH4 +)抗性。
所述细菌是任选为纯性的。
在实施方案中，优化的生长速率为允许具有约0.15-0.18的OD600(600nm下的光密度)的亚硝化单胞菌的连续培养物在约1至2天内达到约0.5-0.6的OD600的速率。在实施方案中，优化的生长速率为当在分批培养条件下培养时约8小时的倍增时间。在实施方案中，优化的NH4 +氧化速率为至少约125微摩尔/分钟的NH4 +氧化为NO2 -的速率。在实施方案中，优化的NH4 +抗性是在包含约200mM NH4 +的培养基中生长至少约48小时的能力。
在一些实施方案中，优化的亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)的纯化制剂具有选自优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性的至少两种特性。在一些实施方案中，优化的亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)的纯化制剂具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性。在一些实施方案中，优化的亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)的纯化制剂包含在极高严格度下与SEQ ID NO:1杂交的染色体。
在一些实施方案中，优化的亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)的纯化制剂包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的AmoA蛋白，与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的AmoB蛋白，与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的amoC基因，与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的羟胺氧化还原酶蛋白，与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的细胞色素c554蛋白，或与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的细胞色素cM552蛋白。
在一些实施方案中，优化的亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)的纯化制剂包含表2中的1-5个、5-10个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个或所有序列特征。例如，在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置1处具有突变(例如，位置1处的V)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置160处具有突变(例如，位置160处的L)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置167处具有突变(例如，位置167处的A)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置33处具有突变(例如，位置33处的V)的AmoB1或AmoB2蛋白(或编码所述突变的AmoB1或AmoB2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置165处具有突变(例如，位置165处的I)的AmoB1或AmoB2蛋白(或编码所述突变的AmoB1或AmoB2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置79处具有突变(例如，位置79处的A)的AmoC3蛋白(或编码所述突变的AmoC3基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置271处具有突变(例如，位置271处的V)的AmoC3蛋白(或编码所述突变的AmoC3基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置85处具有突变(例如，位置85处的S)的Hao1、Hao2或Hao3蛋白(或编码所述突变的Hao1、Hao2或Hao3基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置312处具有突变(例如，位置312处的E)的Hao1、Hao2或Hao3蛋白(或编码所述突变的Hao1、Hao2或Hao3基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置163处具有突变(例如，位置163处的A)的Hao1蛋白(或编码所述突变的Hao1基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置65处具有突变(例如，位置65处的T)的c554CycA1、c554CycA2或c554CycA3蛋白(或编码所述突变的c554CycA1、c554CycA2或c554CycA3基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置186处具有突变(例如，位置186处的T)的c554CycA1蛋白(或编码所述突变的c554CycA1基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置63处具有突变(例如，位置63处的V)的cM552CycB1或cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1或cM552CycB2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置189处具有突变(例如，位置189处的P)的cM552CycB1或cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1或cM552CycB2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置206处具有突变(例如，位置206处的insE)的cM552CycB1或cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1或cM552CycB2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置207处具有突变(例如，位置207处的insE)的cM552CycB1或cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1或cM552CycB2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置195处具有突变(例如，位置195处的insD)的cM552CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置196处具有突变(例如，位置196处的insD)的cM552CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置197处具有突变(例如，位置197处的insD)的cM552CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1基因)。
还描述了表2中的两个或更多个序列特征的组合。所述两个或更多个序列特征可以在相同的基因或不同的基因中。所述两个或更多个序列特征可以在相同的蛋白质或不同的蛋白质中。例如，在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置1处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置1处的V)且在位置160处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置160处的L)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置1处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置1处的V)且在位置167处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置167处的A)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置160处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置160处的L)且在位置167处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置167处的A)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置33处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置33处的V)且在位置165处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置165处的I)的AmoB1或AmoB2蛋白(或编码所述突变的AmoB1或AmoB2基因)。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置79处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置79处的A)且在位置271处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置271处的V)的AmoC3蛋白(或编码所述突变的AmoC3基因)。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置85处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置85处的S)且在位置312处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置312处的E)的Hao1、Hao2或Hao3蛋白(或编码所述突变的Hao1、Hao2或Hao3基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置85处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置85处的S)且在位置163处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置163处的A)的Hao1蛋白(或编码所述突变的Hao1基因)。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置312处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置312处的E)且在位置163处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置163处的A)的Hao1蛋白(或编码所述突变的Hao1基因)。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在位置65处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置65处的T)且在位置186处具有相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置186处的T)的c554CycA1蛋白(或编码所述突变的c554CycA1基因)。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在下列氨基酸位置中的任何两个或更多个处具有突变的cM552CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1基因)：63、189、194、195、196、197、206和207。例如，所述两个或更多个氨基酸位置可以包括：63和189、63和194、63和195、63和196、63和197、63和206、63和207、189和194、189和195、189和196、189和194、189和195、189和196、189和197、189和206、189和207、194和195、194和196、194和197、194和206、194和207、195和196、195和197、195和206、195和207、196和197、196和206、196和207、197和206、197和207、或206和207。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含具有选自由以下所组成的组的任何两个或更多个突变的cM552CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1基因)：I63V、S189P、D194G、195insD、196insD、197insD、206insE和207insE。例如，所述两个或更多个突变可以选自由以下所组成的组：I63V和S189P、I63V和D194G、I63V和195insD、I63V和196insD、I63V和197insD、I63V和206insE、I63V和207insE、S189P和D194G、S189P和195insD、S189P和196insD、S189P和197insD、S189P和206insE、S189P和207insE、D194G和195insD、D194G和196insD、D194G和197insD、D194G和206insE、D194G和207insE、195insD和196insD、195insD和197insD、195insD和206insE、195insD和207insE、196insD和197insD、196insD和206insE、196insD和207insE、197insD和206insE、197insD和207insE以及206insE和207insE。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在下列氨基酸位置中的任何两个或更多个处具有突变的cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552CycB2基因)：63、189、206和207。例如，所述两个或更多个氨基酸位置可以包括：63和189、63和206、63和207、189和206、189和207、或206和207。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含具有选自由以下所组成的组的任何两个或更多个突变的cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552CycB2基因)：I63V、S189P、206insE和207insE。例如，所述两个或更多个突变可以选自由以下所组成的组：I63V和S189P、I63V和206insE、I63V和207insE、S189P和206insE、S189P和207insE以及206insE和207insE。
还描述了表2中的三个或更多个序列特征的组合。例如，在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含具有在位置1处的相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置1处的V)、在位置160处的相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置160处的L)以及在位置167处的相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置167处的A)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含具有在位置85处的相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置85处的S)、在位置312处的相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置312处的E)以及在位置163处的相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变(例如，位置163处的A)的Hao1蛋白(或编码所述突变的Hao1基因)。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在下列氨基酸位置中的任何三个或更多个(例如，4个、5个、6个、7个或所有)处具有突变的cM552CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1基因)：63、189、194、195、196、197、206和207。例如，所述三个突变可以在位置195、196和197处。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含具有选自由以下所组成的组的任何三个或更多个(例如，4个、5个、6个、7个或所有)突变的cM552CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552CycB1基因)：I63V、S189P、D194G、195insD、196insD、197insD、206insE和207insE。例如，所述三个突变可以是195insD、196insD和197insD。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含在下列氨基酸位置中的任何三个或更多个(例如，所有)处具有突变的cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552CycB2基因)：63、189、206和207。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含具有选自由以下所组成的组的任何三个或更多个(例如，所有)突变的cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552CycB2基因)：I63V、S189P、206insE和207insE。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂在至少两种基因(例如，表2中列出的至少两种基因)中包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变。所述两种基因可以是例如AmoA1和AmoA2、AmoA1和AmoB1、AmoA1和AmoB2、AmoA1和AmoC1、AmoA1和AmoC2、AmoA1和AmoC3、AmoA1和Hao1、AmoA1和Hao2、AmoA1和Hao3、AmoA1和c554CycA1、AmoA1和c554CycA2、AmoA1和c554CycA3、AmoA1和cM552CycB1、AmoA1和cM552CycB2、AmoA2和AmoB1、AmoA2和AmoB2、AmoA2和AmoC1、AmoA2和AmoC2、AmoA2和AmoC3、AmoA2和Hao1、AmoA2和Hao2、AmoA2和Hao3、AmoA2和c554CycA1、AmoA2和c554CycA2、AmoA2和c554CycA3、AmoA2和cM552CycB1、AmoA2和cM552CycB2、AmoB1和AmoB2、AmoB1和AmoC1、AmoB1和AmoC2、AmoB1和AmoC3、AmoB1和Hao1、AmoB1和Hao2、AmoB1和Hao3、AmoB1和c554CycA1、AmoB1和c554CycA2、AmoB1和c554CycA3、AmoB1和cM552CycB1、AmoB1和cM552CycB2、AmoB2和AmoC1、AmoB2和AmoC2、AmoB2和AmoC3、AmoB2和Hao1、AmoB2和Hao2、AmoB2和Hao3、AmoB2和c554CycA1、AmoB2和c554CycA2、AmoB2和c554CycA3、AmoB2和cM552CycB1、AmoB2和cM552CycB2、AmoC1和AmoC2、AmoC1和AmoC3、AmoC1和Hao1、AmoC1和Hao2、AmoC1和Hao3、AmoC1和c554CycA1、AmoC1和c554CycA2、AmoC1和c554CycA3、AmoC1和cM552CycB1、AmoC1和cM552CycB2、AmoC2和AmoC3、AmoC2和Hao1、AmoC2和Hao2、AmoC2和Hao3、AmoC2和c554CycA1、AmoC2和c554CycA2、AmoC2和c554CycA3、AmoC2和cM552CycB1、AmoC2和cM552CycB2、AmoC3和Hao1、AmoC3和Hao2、AmoC3和Hao3、AmoC3和c554CycA1、AmoC3和c554CycA2、AmoC3和c554CycA3、AmoC3和cM552CycB1、AmoC3和cM552CycB2、Hao1和Hao2、Hao1和Hao3、Hao1和c554CycA1、Hao1和c554CycA2、Hao1和c554CycA3、Hao1和cM552CycB1、Hao1和cM552CycB2、Hao2和Hao3、Hao2和c554CycA1、Hao2和c554CycA2、Hao2和c554CycA3、Hao2和cM552CycB1、Hao2和cM552CycB2、Hao3和c554CycA1、Hao3和c554CycA2、Hao3和c554CycA3、Hao3和cM552CycB1、Hao3和cM552CycB2、c554CycA1和c554CycA2、c554CycA1和c554CycA3、c554CycA1和cM552CycB1、c554CycA1和cM552CycB2、c554CycA2和c554CycA3、c554CycA2和cM552CycB1、c554CycA2和cM552CycB2、c554CycA3和cM552CycB1、c554CycA3和cM552CycB2、或cM552CycB1和cM552CycB2。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂在至少三种基因(例如，表2中列出的至少三种(例如，4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或所有)基因)中包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91的突变。所述三种基因可以是例如AmoA1和AmoA2和AmoA3；AmoC1和AmoC2和AmoC3；或Hao1和Hao2和Hao3。
在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含相对于野生型细菌如亚硝化单胞菌菌株C91的至少一种结构差异，例如至少一种突变。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含可以使用本文所述的引物对(例如，包含SEQ ID NO:64的序列的引物和包含SEQ ID NO:65的序列的引物)扩增的核酸。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含与图6、图7或图8的基因或由图6、图7或图8的基因编码的蛋白质至少80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或100％相同的核酸或蛋白质。在一些实施方案中，所述细菌或制剂包含与SEQ ID NO:64-66中任一个的序列或由SEQ ID NO:64-66中任一者的序列编码的蛋白质至少80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或100％相同的核酸或蛋白质。
在一些方面，本公开尤其提供了亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其包含位于氨单加氧酶基因、羟胺氧化还原酶基因、细胞色素c554基因或细胞色素cm552基因中的突变。所述突变可以是相对于野生型细菌如亚硝化单胞菌菌株C91。突变可以位于amoA1基因、amoA2基因、amoB1基因、amoB2基因和amoC3基因中的一个或多个中。所述亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以在本文中(例如，表2中)描述的位置处具有突变。所述亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以具有突变，其中所述突变为在本文如表2中描述的突变。
在一些实施方案中，突变可以位于hao1基因、hao2基因或hao3基因中的一个或多个中。所述亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以在本文中(例如，表2中)描述的位置处具有突变。所述亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以具有突变，其中所述突变为在本文如表2中描述的突变。
在一些实施方案中，突变可以位于c554cycA1基因、c554cycA2基因和c554cycA3基因中的一个或多个中。所述亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以在本文中(例如，表2中)描述的位置处具有突变。所述亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以具有突变，其中所述突变为在本文如表2中描述的突变。
在一些实施方案中，突变可以位于cM552cycB1基因和cM552cycB2基因中的一个或多个中。所述亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以在本文中(例如，表2中)描述的位置处具有突变。所述亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以具有突变，其中所述突变为在本文如表2中描述的突变。
在某些方面，在之前的四个段落中描述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以基于具有选自下列的至少一种特性的亚硝化单胞菌细菌，例如优化的亚硝化单胞菌，例如优化的亚硝化单胞菌的纯化制剂：
优化的生长速率；
优化的NH4 +氧化速率；和
优化的铵离子(NH4 +)抗性。
在某些方面，在之前的五个段落中描述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂可以具有在amoA1基因、amoA2基因、amoB1基因、amoB2基因、amoC3基因、hao1基因、hao2基因、hao3基因、c554cycA1基因、c554cycA2基因、c554cycA3基因、cM552cycB1基因和c554cycB2基因中的一个或多个的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个位置处的突变。
在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌具有优化的生长速率(例如，本文所述的优化的生长速率)和结构差异如突变(例如，相对于野生型菌株如亚硝化单胞菌菌株C91)，例如本文所述的突变，例如表2中的突变。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌具有优化的NH4 +氧化速率(例如，本文所述的优化的NH4 +氧化速率)和结构差异如突变(例如，相对于野生型菌株如亚硝化单胞菌菌株C91)，例如本文所述的突变，例如表2中的突变。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌具有优化的NH4 +抗性(例如，本文所述的优化的NH4 +抗性)和结构差异如突变(例如，相对于野生型菌株如亚硝化单胞菌菌株C91)，例如本文所述的突变，例如表2中的突变。
在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌包含可以使用本文所述的引物对(例如，包含SEQ ID NO:64的序列的引物和包含SEQ ID NO:65的序列的引物)扩增的核酸。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含在高严格度下与SEQ ID NO:1杂交的染色体。
在实施方案中，所述染色体在极高的严格度下与SEQ ID NO:1杂交。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)包含与图6-8的一种或多种基因(例如，图6、图7和图8中的任何一个或多个的10种、20种、30种、40种、50种、100种或所有基因)至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的基因。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)缺少与如Stein等人，Whole-genome analysis of the ammonia-oxidizing bacterium,Nitrosomonaseutropha C91:implications for niche adaptation.Environmental Microbiology(2007)9(12),2993-3007中所描述的SEQ ID NO:2(pNeut1)或SEQ ID NO:3(pNeut2)至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的任何质粒。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌(任选为纯性的)缺少存在于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的质粒上的一种或多种基因。例如，所述亚硝化单胞菌(任选为纯性的)可以缺少存在于pNeut1和pNeut2中的一个或两个上的至少2、3、4、5、10、15或20种基因。pNeut1含有55个蛋白质编码序列，而pNeutP2含有52个蛋白质编码序列。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)缺少任何质粒。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因以及与SEQ ID NO:13至少约98.8％相同的amoA2基因。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白以及与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因以及与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amoA1或amoA2基因中的一个或多个。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白以及与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白以及与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:5至少约99.9％相同的amoC1基因、与SEQ ID NO:11至少约99.9％相同的amoC2基因以及与SEQ ID NO:17至少约99.0％相同的amoC3基因。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因、与SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amo2基因、与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因以及与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含与SEQ IDNO:16至少约99.4％相同的AmoC3蛋白。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白、与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白、与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白以及与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:19至少约99.1％相同的hao1基因、与SEQ ID NO:21至少约99.5％相同的hao2基因以及与SEQ ID NO:23至少约99.3％相同的hao3基因。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因、与SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amo2基因、与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因、与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因、与SEQ ID NO:5至少约99.9％相同的amoC1基因、与SEQ ID NO:11至少约99.9％相同的amoC2基因以及与SEQ ID NO:17至少约99.0％相同的amoC3基因。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:18至少约99.6％相同的Hao1蛋白、与SEQ ID NO:20至少约99.7％相同的Hao2蛋白以及与SEQ ID NO:22至少约99.7％相同的Hao3蛋白。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白、与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白、与SEQID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白或与SEQ ID NO:16至少约99.4％相同的AmoC3蛋白。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:25至少约98.1％相同的cycA1基因、与SEQ ID NO:27至少约98.8％相同的cycA2基因以及与SEQ ID NO:28至少约99.4％相同的cycA3基因。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因、与SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amo2基因、与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因、与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因、与SEEQ ID NO:5至少约99.9％相同的amoC1基因、与SEQ ID NO:11至少约99.9％相同的amoC2基因、与SEQ ID NO:17至少约99.0％相同的amoC3基因、与SEQID NO:19至少约99.1％相同的hao1基因、与SEQ ID NO:21至少约99.5％相同的hao2基因以及与SEQ ID NO:23至少约99.3％相同的hao3基因。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:24至少约99.2％相同的CycA1蛋白、与SEQ ID NO:26至少约99.7％相同的CycA2蛋白以及与SEQ ID NO:28至少约99.7％相同的CycA3蛋白。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白、与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白、与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:16至少约99.4％相同的AmoC3蛋白、与SEQ ID NO:18至少约99.6％相同的Hao1蛋白、与SEQ ID NO:20至少约99.7％相同的Hao2蛋白以及与SEQ ID NO:22至少约99.7％相同的Hao3蛋白。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:31至少约96.8％相同的cycB1基因以及与SEQ ID NO:33至少约97.2％相同的cycB2基因。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因、与SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amo2基因、与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因、与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因、与SEQ ID NO:5至少约99.9％相同的amoC1基因、与SEQ ID NO:11至少约99.9％相同的amoC2基因、与SEQ ID NO:17至少约99.0％相同的amoC3基因、与SEQID NO:19至少约99.1％相同的hao1基因、与SEQ ID NO:21至少约99.5％相同的hao2基因、与SEQ ID NO:23至少约99.3％相同的hao3基因、与SEQ ID NO:25至少约98.1％相同的cycA1基因、与SEQ ID NO:27至少约98.8％相同的cycA2基因以及与SEQ ID NO:28至少约99.4％相同的cycA3基因。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:30至少约97.2％相同的CycB1蛋白或与SEQ ID NO:32至少约98.8％相同的CycB2蛋白。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白、与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白、与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:16至少约99.4％相同的AmoC3蛋白、与SEQ ID NO:18至少约99.6％相同的Hao1蛋白、与SEQ ID NO:20至少约99.7％相同的Hao2蛋白、与SEQID NO:22至少约99.7％相同的Hao3蛋白、与SEQ ID NO:24至少约99.2％相同的CycA1蛋白、与SEQ ID NO:26至少约99.7％相同的CycA2蛋白以及与SEQ ID NO:28至少约99.7％相同的CycA3蛋白。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含根据SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33的一种或多种基因。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含根据SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的一种或多种蛋白质。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在表2中列出的至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个或所有氨基酸位置突变的蛋白质。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在表2中列出的所有氨基酸位置具有突变的蛋白质。
在某些方面，本公开提供了菌株D23的亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)，被命名为AOB D23-100的所述细菌的25个小瓶已经于2014年4月8日保藏于ATCC专利保藏所，ATCC登录号为PTA-121157。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)为转基因细菌。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)具有选自优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性的至少一种特性。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)具有选自优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性的至少两种特性。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌(任选为纯性的)具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性。
在实施方案中，如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)大体上不含细菌、其它氨氧化细菌、真菌、病毒或病原体(例如，动物病原体，例如人类病原体)或其任何组合。
在某些方面，本公开提供了包含如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)的组合物，其中所述组合物大体上不含其它生物体。
在某些方面，本公开提供了包含如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)且进一步包含第二生物体(例如，第二菌株或物种)的组合物，其中所述组合物大体上不含其它生物体(例如，菌株或物种)。在实施方案中，第二生物体为氨氧化细菌。在实施方案中，第二生物体选自由亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属、乳酸杆菌属、链球菌属和双歧杆菌属及其组合所组成的组。
本公开还提供了包含如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)且进一步包含第二和第三生物体(例如，其它菌株或物种)的组合物，其中所述组合物大体上不含其它生物体(例如，菌株或物种)。本公开还提供了包含如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)且进一步包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种其它生物体(例如，其它菌株或物种)的组合物，其中所述组合物大体上不含其它生物体(例如，菌株或物种)。
在一些方面，本公开提供了包含OD600为至少约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7或0.8的亚硝化单胞菌细菌的活跃分裂培养物的细胞悬浮液的组合物，其中所述组合物大体上不含其它生物体。
在一些方面，本公开提供了用于局部施用的组合物，其包含如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)和适用于局部施用的药学上或美容上可接受的赋形剂。在实施方案中，所述组合物大体上不含其它生物体。在实施方案中，所述组合物进一步包含第二生物体(例如，另一个菌株或物种的生物体)。在实施方案中，所述组合物进一步包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种其它生物体(例如，其它菌株或物种)。所述第二生物体可以是例如氨氧化细菌。在实施方案中，第二生物体选自由亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属、乳酸杆菌属、链球菌属和双歧杆菌属及其组合所组成的组。
在实施方案中，所述组合物为粉末、化妆品、乳霜、棒状物、气雾剂、药膏、擦拭物或绷带。在实施方案中，所述组合物进一步包含保湿剂、脱臭剂、香味剂、着色剂、驱虫剂、清洁剂或防紫外线剂。在实施方案中，所述赋形剂为抗粘附剂、粘合剂、涂层剂、崩解剂、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、吸附剂、防腐剂或甜味剂。在实施方案中，亚硝化单胞菌在组合物中的浓度为约1011-1013CFU/L。在实施方案中，亚硝化单胞菌在组合物中的浓度为约109CFU/ml。在实施方案中，亚硝化单胞菌对药物赋形剂的质量比可以为约0.1克/升至约100克/升。在实施方案中，亚硝化单胞菌对药物赋形剂的质量比为1克/升。
在一些方面，所述组合物和/或赋形剂可以是液体、固体或凝胶中的一个或多个的形式。例如，液体混悬剂可以包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水或氨氧化储存缓冲液。凝胶制剂可以包括但不限于琼脂、二氧化硅、聚丙烯酸(例如)、羧甲基纤维素、淀粉、瓜耳胶、藻酸盐或壳聚糖。在一些实施方案中，制剂可以补充有氨源，包括但不限于氯化铵或硫酸铵。
在一些方面，本公开提供了包含至少约10、20、50、100、200、500、1,000、2,000或10,000L(例如，约1011CFU/L、1012CFU/L、1013CFU/L)如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)的组合物。在一些实施方案中，所述组合物具有至少约109CFU/L、1010CFU/L、1011CFU/L或1012CFU/L的浓度。在一些方面，本公开提供了包含至少约1、2、5、10、20、50、100、200或500g本文所述的亚硝化单胞菌细菌的组合物，其例如作为干燥制剂如粉末。
在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)的服装制品。在实施方案中，所述服装制品是包装的。在实施方案中，所述服装制品被包装在防气体交换或防水的材料中。可以例如在提供下列中的一个或多个的浓度下提供服装制品：治疗或预防皮肤病症、治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病或病状、治疗或预防体臭、用于向受试者供应一氧化氮的治疗或用于抑制微生物生长的治疗。
在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)的布料。
在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)的纱。
在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)的线。
在一些方面，本公开提供了一种获得(例如，制造)具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性的(任选为纯性的)亚硝化单胞菌细菌的方法，其包括：
(a)在选出优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个的条件下培养所述细菌，由此产生培养物；
(b)测试来自所述培养物的样品的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性；以及
(c)重复所述培养和测试步骤，直到获得具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性的细菌。
在实施方案中，所述方法包括从来源如土壤或个体的皮肤获得亚硝化单胞菌细菌的步骤。在实施方案中，在选出优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个(例如，2或3个)的条件下培养所述细菌包括在含有约200mM NH4 +的欧洲亚硝化单胞菌培养基中培养所述细菌。在实施方案中，所述方法包括建立纯性培养物的步骤。在实施方案中，所述方法包括将亚硝化单胞菌与至少一种其它类型的氨氧化细菌一起共培养的步骤。在实施方案中，步骤(a)的亚硝化单胞菌缺少优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性。在实施方案中，步骤(c)包括重复所述培养和测试步骤，直到获得具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性中的至少两者的细菌。
在一些方面，本公开提供了由上述方法产生的如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。
在一些方面，本公开提供了一种测试(任选为纯性的)亚硝化单胞菌的制剂的方法，其包括：
分析所述亚硝化单胞菌的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个；以及
如果所述亚硝化单胞菌具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个，则将所述亚硝化单胞菌分类为可接受的。
在实施方案中，所述方法进一步包括测试所述制剂中的污染生物体的步骤。在实施方案中，所述方法进一步包括从所述制剂中移出样品并对该样品进行测试的步骤。在实施方案中，所述方法进一步包括测试其中培养有亚硝化单胞菌的培养基。在实施方案中，所述方法进一步包括将来自所述制剂的亚硝化单胞菌包装成包装物。在实施方案中，所述方法进一步包括将来自所述制剂的亚硝化单胞菌商业化。
在一些方面，本公开提供了一种生产例如制造亚硝化单胞菌的方法，其包括使亚硝化单胞菌与培养基接触并培养所述亚硝化单胞菌，直至达到至少约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8的OD600。在一些实施方案中，所述方法包括培养亚硝化单胞菌，直至达到约0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7或0.7-0.8的OD600。
在实施方案中，所述方法进一步包括分析所述亚硝化单胞菌和培养基中的污染生物体。在实施方案中，所述方法进一步包括分析亚硝化单胞菌的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个(例如，2或3个)。在实施方案中，所述方法包括生产至少至少约10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000或10,000L/天亚硝化单胞菌，例如以约1012CFU/L。在一些实施方案中，亚硝化单胞菌的浓度为约109、1010、1011、1012、1013或1014CFU/L。在一些实施方案中，亚硝化单胞菌的浓度为至少约109、1010、1011、1012、1013或1014CFU/L。
在一些方面，本公开提供了一种生产例如制造亚硝化单胞菌的方法，其包括使亚硝化单胞菌与培养基接触并培养所述亚硝化单胞菌，直至产生约至少约1,000L(约1012CFU/L)亚硝化单胞菌。
在实施方案中，所述方法进一步包括分析亚硝化单胞菌的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个(例如，2或3个)的步骤。
在实施方案中，所述方法进一步包括测试所述亚硝化单胞菌或培养基中的污染生物体的步骤。在实施方案中，与培养基进行接触的亚硝化单胞菌是具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个(例如，2或3个)的亚硝化单胞菌。
在一些方面，本公开提供了一种生产例如制造亚硝化单胞菌的方法，其包括
(a)使亚硝化单胞菌与培养基接触；和
(b)培养所述亚硝化单胞菌1至2天，由此建立培养物，直至所述培养物达到约0.5-0.6的OD600。
在实施方案中，所述方法进一步包括分析亚硝化单胞菌的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个的步骤。在实施方案中，所述方法进一步包括测试培养物中的污染生物体(例如，细菌、病毒、真菌或病原体或其组合)的步骤。在实施方案中，步骤(a)的亚硝化单胞菌是具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个(例如，2或3个)的亚硝化单胞菌。在实施方案中，所述方法包括产生至少至少约1,000L/天约1012CFU/L的亚硝化单胞菌。
在一些方面，本公开提供了由上述方法产生的亚硝化单胞菌细菌。
在实施方案中，通过上述方法制备亚硝化单胞菌的制剂。在一些方面，所述制剂可以包含约0.1毫克至约100毫克(mg)亚硝化单胞菌。
在一些方面，可以提供包含光密度为约0.5至约0.6的亚硝化单胞菌的反应混合物。在一些方面，本公开提供了一种生产携有亚硝化单胞菌的服装的方法，其包括使服装制品与如本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)接触。
在实施方案中，所述方法包括生产至少10、100或1000个服装制品。在实施方案中，所述方法包括使服装制品与至少1010CFU的亚硝化单胞菌接触。在实施方案中，所述方法进一步包括包装所述服装。
在某些方面，本公开提供了一种获得亚硝化单胞菌的制剂的方法，其包括使本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)与药学上或美容上可接受的赋形剂接触。
在实施方案中，所述方法进一步包括混合亚硝化单胞菌和赋形剂。在实施方案中，所述方法是在大体上不含污染生物体例如细菌、病毒、真菌或病原体的条件下进行。
在某些方面，本公开提供了一种包装亚硝化单胞菌的方法，其包括将本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)组装至包装中。
在实施方案中，所述包装是防气体交换的或防水的。在实施方案中，所述包装对气体交换、NH3、NH4 +或NO2 -是可渗透的。
在某些方面，本公开提供了一种抑制受试者皮肤上的微生物生长的方法，其包括向有需要的受试者局部施用有效剂量的本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。
在实施方案中，有效剂量为约1x 109CFU、2x 109CFU、5x 109CFU、1x 1010CFU、1.5x1010CFU、2x 1010CFU、5x 1010CFU或1x 1011CFU。在实施方案中，有效剂量为至少约1x109CFU、2x 109CFU、5x 109CFU、1x 1010CFU、1.5x 1010CFU、2x 1010CFU、5x 1010CFU或1x1011CFU在实施方案中，有效剂量为约1x 109CFU--2x 109CFU、2x 109CFU-5x 109CFU、5x109CFU-1x 1010CFU、1x 1010CFU-1.5x 1010CFU、1x 1010CFU-2x 1010CFU 1.5x 1010CFU-2x1010CFU、2x 1010CFU-5x 1010CFU或5x 1010CFU-1x 1011CFU。在实施方案中，以约1x 108、2x108、5x 108、1x 109、2x 109、5x 109或1x 1010CFU/ml的浓度施用所述细菌。在实施方案中，以至少约1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109、5x 109或1x 1010CFU/ml的浓度施用所述细菌。在实施方案中，以约1x 108-2x 108、2x 108-5x 108、5x 108-1x 109、1x 109-2x 109、2x109-5x 109或5x 109-1x 1010CFU/ml的浓度施用所述细菌。在实施方案中，每天施用两次。在实施方案中，受试者是人类。在实施方案中，待抑制的微生物生长是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或金黄色葡萄球菌(S.aureus或SA)、化脓性链球菌(S.pyogenes或SP)或鲍曼不动杆菌(A.baumannii或AB)的生长。
在某些方面，本公开提供了一种向受试者供应一氧化氮的方法，其包括将有效剂量的本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)放置在紧邻所述受试者处。
在某些方面，本公开提供了一种减少体臭的方法，其包括向有需要的受试者局部施用有效剂量的本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。
在某些方面，本公开提供了一种治疗与低亚硝酸盐水平有关的疾病的方法，其包括向有需要的受试者局部施用治疗有效剂量的本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。
在实施方案中，所述疾病是HIV皮炎、糖尿病足溃疡中的感染、过敏性皮炎、痤疮(例如寻常痤疮)、湿疹、接触性皮炎、过敏反应、银屑病、皮肤感染、血管疾病、阴道酵母菌感染、性传播疾病、心脏病、动脉粥样硬化、脱发、继发于糖尿病或卧床的下肢溃疡、心绞痛(特别是慢性稳定型心绞痛)、缺血性疾病、充血性心脏衰竭、心肌梗死、缺血再灌注损伤、蹄叶炎、高血压、肥厚性器官退化、雷诺氏现象(Raynaud’s phenomenon)、纤维化、纤维化器官退化、过敏、自身免疫性致敏、终末期肾病、肥胖、阳痿或癌症。
