FR2516094A1 - Vecteur de clonage recombinant, micro-organisme transforme par ce vecteur, bacteriophage et procede pour produire un polypeptide heterologue - Google Patents

Abstract

VECTEUR DE CLONAGE RECOMBINANT, MICRO-ORGANISME TRANSFORME PAR CE VECTEUR, BACTERIOPHAGE ET PROCEDE POUR PRODUIRE UN POLYPEPTIDE HETEROLOGUE; UN VECTEUR DE CLONAGE RECOMBINANT APPROPRIE A LA TRANSFORMATION D'UN MICRO-ORGANISME HOTE COMPREND UN BACTERIOPHAGE A ADN MONOCATENAIRE MALE-SPECIFIQUE QUI A UN INTERMEDIAIRE INTRACELLULAIRE BICATENAIRE, DANS L'ADN BICATENAIRE DUQUEL EST INSERE UN PROMOTEUR HOMOLOGUE ET, DANS UNE ORIENTATION CORRECTE, UN SEQUENCE D'ADN CODANT POUR UN POLYPEPTIDE HETEROLOGUE PRE-CHOISI, SI BIEN QU'UN MICRO-ORGANISME HOTE TRANSFORME PAR LE VECTEUR DE CLONAGE EST CAPABLE D'EXPRIMER LE POLYPEPTIDE HETEROLOGUE PRECHOISI SOUS UNE FORME RECUPERABLE; DES MICRO-ORGANISMES TRANSFORMES PAR LESDITS VECTEURS ET LEUR EMPLOI POUR LA PRODUCTION DUDIT POLYPEPTIDE HETEROLOGUE, EN PARTICULIER D'UN INTERFERON, SONT EGALEMENT DECRITS.

Description

L'invention concerne-un vecteur de clonage recom-

binant, un micro-organisme transformé par ce vecteur, un bactériophage et un procédé pour produire un polypeptide hétérologue. Plus particulièrement l'invention concerne un pro- cédé pourobtenir une expression accrue d'un polypeptide dans un micro-organisme hôte transformé et le vecteur de clonage recombinant ainsi que l'hôte transformé employé dans ce procéÈ Dans le domaine du génie génétique, l'emploi de

technique à ADN recombinant pour transformer un micro-orga-

nisme hôte, par exemple une bactérie ou une levure, par insertion dans l'hôte d'un vecteur de clonage recombinant

contenant un fragment d'ADN qui code pour un polypeptide pré-

choisi, est bien connu Pour amener l'hôte à exprimer la séquence de ce fragment d'ADN sous forme d'un polypeptide, il est nécessaire de veiller à ce que l'ADN inséré puisse être

transcrit et traduit et également répliqué dans l'hôte.

Un procédé pour obtenir cette transformation,

comprend l'emploi comme vecteur d'un petit fragment circu-

laire d'ADN qui se réplique de lui-même On l'appelle un plasmide et il est généralement constitué de 3-10 x 103 paires de bases codant pour quelques gènes Une séquence

d'ADN codant pour un polypeptide préchoisi, peut être intro-

duit dans le plasmide selon des techniques connues et le

plasmide recombinant ainsi produit peut transformer l'hôte.

Ces plasmides sont maintenus en plusieurs exemplaires, géné-

ralement 20 à 30 par cellule, à l'intérieur de l'hôte par les fonctions géniques propres de l'hôte et par un moyen approprié on peut induire l'hôte recombinant à exprimer le

polypeptide préchoisi.

Un autre vecteur utile dans une transformation est

un virus qui se développe dans l'hôte, par exemple un bacté-

riophage dans le cas d'un hôte bactérien Les bactériophages,

ou phages comme on les appelle également, possèdent normale-

ment au moins 10 gênes par rapport aux plusieurs centaines de gènes d'une bactérie et une séquence d'ADN codant pour

un polypeptide préchoisi peut de façon semblable être intro-

duite dans l'ADN du phage L'hôte bactérien qui permet la transcription et la traduction de l'ADN du phage est donc

capable d'exprimer le polypeptide préchoisi.

