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Die
Erfindung betrifft einen Fluoreszenzmarker und dessen Verwendung.
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Das
aus Bacillus subtilis stammende Gen ytvA wurde im Rahmen der kompletten
Genomsequenzierung identifiziert und als unbekanntes Protein mit Ähnlichkeit
zu Proteinkinasen klassifiziert (Kunst et al. 1997, SubtiList http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/).
In einer von Akbar et al. (2001) durchgeführten Studie wurde das Genom
von B. subtilis auf mögliche
unbekannte Faktoren in der σB-Regulationskaskade untersucht. Im Verlauf der
Experimente wurde unter anderem das YtvA als positiver Regulator
der σB-abhängigen
Stressantwort auf Salz- und Ethanolstress identifiziert. Allerdings
konnte nicht geklärt
werden, auf welche äußeren Einflüsse das YtvA
konkret anspricht und was seine genaue Funktion innerhalb der Regulationskaskade
der σB-Aktivität
ist. (Akbar et al., 1997; Gaidenko et al., 1999). Schon in dieser
Studie wurde aufgrund spektroskopischer Untersuchungen vermutet,
dass YtvA einen Chromophor in Form von Flavinmononukleotid (FMN)
enthalten könnte. Diese
Vermutung wurde 2002 von Losi et al. bestätigt. Bei einer Datenbankrecherche
nach Proteinen mit Homologien zu den pflanzlichen Phototropinen
konnte der N-terminale Bereich von YtvA als sog. LOV-Domäne (Light,
Oxygen, Voltage) identifiziert werden Losi et al. (2002).
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Bei
den Phototropinen handelt es sich um membrangebundene Kinasen höherer Pflanzen,
die bei Bestrahlung mit blauem (390–500 nm) und UV-A-Licht (320–390 nm)
autophosphorylieren (Briggs et al., 2001). Als Hauptphotorezeptoren
in Pflanzen sind sie verantwortlich für den Phototropismus einer
Pflanze, sowie den Ortswechsel von Chloroplasten und die Öffnung von
Stomata (Christie et al., 1998; Briggs et al., 2001; Briggs & Christie, 2002).
Die Phototropine bestehen aus zwei N-terminalen LOV-Domänen (Light,
Oxygen, Voltage), die als LOV 1 und 2 bezeichnet werden, und weisen
außerdem
ein C-terminales Serin/Threonin-Kinase-Motiv auf (Hanks & Hunter, 1995).
Die beiden LOV-Domänen
binden jeweils ein oxidiertes FMN, das als Chromophor dient (Christie
et al., 1998). Strukturell werden die LOV-Domänen in die Superfamilie der
PAS-Domänen (Per-Arnt-Sim)
eingeordnet, wobei sich der Name PAS auf die Proteine bezieht, in
denen diese Art von Domänen
zuerst entdeckt wurde (Taylor & Zhulin,
1999). Proteine mit einer LOV-Domäne werden
in der Regel durch die Faktoren Licht, Sauerstoff und Spannung (Light,
Oxygen, Voltage) reguliert, wobei sie in Bakterien an verschiedene
Effektordomänen
gekoppelt sein können
(Huala et al., 1997; Crosson et al., 2003; Losi, 2004). Ein weiteres
wichtiges Charakteristikum der LOV-Domänen ist das Durchlaufen eines
licht-induzierten Photozyklus (Salomon et al., 2000; Salomon et
al., 2001).
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Anders
als die Phototropine setzt sich das 261 AS große YtvA aus nur zwei Domänen zusammen:
einer N-terminalen LOV- und einer C-terminalen STAS-Domäne (1).
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Die
LOV-Domäne
zeigt eine hohe Homologie zu den LOV-Domänen
der Phototropine, die wie im Falle der phot1-LOV2 aus A. thaliana
bis zu 86 % betragen kann. Auch für die YtvA-LOV-Domäne konnte
nachgewiesen werden, dass sie ein FMN als Chromophor bindet und
einen Photozyklus durchläuft
wie LOV-Domänen der
Phototropine (Losi et al., 2002). Wie im Strukturmodell der YtvA-LOV-Domäne zu erkennen
ist, liegt die LOV-Consensus-Sequenz
NCRFLQG in der zentralen Helix αA' (2). Das innerhalb dieser Sequenz liegende
C62 (unterstrichen) interagiert während des Licht induzierten
Photozyklus mit dem Cofaktor FMN, der sich innerhalb der LOV-Domäne befindet.
Es entspricht von seiner Position am FMN-Flavin-Ring dem C966 innerhalb
der LOV2 des Photorezeptors Phy3.
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C-terminal
der LOV-Domäne
befindet sich die sog. STAS-Domäne (Sulfat-Transporter-Antisigma-Antagonist)
(Losi et al., 2002). Diese Domänen
befinden sich üblicherweise
am C-Terminus eukaryotischer Sulfat-Transporter, in bakteriellen
Anti-Sigma Faktoren oder den σB-Aktivierungsregulatoren. Ihnen wird im
Allgemeinen eine NTP-Bindungsfunktion zugeschrieben (Aravind & Koonin, 2000).
Von der STAS-Domäne
des YtvA wird vermutet, dass es sich bei ihr um die Effektor-Domäne handeln
könnte,
die für
die Weiterleitung des durch die LOV-Domäne registrierten Lichtreizes
zuständig
ist. Im Gegensatz zu den C-terminalen Bereichen der Phototropine
weist die STAS-Domäne
des YtvA kein Kinase-Motiv auf (Losi et al., 2004).
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Bei
der photochemischen Untersuchung des YtvA zeigte sich, dass es einen
Licht induzierten Photozyklus durchläuft, wie es auch bei den homologen
pflanzlichen Phototropinen der Fall ist (Losi et al., 2002; Briggs
et al., 2001). Der unbelichtete Grundzustand von YtvA zeigt maximale
Absorption von Licht der Wellenlänge
449 nm. Bei Belichtung mit blauem Licht erfolgt die Umwandlung zum
Photoprodukt, wobei der Grundzustand, im Folgenden als YtvA449 bezeichnet, ausbleicht. Einhergehend
mit dem Zerfall des YtvA449 wird in weniger
als 20 ns das Photoprodukt mit maximaler Absorption bei 650 nm gebildet
(YtvA650), das spektroskopisch dem angeregten
Triplettzustand des FMN ähnelt
(Losi et al., 2002; Swartz et al., 2001; Kottke et al., 2003). Ein
wichtiges Indiz ist das Auftreten einer Fluoreszenz mit Maxima bei
496 und 523 nm auf (3).
Das rot verschobene YtvA650 weicht nach
1, 6 μs
dem Zwischenprodukt YtvA383, das auch als
Thio383 bezeichnet wird, einhergehend mit
einem Verlust der Fluoreszenz (Losi et al., 2002).
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Man
geht davon aus, dass bei Thio383 das FMN
kovalent an das YtvA gebunden vorliegt, wie es bei den LOV-Domänen der
Phototropine der Fall ist. Diese Bindung entsteht zwischen dem C4a-Kohlenstoff
des FMN-Flavinringes und der Thiolgruppe des konservierten Cystein
(2b)(Losi et al., 2002; Salomon et
al., 2001; Salomon et al., 2000). Vom Zwischenprodukt Thio383 kehrt das YtvA verhältnismäßig langsam (2600 s) in den
Grundzustand (YtvA449) zurück. Eine Übersicht über den
Photozyklus des YtvA ist in 4 schematisch dargestellt.
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In
vivo Fluoreszenzreporter, wie das green fluorescent protein (GFP),
finden in vielen Bereichen der Grundlagenforschung und Biotechnologie
eine breite Anwendung: So werden fluoreszierende Proteine zur Untersuchung
von genregulatorischen Mechanismen (Zimmer M. (2002) Green fluorescent
protein (GFP): application, structure, and related photophysical
behaviour. Chem. Rev 102: 759–781)
oder zur Überwachung
von biotechnologischen Prozessen eingesetzt (March, J.C., Rao, G. & Bentley, W.E.
(2003) Biotechnological applications of green fluorescent protein.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 303–315). Rekombinante Fusionsproteine
mit Fluoreszenzreportern können
für die
Untersuchung von zellulären
Differenzierungsprozessen und zur Lokalisation des jeweiligen Zielproteins
in der Zelle verwendet werden (Thomas, J.D., Daniel, R.A., Errington, J. & Robinson C. (2001)
Export of active green fluorescent protein to the periplasm by the
twin-arginine translocase (Tat) pathway in Escherichia coli. Mol.
Microbiol. 39: 47–53)
oder dienen zur Überprüfung von
Faltungsprozessen heterologer Proteine in bakteriellen Expressionsstämmen (Waldo,
G.S., Standish, B.M., Berendzen, J. & Terwilliger T.C (1999) Rapid protein-folding
assay using green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 17: 691–638). Trotz
der vielseitigen Einsatzmöglichkeiten
ist die Verwendung des GFP sowie sämtlicher Farbvarianten (z.B.
YFP, yellow fluorescent protein) unter anaeroben Bedingungen nur
sehr eingeschränkt
bzw. gar nicht möglich,
da für
die autokatalytische Synthese des Fluorophors, das u. a. durch die
Dehydrogenierung der α-, β-Bindung
des Tyrosin-Rests 66 gebildet wird, Sauerstoff essentiell ist.
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Somit
kann GFP und dessen Farbvarianten in obligat anaeroben Organismen
nicht eingesetzt werden.