在某些方面，本公开提供了一种治疗皮肤病症的方法，其包括向有需要的受试者局部施用治疗有效剂量的如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。在相关方面，本公开提供了用于治疗病症如皮肤病症的如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。在相关方面，本公开提供了用于制造药物(例如，用于治疗皮肤病症的药物)的如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。
在实施方案中，所述皮肤病症是痤疮(例如寻常痤疮)、酒渣鼻、湿疹或银屑病。在一些实施方案中，所述皮肤病症是溃疡，例如，静脉性溃疡，例如下肢溃疡，例如下肢静脉性溃疡，例如糖尿病足溃疡中的感染。在一些实施方案中，局部施用包括用亚硝化单胞菌(例如，本文所述的亚硝化单胞菌)预治疗受试者。在一些实施方案中，局部施用包括在皮肤病症发生之前局部施用。在一些实施方案中，局部施用包括在皮肤病症发生之后局部施用。
在某些方面，本公开提供了一种促进伤口愈合或闭合的方法，其包括向伤口施用有效剂量的如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。在相关方面，本公开提供了用于促进伤口愈合的如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。在相关方面，本公开提供了用于制造药物(例如，用于促进伤口愈合的药物)的如本文所述的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。
在实施方案中，伤口包含一种或多种非所需的细菌，例如，致病性细菌。在实施方案中，伤口包含金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、绿脓杆菌或鲍曼不动杆菌。
在实施方案中，在伤口出现之前向受试者施用亚硝化单胞菌。在实施方案中，向伤口施药包括在伤口出现之前向受试者施药。在实施方案中，所述方法进一步包括在伤口出现之后向伤口施用亚硝化单胞菌(例如，本文所述的亚硝化单胞菌，例如菌株D23)。在一些方面，本公开提供了一种杀死致病性细菌或抑制致病性细菌的生长的方法，其包括使亚硝化单胞菌细菌(例如，本文所述的亚硝化单胞菌，例如菌株D23)接触(例如，施加至)皮肤。
在实施方案中，致病性细菌促进下列病状中的一个或多个：HIV皮炎、溃疡(例如，静脉性溃疡，例如下肢溃疡，例如下肢静脉性溃疡，例如糖尿病足溃疡中的感染)、过敏性皮炎、痤疮(例如寻常痤疮)、湿疹、接触性皮炎、过敏反应、银屑病、荨麻疹、酒渣鼻、皮肤感染、血管疾病、阴道酵母菌感染、性传播疾病、心脏病、动脉粥样硬化、脱发、继发于糖尿病或卧床的下肢溃疡、心绞痛(特别是慢性稳定型心绞痛)、缺血性疾病、充血性心脏衰竭、心肌梗死、缺血再灌注损伤、蹄叶炎、高血压、肥厚性器官退化、雷诺氏现象、纤维化、纤维化器官退化、过敏、自身免疫性致敏、终末期肾病、肥胖、阳痿、肺炎、原发性免疫缺陷病、大疱性表皮松解症或癌症。
在实施方案中，所述病状是溃疡，例如，静脉性溃疡，例如下肢溃疡，例如下肢静脉性溃疡，例如糖尿病足溃疡中的感染。在实施方案中，所述病状是下肢静脉性溃疡。在实施方案中，所述病状是痤疮，例如寻常痤疮。在实施方案中，所述病状是寻常痤疮。在实施方案中，所述致病性细菌是痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌或鲍曼不动杆菌中的一个或多个。在实施方案中，所述方法进一步包括确定受试者是否需要杀死致病性细菌或抑制致病性细菌的生长，例如，确定受试者需要杀死致病性细菌或抑制致病性细菌的生长。在实施方案中，所述方法进一步包括选择需要杀死致病性细菌或抑制致病性细菌的生长的受试者。
在一些实施方案中，亚硝化单胞菌催化以下反应。
在中性pH下，由中性pH条件周围的铵产生的氨是初始反应的底物。氨转化为亚硝酸盐分两个步骤进行，所述两个步骤分别由氨单加氧酶(Amo)和羟胺氧化还原酶(Hao)催化，具体如下：
NH3+2H++2e-+O2→NH2OH+H2O (A)
NH2OH+H2O→NO2 -+4e-+5H+ (B)
在一些情况下，反应B是如下所报道，指出在低pH下形成亚硝酸(HNO2)：
NH2OH+H2O→HNO2+4e-+4H+
在某些实施方案中，当在分批培养条件下生长时，亚硝化单胞菌具有小于4、5、6、7、8、9或10小时，例如约8小时，例如7-9小时或6-10小时的倍增时间。在一些实施方案中，倍增时间在分批培养条件下为至少3、4、5或6小时。在一些实施方案中，当在恒化器(即，连续培养)条件下生长时，亚硝化单胞菌具有小于16、18、20、22、24或26小时，例如约20小时，例如19-21小时或18-22小时的倍增时间。在一些实施方案中，倍增时间在恒化器条件下为至少10、12、14、16或18小时。
在某些实施方案中，OD600为约0.15-0.18的亚硝化单胞菌的连续培养物能够在约1-2天内达到约0.5-0.6的OD600。例如，在一些实施方案中，亚硝化单胞菌的连续培养物可以历时约1天从约0.15的OD600生长到至少0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8的OD600；在实施方案中，所述培养物可以历时约1天达到0.4-0.6或0.3-0.7的OD。在实施方案中，亚硝化单胞菌的连续培养物可以历时约2天从约0.15的OD600生长到至少0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8的OD600；在实施方案中，所述培养物可以历时约2天达到0.4-0.6或0.3-0.7的OD。在一些实施方案中，连续培养条件包括在生物反应器中的任选包含约200mM NH4 +的欧洲亚硝化单胞菌培养基中生长。在一些实施方案中，连续培养条件是实施例2中列出的条件。
在某些实施方案中，亚硝化单胞菌能够以至少约50、75、125或150微摩尔NO2 -/分钟，例如约100-150、75-175、75-125、100-125、125-150或125-175微摩尔/分钟，例如约125微摩尔NO2 -/分钟的速率将NH4 +(例如，约200mM)转化为亚硝酸盐(例如，最多达到约180mM)。在一些实施方案中，在约109CFU/ml的约1L恒化培养物中历时24小时测量反应速率。
在某些实施方案中，所述亚硝化单胞菌能够在包含至少50mM、75mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM或300mM NH4 +(或NH3)(例如，约150-200、175-225、200-250、225-275、250-300mM，例如约200或约250mM)的培养基中生长。在某些实施方案中，亚硝化单胞菌在这些铵浓度下生长于生物反应器中。在一些实施方案中，当亚硝化单胞菌在这些铵浓度下生长时，硝酸盐或亚硝酸盐的浓度能够达到至少60、80、100、120、140、160或180mM，例如约140-180、160-200或140-200mM，例如约160或180mM。
在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌(例如，亚硝化单胞菌菌株D23)的高密度培养物。例如，所述高密度培养物组合物可以包含OD600为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7(例如，约0.2-0.6、0.3-0.6、0.4-0.6、0.5-0.6或0.4-0.7)的亚硝化单胞菌细菌的活跃分裂培养物的细胞悬浮液，其中所述组合物大体上不含其它生物体。
在一些实施方案中，亚硝化单胞菌当在4℃下储存时稳定至少2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。在一些实施方案中，储存方法包括将所述细胞再悬浮于包含Na2HPO4和MgCl2(例如，50mM Na2HPO4和2mM MgCl2)中的一个或多个的缓冲液，例如实施例2中所述的储存缓冲液中。例如，储存条件可以为实施例2中详述的那些条件。在一些实施方案中，亚硝化单胞菌在于4°下储存之前在200mM NH4 +下以及6-8(例如，7)的pH下连续培养。稳定性可以包括以下一种或多种：1)保持活力，2)保持相关特性，诸如产生给定水平的亚硝酸盐的能力。
在某些实施方案中，NH4 +和NH3可以本公开的全文中互换使用。
本公开尤其提供了一种改变受试者的皮肤微生物组的组成的方法。所述方法包括将含有氨氧化细菌的制剂施用(例如，施加)于皮肤的表面，其中施用(例如，施加)的量和频率足以减少皮肤表面上的致病性细菌的比例。
氨氧化细菌在一些实施方案中是普遍存在的革兰氏阴性专性化能自养菌，其具有只从氨转化为亚硝酸盐产生能量的独特能力。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括基于受试者需要减少皮肤表面上的致病性细菌的比例来选择受试者。
在一些实施方案中，含有氨氧化细菌的制剂包含氨、铵盐和尿素中的至少一种。
在一些实施方案中，含有氨氧化细菌的制剂包括控释材料，例如，缓释材料。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂包含赋形剂，例如，药学上可接受的赋形剂或美容上可接受的赋形剂中的一种。所述赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂和美容上可接受的赋形剂中的一种)可以适用于局部、鼻部、肺部和胃肠道施用中的一个。所述赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂和美容上可接受的赋形剂中的一种)可以是表面活性剂。表面活性剂可以选自由以下所组成的组：椰油酰胺丙基甜菜碱(ColaTeric COAB)、聚山梨醇酯(例如，Tween 80)、乙氧基化月桂醇(RhodaSurf 6NAT)、月桂基醚硫酸钠/月桂基葡糖苷/椰油酰胺丙基甜菜碱(Plantapon 611L UP)、月桂基醚硫酸钠(例如，RhodaPex ESB70NAT)、烷基聚葡糖苷(例如，Plantaren 2000N UP)、月桂基醚硫酸钠(Plantaren 200)、布朗纳博士的卡斯蒂利亚肥皂(Dr.Bronner’s Castile soap)、月桂胺氧化物(ColaLux Lo)、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚磺酸酯烷基聚葡糖苷(PolySufanate 160P)、月桂基硫酸钠(Stepanol-WA Extra K)及其任意组合。布朗纳博士的卡斯蒂利亚肥皂包含水、有机椰子油、氢氧化钾、有机橄榄油、有机fair deal麻油、有机荷荷巴油、柠檬酸和生育酚。在一些实施方案中，所述赋形剂包括水、有机椰子油、氢氧化钾、有机橄榄油、有机fair deal麻油、有机荷荷巴油、柠檬酸和生育酚中的一种或多种(例如，全部)。
在一些实施方案中，所述制剂可以大体上不含其它生物体。
在一些实施方案中，所述制剂可以布置在粉末、化妆品、乳霜、棒状物、气雾剂、药膏、擦拭物或绷带中。所述制剂可以作为粉末、化妆品、乳霜、棒状物、气雾剂、药膏、擦拭物或绷带提供。
在一些实施方案中，所述制剂可以包含保湿剂、脱臭剂、香味剂、着色剂、驱虫剂、清洁剂或防紫外线剂。
在一些实施方案中，所述赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂或美容上可接受的赋形剂)可以包括抗粘附剂、粘合剂、涂层剂、崩解剂、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、吸附剂、防腐剂或甜味剂。
在一些实施方案中，含有氨氧化细菌的制剂可以包含约108CFU/L至约1014CFU/L。在某些方面，所述制剂可以包含约1x 109CFU/L至约10x 109CFU/L。
在一些实施方案中，含有氨氧化细菌的制剂可以包含约50毫克(mg)至约1000mg氨氧化细菌。
在一些实施方案中，氨氧化细菌对赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂或美容上可接受的赋形剂)的质量比在约0.1克/升至约1克/升的范围内。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可用于治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病或病状、治疗或预防体臭、进行治疗以向受试者供应一氧化氮或进行治疗以抑制微生物生长(例如，致病性细菌的生长)。
在一些实施方案中，所述氨氧化细菌选自由亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属和其组合所组成的组。所述制剂可以进一步包含选自由乳酸杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属及其组合所组成的组的生物体。在某些方面，所述制剂大体上不含除氨氧化细菌以外的生物体。
在一些实施方案中，含有氨氧化细菌的制剂可以包含处于生长状态的氨氧化细菌。在一些实施方案中，含有氨氧化细菌的制剂可以包含处于储存状态的氨氧化细菌。
在一些实施方案中，本公开的方法可以用于递送美容产品。在一些实施方案中，本公开的方法可以用于递送治疗产品。所述制剂可以用于治疗下列疾病中的至少一个：HIV皮炎、糖尿病足溃疡中的感染、过敏性皮炎、痤疮(例如寻常痤疮)、湿疹、接触性皮炎、过敏反应、银屑病、荨麻疹、酒渣鼻、皮肤感染、血管疾病、阴道酵母菌感染、性传播疾病、心脏病、动脉粥样硬化、脱发、继发于糖尿病或卧床的下肢溃疡、心绞痛(特别是慢性稳定型心绞痛)、缺血性疾病、充血性心脏衰竭、心肌梗死、缺血再灌注损伤、蹄叶炎、高血压、肥厚性器官退化、雷诺氏现象、纤维化、纤维化器官退化、过敏、自身免疫性致敏、终末期肾病、肥胖、阳痿、肺炎、原发性免疫缺陷病、大疱性表皮松解症或癌症。
在某些方面，所述制剂可以用于治疗痤疮(例如寻常痤疮)、湿疹、银屑病、荨麻疹、酒渣鼻和皮肤感染中的至少一个。
在一些实施方案中，所述制剂可以被提供在容器中，所述制剂和容器具有小于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000克的重量。
在一些实施方案中，所述制剂具有少于约0.1％至约10％的表面活性剂。在某些方面，所述制剂可以大体上不含表面活性剂。
在一些实施方案中，所述制剂可以包含螯合剂。在一些实施方案中，所述制剂可以大体上不含螯合剂。
在一些实施方案中，所述方法可以包括每天施用制剂约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次。在某些方面，制剂可以每天施用一次。在某些其它方面，制剂可以每天施用两次。
在一些实施方案中，可以施用制剂约1-3天、3-5天、5-7天、7-9天、5-10天、10-14天、12-18天、12-21天、21-28天、28-35天、35-42天、42-49天、49-56天、46-63天、63-70天、70-77天、77-84天或84-91天。在某些方面，可以施用制剂约16天。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括从皮肤的表面获取样品。在某些方面，所述方法可以进一步包括分离所述样品中的细菌的DNA。在某些方面，所述方法可以进一步包括对所述样品中的细菌的DNA进行测序。
在一些实施方案中，施用氨氧化细菌增加表面上的非致病性细菌的比例。在某些方面，所述非致病性细菌可以是共生非致病性细菌。在某些方面，所述非致病性细菌是葡萄球菌属的共生非致病性细菌。在某些方面，所述非致病性细菌可以是共生非致病性细菌表皮葡萄球菌。
在一些实施方案中，葡萄球菌属非致病性细菌的比例在约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周后增加或被确定为增加。在某些方面，非致病性细菌葡萄球菌属表皮葡萄球菌的比例在约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周后增加或被确定为增加。
在一些实施方案中，潜在致病性的或疾病相关性的丙酸杆菌属在约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周后减少或被确定为减少。
在一些实施方案中，潜在致病性的或疾病相关性的寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)在约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周后减少或被确定为减少。
在一些实施方案中，皮肤的表面包含伤口。
在一些实施方案中，治疗痤疮(例如寻常痤疮)的方法可以由本公开的一种或多种方法提供。在一些实施方案中，治疗湿疹的方法可以由本公开的一种或多种方法提供。在一些实施方案中，治疗银屑病的方法可以由本公开的一种或多种方法提供。在一些实施方案中，治疗荨麻疹的方法可以由本公开的一种或多种方法提供。在一些实施方案中，治疗酒渣鼻的方法可以由本公开的一种或多种方法提供。在一些实施方案中，治疗皮肤感染的方法可以由本公开的一种或多种方法提供。在一些实施方案中，提供了一种减少受试者的表面上的非所需细菌的量的方法。
在一些实施方案中，本文中的方法(例如，向有需要的受试者施用亚硝化单胞菌细菌，例如菌株D23的细菌的方法)进一步包括用抗生素治疗受试者。在实施方案中，所述抗生素是四环素、林可酰胺如克林霉素(Clindamycin)、大环内酯如红霉素、氨基糖苷如庆大霉素、 -内酰胺如哌拉西林(Piperacillin)、β-内酰胺酶抑制剂如他唑巴坦(Tazobactam)或其任何组合(如β-内酰胺(如哌拉西林)和β-内酰胺酶抑制剂(如他唑巴坦)的组合)。在一些实施方案中，抗生素是细菌对其敏感的抗生素。在实施方案中，在细菌已经实现所需的治疗效果后施用抗生素。在实施方案中，抗生素是细菌耐受的抗生素。在实施方案中，在其中所述细菌产生其治疗作用的阶段之前或期间施用抗生素。
应该理解的是，本文中涉及细菌的组合物和方法还可以涉及多个细菌。例如，施用亚硝化单胞菌细菌的方法还可以涉及施用多个亚硝化单胞菌细菌。
在某些方面，本公开还提供了核酸，其包含来自D23基因组内的连续核苷酸(例如，15-100个核苷酸)的序列，例如，本文所提供的基因(例如，描述于表1、图6-8或补充表1中的基因)、或SEQ ID NO:66或任何前述基因的逆向补体的序列。在相关方面，本公开提供了包含来自SEQ ID NO:1或其逆向补体内的连续核苷酸(例如，15-100个核苷酸)的序列的核酸。在相关方面，本公开提供了包含来自表1的基因(例如，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQID NO:33的序列)或其逆向补体内的连续核苷酸(例如，15-100个核苷酸)的序列的核酸。
在一些实施方案中，所述核酸具有非天然存在的序列或另一种修饰(如标签)或两者。在一些实施方案中，所述连续核苷酸的序列不是在亚硝化单胞菌菌株C91中发现的序列中。在一些实施方案中，所述核酸包含位于15-100个连续核苷酸的序列的5’端的异源序列，或位于15-100个连续核苷酸的序列的3’端的异源序列，或两者。在一些实施方案中，所述核酸的长度为10-15个、15-20个、20-25个、25-30个、30-24个、35-40个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸结合(例如，共价结合)至可检测标记，例如荧光标记。在一些实施方案中，所述核酸包含来自D23基因组内的10-15个、15-20个、20-25个、25-30个、30-24个、35-40个、40-50个、50-60个、60-70个、70-80个、80-90个或90-100个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸包含来自D23基因组内的至少约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸为DNA。
在一些方面，本公开提供包含第一核酸和第二核酸的组合物或试剂盒。在一些实施方案中，所述第一核酸包含来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:66、图6-8的基因或表1的基因或其逆向补体内的连续核苷酸(例如，15-100个)。在一些实施方案中，所述第二核酸包含来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:66、图6-8的基因或表1的基因或其逆向补体内的连续核苷酸(例如，15-100个)。在一些实施方案中，所述核酸具有非天然存在的序列，例如未在亚硝化单胞菌菌株C91中发现的序列。在一些实施方案中，所述第一核酸和所述第二核酸限定表1的基因(例如，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33的序列)或其逆向补体内的扩增子。
在一些实施方案中，所述第一核酸具有对应于SEQ ID NO:1的第一区域的序列，且所述第二核酸的逆向补体具有对应于SEQ ID NO:1的第二区域的序列，且所述第一区域和第二区域相隔适于PCR的距离。在一些实施方案中，所述第一核酸的逆向补体具有对应于SEQ ID NO:1的第一区域的序列，且所述第二核酸具有对应于SEQ ID NO:1的第二区域的序列，且所述第一区域和第二区域相隔适于PCR的距离。在一个实施方案中，适用于PCR的距离为SEQ ID NO:1的不超过50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一核酸和第二核酸描绘SEQ ID NO:1中的扩增子。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸各自具有适用于PCR的熔融温度(Tm)，例如约55-65°或约60-65℃。在一些实施方案中，第一核酸的Tm与第二核酸的Tm的差异在10、9、8、7、6、5、4、3、2或1℃内。
在一些实施方案中，第一核酸、第二核酸或第一核酸和第二核酸中的每个进一步包含位于连续核苷酸序列的5’端的异源序列。另外或组合地，在一些实施方案中，第一核酸、第二核酸或第一核酸和第二核酸中的每个进一步包含位于来自SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:66内的连续核苷酸序列的3’端的异源序列。在一些实施方案中，第一核酸、第二核酸或第一核酸和第二核酸中的每个具有15-20个、20-25个、25-30个、30-24或35-40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，第一核酸、第二核酸或第一核酸和第二核酸中的每个结合(例如，共价结合)至可检测标记，例如荧光标记。在一些实施方案中，第一核酸包含SEQ ID NO:64的序列或由SEQ ID NO:64的序列组成。在一些实施方案中，第二核酸包含SEQ ID NO:65的序列或由SEQ ID NO:65的序列组成。在一些实施方案中，第一核酸、第二核酸或两者都是DNA。
在一些实施方案中，所述组合物或试剂盒包含至少两个(例如，3、4、5、6、7、8、9或10个)引物对，每一对识别表1的基因(例如，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33的序列)或其逆向补体内的扩增子。在一些实施方案中，第一引物对识别Amo基因(例如，AmoA1、AmoA2、AmoB1、AmoB2、AmoC1、AmoC2或AmoC3)中的扩增子且第二引物对识别Amo基因(例如，AmoA1、AmoA2、AmoB1、AmoB2、AmoC1、AmoC2、或AmoC3)中的扩增子。在一些实施方案中，第一引物对识别AmoA基因(例如，AmoA1或AmoA2)中的扩增子。在一些实施方案中，第二引物对识别AmoB基因(例如，AmoB1或AmoB2)中的扩增子。在一些实施方案中，第三引物对识别AmoC基因(例如，AmoC1、AmoC2或AmoC3)中的扩增子。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含其中布置有所述第一核酸的第一容器和其中布置有所述第二核酸的第二容器。所述试剂盒可以包含用于例如第三、第四、第五或第六核酸的额外容器。在一些实施方案中，识别扩增子的引物对被储存在单一容器内。
在一些方面，本公开还提供了包含SEQ ID NO:64的序列或由SEQ ID NO:64的序列组成的核酸。在一些方面，本公开还提供了包含SEQ ID NO:65的序列或由SEQ ID NO:65的序列组成的核酸。在一些方面，本公开还提供了包含本文所描述的核酸和可检测标记例如荧光标记的分子。所述核酸可以由例如SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的序列组成。
在一些方面，本公开提供了包含第一分子和第二分子的组合物。在一些实施方案中，所述第一分子包含本文所描述的核酸，例如由SEQ ID NO:64的序列组成的核酸，并且任选地包含可检测标记，例如荧光标记。在一些实施方案中，所述第二分子包含本文所描述的核酸，例如由SEQ ID NO:65的序列组成的核酸，并且任选地包含可检测标记，例如荧光标记。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含其中布置有所述第一分子的第一容器和其中布置有所述第二分子的第二容器。
在一些实施方案中，本文所述的试剂盒进一步包含下列中的一个或多个：缓冲剂、酶(例如，聚合酶，如热稳定聚合酶如Taq)、核苷酸(例如，dNTP)和任选被染料标记的链终止核苷酸(例如，双脱氧核苷酸)；这些组分可以分别提供或作为单一组合物的部分提供。
在某些方面，本公开提供了一种检测D23亚硝化单胞菌核酸是否存在于样品中的方法，其包括：使用特异于D23亚硝化单胞菌的引物对所述样品进行聚合酶链反应(PCR)，以及测定是否产生了PCR产物，其中PCR产物的存在表明D23亚硝化单胞菌核酸存在于所述样品中。在实施方案中，进行至少两个PCR反应，例如，3、4、5、6、7、8、9或10个PCR反应。在实施方案中，以不同的反应体积进行PCR反应。在实施方案中，以多重方式进行两个或更多个PCR反应。
在一些实施方案中，特异于D23亚硝化单胞菌的引物是本文所述的第一核酸和第二核酸，例如，来自本文所述的组合物或试剂盒的第一和第二核酸。在一些实施方案中，第一引物包含SEQ ID NO:65的序列或由SEQ ID NO:65的序列组成，且第二引物包含SEQ IDNO:66的序列或由SEQ ID NO:66的序列组成。
在一些实施方案中，PCR反应是定量或实时PCR反应。在一些实施方案中，PCR反应包括TaqMan反应。在一些实施方案中，PCR反应包括使反应混合物的温度在变性温度(例如，约95℃)、退火温度(例如，45-68℃、55-65℃或60-65℃)和延伸温度(例如，约68℃)之间循环足以产生可检测的PCR产物的循环次数，例如，约10次、15次、20次、25次或30次循环。在一些实施方案中，检测PCR产物包括检测来自PCR产物的荧光。在一些实施方案中，进行阳性对照，例如使用已知的D23亚硝化单胞菌核酸作为模板。在一些实施方案中，使用阴性对照，例如，不使用模板或使用另一种细菌的核酸作为模板。
在某些方面，本公开提供了一种检测D23亚硝化单胞菌核酸是否存在于样品中的方法，其包括检测本文所述的核酸与样品的结合，其中结合的存在表明D23亚硝化单胞菌核酸存在于所述样品中。在一些实施方案中，通过引物延伸或RNase保护检测结合。
在本文中的方法的一些实施方案中，所述样品包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个菌株的细菌。在一些实施方案中，所述样品来自受试者例如人类受试者的皮肤。在一些实施方案中，本文中的方法包括检测样品中的一种或多种其它类型的细菌，例如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌或鲍曼不动杆菌。
本公开预期了前述的方面和/或实施方案中的任何一个或多个的所有组合，以及与具体实施方式和实施例中所阐述的实施方案中的任何一个或多个的组合。
附图简述
图1示出了包含亚硝化单胞菌菌株D23的细菌的混合培养物的生长。绘制了在600nm波长下的光密度相对于时间的曲线图。
图2A示出了包含亚硝化单胞菌菌株D23的细菌的混合培养物的亚硝酸盐产生。绘制了亚硝酸盐浓度相对于时间的曲线图。
图2B-I示出了分批培养的亚硝化单胞菌D23的亚硝酸盐产生动力学。绘制了亚硝酸盐浓度相对于时间的曲线图。
图2B-II示出了亚硝化单胞菌D23在体外的亚硝酸盐产生动力学。绘制了亚硝酸盐浓度相对于时间的曲线图。
图2C示出了储存在4℃下的亚硝化单胞菌D23的稳定性。绘制了亚硝酸盐浓度相对于时间的曲线图。
图3A示出了亚硝化单胞菌D23在共培养实验中抑制铜绿假单胞菌(左图)和金黄色葡萄球菌(右图)的生长的能力。绘制了每种类型的非所需细菌的量(以CFU/ml计)相对于时间的曲线图。在该图中，“AOB”是指菌株D23。
图3B示出了亚硝化单胞菌D23在共培养实验中抑制化脓性链球菌(左图)和鲍曼不动杆菌(右图)的生长的能力。绘制了每种类型的非所需细菌的量(以CFU/ml计)相对于时间的曲线图。在该图中，“AOB”是指菌株D23。
图3C示出了亚硝化单胞菌D23在共培养实验中抑制痤疮丙酸杆菌的生长的能力。绘制了每种类型的非所需细菌的量(以CFU/ml计)相对于时间的曲线图。在该图中，“AOB”是指菌株D23。
图4A(顶部图)绘制了在共培养实验中NO2-浓度随时间的变化。底部图绘制了在共培养实验中pH随时间的变化。
图4B(顶部图)绘制了在共培养实验中指定细菌的CFU/ml随时间的变化。中心图绘制了在共培养实验中NO2-浓度随时间的变化。底部图绘制了在共培养实验中pH随时间的变化。
图4C绘制了D23对皮肤病原体的杀微生物活性。
图4D绘制了D23对皮肤病原体的杀微生物活性。
图4E示出了D23对皮肤病原体的杀微生物活性的替代曲线图。
图5A绘制了在测试D23改善伤口愈合的能力的实验中伤口闭合百分比随时间的变化。
图5B绘制了各种D23治疗的CT50。
图5C绘制了在测试D23改善伤口愈合的能力的实验中伤口闭合百分比随时间的变化。
图5D绘制了在测试D23改善伤口愈合的能力的实验中伤口闭合百分比随时间的变化。
图5E绘制了各种D23治疗的CT50。
图5F示出了糖尿病小鼠中的由D23增强的伤口愈合在第1天、第11天和第15天的图像。
图5G示出了对于各种浓度的D23的血糖测量。
图5H示出了测试受试者在测试过程中的体重。
图5I示出了测试受试者在测试过程中的体重。
图5J示出了受试者的头皮测试的PCR分数。AOB在此图中是指D23。
图5K示出了用于评价含亚硝化单胞菌的局部混悬液(AOB-001)的人类志愿者研究的示意图。
图5L(左图)示出了在研究期间收集的头皮擦拭物的PCR分析。AOB特异性三基因标签(amoA、amoB、amoC)的阳性百分比样品。右图示出了在研究期间收集的头皮擦拭物的PCR分析。从23个志愿者中的每一个收集的总共六个样品的复合PCR分数。指示了用于在六个取样点中的每个所收集的阳性样品的评分方案。
图5M示出了通过在局部施加AOB-001之前和之后收集的皮肤擦拭物样品中的16SrDNA测序所确定的属水平细菌多样性。显示代表在施加之前的基线(第0天)和一周施加之后立即收集(第8天)或停止局部施加后一周(第14天)收集的样品中的12种细菌属中的每种的总序列读段的百分比。示出了不动杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属、埃希氏杆菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、亚硝化单胞菌属、泛菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、葡萄球菌和寡养单胞菌属的比例。
图5N-A示出了在AOB-001施用之前和之后收集的皮肤样品中亚硝化单胞菌和其它物种的丰度的变化。显示代表在施加之前(第0天)、一周施加之后立即(第8天)或停止局部施加后一周(第14天)的亚硝化单胞菌属的总16S rDNA序列读段的百分比。
图5N-B示出了在AOB-001施加之前和之后收集的皮肤样品中亚硝化单胞菌和其它物种的丰度的变化。通过对从AOB使用者所收集的第0天相对于第8天样品进行16S rDNA测序来检测物种丰度的模式变化。
图5O示出了AOB-001的使用者评价。AOB-001美容效果的评估由23名志愿者在其头皮和脸部完成一周施加后提供。对受试者以渐增的复合PCT分数的顺序绘图。(2＝极其一致；0＝没有变化；-2＝极其不一致)。
图6是显示具有指定的开放阅读框(ORF)编号和基于序列分析的功能或长度上超过200个碱基对的假定基因的独特D23基因的表格。列标题表示如下：特征ID＝基因的唯一标识符；类型＝基因类型，其中CDS表示蛋白质编码DNA序列；起始＝SEQ ID NO:1的基因组序列中的基因的起始位置；终止＝SEQ ID NO:1的基因组序列中的基因的末端；框架＝阅读框；长度＝基因的碱基对长度；功能＝基于序列分析的基因或蛋白质功能；子系统＝基因功能的类别；D23GbkId＝基因标识符。
图7是显示具有指定的ORF编号的少于200个碱基对的独特D23基因的表格。列标题如图6中所述。
图8是显示没有指定的ORF编号的独特D23基因的表格。列标题如图6中所述。
图9列出了在D23中没有同源物的独特C91基因。
图10是亚硝化单胞菌菌株D23和C91中的AmoA1和AmoA2蛋白之间的序列比对。表1中列出了每种蛋白质的SEQ ID。图10按出现的顺序公开了SEQ ID NO 6、12、36和42。
图11是亚硝化单胞菌菌株D23和C91中的AmoB1和AmoB2蛋白之间的序列比对。表1中列出了每种蛋白质的SEQ ID。图11按出现的顺序公开了SEQ ID NO 8、14、38和44。
图12是亚硝化单胞菌菌株D23和C91中的AmoC1和AmoC2蛋白之间的序列比对。表1中列出了每种蛋白质的SEQ ID。图12按出现的顺序公开了SEQ ID NO 34、40、10和4。
图13是亚硝化单胞菌菌株D23和C91中的AmoC3蛋白之间的序列比对。表1中列出了每种蛋白质的SEQ ID。图13按出现的顺序公开了SEQ ID NO 46和16。
图14A和图14B示出了亚硝化单胞菌菌株D23和C91中的Hao1、Hao2和Hao3蛋白之间的序列比对。表1中列出了每种蛋白质的SEQ ID。图14按出现的顺序公开了SEQ ID NO 20、22、18、50、52和48。
图15是亚硝化单胞菌菌株D23和C91中的cycA1、cycA2和cycA3基因之间的序列比对。表1中列出了每种蛋白质的SEQ ID。图15按出现的顺序公开了SEQ ID NO 26、28、24、58、56和54。
图16是亚硝化单胞菌菌株D23和C91中的cycB1和cycB2基因之间的序列比对。表1中列出了每种蛋白质的SEQ ID。图16按出现的顺序公开了SEQ ID NO 30、32、60和62。
图17示出了按照属相对于天绘制的细菌比例的条形图。
图18示出了第0天、第1天、第8天、第14天和第16天的按属相对于细菌属绘制的细菌比例的条形图。
补充表1利用序列分析显示在菌株D23中鉴定的2,777个基因的基因组注释。列标题如图6中所述。“C91Alias”是指菌株C91中的同源物。补充表1附加于具体实施方式和实施例的末尾。
补充表2显示在菌株D23中鉴定的选定蛋白质基因的序列。补充表2附加于具体实施方式和实施例的末尾。
详述
亚硝化单胞菌属的氨氧化细菌(AOB)是革兰氏阴性专性自养菌，其具有只从作为能量来源的氨产生亚硝酸盐和一氧化氮的独特能力。它们在土壤和水环境中均广泛存在并且是环境硝化过程的重要组分。由于人类皮肤上的亚硝酸盐和一氧化氮作为若干生理功能(如血管舒张、皮肤炎症和伤口愈合)的重要组分的作用，这些细菌对于健康的皮肤状况和免疫病理性皮肤状况都可以具有有益性质。这些细菌可以在人类中安全使用，因为它们生长缓慢，无法在有机碳源上生长，可以对皂类和抗生素敏感，并且从未与动物或人类中的任何疾病或感染有关。
1.定义
氨氧化细菌是指能够以一定速率，例如实质速率，例如预定速率，例如至少为描绘于图2A、图2B、图2C、图4A、图4B或图5中的任一个中的速率或该速率的至少90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％将氨或铵氧化为亚硝酸盐的细菌。在一些实施方案中，实质速率是指铵离子(NH4 +)(例如，约200mM)以至少50、75、125或150微摩尔NO2 -/分钟，例如约100-150、75-175、75-125、100-125、125-150或125-175微摩尔/分钟，例如约125微摩尔NO2 -/分钟的速率转化为亚硝酸盐(NO2 -)。氨氧化细菌的实例包括亚硝化单胞菌菌株D23和C91，以及亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属和亚硝化弧菌属中的其它细菌。D23亚硝化单胞菌菌株是指被命名为AOB D23-100的菌株，其在2014年4月8日保藏于美国组织培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-121157。登录号PTA-121157的D23亚硝化单胞菌具有如本文中的SEQ ID NO:1中所列出的基因组序列。登录号PTA-121157的核酸序列(例如基因组序列)在此通过引用整体并入。
如本文所使用的术语优化的亚硝化单胞菌(N.eutropha)是指具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性的亚硝化单胞菌。在一个实施方案中，它与天然存在的亚硝化单胞菌的差异在于至少一个核苷酸，例如选自氨单加氧酶、羟胺氧化还原酶、细胞色素c554或细胞色素cM552的基因中的核苷酸。所述差异可以例如通过亚硝化单胞菌的自发产生的突变的选择、诱发型突变或定向基因工程而产生。在一个实施方案中，它与天然存在的亚硝化单胞菌的差异在于其具有在自然中不一起存在的一群等位基因。这些差异可以提供下列中的一个或多个：治疗或预防皮肤病症、治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病或病状、治疗或预防体臭、进行治疗以向受试者供应一氧化氮以及进行治疗以抑制微生物生长。
如本文中所用，“纯性”是指包含生物体的组合物大体上不含其它生物体。例如，氨氧化细菌的纯性培养物是大体上不含除氨氧化细菌以外的生物体的培养物。例如，亚硝化单胞菌的纯性培养物是大体上不含除亚硝化单胞菌以外的生物体的培养物。在一些实施方案中，“大体上不含”表示不能被用于检测其它生物体的方法(例如，平板接种培养物并检查菌落形态，或针对保守基因如16S RNA的PCR)检测到。纯性组合物可以包含不是生物体的元素，例如，它可以包含营养物或赋形剂。本文所讨论的氨氧化细菌的任何实施方案、制剂、组合物或配制物可以包含任选纯性的氨氧化细菌、基本上由任选纯性的氨氧化细菌组成或由任选纯性的氨氧化细菌组成。
在本公开的全文中，配制物可以指组合物或制剂。
如本文中所使用，“自养生物”例如自养细菌是能够通过使用无机材料作为营养源以及使用光合作用或化学合成作为能量来源进行自营养的任何生物体。自养细菌可以从二氧化碳和衍生自其它来源的ATP、使氨氧化成亚硝酸盐、使硫化氢氧化和使Fe2+氧化成Fe3+合成有机化合物。本公开的自养细菌无法引起感染。
如本文中所使用，“组合”施用意指在受试者罹患病症的过程中将两种(或更多种)不同的治疗递送给受试者，例如，在受试者已被诊断为患有所述病症之后以及在所述病症已经被治愈或消除之前递送所述两种或更多种治疗。在一些实施方案中，一种治疗的递送在第二治疗的递送开始时仍然在发生，从而存在重叠。这有时在本文中被称为“同时”或“伴随”或“共同递送”。在其它实施方案中，一种治疗的递送在开始另一种治疗的递送之前结束。这有时在本文中被称为“连续”或“顺序递送”。在任一种情况的实施方案中，治疗都因为组合施用而更有效。例如，第二治疗是更有效的，例如，相比于如果在缺少第一治疗的情况下施用第二治疗将观察到的情况，利用更少的第二治疗观察到同等的效果，或第二治疗在更大程度上减少症状，或者对于第一治疗将观察到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的减少比在递送一种治疗而缺少另一种治疗的情况下将会观察到的减少更大。两种治疗的作用可以部分相加、全部相加或比相加更大(即，协同)。所述递送可以使得递送的第一治疗的作用在递送第二治疗时仍然是可检测的。
完全欧洲亚硝化单胞菌培养基是指描述于Ensign等人，“In vitro activationof ammonia monooxygenase from Nitrosomonas europaea by copper.”JBacteriol.1993年4月；175(7):1971-80中的欧洲亚硝化单胞菌生长培养基。
“培养”是指将一定量的所需细菌放置在促进其生长(即，促进细胞分裂)的条件下的过程。所述条件可以涉及特定培养基、设定温度的范围和/或搅拌速率。可以在液体培养基中或在平板例如琼脂平板上培养细菌。
如本文中所使用，术语“分离的”是指从其原始或天然环境(例如，如果它是天然存在的，则为天然环境)中移出的物质。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但通过人类干预与天然系统中的一些或全部共存物质分离的相同的多核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，且它们仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是其所处的自然环境中的一部分。
术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以是单链的或双链的，并且如果是单链的，那么它可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和其核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后被进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。核酸可以是重组多核苷酸或源自基因组、cDNA、半合成或合成的多核苷酸，其不存在于自然中或者以非天然配置连接至另一个多核苷酸。
如本文中所用，术语“优化的生长速率”是指下列中的一个或多个：当如本文的实施例2中所述在分批条件下培养时，倍增时间小于约4、5、6、7、8、9或10小时；当如本文的实施例2中所述在恒化器条件下生长时，倍增时间小于约16、18、20、22、24或26小时；或在约1天或2天内从约0.15的OD 600生长到至少约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8的OD 600。在一个实施方案中，优化的生长速率是倍增时间比天然存在的亚硝化单胞菌的倍增时间短至少10％、20％、30％、40％或50％的生长速率。
如本文中所用，“优化的NH4 +氧化速率”是指NH3或NH4 +转化为NO2 -的速率为至少约50、75、125或150微摩尔/分钟。例如，所述速率可以为至少约50、75、125或150微摩尔/分钟的NH4 +(例如，约200mM)转化为NO2 -。在一个实施方案中，优化的NH4 +氧化速率是其中NH3或NH4 +转化为NO2 -的速率比在天然存在的亚硝化单胞菌中所见的速率快至少10％、20％、30％、40％或50％。
关于本文的氨基酸序列(例如，由亚硝化单胞菌D23表达的蛋白质)的“百分比(％)氨基酸序列同一性”的定义为：在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性替代视为序列同一性的部分时，候选序列中与参照序列(其可以是天然存在的亚硝化单胞菌序列或亚硝化单胞菌D23序列)中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了测定百分比氨基酸序列同一性的目的而进行的比对可以以在本领域技术人员的手段内的多种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于测量比对的适当参数，包括在被比较序列的全长内实现最大比对所需要的任何算法。例如，WU-BLAST-2软件可以用于确定氨基酸序列同一性(Altschul等人，Methods in Enzymology 266,460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)。WU-BLAST-2使用数个搜索参数，其中大多数被设置为默认值。可调参数设置有以下值：重叠跨度＝1；重叠分数＝0.125；世界阈值(T)＝I 1。HSP分数(S)和HSP S2参数是动态值并且由程序自身根据具体序列的组成来确定，然而，可以视情况调整最小值。
氨基酸替代可以是将一个氨基酸替换为具有相似的结构和/或化学性质的另一个氨基酸的结果，诸如用丝氨酸替换亮氨酸，即保守性氨基酸替换。典型的但非限制性的保守性替代是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的互相替换；含羟基的残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的互换；含酰胺的残基Asn和Gln的互换；碱性残基Lys和Arg的互换；芳族残基Phe和Tyr的互换；以及小型氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的互换。另外的保守性替代包括将一个氨基酸替换为具有类似的空间或立体构型的另一个氨基酸，例如，Asn和Asp的互换或Gln和Glu的互换。氨基酸替代还可以是将一个氨基酸替换为具有不同的结构和/或化学性质的另一个氨基酸的结果，即非保守性氨基酸替换。插入或缺失可以任选地在1至5个氨基酸的范围内。允许的变化可以通过对序列中的氨基酸系统地进行插入、缺失或替代并测试所得变体在体内或者体外分析中对于例如尿素或氨的代谢的活性来确定。
关于本文的核酸序列(例如，亚硝化单胞菌D23基因组及其部分)的“百分比(％)序列同一性”的定义为：在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照序列(其可以是天然存在的亚硝化单胞菌序列或亚硝化单胞菌D23序列)中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。为了测定百分比核苷酸序列同一性的目的而进行的比对可以以在本领域技术人员的手段内的多种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件如BLAST。本领域技术人员可以决定用于测量比对的适当参数，包括在被比较序列的全长内实现最大比对所需要的任何算法。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果为单链)在本文中可互换地用于指氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以间杂有非氨基酸。该术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，诸如与标记组分缀合。该多肽可以从天然来源中分离，可以通过重组技术从真核或原核宿主产生，或者可以是合成程序的产物。
如本文中所使用，“优化的NH4 +抗性”是指能够在大于50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300mM NH3或NH4 +的条件下生长至少约24或48小时。在一个实施方案中，优化的NH4 +抗性是指能够在选定浓度的NH3或NH4 +下比天然存在的亚硝化单胞菌生长快至少10％、20％、30％、40％或50％，或生长时间长至少10％、20％、30％、40％或50％。
如本文中针对核酸或蛋白质序列之间的比较所使用，“相似的”意指具有同源性。相似的基因或蛋白质可以包括例如替代(如保守性替代或非保守性替代)、插入(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30个氨基酸和例如最多2、3、4、5、10、15、20、25、30或50个氨基酸的插入，或它们的任何正性组合，或所述数目的编码所述氨基酸所需要的核苷酸的插入)或缺失(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30个氨基酸和例如最多2、3、4、5、10、15、20、25、30或50个氨基酸的缺失，或它们的任何正性组合，或所述数目的编码所述氨基酸所需要的核苷酸的缺失)，或它们的任何组合。替代、插入和缺失中的每一个可以定位在所述蛋白质或基因的N末端、C末端或中心区域。在实施方案中，保守性替代是不改变替代位置处的电荷和/或极性和/或近似大小和/或几何结构的替代。
如本文中所用，“转基因”意指包含DNA的一个或多个外源性部分。外源性DNA衍生自另一个生物体，例如，另一种细菌、噬菌体、动物或植物。
如本文中所用，疾病或病症的治疗是指与类似的但未经治疗的患者相比，降低所述疾病或病症的至少一种症状的严重程度或频率。治疗还可以指与类似的但未经治疗的患者相比，阻止、减缓或逆转疾病或病症的进展。治疗可以包括解决疾病和/或一种或多种症状的根本原因。
如本文中所使用，治疗有效量是指足以防止疾病或病症的推进或引起疾病或病症的消退，或能够缓解疾病或病症的症状，或能够实现所需结果的剂量。治疗有效剂量可以被测量为例如细菌的数量或活菌的数量(例如，以CFU计)或细菌的质量(例如，以毫克、克或千克计)，或细菌的体积(例如，以mm3计)。
如本文中所使用，术语“活力”是指自养细菌(例如，氨氧化细菌)以预定速率将氨、铵或尿素氧化为亚硝酸盐的能力。在一些实施方案中，实质速率是指铵离子(NH4 +)(例如，以约200mM)以至少50、75、125或150微摩尔NO2-/分钟，例如约100-150、75-175、75-125、100-125、125-150或125-175微摩尔/分钟，例如约125微摩尔NO2 -/分钟的速率转化为亚硝酸盐(NO2 -)。
如本文中所提及的“生长培养基”或“AOB培养基”包括本文的表3或表4中的下列组分。
在一些实施方案中，与本公开最相关的状态是生长(例如，最大生长)的状态，其特征为至少约7.6的pH、氨、微量矿物质、氧和二氧化碳。另一种状态可以由约7.4或更小的pH表征以及由二氧化碳的缺乏表征。在低二氧化碳条件下，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)继续将氨氧化成亚硝酸盐并产生ATP，但缺乏二氧化碳，例如，缺乏足够的二氧化碳来固定和生成蛋白质，其相反生成被其用作能量储存介质的多磷酸盐。这可以允许氨氧化细菌保持在“储存状态”下一段时间，例如预定的时间段，例如，至少1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月；1、2、3、4或5年。在一些实施方案中，氨氧化细菌可以保持在储存状态下至少保持约6个月至约1年。
如本文中所用，“生长状态”是指在可以具有至少约7.6的pH的状态下或环境(例如介质，例如培养基，例如生长培养基)中的自养细菌(例如，氨氧化细菌)。氨、铵离子和尿素中的至少一种的水平可以在约1微摩尔浓度和1000毫摩尔浓度之间。微量物质的水平在约0.01微摩尔浓度的铁和200微摩尔浓度的铁之间。氧的水平在约5％和100％氧饱和度(例如，培养基的氧饱和度)之间。二氧化碳的水平在约20ppm和10％饱和度(例如，培养基的饱和度)之间。在某些方面，氨、铵离子和尿素中的至少一种的水平可以在约10微摩尔浓度和100毫摩尔浓度之间。微量物质的水平在约0.1微摩尔浓度的铁和20微摩尔浓度的铁之间。氧的水平在约5％和100％氧饱和度之间。二氧化碳的水平在约200ppm和5％饱和度(例如，培养基的饱和度)之间。
如本文中所用，“多磷酸盐负载状态”是指在可以具有约7.4或更小的pH的状态下或环境(例如介质，例如培养基，例如生长培养基)中的自养细菌(例如，氨氧化细菌)。氨、铵离子和尿素中的至少一种的水平在约1微摩尔浓度和2000毫摩尔浓度之间。微量物质的水平在0.01微摩尔浓度的铁和200微摩尔浓度的铁之间。氧的水平在约0％和100％O2饱和度(例如，培养基的氧饱和度)之间。二氧化碳的水平介于/小于约0和400ppm之间，且磷酸盐水平大于约1微摩尔浓度。在某些方面，氨、铵离子和尿素中的至少一种的水平在约10微摩尔浓度和200毫摩尔浓度之间。微量物质的水平在0.1微摩尔浓度的铁和20微摩尔浓度的铁之间。氧的水平在约5％和100％O2饱和度之间。二氧化碳的水平介于/小于约0和200ppm之间，且磷酸盐水平大于约10微摩尔浓度。
可以诱导多磷酸盐负载状态一段时间，例如，预定的时间段。该预定的时间段可以是允许在氨氧化细菌中积累足够的多磷酸盐的时间段。该预定的时间段是适于提供充足的多磷酸盐负载以允许氨氧化细菌长时间储存的时间段。预定的时间段可以至少部分基于约0.2-10倍、0.3-5倍、0.5-3倍、0.5-1.5倍或0.5-1倍氨氧化细菌的倍增时间的时间段。预定的时间段可以至少部分基于氨氧化细菌的约1个倍增时间的时间段。在一些实施方案中，预定的时间段介于约8小时和12小时之间。在一些实施方案中，预定的时间段为约10小时。在一些实施方案中，预定的时间段为约24小时。
多磷酸盐负载状态的目的可以是向AOB提供充足的氨、铵离子和/或尿素和O2，以使得可以产生ATP，但不向AOB提供CO2和碳酸盐，以使得它们无法使用该ATP固定CO2，而是使用该ATP来生成可以由细菌储存的多磷酸盐。
如本文中所用，术语“储存状态”是指在具有约7.4或更小的pH(在一些实施方案中，pH可以为7.6或更小)的状态下或环境(例如介质，例如培养基，例如生长培养基)中的自养细菌(例如，氨氧化细菌)。氨、铵离子和尿素中的至少一种的水平在约_1和1000微摩尔浓度之间。微量物质的水平在约0.1和100微摩尔浓度之间。氧的水平在约0％和100％饱和度(例如，培养基的饱和度)之间。二氧化碳的水平在约0和800ppm之间。在某些方面，氨、铵离子和尿素中的至少一种的水平在约_10和100微摩尔浓度之间。微量物质的水平在约1和10微摩尔浓度之间。氧的水平在约0％和100％饱和度(例如，培养基的饱和度)之间。二氧化碳的水平在约0和400ppm之间。
根据本公开的一些实施方案通过在生长状态期间生成AOB生物质，然后使AOB暴露于多磷酸盐负载状态，然后除去培养基并使AOB再悬浮于缓冲液(例如储存缓冲液)中(即，储存状态)来产生AOB。
氨氧化细菌可以保持在“储存状态”下一段时间，例如预定的时间段，例如，至少1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月；1、2、3、4或5年。在一些实施方案中，氨氧化细菌可以保持在储存状态下至少保持约6个月至约1年。在恢复后，氨氧化细菌的活力是氨氧化细菌在储存之前(例如，在生长状态下)的活力的至少约50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，可以制备氨氧化细菌的制剂，以使得当在选定的条件下储存时，使NH4 +氧化的能力损失不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
使氨氧化细菌从储存状态(或多磷酸盐负载状态)恢复所需要的时间可以是预定的时间段。例如，预定的时间段可以小于约75小时或小于约72小时。预定的时间段可以至少部分基于约0.2-10倍、0.3-5倍、0.5-3倍、0.5-1.5倍或0.5-1倍氨氧化细菌的倍增时间的时间段。预定的时间段可以至少部分基于氨氧化细菌的约1个倍增时间的时间段。预定的时间段可以在约8小时和12小时之间。预定的时间段可以为约10小时。预定的时间段可以小于约75小时、72小时、70小时、68小时、65小时、60小时、55小时、50小时、45小时、40小时、35小时、30小时、25小时、20小时、15小时、10小时、5小时、4小时、3小时、2小时或1小时。预定的时间段可以在约5分钟和5小时之间。预定的时间段可以为约5-10分钟、10-15分钟、15-20分钟、20-25分钟、25-30分钟、30-45分钟、45-60分钟、60分钟-1.5小时、1.5小时-2小时、2小时-2.5小时、2.5小时-3小时、3小时-3.5小时、3.5小时-4小时、4小时-4.5小时、4.5小时-5小时。在一些实施方案中，预定的时间段可以为约2小时。例如，预定的时间段可以是实现氨氧化细菌的复活(例如，实现氨氧化细菌相对于该细菌在储存之前(例如，在生长状态下)的活力的活力，例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％活力)可能需要的时间。
2.氨氧化细菌(AOB)、亚硝化单胞菌菌株D23和类似细菌
自养型氨氧化细菌(在本文中可以被称为AOBs或AOB)是如以下文献所记录的专性自养菌：Alan B.Hooper和A.Krummel at al.Alan B.Hooper,Biochemical Basis ofObligate Autotrophy in Nitrosomonas europaea,Journal of Bacteriology,Feb1969,第776-779页；Antje Krummel等人，Effect of Organic Matter on Growth andCell Yield of Ammonia-Oxidizing Bacteria,Arch Microbiol(1982)133:50-54。这些细菌只从氨氧化为硝酸盐获得所有的代谢能量(一氧化氮(NO)作为其呼吸链中的中间产物)并且通过固定二氧化碳获得几乎所有的碳。它们不能利用除了一些简单分子外的其它碳源。
氨氧化细菌(AOB)广泛存在于环境中，并且在氨、氧和微量金属的存在下将固定二氧化碳和增殖。AOB可以缓慢生长，并且在AOB可以增殖并使氨减少至无毒水平之前，毒性水平的氨可能会杀死鱼类和其它生物体。AOB的缓慢生长还可能会延迟AOB在施用于皮肤时所产生的NO和亚硝酸盐的健康效益。
向鱼缸、皮肤或加工补充针对该目的而生长和储存的充足的活AOB是理想的。AOB不形成孢子，因此以高活力储存在干燥状态下是困难的，且储存在潮湿状态下使它们具有代谢活性。
已经研究了在废水处理用AOB的储存期间的硝化能力的衰减，例如(Munz G,Lubello C,Oleszkiewicz JA.Modeling the decay of ammonium oxidizingbacteria.Water Res.2011Jan；45(2):557-64.Oi:10.1016/j.watres.2010.09.022.)
