DE3240960A1 - Expression eines gewuenschten polypeptids durch mikroorganismen, die durch rekombinante klonierungsvektoren transformiert wurden - Google Patents
Expression eines gewuenschten polypeptids durch mikroorganismen, die durch rekombinante klonierungsvektoren transformiert wurdenInfo
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PATENTANWÄLTE MAUFRKIRCHERSTRASSE 45 8000 MÜNCHEN 80
Anwalts-Akte: 32 462 5>
November 1982
THE WELLCOME FOUNDATION LTD. LONDON N.W.l / GROSSBRITANNIEN
Expression eines gewünschten Polypeptids durch Mikroorganismen,
die durch rekombinante Klonierungsvektoren transformiert wurden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem man eine verstärkte Polypeptidexpression in einem transformierten Wirtsmikroorganismus
erhält. Ferner betrifft sie den rekombinanten Klonierungsvektor
und den transformierten Wirt, die bei diesem Verfahren verwendet werden.
Ein bekanntes Verfahren auf dem Gebiet der Gen-Technologie ist
die Verwendung von Rekombinations-DNS-Techniken zur Transformierung eines Wirtsmikroorganismus, z.B. eines Bakteriums oder
einer Hefe, mit denen man in diesen Wirt einen rekombinanten Klonierungsvektor einsetzt, der ein für ein gewünschtes Polypeptid
kodierendes DNS-Fragment besitzt. Um zu erreichen, daß die Expression der Sequenz dieses DNS-Fragments durch den Wirt als
Polypeptid erfolgt, muß sichergestellt sein, daß die eingebaute DNS in dem Wirt transkribiert und translatiert, und auch repliziert
werden kann.
Bei einem der Verfahren, mit denen diese sogenannte Transformation
erzielt wird, wird als Vektor ein kleines kreisförmiges DNS-Stück verwendet, das sich selbst replizieren kann. Dieses
Stück wird als Plasmid bezeichnet und besteht gewöhnlich aus 3-10 χ 10 Basenpaaren, die für einige Gene kodieren. Eine für
ein gewünschtes Polypeptid kodierende DNS-Sequenz kann mit bekannten Techniken in das Plasmid eingesetzt, und das auf diese
Weise erzeugte rekombinante Plasmid in den Wirt transformiert werden. Diese Plasmide werden in mehreren Kopien, und zwar gewöhnlich
2 0 bis 30 pro Zelle, in dem Wirt von dessen eigenen Genfunktionen unterhalten, und der Rekombinationswirt kann mit
geeigneten Mitteln dazu veranlaßt werden, das gewünschte Polypeptid
zur Expression zu bringen.
Ein anderer möglicher Vektor, der bei der Transformation verwendet
werden kann, ist ein Virus, der in dem Wirt wächst, z.B. ein Bakteriophage, falls der Wirt ein Bakterium ist. Bakteriophagen,
oder Phagen, wie sie auch genannt werden, haben norma-
-/4
.ο
- Λ -
!erweise mindestens 10 eigene Gene, im Vergleich zu mehreren
tausend Genen in einem Bakterium. Eine für ein gewünschtes
Polypeptid kodierende DNS-Sequenz kann auf die beschriebene Weise in die Phagen-DNS eingesetzt werden. Der bakterielle Wirt,
der die Transkription und Translation der Phagen-DNS ermöglicht,
ist dann zur Expression des gewünschten Polypeptids fähig.
Diese Verfahren haben verschiedene Nachteile. So ist in vielen Fällen die Ausbeute an dem gewünschten Polypeptid ungenügend.
Dies kann verschiedene Ursachen haben; handelt es sich um eine Transformation mit Viren, dann wird das Virus mindestens einige
Zellen des Wirts abtöten und dadurch die Ausbeute verringern. Aus diesem Grund werden gewöhnlich nur sogenannte "temperierte"
Viren als geeignet betrachtet. Auch kann der Wirt einen Repressor
erzeugen, der die Transkription der Gene in dem rekombinanten Vektor unterdrückt, um eine Einwirkung der Produkte dieser
Gene auf sein eigenes System zu verhindern, und es ist möglich,
daß man die Wirkungen dieses Repressors nicht in ausreichender
Weise unterbinden kann.