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung einen Fluoreszenzmarker zur Verfügung zu
stellen, welcher in der Analytik eingesetzt werden kann. Weiterhin
sollen Verwendungen für
diesen Fluoreszenzmarker zur Verfügung gestellt werden und ein
Herstellungsverfahren für
den Fluoreszenzmarker.
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Überraschenderweise
wird die Aufgabe dadurch gelöst,
dass ein Protein der Familie der LOV-Proteine zur Verfügung gestellt
wird, bei dem mindestens ein Cystein in der LOV-Domäne durch
eine Aminosäure
ersetzt wird, wodurch kein FMN kovalent bindet, wenn das Protein
zur Fluoreszenz angeregt wird. Die Aufgabe wird auch durch die Bereitstellung
der LOV-Domänen
dieses Proteins gelöst,
bei welchem mindestens ein Cystein durch eine Aminosäure ersetzt
ist, an die kein FMN kovalent bindet, wenn die LOV-Domäne zur Fluoreszenz
angeregt wird.
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Von
der Erfindung sind sowohl die erfindungsgemäßen Proteine, YtvA C62A, LOV-Domänen, LOV C62A
sowie Proteine der LOV-Familie umfasst, welche FMN nicht kovalent
gebunden enthalten, als auch nebengeordnet, die reinen genannten
Proteine bzw. zugehörigen
Sequenzen ohne FMN. Wenn YtvA, YtvA C62A, LOV-Domänen, LOV
C62A sowie Proteine der LOV-Familie im Zusammenhang mit der Fluoreszenz
offenbart wird, ist in der Beschreibung damit jedoch immer das FMN
tragende Molekül
gemeint.
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Vorzugsweise
wird das Cystein durch einen Alaninbaustein ersetzt, jedoch ist
auch jede andere Aminosäure
geeignet, an welche kein FMN bindet. Vorzugsweise hat die Aminosäure keine
SH-Gruppe.
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Vorzugsweise
wird das Cystein in Position 4 der Konsensussequenz der entsprechenden
LOV-Domäne
durch eine Aminosäure,
vorzugsweise Alanin, ersetzt, an welche kein FMN bindet. Unter Konsensussequenz
ist die Aminosäurefolge
GXNCRFLQ zu verstehen, in der X eine beliebige Aminosäure bedeutet.
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Vorzugsweise
wird ein LOV-Protein aus einem Organismus aus Tabelle 1 oder Bacillus
subtilis eingesetzt.
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Insbesondere
wird die Aufgabe durch die Bereitstellung der Proteine und deren
DNA-Sequenzen gemäß den Sequenzen,
Seq.
Nr. 1: YtvA C62A aus Bacillus subtilis
Seq. Nr. 2: Teilbereich
der Aminosäuren
1 bis 137 aus YtvA C62A aus Bacillus subtilis = LOV-Domäne,
Seq.
Nr. 3: DNA-Sequenzenz zugehörig
zu Seq. Nr 1 aus Bacillus subtilis,
Seq. Nr. 4: DNA-Sequenzenz
zugehörig
zu Seq. Nr 2 aus Bacillus subtilis,
Seq. Nr. 5: DNA-Sequenzenz
zugehörig
zu Seq. Nr 2 angepasst an den Codon-Gebrauch von Rhodobacter capsulatus,
abgeleitet aus Seq. Nr.4,
Seq. Nr.11: DNA-Sequenz zugehörig zu Seq.
Nr. 12 aus Pseudomonas putida für
das Protein Q88E39, Sensory Box Protein 1 (SB1 C53A),
Seq.
Nr. 12: Protein aus Pseudomonas putida aus Seq. Nr. 11 (Q88E39),
Seq.
Nr. 13: DNA-Sequenz zugehörig
zu Seq. Nr. 14 aus Preudomonas putida für das Protein Q88JB0, Sensory
Box Protein (SB2 C53A),
Seq. Nr. 14: Protein aus Pseudomonas
putida aus Seq. Nr. 13,
gelöst,
die Beispiele für
erfindungsgemäße Proteine
und die für
sie kodierenden DNA-Sequenzen darstellen.
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Für die Sequenzen
12 und 14 sind LOV-Domäne
und LOV-Protein
identisch.
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Folgende
Sequenzen wurden am 20.06.2005 bei der DSMZ, Mascheroder Weg 1B
in 38124 Braunschweig hinterlegt:
- – E. coli
DH5α (pYtvA-LOVRC) entsprechend Seq. Nr. 6, Hinterlegungsnummer:
DSM 17388.
- – E.
coli DH5α (pUytvA)
entsprechend Seq. Nr 7, Hinterlegungsnummer: DSM 17389.
- – E.
coli DH5α (pUytvA-lipA)
entsprechend Seq. Nr. 8, Hinterlegungsnummer: DSM 17390.
- – E.
coli DH5α (pLOV)
entsprechend Seq. Nr. 9, Hinterlegungsnummer: DSM 17391.
- – E.
coli DH5α (pLOV-Cut)
entsprechend Seq. Nr. 10, Hinterlegungsnummer: DSM 17392.
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Weiterhin
können
in folgenden Proteinen mindestens ein Cysteinbaustein durch eine
Aminosäure
ersetzt werden, welche kein FMN kovalent binden.
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Diese
sind beispielhaft in Tabelle 1 angegeben. Hierbei wird ebenso vorzugsweise
eine Ersetzung in Position 4 der Konsensussequenz GXNCRFLQ vorgenommen.
Vorzugsweise wird Cystein durch eine Animosäure ersetzt, welche keine SH-Gruppe
beinhaltet, besonders bevorzugt durch Alanin.
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Von
der Erfindung sind alle FMN-tragenden Photorezeptoren, insbesondere
die nach Sequenz Nr. 1, 2, 12 und 14 sowie die erfindungsgemäß modifizierten
Proteine nach Tabelle 1, die so modifiziert sind, dass FMN nicht
kovalent gebunden wird und deren Verwendung als Fluoreszenzmarker
umfasst.
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Von
der Erfindung sind auch alle Varianten umfasst, welche aus Mutationen
der für
die LOV-Domäne oder
LOV-Proteine kodierenden
Gensequenzen und daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen hervorgehen. Diese
sind beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsvarianten
oder Fusionsgene.
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Die
angeführten,
beispielhaften Proteine zeigen gegenüber der Wildform eine um den
Faktor 1,75 erhöhte
Fluoreszenzquantenausbeute, so dass sie optimal als
- – in
vivo und in vitro Marker für
Untersuchungen zur Genregulation, Proteinfaltung, Lokalisation von
Proteinen, Protein-Protein-Interaktion etc.,
- – Marker
zur Überwachung
von biotechnologischen Prozessen und Produktionsverfahren,
- – Marker
für diagnostische
Untersuchungen in der medizinischen Forschung und Anwendung,
eingesetzt
werden können.
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Dies
gilt insbesondere für
die Verwendung von YtvAC62A und YtvAC62A-LOV als Fluoreszenzmarker.
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Gegenstand
der Erfindung sind auch Vektoren, wie Plasmide sowie Chromosomen,
welche die entsprechenden Sequenzen der LOV-Domäne eines LOV-Proteins oder
die Sequenz des LOV-Proteins selber tragen.
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Beispielhaft
können
hier die Sequenzen folgender Plasmide angeführt werden:
pYtvA-LOVRc entsprechend Seq. Nr. 6,
pUytvA entsprechend
Seq. Nr. 7,
pUytvA-lipA entsprechend Seq. Nr. 8,
pLOV
entsprechend Seq. Nr. 9,
pLOV-Cut entsprechend Seq. Nr. 10.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine
und DNA-Sequenzen können
in Organismen verwendet bzw. exprimiert werden. Diese sind beispielhaft
aber nicht beschränkend
Bakterien, wie z.B. Escherichia coli, Rhodobacter capsulatus oder
Pseudomonas putida.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine
können
für verschiedene
biologische und medizinische Anwendungen eingesetzt werden.
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Beispielhaft
aber nicht beschränkend
können
folgende Verwendungen angegeben werden.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine
können
als Fluoreszenzreporter in aeroben und überraschenderweise auch in
anaeroben Systemen eingesetzt werden.
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Bei
diesen Systemen kann es sich um Zellen, beispielsweise fakultativ
oder strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Rhodobacter capsulatus oder
Lösungen,
welche frei von O2 sind handeln.
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Diese
Verwendung als Fluoreszenzreporter in anaeroben Systemen ist von
besonderem Vorteil, da die Bildung des Fluorophors unabhängig von
Sauerstoff erfolgt und nach dem Stand der Technik bisher mit keinen anderen
Fluoreszenzreportern möglich
gewesen ist.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine
können
auch als Markerproteine für
Klonierungsarbeiten eingesetzt werden.
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Diese
sind beispielhaft Klonierungen beliebiger DNA-Fragmente in Vektoren mit YtvA C62A
als Klonierungsmarker wie z.B. DNA-Fragmente aus Metagenomen.
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Eine
weitere Anwendung für
die erfindungsgemäßen Proteine
ist die Verwendung als Fluoreszenzmarker für die Zellsortierung, insbesondere
mittels FACS.
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Weiterhin
ist es möglich,
die erfindungsgemäßen Proteine
in der Medizin, beispielsweise für
- – Echtzeitanalyse/Diagnostik
in der Krebsforschung (z.B. Tumorangiogenese),
- – Fluoreszenzmarker
für Gentherapie,
- – Marker
für Stammzellforschung
einzusetzen.