Cassidy等人(U.S.5,314,542)讨论了亚硝化单胞菌的生长、长期储存和活性恢复，其中他们公开了生长亚硝化单胞菌，去除有毒废物，在适当盐度的无菌水中储存长达一年的时间段，且然后通过添加缓冲液(CaCO3)和200ppm铵复活，所述复活需要72小时。
作为专性自养生物，AOB经由使用能量固定CO2以及还原由氨氧化为亚硝酸盐所生成的等效物来合成蛋白质。生长需要氨、氧、矿物质和二氧化碳。
根据K.R.Terry和A.B.Hooper所著的“Polyphosphate and OrthophosphateContent of Nitrosomonas europaea as a Function of Growth”，Journal ofBacteriology，1970年7月，第199-206页，第103卷，第I期，亚硝化单胞菌可以以几种代谢状态存在。在本公开的某些实施方案中，所述氨氧化细菌可以是纯性的。氨氧化细菌的制剂(配制物或组合物)可以包含纯性氨氧化细菌、基本上由纯性氨氧化细菌组成或由纯性氨氧化细菌组成。氨氧化细菌可以来自选自由亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属和其组合所组成的组的属。
本公开尤其提供了亚硝化单胞菌菌株D23，一种独特的(例如，优化的)氨氧化细菌菌株，其可以增加一氧化氮和一氧化氮前体在受试者(例如，人类受试者)的表面上的产生。本公开还提供了使用所述细菌的方法和包含所述细菌的制品。
在实施方案中，所述亚硝化单胞菌是非天然存在的。例如，它可能已经在选择期间积累理想的突变。在其它实施方案中，理想的突变可以由实验者引入。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌可以是纯化的制剂，并且可以是优化的亚硝化单胞菌。
在优选的实施方案中，所述亚硝化单胞菌菌株是自养的且因此不会引起感染。优选的菌株利用尿素以及氨，所以汗水中的尿素在被所述细菌吸收和利用之前不需要水解。另外，为了在低pH下生长，所述细菌可以吸收NH4 +离子或尿素。选定的菌株还应该能够在受试者(例如，人类)的外部皮肤上生存并且耐受该处的条件。
尽管本公开详细地涉及亚硝化单胞菌菌株D23，但所述制剂、方法、组合物、治疗方法、可穿戴制品和服装制品可以与下列中的一个或多个一起使用：亚硝化单胞菌的一个或多个其它菌株、亚硝化单胞菌属的一个或多个其它种类以及一种或多种其它氨氧化细菌。自养型AOB是如以下文献所记录的专性自养菌：Alan B.Hooper和A.Krummel at al.AlanB.Hooper,Biochemical Basis of Obligate Autotrophy in Nitrosomonas europaea,Journal of Bacteriology,Feb 1969,第776-779页；Antje Krummel等人，Effect ofOrganic Matter on Growth and Cell Yield of Ammonia-Oxidizing Bacteria,ArchMicrobiol(1982)133:50-54。这些细菌只从氨氧化为硝酸盐获得所有的代谢能量(一氧化氮(NO)作为其呼吸链中的中间产物)并且通过固定二氧化碳获得几乎所有的碳。它们不能利用除了一些简单分子外的其它碳源。
在某些实施方案中，该亚硝化单胞菌是在2014年4月8日保藏于美国组织培养物保藏中心(ATCC)的菌株，其被命名为AOB D23-100(25个小瓶)，登录号为PTA-121157。
在某些实施方案中，该亚硝化单胞菌包含具有与SEQ ID NO:1(菌株D23全基因组序列)至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列的染色体。
在某些实施方案中，具有上述序列特征的细菌具有下列中的一个或多个：(1)由倍增时间测得的优化的生长速率；(2)由OD600测得的优化的生长速率；(3)优化的NH4 +氧化速率；(4)优化的NH4 +抗性；和(4)优化的NO2 -抗性。在以下段落中详细说明了这些特性的特定子组合。
在一些实施方案中，本文所描述的亚硝化单胞菌具有下列中的一个或多个：(1)由倍增时间测得的优化的生长速率；(2)由OD600测得的优化的生长速率；(3)优化的NH4 +氧化速率；(4)优化的NH4 +抗性；和(4)优化的NO2 -抗性。例如，该细菌可以具有在本段的开头所列出的特性(1)和(2)；(2)和(3)；(3)和(4)；或(4)和(5)。作为另一个实例，该细菌可以具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)和(3)；(1)、(2)和(4)；(1)、(2)和(5)；(1)、(3)和(4)；(1)、(3)和(5)；(1)、(4)和(5)；(2)、(3)和(4)；(2)、(3)和(5)；或(3)、(4)和(5)。作为进一步的实例，该细菌可以具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)、(3)和(4)；(1)、(2)、(3)和(5)；(1)、(2)、(4)和(5)；(1)、(3)、(4)和(5)；或(2)、(3)、(4)和(5)。在一些实施方案中，该细菌具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)、(3)、(4)和(5)。
本公开还提供了亚硝化单胞菌的纯性组合物，其具有下列中的一个或多个：(1)由倍增时间测得的优化的生长速率；(2)由OD600测得的优化的生长速率；(3)优化的NH4 +氧化速率；(4)优化的NH4 +抗性；和(4)优化的NO2 -抗性。例如，所述纯性亚硝化单胞菌组合物可以具有在本段的开头所列出的特性(1)和(2)；(2)和(3)；(3)和(4)；或(4)和(5)。作为另一个实例，纯性亚硝化单胞菌组合物可以具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)和(3)；(1)、(2)和(4)；(1)、(2)和(5)；(1)、(3)和(4)；(1)、(3)和(5)；(1)、(4)和(5)；(2)、(3)和(4)；(2)、(3)和(5)；或(3)、(4)和(5)。作为进一步的实例，纯性亚硝化单胞菌组合物可以具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)、(3)和(4)；(1)、(2)、(3)和(5)；(1)、(2)、(4)和(5)；(1)、(3)、(4)和(5)；或(2)、(3)、(4)和(5)。在一些实施方案中，纯性亚硝化单胞菌组合物具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)、(3)、(4)和(5)。
在2014年4月8日以25个小瓶的形式保藏于ATCC专利保藏所，被命名为AOB D23-100，且登录号为PTA-121157的亚硝化单胞菌菌株D23包含具有SEQ ID NO:1或其补体的环状基因组。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌菌株包含类似于SEQ ID NO:1或其补体的核酸序列，例如基因组。
例如，亚硝化单胞菌可以包含具有1,000个碱基对部分的核酸序列，该1,000个碱基对部分与SEQ ID NO:1或其补体的1,000个碱基对部分具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。该1,000个碱基对部分可以跨越例如核苷酸(n*1,000)+1至(n+1)*1,000，其中n＝0、1、2、3…2538，例如，核苷酸1-1,000、1,001-2,000等等，直到SEQ ID NO:1的末端。
在实施方案中，亚硝化单胞菌包含具有2,000个碱基对部分的核酸序列，该2,000个碱基对部分与SEQ ID NO:1或其补体的2,000个碱基对部分具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。该2,000个碱基对部分可以跨越例如核苷酸(n*2,000)+1至(n+1)*2,000，其中n＝0、1、2、3…1269，例如，核苷酸1-2,000、2,001-4,000等等，直到SEQ ID NO:1的末端。
在实施方案中，亚硝化单胞菌包含具有5,000个碱基对部分的核酸序列，该5,000个碱基对部分与SEQ ID NO:1或其补体的5,000个碱基对部分具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。该5,000个碱基对部分可以跨越例如核苷酸(n*5,000)+1至(n+1)*5,000，其中n＝0、1、2、3…508，例如，核苷酸1-5,000、5,001-10,000等等，直到SEQ ID NO:1的末端。
在实施方案中，亚硝化单胞菌包含具有10,000个碱基对部分的核酸序列，该10,000个碱基对部分与SEQ ID NO:1或其补体的10,000个碱基对部分具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。该10,000个碱基对部分可以跨越例如核苷酸(n*10,000)+1至(n+1)*10,000，其中n＝0、1、2、3…254，例如，核苷酸1-10,000、10,001-20,000等等，直到SEQ ID NO:1的末端。
在实施方案中，亚硝化单胞菌包含具有20,000个碱基对部分的核酸序列，该20,000个碱基对部分与SEQ ID NO:1或其补体的20,000个碱基对部分具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。该20,000个碱基对部分可以跨越例如核苷酸(n*20,000)+1至(n+1)*20,000，其中n＝0、1、2、3…127，例如，核苷酸1-20,000、20,001-40,000等等，直到SEQ ID NO:1的末端。
在实施方案中，亚硝化单胞菌包含具有50,000个碱基对部分的核酸序列，该50,000个碱基对部分与SEQ ID NO:1或其补体的50,000个碱基对部分具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。该50,000个碱基对部分可以跨越例如核苷酸(n*50,000)+1至(n+1)*50,000，其中n＝0、1、2、3…51，例如，核苷酸1-50,000、50,001-100,000等等，直到SEQ ID NO:1的末端。
在实施方案中，亚硝化单胞菌包含具有100,000个碱基对部分的核酸序列，该100,000个碱基对部分与SEQ ID NO:1或其补体的100,000个碱基对部分具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。该100,000个碱基对部分可以跨越例如核苷酸(n*100,000)+1至(n+1)*100,000，其中n＝0、1、2、3…26，例如，核苷酸1-100,000、100,001-20,000等等，直到SEQ ID NO:1的末端。
在一些方面，本公开提供了包含与SEQ ID NO:1至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的染色体的亚硝化单胞菌的组合物。在一些方面，本公开提供了包含与SEQ ID NO:1至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的染色体的亚硝化单胞菌的纯性组合物。
在某些实施方案中，亚硝化单胞菌菌株包含与SEQ ID NO:1或与D23菌株(在2014年4月8日以25个小瓶的形式保藏于ATCC专利保藏所，命名为AOB D23-100，登录号为PTA-121157)的基因组或其补体在本文所述的低严格度、中等严格度、高严格度或极高严格度或其它杂交条件下杂交的核酸序列，例如基因组。如本文中所使用，术语“在低严格度、中等严格度、高严格度或极高严格度条件下杂交”描述用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可以见于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中，这些文献通过引用并入。该参考文献中描述了水性方法和非水性方法，并且可以使用其中的任一种。本文所提及的具体杂交条件如下：1)低严格度杂交条件：在约45℃下的6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后在至少50℃下，在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤两次(在低严格度条件下，洗涤液的温度可以提高到55℃)；2)中等严格度杂交条件：在约45℃下的6X SSC中，随后在60℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严格度杂交条件：在约45℃下的6X SSC中，随后在65℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；4)极高严格度杂交条件为0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃下，随后在65℃下在0.2X SSC、1％SDS中洗涤一次或多次。除非另有说明，否则极高严格度条件(4)是合适的条件和应该使用的条件。
将菌株D23的基因组(SEQ ID NO:1)与亚硝化单胞菌C91的基因组进行比较。补充表1中示出了D23基因组的注释，其列出了通过序列分析所确定的SEQ ID NO:1中的2777个基因的位置。在某些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含在补充表1中列出的一个或多个基因或蛋白质，或类似于该基因或蛋白质中的一个的基因或蛋白质。
因此，在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含补充表1中的基因，或由该基因编码的蛋白质。在某些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与补充表1中的基因相似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的基因，或由该基因编码的蛋白质。在实施方案中，亚硝化单胞菌包含与补充表1中的至少2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000、2500个或所有基因相同或相似的基因或蛋白质，或由该基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)包含菌株C91中缺少的一个或多个基因或蛋白质，或类似于该基因或蛋白质中的一个的基因或蛋白质。这些基因的实例列于图6-8中并且更详细地描述于本文的实施例4中。
因此，就图6来说，在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与图6中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个或所有基因相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的基因。在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与由图6中列出的基因编码的1种、2种、3种、4种、5种、10种、15种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、110种、120种、130种、140种、150种、160种或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的蛋白质。
就图7来说，在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与图7中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个或所有基因相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的基因。在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与由图7中列出的基因编码的1种、2种、3种、4种、5种、10种、15种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、110种、120种、130种、140种、150种、160种或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的蛋白质。
就图8来说，在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与图8中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个或所有基因相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的基因。在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与由图8中列出的基因编码的1种、2种、3种、4种、5种、10种、15种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、110种、120种、130种、140种、150种、200种或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的蛋白质。
就图6-8总体来说，在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与图6-8中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、40个、60个、80个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个或所有基因相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的基因。在一些实施方案中，亚硝化单胞菌包含与由图6-8中列出的基因编码的1种、2种、3种、4种、5种、10种、20种、40种、60种、80种、100种、150种、200种、250种、300种、350种、400种、450种、500种或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的蛋白质。
在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)缺少菌株C91中所特有的一个或多个基因或蛋白质，或类似于该基因或蛋白质中的一个的基因或蛋白质。这些基因的实例列于图9中并且更详细地描述于本文的实施例4中。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌缺少图9中的至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、50个、100个、150个、200个、250个或所有基因。在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌缺少图9中的最多2个、3个、4个、5个、10个、20个、50个、100个、150个、200个、250个或所有基因。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌缺少图9中的约1-5个、5-10个、10-20个、20-50个、50-100个、100-150个、150-200个、200-250个或250个至所有基因。
D23基因组的测序揭示了可能受关注的几个基因，包括涉及氨代谢的基因(例如，氨单加氧酶、羟胺氧化还原酶、细胞色素c554和细胞色素cM552)。所有这些基因存在多个拷贝，并且这些拷贝一般彼此不同。一组受关注的基因是氨单加氧酶合成操纵子amoCAB(其存在两个拷贝)以及amoC的第三拷贝。该操纵子具有C91中的同源物，即Neut_2078/7/6和Neut_2319/8/7。另一组受关注的基因是羟胺氧化还原酶(hao)，其存在三个拷贝。C91中的hao同源物被命名为Neut_1672、1793和2335。第三组受关注的基因是由cycA编码的细胞色素c554基因，其存在三个拷贝。相应的C91基因被命名为Neut_1670、1791和2333。第四组受关注的基因是由cycB编码的细胞色素cM552基因，其存在两个拷贝。同源C91基因被命名为Neut_1790和2332。每组基因汇总于表1中并在下文中更详细地加以讨论。
表1.亚硝化单胞菌菌株D23中的氨代谢基因的序列
在一些方面，本文所述的亚硝化单胞菌包含与表1的基因和蛋白质相同或相似的基因。
更具体地说，在某些方面，本公开提供了亚硝化单胞菌的组合物，例如，包含与表1的氨单加氧酶序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的纯化制剂。在某些方面，本公开提供了包含与表1的羟胺氧化还原酶序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的细胞色素c554序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的细胞色素cM552序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的组合物。
在某些方面，本公开提供了包含与表1的氨单加氧酶序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％或99.6％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的羟胺氧化还原酶序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.4％、99.5％、99.6％或99.7％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的细胞色素c554序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.5％、99.6％或99.7％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的细胞色素cM552序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、97.1％、97.2％、97.5％、98％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、99％或99.5％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的组合物。
在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌存在于纯性组合物中，并且例如为优化的亚硝化单胞菌的纯化制剂形式。
更具体地说，在某些方面，本公开提供了包含与表1的氨单加氧酶序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、98.8％、98.9％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％或99.6％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的纯性组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的羟胺氧化还原酶序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的纯性组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的细胞色素c554序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的纯性组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的细胞色素cM552序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的组合物。
在某些方面，本公开提供了包含与表1的氨单加氧酶序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、98.8％、98.9％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％或99.6％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的纯性组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的羟胺氧化还原酶序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.4％、99.5％、99.6％或99.7％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的纯性组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的细胞色素c554序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.5％、99.6％或99.7％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的纯性组合物。在某些方面，本公开提供了包含与表1的细胞色素cM552序列至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、97.1％、97.2％、97.5％、98％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、99％或99.5％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的纯性组合物。
在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含含有与表1的菌株D23序列(例如，SEQID 4-33中的任一个)至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列的基因或蛋白质。替代可以是保守的或非保守的；另外，预期了插入和删除。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含含有表1的序列(例如，SEQ ID 4-33中的任一个)的基因或蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质具有最多约1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、25、50或100个氨基酸的N末端和/或C末端延伸或缺失。
表1的核酸序列的比对显示C91和D23中的同源物之间的百分比同一性。以下段落讨论该百分比同一性并且描述与表1的D23基因具有同源性的各种基因。
更具体地说，amoA1基因为约98.8％相同(即，在821/831个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23amoA1基因至少约98.8％、98.9％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
amoA2基因为约98.8％相同(即，在821/831个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23amoA2基因至少约98.8％、98.9％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
amoB1基因为约99.1％相同(即，在1255/1266个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23amoB1基因至少约99.1％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
amoB2基因为约99.1％相同(即，在1254/1266个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23amoB2基因至少约99.1％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
amoC1基因为约99.8％相同(即，在814/816个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23amoC1基因至少约99.8％、99.9％或100％相同的基因。
amoC2基因为约99.8％相同(即，在814/816个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23amoC2基因至少约99.8％、99.9％或100％相同的基因。
amoC3基因为约98.9％相同(即，在816/825个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23amoC3基因至少约98.9％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
hao1基因为约99.0％相同(即，在1696/1713个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23hao1基因至少约99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
hao2基因为约99.4％相同(即，在1702/1713个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23hao2基因至少约99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
hao3基因为约99.2％相同(即，在1700/1713个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23hao3基因至少约99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
cycA1基因为约98.0％相同(即，在694/708个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23cycA1基因至少约98.0％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
cycA2基因为约98.7％相同(即，在699/708个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23cycA2基因至少约98.7％、98.8％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
cycA3基因为约99.3％相同(即，在703/708个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23cycA3基因至少约99.3％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
cycB1基因为约96.7％相同(即，在696/720个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23cycB1基因至少约96.7％、96.8％、97.0％、97.2％、97.4％、97.6％、97.8％、98.0％、98.2％、98.4％、98.4％、98.6％、98.8％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
cycB2基因为约97.1％相同(即，在702/723个位置)。因此，在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含与D23cycB2基因至少约97.1％、97.2％、97.4％、97.6％、97.8％、98.0％、98.2％、98.4％、98.4％、98.6％、98.8％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的基因。
以下四个段落更详细地描述表1的基因和蛋白质。
氨单加氧酶是涉及氨氧化的酶，其催化反应 (Ensign等人，1993)。在亚硝化单胞菌菌株D23中，氨单加氧酶操纵子包含被命名为amoA、amoB和amoC的三个基因。菌株D23包含整个操纵子的两个拷贝和amoC的第三拷贝。上表1中列出了这些基因和相应的蛋白质。在某些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含表1(例如，表1的D23序列)中的1个或2个氨单加氧酶亚基A基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含表1(例如，表1的D23序列)中的1个或2个氨单加氧酶亚基B基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。在某些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含表1(例如，表1的D23序列)中的1个、2个或3个氨单加氧酶亚基C基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含至少一个或两个下列中的每一个：(a)表1(例如，表1的D23序列)中的氨单加氧酶亚基A基因和/或蛋白质；(b)表1(例如，表1的D23序列)中的氨单加氧酶亚基B基因和/或蛋白质；和(c)表1(例如，表1的D23序列)中的氨单加氧酶亚基C基因和/或蛋白质。例如，所述亚硝化单胞菌可以包含表1(例如，表1的D23序列)中的所有氨单加氧酶基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。甚至更具体地说，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的所有D23氨单加氧酶基因。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的所有D23氨单加氧酶蛋白质。羟胺氧化还原酶催化一般反应 它们通常使用heme作为辅因子。亚硝化单胞菌菌株D23包含三种羟胺氧化还原酶，它们被命名为hao1、hao2和hao3。上表1中列出了这些基因和相应的蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含表1(例如，表1的D23序列)中的1个、2个或3个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。例如，所述亚硝化单胞菌可以包含表1(例如，表1的D23序列)中的所有羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。甚至更具体地说，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的所有D23羟胺氧化还原酶基因。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的所有D23羟胺氧化还原酶蛋白质。
D23有氧异化作为唯一能量来源和还原剂的氨的能力需要两种专用的蛋白质复合体Amo和Hao以及细胞色素c554和cm552，其将电子传递至醌池。c554的NO还原酶活性在低氧浓度下的氨氧化过程中是重要的。亚硝化单胞菌菌株D23包含三个细胞色素c554基因，它们被命名为cycA1、cycA2和cycA3。上表1中列出了这些基因和相应的蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含表1(例如，表1的D23序列)中的1个、2个或3个细胞色素c554基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。例如，所述亚硝化单胞菌可以包含表1(例如，表1的D23序列)中的所有细胞色素c554基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。甚至更具体地说，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的所有D23细胞色素c554基因。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的所有D23细胞色素c554蛋白质。
D23有氧异化作为唯一能量来源和还原剂的氨的能力需要两种专用的蛋白质复合体Amo和Hao以及细胞色素c554和cm552，其将电子传递至醌池。细胞色素cm552利用源自Hao的电子还原醌。亚硝化单胞菌菌株D23包含两个细胞色素cM552基因，它们被命名为cycB1和cycB2。上表1中列出了这些基因和相应的蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含表1(例如，表1的D23序列)中的1个或2个细胞色素cM552基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。例如，所述亚硝化单胞菌可以包含表1(例如，表1的D23序列)中的两个细胞色素cM552基因和/或蛋白质，或与其类似的基因和/或蛋白质。甚至更具体地说，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的两个D23细胞色素cM552基因。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的两个D23细胞色素cM552蛋白质。
在一些实施方案中，本文所述的亚硝化单胞菌包含选自表1的基因和/或蛋白质的组合。该组合可以包含例如在前面四个段落中列出的基因和/或蛋白质。例如，所述组合可以包含来自表1内的两个类别的基因和/或蛋白质。因此，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如前面四个段落中所述的一个或多个氨单加氧酶基因和/或蛋白质以及一个或多个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如前面四个段落中所述的一个或多个氨单加氧酶基因和/或蛋白质以及一个或多个细胞色素c554基因和/或蛋白质。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如前面四个段落中所述的一个或多个氨单加氧酶基因和/或蛋白质以及一个或多个细胞色素cM552基因和/或蛋白质。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如前面四个段落中所述的一个或多个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质以及一个或多个细胞色素c554基因和/或蛋白质。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如前面四个段落中所述的一个或多个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质以及一个或多个细胞色素cM552基因和/或蛋白质。
所述组合还可以包含来自表1内的三个类别的基因和/或蛋白质。因此，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如上述四个段落中所述的一个或多个氨单加氧酶基因和/或蛋白质以及一个或多个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质和一个或多个细胞色素c554基因和/或蛋白质。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如上述四个段落中所述的一个或多个氨单加氧酶基因和/或蛋白质以及一个或多个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质和一个或多个细胞色素cM552基因和/或蛋白质。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如上述四个段落中所述的一个或多个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质以及一个或多个细胞色素c554基因和/或蛋白质和/或一个或多个细胞色素cM552基因和/或蛋白质。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如上述四个段落中所述的一个或多个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质以及一个或多个细胞色素c554基因和/或蛋白质和/或一个或多个细胞色素cM552基因和/或蛋白质。
所述组合可以包含来自表1内的所有四个类别的基因和/或蛋白质。因此，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表1中所述或如上述四个段落中所述的一个或多个氨单加氧酶基因和/或蛋白质以及一个或多个羟胺氧化还原酶基因和/或蛋白质和一个或多个细胞色素c554基因和/或蛋白质和/或一个或多个细胞色素cM552基因。
表2(下文)列出了表1的D23和C91蛋白质之间的序列差异。例如，AmoA1在C91中的位置1处具有M，而在D23中的位置1处具有V，并且这种差异在表2中被缩写为M1V。作为另一个实例，D23CycB1在C91蛋白质的残基194和195之间具有插入DDD，所以添加的残基为D23蛋白质的残基编号195、196和197，并且这种差异在表2中分别被缩写为195insD、196insD和197insD。形成表2的基础的序列比对示于图10-16中。
表2.亚硝化单胞菌菌株D23和C91之间的氨基酸序列差异
因此，本文所述的亚硝化单胞菌可以包含表2中所列的一个或多个序列特征。例如，所述亚硝化单胞菌可以包含表2中的至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个或所有序列特征。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表2中的至多2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个或所有序列特征。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表2中的1-5个、5-10个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个或所有序列特征。所述亚硝化单胞菌还可以包含所述蛋白质的片段。
关于各个类别的基因或蛋白质，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表2的第1部分(其描述氨单加氧酶)中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有序列特征。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表2的第1部分中的1-5个、3-7个、4-8个或5-10个序列特征。例如，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表2中所列的amoA基因或蛋白质的至少1个、2个或3个序列特征，和/或不超过这些特征中的2个或3个。所述亚硝化单胞菌还可以包含如表2中所列的amoB基因或蛋白质的至少1个或2个序列特征。另外，所述亚硝化单胞菌可以包含如表2中所列的amoC3基因的至少1个或2个序列特征。所述亚硝化单胞菌还可以包含所述蛋白质的片段。