Erfindungsgemäß wurde nunmehr gefunden, daß die Ausbeute an
einem gewünschten Polypeptid aus einem transformierten Wirtsmikroorganismus erhöht werden kann, wenn man bei der Herstellung
des rekombinanten Klonierungsvektors eine bestimmte Art von
Bakteriophagen als Träger verwendet. Das heißt, der rekombinante Klonierungsvektor wird aus einem für männliche Bakterien spezifischen»
einzelsträngigen DNS-Bakteriophagen gebildet, der eine
doppeisträngige intrazelluläre Zwischenstufe durchläuft» Derartige
Phagen gehören zu dem sogenannten Ml3 Typ.,
M13 Phagen sind bereits bekannt und wurden vielfach in DNS-Sequenzierungstechniken
verwendet; dabei wird ein Fragment einer doppelsträngigen DNS an einer bekannten Stelle der Phagen-DNS
eingesetzt, die dann in E. coli kloniert wird. Die aus dem Bakterium
sprießenden Phagen enthalten die einzeIsträngige Form
der DNS und können isoliert werden. Die DNS-Sequenz eines einzelnen Stranges des eingesetzten Fragments kann dann mit her-
könunlichen Methoden bestimmt werden; dabei wird eine beschränkte
Anzahl von Sequenzen, die zu dem Originalstrang der eingesetzten DNS komplementär sind, erzeugt, und auf Polyacrylamidgel
analysiert (vgl. Sanger, Nicklen und Coulson, 1978, Proc. Nat. Acad. Sei., 74, 5463-7).
Trotz dieser bekannten Verwendung der Ml3 Phagen wurde bisher
niemals vorgeschlagen, diese zur Expression eines heterologen
Polypeptids in einem Wirt, z.B. einem Bakterium wie E. coli, zu
verwenden.
Diese Phagen haben eine hohe Kopienzahl von 80 bis 100 pro
Zelle; diese Tatsache bedeutet jedoch nicht unbedingt, daß eine hohe Expression der Gene in der Ml3 DNS erzielt werden kann.
Während Plasmide die meisten ihrer Kopien für die Transkription verwenden, haben Phagen andere Funktionen und verwenden einige
für die Transkription und einige für die Replikation. Die Kopienzahl eines Phagen kann also nichts über die Anzahl der Kopien
aussagen, die für eine brauchbare Transkription zur Verfügung stehen.
Ml3 Phagen sind immer infektiös und nicht temperiert, sie können
also nicht reguliert werden und sind anscheinend für die Verwendung als rekombinante Klonierungsvektoren nicht zureichend
kontrollierbar. Außerdem hielt man die doppeIsträngige Form
von M13 (welche eine Zwischenstufe bei der Herstellung eines neuen, infektiösen einzelsträngigen Phagen darstellt und die für
die Transkription notwendige Form ist) für eine Obergangsform,
und dies ließ nicht vermuten, daß damit hohe Raten einer brauchbaren Transkription erzielt werden könnten.
Erfindungsgemäß wurde jedoch gefunden, daß aus Ml3 Phagen hergestellte
rekombinante Klonierungsvektoren in einigen Fällen dazu veranlaßt werden können, mindestens zehnmal höhere PoIypeptidausbeuten
zu erbringen, als dies mit früheren Methoden möglich war. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung
einen für männliche Bakterien spezifischen, einzelsträngigen
DNS-Bakteriophagen, der eine doppeIsträngige intrazelluläre
Zwischenstufe hat, und der in einem Wirtsmikroorganxsmus zur
Expression eines gewünschten heterologen Polypeptids in- gewinnbarer Form verwendet wird. (Die Bezeichnung "heterolog"
bedeutet, daß das Polypeptid normalerweise nicht von dem .
Wirtsmikroorganismus erzeugt wird.)
Wirtsmikroorganismus erzeugt wird.)
Die Erfindung betrifft ferner einen für die Transformation
eines Wirtsmikroorganismus geeigneten rekombinanten Klonierungsvektor,
der einen für männliche Bakterien spezifischen» einzelsträngigen DNS-Bakteriophagen mit doppeIsträngiger
intrazellulärer Zwischenstufe enthält, in dessen doppelsträngige DNS ein homologer Promotor und, in richtiger Orientierung, eine für ein gewünschtes heterologes Polypeptid kodierende
DNS-Sequenz eingebaut sind, so daß ein von dem Bakteriophagen transformierter Mikroorganismus das gewünschte heterologe
Polypeptid in gewinnbarer Form zur Expression bringen kann. (Die Bezeichnung homolog bedeutet} daß der Promotor normalerweise
auch vorhanden ist und von dem Mikroorganismus mit Sicherheit erkannt wird.) Bestimmte Beispiele für einen derartigen
Vektor sind WlH und W89 wie sie im Beispiel 1 unten beschrieben
werden.