On a constaté diverses limitations Ile ces procédés.

Dans de nombreux cas, le rendement du polypeptide préchoisi n'est pas suffisamment élevé Ceci peut résulter de plusieurs causes; dans le cas d'une transformation avec des virus, le

virus peut tuer au moins certaines cellules de l'hôte en ré-

duisant ainsi le rendement Pour cette raison on ne considère généralement comme appropriés que les virus "tempérés" Sinon

l'hôte peut produire un répresseur pour réprimer la trans-

cription des gènes dans le vecteur recombinant de façon à empêcher que les produits de ces gènes interfèrent avec son propre système et il peut être impossible de neutraliser

de façon appropriée les effets de ce répresseur.

Selon l'invention on a découvert que l'on peut accroître les rendements d'un polypeptide préchoisi produit par un micro-organisme hôte transformé, par emploi d'un bactériophage de type particulier comme support pour préparer le vecteur de clonage recombinant Plus particulièrement on prépare le vecteur de clonage recombinant à partir d'un bactériophage à ADN monocaténaire mâle-spécifique qui a un intermédiaire intracellulaire bicaténaire Les phages qui entrent dans le cadre de cette définition appartiennent au

type "M 13 ".

Les phages M 13 sont déjà connus et ont été abon-

damment utilisés dans les techniques de détermination des séquences d'ADN dans lesquelles on insère un fragment d'ADN bicaténaire dans une position connue de l'ADN du phage que l'on clone ensuite dans E coli Les phages qui sont libérés

par "bourgeonnement" des bactéries contiennent la forme mono-

caténaire de l'ADN et peuvent être isolés La séquence d'ADN

d'un brin isolé du fragment inséré peut ensuite être déter-

minée selon des techniques classiques dans lesquelles un nombre limité de séquences complémentaires du brin original d'ADN inséré sont produites et analysées sur des gels de polyacrylamide (voir Sanger, Nicklen et Coulson ( 1978) Proc.

Nat Acad Sci 74 5463-7).

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Malgré cet emploi connu des phages M 13, on n'a jamai suggéré qu'on puisse les utiliser pour l'expression d'un poly peptide hétérologue dans un hôte, par exemple une bactérie

telle que E coli Ces phages ont un nombre élevé d'exem-

plaires atteignant 80 à 100 par cellule, mais ce fait n'in-

dique pas nécessairement une capacité d'obtenir une expres-

sion importante des gènes dans l'ADN de M 13 Bien que les plasmides utilisent la plupart de leurs exemplaires pour la

transcription, les phages ont d'autres fonctions et en utili-

sent certains pour la transcription et certains pour la ré-

plication Donc le nombre d'exemplaires d'un phage ne peut

pas être considéré comme une indication du nombre d'exem-

plaires disponibles pour une transcription utile.

Les phages M 13 sont toujours infectieux et non tem-

pérés et par conséquent on ne peut pas en assurer la régu-

lation et ils sembleraient apparemment insuffisamment contrô-

lables pour être utilisés comme vecteurs de clonage recombi-

nants De plus la forme bicaténaire; des M 13 (qui est un

intermédiaire dans la production de nouveaux phages infec-

tieux bicaténaires et qui est la forme nécessaire à la trans-

cription) a été considérée comme une forme transitoire et ceci ne suggère pas la possibilité d'obtenir des valeurs

élevées d'une transcription utile.

De façon surprenante, on a découvert selon l'in-

vention que des vecteurs de clonage recombinants préparés à partir de phages M 13 peuvent dans certains cas être amenés à produire des rendements en polypeptides dix fois supérieur E à ceux des techniques de l'art antérieur Par conséquent la

présente invention fournit un bactériophage à, ADN monocaté-

naire mâle-spécifique, qui a un intermédiaire intracellulaire bicaténaire, pour l'emploi dans l'expression d'un polypeptide hétérologue préchoisi sous une forme récupérable dans un micro-organisme hôte (Le terme "hétérologue" est utilisé pot indiquer que le polypeptide n'est pas un de ceux produits

normalement par le micro-organisme hôte).

