JPH05505109A - バチルス・スリンギエンシスのｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子および蛸翅目の昆虫に対して毒性のタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バチルス・スリンギエンシスのｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子および鞘翅目の昆虫に対し て毒性のタンパク質発明の分野 本発明は、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣと表示する殺昆虫性結晶賀タンパク質をエンコー ドするバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ）（以後、ｒＢ、ｔ、Ｊ）から分離された遺伝子、ならびに前記タンパク 質を含有する殺昆虫組成物および前記遺伝子で形質転換された植物に関する。殺 昆虫組成物および形質転換された植物は鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の昆虫 に対して毒性であり、そしてとくにジアブロチ力（Ｄｉａｂｒｏｔ　ｉ　ｃａ） 属の昆虫に対して毒性である。

発明の背景 Ｂ、ｔ、は、昆虫の目および種に対して特異的に毒性である結晶質タンパク質を 、胞子形成の間に、産生ずる、ダラム陽性の土のバクテリアである。Ｂｔ、の多 数の異なる菌株は、殺昆虫性結晶質タンパク質を産生ずることが示された。殺昆 虫性タンパク質を産生するＢ、ｔ、を包含する組成物は、商業的に入手可能であ り、そして特定の標的昆虫に対して非常に毒性であるが、植物および他の非標的 有機体に対して無害であるので、環境的に許容されうる殺昆虫剤である。

結晶質タンパク質をエンコードするある数の遺伝子は、Ｂ、ｔ、のいくつかの菌 株からクローニングされてきている。すぐれた外観は、Ｈ。

ホフテ（Ｈｏ　ｆ　ｔ　ｅ）ら、マイクロバイオロジカル・リビューズ（Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、　）、５５．２４２−２５５　（１９８９）に記載され ている。この参考文献は本発明に関する先行技術ではないが、Ｂ。

ｔ、から得られる遺伝子およびタンパク質およびそれらの使用のすぐれた外観を 提供し、Ｂ、ｔ、の遺伝子およびタンパク質のための名称および分類の概要を採 用し、そして広範な引用文献を有する。

Ｂ、ｔ、の結晶質タンパク質は摂取後にのみ昆虫において活性である。

昆虫による摂取後、中部栄養管におけるアルカリ性ｐＨおよびタンパク質分解は 結晶を可溶化し、毒性成分を解放させる。これらの毒性成分は中部栄養管の細胞 を崩壊させて、昆虫の食物摂取を停止させそして、究極的に、昆虫を死亡させる 。事実、Ｂ、ｔ、は、種々の昆虫の病害虫を取り扱うとき、有効なかつ環境的に 安全な殺昆虫であることが証明された。

ホフテ（Ｈｏｆｔｅ）らが認めたように、殺昆虫Ｂ、ｔ、！Ｉｒ株の大部分は他 の鱗翅目（Ｌｅｐ　１ｄｏｐｔｅｒａ）の昆虫、例えば、幼虫の昆虫に対して活 性である。他のＢ、ｔ、菌株は双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の昆虫、例えば、ハエ または力に対して、あるいは鱗翅目および双翅目の両者の昆虫に対して活性であ る。近年、わずかのＢ、ｔ、ｌ１株が、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の昆虫 、例えば、甲虫に対して殺昆虫性である結晶質タンパク質を産生ずるとして報告 された。

鞘翅目毒性Ｂ、ｔ、菌株は、次の文献に記載されている：Ａ、クリーグ（Ｋｒｉ ｅｇ）ら、ツァイトシュリフト・ツーエル・アンゲパンテ・エントモロギー（Ｚ 、Ａｎｇｅｗ、Ｅｎ　ｔ、）　、９旦、ｐｐ、５００−５０８　（１９８３）： 参照、また、Ａ、クリーブ（Ｋｒｉｅｇ）ら、アンゼイゲル・フール・シェドリ ングスクンデ、ブフランゼシュッツ、ウンヴエルトシｓ−ｙ”ｔ　（Ａｎｚ、５ ｃｈａｅｄｌ　ｉｎｇｓｋｄｅ、Ｐｆ　１ａｎｚｅｎｓｃｈｕｔｚ、Ｕｍｗｅｌ ｔｓｃｈｕｔｚ）、５ユ、ｐｐ。

１４５−１５０　（１９８４）および米国特許第４，７６６．２０３号、Ａ６　 クリーブ（Ｋｒｉｅｇ）ら、１９８８年８月２３日発行。Ｂ、ｔ。

ｖａｒ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｔｓ）と表示する菌株は、鞘翅目 の昆虫Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ　ａｌｎｉ（青ハンノキの葉の甲虫）およびＬｅｐ ｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（コロラドジャガイモの甲虫） の幼虫に対して毒性であると報告されている。Ｂ。

ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）は、約６５〜７０キロダルトン （ｋＤａ）であると報告されている、殺昆虫性結晶質タンパク質を作る：参照、 また、Ｋ、ベルンハード（Ｂｅｒｎｈａｒｄ）、ＦＥ　−ＭＳ　？イクロバイオ ロジー・レターズ（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉ。

１、Ｌｅｔｔ、）３旦、ｐｐ、２６１−２６５　（１９８６）。

■、セカー（Ｓｅｋａｒ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナルφアカデ ミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８４Ｓｐｐ、７０３６−７０４０　（１９８７）は、Ｂ、 ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）の鞘翅目毒性結晶質タンパク質 の遺伝子のクローニングおよび特性決定を報告している。

