CH656388A5

CH656388A5 - Dns-sequenzen und rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-fibroblasten-interferon.

Info

Publication number: CH656388A5
Application number: CH238/85A
Authority: CH
Inventors: David Van Norman Goeddel; Roberto Crea
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1980-09-25
Filing date: 1981-09-24
Publication date: 1986-06-30
Also published as: EP0048970A2; AU7564981A; ATA410381A; NL8104400A; MTP900B; EP0048970A3; IT1139487B; PL233194A1; IE51679B1; YU44835B; ZW23981A1; KE3630A; DD209477A5; ES515032A0; FR2490675B1; SE8105657L; DD209652A5; ES505742A0; IE812224L; OA06908A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekom-binanten DNS-Technologie, d.h. Verfahren, die auf diesem Gebiet verwendet werden, DNS-Sequenzen sowie rekombi-nante Expressionsvektoren, die mit diesen Verfahren erhalten werden.

Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung DNS-Sequenzen, die insbesondere die Aminosäuresequenz von reifem Human-Interferon kodieren. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Expressions-Vektoren (im folgenden kurz Vektoren genannt), die in diesem Verfahren verwendet werden und die neuen Mikroorganismen, die diese Vektoren enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Hintergrund der Erfindung

Human-Fibroblasten-Interferon (FIF) ist ein Protein, das antivirale sowie ein weites Spektrum anderer biologischer Aktivitäten aufweist (Übersicht siehe W.E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag, New York-Wien, 1979). Angeblich ist es bis zur Homogenität gereinigt worden. Es handelt sich um ein einzelnes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 19 000 — 20 000, mit einer spezifischen Aktivität von 2 —10 x 108 Einheiten/mg (E. Knight,

2

Proc. Nati. Acad. Sei. USA 73, 520-523 [1976]; W. Berthold et al., J. Biol. Chem. 253, 5206-5212 [1978]). Die Sequenz der 13 NH2-terminaIen Aminosäuren des FIF wurde als Met-Ser-T yr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-s Ser bestimmt (E. Knight et al., Science 207, 525—526 [1980]). Houghton et al. (Nucleic Acids Res. 8,1913—1931 [1980]) haben synthetische Deoxyoligonucleotide (vorausgesagt aus der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenz) verwendet, um die Sequenz der 276 5'-terminalen Nucleotide io von FIF-mRNS zu bestimmen. Taniguchi et al. (Nature 285, 547 — 549 [1980]; Gene 10, 11 —15 [1980]) und Derynck et al. (Nature 285, 542—547 [1980]) waren kürzlich in der Lage, die Nucleotidsequenz klonierter cDNS-Kopien von FIF-mRNS in E. coli zu bestimmen und haben daraus die voll-15 ständige Aminosäuresequenz von Human-FIF einschliesslich einer 21 Aminosäure umfassenden Signalsequenz abgeleitet. Das reife Peptid umfasst 166 Aminosäuren. Schliesslich haben Taniguchi et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 77, 5230—5233 [1980]) ein Plasmid konstruiert, welches die Ex-20 pression des Human-FIF-Gens in E. coli veranlasst, so dass reifes FIF erhalten wird.

Durch rekombinante DNS-Technologie ist es inzwischen gelungen, eine grosse Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren inzwischen be-25 reits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, dass sie die Herstellung von Polypeptiden wie So-matostatin, die A und B Ketten des Human-Insulins und Human-Wachstumshormon gestatten (Itakura et al., Science 198,1056-1063 [1977]; Goeddel et al., Nature 281, 30 544—548 [1979]). Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin, Thymosin ai und Leukozyten-Interferon.

Das Zugpferd der rekombinanten DNS-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträn-35 giger DNS, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasmid-DNS enthaltene Information umfasst diejenige zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d.h. ein «Replicon») und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Charakteristiken wie, 40 im Fall von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, dass sie spezifisch durch die eine 45 oder andere Restriktions-Endonuclease (auch Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endo-nuclease eine andere Stelle der Plasmid-DNS erkennt. Hete-rologe Gene oder Genfragmente können in das Plasmid an den Spaltstellen oder an anschliessend an die Spaltstellen reso konstruierte Enden eingefügt werden. Die DNS-Rekombination wird ausserhalb der Zelle durchgeführt aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt und grosse Mengen an heterologe Gene enthaltenden, re-5s kombinierten Plasmiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d.h. operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plasmids eingefügt, die für die Transcription und Translation der kodierten DNS-Nachricht verantwortlich 60 sind, dann kann das erhaltene rekombinierte Plasmid (Expressionsvektor, Vektor) zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden, dass durch das heterologe Gen kodiert wird. Dieser Prozess wird als Expression bezeichnet.

Die Expression wird ausgelöst in der Promoter-Region, 65 die durch RNS-Polymerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z.B. beim Tryptophan- oder «Trp»-Promoter, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promoter-Regionen von söge-

3

656 388

nannten Operator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promoter-Operator. Operatoren sind DNS-Sequenzen, die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promoter regulieren. Die Polymerase wandert an der DNS entlang und überschreibt die Information, die der kodierende Strang enthält, vom 5'-zum 3'-Ende in mRNS, die dann wiederum in das Polypeptid mit der durch die DNS kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jede Aminosäure eines Polypeptids wird innerhalb des sogenannten Strukturgens durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon kodiert. Nach der Bindung an den Promoter transkribiert die RNS-Polymerase zunächst Nukleotide, die eine Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der mRNS zu AUG wird) und schliesslich die Nukleotid-Sequenzen des Strukturgens selbst. Am Ende des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weitere mRNS-Sequenzen bilden kann, die aber wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden. Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRNS an, in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle kodieren richtig liegen in Bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase sind. Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lyse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise.

Während das aus Spender-Fibroblasten isolierte homogene Fibroblasten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakterisierung und für limitierte klinische Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für breite klinische Prüfungen und die anschliessende prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Human-Fibroblasten-Interferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit < 1 %) und die langen Zeiten, die nötig sind, um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in grösserem Massstab geführt.

Der vorliegenden Erfindung lag der Gedanke zugrunde, dass die Anwendung der rekombinanten DNS-Technologie (d.h. die Einfügung eines Interferongens in mikrobielle Vektoren und deren Expression unter der Kontrolle mikrobieller genregulatorischer Elemente) der wirkungsvollste Weg zur Gewinnung grosser Mengen reinsten Fibroblasten-Interfe-rons wäre, welches trotz der Tatsache, dass es nicht glykosy-liert ist, wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behandlung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden könnte.

Ein Fibroblasten-Interferon-Gen wurde durch die folgenden Massnahmen erhalten:

1) Aminosäurepartialsequenzen von homogenem Hu-man-Fibroblasten-Interferon wurden verwendet, um synthetische DNS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle möglichen Nucleotidkombinationen repräsentierten, durch die die Aminosäurepartialsequenzen kodiert werden.

2) Es wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DNS (cDNS) aus induzierter mRNS enthielten. Die gemäss (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS verwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden. Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induzierter mRNS als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte 5 cDNS zu bilden. In dieser Weise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDNS hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kodierenden Gens. Jedes so erhaltene, möglicherweise eine Teilsequenz des Interferons kodierende Genio fragment wurde als Sonde für ein vollständiges Gen verwendet.

3) Das so erhaltene ungekürzte Gen wurde massgeschnei-dert unter Verwendung synthetischer DNS, um jegliche Lea-der-Sequenz, die die mikrobielle Expression des reifen Poly-15 peptids verhindern könnte, auszuschliessen und um es in einem Vektor in die richtige Position bringen zu können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines mikrobiellen Promoters. Das exprimierte Interferon wurde so weit gereinigt, dass es charakterisiert und seine Ak-20 tivität bestimmt werden konnte.

