DE3220333A1 - 27-desamidosecretin und verfahren zu seiner herstellung durch rekombinierte dna-technologie - Google Patents
27-desamidosecretin und verfahren zu seiner herstellung durch rekombinierte dna-technologieInfo
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- C07K14/575—Hormones
- C07K14/645—Secretins
Description
Die Erfindung betrifft 27~Desamidosecretin (die "27" kann im folgenden manchmal weggelassen sein) und seine
Herstellung. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Desaraidosecretin durch
Gentechnologie unter Verwendung eines Strukturgens für Desamidosecretin, welches chemisch synthetisiert wurde.
Secretin ist eine Verbindung, die als gastrointestinales
Hormon bekannt ist. Es ist bekannt, daß es verschiedene
physiologische Aktivitäten aufweist, um die Sekretion von Wasser und Bicarbonaten aus dem Pankreas zu aktivieren,
und es wurde praktisch für einen Pankreas-Funktionstest
und als therapeutisches Mittel für duodenalen Ulcer verwendet.
Secretin ist ein Polypeptid der folgenden Formel:
20 5 10
Hxs-Ser-Äsp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-
15 . 20
Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-
25 27
LeU-GIn-GIy-LeU-VaI-NH2
Zur Herstellung dieses Secretins wurden solche Verfahren, wie die Extraktion von natürlich vorkommendem
Secretin [Acta Chemica Scandinavica, 15, 1790, (1961);
(1)], welches normales, vom Schwein stammendes Secretin enthält. Es wurde jedoch nachgewiesen, daß die Aminosäuresequenz
von Rindersecretin gleich ist wie die von Schweinesecretin. · Weiterhin wurde eine chemische
Synthese [Chemical Industry, 1966, 1757, (2a); Journal of the American Chemical Society, 89, 6753(1967),
(2b)] durchgeführt. Bei allen diesen Verfahren treten jedoch Nachteile auf, wie die Kosten, die Schnelligkeit,
die Produktionsausbeute, etc.. Bei dem bekannten Verfah-
10
ren, bei dem das Secretin aus dem Dünndarm von Schweinen
extrahiert und gereinigt wird, tritt die Schwierigkeit auf, daß die Vielzahl der gastrointestinalen Hormone
(Motilin, VIP, CCK-PZ, GIP, GLI, usw.) einen genauen
Bioassay oder Radioimmunoassay des Secretins stört*
In der Zwischenzeit haben die Entwicklungen bei der sog.
Gentechnologie, bei der synthetische Gene verwendet werden, solche Fortschritte gemacht, daß verschiedene physiologisch
aktive Polypeptide jetzt technisch unter Verwendung dieser Technologie hergestellt werden können.
Dementsprechend ist es möglich, wenn Secretin gemäß der Gentechnologie hergestellt werden kann, Schlüssel für
die Lösung der Probleme zu finden» wie sie oben bei den
15 bekannten Herstellungsverfahren auftreten.
Obgleich es allgemein geklärt wurde, daß die Herstellung eines Polypeptids durch Gentechnologie unter Verwendung
synthetischer Gene möglich ist, indem man das Strukturgen
chemisch synthetisiert, das Gen in ein entsprechendes Plasmid als Vektor einsetzt, einen geeigneten Wirt
transformiert und das gewünschte Polypeptid bildet und gewinnt, indem man das Transformans züchtet, ist es
nicht notwendigerweise möglich, vorab festzustellen oder vorherzusagen, ob gemäß diesem Verfahren ein besonders
gewünschtes Polypeptid, das die gewünschte physiologische Aktivität aufweist, hergestellt werden kann.
Diese Schwierigkeiten bedeuten im Falle von Secretin, SQ daß das Ende des Strukturgens DNA, das das Polypeptid
ausdrückt, notwendigerweise das Codon aufweisen muß, das Valin entspricht, da das C-Ende des Secretin-Polypeptids
ein Amid von Valin ist, wie oben erwähnt, und daher muß das gebildete Polypeptid ein C-Ende, das Valin
*"' ist, besitzen. Aufgrund dieser Überlegungen ist es sehr
zweifelhaft, ob das erhaltene Polypeptid die physiologi-
11
1 sehe Aktivität, die Secretin eigen ist, aufweist.
1 sehe Aktivität, die Secretin eigen ist, aufweist.
Es wurde nun gefunden, daß das Strukturgen, welches ein Secretinderivat, dessen C-Ende Valin ist, nicht in Form
des Amids aufweist, nämlich Desamidosecretin, chemisch
synthetisiert werden kann; daß das Gen in ein geeignetes Plasmid als Vektor unter Bildung eines Chimären-Plasmids
eingesetzt werden kann; daß die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit dem Chimären-Plasmid
wie auch die Bildung und Gewinnung von Desamidosecretin durch Züchten des Transformans möglich sind; daß das
gebildete Desamidosecretin eine Aktivität aufweist, die ähnlich ist wie die von Secretin; und daß weiterhin ein
Expressionssystem von Lactoseoperon bei der Herstellung von Desamidosecretin verwendet werden kann und daß die
Ausbeute an Desamidosecretin wesentlich erhöht werden kann, wenn man dieses Expressionssystem verwendet.
Das erfindungsgemäße 27-Desamidosecretin umfaßt ein PoIypeptid,
das durch die Aminosäuresequenz His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-AIa-Arg-Leu-GIn-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-OH
dargestellt wird, worin VaI-OH anzeigt, daß das C-Ende
des Polypeptids, das Valin aufweist, eine Carbonsäure
ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin, das die
folgenden Stufen umfaßt:
(1) die chemische Synthese eines Strukturgens für das Desamidosecretin, das dem Polypeptid entspricht, bei
dem die Aminosäure am C-Ende des Secretins Valin ist;
(2) Einsetzen dieses Gens in ein Vektorplasmid,
das in einer vorbestimmten Wirtszelle unter Bildung eines
Chimären-Plasmids wachsen kann, das in der Zelle ebenfalls wachsen kann;
(3) Transformation der Wirtszelle mit dem Chimären-Plasmid;
und
(4) Züchten des erhaltenen Transformans und Gewinnung des gebildeten Desaraidosecretins.
5
Ein weiteres und bevorzugtes Verfahren zur Herstellung
des erfindungsgemäßen Desamidosecretins umfaßt die folgenden Stufen:
(1) chemische Synthese eines Strukturgens für das Desamidosecretin, das dem Polypeptid entspricht, bei
dem die Aminosäure am C-Ence des Secretins Valin ist; • (2) Vorsehen eines Vektorplasmids, welches das
Lactoseoperon ausnutzen kann und ebenfalls in einer vorbestimmten Wirtszelle wachsen kann;
(3) Einsetzen des Strukturgens in das Vektorplasmid unter Herstellung eines Chimären-Plasmids, das
in der Zelle wachsen kann;
(4) Transformation der Wirtszelle mit dem Chimären-Plasmid;
und
(5) Züchten des entstehenden Transformans und Gewinnung des gebildeten Desamidosecretins.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin
umfaßt in seiner allgemeinsten Form folgende Stufen:
(1) Herstellung eines Chimären-Plasmids, das ein Fragment eines Strukturgens für ein Desamidosecretin
enthält, das einem Polypeptid entspricht, bei dem die Aminosäure am C-Ende des Secretins Valin ist, und wobei
das Chimären-Plasmid in einer vorbestimmten Wirtszelle wachsen kann und das Strukturgen für ein Desamidosecretin
in der Wirtszelle ausdrücken kann;
(2) Transformieren der Wirtszelle mit dem Chimären-Plasmid;
und
*" (3) Züchten des entstehenden Transformans und
Gewinnung des gebildeten Desamidosecretins.
Ein typisches Beispiel für Wirtszellen, die bei dem
Transformationsverfahren, wie oben definiert, verwendet
werden können, ist Escherichia coli, das zum Genus Escherichia gehört, und das Lactoseoperon stammt von
5 Escherichia coli.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin können alternativ als Verfahren definiert werden, das darin besteht, daß man einen Des-
10 amidosecretin erzeugenden Mikroorganismus, der zu
Escherichia coli gehört und in den ein Plasmid eingearbeitet wurde, das das Desamldosecretin-Strukturgen enthält,
züchtet, und daß das bei der Ausnutzung des Lactoseoperons in Escherichia coli gebildete Desamido-
15 secretin gewonnen wird.
Die Erfindung betrifft somit weiterhin die Züchtung von Escherichia coli, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, wobei Escherichia coli so transformiert wurden, daß sie einen solchen Phenotyp aufweisen, daß
der Stamm beim Züchten 27-Desamidosecretin bildet. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Escherichia
coli, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mit einem Plasmid transformiert wurden, welches darin eingearbei- _,
tet oder eingesetzt ein chemisch synthetisiertes Strukturgen von Desamidosecretin aufweisen, welches dem PoIypeptid
entspricht, bei dem die Aminosäure am C-Ende
Valin ist, und wobei das Plasmid fähig ist, das Lactoseoperon ausnutzen zu können,und ebenfalls fähig ist, in
30 einer vorbestimmten Wirtszelle zu wachsen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid, welches das Strukturgen umfaßt,
das 27-Desamidosecretin ausdrückt. 35
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Plasmid, welches
das Strukturgen umfaßt, das 27-Desamidosecretin ausdrückt bzw. vorzeichnet.
Entsprechend der oben zusammengefaßten Lehre der vorliegenden Erfindung, können die Probleme, die bei Extraktion
und Reinigung im Falle der Extraktion von natürlichem Secretin auftreten, wobei man davon ausgegangen
ist, daß die Extraktion von natürlichem Secretin das einzig technische Verfahren war, vermieden werden, wenn
der Extrakt von Rekombinationsgen erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial verwendet wird.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, eine oder mehrere Arten der Aminosäuren, die das Peptid
darstellen, zu ändern, wodurch es möglich wird, die Korrelationen zwischen den Strukturen und den Aktivitäten
der Peptidhormone zu untersuchen. Dies bedeutet in anderen Worten, daß erfindungsgemäß ein Verfahren zur
leichten Herstellung eines beliebigen, gewünschten, mit Aminosäure substituierten Derivats eines physiologisch
aktiven Peptide zur Verfügung gestellt wird. Die Bildung eines Polypeptid-Derivats durch Manipulation
von Genen ist das beste Verfahren im Hinblick auf die Tatsache, daß die Bildung eines hochmolekularen Polypeptid-Derivats
durch chemische Synthese entsprechend den derzeit verfügbaren Verfahren sehr schwierig ist.
Durch die Verwendung des Virt-Vektor-Systems, das bei
dem bevorzugten Verfahren zur Herstellung des Desamidosecretins, wie oben erwähnt, verwendet wird, ist es
•möglich, Desamidosecretin mit einer Secretinaktivität
herzustellen, die etwa 3 x 10 Molekülen/1 Wirtszelle
entspricht, was einer praktisch annehmbaren Ausbeute gleichkommt. Ausgedrückt als Fusionsprotein, wie. nachstehend
erläutert, beträgt die Ausbeute 2,85 x 10 Moleküle/Zelle, wobei dieser Wert eine hohe Ausbeute bei der
Herstellung von Desamidasecretin angibt, und wobei diese
hohe Ausbeute möglich wird, indem man unter Verwendung
des Chimären-Plasmids erfindungsgemäß in Bakterien ohne zerstörende (proteolytische) Wirkung durch Proteasen
5 eine Merkmalsexpression hervorruft.
Es existieren Polypeptide mit Ausnahme von Secretin mit
einem C-Ende In Form eines Amids, und die vorliegende Erfindung erschließt die Herstellung von Desamidderivaten
solcher anderen Polypeptide wie auch die Expression ihrer physiologischen Aktivitäten.
(1) Desamidosecretin
Das erfindungsgemäße 27-Desamidosecretin ist ein PoIypeptid,
das durch die Aminosäuresequenz der folgenden Formel (I) dargestellt wird:
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-VaI-OH
.......... (I).
in der Formel (I) "bedeuten His und die anderen Bezeichnungen
die bekannten Symbole für Aminosäuren, wie Hystidin, etc..