このタンパク質のサイズは、この遺伝子の配列から推定して、７３ｋＤａであっ たが、分離されたタンパク質は主として６５ｋＤａの成分を含有した。ホフテ（ Ｈｏｆｔｅ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃＢ、ｔ、テネブリオニス（ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）からのクローニングした遺伝子のＤＮＡ配列を報告し ており、そしてこの遺伝子の配列は七カー（Ｓｅｋａｒ）ら（１９８７）により 報告されているものと同一である。

マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、旦、ｐｐ、６１−６６　（１９８８）は、Ｂ、ｔ、テネ ブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）からのクローニングした昆虫抑制遺伝子 のＤＮＡ配列を開示しており、そしてこの遺伝子の配列は七カー（Ｓ　ｅ　ｋ　 ａ　ｒ）ら（１９８７）により報告されているものと同一である。クローニング した遺伝子を収容するＥ、ｃｏｌｉ細胞およびシュードモナス・フルオレセンス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）細胞は、コロラド（Ｃｏ ｌｏｒａｄｏ）ジャガイモの甲虫の幼虫に対して毒性であることが発見された。

Ｂ、ｔ、　Ｗａｒ、サン・ジエゴ（ｓａｎ　ｄｉｅｇｏ）と表示する鞘翅目毒性 菌株は、Ｃ，ヘルンスッタト（Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔ）ら、バイオ／テクノロジ ー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４、ｐｐ、３０５−３０８　（１９８６ ）により、種々の鞘翅目の昆虫に対して毒性である６４ｋＤａの結晶質タンパク 質を産生ずると報告されている：Ｐｙｒｒｈａｌａ　１ｕｔｅｏｌａ　にしの素 の甲虫）に対して強く毒性；Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ（ワタミハ ナゾウムシ）、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（コロラ ドジャガイモの甲虫）、０ｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　５ｕｌｃａｔｕｓ（黒ブド ウのゾウムシ）、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ　ｍｏｌｉｔｏｒ　（黄色コメノゴミムシダ マシ）およびＨａｌｔｉｃａ　ｔｏｍｂａｃｉｎａに対して注で井戸に毒性そし てＤｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ　ｕｎｄｅｃｉｍｐ ｕｎｃｔａｔａ（西斑点キュウリ甲虫〕に対して弱く毒性。

Ｂ、ｔ、サン・ジエゴ（ｓａｎ　ｄｉｅｇｏ）のクローニングした鞘翅目毒性遺 伝子のＤＮＡ配列は、Ｃ，ヘルンスッタト（Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔ）ら、遺伝子 （Ｇｅｎｅ）、旦ヱｐｐ、３７−４６　（１９８７）に報告されている：参照、 また、米国特許第４，７７１，１３１号、ヘルンスッタト（Ｈｅｒｒｎｓｔａｄ ｔ）ら、１９８８年９月１３日発行。

Ｂ、ｔ、サン・ジエゴ（ｓａｎ　ｄｉｅｇｏ）の毒性遺伝子の配列は、セカー（ Ｓ　ｅ　ｋ　ａ　ｒ）ら（１９８７）がＢ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒ ｉｏｎｉｓ）のクローニングした鞘翅目毒性遺伝子について報告する配列と同一 である。

クリーブ（Ｋｒｉｅｇ）Ｉａ、ジャーナル・オブ・アプライド・エンドモロジー （Ｊ、Ａｐｐ　１．Ｅｎｔ、）　、１０４１、ｐｐ、４１７−４２４　（１９８ ７）は、菌株Ｂ、ｔ、サン・ジエゴ（ｓａｎ　ｄｉｅｇｏ）が、種々の診断試験 に基づいて、Ｂ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）菌株と同一で あることを報告している。

ＥＧ２１５８と表示する、他の新規なり、ｔ、菌株は、ｗ、ｐ、トノパン（Ｄｏ ｎｏｖａｎ）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティックス（Ｍｏ １．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　、２１４．ｐｐ、３６５−３７２　（１９８８） により、鞘翅目の昆虫に対して殺昆虫性である７３ｋＤａの結晶質タンパク質を 産生ずることをＢ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８からの毒素をエンコードする遺伝子は クローニングされそして配列決定され、そしてその配列は七カー（Ｓｅｋａｒ） ら（１９８７）がクローニングしたＢ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｎｉｓ）の鞘翅目の毒素の遺伝子について報告した配列と同一である。この鞘翅 目の毒素の遺伝子は、ヘフテ（Ｈｏｆ　ｔｅ）ら、マイクロバイオロジカル・リ ビューズ（Ｍｉ　ｃ　ｒｏｂ　ｉ　ｏ　１．　Ｒｅｖ、　）　、５３、ｐｐ、２ ；２−２５５　（１９８９）により、ｃｒｙＩＩＩＡと呼ばれティる。

米国特許第４．７９７．２７９号、Ｄ、カラマタ（Ｋａｒａｍａｔａ）ら、１９ ８９年１月１０日発行、は、鱗翅目の毒素の遺伝子をもつＢ。

ｔ、クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）からのプラスミドおよび鞘翅目の毒素の遺 伝子をもつＢ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）からのプラスミ ドを含有する、ハイブリッドのＢ、ｔ、微生物を開示している。ハイブリッドの Ｂ、ｔ、　は、Ｂ、ｔ、クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）により作られたもの、 ならびにＢ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）のの特徴を示す結 晶質タンパク質を産生ずる。