Unter Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DNS-Technologie konnte eine Reihe replizierbarer Plasmid-Vektoren hergestellt werden, die die Synthese eines reifen Polypeptids mit den Eigen-25 Schäften von authentischem Human-Fibroblasten-Interferon in einem transformierten Mikroorganismus mit hohen Ausbeuten veranlassen. Das erhaltene Polypeptid weist die Aminosäuresequenz des FIF auf und ist in in-vitro-Testen aktiv ungeachtet fehlender Glykosylierung wie sie für Material, 3o das aus natürlichen menschlichen Zellen gewonnen wurde, charakteristisch ist. Der Ausdruck «Expression von reifem Fibroblasten-Interferon» bezeichnet die mikrobielle (z. B. bakterielle) Herstellung eines Interferonmoleküls, das weder Glykosylgruppen noch eine Präsequenz enthält, die unmit-35 telbar die mRNS-Translation des Human-Fibroblasten-Interferon-Genoms veranlassen. Reifes Fibroblasten-Inter-feron wird erfindungsgemäss unmittelbar von einem Trans-lations-Startsignal (ATG) exprimiert, das gleichzeitig die erste Aminosäure des natürlichen Produkts kodiert. Die An-40 oder Abwesenheit von Methionin als erster Aminosäure im mikrobiell hergestellten Produkt ist kinetisch bedingt und hängt ab von den Fermentationsbedingungen und/oder der Höhe der Expression in dem transformierten Mikroorganismus.

45 Die zum Inhalt dieser Beschreibung gehörenden Figuren 1 — 5 werden an den geeigneten Textstellen genauer beschrieben. Figur 6 stellt schematisch die Herstellung der Plasmide dar, die die direkte Expression von reifem Fibroblasten-Interferon kodieren. Die Restriktionsstellen und -fragmente so sind angegeben («Pst I», usw.). «ApR» und «TcR» bezeichnen diejenigen Orte des Plasmids, die für die Expression der Ampicillin- bzw. Tetracyclin-Resistenz verantwortlich sind. Die Abkürzung «p o» steht für «Promoter-Operator». Figur 7a, b stellt schematisch die Herstellung des Plasmids pFIF 55 trp369 dar, welches die direkte Expression von reifem Fibroblasten-Interferon kodiert. Die Restriktionsstellen und -fragmente sind angegeben («Xba», usw.). Die Abkürzung «po» steht für «Promoter-Operator».

60 Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

A. Die verwendeten Mikroorganismen

Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Mikroorganismus ist E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi hsr~, 65 hsm+k), wie in der britischen Patentpublikation Nr. 255 382 A beschrieben. Dieser Stamm wurde am 28. 10. 1978 bei der American Type Culture Collection (ATCC Nr. 31 446) hinterlegt und ist der Öffentlichkeit frei zugänglich. Die gesamte

656 388

4

Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institutes of Health durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung, obgleich in ihrer bevorzugtesten Ausführungsform an E. coli K-12 Stamm 294 beschrieben, umfasst auch die Verwendung anderer E. coli-Stämme wie E. coli B, E. coli x 1776 und E. coli W 3110, sowie andere Mikroorganismen, von denen viele bei einem offiziellen De-positorium (z. B. der American Type Culture Collection, ATCC) hinterlegt wurden und von dort (möglicherweise) erhältlich sind (vergleiche auch deutsche Offenlegungsschrift Nr. 26 44 432). Weitere Mikroorganismen, die erfindungsge-mäss verwendet werden können, sind z. B. Bacilli, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem Salmonella typhimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die mit Hilfe von sich vermehrenden Plasmiden heterologe Gene zur Expression bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise in Saccharomyces cerevisiae, können Interferongene zur Expression gebracht werden unter der Kontrolle eines Hefe-Promotors.

B. Allgemeine Methoden

Die Restriktionsenzyme wurden bei New England Biolabs gekauft und vorschriftsmässig verwendet. Die Plasmid-DNS wurde nach einem Standard-Verfahren (D.B. Clewell, J. Bacteriol. 110,667—676 [1972]) hergestellt und durch Säulenchromatographie an Biogel A-50 M gereinigt. Die DNS-Sequenzierung erfolgte nach der Methode von Maxam und Gilbert (Methods Enzymol. 65,499—560 [1989]). Die durch Restriktion erhaltenen DNS-Fragmente wurden durch Elektroelution aus Polyacrylamidgelen erhalten. Die Radiomarkierung der DNS-Fragmente zwecks Verwendung als Hybridisierungssonden erfolgte nach der Methode von Taylor et al. (Biochim. Biophys. Acta 442, 324—330 [1976]). Die in-situ-Koloniehybridisierung wurde nach der Methode von Grunstein und Hogness durchgeführt (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 72,3961-3965 [1975]).

C. Synthese der Deoxyoligonucleotide

Die Deoxyoligonucleotide wurden synthetisiert nach der modifizierten Phosphotriester-Methode in Lösung (Crea et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 75, 5765—5769 [1978]) unter Verwendung von Trideoxynucleotiden als Bausteinen (Hiro-se et al., Tetrahedron Letters 28,2449 — 2452 [1978]). Die Materialien und allgemeinen Verfahren ähnelten den von Crea et al. beschriebenen (Nucleic Acids Res. 8,2331—2348 [1980]). Die 6 Starter-Pools (Figur 1), die jeweils 4 Dodeca-nucleotide enthielten, wurden durch separate Kopplung von 2 Hexamer-Pools (mit jeweils 2 unterschiedlichen 5'-termina-len Sequenzen) mit 3 verschiedenen Hexamer-Pools (mit jeweils 2 unterschiedlichen 3'-terminalen Sequenzen) erhalten.

D. Induktion der Fibroblasten

Human-Fibroblasten (Zellinie GM-2504A) wurden gezüchtet wie bereits von Pestka et al. beschrieben (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 72, 3898-3901 [1975]). Das Nährmedium (Eagle's Minimalmedium mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum) wurde aus den Rollflaschen (850 cm3) entfernt und ersetzt durch 50 ml Nährmedium, enthaltend

50 jig/ml Poly(I):Poly(C) und 10 (ig/ml Cycloheximid. Dieses Induktionsmedium wurde nach 4 Stunden bei 37 C entfernt und die Zell-Monoschichten wurden mit Phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen (PBS; 0,14M NaCl, 3mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8mM Na2HP04). Jede Flasche wurde bei 37 C mit 10 ml einer Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco 610 — 5305) inkubiert bis die Zellen sich ablösten. Dann wurde fötales Kälberserum bis zu einer Konzentration von 10% zugesetzt. Das Zellmaterial wurde 15 Minuten bei 500 x g zentrifugiert, der Rückstand nochmals in PBS suspendiert und sedimentiert. Die Zellen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren. Pro Rollflasche wurden etwa 0,17 g Zellmaterial erhalten.

5 E. Herstellung und Assay von Interferon-mRNS

Poly(A)-enthaltende mRNS wurde nach der von Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74—89 [1975]) beschriebenen Methode aus Humanfibroblasten durch Phenolextraktion und OHgo(dT)-Zellulose-Chromatographie erhal-10 ten. Die Poly(A)-enthaltende RNS wurde bezüglich Interfe-ron-mRNS durch Zentrifugieren in einem linearen Saccha-rose-Gradienten (5—20%, w/v) angereichert. Die RNS-Proben wurden während 2 Minuten auf 80°C erhitzt, schnell abgekühlt, über den Gradienten gegeben und 20 Stunden bei 15 30 000 U/min. bei 4 C in einem Beckman SW-40 Rotor zentrifugiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, mit Ethanol gefällt und in Wasser gelöst.