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Die
Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine,
welches folgende Schritte umfasst:
- 1. Identifizieren
von Proteinen aus der Klasse, welche eine LOV-Domäne enthalten
mittels Sequenzvergleich in Datenbanken.
- 2. Identifizieren des Cysteins innerhalb der LOV-Domäne, welches
FMN bindet und somit ausgetauscht werden soll.
- 3. Austausch des Cysteins, welches FMN bindet durch eine Aminosäure, die
kein FMN bindet.
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Das
relevante Cystein gemäß Punkt
2 kann mit Hilfe von Aminosäuresequenzvergleichen
identifiziert werden. Dabei werden mit handelsüblichen Programmen die Sequenzbereiche
innerhalb eines LOV-Proteins computergestützt identifiziert, die für die Koordination
und Bindung des FMN notwendig sind. Dies geschieht durch Vergleiche
mit bereits bekannten Proteinen aus der LOV-Familie, wie z.B. YtvA.
Das Cystein befindet sich immer an der Position 4 innerhalb der
definierten Konsensussequenz GXNCRFLQ. Diese wurde anhand der Aminosäuresequenzen
aller bislang bekannten LOV-Proteine (siehe Tab. 1) abgeleitet und
kann geringfügig
variieren. Die Variation kann innerhalb 85 %-Ähnlichkeit liegen. Der Austausch
des Cysteins durch eine andere Aminosäure erfolgt mittels gängiger Methoden
zur ortsgerichteten Mutagenese. Es ist auch möglich andere Cysteine innerhalb
der LOV-Domäne gegen
eine andere Aminosäure
auszutauschen, welche kein FMN bindet, um die erfindungsgemäße Wirkung
zu erzielen.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
können
auch Fluoreszenzmarker, ausgehend von LOV-Proteinen Q88E39 und Q88JB0,
aus Pseudomonas putida hergestellt werden. Die zugehörigen Sequenzen
sind in den Sequenzprotokollen 11 bis 14 angegeben.
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In
den Figuren sind die Versuchsergebnisse sowie Abbildungen nach dem
Stand der Technik dargestellt, auf die in der Beschreibung Bezug
genommen wird.
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Es
zeigt:
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1 Schematischer
Aufbau des potentiellen Blaulichtrezeptors YtvA aus B. subtilis.
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2 Modelle
der LOV-Domäne
des YtvA aus B. subtilis.
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3 Spektren
der Absorption (links) und Fluoreszenz (rechts) des YtvA.
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4 Photozyklus
des YtvA.
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5 Fluoreszenzspektren
von Wildtyp-YtvA und von YtvA C62A (A) sowie Ausstriche von YtvA-
und YtvA C62A exprimierenden Stämmen
(B).
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6 Das
phototrophe Bakterium Rhodobacter capsulatus.
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7 Schematische
Darstellung der erzeugten YFP- und
YtvA C62A -Transkriptionsfusionen.
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8 Schematische
Darstellung der Klonierungsstrategie zur Konstruktion der PaphII- und PT7-abhängigen YFP-Expressionsvektoren.
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9 Schematische
Darstellung der Klonierungsstrategie zur Konstruktion der PaphII- und PT7-abhängigen YtvA
C62A-Expressionsvektoren.
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10 PaphII und PT7-abhängige Expression
von YFP in E. coli.
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11 PaphII und PT7-abhängige Expression
von YtvA C62A in E. coli.
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12 Einfluss
von Sauerstoff auf die Synthese und Fluoreszenz von YFP in R. capsulatus.
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13 Schema
zur Klonierung des lipA-Fragmentes aus pET22lipA in den pUytvA.
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14 Fotos
der ausgestrichenen Transformanten unter Blaulicht (A) und auf Tributyrin-Agar
(B).
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15 Schema
zur Herstellung des Vektors pLOV aus pRC-ytvA1.II.
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16 Fluoreszenzspektren
von Ganzzell-Suspensionen der Kulturen JG 4000 und 4001.
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17 SDS-PAGE
der Zellextrakte von JG 4000 und 4001 nach 3 h Expression.
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18 Schematische
Darstellung zur Klonierung der Cutinase in den Vektor pLOV.
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19 Ausstriche
der Kulturen JG 4001 (pLOV) und JG 4002 (pLOV-cut) auf LB-Agar (A)
und LB-Tributyrin-Agar
(B).
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1 zeigt
den schematischen Aufbau des potentiellen Blaulichtrezeptors YtvA
aus Bacillus subtilis nach dem Stand der Technik. Das Protein besteht
insgesamt aus 261 AS und weist zwei Domänen auf, die N-terminale LOV-Domäne, die
C-terminal gelegene STAS-Domäne.
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In 2A ist
ein Modell der LOV-Domäne
des YtvA aus Bacillus subtilis dargestellt. Die in der LOV-Domäne befindliche αHelices,
die das FMN umschließen,
sind mit αA, αA', αB und αC bezeichnet.
Im Zentrum der Domäne
ist der Cofaktor FMN hervorgehoben. Das mit dem FMN interagierende
Cystein 62, das sich in der zentralen α-Helix αA' befindet, ist mit einem Pfeil markiert
hervorgehoben (Modifiziert nach Losi et al., 2002).
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2B zeigt
die Licht induzierte, reversible Bildung einer kovalenten Bindung
zwischen einem konservierten Cystein der LOV-Domäne und dem Chromophor FMN.
Die Anregung durch Licht führt
möglicherweise
dazu, dass das Flavin den „elektronischen
Status" des Isoalloxazin-Ringes
verändert,
so dass das Cystein durch Protonenabgabe des Stickstoffs an Position
5 den Kohlenstoff an Position 4a des Ringes nukleophil angreifen
kann. Es könnte
aber auch ein anderer Protonendonator involviert sein. Dies ist
sogar wahrscheinlicher, da die Photoreduktion die Elektrophilität des Flavins
herabsetzen und den nukleophilen Angriff des Cysteins unwahrscheinlicher
machen würde
(modifiziert nach Losi et al., 2002).
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3 zeigt
Spektren der Absorption (links) und der Fluoreszenz (rechts) des
YtvA nach dem Stand der Technik. Das Spektrum der Absorption ist
als durchgezogene Linie, das der Fluoreszenz gepunktet dargestellt
Die Fluoreszenz wurde mit Licht der Wellenlänge 450 nm angeregt, die Werte
der Fluoreszenz sind in relativen Einheiten (Arbitrary Units, AU)
angegeben. (modifiziert nach Losi et al., 2002).
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In 4 ist
der Phtotocyclus des YtvA nach dem Stand der Technik dargestellt.
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Nach
Anregung des YtvA449 mit blauem Licht wird
in weniger als 20 ns das Intermediat YtvA650 gebildet, bei
dem sich das FMN im angeregten Triplett-Zustand befindet. Einhergehend
mit einer Abgabe von Lichtquanten wird in weniger als 2 μs das Photoaddukt
YtvA383 (Thio383)
gebildet, bei dem das FMN kovalent an das Cystein 62 gebunden ist.
Die Rückreaktion
zum Grundzustand dauert 2600 s.
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5 zeigt
Fluoreszenzspektren von Wildtyp-YtvA und von YtvA C62A (A) sowie
Ausstriche von YtvA- und YtvA C62A exprimierenden Stämmen (B).
Im Fluoreszenzspektrum sind die Variante YtvA C62A und der Wildtyp
YtvA (YtvA WT) sowie als Kontrolle isoliertes FMN dargestellt. Das
Spektrum des ausgeblichenen YtvA-WT-Photoadduktes Thio383 ist
ebenfalls dargestellt (A). Die Ausstriche verschiedener E. coli-Kulturen
unter Blaulicht zeigen die dauerhafte Fluoreszenz von YtvA C62A
(unten) gegenüber
dem ausbleichenden Wildtyp (rechts) und der nicht fluoreszierenden
Negativkontrolle (links).
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6 zeigt
das phototrophe Bakterium Rhodobacter capsulatus. Unter anaeroben
Wuchsbedingungen bildet R. capsulatus eine intensive Rotfärbung aus,
die sowohl in einzelnen Kolonien (A) als auch in Flüssigkulturen
(B) deutlich zu erkennen ist. Die charakteristische Farbe wird durch
die Synthese verschiedener Photopigmente, die in der Bakterienmembran
eingelagert werden, hervorgerufen.
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7 zeigt
eine schematische Darstellung der erzeugten YFP- und YtvA C62A -Transkriptionsfusionen.
Zur konstitutiven (Sauerstoff-unabhängigen) Expression der Reportergene
wurde der Promotor des Kanamycinresistenzgens (PaphII)
stromaufwärts
des jeweiligen promotorlosen Gens kloniert (a). Der Promotor des Bakteriophagen
T7 erlaubt eine starke Expression der Gene in Gegenwart der spezifischen
RNA-Polymerase (b).
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In 8 wird
eine schematische Darstellung der Klonierungsstrategie zur Konstruktion
der PaphII- und PT7-abhängigen YFP-Expressionsvektoren
gezeigt. RBS: Ribosomenbindestelle.
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9 zeigt
eine schematische Darstellung der Klonierungsstrategie zur Konstruktion
der PaphII- und PT7-abhängigen YtvA
C62A-Expressionsvektoren. RBS: Ribosomenbindestelle.