欧州特許発行第０．３０３，３７９号、マイコーサン・コーポレーション（Ｍｙ ｃｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１９８９年２月１５日発行、は、鞘翅 目および鱗翅目の両者の昆虫に対して殺昆虫活性を有する、Ｂ、ｔ、ＭＴｉＯ３ と同定された、新規なり、ｔ、分離物を開示している。

欧州特許発行第０．３１８．１４３号、ルブリゾル・ジエネテイツクス・インコ ーホレーテッド（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ、）　、１９８ ９年３月３１日発行、は、Ｂ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ） からの完全な部分的に修飾された遺伝子のクローニング、特性決定および選択的 発現、および微生物が鞘翅目の昆虫に対する毒性を有するタンパク質を産生でき るようにする宿主微生物を開示している。前述のへルンスタット（Ｈｅｒｒｎｓ ｔａｄｔ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４、 ｐｐ、３０５−３０８　（１９８６）から再生されたＢ、ｔ、サン・ジエゴ（ｓ ａｎｄｉｅｇｏ）についての昆虫のバイオアッセイのデータが要約されている。

要約は、また、他の源についての、Ｂ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｎｉｓ）についてのデータを包含する。Ｂ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒ ｉｏｎｉｓ）は、コロラド（Ｃｏｌｏｒａｄｏ）ジャガイモの甲虫に対して強い 毒性、西トウモロコシ根負い虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ） に対して中程度の毒性および南トウモロコシ根負い虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　 ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃ　ｔ　ａ　ｔ　ａ）に対して弱い毒性を示すと報告され ている。

欧州特許出願公開第０．３２４．２５４号、インペリアル・ケミカル・インダス トリース（Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓ　−ｔｒｉｅｓ） ＰＬＣ，１９８９年７月１９日発行、は、鞘翅目の昆虫に対して殺昆虫活性を有 する、Ａ３０と同定された、新規なり、ｔ、　ｍ株を開示している。

欧州特許発行第０．３２８．３８３号、マイコーサン・コーポレーション（Ｍｙ ｃｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１９８９年８月１６日発行、は、鞘翅 目の昆虫に対して殺昆虫活性を有する、Ｂ、ｔ、ｐｓ４０Ｄ１と同定された、新 規なり、ｔ、微生物を開示している。

欧州特許発行第０．３３０．３４２号、マイコーサン・コーポレーション（Ｍｙ ｃｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１９８９年８月３０日発行、は、鞘翅 目の昆虫に対して殺昆虫活性を有する、Ｂ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ１と同定された、新 規なり、ｔ、微生物を開示している。

これらの後者の４件の刊行物は１、本発明に関して先行技術ではない。

Ｂ、ｔ　テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）は、最初にＡ。

フレイブ（Ｋｒｅｉｇ）らにより報告され、ドイツ国ダーマシュタットにおいて またはその付近において発見され、モしてＢｔ、サン・ジェゴ（ｓａｎ　ｄｉｅ ｇｏ）は、ヘルンスタット（Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔ）らにより報告さね、カリフ ォルニア州サン・ジエゴまたはその付近における位置から得られたと信じられる 。Ｂ、ｔ、ｉｌ１株ＥＧ２１５８は、ド／パン（Ｄｏｎｏｖａｎ）らにより報告 され、カンサス州からの作物のダストの試料から分離された。こうして、いくつ かの広く分離した地理学的位置から分離された種々のＢ、ｔ、菌株のすべては、 明らかに同一の鞘翅目の毒素の遺伝子、Ｃｒ’７ＩＩＩＡ遺伝子、を含有した。

７年以前にわたってＢ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉＳ）におい て最初に発見された独特なり、ｔ、遺伝子以外の、新規な鞘翅目の毒素のＢ、ｔ 、遺伝子は文献に報告されていない。

そのうえ、鞘翅目の昆虫に対する結晶質タンパク質の殺昆虫活性を有すると報告 された、種々のＢ、ｔ、菌株の間でさえ、ジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ）属の昆虫（トウモロコシ根負い虫）の幼虫および成虫に対して有意の毒性を有 することが示されていす、このようなジアブロチ力（Ｄｉａｂｒｏｔｉｅａ）属 の昆虫は西トウモロコシ根負い虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ 　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、１ｉ）つ％ロ＝＋シ根負い虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ 　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ）および北トウモロコシ根 負い虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｂａｒｂｅｒｉ）を包含する。本発明のｃｒｙ ＩＩＩＣ遺伝子は、他の鞘翅目の昆虫の間で、ジアブロチ力（Ｄｉａｂｒ。

ｔｉｃａ）属の昆虫に対して定量可能な殺昆虫活性を有するタンパク質毒素を発 現する。

発明の要約 本発明の１つの面は、第１図を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド塩基 配列を有する、精製されそして分離された鞘翅目の毒素の遺伝子に関し、そして 以後ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子と表示する。ｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子は第１図に示 すヌクレオチド塩基１４〜１９７２から延びる解読領域を有する。

本発明の他の面は、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子により産生された殺昆虫性タンパ ク質に関する。ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質は、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子の ヌクレオチド配列から推定して、塩基１４〜１９７２のアミノ酸配列、すなわち 、第１図に示すアミノ酸配列を有する。このタンパク質は、鞘翅目（Ｃｏ　Ｉ　 ｅｏｐ　ｔ　ｅ　ｒａ）の昆虫、とくにコロラド（Ｃｏｌｏｒａｄｏ）ジャガイ モ甲虫およびジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）属の昆虫に対して殺昆虫活 性を有する。