La présente invention fournit également un vecteur de clonage recombinant approprié à la transformation d'un micro-organisme hôte qui comprend un bactériophage à ADN

monocaténaire mâle-spécifique qui a un intermédiaire intra-

cellulaire bicaténaire qui a, inséré dans son ADN bicaténaire, un promoteur homologue et, dans une orientation correcte, une

séquence d'ADN codant pour un polypeptide hétérologue pré-

choisi, si bien qu'un micro-organisme hôte transformé par le bactériophage est capable d'exprimer le polypeptide hétérologue préchoisi sous une forme récupérable (Le terme "homologue" est utilisé pour indiquer que le promoteur est un de ceux que possède également normalement le micro-organisme hôte et qu'il reconnaît de façon certaine) Des exemples particuliers d'un tel vecteur sont le W 14 et le W 8 décrits dans l'exemple 1 suivant. Le promoteur hétérologue est introduit dans l'ADN de M 13 pour fournir un moyen d'amorcer la transcription de la séquence d'ADN codant pour le peptide préchoisi En général, en particulier lorsque l'hôte est E coli, c'est de préférence

le promoteur lac Le promoteur est le site sur lequel l'ARN-

polymérase se fixe pour commencer la transcription Dans un mode de réalisation préféré, le promoteur est présent en association avec un opérateur qui est e site qui fixe les

répresseurs formés par l'hôte Grâce à l'emploi d'un induc-

teur approprié pour libérer l'opérateur comme décrit ci-après, l'expression du polypeptide préchoisi peut être contrôlée et elle ne se produit pas ensuite de façon constitutive comme

c'est le cas lorsque seul le promoteur est présent La possi-

bilité de contrôler ainsi l'expression est particulièrement

souhaitable car sinon le micro-organisme hôte pourrait accu-

muler des quantités importantes d'un polypeptide dont il n'a pas l'emploi ce qui pourrait conduire au rejet par

l'hôte du vecteur de clonage de type bactériophage.

Dans l'exemple 1 qui suit, une séquence, comprenant entre autres les régions du promoteur lac et de l'opérateur lac, a été insérée dans la région intergénique entre les

gènes IV et II de l'ADN de M 13 On préfère, selon l'inven-

tion insérer le promoteur ou le système promoteur/opérateur, dans la région intergénique de l'ADN du phage de façon à ne pas perturber l'un quelconque des gènes propres du phage

ce qui pourrait perturber les fonctions du phage et éven-

tuellement la réplication.

La séjquence d'ADN codant pour le polypeptide préchois

est de façon souhaitable un gène ou une séquence d'ADN exis-

tant dans la nature Le gène ou la séquence d'ADN peut être obtenu à partir d'une source cellulaire appropriée selon des techniques classiques Elles peuvent comprendre l'isolement du gène ou de la séquence d'ADN directement par traitement du génome par une enzyme de restriction suivi d'un clonage La technique d'isolement directe du gène ou de la séquence d'ADN peut être utilisée lorsque le gène ou la séquence d'ADN ne comprend pas d'introns, comme c'est le cas des gènes codant pour l'interféron Sinon, en particulier lorsque le gène ou là

séquence d'ADN approprié comporte des introns qu'il est néces-

saire d'exciser, les techniques peuvent comprendre l'isolemen de l'ARN messager Tm ARN) de la source cellulaire, la copie de l'information génétique de ce m ARN en un ADN monocaténaire complémentaire (c ADN) par l'emploi de tran-scriptase reverse,

la destruction du modèle de m ARN et l'emploi d'une ADN-

polymérase pour former un second brin d'ADN contre le premier brin A ce moment, les deux brins d'ADN sont contigus et sont

liés par une région d'ADN monocaténaire Cette région mono-

caténaire est ensuite digérée avec une nucléase pour produire l'ADN bicaténaire Dans l'exemple l qui suit, la séquence génique est clonée dans un plasmide Ceci n'est pas un stade

essentiel mais est utile pour identifier le gène.