Das Polypeptid unterscheidet sich von dem Secretinpolypeptid darin, daß das Valin am C-Ende nicht in Form eines
Amids (VaI-NH2)* sondern in Form des Carboxyls
. (VaI-OH) vorliegt.
Das Desamidosecretin, das eine physiologische Aktivität aufweist, die ähnlich 1st wie die von Secretin, wie
eine Wirkung, daß es die Sekretion des Pankreassaftes aktiviert, kann selbst als ein dem Secretin ähnliches,
physiologisch aktives Polypeptid verwendet werden. Andererseits kann das Desamidosecretin als Secretin verwendet
werden, nachdem es am C-Ende-Carboxylmolekülteil
amidiert wurde. Die Amidierung kann nach einem reinen chemischen Verfahren, einem enzymatischen Verfahren oder
einem biologischen Verfahren in vivo durchgeführt werden.
1 (2) Herstellung: von Desarnidosecretin
Das Desamidosecretin wird, obgleich es durch Modifizierung
des C-Endes von Secretin hergestellt werden kann, bevorzugt erfindungsgemäß nach gentechnologischen Verfahren
erzeugt, indem man ein Strukturgen für dieses Polypeptid chemisch synthetisiert, ein Plasmid herstellt,
so daß das Polypeptid ausgedrückt werden kann, eine Wirtszelle mit dem Plasmid transformiert, das gewünschte
Polypeptid durch Züchten des Transformans bildet und das Desamidosecretin gewinnt.
(1) Strukturgen
(1) Aufbau des Gens
Die Grundsequenz von DNA, aus der das Strukturgen von Secretin besteht, ist unbekannt. Daher werden von einigen Codonen, die die Aminosäuren, die das Peptid darstellen, vorzeichnen, solche für die Synthese der DNA ausgewählt, die die folgenden Bedingungen erfüllen: (i) es sollte so kontrolliert sein, daß der Bereich, der an A - T -Grund- bzw. Basenpaaren angereichert ist, nicht unmittelbar dem Bereich folgt, der an G - C-Grund- bzw. Basenpaaren angereichert ist; und
Die Grundsequenz von DNA, aus der das Strukturgen von Secretin besteht, ist unbekannt. Daher werden von einigen Codonen, die die Aminosäuren, die das Peptid darstellen, vorzeichnen, solche für die Synthese der DNA ausgewählt, die die folgenden Bedingungen erfüllen: (i) es sollte so kontrolliert sein, daß der Bereich, der an A - T -Grund- bzw. Basenpaaren angereichert ist, nicht unmittelbar dem Bereich folgt, der an G - C-Grund- bzw. Basenpaaren angereichert ist; und
(ii) es sollte so kontrolliert werden, daß jedes der im folgenden beschriebenen synthetischen Fragmente
nicht eine unerwünschte, komplementäre Basensequenz intramolekular oder intermolekular aufweist.
Es ist weiterhin wegen der leichten Selektion des transformierten Stammes bevorzugt, das Strukturgen so zu
entwerfen, daß darin eine oder mehrere Erkennungsbasensequenzen für das Restriktionsenzym enthalten sind. Im
Falle von Desamidosecretin ist es bevorzugt, daß das Gen die Erkennungsbasensequenz von Hinf I und Hae II
aufweist.
35
35
Aufgrund dieser Überlegungen sind typische Beispiele
von Codonen, die Aminosäuren in dem Desamidosecretin-Strukturgen ausdrücken bzw. vorzeichnen, die folgenden.
Aminosäure | Codon | TCA | • |
His | CAC | CTC, CTA, | |
Ser | TCT , | TTA, CTT, | |
Asp | GAT | ACC | CGC |
GIy | GGT | ||
Thr | ACT, | CAG | |
Phe | TTC | ||
GIu ■ | GAA | ||
Leu | TTG, | ||
CTG, | |||
Arg | CGT, | ||
AIa | GCA | ||
GIn | CAA, | ||
VaI | GTT | ||
Dementsprechend besitzt eine bevorzugte Ausführungsform des Strukturgens für das erfindungsgemäße Desamidosecretin
eine Basensequenz, wie sie im folgenden in den Versuchsbeispielen und in der Zeichnung dargestellt
wird (wobei in der Zeichnung die Basensequenz natürlich der Molekülteil von CAC ist, der His bis GTT, entsprechend
VaI, entspricht),.
Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft in einer
Ausführungsform ein doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid, welches ein Strukturgen umfaßt, das das 27-Desamidosecretxn,
wie oben ausgeführt, ausdrückt, und eine bevorzugte Ausführungsform des Strukturgens besitzt
die im folgenden dargestellte Basensequenz.
His Ser Asp GIy Thr Phe Thr
CAC - TCA - GAT - GGT - ACT - TTC - ACC -
GTG - AGT - CTA - CCA - TGA - AAG - TGG -
Ser GIu Leu Ser Arg Leu Arg
TCA - GAA - CTA - TCT - CGT - CTA - CGT AGT - CTT - GAT - AGA - GCA - GAT - GCA -
" ·
Asp Ser Ala Arg -Leu Gin Arg
GAT - TCA - GCA - CGC - CTC - CAG - CGC -CTA - -AGT - . CGT - .GCG - GAG - GTC - GCG -
Leu Leu Gin GIy Leu VaI
TTG - CTG - CAA - GGT - CTC - GTT
AAC - GAC - GTT - CCA - GAG - CAA
Das Verfahren zum Ausdrücken bzw. für die Expression eines solchen Strukturgens wie in Einzelheiten z.B. in
der JA-OS 92696/1979 beschrieben. Wenn pBR 322 als Plasmid verwendet wird, in das das Gen eingearbeitet
25 werden soll, und wenn das Desamidosecretin als Fusionsprotein mit dem Lactamaseoperon davon ausgedrückt werden
soll, ist die Stelle, an der das Gen eingearbeitet wird, geeigneterweise die Erkennungsstelle im Operon
für das Restriktionsenzym Pst I. Das heißt, das Codon
30 ATG für Methionin, welches die Stelle ist, die durch Bromcyan angegriffen wird, wird an der 5'-Endenseite
des Strukturgens vorgesehen, während eine oder mehrere Stoppcodone an dem 3'-Ende vorgesehen sind. Daher werden
für die Synchronisierung mit dem Raster [Proceedings
35 of the National Academy of Sciences of the United States of the America, 75, 3737 (1978); (3)], beginnend mit dem
ι Startcodon des Lactamasegens, die Basen randomartig in
Zahlen von 2 + 3n (n = O, 1, 2, ...) ausgewählt, dem
Gen an der 5'-Seite von ATG ■ und weiterhin Pst I-Erkennungsbasensequenzen für die Bildung der
kohäsiven Enden an beiden Enden verliehen. Im allqemeinen werden
Strukturgene so vorgezeichnet und synthetisiert [Science, 198, 1056 (1977, (4a); Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America,
75, 5765 (1978), (4b); Nature, 281, 18 (1979), (4c); Biochemistry, 1980, 6096 (1980), (4d)j, daß die beiden
kohäsiven Enden freiliegen« Gegebenenfalls können jedoch auch beide Enden glatte Enden sein, wofür es
erforderlich ist, zwei oder mehrere Basen, die randomartig ausgewählt sindr an weiteren, äußeren Teilen der Erkennungsbasensequenz
vorzu-sehen, um die Hydrolysewirksamkeit des Restriktionsenzyms zu verbessern.
Die optischen Paare von Basen, die an der 5'-Stelle
von ATG vorgesehen sind, sind 3m-Paare (3m + 1)-Paare
oder (3m + 2)-Paare, wobei m eine ganze Zahl von 0 oder 1 oder mehr bedeutet.
Unter Beachtung dieser Überlegungen ist eine bevorzugte Ausführungsform des Gens für das Desamidosecretin, das
bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, dasjenige, das in den folgenden Versuchsbeispielen
näher erläutert wird.
Ein bevorzugtes Gen für das Desamidosecretin besitzt die im folgenden angegebene Struktur:
Met-
ACCTGCAGCC - ATG TGGACGTCGG - TAC - ,.
35 ·
20
His Ser Asp GIy Thr Phe Thr
His Ser Asp GIy Thr Phe Thr
CAC - TCA - GAT - GGT - ACT - TTC - ACC - "
GTG - AGT - CTA - CCA - TGA - AAG - TGG -
Ser GIu Leu Ser Arg Leu Arg
TCA - GAA - CTA - TCT - CGT - CTA - CGT AGT - CTT - GAT - AGA - GCA - GAT - GCA -
Asp Ser Ala Arg Leu · Gin Arg GAT - TCA - GCA - CGC - CTC - CAG - CGC CTA
- AGT - CGT .- GCG - GAG - GTC .- GCG .- -
Leu Leu Gin GIy Leu VaI TTG - CTG - CAA - GGT - CTC - GTT -
AAC - GAC - GTT - CCA - GAG - CAA 20
END END
TGA - TAG - GGCTGCAGGT
ACT - ATC - CCGACGTCCA
(2) Synthese
Für die Synthese des Gens, das, wie oben beschrieben, entworfen bzw. konstruiert wurde, kann jeder der beiden +-
und —Stränge in mehrere Fragmente geteilt werden. Diese
30 Fragmente können chemisch synthetisiert werden und dann werden die entsprechenden Fragmente miteinander verbunden.
Es ist bevorzugt, jeden Strang in etwa 16 Fragmente zu teilen, wovon jedes 9 bis 16 Basen enthält, so
daß sich 6 bis 7 Basen überlappen. Als Syntheseverfahren
.für jedes Fragment kann man das Diesterverfahren
[Science, 203, 614 (1979); (5)], das Triesterverfahren [Nucleic Acids Research, 8, 5491 (1980), (6a); Nucleic
Acids Research, 8, 5193 (1980), (6b); Tetrahedron Letters,
21, 4159 (1980), (6c); Nucleic Acids Research, 8, 2331 (1980), (6d)], das Verfahren mit fester Phase [supra;
(4a) bis (4d)], das Flüssigkeitsphasenverfahren oder das Verfahren, bei dem ein Enzym verwendet wird, [The
Journal of Biological Chemistry (j.Biol.Chem.), 241,
2014 (1966), (7a); Nucleic Acids Research, 1, 1665 (1974), (7b)] verwenden. Im Hinblick auf die Synthesezeit,
die Ausbeute und die Reinigung ist das Verfahren mit fester Phase entsprechend dem Triesterverfahren besonders
bevorzugt.
Hinsichtlich der Einzelheiten für die Synthese wird auf die zahlreichen, aufgeführten LiteratursteIlen und die
folgenden Versuchsbeispiele verwiesen.
(3) Reinigung
Wenn ein Oligonucleotid synthetisiert wird, wird die Abtrennung und Reinigung des Endprodukts im allgemeinen
schwieriger mit der Ausdehnung der Stranglänge. Insbesondere werden bei dem synthetischen Verfahren mit fester
Phase Oligonucleotidblöcke, die auf geeignete Weise geschützt werden, stufenweise kondensiert, und daher
kann eine Reinigung nach an sich bekannten Verfahren, wie Gelfiltration, Gelelektrophorese, Ionenaustauschsäule,
Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie,
etc., nicht leicht durchgeführt werden.
In einer Säule mit Umkehrphase differiert die Retentionszeit stark, abhängig davon, ob das Oligonucleotid eine
lipophLle Schutzgruppe umfaßt oder nicht. Dementsprechend kann bei der Verwendung in der. letzten Kondensationsstufe
eines Oligonucleotidblocks mit einer Schutzgruppe, die bei den Bedingungen, bei denen die anderen
Schutzgruppen entfernt werden, stabil ist, gefolgt von einer geeigneten Entfernung der anderen Schutzgruppen,
ein Gemisch aus Oligonucleotiden mit den stabilen Schutzgruppen nur in dem gewünschten Endprodukt erhalten
werden. Unter Ausnutzung der lipophilen Natur der Schutzgruppe, kann das gewünschte Endprodukt von dem
Gemisch von nichtumgesetzten Species mittels einer Säule mit Umkehrphase abgetrennt werden; auf diese Stufe
folgt die Entfernung der Schutzgruppe unter Bildung des gewünschten Oligonucleotids. Gemäß diesem Verfahren
kann das so synthetisierte Oligonucleotid wirksam aus dem Gemisch der nichtumgesetzten Species abgetrennt
und gereinigt werden.