本発明のなお他の面は、ＮＲＲＬに受託され、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８５３３の受け 入れ番号を有し、そしてＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１と表示する、Ｂ、ｔ、バクテ リアの生物学的に純粋な培養物に関する。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１はｃｒｙＩ 　Ｉ　ＩＣ遺伝子を有し、そして殺昆虫性ＣｒＶＩＩＩＣタンパク質を産生ずる 。ｃｒｙｌＩＩｃ遺伝子を有する他のＢ、ｔ、バクテリアの生物学的に純粋な培 養物は、また、本発明の範囲内にはいる。

本発明のなお他の面は、農学的に許容されうる担体と組み合わせて、ＣｒｙＩＩ ＩＣタンパク質または（：ｒｙＩＩＩＣタンパク質を産生じたＢｔ、菌株の発酵 培養物を含有する殺昆虫組成物に関する。

本発明は、また、鞘翅目の昆虫の宿主植物に殺昆虫的に有効量のＣｒ７Ｉ　Ｉ　 ＩＣタンパク質またはＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＣタンパク質を作ったＢ、ｔ。

菌株の発酵培養物を適用することからなる、鞘翅目の昆虫を抑制する方法を包含 する。この方法は、コロラドジャガイモ甲虫、ニレの葉の甲虫、輸入されたヤナ ギの葉の甲虫およびトウモロコシの根食い虫を包含する、種々の鞘翅目の昆虫に 適用することができる。

本発明のなお他の面は、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子を含有する組み換えプラスミ ド、このような組み換えプラスミドで形質転換されたバクテリアの生物学的に純 粋な培養物、バクテリアは好ましくはＢ、ｔ、である、ならびにｃｒｙＩ　Ｉ　 ＩＣ遺伝子で形質転換された植物に関する。

本発明のそれ以上の面は、鞘翅目毒性タンパク質を含有する殺昆虫組成物の鞘翅 目の昆虫に対する殺昆虫活性を増強する方法に関し、ここでこの方法はＣｒｙＩ ＩＩタンパク質を含有する殺昆虫組成物の中に、鞘翅目の昆虫に対する前記組成 物の殺昆虫活性を増強するために有効量のＣｒｙｌタンパク賀を添加または混入 することからなる。Ｃｒｙｉ　Ｉ　ＩＣタンパク質を含有する殺昆虫組成物およ びＣｒｙＩタンパク質は、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の昆虫、とくにコロ ラドジャガイモ甲虫およびトウモロコシの根食い虫に対して、増強された殺昆虫 活性を示す。

図面の簡単な説明 第１図は、第１−１図〜第１−３図からなり、モしてｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子のヌ クレオチド塩基配列およびＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク賀の推定されたアミノ酸 配列を示す。推定上のリポ・ソーム結合部位（ＲＢＳ）が示されている。Ｈｉｎ ｄＩ　Ｉ　ＩおよびＢａｍＨＩの制限部位は、また、示されている。

第２図は、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８、ＥＧ２８３８およびＥＧ４９６１のサイ ズ分画した自然プラスミドを含有する、臭化エチジウム染色したアガロースゲル の写真である。第２図の右に対する数は、Ｂ、ｔ。

菌株ＥＧ４９６１のプラスミドの近似のサイズ、メガタルトン（ＭＤａ）を示す 。

第３図はオートラジオグラムの写真であり、この写真は第２図に示すプラスミド をニトロセルロースのフィルターに転移し、このフィルターを放射線標識した２ 、４キロ塩基（ｋ　ｂ）のｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢＢａ−ブとハイブリダイゼーショ ンし、そしてフィルターをＸ線フィルムに暴露することによって作られた。第３ 図の右に対する数は、ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢブ　′ローブに対してハイブリダイゼ ーションするＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のプラスミドのサイズ（ＭＤａ）を示す 。第３図の右に対する文字ｒｆＪは、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢハイブリダイゼーショ ンするプラスミドの破壊から生ずる断片を示す。

第４図は、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ＋ＥｃｏＲＩで消化し、そして電気泳動によりサ イズ分画した、Ｂ、ｔ、菌株Ｇ２１５８、ＥＧ２８３８およびＥＧ４９６１から のＤＮＡを含有する、臭化エチジウム染色したアガロースゲルの写真である。レ ーンの標識ｒｓｔｎｄＪはサイズの標準である。

第５図はオートラジオグラムの写真であり、この写真は第３図のＤＮＡ断片をニ トロセルロースのフィルターに転移し、このフィルターを放射線標識した２、４ に、ｂのｃｒｙＩＩＩＢプローブとハイブリダイゼーションし、そしてフィルタ ーをＸ線フィルムに暴露することによって作られた。第５図の右に対する数は、 ｃｒｙｌｌＩＢプローブに対してハイブリダイゼーションするＢ、ｔ、菌株ＥＧ ４９６１の制限断片のサイズ（ｋ　ｂ）を示す。レーンの標識ｒｓｔｎｄＪはサ イズの標準である。

第６図は、クーマツシー染色したドデシル硫酸ナトリウム（ｒＳＤＳＪ）ポリア クリルアミドゲルの写真であり、Ｂ、ｔ、菌株Ｇ２１５８、ＥＧ２８３８および ＥＧ４９６１から可溶化した結晶質タンパク質を示す。