关于hao基因和蛋白质，所述亚硝化单胞菌可以包含表2的第2部分(其描述羟胺氧化还原酶)中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或所有序列特征。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表2的第2部分中的1-4个、2-5个、3-6个或4-8个序列特征。所述亚硝化单胞菌还可以包含如表1中所列的Hao1的至少1个、2个或3个序列特征，和/或不超过这些特征中的2个或3个。所述亚硝化单胞菌还可以包含如表2中所列的Hao2或Hao3的至少1个或2个序列特征。所述亚硝化单胞菌还可以包含所述蛋白质的片段。
现在转向细胞色素c554，所述亚硝化单胞菌可以包含表2的第3部分(其描述细胞色素c554)中的至少1个、2个、3个、4个或所有序列特征。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表2的第3部分中的至多2个、3个、4个或所有序列特征。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含如表2中所列的细胞色素c554CycA1的至少1个或2个序列特征。所述亚硝化单胞菌还可以包含如表2中所列的c554CycA2或c554CycA3的至少1个序列特征。所述亚硝化单胞菌还可以包含所述蛋白质的片段。
关于cM552基因和蛋白质，所述亚硝化单胞菌可以包含表2的第4部分(其描述细胞色素cM552)中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有序列特征。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表2的第4部分中的至多2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有序列特征。例如，在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表2的第4部分中的1-5个、2-7个、3-8个或5-10个序列特征。在实施方案中，如表2中所列的cM552CycB1的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个序列特征，和/或不超过这些特征中的2个、3个、4个、5个、6个或7个。所述亚硝化单胞菌还可以包含如表2中所列的cM552CycB2的至少1个、2个或3个序列特征，和/或不超过这些特征中的2个或3个。所述亚硝化单胞菌还可以包含所述蛋白质的片段。
应当理解，涉及各种亚硝化单胞菌蛋白质的序列特征的上述段落还描述了编码这些蛋白质的核酸的序列。
本文所述的测序分析揭示菌株D23缺少质粒。因此，在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌缺少质粒，即，它的DNA全部包含在染色体中。在一些实施方案中，所述亚硝化单胞菌细菌缺少内源性质粒，但携带一个或多个转基因质粒。
该D23菌株不被认为是自然的产物，而是在实验室的长时间的培养和选择期间已经获得某些突变和特征。例如，D23具有在大于约200或250mM NH4 +的条件下生长超过24小时的能力。
在一些实施方案中，本文所公开的亚硝化单胞菌与天然存在的细菌的不同之处在于铁载体的丰度。例如，所述亚硝化单胞菌相比于亚硝化单胞菌C91可以具有升高或降低的铁载体水平。通常，铁载体是分泌的铁螯合化合物，其帮助细菌从其环境中清除铁。一些铁载体是肽，且其它是有机小分子。
AOB(例如，在本公开中预期的亚硝化单胞菌)可以包含相对于野生型亚硝化单胞菌和/或本文所公开的亚硝化单胞菌序列的突变。这些突变可以例如自然发生、由随机诱变引入或由定点诱变引入。例如，所述亚硝化单胞菌可以缺少野生型亚硝化单胞菌通常包含的一个或多个基因或调控DNA序列。所述亚硝化单胞菌还可以包含相对于测序菌株或野生型菌株的点突变、替代、插入、缺失和/或重排。所述亚硝化单胞菌可以是优化的亚硝化单胞菌的纯化制剂。
在某些实施方案中，所述亚硝化单胞菌是转基因的。例如，它可以包含野生型亚硝化单胞菌D23缺少的一个或多个基因或调控DNA序列。更具体地说，所述亚硝化单胞菌可以包含例如报告基因、选择标记、编码酶的基因或启动子(包括诱导型启动子或阻抑型启动子)。在一些实施方案中，额外的基因或调控DNA序列被整合到细菌染色体内；在一些实施方案中，额外的基因或调控DNA序列位于质粒(例如，与在亚硝化单胞菌N91中发现的质粒有关的质粒)上。
在一些优选的实施方案中，所述亚硝化单胞菌与天然存在的细菌的不同之处在于至少一种核苷酸。例如，所述亚硝化单胞菌与天然存在的细菌的不同之处可以在于作为相关途径(例如，氨代谢途径、尿素代谢途径或用于产生一氧化氮或一氧化氮前体的途径)的一部分的基因或蛋白质。更具体地说，所述亚硝化单胞菌可以包含提升所述途径的活性(例如，通过提高该途径的要素的水平或活性)的突变。
上述突变可以使用任何合适的技术来引入。用于将突变引入给定位置中的许多方法是已知的。例如，可以使用定点诱变、寡核苷酸定向诱变或位点特异性诱变。具体诱变方案的非限制性实例描述于例如Mutagenesis，13.1-13.105页(Sambrook和Russell编辑，Molecular Cloning A Laboratory Manual，第3卷，第3增补版，2001)中。此外，可从商业供应商得到的充分表征的诱变方案的非限制性实例包括但不限于：Altered Sites.RTM.II体外诱变系统(Promega Corp.,Madison,Wis.)；Erase-a-Base.RTM.系统(Promega,Madison,Wis.)；GeneTailor.TM.定点诱变系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,Calif.)；QuikChange.RTM.II定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,Calif.)；以及Transformer.TM.定点诱变试剂盒(BD-Clontech,Mountain View,Calif.)。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以包含一定浓度或量的氨氧化细菌以至少部分治疗病症或疾病。氨氧化细菌的制剂可以包含一定浓度或量的氨氧化细菌，以改变(例如，减少或增加)表面(例如，皮肤表面)上的细菌或细菌属的量、浓度或比例。所述细菌可以是非致病性的或致病性的，或潜在致病性的。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以包含约108至约1014CFU/L。所述制剂可以包含至少108,109、1010、1011、2x 1011、5x 1011、1012、2x 1012、5x 1012、1013、2x 1013、5x1013或1014；或约108-109、109-1010、1010-1011、1011-1012、1012-1013或1013-1014CFU/L。在某些方面，所述制剂可以包含约1x 109CFU/L至约10x 109CFU/L。在某些方面，所述制剂可以包含约1x 109CFU至约10x 109CFU。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以包含约0.1毫克(mg)至约1000mg氨氧化细菌。在某些方面，所述制剂可以包含约50mg至约1000mg氨氧化细菌。所述制剂可以包含约0.1-0.5mg、0.2-0.7mg、0.5-1.0mg、0.5-2mg、0.5-5mg、2.5-5mg、2.5-7.0mg、5.0-10mg、7.5-15mg、10-15mg、15-20mg、15-25mg、20-30mg、25-50mg、25-75mg、50-75mg、50-100mg、75-100mg、100-200mg、200-300mg、300-400mg、400-500mg、500-600mg、600-700mg、700-800mg、800-900mg、900-1000mg、100-250mg、250-500mg、100-500mg、500-750mg、750-1000mg或500-1000mg。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以包含在约0.1克/升至约1克/升的范围内的氨氧化细菌对赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂或美容上可接受的赋形剂)的质量比。所述制剂可以包含在约0.1-0.2、0.2-0.3、0.1-0.5、0.2-0.7、0.5-1.0或0.7-1.0克/升的范围内的氨氧化细菌对赋形剂的质量比。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以处于生长状态。生长状态可以通过使氨氧化细菌暴露于可以促进生长的环境来提供。生长状态可以是例如氨氧化细菌处于允许氨氧化细菌能够即时将铵离子(NH4 +)转化为亚硝酸盐(NO2 -)的环境中的状态。生长状态可以包括在具有大于约7.6的pH的环境中提供氨氧化细菌。生长状态还可以包括在如在以上部分1中所述的具有氨、铵盐和/或尿素、微量矿物质以及充足的氧和二氧化碳的环境中提供氨氧化细菌。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以处于多磷酸盐负载状态，其中所述状态或环境(例如介质，例如培养基，例如生长培养基)可以具有小于约的7.4的pH。氨、铵离子和尿素中的至少一种的水平可以在约10微摩尔浓度和200毫摩尔浓度之间。微量物质的水平可以在0.1微摩尔浓度的铁和20微摩尔浓度的铁之间。氧的水平可以在约5％和100％氧饱和度之间。二氧化碳的水平可以介于/小于约0和200ppm之间，且磷酸盐水平大于约10微摩尔浓度。多磷酸盐负载状态的目的是向AOB提供氨和氧，以使得可以产生ATP，但不向AOB提供二氧化碳和碳酸盐，以使得它们无法使用该ATP固定二氧化碳，而是使用该ATP来生成可以储存的多磷酸盐。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以处于储存状态。储存状态可以被定义为氨氧化细菌处于它们可以被储存至稍后恢复的环境中。储存状态可以是例如氨氧化细菌处于允许氨氧化细菌在复活后(例如，在放置于促进生长状态的环境中预定的时间段后)可用的环境中的状态。
储存状态可以包括在具有小于约7.4的pH的环境中提供氨氧化细菌。储存状态还可以包括在如在以上部分1中所述的具有氨、氨盐和/或尿素、微量矿物质、氧和低浓度二氧化碳的环境中提供氨氧化细菌。
储存还可以通过在4℃下储存最多几个月来完成。储存缓冲液在一些实施方案中可以包含50mM Na2HPO4-2mM MgCl2(pH 7.6)。
在一些实施方案中，氨氧化细菌可以低温保存。可以将1.25ml氨氧化细菌对数中期培养物添加到2ml的冻存管和0.75ml无菌的80％甘油中。管可以轻轻振荡，并在室温下培养15分钟，以允许细胞吸收冷冻保护剂。可以将所述管直接储存在-80℃冷冻器中用于冷冻和储存。
对于培养物的复苏，可以使冷冻原液在冰上解冻10到20分钟，然后在4℃下，在8000x g下离心3分钟。球团可以通过将它悬浮在2ml AOB培养基中进行洗涤，随后在4℃下，在8000x g下再离心3分钟，以降低冷冻保护剂的潜在毒性。可以使所述球团再悬浮于2mlAOB培养基中，接种到含50mM NH4 +的50ml AOB培养基中，并通过在200rpm下振荡，在30℃的黑暗环境中培养。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以包括在储存状态下的氨氧化细菌和/或在多磷酸盐负载状态下的氨氧化细菌和/或在生长状态下的氨氧化细菌。
不希望受理论的束缚，通过将氨氧化细菌保持在具有低二氧化碳以及足够的氧和氨的条件下或环境中，它们可以积累多磷酸盐达预定的时期，例如，约一个倍增时间的时期，例如约8-12小时，例如约10小时。氨氧化细菌可以积累足够的多磷酸盐以延长其储存活力、储存时间，并加快其复活。这可以在添加或不添加缓冲液和氨的情况下发生。
存在储存充足的多磷酸盐可以允许氨氧化细菌(ATP资源)在甚至不存在氨和氧的情况下维持代谢活性，并在原本将会致命的攻击下存活。
氨氧化产生ATP的过程具有两个步骤。第一步骤是通过氨单加氧酶(Amo)使氨氧化为羟胺，然后通过羟胺氧化还原酶(Hao)使羟胺转化为亚硝酸盐。来自第二步骤(羟胺转化为亚硝酸盐)的电子被用来驱动第一步骤(氨氧化为羟胺)。
如果氨氧化细菌不具有羟胺来生成用于Amo的电子，则羟胺不可用于Hao。例如，乙炔不可逆地抑制对于氨氧化为亚硝酸盐中的第一步骤(氨氧化为羟胺)而言关键的酶。一旦AOB暴露于乙炔，Amo即被不可逆地抑制，并且在可以产生羟胺之前必须合成新的酶。在正常的聚生体生物膜栖息地，AOB可以分享和接收来自其它AOB(甚至是对抑制剂具有不同易感性的不同菌株)的羟胺，因此生物膜趋于比单个生物体对抑制剂如乙炔更具抗性。AOB可以使用储存的多磷酸盐来合成新的Amo，即使在没有羟胺的情况下。
本文所讨论的氨氧化细菌的任何实施方案、制剂、组合物或配制物可以包含任选纯性的氨氧化细菌、基本上由任选纯性的氨氧化细菌组成或由任选纯性的氨氧化细菌组成。
3.生产亚硝化单胞菌的方法
培养各种亚硝化单胞菌属种类的方法是本领域中已知的。可以例如使用如下文的实施例2中所述的欧洲亚硝化单胞菌培养基来培养亚硝化单胞菌。可以例如使用在上文的表3或表4中所述的培养基来培养氨氧化细菌。
亚硝化单胞菌可以生长在例如液体培养基中或平板上。合适的平板包括1.2％R2A琼脂、1.2％琼脂、1.2％琼脂糖和含有0.3g/L丙酮酸盐的1.2％琼脂糖。
在一些实施方案中，在无有机物培养基中培养氨氧化细菌如亚硝化单胞菌。使用无有机物培养基的一个优点是除了由自养细菌产生的底物外它缺乏异养细菌进行代谢的底物。使用生长态培养物的另一个优点是大量的亚硝酸盐在培养基中积累，而该亚硝酸盐也抑制异养细菌且因此在储存期间作为防腐剂。
在一些实施方案中，氨氧化细菌如具有改善的(例如，优化的)性质的亚硝化单胞菌菌株是通过繁殖和选出所需性质的迭代过程而产生。在一些实施方案中，选择和繁殖同时进行。在一些实施方案中，在包含50mM、75mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM或300mM NH4 +(例如，至少200mM NH4 +)的反应介质(例如，完全欧洲亚硝化单胞菌培养基)中进行选择。在一些实施方案中，繁殖和/或选择的周期为至少1、2、3或6个月。在实施方案中，繁殖和/或选择的周期为至少1、2、4、6、8或10年。
在一些方面，所述氨氧化细菌如亚硝化单胞菌是以商业规模来生产。在一些实施方案中，商业规模是指具有至少10,000、20,000、30,000、50,000或100,000升(L)的培养基体积的液体培养方法。在一些实施方案中，在生物反应器中生产细菌。所述生物反应器可以使用例如绝缘热夹套、温度传感器以及加热或冷却元件将细菌维持在恒定温度例如约26℃-30℃下。所述生物反应器可以具有用于搅拌培养物以改善营养物如氨、尿素、氧、二氧化碳和各种矿物质的分布的装置。所述生物反应器还可以具有用于添加新培养基的进口管，以及用于收集细胞的出口管。所述生物反应器还可以具有用于将氧和/或二氧化碳分配至培养物中的曝气器。所述生物反应器可以是例如间歇式反应器、馈料分批反应器或连续反应器。在一些实施方案中，亚硝化单胞菌的商业规模生产以约1012CFU/升产生1,000至100,000L/天的批料和1,000至100,000。商业规模生产可以产生例如1,000-5,000L/天、5,000-10,000L/天、10,000-50,000L/天或50,000-100,000L/天的批料。商业规模生产可以产生例如1,000-5,000L/批、5,000-10,000L/批、10,000-50,000L/批或50,000-100,000L/批的批料。在一些实施方案中，生成物的浓度为至少1010、1011、2x 1011、5x 1011或1012CFU/L，或约1010-1011、1011-1012、1012-1013或1013-1014CFU/L。
在一些实施方案中，通常包括商业规模生产，进行质量控制(QC)测试步骤。QC的一般步骤通常包括：1)培养亚硝化单胞菌；2)对培养物或其等分试样执行测试步骤；以及3)从所述测试步骤获得值，并且任选地：4)将所获得的值与参考值或可接受值的范围进行比较，和5)如果所获得的值满足可接受的参考值或范围，则将培养物分类为可接受的，且如果所获得的值不满足可接受的参考值或范围，则将培养物分类为不可接受的。如果培养物被分类为可接受的，则可以例如允许培养物继续生长且/或可以收获培养物并将其加入商业产品中。如果培养物被分类为不可接受的，则可以例如安全地处置培养物或者可以补救缺陷。
测试步骤可以包括测量培养物的光密度(OD)。OD是在分光光度计中进行测量，并且提供区别于吸收或散射的光关于透射通过样品的光的量的信息。在一些实施方案中，可以测定OD600(例如，具有600nm波长的光的光密度)。这种测量通常指示培养基中的细胞的浓度，其中较高的光密度对应于较高的细胞密度。
测试步骤可以包括测量培养物的pH。亚硝化单胞菌培养物的pH指示氮氧化的速率，并且还可以指示培养物是否包含污染生物体。pH可以使用例如包括电极(如氢电极、醌氢醌电极、锑电极、玻璃电极)的pH感测装置、包括半导体的pH感测装置或颜色指示试剂(如pH试纸)来测量。
在某些实施方案中，生产氨氧化细菌如亚硝化单胞菌包括进行各种质量控制步骤。例如，可以测试其中生长有亚硝化单胞菌的培养基，以例如确定它是否具有适当的pH，它是否具有足够低的废产物水平，和/或它是否具有足够高的营养物水平。还可以测试污染生物体的存在。污染生物体通常为非氨氧化细菌(如亚硝化单胞菌)的生物体，例如选自微杆菌属、产碱菌科细菌、柄杆菌属、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkodelia multivorans)、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌的生物体。可以通过例如提取DNA、扩增该DNA并对保守基因如16S rRNA进行测序来测试污染物。还可以通过将培养物接种在琼脂平板上并观察菌落形态来测试污染物。亚硝化单胞菌通常形成红色菌落，所以非红色菌落往往指示污染生物体。
4.包含氨氧化细菌的组合物；包含亚硝化单胞菌的组合物
本公开尤其提供了包含氨氧化细菌的组合物，例如，氨氧化细菌的制剂或氨氧化细菌的纯化制剂，例如，天然产品或强化的天然产品。可以在美容产品或治疗产品中提供包含氨氧化细菌的组合物，例如，氨氧化细菌的制剂或氨氧化细菌的纯化制剂。所述制剂可以包含尤其是氨、铵盐和尿素中的至少一种。
本公开尤其提供了包含亚硝化单胞菌的组合物，例如优化的亚硝化单胞菌的纯化制剂。在一些实施方案中，所述组合物中的亚硝化单胞菌具有选自优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性的至少一种特性。
在一些方面，本公开提供了具有限定数量的物种的组合物。例如，本公开提供具有亚硝化单胞菌和另一种类型的生物体且没有其它类型的生物体的组合物。在其它实例中，所述组合物具有亚硝化单胞菌和2、3、4、5、6、7、8、9或10种其它类型的生物体，并且不含其它类型的生物体。该组合物中的其它类型的生物体可以是例如细菌，如氨氧化细菌。适用于此目的的氨氧化细菌包括亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属或亚硝化弧菌属中的氨氧化细菌。
在一些实施方案中，包含亚硝化单胞菌的组合物提供支持亚硝化单胞菌活力的条件。例如，所述组合物可以促进亚硝化单胞菌生长和代谢，或者可以促进休眠状态(例如，冷冻)，活的亚硝化单胞菌可以从所述休眠状态恢复。当所述组合物促进生长或代谢时，其可以包含水和/或亚硝化单胞菌消耗的营养物，例如铵、氨、尿素、氧、二氧化碳或微量矿物质。在一些实施方案中，包含氨氧化细菌的组合物提供支持氨氧化细菌活力的条件。例如，所述组合物可以促进氨氧化细菌生长和代谢，或者可以促进本文所述的休眠状态(例如，冷冻)或储存状态，活的氨氧化细菌可以从所述休眠状态和储存状态恢复。当所述组合物促进生长或代谢时，其可以包含水和/或氨氧化细菌消耗的营养物，例如铵离子、氨、尿素、氧、二氧化碳或微量矿物质。
在一些实施方案中，在氨氧化细菌的制剂中可以包括除了氨氧化细菌以外的一种或多种其它生物体。例如，可以在氨氧化细菌的制剂中提供选自由乳酸杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属及其组合所组成的组的属的生物体。在一些实施方案中，所述制剂可以大体上不含其它生物体。
氨氧化细菌的制剂可以包含约108CFU/L至约1014CFU/L。所述制剂可以包含至少108、109、1010、1011、2x 1011、5x 1011、1012、2x 1012、5x 1012、1013、2x 1013、5x 1013或1014；或约108-109、109-1010、1010-1011、1011-1012、1012-1013或1013-1014CFU/L。
在一些实施方案中，所述制剂可以包含至少108、109、1010、1011、2x 1011、5x 1011、1012、2x 1012、5x 1012、1013、2x 1013、5x 1013或1014；或约108-109、109-1010、1010-1011、1011-1012、1012-1013或1013-1014CFU/ml。
在一些实施方案中，所述制剂可以包含约1x 109CFU/L至约10x 109CFU/L。在一些实施方案中，所述制剂可以包含约3x 1010CFU，例如3x 1010CFU/天。在一些实施方案中，所述制剂可以包含约1x 109至约10x 109CFU，例如约1x 109至约10x 109CFU/天。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以包含约0.1毫克(mg)至约1000mg氨氧化细菌。在某些方面，所述制剂可以包含约50mg至约1000mg氨氧化细菌。所述制剂可以包含约0.1-0.5mg、0.2-0.7mg、0.5-1.0mg、0.5-2mg、0.5-5mg、2.5-5mg、2.5-7.0mg、5.0-10mg、7.5-15mg、10-15mg、15-20mg、15-25mg、20-30mg、25-50mg、25-75mg、50-75mg、50-100mg、75-100mg、100-200mg、200-300mg、300-400mg、400-500mg、500-600mg、600-700mg、700-800mg、800-900mg、900-1000mg、100-250mg、250-500mg、100-500mg、500-750mg、750-1000mg或500-1000mg。
在一些实施方案中，氨氧化细菌的制剂可以包含在约0.1克/升至约1克/升的范围内的氨氧化细菌对赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂或美容上可接受的赋形剂)的质量比。所述制剂可以包含在约0.1-0.2、0.2-0.3、0.1-0.5、0.2-0.7、0.5-1.0或0.7-1.0克/升的范围内的氨氧化细菌对赋形剂的质量比。
有利地，配制物可以具有促进AOB(例如，亚硝化单胞菌)活力(例如，代谢活性)的pH。尿素将水解为氨并且将使pH提高到7至8。AOB在该pH范围下极具活性并且将使pH降低至约6，在此pH下NH3转化为铵并且不可利用。较低的pH水平(例如，约pH4)也是可接受的。氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)可以与一种或多种药学上或美容上可接受的赋形剂组合。在一些实施方案中，“药学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或封装材料。在一些实施方案中，每种赋形剂从与药物制剂的其它成分相容的意义上说是“药学上可接受的”，并且适用于接触人类和动物的组织或器官，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或与合理的效益/风险比相称的其它问题或并发症。参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,Pa.,2005；Handbook of PharmaceuticalExcipients，第6版；Rowe等人编辑；The Pharmaceutical Press and the AmericanPharmaceutical Association:2009；Handbook of Pharmaceutical Additives，第3版；Ash和Ash编辑；Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation andFormulation，第2版；Gibson编辑；CRC Press LLC:Boca Raton,Fla.,2009。
在一些实施方案中，美容上可接受的赋形剂是指美容上可接受的物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或封装材料。在一些实施方案中，每种赋形剂从与美容制剂的其它成分相容的意义上说是美容上可接受的，并且适用于接触人类和动物的组织或器官，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或与合理的效益/风险比相称的其它问题或并发症。
虽然活性成分(例如，氨氧化细菌，例如亚硝化单胞菌)可以单独施用，但在许多实施方案中，其存在于药物制剂或组合物中。因此，本公开提供一种药物制剂，其包含氨氧化细菌例如亚硝化单胞菌，以及药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以采用如下所述的药物制剂的形式。
本文所述的药物制剂包括那些适用于口服、肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内和关节内)、吸入(包括可以通过各种类型的定量加压气雾剂、喷雾器或吹入器产生的细颗粒粉剂或细雾，并且包括经鼻内或经肺)、直肠和局部(包括皮肤、经皮、经粘膜、口腔、舌下和眼内)施用的药物制剂，但最合适的途径可以取决于例如接受者的病状和病症。
所述制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域中已知的任何方法来制备。通常，方法包括使活性成分(例如，氨氧化细菌，例如亚硝化单胞菌)与组成一种或多种辅助成分的药物载体缔合的步骤。通常，所述制剂是通过使活性成分与液体载体或微细固体载体或两者均匀和紧密地缔合且然后在必要时使产品成型为所需制剂来制备。
制剂可以呈现为离散单位如胶囊剂、扁囊剂或片剂，每个单位包含预定量的例如亚硝化单胞菌；呈现为散剂或颗粒剂；呈现为在水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或呈现为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以呈现为大丸剂、药糖剂或糊剂。各种药学上可接受的载体和它们的制剂描述于标准配制论文例如E.W.Martin所著的Remington's Pharmaceutical Sciences中。还参见Wang,Y.J.and Hanson,M.A.,Journalof Parenteral Science and Technology,Technical Report No.10,Supp.42:2S,1988。
所述氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)组合物可以例如以适于立即释放或长期释放的形式来施用。合适的缓释系统的实例包括合适的聚合物材料，例如呈成形制品的形式(例如，薄膜或微胶囊)的半渗透性聚合物基质；合适的疏水性材料，例如作为在可接受的油中的乳剂；或离子交换树脂。缓释系统的施用方式可以为：口服；经直肠；肠胃外；脑池内；阴道内；腹膜内；局部，例如作为粉末、软膏、凝胶、滴剂或透皮贴剂；口腔；或作为喷雾剂。
可以适当地配制用于施用的制剂以提供氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)的控制释放。例如，药物组合物可以为包含生物可降解聚合物、多糖胶凝和/或生物粘附聚合物或两亲性聚合物中的一个或多个的颗粒的形式。这些组合物表现出允许活性物质的控制释放的某些生物相容性特征。参见美国专利第5,700,486号。
示例性组合物包括混悬液，其可以含有例如用于赋予体积的微晶纤维素、藻酸或作为悬浮剂的藻酸钠、作为增粘剂的甲基纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其它赋形剂、粘合剂、增量剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂、甘露醇、乳糖蔗糖和/或环糊精。此类制剂中还可以包括高分子量赋形剂如纤维素(微晶纤维素(avicel))或聚乙二醇(PEG)。此类制剂还可以包括用于辅助粘膜粘附的赋形剂，如羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酸酐共聚物(例如，Gantrez)，以及用于控制释放的试剂如聚丙烯酸类共聚物(例如，Carbopol 934)。还可以添加润滑剂、助流剂、香料、着色剂和稳定剂以便于制造和使用。表面活性剂可以是两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂或阴离子型表面活性剂。
可以用于本公开的实施方案的赋形剂如表面活性剂可以包括下列中的一个或多个：椰油酰胺丙基甜菜碱(ColaTeric COAB)、聚山梨醇酯(例如，Tween 80)、乙氧基化月桂醇(RhodaSurf 6NAT)、月桂基醚硫酸钠/月桂基葡糖苷/椰油酰胺丙基甜菜碱(Plantapon611L UP)、月桂基醚硫酸钠(例如，RhodaPex ESB 70NAT)、烷基聚葡糖苷(例如，Plantaren2000N UP)、月桂基醚硫酸钠(Plantaren 200)、布朗纳博士的卡斯蒂利亚肥皂、布朗纳博士的婴儿肥皂、月桂胺氧化物(ColaLux Lo)、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚磺酸酯烷基聚葡糖苷(PolySufanate 160P)、月桂基硫酸钠(Stepanol-WA Extra K)及其组合。布朗纳博士的卡斯蒂利亚肥皂和布朗纳博士的婴儿肥皂包含水、有机椰子油、氢氧化钾、有机橄榄油、有机fair deal麻油、有机荷荷巴油、柠檬酸和生育酚。
在一些实施方案中，表面活性剂可以以允许亚硝酸盐产生发生的量与氨氧化细菌一起使用。在一些实施方案中，所述制剂可以具有少于约0.0001％至约10％的表面活性剂。在一些实施方案中，所述制剂可以具有约0.1％至约10％的表面活性剂。在一些实施方案中，所用的表面活性剂的浓度可以在约0.0001％至约10％之间。在一些实施方案中，所述制剂可以大体上不含表面活性剂。
在一些实施方案中，配制物例如制剂可以包括可增强氨氧化细菌的效力或增强治疗或指示的其它组分。
在一些实施方案中，制剂中可以包括螯合剂。螯合剂可以是可以与另一种化合物(例如，金属)结合的化合物。螯合剂可以帮助从环境中去除不想要的化合物，或可以以保护方式起到减少或消除特定化合物与环境(例如，氨氧化细菌，例如氨氧化细菌的制剂，例如赋形剂)的接触的作用。在一些实施方案中，所述制剂可以大体上不含螯合剂。
制剂还可以包含抗氧化剂、缓冲剂、防止非所需细菌的生长的制菌剂、溶质以及可以包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬液。所述制剂可以呈现在单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿和小瓶)中，并且可以储存在仅需要在使用前立即加入无菌液体载体(例如，盐水或注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下。临时性溶液和混悬液可以由先前所描述的种类的粉末、颗粒和片剂制备。示例性组合物包括溶液或混悬液，其可以含有例如合适的无毒的药学上可接受的稀释剂或溶剂，如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液，或其它合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂，包括合成的单甘油酯或二甘油酯，以及脂肪酸，包括油酸或Cremaphor。水性载体可以是例如在约3.0至约8.0的pH、约3.5至约7.4(例如3.5至6.0，例如3.5至约5.0)的pH下的等渗缓冲溶液。有用的缓冲剂包括柠檬酸钠-柠檬酸和磷酸钠-磷酸，以及乙酸钠/乙酸缓冲剂。在一些实施方案中，组合物不包括氧化剂。
可以包括的赋形剂是例如蛋白质，如人血清白蛋白或血浆制剂。必要时，药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇酐单月桂酸酯。在一些实施方案中，赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂或美容上可接受的赋形剂)可以包括抗粘附剂、粘合剂、涂层剂、崩解剂、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、吸附剂、防腐剂或甜味剂。在一些实施方案中，所述制剂可以大体上不含赋形剂。
在一些实施方案中，所述制剂可以大体上不含本公开中所列的化合物或物质中的一种或多种。
用于气雾剂施用的示例性组合物包括盐水溶液，其可以含有例如苄醇或其它合适的防腐剂、用于提高生物利用度的吸收促进剂和/或其它增溶剂或分散剂。方便的是，在用于气雾剂施用的组合物中，氨氧化细菌例如亚硝化单胞菌是以从加压包装或喷雾器的气雾剂喷雾表现的形式，使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)来递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。可以将由例如明胶制成的胶囊和药盒配制成包含亚硝化单胞菌和合适的粉末基质(例如，乳糖或淀粉)的粉末混合物。在某些实施方案中，亚硝化单胞菌是作为气雾剂，通过气雾剂适配器(又称致动器)从定量阀施用。任选地，还包括稳定剂，且/或包括用于深肺递送的多孔颗粒(例如，参见美国专利第6,447,743号)
制剂可以与载体如可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇一起呈现。此类载体在常温下通常为固体，但在体温下液化和/或溶解以释放氨氧化细菌，例如亚硝化单胞菌。
用于局部施用的示例性组合物包括局部载体如Plastibase(与聚乙烯一起胶化的矿物油)。在一些方面，所述组合物和/或赋形剂可以是液体、固体或凝胶中的一个或多个的形式。例如，液体混悬剂可以包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水或氨氧化储存缓冲液。凝胶制剂可以包括但不限于琼脂、二氧化硅、聚丙烯酸(例如)、羧甲基纤维素、淀粉、瓜耳胶、藻酸盐或壳聚糖。在一些实施方案中，制剂可以补充有氨源，包括但不限于氯化铵或硫酸铵。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)组合物被配制来提高NO渗透到皮肤中。凝胶形成材料如KY胶或各种发胶将形成NO损失到环境空气中的扩散障碍，从而提高NO的皮肤吸收。皮肤中的NO水平一般不会大大超过20nM/L，因为该水平激活GC并且将会引起局部血管舒张和过量NO的氧化破坏。
应当理解的是，除了上文特别提到的成分，如本文所述的制剂可以包括在涉及所讨论的制剂类型的领域中常用的其它试剂。
所述配制物(例如，制剂，例如组合物)可以提供在容器、递送系统或递送装置中，所述容器、递送系统或递送装置具有包括或不包括容器的内容物可以小于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000克的重量。
合适的单位剂量制剂是含有如前文所述的有效剂量或其适当分数的氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)的那些单位剂量制剂。
治疗有效量的氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)可以作为单脉冲剂量、作为单次剂量或作为随时间施用的脉冲剂量来施用。因此，在脉冲剂量中，提供氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)的推注施用，在随后的时间段中将氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)施用给受试者，接着进行第二推注施用。在具体的非限制性实例中，在一天期间、在一周期间或在一个月期间施用脉冲剂量。
在一些实施方案中，可以施用氨氧化细菌的制剂(例如，配制物，例如组合物)预定的天数。这可以至少部分基于例如病症或疾病的严重程度、治疗反应、施用剂量和给药频率。例如，可以施用所述制剂约1-3天、3-5天、5-7天、7-9天、5-10天、10-14天、12-18天、12-21天、21-28天、28-35天、35-42天、42-49天、49-56天、46-63天、63-70天、70-77天、77-84天、84-91天，例如约1个月、约2个月、约3个月。在一些实施方案中，施用氨氧化细菌无限期的时间，例如，大于一年、大于5年、大于10年、大于15年、大于30年、大于50年、大于75年。在某些方面，可以施用制剂约16天。
在一些实施方案中，可以每天施用氨氧化细菌的制剂(例如，配制物，例如组合物)预定的次数。这可以至少部分基于例如病症或疾病的严重程度、治疗反应、施用剂量和给药频率。例如，可以每天施用所述制剂1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24次。
在一些实施方案中，所述制剂可以每天施用一次。在其它实施方案中，所述制剂可以每天施用两次。在一些实施方案中，可以在某几天施用第一预定量的所述制剂，且在随后的某几天施用第二预定量的所述制剂。在一些实施方案中，可以施用所述制剂约16天。
消费产品
氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)可以与多种消费产品相关，且此类产品的实例如下所述。在一些实施方案中，将与产品相关的氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与所述产品混合，例如均匀地散布在整个产品中，并且在一些实施方案中，与产品相关的氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)层叠在所述产品上。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与粉末相关。粉末通常是小颗粒固体，它们彼此不粘附并且在倾斜时可以自由流动。消费用途的示例性粉末包括滑石粉和一些化妆品(例如，粉底霜)。
在一些实施方案中，氨氧化细菌与化妆品相关。化妆品可以是旨在改变个人的外观的供局部施用的物质，例如，粉底液、粉底霜、腮红或唇膏。化妆品可以是在食品和药物管理法规中例如根据21C.F.R.§720.4所列举的任何物质。
化妆品可以是下列中的至少一种：婴儿产品，例如，婴儿洗发剂、婴儿润肤露、婴儿油、婴儿粉、婴儿霜；浴用制剂，例如，沐浴油、片剂、浴盐、泡泡浴、浴胶囊；眼妆制剂，例如，眉笔、眼线、眼影、洗眼液、眼部卸妆液、睫毛膏；香料制剂，例如，古龙香水、化妆水、香水、粉末(粉尘和滑石)、香囊；发用制剂，例如，护发素、发胶、直发膏、烫发水、冲洗液、洗发剂、滋补品、敷料、毛发梳理助剂、卷发液；毛发着色制剂，例如，染发剂和颜色、毛发着色剂、染发漂洗剂、染发洗发剂、头发美白用颜色、头发漂白剂；化妆制剂，例如，粉饼、粉底、腿部和身体涂料、唇膏、妆前底霜、胭脂、化妆固定剂；美甲制剂，例如，底漆和底漆、角质层软化剂、指甲霜和指甲乳液、指甲扩展、指甲油、指甲油去除剂；口腔卫生产品，例如，牙粉、漱口水和口气清新剂；浴用香皂和清洁剂、除臭剂、冲洗液、女性卫生除臭剂；剃须制剂，例如，剃须后润肤液、胡须软化剂、滑石粉、剃须前洗剂、剃须膏、剃须皂；护肤制剂，例如，清洗、脱毛、面部及颈部、身体和手部、足部粉末和喷雾、保湿、夜用制剂、粘贴面罩、皮肤清新剂；以及晒黑制剂，例如，凝胶、乳膏和液体和室内晒黑制剂。
在一些实施方案中，本文所述的配制物、组合物或制剂可以包含下列中的至少一种，作为下列中的至少一种提供，或布置在下列中的至少一种中：婴儿产品，例如，婴儿洗发剂、婴儿润肤露、婴儿油、婴儿粉、婴儿霜；浴用制剂，例如，沐浴油、片剂、浴盐、泡泡浴、浴胶囊；粉末(粉尘和滑石)、香囊；发用制剂，例如，护发素、冲洗液、洗发剂、滋补品；粉饼、角质层软化剂、指甲霜和指甲乳液、口腔卫生产品、漱口水、浴用香皂、冲洗液、女性卫生除臭剂；剃须制剂，例如，剃须后润肤液；护肤制剂，例如，清洗、面部及颈部、身体和手部、足部粉末和喷雾、保湿、夜用制剂、粘贴面罩、皮肤清新剂；以及晒黑制剂，例如，凝胶、乳膏和液体。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与化妆品相关。化妆品可以是旨在改变个人的外观的供局部施用的物质，例如，粉底液、粉底霜、腮红或唇膏。可以向这些化妆品制剂中添加由化妆品制剂领域的技术人员选择的其它组分，诸如(例如)水、矿物油、着色剂、香料、芦荟、甘油、氯化钠、碳酸氢钠、pH缓冲剂、防紫外线剂、硅油、天然油、维生素E、草药浓缩物、乳酸、柠檬酸、滑石、粘土、碳酸钙、碳酸镁、氧化锌、淀粉、尿素和异抗坏血酸，或本领域技术人员已知的任何其它赋形剂(包括本文中所公开的那些)。
在一些实施方案中，所述制剂可以布置在粉末、化妆品、乳霜、棒状物、气雾剂、药膏、擦拭物或绷带中，或作为这些来提供。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与乳霜相关。乳霜可以是包含增稠剂的流体，且一般具有允许其均匀涂敷在皮肤上的稠度。示例性乳霜包括保湿乳液、面霜和润肤霜。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与棒状物相关。棒状物通常是当放置成与表面接触时将棒状物内容物的一些转到到表面的固体。示例性棒状物包括除臭棒、唇膏、棒状润唇膏和防晒霜涂抹棒。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与气雾剂相关。气雾剂通常是微细固体颗粒或微细液滴在气体如空气中的胶体。气雾剂可以通过将亚硝化单胞菌(和任选的载体)放置在处于压力下的容器中且然后打开阀门以释放内容物来产生。所述容器可以被设计为仅施加与亚硝化单胞菌活力相容的压力水平。例如，仅可以短时间施加高压力，且/或压力可以足够低而不损害活力。气雾剂的消费用途的实例包括用于防晒霜、脱臭剂、香料、发胶和驱虫剂。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与药膏相关。药膏可以是具有液体或奶油样稠度的局部施用剂，其旨在保护皮肤或促进愈合。药膏的实例包括烧伤膏和润肤液。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与擦拭物相关。擦拭物可以是适于将液体或乳霜局部施用至皮肤上的柔性材料。擦拭物可以是例如纸基或布基的。示例性擦拭物包括纸巾和湿巾。
包含氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)的组合物还可以包含保湿剂、脱臭剂、香味剂、着色剂、驱虫剂、清洁剂或防紫外线剂中的一种或多种。
例如，保湿剂可以是减少或防止皮肤干燥的试剂。示例性的保湿剂包括润湿剂(例如，尿素、甘油、α-羟基酸和聚二甲基硅氧烷)和润肤剂(例如，羊毛脂、矿物油和矿脂)。保湿剂可以包括在例如含有氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)的乳霜、香脂、洗剂或防晒霜中。
脱臭剂可以是减少非所需的气味的试剂。脱臭剂可以通过直接中和气味、防止排汗或防止产生气味的细菌的生长来起作用。示例性的脱臭剂包括铝盐(例如，氯化铝或羟基氯化铝)、环甲硅油、滑石、小苏打、香精油、矿物盐、啤酒花和金缕梅。脱臭剂通常存在于除臭喷雾或除臭棒中，并且还可以发现于一些皂类和服装中。
驱虫剂可以是能够被施加至表面(例如，皮肤)以阻止昆虫和其它节肢动物停落在该表面上的试剂。驱虫剂包括DEET(N,N-二乙基-间-甲苯甲酰胺)、对-薄荷烷-3,8-二醇(PMD)、埃卡瑞丁(icaridin)、荆芥内酯(nepetalactone)、香茅油、印楝油、沼泽番石榴、肼基甲酸酯二甲酯、三环癸烯基烯丙醚和IR3535(3-[N-丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸乙酯)。
清洁剂可以是从表面如皮肤去除污物或非所需的细菌的试剂。示例性清洁剂包括条皂、液体皂和洗发剂。