15 (4) Phosphorylierung und Verknüpfung
Die so hergestellten, synthetischen Fragmente werden anschließend miteinander unter Verwendung einer DNA-Ligase
verknüpft. Zur Herstellung der synthetischen Fragmentsubstrate für das Enzym ist es erforderlich,
die 5' -Hydroxylgruppe in den Fragmenten zu phosphorylieren. Zu diesem Zweck wird im allgemeinen PoIynucleotidkinase
verwendet, aber die chemische Phosphorylierung kann ebenfalls durchgeführt werden [Nucleic
Acids Research, 8, 5753 (1980), (8)]. Obgleich die Verknüpfung
der Fragmente im allgemeinen unter Verwendung von DNA-Ligase erfolgt, ist es weiterhin möglich, das
Verfahren zu verwenden, bei dem die Phosphorsäuregruppen an den 5'-Enden nach geeigneten Verfahren (z.B.
Imidazolylierung) aktiviert und chemisch mit dem Strang
an der entgegengesetzten Seite als Templat verknüpft werden [Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 26,2396,
(1978), (9)].
(2) Herstellung eines'Vektors mit Lactoseoperon
Bei dem bevorzugten Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin
gemäß der Erfindung ist es möglich,
verschiedene Plasmide zu verwenden, die das gesamte oder einen Teil des Laetoseoperons von E- coli-Chromosom
DNA enthalten und in der Lage sind, in E. coli zu wachsen. Die Herstellung dieser Plasmide kann entsprechend herkömmlichen
Verfahren, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind, durchgeführt werden. Die das
Lactoseoperon enthaltende DNA kann direkt aus E. coli-Chromosomen erhalten werden, aber verschiedene Transduktionsphagen,
die das gesamte oder einen Teil des Lactose-
10 operons enthalten (z. B. Pldl, F'-Iac, ?f80dplac,
Ah80dlac, Aplac, etc.), können hergestellt werden, und
daher kann der erforderliche Anteil an Lactoseoperon zweckdienlich aus diesen Phagen entnommen werden. Damit
das Plasmid in E. coli wachsen kann, ist es erforderlieh,
den notwendigen Teil des obigen Laetoseoperons mit einem anderen Plasmid von E. coli (z.B . pBR322,
pSCIOI, \dVl) unter Bildung eines einzigen Plasmidvektors
zu verknüpfen.
Gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung wird die Transduktionsphage Aplac5 [Nature, 224, 768 (1969);
(23)] als DNA enthaltendes Lactoseoperon verwendet. Aplac5-DNA kann beispielsweise aus E.coli PK1512, einem
lysogenen Bakterium, nach an sich bekannten Verfahren
[Extra Volumes of "Protein, nucleic acid & enzyme", Last vol., S.19 (1973); (2O)] erhalten werden.
Dieses \plac5hat den Bereich von dem Mittelweg in dem i-Gen
bis zum Mittelweg des y-Gens des Lactoseoperons und besitzt bevorzugt kein anderes E.coli-Gen als das Lactoseoperon
[supra; (20)], und daher ist es bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Als Plasmid von E. coli
verwendet man pBR322, das aus solchen Gründen ausgewählt wurde. , daß es eins der am leichtesten verfügbaren
Plasmide ist und daß die gesamte Basensequenz bestimmt bzw. vorgezeichnet ist· und daß es gegenüber Ampicillin
und Tetracyclin resistente Markierungsgene aufweist.
Weiterhin wird in Verknüpfung mit diesen Genen jedes Gen
(\plac5 und p3R322) mit den Restriktionsenzymen EcοRI
und HindiII behandelt und das Fragment von 3»8 Md (Mega-Dalton)
[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 73, 3900 (1977); (15)]
für Xplac5 und das größere Fragment [Gene, 2, 95 (1977);
(16)] für pBR322 werden entnommen und miteinander verknüpft, so daß der erwünschte Plasmidvektor erreicht
wird. Dieser Vektor wird bei der vorliegenden Erfindung als "pRE" bezeichnet.
Das Lactoseoperon aus E.coli-Chromosom wurde für die Expression des gewünschten Desamidosecretins aus den Gründen
ausgewählt, weil das Fremdgen in das z-Gen in dem Lactoseoperon an der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms von EcoRI eingesetzt werden kann, das in Form
eines Proteins, das mit ß-Galactosidase [supra, (4a);
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76, 106 (1979), (17)] fusionieitist,
ausgedrückt werden kann, daß ein Protein in großer Menge gebildet werden kann, daß induzierte Bildung
durchgeführt werden kann, wenn ein geeigneter Wirt-Mikroorganismus verwendet wird, und daß das Produkt
leicht und auf stabile Art als Fusionsprotein in im we-
25 sentlichen reiner Form isoliert werden kann.
Es ist somit bevorzugt, daß der Vektor, der erfindungsgemäß hergestellt wird, nur eine Erkennungsstelle des
Restriktionsenzyms EcoRI aufweist, und zu diesem Zweck
verwendet man die DNA-Fragmente, die man erhält, indem man Aplac5 und pBR322 mit EcoRI bzw. Hindlll, wie oben
' beschrieben, spaltet, die ihrerseits wieder miteinander verbunden sind.
1 (3) Chimären-Plasmid
(1) Herstellung
An einer geeigneten Stelle in dem Vektor, der so bestimmt
wurde, daß er das Fremdgen, wie oben beschrieben, ausdrücken kann, wird das zuvor erwähnte Desamidosecretin-Strukturgen
eingesetzt bzw. eingearbeitet. Die Einsetzung bzw. Einarbeitung per se kann nach einem an
sich bekannten Verfahren, das auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt ist, erfolgen. Hinsichtlich der
Einzelheiten des verwendeten Verfahrens wird auf die folgenden Versuchsbeispiele verwiesen.
Entsprechend einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird pBR322 als Vektorplasmid verwendet, und das Gen
wird an seiner Pstl-Erkennungssteile unter Bildung des
Chimären-Plasmids eingesetzt. Bei der vorliegenden Erfindung wird dieses Chimären-Plasmid als "pMG" bezeichnet.
Die Hauptgründe, weshalb pBR322 als Vektorplasmid ausgewählt wird, sind die, daß es eines der am leichtesten
zugänglichen Plasmide ist, daß die gesamte Basensequenz bestimmt ist und daß es gegenüber Ampicillin und Tetracyclin
resistente Markierungsgene aufweist. pBR322-Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA,
unter der Hinterlegungsnummer ATCC 37017 hinterlegt. Die Hauptgründe, weshalb die Pstl-Stelle als Platz für
die Einarbeitung des Gens ausgewählt wurde, sind, daß das Lactamaseoperon als solches verwendet werden kann,
daß das Suchen für das Transformans leicht durchgeführt werden kann, da sich die Ampicillin-Resistenz (Ap )
zu einer Ampicillin-Empfänglichkeit (Aps) ändert,und
daß nur eine Pstl-Stelle in pBR322 vorhanden*ist.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin
entsprechend einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird pRE 1 , das im folgenden
näher erläutert wird, als Vektorplasmid eingesetzt, und ein Gen, das das Desamidosecretin-Strukturgen enthält,
wird an der EcoRI-Erkennungsstelle unter Bildung eines
Chimären-Plasmids eingesetzt. Bei der vorliegenden Erfindung wird dieses Chimären-Plasmid als "pLS" bezeichnet.
Bei dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das das obige Strukturgen enthaltende Gen das bevorzugte,
d.h. es hat die Basensequenz, die in der Zeichnung dargestellt wird. Zur Einarbeitung dieses Gens, das
Erkennungsstellen des Restriktionsenzyms Pst I an seinen beiden Enden trägt, in pRE 1 ist es erforderlich,
die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen Pst I zu EcoRI umzuwandeln.
20 (2) Linker
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Desamidosecretins wird eine doppelstrangige DNA für den Linker zwischen dem das Strukturgen
enthaltenden Gen und pRE 1 benötigt. Das heißt, die doppelstrangige DNA muß zwei Erkennungsstellen für die
Restriktionsenzyme Pst I und EcoRI aufweisen, wobei beide
Paare zwischen beiden Restriktionsenzym-Erkennungsstellen 3n+1 (n = 1, 2, 3» ···) sind, so daß sie mit
dem Leseraster für die Translation, beginnend mit dein Startcodon von ß-Galactosidase-Gen,synchronisiert werden
können (die Arten der Basenpaare können randomartig ausgewählt werden, solange kein Nonsenscodon auftritt).
Es ist lediglich erforderlich, daß der Teil für den Linker schließlich"die obige Funktion ausübt und daß es
möglich ist, den Linker gemäß dem Verfahren zti erhalten,
bei dem das obige Strukturgen synthetisiert wird. Bei
2?
einer AuGführungsform der vorliegenden Erfindung wird
gemMß einem Beispiel eines solchen synthetischen Verfahrens
der Linker erhalten, indem man das im folgenden beschriebene Verfahren verwendet.
Zuerst wird eine einstrangige DNS, wie im folgenden gezeigt, mit Erkennungsstellen der Restriktionsenzyrne
Pst I und EcoRI entwickelt.
51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
CTGAATTCAG C T CT GC A G A G
!5 worin 1, 2, 9-12, 19, 20 randomartig ausgewählt werden
können, solange sie die folgenden Bedingungen erfüllen.
Bedingung (1); 1 und 10, 2 und 9, 11 und 20 und
12 und 19 sind je ein Paar von Basen, die ,zueinander komplementär sind;
Bedingung (2j: die Sequenz 9t 10, 11 ist kein
sog. Nonsenscodon.
Die so konstruierte, einstrangige DNA (die in der vorliegenden Anmeldung als "Prälinker?1 bezeichnet wird),
bedingt wegen ihrer eigenen Komplementär!tat, nimmt
eine langkettige, doppeistrangige DNA-Struktur an mit
einer Zahl von Einschnitten (gespaltene Stellen ohne . Spalt, die auf einem der beiden Stränge von DNA gebildet
werden). Dementsprechend kann eine doppeIstrangige
DNA ohne Spalt daraus durch Einfluß einer DNA-Ligase
auf sie gebildet werden. Die so hergestellte, doppelstrangige DNA ist eine doppelstrangige PoIy-DNA mit
alternierenden Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme Pst I und EcoRI, nämlich sich wiederholende Basensequenzen
1 bis 20, wie oben, aufweist.
? 8
Durch Behandlung der doppelstrangigen DNA mit dem Restriktionsenzym
Psti kann ein Linker von Pstl-EcoRI-Pstl
mit kohäsiven Enden erhalten werden.
Allgemein gesagt, besitzt der Linker mit Erkennungsstellen
für zwei Restriktionsenzyrne verschiedene Verwendungen
und die Ziele wurden gemäß dem Stand der Technik erreicht, wenn zwei Arten von Oligomeren verwendet wurden.
Die hier entwickelte Idee ermöglicht das Erreichen des Ziels unter Verwendung einer Art von Oligomeren
nach dem oben beschriebenen Verfahren, und die einstrangige DNA ist für die im folgenden angegebene Expression
geeignet.
Λ ... A. Q-**-
15
Restriktionsenzym A-Erkennungsstelle
X-X
2* '
XnYm
• · . Ip *· Λ
Restriktionsenzym B-Erkennungsstelle
) I
Y'
wobei X und X' und Y und Y' irgendeine der gewünschten
Basen (A, G, C, T) sind, die miteinander komplementär sind (n und m=0, 1, 2, ...). Bei der vorliegenden Erfindung
bedeutet A EcoRI und B Pst I und η + m = 3p + 1
(p = 1, 2, ...), worin ρ bevorzugt 1 oder 2 bedeutet.
25
(3) Bestimmung der Richtung
Die Bestimmung der Richtung des 27-Desamidosecretin-Gens,
das in das Plasmid eingearbeitet wird, kann durchgeführt
werden, indem man die spezifische Stelle, die in dem Strukturgen enthalten ist, mit einem Enzym (Hae II),
das die spezifische Stelle erkennt, spaltet, eine andere Stelle an einer bestimmten Lage außerhalb des Strukturgens
spaltet und die Größe des erhaltenen Fragments analysiert.