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10 zeigt
die PaphII- und PT7-abhängige Expression
von YFP in E. coli. Dargestellt ist die relative Fluoreszenz (Fluoreszenzemission/[OD580 × 1ml])
von Zellextrakten der E. coli Expressionsstämme DH5α (pRc-Exp1I-YFP; PaphII > YFP), BL21(DE3) (pRcExp1II-YFP;
PT7 > YFP)
und des Kontrollstamms DH5α (pRc-Exp1I;
Kontrolle). Zur Herstellung der Zellextrakte wurden 1,5 ml der jeweiligen
Kultur zentrifugiert, das Medium dekantiert und das Pellet in 1,5
ml Tris-HCl-Puffer (pH8,0) resuspendiert. Nach Ultraschallbehandlung wurde
der Zellextrakt durch Zentrifugation von Zelltrümmern befreit und 750 μl des löslichen
Proteinextraktes fluoreszenzphotometrisch analysiert.
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11 zeigt
die PaphII- und PT7-abhängige Expression
von YtvA C62A in E. coli. In der Abbildung ist die Fluoreszenz von
Einzelkolonien der E. coli Expressionsstämme DH5α (pRc-Exp1IytvA; PaphII > ytvA) und des Kontrollstamms
DH5α (pRc-Exp1I;
Kontrolle) (A) sowie einzelner Bakterienzellen des Expressionsstamms BL21(DE3)
(pRc-Exp1II-ytvA; PT7 > ytvA) unter induzierenden und nicht induzierenden
Bedingungen (B, C) dargestellt. Die Einzelkolonien wurden bei Anregung
mit Licht der Wellenlänge
365 nm fotografiert (A). Der direkte Vergleich der emittierten Fluoreszenz
bei induzierter YtvA C62A-Synthese
(1 mM IPTG Endkonzentration) (B) und nicht induzierten Expressionsbedingungen
(C) wurde mit Hilfe des konfokalen Laser Scanning Mikroskop bei
63-facher Vergrößerung durchgeführt. Es
wurde jeweils 1 μl
Zellkultur (OD580 = 1) analysiert.
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12 stellt
den Einfluss von Sauerstoff auf die Synthese und Fluoreszenz von
YFP in R. capsulatus dar. (A) Confocal Laser Scanning Mikroskop-Aufnahmen
(63-fache Vergrößerung)
von R. capsulatus B10S (pRc-Exp1IYFP)
nach aerober Anzucht. Es wurde jeweils 1 μl Zellkultur (OD660 =
1) analysiert. (B) Immunologischer Nachweis von YFP in zellfreien
Proteinextrakten und Bestimmung der YFP-vermittelten Fluoreszenz. Der
Expressionsstamm R. capsulatus B10S (pRc-Exp1IYFP; aphII > YFP) wurde unter aeroben
(+ O2) and anaeroben Bedingungen (–O2) angezogen. Anschließend wurde die YFP-Synthese
mittels Western Blot-Analysen unter Verwendung eines spezifischen
YFP Antikörpers
der Fa. Clontech nachgewiesen.
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Als
Negativkontrolle diente der Stamm R. capsulatus B10S (pRc-Exp1I).
Der E. coli Expressionsstamm DH5α (pRc-Exp1IYFP;
aphII > YFP) wurde
als Positivkontrolle verwendet. Die relativen Fluoreszenzemissionen
in den Ganzzellextrakten und ganzen Zellen wurde bei einer Wellenlänge von
528,5 nm gemessen.
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13 zeigt
ein Schema zur Klonierung des lipA-Fragmentes aus pET22lipA in den pUytvA.
Das lipA-Gen wurde über
die Schnittstellen XbaI und XhoI aus dem pET22lipA herausgeschnitten
und in den entsprechend hydrolysierten Vektor pUytvA kloniert. Das
daraus resultierende Plasmid pUytvA-lipA wurde in E. coli XL1-Blue transformiert.
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14 zeigt
Fotos der ausgestrichenen Transformanten unter Blaulicht (A) und
auf Tributyrin-Agar (B). Auf beiden Platten wurden die gleichen
12 Kolonien ausgestrichen; die nicht fluoreszierende, lipolytische Aktivität zeigende
Kolonie ist auf beiden Bildern mit einem Pfeil markiert.
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In 15 ist
ein Schema zur Herstellung des Vektors pLOV aus pRC-ytvA1.II dargestellt.
Der pRC-ytvA1.II wurde mit XhoI geschnitten und selbstligiert, so
dass die verbleibende LOV-Domäne
des YtvA C62A unter der Kontrolle des T7-Promotors stand. Der resultierende
Vektor pYtvA C62A-LOV wurde in E. coli BL21 transformiert.
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16 zeigt
die Fluoreszenzspektren von Ganzzell-Suspensionen der Kulturen JG 4000 und
4001. Die Proben wurden mit Licht der Wellenlänge 450 nm angeregt. Fluoreszenzintensitäten werden
in relativen Einheiten (Arbitrary Units, AU) angegeben, Fluoreszenzwellenlängen in
nm.
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17 zeigt
die SDS-PAGE der Zellextrakte von JG 4000 und 4001 nach 3 h Expression.
Es wurden im Fall der beiden Zellextrakt-Proben jeweils eine O.D.580 = 0,15 entsprechende Menge Zellen in
SDS-Probenpuffer aufgenommen und auf das Gel aufgetragen. Das überexprimierte
YtvA C62A bzw. die YtvA C62A-LOV-Domäne sind rechts im Bild mit
einem Pfeil markiert.
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18 zeigt
eine schematische Darstellung zur Klonierung der Cutinase in den
Vektor pLOV. Das Fragment wurde über
die Schnittstellen NdeI und XhoI in den entsprechend hydrolysierten
Vektor pLOV kloniert, wobei das im pLOV vorhandene ytvA-STAS-Fragment
aus dem Vektor entfernt wird. Dies bewirkt einen totalen Verlust
der Fluoreszenz.
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19 zeigt
Ausstriche der Kulturen JG 4001 (pLOV) und JG 4002 (pLOV-cut) auf
LB-Agar (A) und LB-Tributyrin-Agar
(B). Bei den auf LB-Agar (A) ausgestrichenen Kolonien ist bei der
Anregung durch Blaulicht deutlich zu sehen, dass die den leeren
pLOV enthaltende Kultur JG 4001 im Gegensatz zu JG 4002 deutlich fluoresziert.
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Der
Ausstrich der Cutinase-exprimierenden Kultur JG 4002 bildet auf
LB-Tributyrin-Agar (B) im Gegensatz zu JG 4001 einen deutlichen
Hof, der auf eine lipolytische Aktivität der Cutinase schließen lässt.
-
Beispielhafter
Gegenstand der Erfindung ist die fluoreszierende Variante C62A des
Bacillus subtilis Proteins YtvA C62A im Folgenden als Seq. Nr. 1
bezeichnet und YtvA C62A-LOV im Folgenden als Seq. Nr. 2 bezeichnet
sowie Teile hiervon. Beide Proteine können vielfältig als molekularbiologische
Fluoreszenz-Marker eingesetzt werden. Im Besonderen können YtvA
C62A, YtvA C62A-LOV und Derivate hiervon als in vivo Fluoreszenzmarker
unter Ausschluss von Sauerstoff, also unter anaeroben Kulturbedingungen
genutzt werden, wozu bisher beschriebene Fluoreszenzproteine nicht
geeignet sind. Als weiteres Einsatzfeld in der Molekularbiologie
können
YtvA C62A, YtvA C62A-LOV und deren Derivate und/oder Strukturen,
in denen YtvA C62A und/oder YtvA C62A-LOV enthalten sind, als in
vivo Marker zur effizienten Detektion erfolgreicher Klonierungsexperimente
genutzt werden. Im Besonderen können
die Proteine im Ultra-Hochdurchsatz-Screening von Genom-, Metagenom- sowie Mutantenbibliotheken
mittels FACS eingesetzt werden.
-
Experimenteller Teil:
-
1) Konstruktion des YtvA-basierten
Fluoreszenzmarkers YtvA C62A
-
Die
kovalente Bindung des konservierten Cystein-Rests an das C4a des
FMN-Cofaktors spielt im Photozyklus der LOV-Domänen eine wichtige Rolle. So
konnte bereits von Salomon et al. (2000) gezeigt werden, dass eine
Mutation dieses Cysteins in den LOV-Domänen des Phototropins aus Avena
sativa zu einem Verlust der photochemischen Reaktivität führt.
-
Im
Falle von YtvA wurde der konservierte Cystein-Rest (C62) zielgerichtet
durch ein Alanin ersetzt. Die so entstandene YtvA-Variante C62A,
im Folgenden als YtvA C62A bezeichnet, zeigte neben der erwarteten Blockierung
des Photozyklus zwei weitere interessante Eigenschaften. Zum einen
war die Fluoreszenzlebensdauer von YtvA C62A drastisch erhöht, so dass
bei Bestrahlung mit Blaulicht dauerhafte Fluoreszenz, ohne Ausbleichen
verzeichnet werden konnte. Darüber
hinaus war auch die Quantenausbeute der Variante (YtvA C62A) gegenüber dem
Wildtyp, wie in 5 dargestellt, deutlich erhöht.