防紫外线剂可以是能够被施加到表面上以减少表面的紫外光接收量的试剂。防紫外线剂可以阻挡UV-A和/或UV-B光线。防紫外线剂可以通过吸收、反射或散射紫外线而起作用。示例性防紫外线剂包括吸收剂，例如，胡莫柳酯(homosalate)、奥替柳酯(octisalate)(又称水杨酸辛酯)、奥西诺酯(octinoxate)(又称甲氧基肉桂酸辛酯或OMC)、奥克立林(octocrylene)、羟苯甲酮和阿伏苯宗(avobenzone)；以及反射剂(例如，二氧化钛和氧化锌)。防紫外线剂通常存在于防晒霜中，并且还可以发现于护肤霜和一些化妆品中。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与护发素相关。护发素一般是指可以施用于毛发以改善其外观、强度或顺滑性的具有奶油样稠度的物质。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与布料相关。布料一般是指适用于制成服装的柔性材料，例如，其具有足够的材料强度来承受穿着者的日常运动。布料可以是纤维的、织造的或针织的；它可以由天然存在的材料或合成材料制成。示例性布料包括棉、亚麻、羊毛、苎麻、丝、牛仔布、皮革、尼龙、聚酯和氨纶及其共混物。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与纱相关。纱通常是指适合于针织或编织的细长柔性纺成材料。纱可以由例如羊毛、棉、聚酯和其共混物组成。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与线相关。线通常是指适合于缝纫的细长柔性纺成材料。线通常具有比纱更细的直径。线可以由例如棉、聚酯、尼龙、丝及其共混物制成。
还可以用氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)处理服装制品，如(例如)鞋类、鞋垫、睡衣、运动鞋、皮带、帽子、衬衫、内衣、运动服装、头盔、毛巾、手套、袜子、绷带等。还可以用氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)处理床上用品，包括床单、枕头、枕套和毛毯。在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)还可以接触在一段时间内不能清洗的皮肤区域。例如，封闭在矫形铸件(其在愈合过程中固定受伤肢体)中的皮肤，以及为了适当愈合而必须保持干燥的接近受伤处的区域(如缝合伤口)可以受益于与氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)的接触。
在一些方面，本公开提供了一种可穿戴制品，其包含如本文所述的亚硝化单胞菌菌株。可穿戴制品可以是能够与使用者的身体密切相连而不妨碍行走的轻质制品。可穿戴制品的实例包括手表、腕带、头带、头筋、发网、浴帽、帽子、假发和珠宝。包含氨氧化细菌(例如，本文所述的亚硝化单胞菌菌株)的可穿戴制品可以例如在提供下列中的一个或多个的浓度下提供：治疗或预防皮肤病症、治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病或病状、治疗或预防体臭、用于向受试者供应一氧化氮的治疗或用于抑制微生物生长的治疗。
在一些实施方案中，氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)与旨在接触毛发的产品(例如，刷子、梳子、洗发剂、护发素、头带、头筋、发网、浴帽、帽子和假发)相关。在头发上形成的远离皮肤表面的一氧化氮可以被捕获在帽子、头巾或面罩内并引导至吸入的空气中。
接触人类受试者的表面的制品如尿布可以与氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)相关。因为尿布被设计成保持和容纳由失禁个体产生的尿液和粪便，尿液和粪便中的尿素可以被皮肤和粪便细菌水解而形成游离氨，所述游离氨具有刺激性且可能导致尿布疹。掺入将尿素代谢成亚硝酸盐或硝酸盐的细菌(如氨氧化细菌，例如，亚硝化单胞菌)可以避免游离氨的释放，并且可以释放亚硝酸盐和最终NO，它们可以有助于维持儿童和失禁成年人的健康皮肤。一氧化氮在尿布中的释放还可以对存在于人类粪便中的致病生物体具有抗微生物作用。这种作用即使在一次性尿布被作为废物处置后仍可以持续，并且可以通过接触弄脏的一次性尿布而减少疾病传播的发生。
在一些实施方案中，将包含氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)的产品包装。包装可以用于压缩产品或保护其免受损坏、污垢或降解。包装可以包括例如塑料、纸、纸板或木材。在一些实施方案中，包装是不透细菌的。在一些实施方案中，包装可渗透氧气和/或二氧化碳。
5.使用亚硝化单胞菌的治疗方法
本公开提供了使用氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)来治疗疾病和病症的各种方法。可以用于治疗疾病和病症的氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)包括所有氨氧化细菌，例如本公开中所描述的亚硝化单胞菌组合物，例如优化的氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌，例如在上文的第2部分中的亚硝化单胞菌，例如菌株D23)的纯化制剂。
例如，本公开提供了包含与SEQ ID NO:1至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的任选纯性的组合物以及包含与表1的菌株D23核酸中的任一个至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的亚硝化单胞菌的任选纯性的组合物用于治疗病症或疾病(例如，抑制受试者皮肤上的微生物生长)的用途。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或所有菌株D23核酸。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含图6-8的一个或多个核酸。作为另一个实例，本公开提供了包含与表1的菌株D23蛋白序列中的任一个至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的氨基酸序列的亚硝化单胞菌的任选纯性的组合物用于治疗病症或疾病的用途。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含表1中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或所有菌株D23蛋白质序列。在实施方案中，所述亚硝化单胞菌包含由图6-8的核酸编码的一种或多种蛋白质。本段中的亚硝化单胞菌可以用于治疗例如糖尿病溃疡(例如，糖尿病足溃疡)、慢性创伤、痤疮、酒渣鼻、湿疹或银屑病。
在某些实施方案中，本公开提供了具有下列中的一个或多个的亚硝化单胞菌的任选纯性的组合物用于治疗病症或疾病(例如，抑制受试者皮肤上的微生物生长)的用途：(1)优化的生长速率；(2)优化的NH4 +氧化速率；(3)优化的NH3抗性；(4)优化的NH4 +抗性；和(5)优化的NO2 -抗性。例如，所述纯性亚硝化单胞菌组合物可以具有在本段的开头所列出的特性(1)和(2)；(2)和(3)；(3)和(4)；或(4)和(5)。作为另一个实例，纯性亚硝化单胞菌组合物可以具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)和(3)；(1)、(2)和(4)；(1)、(2)和(5)；(1)、(3)和(4)；(1)、(3)和(5)；(1)、(4)和(5)；(2)、(3)和(4)；(2)、(3)和(5)；或(3)、(4)和(5)。作为进一步的实例，所述任选为纯性的亚硝化单胞菌组合物可以具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)、(3)和(4)；(1)、(2)、(3)和(5)；(1)、(2)、(4)和(5)；(1)、(3)、(4)和(5)；或(2)、(3)、(4)和(5)。在一些实施方案中，纯性亚硝化单胞菌组合物具有在本段的开头所列出的特性(1)、(2)、(3)、(4)和(5)。本段中的亚硝化单胞菌可以用于治疗例如糖尿病溃疡(例如，糖尿病足溃疡)、慢性创伤、痤疮、酒渣鼻、湿疹或银屑病。
在一些实施方案中，使用任选为纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)来治疗受试者。受试者可以包括动物、哺乳动物、人类、非人类动物、家畜动物或伴侣动物。
在一些实施方案中，使用本文所述的任选为纯性的亚硝化单胞菌(例如，在该部分和上文的第2部分中描述的亚硝化单胞菌，例如菌株D23)来抑制其它生物体的生长。例如，亚硝化单胞菌D23良好地适于长期定植于人类皮肤，并且在一些实施方案中，它竞争过在皮肤上非所需的其它细菌。非所需的皮肤细菌包括例如那些可以感染伤口、提高疾病的风险或严重程度或产生气味的细菌。某些非所需的皮肤细菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌和鲍曼不动杆菌。本文所述的亚硝化单胞菌可以通过例如消耗稀少的营养物或产生有害于其它生物体的副产物(例如，使皮肤的pH变成不利于非所需生物体的生长的水平)竞争过其它生物体。
因此，本公开尤其提供了一种抑制受试者皮肤上的微生物生长的方法，其包括向有需要的人类局部施用有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。类似地，本公开提供了用于抑制受试者皮肤上的微生物生长的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)。同样地，本公开提供了任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)在制造用于抑制受试者皮肤上的微生物生长的药物中的用途。
本公开还提供了一种向受试者供应一氧化氮的方法，其包括将有效剂量的本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)放置在紧邻所述受试者处。类似地，本公开提供了用于向受试者供应一氧化氮的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)。同样地，本公开提供了任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)在制造适于放置在紧邻受试者处的药物或组合物中的用途。
本公开还提供了一种减少体臭的方法，其包括向有需要的受试者局部施用有效剂量的本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。类似地，本公开提供了用于减少受试者的体臭的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)。同样地，本公开提供了如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)在制造用于减少体臭的药物或组合物中的用途。
本公开还提供了一种治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病的方法，其包括向有需要的受试者局部施用治疗有效剂量的本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。类似地，本公开提供了用于治疗与低亚硝酸盐水平有关的疾病的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)的局部制剂。同样地，本公开提供了如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)在制造用于治疗与低亚硝酸盐水平有关的疾病的局部药物中的用途。
本公开还提供了一种治疗或预防皮肤病症或皮肤感染的方法，其包括向有需要的受试者局部施用治疗有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。类似地，本公开提供了用于治疗受试者中的皮肤病症的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)。同样地，本公开提供了如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)在制造用于治疗皮肤病症的药物中的用途。在实施方案中，所述皮肤病症是痤疮、酒渣鼻、湿疹、银屑病或荨麻疹；所述皮肤感染是脓疱病。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)治疗痤疮可以涉及由于NO生成所引起的炎症下调；和/或通过酸化的亚硝酸盐和NO产生来限制和/或抑制与寻常痤疮有关的痤疮丙酸杆菌的扩散和增殖。
例如，本公开提供了氨氧化细菌的组合物用于治疗病症或疾病(例如，抑制受试者皮肤上的微生物生长)的用途。在实施方案中，可以使用氨氧化细菌来治疗例如慢性创伤、痤疮、酒渣鼻、湿疹、银屑病、荨麻疹、皮肤感染或糖尿病溃疡(例如，糖尿病足溃疡)。
本公开的系统和方法可以提供或含有可用于下列中的一个或多个的内容物：治疗或预防皮肤病症；治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病或病状；治疗或预防体臭；用于向受试者供应一氧化氮的治疗；或用于抑制微生物生长的治疗。
本公开的系统和方法可以用于减少环境中(例如，受试者的表面)的非所需细菌的量。
本公开的系统和方法可以提供或含有可用于治疗下列疾病中的至少一个的内容物：HIV皮炎、糖尿病足溃疡中的感染、过敏性皮炎、痤疮、湿疹、接触性皮炎、过敏反应、银屑病、荨麻疹、酒渣鼻、皮肤感染、血管疾病、阴道酵母菌感染、性传播疾病、心脏病、动脉粥样硬化、脱发、继发于糖尿病或卧床的下肢溃疡、心绞痛(特别是慢性稳定型心绞痛)、缺血性疾病、充血性心脏衰竭、心肌梗死、缺血再灌注损伤、蹄叶炎、高血压、肥厚性器官退化、雷诺氏现象、纤维化、纤维化器官退化、过敏、自身免疫性致敏、终末期肾病、肥胖、阳痿、肺炎、原发性免疫缺陷病、大疱性表皮松解症或癌症。
本公开的系统和方法可以提供或含有可用于治疗下列中的至少一个的内容物：痤疮、湿疹、银屑病、荨麻疹、酒渣鼻、皮肤感染和伤口(感染的伤口)。
在一些实施方案中，氨氧化细菌可以用于治疗受试者。受试者可以包括动物、哺乳动物、人类、非人类动物、家畜动物或伴侣动物。
在一些实施方案中，使用本文所述的氨氧化细菌来抑制其它生物体的生长。例如，氨氧化细菌可以良好地适于长期定植于人类皮肤，并且在一些实施方案中，它竞争过在皮肤上非所需的其它细菌。非所需的皮肤细菌包括例如那些可以感染伤口、提高疾病的风险或严重程度或产生气味的细菌。非所需的细菌可以被称为致病性细菌。某些非所需的皮肤细菌包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、丙酸杆菌和寡养单胞菌。本文所述的氨氧化细菌可以通过例如消耗稀少的营养物或产生有害于其它生物体的副产物(例如，使皮肤的pH变成不利于非所需生物体的生长的水平)竞争过其它生物体。
因此，本公开尤其提供了一种抑制受试者皮肤上的微生物生长的方法，其包括向有需要的人类局部施用有效剂量的如本文所述的氨氧化细菌。类似地，本公开提供了用于抑制受试者皮肤上的微生物生长的如本文所述的氨氧化细菌。同样地，本公开提供了氨氧化细菌在制造用于抑制受试者皮肤上的微生物生长的药物中的用途。
本公开尤其提供了一种改变环境(例如表面，例如受试者的表面)中的皮肤微生物组的组成(例如，调节皮肤微生物组的组成，例如调节或改变皮肤微生物组的比例)的方法。所述方法可以包括向环境(例如表面，例如受试者的表面)施用(例如，施加)含有氨氧化细菌的制剂。在一些实施方案中，施用(例如，施加)的量和频率可以足以减少皮肤表面上的致病性细菌的比例。在一些实施方案中，所述受试者可以基于受试者需要减少皮肤表面上的致病性细菌的比例来选择。
本公开可以进一步提供从皮肤表面获得样品，并分离所述样品中的细菌的DNA。还可以对所述样品中的细菌的DNA进行测序，以确定或监测受试者的样品中的细菌的量或比例。
本公开还可以用于增加表面上的非致病性细菌的比例。在一些实施方案中，所述非致病性细菌可以是共生非致病性细菌。在一些实施方案中，非致病性细菌可以是葡萄球菌属细菌。在一些实施方案中，非致病性细菌可以是表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，比例增加的非致病性细菌可以是葡萄球菌属细菌，其包含至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的表皮葡萄球菌。
非致病性细菌的比例增加可以在预定的时间段内发生，例如，在小于1天、2天、3天、4天、5天、1周、2周、3周或4周内发生或在小于1-3天、3-5天、5-7天、7-9天、5-10天、10-14天、12-18天、12-21天、21-28天、28-35天、35-42天、42-49天、49-56天、46-63天、63-70天、70-77天、77-84天、84-91天内发生。
可以在小于约3周(例如，约16天，例如约2周)内观察到葡萄球菌属细菌(例如，表皮葡萄球菌)的比例的增加。
本公开可以用于减少表面上的致病性细菌(例如，潜在致病性细菌，例如与疾病相关的细菌)的比例。在一些实施方案中，致病性细菌可以是丙酸杆菌属。在一些实施方案中，致病性细菌可以是寡养单胞菌属。
致病性细菌的比例减少可以在预定的时间段内发生，例如，在小于1天、2天、3天、4天、5天、1周、2周、3周或4周内发生或在小于1-3天、3-5天、5-7天、7-9天、5-10天、10-14天、12-18天、12-21天、21-28天、28-35天、35-42天、42-49天、49-56天、46-63天、63-70天、70-77天、77-84天、84-91天内发生。
可以在小于约3周(例如，约16天，例如约2周)内观察到丙酸杆菌属细菌和/或寡养单胞菌属细菌的比例的减少。
本公开还提供了一种向受试者供应一氧化氮的方法，其包括将有效剂量的本文所述的氨氧化细菌放置在紧邻所述受试者处。类似地，本公开提供了用于向受试者供应一氧化氮的如本文所述的氨氧化细菌。同样地，本公开提供了在制造适于放置在紧邻受试者处的药物或组合物中的用途。
本公开还提供了一种减少体臭的方法，其包括向有需要的受试者局部施用有效剂量的本文所述的氨氧化细菌。类似地，本公开提供了用于减少受试者的体臭的如本文所述的氨氧化细菌。同样地，本公开提供了如本文所述的氨氧化细菌在制造用于减少体臭的药物或组合物中的用途。
本公开还提供了一种治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病的方法，其包括向有需要的受试者局部施用治疗有效剂量的本文所述的氨氧化细菌。类似地，本公开提供了用于治疗与低亚硝酸盐水平有关的疾病的如本文所述的氨氧化细菌的局部制剂。同样地，本公开提供了如本文所述的氨氧化细菌在制造用于治疗与低亚硝酸盐水平有关的疾病的局部药物中的用途。
本公开还提供了一种治疗或预防皮肤病症或皮肤感染的方法，其包括向有需要的受试者局部施用治疗有效剂量的如本文所述的氨氧化细菌。类似地，本公开提供了用于治疗受试者中的皮肤病症的如本文所述的氨氧化细菌。同样地，本公开提供了如本文所述的氨氧化细菌在制造用于治疗皮肤病症的药物中的用途。在实施方案中，所述皮肤病症是痤疮、酒渣鼻、湿疹、银屑病或荨麻疹；所述皮肤感染是脓疱病。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)治疗酒渣鼻可以涉及由于NO生成所引起的下调。这可能是由于Kazal型KLK5/KLK7抑制剂的表达，其可以减少人类cathelicidin肽LL-37从其前体前肽hCAP18的形成。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)治疗湿疹和/或过敏性皮炎可以涉及由于NO生成所引起的炎症下调；和/或通过酸化的亚硝酸盐和NO产生来限制和/或抑制金黄色葡萄球菌和经常与过敏性皮炎中的极高的定植率和皮肤负荷有关的其它皮肤病原体的扩散和增殖。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)治疗银屑病可以涉及由于NO生成所引起的炎症下调以及人类cathelicidin肽LL-37的形成的减少。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)治疗银屑病可以涉及由于NO生成所引起的炎症下调。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)治疗脓疱病或其它皮肤感染和软组织感染可以涉及限制和/或抑制金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的扩散和增殖。
本公开还提供了一种促进伤口愈合的方法，其包括向伤口施用有效剂量的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌细菌(例如，菌株D23)。类似地，本公开提供了用于治疗伤口的如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)。同样地，本公开提供了如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)在制造用于治疗伤口的药物或组合物中的用途。
如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)可以用于促进愈合能力受损的患者(例如，糖尿病患者)中的伤口愈合。
在一些实施方案中，本公开提供了使用如本文所述的任选纯性的亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)来预防疾病或病症(例如，皮肤病症)的方法。在某些实施方案中，预防意指相比于类似的未经治疗的受试者降低受试者发展疾病的风险。需要将所述风险降低至零。
沐浴频率降低的个体(如宇航员、潜艇船员、战役期间的军事人员、偏远地区的民工、难民、卧床不起的个体和许多其它人)可以通过将亚硝化单胞菌保持在皮肤上来维持更健康的皮肤。关于卧床不起的个体，在一些实施方案中，亚硝化单胞菌通过扩张不充分循环来降低褥疮的频率或严重性。
应当理解，许多现代的退行性疾病可能由缺乏NO种类所引起，且外部皮肤上的AOB可以通过扩散供应那些种类，并且对皮肤施用AOB解决长期的医疗状况。在某些实施方案中，向受试者施用AOB以抵消现代的沐浴实践，尤其是阴离子去污剂从外部皮肤上除去AOB。
局部施用的一种合适的方法为施加足够的亚硝化单胞菌，然后穿上足够的衣物，以便诱导出汗。然而，许多人将希望得到AOB的益处，同时维持他们当前的沐浴习惯，在这种情况下，可以连同足够的底物一起施用所述细菌的培养物以供它们产生NO。接近人类汗液的无机组成的营养液可以用于此目的。利用适于接近人类汗液的培养基的细菌使它们在被施用时适应的时间减至最少。由于汗液一旦分泌到皮肤表面上便蒸发，因此使用具有较高离子强度的培养基是理想的。约两倍于人类汗液的浓度是合适的，但还考虑了其它条件。NH3或尿素、O2、CO2和矿物质通常满足AOB的营养需求。在一些实施方案中，所述底物包含微量矿物质，其包括铁、铜、锌、钴、钼、锰、钠、钾、钙、镁、氯化物、磷酸盐、硫酸盐或其任何组合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过将含有亚硝化单胞菌的绷带施加到伤口上来治疗所述伤口的方法。还提供了制造这种绷带的方法。所述绷带可以包括例如将绷带固定在伤口附近的未受损皮肤上的粘附部分以及包覆或覆盖伤口的柔软的柔性部分。在一些实施方案中，所述绷带不包含除亚硝化单胞菌以外的其它生物体。所述绷带可以由可渗透材料制成，所述可渗透材料在绷带被施加至伤口上时允许气体如氧气和二氧化碳触及亚硝化单胞菌。在某些实施方案中，所述绷带包含用于亚硝化单胞菌的营养物，如铵、氨、尿素或微量矿物质。在某些实施方案中，所述绷带包含亚硝化单胞菌耐受的抗生素。所述抗生素抗性可以产生自一个或多个内源性抗性基因或产生自一个或多个转基因。
在一些实施方案中，以每次施用约108–109CFU、109–1010CFU、1010–1011CFU或1011-1012CFU的剂量施用亚硝化单胞菌。在一些实施方案中，以约1010-1011CFU，例如约1x 1010–5x1010、1x 1010–3x 1010或1x 1010–2x 1010CFU的剂量局部施用亚硝化单胞菌。
在一些实施方案中，以每剂约1-2ml、2-5ml、5-10ml、10-15ml、12-18ml、15-20ml、20-25ml或25-50ml的体积施用亚硝化单胞菌。在一些实施方案中，溶液的浓度为约108-109、109-1010或1010-1011CFU/ml。在一些实施方案中，每天以两个15ml剂量施用亚硝化单胞菌，其中每个剂量的浓度为109CFU/ml。
在一些实施方案中，每天施用氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)一次、两次、三次或四次。在一些实施方案中，每周施用氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)一次、两次、三次、四次、五次或六次。在一些实施方案中，在沐浴后不久施用氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)。在一些实施方案中，在睡觉前不久施用氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)。
在某些方面，本公开提供了组合疗法，其包括氨氧化细菌(例如，亚硝化单胞菌)和第二治疗剂。例如，本公开提供了两种(或更多种)疗法的物理混合物。在其它实施方案中，将两种(或更多种)疗法作为单独的制剂组合施用。第二疗法可以是例如药物制剂、手术或治疗有关疾病或病症的任何其它医疗方法。以下段落描述能够治疗糖尿病溃疡、慢性创伤、痤疮、酒渣鼻、湿疹和银屑病的组合疗法。
例如，在能够治疗糖尿病溃疡的组合疗法中，第二疗法可以包括例如伤口敷料(例如，吸收性填料、水凝胶敷料或水胶体)、血管紧张素、血管紧张素类似物、富血小板纤维蛋白疗法、高压氧疗法、负压伤口疗法、清创术、引流、动脉血管再生、高压氧疗法、低强度激光疗法和腓肠肌退缩术。组合疗法可以包含上述治疗中的一个或多个。
在能够治疗慢性创伤的组合疗法中，第二疗法可以包括例如抗生素(例如，局部或全身性的，以及杀菌或抑菌的)，如青霉素、头孢菌素、多粘菌素、利福霉素(rifamycin)、台勾霉素(lipiarmycin)、喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类、林可酰胺类、四环素类、环脂肽、甘氨酰环素类、恶唑烷酮类和台勾霉素；血管紧张素、血管紧张素类似物；清创术；引流；伤口冲洗；负压伤口疗法；加热；动脉血管再生；高压氧疗法；抗氧化剂，如抗坏血酸、谷胱甘肽、硫辛酸、胡萝卜素、α-生育酚或泛醇；低强度激光疗法；腓肠肌退缩术；生长因子，如血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1-2、血小板源性生长因子、转化生长因子β或表皮生长因子；施用自体血小板，如那些分泌一种或多种生长因子如血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1-2、血小板源性生长因子、转化生长因子β或表皮生长因子的自体血小板；角化细胞培养物的植入；同种异体移植物；胶原蛋白，例如包含胶原蛋白的敷料；或蛋白酶抑制剂如SLPI。组合疗法可以包含上述治疗中的一个或多个。
在能够治疗痤疮的组合疗法中，第二疗法可以包括例如药物治疗(例如，全身或局部的)，如过氧化苯甲酰、抗生素(如红霉素、克林霉素或四环素)、水杨酸、激素(例如，包括孕激素如去氧孕烯(desogestrel)、诺孕酯(norgestimate)或屈螺酮(drospirenone))；类视色素如维甲酸(tretinoin)、阿达帕林(adapalene)、他扎罗汀(tazarotene)或异维甲酸(isotretinoin)。第二疗法还可以是诸如粉刺摘除、皮质类固醇注射或手术切缝的程序。组合疗法可以包含上述治疗中的一个或多个。
在能够治疗酒渣鼻的组合疗法中，第二疗法可以包括例如抗生素，例如，口服四环素抗生素如四环素、强力霉素或米诺环素，或局部抗生素如甲硝唑；壬二酸；α-羟基酸；可以开具异维甲酸的处方；檀香油；可乐定(clonidine)；β-阻断剂如纳多洛尔(nadolol)和普萘洛尔(propranolol)；抗组胺药(如氯雷他定(loratadine))；米氮平(mirtazapine)；甲基磺酰甲烷或水飞蓟素，任选地彼此组合；激光，如皮肤血管激光或CO2激光；或光疗法，如强脉冲光、低强度光疗法或光子嫩肤术。组合疗法可以包含上述治疗中的一个或多个。
在能够治疗湿疹的组合疗法中，第二疗法可以包括例如皮质类固醇，如氢化可的松或丙酸氯倍他索；免疫抑制剂(局部或全身的)，如吡美莫司(pimecrolimus)、他克莫司(tacrolimus)、环孢素、硫唑嘌呤或甲氨蝶呤；或光疗法，如利用紫外光。组合疗法可以包含上述治疗中的一个或多个。
在能够治疗银屑病的组合疗法中，第二疗法可以包括例如皮质类固醇，如去羟米松；类视色素；焦油；维生素D或其类似物，如帕立骨化醇(paricalcitol)或卡泊三醇(calcipotriol)；保湿剂和润肤剂，如矿物油、凡士林、卡泊三醇、decubal或椰子油；地蒽酚(dithranol)；或醋酸氟轻松(fluocinonide)。组合疗法可以包含上述治疗中的一个或多个。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的本文所述的氨氧化细菌治疗银屑病可以涉及由于NO生成所引起的炎症下调以及人类cathelicidin肽LL-37的形成的减少。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的如本文所述的氨氧化细菌治疗银屑病可以涉及由于NO生成所引起的炎症下调。
虽然不希望受理论的束缚，但提出了用治疗有效剂量的如本文所述的氨氧化细菌治疗脓疱病或其它皮肤感染和软组织感染可以涉及限制和/或抑制金黄色葡萄球菌(S.aureus)例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、丙酸杆菌和寡养单胞菌的扩散和增殖。
本公开还提供了一种促进伤口愈合的方法，其包括向伤口施用有效剂量的如本文所述的氨氧化细菌。类似地，本公开提供了用于治疗伤口的如本文所述的氨氧化细菌。同样地，本公开提供了如本文所述的氨氧化细菌在制造用于治疗伤口的药物或组合物中的用途。
如本文所述的氨氧化细菌可以用于促进愈合能力受损的患者(例如，糖尿病患者)中的伤口愈合。
在一些实施方案中，本公开提供了使用如本文所述的氨氧化细菌来预防疾病或病症(例如，皮肤病症)的方法。在某些实施方案中，预防意指相比于类似的未经治疗的受试者降低受试者发展疾病的风险。需要将所述风险降低至零。
沐浴频率降低的个体(如宇航员、潜艇船员、战役期间的军事人员、偏远地区的民工、难民、卧床不起的个体和许多其它人)可以通过将氨氧化细菌保持在皮肤上来维持更健康的皮肤。关于卧床不起的个体，在一些实施方案中，氨氧化细菌通过扩张不充分循环来降低褥疮的频率或严重性。
应当理解，许多现代的退行性疾病可能由缺乏NO种类所引起，且外部皮肤上的氨氧化细菌可以通过扩散供应那些种类，并且对皮肤施用氨氧化细菌解决长期的医疗状况。在某些实施方案中，向受试者施用氨氧化细菌以抵消现代的沐浴实践，尤其是阴离子去污剂从外部皮肤上除去氨氧化细菌。
局部施用的一种合适的方法为施加足够的氨氧化细菌，然后穿上足够的衣物，以便诱导出汗。然而，许多人将希望得到氨氧化细菌的益处，同时维持他们当前的沐浴习惯，在这种情况下，可以连同足够的底物一起施用所述细菌的培养物以供它们产生NO。接近人类汗液的无机组成的营养液可以用于此目的。利用适于接近人类汗液的培养基的细菌使它们在被施用时适应的时间减至最少。由于汗液一旦分泌到皮肤表面上便蒸发，因此使用具有较高离子强度的培养基是理想的。约两倍于人类汗液的浓度是合适的，但还考虑了其它条件。NH3或尿素、O2、CO2和矿物质通常满足氨氧化细菌的营养需求。在一些实施方案中，所述底物包含微量矿物质，其包括铁、铜、锌、钴、钼、锰、钠、钾、钙、镁、氯化物、磷酸盐、硫酸盐或其任何组合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过将含有氨氧化细菌的绷带施加到伤口上来治疗所述伤口的方法。还提供了制造这种绷带的方法。所述绷带可以包括例如将绷带固定在伤口附近的未受损皮肤上的粘附部分以及包覆或覆盖伤口的柔软的柔性部分。在一些实施方案中，所述绷带不包含除氨氧化细菌以外的其它生物体。所述绷带可以由可渗透材料制成，所述可渗透材料在绷带被施加至伤口上时允许气体如氧气和二氧化碳触及氨氧化细菌。在某些实施方案中，所述绷带包含用于氨氧化细菌的营养物，如铵、氨、尿素或微量矿物质。在某些实施方案中，所述绷带包含氨氧化细菌耐受的抗生素。所述抗生素抗性可以产生自一个或多个内源性抗性基因或产生自一个或多个转基因。
在一些实施方案中，以每次施用或每天约108–109CFU、109–1010CFU、1010–1011CFU或1011-1012CFU的剂量施用氨氧化细菌(例如，氨氧化细菌的制剂)。在一些实施方案中，以约109-1010CFU，例如约1x 109–5x 109、1x 109–3x 109或1x 109–10x 109CFU的剂量局部施用氨氧化细菌。
在一些实施方案中，以每剂约1-2ml、2-5ml、5-10ml、10-15ml、12-18ml、15-20ml、20-25ml或25-50ml的体积施用氨氧化细菌。在一些实施方案中，溶液的浓度为约108-109、109-1010或1010-1011CFU/ml。在一些实施方案中，每天以两个15ml剂量施用氨氧化细菌，其中每个剂量的浓度为109CFU/ml。
在一些实施方案中，每天施用氨氧化细菌一次、两次、三次或四次。在一些实施方案中，每周施用氨氧化细菌一次、两次、三次、四次、五次或六次。在一些实施方案中，在沐浴后不久施用氨氧化细菌。在一些实施方案中，在睡觉前不久施用氨氧化细菌。
在一些实施方案中，施用氨氧化细菌约1-3天、3-5天、5-7天、7-9天、5-10天、10-14天、12-18天、12-21天、21-28天、28-35天、35-42天、42-49天、49-56天、46-63天、63-70天、70-77天、77-84天、84-91天，例如约1个月、约2个月、约3个月。在一些实施方案中，施用氨氧化细菌无限期的时间，例如，大于一年、大于5年、大于10年、大于15年、大于30年、大于50年、大于75年。
6.用于改善D23治疗的实验模型
包含如本文所述的氨氧化细菌(其任选与另一种疗法组合)的治疗可以使用许多模型系统加以改善。这些模型系统可以用于确定合适的剂量和施用时间安排。
例如，对于慢性创伤和糖尿病溃疡，可以使用小鼠皮肤穿刺模型。这些病症的其它模型包括豚鼠模型中的受控皮肤缺血、兔耳溃疡模型、对伤口施用钙或局部施用阿霉素(doxorubicin)。
对于痤疮，可以使用(例如)墨西哥无毛犬模型、犀鼠模型或兔耳分析。对于酒渣鼻，可以使用(例如)皮内注射LL-37至小鼠皮肤中或叙利亚仓鼠(Syrian hamster)模型。对于湿疹，可以使用(例如)施用粉尘螨的粗提取物、对致敏豚鼠或NC/Nga小鼠的耳部施用二硝基氯苯。对于银屑病，可以使用(例如)异种移植模型，其中将涉及和未涉及的银屑病皮肤移植到免疫缺陷小鼠上；对SCID小鼠的皮肤施用针对白介素15的抗体；以及Sharpincpdm/Sharpincpdm小鼠模型。
包含如本文所述的氨氧化细菌例如亚硝化单胞菌(例如，菌株D23)(其任选与另一种疗法组合)的治疗可以使用许多模型系统加以改善。这些模型系统可以用于确定合适的剂量和施用时间安排。
例如，对于慢性创伤和糖尿病溃疡，可以使用在本文的实施例6中所述的小鼠皮肤穿刺模型。这些病症的其它模型包括豚鼠模型中的受控皮肤缺血、兔耳溃疡模型、对伤口施用钙或局部施用阿霉素(doxorubicin)。
对于痤疮，可以使用(例如)墨西哥无毛犬模型、犀鼠模型或兔耳分析。对于酒渣鼻，可以使用(例如)皮内注射LL-37至小鼠皮肤中或叙利亚仓鼠(Syrian hamster)模型。对于湿疹，可以使用(例如)施用粉尘螨的粗提取物、对致敏豚鼠或NC/Nga小鼠的耳部施用二硝基氯苯。对于银屑病，可以使用(例如)异种移植模型，其中将涉及和未涉及的银屑病皮肤移植到免疫缺陷小鼠上；对SCID小鼠的皮肤施用针对白介素15的抗体；以及Sharpincpdm/Sharpincpdm小鼠模型。
7.治疗效益的机制
不受理论的束缚，据信，以下机制有助于氨氧化细菌如亚硝化单胞菌(N.eutropha)在治疗本文所讨论的疾病和病状的有益效果。其它机制性细节在国际申请WO/2005/030147中找到，所述申请全文以引用方式并入本文。
为了理解这些细菌有益的方面，理解血管生成是有帮助的。所有的体细胞，除了那些暴露在几百微米外界空气中的细胞，都从血液供应中获取所有代谢氧气。氧气被肺中的血液吸收，作为氧合血红蛋白被血红细胞运载到外周组织，在那里和二氧化碳交换，二氧化碳然后被运回，从肺中呼出。氧气必须从红细胞中扩散，通过细胞质，穿过内皮，并穿过各种组织直到到达利用氧气的细胞线粒体。人体内含有约5升血液，所以循环系统的体积与身体的体积相比而言很小。氧气不能主动被运输。它被动的通过浓度梯度从空气扩散到红细胞中，从红细胞扩散到细胞中，再从细胞到消耗氧气的细胞色素氧化酶。消耗氧气部位的氧气浓度在体内是最低的，且O2通量由扩散阻力和浓度梯度决定。完成给所有的外周组织供应充足氧气需要对毛细血管的大小和位置进行敏锐的控制。如果毛细血管的空间增加，完成同样的氧气通量就需要更大的浓度差和因此更低的细胞色素氧化酶的O2浓度。毛细血管之间的细胞越多，O2的需求就会更大。如果毛细血管之间的空间减小，完成器官代谢功能的细胞的可利用的空间也减小。
在某些方面，来自氨氧化细菌的NO容易被外皮肤所吸收，且由于外皮肤没有血红蛋白而转化成S-亚硝基硫醇。M.Stucker等人在“The cutaneous uptake of atmosphericoxygen contributes significantly to the oxygen supply of human dermis andepidermis”中已经表明，外皮肤从外界空气中接受所有的氧气。(Journal of Physiology(2002),538.3，第985–994页。)这是显然的，因为可以看到外皮肤基本上没有红细胞。因为它们是活的，且需要血液中的营养而不仅仅是氧气，所以这些层之间存在血浆循环。形成的S-亚硝基硫醇是稳定的，可以扩散通过身体，并构成可靠NO的体积源和使蛋白巯基转亚硝基的NO源。
在一些方面，应该了解，毛细血管稀薄是NO水平不足的首要表现之一。F.T.Tarek等人表明，疏松的毛细血管或者说毛细血管稀薄在患有原发性高血压的人群中较为常见。(Structural Skin Capillary Rarefaction in EssentialHypertension.Hypertension.1999；33:998-1001
许多病状与毛细血管密度变得疏松有关。高血压是其中一种，且研究者报道稀疏的毛细血管也见于原发性高血压人群的孩童时期中以及糖尿病人群中。糖尿病的严重并发症是高血压、糖尿病性肾病，糖尿病性视网膜病，糖尿病性神经病。R.Candido等人已经发现，最后两种病状的特征是观察到症状之前流向受影响部位的血流量降低。(Haemodynamics in microvascular complications in type 1diabetes.DiabetesMetab Res Rev 2002；18:286-304。)降低的毛细血管密度和肥胖症相关，且普通体重降低增加毛细血管密度，如由A Philip等人在“Effect of Weight Loss on Muscle FiberType,Fiber Size,Capilarity,and Succinate Dehydrogenase Activity in Humans”中所示。The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism第84卷,第11期4185-4190,1999。
研究者已表明，在原发性雷诺现象(PRP)中，甲襞毛细血管比正常对照组的稀薄(轻微的)，且比已经发展为全身硬化(SSc)的病人丰富的多。M.Bukhari,IncreasedNailfold Capillary Dimensions In Primary Raynaud’s Phenomenon And SystemicSclerosis.British Journal of Rheumatology，第24卷，第35期：1127-1131,1996。他们发现毛细血管密度从35环(loops)/mm2(正常对照组)降到33(PRP组)、17(SSc组)。对照组、PRP组、SSc组毛细血管支路之间的平均距离分别是18μ、18μ和30μ。
在某些方面，应该了解，正常情况下身体用于感受“缺氧”的机制可影响到调节毛细血管密度的身体系统。根据本发明的这个方面，大量的“缺氧”成分被感受到，不是通过O2水平的降低，而是通过一氧NO水平的增加。NO基础水平的降低干扰了“缺氧”的感受，所以影响了许多通过“缺氧”调节的身体功能。例如，贫血通常被定义为“血红蛋白不足”，血红蛋白不足的一个后果就是“缺氧”，它被定义为“氧气不足”。根据一些方面，这些普通的定义不能解释两种病状的一氧化氮引起的方面。
在休息状态时，急性等容贫血的耐受性良好.血细胞比容的2/3的减少对静脉回流的PvO2影响很小，这暗示了无论是O2压还是整个身体的运输都没有降低。Weiskopf等人，Human cardiovascular and metabolic response to acute,severe isovolemicanemia.JAMA 1998，第279卷，第3期，217-221。在降低50％时(从140到70g Hb/L)，平均PvO2饱和度(大于32个受试者)从大约77％降到74％。血液中O2容量的降低通过血管舒张和心率从63增加到85bpm的心动过速来补偿。补偿是有效而明显的，然而，机制却不是。典型的解释是“缺氧”感受器检测到了“缺氧”，并用血管舒张和心动过速的方式补偿。然而，却检测不到“缺氧“。血液乳酸(厌氧呼吸的标志物)轻微地从0.77降到0.62mM/L，暗示了较少厌氧呼吸和较少”缺氧”。静脉回流PvO2的3％的降低与人的海拔上升300米(通常不会产生心动过速)是同样水平的“缺氧”。静脉回流的O2浓度保持不变，且O2消耗保持不变，在体内没有O2浓度降低的空间。因为O2感应，等容贫血期间的代偿不会发生。
因此，急性等容贫血中观察到的血管舒张可归因于血管壁处的NO浓度增加。NO响应剪切应力和其它因素介导血管扩张。观察到NO代谢水平没有改变，因为NO的产生速率没有改变，且继续等于起消耗速率。没有观察到“低氧症”的metHb代偿是很容易理解的，因为metHb就像Hb那样结合NO，因此当Hb降低导致metHb代偿时NO浓度并没有增加。
一氧化氮在许多代谢途径中起重要作用。已经表明，NO的基本水平在色调抑制反应中发挥作用，并且这个基本水平的降低导致这些路径双重抑制。Zanzinger等人曾经报道NO抑制基本交感紧张和减弱兴奋反射。(Inhibition of basal and reflex-mediatedsympathetic activity in the RVLM by nitric oxide.Am.J.Physiol.268(RegulatoryIntegrative Comp.Physiol.37):R958-R962,1995。)
在一些方面，应该了解，NO体积源的一种组分为低分子量S-亚硝基硫醇，其在无红细胞皮肤上通过氨氧化细菌由外皮肤上产生的NO产生。这些低分子量S-亚硝基硫醇长期稳定，并且可以在血浆中自由扩散和循环。多种酶可从多种S-亚硝基硫醇裂解出NO，从而在酶切位点释放出NO。皮肤上的AOB的这个NO体积源的损失导致破坏正常生理。身体使用S-亚硝基硫醇远离毛细血管产生NO的优点在于从S-亚硝基硫醇生产NO无需O2。一氧化氮合成酶(NOS)产生NO需要O2。当有足够的S-亚硝基硫醇背景时，甚至在缺氧区域中也可以生成NO。也不需要自由的NO，因为NO只有与另一个分子附接时才发挥作用，如半胱氨酸残基的巯基或血红素的铁，因此NO的作用可以被转亚硝基化所介导，甚至没有自由NO而只要有S-亚硝基硫醇和转亚硝基酶存在时也是可以的。
Frank等人已表明，伴随普通创伤恢复的血管生成部分是由提升的VEGF产生的，VEGF是由增加的一氧化氮诱导的。(Nitric oxide triggers enhanced induction ofvascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes(HaCaT)and during cutaneous wound repair.FASEB J.13,2002–2014(1999).)