35
1 (4) Transformation (T) Wirtszelle
Ein typisches Beispiel einer Wirtszelle, die unter Verwendung des Chimären-Plasmids, das darin das Desamidosecretin-Strukturgen,
wie oben beschrieben, wie das obige pMG, eingearbeitet enthält, transformiert werden kann,
ist ein E.coli-Stamm K12C600, FEPWi BP-115, hinterlegt
bei dem Institute of Fermentation Research, Agency of
Industrial Science and Technology, Japan. Der E. coli-Stamm
K12C600 wird in der Literatur beschrieben [Nature, 217, 1110, (1968); (24)], und seine bakteriologischen
Eigenschaften werden dort ebenfalls beschrieben [supra;
Ein weiteres Beispiel für das Chimären-Plasmid, das darin eingearbeitet das Desamidosecretin-Strukturgen, wie oben
beschrieben, enthält, ist pLS, wie pLS 58, das bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren für die Herstellung
von Desamidosecretin verwendet wird. Ein typisches Beispiel der Wirtszelle, die unter Verwendung von pLS
transformiert wird, ist der E. coli-Stamm XA35, der zu
Escherichia coli gehört, welcher sich von dem bekannten Stamm, dem E-coli K12-Stamm [Microbiological Reviews,
44, 1-50, (1980); (22)] ableitet und die im folgenden angegebene Eigenschaft aufweist, wobei sich die verbleibenden
Eigenschaften nicht von denen des K12-Stamms unterscheiden,
„r
„r
[Sm , Lac"(i5", z")]
Die Transformation mit dem Chimären-Plasmid, das darin
eingearbeitet das Desamidosecretin-Strukturgen erfindungsgemäß enthält, ist bei allen E. coli-Stämmen möglich.
Damit man jedoch das Desamidosecretin als Fusionsprotein mit ß-Galactosidase gewinnen kann, ist es bevor-
zugt, einen Stamm zu verwenden, der arm ist an dem Gen der ß-Galactosidase, um die Anwesenheit von normaler
ß-Galactoöidase, vermischt mit dem Protein, zu verhindern.
Allgemein gesagt, wird die Bildung des Proteins durch das Repressorgen (i-Gen) des Lactoseoperons kontrolliert.
Wenn man daher einen wilden Typ E. coli verwendet, ist die induzierte Produktion des Fusionsproteins
mit einem Inducer, z.B. IPTG (Isopropylthiogalactosid)
möglich. Wenn man einen Stamm mit einem Gen hoher Temperaturempfindlichkeit -verwendet, kann das
Fusionsprotein induziert werden, indem man die Temperatür erhöht. Wenn man einen Stamm verwendet, der an dem
i-Gen verarmt ist, kann das Fusionsprotein immer hergestellt werden [The operon, 31 (1980)( abgefaßt von
J.H.Miller und W.S.Resnikoff; veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory); (18)].
Bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des Desamidosecretins wird der E. coli-Stamm
XA35, der ein Stamm ist, der an den Genen der ß-Galactosidase und i-Gen verarmt ist, verwendet.
Die Transformation mit dem Plasmid, das darin eingearbeitet das Desamidosecretin-Strukturgen enthält, ist
nicht auf E. coli als Wirt beschränkt. Ein geeigneter Wirt kann ebenfalls aus einem großen Spektrum von Bakterienspecies
ausgewählt werden, wenn ein geeigneter Vektor ausgewählt wird, wie es auf dem Gebiet der Molekularbiologie
gut bekannt ist. Ein typisches Beispiel einer Wirtszelle wird in der JA-OS 92696/1979 beschrieben.
(2) Transformation
Der Transformationsvorgang selbst kann nach an sich bekannten Verfahren erfolgen, die auf dem Gebiet der
Molekularbiologie gut bekannt sind. Hinsichtlich der Einzelheiten der verwendeten Verfahren "wird auf im folgenden
aufgeführten Versuchsbeispiele verwiesen.
l (3) Transformans
Ein typisches Beispiel eines Transfοrmans ist ein Transfonnans,
das man durch Transformieren von K12C600 mit pMg erhält. Bei der vorliegenden Erfindung wird dieses
5 als K12C6OO (pMG1O3) bezeichnet. Das Transformans
K12C600 (pMG1O3) besitzt die im folgenden angegebenen,
genetischen Eigenschaften:
[m~, r", F"", lacY, Leu, Thr, tonA, supE, recBC]
Ein weiteres Beispiel von Transformantien ist ein Transformans, das man erhält, indem man den E* coli-Stamm
XA35, der bei dem bevorzugten Verfahren für die Herstellung
des erfindungsgemäßen Desamidosecretins verwendet
wird, wie oben beschrieben, mit pLS 58 transformiert.
Dies wird bei der vorliegenden Erfindung als E. coli
XA35 (pLS5.8) bezeichnet.
Das Transformans, der E. coli-Stamm XA35 (pLS58), unterscheidet
sich von dem E. coli-Stamm XA35 in den folgenden Eigenschaften, was aus den folgenden Versuchsbeispielen
hervorgeht.
[Apr, LaC+J.
(5) Herstellung von Desamidosecretin
Das Desamidosecretin kann durch Züchten der so transformierten Bakterien nach an sich bekannten Verfahren gebildet werden. Hinsichtlich der Einzelheiten wird auf
die folgenden Versuchsbeispiele verwiesen.
30 , Versuchsbeispiele
(1) Ein Gen mit der Basensequenz, bestehend aus einer
Kombination der Blöcke A, B und C, wie in der beigefügten
Zeichnung' angegeben, wurde entwickelt. Diese Blöcke
umfassen die im folgenden aufgeführten Fragmente.
1 Block Frafynente
A S-1 - S-4, S-6
B S-5, S-7 - S-10, S-12
C S-11, S-13 - S-16
(2) Das Aufbauverfahren wird im folgenden näher erläutert.
(1) Auswahl der Codone
Die Codone werden, wie in der Zeichnung dargestellt, ausgewählt.
10
10
(2) Das Codon ATG für Methionin wird zu dem N-Ende addiert, so daß das Polypeptid, das synthetisiert wurde,
an dieser Stelle durch chemische Behandlung (+CNBr) gespalten wird,
(3) Zu dem C-Ende addiert man zwei Translationsstopp-Codone (TAG oder TGA), so daß kein überflüssiges Peptid
gebildet wird, .
(4) Für den Zweck der Synchronisierung mit dem Raster, beginnend mit dem Startcodon des Lactamase-Gens,
werden zwei ausgewählte Basenpaare (im allgemeinen 2 + 3n; n=0, 1, 2, 3» ···) stromaufwärts an das Methionin
addiert.
(5) Pst I-Stellen werden an beiden Enden addiert.
Irgendeine gewünschte Zahl an Basenpaaren kann unmittelbar vor der Pst I-Stelle an der strornabwärtigen Seite
addiert werden, wenn dies für die Synthese jedes Fragments zweckdienlich ist.
(6) Schließlich werden zwei Paare von beliebig ausgewählten Basen an beiden Enden addiert, um die HydroIy-
sewirksamkeit des Restriktionsenzyms Pst I zu erhöhen.
Das wie oben beschrieben aufgebaute Gen enthält die Hinf I-Stelle und. die Hae II-Stelle in dem 27-Desamidosecretin-Strukturgen.
5 Chemische Synthese des Fragments (1) Synthese
Die Synthese der Fragmente wird entsprechend dem in der
Literatur beschriebenen Festphasen-Verfahren [supra; (6a)] durchgeführt. Die Isolierung und Reinigung der .
Q synthetischen Fragmente wurden nach dem im folgenden beschriebenen,
verbesserten Verfahren durchgeführt. Die Syntheseausbeuten der entsprechenden Fragmente sind in
der folgenden Tabelle aufgeführt.
Fragment | Basensequenz " | Kettenlänge | Ausbeute,^ |
S-I | ACCTGCAGCCATGCAC | 16 | 33 |
S-2 | " GCTGCAGGT | 9 | 52 |
S-3 | . . tcagatggtactt. ... | 13 | 56 |
S-4 | ~ - ■ ATCTGAGTGCATG - | '■". 13 | 42 ' |
S-5 | TCACCTCAGAACTAT | 15 | 43 |
S-6 | GAGGTGAAAGTACC | 14 | 47 |
S-7 | CTCGTCTACGTGATT | 15 | 38 |
S-8 | AGACGAGATAGTTCT | 15 | 27 |
S-9 | CAGCACGCCTCCAGC | 15 | 32' |
S-IO | CGTGCTGAATCACGT | 15 | 43 ' |
S-Il | GCTTGCTGCAAGGT | 14 | 22 |
S-12 | AGCAAGCGCTGGAGG | 15 | 44 |
S-13 | CTCGTTTGATAGG | 13 | .47 |
S-14 | AAACGAGACCTTGC | 14 | 42 |
S-15 | gleich wie S-2 | ||
S-16 | ACCTGCAGCCCTATC | 15 | 32 |
l (2) Reinigung
Zu 50 mg eines Harzes, welches die Synthese der festen Phase erleidet, werden 0,5 M a-Picolinsäure-aldoximtetramethylguanidin
und 100 bis 200yul eines Gemisches
aus Dioxan und Wasser (1:1) [Tetrahedron Letters, 1978, 2727, (1978); (14)] zugegeben, und das Gemisch wird
mehrere Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann werden 2 ml konz. wäßrigen Ammoniaks zu dem Gemisch
gegeben, welches seinerseits über Nacht bei dichtem Ver-
IQ schließen mit einem Stopfen bei 55°C stehengelassen
wird. Das enstehende Gemisch wird zur Abtrennung des Harzes
filtriert, und das Filtrat wird konzentriert und der Gelfiltration unterzogen. Die Eluierung erfolgt mit
50 mM TEAB-Puffer (pH 7,5), und die in das Leervolumen
eluierten Fraktionen werden gesammelt. Diese werden konzentriert und auf HPLC für eine Säule mit Umkehrphase
C-18 angewendet (Waters: "Radial Pack A", Durchmesser 8 cm χ 10 cm). Die Eluierung erfolgt mit 0,01 M Äthylendiamin-diacetat-Puffer
(pH 7,8) mit einem Konzentrationsgradienten des Acetonitrils von 10 bis 32% bei einer
Strömungsrate von 2 ml/min im Verlauf von 16 min. Die innerhalb von 11 bis 12 min eluierten Fraktionen werden
gesammelt. Während dieses Vorgangs werden Oligonucleotlde ohne Tritylgruppe als Inöektionspeak eluiert. Das
2$ Eluat wird konzentriert und nach Zugabe von 1 ml 80%iger
Essigsäure 15 min bei Zimmertemperatur stehengelassen. Tritanol wird durch Extraktion entfernt, und die wäßrige
Schicht wird konzentriert und erneut auf die Säule mit Umkehrphase gegeben. Bei den gleichen Bedingungen,
wie zuvor beschrieben, erfolgt die Eluierung mit einem Konzentrationsgradienten des Acetonitrils von 0 bis
20% und die innerhalb von 12 bis 13 min eluierten Fraktionen
werden gesammelt.
l Phosphorylierung
Jedes Fragment (30/Ug) wird in 30 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,5) gelöst und 60/uCi (19,8 pMol) [γ32Ρ]-ΑΤΡ und
2/Ul (9 Einheiten) T4 Polynucleotidkinase werden zu der
Lösung zugesetzt, so daß man insgesamt 50/ul erhält.
Dann wird 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 10 Äquiv., bezogen auf das Fragment von ATP und
T4 Polynucleotidkinase (9 Einheiten), zu dem Gemisch zugegeben und dann wird 20 min bei 37°C inkubiert. Die
!0 Reaktion wird beendigt, indem man 2 min bei 100° C erhitzt,und
das Produkt wird durch Gelfiltration gereinigt. Jedes Fragment wird durch 20%ige Gelelektrophorese
bestätigt.