Selon un autre procédé, il est inutile d'isoler un gène ou une séquence d'ADN de la nature Il est possible

d'édifier une séquence d'ADN synthétique codant pour le poly-

peptide préhoisi et de l'insérer dans l'ADN de phage en un point approprié Quel que soit le procédé utilisé, il est souhaitable que la séquence d'ADN ait une proportion élevée de codons qui sont préférés par l'hôte pour l'expression

des amino-acides particuliers.

La région de promoteur et la séquence d'ADN codant pour le polypeptide préchoisi, peuvent être insérées dans l'ADN de phage soit séparément soit simultanément Ces inser tions peuvent être effectuees par insertion de la séquence d'ADN en utilisant une ligase, dans l'ADN de phage, lui-même clivé par une endonucléase de restriction La séquence d'ADN peut être clivée pour produire des extrémités mousses qui sont liées comme décrit dans l'exemple 1 ci-après ou clivées pour produire des' xtrémités cohésives ou "collantes" qui se comportent comme des sites pour l'insertion avec une T 4-ligase Sinon il est possible d'allonger l'un des deux brins d'ADN ou les deux d'un certain nombre de bases qui sont complémentaires du même nombre de bases introduites dans l'ADN de phage clivé puis d'insérer cette séquence d'ADN

modifiée dans l'ADN de phage modifié.

Le polypeptide préchoisi pour lequel code la séquence d'ADN est de façon appropriée une protéine complète dont un

exemple particulier est l'interféron (comme défini ci-après).

Il existe trois types d'interférons (IFN) connus: l'a(des cellules lymphoblastoides ou des lymphocytes), lef (des

fibroblastes) et le i(des cellules du sytème immunitaire).

Les exemples particuliers qui suivent décrivent la production d'interféron-12 qui représente un composant de l'interféron lymphoblastoide et qui contient 165 amino-acides et a un poids moléculaire d'environ 20 000 D'autres types et composants

d'interféron peuvent être préparés selon la présente inven-

tion ainsi que d'autres protéines et polypeptides.

Pour produire le polypeptide préchoisi, le vecteur de clonage recombinant de la présente invention doit être

transféré dans un hôte Cet hôte est généralement une bacté-

rie notamment E coli mâle et doit de façon souhaitable être tel qu'il ne décompose pas le polypeptide préchoisi ou qu'on puisse l'empêcher de le faire L'hôte doit également de façon souhaitable être capable de bien se développer

malgré l'infection par le phage et le fait qu'il peut pro-

duire des quantités importantes de matière dont il n'a pas l'emploi (La séquence d'ADN insérée dans l'ADN du support constitué de M 13 code pour un polypeptide qui est hétérologue du micro-organisme hôte qui est transformé, c'est-à-dire qui n'est normalement pas produit par lui, tandis que le promoteur ou le système promoteur/opérateur sont homologues à l'hôte) Les techniques pour réaliser l'infection d'un hôte

afin d'effectuer la transformation sont bien connues dans l'art.

Un autre mode de réalisation de la présente inventior est donc un procédé pour transformer un micro-organisme hôte en particulier E coli pour le rendre capable d'exprimer un polypeptide hétérologue, par infection de cet hôte avec un vecteur de clonage recombinant de la présente invention. Le micro-organisme hôte ainsi transformé qui peut exprimer

le polypeptide hétérologue préchoisi sous une forme récupé-

rable, constitue également un mode de réalisation de la

présente invention Un exemple particulier d'un micro-orga-

nisme hôte transformé est E coli JM 103 (W 14) qui est décrit dans l'exemple 2 qui suit Le micro-organisme hôte transformé est généralement placé dans un système de culture contenant

un milieu de culture nutritif synthétique pour l'hôte.