NO在形成癌症中起重要作用，表明本文所述细菌可用于癌症治疗和预防的方法中。根据某些方面，应该了解，在缺氧期间存在NO可阻止细胞在缺氧应激下分裂，这时细胞复制DNA的错误风险较大。一个相关的细胞功能是调控细胞周期。这是控制着细胞如何和何时复制DNA、组装成双染色体和分裂的调控程序。细胞周期的调控是非常复杂的，并且没有完全理解。但是，已知，在细胞周期的路径上存在许多点，在这些点上细胞周期可以被停止，且分裂可以被阻止直至发生这种情况的状态被改善。P53肿瘤抑制蛋白是细胞周期调控时的关键蛋白，且它通过包括DNA损伤的不同细胞压力信号启动细胞阻滞和凋亡，并且P53在超过一半以上的人类癌症中发生突变，如Ashcroft等人在“Stress Signals UtilizeMultiple Pathways To Stabilize p53”中所报道。(Molecular And Cellular Biology,May 2000年5月,第3224–3233页。)缺氧启动p53的积累，而且当缺氧在调控细胞周期中很重要时，缺氧单独不能诱导p53mRNA效应蛋白的下游表达，因此不能够引起细胞周期的停止。Goda等人曾经报道到细胞阻滞的缺氧诱导需要缺氧-诱导因子-1(HIF-1α)。(Hypoxia-Inducible Factor 1αIs Essential for Cell Cycle Arrest during Hypoxia。Molecular And Cellular Biology，2003年1月，第359–369页。)Britta等人曾经报道，NO是HIF-1α的主要刺激物之一。(Accumulation of HIF-1a under the influence of nitricoxide.Blood，2001年2月15日，第97卷，第4号。)相比之下，NO引起转录活性p53的积累，并且引起细胞周期的阻滞，和引起凋亡。Wang等人，P53Activation By Nitric Oxide InvolvesDown-Regulation Of Mdm2。THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY第277卷，第18期，发行期5月3日，第15697–15702号，2002。
在本发明的某些方面，应该了解，通过阻止会导致缺氧性死亡的毛细血管稀薄来阻止细胞坏死性死亡可以防止自身免疫性疾病。当细胞暴露于慢性缺氧时，反应性氧物质(ROS)生产增加，且对细胞代谢机能的损伤增加，最终导致细胞DNA的损伤增加。降低的代谢能力，由于ROS和外源性致癌物质暴露，将会降低损伤恢复能力。随时间推移，损伤积累，并增加三个事件的概率：细胞将缺失抑癌基缺失，且细胞将变得癌化，细胞将通过坏死而死亡，或细胞通过细胞凋亡而死亡。当细胞死亡时，无论是坏死还是凋亡，细胞残骸必须从那个部位中清除。死亡细胞被免疫细胞，包括树枝状细胞和巨噬细胞所吞噬。当这些细胞吞噬主体，所述主体通过各种蛋白水解酶消化为抗原片段，然后将这些抗原附接至主要组织相容性复合物(MHC1、MHC2)，并将抗原-MHC复合物移动到细胞表面，在那里与它可与T细胞相互作用，并以各种方式激活T细胞。任何细胞损伤都会通过不同方式释放出刺激免疫系统的辅助因子。一般来说，坏死的细胞会比凋亡的细胞刺激更大的免疫反应。因此，将免疫细胞长期暴露于已经死亡或正在死亡的细胞有可能导致自身性免疫疾病。
在某些方面，应该了解，低基本NO导致纤维性肥大。一旦清除死亡细胞后，新的细胞无法轻易取代其位置，因为没有足够O2的支持。任何此类新的细胞将遭遇相同宿命。空间可保持空置，其这种情况下，器官萎缩，毛细血管彼此靠的更紧，现在新的细胞被由正在死亡的细胞剥夺先前产生的VEGF，所以毛细血管消失，并重新形成缺氧区。这可导致受影响的组织全面萎缩。在支持纤维化的组织中，相对惰性的胶原纤维可填充空间。因为身体对正在讨论的特定器官的代谢需求没有降低，器官就试图变大，但现在有着大量纤维含量。这可导致纤维性肥大，例如心脏和肝脏的纤维化肥大。一些器官如脑无法变大或变小，因为神经和血管的三维连通性很重要，且无法连续并同时地映射到不对称萎缩的脑上。空间必须充满着物质，且β-淀粉可能会成为(不太惰性的)空间填充物。肾脏因为肾囊而无法变大，所以活细胞的数量变少，且它们被纤维化组织替代。如果死亡细胞被清除，组织萎缩，而且NO/O2的比例又下降，且毛细血管又变稀薄。这就形成以下疾病的恶性循环：终末期肾病、充血性心力衰竭/心脏肥大、原发性胆汁性肝硬化、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、发炎性肠病、瘢痕增生、和以雷诺现象开始并以全身性硬化和原发性干燥綜合征结束的多种结缔组织疾病，其中还观察到毛细血管稀薄。Ferrini等人已表明，由于用L-NAME造成的NOS的慢性抑制引起的基础NO水平的降低导致了心脏和肾脏的全面纤维化。(Antifibrotic Role ofInducible Nitric Oxide Synthase.Nitirc Oxide:Biology and Chemistry第6卷，第3期，第283–294页(2002)。)可能是低基础NO导致了纤维性肥大。
在某些方面，应该了解，毛细血管稀薄影响受试者控制食欲的能力。在老人和动物的脑中观察到毛细血管稀薄。毛细血管稀薄与循环生长因子(包括胰岛素样生长因子-1)的下降相关。成人脑中的神经形成与血管生成相配合。因为脑调节许多稳态功能，为控制脑成分，毛细血管间的扩散长度增加可“理解”为那些物质的血液浓度不足。脑中葡萄糖的通量相当接近正常代谢需求，其中葡萄糖通量只比葡萄糖消耗大50至75％，且跨血脑屏障的葡萄糖转运体可以是饱和的，甾类特异性的，且不依赖于能量或离子梯度。胃口的大部分调节通过脑介导，且毛细血管稀薄可导致“营养物质”(或与“营养物质”成比例的标记化合物)的充足血液浓度被解读为不充足。这可能是肥胖症的一个原因。
根据某些方面，应该了解，毛细血管稀薄可以是非胰岛素依赖型糖尿病的原因。非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)也称为代谢綜合征或第2型糖尿病，特征为胰岛素抗性。身体对胰岛素的敏感性降低，且胰岛素水平增加。患有NIDDM的人具有高血液葡萄糖、高血液三甘油酯，通常很肥胖，有高血压，且通常具有大量内脏脂肪。
NIDDM伴有其它症状，毛细血管稀薄可能为原因。在研究40名患有或不患有NIDDM、肥胖症(BMI 29)和消瘦病(lean)(BMI 24)(每种10名)的男性时，Konrad等人报道，对于不患NIDDM的消瘦男性、不患NIDDM的肥胖男性、患有NIDDM的消瘦男性、患有NIDDM的肥胖男性，休息时的血液乳酸水平分别为1.78、2.26、2.42和2.76(mM/L)。(Α-Lipoic acidtreatment decreases serum lactate and pyruvate concentrations and improvesglucose effectiveness in lean and obese patients with type 2diabetes。DiabetesCare 22:280-287,1999。)乳酸是无氧糖酵解的量度。当O2不足以通过氧化磷酸化生成ATP时，细胞可通过无氧糖酵解产生ATP。无氧糖酵解的产物之一是乳酸，乳酸必须从细胞排出，否则pH下降，且功能受损。血液乳酸通常在运动研究中测到，其中增加暗示了可完成最大氧化工作的工作负荷。在休息时较高的乳酸水平将指示休息时无氧糖酵解增加，这与毛细血管稀薄相一致。
原发性胆汁性肝硬化与雷诺现象、瘙痒症、干燥綜合征、骨质疏松、门静脉血压过高、神经病和胰功能不全相关，且肝功能异常与风湿性疾病相关。肝酶升高是肝炎症的症状，肝酶升高是作为“无症状”原发性胆汁性肝硬化的早期症状观察到。因此，本文所述细菌可用于治疗肝炎症。
Torre等人已经报道，阿尔茨海默病(AD)是微血管疾病，伴随着低灌注激发的神经性退化，这部分是由一氧化氮不足导致的。(Review:Evidence that Alzheimer’s diseaseis a microvascular disorder:the role of constitutive nitric oxide,BrainResearch Reviews 34(2000)119-136。)因此，本文所述细菌可用于治疗AD。
与高血压相关的不利健康影响也可以是低基础NO的结果。对血管舒张的反应下降也与低基础NO相一致。NO是从来源扩散到传感器位置的可扩散分子，NO在传感器位置具有信号传递效果。因为NO水平低，每个NO来源必须产生较多NO来生成与某一距离的某一强度相等的NO信号。NO在三个维度扩散，且所述扩散范围内的全部体积必须提升至将在传感器位置给出适当信号的水平。这可在来源处和来源与传感器之间导致较高NO水平。接近来源的NO高NO的不利局部效果可由过低NO背景引起。有一些证据表明实际上发生这种情况。在大鼠胰岛中，Henningsson等人已报道，用L-NAME抑制NOS通过诱导iNO增加总NO生产。(Chronic blockade of NO synthase paradoxically increases islet NO productionand modulates islet hormone release。Am J Physiol Endocrinol Metab 279:E95–E107,2000。)通过增加NOS活性增加NO将只能在一定限度下起作用。当NOS被活化但未供应足够四氢生物喋呤(BH4)或L-精氨酸时，其“解偶联”并生成超氧化物(O2-)而非NO。这个O2 -随即可以破坏NO。试图以超过供应BH4或L-精氨酸的速率生产NO反而降低NO水平。这可导致正反馈，低的NO水平由于NOS的刺激而变得更糟糕，且解偶联的NOS生成大量的O2 -，造成局部活性氧物质(ROS)损伤，如在动脉粥样硬化、终末期肾病、阿尔兹海默病和糖尿病中所观察到的那样。
本文所述细菌也可以用于延迟衰老迹象。热量限制延长寿命，且Holloszy报道，限制食物摄入至随意对照的70％，将静坐大鼠的寿命从858天延长至1,051天，延长几乎25％。(Mortality rate and longevity of food restricted exercising male rats:areevaluation.J.Appl.Physiol.82(2):399–403,1997。)热量限制与延长寿命之间的联系已被确立，然而，原因机制并不清楚。Lopez-Torres等人报道，检查大鼠中肝线粒体酶表明，H2O2的生产由于与热量限制相关的复合物I活性降低而减少。(Influence Of Aging AndLong-Term Caloric Restriction On Oxygen Radical Generation And Oxidative DNADamage In Rat Liver Mitochondria。Free Radical Biology&Medicine第32卷第9期第882-8899页，2002。)H2O2是由O2 -歧化产生，它是在呼气作用期间由线粒体生产的主要ROS。Kushareva等人和其他人提出，O2 -的主要来源是复合物I，它通过来自复合物III(琥珀酸盐还原位点)的电子逆流催化NAD/NADH氧化还原对。提出的老化自由基理论假定，自由基对细胞DNA、抗氧化剂系统和DNA修复系统的伤害随着年龄累积，且当关键系统的损伤到无法修复的程度，随即死亡。(The Free Radical Theory of Aging Matures.Physiol.Rev.78:547–581,1998。)
作为另一机制，Vasa等人已经证实，NO激活端粒酶并延缓内皮细胞衰老。(NitricOxide Activates Telomerase and Delays Endothelial Cell Senescence.CircRes.2000；87:540-542。)低基础NO将通过解除细胞色素氧化酶抑制来增加基础代谢速率。增加的基础代谢还将增加细胞再生和生长速率。毛细血管稀薄通过诱导慢性缺氧可增加自由基损伤，且还可增加细胞再生，且因此通过两种机制加速老化。
在一些方面，应该了解自养氨氧化细菌可产生过敏和自身性免疫疾病的保护方面。最为人所知的自身免疫疾病可能是第1型糖尿病，它是由通过免疫系统破坏胰腺中的产胰岛素细胞引起的。复发性流产也与自身性免疫疾病相关，其中阳性自体免疫抗体的数量与复发性流产的次数呈正相关。全身性硬化、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、和各种风湿病是自身性免疫疾病的其它实例。观察到，施用AOB减少过敏、枯草热，如WO/2005/030147中所述。
AOB借以对过敏和自身性免疫疾病发挥保护作用的一个机制是通过产生一氧化氮，主要是通过调节抑制NF-КB和防止免疫细胞活化和诱导炎症反应。NF-КB是上调基因表达的转录因子，且这些基因中的许多与炎症和免疫反应相关，包括导致释放细胞因子、趋化因子和各种粘附因子。这些各种免疫因子导致免疫细胞迁移到它们的释放位点，导致炎症反应。已显示，组成型NO生产通过防止IКBα降解稳定IКBα(NF-КB的抑制剂)而抑制NF-КB。
Xu等人已证实，施用NO供体防止大鼠中实验性过敏性脑脊髓炎的发展。(SIN-1,aNitric Oxide Donor,Ameliorates Experimental Allergic Encephalomyelitis inLewis Rats in the Incipient Phase:The Importance of the Time Window。TheJournal of Immunology,2001,166:5810–5816。)在此研究中，已证实，施用NO供体减少巨噬细胞浸润中枢神经系统，减少血液单核细胞增生，并增加血液单核细胞凋亡。所有这些结果都被认为降低了诱导免疫反应的程度和严重性。
低基础NO可通过以下机制导致自闭症，所述机制为由于基础一氧化氮不足，不足以在脑中形成新的连接。尽管不希望限制于理论，但在一些实施方案中，通过NO调节神经连接的形成。在这些情况下，任何降低NO扩散范围的条件都可以减小可经历连接的脑要素的体积尺寸。在低基础NO水平条件下发育的脑可布置在小体积要素中，因为NO的有效范围减小。
自闭症个体中呈现的其它症状也可以将低NO指定为病因，包括音高辨别增加、肠道紊乱、免疫系统异常、脑血流量减少、脑葡萄糖消耗增加、血浆乳酸增加、依附障碍和哼唱。这些症状中的每一种都可以归因于低基础NO水平。
Takashi Ohnishi等人已经报道，自闭症个体的血流量减少。Takashi Ohnishi等人，Abnormal regional cerebral blood flow in childhood autism.Brain(2000),123,1838-1844。J.M.Rumsey等人已报道，自闭症个体的葡萄糖消耗增加。Rumsey JM,Duara R,Grady C,Rapoport JL,Margolin RA,Rapoport SI,Cutler NR。自闭症的脑代谢。用正电子发射断层扫描测量静息脑葡萄糖利用率。Arch Gen Psychiatry,1985年5月；42(5):448-55(摘要)。D.C.Chugani已报道，自闭症个体的血浆乳酸水平增加。Chugani DC等人，Evidenceof altered energy metabolism in autistic children。Prog NeuropsychopharmacolBiol Psychiatry.1999年5月；23(4):635-41。出现这些效果可能是脑中毛细血管稀薄的结果，脑中毛细血管稀薄可减少血流量和O2供应，使得脑的一些代谢负荷可通过糖酵解而非氧化磷酸化产生。
B.A.Klyachko等人已经证实，一氧化氮通过离子通道的cGMP修饰增加后超级化而增加神经元的兴奋性。Vitaly A.Klyachko等人，cGMP-mediated facilitation in nerveterminals by enhancement of the spike after hyperpolarization。Neuron，第31卷，1015-1025,September27,2001。C.Sandie等人已经表明，抑制NOS减少吃惊。Carmen Sandi等人，Decreased spontaneous motor activity and startle response in nitricoxide synthase inhibitor-treated rats。European journal of pharmacology 277(1995)89-97。已经利用自发性高血压大鼠(SHR)和那不勒斯高兴奋(NHE)大鼠建立注意力缺陷多动障碍(ADHD)模型。Raffaele Aspide等人已经表明，这两个模型在急性NOS抑制期间的注意力缺陷加剧。Raffaele Aspide等人，Non-selective attention and nitricoxide in putative animal models of attention-deficit hyperactivity disorder。Behavioral Brain Research 95(1998)123-133.因此，本文的细菌可用于治疗ADHD。
M.R.Dzoljic还表明抑制NOS可抑制睡眠。M.R.Dzoljic,R.de Vries,R.vanLeeuwen.Sleep and nitric oxide:effects of 7-nitro indazole,inhibitor of brainnitric oxide synthase。Brain Research 718(1996)145-150。G.Zoccoli已经报道，当NOS受到抑制时，睡眠期间的多个生理作用被改变，包括眼球快速运动和脑循环的睡眠-清醒区别。G.Zoccoli等人，Nitric oxide inhibition abolishes sleep-wake differences incerebral circulation.Am.J.Physiol.Heart Circ Physiol 280:H2598-2606,2001。L.Kapas等人已表明，NO供体促进非-REM睡眠，然而，这些增加比NO供体的持续时间持续长得多的时间，暗示可能是反弹效应。Levente Kapas等人Nitric oxide donors SIN-1andSNAP promote nonrapid-eye-movement sleep in rats。Brain Research Bullitin，第41卷，第5期，第293-298页，1996。M.Rosaria等人，Central NO facilitates both penileerection and yawning。Maria Rosaria Melis and Antonio Argiolas。Role of centralnitric oxide in the control of penile erection and yawning。Prog Neuro-Psychopharmacol&Biol.Phychiat.1997，第21卷，第899-922页。P.Tani等人已报道，失眠常见于患有亚斯伯格氏綜合征(Asperger’s)的成人中。Pekka Tani等人，Insomnia is afrequent finding in adults with Asperger's syndrome。BMC Psychiatry 2003,3:12。Y.Hoshino还在自闭症儿童中观察到睡眠障碍。Hoshino Y,Watanabe H,Yashima Y,KanekoM,Kumashiro H.An investigation on sleep disturbance of autistic children。Folia Psychiatr Neurol Jpn.1984；38(1):45-51。(摘要)K.A.Schreck等人观察到，睡眠障碍的严重性与自闭症症状的严重性相关。Schreck KA等人，Sleep problems aspossible predictors of intensified symptoms of autism。Res Dev Disabil.2004年1月-2月；25(1):57-66。(摘要)。因此，本文的细菌可用于治疗失眠。
W.D.Ratnasooriya等人报道，抑制雄性大鼠中的NOS减少性交前活动，减少性欲，并降低能育性。W.D.Ratnasooriya等人，Reduction in libido and fertility of malerats by administration of the nitric oxide(NO)synthase inhibitor N-nitro-L-arginine methyl ester。International journal of andrology,23:187-191(2000)。
许多看似截然不同的以ATP耗竭和最终器官衰竭为特征的病症实际上可能是由一氧化氮匮乏(nitropenia)“引起”，由基础一氧化氮的全身缺乏引起。当这种情况出现在心脏中时，结果是扩张型心肌病。当这种情况出现在脑中时，结果是白质高信号、阿尔茨海默病、血管性抑郁、血管性痴呆、帕金森氏症和路易体痴呆。当这种情况出现在肾脏中时，结果为终末期肾病，当这种情况出现在肝脏中时，结果为原发性胆汁性肝硬化。当这种情况出现在肌肉中时，结果为纤维肌痛、海湾战争綜合征或慢性疲劳综合症。当这种情况出现在肠中时，结果为缺血性肠病。当这种情况出现在胰脏中时，结果为首先第2型糖尿病，接着为胰脏慢性炎症，接着为胰脏的自身免疫攻击(或胰脏癌)，接着为第1型糖尿病。当这种情况出现在结缔组织中时，结果为全身性硬化。
在终末期肾病放入残肾模型中，部分肾被移除，(无论是外科手术或是毒素)，这样增加对剩余部分的代谢负荷。生成超氧化物以降低NO，并增加O2扩散至肾线粒体中。长期超负荷导致进行性肾毛细血管稀薄和进行性肾衰竭。在急性肾衰竭中，给人透析可让肾“休息”，并允许其恢复。在由横纹肌溶解(将肌红蛋白释放至血流中的肌肉损伤)诱导的急性肾衰竭中，肾损伤是以缺血性损伤为特征。肌红蛋白清除NO，就如同血红蛋白一样，且将在肾脏中引起血管收缩，导致局部缺血。肌红蛋白也将诱导局部一氧化氮匮乏和一连串事件，导致进一步ATP耗竭。
在一些方面，低NO水平导致线粒体生物发生减少。在减少的线粒体密度下生产相同ATP将导致O2消耗增加，或基础代谢速率加快。在许多病状中观察到加快的基础代谢速率，包括：镰状细胞性贫血、充血性心力衰竭、糖尿病、肝硬化、克罗恩病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、肥胖症、终末期肾病、阿尔茨海默病和慢性阻塞性肺病。
虽然一定程度增加的O2消耗可被高效利用，但在这些病状中的许多中，解偶联蛋白也向上调节，表明至少部分增加的代谢速率是由低效率引起。解偶联蛋白已知被向上调节的病状包括肥胖症和糖尿病。
随着较少线粒体将O2消耗至较低O2浓度，驱动O2扩散的O2梯度较大，所以O2扩散路径长度可增加，导致毛细血管稀薄，在扩张型心肌病、高血压、第2型糖尿病和肾性高血压中观察到毛细血管稀薄。
铜，不管作为Cu2+或血浆铜蓝蛋白(CP)(主要的含铜血清蛋白，在成人血清中以0.38g/L存在，也就是0.32％的Cu，且包含94％的血清铜)催化从NO和含硫巯基基团(RSH)形成S-NO-硫醇。血浆的Cu含量是可变的，且在感染条件下增加。Berger等人报道，烧伤渗出物的Cu和Zn含量相当多，1/3皮肤烧伤的患者在7天内损失20至40％正常身体Cu和5至10％的Zn含量。(Cutaneous copper and zinc losses in burns.Burns.1992年10月；18(5):373-80。)如果患者皮肤被AOB寄居，包含AOB需要的尿素和Fe、Cu和Zn的伤口渗出物将被转化为NO和亚硝酸盐，通过iNOS大大增补NO的局部生产，而不消耗代谢激发伤口中的来源(诸如O2和L-精氨酸)。预期，伤口表面上的AOB造成的高NO和亚硝酸盐生产抑制感染，特别抑制厌氧细菌如梭菌感染，所述厌氧细菌导致破伤风、气性坏疽和肉毒中毒。
除非另有指示，否则本发明的实施可采用本领域的技术范围内的常规免疫学方法、分子生物学和重组DNA技术。文献中全面阐释此类技术。参见例如Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(最新版本)；和Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等人编，现行版)。
8.来自亚硝化单胞菌的核酸和蛋白质
本公开尤其提供了与在菌株D23中发现的蛋白质和核酸相同或相似的蛋白质和核酸(任选为分离的蛋白质和核酸)。虽然不希望受理论的束缚，但据信D23的测序菌株由于在实验室中的长时间的培养和选择而具有非天然存在的蛋白质和核酸序列。
这些核酸和蛋白质具有多种用途。例如，所述蛋白质可以用于产生抗体或检测菌株D23或相关菌株的其它结合分子。所述蛋白质还可以用于进行在高NH4 +条件下的反应，因为D23适于在这些条件下的生长和代谢。作为另一个实例，所述核酸可以用来产生用于生成抗体或进行如上所述的反应的蛋白质。所述核酸还可以用于检测菌株D23或相关菌株，例如，使用微阵列或另一种基于杂交的分析。
菌株D23的基因组被作为SEQ ID NO:1提供。基因组注释(包括SEQ ID NO:1内的基因的位置和取向)作为补充表1来提供。因此，本公开提供了与补充表1中所列的基因相同或相似的基因和蛋白质。
因此，本公开提供了包含补充表1中的基因的序列的核酸(例如，分离的核酸)，以及由所述基因编码的蛋白质。在某些实施方案中，所述核酸包含与补充表1中的基因相似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的序列，或由所述基因编码的蛋白质。本公开还提供了一种包含核酸或由所述核酸编码的一种或多种蛋白质的组合物，所述核酸为补充表1中的至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、50个、100个、200个、500个、1,000个、1,500个、2,000个、2,500个或所有序列或与其相似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的序列。还提供了所述核酸和蛋白质的片段。
本公开还尤其提供了存在于菌株D23中且菌株C91中缺少的一种或多种基因或蛋白质，或与所述基因或蛋白质中的一个相似的基因或蛋白质。这些基因的实例列于图6-8中并且更详细地描述于本文的实施例4中。下文描述了这些基因和蛋白质的实例，以及与其相似的基因和蛋白质。
因此，就图6来说，本申请公开了与图6中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个或所有序列相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的核酸。本申请还公开了与由图6中列出的基因编码的1种、2种、3种、4种、5种、10种、15种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、110种、120种、130种、140种、150种、160种或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的蛋白质。此外，本申请公开了这些基因和蛋白质的片段，例如0-20个、20-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1000个或多于1000个核苷酸或氨基酸的片段。在一些实施方案中，将多个上述基因或蛋白质固定在固体载体上，例如以形成微阵列。
就图7来说，本申请公开了与图7中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个或所有序列相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的核酸。本申请还公开了与由图7中列出的基因编码的1种、2种、3种、4种、5种、10种、15种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、110种、120种、130种、140种、150种、160种或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的蛋白质。此外，本申请公开了这些基因和蛋白质的片段，例如0-20个、20-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1000个或多于1000个核苷酸或氨基酸的片段。在一些实施方案中，将多个上述基因或蛋白质固定在固体载体上，例如以形成微阵列。
就图8来说，本申请公开了与图8中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个或所有序列相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的核酸。本申请还公开了与由图8中列出的基因编码的1种、2种、3种、4种、5种、10种、15种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、110种、120种、130种、140种、150种、200种或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的蛋白质。此外，本申请公开了这些基因和蛋白质的片段，例如0-20个、20-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1000个或多于1000个核苷酸或氨基酸的片段。在一些实施方案中，将多个上述基因或蛋白质固定在固体载体上，例如以形成微阵列。
就图6-8总体来说，本申请公开了与图6-8中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、40个、60个、80个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个或所有序列相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的核酸。本申请公开了与由图6-8中列出的基因编码的1种、2种、3种、4种、5种、10种、20种、40种、60种、80种、100种、150种、200种、250种、300种、350种、400种、450种、500种或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同)的蛋白质。此外，本申请公开了这些基因和蛋白质的片段，例如1-20个、20-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1000个或多于1000个核苷酸或氨基酸的片段。在一些实施方案中，将多个上述基因或蛋白质固定在固体载体上，例如以形成微阵列。
本公开还提供了作为SEQ ID NO:1的片段的核酸序列。所述片段的长度可以是例如1-20个、20-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1000个、1,000-2,000个、2,000-5,000个或10,000个或更多个核苷酸。所述片段还可以与SEQ ID NO:1或其补体的相应部分具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。所述片段还可以是与SEQ ID NO:1或与D23菌株(在2014年4月8日保藏于ATCC专利保藏所，被ATCC命名为AOBD23-100，登录号为PTA-121157)的基因组或其补体在本文所述的低严格度、中等严格度、高严格度或极高严格度或其它杂交条件下杂交的片段。
本公开还提供了在表1(其描述参与氨代谢的基因)中列出的核酸序列。因此，在一些方面，本申请公开了与表1中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或所有基因相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同)的基因。在实施方案中，本申请公开了与表1中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或所有蛋白质相同或类似(例如，至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同)的蛋白质。
表1的核酸序列的比对显示C91和D23中的同源物之间的百分比同一性。以下段落讨论该百分比同一性并且描述与表1的D23基因具有同源性的各种核酸。
更具体地说，amoA1基因为约98.8％相同(即，在821/831个位置)。因此，在一些实施方案中，amoA1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoA1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoA1核酸包含与D23amoA1基因至少约98.8％、98.9％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
amoA2基因为约98.8％相同(即，在821/831个位置)。因此，在一些实施方案中，amoA2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoA2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoA2核酸包含与D23amoA2基因至少约98.8％、98.9％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
amoB1基因为约99.1％相同(即，在1255/1266个位置)。因此，在一些实施方案中，amoB1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoB1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoB1核酸包含与D23amoB1基因至少约99.1％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
amoB2基因为约99.1％相同(即，在1254/1266个位置)。因此，在一些实施方案中，amoB2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoB2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoB2核酸包含与D23amoB2基因至少约99.1％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
amoC1基因为约99.8％相同(即，在814/816个位置)。因此，在一些实施方案中，amoC1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoC1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoC1核酸包含与D23amoC1基因至少约99.8％、99.9％或100％相同的序列。
amoC2基因为约99.8％相同(即，在814/816个位置)。因此，在一些实施方案中，amoC2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoC2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoC2核酸包含与D23amoC2基因至少约99.8％、99.9％或100％相同的序列。
amoC3基因为约98.9％相同(即，在816/825个位置)。因此，在一些实施方案中，amoC3核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoC3核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，amoC3核酸包含与D23amoC3基因至少约98.9％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
hao1基因为约99.0％相同(即，在1696/1713个位置)。因此，在一些实施方案中，hao1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，hao1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，hao1核酸包含与D23hao1基因至少约99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
hao2基因为约99.4％相同(即，在1702/1713个位置)。因此，在一些实施方案中，hao2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，hao2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，hao2核酸包含与D23hao2基因至少约99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
hao3基因为约99.2％相同(即，在1700/1713个位置)。因此，在一些实施方案中，hao3核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，hao3核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，hao3核酸包含与D23hao3基因至少约99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
cycA1基因为约98.0％相同(即，在694/708个位置)。因此，在一些实施方案中，cycA1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，cycA1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，所述cycA1核酸包含与D23cycA1基因至少约98.0％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
cycA2基因为约98.7％相同(即，在699/708个位置)。因此，在一些实施方案中，cycA2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，cycA2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，cycA2核酸包含与D23cycA2基因至少约98.7％、98.8％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
cycA3基因为约99.3％相同(即，在703/708个位置)。因此，在一些实施方案中，cycA3核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，cycA3核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，cycA3核酸包含与D23cycA3基因至少约99.3％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
cycB1基因为约96.7％相同(即，在696/720个位置)。因此，在一些实施方案中，cycB1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，cycB1核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，所述cycB1核酸包含与D23cycB1基因至少约96.7％、96.8％、97.0％、97.2％、97.4％、97.6％、97.8％、98.0％、98.2％、98.4％、98.4％、98.6％、98.8％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
cycB2基因为约97.1％相同(即，在702/723个位置)。因此，在一些实施方案中，cycB2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，cycB2核酸包含该基因在菌株C91和D23之间有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或所有位置存在差异的D23核苷酸。在实施方案中，所述cycB2核酸包含与D23cycB2基因至少约97.1％、97.2％、97.4％、97.6％、97.8％、98.0％、98.2％、98.4％、98.4％、98.6％、98.8％、99.0％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％相同的序列。
本文进一步提供了包括本文所述的核苷酸序列的载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码本文所述的蛋白质的核苷酸。所述载体包括但不限于：病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。此类载体可以包括启动子、有或没有内含子的开放阅读框以及终止信号。
本公开还提供了包含如本文所述的核酸或编码如本文所述的蛋白质的核酸的宿主细胞。
在某些实施方案中，通过使用表达盒对所述宿主细胞进行基因改造。短语“表达盒”是指核苷酸序列，其能够影响基因在与这些序列相容的宿主中的表达。此类盒可以包括启动子、有或没有内含子的开放阅读框以及终止信号。还可以使用对于实现表达是必要的或有助于实现表达的其它因素，如(例如)诱导型启动子。
本公开还提供了包含本文所述的载体的宿主细胞。
所述细胞可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人类细胞。如果所述细胞是细菌细胞，那么它可以是例如大肠杆菌或氨氧化细菌如亚硝化单胞菌属(例如，亚硝化单胞菌或欧洲亚硝化单胞菌)、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属和亚硝化弧菌属。
9.用氨氧化细菌调节皮肤微生物组
本公开提供了用于改变皮肤微生物组(例如，人类皮肤微生物组)的系统和方法。所述系统和方法可以提供例如涉及皮肤的感染或病症(例如，皮肤感染和/或皮肤病症)的治疗。
亚硝化单胞菌属的氨氧化细菌(AOB)是革兰氏阴性专性自养菌，其具有只从作为能量来源的氨产生亚硝酸盐和一氧化氮的独特能力。它们在土壤和水环境中均广泛存在并且是环境硝化过程的重要组分。由于人类皮肤上的亚硝酸盐和一氧化氮作为若干生理功能(如血管舒张、皮肤炎症和伤口愈合)的重要组分的作用，这些细菌对于健康的皮肤状况和免疫病理性皮肤状况都可以具有有益性质。这些细菌可以在人类中安全使用，因为它们生长缓慢，无法在有机碳源上生长，可以对皂类和抗生素敏感，并且从未与动物或人类中的任何疾病或感染有关。
对受试者(例如，人类受试者)局部施用氨氧化细菌可以导致皮肤微生物组发生出乎意料的变化，并且更具体地说，它可以导致正常的共生非致病性物种的比例增加以及潜在致病性的、致病性的或引起疾病的生物体的比例减少。
实施例
实施例1.亚硝化单胞菌的初始培养
如WO/2003/057380中所述将富含各种氨氧化细菌的土壤源性培养基施加到成年男性受试者皮肤上。针对具有长时间定植人类皮肤能力的菌株选择在人体上生长期。几个月后，从个体皮肤重新分离菌株，并如后续实施例中所述在实验室条件下培养较长时间。尽管不受理论的束缚，据信，针对改善菌株性质，例如提高对高氨条件的耐受性的新突变选择持续实验室培养物。
实施例2.培养和监控D23或含D23的菌株混合物
培养条件
D23可分批培养或在生物反应器中通过连续培养进行培养。分批制备使用表3的培养基。
表3.用于分批培养的生长培养基：
表3的培养基接种约15ml 3天大的D23培养物(即1％体积)。在30℃下，通过以200rpm振荡在黑暗中培养培养物。
通常，亚硝化单胞菌D23混合培养物培养在完全欧洲亚硝化单胞菌培养基中。下文描述培养基，且关于培养氨氧化细菌的其它细节可在万维网nitrificationnetwork.org/Nerecipe.php获取，Ensign等人，1993和Stein&Arp,1998。
步骤1.
向2升锥形瓶添加900ml去离子水。
依次添加：
3.3g(NH4)2SO4(50mM)；
0.41g KH2PO4
0.75ml 1M MgSO4原液
0.2ml 1M CaCl2原液
0.33ml 30mM FeSO4/50mM EDTA原液
0.01ml 50mM CuSO4原液
通过高压灭菌给溶液灭菌。
步骤2.
向烧杯添加400ml去离子水。添加：
27.22g KH2PO4
2.4g NaH2PO4
用10N NaOH将pH调整为8.0，并用去离子水将最终体积变成500ml。
在250-500ml锥形瓶中通过高压灭菌给溶液的100ml馏分灭菌。
步骤3
制备500ml 5％(w/v)Na2CO3(无水)
通过高压灭菌给溶液灭菌。
步骤4
向步骤1中准备的烧瓶添加步骤2中制备的溶液的1x 100ml等分试样。
步骤5
向步骤1中准备的烧瓶添加8ml步骤3中制备的溶液。
D23也可以在生物反应器中连续培养。表4描述合适培养基。
表4.用于连续培养的生长培养基：
生物反应器容器中的分批培养基接种约10ml 3天大的亚硝化单胞菌D23培养物(即1％体积)。使用7.5％Na2CO3将pH调整至7.6。生物反应器以分批模式运行，参数如下：pH：7.6(下限：7.45&上限：7.8)，温度：28℃(下限：25℃&上限：32℃)，DO(溶解氧)：45％(下限：10％，上限：100％)，搅拌器：550rpm。
生物反应器中的培养物的OD600nm在3-4天达到0.15至0.18。此时，培养物消耗存在于AOB生长培养基中的大部分50mM NH4+，使用者应该开始以0.59ml/min(约10％)给生物反应器馈送馈送溶液。流出泵也应该打开，0.59ml/min(约10％)。生物反应器的OD600nm在1-2天连续培养内达到0.5–0.6。通过将1ml生物反应器流出物接种在LB板上测试生物反应器中的培养物的异养污染物。
监测亚硝化单胞菌D23的生长
通过测量培养物的OD600nm监测亚硝化单胞菌D23细胞的生长。由OD600nm测量的分批培养物的典型生长在0.06与0.08之间。
AOB生长培养基包含由亚硝化单胞菌D23按化学计量转化为NO2 -的NH4+。监测亚硝化单胞菌生长的另一种反式是追踪生长培养基中亚硝酸根(NO2 -)的释放。用格里斯试剂、磺胺和N-萘基乙二胺(也称为NNEQ)测定NO2-浓度。简而言之，将磺胺和NNEQ添加至样品和已知浓度的制作标准曲线的亚硝酸钠。样品在黑暗中培养30分钟。在540nm下读取吸光度。
追踪亚硝酸盐生产的另一种方式是通过使用分光光度计，监测352nm与400nm间的光密度(OD)差异。利用0.0225mM-1的毫摩尔消光系数测定亚硝酸盐浓度。这项分析可通过获取具有细胞的培养基样品来进行。
NO2-浓度(mM)＝(OD352-OD400)/0.0225
通过测量600nm下的光密度(OD600nm)和测量亚硝酸根(NO2 -)监测含D23的混合培养物的生长，并将生长速率示于图1和2中。图1示出，600nm波长下的光密度在3至4天后在略低于0.1下达到平衡。图2A示出，所产生的亚硝酸盐的量在3至4天后在略低于25mM下达到平衡。培养物中的NO2 -浓度以比色测定法通过格里斯试剂(Hageman&Hucklesby,1971)测定，并用作生长速率和生长期的第二指示物，因为NO2 -的累积一贯地与生长期间的细胞质量的增加成比例。
在图2B-I中，将渐增密度的从连续培养物收获的D23悬浮在补充有50mM NH4 +的培养基中，并在30℃下振荡培养48小时。在所示时间点下，在上清液样品中利用格氏分析法测量亚硝酸盐生产。所示结果为三个独立实验的平均值±SD。
在2B-II中。示出了亚硝化单胞菌D23的体外亚硝酸盐生产。将渐增密度的D23悬浮在补充有50mM NH4 +的无机盐培养基，并在30℃下振荡培养24小时。在所示时间点下，在上清液样品中利用格氏分析法测量亚硝酸盐生产。
储存条件
得自连续培养系统的亚硝化单胞菌悬浮液在4℃下示出卓越稳定性达几个月，这是由在分批生长条件下传代培养时产生的高度一致亚硝酸盐浓度所指示。下文列出储存和回收亚硝化单胞菌的方案。
获得500ml培养至后指数期的亚硝化单胞菌D23培养物(在连续培养物中，OD600＝0.5–0.6)。在20℃下以10,000x g离心15min。移除上清液，并将球团重新悬浮在50ml AOB储存缓冲液中。如上进行离心沉降。移除上清液，并完全重新悬浮在总共50ml储存缓冲液中。这将成为10x AOB原液。在4℃下竖直储存在50ml聚丙烯管中。
AOB储存缓冲液(对于AOB储存，在4℃下)：50mM Na2HPO4-2mM MgCl2(pH 7.6)可如下制备。
在1升ddH2O中：Na2HPO4–7.098g
MgCl2–0.1904g
将pH调整为7.6。过滤-灭菌。
亚硝化单胞菌可如下冷冻保存。将1.25ml亚硝化单胞菌D23对数中期培养物转移到2ml冷冻管和0.75ml无菌80％甘油。轻轻地振荡管，在室温下培养15min，以使得细胞摄入冷冻保护剂。然后，将管直接放入-80℃冷冻机中进行冷冻和储存。为使培养物复活，使冷冻原液在冰上解冻10-20分钟。在4℃下以8,000x g离心3分钟。弃去上清液，并通过将球团悬浮在2ml AOB培养基中清洗，然后在4℃下以8,000x g离心3分钟，以减轻冷冻保护剂在后续生长实验中的潜在毒性。弃去上清液，并将球团重新悬浮在2ml AOB培养基中，接种在50ml含50mM NH4 +的AOB培养基中，并在30℃下，在黑暗中以200rpm振荡培养。
在图2C中，研究在4℃下储存时的稳定性。以109CFU/ml将先前从连续培养中收获并储存在4℃下的亚硝化单胞菌D23接种在补充有50mM NH4 +的无机盐培养基中，并在30℃下培养。在接种24和48小时后测定亚硝酸盐生产(分别为左图和右图)。所示数据为在6个月时间内重复取样的D23悬浮液的代表。
实施例3.建立纯性D23培养物
为在纯培养物中分离亚硝化单胞菌D23，制备四类培养基(下文描述)，高压灭菌，并倾倒到板中。将无菌尼龙膜放在板上。
欧洲亚硝化单胞菌培养基+1.2％R2A琼脂
欧洲亚硝化单胞菌培养基+1.2％琼脂
欧洲亚硝化单胞菌培养基+1.2％琼脂糖
欧洲亚硝化单胞菌培养基+1.2％琼脂糖+0.3g/L丙酮酸
将3天大亚硝化单胞菌D23培养物划线接种在尼龙膜上，并在30℃下培养板。每天监测板的红色亚硝化单胞菌细胞的生长。将尼龙膜转移到新的板上，一周一次。
在1周结束时在具有R2A琼脂或琼脂的板上出现淡红色集落。从具有R2A琼脂的板挑取单个集落，并在欧洲亚硝化单胞菌培养基中培养。培养物在6天内很好地长到0.08OD600nm。在将培养物涂铺在LB-琼脂板上时出现异养集落。
在2周结束时在具有R2A琼脂、琼脂、琼脂糖或琼脂糖+丙酮酸的板上出现淡红色集落。从具有琼脂或琼脂糖的板挑取单个集落，并在欧洲亚硝化单胞菌培养基中培养。培养物在6-8天内很好地长到0.08OD600nm。在将培养物涂铺在LB-琼脂板上时出现异养集落。
在4周结束时在具有R2A琼脂、琼脂、琼脂糖或琼脂糖+丙酮酸的板上出现亮红色集落。从具有琼脂糖的板挑取单个集落，并在欧洲亚硝化单胞菌培养基中培养。培养物在6-8天内很好地长到0.08OD600nm。在将培养物涂铺在LB-琼脂板上时出现白色集落。
通过培养、以PCR扩增16S rRNA并给PCR产物测序，鉴别受污染的细菌(例如，存在于混合培养物中的非亚硝化单胞菌)。经鉴定，污染物为细杆菌属物种(Microbacteriumsp.)和产碱杆菌(Alcaligenaceae bacterium)。
为形成D23的纯性培养物(即，无污染细菌)，使用连续稀释。挑选八个单一集落(指定为A-H)，并将每个集落置于10ml N.europae培养基培养物中。对于每个培养物，形成五个连续1:10稀释液。对于每个培养物A-H，在两个或三个最浓稀释液中观察到生长。
进行第二连续稀释。给50ml培养基接种约2x 108亚硝化单胞菌细胞，并进行1:50连续稀释，使得在第五稀释后，预期烧瓶中具有大约一个细胞。将表现出细菌生长的烧瓶涂铺在LB-琼脂上，以分析污染细菌，且没有观察到污染细菌。此外，在显微镜下没有观察到污染的革兰氏阳性细胞。
因此，连续稀释过程得到纯性的或大体上纯性的亚硝化单胞菌培养物。
实施例4. D23基因组的测序
如实施例1中所述获得菌株D23，并如实施例3中所述制备成纯性。
将细菌样品的10ml等分试样接种到约1L实施例2中所述的亚硝化单胞菌生长培养基中。在3天的分批培养中，培养物良好地生长至在600nm下的光密度为0.08。
使用技术和/或DNA测序系统技术(Pacific Biosciences)制备培养物的总DNA并进行测序。该菌株被鉴定为亚硝化单胞菌并命名为D23。
将D23的基因组序列与亚硝化单胞菌C91(其被认为是亚硝化单胞菌的唯一的另一个测序菌株)的基因组序列进行比较。
D23染色体的长度为2,537,572个碱基对，其短于亚硝化单胞菌菌株C91染色体的2,661,057个碱基对染色体。基于16S-23S操纵子，菌株D23与C91具有99.46％的同一性，且与亚硝化单胞菌具有95.38％的同一性。亚硝化单胞菌D23的DNA测序表明该菌株缺少质粒。这与具有两个质粒的菌株C91的序列形成对比。
通过序列分析鉴定蛋白质编码区和RNA编码序列。补充表1是列出D23基因组(SEQID NO:1)中的2,777个基因的位置的注释表。
在单个基因的水平上，几个基因存在于D23中，而在C91中不存在。这些基因汇总于图6-8中。图6是显示具有指定的ORF编号和基于序列分析的功能或长度上超过200个碱基对的假定基因的独特D23基因的表格。这个类别中有162个基因。图7是显示具有指定的ORF编号的少于200个碱基对的独特D23基因的表格。这些基因有164个。图8是显示没有指定的ORF编号的独特D23基因的表格。这些基因有219个(其中有180个基因的长度低于200bp)。
菌株D23也缺乏在菌株C91中存在(或缺乏接近的同源物)的许多基因。这些基因有时被称为独特的C91基因。这些基因包括图9中列出的约300个基因。
D23包含几个不同于其在C91中的同源物的氨代谢基因。这些基因中的某些列举在具体实施方式的表1中。在D23蛋白和其在菌株C91中的同源物之间进行序列比对。序列比对示于图10-16中，并且两个菌株之间的序列差异示于具体实施方式的表2中。
序列比较揭示了每个蛋白质的C91和D23同源物之间的百分比序列同一性。更具体地说，图10是菌株C91和D23中的AmoA1和AmoA2之间的比对。每个蛋白质在273/276个位置是相同的，且因此每个在菌株之间为约98.9％相同。图11是菌株C91和D23中的AmoB1和AmoB2之间的比对。两种蛋白质在419/421个位置是相同的，且因此在菌株之间为约99.5％相同。图12是菌株C91和D23中的AmoC1和AmoC2之间的比对。两种蛋白质是完全相同的。图13是菌株C91和D23中的AmoC3之间的比对。该蛋白质在272/274个位置是相同的，且因此在菌株之间为约99.3％相同。
关于Hao蛋白，图14(A和B)是菌株C91和D23中的Hao1、Hao2和Hao3之间的比对。Hao1在567/570个位置是相同的，且因此每个在菌株之间为约99.5％相同。Hao2和Hao3在568/570个位置是相同的，且因此在菌株之间为约99.6％相同。
现在转向细胞色素c554蛋白，图15是菌株C91和D23中的CycA1、CycA2和CycA3之间的比对。CycA1在233/235个位置是相同的，且因此在菌株之间为约99.1％相同。CycA2和CycA3在234/235个位置是相同的，且因此每个在菌株之间为约99.6％相同。
关于细胞色素cM552蛋白，图16是菌株C91和D23中的CycB1和CycB2之间的比对。CycB1在232/239个位置是相同的，且因此在菌株之间为约97.1％相同。CycB2在236/239个位置是相同的，且因此在菌株之间为约98.7％相同。在此，蛋白质的长度被认为是239个氨基酸，因为那是其在菌株D23中的长度。
表1的核酸序列的比对显示C91和D23中的同源物之间的百分比同一性。amoA1基因为约98.8％相同(即，在821/831个位置)，amoA2基因为约98.8％相同(即，在821/831个位置)，amoB1基因为约99.1％相同(即，在1255/1266个位置)，amoB2基因为约99.1％相同(即，在1254/1266个位置)，amoC1基因为约99.8％相同(即，在814/816个位置)，amoC2基因为约99.8％相同(即，在814/816个位置)，且amoC3基因为约98.9％相同(即，在816/825个位置)。hao1基因为约99.0％相同(即，在1696/1713个位置)，hao2基因为约99.4％相同(即，在1702/1713个位置)，且hao3基因为约99.2％相同(即，在1700/1713个位置)。在细胞色素c554基因中，cycA1基因为约98.0％相同(即，在694/708个位置)，cycA2基因为约98.7％相同(即，在699/708个位置)，且cycA3基因为约99.3％相同(即，在703/708个位置)。在细胞色素cM552基因中，cycB1基因为约96.7％相同(即，在696/720个位置)，且cycB2基因为约97.1％相同(即，在702/723个位置)。
实施例5.竞争性生长研究
设计研究来确定亚硝化单胞菌菌株D23是否可以一直非期望细菌的生长，诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa或PA)、金黄色葡萄球菌(S.aureus或SA)、酿脓链球菌(S.pyogenes或SP)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii或AB)和痤疮丙酸杆菌，所有这些细菌都是常从受感染皮肤和伤口位置中的一个或两个分离的重要病原体。这个方案也可以用来测试其它亚硝化单胞菌菌株抑制非期望细菌生长的能力。
简而言之，合适的方案可包括以下步骤。在t＝0时，给培养物接种亚硝化单胞菌，然后培育亚硝化单胞菌24小时。分析培养物特性(例如，pH和亚硝酸盐水平)。在t＝24小时时，将非期望细菌添加至培养物。添加后，立即获得样品来测定非期望细菌的CFU/ml以及任选地亚硝化单胞菌的CFU/ml、pH和亚硝酸盐水平。继续培养另外24小时。在后续时间点，例如，t＝30和t＝48，可如同t＝24时一样获取相同测量值。为测定CFU/ml，可涂铺纯/-1/-2/-3/-4/-5(或更高)来获得精确计数。
下文列出更详细方案。
第1天
1.通过将储存在4℃下的10x AOB原液悬浮液颠倒几次混合，直到获得均质悬浮液。
2.将10ml悬浮液在8x 1.5ml聚丙烯管中等分。
3.在室温下以17,000x g离心3min。
4.移除上清液和每个球团的任何残余缓冲液，并将所有球团完全重新悬浮在50ml聚丙烯管中的总共10ml完全AOB培养基中。
5.用移液管将5ml 10x AOB悬浮液移到两个50ml聚丙烯管(管1-2)中。
6.额外准备五个管(管4-8)，它们包含在完全AOB培养基/0.5x磷酸盐缓冲液中的10x AOB悬浮液。将26ml 10x AOB原液悬浮液在16x 1.5ml聚丙烯管中等分。如上获得球团，并重新悬浮在50ml聚丙烯管中的总共26ml完全AOB培养基/0.5x磷酸盐缓冲液。
7.用移液管将5ml 10x AOB悬浮液移到五个50ml聚丙烯管(管4-8)中的每个管中。
8.同样，准备两个管，其中10x热灭活AOB悬浮液在完全AOB培养基中(管3)或完全AOB培养基/0.5x磷酸盐缓冲液(管9)中。将10ml储存在4℃下的热灭活悬浮液在8x 1.5ml聚丙烯管中等分。在室温下以17,000x g离心3min，并如上文针对活AOB所述移除上清液。将四个球团重新悬浮在一个50ml聚丙烯管(管3)中的总共5ml完全AOB培养基中，并将剩余的四个球团重新悬浮在第二个50ml聚丙烯管(管9)中的总共5ml完全AOB培养基/0.5磷酸盐缓冲液中。
9.添加141μl 1M硫酸铵以获得25mM最终浓度(管1、3、4、5、9)。将等体积dH2O添加至相应对照管(管2、6、7)中。
10.向管8添加141μl新的1M NaNO2。
11.使所有管轻轻涡旋，但充分混合。
12.在混合每种悬浮液后，立即从每个管移除0.5ml，并在室温下使所有样品以17,000x g离心3min。完成步骤13后，将上清液转移到新的管中，并利用格里斯试剂测量pH和亚硝酸盐水平，以获得T0值。
13.在30℃下培养所有50ml管，在定轨振荡器上以150rpm(竖直位置)混合24h。
表5.