15 Verknüpfung der Fragmente
Jeweils 0,05A2g0 von s~1» s~2» s"*3>
S-4 und S-6 werden in einem Puffer [20 mM TrIa-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2,
10 mM DTT (Dithiothreitol), 0,2 mM ATP (Adenosintriphosphat)]
gelöst, so daß man eine Lösung mit einer Gesamtmenge von 30/ul erhält. 1 /ul (150 Einheiten) von
T4-DNA-Ligase wird zu der Lösung gegeben und das Gemisch wird über Nacht bei 10°C stehengelassen. Die Reaktion
wird durch 8%ige Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt. Auf ähnliche "Weise-werden die Blöcke B und C
25 synthetisiert.
Die Reaktionsgemische der Blöcke A und B werden zusammen
vermischt und nach Zugabe von 3/ul von 0,2 mM ATP
und 1 /ul (150 Einheiten Te-DNA-Ligase wird das Gemisch über
Nacht bei 10°C stehengelassen. Nachdem die Reaktion durch 8%ige Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt
wurde, wird das Reaktionsgemisch aus Block C zugegeben
und die Reaktion kann auf ähnliche Weise über Nacht ablaufen. Das Fortschreiten der Reaktion wird
durch 5%ige Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt.
Das Reaktionsgemisch wird 15 min bei 6S0C erhitzt und
dann auf Zimmertemperatur abgekühlt. Dann v/erden 15 /Ul
O,5M NaCl und 80 Einheiten des Restriktionsenzyms Pst I
zugesetzt und die Mischung wird über Nacht bei 370C stehengelassen. Die Reaktion wird gestoppt, indem man
1 min bei 900C erhitzt, und das Reaktionsgemisch wird
durch 5%ige Polyacrylamidgelelektrophorese einer Abtrennung unterworfen. Die Bande mit der längsten Kettenlänge
wird herausgeschnitten und bei einer 1%igen Agaro-
IQ segelelektrophorese, wobei die Agarose einen niedrigen
Schmelzpunkt aufweist, für die Extraktion der erhaltenen Bande überführt.
Cloning
Das Plasmid pBR322 (4/Ug) wird .zu einem Gemisch (Gesamtmenge
= 50/ul) aus 100 mM Tris-HCl-Puffer, 5 mM
MgCl2 und 50 mM NaCl gegeben und die Reaktion wird unter
Verwendung von 6 Einheiten des Restriktionsenzyms Pst I
2 h bei 370C durchgeführt. Dann wird die Reaktion durch
15minütiges Erhitzen bei 68°C beendigt. Das obige Synthesegen wird zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die
Verknüpfungsreaktion wird auf ähnliche Weise unter Verwendung von Τ4 DNA-Ligase durchgeführt.
Unter Verwendung von 5/ul des entstehenden Reaktionsgemisches,
welches äquivalent zu 0,68/Ug pBr322 DNA ist, erfolgt die Transformation von E.CoIi Stamm K12C600 entsprechend
dem Verfahren von Kuschner [Genetic Engineering 1978, 17 (1978); (10)] in einer P-3 physikalischen
Containment facility [Guidelines for Recombinant DNA Experiment, herausgegeben im August 1979; (11)3·
Der transformierte Stamm wird auf einer L-Platte (1%
Bactotripton, 0,5% Bactohefeextrakt, O,5?6 HCl, 1,5%
Bactoagar), enthaltend 10/Ug/ml Tetracyclin (Tc), selektiert,
und 500 Stämme unter den erhaltenen, transformier-
ten Stämmen werden auf ihre Resistenz gegenüber Ampicillin
(Ap) geprüft und 45 Stämme von Tcr/Aps transformierten
Stämmen werden isoliert. Für Rückbeziehungszwecke
werden diese mit C6OO (pMG 101) - C600 (pMG 145) be-
5 zeichnet.
Unter den transformierten Stämmen von Tcr/Aps werden
8 Stämme [C600 (pMg 101) - C600 (pMG 108) ] "beliebig
ausgewählt, und das Plasmid DNA wird durch Gleichge-Wichtssedimentation
mittels Cäsiumchlörid-Dichtegradienten, enthaltend Äthidiumbromid, isoliert. Das so isolierte
Plasmid DNA wird als pMg 101 - pMG 108 bezeichnet.
Das Plasmid (5/Ug) wird in einem Gemisch (30/ul) von
10 mM Tris-HCl-Puffer, 66 mM MgCl2, 6 mM ß-Mercaptoäthanol
und 60 mM NaCl gelöst. 30 Einheiten des Restriktionsenzyms
Hae III werden zu der Lösung gegeben und anschließend wird 1 h bei 370C erhitzt. Die Fragmente
von 375 bp werden mittels Gelelektrophorese mit 1,5%iger
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt extrahiert. Die so extrahierten Fragmente werden auf ähnliche Weise unter
Verwendung von 18 Einheiten des Restriktionsenzyms Hae II hydrolysiert und das Produkt,zu 191 bp und 176 bp
hydrolysiert, bestimmt durch 5%ige Polyacrylamidgelelektrophorese,
wird als Plasmid mit der richtigen Richtung bewertet.
Identifizierung des Fusionsproteins mit Minizellen Minizellen erzeugende E. coli (F , thr , ara , leu ,
azis, tonAs, minA, minB, gal
>λ", sfrr, malA, xyl, mti,
thi, sup") wird mit pMG 103 und pBr322 gemäß dem Verfahren von Ruschner [supra; (1O)] transformiert, wobei
ein Transformans von Tcr/Aps gebildet wird.
·
Das Transformans wird in 20 ml von Davis Minimum-Kulturmedium,
enthaltend 0,5% Casaminosäure, Thymin
(20/Ug/ml), Thiamin (2/Ug/ml) und Tetracyclin (iO/ug/
ml), 16 h bei 370C vorgezüchtet und unter Inokulieren
mit 10 ml Vorkultur in 500 ml des gleichen Mediums (ohne Gehalt an Tetracyclin) erfolgt die Züchtung weiter
bis ODg2O = ^»^ ^iS 0,8. Die Kulturbrühe wird mittels
einer Hitachi Refrigerated Centrifuge (Modell RPR-9, bei 3000 U/min) während 12 min zentrifugiert, um die
10 Wirtszellen zu entfernen, und weiter 25 min bei
8500 U/min zur Bildung von Minizellenpellets zentrifugiert. Die Minizellenpellets werden durch Suspension
in 25 ml To-Puffer (1 M Tris-HCl, pH 7,3, MgSO4.7H2O
150 mg, 1 ml 1#ige Gelatine, 0,25 ml 1M CaCl2/1 1 H2O)
gewaschen. Die Suspension wird 15 min bei 10 000 U/min (in einem RPR-20 Rotor) zentrifugiert, und die entstehenden
Minizellenpräzipitate werden in 1 ml Tl-Puffer suspendiert. Die entstehende Suspension wird einer
10%-159ό-2Ο% stufenweisen Dichtegradienten-Zentrifuga-
20 tion (bei 4000 U/min in einem RPRS-4 Rotor während
25 min) zur Gewinnung der Minizellen unterworfen. Die
Minizellen-Suspension wird weiterhin in 20 ml Tl-Puffer suspendiert und ähnliche Verfahren werden wiederholt.
Die Minizellen werden in 1 ml Davis Minimum-Kulturmedium, enthaltend jeweils 50/Ug/ml als Endkonzentration
von 18 Aminosäuren (Alanin, Valin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Glycin, Serin, Threonin,
Cystin, Tyrosin, Asparagin, Aspartinsäure, Glutamin,
30 Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin), 20/Ug/ml
Thymin und 2/ug/ml Thiamin, suspendiert und 12 min unter
Schütteln bei 370C erhitzt. Nach Zugabe von 20/uCi
(35S)-Methionin [NEN (New England Nuclear) = 1260,1 Ci/
rnMol}-und 5 /uCi(%)-Leucin (NEN = 115,2 Ci/mMol) zu der
Suspension wird das Gemisch weiterhin 10 min erhitzt. Unmittelbar danach wird der gleiche Puffer, enthaltend
50 mM NaN7, 100/ug/ml Methionin und 100/Ug/ml Leucin,
zu dem Gemisch zugesetzt. Dann erfolgt eine Zentrifugation bei 3000 U/min während 20 min zur Gewinnung der
Minizellen, die ihrerseits in 20/Ul eines Proben-Puffers
[6 ml Wasser, 1 ml (1,25 Mol) Tris-HCl (pH 6,8), 0,4 g
SDS (Natriumdodecylsulfat), 2 ml Glycerin, 1 ml 2-Mercaptoäthanol,
4 mg BPB (Bromphenolblau)] suspendiert und 3 min bei 1000C erhitzt werden. Dann werden 18/ul
dieser Suspension einer Abtrennung mittels SDS-PoIyacrylamid-Elektrophorese
unterworfen.
In den Zellen von E. coli K12C600 (pBr 322) (FERM P-6017)
wurde ß-Lactamase synthetisiert und eine Bander
die einem Molekulargewicht von etwa 29 Kilodalton entspricht, tritt in dem Elektrophoresegel auf. Es wird
jedoch kein solches Protein von etwa 29 Kilodalton in den Extrakten der Zellen von E. coli K12C600 (pMG 103)
festgestellt. Stattdessen tritt ein Polypeptid von etwa 24 Kilodalton als neue Bande auf. Dies ist eindeutig
das Genprodukt, welches gebildet wurde und durch pMG 103 codiert wurde und welches im Zusammenhang mit
dem Verschwinden der ß-Lactamase-Bande steht. Das pMG 103 besitzt eine Struktur, bei der ein Teil des ß-Lactamasegens
von pBR 322 (Codierung von 182 Aminosäuren von dem Amino-Ende des Signalpeptids des Strukturproteins
von ß-Lactamase) stromabwärts davon für die Transkription mit dem 27-Desamidosecretingen (Codierung
von 27 Aminosäuren) verknüpft ist,und sein Genprodukt muß als Fusionsprotein des ß-Lactamasefragments (182.
Aminosäuren)-27-Desaraidosecretin (27 Aminosäuren) angesehen
werden. Das Molekulargewicht des Fusionsproteins wird zu 23,4 Kilodalton berechnet, und daher wird
die neu auftretende Bande in den E.coli K12C600 (pMG 103)-Extrakten diesem Fusionsprotein zugeordnet.
AO
des Proteins
Die E. coli K12C6OO (pMG 103) werden einer Schüttelzüchtung
in 3 1 Luriabrühe bei 370C unterworfen und zentrifugiert,
wenn die Konzentration der Mikroorganismen etwa 1 χ 10 Zellen/ml erreicht hat. Die enstehenden
Pellets werden mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,O)/1 mM
Phenylmethylsulfonylfluorid gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Pellets werden erneut in dem gleichen Puffer
suspendiert. Die Suspension wird mit EDTA bei einer Endkonzentration von 10 mM bei 00C während 5 min
behandelt und anschließend mit Eiweißlysozym bei einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml bei O0C während
30 min behandelt, um eine sphäroplastische Bildungs-Lyse
zu erreichen. Das entstehende Lysat wird mittels einer Kubota Ultraschallwellen-Erzeugungsvorrichtung
"Insonator 200 M" bei einer maximalen Output (200 W)
während 10 min zur vollständigen Zerstörung der Bakterienzellen unterworfen. Auf diese Stufe folgt eine
Zentrifugenabtrennung (unter Verwendung einer Hitachi
2Q Refrigerated Centrifugal Machine, Modell 20 PR52, mit
RPR-20-2 Rotor, bei 18 000 U/min während 30 min bei O0C) zur Entfernung der Zellendebris. Zu dem erhaltenen,
überstehenden Material (110 ml) gibt man Magnesiumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und dann
wird das Gemisch zentrifugiert (mittels des obigen Rotors bei 8000 U/min während 10 min bei O0C). Zu der
überstehenden Lösung gibt man 400/Ug DNase I und 5 mg
RNase I, um die Behandlung während 1 h bei 4°C durchzuführen· Dann werden die Proteine und Peptide mit
80%igem gesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzt. Die durch Zentrifugieren (mittels des RPR 20-2 Rotors, bei
8000 U/min während 10 min bei O0C) erhaltenen Präzipitate
werden in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gelöst mit dem gleichen Puffer entsalzt und zentrifugiert (unter den ·
obigen Bedingungen). Dann wird Aceton bis zu einer Endkonzentration von 7596 zu der überstehenden Lösung züge-
setzt und die gebildeten Niederschlage werden über Nacht mit 1,0 ε Bromcyanin in 20 ml 80%iger Ameisensäure behandelt. Nach dem Verdampfen wird der Rückstand mit
40 ml Isopropanol extrahiert und anschließend mit einem gleichen Volumen Methanol. Anschließend erfolgt
eine erneute Verdampfung und der Rückstand wird in 0,1N
Essigsäure gelöst. Nach Entfernung der unlöslichen Stoffe durch Zentrifugieren (3000 bis 4000 G während
5 min) erfolgt eine Gelfiltration mittels einer Sephadex G-25-Säule (hergestellt von Pharmacia Co.), und die
Fraktionen mit Molekulargewichten von 1000 bis 10 000 werden gesammelt und lyophilisiert.