Ein-Mikrogramm-Proben von mRNS wurden, wie von Cavalieri et al. beschrieben (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 74, 20 3287—3291 [1977]), Xenopus laevis-Oocyten injiziert. Die Oocyten wurden 24 Stunden bei 21°C inkubiert, homogenisiert und 5 Minuten mit 10 000 x g zentrifugiert. Im Überstand wurde das Interferon nach dem CPE-Hemmtest (Stewart, The Interferon System, Springer-Verlag, NewYork-25 Wien, 1979) bestimmt unter Verwendung von Sindbis-Virus und humanen diploiden Zellen (WISH). Für die 12 S-Frak-tion der mRNS wurden Interferontiter von 1000 bis 6000 Einheiten/mg injizierter RNS festgestellt (NIH Referenzstandard).

30

F. Synthese und Clonierung von cDNS

Einsträngige cDNS wurde hergestellt in 100 ml Reaktionen, aus 5 [ig der 12S mRNS-Fraktion, 20 mM Tris-HCI (pH 8,3), 20 mM KCl, 8mM MgCl2, 30 mM ß-Mercaptoet-35 hanol, 100 |iCi (a32P)dCTP und 1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Der Starter war das synthetische Hindlll-Deca-mer dCCAAGCTTGG (Scheller et al., Science 196,

177—180 [1977]), das auf der 3'-terminalen Seite um etwa 20 — 30 Deoxythymidinreste unter Verwendung der termina-40 len Deoxynucleotidyl-Transferase (Chang et al., Nature 275, 617 — 624 [1978]) verlängert worden war. 100 Einheiten reverser Transkriptase wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei 42°C inkubiert. Die Synthese des zweiten Stranges der DNS wurde wie von Goeddel 45 et al. bereits beschrieben (Nature 281, 544—548 [1979]) ausgeführt. Die doppelsträngige cDNS wurde mit 1200 Einheiten Sl-Nuklease während 2 Stunden bei 37°C in 25 mM Na-triumacetat (pH 4,5), 1 mM ZnCl2 und 0,3 M NaCl behandelt. Nach Phenolextraktion wurde das Gemisch elektropho-50 retisch an einem 8%igen Polyakrylamidgel aufgetrennt. Durch Elektroelution wurden etwa 0,5 [ig cDNS von 550—1500 Basenpaaren (bp) erhalten. Ein aliquoter Teil (20 ng) wurde mit Deoxy(C)-Resten verlängert unter Verwendung terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase (Chang 55 et al., supra) und mit 100 ng des Plasmids pBR322, welches mit Deoxyguanosinresten an der Pstl-Spaltstelle (Chang et al., supra) verlängert worden war, verbunden. Das Gemisch wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 nach einem publizierten Verfahren (Hershfield et al., Proc. Nati, so Acad. Sei. USA 71, 3455-3459 [1974]) verwendet.

G. Herstellung von induzierten und nicht induzierten 32P-cDNS-Sonden

5 jxg 12S-mRNS wurden mit entweder 2 ng Oligo(dT) 65 oder je 5 ng der synthetischen Starter-Pools (Figur 1) in 60 jo.1 10 mM Tris-HCI (pH 8) und 1 mM EDTH kombiniert. Die Gemische wurden 3 Minuten gekocht, auf Eis gegeben und mit 60 (il 40 mM Tris-HCI (pH 8,3), 40 mM KCl, 16 mM

5

656388

MgCl2, 50 mM ß-Mercaptoethanol, 1 mM dATP, dGTP, dTTP und 5 x 10-7 M (a-J2P) dCTP (2000—3000 Ci/mM) bei 0°C versetzt. Nach Zusatz von 100 Einheiten reverser Transkriptase wurde 30 Minuten lang bei 42°C inkubiert und durch Passage über eine 10 ml-Sephadex G-50-Säule gereinigt. Die Produkte wurden mit 0,3 N NaOH während 30 Minuten bei 70°C behandelt, neutralisiert und mit Ethanol gefällt.

Die 32P-cDNSs wurden mit 100 ng Poly(A)-mRNS aus nichtinduzierten Fibroblasten in 50 jj.1 0,4M Natriumphosphat (pH 6,8) und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) versetzt. Die Gemische wurden 5 Minuten auf 98°C erhitzt und 15 Stunden bei 45°C getempert. Durch Chromatographie an Hydroxyapatit, wie von Galau et al. beschrieben (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 74,1020-1023 [1977]), wurden die DNS-RNS-Hybride (enthaltend nichtinduzierte cDNS-Sequenzen) von einsträngiger DNS (induzierten cDNS-Sequenzen) getrennt. Die DNS-RNS-Hybride wurden mit Alkali zwecks Entfernung von RNS behandelt.

H. Screening rekombinanter Plasmide mit 32P-cDNS-

Sonden

Plasmid-DNS-Proben von etwa 1 jag wurden aus individuellen Transformanten nach einem bekannten Verfahren (Birnboimetal., Nucleic Acids Res. 7,1513 — 1523 [1979]) hergestellt. Die DNS-Proben wurden durch Behandlung mit Eco RI linearisiert, in Alkali denaturiert und jeweils auf 3 Ni-trocellulosefilter nach der Tüpfelshybridisationsmethode (Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7,1541 —1552 [1979]) gebracht. Die Filter wurden mit den 32P-cDNS-Sonden während 16 Stunden bei 42°C in 50% Formamid, 10 x Den-hardt's Lösung (Biochem. Biophys. Res. Comm. 23,

641-646 [1966]), 6xSSC, 40 mM Tris-HCI (pH 7,5), 2 mM EDTA und 40 ng/ml Hefe-RNS hybridisiert. (SSC enthält 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumeitrat, pH 7,0). Die Filter wurden gewaschen mit 0,1 x SSC sowie 2 x 30 Minuten lang bei 42°C mit 0,1 % SDS, getrocknet und der Autoradiogra-phie unterworfen.

I. Konstruktion von Plasmiden für direkte Expression von

FIF

Die synthetischen Starter I (dATGAGCTACAAC) und II (dCATGAGCTACAAC) wurden nach der von Goeddel et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 76,106-110 [1979], beschriebenen Methode phosphoryliert unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase und (y-32P)ATP bis zu einer spezifischen Aktivität von 700 Ci/mM. Die Starterreparatur wurde folgendermassen durchgeführt: 250 pM der 32P-Starter wurden vereinigt mit 8 (ig (10 pM) eines 1200 Basenpaare langen Hhal-Restriktionsfragments, das die FIF-cDNS-Sequenz enthielt. Das Gemisch wurde mit Ethanol präzipitiert, in 5014.1 Wasser resuspendiert, 3 Minuten gekocht, in Trocken-eis-Ethanol gegeben und mit 50 p.1 einer Lösung von 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 14 mM MgCl2,120 mM NaCl, 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP bei 0 C vermischt. Nach Zusatz von 10 Einheiten DNS-Polymerase I Klenowfragment wurde 4'/2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Extraktion mit Phenol/CHCl3 und Restriktion mit Pstl wurde das gewünschte Produkt an einer 6%igen Polyacrylamidgelsäule gereinigt. Die anschliessenden Verknüpfungen erfolgten bei Raumtemperatur (kohäsive Enden) oder bei 4°C (stumpfe Enden) unter den von Goeddel .et al., supra, angegebenen Bedingungen.