Der homologe Promotor wird in die Ml3 DNS eingeführt, um damit
die Transkription der für das gewünschte Polypeptid kodierten DNS-Sequenz initiieren zu können. Vorzugsweise wird im allgemeinen der Iac'-Promotor verwendet, vor allem wenn E. co Ii der
Wirt ist. Der Promotor ist die Stelle, an welche die RNS-PoIymerase
bindet, um die Transkription zu beginnen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor zusammen mit einem
Operator vorhanden; dies ist die Stelle, welche vom Wirt gebildete Repressoren bindet. Verwendet man wie unten beschrieben
einen geeigneten Induktor, um den Operator freizulegen, dann
kann die Expression des gewünschten Polypeptids kontrolliert werden, und sie findet nicht zwangsläufig statt, was der Fall
s wenn nur der Promotor vorhanden ist. Die Möglichkeit, die
Expression auf diese Weise zu kontrollieren, ist außerordentlich günstig, da andernfalls der Wirtsmikroorganismus große Mengen
eines Polypeptids speichern könnte, für die er keine Verwendung hat, und dies könnte zur Abstoßung des Bakteriophagen-Klonierungsvektors
aus dem Wirt führen.
In dem folgenden Beispiel 1 wurde eine Sequenz, die u.a. den lac-Promotor und Operatorregionen enthielt, in die Intergenregion
zwischen den Genen IV und II der M13-DNS eingesetzt. Erfindungsgemäß
werden der Promotor bzw. das Promotor/Operatorsystem vorzugsweise in die Intergenregion der Phagen-DNS eingesetzt,
damit keines der eigenen Gene des Phagen zerstört wird, was die Phagenfunktion und möglicherweise die Replikation stören
könnte.
Die für das gewünschte Polypeptid kodierende DNS-Sequenz ist am besten ein Gen oder eine DNS-Sequenz, die natürlich vorkommt.
Man kann dieses Gen oder die DNS-Sequenz mit herkömmlichen Methoden aus einer geeigneten zellulären Quelle gewinnen. Dies
kann durch direkte Isolierung des Gens oder der DNS-Sequenz durch Behandlung des Genoms mit Restriktionsenzym und anschliessende
Klonierung geschehen. Diese Methode der direkten Isolierung des Gens oder der DNS-Sequenz kann angewandt werden, wenn
das Gen oder die DNS-Sequenz keine Intronen enthält, was bei für Interferon kodierenden Genen der Fall ist. Bei einem anderen
Verfahren, das besonders dann angezeigt ist, wenn das geeignete Gen oder die DNS-Sequenz Introne enthält, die herausgeschnitten
werden müssen, können folgende Schritte angewandt werden: die Boten-RNS (mRNA) wird aus der zellulären Quelle isoliert,
die genetische Information dieser mRNA wird mit Hilfe von reverser Transkriptase in einen einzelnen Strang komplementärer
DNS (cDNA) kopiert, die mRNA-Matritze wird zerstört, und eine DNS-Polymerase wird verwendet, um einen zweiten DNS-Strang zu
dem ersten Strang zu bilden. Zu diesem Zeitpunkt hängen die beiden DNS-Stränge zusammen, indem sie durch eine einzelsträngige
DNS-Region verbunden sind. Diese einzelsträngige Region wird
-/8
-JBT-
dann durch eine Nuklease verdaut, so daß die doppeIsträngige
DNS entsteht. Im unten folgenden Beispiel 1 wurde die Gensequenz in ein Plasmid kloniert. Dieser Schritt ist nicht wesentlich, hilft aber bei der Identifizierung des Gens.
Bei einem weiteren Verfahren entfällt die Isolierung von natürlich
vorkommenden Genen oder DNS-Sequenzen. Es ist nämlich
möglich, eine für ein gewünschtes Polypeptid kodierende Sequenz synthetischer DNS aufzubauen und diese an einem geeigneten
Punkt der Phagen-DNS einzusetzen. Bei jedem dieser Verfahren ist es günstig» wenn die DNS-Sequenz einen hohen Anteil an
Codonen hat, die von dem Wirt für die Expression der gewünschten Aminosäuren bevorzugt werden. .