Bioassav
Die so erhaltene, lyophilisierte Probe wird nach dem
Bioassay-Verfahren [The Japanese Journal of Pharmacology» 21, 325 (1971); (12)] analysiert, gemäß dem die
erhaltene, lyophilisierte Probe in 2 ml als Gesamtvolumen einer isotonischen Natriumchloridlösung gelöst wird.
Jeweils aliquote Teile von 0,25 ml werden intravenös in die Leistengegend von 5 Ratten injiziert. Die Mengen
an Pankreassaft> die aus einem künstlichen Pankreasschlauch
sekretiert . werden, werden in Intervallen von 10 min gemessen, und die Erhöhung in der Menge wird als
25 biologische Aktivität von Secretin bestimmt. Als
Standard-Secretin wird Secrepan (Eisai, Japan) in Mengen
von 0,25 E/kg und 0,50 E/kg den gleichen Ratten zuvor intravenös indiziert, und die Mengen an sekretiertem
Pankreassaft werden gemessen, um das Übereinstimmen mit der Eisai-Einheit festzustellen (im wesentlichen
gleich der Crick Harper Raper-Einheit). Als Folge stellt man fest, daß die aus E. CoIi K12C600 (pMG 103) erhaltenen
Proben eine Erhöhung an sekretiertem Pankreassaft von 202% + 76 (Durchschnitt*+ Standardabweichung) 10 min
nach der Injektion und von 180% +87,6 20 min nach der Injektion ergeben. Andererseits ergibt Secrepan eine
Erhöhung von 162% ± 28 bzw. 206% + 58 nach 10 bzw.
min im Falle von 0,25 E/kg-Injektionen und von 159,85a +
83,7 bzw, 250,8% + 216,5 10 min und 20 min nach der Injektion von 0,5 E/kg. Diese Werte (als Ergebnis des
t-Testes) zeigen, daß diese Werte einen signifikanten Unterschied von p<0,05 ergeben. Andererseits beobachtet
man, wenn man die Probe, die man erhält, indem man von den Extrakten der Bakterienzellen ausgeht, die aus dem
Clon erhalten werden, der lediglich pBR 322 enthält
und frei vom Desamidosecretingen ist, nach dem glei-■chen
Verfahren prüft, keine Erhöhung in der Menge an sekretiertem Pankreassaft. Dies zeigt, daß eine Substanz
mit secretinartiger, biologischer Aktivität in den Zellen von E. coli K12C600 (pMG 103) gebildet wird, während
die Bildung einer solchen Substanz in den Zellen von E. coli K12C600 (pBR322) nicht beobachtet wird. Wenn man
die erhöhten Mengen an sekretiertem Pankreassaft aus Proben, die aus E. coli K12C600 (pMG 103) erhalten werden,
auf eine gerade Linie aufträgt, die man erhält, indem man ein semilogarithmisches Zeichenpapier mit
den erhöhten Mengen an sekretiertem Pankreassaft als Ordinate verwendet, und die Secrepan-Einheiten als Abzsisse
(logarithmische Skala) aufträgt, so kann die Secretin-Einheit durch Extrapolationsverfahren bestimmt
werden (vorausgesetzt, daß eine lineare Beziehung erhalten wurde) und beträgt 0,17 bis 0,24 Eisai-Einheiten
(= 0,17 bis 0,24 Crick Harper Raper-Einheiten)/0,25 ml/
kg Ratte. Wenn man die Berechnung unter Beachtung des Körpergewichts der Ratten durchführt, wird dieser Wert
auf 0,051 bis 0,072 E/0,25 ml/Ratte kalibriert, wobei die Gesamtaktivität 0,408 bis 0,576 E für die Gesamtmenge
von 2 ml beträgt. Da bekannt ist, daß Secretin, wenn es die höchste Reinheit besitzt [Chemische Berichte,
105, 2508 (1972),(13a); Chemische Berichte, 105,
35 2515 (1972), (13b)], eine spezifische Aktivität von
16 000 CHR-Einheiten/mg besitzt, entsprechen die Werte
von 0,408 bis 0,576 E 25,5 bis 36 ng der Secretinmenge.
Dies entspricht 7,15 bis 10,1 pMol Secretinmolekülen,
was anzeigt, daß ein Desamidosecretin mit einer Aktivitat,entsprechend
4,3 bis 6,1 χ 10 Secretininolekülen, biosynthetisiert wurde. Da das Desamidosecretin unter
Verwendung von etwa 3 x 10. Zellen E. coil K12C600
CpMG 103) als Ausgangsmaterial hergestellt wurde, wur- . den mindestens 1,4 bis 2,0 Moleküle, äquivalent zu
Secretin/eine Bakterienzelle, isoliert.
Radioimmunoassay .
Die Probe wird mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/0,1# Rinderserumalbumin
verdünnt. Der Radioimmunoassay der verdünnten Probe wird unter Verwendung von "Secretin kit
Daiichi", hergestellt von Daiichi Radioisotope Research Institute, Japan, entsprechend dem angegebenen Verfahren
durchgeführt, um seine Aktivität zu bestimmen.
Die Stufen für die Verknüpfungsreaktion zwischen den
Fragmenten werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Herstellung von Xplac5-DNA und pBR322-PNA
Xplac5-DNA wird aus dem lysogenen Bakterium E. coli
PK 1512 (IFO 14149) erhalten und die Verfahren zur Herstellung erfolgten gemäß dem Verfahren von Oshima
[supra; (20)].
pBR3?2 wird aus E. coli K12C600 (pBR322) (FERM-P 6017)
erhalten und die Verfahren zur Herstellung erfolgten gemäß dem Verfahren von Kahn et al [Methods in
Enzymology, 68, 265 (1979); (21)].
1 Herstellung von pRE1
Xplac5-DNA (10/Ug) wird zu einem Gemisch (Gesamtmenge=
20/ul) aus 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 7 mM MgCl2
und 50 mM NaCl gegeben, und die Reaktion erfolgt unter
5 Verwendung von 10 Einheiten des Restriktionsenzyms
EcoRI und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms Hind III
während 2 h bei 370C Anschließend werden mittels Gelelektrophorese mit 1%iger Agarose 3,8 Megadalton von
DNA-Fragmenten gereinigt.
pBR322-DNA (1 /Ug) wird zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 10/ul), ähnlich dem obigen Gemisch, gegeben, und die
Reaktion erfolgt unter Verwendung von 1 Einheit des Restriktionsenzyms EcoRI und 1 Einheit des Restriktionsenzyms
Hind III während 2 h bei 370C. Anschließend werden
2,6 Megadalton DNA-Fragmente mittels 1%iger Agarosegelelektrophorese
gereinigt.
Die resultierenden Fragmente werden zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 10 /ul) aus 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8),
10 mM MgCl2, 20 mM DTT und 1 mM ATP gegeben, und die
Reaktion erfolgt unter Verwendung von 30 Einheiten T4DNA-Ligase während 24 h bei 14°C.
Unter Verwendung des Reaktionsgemisches wird die Transformation des E. coli Stamms XA35 gemäß dem Verfahren
von Kuschner [supra; (10)] in einer p-1 physikalischen
Containment facility [supra; (11)] durchgeführt.
Der transformierte Stamm wird auf einerL-PIatte (1%
Bactotrypton, 0,5% Bactohefeextrakt, 0,5% NaCl, 1,5%
Bactoagar), enthaltend Ap (20/Ug/ml), ausgewählt; die erhaltenen, transformierten Stämme werden auf einer
Platte aus EMB-lac (2,25% Bacto-EMB-Brühe, 1 ,5% Bao-toagar)
reproduziert. Die zu Lac (rote Kolonie) umgewandelten Stämme werden ausgesucht. Unter diesen Stämmen
werden 5 Stämme randomartig ausgewählt, um ein Plasmid herzustellen, das mit verschiedenen Arten von Restriktionsenzymen
analysiert wird. Dabei wird festgestellt, ·
daß die vier Stämme aus 3»8 Megadalton-Fragmenten von Aplac5DNA, verknüpft mit EcoRI-Hindi11-Fragment von
pBR322 DNA, bestehen. Von diesen Stämmen wird ein Stamm
als E. CoIi XA35 (pRE 1) bezeichnet. Das heißt, das Transformans E. coli XA35 (pRE 1) unterscheidet sich
von dem zuvor erwähnten E. coli-Stamm XA35 in den folgenden Eigenschaften.
[Apr, LaC+].
Linker .
Die Synthese eines Fragments mit der Basensequenz
CTGAATTCAGCTCTGCAGAG wird durchgeführt. Die Synthese und die Reinigung erfolgen gemäß den oben besqhriebenen
Verfahren zur Synthese und Reinigung der entsprechenden Strukturgene (Ausbeute ss 40%). In der vorliegenden
Erfindung wird diese einstrangige DNA als "Prä-
20 linker" bezeichnet.
Der Prälinker (15/ug) wird zusammen mit 20 Einheiten
T4-Polynücleotidkinase 40 min bei 370C in einem Gemisch
(Gesamtmenge « 30 /ul) aus 50 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,5), 10 mM MgCl2, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA, 10 mM DTT und 0,2 mM ATP inkubiert. Die Reaktion wird
durch 2minütiges Erhitzen bei 600C beendigt. Nach 1 stündigem
Stehenlassen des Gemisches bei Zimmertemperatur werden 300 Einheiten (1 /ul) T4-DNA-Ligase zugesetzt und
die Reaktion wird über Nacht bei 14°C durchgeführt.
Durch Erhitzen während 2 min bei 600C wird die Reaktion
beendigt. Das Gemisch wird 1 h bei Zimmertemperatur ' stehengelassen und/20 Einheiten Restriktionsenzym Pst I
werden zugesetzt, um die* Reaktion während 5 h durchzuführen. Durch Erhitzen während 2 min bei 60°C wird'die
Reaktion beendigt. Man erhält so 15/ug Pst I-Eco RI-Pst
I-Linker.
I
Herstellung des EcoRI-EcoRI-Struktur/^ens
Der zuvor hergestellte Pst I-EcoRI-Pstl-Linker (4 mg)
und. das obengenannte Pstl-P_stl-Struktur gen von Beispiel
(0,6 /Ug) werden zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 35/Ug) aus 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 7 mM MgCl2 und
50 mM NaCl gegeben, und die Reaktion wird unter Verwendung von 300 Einheiten T4-DNA-Ligase 24 h bei 140C durchgeführt.
Dann wird die Reaktion durch Erhitzen bei 68°C während 10 min beendet, gefolgt von einem allmählichen
Abkühlen des Reaktionsgemisches.
Zu dem erhaltenen Reaktionsgemisch gibt man das Restriktionsenzym EcoRI (100 Einheiten) und führt die Umsetzung
5 h bei 370C durch. Anschließend wird das DNA-Fragment mit 120 Basenpaaren mittels 5%iger Polyacrylamidgelelektrophorese
gereinigt.
0,25/Ug pRE1 werden zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 4/ul)
aus 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 7 mM MgCl2 und 50 mM NaCl gegeben und die Reaktion erfolgt unter Verwendung
von 1 Einheit Restriktionsenzym EcoRI während 1 h bei 37°C.