第2天
14.在24h时，制备SA、PA、SP或AB菌剂，以添加至悬浮液。
15.从生长在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上的过夜(20-24h)SA或PA培养物或在脑心浸液(BHI)琼脂上制备的SP或AB培养物在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或BHI肉汤(BHIB)中以约2x 108CFU/ml制备细菌悬浮液。
16.用移液管将50μl SA/PA/SP/AB悬浮液移到9.95ml盐水中，以得到约106CFU/ml。按需要保持在冰上。
17.使SA/PA/SP/AB悬浮液涡旋，并向管1-9添加0.5ml。
18.使所有管轻轻涡旋，但充分混合。
19.在混合每种悬浮液后，立即将来自每个管的100μl转移到0.9ml TSB或BHIB(10-1稀释)中，以中和样品，进行CFU测定。此外，从每个管移除0.5ml，并在室温下以17,000xg离心3min。完成步骤20后，移除新的管中的上清液，并在步骤21后利用格里斯试剂测量pH和亚硝酸盐水平，以获得T24值。
20.在30℃下培养所有50ml管，在定轨振荡器(150rpm)上额外混合24h。
21.将T24样品进一步稀释在TSB或BHIB中，并将-2/-3/-4稀释液涂铺在TSA或BHI琼脂上。在37℃下培养板24h，以获得SA、PA、SP或AB活菌计数。
22.在SA/PA/SP/AB与AOB混合6和24小时后，使管涡旋，并用移液管将100μl样品移到0.9ml TSB中。进一步稀释在TSB或BHIB中，并将-5稀释液整齐涂铺在TSA或BHI琼脂上。在每个时间点，还从每个管移除0.5ml，并如上所述在每个上清液样品中测量pH和亚硝酸盐水平。
23.在37℃下培养TSA或BHI琼脂板24h，以获得T30(6h)和T48(24h)活菌计数。
24.计算CFU，以确定每个时间点的杀菌率％。
用于量化硝酸盐的格里斯试剂分析
1.使用在0、2、6和24h测定pH时获得的0.5ml上清液样品。
2.按需要将56μl上清液连续稀释在0.5ml dH2O中，以得到10-、100-和1000-倍稀释液。对于T0样品，管1-6、8、9使用1/10，且管7使用1/1000。对于T24/T30/T48样品，所有管使用1/10、1/100、1/1000。
3.为制备亚硝酸钠标准物，将10μl新的1M原液稀释在990μl完全AOB培养基-10％盐水中，以得到10mM溶液。
4.将10μl 10mM原液稀释于990μl dH2O中，以得到100μM工作溶液。
5.如下文所示在dH2O中制备标准物。只用T0样品运行标准物。
表6.
6.向每个0.5ml样品(或亚硝酸钠标准物)添加0.25ml试剂A(58mM磺胺在1.5N HCl中)和试剂B(0.77mM正(1-萘基)乙二胺-2HCl中的每种在H2O中(光敏；避光保存)。
7.混合并在室温下在黑暗中(或覆盖箔)静置30min。颜色应变为亮粉色/紫色。
8.读取540nm下的吸光度，并由标准曲线测算亚硝酸盐浓度。
使用这个方案来测试亚硝化单胞菌D23抑制铜绿假单胞菌(PA)、金黄色葡萄球菌(SA)、酿脓链球菌(SP)、鲍氏不动杆菌(AB)或痤疮丙酸杆菌生长的能力。图3A、3B和3C中示出这个实验的结果。
图3A的左图相对于时间绘制当PA与活亚硝化单胞菌和铵(正方形)、活亚硝化单胞菌无铵(圆形)、灭活亚硝化单胞菌和铵(三角形)、或活亚硝化单胞菌和NaNO2(倒三角形)共同培养时PA的CFU/ml。图3A的右图相对于时间绘制在相同条件下SA的CFU/ml。图3B的左图相对于时间绘制在相同条件下SP的CFU/ml。图3B的右图相对于时间绘制在相同条件下AB的CFU/ml。图3C相对于时间绘制当痤疮丙酸杆菌与活亚硝化单胞菌和铵(正方形)、活亚硝化单胞菌无铵(圆形)、灭活亚硝化单胞菌和铵(三角形)、或活亚硝化单胞菌和NaNO2(倒三角形)共同培养时痤疮丙酸杆菌的CFU/ml。在所有情况下，活亚硝化单胞菌与铵导致PA、SA、SP、AB或痤疮丙酸杆菌的数量下降，而其它培养条件允许非期望细菌生长。不受理论的约束，这些实验表明，由氨生成亚硝酸根同时D23使培养基酸化引起强烈抗菌效果，例如，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、酿脓链球菌、鲍氏不动杆菌或痤疮丙酸杆菌的活菌计数下降约100倍。相比之下，病原菌与热灭活D23加氨或与活D23而无氨的对照共培养物不产生相当的抗菌效果。含活亚硝化单胞菌培养物而无氨的对照与亚硝化单胞菌氨氧化活性促进其抗菌效果的模型相一致。含灭活亚硝化单胞菌和氨的对照表明，亚硝化单胞菌的一些生物活性(例如，其氨氧化活性)有助于抗菌活性。含活亚硝化单胞菌和NaNO2的对照表明，相当的亚硝酸盐水平在中性pH(相对于细菌利用氨的低pH)下没有强抗微生物效果，且与亚硝化单胞菌的氨氧化而非只有亚硝酸盐促进抗菌活性的模型相一致。
图4A的上图绘制上面段落中描述的共培养物随时间变化的NO2 -浓度。NO2 -浓度指示培养物中NH3代谢速率。如上，PA与亚硝化单胞菌和铵(正方形)、与亚硝化单胞菌而无铵(圆形)、或与灭活亚硝化单胞菌和铵(三角形)共培养。活亚硝化单胞菌和铵比两种对照培养物产生明显更高的NO2 -水平，表明活亚硝化单胞菌在培养条件下将铵转化为NO2 -。
图4A的下图绘制在相同共培养条件下随时间变化的pH。pH指示亚硝化单胞菌的代谢活性，因为氨转化为亚硝酸根产生氢离子。PA与亚硝化单胞菌和铵(正方形)、与亚硝化单胞菌而无铵(圆形)、与灭活亚硝化单胞菌和铵(三角形)、或与活亚硝化单胞菌和NaNO2(倒三角形)共培养。相对于三种对照培养物，活亚硝化单胞菌和铵使培养基酸化，表明活亚硝化单胞菌在培养条件下代谢铵。
图4B的上图绘制上述共培养物随时间变化的NO2 -浓度。NO2 -浓度指示培养物中NH3代谢速率。如上，酿脓链球菌(SP)和鲍氏不动杆菌(AB)与亚硝化单胞菌和铵(正方形)、与亚硝化单胞菌而无铵(圆形)、或与灭活亚硝化单胞菌和铵(三角形)共培养。活亚硝化单胞菌和铵比两种对照培养物产生明显更高的NO2 -水平，表明活亚硝化单胞菌在培养条件下将铵转化为NO2 -。
图4B的下图绘制在相同共培养条件下随时间变化的pH。pH指示亚硝化单胞菌的代谢活性，因为氨转化为亚硝酸根产生氢离子。SP和AB与亚硝化单胞菌和铵(正方形)、与亚硝化单胞菌而无铵(圆形)、与灭活亚硝化单胞菌和铵(三角形)、或与活亚硝化单胞菌和NaNO2(倒三角形)共培养。相对于三种对照培养物，活亚硝化单胞菌和铵使培养基酸化，表明活亚硝化单胞菌在培养条件下代谢铵。
图4E示出图4A和4B数据的替代可视形式。
通过在体外测试5种病原菌菌株在用D23的共培养研究中的存活评估亚硝化单胞菌D23抑制病原菌因为亚硝酸盐生产同时酸化(酸化亚硝酸盐)而引起的增殖的能力。五种病原菌菌株包括痤疮丙酸杆菌、酿脓链球菌,耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单胞菌和多耐药性鲍氏不动杆菌。在铵存在下培养亚硝化单胞菌D23(1010个细胞/ml)得到10mM或更高的亚硝酸盐浓度，并酸化至pH 6或更低(图4B)。亚硝酸盐浓度增加和pH降低的组合导致杀菌或抑菌效果，以及所测试的病原菌物种的活菌计数显著下降(高达965倍)。这些研究的结果汇总在图4D和下表7中。相对于在铵存在下培养的D23共培养物，五种病原体与D23不加铵、或与热灭活D23(B244)加上铵的共培养物不会导致任何抑制或抗微生物效果。
表7亚硝化单胞菌D23(D23)在体外对病原菌的相对存活的影响
实施例6.伤口愈合。
在两个独立研究中评估亚硝化单胞菌D23(有时也称为B244)对糖尿病小鼠的伤口闭合的影响。在研究1中，通过每天用3种浓度的补充有氯化铵的D23(107、108或109个细胞/ml)或只用媒介物对照悬浮液一周中每天身体沉浸预处理db/db小鼠(8只小鼠/组)。随后，只用媒介物或等体积的3种浓度的在补充有氯化铵的PBS中的D23(107、108或109个细胞/ml)14天中每天一次局部处理每个动物背上形成的全皮层伤口。在三个D23处理组中，接受最高剂量的组示出伤口闭合从第5天至第15天明显改善，在受伤后的第9天观察到最明显的83％的改善。与只接受媒介物处理的动物组相比，用109个细胞/ml D23处理的动物到50％伤口闭合的中值时间显著减少(P<0.05)。
在研究完成时的第15天收集的受伤组织样品的初步组织病理学分析未显示出媒介物处理的动物与D23处理的动物之间的任何显著差异。随后，根据Altavilla等人(2001)改编和修改的评分系统和参数对组织切片进行更深入检查。这项分析表明，相对于媒介物对照组，在用109个细胞/ml的D23处理的动物中，血管生成水平和肉芽组织的成熟度有随着皮肤发炎水平下降而增加的趋势，这与观察到的D23处理的动物的伤口愈合速率的改善相一致。
利用C57BLKS/J Iar-+Leprdb/+Leprdb雄性小鼠(非-GLP)测试亚硝化单胞菌菌株D23加速糖尿病小鼠模型的伤口愈合的能力。下文列出详细方案。
第6天至第1天：用测试生物体对小鼠进行全身沉浸预处理。
1.通过将储存在4℃下的10x D23原液悬浮液颠倒几次混合，直到获得均质悬浮液。
2.用移液管将2x 29ml 10x原液悬浮液移到两个50ml聚丙烯离心管中。
3.在20℃下以8,000x g离心15min。
4.移除上清液和球团的任何残余缓冲液，并将两个球团轻轻但充分重新悬浮在pH为7.4的总共58ml室温磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。这是将用于以下步骤中的10x D23(测试生物体)悬浮液。
5.如下文所示，在预先在30℃下预热的补充有2mM NH4Cl的PBS中制备500ml含1x、0.1x和0.01x强度测试生物体的浴液或制备媒介物对照浴液。每次从维持在室温下的10xD23悬浮液制备并使用一个浴，然后继续下一个浴。这将防止使测试物质在没有铵的情况下长时间维持在30℃下。为防止测试物质污染媒介物对照组，以媒介物对照组开始，然后继续D23浴液。
6.每天将每组小鼠浸没在相应浴液中60秒，持续七天。
7.对于每天每次浸入测试生物体或媒介物对照，使用新的500ml浴液。
表8.
第1天：通过皮肤穿刺创伤小鼠
1.在刮去背部和肩部的毛后通过皮肤穿刺在每只小鼠的背部产生皮肤伤口。
2.在剩余的研究时间里，单独圈养每只小鼠。
第1天至第15天：用测试生物体局部处理皮肤伤口
1.通过将储存在4℃下的10x D23原液悬浮液颠倒几次混合，直到获得均质悬浮液。
2.用移液管将1ml 10x原液悬浮液移到1.5ml聚丙烯管中。
3.在室温下以17,000x g离心3min。
4.移除上清液和球团的任何残余缓冲液，并将球团轻轻但充分重新悬浮在pH为7.4的总共10ml预热的30℃磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。这是将用于以下步骤中的1x D23(测试生物体)悬浮液。
5.如下文所示，在50ml聚丙烯管中，在补充有2mM NH4Cl的预热PBS中制备测试生物体的1x、0.1x和0.01x悬浮液，或制备媒介物对照溶液。
6.利用重复移液管吸取2.0ml每种悬浮液。
7.缓慢的将0.2ml测试生物体(1x、0.1x、0.01x组)或等体积媒介物对照滴加至每个伤口和周围刮掉毛的皮肤区域。利用移液管尖端轻轻地使施加的悬浮液扩散至伤口和整个刮掉毛的皮肤区域。
8.每天重复施加测试生物体或媒介物对照，总共持续14天。
9.通过伤口平面几何测量伤口尺寸，并在第1、3、5、7、9、11、13和15天利用图像分析器(Image-pro plus 4.5版，Media Cybernetics Inc)获得每个伤口的照片图像。
10.计算每个组的伤口闭合％和伤口半闭合时间(CT50)。
表9.
第15天(研究完成时)：收集伤口组织样品和组织病理学分析
1.利用无菌技术从每组四只小鼠获得一半伤口组织样品，以避免组织交叉污染。
2.继续进行组织病理学分析。
3.暂时储存在-70℃下，进一步评估每个组的剩下的一半伤口样品和另外四个全尺寸伤口组织。
如图5A中所示，局部施用109CFU/ml菌株D23显著(*p<0.05)加速伤口愈合。样本量为N＝8只动物/gp。接受最高剂量的组示出伤口闭合从第5天至第15天明显改善，在受伤后的第9天观察到最明显的83％的改善。此研究证明，氨氧化细菌例如D23对糖尿病足溃疡、慢性伤口和其它相关适应症有治疗益处。
图5B为示出CT50相对于对照(媒介物)和109CFU/ml D23的图。CT50是达到50％伤口闭合所需的时间。如图中所示，那些施用D23的伤口具有较低CT50值。
图5C为另一个实验的图，其中实施上述方案以获得伤口闭合测量值对时间。测试对照(媒介物)伤口，并与109CFU/ml D23伤口比较。这个图示出在实施沉浸预处理和局部施用时D23的效果。
图5D为另一个实验的图，其中实施上述方案而无沉浸预处理以获得伤口闭合测量值对时间。测试对照(媒介物)伤口，并与施用109CFU/ml和1010CFU/ml D23至伤口作比较。这个图示出在实施局部施用时D23的效果。
图5E为示出CT50相对于对照(媒介物)和109CFU/ml D23、加上和不加沉浸预处理、以及109CFU/ml D23不加预处理的图。如图中所示，那些施用D23的伤口具有较低CT50值。
图5F为在第1天、第11天和第15天时伤口愈合实验的图像。AOB代表D23。
可能调节炎症反应加上D23的抗感染作用证明针对糖尿病和其它慢性伤口的有效局部治疗。
图5G为针对对照(媒介物)和各种浓度的D23测试的小鼠中的血液葡萄糖水平的图。左手侧图的x轴中所示“IM”代表那些具有D23沉浸预处理的测试。图5H为研究(包括沉浸预处理)测试中所用动物在研究期间的体重图。图5I为研究(包括沉浸预处理研究和没有进行沉浸预处理的研究)测试中所用动物在研究期间的体重图。
在研究2中，检查了用109个细胞/ml B244预处理db/db小鼠对伤口闭合的影响。用进行和不进行先前身体沉浸的109个细胞/ml B244局部处理七小鼠组。用1010个细胞/mlD23(B244)局部处理另一个七小鼠组。作为阴性对照，平行地进行相应的进行和不进行身体沉浸的媒介物组(七只小鼠)。如之前一样获得每个伤口的伤口表面积和照片图像。这些研究再现了研究1的发现，表明约109个细胞/ml的B244剂量改善伤口闭合。此外，只用109个细胞/ml局部处理改善伤口闭合速率，这类似于接受局部沉浸处理的动物。通过H&E-染色第5天回收的伤口组织切片进行的其它组织病理学分析未显示出媒介物处理的伤口和D23(B244)处理的伤口之间的任何差异。
利用Luminex技术研究D23处理的糖尿病动物中的细胞因子和生长因子表达。具体地说，比较D23处理的糖尿病动物与对照糖尿病动物在第5天和第15天从进行或未进行先前身体沉浸的每组四只小鼠获得的血清样品的生长调节抑癌基因/角质细胞化学引诱物(Gro/KC)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)、肿瘤坏死因子(TNF)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。在类似的Luminex分析中，还分析来自D23处理动物或媒介物对照动物在完成研究时(第15天)获得的组织的溶解物。之前已将炎症标记物(包括MIP-2、TNFα和IL-1β)的异常高且持续表达与db/db小鼠中的炎症反应调节异常和伤口愈合过程受损联系在一起(Wetzler,2000)。在D23处理的动物和媒介物对照动物中，对第5天和第15天血清样品的分析得出所有六种细胞因子具有极低信号，该结果表明以高D23剂量处理伤口后缺乏全身效果。在第15天获得的伤口组织溶解物中，MIP-2水平(1155-1516pg/100g总蛋白)显著高于剩余的五种细胞因子，测得IL-6和Gro/KC在低得多的水平下(44–48pg/100g总蛋白)，且IL-1和VEGF近乎不可测(≤3.8pg/100g总蛋白)。总之，未观察到全身沉浸或不沉浸在D23悬浮液中的D23处理的动物与媒介物对照动物之间有差异。所有检查的四组小鼠的组织溶解物中测得的所有六种细胞因子或生长因子的水平汇总在下表10中。
表10 D23处理的db/db小鼠和媒介物对照处理的db/db小鼠的伤口组织溶解物中测得的细胞因子水平
如下文部分中所述，在28天重复剂量毒理学研究中，在啮齿类动物中进行D23(B244)的药代动力学评估。不针对D23(B244)进行独立的单剂量药代动力学研究。
实施例7：毒理学
亚硝化单胞菌D23(B244)应用在链脲佐菌素诱导的糖尿病Sprague-Dawley大鼠的全皮层伤口上的28天安全性研究
此研究的目标是在经皮施用在受伤皮肤上最少28天时测定大鼠中亚硝化单胞菌D23(B244)的潜在毒性，以及评估任何发现的潜在可逆性。此外，测定D23(B244)的毒代动力学特性。
研究设计和方法
设计基于研究目标、测试物的总体产品开发策略和以下研究设计指南：OECD指南407和417，人用药委员会(CHMP)，以及ICH协调三方指南M3(R2)、S3a和S6(R1)。本文概述研究设计，并将结果示于表11中。
表11 28天安全性研究设计
M＝雄性，F＝雌性，Conc.＝浓度，CFU＝菌落形成单位数。
对照物＝99.998％磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4(PBS)，0.002％1M NH4Cl
为诱导糖尿病，在第4天通过腹膜内注射将链脲佐菌素施用至Sprague Dawley大鼠。将血液葡萄糖水平>200mg/dL的动物视为链脲佐菌素处理的应答人，并用于研究的给药阶段。利用8-mm皮肤活检取样钳给每只动物产生两个全层皮肤伤口(每只麻醉动物背部每侧1个)。伤口在施用对照和测试物期间以及研究期间未覆盖。从第1天到第28天，将测试物和对照物经皮施用至合适动物，每天一次(持续24小时±1小时)。此研究中评估的终点如下：临床征象、真皮发现、体重、体重变化、摄食量、眼科学、葡萄糖分析、临床病理学参数(血液学、凝血、临床化学、尿分析、血红蛋白A1c和高铁血红蛋白)、C-反应蛋白和血清铁蛋白分析、毒代动力学参数、肉眼尸检发现、器官重量和伤口组织病理学。
结果
下文在表12中列出28天GLP毒理学研究中评估的终点的结果。
表12 28天安全性研究-结果
结论
·在6x 107、6x 108和6x 109CFU/kg/天的水平下，每天一次施用D23(B244)在大鼠伤口上的耐受性良好。
·在研究期间没有观察到D23(B244)相关死亡率
·在所有组中，全组织厚度切除物的愈合类似
·没有观察到D23(B244)相关临床征象或真皮刺激
·在研究期间没有观察到对体重、摄食量、临床病理学参数、c-反应蛋白或血清铁蛋白的影响
·没有测试物相关肉眼验尸发现或组织病理学发现
·测定没有观察到的不良作用水平(NOAEL)为6x 109CFU/kg/天(8x 109个细胞/ml)
·未确定具体目标器官
在研究期间未出现D23相关死亡。没有D23相关临床征象或真皮刺激，且在研究期间，对体重、体重变化、摄食量、临床病理学参数、C-反应蛋白或血清铁蛋白没有影响。没有测试物相关肉眼验尸发现或组织病理学发现。在第29天在>6x 108CFU/kg/天雌性中注意到肾上腺重量增加；然而，基于在雄性中缺少类似效果，缺少相应肉眼发现，且缺少对这个组织的微观评估，与D23相关被视为模棱两可。
所有伤口位置完全被上皮覆盖，且似乎处于重塑/消退阶段，其特征为上皮层化伴角质化，以及真皮胶原蛋白精制(合成、归拢(bundling)和降解)，以及毛细血管恢复上皮和真皮的正常结构。所有组(包括对照)的发病率和严重性类似。
实施例8：抗生素敏感性
测试五种抗生素(各代表不同抗生素类别)抵抗亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseutropha)D23的活性。所测试的抗生素包括克林霉素(clindamycin)、红霉素(erythromycin)、庆大霉素(gentamicin)、哌拉西林(piperacillin)联合或不联合β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦(Tazobactam)、及四环素(tetracycline)。这些抗生素是基于临床和实验室标准协会(CLSI)第24版资料增刊(M100-S24)中在非苛养有机体和非肠杆菌科下所列的用于常规测试和报告系谱相关变形菌门(绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))的CLSI推荐来选择，并且还包括常用于抵抗痤疮的局部或全身性抗微生物剂(例如克林霉素或四环素)。包括涉及克林霉素的研究，尽管这种抗生素并非所预期般极为有效地抑制亚硝化单胞菌属，其它需氧性革兰氏阴性细菌的情况亦如此。
通过将亚硝化单胞菌(N.eutropha)D23培养在递减浓度的五种抗生素的每一种中来测定最小抑制浓度(MIC)。通过测定以24小时间隔收集的样品中的光密度(OD600)值来监测在30℃下的细菌生长，持续48-72小时。MIC值确定为两倍稀释系列中的导致OD600测量值未增加达2或3天培养时间的最低抗生素浓度。每种抗生素测试中的亚硝化单胞菌D23表型将根据CLSI所提供的MIC解释标准而判定为敏感、中度或耐受。如表13中所概述，这些研究证实亚硝化单胞菌D23对红霉素和庆大霉素敏感以及对四环素和哌拉西林中度耐受，从而表明所述药物成分缺乏强抗生素耐受性潜力。针对亚硝化单胞菌D23所观察到的克林霉素耐受性是与先前关于需氧性革兰氏细菌对这种抗生素的天然耐受性的报告一致。除了单独测试β-内酰胺抗生素哌拉西林以外，还测试了广谱β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦与哌拉西林的组合以评估亚硝化单胞菌D23表达β-内酰胺酶的可能这种比较的结果显示了亚硝化单胞菌D23敏感性未增加，从而表明至少在测试条件下，亚硝化单胞菌D23不表达β-内酰胺酶。
表13.所测试的五种抗生素抵抗体外亚硝化单胞菌D23培养物的MIC值
*根据临床和实验室标准协会所推荐(括号中的值代表对应敏感、中度或耐受结果的MIC水平)
结论
这些研究证实D23(B244)对大环内酯和氨基糖苷抗生素的敏感性以及对林可酰胺的耐受性，结果指示所述药物成分缺乏强抗生素耐受性潜力。
实施例9：亚硝化单胞菌的结构的说明
亚硝化单胞菌是使用PCR和基因测序方法在物种和菌株水平上来定义。通过测序16S rRNA基因的V1–V5可变区而将物种水平定义为亚硝化单胞菌。通过从全基因组序列分析中识别独特基因而将亚硝化单胞菌定义为新型亚硝化单胞菌菌株D23。亚硝化单胞菌是通过使用MicroSeq 500rDNA细菌识别PCL和测序试剂盒进行16S rRNA基因测序而在物种水平上定义为亚硝化单胞菌。
菌株身份可以使用定制引物来测定，该定制引物对应于以下序列的下划线部分和下文D23 1c1355序列和引物表14。虽然不希望受理论约束，但据信基因D23 1c1355为亚硝化单胞菌D23独有，且因此进行基因D23 1c1355内的PCR扩增反应将指示亚硝化单胞菌D23是否存在于给定样品中。
表14. D23_1c1355序列和引物
D23_1c1355含外膜自转运筒结构域的蛋白质
实施例10：将氨氧化细菌施用到头部后面以改变皮肤微生物组
将氨氧化细菌(亚硝化单胞菌D23)局部施加到受试者头部的后面，持续超过2周。剂量为每天施加3x 1010CFU。产物浓度为溶于含氯化镁的磷酸盐缓冲液中的1x 109CFU/ml(15ml，一天两次)。每天，使用所属技术领域中已知的分离和测序方案，采集皮肤擦拭物以分离并测序所有存在的细菌DNA。
亚硝化单胞菌属的氨氧化细菌不存在于第0天样品中，但被检测到存在于第7、14和16皮肤擦拭物中。
如图17和18(其绘示第0、1、8、14和16天的比例相对于细菌属)中所示，氨氧化细菌的施加导致共生的非致病性葡萄球菌(其为至少98％表皮葡萄球菌)从第0天的接近0％成比例增加到第16天的约50％。另外，氨氧化细菌的施加导致潜在致病性或疾病相关的丙酸杆菌在所测试的时间段内成比例减少(从第0天的超过75％到第16天的50％以下)。氨氧化细菌的施加还导致潜在致病性或疾病相关的寡养单胞菌在所测试的时间段内减少(从第0天的0.1％到第16天的0.01％以下)。
图1和2中所示的一些数据也显示于下表15中。
表15.随天数变化的属
如表15中所示，丙酸杆菌的比例在约14天后减小(比较表15中第0、1和8天的数据与第14和16天的数据)。葡萄球菌的比例在约2周后增加(比较表15中第0、1和8天的数据与第14和16天的数据)。寡养单胞菌的比例在约1天后降低(比较表15中第0天的数据与第1、8、14和16天的数据)。
皮肤微生物组成的这些改变到低致病状态指示氨氧化细菌的施加将适用于治疗皮肤病(包括但不限于痤疮、湿疹、皮肤感染和红斑痤疮)。
实施例11：涉及氨氧化细菌对于人类皮肤的研究：美容效果、安全性、检测和皮肤宏基因组
进行随机4:1AOB:安慰剂对照的盲法安慰剂对照的24名人类志愿者研究。受试者每天两次在其脸部和头皮施加亚硝化单胞菌属悬浮液(109CFU/ml，每天2次，每天施加共3x1010CFU)，持续一周，并且在施加后再随访两周。告知志愿者在一周AOB施加期间以及施加后的一周期间避免使用护发产品，然后在第三周重新使用普通洗发水。获得第0天(作为基线对照)和第1、3、8、14和21天的头皮擦拭物，以通过PCR和16S rRNA测序分析评估是否存在AOB。
AOB施加一周不产生严重不良事件，则产品视为安全。AOB使用者报告皮肤状况和质量得到明显改善，如七天施加期后完成的自评报告所指示。使用皮肤样品的AOB特异性PCR分析，我们可以证实83-100％的AOB使用者在施加期间存在所述细菌，而在安慰剂对照样品中未检测到AOB。所有受试者在研究开始前所获得的基线擦拭物均缺乏AOB，这与这些细菌对肥皂和其它商业产品的预测敏感性一致。16S rRNA基因的扩增和样品子集的测序证实对应样品中存在AOB并且表明局部AOB施加具有调节皮肤微生物组的潜在趋势。总之，基于活AOB的产品是安全的并且可以很有希望作为将亚硝酸盐和一氧化氮递送到人类皮肤的新型自调节局部递送剂。
如下表16中所示，当第0天相对于第8天比较时，亚硝化单胞菌属(AOB)的比例上升。当第0天相对于第8天比较时，其它细菌(丙酸杆菌、肠杆菌和柠檬酸杆菌)下降。表16中指示的p值证实对亚硝化单胞菌属(AOB)观察到第0天与第8天之间之最显著变化，接着是丙酸杆菌。肠杆菌和柠檬酸杆菌也显示第0天与第8天之间之较低程度变化。
表16. AOB施加后微生物组成的趋势(第0天相对于第8天)
因为亚硝酸盐和一氧化氮涉及重要生理功能(例如血管扩张、皮肤发炎和伤口愈合)，所以我们已假定AOB可以通过使来自汗水的氨新陈代谢且同时共同驱动皮肤酸化而对健康和免疫病理皮肤状况产生有益影响。我们推断亚硝化单胞菌属用于人类用途而言将为安全的，因为它们生长缓慢且无法利用有机碳源，它们对抗生素敏感，以及它们从未涉及动物或人类疾病。此处我们描述一种盲法安慰剂对照的24名人类志愿者研究，在所述研究中，受试者每天两次在其脸部和头皮施加活亚硝化单胞菌悬浮液，持续一周，并且随后再进行2周的随访。志愿者们在第一周和第二周期间不使用护发产品，然后让他们在第三周重新回到常规日常。获得第0天(作为基线对照)和第1、3、8、14和21天的头皮擦拭物，评估是否存在亚硝化单胞菌属并检查微生物多样性。重要的是，局部施加不产生严重不良事件。PCR分析证实在完成一周施加(第1、3或8天)期间或之后立即从AOB使用者所获得的83-100％的皮肤擦拭物和在第14天的60％的使用者中存在所述细菌，而在安慰剂对照样品中不存在。所有受试者在研究开始前所获得的基线擦拭物均缺乏AOB。一周施加期间的AOB增加水平与皮肤状况的定性改善具有相关性，这与安慰剂对照受试者报告的未改善形成对比。从受试者子集获得的16S rRNA基因扩增产物的测序证实对应样品中存在AOB并且表明皮肤微生物组成的潜在调节。总之，活亚硝化单胞菌属相当耐受并且可以很有希望作为将亚硝酸盐和一氧化氮递送到人类皮肤的新型自调节局部递送剂。
此处，我们呈现人类中初步研究的结果，其中我们已开始评估亚硝化单胞菌属悬浮液对人类皮肤的局部施加以及使用AOB作为活体内NO/NO2 -的天然递送系统的潜力。我们已探索了用于皮肤样本中的AOB检测的方法以及AOB于皮肤微生物群落中的可能影响，以及从我们的局部美容品的早期采用者所收集的重要使用者反馈。
方法
培养条件.使亚硝化单胞菌D23在28-30℃分批培养物的补充有20-50mM NH4 +和碳酸钠作为碳源的矿物盐培养基中繁殖[Ensign等人,1993]。为连续培养，使用用于pH中和并且作为碳源的碳酸钠，使D23在28℃的1公升迷你生物反应器(Applikon Biotechnology)中以约109个细胞/ml生长。
亚硝酸盐量化。使用格里斯比色分析(Griess colorimetric assay)[Hagemanand Kucklesby,1971]和亚硝酸钠作为标准物来测定培养物上清液中的亚硝酸盐浓度。
来自皮肤擦拭物的DNA提取物。将样品维持在1ml稀释于PBS中的10％AssayAssureBioservative(Thermo Scientific)中。将生物量进行离心并且使用经过修改的针对皮肤样本所开发的方法[Grice,2009]将细胞溶解于经过设计用来维持长DNA完整性的缓冲液中。然后使用PowerLyzer UltraClean微生物DNA分离试剂盒(Mo Bio Laboratories)纯化DNA。使用扩增编码基因座amoCAB的氨单加氧酶的3-基因PCR信号识别亚硝化单胞菌D23。
PCR和文库制备。使用引物鸡尾酒和AccuPrime DNA聚合酶SuperMix试剂盒(LifeTechnologies)于复制反应中扩增全长16S rRNA基因。将所有PCR产物用SMRTbell模板制备试剂盒直接处理，之后用DNA/聚合酶结合试剂盒P4(Pacific Biosciences)直接处理。
16S rDNA测序和分析。PCR产物使用Pacific Biosciences RS仪器[Eid,2009]来测序。使用太平洋生物共识工具包(Pacific Biosciences Consensus Tools package)将原始碱基识别转变成共有DNA序列，随后使用Whole Biome Microbiome ProfilingPlatform处理以获得每个样品的门-属和菌株水平频率量度。
人类志愿者研究。将总计24名男性志愿者纳入盲法安慰剂对照的研究中，每名志愿者根据艾伦代尔机构审查委员会(Old Lyme,Connecticut)批准的局部AOB-001使用方案进行总共3周。从每个研究参与者获得书面知情同意书。受试者每天两次施加15ml亚硝化单胞菌(AOB-001)水性悬浮液或安慰剂(媒介物)，其含有约109个细胞/ml。
用于初步评估含亚硝化单胞菌属的局部悬浮液(AOB-001)的人类志愿者研究设计显示于图5K。通过PCR于头皮擦拭物样品中进行AOB的检测。图5L显示在所述研究期间所收集的头皮擦拭物的PCR分析。左图指示AOB特异性三基因信号(amoA、amoB、amoC)的阳性样品百分比。右图指示从23名志愿者中每个人处所收集的总计6个样品的复合PCR分数。指示了用于在六个取样点中的每个所收集的阳性样品的评分方案。
通过16S rDNA测序获得AOB-001施加之前和期间的皮肤微生物组成。图5M指示属水平细菌多样性，其根据通过对局部施加AOB-001之前和之后所收集的皮肤擦拭物样品进行16S rDNA测序来测定。
显示代表在施加之前的基线(第0天)和一周施加之后立即收集(第8天)或停止局部施加后一周(第14天)收集的样品中的12种细菌属中的每种的总序列读段的百分比。
图5N指示在AOB-001施加之前和之后所收集的皮肤样品中的亚硝化单胞菌属和其它物种的丰度变化。图A显示代表施加之前(第0天)、一周施加之后立即(第8天)或停止局部施加后一周(第14天)的亚硝化单胞菌属的总16S rDNA序列读段的百分比。图B显示通过对从AOB使用者收集的第0天相对于第8天样品的16S rDNA测序所检测到的物种丰度的模式变化。
AOB-001使用者报告皮肤状况的改善。图5O示出了AOB-001的使用者评价。AOB-001美容效果的评估由23名志愿者在其头皮和脸部完成一周施加后提供。对受试者以渐增的复合PCR分数的顺序绘图。(反应分类为2＝极其一致；0＝没有变化；-2＝极其不一致)。总之，AOB-001是良好耐受的。盲法研究中的使用者反应指示改善的皮肤/头皮状况。通过PCR和16S rRNA基因测序容易于皮肤微生物组样品中检测到AOB(亚硝化单胞菌属)。初步微生物组分析指示AOB调节皮肤微生物区。
补充表1：SEQ ID NO:1中的基因的注释
补充表2：选定的D23序列
引用并入
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虽然已讨论了本发明的特定实施方案，但上述说明是阐述性的而非限制性的。在回顾本说明书和以下权利要求书后，对本领域技术人员来说，本发明的很多变化将变得明显。应该参考权利要求书以及其等效物的完整范围和说明书以及此类变体，确定本发明的完整范围。
某些实施方案是在以下权利要求书的范围内。
PCT/RO/134表

Claims (285)

1.一种优化的亚硝化单胞菌(N.eutropha)细菌的纯化制剂，其具有选自下列的至少一种特性：
优化的生长速率；
优化的NH4 +氧化速率；和
优化的NH4 +抗性。
2.根据权利要求1所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其中所述优化的生长速率为允许具有约0.15-0.18的OD600(600nm下的光密度)的亚硝化单胞菌的连续培养物在约1至2天内达到约0.5-0.6的OD600的速率。
3.根据权利要求1或2所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其中所述优化的生长速率为当在分批培养条件下培养时约8小时的倍增时间。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其中所述优化的NH4 +氧化速率为至少约125微摩尔/分钟NH4 +氧化为NO2 -的速率。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其中所述优化的NH4 +抗性是在包含约200mM NH4 +的培养基中生长至少约48小时的能力。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其具有选自优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性的至少两种特性。
7.根据权利要求1至6所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含在极高严格度下与SEQ ID NO:1杂交的染色体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的AmoA蛋白，与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的AmoB蛋白，与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的amoC基因，与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的羟胺氧化还原酶蛋白，与SEQID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的细胞色素c554蛋白，或与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32具有选自至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％和100％相同的同一性的细胞色素cM552蛋白。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含表2中的1-5个、5-10个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个或所有序列特征。
11.根据权利要求10所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置1处具有突变(例如，位置1处的V)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置160处具有突变(例如，位置160处的L)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置167处具有突变(例如，位置167处的A)的AmoA1或AmoA2蛋白(或编码所述突变的AmoA1或AmoA2基因)。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置33处具有突变(例如，位置33处的V)的AmoB1或AmoB2蛋白(或编码所述突变的AmoB1或AmoB2基因)。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置165处具有突变(例如，位置165处的I)的AmoB1或AmoB2蛋白(或编码所述突变的AmoB1或AmoB2基因)。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置79处具有突变(例如，位置79处的A)的AmoC3蛋白(或编码所述突变的AmoC3基因)。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置271处具有突变(例如，位置271处的V)的AmoC3蛋白(或编码所述突变的AmoC3基因)。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置85处具有突变(例如，位置85处的S)的Hao1、Hao2或Hao3蛋白(或编码所述突变的Hao1、Hao2或Hao3基因)。
19.根据权利要求10至18中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置312处具有突变(例如，位置312处的E)的Hao1、Hao2或Hao3蛋白(或编码所述突变的Hao1、Hao2或Hao3基因)。
20.根据权利要求10至19中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置163处具有突变(例如，位置163处的A)的Hao1蛋白(或编码所述突变的Hao1基因)。
21.根据权利要求10至20中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置65处具有突变(例如，位置65处的T)的c554 CycA1、c554 CycA2或c554 CycA3蛋白(或编码所述突变的c554 CycA1、c554 CycA2或c554 CycA3基因)。
22.根据权利要求10至21中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置186处具有突变(例如，位置186处的T)的c554 CycA1蛋白(或编码所述突变的c554 CycA1基因)。
23.根据权利要求10至22中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置63处具有突变(例如，位置63处的V)的cM552 CycB1或cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552 CycB1或cM552 CycB2基因)。
24.根据权利要求10至23中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置189处具有突变(例如，位置189处的P)的cM552 CycB1或cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552 CycB1或cM552 CycB2基因)。
25.根据权利要求10至24中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置206处具有突变(例如，位置206处的insE)的cM552 CycB1或cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552 CycB1或cM552 CycB2基因)。
26.根据权利要求10至25中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置207处具有突变(例如，位置207处的insE)的cM552 CycB1或cM552CycB2蛋白(或编码所述突变的cM552 CycB1或cM552 CycB2基因)。
27.根据权利要求10至26中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置195处具有突变(例如，位置195处的insD)的cM552 CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552 CycB1基因)。
28.根据权利要求10至27中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置196处具有突变(例如，位置196处的insD)的cM552 CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552 CycB1基因)。
29.根据权利要求10至28中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在位置197处具有突变(例如，位置197处的insD)的cM552 CycB1蛋白(或编码所述突变的cM552 CycB1基因)。
30.根据前述权利要求中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含相对于野生型细菌如亚硝化单胞菌菌株C91的至少一种结构差异，例如至少一种突变。
31.根据前述权利要求中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含可以使用本文所述的引物对(例如，包含SEQ ID NO:64的序列的引物和包含SEQ ID NO:65的序列的引物)扩增的核酸。
32.根据前述权利要求中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含与图6的基因或由图6的基因编码的蛋白质至少80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或100％相同的核酸或蛋白质。
33.根据前述权利要求中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌的制剂，其包含与SEQ IDNO:64-66中任一个的序列或由SEQ ID NO:64-66中任一个的序列编码的蛋白质至少80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或100％相同的核酸或蛋白质。
34.一种亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其包含位于氨单加氧酶基因、羟胺氧化还原酶基因、细胞色素c554基因或细胞色素cm552基因中的相对于野生型细菌如亚硝化单胞菌菌株C91的突变。
35.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于amoA1基因中。
36.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于amoA2基因中。
37.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于amoB1基因中。
38.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于amoB2基因中。
39.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于amoC3基因中。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于在本文如表2中描述的位置。
41.根据权利要求34至39中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变为在本文如表2中描述的突变。
42.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于hao1基因中。
43.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于hao2基因中。
44.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于hao3基因中。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于在本文如表2中描述的位置。
46.根据权利要求42至44中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变为在本文如表2中描述的突变。
47.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于c554cycA1基因中。
48.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于c554cycA2基因中。
49.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于c554cycA3基因中。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于在本文如表2中描述的位置。
51.根据权利要求47至49中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变为在本文如表2中描述的突变。
52.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于cM552cycB1基因中。
53.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于c554cycB2基因中。
54.根据权利要求52至53中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变位于在本文如表2中描述的位置。
55.根据权利要求52至53中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其中所述突变为在本文如表2中描述的突变。
56.根据权利要求1所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其包含位于氨单加氧酶基因、羟胺氧化还原酶基因、细胞色素c554基因或细胞色素cm552基因中的突变。
57.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于amoA1基因中。
58.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于amoA2基因中。
59.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于amoB1基因中。
60.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于amoB2基因中。
61.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于amoC3基因中。