Die Promotorregion und die für das gewünschte Polypeptid kodierende
DNS-Sequenz können in die Phagen-DNS entweder getrennt
oder gleichzeitig eingesetzt werden. Dieses Einsetzen kann erfolgen, indem man die DNS-Sequenz mit Hilfe einer Ligase in
die Phagen-DNS einsetzt, die ihrerseits durch eine Restriktions-Endonuklease
gespalten wird» Die DNS-Sequenz kann so gespalten werden, daß stumpfe Enden entstehen, die,wie in Beispiel 1 unten
beschrieben9 ligiert werden„ oder so gespalten werden, daß haftende
oder "klebrige" Enden entstehen, die mit TM- Ligase als
Insertionsstellen dienen..Ferner ist es möglich, einen oder
beide DNS-Stränge um eine bestimmte Anzahl von Basen zu verlängern, die zu der gleichen Anzahl von Basen, die in die gespaltene
Phagen-DNS eingeführt werden, komplementär sind, und dann diese modifizierte DNS-Sequenz in die modifizierte Phagen-DNS
einzusetzen.
Das gewünschte Polypeptid9 für das die DNSrSequenz kodiert,
ist am besten ein vollständiges Protein, wofür Interferon (gemäß der unten gegebenen Definition) ein besonderes Beispiel
ist. Es gibt drei bekannte Interferonarten, nämlich α Clymphoblastoid
oder aus Leukozyten), 0 (aus Fibroblasten), und γ (aus Zellen des Immunsystems). In den unten folgenden speziellen
Beispielen wird die Erzeugung von Interferon a2 beschrieben,
das eine Komponente des lymphoblastoiden Interferons darstellt,
165 Aminosäuren enthält und ein Molekulargewicht von etwa 20 000 hat. Erfindungsgemäß können auch andere Arten und Komponenten
von Interferon, sowie andere Proteine und Polypeptide hergestellt werden.
Zur Herstellung des gewünschten Polypeptids muß der erfindungsgemäße
rekombinante Klonierungsvektor in einen Wirt transformiert werden. Der Wirt ist im allgemeinen ein Bakterium, insbesondere
männliches E. coli, und sollte so beschaffen sein, daß er das gewünschte Polypeptid nicht zerstört bzw. an dessen Zerstörung
gehindert werden kann. Der Wirt sollte ferner trotz der Phageninfektion gut wachsen können, und das ungeachtet der Tatsache,
daß er große Mengen eines Materials produziert, für das er keine Verwendung hat. (Die in die DNS des Ml3-Trägers eingesetzte
DNS-Sequenz soll für ein Polypeptid kodieren, das für den zu transformierenden Wirtsmikroorganismus heterolog ist, d.h.
normalerweise von diesem nicht produziert wird, während der Promotor bzw. das Promotor/Operatorsystem für den Wirt homolog
sind). Methoden zur Infizierung eines Wirts, mit der eine Transformation bewirkt wird, sind bekannt.
Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur
Transformierung eines Wirtmikroorganismus, inbesondere E. coli,
wodurch dieser zur Expression eines heterologen Polypeptids befähigt
wird; dies geschieht durch Infizierung des Wirts mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Klonierungsvektor.
Der auf diese Weise transformierte Wirtsmikroorganismus, der das
gewünschte heterologe Polypeptid in gewinnbarer Form zur Expression
bringen kann, stellt ebenfalls eine Ausführungsform der Erfindung
dar. Ein besonderes Beispiel für einen transformierten
Wirtmikroorganismus ist E. coli JM103 (W14), wie es in Beispiel 2 unten beschrieben wird. Der transformierte Wirtsmikroorganismus
wird im allgemeinen in einem Kultursystem gehalten, das ein synthetisches Nährkulturmedium für den Wirt enthält.