Das so hergestellte Plasmid pRE1 (gespalten mit EcoRI)
(0,25 /Ug) und 0,02 /Ug EcoRI-EcoRI-Strukturgen werden zu
einem Gemisch (Gesamtmenge = 10 /ul) aus 50 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM DTT und 1 mM ATP gegeben,
und die Reaktion wird unter Verwendung von 30 Einheiten T4-DNA-Ligase während 24 h bei 14°C durchgeführt.
Unter Verwendung des erhaltenen Reaktionsgemisches er-• folgt die Transformation des E.coli-Stamms XA35 gemäß
dem Verfahren von Kuschner [supra; (10)] in einer P-3 physikalischen Containment facility [supra;■(11)].
Der transformierte Stamm wird auf einer L-PIatte ausgewählt,
die Ap (20/ug/ml) enthält, wie zuvor beschrieben. Die entstehenden, transformierten Stämme werden auf· der
EMB-lac-Platte (wie oben beschrieben) für die weitere
Selektion des Lac+-Stamms kopiert. Unter diesen Stämmen
werden 200 Stämme zur Herstellung des' Plasmids DNA ausgewählt, dessen Strukturen durch das Restriktionsenzym
Pstl oder Haell analysiert wurden, und es wurde bestätigt,
daß 11 Stämme das obige Strukturgen enthalten,
Der folgende Versuch wird für jedes Plasmid der 11 Stämme
mit dem Strukturgen durchgeführt.
Das Plasmid (20/ug) wird zu einem Gemisch (Gesamtmenge =
20/Ul) aus 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 66 mM MgCl2
und 60 mM NaCl gegeben und dann gibt man zusätzlich
20 Einheiten Restriktionsenzym Haell zu der Lösung.
Anschließend erfolgt eine Inkubation während 2 h bei 37°C. Aus dem entstehenden Gemisch werden mittels 19^iger
Agarosegelelektrophorese Fragmente von etwa 1 Megadalton und Fragmente von etwa 0,7 Megadalton extrahiert. Die
entsprechenden Fragmente werden mit dem Restriktionsenzym EcoRI gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ge-
spalten und einer 15?6igen Polyacrylamidgelelektrophorese
unterworfen. Das Plasmid, bei dem nach der Elektrophorese die DNA-Fragmente mit 40 Basenpaaren aus dem
Fragment von etwa 1 Megadalton und das DNA-Fragment mit 80 Basenpaaren aus dem Fragment von etwa 0,7 Megadalton
erhalten wurden, wird als das Plasmid angesehen, in das das Strukturgen in der richtigen Richtung eingesetzt
bzw. eingebaut wurde.
Aus diesen Versuchen ergibt sich, daß 5 Stämme des
Plasmids unter den 11 Stämmen des Plasmids mit dem
Strukturgen die richtige Richtung aufweisen. Einer die-
ser Stämme wurde beliebig ausgewählt und als E.coli
XA35 (pLS58) bezeichnet.
Identifizierung und Reinigung des Fusionsproteins
E.coli XA35 (pLS58) wird der Schüttelkultivierung in 1 1 Luria-Brühe mit einem Gehalt von 20/ug/ml Ampicil-
ο
lin bei 37 C unterworfen, bis die Zahl der Bakterien-
lin bei 37 C unterworfen, bis die Zahl der Bakterien-
zellen 5 x 10 Zellen/ml erreicht hat. Dann werden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gesammelt und in
einem Gemisch (Gesamtmenge = 100 ml) aus 10 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,5)/10 mM MgCl2 suspendiert, und die Suspension wird mittels Kubota Ultraschallwellen-Erzeugungsvorrichtung
"Insonator 200 M" während 30 min zur Zerstörung der Bakterienzellen behandelt.
Die so erhaltene Lösung (2/ul) wird der 7,5%igen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
unterworfen, wobei eine Proteinbande mit einer Größe von 120 000 Dalton festgestellt
wird. Keine solche Bande wird in dem Extrakt festgestellt, den man auf ähnliche Weise aus den Bakterien
ohne Plasmidgehalt (E.coli-Stamm XA35) erhält. Daraus kann geschlossen werden, daß dieses Protein sich
von dem Plasmid pLS58 ableitet.
Es wurde weiterhin bestätigt, daß das Protein eine Größe aufweist, die im wesentlichen gleich ist wie die von
ß-Galactosidase [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 1507,
(1977); (19)] aus E. coli, was nicht im Gegensatz zu der Größe (117 873 Dalton) des Fusionsproteins von Desamidosecretin
und ß-Galactosidase steht.
Daraus kann man schließen, daß dieses Protein mit etwa 120 000 Dalton das Fusionsprotein ist, und die'Reinigung
des Proteins wurde durchgeführt.
Der durch Ultraschallzerstörung erhaltene Extrakt wird
einer Zentrifugierung unterworfen und die Präzipitate werden gewonnen. Das Fusionsprotein wird im wesentlichen in den Präzipitaten isoliert. Die Präzipitate wer-
den in einem Gemisch (Gesamtmenge = 100 ml) aus 10 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) und 1 mM MgCl2 suspendiert und
einer Zentrifugierung unterworfen, gefolgt von der Gewinnung der Präzipitate. Dieser Vorgang wird zweimal
zur Entfernung von wasserlöslichen Materialien wiederholt.
Der entstehende Niederschlag wird in einem Gemisch (Gesamtmenge =100 ml) aus 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH
7,5), 1 mM MgCl2, 10 mM NaCl und 7 M Harnstoff gelöst
und auf eine Säule (5 cm0 χ 3 cm) aus DEAE-Cellulose,
die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war, gegeben.
Nach dem Waschen mit 20 ml des gleichen Puffers wird
die Säule weiterhin mit 100 ml eines ähnlichen Puffers
gewaschen, dessen NaCl-Konzentration zu 50 mM geändert war. Dann wird das Fusionsprotein mit 150 ml eines
ähnlichen Puffers, dessen NaCl-Konzentration zu 150 mM geändert war, eluiert.
Zu dem resultierenden Eluat gibt man ß-Mercaptoäthanol
bis zu einer Endkonzentration von 1% und dialysiert das Gemisch dreimal gegenüber 5 1, Wasser. Das Dialysat
wird zentrifugiert, uin das Fusionsprotein als Niederschlag zu gewinnen. Das entstehende Fusionsprotein ergibt
eine im wesentlichen einfache Bande bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
in einer Menge von etwa 28 mg/1 1 Kulturbrühe, berechnet aus der Absorption bei 280 nm. Dieser Wert entspricht etwa 280 000 Molekülen/Zelle
.
l Das gereinigte Fusionsprotein wird in 2 ml 70%iger
Ameisensäure gelöst und mit 100 mg Brorncyan während 18 h behandelt. Nach dem Verdampfen wird der Rückstand mit
5 ml Isopropanol und dann mit 5 ml Methanol extrahiert.
5 Auf die Extraktion erfolgt eine Lyophilisierung.
Bioassay
Die so erhaltene, lyophilisierte Probe wird gemäß einem
Bioassayverfahren [The Japanese Journal of Pharma-
cology, 21, 325 (1971); (12)] analysiert, bei dem die lyophilisierte Probe in 25 ml (Gesamtvolumen) isotonischer
Natriumchloridlösung gelöst wird. Aliquote Teile von jeweils 50/ul werden intravenös in die Leistengegend
von 5 Ratten injiziert. Die Mengen an Pankreassaft, die ausgeschieden werden und aus einem künstlichen Pankreasschlauch
fließen, werden in Intervallen von 5 min gemessen. Das Inkrement wird als biologische Aktivität
des Secretins bestimmt. Als Standard-Secretin wird
Secrepan (Eisai, Japan) in Mengen von 1 Einheit, 2 Einheiten und 4 Einheiten/Ratte zuvor intravenös den gleichen Ratten injiziert, und die Mengen an sekretiertem
Pankreassaft werden gemessen, um die Übereinstimmung mit der Eisai.-Einheit (im wesentlichen gleich zu der
Crick Harper Raper-Einheit) festzustellen.
Als Ergebnis stellt man fest, daß die aus E.coli XA35 (pLS58) erhaltenen Proben eine Erhöhung an sekretiertem
Pankreassaft ergeben. Andererseits beobachtet man keine Erhöhung in der Menge an sekretiertem Pankreassaft, wenn
die Probe entsprechend dem gleichen Verfahren geprüft wird, die man erhält, wenn man die Extrakte der Bakterienzellen
als Ausgangstaaterial verwendet, die man aus einem Clon erhält, das lediglich pRE1 aufweist und frei
von Desamidosecretingen ist. Dies zeigt an, daß eine Substanz mit secretinartiger biologischer Aktivität in
den Zellen von E. coli XA35 (pLS58) gebildet wird, wan-
rend keine derartige Bildung einer solchen Substanz in
den Zellen von E. coil XA35 (pRE1) auftritt.
Trägt man die erhöhten Mengen an sekretiertem Pankreassaft
aus den mittels E. coli XA35 (pLS58) erhaltenen
Proben auf eine gerade Linie auf, die man erhält, indem man ein semilogarithmisches Zeichenpapier verwendet,
wobei die erhöhten Mengen an sekretiertem Pankreassaft als Ordinate verwendet werden und die Secrepan-Einhei-
10 ten als Abszisse (logarithmische Skala), so kann
die Secretin-Einheit nach einem Interpolationsverfahren
bestimmt werden und beträgt 3 El s ai-Einhei ten/50/ul/ Ratte, welches etwa 1500 Eisai-Einheiten als 25 ml
isotonische Natriumchloridlösung, die die lyophilisierte
Probe enthält, entspricht. Da bekannt ist, daß das Secretin, welches auf die höchste Reinheit gereinigt
wurde, [Chemische Berichte, 105, 2508 (1972), (13a); Chemische Berichte, 105, 2515 (1972), (13b)], eine spezifische
Aktivität von 16 000 CHR-Einheiten/mg aufweist,
1500 Einheiten entsprechen etwa 26 nMol Secretinmolekülen,
zeigt dies an, daß ein Desamidosecretin mit
Ί A
einer Aktivität entsprechend 1,6 χ 10 Secretinmolekülen
biosynthetisiert wurde. Da das Desamidasecretin
11 unter Verwendung von etwa 5 χ 10 Zellen E. coli XA35
(pLS58) als Ausgangsmaterial hergestellt wurde, werden mindestens 3 x 10 Moleküle, äquivalent dem Secre-tin/
1 Bakterienzelle, isoliert.
Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, daß das synthetische 27-Desamidosecretingen durch den Einfluß
von E. coli Lactoseoperon-Aktivator in den Zellen von E. coli XA35 (pLS58) ausgedrückt wird und das daraus
entstehende Produkt, nämlich 27-Desamidosecretin, zeigt
eine Aktivität, die ähnlich ist wie die von Secretin. 35
1 Radioimmunoassav
Die Probe wird mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,O)/θ,Λ% Rinderserumalbumin
verdünnt. Der Radioimmunoassay der verdünnten
Probe wird unter Verwendung von "Secretinkit Daiichi", hergestellt von Daiichi Radioisotope Research
Institute, Japan, nach dem zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt, um ihre Aktivität zu bestimmen.
(4) Aufbauzeichnung des Gens .