J. Assay für Interferonexpression in E. coli

Bakterienextrakte für den Interferon-Assay wurden folgendermassen hergestellt: 1 ml Kulturen wurden über Nacht in LB (Luria-Bertani) Medium, enthaltend 5 ng/ml Tetracyclin, gezüchtet und auf 25 ml mit M9-Medium, das durch 0,2% Glukose, 0,5% Casaminosäuren und 5 ng/ml Tetracyclin ergänzt war, verdünnt. 10 ml-Proben wurden zentrifugiert wenn die Absorption bei 550 nm (A550) den Wert 1,0 er-5 reichte. Die Zellkuchen wurden schnell in Trockeneis-Etha-nol gefroren und geklärte Lysate wurden, wie von Clewell (supra) beschrieben, hergestellt. Die Interferonaktivität in den Überständen wurde durch Vergleich mit NIH-FIF-Stan-dard nach dem CPE-Hemmtest bestimmt. Es wurden 2 ver-io schiedene Tests verwendet: (a) WISH-Zellen (humane Am-nionzellen) wurden auf Mikrotiterplatten verteilt. Nach 16—20 Stunden wurden die Proben zugesetzt und seriell zweifach verdünnt. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 3 Stunden wurde Sidbis-Virus zugesetzt. Die Platten i5 wurden nach 20—24 Stunden mit Kristallviolett angefärbt, (b) MDBK-Zellen (aus Rindernieren) wurden ausgesät unter gleichzeitiger zweifacher Verdünnung der Proben. Nach einer Inkubationszeit von 2—3 Stunden wurden vesikuläre Stomatitisviren zugesetzt und nach weiteren 16—18 Stunden 20 wurden die Platten mit Kristallviolett angefärbt. Um die Stabilität bei pH 2 zu testen, wurden die Bakterienextrakte und Standarde in Minimalmedium auf eine Konzentration von 1000 Einheiten/ml verdünnt. Aliquote Teile von 1 ml wurden mit IN HCl auf pH 2 gebracht, 16 Stunden bei 4°C inkubiert 25 und durch Zusatz von NaOH neutralisiert. Die Interferonaktivität wurde nach dem CPE-Hemmtest unter Verwendung menschlicher Amnionzellen bestimmt. Um antigenische Identität herzustellen, wurden aliquote Teile (25 nl) der 1000 Einheiten/ml enthaltenden Interferon-proben (unbe-30 handelt) 60 Minuten lang bei 37°C mit 25 nl Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon inkubiert, 5 Minuten mit 12 000 x g zentrifugiert und der Überstand getestet. FIF- und LIF-Standards wurden vom NIH erhalten. Kanin-chen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon wurde vom Na-35 tional Institute of Allergy and Infectious Diseases erhalten.

K. Synthese von Starterpools, die komplementär sind zu

FIF-mRNS

Von der bekannten aminoterminalen Aminosäurese-40 quenz des Human-Fibroblasten-Interferons wurden die 24 möglichen mRNS-Sequenzen, die für die Kodierung der ersten 4 Aminosäuren in Frage kommen, abgeleitet. Die theoretisch möglichen 24 komplementären Deoxyoligonucleotide wurden in 6 Pools zu je 4 Dodecameren synthetisiert (Fi-45 gur 1). Die Synthese erfolgte nach der modifizierten Phos-photriester-Methode in Lösung und an Festphasen (Crea et al., supra). Die grundlegende Strategie beruhte auf der Umsetzung zweier 3'-geschützter Trimerer mit einem Über-schuss eines einzelnen 5'-geschützten Trimeren zu einem so Pool von 2 Hexameren, die beide gleich stark vertreten waren. Die Kupplung von 2 Pools, die jeweils 2 Hexamere enthielten, lieferte dann einen Pool mit 4 Dodecameren.

L. Identifizierung von FIF-cDNS-Klonen 55 Unter Verwendung von 12S-mRNS aus induzierten Hu-man-Fibroblasten (1000 Einheiten Interferon-Aktivität/ng im Oocytentest) wurde doppelsträngige cDNS hergestellt und in das Plasmid pBR322 an der Pstl-Restriktionsstelle nach der Standard dG:dC-Tailing-Methode, wie von Chang 60 et al. (supra) beschrieben, eingefügt. Eine FIF-cDNS-Bibliothek aus 30 000 Ampicillin-empfindlichen, Tetracyclin-resistenten Transformanten von E. coli K-12 Stamm 294 wurde aus 20 ng cDNS, enthaltend 550—1300 Basenpaare, angelegt. Aus 600 der Transformanten wurde Plasmid-DNS 65 hergestellt und auf 3 Sätze von Nitrocellulosefiltern, wie oben beschrieben, gebracht.

Die Methode zur Identifizierung hybrider Plasmide, die FIF-cDNS-Sequenzen enthielten, ähnelte der, die ange-

656388

6

wandt wurde zur Identifizierung entsprechender hybrider Plasmide mit LIF-cDNS Sequenzen (Goeddel et al., Nature 287,411—416 [1980]). Radiomarkierte cDNS-Hybridisie-rungssonden wurden hergestellt unter Verwendung von entweder den 24 synthetischen Dodecameren oder von Oligo (dT)i2_i8 als Starter und 12S-RNS aus induzierten Fibroblasten (5000 Einheiten/ng im Oocytentest) als Matrize. Die erhaltenen 32P-cDNSs (spezifische Aktivität > 5 x 108cpm/ Hg) wurden mit einem grossen Überschuss an mRNS, aus nicht induzierten Human-Fibroblasten isoliert, hybridisiert und die mRNS-cDNS-Hybride wurden von nicht umgesetzter cDNS mittels Chromatographie an Hydroxyapatit (Galau et al., supra) abgetrennt. Die einsträngigen cDNS-Fraktionen sollten angereichert sein mit Sequenzen, die in induzierten Fibroblasten vorhanden, in nicht-induzierten Zellen aber abwesend sind, und die mRNS-cDNS Hybride sollten Sequenzen darstellen, die sowohl in induzierten wie nicht-induzierten Zellen vorkommen. Etwa 4 x 106 cpm ein-strängige cDNS (Hybridisierungssonde A) und 8 x 106 cpm cDNS-mRNS-Hybride wurden unter Verwendung der mit Oligo (dT)i2_is gestarteten cDNS erhalten, während von der mit den synthetischen Dodecamerpools 1 —6 gestarteten cDNS 1,5 x 106 cpm einsträngige cDNS (Hybridisierungssonde B) und 1,5 x 106 cpm Hybride erhalten wurden. Die cDNS-mRNS-Hybride aus beiden Fraktionierungen wurden vereinigt, die RNS durch Behandlung mit Alkali hydroly-siert und die 32P-cDNS wurde als Hybridisierungssonde C verwendet. Viele der 600 Plasmidproben hybridisierten sowohl mit der Sonde A wie mit der Sonde C, was daraufhinwies, dass die Hybridisierungsreaktionen zwischen nicht induzierter mRNS und 32P-cDNS (vor der Hydroxyapatitfrak-tionierung) nicht vollständig verlaufen waren. Nur 1 der 600 Plasmide (pF526) hybridisierte stark mit der speziell gestarteten, induzierten cDNS-Sonde B (Figur 2). Plasmid pF526 hybridisierte auch mit der Oligo (dT)i2_is gestarteten, induzierten cDNS-Sonde A und lieferte keine nachweisbare Hybridisierung mit der kombinierten nicht-induzierten Sonde C.