62.根据权利要求57至61中任一项所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于本文如表2中所描述的位置。
63.根据权利要求57至61中任一项所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变为本文如表2中所描述的突变。
64.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于hao1基因中。
65.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于hao2基因中。
66.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于hao3基因中。
67.根据权利要求64至66中任一项所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于本文如表2中所描述的位置。
68.根据权利要求64至66中任一项所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变为本文如表2中所描述的突变。
69.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于c554 cycA1基因中。
70.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于c554 cycA2基因中。
71.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于c554 cycA3基因中。
72.根据权利要求69至71中任一项所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于本文如表2中所描述的位置。
73.根据权利要求69至71中任一项所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变为本文如表2中所描述的突变。
74.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于cM552 cycB1基因中。
75.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于cM552 cycB2基因中。
76.根据权利要求56、74和75中任一项所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变位于本文如表2中所描述的位置。
77.根据权利要求56、74和75中任一项所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其中所述突变为本文如表2中所描述的突变。
78.根据权利要求34所述的亚硝化单胞菌细菌或其纯化制剂，其具有在amoA1基因、amoA2基因、amoB1基因、amoB2基因、amoC3基因、hao1基因、hao2基因、hao3基因、c554 cycA1基因、c554 cycA2基因、c554 cycA3基因、cM552 cycB1基因和c554 cycB2基因中的一个或多个的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个位置处的突变。
79.根据权利要求56所述的优化的亚硝化单胞菌细菌的纯化制剂，其具有在amoA1基因、amoA2基因、amoB1基因、amoB2基因、amoC3基因、hao1基因、hao2基因、hao3基因、c554cycA1基因、c554 cycA2基因、c554 cycA3基因、cM552 cycB1基因和c554 cycB2基因中的一个或多个的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个位置处的突变。
80.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含在高严格度下与SEQ ID NO:1杂交的染色体。
81.根据权利要求80所述的亚硝化单胞菌细菌，其中所述染色体在极高严格度下与SEQID NO:1杂交。
82.根据权利要求80或81所述的亚硝化单胞菌细菌，其包含图6-8的基因中的至少一个或与所述至少一个基因具有至少80％同一性的基因。
83.根据权利要求80或81所述的亚硝化单胞菌细菌，其包含图6-8的基因中的至少一个。
84.根据权利要求80至82中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌，其缺少与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3至少约80％相同的任何质粒。
85.根据权利要求80至84中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌，其缺少任何质粒。
86.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的AmoA1基因以及与SEQ ID NO:13至少约98.8％相同的amoA2基因。
87.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白以及与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白。
88.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因以及与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因。
89.根据权利要求88所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含与SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:13至少约98.9％相同的AmoA1或amoA2基因中的一个或多个。
90.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白或与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白。
91.根据权利要求90所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白以及与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白。
92.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:5至少约99.9％相同的amoC1基因、与SEQ ID NO:11至少约99.9％相同的amoC2基因以及与SEQ IDNO:17至少约99.0％相同的amoC3基因。
93.根据权利要求92所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因、与SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amo2基因、与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因以及与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因。
94.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含与SEQ ID NO:16至少约99.4％相同的AmoC3蛋白。
95.根据权利要求94所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白、与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白、与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白以及与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白。
96.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:19至少约99.1％相同的hao1基因、与SEQ ID NO:21至少约99.5％相同的hao2基因以及与SEQ ID NO:23至少约99.3％相同的hao3基因。
97.根据权利要求96所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因、与SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amo2基因、与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因、与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因、与SEQ ID NO:5至少约99.9％相同的amoC1基因、与SEQ ID NO:11至少约99.9％相同的amoC2基因以及与SEQ ID NO:17至少约99.0％相同的amoC3基因。
98.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:18至少约99.6％相同的Hao1蛋白、与SEQ ID NO:20至少约99.7％相同的Hao2蛋白以及与SEQ ID NO:22至少约99.7％相同的Hao3蛋白。
99.根据权利要求98所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白、与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白、与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白或与SEQID NO:16至少约99.4％相同的AmoC3蛋白。
100.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:25至少约98.1％相同的cycA1基因、与SEQ ID NO:27至少约98.8％相同的cycA2基因以及与SEQ IDNO:28至少约99.4％相同的cycA3基因。
101.根据权利要求100所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因、与SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amo2基因、与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因、与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因、与SEEQ ID NO:5至少约99.9％相同的amoC1基因、与SEQ ID NO:11至少约99.9％相同的amoC2基因、与SEQ ID NO:17至少约99.0％相同的amoC3基因、与SEQ ID NO:19至少约99.1％相同的hao1基因、与SEQ ID NO:21至少约99.5％相同的hao2基因以及与SEQ ID NO:23至少约99.3％相同的hao3基因。
102.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:24至少约99.2％相同的CycA1蛋白、与SEQ ID NO:26至少约99.7％相同的CycA2蛋白以及与SEQ IDNO:28至少约99.7％相同的CycA3蛋白。
103.根据权利要求102所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白、与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白、与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:16至少约99.4％相同的AmoC3蛋白、与SEQ ID NO:18至少约99.6％相同的Hao1蛋白、与SEQ ID NO:20至少约99.7％相同的Hao2蛋白以及与SEQ IDNO:22至少约99.7％相同的Hao3蛋白。
104.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:31至少约96.8％相同的cycB1基因以及与SEQ ID NO:33至少约97.2％相同的cycB2基因。
105.根据权利要求104所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:7至少约98.9％相同的amoA1基因、与SEQ ID NO:13至少约98.9％相同的amo2基因、与SEQ ID NO:9至少约99.2％相同的amoB1基因、与SEQ ID NO:15至少约99.2％相同的amoB2基因、与SEQ ID NO:5至少约99.9％相同的amoC1基因、与SEQ ID NO:11至少约99.9％相同的amoC2基因、与SEQ ID NO:17至少约99.0％相同的amoC3基因、与SEQ ID NO:19至少约99.1％相同的hao1基因、与SEQ ID NO:21至少约99.5％相同的hao2基因、与SEQID NO:23至少约99.3％相同的hao3基因、与SEQ ID NO:25至少约98.1％相同的cycA1基因、与SEQ ID NO:27至少约98.8％相同的cycA2基因以及与SEQ ID NO:28至少约99.4％相同的cycA3基因。
106.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:30至少约97.2％相同的CycB1蛋白或与SEQ ID NO:32至少约98.8％相同的CycB2蛋白。
107.根据权利要求106所述的亚硝化单胞菌细菌，其进一步包含下列中的一个或多个：与SEQ ID NO:6至少约99.0％相同的AmoA1蛋白、与SEQ ID NO:12至少约99.0％相同的AmoA2蛋白、与SEQ ID NO:8至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:14至少约99.6％相同的AmoB1蛋白、与SEQ ID NO:16至少约99.4％相同的AmoC3蛋白、与SEQ ID NO:18至少约99.6％相同的Hao1蛋白、与SEQ ID NO:20至少约99.7％相同的Hao2蛋白、与SEQ ID NO:22至少约99.7％相同的Hao3蛋白、与SEQ ID NO:24至少约99.2％相同的CycA1蛋白、与SEQID NO:26至少约99.7％相同的CycA2蛋白以及与SEQ ID NO:28至少约99.7％相同的CycA3蛋白。
108.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含根据SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:33的一种或多种基因。
109.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含根据SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:32的一种或多种蛋白质。
110.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在表2中列出的至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个或所有氨基酸位置突变的蛋白质。
111.一种亚硝化单胞菌细菌，其包含相对于亚硝化单胞菌菌株C91在表2中列出的所有氨基酸位置具有突变的蛋白质。
112.根据权利要求1至111中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌，其为转基因的。
113.根据权利要求80至112中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌，其具有选自优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性的至少一种特性。
114.根据权利要求113所述的亚硝化单胞菌细菌，其具有选自优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性的至少两种特性。
115.根据权利要求113所述的亚硝化单胞菌细菌，其具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性。
116.一种组合物，其包含根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌，其中所述组合物大体上不含其它生物体。
117.一种组合物，其包含根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌且进一步包含第二生物体，其中所述组合物大体上不含其它生物体。
118.根据权利要求117所述的组合物，其中所述第二生物体为氨氧化细菌。
119.根据权利要求117所述的组合物，其中所述第二生物体选自由亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属、乳酸杆菌属、链球菌属和双歧杆菌属及其组合所组成的组。
120.一种组合物，其包含OD600为至少约0.2的亚硝化单胞菌细菌的活跃分裂培养物的细胞悬浮液，其中所述组合物大体上不含其它生物体。
121.一种用于局部施用的组合物，其包含根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌以及适用于局部施用的药学上或美容上可接受的赋形剂。
122.根据权利要求121所述的组合物，其大体上不含其它生物体。
123.根据权利要求121所述的组合物，其进一步包含第二生物体。
124.根据权利要求123所述的组合物，其中所述第二生物体为氨氧化细菌。
125.根据权利要求123所述的组合物，其中所述第二生物体选自由亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属、乳酸杆菌属、链球菌属和双歧杆菌属及其组合所组成的组。
126.根据权利要求121至125中任一项所述的组合物，其作为粉末、化妆品、乳霜、棒状物、气雾剂、药膏、擦拭物或绷带提供或布置在这些物品中。
127.根据权利要求121至126中任一项所述的组合物，其进一步包含保湿剂、脱臭剂、香味剂、着色剂、驱虫剂、清洁剂或防紫外线剂。
128.根据权利要求121至127中任一项所述的组合物，其中所述赋形剂包括抗粘附剂、粘合剂、涂层剂、崩解剂、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、吸附剂、防腐剂或甜味剂。
129.根据权利要求121至128中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的亚硝化单胞菌的浓度为约1011-1012CFU/L。
130.根据权利要求121至129中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的亚硝化单胞菌的浓度为约109CFU/ml。
131.根据权利要求121至130中任一项所述的组合物，其中亚硝化单胞菌对药物赋形剂的质量比在约0.1克/升至约1克/升的范围内。
132.一种组合物，其包含至少约1,000L约1012CFU/L的根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌。
133.一种组合物，其包含至少约1、2、5、10、20、50、100、200或500g根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌，其例如作为干燥制剂如粉末。
134.一种服装制品，其包含例如在提供下列中的一个或多个的浓度下的根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌：治疗或预防皮肤病症、治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病或病状、治疗或预防体臭、用于向受试者供应一氧化氮的治疗或用于抑制微生物生长的治疗。
135.根据权利要求134所述的服装制品，其为包装的。
136.根据权利要求134至135所述的服装制品，其被包装在防气体交换或防水的材料中。
137.一种布料，其包含根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌。
138.一种纱，其包含根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌。
139.一种线，其包含根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌。
140.一种获得(例如，制造)具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性的亚硝化单胞菌细菌的方法，其包括：
(a)在选出优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个的条件下培养所述细菌，由此产生培养物；
(b)测试来自所述培养物的样品的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性；以及
(c)重复所述培养和测试步骤，直到获得具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性的细菌。
141.根据权利要求140所述的方法，其进一步包括从来源获得亚硝化单胞菌细菌的步骤。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述来源为土壤或个体的皮肤。
143.根据权利要求142所述的方法，其中在选择优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个的条件下培养所述细菌包括在含有约200mM NH4 +的亚硝化单胞菌培养基中培养所述细菌。
144.根据权利要求143所述的方法，其包括建立纯性培养物的步骤。
145.根据权利要求143或144所述的方法，其包括将所述亚硝化单胞菌与至少一种其它类型的氨氧化细菌一起共培养的步骤。
146.根据权利要求140至145中任一项所述的方法，其中步骤(a)的亚硝化单胞菌缺少优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性。
147.根据权利要求140至146中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括重复所述培养和测试步骤，直到获得具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率和优化的NH4 +抗性中的至少两者的细菌。
148.一种由根据权利要求140至147中任一项所述的方法生产的亚硝化单胞菌细菌。
149.一种测试亚硝化单胞菌的制剂的方法，其包括：
分析所述亚硝化单胞菌的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个；以及
如果所述亚硝化单胞菌具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个，则将所述亚硝化单胞菌分类为可接受的。
150.根据权利要求149所述的方法，其进一步包括测试所述制剂中的污染生物体的步骤。
151.根据权利要求149至150中任一项所述的方法，其进一步包括从所述制剂中移出样品并对所述样品进行测试的步骤。
152.根据权利要求149至151中任一项所述的方法，其进一步包括测试其中培养有所述亚硝化单胞菌的培养基。
153.根据权利要求149至152中任一项所述的方法，其进一步包括将来自所述制剂的亚硝化单胞菌包装成包装物。
154.根据权利要求149至153中任一项所述的方法，其进一步包括将来自所述制剂的亚硝化单胞菌商业化。
155.一种生产例如制造亚硝化单胞菌的方法，其包括使亚硝化单胞菌与培养基接触并培养所述亚硝化单胞菌，直至达到至少约0.5的OD600。
156.根据权利要求155所述的方法，其进一步包括分析所述亚硝化单胞菌和培养基中的污染生物体。
157.根据权利要求155至156中任一项所述的方法，其进一步包括分析所述亚硝化单胞菌的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个。
158.根据权利要求155至157中任一项所述的方法，其包括产生至少至少约1,000L/天约1012CFU/L的亚硝化单胞菌。
159.一种生产例如制造亚硝化单胞菌的方法，其包括使亚硝化单胞菌与培养基接触并培养所述亚硝化单胞菌，直至产生约至少约1,000L约1012CFU/L的亚硝化单胞菌。
160.根据权利要求159所述的方法，其进一步包括分析所述亚硝化单胞菌的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个的步骤。
161.根据权利要求159至160中任一项所述的方法，其进一步包括测试所述亚硝化单胞菌或培养基中的污染生物体的步骤。
162.根据权利要求159至161中任一项所述的方法，其中与所述培养基进行接触的所述亚硝化单胞菌是具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个的亚硝化单胞菌。
163.一种生产例如制造亚硝化单胞菌的方法，其包括：
(a)使亚硝化单胞菌与培养基接触；和
(b)培养所述亚硝化单胞菌1至2天，由此建立培养物，直至所述培养物达到约0.5-0.6的OD600。
164.根据权利要求163所述的方法，其进一步包括分析所述亚硝化单胞菌的优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个的步骤。
165.根据权利要求163至164中任一项所述的方法，其进一步包括测试所述培养物中的污染生物体的步骤。
166.根据权利要求163至165中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述亚硝化单胞菌是具有优化的生长速率、优化的NH4 +氧化速率或优化的NH4 +抗性中的一个或多个的亚硝化单胞菌。
167.根据权利要求163至166中任一项所述的方法，其包括产生至少至少约1,000L/天约1012CFU/L的亚硝化单胞菌。
168.一种由根据权利要求155至167中任一项所述的方法生产的亚硝化单胞菌细菌。
169.一种由根据权利要求155至167中任一项所述的方法制备的亚硝化单胞菌的制剂。
170.根据权利要求169所述的制剂，其中所述制剂包含至少约0.1至约100毫克(mg)亚硝化单胞菌。
171.一种包含亚硝化单胞菌的反应混合物，所述亚硝化单胞菌具有约0.5至约0.6的光密度。
172.一种生产携有亚硝化单胞菌的服装的方法，其包括使服装制品与根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌接触。
173.根据权利要求172所述的方法，其包括生产至少10、100或1000个服装制品。
174.根据权利要求172所述的方法，其包括使所述服装制品与至少1010CFU的亚硝化单胞菌接触。
175.根据权利要求172所述的方法，其进一步包括包装所述服装。
176.一种获得亚硝化单胞菌的制剂的方法，其包括使根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌与药学上或美容上可接受的赋形剂接触。
177.根据权利要求176所述的方法，其进一步包括混合所述亚硝化单胞菌和所述赋形剂。
178.根据权利要求176所述的方法，其在大体上不含污染生物体的条件下进行。
179.一种包装亚硝化单胞菌的方法，其包括将根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌组装至包装中。
180.根据权利要求179所述的方法，其中所述包装是防气体交换或防水的。
181.根据权利要求179所述的方法，其中所述包装对气体交换、NH3、NH4 +或NO2 -是可渗透的。
182.一种抑制受试者皮肤上的微生物生长的方法，其包括向有需要的受试者局部施用有效剂量的根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述有效剂量为约1.5x1010CFU。
184.根据权利要求182至183中任一项所述的方法，其中每天进行所述施用两次。
185.根据权利要求182至184中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
186.根据权利要求182至185中任一项所述的方法，其中待抑制的微生物生长是铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌或鲍曼不动杆菌的生长。
187.一种向受试者供应一氧化氮的方法，其包括将有效剂量的根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌放置在紧邻所述受试者处。
188.一种减少体臭的方法，其包括向有需要的受试者局部施用有效剂量的根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌。
189.一种治疗与低亚硝酸盐水平有关的疾病的方法，其包括向有需要的受试者局部施用治疗有效剂量的根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌。
190.根据权利要求189所述的方法，其中所述疾病是HIV皮炎、糖尿病足溃疡中的感染、过敏性皮炎、痤疮例如寻常痤疮、湿疹、接触性皮炎、过敏反应、银屑病、皮肤感染、血管疾病、阴道酵母菌感染、性传播疾病、心脏病、动脉粥样硬化、脱发、继发于糖尿病或卧床的下肢溃疡、心绞痛特别是慢性稳定型心绞痛、缺血性疾病、充血性心脏衰竭、心肌梗死、缺血再灌注损伤、蹄叶炎、高血压、肥厚性器官退化、雷诺氏现象、纤维化、纤维化器官退化、过敏、自身免疫性致敏、终末期肾病、肥胖、阳痿或癌症。
191.一种治疗皮肤病症的方法，其包括向有需要的受试者局部施用治疗有效剂量的根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌。
192.根据权利要求191所述的方法，其中所述皮肤病症是痤疮例如寻常痤疮、酒渣鼻、湿疹或银屑病。
193.根据权利要求191所述的方法，其中所述皮肤病症是溃疡，例如，静脉性溃疡，例如下肢溃疡，例如下肢静脉性溃疡，例如糖尿病足溃疡中的感染。
194.根据权利要求191至193中任一项所述的方法，其中局部施用包括用亚硝化单胞菌(例如，根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌)预治疗所述受试者。
195.根据权利要求191至194中任一项所述的方法，其中局部施用包括在所述皮肤病症发生之前的局部施用。
196.根据权利要求191至195中任一项所述的方法，其中局部施用包括在所述皮肤病症发生之后的局部施用。
197.一种促进伤口愈合或闭合的方法，其包括向伤口施用有效剂量的根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌细菌。
198.根据权利要求197所述的方法，其中所述伤口包含一种或多种非所需的细菌，例如，致病性细菌。
199.根据权利要求197所述的方法，其中所述伤口包含金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌。
200.根据权利要求197所述的方法，其中在所述伤口出现之前向所述受试者施用所述亚硝化单胞菌。
201.根据权利要求197所述的方法，其中向所述伤口施药包括在所述伤口出现之前向所述受试者施药。
202.根据权利要求197至201中任一项所述的方法，其进一步包括在所述伤口出现之后向所述伤口施用亚硝化单胞菌。
203.一种杀死致病性细菌或抑制致病性细菌的生长的方法，其包括使亚硝化单胞菌细菌(例如，根据权利要求1至115中任一项所述的亚硝化单胞菌)接触(例如，施加至)皮肤。
204.根据权利要求203所述的方法，其中所述致病性细菌促进下列病状中的一个或多个：HIV皮炎、溃疡(例如，静脉性溃疡，例如下肢溃疡，例如下肢静脉性溃疡，例如糖尿病足溃疡中的感染)、过敏性皮炎、痤疮(例如寻常痤疮)、湿疹、接触性皮炎、过敏反应、银屑病、荨麻疹、酒渣鼻、皮肤感染、血管疾病、阴道酵母菌感染、性传播疾病、心脏病、动脉粥样硬化、脱发、继发于糖尿病或卧床的下肢溃疡、心绞痛(特别是慢性稳定型心绞痛)、缺血性疾病、充血性心脏衰竭、心肌梗死、缺血再灌注损伤、蹄叶炎、高血压、肥厚性器官退化、雷诺氏现象、纤维化、纤维化器官退化、过敏、自身免疫性致敏、终末期肾病、肥胖、阳痿、肺炎、原发性免疫缺陷病、大疱性表皮松解症或癌症。
205.根据权利要求204所述的方法，其中所述病状是溃疡，例如，静脉性溃疡，例如下肢溃疡，例如下肢静脉性溃疡，例如糖尿病足溃疡中的感染。
206.根据权利要求204所述的方法，其中所述病状是下肢静脉性溃疡。
207.根据权利要求204所述的方法，其中所述病状是痤疮，例如寻常痤疮。
208.根据权利要求204所述的方法，其中所述病状是寻常痤疮。
209.根据权利要求203至208中任一项所述的方法，其中所述致病性细菌是痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌或鲍曼不动杆菌中的一个或多个。
210.根据权利要求203至209中任一项所述的方法，其进一步包括确定所述受试者是否需要杀死致病性细菌或抑制致病性细菌的生长，例如，确定所述受试者需要杀死致病性细菌或抑制致病性细菌的生长。
211.根据权利要求203至210中任一项所述的方法，其进一步包括选择需要杀死致病性细菌或抑制致病性细菌的生长的受试者。
212.一种改变受试者的皮肤微生物组的组成的方法，其包括：
向所述皮肤的表面施用(例如，施加)含有氨氧化细菌的制剂，
其中施用例如施加的量和频率足以减少所述皮肤表面上的致病性细菌的比例。
213.根据权利要求212所述的方法，其进一步包括基于所述受试者需要减少皮肤表面上的致病性细菌的比例来选择所述受试者。
214.根据权利要求212至213中任一项所述的方法，其中所述制剂包含氨、铵盐和尿素中的至少一种。
215.根据权利要求212至214中任一项所述的方法，其中所述制剂包含控释材料，例如，缓释材料。
216.根据权利要求212至215中任一项所述的方法，其中所述氨氧化细菌的制剂进一步包含赋形剂，例如，药学上可接受的赋形剂或美容上可接受的赋形剂中的一种。
217.根据权利要求216所述的方法，其中所述赋形剂例如所述药学上可接受的赋形剂和所述美容上可接受的赋形剂中的一种适用于局部、鼻部、肺部和胃肠道施用中的一个。
218.根据权利要求216至217中任一项所述的方法，其中所述赋形剂例如所述药学上可接受的赋形剂和所述美容上可接受的赋形剂中的一种是表面活性剂。
219.根据权利要求218所述的方法，其中所述表面活性剂选自由以下所组成的组：椰油酰胺丙基甜菜碱(ColaTeric COAB)、聚山梨醇酯(例如，Tween 80)、乙氧基化月桂醇(RhodaSurf 6 NAT)、月桂基醚硫酸钠/月桂基葡糖苷/椰油酰胺丙基甜菜碱(Plantapon611 L UP)、月桂基醚硫酸钠(例如，RhodaPex ESB 70 NAT)、烷基聚葡糖苷(例如，Plantaren 2000N UP)、月桂基醚硫酸钠(Plantaren 200)、布朗纳博士的卡斯蒂利亚肥皂、月桂胺氧化物(ColaLux Lo)、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚磺酸酯烷基聚葡糖苷(PolySufanate 160 P)、月桂基硫酸钠(Stepanol-WAExtra K)及其任意组合。
220.根据权利要求212至219中任一项所述的方法，其中所述制剂大体上不含其它生物体。
221.根据权利要求212至220中任一项所述的方法，其中所述制剂被布置在粉末、化妆品、乳霜、棒状物、气雾剂、药膏、擦拭物或绷带中。
222.根据权利要求212至221中任一项所述的方法，其中所述制剂作为粉末、化妆品、乳霜、棒状物、气雾剂、药膏、擦拭物或绷带来提供。
223.根据权利要求212至222中任一项所述的方法，其中所述制剂包含保湿剂、脱臭剂、香味剂、着色剂、驱虫剂、清洁剂或防紫外线剂。
224.根据权利要求216至217中任一项所述的方法，其中所述赋形剂例如所述药学上可接受的赋形剂或所述美容上可接受的赋形剂包括抗粘附剂、粘合剂、涂层剂、崩解剂、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、吸附剂、防腐剂或甜味剂。
225.根据权利要求212至224中任一项所述的方法，其中所述含有氨氧化细菌的制剂包含约108至约1014CFU/L。
226.根据权利要求225所述的方法，其中所述制剂包含约1x109CFU/L至约10x109CFU/L。
227.根据权利要求212至226中任一项所述的方法，其中所述含有氨氧化细菌的制剂包含约50毫克(mg)至约1000mg氨氧化细菌。
228.根据权利要求216至227中任一项所述的方法，其中氨氧化细菌对所述赋形剂例如所述药学上可接受的赋形剂或所述美容上可接受的赋形剂的质量比在约0.1克/升至约1克/升的范围内。
229.根据权利要求212至228中任一项所述的方法，其中所述氨氧化细菌的制剂可用于治疗或预防皮肤病症、治疗或预防与低亚硝酸盐水平有关的疾病或病状、治疗或预防体臭、进行治疗以向受试者供应一氧化氮或进行治疗以抑制微生物生长例如致病性细菌的生长。
230.根据权利要求212至229中任一项所述的方法，其中所述氨氧化细菌选自由亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化囊菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属和其组合所组成的组。,
231.根据权利要求212至230中任一项所述的方法，其中所述制剂包含选自由乳酸杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属及其组合所组成的组的生物体。
232.根据权利要求212至230中任一项所述的方法，其中所述制剂大体上不含除氨氧化细菌以外的生物体。
233.根据权利要求212至232中任一项所述的方法，其中所述氨氧化细菌的制剂包含处于生长状态的氨氧化细菌。
234.根据权利要求212至232中任一项所述的方法，其中所述氨氧化细菌的制剂包含处于储存状态的氨氧化细菌。
235.根据权利要求212至234中任一项所述的方法，其用于递送美容产品。
236.根据权利要求212至234中任一项所述的方法，其用于递送治疗产品。
237.根据权利要求212至236中任一项所述的方法，其中所述制剂可用于治疗下列中的至少一个：HIV皮炎、糖尿病足溃疡中的感染、过敏性皮炎、痤疮例如寻常痤疮、湿疹、接触性皮炎、过敏反应、银屑病、荨麻疹、酒渣鼻、皮肤感染、血管疾病、阴道酵母菌感染、性传播疾病、心脏病、动脉粥样硬化、脱发、继发于糖尿病或卧床的下肢溃疡、心绞痛特别是慢性稳定型心绞痛、缺血性疾病、充血性心脏衰竭、心肌梗死、缺血再灌注损伤、蹄叶炎、高血压、肥厚性器官退化、雷诺氏现象、纤维化、纤维化器官退化、过敏、自身免疫性致敏、终末期肾病、肥胖、阳痿、肺炎、原发性免疫缺陷病、大疱性表皮松解症或癌症。
238.根据权利要求237所述的方法，其中所述制剂可用于治疗痤疮例如寻常痤疮、湿疹、银屑病、荨麻疹、酒渣鼻和皮肤感染中的至少一个。
239.根据权利要求212至238中任一项所述的方法，其中将所述制剂提供在容器中，所述制剂和所述容器具有小于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000克的重量。
240.根据权利要求212至239中任一项所述的方法，其中所述制剂具有小于约0.1％至约10％的表面活性剂。
241.根据权利要求212至240中任一项所述的方法，其中所述制剂大体上不含表面活性剂。
242.根据权利要求212至241中任一项所述的方法，其中所述制剂包含螯合剂。
243.根据权利要求212至242中任一项所述的方法，其中每天施用所述制剂约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次。
244.根据权利要求212至243中任一项所述的方法，其中每天施用所述制剂一次。
245.根据权利要求212至243中任一项所述的方法，其中每天施用所述制剂两次。
246.根据权利要求212至245中任一项所述的方法，其中施用所述制剂约1-3天、3-5天、5-7天、7-9天、5-10天、10-14天、12-18天、12-21天、21-28天、28-35天、35-42天、42-49天、49-56天、46-63天、63-70天、70-77天、77-84天或84-91天。
247.根据权利要求212至246中任一项所述的方法，其中施用所述制剂约16天。
248.根据权利要求212至247中任一项所述的方法，其进一步包括从所述皮肤表面获取样品。
249.根据权利要求248所述的方法，其进一步包括分离所述样品中的细菌的DNA。
250.根据权利要求248至249中任一项所述的方法，其进一步包括对所述样品中的细菌的DNA进行测序。
251.根据权利要求212至250中任一项所述的方法，其中施用所述氨氧化细菌增加所述表面上的非致病性细菌的比例。
252.根据权利要求251所述的方法，其中所述非致病性细菌是共生非致病性细菌。
253.根据权利要求252所述的方法，其中所述非致病性细菌是葡萄球菌属的共生非致病性细菌。
254.根据权利要求253所述的方法，其中所述非致病性细菌是共生非致病性细菌表皮葡萄球菌。
255.根据权利要求252至254中任一项所述的方法，其中所述葡萄球菌属的非致病性细菌在约2周后增加或被确定为增加。
256.根据权利要求255所述的方法，其中所述非致病性细菌表皮葡萄球菌在约2周后增加或被确定为增加。
257.根据权利要求212至256中任一项所述的方法，其中潜在致病性的或疾病相关性的丙酸杆菌在约2周后减少或被确定为减少。
258.根据权利要求212至257中任一项所述的方法，其中潜在致病性的或疾病相关性的寡养单胞菌在约2周后减少或被确定为减少。
259.根据权利要求212至258中任一项所述的方法，其中所述皮肤表面包含伤口。
260.一种通过根据权利要求212至259中任一项所述的方法来治疗痤疮例如寻常痤疮的方法。
261.一种通过根据权利要求212至259中任一项所述的方法来治疗湿疹的方法。
262.一种通过根据权利要求212至259中任一项所述的方法来治疗银屑病的方法。
263.一种通过根据权利要求212至259中任一项所述的方法来治疗荨麻疹的方法。
264.一种通过根据权利要求212至259中任一项所述的方法来治疗酒渣鼻的方法。
265.一种通过根据权利要求212至259中任一项所述的方法来治疗皮肤感染的方法。
266.一种通过根据权利要求212至258中任一项所述的方法来减少受试者表面上的非所需细菌的量的方法。
267.一种核酸，其包含来自SEQ ID NO:66或其逆向补体内的15至100个连续核苷酸的序列，条件为所述核酸具有非天然存在的序列或另一种修饰如标签或二者。
268.根据权利要求267所述的核酸，其中所述15至100个连续核苷酸的序列是未在亚硝化单胞菌菌株C91中发现的序列中。
269.根据权利要求267或268所述的核酸，其进一步包含位于来自SEQ ID NO:66内的15-100个连续核苷酸的序列的5’端的异源序列。
270.根据权利要求267或268所述的核酸，其进一步包含位于来自SEQ ID NO:66内的15-100个连续核苷酸的序列的3’端的异源序列。
271.根据权利要求267或268所述的核酸，其进一步包含位于来自SEQ ID NO:66内的15-100个连续核苷酸的序列的5’端的第一异源序列和位于来自SEQ ID NO:66内的15-100个连续核苷酸的序列的3’端的第二异源序列。
272.根据权利要求267至271中任一项所述的核酸，其具有15-20个、20-25个、25-30个、30-24或25-40个核苷酸的长度。
273.根据权利要求267至272中任一项所述的核酸，其结合例如共价结合至可检测标记，例如荧光标记。
274.一种组合物，其包括：
包含来自SEQ ID NO:66内的15至100个连续核苷酸的第一核酸；以及
包含来自SEQ ID NO:66的逆向补体内的15至100个连续核苷酸的第二核酸，
条件为所述第一核酸或所述第二核酸或两者具有非天然存在的序列或修饰如标签或二者。
275.根据权利要求274所述的组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸或所述第一核酸和第二核酸中的每个不包含在亚硝化单胞菌菌株C91中发现的序列中。
276.根据权利要求274或275所述的组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸或所述第一核酸和第二核酸中的每个进一步包含位于来自SEQ ID NO:66内的15-100个连续核苷酸的序列的5’端的异源序列。
277.根据权利要求274至276中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸或所述第一核酸和第二核酸中的每个进一步包含位于来自SEQ ID NO:66内的15-100个连续核苷酸的序列的3’端的异源序列。
278.根据权利要求274至277中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸或所述第一核酸和第二核酸中的每个具有15-20个、20-25个、25-30个、30-24或25-40个核苷酸的长度。
279.根据权利要求274至278中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸或所述第一核酸和第二核酸中的每个结合(例如，共价结合)至可检测标记，例如荧光标记。
280.一种核酸，其由序列AATCTGTCTCCACAGGCAGC(SEQ ID NO:64)组成。
281.一种核酸，其由序列TATACCCACCACCCACGCTA(SEQ ID NO:65)组成。
282.一种分子，其包含根据权利要求280或281所述的核酸以及可检测标记，例如荧光标记。
283.一种组合物，其包括由序列AATCTGTCTCCACAGGCAGC(SEQ ID NO:64)组成的第一核酸和由序列TATACCCACCACCCACGCTA(SEQ ID NO:65)组成的第二核酸。
284.一种组合物，其包括：
第一分子，所述第一分子包含(i)由序列AATCTGTCTCCACAGGCAGC(SEQ ID NO:64)组成的第一核酸，并且任选地包含(ii)可检测标记，例如荧光标记；以及
第二分子，所述第二分子包含(i)由序列TATACCCACCACCCACGCTA(SEQ ID NO:65)组成的第二核酸，并且任选地包含(ii)可检测标记，例如荧光标记。
285.一种检测样品中是否存在D23亚硝化单胞菌核酸的方法，其包括：
使用特异于亚硝化单胞菌D23的引物对所述样品进行聚合酶链反应(PCR)；以及
测定是否产生了PCR产物，其中PCR产物的存在表明所述样品中存在所述D23亚硝化单胞菌核酸。
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