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2) Verwendung von YtvA
C62A als in vivo Fluoreszenzreporter in anaeroben Bakterien
-
Beschreibung des verwendeten
Testsystems
-
Um
untersuchen zu können,
ob das fluoreszierende Protein YtvA C62A als in vivo Reporterprotein auch
in Sauerstoff-limitierten Systemen eingesetzt werden kann, wurde
ein Expressionssystem für
das fakultativ anaerobe Bakterium Rhodobacter capsulatus entwickelt,
welches die Expression von YtvA C62A und YFP sowohl unter anaeroben
(–O2) als auch aeroben Bedingungen (+O2) erlaubt:
-
1) Der Expressionsstamm
Rhodobacter capsulatus
-
R.
capsulatus ist ein photosynthetisches Bakterium aus der Gruppe der α-Proteobakterien,
welches in der Lage ist, unter einer Vielzahl unterschiedlicher
Umweltbedingungen zu leben. Neben dem phototrophen Wachstum (anaerob
mit Licht als Energie-Quelle) kann der Organismus auch chemoheterotroph
(aerob mit organischen Verbindungen als Energie-Quelle) wachsen.
Aufgrund der Fähigkeit,
sowohl anaerob als auch aerob wachsen zu können, stellt R. capsulatus
ein ideales Testsystem dar, um in vivo die Fluoreszenzeigenschaften
von YtvA C62A und YFP in Abhängigkeit
des Sauerstoffpartialdrucks zu analysieren.
-
2) Die rekombinanten Expressionsplasmide
-
Um
eine vergleichbare Syntheserate der beiden in vivo Reporterproteine
unter +O2 und –O2 Bedingungen
zu gewährleisten,
wurden zunächst
verschiedene Expressionsvektoren konstruiert, die eine konstitutive (PaphII-abhängige) und
eine induzierbare (PT7-abhängige) Expression
von YFP und YtvA C62A in R. capsulatus und E. coli erlaubt (7).
-
Die
verschiedenen Expressionsvektoren werden von einem E. coli Donorstamm
mittels Konjugation auf die jeweiligen R. capsulatus Expressionsstämme übertragen.
Die O2-unabhängige Synthese der Fluoreszenzproteine
kann in R. capsulatus mit Hilfe immunologischer Verfahren unter
Zuhilfenahme spezifischer Antikörper
nachgewiesen werden. Die Auswirkungen von Sauerstoff auf die spezifische
Fluoreszenz von YFP und YtvA C62A im Expressionswirt R. capsulatus
kann in vivo in einem konfokalen Lasermikroskop sowie in Extrakten
der löslichen
Zellproteine im Fluoreszenzphotometer bestimmt werden.
-
3) Erzeugung der R. capsulatus
Expressionsplasmide zur heterologen Synthese von YFP
-
Um
YFP für
die Fluoreszenzanalysen in ausreichenden Mengen in R. capsulatus
synthetisieren zu können,
wurden geeignete Expressionsplasmide mit weitem Wirtsspektrum konstruiert
(8). Dazu wurde zunächst das Reportergen YFP in
einer PCR mit spezifischen Primern, die am 5'-Ende des YFP-Gens eine NdeI-Schnittstelle
und am 3'-Ende eine
BamHI-Schnittstelle anfügten,
amplifiziert. Nach der Amplifikation des YFP-Fragments wurde das
DNA-Produkt in die SmaI-Schnittstelle des Sequenziervektors pSVB10
kloniert. Die beiden resultierenden rekombinanten Plasmide pSVB10*IYFP
(YFP in Orientierung I) und pSVB10*IIYFP (YFP in Orientierung II)
wurden isoliert und anschließend
sequenziert. Danach wurde das Reportergen mit NdeI und BamHI aus
dem pSVB10-Derivat herausgeschnitten und in die NdeI- und BamHI-Restriktionsschnittstelle
des Vektors pRc-Exp1I (R. capsulatus PaphII-Expressionsvektor)
bzw. pRc-Exp1II (R. capsulatus PT7-Expressionsvektor)
kloniert. Die erzeugten rekombinanten Plasmiden wurden als pRc-Exp1IYFP
und pRc-Exp1IIYFP bezeichnet.
-
4) Erzeugung der R. capsulatus
Expressionsplasmide zur heterologen Synthese eines YtvA C62A-basierten Reporterproteins
-
Um
die Expression des neuen Fluoreszenzreporterproteins in R. capsulatus
und anderen Bakterien mit einem hohen CG-Gehalt der chromosomalen
DNA zu ermöglichen,
wurde zunächst
der Bereich der YtvA C62A-Sequenz, der für die LOV-Domäne codiert
(Base 1 bis 409 der codierenden Sequenz), an die codon usage des
phototrophen Bakteriums angepasst. Die veränderte Sequenz ist in Seq.
Nr. 5 dargestellt.
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Um
YtvA C62A für
die Fluoreszenzanalysen in R. capsulatus exprimieren zu können, wurde
das Bacillus-Gen, genau wie das Gen YFP, in die Expressionsvektoren
pRc-Exp1I und pRc-Exp1II
umkloniert. Das ytvA C62A Gen wurde dazu mit den Restriktionsendonukleasen
NdeI- und XhoI in die beiden oben genannten R. capsulatus Vektoren
einkloniert (9). Dabei entstanden die Expressionsplasmide
pRc-Exp1IytvA und pRc-Exp1IIytvA, die eine PaphII und
PT7-abhängige
Expression des ytvA-Gens erlauben.
-
Analyse der YFP- und YtvA
C62A -Expression in E. coli:
-
Um
zeigen zu können,
dass die Synthese von YFP und YtvA C62A unter Verwendung der neu
erzeugten Expressionsvektoren möglich
ist, wurden die aphII-Expressionsvektoren pRc-Exp1I-YFP und pRc-Exp1I-ytvA
in den E. coli Stamm DH5α transformiert.
Die Plasmide zur T7-Polymerase abhängigen Expression der Fluoreszenzreportergene
(pRc-Exp1II-YFP
und pRc-Exp1II-ytvA) wurden in den entsprechenden E. coli Expressionsstamm
BL21(DE3) eingebracht. Nach Anzucht der jeweiligen Expressionsstämme und
geeigneter Kontrollstämme
(E. coli DH5α und
BL21 (DE3) mit den Leervektoren pRc-Exp1I und pRc-Exp1II) wurde
die Synthese von YFP und YtvA C62A indirekt über die Fluoreszenz im Fluoreszenzphotometer
(10) oder unter Blaulicht und mit Hilfe des konfokalen
Laserscanning-Mikroskops (11) nachgewiesen.
-
Anhand
der detektierten Fluoreszenzen konnte eindeutig gezeigt werden,
dass sowohl die PaphII-abhängige Expression
(5; PaphII > YFP) als auch die
PT7-abhängige
Expression (5; PT7 > YFP) des Reportergens
zu einer signifikanten Synthese des gelb fluoreszierenden Proteins
in E. coli führt.
Die PaphII- und PT7-abhängige Expression
von YtvA C62A führt
in den entsprechenden E. coli-Expressionsstämmen ebenfalls zu einer eindeutig
detektierbaren Fluoreszenz (11A,
B), wo hingegen in den Kontrollstämmen keine Fluoreszenz nachweisbar
ist (11A, C). In E. coli können somit
die erzeugten Expressionsvektoren pRc-ExpIYFP, pRc-ExpIIYFP, pRc-ExpIytvA und pRc-ExpIIytvA
zur Synthese der in vivo Reporter YFP und YtvA C62A verwendet werden
und sind daher für
die geplanten Expressionsanalysen in R. capsulatus geeignet.
-
Untersuchungen zur Sauerstoff
abhängigen
Synthese und Fluoreszenz des YFP in R. capsulatus:
-
Um
den Einfluss von Sauerstoff auf die Fluoreszenz des Reporterproteins
YFP bestimmen zu können, wurde
zunächst
untersucht, ob der Einsatz von Fluoreszenzreportern in R. capsulatus
grundsätzlich
möglich ist.
Aufgrund der besonderen physiologischen Eigenschaften des phototrophen
Bakteriums ist dabei insbesondere zu berücksichtigen, dass durch die
Ausbildung des Photosynthese-Apparates eine große Menge verschiedener Photopigmente
(Carotinoide und Bakteriochlorophylle) in der Zelle akkumuliert,
die möglicherweise die
Anregung des Reporters bzw. die Detektion der Fluoreszenz verhindern
können.
Dazu wurde der Expressionsvektor pRc-ExpIYFP und ein Kontrollvektor
(pRc-Exp1I) in den R. capsulatus Wildtypstamm B10S transferiert
und anschließend
die YFP-vermittelte Fluoreszenz zunächst im konfokalen Laser Scanning
Mikroskop qualitativ bestimmt. Wie in 12 dargestellt,
führt die
konstitutive (PaphII-abhängige) Expression
des YFP-Gens in R. capsulatus zu einer eindeutig detektierbaren
Fluoreszenzemission.
-
Nachdem
gezeigt werden konnte, dass die Verwendung von in vivo Fluoreszenzreportern
in dem phototrophen Bakterium R. capsulatus grundsätzlich möglich ist,
konnte nun der Fragestellung nachgegangen werden, inwieweit der
Umweltfaktor Sauerstoff das etablierte Testsystem beeinträchtigt.
