DD153393A5 - Verfahren zur reinigung von nucleotidsequenzen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung linearer DNS spezifischer Nucleotidsequenz, die eine Restriktionsstelle enthaelt. Ausgangsmaterial ist eine erhaltene Population von DNS-Molekuelen mit im wesentlichen homogener Laenge, die a) vorbehandelt wird zur Entfernung aller 5'-Phosphat-Endgruppen,b) worauf die DNS mit einer Restriktions-Endonnuclease inkubiert wird, die zur Einwirkung auf die Nucleotidsequenz unter Bildung von zwei linearen Unterfragmenten befaehigt ist, c) anschliessend die Unterfragmente aufgrundihrer Laenge fraktioniert werden, d) die beiden Unterfragmente isoliert werden, e) die Unterfragmente in einer durch DNS-Ligase katalysierten Reaktion covalent erneut verknuepft werden, wobei die urspruengliche Sequenz wiederhergestellt wird und f) die wiederverknuepften DNS-Molekuele aufgrund ihrer Laenge fraktioniert werden.
Description
22 43 7 4 -
Berlin, den 1. 10. 1980 57 942 11
Verfahren zur Reinigung von Nucleotidsequenzen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Nucleotidsequenzen insbesondere zur Reinigung einer spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz zur Neukombination mit einem DNS-Transfer-Ve!<tor und Transformation in einen Mikroorganismus. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismus, der eine erfindungsgemäß gereinigte Nucleotidsequenz enthält.
Proteine und Peptide werden in nahezu unendlicher Vielfalt von lebenden Organismen synthetisiert. Einige dieser Stoffe erwiesen sich als brauchbar für medizinische, landwirtschaftliche oder technische Zwecke. Einige Proteine sind Enzyme, die als spezifische Katalysatoren in komplizierten chemischen Reaktionen wirksam werden. Andere funktionieren als Hormone, die Wachstum oder Entwicklung eines Organismus steuern oder die Funktion in spezifischen Geweben in medizinisch bedeutungsvoller V/eise beeinflussen. Spezielle Binderproteine können zu wirtschaftlicher Bedeutung gelangen bei der Isolierung und Reinigung von Spurensubstanzen und der Entfernung von verunreinigenden Substanzen. Sowohl Proteine wie Peptide bestehen aus linearen Aminosäureketten, wobei es sich bei den letzteren um kurze, einkettige Sequenzen und den ersteren um langkettige und mehrkettige Substanzen handelt. Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl Proteine als auch Peptide.
Die Erfindung wird angewandt auf den Gebieten der Mikro-
1. 10. 1980 57 942 11
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biologie, der Endokrinologie, der Pharmakologie, der Medizin, der Veterinärmedizin und der Tierzucht. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Krankheitszustände bei Mensch und Tier behandelt und kann das Wachstum von Tieren beeinflußt werden.
Charakteristik der_ bekannten technischen Lösungen
Proteine und Peptide sind im allgemeinen hochmolekulare Substanzen mit einer spezifischen Aminosäuresequenz. Abgesehen von den kleineren Peptiden ist die chemische Synthese von Peptiden und Proteinen häufig umständlich, teuer und zeitraubend, falls nicht sogar unmöglich. In den meisten Fällen muß daher bei beabsichtigter praktischer Verwendung eines Proteins dieses zunächst aus dem Organismus isoliert werden, von dem es produziert wird. Häufig ist das Protein dort nur in geringsten Mengen vorhanden. Ferner steht dieser Organismus häufig nicht in den Mengen zur Verfugung, die die gewünschten Proteinmengen ergeben. So liegen zahlreiche potentielle Verwendungszwecke für spezielle Proteine in Landwirtschaft, Industrie und Medizin vor, sie bleiben jedoch unentwickelt, da die entsprechende Versorgung mit dem gewünschten Protein oder Peptid nicht gegeben ist.
Kürzlich entwickelte Verfahren haben es möglich gemacht, zu raschem und reichlichem Wachstum befähigte Mikroorganismen zur Synthese technisch brauchbarer Proteine und Peptide zu verwenden, wobei die Herkunft der letzteren keine Rolle spielt. Diese Verfahren ermöglichen es, einen geeigneten Mikroorganismus genetisch mit der Fähigkeit
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zur Synthese eines Proteins oder Peptids auszustatten, das normalerweise von einem anderen Organismus produziert wird. Diese Verfahren basieren auf der fundamentalen Beziehung, die in allen lebenden Organismen zwischen dem genetischen Material, gewöhnlich der DNS, und denvom Organismus synthetisierten Proteinen besteht. Diese Beziehung ist derart, daß die Aminosäuresequenz des Proteins durch die Nucleotidsequenz der DNS vorgegeben ist. Ein oder mehrere Trinucleotidsequenzen stehen in spezieller Beziehung zu jeweils einer der 20 Aminosäuren, die in den Proteinen am häufigsten vorkommen. Die Beziehung zwischen den Trinucleotid-Sequenzen und den ihnen entsprechenden Aminosäuren bezeichnet man als den genetischen Code. Der genetische Code wird für alle lebenden Organis* men als gleich oder ähnlich erachtet. Demzufolge spiegelt sich die Aminosäuresequenz jedes Proteins oder Peptids in einer entsprechenden Nucleotidsequenz wider. Außerdem kann diese Nucleotidsequenz im Prinzip von jedem lebenden Organismus übersetzt werden. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle:
Tabelle 1 Genetischer Code
Phenylalanin (Phe) TTK Histidin (His) CAK
Glutamin (Gin) CAD Asparagin (Asn) AAK Lysin (Lys) AA3 Asparaginsäure (Asp) GAK Glytaminsäure (GIu) GAG Cystein (Cys) TGK
| Leucin (Leu) | XTY |
| Isoleucin (lie) | ATM |
| Methionin (Met) | ATG |
| Valin (VaI) | GTL |
| Serin (3er) | QRS |
| Prolin (Pro) | CCL |
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Threonin (Thr) ACL Tryptophan (Try) TGG
Alanin (Ala) GCL Arginin (Arg) V/GZ
Tyrosin (Tyr) TAK Glycin; (Gly) GGL
Terminationssignal TAD
Terminationssignal TGA
Schlüssel:
Dedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DN3 dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden:
A = Adenin,
G β Guanin,
C = Cytosin,
T - Thymin,
O=A oder G,
K=T oder C,
L = A1 T, C oder G1 M = A, C oder T
X=T oder C, falls Y=A oder G1 X=C, falls Y=C oder T, Y = A, G, C oder T, falls X=C, Y=A oder G, falls X = T, W = C oder A, falls Z=A oder G, VV = C, falls Z=C oder T, Z = A, G, C oder T, falls W = C, Z=A oder G, falls W = A, QR = TC1 falls 3 = A, G, C oder T, QR = AG, falls S=T oder C1 S = A, G, C oder T, falls QR = TC, S=T oder C, falls QR = AG
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Die Trinucleotide der Tabelle 1, die als Codons bezeichnet werden, stellen DNS-Trinucleotide dar, da sie im genetischen Material eines lebenden Organismus vorliegen. Die Expression
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dieser Codons bei der Proteinsynthese erfordert die dazwischenliegende Bildung einer messenger-RNS (mRNS), die nachstehend noch näher beschrieben wird. Die mRMS-Codons besitzen die gleichen Sequenzen wie die DNS-Codons gemäß Tabelle 1, mit der Ausnahme, daß Thymin durch Uracil ersetzt ist. Bekanntlich sind komplementäre Trinucleotid-DNS-Sequenzen mit entgegengesetzter Polarität den Codons gemäß Tabelle 1 funktionell gleichwertig. Ein wichtiges und bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist der Überschuß an Zeichen, wodurch für die meisten zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren mehr als ein codierendes Nucleotid-Triplett verwendet werden kann.Daher können mehrere verschiedene Nucleotidsequenzen eine vorgegebene Aminosäuresequenz codieren. Derartige Nucleotidsequenzen werden als funktionell gleichwertig betrachtet, da sie zur Produktion der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen dienen können, wenn auch manche Sequenzen von bestimmten Stämmen wirkungsvoller übersetzt werden als von anderen. Gelegentlich findetsich eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in einer vorgegebenen Nucleotidsequenz. Durch diese Methylierungen wird die Codierung in keiner Weise beeinträchtigt.
Ein Verfahren zur Ausstattung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Synthese eines neuen Proteins umfaßt drei allgemeine Stufen:
(1) die Isolierung und Reinigung der spezifischen Gon- oder Nucleotidsequenz, die die genetisch codierte Information für die Aminosäuresequenz des gewünschten
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Threonin (Thr) ACL Tryptoplfan (Try) TGG
Alanin (Ala) GCL Arginin (Arg) WGZ
Tyrosin (Tyr) TAK Glycin. (GIy) GGL
Terminationssignal TAD
Terminationssignal TGA
Schlüssel:
Dedes Triplett aus drei Buchstabon stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden:
A = Adenin,
G = Guanin,
C = Cytosin,
T = Thymin,
O=A oder G,
K=T oder C,
L = A1 T, C oder G, M = A, C oder T
X=T oder C, falls Y=A oder G1 X=C, falls Y=C oder T, Y= A1 G, C oder T, falls X=C, Y=A oder G, falls X=T, VV = C oder A, falls Z = A oder G1 W = C, falls Z=C oder T, Z = A1 G, C oder T, falls W = C, Z=A oder G, falls W = A1 QR = TC, falls S = A, G, C odor T, QR = AG, falls S=T oder C, S = A, G, C oder T, falls QR = TC, S=T oder C, falls QR = AG
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Die Trinucleotide der Tabelle 1, die als Codons bezeichnet werden, stellen DNS-Trinucleotide dar, da sie im genetischen Material eines lebenden Organismus vorliegen. Die Expression dieser Codons bei der Proteinsynthese erfordert die dazwischenliegende Bildung einer messenger-RNS (mRNS), die nachstehend noch näher beschrieben wird. Die mRNS-Codons besitzen die gleichen Sequenzen wie die DNS-Codons gemäß Tabelle I1 mit der Ausnahme, daß Thymin durch Uracil ersetzt ist. Bekanntlich sind komplementäre Trinucleotid-DNS~Sequenzen mit entgegengesetzter Polarität den Codons gemäß Tabelle 1 funktionell gleichwertig. Ein wichtiges und bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist der Überschuß an Zeichen, wodurch für die meisten zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren mehr als ein codierendes Nucleotid-Triplett verwendet werden kann.Daher können mehrere verschiedene Nucleotidsequenzen eine vorgegebene Aminosäuresequenz codieren. Derartige hiucleotidsequenzen werden als funktionell gleichwertig betrachtet, da sie zur Produktion der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen dienen können, wenn auch manche Sequenzen von bestimmten Stämmen wirkungsvoller übersetzt werden als von anderen. Gelegentlich findetsich eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidine in einer vorgegebenen Nucleotidsequenz. Durch diese Methylierungen wird die Codierung in keiner l/eise beeinträchtigt.
Ein Verfahren zur Ausstattung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Synthese eines neuen Proteins umfaßt drei allgemeine Stufen:
(1) die Isolierung und Reinigung der spezifischen Genoder Nucleotidsequenz, die die genetisch codierte Information für die Aminosäuresequenz des gewünschten
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Proteins enthält.
(2) die Neukombination der isolierten Nucleotidsequenz mit einem geeigneten Transfer-Vektor, typischerweise der DNS eines Bakteriophagen oder Plasmids, und
(3) die Einführung das Vektors in den geeigneten Mikroorganismus und Auswahl eines Stammes des aufnehmenden Mikroorganismus, der die gewünschte genetische Information enthält.