-/10
Nach der Infizierung kann es notwendig werden, den transformierten
Wirtsmikroorganismus zur Herstellung des -in dem rekombinanten
Klonierungsvektor kodierten gewünschten Polypeptids
anzuregen, vor allem wenn zusammen "mit dem Promotor ein Operator eingeführt wurde. Dies geschieht normalerweise durch
Zugabe eines geeigneten Induktors, d.h. einer Substanz, welche vom Wirt gebildetes Repressorprotein inaktiviert, dadurch den
Operator freisetzt und es der RNS-Polymerase ermöglicht, an
den Promotor zu binden und die Transkription zu beginnen. Welcher Induktor zu verwenden ist, hängt von dem gewählten und in
die Phagen-DNS eingesetzten Promotor/Operatorsystem ab. Die
DNS-Sequenz wird vorzugsweise unterhalb eines Iac-Promotors
und Operators eingesetzt; die Transkription dieser DNS-Sequenz kann dann durch Zugabe einer Substanz erzielt werden, welche
den lac-Operator freisetzt und die Transkription der @-Galactosidasesequenz
startet. Ein solcher Induktor ist IPTG (Isopropyl-l-thio-3-D-galactopyranosid).
Am 3'-Ende der für das gewünschte Polypeptid kodierenden Sequenz
befindet sich vorzugsweise ein Stopsignal, so daß das durch Translation der mRNA erzeugte Produkt das gewünschte
Polypeptid in einer Form enthält, bei der sich z.B. einige der ß-Galactosidaseaminosäuren nur am 5'-Ende befinden. Wenn gewünscht
kann dann diese Aminosäuresequenz abgespalten werden, so daß lediglich das gewünschte Polypeptid übrigbleibt.
Vorzugsweise enthält das Polypeptidprodukt so wenig Aminosäuren wie möglich ΰ die nicht zu dem gewünschten Polypeptid gehören.
Es ist besonders günstig., die für das gewünschte Polypeptid
kodierende DNS-Sequenz so einzusetzen, daß sie nur durch
3 Basen von der Startsequenz getrennt ist. Diese 3 Basen sind Adenin-Uracil-Guanin (AUG), die für Methionin kodieren.
Das Produkt kann durch Lysieren des Wirts von diesem getrennt,
und dann das gewünschte Material z.B. durch Zentrifugieren isoliert werden. Es kann anschließend mit üblichen Methoden wie
z.B. Immunchromatographie gereinigt werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren
zur Erzeugung eines gewünschten heterologen Polypeptids mittels Expression durch einen rekombinanten Klonierungsvektor;
dieses Verfahren sieht die folgenden Schritte vor: Kultivierung eines Wirtsmikroorganismus, in den der erfindungsgemäße
rekombinante Klonierungsvektor transformiert wurde, wenn nötig Anregung der Produktion, des heterologen Polypeptids, und Isolierung
des erzeugten heterologen Polypeptids.
Das mit diesem Verfahren hergestellte heterologe Polypeptid stellt ebenfalls eine Ausführungsform, der Erfindung dar. Wie
bereits erwähnt, kann das Polypeptidprodukt überflüssige Aminosäuren enthalten, die vorteilhafterweise abgespalten werden,
und das gewünschte Polypeptid (Protein) ist vorzugsweise ein Interferon. (Für die Zwecke dieser Spezifikation bedeutet
"ein Interferon" "ein Protein, welches zumindest in homologen Zellen mittels zellulärer Stoffwechselprozesse, zu denen Syn·*
these von RNS und Protein gehören, antivirale Aktivität gegen Viren im allgemeinen ausübt". Dies ist die Definition, welche
von dem unter der Schirmherrschaft des National Institute of Allergy and Infectuous Diseases und der World Health Organization
- U.S. National Center on Interferon zusammengetretenen Kommittee zur Aufstellung eines Systems für die Interferon-Nomenklatur
angenommen wurde.)
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern*
Ein rekombinanter Klonierungsvektor wurde mit dem folgenden
Verfahren hergestellt:
Man gewann mRNA aus Sendaivirus-induzierten'Nawalmazellen
(Nawalmazellen sind eine lymphoblastoide Zeil-Linie, die durch
Transformation von Leukozyten mit Epstein Barr Virus gebildet wurde j ATCC Deposit No. CRL 14 32, deponiert am 7.7.78), und
diese mRNA wurde für Interferon-mRNA angereichert. Eine Fraktion
-/12
"β"
-JT-.
dieser angereicherten mRNA wurde zur Erzeugung von cDNA verwendet,
die wiederum mit herkömmlichen Methoden zur Bildung einer doppelsträngigen DNS-Sequenz verwendet wurde. Diese DNS-Sequenz
wurde in die Bam HI Stelle im Tetracyclingen des Plasmids
pAT 15 3 kloniert und in ein restrikt ionsloses E. coli*
Stamm HB 10I9 transformiert.