Pstl-Behandlung mit pF526 zeigte, dass der klonierte cDNS-Abschnitt etwa 550 Basenpaare lang war, wahrscheinlich zu kurz, um den gesamten kodierenden Bereich für Fibroblasten-Interferon zu enthalten. Daher wurde eine 32P-markierte DNS Sonde aus diesem Pstl-Fragment hergestellt mittels DNS-Starter aus Kälberthymus (Taylor et al., supra). Diese Sonde wurde gebraucht, um 2000 einzelne Kolonien einer neu hergestellten Fibroblasten-cDNS-Bibliothek zu screenen. Die neue cDNS-Bibliothek wurde unter Verwendung von 12S-mRNS aus induzierten Fibroblasten mit einem Titer von 6000 Einheiten/ml im Oocytentest hergestellt. 16 Klone hybridisierten mit der Sonde. Die aus der Mehrzahl dieser Klone gewonnenen Plasmide lieferten bei Spaltung mit Pstl 2 Fragmente, d.h. sie besassen eine interne Pstl-Spaltstelle. Klon pFIF3 enthielt den längsten cDNS-Abschnitt von etwa 800 Basenpaaren. Die DNS-Sequenz dieses Abschnitts wurde nach der Maxam-Gilbert Methode (supra) bestimmt und ist in Figur 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Human-Fibroblasten-Interferons, die aus der Nucleotidsequenz vorhergesagt wurde, ist mit der kürzlich von Taniguchi et al. (Gene 10,11 —15 [1980]) sowie von De-rynck et al. (supra) beschriebenen identisch. Es wird zunächst eine Präsequenz oder ein Signalpeptid von 21 Aminosäuren kodiert, dann eine Aminosäuresequenz von 166 Aminosäuren, die das reife Interferon darstellen. Schliesslich folgen 196 nicht übersetzte Nucleotide und ein Poly(A)-Schwanz. Die 20 aminoterminalen Aminosäuren des reifen FIF sind direkt bestimmt worden durch Sequenzierung und stimmen überein mit der aus der DNS-Sequenz vorhergesagten Sequenz.

M. Direkte Expression von Fibroblasten-Interferon

Um eine möglichst hohe Expression von reifem Fibroblasten-Interferon in E. coli zu erhalten, sollte der Start der Proteinsynthese am ATG-Codon des reifen Polypeptids s (Aminosäure 1) und nicht am ATG-Codon des Signalpep-tids (Aminosäure Sl) stattfinden (Figur 3).

Wie die das Signalpeptid kodierende Region aus dem Plasmid pFIF3 entfernt wurde ist in Figur 4 dargestellt. Ein DNS-Fragment aus 1200 Basenpaaren, das den gesamten, io FIF kodierenden cDNS Abschnitt enthielt, wurde nach Behandlung von pFIF3 mit Hhal an einem Polyacrylamidgel isoliert. Zwei synthetische Deoxyoligonucleotidstarter, dAT-GAGCTACAAC(I) und dCATGAGCTACAAC(II) wurden hergestellt. Beide Starter enthalten die die ersten 4-Ami-is nosäure des reifen Fibroblasten-Interferons kodierenden Sequenzen und Starter II besitzt zusätzlich ein C am 5'-Ende. Starterreparatur und anschliessende Verknüpfungen wurden für jeden der beiden Starter I und II getrennt durchgeführt und lieferten nahezu identische Resultate. Es werden daher 2o hier nur die Reaktionen mit dem Starter I im Detail beschrieben. Die Starter wurden 5'-radiomarkiert unter Verwendung von (y-32P) ATP und T4 Polynucleotidkinase und mit dem 1200 Basenpaare enthaltenden Hhal-DNS-Frag-ment kombiniert. Das Gemisch wurde durch Erhitzen dena-25 turiert. Nach Hybridisierung des Starters an das denaturierte Hhal-DNS-Fragment, wurde die Reparatur des oberen (+)-Stranges mit E. coli-DNS-Polymerase I Klenowfrag-ment (Klenow et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 65,

168 — 175 [1969]) katalysiert (Figur 4). Gleichzeitig wird 3o durch die 3'-»5'-Exonucleaseaktivität des Klenowfragments das in 3'-Richtung vorragende Ende des unteren (—)-Stran-ges entfernt unter Schaffung eines glatten Endes. Die Analyse des Reaktionsgemischs durch Polyacrylamidgelelektro-phorese zeigte, dass die Reparatur nicht vollständig war son-35 dem an verschiedenen bestimmten Stellen aufgehört hatte. Daher wurde das gesamte Reaktionsgemisch mit Pstl behandelt und das gewünschte 141 Basenpaare-enthaltende Fragment (180 000 Cerenkow cpm; ca. 0,3 pM) wurde durch Po-lyacrylamidgelelektrophorese gereinigt (Figur 5). Die Bin-40 dung dieses Fragments an 1 ng (ca. 4 pM) des 363 Basenpaa-re-enthaltenden Pstl-Bglll-Fragments, das aus pFIF3 isoliert wurde, mit anschliessender Bglll-Behandlung, lieferte etwa 30 ng (ca. 0,1 pM, 50,000 Cerenkow cpm) des 504 Ba-senpaare-enthaltenden DNS-Fragments, das die gesamte rei-45 fes Fibroblasten-Interferon kodierende Sequenz enthielt. Dieselben Reaktionen mit dem Starter II lieferten etwa 50 ng (ca. 0,15 pM, 83,000 Cerenkow cpm) des 505 Basenpaare-enthaltenden Produkts.

Die Konstruktion von Plasmiden, die die Synthese von so Human-Fibroblasten-Interferonen lenken, ist in den Figuren 6 und 7 dargestellt. Es wurden verschiedene Plasmide konstruiert, die die FIF-Synthese unter die Kontrolle von E. coli Lac- oder Trp-Promotor-Operatorsystemen brachte. Diese beiden Systeme haben sich bereits als geeignet für die 55 direkte Expression von Eukaryoten-Genen in E. coli erwiesen: humanes Wachstumshormon wurde unter Verwendung des Lac-Systems (Goeddel et al.. Nature 281, 544—548 [1979]) synthetisiert, während Human-Leukozyten-Interfe-ron in hohen Ausbeuten unter Verwendung des Trp-Systems 6o erhalten wurde (Goeddel et al., Nature 287,411 [1980]).

pBRH-trp wurde mit EcoRI behandelt und das erhaltene Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. EcoRI-behandeltes Plasmid pSomll (Itakura et al., Science 198,1056—1063 [1977]); brit. Patentpublikation Nr.

65 2 007 676 A) wurde mit dem obigen Fragment kombiniert. Das Gemisch wurde mit T4 DNS-Ligase behandelt und die erhaltene DNS zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 in der bereits beschriebenen Weise verwendet. Die trans-

7

656 388

formierten Bakterien wurden auf Grund ihrer Ampicillinre-sistenz selektioniert und nach der Koloniehybridisationsmethode von Grunstein et al. (supra) getestet, wobei das obige, aus pBRHtrp isolierte Fragment, das den Trp-Promotor-Operator enthielt und mit P32 radioaktiv markiert war, als Sonde verwendet wurde. Die Plasmid-DNS verschiedener im Koloniehybridisationstest positiver Kolonien wurde isoliert und die Orientierung der eingefügten Fragmente wurde durch Restriktionsanalyse mit den Enzymen Bglll und Bam-HI bestimmt. E. coli 294 mit dem Plasmid pSOM7A2, das das Trp-Promotor-Operator-Fragment in der gewünschten Orientierung enthielt, wurde in LB-Medium, enthaltend 10 ng/ml Ampicillin, gezüchtet. Man liess die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 1 (bei 550 nm) wachsen, zentrifu-gierte und suspendierte in M9-Medium bei 10-facher Verdünnung. Die Zellen wurden nochmals 2—3 Stunden zu einer optischen Dichte 1 wachsen gelassen, dann lysiert und das gesamte Zellprotein wurde durch SDS-Harnstoff (15%) PAGE (Maizel et al., Methods Virol. 5,180—246 [1971]) analysiert.