Dazu wurde der Rhodobacter-Expressionsstamm B10S (pRc-Exp1IYFP),
dessen Plasmid-codiertes YFP-Gen durch den konstitutiven (Sauerstoff
unabhängigen)
aphII-Promoter transkribiert wird, unter anaeroben (–O2) und aeroben (+O2) Bedingungen
angezogen. Anschließend
wurde die Synthese des Fluoreszenzreporterproteins mit Hilfe immunologischer
Verfahren analysiert (12B).
wie erwartet, akkumuliert YFP in R. capsulatus sowohl unter +O2 Bedingungen (12B,
Spur 1) als auch unter –O2 Bedingungen (12B,
Spur 2) in signifikanten Mengen, wohingegen in dem Kontrollstamm
(R. capsulatus B10S mit dem Leervektor pRc-Exp1I) YFP nicht nachgewiesen
werden konnte (12B, Spur 3). Proteinextrakt
des entsprechenden E. coli Expressionsstamms (DH5α + pRc-Exp1IYFP)
diente in diesem Versuch als Positivkontrolle (Spur 4). Mit diesem
Versuch konnte eindeutig gezeigt werden, dass Sauerstoff weder einen
Einfluss auf die Expression des YFP-Gens besitzt, noch die Proteinstabilität des fluoreszierenden
Proteins in dem Expressionswirt R. capsulatus beeinträchtigt.
-
Obwohl
YFP unabhängig
von der O2-Konzentration in signifikanten
Mengen in dem phototrophen Bakterium akkumuliert, konnte ein deutlicher
Einfluss des vorherrschenden Sauerstoffpartialdrucks auf die Fluoreszenz
des Proteins nachgewiesen werden: Fluoreszenzmessungen mit R. capsulatus-Zellextrakten
ergaben, dass YFP, welches in Gegenwart von Sauerstoff in den Zellen
synthetisiert wird, eine dreifach höhere Fluoreszenz aufweist als
YFP, welches bei Abwesenheit von O2 exprimiert
wurde (12B). Dies ist darauf zurückzuführen, dass
Sauerstoff für
die Bildung des Fluorophors essentiell ist. Der beschriebene Einfluss
von Sauerstoff auf die Fluoreszenz des YFP ist sogar noch offensichtlicher,
wenn statt des Zellextraktes unbehandelte Zellen für die Fluoreszenzmessungen
verwendet wurden. In diesem Fall konnte eine um den Faktor 3,5 verminderte
Fluoreszenz unter anaeroben Anzuchtbedingungen verzeichnet werden.
Diese Beobachtung ist darauf zurückzuführen, dass
im Gegensatz zu den eingesetzten Zellen der in vivo Fluoreszenzmessung,
die durch die Ultraschallbehandlung aufgeschlossen Zellen nicht
länger
ein geschlossenes anaerobes System darstellen.
-
YtvA
C62A-LOV kann in R. capsulatus als in vivo Reporter auch unter anaeroben
Bedingungen verwendet werden.
-
Mit
Hilfe von Immunoblot- und Fluoreszenzanalysen konnte nachgewiesen
werden, dass YtvA C62A-LOV sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben
Wuchsbedingungen in signifikanten Mengen in R. capsulatus akkumuliert.
Im Gegensatz zu YFP weist YtvA C62A-LOV auch in Abwesenheit von
Sauerstoff eine hohe Fluoreszenz auf.
-
3) Verwendung von YtvA
C62A als Markerprotein für
Klonierungsarbeiten
-
Die
unter Bestrahlung mit Blaulicht dauerhaft fluoreszierende Variante
des Bacillus subtilis Proteins YtvA, im Folgenden als YtvA C62A
bezeichnet, sollte als Hauptkomponente in einem Selektionssystem
zur Detektion erfolgreicher Klonierungen eingesetzt werden. Im Speziellen
sollte ein neues Verfahren entwickelt werden, um das bisher am häufigsten
genutzte System zur Identifizierung positiver Klone bei Ligationen,
die auf X-Gal-Hydrolyse basierende Methode der Blau-Weiß-Selektion, zu ersetzten.
-
Das
neue System basiert auf der Unterscheidung Leervektor tragender
Klone von Insert tragender Klone durch die Detektion der YtvA C62A-Expression
nach Bestrahlung mit blauem Licht. Hierzu wurde das YtvA C62A-Gen
in den pUC19-Vektor kloniert und auf seine Nutzbarkeit für die Fluoreszenz-Selektion
getestet. Wie in 13 dargestellt, wurde aus dem
Vektor pET22lipA das Gen der B. subtilis Lipase lipA über die Schnittstellen
XbaI und XhoI herausgeschnitten und in den entsprechend hydrolysierten
pUYtvA C62A-Vektor kloniert. Im Fall des hydrolysierten und religierten
pUYtvA C62A-Vektors konnten die Zellen unter Blaulicht als grün fluoreszierende
Kolonien auf der Agarplatte identifiziert werden. Zellen mit dem
Lipase-Insert konnten unter denselben Bedingungen aufgrund des Verlustes
von YtvA C62A nicht fluoreszieren. In 14A ist
dieser Unterschied deutlich zu erkennen. Als Kontrolle wurden dieselben
Klone auf einer Lipase-Indikatorplatte (Tributyrin-Agar) ausgestrichen.
Auch hier konnte der Insert tragende Klon aufgrund seiner lipolytischen
Aktivität identifiziert
werden (14B).
-
Um
die Vermutung, dass es sich bei nicht fluoreszierenden Kolonien
um Transformanten handelt, in deren Plasmide das gewünschte Insert
korrekt einkloniert vorlag, wurden Übernacht-Kulturen von 8 nicht
fluoreszierenden Kolonien hergestellt, aus denen die enthaltene
Plasmid-DNA isoliert
wurde.
-
Durch
Restriktionsanalyse mit den Restriktionsenzymen XbaI und XhoI konnte
bestätigt
werden, dass sämtliche
nicht fluoreszierenden Klone ein Insert der Größe von 0,7 kb aufwiesen, was
der Größe des klonierten
lipA-Fragmentes
entspricht.
-
4) Verwendung von YtvA
C62A als Fluoreszenzmarker für
Zellsortierung mittels Fluorescens activated cell sorting (FACS)
-
Einsatz
in der Herstellung von großen
Mutantenbibliotheken in der gerichteten Evolution oder Genbanken
durch effizientes vorselektieren der Ligationsansätze auf
Insert tragende Zellen durch FACS, wobei das aufwendige Ausplattieren
der Zellen mit anschließender
Blau-Weiß-Selektion
wegfällt.
-
Da
sich die Fluoreszenz-Selektion im Vektor pUytvA als Erfolg versprechend
erwiesen hatte, wurde im Folgenden auch ein Konzept entwickelt,
das die Fluoreszenz-Selektion
in einem pET22b-basierten System erlauben sollte. Als Vorteil eines
pET-basierten Systems wurden dabei die wesentlich höheren Expressionsrate im
Vergleich zum pUC-System gesehen. Es wurde daher angenommen, dass
sich die Vorteile einer zuverlässigen
Klonierungs-Selektion mit denen einer hohen Expressionsrate verbinden
lassen könnten.
-
Als
pET-basierter, YtvA C62A-enthaltender Vektor wurde der pRC-ytvA1.II
ausgewählt.
Bei diesem Plasmid handelt es sich um einen Broadrange-Vektor für alle Proteobakterien.
-
Der
pRC-ytvA1.II enthält
dabei als Selektionsmarker die Resistenzen gegen Chloramphenicol
und Kanamycin, eine der Plasmid-Mobilisierung dienende MOB-Region,
zwei Replikationsursprünge
und das über NdeI
und BamHI klonierte ytvA-Gen, welches unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren
T7-Promotors steht. Das MOB-Gen, ein Replikationsursprung und die
Cm-Resistenz stammen hierbei aus dem pBBR1MCS (Kanter-Smoler et al., 1994),
der T7-Promotor und der zweite Replikationsursprung aus dem pET22b.
-
Wie
in 15 dargestellt ist, wurde in einem ersten Schritt
der für
die STAS-Domäne
codierende Teil des YtvA C62A aus dem Plasmid über die Restriktionsschnittstelle
XhoI herausgeschnitten und dieses anschließend selbstligiert, weil erwartet
wurde, dass auch die isolierte YtvA C62A LOV-Domäne eine ausreichend hohe Fluoreszenzintensität aufweist,
die eine Identifikation von negativen Klonen ermöglicht. Eine Expression des
verkürzten
Proteins könnte
sich dabei aufgrund des niedrigeren Aminosäure- und Energiebedarfs als
vorteilhaft für
die Zellen erweisen und letztendlich in einer erhöhten Expressionsrate
resultieren.
-
Das
durch XhoI-Restriktion und Selbstligation entstandene Plasmid wurde
im Folgenden als pYtvA C62A-LOV bezeichnet und, wie auch der ursprüngliche
pRC-ytvA1.II, in E. coli BL21 (DE3) transformiert. Die erhaltenen
Stämme
wurden als JG 4000 (pRC-ytvA1.II) und JG 4001 (pYtvA C62A-LOV) bezeichnet.
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Die isolierte LOV-Domäne YtvA
C62A-LOV fluoresziert:
-
Um
Fluoreszenz- und Expressionsverhalten der isolierten YtvA C62A-LOV-Domäne im Vergleich
zum Volllängen
YtvA C62A zu untersuchen, wurden die Stämme JG 4000 (pRC-ytvA1.II) und JG
4001 (pYtvA C62A-LOV) in 25 ml LB-Medium unter entsprechendem Selektionsdruck
bis zum Erreichen der exponentiellen Wuchsphase inkubiert. Anschließend erfolgte
die Induktion mit 0,4 mM IPTG. Für
die fluorimetrische Messung von Ganzzell-Suspensionen wurden O.D.450 = 0,1 entsprechende Suspensionen in PBS-Puffer
erstellt. Von diesen wurden bei einer Excitations-Wellenlänge von
450 nm Emissions-Spektren im Bereich von 480 bis 540 nm aufgenommen.