Die grundlegende Schwierigkeit bei Versuchen zur technischen Auswertung des oben skizzierten Verfahrens liegt in der ersten Stufe der Isolierung und Reinigung der spezifischen genetischen Information. Die DNS liegt in allen lebenden Fällen in Form äußerst hochmolekularer Nucleotidetten vor. Eine Zelle kann mehr als 10 000 Strukturgene enthalten, die die Aminosäuresequenzen von mehr als 10 000 Proteinen codieren, wobei jedes Gen eine Sequenz aus mehreren Hunderten von Nucleotiden enthält. In der Regel bilden vier verschie·= dene Nucleotidbasen alle vorkommenden Sequenzen. Es handelt sich um das Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die langen Sequenzen, die die Strukturgene spezifischer Proteine enthalten, sind sich daher in chemischem Aufbau und physikalischen Eigenschaften äußerst ähnlich. Die Absonderung einer derartigen Sequenz aus der Überfülle anderer Sequenzen, die in isolierter DNS vorliegen, kann daher gewöhnlich nicht durch konventionelle physikalische und chemische präparative Methoden erzielt werden.
Die messenger-RNS beteiligt sich am Vorgang der Obersetzung der Information der Nucleotidsequenz der DNS in die Aminosäuresequenz eines Proteins. In der ersten Stufe dieses
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Vorgangs, der als Transcription bezeichnet wird, wird ein Segment der DMS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose anstelle der Deoxyribose und Uracil anstelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. A und U (T) sowie" G und C sind komplementär. Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstandene RNS istdaher zu dieser kopierten Sequenz komplementär. Diese RNS wird als messenger· RNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zellen. Im allgemeinen liegen zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle nur solche mRNS-Sequenzen vor, die zu diesem Zeitpunkt zu produzierenden Proteinen entsprechen. Eine differenzierte Zelle, deren Funktion hauptsächlich die Synthese eines einzigen Proteins ist, enthält daher hauptsächlich die diesem Protein entsprechende RNS. In solchen Fällen können möglicherweise die Isolierung und Reinigung der entsprechenden, ein bestimmtes Protein codierenden Nucleotidsequenz erfolgen durch Isolierung von mRNS, die die spezielle Synthese dieses Proteins codiert.
Der Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß es nur in relativ seltenen Fällen anwendbar ist, in denen man Zellen findet, die hauptsächlich ein einziges Protein synthetisieren. Die Hauptmenge der Proteine von technischer Bedeutung wird nicht auf diese spezielle 'A'eise erzeugt. Das gewünschte Protein kann zum Beispiel eines von hundert anderen Proteinen sein, die zum gegebenen Zeitpunkt von den Zellen einesGe'.vebos oder Organismus erzeugt werden. Trotzdem ist die Technik der Isolierung
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der mRNS potentiell anwendbar, da die in der Zelle vorhandene RNS gewöhnlich nur einen Teil der gesamten Sequenzen der DNS darstellen, so daß eine erste Reinigung erzielt wurde. Um aus dieser Reinigung Vorteile zu ziehen, benötigt man jedoch eine Methode, mit der in geringer Häufigkeit, zum Beispiel in wenigen Prozenten, vorliegende Sequenzen in hoher Reinheit isoliert werden können.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen, wirtschaftlichen und technisch anwendbaren Verfahrens, mit dem Nucleotidsequenzen, auch bei Vorliegen in geringer Konzentration, aus Gemischen isoliert und in hoher Reinheit erhalten werden können.
Darlegung des .Vesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch geeignete Verfahrensschritte und Reaktionsbedingungen, ausgehend von einer erhaltenen Nucleotidsequenz, die eine Restriktionsstelle enthält, ein gereinigtes Produkt zu erhalten.
Erfindungsgemäß werden in einem Verfahren zur Reinigung linearer DMS spezifischer Nucleotidsequenz, die eine Restriktionsstelle enthält,
(a) die DNS vorbehandelt zwecks Entfernung aller 5'-Phosphat-Endgruppen,
(b) die DNS mit einer Restriktions-Endonuclease inkubiert, die zur Einwirkung auf die Nucleotidsequenz unter
Bildung von zwei linearen Unterfragmenten befähigt ist,
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(c) die Unterfragmente aufgrund ihrer Länge fraktioniert,
(d) die beiden Unterfragmente isoliert,
(e) die Unterfragmente in einer durch DNS-Ligase katalysierten Reaktion covalent erneut verknüpft unter Wiederherstellung der ursprünglichen Sequenz und
(f) die wiederverknüpften DNS-Moleküle aufgrund ihrer Länge fraktioniert«
Dabei werden zur Entfernung der 5'-Phosphatgruppen alkalische Phosphate verwendet. Die Fraktionierung erfolgt aufgrund der Länge durch Gelelektrophorese·
Es wird ein Mikroorganismusstamm, der ein nach (a) bis
(f) erhaltenes Fragment einer spezifischen Deoxyribonucleotidsequenz enthält, erhalten.
Es wird auch ein Mikroorganismus, der Codons» für menschliches Chlorion»Somatomammotropin mitder Nucleotidsequenz enthält, offenbart:
5'-G GCL24ATM25GAK25ACL27TAK27CAD29GAD30TTK31GAO32GAa33 ACL34TAK35ATM36CCL37AAD38GAK39CAD40AAD41TAK42Qr43TTK44 X45CAK46GAI<47QR48S48CA:i49ACL50QR5lS5lTTK52TGK53TTK54QR55S55 GAK56QR57S57ATM58CCL59ACL60CCL61QR62S62MK63ATGGAD65GAd66
W77GZ77ATM78QR79S79X80TY80X81TY81X82TY82ATM83GAD84Qr85S85 TGGX87TY87GAD88CCL89GTL90W91GZ91TTK92X93TY93W94GZ94Qr95S95
0-R106S106GAK107QR108S108GA!<109GA!<110TA1<lllCA1<112X113TY113 X114TY114AAD115GA!<il6X117TY117GAD118GAD119GGL120A™121
TTK146GAK147ACL148AAi<149QRl50S150CAKl51AA-I<l52CAKl53GAKl54
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I 4 3 7 4 - ίο -
GC455Xl56TYl56Xi571T157AA3l58AAI<159TAi<l60GGL161X162TY162
^172GT473M174ACL175TTKi76X177TY177W178GZ178ATGGTL180
TAGGTGCCCGAGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCC - 3*
A = Deoxyadenyl,
G = Deoxyguanyl, ""
C = Deoxycytosyl,
T s Thymidyl,
O=A oder G,
K=T oder C,
L = A, TC oder G,
M - A, C oder T,
X = T oder C, falls Yn = A oder G, und C, falls Yp « C oder
T
Y = A, G, C oder T, falls X = C, und A oder G1 falls X =
cT, W=C oder A, falls Zn = G oder A, und C, falls Zn = C oder
T, Z β A, G, C oder T, falls W = C, und A oder G, falls W =
QRn =TC, falls Sn = A, G, C oder T, und AG, falls Sn = T oder C,
Sn = A, G, C oder T, falls QRn = TC, und T oder C, falls QRn = AG,
worin die tiefgestellten Ziffern η die Aminosäurestellung im menschlichen Chlorion-Somatomammotropin, dem die Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bezeichnen, wobei die Aminosäurestellung vom Aminoende
beziffert wird. - 11 «-
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Der Mikroorganismus kann aus einem Bakterium bestehen, beispielsweise aus Escherichia coli X - 1776 und das Plasmid pBR - 322 enthalten.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren, durch das Nucleotidsequenzen isoliert und gereinigt werden können, die mit einer Häufigkeit von nur 2 % in einer heterogenen Population von mRNS-Sequenzen vorliegen können. Das Verfahren kann ferner mit bekannten Methoden zur Fraktionierung von mRNS kombiniert werden, um Sequenzen zu isolieren und zu reinigen, die in der gesamten RNS-Population in noch niedrigerer Häufigkeit als nach anfänglicher Isolierung vorliegen. Das Verfahren ist allgemein anwendbar auf mRNS aus praktisch jedem Organismus und stellt daher die wirksamen Maßnahmen bereit zur Produktion von geeigneten Mengen solcher Proteine, die von technischem Interesse oder Interesse für die Forschung sind.
Menschliches Wachstumshormon findet medizinische Anwendung bei der Behandlung von Hypophysen-Mangelfunktion. Tierische Wachstumshormone werden in der Tiermedizin und Landwirtschaft angewendet, insbesondere bei Tieren, die als Nahrungsquelle dienen, und deren rasches Wachstum und Größe daher erwünscht sind. Menschliches Chorion-Somatomammotropin ist von medizinischer Bedeutung wegen seiner Rolle bei der Entwicklung des Fötus.
Das erfindungsgemäße Verfahren zieht Vorteile aus bestimmten Strukturmerkmalen von mRNS und DNS und verwendet bestimmte •Enzym-katalysierte Reaktionen. Die vorhandenen Kenntnisse über diese Reaktionen und strukturellen Einzelheiten werden nachstehend beschrieben. Dabei werden folgende Symbole und
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4 3 7 4 . 12 .
Abkürzungen verwendet:
DNS - Deoxyribonucleinsäure RNS - Ribonucleinsäure cDNS » komplementäre DNS (enzymatisch synthetisiert an einer
mRNS-Sequenz) mRNS .- messenger-RNS dATP - Deoxyadenosintriphosphat dGTP - Deoxyguanosintriphosphat ÖCTP - Deoxycytidintriphosphat HCS - menschl, Chorion-Somatomammotrcpin TCA - Trichloressigsäure HGH - menschl. Wachstumshormon A - Adenin T - Thymin G - Guanin C - Cytosin U - Uracil
Tris - 2»Amino-2«hydroxyetgyl-l,3-propandiol EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure ATP - Adenosintriphosphat TTP - Thymidintriphosphat
Als Folge der bekannten Basenpaarungsregel, die die Replikation und Transcription von DNS steuert, ist die Isolierung der mRN3, die die Nucleotidsequenz enthält, welche die Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins codiert, der Isolierung der gleichen Sequenz aus der DNS selbst gleichwertig« Wird die mRNS transcribiert unter Bildung der komplementären DNS (cDNS), so ist damit die genaue DNS-Sequenz wieder hergestellt, und diese kann
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durch geeignete Techniken in das genetische Material eines anderen Organismus eingeführt ',werden. Die beiden komplementären Formen einer bestimmten Sequenz sind daher ineinander umwandelbar und funktionell gleichgestellt.
Die Nucleotid-Untereinheiten von DNS und RNS sind über Phosphordiester-Bindungen zwischen der 5'-Stellung eines Nucleotidzuckers und der 3'-Stellung des nächsten Nachbarn verbunden. Die ständige Wiederholung derartiger Bindungen führt zu einen linearen Polynucleotide das insofern Polarität besitzt, als ein Ende vom anderen unterschieden werden kann. Das 3f-Ende kann eine freie 3'-Hydroxylgruppe aufweisen, oder die Hydroxylgruppe kann durch eine Phosphatgruppe oder eine komplizierte Gruppe ersetzt sein. Das gleiche gilt für das 5'-Ende. In eucaryotischen|Organismenf das heißt in Organismen mit definiertem Kern und Vermehrung unter Mitose, umfaßt die Synthese von funktionaler rnRNS gewöhnlich die Addition von Polyadenylsäure an das 3*-Ende der mRNS. Die mRNS kann daher von anderen RNS-Arten, die aus einem eucaryotischen Organismus stammen, durch Säulenchromatographie an Cellulose, an die Polythymidylsäure gebunden ist, getrennt werden, vergleiche Aviv, H., und Leder, P„, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 69,, 1408 (1972). Auch andere chromatographische Verfahren sind geeignet, die die Basenpaarungsneigung von PoIy-A für chromatographische Packungen ausnutzen, die Oligo-dT, PoIy-U oder Kombinationen aus PoIy-T und PoIy-U enthalten. Zum Beispiel kann man PoIy-U verwenden.
Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-M3trize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Primers, der ein beliebiges komplementäres Oligo-
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oder Polynucleotid mit einer 3*-Hydroxylgruppe sein kann, und der 4 Deoxynucleotid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und dTTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nichtcovalente Bindung des Oligo-deoxynucleotid nahe dem 3'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Deoxynucleotide entsprechend der Basenpaarungsregel an das 3*»Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden. Es enthält die Ausgangs-RNS durch Wasserstoffbindung gepaart mit einem komplementären DNS-Strang, von dem ein Teil an einem Ende auf sich selbst zurückgefaltet ist. Die DNS- und RNS-Stränge sind nicht covalent miteinander gebunden. Die Reverse Transcriptase kann auch eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der man aus einem DNS-Einzelstrang als Produkt einen haarnadelförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch di© ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H. und Leder, P., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 69,, 1408 (1972) und Efstratiadis, A,, Kafatos, F. C, Maxam, A. M., und Maniatis, T., Cell. 7, 279 (1976).
Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodis-esterbindungen in DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Stranges gespalten wird. Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in eine lineare Form überführt. Das Hauptmerkmal eines Restriktionsenzyms besteht darin, daß seine hydrolytische Wirkung nur an einer Stelle eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz wird als Restriktionsstelle der Restriktions-Endonuclease bezeichnet. Restriktions-Endonuclease wurden aus verschiedenen Quellen isoliert, und ihre Nucleotidsequenz und die Restriktionsstellen wurden ermittelt· Bei doppelsträngigen DNS hydrp-
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lysieren einige Restriktions-Endonucleasen die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so daß stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespalteten Moleküls entstehen» Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysierte DNS erneut zu binden. Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muß, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so daß es möglich wird, heterogene DNS-Sequenzen, die mit Restriktions-Endonuclease behandelt wurden, mit anderen analog behandelten Sequenzen zu verknüpfen; vergleiche Roberts, R. 3., Crit. Rev. Biochem. 4 , 123 (1976).
Es würde festgestellt, daß Restriktionsstellen für ein bestimmtes Enzym relativ selten und nicht gleichmäßig verteilt sind« Ob eine Restriktionsstelle in einem bestimmten Segment vorliegt, muß empirisch ermittelt werden. Es gibt jedoch bereits eine große und wachsende Anzahl Restriktions-Endonucleasen aus verschiedenen Quellen mit verschiedener Spezifität, so daß es hinreichend wahrscheinlich ist, daß ein gegebenes Segment von etwa 1000 Nucleotiden ein oder mehrere Restriktionsstellen aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahreh zur Reinigung von cDNS gewünschter Nucleotidsequenz; die zu einer mRNS komplementär ist. Das Verfahren verwendet die Spaltung von durch Transcription aus einem komplexen Gemisch von mRNS entstandener cDNS mit Restriktions-Endonuclease« Das Verfahren erfordert keine ausgiebige Reini-
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gung von RNS, sondern macht statt dessen Gebrauch von der Transcription von RNS in cDNS, der Sequenz-spezifischen Fragmentierung dieser cDNS mit ein oder zwei Restriktions-Endonucleasen und der Fraktionierung der cDNS-Restrikttionsfragmente aufgrund ihrer Länge. Die Verwendung von Restriktions-Endonucleasen eliminiert Größenunterschiede und führt zu DNS-Fragmenten homogener Länge aus Fragmenten jeder be·= liebigen cDNS, die mindestens zwei Restriktionsstellen enthält· Aus der anfänglich heterogenen Population von cDNS-Transcripten entstehen gleichmäßig große Fragmente gewünschter Sequenz. Die Fragmente können eine Länge von einigen hundert Nucleotiden besitzen und gelegentlich das gesamte Strukturgen des gewünschten Proteins enthalten· Die Länge der Fragmente hängt von der Anzahl der Nucleotide ab, die zwischen den Restriktionsstellen liegen, und ist gewöhnlich verschieden bei verschiedenen Regionen der DNSβ Die Längenfraktionierung ermöglicht die Reinigung einer homogenen Population von Fragmenten gewünschter Sequenz· Die Fragmente sind von homogener Größe und hinsichtlich der Nucleotidsequenz hochrein· Diegängigen Trenn- und Analyseverfahren ermöglichen die Isolierung dieser Fragmente der betreffenden mRNS, die mindestens 2 % der Gesamt-RNS ausmacht. Die Verwendung der bekannten RNS-Fraktionierverfahren zur Vorreinigung der mRNS vor der Transcription senkt die tatsächliche untere Ermittlungsgrenze auf weniger als 2 % der gesamten aus dem Organismus isolierten mRNS.
Nach obigem Verfahren gereinigte, spezielle Sequenzen können in einer zweiten spezifischen Spaltungsreäktion mit einer Restriktions-Endonuclease weiter greinigt wer-
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den, die die Sequenz an einer Stelle im Innern spaltet. Diese Spaltung führt zu zwei Unterfragmenten gewünschter Sequenz, die aufgrund ihrer Länge voneinander getrennt werden können. Die Unterfragmcnte werden von ungespaltenen und spezifisch gespaltenen verunreinigenden Sequenzen mit im wesentlichen Ausgangsgröße abgetrennt. Diese Methode basiert auf der- Seltenheit und zufälligen Anordnung der Erkennungsstellen der Restriktions-Endonucleasen, aufgrund derer es extrem unwahrscheinlich ist, daß ein verunreinigender Anteil mit gleicher Länge vom gleichen Enzym abgespalten wird unter Bildung von Fragmenten, die die gleiche Länge wie die gewünschte Sequenz aufweisen. Nach der Absonderung von den Verunreinigungen können die Unterfragmente der gewünschten Sequenz nach bekannten Methoden zusammengefügt werden, um die Ausgangssequenz wieder herzustellen. Die beiden Unterfragmente müssen jedoch an einer Verknüpfung in umgekehrter Reihenfolge ihrer Ausgangssequenz verhindert werden. Es wird ein Verfahren offenbart, wonach sich die Unterfragmente nur in der gewünschten Reihenfolge verknüpfen können.
Abwandlungen der skizzierten Methoden können in Kombination mit geeigneten Markierungstechniken angewandt werden, um genaue quantitative Messungen der Reinheit der isolierten Sequenzen zu ermöglichen. Diese kombinierten Techniken wurden angewandt zur Herstellung einer bekannten Nucleotidsequenz mit mehr als 99 % Reinheit.
Die nach vorstehend beschriebenen Methoden isolierte und gereinigte cDNS kann mit einem geeigneten Transfer-Vektor rekombiniert und in bekannter Weise in einen geeigneten Mikroorganismus als Wirt transferiert werden. Es wurden
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neue Plasmide erzeugt, die die Nucleotidsequenzen enthalten, welche den Hauptteil des menschlichen Chorion-Somatomammotropins bzw. des menschlichen Wachstumshormons codieren. Ferner warSen neue Mikroorganismen erzeugt, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung den Hauptteil von HCS bzw. HGH enthalten. Die offenbarten Verfahren können angewandt werden zur Isolierung und Reinigung von Wachstums· hormonen aus anderen Tieren und zur Herstellung neuer Transfer-Vektoren und Mikroorganismen, die diese Gene enthalten. ""
Oas erfindungsgemäße Verfahren verwendet als Ausgangsmaterial polyadenylierte, rohe oder partiell gereinigte itiRNS, die in Sequenz und Molekülgröße heterogen sein kann. Die Selektivität des RNS-Isolierverfahrens wird durch jede Methode gesteigert, die zu einer Anreicherung der gewünschten mRNS in der heterodispersen Population äer isolierten mRNS führt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jede beliebige Vorreinigung dieser Art kombiniert werden, vorausgesetzt, daß die betreffende Methode keine endonucleotysche Spaltung der mRNS bewirkt. Eine wichtige Ausgangsüberlegung ist die Wahl des geeigneten Gewebes für die gewünschte mRNS. Diese Wahl wird häufig von der Tatsache bestimmt, daß das letztlich zu produzierende Protein nur von einem bestimmten spezialisierten Gewebe eines differenzierten Organismus erzeugt wird. Dies ist beispielsweise der Fall bei den Peptidhormonen, wie dem Wachstumshormon oder dem HCS, In anderen Fällen können verschiedene Zellarten oder Mikrobenarten als Quelle für die gewünschte mRNS dienen. In diesen Fällen sind einige Vorversuche zur Ermittlung des optimalen Ausgangsmaterials erforderlich. Häufig zeigt sich, daß die Menge an
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gewünschter mRHS erhöht werden kann, indem man die Reaktion der Zelle auf Stimuli aus der Umgebung ausnutzt. So kann zum Beispiel die Behandlung mit einem Hormon eine erhöhte Produktion der gewünschten rnRNS bewirken. Andere Verfahren benutzen das Wachstum bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines speziellen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz«
Die Vorreinigung zwecks Anreicherung der gewünschten mRNS-Sequenzen kann auch unter Anwendung konventioneller Verfahren zur Fraktionierung der RNS nach deren Isolation aus der Zelle erfolgen. Man kann jedes Verfahren anwenden,das zu keinem Abbau der RNS führt. Besonders geeignet sind die Verfahren der präparativen Sedimentation in einem Sucrose-Gradienten und die Gelelektrophorese.
Die mRNS muß aus der Ausgangszelle unter Bestimmungen isoliert werden, die ihren Abbau ausschließen» Insbesondere muß die Wirkung von RNase-Enzymen verhindert werden, da diese Enzyme zur hydrolytischen Spaltung der RNS-Nucleotidsequenz fähig sind. Die Hydrolyse einer Bindung in der Sequenz führt zum Abreißen dieser Sequenz und Verlust des RNS-Fragments, das das ursprüngliche 5*-Ende der Sequenz enthält* Eine geeignete Methode zur Inhibierung der RNase während der Extraktion aus Zellen ist in der DE-PS (DE-Patentanmeldung P 28 22 568.5) offenbart.
Bei diesem Verfahren wendet man während des Aufbrechens der Zellen 4molares Guanidiniumthiocyanat und lmolares Mercaptoethanol an. Ferner sind niedrige Temperaturen und pH-Werte nahe 5,0 hilfreich, um einen RNase-Abbau der isolierten RNS zu vermindern.
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Vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß eine von verunreinigendem Protein, DNS, Polysacchariden und Lipiden im wesentlichen freie mRNS hergestellt werden. Zur Durchführung dieser Reinigung stehen Standardmethoden zur Verfugung. Die so isolierte RNS enthält sowohl nun-messenger-RNS als auch messenger-RNS. Eine bequeme Methode zur Abtrennung der mRNS von Eucaryoten ist die Chromatographie an Säulen aus Oligo-dT-Cellulose oder einem anderen mit Oligonucleotiden substituierten Säulenmaterial wie PoIy-U-Sepharose, wobei man die Spezifität der Wasserstoffbindung heranzieht, die auf die Anwesenheit von Polyadenylsäure am 3*-Ende der eucaryotischen mRNS zurückgeht.
Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Bindung der DNS, die zu den isolierten heterogenen mRNS-Sequenzen komplementär ist. Das Enzym der Wahl ist bei dieser Reaktion die Reverse Transcriptase, obgleich man im Prinzip auch jedes andere Enzym verwenden könnte, das eine echt komplementäre DNS-Kopie der mRNS-Matrize herstellen kann. Die Reaktion kann unter den literaturbekannten Bedingungen erfolgen, wobei man mRNS als Matrize und ein Gemisch aer 4 Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und dTTP als Vorläufer für den DNS-Strang verwendet.
Zweckmäßig wird eines der Deoxynucleiosid-Triphosphate
32 mit einem Radioisotop, zum Beispiel £ , in of.-Stellung markiert, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, zum Beispiel durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Angaben machen zu können; vergleiche Efstratiadis, A., et al, loc. cit.