第６図の右に対する数は、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１により産生された結晶質タ ンパク質の近似のサイズ（ｋＤａ）を示す。

第７図は、プラスミドｐＥＧ２５８の制限地図を示す。ｃｒｙｌＩＩＣ遺伝子の 位置および向きは矢印で示されている。ｃｒｙＸ遺伝子と表示する遺伝子は、点 線で示す領域内に位置する。ＡｓｐはＡｓｐ７１８であり、ＢａｍはＢａｍＨＩ であり、Ｈ３はＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉであり、モしてＰはｐｓｔｌ制限酵素である 。１つのｋｂの目盛りのマーカーは、また、示されている。

第８図は、第７図と整列しかつ第７図と同一目盛りに基づき、Ｂ、ｔ。

菌株ＥＧ４９６１からのＤＮＡの８．３ｋｂの断片を含有するプラスミドの制限 地図を示し、ここでｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子は矢印で示され、モしてｃｒｙＸ 遺伝子は点線により示される領域内に位置する。第７図に関して前述した制限酵 素のための略号に加えて、（ＲＶ／Ａ、ｓｐ）はＥｃｏＲＶおよびＡｓｐ７１８ の制限部位の融合を意味し、そして（ＲＶ／Ｐｓｔ）はＥｃｏＲＶおよびＰｓｔ ｌの制限部位の融合を意味する。

第９図は、第７図と整列しかつ第７図と同一目盛りに基づき、組み換えＥ、ｃｏ ｌｉ薗株ＥＧ７２３３からのＤＮＡ断片の一部分として、矢印で示すｃｒｙＩ　 Ｉ　ＩＣ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＧ２６９の制限地図を示す。第７図に 示すｐＥＧ２５８に関して使用する略号はこの図面に適用可能である。さらに、 Ｓｐｈは５ｐｈｌ制限部位であり、そ第１０図はクーマツシー染色した５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲルの写真である。ゲルは次のバクテリアの菌株により合成 されたタンパク質のバンドを示す：Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＥＧ７２２１　（ｐＵＣ１ ８／Ｃｒｙ−）；Ｅ、ｃｏｌ　ｉ菌株ＥＧ７２１８　（ｐＥＧ２５８／ｃｒｙｌ 　Ｉ　ＩＣ’″ｃｒｙＸつ　、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ７２１１　（ｐＥＧ２００／Ｃ ｒｙつ　；Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１　（ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ”ｃｒｙＸつ　； Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ７２３１　（ｐＥＧ２６９／ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ”ｃｒｙＸつ 　；およびＢ、ｔ、菌株ＥＧ７２２０　（ｐＥＧ２６０／ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ” ／ｃｒｙＸ゛）。ゲルの右に対する数は、これらの菌株により産生された結晶質 タンパク質の近似のサイズ（ｋＤａ）である。

好ましい実施態様の詳細な説明 ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子および鞘翅目毒性Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ結晶質タンパク 質の分離および精製およびＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＣタンパク質を産生ずる新規なり、 ｔ、菌株ＥＧ４９６１の特性決定を、実施例において詳細に説明する。殺昆虫組 成物および方法におけるＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１およびＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ結 晶質タンパク質の実用性を、また、実施例において説明する。

実施例は、また、Ｃｒｙｌタンパク質の添加によるＣｒｙＩＩＩタンパク質の殺 昆虫活性の相乗的増強を例示する。こうして、ＣｒｙＩＩＩおよびＣｒｙｌの両 者のタンパク質の組み合わせを有する殺昆虫組成物は、とくに両者の幼虫および 成虫のコロラドジャガイモ甲虫および南トウモロコシ根負い虫、ならびに他の昆 虫に関して、増強された殺昆虫活性を提供する。

本発明のＣｒｙｌ　Ｉ　Ｉ型遺伝子、ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ遺伝子は、第１図に示 すヌクレオチド塩基配列を有する。ｃｒｙＩ　Ｔ　ＩＣ遺伝子の解読領域は、第 １図に示すヌクレオチド塩基の位置１４から位置１９７２に延びる。

ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子のヌクレオチド塩基対と先行技術のｃｒｙＩＩＩＡ遺 伝子の対応する解読領域との比較は、２つの遺伝子の間の有意差を示す。ｃｒｙ ｌ　Ｉ　ＩＣ遺伝子はｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺伝子とわずかに７５％の相同性（位 置的に同一）である。

ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子の解読領域のヌクレオチド塩基対と最近発見したＢ、 ｔ、菌株ＥＧ２８３８　（ＮＲＲＬ受は入れ番号Ｂ−１８６０３）から得られた ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢ遺伝子の対応する解読領域との比較は、Ｃｒｙ１１１ｃ遺伝 子がｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子と９６％の相同性（位置的に同一）である。

ｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子によりエンコードされる本発明のＣｒｙＩＩＩ塁タンパク 質、ＣｒｙｌｌｌＣタンパク質は、第１図に示すアミノ酸配列を有する。この開 示において、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣｒタンパク質」に対する言及は、特記しない限 り、「結晶質タンパク質」、「タンパク質毒素」、「殺昆虫性タンパク質」など としてのその記載と同一の意味である。