Diese sind in 16 dargestellt.
-
Die
Fluoreszenzintensität
der Zell-Suspension von JG 4001 ist geringfügig höher als die der Zellsuspension
von JG 4000; der Unterschied beträgt maximal 1 AU. Das Maximum
der Fluoreszenz liegt in beiden Fällen bei 495 nm.
-
Um
die Expression des YtvA C62A bzw. der isolierten YtvA C62A-LOV-Domäne zu überprüfen, wurde den
beiden Kulturen JG 4000 und 4001 nach 3h Expression zusätzlich zu
den für
die Fluoreszenzmessung verwendeten Proben Volumina entnommen, die
einer O.D.580 von 0,15 entsprachen. Die
Zellen wurden durch Zentrifugation vom Überstand getrennt, in 15 μl SDS-Probenpuffer
aufgenommen und aufgekocht. Anschließend erfolgte die Auftrennung
der Proben auf einem 12,5 %-SDS-Gel, das in 17 dargestellt
ist.
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Im
Fall des Zellextraktes des Stamme JG 4001 (pLOV) konnte eine deutliche Überexpressionsbande bei
14 kDa beobachtet werden, beim Zellextrakt von JG 4000 (pRC-ytvA1.II)
lag eine ähnlich
starke Bande bei 30 kDa (17).
-
Nutzung des pLOV als Klonierungssystem:
-
Nachdem
gezeigt werden konnte, dass die isolierte LOV-Domäne des YtvA
eine fast unveränderte
Fluoreszenz aufweist, musste überprüft werden,
ob der pLOV sich als kombinierter Klonierungs- und Expressionsvektor
eignet. Zu diesem Zweck wurde die DNA-Sequenz des extrazellulären, lipolytischen
Enzyms Cutinase aus Fusarium solani pisi amplifiziert (Egmont & de Vlieg, 2000).
Als Matrizen diente der Vektor pMA5(–)-Cut. Als Startermoleküle wurden
die Oligonukleotide Cut-Up und Cut-Down genutzt. Der Upstream-Primer
wurde so gewählt,
dass der für
die jeweilige Signalsequenz codierende Bereich nicht amplifiziert
wurde. Dadurch sollte das zu exprimierende Protein im Inneren der
Zelle verbleiben. Über
den Upstream-Primer wurde zusätzlich
eine NdeI-Restriktionsschnittstelle sowie ein Startcodon an das
5'-Ende der Sequenz
angefügt. Über den
Downstream-Primer wurde an das 3'-Ende
eine XhoI-Schnittstelle und ein Stopcodon angefügt. Die Sequenz wurde nach
der PCR-Reaktion gelelektrophoretisch analysiert und anschließend aus
dem Agarose-Gel eluiert.
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Das
Fragment der Cutinase konnte über
die Schnittstellen XhoI und NdeI in den entsprechend hydrolysierten
Vektor pLOV kloniert werden.
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Ein
Schema der Klonierung ist in 18 gezeigt.
Der Vektor pLOV-cut wurde im Anschluss in E. coli BL21 (DE3) transformiert
und der dabei entstandene Stamm als JG 4002 bezeichnet.
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Wie
in 18(A) zu sehen ist, zeigte der
auf LB-Agar inkl. 100 mM IPTG ausgestrichene Stamm JG 4002 (pLOV-cut) keinerlei Fluoreszenz
bei der Belichtung durch Blaulicht. Zum Vergleich wurde der den
pLOV enthaltende Stamm JG 4001 ausgestrichen, bei dem eine deutliche
Fluoreszenz zu sehen ist. Beide Stämme wurden zusätzlich auf
Tributyrin-Agar inkl. 100 mM IPTG ausgestrichen (19B),
um eine mögliche
extrazelluläre lipolytische
Aktivität
der Cutinase beobachten zu können.
Es zeigte sich, dass der die Cutinase exprimierende Stamm JG 4002
einen durch Hydrolyse des Tributyrins bedingten deutlichen Hof auf
der Platte bildete, was auf eine lipolytische Aktivität der Cutinase
schließen
lässt.
-
Um
die Aktivität
der in JG 4002 exprimierten Cutinase zu quantifizieren, wurden die
Kulturen JG 4002 (pLOV-cut)
und JG 4001 (pLOV) bis zum Erreichen der logarithmischen Phase unter
Schütteln
inkubiert und mit 0,4 mM IPTG induziert. Anschießend wurde über einen Zeitraum von drei
Stunden exprimiert. Die Zellen wurden danach durch Zentrifugation
vom Medium getrennt und durch Ultraschall aufgeschlossen.
-
Um
die Zellsuspensionen auf lipolytische Aktivität zu überprüfen, wurde mit ihnen ein pNpp-Test
durchgeführt.
Zu diesem Zweck wurden 10 μl
der jeweiligen Zellsuspension zu 2,5 ml der pNpp-Substratemulsion gegeben.
-
Nach
15 min. Inkubation bei 37°C
wurde die O.D.410 der Proben gemessen. Zusätzlich wurde
der Wert des durch Autohydrolyse bedingten pNpp-Umsatzes bestimmt,
indem eine ausschließlich
2,5 ml Substratemulsion enthaltende Probe erstellt wurde, bei welcher
keine Zugabe von Zellsuspension erfolgte.
-
Während bei
der Zellsuspension von JG 4001 (pLOV) unter Einberechnung der Autohydrolyse
des pNpp keine lipolytische Aktivität detektiert werden konnte,
zeigte die Zellsuspension von JG 4002 (pLOV-cut) eine Aktivität von 0,032
U/ml. 6)
Anhang/Methoden Anzucht
von R. capsulatus R.
capsulatus Medien
| PY-Vollmedium | |
| Bacto
Peptone | 10,0
g |
| Hefeextrakt | 0,5
g |
| 1 M
MgCl2 | 2,0
ml |
| 1 M
CaCl2 | 2,0
ml |
| 0,5
% FeSO4 | 2,4
ml |
| A.
dest. | ad
1000 ml |
| | |
| PY-Fe | |
| Bacto
Peptone | 10,0
g |
| Hefeextrakt | 0,5
g |
| 1 M
MgCl2 | 2,0
ml |
| 1 M
CaCl2 | 2,0
ml |
| A.
dest. | ad
1000 ml |
| | |
| PYG-Puffer | |
| Bacto
Peptone | 3,0
g |
| Hefeextrakt | 3,0
g |
| 20
% MgCl2 | 2,5
ml |
| 7,5
% CaCl2 | 4,0
ml |
| A.
dest. | ad
1000 ml |
| RCV-Minimalmedium
(ohne Stickstoff-Quelle) | |
| 10
% DL-Malat, pH 6,8 | 40,0
ml |
| 1 %
EDTA | 2,0
ml |
| 20
% MgSO4 | 1,0
ml |
| Spurenelement-Lösung | 1,0
ml |
| 7,5
% CaCl2 | 1,0
ml |
| 0,5
% FeSO4 | 2,4
ml |
| 0,1
% Thiamin | 1,0
ml |
| 1 M
Phosphat-Puffer, pH 6,8 | 9,6
ml |
| A.
dest. | ad
1000 ml |
| | |
| RCV
+ N (15 mM NH4 +) | |
| 10
% (NH4)2SO4 | 10,
0 ml |
| RCV | ad
1000 ml |
| | |
| RCV
+ S (9,5 mM Serin) | |
| 10
% Serin | 10,0
ml |
| RCV | ad
1000 ml |
| | |
| RCV
+ Lactat (ohne Stickstoff-Quelle) | |
| 10
% Lactat, pH 6,8 | 20,0
ml |
| 1 %
EDTA | 2,0
ml |
| 20
% MgSO4 | 1,0
ml |
| Spurenelement-Lösung | 1,0
ml |
| 7,5
% CaCl2 | 1,0
ml |
| 0,5
% FeSO4 | 2,4
ml |
| 0,1
% Thiamin | 1,0
ml |
| 1 M
Phosphat-Puffer, pH 6,8 | 9,6
ml |
| A.
dest. | ad
1000 ml |
| RCV
+ Lactat + N (15 mM NH4 +) | |
| 10
% (NH4)2SO4 | 10,0
ml |
| RCV | ad
1000 ml |
-
Phototrophe Anzucht unter
Starklichtbedingungen
-
R.
capsulatus wird vorzugsweise anaerob im Licht (photoheterotroph)
angezogen. Die anaerobe Anzucht kann auf Festmedium (PY-Agarplatten)
oder in Flüssigmedium
in Eppendorfgefäßen (EPG;
bis 2 ml Kulturvolumen) in einem speziellen Anaerob-Inkubationstopf
unter Verwendung des Gas-Pack Anaerobic-System (BBL) erfolgen. Größere Kulturvolumina
werden in gasdicht verschließbaren
Röhrchen
(Hungates) oder in Schott-Flaschen angezogen. Die Gefäße können durch
ein im Deckel befindliches Septum mit Argon oder N2 begast
werden. Unter diesen Bedingungen wird R. capsulatus für drei Tage
im Starklicht (sechs Glühbirnen
a 60W; entspricht 2500 lux) kultiviert.
-
Aerobe Anzucht
im Dunkeln
-
Die
Inkubation von R. capsulatus-Einzelkolonieausstrichen kann unter
aeroben Bedingungen im Brutschrank (im Dunkeln) erfolgen.