Die bei der Reaktion mit Reverser Transcriptase erhaltenen cDNS-Transcripte sind hinsichtlich der Sequenzen am 5'-Ende und 3'-Ende etwas heterogen aufgrund von unterschiedlichen
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Anfangs- und Endpunkten der einzelnen Transcripte im Bezug zu der mRNS-Matrize. Die Variationsmöglichkeiten am 5*-Ende gehen vermutlich auf die Tatsache zurück, daß der zu der Einleitung der Synthese verwendete Oligo-dT-Primer zur Bindung an zahlreichen Stellen längs der polyadenylierten Region der mRNS befähigt ist. Die Synthese des cDNS-Transcripts beginnt an einem unbestimmten Punkt in der PoIy-A-Region, dann wird eine variable Länge der Poly-A-Region transcribiert, je nach der anfänglichen Bindungsstelle des Oligo-dT-Primers. Man kann diese Unbestimmtheit vermeiden, indem man einen Primer verwendet, der zusätzlich zum Oligo-dT-Trakt ein oder zwei Nucleotide der RNS-Sequenz selbst enthält, wodurch man einen Primer erzielt, der eine bevorzugte und definierte Bindungsstelle zur Einleitung der Transcription besitzt. Die Unbestimmtheit am 3'-Ende des cDNS-Transcripts geht auf verschiedene Faktoren zurück, die die Reaktion der Reversen Transcriptase beeinflussen, und aufdie Möglichkeit eines partiellen Abbaus der RNS-Matrize. Die Isolierung spezifischer cDNS-Transcripte maximaler Länge wird sehr erleichtert, wenn man solche Bedingungen für die Reaktion der Reversen Transcriptase wählt, die nicht nur die Synthese von Sequenzen voller Länge begünstigen, sondern auch die Synthese kleiner DNS-Ketten unterdrücken. Bevorzugte Reaktionsbedingüngen für Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus werden im Beispielteil angegeben. Die spezifischen Parameter, die man variieren kann, um eine maximale Produktion langkettiger DNS-Obersetzungen hoher Originaltreue zu erzielen, sind die Reaktionstemperatur, Salzkonzentration, Enzymmenge, Konzentration des Primers in bezug zur Matrize und die Reaktionszeit.
Die Bedingungen von Temperatur und Salzkonzentration werden
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so gewählt, daß die spezifische Basenpaarung zwischen dem Oligo-dT-Primer und polyadenylierten Anteil der RNS-Matrize optimiert sind. Unter geeignet gewählten Bedingungen ist der Primer befähigt zur Bindung an die polyadenylierte Region der RNS-Matrize, wobei eine nicht-spezifische Initiierung aufgrund von Bindungen an anderen Stellen der Matrize wie kurzen Α-reichen Sequenzen im wesentlichen verhindert wird. Die Effekte von Temperatur und Salzkonzentration sind gegenseitig abhängig. Höhere Temperaturen und niedrigere Salzkonzentrationen vermindern die Sicherheit spezifischer Basenpaarungswirkungen. Die Reaktionszeit wird so kurz wie möglich gehalten, um nicht-spezifische Initiierungen zu verhindern und um die Gelegenheit eines Abbaus gering zu halten. Die Reaktionszeiten sind von der Temperatur abhängig, wobei niedrigere Temperaturen längere Reaktionszeiten erfordern. Bei 42 0C sind Reaktionszeiten von 1 bis 10 Min. geeignet. Der Primer sollte in 50- bis 500fachem molarem Oberschuß überdie RNS-Matrize vorliegen, und auch das Enzym sollte in ähnlichem molarem Oberschuß über die RNS-Matrize vorhanden sein. Die Verwendung von überschüssigem Enzym und Primer begünstigen Initiferung und Kettenwachstum der cDNS, so daß man im Rahmen der kurzen Inkubationszeiten langkettige cDNS-Transcripte erhält.
In vielen Fällen wird es möglich sein, das restliche Reinigungsverfahren gemäß der Erfindung mit einsträngigen cDNS-Sequenzen auszuführen, die durch Transcription aus mRNS erhalten wurden. Wie nachstehend noch beschrieben wird, gibt es jedoch Fälle, in denen das gewünschte Restriktionsenzym nur an doppelständiger DNS wirkt. In diesen Fällen
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kann die auf vorstehende V/eise erzeugte cDNS als Matrize zur Synthese der doppelsträngigen DNS verwendet werden, wobei man eine DNS-Polymerase wie Reverse Transcriptase und eine zur Hydrolyse einsträngiger DNS befähigte Nuclease verwendet· Methoden zur Herstellung doppelsträngiger DNS auf diese Weise wurden bereits beschrieben, siehe zum Beispiel Ullrich, A., Shine, D., Chirgwin, CJ., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W. CJ. und Goodman, H. M., Science 196, 1313 (1977).
Durch Transcription heterogener mRNS-Sequenzen erhaltene heterogene cDNS wird dann mit ein oder zwei Restriktions-Endonucleasen behandelt. Die Wahl der Endonucleolease hängt in erster Linie von einem Vorversuch ab, der die Erkennungsstellen für das Enzym in der Sequenz der zu isolierenden cDNS feststellt. Die Methode basiert auf dem Vorliegen von zwei derartigen Stellen. Sind diese identisch, so reicht ein einziges Enzym aus. Die gewünschte Sequenz entsteht durch Spaltung an zwei Stellen, wobei Größenunterschiede bei der gewünschten cDNS-Sequenz eliminiert werden und man eine Anzahl von Molekülen - als Fragmente bezeichnet erhält, die die gewünschte Sequenz aufweisen und bezüglich der Länge homogen sind. Sind die Restriktionsstellen verschieden, so benötigt man zwei Enzyme, um die Fragmente homogener Länge zu erzeugen.
Die Wahl des oder der Restriktionsenzyme, die zur Produktion eines^Nucleotidsequenz-Fragments optimaler Länge befähigt sind, welches das gesamte oder einen Teil des gewünschten Proteins codiert, muß'empirisch erfolgen. Ist die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins bekannt, so kann man die Nucleotidsequenz von Nucleotidfragmenten gleichmäßiger Länge, die durch Spaltung mit Rastriktions-Endonucleasen entstanden ist, mit der sie codierenden Aminosäuresequenz
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vergleichen, wobei man die bekannte Beziehung des genetischen Codes zugrunde legt« Eine vollständige Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins ist jddoch nicht erforderlich, da eine hinreichend genaue Identifizierung auf der Grundlage einer Teilsequenz gemacht werden kann. Ist die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins unbekannt, so können die durch die Spaltung mit der Restriktions-Endonucle· ase erzeugten Polynucleotide gleicher Länge als Testreagenzien verwendet werden, die fähig sind, die Synthese des gewünschten Proteins in einem geeigneten, in vitro stattfindenden Proteinsynthesesystem zu identifizieren. Die mRNS kann auch durch Affinitätschromatographie oder andere, dem Fachmann geeignet erscheinende Techniken gereinigt werden.
Die Zahl der geeigneten Restriktionsenzyme hängt davon ab, ob man einsträngige oder doppelsträngige cDNS verwendet. Bevorzugt werden Enzyme, die zur Einwirkung auf einsträngige DNS befähigt sind, da letztere das direkte Reaktionsprodukt der mRNS-Transcription ist. Die Zahl der Restriktionsenzyme, von denen bisher die Fähigkeit zur Einwirkung auf einsträngige DNS bekannt ist, ist begrenzt. Zur Zeit erscheinen die Enzyme Haelll, Hhal und Kin(f)I als geeignet. Auch das Enzym MboII wirkt auf einsträngige DNS ein.Sobald weitere Untersuchungen die Wirkung anderer Restriktionsenzyme auf einsträngige DNS erkennen lassen, können diese Enzyme ohne weiteres in die Liste bevorzugter Enzyme eingereiht werden. Außerdem eignen sich Enzyme, die auf doppelsträngige cDNS wirken. Sie werden jedoch nicht bevorzugt, da zusätzliche Reaktionen zur Herstellung der doppelsträngigen cDNS erforderlich sind, die Möglichkeiten zum Verlust langer Sequenzen und anderer Verluste bei der Aufarbeitung bieten. Das Arbeiten mit doppelsträngiger cDNS hat den weiteren
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technischen Nachteil, daS die spätere Sequenzanalyse komplizierter und umständlicher ist. Aus diesen Gründen wird die einsträngige cDNS bevorzugt, jedoch ist die Verwendung doppelsträngiger DNS möglich.
Die zur Behandlung mit der Restriktions-Endonuclease vorbereitete cDNS kann radioaktiv markiert werden, so daß sie nach späteren Trennverfahren aufgefunden werden kann. Eine bevorzugte Methode besteht in der Einverleibung einer radioaktiven Markierung wie zum Beispiel ^ in {/..-Stellung eines der 4 Deoxynucleosid-Triphosphate. Die höchste Aktivität wird erzielt, wenn die Konzentration des radioaktiven Vorprodukts in bezug auf die Konzentration der nichtradioaktiven Form hoch ist. Die Gesamtkonzentration jedes Deoxynucleosid-Triphosphats sollte jedoch größer als 30 pM sein, um die Länge der cDNS, die in der Reaktion mit Reverser Transcriptase erhalten wird, maximal werden zu lassen; vergleiche Efstratiadis, A., Maniatis, T., Kafatos, F. C, Oeffrey, A. und Vournakis, D. N., Cell. 4, 367 (1975). Zur Bestimmung der Nucleotidsequenz der cDNS können
32 die 5"-Enden mit Q. markiert werden, und zwar in einer Reaktion, die durch das Enzym Polynucleotidkinase katalysiert wird, vergleiche Maxam, A. M. und Gilbert, W., Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977).
Fragmente, die durch die Einwirkung eines Restriktionsenzyms oder zweier Restriktionsenzyme erzeugt werden, können voneinander und von heterodispersen Sequenzen, die keine Erkennungsstellen besitzen, durch jede geeignete Technik abgetrennt werden, die zur Trennung von Polynucleotiden aufgrund der Längenunterschiede fähig ist.
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Zu diesen Methoden gehören die verschiedenen elektrophoretischen Verfahren und Sedimentationsverfahren in der Ultrazentrifuge. Die Gelelektrophorese wird bevorzugt, da sie bezüglich der Polynucleotid-Länge die beste Trennung ergibt. Außerdem erlaubt diese Methode die quantitative Isolierung der abgesonderten Materialien. Verfahren zur Gelelektrophorese wurden von Dingman, C. W. und Peacock, A. C, Biochemistry _7_, 659 (1968) und Maniatis, T., Jeffrey, A. und xzan de Sande, H. Biochemistry 14, 3787 (1975) beschrieben.-
Ohne Behandlung mit Restriktions-Endonuclease sind die aus den meisten Quellen erhaltenen cDNS-Transcripte heterodispers bezüglich ihrer Länge. Durch die Einwirkung einer geeignet gewählten Restriktions-Endonuclease oder eines Paares solcher Endonucleasen werden die die gewünschte Sequenz enthaltenden Polynucleotidketten an den Restriktionsstellen gespalten, so daß man Polynucleotidfragmente gleicher Länge erhält. Nach der Gelelektrophorese bilden diese eine ausgeprägte Bande. Oe nach Anwesenheit oder Abwesenheit von Restriktionsstellen an anderen Sequenzen können auch andere diskrete Banden entstehen, die jedoch mit größter Wahrscheinlichkeit einer anderen Länge als derjenigen der gewünschten Sequenz entsprechen. Als Folge der Einwirkung der Restriktions-Endonuclease ist das Ergebnis der Gelelektrophorese das Auftfeten von ein oder mehreren diskreten Banden, während der Rest der cDNS weiterhin heterodispers bleibt. Umfaßt die gewünschte cDNS-Sequenz die Hauptmenge des vorhandenen Polynucleotids, so zeigt das Ergebnis der Elektrophorese, daß der größte Teil der cDNS in der diskreten Bande vorliegt.