Après l'infection il peut être nécessaire d'induire le micro-organisme hôte transformé à fabriquer le polypeptide préchoisi pour lequel code le vecteur de clonage recombinant

en particulier lorsqu'un opérateur a été introduit en asso-

ciation avec le promoteur Ceci est normalement obtenu par addition d'un inducteur approprie c'est-à-dire d'une substani qui désactive toute protéine répressive formée par l'hôte, et qui libère ainsi l'opérateur etpermet à l'ARN-polymérase de se

fixer au promoteur et de commencer la transcription L'in-

ducteur approprié à utiliser dépend du système promoteur/ opérateur choisi inséré dans l'ADN de phage De préférence la séquence d'ADN est insérée en aval d'un promoteur et d'un opérateur lac; la transcription de cette séquence d'ADN peut être obtenue par addition d'une substance qui libère l'opérateur lac et commence la transcription de la séquence de jrgalactosidase Un tel inducteur est l'IPTG

(isopropyl-1-thio-j-D-galactopyrannoside).

De préférence il existe un signal d'arrêt à l'extré-

mité 3 ' de la séquence codant pour le polypeptide préchoisi, si bien que le produit formé par la traduction du m ARN peut comprendre le polypeptide désiré ayant par exemple certains des amino-acides correspondants à la i-galactosidase fixés uniquement à l'extrémité 5 ' Si on le désire, cette séquence

d'amino-acides peut ensuite être clivée pour laisser sim-

plement le polypeptide préchoisi.

De préférence, le polypeptide produit contient aussi

peu que possible d'amino-acides n'asppartenant pas au poly-

peptide préchoisi Il est particulièrement souhaitable

d'insérer la séquence d'ADN codant pour le polypeptide pré-

choisi avec seulement trois bases la séparant de la séquence de départ Ces trois bases sont l'adénine-uracile-guanine

(AUQ) qui codent pour la méthionine.

Le produit peut être récupéré de l'hôte par lyse de l'hôte puis isolement de la matière désirée, par exemple par centrifugation Celle-ci peut ensuite être purifiée

selon des techniques classiques,par exemple par immuno-

chromatographie. Par conséquent, un autre mode de réalisation de la

présente invention est un procédé pour produire un poly-

peptide hétérologue préchoisi par expression d'un vecteur de clonage recombinant, ce procédé comprenant la culture d'un micro-organisme hôte qui a été transformé par le vecteur de clonage recombinant de la présente invention; s'il est

nécessaire l'induction de la production du polypeptide hété-

rologue et l'isolement du polypeptide hétérologue produit.

Le polypeptide hétérologue produit selon le procédé ci-dessus constitue également un mode de réalisation de la présente invention Comnmindiqué cidessus, le polypeptide produit peut contenir des amino-acides superflus que de façon souhaitable on clive et le polypeptide (protéine) préchoisi est de préférence un interféron (Dans la présente

description, l'expression "un interféron" désigne "une pro-

téine qui exerce une activité antivirale sans spécificité virale au moins dans les cellules homologues selon des processus métaboliques cellulaires comprenant la synthèse d'ARN et d'une protéine", qui est l Redéfinition admise par le comité réuni sous l'égide du National Institute of Allergy and Infections Disesses et le U S National Centre on Interferon de l'organisation Mondiale de la Santé pour mettre

au point un système de nomenclature ordonnée des interférons).

La présente invention est de plus décrite par les

exemples non limitatifs suivants.