Die Interferon-a2-Gensequenz, die in Klon N5 H8 identifiziert
wurde, wurde mit Hilfe von Restriktionsenzym Msp~l ausgeschnitten,
mit Agarosegel-Elektrophorese gereinigt, und mit
QO ' · ■
a( P)dCTP und kaltem dGTP markiert, wozu das Klenowfragment
der DNS-Polymerase 1 verwendet wurde. Das erhaltene radioaktive
Fragment hatte stumpfe Enden und wurde dann teilweise mit Restriktionsenzym Pvu-II verdaut. (Von dem Fragment war bekannt,
daß es zwei Pvu-II Restriktionsstellen besaß, eine an den Nukleotiden +42 bis +46 in der Signalsequenz, die andere bei
+344 bis +349 in der Kodiersequenz, und die Verdauung wurde so durchgeführt, daß mit Sicherheit nur eine Spaltung pro Molekül
auftrat.) Die Produkte wurden mit Agarosegel-Elektrophorese getrennt, und das durch die Verdauung erzeugte größere Fragment,
das eine Pvu-II Stelle am 5'-Ende und eine Msp-1 Stelle am
3'-Ende besaß, wurde isoliert.
Der in diesem Beispiel verwendete Bakteriophage war Ml3 mp7,
ein M13 Phage, in den das aus E. coli isolierte Hind II Fragment eingesetzt worden war. Das Hind II Fragment besteht aus Iac-Promotor,
lac-Operator, und einem Teil des lac-Z Gens (welches
für das sogenannte ct-Peptid mit 145 Aminosäuren kodiert), sowie, eingesetzt in die lac-Z DNS, einem Eco RI Fragment mit
42 Basenpaaren, das mehrere einzelne Kionierungsstellen besitzt
(Bam HI, Sal I, Pst I9 Acc I und Hinc II). Das Hind II Fragment
wurde in die Intergenregion zwischen den Genen IV und II eingesetzt,
und zwar mit Hilfe des Restriktionsenzyms Bsu I zur Spaltung der Phagen-DNS und einer Ligase, mit der das Einsetzen
durchgeführt wurde.
-/13
Die DNS des Bakteriophagen Ml3 mp7 wurde mit Restriktionsenzym
Hinc II gespalten, welches das eingesetzte lac-Z Genfragment spaltet, und die neue, wie oben beschrieben hergestellte, für
Interferon kodierte DNS-Sequenz wurde unter Verwendung von T4 DNS-Ligase mit Stumpfendbindung in die öffnung eingesetzt.
Eigenbindung der neuen DNS-Sequenz wurde durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase verhindert.
Von dem Bakteriophagen erzeugte Plaques wurden dann mit dem klonierten IFN~ct2 DNS-Fragment getestet (hergestellt wie oben
beschrieben und radioaktiv markiert), und es wurden 18 positive Klone identifiziert, d.h. Klone mit einem lac-Gen, unterbrochen
durch eine für IFN-a2 kodierende Sequenz. DNS aus 8 dieser Isolate
wurde am 3' Ende sequenziert, um die Orientierung zu bestimmen, und bei zwei der Transformanten, mit W8 und W14 bezeichnet,
wurde nachgewiesen, daß sie die neue DNS-Sequenz in der richtigen Orientierung enthielten. Sequenzierung am 5' Ende
zeigte, daß die eingesetzte DNS in Phase mit dem Iac-Genfragment
von Ml3 mp7 war.
Es wurde gefunden, daß in WlH eine Sequenz eingesetzt war, die
für die 165 Aminosäuren von reifem Interferon-ot2 kodierte, ferner
war an dem für das N-Terminal des Interferon eine weitere
für 19 Aminosäuren kodierte Sequenz eingesetzt. Von diesen 19 Aminosäuren gehören 11 zu Ml3 mp7 ß-Galactosidase, und 8 sind
Aminosäuren, die einen Teil der IFN-ot2 Membrantransportsignalsequenz
bilden.