Das Plasmid pBR322 wurde mit Hindlll behandelt und die vorstehenden Hindlll-Enden wurden mit Sl-Nuclease entfernt. Für letztere Reaktion wurden 10 ng Hindlll-gespaltenes pBR322 in 30 (il S1-Puffer (0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl2,25 mM Natriumacetat, pH 4,5) mit 300 Einheiten Sl-Nuclease 30 Minuten lang bei 15°C behandelt. Die Reaktion wurde beendet durch Zusatz von 1 (il 30 x Sl-Nuclease-Stoplösung (0,8 M Trisbase, 50 mM EDTA). Das Gemisch wurde mit Phenol und anschliessend mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und schliesslich mit Eco RI, wie bereits beschrieben, behandelt. Nach PAGE und Elektroelution wurde das grosse Fragment (1) erhalten, das ein Eco RI kohäsives Ende und ein stumpfes Ende, dessen kodierender Strang mit Thymidin beginnt, besitzt.

Das Plasmid pSom7A2 wurde mit Bglll behandelt und die resultierenden kohäsiven Enden wurden mittels Klenow-Polymerase I unter Verwendung aller 4 Deoxynucleotidtri-phosphate doppelsträngig gemacht. Spaltung mit EcoRI sowie PAGE und Elektroelution lieferten ein kurzes lineares DNS-Fragment (2), das den Tryptophan-Promotor-Opera-tor enthielt sowie Codons der LE' «proximalen» Sequenz stromaufwärts von der BglII-Spaltstelle («LE' (p)»). Dieses Fragment besass ein kohäsives EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende, das von der Auffüllung der Bglll-Spaltstelle herrührte. Aus den beiden Fragmenten (1) und (2) wurde mit Hilfe von T^DNS-Ligase das Plasmid pHKY 10 gebildet, mit dem kompetente E. coli Stamm 294-Zellen transformiert wurden.

Das Plasmid pGMI trägt das E. coli-Tryptophan-Operon mit der Deletion ALE1413 (Miozzari et al., J. Bacte-riology 133,1457—1466 [1978]) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des Trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des Trp E-Polypeptids (im folgenden LE' genannt), sowie dem vollständigen Trp D-Polypeptid, und zwar unter der Kontrolle des Trp-Promotor-Operator-Systems. Das Plasmid (20 (ig) wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII an 5 Stellen gespalten. Die Genfragmente wurden dann mit EcoRI-Verbindungssequen-zen (bestehend aus einer selbstkomplementären Polynukleo-tidsequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, um eine Eco-RI-Spaltstelle für das spätere Klonieren in ein Plasmid mit einer solchen EcoRI-Spaltstelle zu schaffen. Die 20 (ig der aus pGMI erhaltenen DNS-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T4 DNS-Ligase in Gegenwart von 200 pMol des 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTCATG in 20 (il T4 DNS-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgCl2, 5 mMol Di-thiothreit) bei 4 C über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70"C erwärmt. Die Verbindungssequenzen wurden mit EcoRI gespalten und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5% Poly-acrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Die drei grössten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Jedes Gelfragment wurde mit 300 Microliter 0,1 x TBE in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 x TBE-Puffer der Elektrophorese bei 100 Volt ausgesetzt (TBE-Puffer enthält: 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na2EDTA in 1 Liter H20). Die wässrige Lösung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2M an Natriumchlorid gemacht. Die DNS wurde nach Ethanolfällung in wässriger Lösung erhalten. Das den trp-Promoter-Operator enthaltende Gen mit EcoRI kohäsiven Enden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht, dass man Fragmente in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promotor-Operators Tetracyclin-resistent werden.

Das Plasmid pBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6,3267 — 3287 [1979]) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promoter existiert, exprimiert diese Resistenz nicht. Das Plasmid ist daher Tetracyclin-empfindlich. Durch Einfügung eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden.

pBRHI wurde mit EcoRI behandelt und das Enzym durch Phenolextraktion und Chloroformextraktion entfernt. Das nach Ethanolpräzipitation in Wasser erhaltene DNS-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen kombiniert mit jedem der drei DNS-Fragmente, die oben erhalten wurden und mit T4 DNS-Ligase, wie bereits beschrieben, verbunden. Die DNS des Reaktionsgemischs wurde zur Transformation kompetenter E. coli K-12 Stamm 294-Orga-nismen nach Standardmethoden (Hershfield et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 71, 3455-3459 [1974]) verwendet. Die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani)-Platten gebracht, die 20 ng/ml Ampicillin und 5 ng/ml Tetracyclin enthielten. Es wurden verschiedene Tetracyclin-resistente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNS isoliert und das Vorhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktionsenzymanalysen bestätigt. Das entstandene Plasmid wurde pBRHtrp genannt.

Ein EcoRI und BamHI Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoRI und BamHI Spaltstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]), wodurch das Plasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und der Ethanolpräzipitation unterworfen. Es wurde dann mit 1 (il E. coli DNS-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheim), in 30 (il Poly-merase-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7.4, 7 mM MgCl2,1 mM ß-Mercaptoethanol), enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1 mM dCTP, während 30 Minuten bei 0 C und 2 Stunden bei 37' C behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Xbal Spaltstelle folgendermassen verändert:

5' CT AGA - 5' CT AGA -

—>

y T- y TCT-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

656 388

8

Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten. Das grosse Plasmidfrag-ment wurde vom kleinen EcoRI-Xbal-Fragment abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNS-Fragment von pHS32 (0,2 ng) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den obenbeschriebenen an das EcoRI-Taql-Fragment des Tryptophanoperons (etwa 0,01 ng) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes:

— T CT AGA —TCTAGA—

+ *

— AGC TCT —AGCTCT—

mit der ungewöhnlichen Basenpaarung T—C. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde in E. coli 294-Zellen transformiert, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, gebracht. Es wurden 24 Kolonien ausgewählt, in 3 ml LB-Medium aufgezogen und das Plasmid isoliert. Es wurde festgestellt, dass sechs davon die Xbal-Spaltstellen im E. coli durch katalysierte DNS-Ausbesserung und Replika-tion regeneriert hatten in folgender Weise:

-TCTAGA- -TCTAGA-

—►

-AGCTCT- -AGATCT-

Diese Plasmide konnten auch mit EcoRI und Hpal gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente. Ein Plasmid, pTrpl4 bezeichnet, wurde für die Expression heterologer Peptide, wie im folgenden beschrieben, verwendet.

Das Plasmid pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544, [1979]) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon, bestehend aus 23 synthetisch hergestellten Amino-säurecodons und 153 Aminosäurecodons, die von cDNS über reverse Transcription der mRNS erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormons nicht enthält, besitzt ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 10 (ig pHGH 107 isoliert nach Behandlung mit EcoRI und E. coli s DNA Polymerase I Klenow-Fragment, sowie dTTP und dATP, wie oben beschrieben. Nach Phenol- und Chloroformextraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch io PAGE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNS-Fragment enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetra-cyclineresistenz-verleihenden Strukturgens, aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promoter-Operator-System, so dass, wenn es anschliessend in ein Expressionsplasmid kloniert wird, dieje-is nigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wo-20 durch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.

Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben "hergestellt wurde, vorbereitet. pTrpl4 wurde mit Xbal be-2s handelt und die entstehenden kohäsiven Enden wurden nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Nach Phenol* und Chloroform-Extraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNS mit BamHI behandelt und das ent-30 standene grosse Plasmidfragment wurde durch PAGE und Elektroelution eluiert. Dieses Fragment besass ein stumpfes und ein kohäsives Ende und erlaubte die Rekombination in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde. 35 Das das HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpl4 AXba-BamHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbunden unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind. Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden wurden 40 die Xbal- und EcoRI-Restriktionsstellen wieder hergestellt:

Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang

-TCTAG AATTCTATG- -TCTAG AATTCTATG-

+

-AGATC TTAAGATAC- -AGATC TTAA GATAC-

Xbal EcoRI

Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresi-stenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promoter, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promotor) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGH 207, die Expression des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promotor-Operators. Das erhaltene Gemisch wurde in E. coli 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5 ng/ml Tetracyclin enthielten, selektioniert.

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit EcoRI behandelt und das den Trp-Promotor enthaltende Fragment wurde mittels PAGE und Elektroelution isoliert. Das Plasmid pBRHI wurde mit EcoRI behandelt und die Spaltstellen mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP, 1 (ig, in 50 mM Tris, pH 8, und 10 mM MgCl2) 30 Minuten lang bei 65 C behandelt, um die Phosphatgruppen an den vorstehenden EcoRI-

Enden zu entfernen. Überschüssige bakterielle alkalische Phosphatase wurde durch Phenolextraktion, Chloroformextraktion und Ethanol-Fällung entfernt. Infolge der an den ss überstehenden Enden fehlenden Phosphatgruppen kann das erhaltene lineare DNS-Fragment sich nicht selbst zu einem Kreis schliessen sondern nur mit solchen anderen DNS-Fragmenten reagieren, deren kohäsive Enden phosphoryliert sind.

so Das EcoRI-Fragment aus pHGH 207 wurde mit dem aus pBRHI erhaltenen linearen DNS-Fragment in Gegenwart von T4-Ligase wie vorstehend beschrieben verbunden. Ein Teil des erhaltenen Gemischs wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 in der vorstehend beschriebenen Weise es verwendet. 12 Tetracyclin-resistente Kolonien wurden selektioniert (LB-Medium mit einem Gehalt von 5 ng/ml Tetracyclin). Aus jeder Kolonie wurde Plasmid-DNS isoliert und durch Behandlung mit EcoRI und Xbal auf das Vorhanden

9

sein des gewünschten DNS-Abschnitts untersucht. Ein Plasmid, das den gewünschten Abschnitt enthielt, wurde pHKYl bezeichnet.

Das Plasmid pHKYlO ist ein Derivat von pBR322, das eine BglH-Spaltstelle zwischen dem Tetracyclinresistenz 5 (TcR)-Promotor und dem Strukturgen enthält. Das grosse DNS-Fragment, das nach Behandlung von pHKYlO mit Pstl und Bglll isoliert wurde, enthält daher einen Teil des Ampicillinresistenz (ApR)-Gens und das gesamte TcR-Struk-turgen aber nicht den TcR-Promotor (Figur 6). Das Plasmid io pGH6 (Goeddel et al., Nature 281, 544—548 [1979]) wurde mit EcoRI behandelt, die einsträngigen Enden wurden mit DNS-Polymerase I aufgefüllt und das Plasmid wurde mit Pstl gespalten. Das kleine Fragment, enthaltend einen Teil des ApR-Gens, einen doppelten Lac-Promotor und die Lac- is Ribosomenbindungsstelle, nicht aber den ATG-Startcodon, wurde isoliert. Ein ähnliches Trp-Promotor-Fragment, das die Trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthält, nicht aber eine ATG-Sequenz (Goeddel et al., Nature 287,411—416 [1980]), kann aus pHKYl isoliert werden. 20

Das soeben erwähnte Trp-Fragment ist ein analoges des E. coli-Tryptophan-Operons, aus dem der sogenannte Trp-Attenuator entfernt wurde (Miozzari et al., J. Bact. 133, 1457—1466 [1978]), um die Expression kontrolliert zu erhöhen. Expressionsplasmide, die das modifizierte Trp-Regulon 25 enthalten, können bis zu vorgegebenen Konzentrationen in einem Nährmedium, das genügend zusätzliches Tryptophan enthält um das Promotor-Operator-System zu unterdrücken, gezüchtet werden. Entzug des Tryptophans, wodurch der

656 388

Promotor-Operator in Aktion tritt, bewirkt die Expression des gewünschten Produktes.

Die Expressionsplasmide können zusammengesetzt werden über 3-stufige Verbindungsschritte, wie in Figur 6 gezeigt. 15 ng (0,05 pM) des FIF-Gens (504 bzw. 505 Basenpaare), 0,5 |ag (0,2 pM) des grossen Pstl-Bglll-Fragments von pHKYlO und 0,2 \ig (0,3 pM) des geeigneten Promotorfragments wurden miteinander verbunden und das Gemisch wurde verwendet zur Transformation von E. coli 294 (Goeddel et al., Nature 287,411 —416 [1980]). Aus den einzelnen Transformanten wurde Plasmid-DNS isoliert und mittels Restriktionsenzymen analysiert. Bei korrekter Verbindung des FIF-Gens mit dem Promotorfragment wird die EcoRI (Lac)- oder die Xbal (Trp)-Erkennungssequenz wieder hergestellt. Die überwiegende Zahl der Plasmide lieferten das erwartete Restriktionsmuster. Einzelne Klone wurden hochgezüchtet (12 mit dem Trp-Promotor und 12 mit dem Lac-Promotor). Für den Interferon-Assay wurden aus ihnen Extrakte, wie bereits beschrieben, hergestellt.

Im CPE-Hemmtest auf menschlichen Amnionzellen (WISH) waren 5 Trp-Transformanten positiv (alle etwa gleich stark) und 11 der Lac-Transformanten zeigten äquivalente Interferonaktivitäten. Daher wurde aus jeder Serie ein Transformant für die weiteren Untersuchungen ausgesucht (pFIFac9 und pFIFtrp69, Tabelle 1). Die DNS-Sequenzanalyse bestätigte, dass in beiden Fällen die gewünschte Verknüpfung des Promotors an das FIF-Strukturgen stattgefunden hatte.

Tabelle 1

Interferon-Aktivität in Extrakten von E. coli

E. coli K-12 Stamm 294 transformiert mit

Zelldichte (Zellen/ml)

IF-Aktivität (B/1 Kultur)

FIF Moleküle pro Zelle pBR 322 pFIFIac9 pFIFtrp69 pFIFtrp369

3,5 xlO8 3,5 xlO8 3,5 xlO8 3,5 xlO8

9,0x10« 1,8 xlO7 8,1 xlO7

2,250 4,500 20,200

Die Züchtung der Zellen und die Herstellung der Extrakte erfolgte in der oben angegebenen Weise. Die menschliche Amnionzellinie (WISH) wurde für den CPE-Hemmtest verwendet. Die angegebenen Aktivitäten sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen. Um die Anzahl der Interferonmoleküle pro Zelle zu bestimmen, wurde eine spezifische FIF-Aktivität von 4 x 108 Einheiten/mg verwendet (Knight, su-pra).