EXEMPLE 1:

On produit un vecteur de clonage recombinant selon le procédé suivant: on obtient du m ARN à partir de cellules Namalwa ayant subi une induction par le virus Sendai (les cellules Namalwa étant

une lignée cellulaire lymphoblastoide formée par transforma-

tion de leucocytes par le virus d'Epstein-Barr et ayant été déposée à i'ATCC le 7 juillet 1978 sous le N de dépôt CRL 1432), et ce m ARN est enrichi en m ARN d'interféron On utilise une fraction de ce m ARN enrichi pour produire du c ADN

que l'on utilise lui-même pour former une séquence d'ADN bica-

ténaire selon des techniques classiques On clone ensuite cette séquence d'ADN dans le site Bam HI du gène de la tétracycline du plasmide p AT 153 et on transforme en une souche H Bl O 1 de

E coli sans restriction.

On découpe la séquence génique d'interféron-ç 2 identifiée dans le clone N 5 H 8, en utilisant l'enzyme de restriction Msp-1, on purifie par électrophorèse sur gel d'agarose et on marque avec de l'j( 32 P)d CTP et du d GPT en utilisant le fragment de Klenow de l'ADN-polymérase 1 Le fragment radio-actif obtenu a des extrémités mousses et on le soumet ensuite à une digestion partielle avec l'enzyme de restriction Pvu-II (On sait que le fragment contient deux sites de restriction par Pvu-II, unau K nucléotides + 42 à + 46 dans la séquence de signal et l'autre à + 344 à + 349 dans la séquence de codage, et la digestion est telle qu'elle assure uniquement un clivage par molécule) On sépare les produits par électrophorèse sur gel d'agarose et on isole le fragment le plus gros produit par la digestion qui a un site Pvu-II à l'extrémité 5 ' et un site Msp-l à l'extrémité 3 ' Le bactériophage utilisé dans cet exemple est le M 13 mp 7 qui est un phage M 13 dans lequel on a inséré le fragment Hind II isolé de E coli Le fragment Hind II est constitué du promoteur lac, de l'opérateur lac et d'une partie du gène lac-Z (qui code pour l'-peptide ayant amino-acides) et, inséré dans l'ADN de lac-Z, un fragment Eco RI à 42 paires de bases contenant plusieurs sites de clonage isolés (Bam HI, Sal I, Pst I, Acc I et Hinc II) On insère le fragment Hind II dans la région

intergénique entre les gènes IV et II, par emploi de l'en-

zyme de restriction Bsu I pour cliver l'ADN de phage et d'une

ligase pour effectuer l'insertion.

On clive l'ADN du bactériophage M 13 mp 7 avec l'en- zyme de restriction Hinc II qui clive le fragment de gène làc-Z inséré et on insère la nouvelle séquence d'ADN codant

pour l'interféron produite comme décrit ci-dessus dans l'ou-

verture par ligature de l'extrémité mousse en utilisant la

T 4 ADN-ligase On empecne l'autoligature de la nouvelle sé-

quence d'ADN par traitement avec une phosphatase alcaline bactérienne.

On teste ensuite les plages produites par le bacté-

tiophage avec le fragment d'ADN d'IFN-dç 2 cloné (produit

comme indiqué ci-dessui à marquage radio-actif) et on iden-

tifie 18 clones positifs, c'est-à-dire les clones ayant un

gène lac interrompu par une séquence codant pour l'IFN- 2.

On détermine la séquence d'ADN de l'extrémité 3 ' de 8 de ces isolats pour connaître l'orientation et on constate que deux

transformants appelés W 8 et W 14 contiennent la nouvelle sé-

quence d'ADN dans l'orientation correcte L'étude de la sé-

quence de l'extrémité 5 ' montre que ll ADN inséré est en

phase avec le fragment de gène lac du M 13 mp 7.

On constate que le W 14 comporte une séquence insérée codant pour les 165 amino-acides de l'interféron-à 2 définitif et, à l'extrémité codant pour la portion N-terminale de l'interféron, une séquence additionnelle codant pour 19 amino-acides Sur ces 19 amino-acides, 11 appartiennent à la a galactosidase de M 13 mp 7 et 8 sont des amino-acides

faisant partie de la séquence de signal de transport mem-

branaire de l'IFN-t 2.