ＣｒｙＩＩＩＣタンパク賀のサイズは、ｃｒｙｌｌｌｃ遺伝子のＤＮＡ配列から 推定して、７４．４ｋＤａである。

ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢタンパク賀は、ｅｒｙｌ　Ｉ　ＩＢ遺伝子のＤＮＡ配列から 推定して、７４．２ｋＤａである。先行技術のＣｒｙＩＡタンパク賀は、ｃｒｙ Ｉ　Ｉ　ＩＡ遺伝子によりエンコードされ、７３．１ｋＤａの推定されたサイズ を有する。

明らかなサイズの類似せいにかかわらず、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質のアミ ノ酸配列と先行技術のＣｒｙＩＡタンパク質との比較は、２つとの間の有意差を 示す。ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質はＣｒｙＩＡタンパク質とわずかに６９％ の相同性（位置的に同定のアミノ酸）である。Ｃｒｙｉ　Ｉ　ＩＣタンパク質は ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢタンパク質と９４％の相同性である。それにもかかわらず、 ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質およびＣｒｙｌＩＩＢタンパク質の明らかな相同 性にかかわらず、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質は、鞘翅目（Ｃｏ　１　ｅｏｐ 　ｔ　ｅ　ｒａ）の昆虫および、と（に、ジ　−アブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉ ｃａ）属の昆虫に関して、ＣｒｙＩＩＩＢタンパク質と比較して、その有意に改 良された殺昆虫活性に基づいて、Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢタンパク貫と異なるタンパ ク質であることが示された。

ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質は、トウモロコシの根食い虫に対して定量可能な 殺昆虫活性を示す、最初のＢ、ｔ、タンパク質である。

本発明は、本質的にＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質と同一の性質をもっ鞘翅目毒 性タンパク質を止する、ｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子の突然変異体および組み換えまた は遺伝子操作した誘導体を包含することを意図する。

ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子は、また、他のＢｔ、菌株において同様なまたは密接 に関係するｃｒｙＩＩＩ型遺伝子を発見するだめの、ＤＮＡハイブリダイゼーシ ョンプローブとして有用である。ｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子またはその一部分または 誘導体は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するために、例えば、放 射ＩＮ標識で、普通の技術を使用して標識することができる。次いで、標識され たハイブリダイゼーションプローブを実施例に記載する方法で使用することがで きる。

ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子および対応する殺昆虫性ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク 質は、最初に、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１、新規なり、ｔ、１１株、において同 定された。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６］の特性は実施例においてより完全に記載す る。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のプラスミドの列および他の菌株の特性と、最近 発見されたＢ、ｔ、１株ＥＧ２８３ｇの特性および先は技術のＢ、ｔ、菌株ＥＧ ２１５８の特性との比較は、これらの３つの鞘翅目毒性Ｂ、ｔ、！Ｉ株が明確に 異なることを実証する。

ｃｒｙｌｌＩｃ遺伝子は種々の微生物の宿主の中に、適当な宿主の形賀転換につ いて当業者によく知られている手順を使用して、クローニングされたｃｒｙＩ　 Ｉ　ＩＣ遺伝子の安定な維持および発現を可能とする条件下に導入することがで きる。ｃｒｙｌＩＩｃ遺伝子の発現およびＣｒｙｌｌｌｃタンパク質の産生を可 能とする適当な宿主は、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）および他のバチルスｍ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、 例えば、枯草菌（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・メガテリウム（Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｊｕｍ ）を包含する。明らかなように、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子を含有する遺伝学的 に変更した、あるいは遺伝子操作した微生物は、また、同一有機体の中に存在す る他の毒素の遺伝子を含有することができ、そしてこれらの遺伝子はＣｒｙＩ　 Ｉ　ＩＣタンパク質と異なる殺昆虫性結晶質タンパク質を同時に産生ずることが できる。

この開示に記載するバチルス属（Ｂａｃｉ　１１ｕｓ）の菌株は、普通の成長培 地および標準の発酵技術を使用して培養することができる。ＣｒｙＩＩＩＣ遺伝 子を収容するＢｔ、菌株は、実施例に記載されているように、培養したＢ、ｔ、 細胞がＣｒｙＩＩＩＣ結晶買タンパク質が形成するそれらの成長サイクルに到達 するまで、発酵させることができる。胞子形成性Ｂ、ｔ、！Ｉ株について、発酵 は、典型的には、ＣｒｙＩＩＩＣ結晶賞タンパク質が胞子と一緒に形成する胞子 形成段階を通して続ける。次いで、Ｂ、ｔ、発酵培養物は、典型的には、遠心、 濾過などにより収穫して、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ結晶賀タンパク質を含有する発酵 培養固体を培養物の水性ブロス部分から分離する。

この開示に例示するＢ、ｔ、９株は胞子形成する変種（胞子形成または胞子発生 性菌株）であるが、ｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子は、また、非胞子発生性バチルス属（ Ｂａｃ　ｉ　ｌ　Ｉｕｓ）種、すなわち、胞子を形成しないで結晶質タンパク質 を産生ずる菌株において実用性を有する。この開示におけるＢｔ、菌株（ｃｒｙ ＩＩＩｃ遺伝子を含有する）の「発酵培養物」の言及は、胞子形成したＢ、ｔ、 培養物、すなわち、ＣｒｙＩＩＩＣ結晶質タンパク質および胞子を含有するＢ、 ｔ、ｌ！を株、および栄養成長段階の間に結晶質タンパク質を産生じた胞子発生 性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、ならびに培養物が結晶質タンパク質が 実際に産生される成長段階に到達した、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子を含有する非 胞子発生性バチルス属（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　１ｕｓ）種を包含することを理解すべ きである。