Obgleich es unwahrscheinlich ist, daß zwei verschiedene
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Sequenzen bei der Spaltung durch Restriktionsenzyme Fragmente praktisch gleicher Länge ergeben, wäre eine Methode zur Feststellung der Reinheit der Fragmente definierter Länge wünschenswert. Die Sequenzanalyse kann angewandt werden, um Verunreinigungen festzustellen, die 10 % oder mehr des Gesamtmaterials der betreffenden Bande ausmachen. Als Teil vorliegender Erfindung wurde eine Methode zum Auffinden geringerer Mengen an Verunreinigungen entwickelt, die auf den gleichen Prinzipien wie das vorstehend beschriebene Isolierverfahren beruht. Die Methode erfordert, daß das Nucleotidsequenz-Fragment eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease aufweist, die bei der vorausgegangenen Isolierung nicht verwendet wurde. Die Behandlung eines aus einer Gelelektrophorese-Bande eluierten Polynucleotidmaterials mit einer Restriktions-Endonuclease, weihe befähigt ist, Im Innern auf die betreffende Sequenz einzuwirken, führt zur Spaltung dieser Sequenz in zwei Unterfragmente,von wahrscheinlich verschiedener Länge. Diese Unterfragmente bilden bei der Elektrophoresezwei diskrete ßanden an den ihren Längen entsprechenden Stellen, deren Summe gleich ist der Länge des Polynucleotide vor der Spaltung. Verunreinigungen in aer ursprünglichen Bande, die vom Restriktionsenzym nicht angegriffen werden, sollten in die ursprüngliche Stellung wandern. Verunreinigungen, die ein oder mehrere Erkennungsstellen für das Enzym bieten, sollten zwei oder mehrere Unterfragmente ergeben. Da angenommen wird, daß die Verteilung der Erkennungsstellen im wesentlichen zufällig ist, ist die Wahrscheinlichkeit, daß eine Verunreinigung Unterfragmente gleicher Größe wie das Fragment der gewünschten Sequenz ergibt, extrem gering. Die Menge des radioaktiv markierten Polynucleotide in jeder Bande
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kann durch Messen der in jeder Bande vorhandenen Radioaktivität oder durch ein anderes geeignetes Verfahren quantitativ bestimmt werden. Ein quantitatives Maß für die Reinheit der Fragmente gewünschter Sequenz kann erhalten werden, indem man die den Unterfragmenten aus der gewünschten Sequenz entsprechenden Stoffmengen mit der gesaraten Stoffmenge vergleicht.
Nach der erfolgten Abtrennung kann diqfgewünschte Sequenz dann wieder hergestellt werden. Zu diesem Zweck kann man das Enzym-DNS-Ligase, das die End-an-End-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, verwenden. Die Banden der Gelelektrophorese, die den Unterfragmenten der gewünschten Sequenz entsprechen, können gesondert eluiert und x\ Gegenwart von DNS-Ligase unter den geeigneten Bedingungen dann kombiniert werden, vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, 0. H. und Khorana, H. G., Proc. Nat. Acäd. Sei. USA, 67, 1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpfendig, so kann man Ligase aus E. coli verwenden, vergleiche Modrich, P., und Lehman, I.R., 0. Biol. Chem. 245. 3626 (1970).
Die Wiederherstellung der Originalsequenz aus Unterfragmenten, die durch Behandlung mit Restriktions-Endonuclease erhalten wurden, wird stark verbessert durch Anwendung einer Methode, die die Wiederherstellung in falscher Sequenz verhindert. Dieses unerwünschte Ergebnis wird verhindert, wenn man die cDNS-Fragmente gewünschter Sequenz und homogener Länge vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease mit einem Reagens behandelt, das zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist. Als Enzym wird alkalische Phosphatase bevorzugt. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind eine
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strukturelle Voraussetzung für die nachfolgende Verknüpfung durch DNS-Ligase, die zur Wiederherstellung der U,-,terfragmente verwendet wird. Enden, denen eine 5'-terminale Phosphatgruppe fehlt, können daher nicht covalent gebunden warden. Die DNS-Unterfragmente können nur an den Enden verknüpft werden, die eine 5'-Phosphatgruppe aufweisen, wobei diese durch die Spaltung der isolierten DNS-Fragmente mit der Restriktions-Endonuclease erzeugt wurden. Die Methode wird im einzelnenin der DE-PS (DE-Patentanmeldung P 28 22 568.5) beschrieben.
Die Hauptmenge der cDNS-Transcripte entstammt bei den angewandten Bedingungen dem mRNS-Bereich, weiher das 5'-Ende der mRNS-Matrize umfaßt, durch spezifische Primer-VVirkung auf diese Matrize durch ein Fragment, das durch Spaltung mit Restriktions-Endonuclease erhalten wurde. Auf diese Weise kann die vorstehend beschriebene Methode angewandt werden, um nicht nur Fragmente mit spezifischer Nucleotidsequenz in bezug auf ein gewünschtes Protein, sondern auch die gesamte, das betreffende Protein codierende Nucleo· tidsequenz zu erzeugen.
Das Reinigungsverfahren ist von besonderer Bedeutung bei der Klonierung menschlicher Gene, die unter den in den USA gültigen Bestimmungen nur nach sehr sorgfältiger Reinigung in rekombinante DNS und dann in Bakterien verbracht werden können, oder falls in entsprechend abgesicherten (P4) Einrichtungen gearbeitet wird, vergleiche US-Feral Register, Bd. 41, Nr. 131, 7.7.1967, S. 27902-27943. Das vorliegende Verfahren ermöglicht die Herstellung von genügend reinen menschlichen Genen, die die wesentliche Struktur von HCS und HGH haben. Menschliches Gen-Material, das auf vorstehend beschriebene
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Weise isoliert und gereinigt wurde, kann in rekombinante Plasmide oder andere Transfer-Vektoren einverleibt werden. Doppelsträngige, chemisch synthetisierte Oligonucleotid-Bindeglieder, die die Erkennungssequenz für eine Restriktions-Endonuclease besitzen, können an die Enden der isolierten cDNS gebunden werden, um die spätere enzymatische Entfernung des Genteils von der Transfer-Vektor-DNS zu erleichtern, vergleiche Scheller, R. H., et al, Science 196, 177 (1977). Die DNS des Transfer-Vektors wird durch Behandlung mit einer "entsprechenden Restriktions-Endonuclease von einer geschlossenen Schleife in eine lineare Form überführt. Die dabei entstehenden Enden werden mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die 5'-Phos.phatgruppen zu entfernen, so daß die DNS des Transfer-Vektors bei der Reaktion mit DNS-Ligase nicht erneut eine kontinuierliche Schleife bildet, ehe zunächst ein Segmentder nenschlichen DNS eingebaut wurde. Die cDNS mit dem Obligonucleotid-Bindeglied und die vorbehandelte Transfer-Vektor-DNS werden mit einer DNS-Ligase vermischt, um die cDNS mit der Vektor-DNS zu verknüpfen unter Bildung einer geschlossenen Schleife aus rekombinanter Vektor-DNS mit eingebauter cDNS. Verwendet man ein Plasmid als Transfer-Vektor, so ist die geschlossene Schleife gewöhnlich die einzige, zur Transformation eines Bakteriums befähigte Form. Unter Transformation versteht man den Vorgang, bei welchem ein Mikroorganismus extracelluläre DNS seinem eigenen genetischen Aufbau einverleibte Plasmid-DNS in Form einer geschlossenen Schleife kann unter geeigneten Milieubedingungen einverleibt werden. Das Plasmid in Form der geschlossenen Schleife wird in der transformierten Zelle repliziert, und die replizierten Kopien werden bei der Zellteilung auf die Zellnachkommen verteilt. Als Ergebnis entsteht ein neuer ZeIl-
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stamm, der das Plasrnid enthält und dessen genetische Determinanten trägt. Die derartige Transformation durch ein Plasmid unter Beibehaltung der Plasmidgene bei der Plasmid-Replikation erfolgt mit großer Häufigkeit, wenn die transformierende Plasmid-DNS in Form einer geschlossenen Schleife vorliegt, jedoch gar nicht oder selten, wenn lineare Plasmid-DNS verwendet wird. Sobald man einen rekombinanten Transfer-Vektor erhalten hat, ist die Transformation eines geeigneten Mikroorganismus ein einfacher Vorgang, und neue Mikroorganismenstämme i die menschliches Gen enthalten, können leicht unter Anwendung der entsprechenden, an sich bekannten Selektionsverfahren isoliert werden.
Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Reinigung und Analyse wurde eine Nucleotidsequenz isoliert, die den Hauptanteil des Strukturgens für HCS enthält, deren Reinheit sich mehr als 99%ig erwies. Das Strukturgen für HGH wurde in vergleichbarem Reinheitsgrad isoliert. Neue Plasmide, die die isolierten HCS- oder HGH-Sequenzen enthalten, wurden synthetisiert. Ferner wurden neue Mikroorganismen hergestellt, die die isolierten HCS- oder HGH-Sequenzen als Teil ihres Genmaterials enthalten.
Die beiliegenden Zeichnungen demonstrieren die in den Beispielen erzielten Ergebnisse.
Fig. 1 ist ein Autoradiogramm einer Serie von Gelelektro-
32 phorese-Versuchen mit P-markierter cDNS (vergleiche
Fig. 2 ist die schematische Wiedergabe der HCS codierenden Nucleotidsequenz, die die relative Stellung verschiedener Restriktionsstellen zeigt (vergleiche Beispiel 1).
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Fig. 3 ist ein Autoradiogramm von Gelelektrophorese-
32 Versuchen an P-markierter cDNS (vergleiche Beispiel 2). Die Fig. 4 und 5 sind Autoradiogramme von Geleelktro-
32 phorese-Versuchen mit P-markierter cDNS (vergleiche
AusfUhrungsbeispiel
Nachstehend wird die Erfindung an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert:
Das allgemeine Verfahren zur Isolierung einer spezifischen cDNS-Sequenz wied demonstriert an der Isolierung einer Sequenz, die einen Teil der Codierungsregion für HCS umfaßt und aus Placentagewebe extrahiert wurde.
Extraktion
der
mRNS aus der Placenta
Menschliche Geburtsplacentas, bei Kaiserschnitt-Geburten erhalten, wurden in flüssigem Stickstoff rasch eingefroren und bei -60 0C gelagert. Zur Extraktion der gesamten RNS wurden 40 g der gefrorenen Placentagewebe in kleine Stücke zerbrochen und in einem Mischer in 140 ml einer frisch zubereiteten Lösung von 7 M-Guanidinium-HCl (s. Cox, R. A., Methods in Enzymology 12, 120 (1968)).20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 % Sarcosyl (Handelsbezeichnung der Ciba-Geigy Corp., Greensboro, N. C.) bei O 0C gelöst. Nach Zusatz von 0,5 g Casiumchlorid pro Milliliter wurde die dunkelbraune Lösung 5 Min. auf 65 0C erwärmt, rasch in Eis gekühlt, auf ein Kissen auf 5,7 M CsCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M EDTA in 2,5 χ 8,75 cm Nitrocellulose-Röhrchen
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aufgeschichtet und in einem SW27-Rotor (Beckman -Instruments Corp., Fullerton, California) bei 27 000 Umdrehungen/Min. 16 Std«, lang bei 15 0C zentrifugiert (Glisin, V., Crkvenjakov, R. und Ryus, C, Biochem. 13., 2633 (1974)). Nach dem Zentrifugieren wurde abdekantiert, die Röhrchen wurden entwässert, und das /2 cm große Bodenstück, das das reine RNS-Pellet enthielt, wurde mit einem Rasiermesser zerschnitten. Die Pellets wurden in einen sterilen Erlenmeyer_Kolben überführt und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 1 mM EDTA, 5 % Sarcosyl und 5 % Phenol gelöst. Die Lösung wurde dann O,lmolar an Natriumchlorid gemacht und mit 40 ml eines Gemischs aus 50 % Phenol und 50 % Chloroform kräftig geschüttelt. Die RNS wurde aus derwäßrigen Phase mit Ethanol in Gegenwart von 0,2 tii Na-acetat, pH 5,5 ausgefällt. Die RNS-Pellets wurden mit 95 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser gelöst. Gewöhnlich ergeben 40 g Placentagewebe etwa 30 mg RNS, woraus man etwa 300 ug polyadenylierter RNS nach zweimaligem Chromatographieren an Oligo-dT-zellulose erhält, vergleiche Aviv und Leder, loc. cit.