Die mit pFIFlac9 und pFIFtrp69 erhaltenen FIF-Mengen sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Der Trp-Promotor lieferte eine höhere Expression als der Lac-Promotor. Um die FIF-Expression weiter zu erhöhen, wurde pFIFtrp69 mit EcoRI gespalten und zwei 300 Basenpaar-lange EcoRI-Fragmente, die den Trp-Promotor enthielten (Goeddel et al.,

Nature 287,411 —416 [1980]), wurden eingefügt (Figur 7a, 45 b). Das erhaltene Plasmid, pFIFtrp369, enthält drei aufeinanderfolgende Trp-Promotoren, die in Richtung des FIF-Gens orientiert sind. Die von E. coli K-12 Stamm 294/pFIF trp369 produzierte FIF-Menge ist vier- bis fünfmal so gross wie die von E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69 produzierte 50 (Tabelle 1). Das von E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69 hergestellte FIF verhält sich wie authentisches Human-FIF. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, ist seine antivirale Aktivität etwa 30mal grösser bei menschlichen Zellen als bei Rinderzellen. Zusätzlich ist das bakteriell hergestellte FIF bei pH 2 ss über Nacht stabil und wird nicht durch Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon-Antikörper neutralisiert (Tabelle 3).

Tabelle 2

Interferon-Aktivitäten verschiedener Zelltypen

Interferon-Aktivität (E/ml)

Zellen LelF FIF E. coli K-12 Stamm

294/pFIFtrp69-Extrakt

Amnion (human) Niere (Rind)

20,000 13.000

10,000 400

1280 40

656 388

10

Tabelle 3

Vergleich der Interferon-Aktivitäten aus Extrakten von E. coli K-12 Stamm 294 pFIFtrp69 mit Human-LelF- und -FIF-Standard

Interferon-Aktivität (E/ml)

, LelF FIF E. coli K-12 Stamm

294 pFIFtrp69

unbehandelt 1000 1000 1000

pH 2 ' 1000 1000 1000

Kaninchen-anti-

Human-LelF-Antikörper 16 1000 1000

LelF und FIF sind NIH-Standardlösungen mit 20,000 bzw. 10,000 Einheiten/ml.

N. Reinigung

Bakteriell hergestelltes Fibroblasten-Interferon kann fol-gendermassen gereinigt werden:

1. Die gefrorenen Zellen werden in der 12-fachen Menge (v/w) eines Saccharosepuffers (100 mM Tris-HCI, 10% Saccharose, 0,2 M NaCl, 50 mM EDTA, 0,2 mM PMSF [Phe-nylmethylsulfonylchlorid], pH 7,9), enthaltend 1 mg/ml Ly-sozym, suspendiert. Die Zellsuspension wird 1 Stunde bei 4°C gerührt und zentrifugiert. Die Fibroblasten-Interfero-naktivität findet sich im Überstand.

2. Der mit Ultraschall behandelte Überstand wird mit 5%igem Polyethylenimin (v/v) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (v/v) versetzt. Die Lösung wird 1 Stunde bei 4°C gerührt und dann zentrifugiert. Die Interferonaktivität verbleibt im Überstand.

3. Der Überstand wird mit festem Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 50% versetzt, 30 Minuten bei 4°C gerührt und zentrifugiert. Die Interferonaktivität befindet sich im Niederschlag.

4. Der Ammoniumsulfatniederschlag wird in PBS

(20 mM Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,4) suspendiert und zwar in einem Volumen, das halb so gross ist wie das der 50%igen Ammoniumsulfat-Suspension. Es wird Po-lyethylenglykol 6000 (50%, w/v, in PBS) zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 12,5% (v/v), 2 Stunden bei 4°C gerührt und zentrifugiert. Die Interferonaktivität befindet sich im Niederschlag, der in einer minimalen Menge des unter (1) definierten Saccharosepuffers suspendiert und durch zentrifugieren geklärt wird.

Durch dieses Extraktionsverfahren wird eine Anreicherung des Fibroblasten-Interferons von 0,001% Gesamtprotein auf 0,05% Gesamtprotein erreicht. Das Material kann weiter bis zur Homogenität durch folgende säulenchromato-graphischen Verfahren gereinigt werden:

5. Affinitätschromatographie an Amicon-Blau B in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer.

6. Anionenaustauschchromatographie an QAE Sepha-dex in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer bei Abwesenheit von 0,2 M NaCl.

7. Grössenausschlusschromatographie an Sephadex G-75 in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer.

8. HPLC an Umkehrphasen.

O. Parenterale Applikation

FIF kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an solche, die immundepressive Zustände aufweisen. Die Dosierung kann sich an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen Materials, das aus menschlichen Zellen gewonnen wurde, anlehnen und kann z.B. etwa 1 —10 x 106 Einheiten/Tag, im Fall von Material mit einer Reinheit, die grösser ist als 1 %, bis zu etwa 15 x 10 7 Einheiten/Tag betragen. Die Dosierungen von bakteriell hergestelltem FIF können zur Erzielung eines besseren Effekts markant erhöht werden, wegen der höheren Reinheit und der weitgehenden Abwesenheit anderer Human-Proteine, die als Pyrogene wirken können und für unerwünschte Nebenwirkungen verantwortlich sein können, beispielsweise erhöhte Temperatur, Übelkeit usw.

Ein für die parenterale Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man 3 mg bakteriell hergestelltes FIF mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 x 108 Einheiten/mg in 25 ml 5%igem humanen Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 x 106 Einheiten reines 45 Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (—20°C) aufbewahrt.

Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die durch rekombinante DNS-Technik erhaltene Interferone enthal-50 ten, kann nach den allgemein bekannten Methoden der Ga-lenik unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägermaterialien, wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen.

25

30

60

65

8 Blatt Zeichnungen

Claims

656 388 PATENTANSPRÜCHE

1. DNS-Sequenzen, die die Aminosäuresequenz eines reifen Human-Fibroblasten-Interferons ohne Präsequenz kodieren.

2. DNS-Sequenzen gemäss Anspruch 1 mit der in Figur 3 von Position 64 bis 561 gezeigten Nukleotidsequenz.

3. DNS-Sequenzen, die die Aminosäuresequenz eines reifen Human-Fibroblasten-Interferons kodieren und operabel verbunden sind mit einer DNS-Sequenz, die die für die Expression notwendigen Signale enthält.

4. Replikable mikrobielle Vektoren mit einer DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 1,2 oder 3.

5. Vektoren gemäss Anspruch 4, die Plasmide sind.

6. Vektoren gemäss Anspruch 4, die Plasmide aus der Gruppe pFIFlac 9, pFIF trp 69 und pFIF trp369 mit der Genkarte gemäss den Figuren 6 und 7b sind.

7.

7. Mikroorganismen, die mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 4—6 transformiert sind.

8. Ein Stamm von E. coli als Mikroorganismus nach Anspruch 7.

9. E. coli K-12 Stamm 294 als Mikroorganismus nach Anspruch 7.

10. Bacillus subtilis als Mikroorganismus nach Anspruch

11. Saccharomyces cerevisiae als Mikroorganismus nach Anspruch 7.

12. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus gemäss Anspruch 7, dadurch gekenzeichnet, dass man einen Mikroorganismus mit einem replikablen Vektor gemäss Anspruch 4 transformiert und kultiviert.

13. Verfahren zur Herstellung eines replikablen mikro-biellen Vektors gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine DNS-Sequenz gemäss Anspruch 1 operabel mit einer DNS-Sequenz, die die für die Expression notwendigen Signale enthält, verbindet.

14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite DNS-Sequenz einen mehrfachen Trp-Promoter-Operator enthält.

15. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite DNS-Sequenz einen mehrfachen lac-Promoter-Operator enthält.