分離された発酵固体は、主としてＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ結晶賞タンパク質およびＢ 、ｔ、胞子、ならびに多少の細胞破片、多少の完全な細胞、および残留する培地 の固体である。必要に応じて、結晶質タンパク質は他の回収された固体から、慣 用方法、例えば、スクロース密度の勾配の分画を経て、分離することができる。

高度に精製されたＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質は、回収された結晶質タンパク 質を可溶化し、次いでタンパク質を溶液から再沈澱させることによって得ること ができる。

ＣｒｙＩＩＩＣタンパク質は、前述したように、鞘翅目の昆虫、例えば、コロラ ドジャガイモ甲虫、ニレの葉の甲虫、輸入されたヤナギの葉の甲虫などに対して 、効力のある殺昆虫性化合物である。ＣｒｙＩＩＩＣタンパク賀は、ＣｒｙＩＩ ＩＡタンパク質およびＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢタンパク質と対照的に、他の鞘翅目毒 性Ｂ、ｔ、タンパク質により影響を受けないで、ジアブロチ力（Ｄｉ　ａｂｒｏ ｔ　ｉ　ｃａ）属の昆虫、例えば、トウモロコシの根食い虫に対して、測定可能 な殺昆虫活性を示す。Ｃｒ７Ｉ　Ｉ　ＩＣタンパク質は、鞘翅目の昆虫、例えば 、前述した昆虫の抑制に有用である殺昆虫性配合物において、活性成分として利 用することができる。このような殺昆虫性配合物または組成物は、典型的には、 活性成分に加えて、農学的に許容されうる担体またはアジ；バントを含有する。

ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質は、殺昆虫性配合物において、分離または精製さ れた形態で、例えば、結晶質タンパク質それ自体として使用することができる。

あるいは、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質は、バチルスｊｌＥ（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ）菌株、例えば、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、あるいはｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子を有しそしてＣｒｙ ｌ　Ｉ　ＩＣタンパク質を産生ずることができる、他の微生物の宿主から得られ た、回収された発酵固体の中に存在することができる。好ましいバチルス属（Ｂ ａｃ　ｉ　ｌ　１ｕｓ）の宿主は、Ｂ。

ｔ、菌株ＥＧ４９６１およびＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１から誘導された、遺伝学 的に改良されたＢ、ｔ、菌株を包含する。後者のＢ、ｔ、菌株は、プラスミドの キユアリングおよび／または接合技術を経て得ることができ、モしてＢ、ｔ、菌 株ＥＧ４９６１からのプラスミドを含有する自然ｃｒｙｌｌｌｃ遺伝子を含有す ることができる。遺伝子操作または形質転換されたＢ、ｔ、菌株または、組み換 えＤＮＡ手順により得られた、クローニングされたｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子を 発現する組み換えプラスミドを含有する、他の宿主微生物を、また、使用するこ とができる。

このような形質転換体の例は、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ７２３１およびＥＧ７２２０を 包含し、これらの両者は組み換えプラスミド上にクローニングされたｃｒｙＩ　 Ｉ　ＩＣ遺伝子を含有する。

回収された発酵固体は、主として、結晶質タンパク質および（胞子形−成り、ｔ 、宿主を使用する場合）胞子を含有する；細胞の破片および残留発酵培地の固体 は、また、存在することができる。Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣタンパク質を含有する、 回収された発酵固体は、必要に応じて、乾燥した後、殺昆虫性配合物の中に混入 することができる。

活性成分として殺昆虫性Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣタンパク質を含有する本発明の配合 物または組成物は、殺昆虫的に有効量で適用され、この量は、例えば、抑制すべ き特定の鞘翅目の昆虫、処理すべき特定の植物または作物および殺昆虫活性組成 物を適用する方法のような因子に依存して変化するであろう。殺昆虫性配合物の 殺昆虫的に有効量は、本発明の昆虫抑制方法において使用される。

殺昆虫組成物は、殺昆虫活性成分を所望の農学的に許容されうる担体と配合する ことによって調製される。配合された組成物は、ダストまたは粒状物質、油（植 物または鉱物）または水中の懸濁液または油／水乳濁液、または湿潤性粉末、あ るいは農学的に許容されつる他の担体物質と組み合わせた形態であることができ る。適当な農学的担体は固体または液体であることができ、そしてこの分野にお いてよく知られている。

用語「農学的に許容されうる担体」は、通常殺昆虫配合技術において使用される 、すべてのアジュバント、例えば、不活性の成分、分散剤、界面活性剤、増粘剤 、結合剤などを包含する；これらは殺昆虫配合において当業者によ（知られてい る。

ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質および１または２以上の固体または液体のアジュ バントを含有する配合物は、既知の方法で、例えば、殺昆虫活性ＣｒｙＩ　Ｉ　 ＩＣタンパク質の成分を適当なアジュバントと、普通の配合技術を使用して、均 質に混合、ブレンドおよび／または粉砕することによって調製される。

Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣタンパク質、および他の鞘翅目毒性タンパク質、例えば、Ｃ ｒｙＩ　Ｉ　ＩＢおよびＣｒｙｉ　Ｉ　ＩＡを、また、ＣｒｙＩタンパク質と組 み合わせて使用して、鞘翅目の昆虫標的に対する予期せざるほどに増強された殺 昆虫組成物を得ることができる。ＣｒｙＩＩ　ＩＣ，Ｃｒｙｒ　Ｉ　ＩＢおよび ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＡのタンパク質の鞘翅目特異的活性は、このようなＣｒｙＩ　 Ｉ　１タンパク質を含有する殺昆虫組成物の中にＣｒｙＩタンパク質を添加また は混入することによって太き（増強される。