Les diagrammes suivants illustrent: (I) la section de l'ADN de M 13 mp 7 qui comprend les sites de clonage: (II) les amino-acides codés autour du site de clonage Hinc II de l'ADN de M 13 mp 7: (III) la partie de la séquence de tête de l'interféron-'2 codant pour les amino-acides Sl à 523 qui sont clivés dans les cellules des mammifères; et (IV) une partie de la séquence recombinante, les 32 premières bases

dérivant de (II) par clivage par Hinc II et les bases sui-

vantes dérivant de (III) par clivage par Pvu-II.

Lac Z gène _______ transcription Ec ORI Bami HI Sal I Sal I F 1 Hinc I Hi nc Il EQR GT A '-TGACATGTTACAATTCCCGATC Gy GACCTGCAGGTCGACîGATCCGGG Cf AAT Tc C TGGCCGTCGTTTTACAACGTC G C-3 ' Acc I Pst I Acc I Baxn HI

6215 6305

Lac Z gène transcription Hinc Il ' -ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATCCGT 2 WCCGC (l Met Thr Met Ile Thr Asn S er Pro Asp Pro Ser Thr Cys i 10 P.vu I 1 IFN-a 2

'-ATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTCGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGC TGT-

Met Ala Leu Trhr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys Lys Ser Ser Cys SE r Val Gly Cys si 51 o 520 ' IN terminal

__________ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATCCGTCCTG CAAGTCAAGTTGCTCTGTGGGC TGT

Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Pro Asp Pro Ser Cys Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys (IV) si S 1 o 519 L-n C-à C

EXEMPLE 2:

Dans cet exemple, on utilise comme hôte E coli K 12 (JM 103) Cet E coli présente les mutations suivantes: lacpro, thi, str A, end A, sbc B 15, hcs R 4, sup E, F'tra D 36, pro AB, lac I,Z 415 et est un K 12 sans restric-

tion mais modification +.

On repique une culture d'une nuit de E coli K 12 (JM 103) et on la cultive dans du bouillon YT ( 5 g/l de Na Cl, 5 g d'extrait de levure pour bactériologie et 8 g de tryptone pour bactériologie) à 37 C jusqu'à ce qu'on atteigne à peu près le milieu de la phase exponentielle de croissance (environ 108 bactéries/ml; D 0590 = 0,8) On infecte ensuite ml de ces bactéries avec le vecteur de clonage recombinant W 14 (voir l'exemple 1) et avec une multiplicité infectieuse de 100 unités de formation de plage/cellule pendant 5 minutes

à 30 C avant de transférer dans un litre de bouillon YT pré-

chauffé à 37 C.

Après 2 heures de croissance avec agitation douce,

on ajoute un inducteur de l'opéron lac, i'IPTG, à la concen-

tration de 0,5 m M. b Après encore 1,5 à 2 heures de croissance, on recueille les cellules et on les remet en suspension dans ml de tampon de lyse (Tris-HC 1 50 m M, p H 8,0 et Na Cl 30 m M)

contenant 1 mg/ml de lysozyme.

On lyse les bactéries après 30 minutes sur de la

glace en effectuant trois cycles de congélation-décongélation.

On isole ensuite à S-100 (c'est-à-dire une matière demeurant dans le surnageant après centrifugation à 100 000 g) par

centrifugation avec un rotor SW 40.

On purifie finalement la matière que l'on a obtenue avec des rendements atteignant 2 x 10 unités/litres par

immunochromat Qgraphie sur une colonne de Sépharose à la-

quelle est liée de l'Ig G de NK 2 (NK 2 étant une lignée de cellules de myélome hybrides sécrétant des anticorps monoclonaux de souris contre l'interféron lymphoblastoide, voir Secher et Burke, Nature 285 446-450) bien que toute autre matière appropriée capable de présenter une réaction immunologique avec l'interféron-à 2 convienne On élue

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l'interféron retenu avec du tampon à p H 2.