10 In dem folgenden Diagramm ist die Basensequenz des
Gens, welches das 27-Desamidosecretin-Strukturgen enthält, getrennt in den Blöcken A, B und C dargestellt,
wobei a ein mögliches Basenpaar, b die Pstl-Stelle, c
ein mögliches Basenpaar, d ein Startcodon, e die Hinfl-
15 Stelle und f die Haell-Stelle bedeuten.
Aufbauzeichnung des Gens Block A__
S - 3
A C
T G |
CTGCAG
GACGTC |
C C^
G G |
■AT G TAC |
I Γ
VC A C-T C A-G A T-G G T-A C T-T
rG T G-A G T-C T A-C C A-TG A-A Λ G-T G G-A G
b
■S - 2-
c
J L
S - V-
J L
Block
• S ~ ~
s "
ι . - Ii -
T C-A C. C-T C A-G A A-C T A-T C T-C G T-C T A-C G T-I
T-C T T-G A T-A G A-GC A-G A T-G C A-j
JG~Ä~T-T C
C T A-A G A-G C A-C G C-C T C-C
T-C G T-G C G-G A G-G
Λ G-C
T C-G C
11
ο -S -/<?■
JL
S -/2
AC-GA ■·»·'
Block
Arg Lou Leu Gin GIy Lou VaI END END
ι — s -// —ι, s -/3-—:——
-S
I Ii Ii
G C-T T G-C T G-C A A-G GT-C T C-G T T-T G A-T A G-G G C-G T T-C C A-G A G-C A A-A C T-AT C-C C
CTGCAG
Ig a c G τ c
G T
C A
S - /V-
JL
S -
CO
ro ο
CaJ
co co
ι (5) Hinterlegung der Mikroorganismen
E. coli K12C6OO; E. coli XA35 und sein Transformans E.
coli XA35 (pRE1) mit dem Plasmid pRE1 wurden
gemäß dem Budapester Vertrag für die internationale
Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke der Patentverfahren ara Fermentation Research Institute,
Agency of Industrial Science and Technology (FERM), 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken,
Japan, unter FERM BP-115 am 9. Juni 1981; FERM BP-116
am 7. Januar 1982; und FERM BP-117 am 7. Januar 1982
hinterlegt. Das Plasmid pBR322 wurde bei FERM in Form eines Transformans von E. coli K12C6OO mit pBR322, nämlich
E. coli K12C6OO (pBR322), unter FERM P-6017 am 9. Juni 1981 hinterlegt.
E. coli K12C600 (pMG 103), welches das Transformans mit
dem Chimären-Plasmid pMG ist, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301, Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, USA, unter ATCC 39042 am
20 26. Januar 1982 hinterlegt.
E. coli PK 1512, welches das λ plac5 lysogene Bakterium ist, wurde bei dem Institute for Fermentation, Juso-Hommachi,
2-17-85, Yodogawa-Ku, Osaka-Shi, Japan, unter IFO Nr. 14149 am 1. Februar 1982 hinterlegt.
E. coli XA35 (pLS58), welches das Transformans mit dem Chimären-Plasmid ist, wurde gemäß dem Budapester Vertrag
bei ATCC unter ATCC 39Q40 am 11. Januar 1982 hinterlegt.
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the United States of America, 74, 1507, (1977);
35 (20) Extra Volumes of "Protein, nucleic acid & enzyme",
Last vol., S. 19, (1973);
1 (21) Methods in Enzymology, 6:J, 2CD, (1979);
(22) Microbiological Reviews» 44, 1-50, (1980);
(23) Nature, 224, 768, (1969);
(24) Nature, 217, 1110, (1968).
Ende der Beschreibung.
Claims (39)
1. 27-Desamidosecretin, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid aufweist, das durch die Aminosäure-Sequenzformel
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-OH
dargestellt wird, worin VaI-OH anzeigt, daß das C-Ende
des Polypeptide, welches ein Valin enthält, eine Carbonsäure ist.
2. Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin,
dadurch gekennzeichnet, daß man
(1) chemisch ein Strukturgen für das Desamidosecretin synthetisiert, welches einem Polypeptid entspricht,
bei dem die Aminosäure am C-Ende des Secretins Valin ist;
(2) das Gen in ein Vektorplasmid einsetzt, das in der Lage ist, in einer vorbestimmten Wirtszelle zu
wachsen und ein Chimären-Plasmid zu ergeben, welches
10 in der Zelle wachsen kann;
(3) die Wirtszelle mit dem Chimären-Plasmid transformiert; und
(4) das entstehende Transformans züchtet und das gebildete Desamidosecretin gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle ein E. coli ist, welches zum Genus
Escherichia gehört.
4. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß man als E. coli E. coli K12C6OO, FERM BP-115, verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Vektorplasmid pBR322 ist.
6. Verfahren nach Anspruchs, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chimären-Plasmid pMG ist, welches darin eingebaut das Strukturgen in der Pst I-Erkennungsstelle von
30 pBR322 enthält.
7. Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin, dadurch gekennzeichnet, daß man
(1) chemisch ein Strukturgen für das Desamido- ° secretin. synthetisiert, das einem Polypeptid entspricht,
bei dem die Aminosäure am C-Ende des Secretins Valin ist;
(2) ein Vektorplasmld, welches das Lactoseoperon
ausnutzen kann und welches ebenfalls in einer vorbestimmten Wirtszelle wachsen kann, herstellt;
(3) das Strukturgen in das Vektorplasmid ein-
setzt, um ein Chimären-Plasmid zur Verfügung zu stellen,
das in der Zelle wachsen kann;
(4) die Wirtszelle mit dem Chimären-Plasmid transformiert; und
(5) das entstehende Transformans züchtet und das gebildete Desamidosecretin gewinnt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtszelle E. coli verwendet, welches zum
Genus Escherichia gehört,
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man als E. coli E. coli XA35, FERM BP-116, verwendet,
welches ein Stamm ist, der arm an dem Gen von ß-Galaetosidase und ebenfalls arm an dem i-Gen ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das Lactoseoperon von E. coli stammt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Vektorplasmid einen Teil oder das gesamte
Lactoseoperon von E. coli Chromosom DNA enthält und in E. coli wachsen kann.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß das Vektorplasmid aus einer Tiransduktionsphage
gestellt wird, die das gesamte oder einen Teil des Lactoseoperons und ein Plasmid von E. coli enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeich- .
net, daß man die Transduktionsphage aus der Gruppe pldl,
F'-Iac, $feOdplac, Mi80dlac und\plac auswählt.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasinid von E. coli aus der Gruppe
pBR322, pSC 101 und Advl auswählt.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phage Xplac5 verwendet,
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Plasmid pBR 322 verwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Vektorplasmid pRE verwendet, welches das 3»8 Md des Fragments von Aplac5, verbunden
mit dem größeren Fragment der Fragmente, aufweist, die man durch Digestion von pBR322 mit EcoRI und Hind III
erhält.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Chimären-Plasmid pLS ist, welches ein Produkt
ist, das man erhält, wenn man das Strukturgen in pRE an seiner Ec£RI-Erkennungsstelle einsetzt.
19. Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß
es mit einem Plasmid transformiert ist, wobei das Pladmid darin eingearbeitet ein chemisch synthetisiertes Strukturgen
von Desamidosecretin aufweist, das dem Polypeptid entspricht, bei dem die Aminosäure am C-Ende Valin ist
und das fähig ist, Lactoseoperon auszunutzen und das ebenfalls in einer vorbestimmten Wirtszelle wachsen kann.
30
20. E. coli nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,
daß es E. coli XA35 (pLS58), ATCC 39040, ist.
21. Doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid, dadurch *5 gekennzeichnet, daß es ein Strukturgen enthält, welches
27-Desamidosecretin ausdrückt.
λ
22. Doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen
die Grundsequenz:
5 His Ser Asp GIy Thr Phe Thr
CAC - TCA - GAT - GGT - ACT - TTC - ACC GTG
- AGT - CTA - CCA - TGA - AAG - TGG -
VO Ser GIu "Leu " Ser " Arg "Leu " Arg ' \
TCA - GAA - CTA - TCT - CGT - CTA - CGT AGT - CTT - GAT - AGA - GCA - GAT - GCA -
ic Asp Ser AIa Arg Leu GIn Arg
GAT - TCA - GCA - CGC - CTC -CAG -CGG CTA - AGT - CGT - GCG - GAG - GTC - GCG -
Leu Leu Gin GIy Leu VaI
20
TTG - CTG - CAA - GGT - CTC - GTT AAC - GAC - GTT - CCA - GAG - CAA.
besitzt. 25
23. Doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid nach.
Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen ein Codon enthält, das an seinem 5'-Ende
Methionin bestimmt, und ein oder mehrere Codone aufweist,
um den Translationsstopp am 3'-Ende zu bestimmen.
•
24. Doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das 5'-Ende
3$ des Methionin-Codons und das 3'.-Ende des Translationsstopp-Codons
ein 3m Basenpaar, (3m +1) Basenpaar oder (3m + 2) Basenpaar (worin m für 0 oder eine ganze Zahl
1 von mindestens 1 steht) von beliebig ausgewählten Basen
umfaßt.
25. Doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid nach
5 Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Erkennungsbasensequenz
von irgendeinem gewünschten Restriktionsenzym an beiden Enden aufweist und außerhalb der
entstehenden Enden mindestens zwei Basenpaare aufweist, um glatte Enden, die beliebig ausgewählt sind, zu bilden.
10
26. Doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid nach Anspruch
21, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Struktur aufweist:
Met
ACCTGCAGCC - ATG -
TGGACGTCGG - TAC-
His "Ser Asp 'GIy "Thr Phe Thr
20
CAC - TCA - GAT - GGT - ACT - TTC - ACC -
GTG - AGT - CTA - -CCA - TGA - AAG - TGG -
Ser GIu Leu Ser Arg Leu Arg
TCA - GAA - CTA - TCT - CGT - CTA - CGT -
AGT - CTT - GAT - AGA - GCA - GAT - GCA -
Asp Ser AIa Arg Leu GIn Arg
GAT - TCA - GCA - CGC - CTC - CAG - CGC -
CTA - AGT - CGT - GCG - GAG - GTC - GCG -
Leu . Leu Gin GIy Leu VaI
^5 , TTG - CTG - CAA - GGT - CTC - GTT AAC
- GAC - GTT - CCA - GAG - CAA -
END END
TGA - TAG - GGCTGCAGGT
ACT - ATC - CCGACGTCCA.
27. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Strukturgen aufweist, welches 27-Desamidosecretin ausdrückt.
28. Plasmid nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet,
daß das Plasmid von pBR322 stammt.
29. Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin,
dadurch gekennzeichnet, daß man
(1) ein Chimären-Plasmid zur Verfügung stellt, welches ein Fragment eines Strukturgens für ein Desamidosecretin
umfaßt, welches einem Polypeptid entspricht, in dem die Aminosäure am C-Ende des Secretins Valin
ist, und wobei das Chimärsn-Plasmid in einer vorbestimmten
Wirtszelle wachsen kann und das Strukturgen für ein Desamidosecretin in der Wirtszelle ausdrücken kann;
(2) die Wirtszelle mit dem Chimären-Plasmid transformiert; und
(3) das entstehende Transformans züchtet und das gebildete Desamidosecretin gewinnt.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chimären-Plasmid Lactoseoperon ausnutzen
30 kann. ·
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chimären-Plasmid gebildet wird, indem man das Strukturgen in ein Vektorplasmid einsetzt, welches
35 ■
Lactoseoperon ausnutzen kann und ebenfalls fähig ist,
in der Wirtszelle zu wachsen.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,
daß das Vektorplasrnid das gesamte oder einen Teil des Lactoseoperons aus E. coli Chromosom DNA enthält
und in E. coli wachsen kann.
5
5
33· Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Vektorplasmid aus einer Transduktionsphage
hergestellt wird, die das gesamte oder einen Teil des Lactoseoperons enthält und ein Plasmid von E. coli ist.
10
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Transduktionsphage ausgewählt wird aus der
Gruppe pldl, F'-Iac, ^80dplac,λ h80dplac und λ plac.
35. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet,
daß das Plasmid von E. coli aus der Gruppe pBR322, pSC1O1 undAdvl ausgewählt wird.
36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Phage Aplac5 verwendet.
37· Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Plasmid pBR322 verwendet.
38. Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet,
daß das Vektorplasmid pRE ist, welches das 3,8 Md des Fragments von Aplac5, verbunden mit dem
größeren Fragment der Fragmente, enthält, die man durch
.Digestion von pBR322 mit EcoRI und HindiII erhält.
30
39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Chimären-Plasmid pLS ist, welches ein Produkt
ist, das man erhält, wenn man das Strukturgen in
pRe an seiner EcoRI-Erkennungsstelle einsetzt. .
35
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JP8460381A JPS57200343A (en) | 1981-06-02 | 1981-06-02 | 27-desamidosecretin and its preparation |
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Cited By (1)
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DE3500961A1 (de) * | 1985-01-14 | 1986-07-17 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Escherichia-coli-staemme, dna-teilsequenzen dieser staemme und herstellungsverfahren |
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GB2103220A (en) | 1983-02-16 |
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