Im folgenden Diagramm werden dargestellt:
I Der Abschnitt der Ml3 mp7 DNS, der die Klonierungsstellen
enthält;
II Die Aminosäuren, die um die Hinc II Klonierungsstelle in der M13 mp7 DNS kodiert sind;
III Teil der Leaderfrequenz für Interferon a2, die für die
Aminosäuren Sl bis S2 3 kodiert, die in Säugetierzellen abgespalten
werden;
-/1M-
IV Teil der rekombxnanten Sequenz, wobei die ersten 32 Basen
durch Hinc II Spaltung aus (II) abgeleitet und die folgenden Basen aus (III) durch Pvu-II Spaltung abgeleitet sind.
-/15
Lac Z gene
transcription
transcription
ECoRI BamHI Sal I Sal I
~ 1
Γ ' I 1 Hindi I Hinc II Eco RI
· -ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATCCGTCßACCTGCAGGTGGACGGATCCGGGGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTC GC- 3 ' (I)
ι Jl'1 ' · I
Acc I Pst! Accl BamHI · . ·
· 6305
Lac Z gene
transcription
transcription
Hinc II
S'-ATGACCATGATTACGAATTCCCC&GATCCGTCGACCTGC- (II) ,
MetThrMetlleThrAsnSerProAspProSerThrCys t
• 1 10 Λ
Pvu II . IFN-a2 S^
«-ATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTCGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGC ' TGT-
MetAlaLeuThrPheAlaLeuLeuValAlaLeuLeuValLeuSerCysLysSerSerCysSerValGly Cys
Sl SlO S20 IN terminal .
ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATCCGTCCTGCAAGTCAAGTTGCTCTGTGGGC TGT
MetThrMetlleThrAsnSerProAspProSerCysLysSerSerCysSerValGly Cys · (IV)
Sl SlO " S19 . Ki
• Jp-O CD
CD CD
-yr-
In diesem Beispiel wurde E. coli K12 (JM 103) als Wirt verwendet. Dieses Ε« coli hat die folgenden Mutationen:
Δ lacpro, thi, str A, end A, sbc B15, hsc Rt, sup E 1 F'tra D36,
pro AB, lac I 9 ΖΔΜ15, und ist K12 restriktionslos, jedoch plus
modifiziert.
Eine Obernachtkultur von E. coli K12 (JM 103) wurde in Subkulturen
in YT Nährlösung (5 g/l NaCl, Sg Bactohefeextrakt und
8 g Bactotrypton) bei 37 0C gehalten, bis sie etwa die mid-log
Phase erreichte (etwa 10 Bakterien/ml, OD590 =0,8). 10 ml
dieser Bakterien wurden dann mit dem rekombinanten Klonierungsvektor
WlH infiziert (siehe Beispiel 1), mit einem Grad der
Vielfachinfektion von 100 pfu/Zelle, für 5 min bei 30 0C, wonach
die Kultur in 1 1 vorgewärmte YT Nährlösung bei 37 0C übertragen wurde.
Nach 2 h Wachstum unter sanftem Schütteln wurde IPTG, ein Induktor
des lac—Operon, in einer Konzentration von 0,5 mmol/1
zugegeben.
Nach weiterem 1 1/2 bis 2-stündigen Wachstum wurden die Zellen
geerntet und in 20 ml Lysispuffer (50 mmol/1 Tris-Cl bei
pH 8,0 und 30 mmol/1 NaCl), der 1 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert.
Die Bakterien wurden nach 30 min auf Eis durch drei Gefrierungs-Auftauzyklen
lysiert. Eine S-100 Fraktion (d.h. Material, das
im Oberstand nach Zentrifugieren bei 100 000 g verblieb) wurde
dann durch Zentrifugieren in einem SW h0 Rotor isoliert.
Das Material, das in Ausbeuten von bis zu 2 χ 10 Einheiten/1
produziert wurde, wurde schließlich durch ImmunChromatograph ie
auf einer Sepharosesäule, an die die IgG von NK2 (NK2 ist eine Hybridmyelomzell-Linie, die monoklonale Mäuseantikörper für
Lymphoblastoidinterferon secerniert, vgl. Secher und Burke,
-/17
Nature 285, 4U6-45O) gebunden war, gereinigt. Irgend ein anderes
geeignetes Material, das eine Immunreaktion mit Interferon o2 eingehen kann, wäre ebenfalls brauchbar. Das erhaltene Interferon
wurde mit pH 2 Puffer eluiert.