Analytische Reaktionen wurden ausgeführt in 5 jul, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,1 mM EDTA, 7 mM MgCl, 20 mM KCl, 10 mM ß-Merkaptoethanol, 40 um dCTP (50 000 cpm 32P/pMol), 500,uM dCTP, dATP und dTTP, 100 ug/ml polyadenylierte RNS, 20 /jg/ml Oligo-dT^p 1S (zu beziehen bei Collaborative Research, VValtham, Mass.) und 100 Einheiten/ml Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus. Das Enzym kann bezogen werden bei der Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es unter Vertrag mit den National Institutes of Health nach dem Verfahren
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von Kacian, D. L, und Spiegelrnan S., Methods in Enzymology 29, Großman, L. und Moldave, K0, (Hrsg.) Academic Press, N. Y. (1974) 3, 150 produziert. Die Reaktionen wurden eingeleitet durch Zusatz des Enzyms bei O C, die Synthese erfolgte während 6 Min. bei 42 0C. Unter diesen Bedingungen wurden 10 cpm P in das mit Trichloressigsäure ausfällbare Material einverleibt, und jedesyug RNS ergab etwa 50 ng cDNS. Um genügend cDNS für eine Sequenzanalyse zu erhalten, wurden die Reaktionsvolumina auf 100 ul und die dCTP-Konzentrationen auf 250 juM erhöht (spezifi-
32 sehe Aktivität 500 cpm /P/Mol). Unter diesen Bedingungen wurden etwa 200 000 cpm P-markiertes dCTP in cDNS eingebracht.
Behandlung mit Restriktion.s-Endonuclease
Zur Digerierung mit Restriktions-Endonuclease wurden die analytischen Reaktionen durch Zusatz von 20 LiI eiskaltem Wasser gestoppt, dann wurde 2 Min. gekocht, schnell auf Eis ,abge->kühlt und mit Magnesiumchlorid 7 millimolar gemacht« Proben von jeweils 5 ul (2 χ 10 cpm) wurden unter Verwendung eines Oberschusses der Restriktions-Endonuclease-(n) Haelll oder Hhal, oder beider, 1 Std. bei 37 0C digeriert. Das Enzym Haelll war nach der Methode von Middleton, D. H., Edgell, M. H., und Hutchinson, C. A. III, 0. Virol. 10, 42 (1972) hergestellt worden. Die Enzyme Hhal und Hpall waren erhalten worden von der New England Bio-Labs, Beverly, Mass. Auch Haelll ist bei diesem Hersteller zu beziehen. Die Enzymmenge wurde empirisch so bestimmt, daß ein Oberschuß über die zur vollständigen Verdauung einer äquivalenten Menge restriktionsempfindlicher DNS unter identischen Reaktionsbedingungen notwendige Menge vorlag. Die Reaktionen wurden mit 5/jI 20 mM EDTA, 20 %
ο Sucrose, 0,05 % Bromphenolblau abgestoppt, 1 Min auf 100 C
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erhitzt und dann durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Die Trennung der Produkte erfolgte mit einem 4,5- bis 10%igen Polyacrylamid-Plattengel, während 2 /2 Std. bei 150 V in Tris-Borat-EDTA-Püffer (Fingman, C. W. und Peacock, A. C, loc. cit.), die Sichtbarmachung erfolgte durch Autoradiographieudes trockenen Gels.
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse von Elektrophorese und Auto-
32 radiographie der P-markierten cDNS, deren Herstellung vorstehend beschrieben ist. Die Proben wanderten elektrophoretisch durch 4,5 % Acrylamid und dann durch 10 % Acrylamid. Links wird mit einem Strich die Grenze zwischen den zwei Gel-Bereichen angegeben. Das Band A gibt die elektrophoretische Wanderung des gesamten cDNS-Transcripts wieder, Band B zeigt die Wanderung der mit Hhal behandelten cDNS. Band C zeigt die Wanderung der mit Haelll behandelten cDNS. Band D zeigt die elektrophoretische Wanderung der sowohl mit Hhal als auch mit Haelll behandelten gesamten cDNS. Band E zeigt die elektrophoretische Wanderung des aus der Hauptbande Band C isolierten Materials. Band F zeigt die elektrophoretische Wanderung des aus der Hauptbande von Band C isolierten Materials nach Behandlung mit Hhal. Band G zeigt die elektrophoretische Wanderung
32 einer mit Haelll gespaltenen, 5*- P endmarkierten einsträn· gigen Phagen-M13-DNSf die als Größenstandard verwendet wurde, siehe Horiuchi, K., und Zinder, N. D., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 72, 2555 (1975). Die angenäherten Längen dieser DNS-Fragmente in Nucleotideinheiten sind durch die Zahlen rechts angegeben.
Das Ergebnis im Band A zeigt, daß das cDNS-Tpanscript aus
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mRNS-Geburtsplacenta heterodispers ist· Die Behandlung mit Hhal (Band B) oder HaeIII (Band C) führt zur Anhäufung von Polynucleotiden diskreter Länge. Die Herstellung solcher diskreter Banden weist darauf hin, daß in einer heterogenen Population von CdNS-Transcripten mindestens eine Sequenz in mehreren Kopien vorhanden ist, die zwei Restriktionsstellen für Hhal bzw. HaeIII besitzt. Die Spaltung mit Hhal erzeugt ein Fragment von etwa470 Nucleotiden, und mit Haelll erhält man ein Fragment von etwa 550 Nucleotiden Länge. Die Digerierung mit beiden Enzymen ergibt drei Fragmente, nämlich A mit 90 Nucleotiden Länge, B mit 460 Nucleotiden Länge und C mit etwa 10 Nucleotiden Länge. Aufgrund der geringen Größe wandert das Fragment C unter den bei Fig. 1 verwendeten Bedingungen aus dem Gel. Die an der Grenzfläche zwischen 10 und 4,5 % Gel auftretende Bande stellt ein heterogenes Material dar, das zum Eintritt in das 10 % Gel zu groß war und sich daher an der Grenzfläche ansammelte. Wie aus dem einfachen Bandenmuster von Band D zu schließen, scheinen die Fragmente A und B aus dem gleichen cDNS-f4olekül zu stammen. Dieser Schluß wird durch die Eluierung des größeren Hae-III-Fragments aus dem Gel bestätigt, das erneut mit Hhal digeriert wird. Diese Behandlung liefert zwei Fragmente, die gleichermaßen wandern wie die Banden, die entstehen bei kombinierter Digerierung der gesamten cDNS mit Haelll und Hhal, wie aus dem Vergleich der Bänder D und F ersichtlich. Im Digerierungsprodukt der gesamten cDNS gemäß Band D ist die autoradiographische -Dichte, die ein Maß für die gesamte vorhandene Radioaktivität darstellt, für Fragment A größer als für Fragment B, obgleich man aufgrund der Größenunterschiede das Umgekehrte erwarten könnte. Diese Beobachtung legt den Schluß nahe, daß das Fragment A durch Transcription einer dem 3*-Ende
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der mRNS nahegelegenen Region als Fragment B entsteht-
Fig. 2 ist eine schematische Wiedergabe des cDNS-Moleküls mit den relativen Plazierungen der Hae-III- und Hha-I-Restriktionsstellen. Die DNS-Fragmente A und B, die dem gleichen cDNS-Molekül entstammen, wurden aufgrund ihrer relativen Intensität im Autoradiograram gemäß Fig. 1, Band D angeordnet. Die Existenz des DNS-Fragments C wurde aus dem Unterschied der elektrophoretischen Mobilität der in den Bändern B und D von Fig. 1 erscheinenden Banden geschlossen. Die Größe des DNS-Fragments A ist genau bekannt aufgrund einer Bestimmung der Nucleotidsequenz nach dem Verfahren von Maxam, A. und Gilbert, W1 10c. cit. Die Größe des DNS-Fragments B wurde durch Vergleich mit M13-DNS-Größenmarkierungen gemäß Fig. 1, Band G ermittelt·
Die Nucleotidsequenz des DNS-Fragments A und eines Teils des 5*-Endes von Fragment B erfolgten nach dem Verfahren von Maxam, A. und Gilbert, W., loc. cit. Da die Aminosäuresequenz von HCS bekannt ist, kann die Nucleotidsequenz der beiden Fragmente mit der Aminosäuresequenz verglichen werden unter Anwendung der bekannten Beziehung des genetischen Codes. Auf der Basis dieser Beziehung konnte nachgewiesen werden, daß die spezifischen Sequenzen tatsächlich Teile des HCS-Moleküls codieren, ferner konnte die Anordnung dieser Fragmente gemäß Fig. 2 bestätigt werden.
Folgendes Beispiel demonstriert die Fähigkeit des erfindungs· gemäßen Verfahrens zum Reinigen einer Nucleotidsequenz, die als geringerer Anteil in der gesamten Population von
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Nucleotidsequenzen vorliegt. Als Matrize wurden definierte RNS-Gemische verwendet, die gereinigte Globin-RNS von Kaninchen und menschliche polyadenylierte Placenta-RNS enthielten, wobei die Reaktion mit der Reversen Transcriptase
in Gegenwart von D^-P dCTP mit einer spezifischen Endaktivität von 10 cpm/pMol erfolgte. Die cDNS-Produkte wurden mit der Endonuclease Haelll gespalten, und die Spaltungsprodukte wurden auf 4,5- bis 10%igem Polyacrylamid-Plattengel getrennt.
Die cDNS-Fragmente wurden durch Autoradiographie des getrockneten Gels sichtbar gemacht.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Versuche. Die Gelelektrophorese wurde im wesentlichen, wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt. Die Bänder A und H bezeichnen ds Größenmarkierer, die erhalten worden waren durch Spaltung von Phagen~M13-DNS mit der Endonuclease Haelll und 5'- P-Endmarkierung der dabei erhaltenen Fragmente. Die angenäherten Längen dieser DNS-Fragmente in Nucleotiden sind durch die Zahlen links angezeigt. Die Bänder B und C zeigen die Elektrophoresemuster, die erhalten wurden nach Ausführung obiger Reaktionsfolge an Gemischen von Globin-RNS und Placenta-RNS unter Veränderung der Mengen, wie aus folgender Tabelle ersichtlich:
| Band | Globin-RNS Nanogramm | Placenta-RNS Nanopramm |
| B | 300 | O |
| C | 60 | 240 |
| D | 30 | 270 |
| E | 15 | 285 |
| F | 7,5 | 292,5 |
| G | 0 | 300 |
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| 4 | 3 | 7 | 4 | 39 - 3«·- | 1. | 10. | 1980 | |
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Man sieht, daß die Globin-RNS ein Hae-III-Fragment von 320 Nucleotiden Länge ergibt. Das Globin-cDNS-Transcript kann noch ermittelt werden, wenn die Globin-RNS nur 2 bis 5 % der gesamten RNS ausmacht. Liegt eine RNS-Art nach der Isolierung in zur Ausführung dieser Analyse zu geringer Kopienanzahl vor, so kann sie zunächst durch eines der bekannten RNS-Reinigungsverfahren teilweise gereinigt werden, bis sie etwa 2 bis 5 % des restlichen Gemischs beträgt.
Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung eines Nucleotidsequenz-Fragments von etwa 50 Basenpaaren Länge, das einen Teil der Codierungsregion für HCS enthält, und ein Verfahren zum Messen der Reinheit der isolierten Sequenz. Die Reinheit des gereinigten Fragments betrug mehr als
Reinigung von HCS-cDNS
Polyadenylierte Placenta-RNS, die nach der Vorschrift von Beispiel 1 isoliert worden war, wurde an HCS-mRNS angereichert durch Sedimentation in einem 5 % bis 20 % (Gew./Vol.) Sucrose-Gradienten von 4 0C im S7/-27-Rotor einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 25 000 Umdrehungen während 16 Std. Die llS-;14-Region des Gradienten wurde gesammelt, und
100 jug dieser RNS wurden zur Synthese der doppelsträngigen cDNS nach der Vorschrift von Ulrich, A., et al., loc. cit. verwendet. Die Synthese des zweiten Stranges wurde gestoppt durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit 1 Vol.-Teil Ethanol bei -70 0C. Die Digerierung der cDNS mit Hae-III-Endonuclease erfolgte in 50,ul 6 mM Tris-HCL, pH 7,5 6 mM MgCl2, 6 mM ß-Mercaptoethanol mit 2 Einheiten Haelll bei
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37 0C während 2 Std., anschließend erfolgte Behandlung mit 0,1 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase (Typ BAPF, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N. 3., Definition der Einheiten durch den Hersteller) bei 60 C während 10 Min. Nach der Extraktion mit 1 Vol.-Teil Phenol/Chloroform wurde die DNS mit 2 Vol.-Teilen Ethanol von -70 0C ausgefällt, in 20 ul 10 mM Tris-HCL, pH 8,1 mM EDTA gelöst und einer Elektrophorese an 6-%-(Gewicht/Vol.)-Polyacrylamidgel unterworfen. Fig. 4 (F) zeigt das Elektrophoresemuster dieses^Reaktionsgemische, das eine herausragende Bande entsprechend einer Nucleotidsequenz von etwa 550 Basenpaaren Länge zeigt. Das Fragment mit 550 Basenpaaren wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektrophoretisch eluiert, das Ergebnis zeigt Fig. 4 (E).