-
Mit
Zellmaterial von anaeroben Plattenkulturen kann R. capsulatus aerob
im Flüssigmedium
kultiviert werden, das in einem Erlenmeyerkolben mit 10-fachem Volumen
im Bezug auf die Flüssigkultur
vorliegt. Dabei erfolgt die Inkubation üN bei 30°C und 130 Upm im Dunkeln.
-
Anzucht E.coli
-
E.coli
wurde in LB-Medium bei 37°C
angezogen. Flüssigkulturen
bis zu einem Volumen von 5 ml wurden auf einem Brutroller, größere Volumina
in Erlenmeyerkolben auf einem Brutschüttler bei 150 UpM bebrütet, wobei
das Verhältnis
zwischen Kulturvolumen und Kolbenvolumen 1:5 entsprach. E.coli Stämme mit
plasmidkodierter Antibiotikaresistenz wurden immer unter entsprechendem
Selektionsdruck durch Zugabe des jeweiligen Antibiotikums kultiviert
(100 μg/ml
Ampicillin, 50 μg/ml
Kanamycin)
-
Flüssigmedien
-
LB-Medium (Sambrook et
al., 1989)
-
- 10 g/l Trypton; 10 g/l NaCl; 5 g/l Hefeextrakt; 1g NaOH
-
Tributyrin-Agar (Kok et
al., 1993)
-
- 7,5 ml Tributyrin, 0,75 g Gummi arabicum, ad 15 ml A.dest.
-
Das
Tributyrin-Gemisch wurde 3 min. mit dem Homogenisator (Ultra Turrax
T25, IKA Labortechnik, Staufen) emulgiert und anschließend 500
ml autoklaviertem LB-Agar zugegeben. Bei Lipaseaktivität bildeten sich
klare Höfe
um die Bakterienkolonien.
-
Konjugation: Transfer
mobilisierbarer Plasmide von E. coli nach R. capsulatus
-
Plasmide,
die über
eine Mobilisierungsfunktion verfügen
(oriT), können
von dem E. coli Stamm 517-1, welcher die Transfer-Gene (tra-Gene)
im Chromosom trägt, über Konjugation
auf R. capsulatus übertragen werden.
Durch die Konjugation werden diejenigen Plasmide in R. capsulatus eingeführt, die
dort stabil replizieren oder aufgrund eines fehlenden Replikationsursprungs
instabil sind. Mobilisierbare nicht replizierende Plasmide werden
zur Erzeugung von R. capsulatus Insertions-/Interposon-Mutanten eingesetzt.
Um die Ausbildung einer Konjugationsbrücke zwischen E. coli S17-1
und R. capsulatus zu ermöglichen,
wird das im Folgenden beschriebene Verfahren der Filterkreuzung
angewandt.
-
Der
Rezipient wird von einer frischen anaeroben Stammplatte in 5 ml
Minimalmedium (RCV + N) aufgenommen und üN bei 30°C auf dem Brutroller resuspendiert.
Der plasmidtragende E. coli S17-1 Donor wird üN bei 37°C selektiv auf einer LB-Agarplatte
angezogen. Von der Donorplatte werden Einzelkolonien der logarithmischen
Wachstumsphase geerntet und in 1 ml PY-Fe resuspendiert. Jeweils
1 ml der Rezipientenkultur (stationäre Phase) wird mit 0,5 ml der
Donorkultur vermischt und in einem Eppendorfgefäß zentrifugiert (5 min, 13.000
Upm, RT). Das Sediment wird vorsichtig im Rücklauf resuspendiert. Die Zellsuspension
wird anschließend
auf Nitrozellulose-Filter (Schleicher & Schüll OE 66, Porendurchmesser
0,2 μm) übertragen
und üN
bei 30°C
auf PY-Agarplatten inkubiert. Die Filter werden in 1 ml Minimalmedium
(RCV + N) resuspendiert. Von der Bakteriensuspension wird eine Verdünnungsreihe
angelegt und verschiedene Volumina werden auf Selektivmedium ausgestrichen.
Es folgt eine 3-tägige
Inkubation im Brutschrank bei 30°C.
-
Herstellung transformationskompetenter
E. coli-Zellen (Elektroporation)
-
In
einem sterilen Erlenmeyerkolben wurden 500 ml LB mit 5 ml einer
E. coli-Übernachtkultur
angeimpft. Die Zellen wurden bei 37°C und 150 UpM bis zu einer O.D.580 von 0,5–0,7 angezogen. Anschließend wurden
die Zellen 20 min. auf Eis gekühlt
und durch Zentrifugation (10 min., 5000 UpM, 4°C) sedimentiert. Die Zellen
wurden mit 500 ml eisgekühltem
10 % (v/v) Glycerol gewaschen, erneut sedimentiert (10 min., 5000 UpM,
4°C) und
in 250 ml eisgekühltem
10 % (v/v) Glycerol resuspendiert. Nach einem weiteren Sedimentationsschritt
wurden die Zellen in 20 ml 10 % (v/v) Glycerol aufgenommen, sedimentiert
und in einem Endvolumen von 2 ml 10 % (v/v) Glycerol resuspendiert.
Die Zellsuspension wurde in 50μl-Aliquots
aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung auf Eis oder bei –80°C gelagert.
-
Zur
Transformation wurde 1 μl
eines Ligationsansatzes oder 0,5 μg
isolierter Plasmid-DNA mit Hilfe eines hydrophoben Membranfilters
(„Durapore", 0,22 μm Porendurchmesser,
Millipore) mindestens 30 min. gegen A. dest. Dialysiert, um die
Salzkonzentration zu reduzieren. Anschließend wurde die DNA mit einem
Ansatz kompetenter Zellen vermischt und für 45 min. auf Eis inkubiert.
Der Transformationsansatz wurde daraufhin in eine vorgekühlte Transformationsküvette (Biorad,
2 mm) überführt, durch
welche im Elektroporator (GenePulser Xcell, Biorad) ein elektrischer
Impuls (2500 V, 25 μF,
200 Ω,
5 ms) geschickt wurde. Die Transformationsansätze wurden sofort nach dem
elektrischen Impuls mit 0,9 ml LB-Medium vermischt und anschließend 60
min. bei 37°C
inkubiert. Nach der Zentrifugation des Ansatzes (3 min., 13.000
UpM, EZ, RT) wurde das Zellsediment in 0,2 ml LB-Medium aufgenommen,
resuspendiert und anschließend
auf den entsprechenden Selektivagarplatten ausplattiert. Gleichbehandelte
Bakterienansätze,
denen keine DNA zugesetzt wurde, dienten als Negativkontrolle. Spektrophotometrischer
Nachweis von Lipase-/Esterase-Aktivität Sørensen
Phosphat-Puffer (pH 8) (Winkler & Stuckmann,
1979):
| Lösung A: | 50
mM Na2HPO42H2O |
| Lösung B: | 50
mM KH2PO4 |
-
Lösungen A
und B wurden im Verhältnis
17:1 gemischt. Substratemulsion:
| Lösung 1: | 207
mg Natriumdesoxycholat; 100 mg Gummi arabicum, 90 ml Sørensen
Phosphat-Puffer |
| Lösung 2: | 8
mM Nitrophenyl-Ester in 10 ml Isopropanol |
-
Lösung 2 wurde
zu Lösung
1 gegeben, gemischt und innerhalb 1 h verbraucht.
-
Die
Endkonzentration des Substrates betrug 0,8 mM.
-
Zellfraktionen
oder gereinigte Enzyme wurden mit je 2,5 ml Substratemulsion gemischt
und nach 15 min.
-
Inkubation
bei 37°C
die Absorbtionsänderung
bei 410 nm photometrisch (Shimadzu UV- 1602, Duisburg) bestimmt.
Die Enzymaktivität
wurde mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 15.000 M–1cm–1 errechnet,
wobei 1 Unit Aktivität
als die Enzymmenge definiert wurde, die 1 μmol p-Nitrophenol/min. freisetzt. Falls
im Text nicht anders angegeben, wurde p-Nitrophenyl-Palmitat als
Substrat verwendet.
-
Fluoreszenzmessungen
-
PBS-Puffer (pH 7,0):
-
- 4 mM KH2PO4;
16 mM Na2HPO4; 115
mM NaCl
-
Fluoreszenzmessungen
ganzer Zellen wurden in PBS-Puffer durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden O.D.580 = 1 entsprechende Aliquots den jeweiligen
Expressionskulturen entnommen, pelletiert (3 min., 14.500 UpM, RT,
EZ) und mit PBS-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 1
ml PBS-Puffer aufgenommen. Die so erhaltenen Zellsuspensionen wurden
als Stammlösungen
für die
folgenden Fluoreszenzmessungen verwendet; mit PBS-Puffer wurden
aus ihnen Zellsuspensionen mit einer O.D.450 =
0,1 hergestellt. Die Fluoreszenz der Proben wurde mit einem Fluoreszenzphotometer
(Luminescence Spectrometer LS 50B, Perkin Elmer, Boston, USA) gemessen.
-
Bei
Fluoreszenzmessungen von Cytoplasmafraktionen und Kulturüberständen wurden
die zu messenden Suspensionen mit den jeweiligen für die Fraktionierung
verwendeten Puffern bzw. Medien auf eine O.D.450 =
0,02 – 0,1
eingestellt.
-
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-
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-
Tabelle
mit Sequenzen weiterer Proteine aus der LOV-Familie Tabelle
1:
-
-
Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