Das so gereinigte Produkt verhielt sich wie Interferon: es
zeigte die erwartete antivirale Aktivität auf heterologe Zellen
(siehe unten) und es wurde in einem immunradiometrischen Testverfahren genauso wie Interferon, das durch Namalwa-Zellen
produziert wurde, erkannt. Ferner wurde, wie erwartet, das Pro dukt durch einen polyklonalen Antikörper gegen Interferon α
neutralisiert. Elektrophorese des Produktes in einem 10 bis 25%igen Polyacrylamid-Gradientengel zeigte ein einziges gefärb
tes Band, das die gesamte antivirale Interferonaktivität enthielt.
Das Verfahren dieses Beispiels wurde mit W8 Klonierungsvektor
anstelle von W14 wiederholt.
Bei Tests mit heterologen Zellen zeigte durch W8 oder W14 produziertes
Interferon das gleiche Aktivitätsmuster wie durch Nawalma-Zellen produziertes Interferon. Die im Test verwendeten
Zellen waren:
Trisomale menschliche Zellen, Bovine EBT_-Zellen, menschliche
diploide Zellen, und Mäuse-L-Zellen. Für das Interferon aus
jeder der 3 Quellen entspricht diese Reihenfolge der Zelltypen der Reihenfolge abnehmender Aktivität. (Menschliche trisomale
Zellen sind trisomal in Hinsicht auf Chromosom 21, welches den Interferonrezeptor enthält, so daß die für diese Zellen gefundene
relativ hohe Aktivität zu erwarten war.)
Der transformierte Wirtsmikroorganismus E. coli JM 103 (W14)
wurde bei der National Collection of Industrial Bacteria (N.C.I.B.) bei der Torry Research Station, Aberdeen, Scotland,
am 12. November 19 81 deponiert und erhielt die Zugangsnummer 11704.
-h
Ende der Beschreibung
Claims (13)
1. Rekombinanter Klonierungsvektor, der für die Transformation
eines Wirtsmikroorganismus geeignet ist, d a du r c h
gekennze ich net , daß er einen für männliche Bakterien spezifischen, einzelsträngigen DNS-Bakteriophagen,
der eine doppelsträngige intrazelluläre Zwischenstufe durchläuft, beinhaltet, in dessen doppelsträngige DNS ein homologer
Promotor und, in der richtigen Orientierung, eine für ein gewünschtes heterologes Polypeptid kodierende DNS-Sequenz
eingesetzt ist, so daß ein durch den Klonierungsvektor transformierter
Wirtsmikroorganismus das gewünschte heterologe Polypeptid in gewinnbarer Form zur Expression bringen kann,
2. Rekombinanter Klonierungsvektor nach Anspruch 1, da durch
gekennzeichnet, daß der homologe Promotor ein Iac-Promotor ist.
3. Rekombinanter Klonierungsvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß der Promotor zusammen mit einem Operator vorhanden ist.
U. Rekombinanter Klonierungsvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch g e kenn ζ e i c h η e ΐ ,
daß das gewünschte heterologe Polypeptid ein Interferon ist.
5, Rekombinanter Klonierungsvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch g e kennzeichnet ,
daß das gewünschte heterologe Polypeptid ein α-Interferon ist.
6. Rekombinanter Klonierungsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferon
Interferon a2 ist.
7. Rekombinanter Klonierungsvektor nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakteriophage Ml3 mp 7 ist.
8. Rekombinanter Klonierungsvektor W14.
9. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet,
daß er durch einen Klonierungsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche transformiert ist.
10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß er ein E. coli ist.
11. Mikroorganismus nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß er ein E. coli JM103 (W14)
ist.
12. Verfahren zur Erzeugung eines gewünschten heterologen Polypeptids durch Expression mit Hilfe eines rekombinanten
Klonierungsvektors, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Wirtsmikroorganismus nach einem der Ansprüche 9 bis 11 in Kultur gehalten wird, die Polypeptiderzeugung
wenn nötig induziert, und das auf diese Weise erzeugte Polypeptid isoliert wird.
13. Für männliche Bakterien spezifischer, einzelsträngiger DNS-Bakteriophage, der eine doppeIsträngige intrazelluläre
Zwischenstufe durchläuft, und der in einem Wirtsmikroorganismus zur Expression eines gewünschten heterologen Polypeptids
in gewinnbarer Form verwendet wird.
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|---|---|---|---|
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