Das Festliche Material entsprechend dem Fragment mit 550 Basenpaaren gemäß Fig. 4 (E) wurde mit 4 Einheiten Hha-I-Endoouclease in 50 ul des gleichen Puffers, der zum Digerieren mit Hae-III-Endonuclease verwendet worden war, 2 Std. bei 37 0C behandelt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ausfällung mit Ethanol wurden die Produkte der Digerierung durch Elektrophorese an einem 6-/o-(Gewicht/Volumen)-Polyacrylamidgel getrennt. Das Ergebnis zeigt Fig. 4 (D).
Die beiden Fragmente wurden elektrophoretisch eluiert, vereinigt und neu verknüpft durch zweistündiges Inkubieren bei 15 0C in 20 ul 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCl2, 15 dM Dithiothreit, 1 mM ATP enthaltend 20^UgZmI T4 DNS-Ligase. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit O,!molarer Natriumchloridlösung auf 200 υ1 verdünnt und mit 1 Vol.-Teil Phenol/Chloroform extrahiert, die DNS.wurde mit 2 Vol.-Teilen Ethanol ausgefällt. Nach erneuter Suspendierung in 20 ul
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10 πιΜ Tris-HCl, pH 8,1 mM EDTA wurden die Verknüpfungsprodukte durch Elektrophorese an 6-%-(Gew./Vol.)-Polyacrylamidgel getrennt. Das Ergebnis zeigt Fig. 4 (C). Aus dem Elektrophoresemuster von Fig. 4 (c) ist zu ersehen, daß das Fragment auf 550 Nucleotiden durch die Verknüpfungsbehandlung wiederhergestellt worden ist. Die vorgängige Behandlung mit alkalischer Phosphatase stellte sicher, daß die beiden Hha-I-Fragraente in der ursprünglichen Reibenfolge verknüpft worden waren. Die weiteren Banden gemäß Fig. 4 (C) entsprechen der Dimerbildung zwischen Hha-I-Fragmenten, da diese durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase nicht verhindert wird.
Das Fragment aus 550 Nucleotiden wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektrophoretisch eluiert. Das Elektrophoresetnuster dieses Materisl zeigt Fig. 4 (B). Fig. 4(A) ist
32 das Elektrophoresemuster eines mit P-markierten Hae-III-Verdauungsprodufcts von doppelsträngiger M13-DNS, die zur Größenmarkierung verwendet wurde. Die elektrophoretischen Analysen erfolgten in 6-%-(Gew./Vol.)-Polyacrylamidgel in 50 mM Tris-borat, pH 8,1 mM EdTA bei 100 Volt während 2 Std. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet, und mit Hilfe eines Kodak-NS2T-x-Röntgenfilms wurden die Autoradiogruppe hergestellt.
Reinheit des wiederhergestellten 550-Nucleotid-Fragments
von HCS-sDNS
Die isolierten, wiederhergestellten HCN-cDNS-Hae-III-Fragmente wurden am 5'-Ende mit 32p markiert unter Verwendung des Enzyms Polynucleotid-Kinase aus mit Bakteriophagen T4 infizierten E.coli, siehe Panet, A« et al., Biochemistry 12,
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5045 (1973). Polynucleotid-Kinase ist zu beziehen bei P-L- Biochemical, Milwaukee, Wisconsin. Das Fragment wurde dann entweder mit Hhal oder Hpall in 50yUl 6 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCl2, 6 mM ß-Mercaptoethanol bei 37 0C 2 Std. lang digeriert. Nach der Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform wurde die DNS mit 2 Volumina Ethanol von -70 0C ausgefällt, in 20 ul, 10 mM Tris-HCl, pH 8,1 mM EDTA erneut suspendiert und einer Elektrophorese unterworfen, Mit einem Röntgenfilm wurden die markierten Fragmente sichtbar gemacht , wie vorstehend beschrieben.
Die Ergebnisse zeigt Fig. 5. Fig. 5 (B) und Fig. 5 (E) zeigen Wiederholungsläufe mit dem 550 Nucleotid-Fragment vor der Behandlung mit Restriktionsenzym. Fig. 5 (C) zeigt das Muster nach Hha-I-Spaltung und Fig. 5 (D) nach Hpa-II-Spaltung.
Die Reinheit des 550 Nucleotid-Fragments wurde gemessen durch Zerlegen des Autoradiogramms der mit cfem Restriktionsenzym entstandenen Spaltprodukte und durch Quantifizierung der Verteilung der Radioaktivität in beiden Digerierungsprodukten. Diese Messungen ergeben, daß das rekonstituierte Hae-III-Fragment von menschlicher HCS-cDNS zu mehr als 99 % homogen war.
BeJSpJeI
1
4
Dieses Beispiel beschreibt die Synthese eines Plasmids, das eine Nucleo-tidsequenz von 550 Basenpaaren enthält, die den Hauptanteil der codierenden Region für HCS ausmacht.
Nach der Vorschrift von Beispiel 3 wird ein 550-Nucleotidfragment von HCS-cDNS von mehr als 99 % Reinheit hergestellt
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Die terminalen 5'-Phosphatgruppen werden in einem Reaktionsgemisch wiederhergestellt, das 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 10 mM MgCIp, 0,1 mM Spermidin, 5 mM ß-Merkaptoethanol, 5 % (Gew.-/Vol.) Glycerin, 333 pMol ATP, 5 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase enthält, unter zweistündiger Inkubation in einem Endvolumen von 40/j1 bei 37 0C. Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch durch Phenol-Extraktion und Ausfällung mit Ethanol isoliert. Dann werden synthetische Decanucleotid-Bindeglieder mit einer Restriktions-Spezifitat für EcoRI mit der Sequenz S'-CCGAATTCGG-S' (Herstellung Se Scheller, et a., loc. cit) an die HCS-DNS angeknüpft im Molverhältnis von etwa 50:1 in 50 jliI 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 9 mM MgCl2, 15 mM Dithiothreit, 1 mM ATP und 20 ug/ml T4 DNS-Ligase. Die Bindeglieder sind zu beziehen von Collaborative Research, Waltham, Massachusetts. Nach 18stündiger Inkubation bei 4 0C wird die Reaktion durch Extraktion mit Phenol/Chloroform gestoppt. Die Verknöpfungsprodukte werden mit Ethanol ausgefällt,, erneut geBst in 50 jul 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 7 mM MgCl2 und mit 50 Einheiten EcoRI-Endonuclease bei 37 0C 2 Std. digeriert· Die Digerierung mit der Endonuclease führt zur Spaltung an der EcoRI-Stelle der Decameren, wodurch man HCS-eDNS mit kohäsiven EcoRI-Enden sowie abgespaltete nicht-umgesetzte Decanucleotide und mit sich selbst verknüpfte Decanucleotide erhält. Da die gespalteten Decmere auch EcoRI-Endgruppen besitzen und bei der Neukombination mit dem ähnlich gespalteten Plasmid mit der HCS-cDNS konkurrieren müssen, wird die HCS-cDNS vor der Umsetzung mit dem Transfer-Vektor durch Gelelektrophorese isoliert. Die Verwendung obiger Decanucleotid-Bindeglieder besitzt den Vorteil, daß man das HCS-cDNS Fragment aus dem Plasmid in einer Form isolieren kann, die mit dem
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ursprünglichen Fragment identisch ist.
Als Transfer-Vektor wurde das bakterielle Plasmid pMB-9 verwendet, ein Molekül vom Molekulargewicht 3,5 χ 10 , das eine einzige EcoRI-Stellung aufweist (Herstellung siehe Rodriguez, R» L., Bolivar, F., Goodman, H. M., Boyer, H. VV., und Betlach, M. ICN-UCLA Symposium On Molecular and Genetic Biology, Wierlich, D, P., Rutter, W. O. und Fox,C. F. (Hrsg.) Academic Press, New York (1976) S. 471-477). Die Plasmide pMB-9 und pBR-322 (siehe Beispiel 5) sind zu beziehen von Bethesda Reseerch Labs, Rockville, Maryland. Die infizierung von E.coli mit pMB-9 verleiht Resistenz gegen Tetracyclin. Die Einverleibung von DNS in die EcoRI-Stellung von pMB-9 verändert weder die Tetracyclin-Resistenz noch eine andere bekannte Eigenschaft des Plasmids» Daher gibt es keine phänotypischen Unterschiede zwischen rekombinanten und normalen Plasmiden. Das mit EcoRI gespaltete pMB-9 wurde somit zunächst mit alkalischer Phosphatase behandelt nach dem Verfahren der DE-PS (DE-Patentanmeldung P 28 22 568.5), vergleiche auch Ullrich, et al., loc. cit. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase entfernt die 5*-Phosphatgruppen von den mit EcoRI erzeugten Enden des Plasmids und verhindert Selbstverknüpfung der Plasmid-RNS, wodurch sichergestellt wird, daß die Ringbildung und spätere Transformation abhängig werden von der Inserierung eines DNS-Fragments mit 5'-phosphorylierten Enden. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase erfolgte in einem Reaktionsgemisch mit 1,0 Enzymeinheiten pro Milligramm Plasmid-DNS in 25 mM Tris-HCl, pH 8 während 30 Min. bei 65 0C. Dann erfolgte Phenol-Extraktion zur Entfernung der Phosphatase undAusfällung der DN3 mit Ethanol. Die Verknüpfung der HCS-cDNS mit dem so behandelten pMB-9 erfolgte in 50 μΐ -Reaktionen enthaltend 60 mM Tris-HCl,
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pH 8,10 mM ß-Mercaptoethanol, 9 mM MgCl2, 10 bis 50 ng der gereinigten HCS-cDNS und etwa 500 ng mit EcoRI gespaltener, 5'-dephosphorylierter Plasmid-DNS. Die Reaktionen wurden eingeleitet durch Zusatz von T4 DNS-Ligase bis 5 jug/ml, 1 Std. bei 15 0C ablaufen gelassen, und dann wurde das Gemisch verdünnt auf 0,25 ml mit 120 mM NaCl,1 mM EDTA. Das verdünnte Reaktionsgemisch wurde direkt zur Transformation von E.coli-X-1776 verwendet.