Le produit ainsi purifié se comporte de la même

façon que l'interféron en ce qu'il présente l'activité anti-

virale prévue sur des cellules hétérologues (voir ci-dessous) et qu'il est reconnu dans un dosage immunoradiométrique comme aussi efficace que l'interféron produit par les cellules Namalwa Egalement comme prévu, le produit est neutralisé par

un anticorps polyclonal dirigé contre l'interféron-s L'élec-

trophorèse du produit dans un gradient de gel de polyacryl-

amide à 10-25 % révèle la présence d'une seule bande colorée

qui contient la totalité de l'activité antivirale de l'inter-

féron. On répète le mode opératoire de cet exemple avec le

vecteur de clonage recombinant W 8 au lieu du W 14.

Dans les essais portant sur les cellules hétérologue l'interféron produit par W 8 et W 14 présente le même profil

d'activité que l'interféron produit par les cellules Namalwa.

Les cellules étudiées sont: des cellules trisomiques humaine des cellules EBTR bovines, des cellules diploïdes humaines et des cellules L de souris et pour l'interféron de chacune

de ces trois sources, cet ordre correspond à l'odre d'acti-

vité décroissante (Les cellules trisomiques humaines sont trisomiques pour le chromosome 21 qui comprend le récepteur de l'interféron, si bien que l'activité élevée observée dans

ces cellules était prévisible).

Le micro-organisme hôte transformé E coli JM 103 (TW 14 a été déposé au National Collection of Industrial Bacteria (N.C I B) de la Torry Research Station, Aberdeen, Ecosse

le 12 novembre 1981 et a reçu le numéro d'admission 11704.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Vecteur de clonage recombinant approprié à la

transformation d'un micro-organisme hôte comprenant un bac-

tériophage à ADN monocaténaire mâle-spécifique qui a un

intermédiaire intracellulaire bicaténaire dans l'ADN bica-

ténaire duquel est inséré un promoteur homologue et, dans une orientation correcte, une séquence d'ADN codant pour un

polypeptide hétérologue préchoisi, si bien qu'un micro-

organisme hôte transformé par le vecteur de clonage est capable d'exprimer le polypeptide hétérologue préchoisi sous

une forme récupérable.

2. Vecteur de clonage recombinant selon la reven-

dication 1, dans lequel le promoteur homologue est un pro-

moteur lac.

3. Vecteur de clonage recombinant selon l'une des

revendications 1 ou 2, dans lequel le promoteur est présent

en association avec un opérateur.

4. Vecteur de clonage recombinant selon l'une

quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le poly-

peptide hétérologue préchoisi est un interféron.

5 Vecteur de clonage recombinant selon l'une

quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le poly-

peptide hétérologue préchoisi est un à-interféron.

6. Vecteur de clonage recombinant selon la reven-

dication 5, dans lequel l'interféron est l'interféron-cv 2.

7 Vecteur de clonage recombinant selon l'une

quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le bacté-

riophage est le M 13 mp 7.

8. Le vecteur de clonage recombinant W 14.

9. Micro-organisme transformé par un vecteur de

clonage comme défini dans l'une quelconque des revendications

1 à 8.

10. Micro-organisme selon la revendication 9 qui

est un E coli.

11. Micro-organisme selon la revendication 10 qui

est E coli JM 103 (W 14).

12. Procédé pour la production d'un polypeptide hétérologue préchoisi par expression d'un vecteur de clonage recombinant qui comprend la culture d'un micro-organisme

hôte comme défini dans l'une quelconque des revendications

9 à 11, s'il est nécessaire l'induction de la production du

polypeptide et l'isolement du polypeptide ainsi produit.

13. Bactériophage à ADN monocaténaire mâle-

spécifique qui a un intermédiaire intracellulaire bicaténaire,

utile pour l'expression d'un polypeptide hétérologue pré-

1 O choisi sous une forme récupérable dans un micro-organisme hôte.