E.coli-X-1776 ist ein Wirtsorganismus, der speziell zur refcombinanten DNA-Technik entwickelt wurde und vom Methanol Institut of Health in den Richtlinien als ΕΚ-2-lVirt bezeichnet wird. Der Stamm kann bezogen werden von Dr. Roy Curtiss III, University of Alabama, Department of Microbiology, Birmingham, Alabama. Die Bakterien werden in 150 ml Nährbrühe gezüchtet, die mit 100 ug/ml Diaminopimelinsäure (DAP) und 40 ug/rnl Thymin ergänzt ist, bis zu einer Zelldichte von etwa 2 χ 10 Zellen/ml. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und in 60 ml 10 mM NaCl gewaschen, erneut zentrifugiert und in 60 ml Transformations-Puffer suspendiert, der 10 mM Tris-HCl, pH 8, 140 mM NaCl, 75 mM CaCIp enthält. Die Zellsuspension wird 15 Min. auf Eis gehalten, dann werden die Zellen abzentrifugiert und in 1,5 ml des gleichen Transformations-Puffers suspendiert. 0,5 ml der Zellsuspension werden .zu 0,5 ml verdünntem Verknüpfungs-Reaktionsgemisch zugegeben, worauf 15 Min. auf Eis inkubiert wird. Nach 4 Min. bei 25 0C wird das Gemisch wieder 30 Min. aufEis gehalten. 0,2 ml der Zellsuspension werden .direkt auf Nähragar-Platten verbracht, die mit 100 Ltl/ml DAP, 40 jug/ml Transformationsproben, die alle eine Inserierung von 550 Basenpaaren enthielten, welche von öer Plasmid~DNS durch Digerierung mit EcoRI- oder Haelll-
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Endonuclease freigesetzt wurde·
Zur Sequenzanalyse wurde ein Transformations-Klon mit der Bezeichnung pHCS-1 ausgewählt. E.coli X-1776 (pHCS-1) wurde in geeignetem Nährmedium gezüchtet, die Plasmid-DNS wurde daraus isoliert und mit EcoRI-Endonuclease gespalten. Die Inserierung aus 550 Basenpaaren wurde von dem linearen pMB-9 isoliert durch Elektrophorese in 6 % Polyacrylamidgel, worauf die DNS-Sequenzanalyse nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert, loCeCit. erfolgte. Unterfragmente der HCS-DNS wurden hergestellt durch Inkubation mit Hpa-II-Restriktions-Endonuclease, und die 5*-Enden wurden unter Verwendung von Tf P-ATP und Polynucleotid-Kinase markiert. Nach der Sequenzanalyse nach Maxam und Gilbert wurde die Nucleotidsequenz der klonierten HCS-DNS bestimmt. Durch Vergleich mit der bekannten Aminosäuresequenz der HCS ergab sich, daß die Sequenz aus 557 Nucleotiden den Teil der codierenden Region der HCS-mRNS von den Aminsäuren bis 191 plus 50 Nucleotiden der 3'-unübersetzten Region darstellte, vergleiche Niall, H. D#, Hogan, M. L., Sauer, R., Rosenblum, I, Y. und Greenwood, F. C. Proc. Nat. Acad. Sei. USA (58, 866 (1971).Die Primärstruktur der HCS-mRNS, bestimmt aus der DNS-Sequenz des klonierten Fragments pHCS-1, zeigt Tabelle 3, zusammen mit der daraus, entsprechend dem genetischen Code, resultierenden Aminosäuresequenz. Die sich aus der Nucleotidsequenz ergebende Aminosäuresequenz ist identisch mit der kürzlich veröffentlichten, auf chemischem Weg ermittelten Aminosäuresequenz. Dies zeigt,daß die anfangs isolierten HCS-mRNS in vitro mitgroßer Genauigkeit kopiert wurde, und daß das klonierte HCS-DNS-Fragment im transformierten Bakterium mit großer Genauigkeit repliziert wurde.
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Nucleotidsequenz eines Stranges von HCS-DNS aus kloniertem pHCS-1.
Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz, beginnend am Aminoende. Die gezeigte DNS-Sequenz entspricht der mRNS-Sequenz für HCS, abgesehen davon, daß in der mRNS T durch U ersetzt ist. Ferner wird die Aminosäuresequenz von Stellung 1 bis 23 gezeigt:
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Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung von DNS, deren Nucleotidsequenz den Hauptanteil der corierenden Region für HGH umfaßt, und die Synthese eines plasmidischen Transfer-Vektors, der die gereinigte DNS enthält. Ferner wird die Herstellung eines Mikroorganismenstammes beschrieben, der die DNS als Teil seiner genetischen Ausstattung enthält. Das HGH war im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 3 für HCS gereinigt worden, abgesehen von den nachstehenden Änderungen.
5 benigne Hypophysentumoren vom Menschen, die nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren und von denen jeder o,4 bis 1,5 g wog, wurden in 4molarer Guanidiniumthiocyanatlösung, die an Merkaptoethanol Imolar und auf pH 5,0 gepuffert worden war, bei 4 C aufgetaut und homogenisiert. Das HomogBnisat wurde über 1,2 ml 5,7inolare Cäsiumchloridlösung, die 100 Millimol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, aufgeschichtet und 18 Std. bei 37 Umdrehungen/Minute im Rotor SlV 50,1 einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 15 0C zentrifugiert. Dabei gelangte die RNS auf den Boden des Zentrifugenröhrchens. Die weitere Reinigung in einer Säule mit Oligo-dT und Sucrose-Gradientensedimentation erfolgte, wie in den Beispielen 1 und 3 beschrieben. Etwa 10 % der so isolierten RNS codierten Wachstumshormon, wie abzuschätzen war, aus der Einverleibung eines radioaktiven Aminosäure-Vorläufers im Niederschlagsmaterial aus Antiwachstumshormon in einem zellfreien Translationssystem aus Weizenkeimen; vergleiche Roberts, B. E. und Patterson, B. M., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70, 2330 (1973). Einsträngige und doppelsträngige cDMS
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wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt. Die HGH-cDNS wurde dann mit der.Restriktions-Endonuclease Haelll und alkalischer Phosphatase, wie in Beispiel 3 beschrieben, behandelt, dann erfolgte Fraktionierung durch Gelelektrophorese. Es wurde eine diskrete Bande in etwa 550 Nucleotiden Länge entsprechender Stellung beobachtet und zur weiteren Reinigung isoliert.
Zur weiteren Behandlung wurde die vorstehend beschriebene Technik der Aufteilung der DNS in Unterfragmente, gesonderten Reinigung dieser Unterfragmente und deren Rekombination durchgeführt, wobei jedoch im Fall von HGK die Restriktions-EndonucleasePvuII verwendet wurde, die zwei Unterfragmente von etwa 490 bzw. etwa 60 Nucleotiden Länge ergab. Alle verwendeten Restriktionsenzyme sind Handelsprodukte der New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Das neu verknüpfte Produkte von etwa 550 Basenpaaren Länge war von mehr als 99%iger Reinheit, wie durch Unterfraktionierung in 4 verschiedenen Restriktions-Endonucleasesystemen ersichtlich.
Die Synthese eines rekombinanten Transfer-Vektors, der HGH-DNS enthält, erfolgte im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 4, wobei sich jedoch das Decanucleotid-Bindeglied und Plasmid unterschieden. Es wurde ein Decanucleotid-Bindeglied mit Hind-III-Spezifität verwendet, das die Sequenz S'-CCAAGCTTGG-S' besaß. Die Behandlung mit Hsul ergab HGH-cDNS mit kohäsiven Enden. Hsul und Hind III besitzen die gleiche Spaltstellen-Spezifität und können im Austausch verwendet werden. Als Transfer-Vektor wurde das Plasmid pBR-322 verwendet. Es verleiht dem Wirt Resistenz gegen die Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin.
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Durch DNS-Inserierung in die Hind-III-Stelle wird die Tetra· cyclinresistenz vermindert oder beseitigt. Die Auswahl der Neukombination erfolgte daher durch Wachstum auf Ampicillin enthaltenden Nährplatten und aufgrund der Unfähigkeit zum Wachstum auf 20 ug/ml Tetracyclin. Die HGH-cDNS wurde rekombiniert ait durch Hsul gespaltenem und mit alkalischer Phosphatase behandeltem pBE-322, wobei im wesentlichen die Bedingungen von Beispiel 4 angewandt wurden.
Die Produkte der L^gase-Reaktion wurden zur Transformation von E.coli X-1776 unter den Bedingungen von Beispiel 4 eingesetzt. Sieben Kolonien wurden isoliert aufgrund ihrer Fähigkeit zum Wachstum in Gegenwart von Ampicillin und ihrer Unfähigkeit zum Wachstum in Gegenwart von Tetracyclin. Fünf der sieben Kolonien enthielten das rekombinante Plasmid, welches den Teil der HGH-DNS mit etwa 550 Basenpaaren aufwies. Einer der Bakterienstämme, pHGH-1, der die HGH-DNS als Teil seiner genetischen Ausstattung trug, wurde in ausreichender Menge gezüchtet, so daß er eine Quelle für Plasmid-DNS bildete, aus der die HGH-DNS durch Behandlung mit Hind III oder Hsul reisoliert werden konnte. Diese isolierte HGH-DNS, die zahlreiche Replikationen durchlaufen hatte, wurde der Sequenzanalyse gemäß Beispiel 4 unterworfen, wobei folgendes Ergebnis erzielt wurde:
Nucleotidsequenz eines Strangs von HGH-DNS aus kloniertem pHGH-1. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz von HGH, beginnend an Amino-Ende. Die gezeigte DNS-Sequenz stimmt überein mit der mRNS-Sequenz für HGH, abgesehen davon, daß in der mRNS T durch U ersetzt ist.
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1. 10. 1980 57 942 11
22 A3 7 4 - & -
Die vorliegende Erfindung liefert erstmalig ein allgemein anwendbares Verfahren zum Reinigen spezifischer Nucleotidsequenzen. Diese Sequenzen können in Beziehung gesetzt werden zur Produktion eines speziellen Proteins von technischer oder medizinischer Bedeutung. Das Verfahren führt zu gereinigten Nucleotidsequenzen, die Fragmente größerer Sequenzen sein können, welche das gewünschte Protein codieren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Kombination mit bekannten Hilfsverfahren zur Erzeugung der gesamten, ein spezielles Protein codierenden Nucleotidsequenz angewandt werden.
Die Erfindung erlaubt auch die Hochreinigung einer Nucleotidsequenz spezieller Länge und beliebiger Herkunft. Ferner wird ein Verfahren zum Messen des Reinheitsgrades derartiger Fragmente offenbart. Erfindungsgemäß wurde eine einen Teil von menschlichem HCS codierende Nucleotidsequenz isoliert, deren Reinheit mindestens 99 % betrug.
Es wurden Transfer-Vektoren synthetisiert, die den Hauptanteil der HCS bzw* HGH codierenden Nucleotidsequenz enthielten. Ferner wurden neue Stämme von Mikroorganismen erzeugt, die die genannten Gene und Teile von Genen enthalten. Die Nucleotidsequenzen wurden nach zahlreichen Replikationen im Wirtsorganismus erneut isoliert, und es wurde gefunden, daß ihre Nucleotidsequenz im wesentlichen identisch war mit der im Ausgangsorganismus vorliegenden Sequenz.
Auf der Grundlage des genetischen Codes gibt es eine endliche Anordnung von Nucleotidsequenzen, die eine vorgegebene Aminosäuresequenz codieren. All diese äquivalenten Nucleotidsequenzen sind brauchbare Varianten der offen-
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harten Sequenzen, da sie alle zum gleichen Proteinhormon mit der gleichen Aminosäuresequenz im Verlauf der Transcription und Translation in vivo führen· Folglich sind alle derartigen Varianten vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Der hier beschriebene Mikroorganismus E. coli HCS X-1776 wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 31391 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus trägt eine DNS-Sequenz, die den Hauptteil von menschlichem HCS codiert. Die DNS-Sequenz wird von einem Plasmid getragen, das ebenfalls bei der ATCC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer 40002 besitzt.
- 54 -
Claims (3)
1. Verfahren zur Reinigung linearer DNS spezifischer Nucleotidsequenz, die eine Restriktionsstelle enthält, ausgehend von einer erhaltenen Population von DNS-Molekülen mit im wesentlichen homogener Länge, gekennzeichnet dadurch, daß man
(a) die DNS vorbehandelt zwecks Entfernung aller 5'-Phosphat-Endgruppen,
(b) die DNS mit einer Restriktions-Endonucleae inkubiert, die zur Einwirkung auf die Nucleotidsequenz unter Bildung von zwei linearen Unterfragmenten befähigt ist,
(c) die Unterfragmente aufgrund ihrer Länge fraktioniert,
(d) die beiden Unterfragmente isoliert,
(e ) die Unterfrsgmente in einer durch DNS-Ligase katalysierten Reaktion covalent erneut verknüpft unter Wiederherstellung der ursprünglichen Sequenz und
(f) die vviederverknüpften DNS-Moleküle aufgrund ihrer Länge fraktioniert.
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Erfindungsanspruch
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Entfernung der 5'-Phosphatgruppen alkalische Phosphate verwendet. % '
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Fraktionierung aufgrund der Länge durch Gelelektrophorese erfolgt.
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