この方法を使用して、それぞれのＣｒｙＩ　Ｉ　ＩおよびＣｒｙＩのタンパク質 の物理的組み合わせを経てるか、あるいはそれぞれのタンパク質を作るＢ、ｔ、 菌株の組み合わせを経て、相乗的なＣｒｙｌＩＩ−Ｃｒｙ■タンパク質の殺昆虫 組成物を調製することができる。相乗的ＣｒｙＩＩＩ殺昆虫性の組み合わせにお いて使用するために好ましいＣｒｙｌタンパク質はＣｒｙＩＡ、とくにＣｒｙｌ Ａ（ｃ）であるが、他のＣｒｙＩタンパク質を、また、相乗的組み合わせにおい て使用することができると信じられる。驚（べきことには、鱗翅目の昆虫に対す るＣｒｙＩタンパク質の殺昆虫性効能の増強は存在しないように思われる：すな わち、ＣｒｙＩ　Ｉ　Ｉ結晶質タンパク質の存在により付与されるＣｒｙＩタン パク賀との「逆相乗性」は存在しないと思われる。

必要に応じて、本発明におけるＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ（またはＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＢ ）およびＣｒｙＩのタンパク質の組み合わせは、Ｂ、ｔ、菌株またはそれぞれの ＣｒｙｌＩＩおよびＣｒｙＩタンパク質を産生ずることができるこのようなｃｒ ｙＩ　Ｉ　Ｉ遺伝子およびｃｒｙＩ遺伝子を有する他の微生物の宿主の培養から 、組み合わせの形態でその場で得ることができる。このような菌株または宿主は 、Ｂ、ｔ−あるいはクローニングされたｃｒｙＩＩＩ遺伝子およびｃｒｙＩ遺伝 子を発現する組み換えプラスミドを含有する他の菌株および宿主微生物を包含す る、ブラスミｒのキユアリングおよび／または接合技術を経て得ることができる 。

この組み合わせの中に存在するＣｒｙＩ　Ｉ　Ｉタンパク質の物質にほぼ等しい 量のＣｒｙＩタンパク質は、鞘翅目特異的殺昆虫活性のすぐれた増強を提供する 。この１：１のＣｒｙＩ　：Ｃｒｙｌ　Ｉ　Ｔ比より少ない量のＣｒｙＩタンパ ク質は、同様になお満足すべきレベルの増強をＣｒｙＩＩＩタンパク質に与える であろう。

本発明の殺昆虫組成物は、標的の鞘翅目の昆虫の環境に、典型的には、保護すべ き植物または作物の葉の上に、慣用方法により、好ましくは適用により適用され る。他の適用技術、例えば、ダスチング、振り掛け、ソーキング、土の注入、種 子の被覆、実生の被覆または噴霧などは、また、可能であり、そして根または茎 の蔓延を引き起こす昆虫に要求される。適用手順はこの分野においてよく知られ ている。

ｃｒｙｌＩＩｃ遺伝子またはその機能的同等体は、以後時には「毒性遺伝子」と 呼び、広範な種類の微生物の宿主の中に導入することができる。ｃｒｙＩＩＩｃ 遺伝子の発現は、殺昆虫性Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ結晶質タンパク質の毒素の産生を 生ずる。適当な宿主は、Ｂ、ｔ、およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の他の 種、例えば、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉＩｔｓ）またはバチルス・メガテリウム（ Ｂ、　ｍｅ　ｇ　ａ　ｔ　ｒ　ｉ　ｕｍ）を包含する。植物コロニー化または根 コロニー化微生物を、また、ｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子のための宿主として使用する ことができる。当業者によく知られている種々の手順を利用して、ｃｒｙＩ　Ｉ 　ＩＣ遺伝子を微生物の宿主の中に、生ずる形質転換体中の安定な維持および発 現を可能とする条件下に導入することができる。

形質転換体、すなわち、組み換えプラスミドの中にクローニングされた遺伝子を 収容する宿主の微生物は、慣用方法に従い、組み換えプラスミドを含有する宿主 の微生物のみの成長を可能とする、選択技術を使用して分離することができる。

次いで、形質転換体を殺昆虫活性について試験する。再び、これらの技術は標準 の手順である。

産生の目的で宿主細胞を選択するときとくに興味ある特性は、宿主の中への遺伝 子の導入の容易さ、発現の効率、宿主中のＣｒｙＩ　Ｉ　ｒｃ殺昆虫性タンパク 質の安定性、および補助的遺伝学的能力の存在を包含する。殺昆虫性ｃｒｙＩ　 Ｉ　ＩＣ遺伝子を含有する細胞の宿主は便利な栄養培地中で成長することができ 、ここでｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子の発現が得られ、モしてＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタン パク質は産生じ、典型的には胞子形成する。次いで、結晶質タンパク質を含有す る胞子形成した細胞を慣用方法、例えば、遠心または濾過に従い収穫することが できる。

（ｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子は、また、遺伝子を発現し、モしてＣｒｙｌＩＩＣタ ンパク質を産生ずることができる植物の中に組み込み、植物を昆虫の攻撃に対し ていっそう抵抗性とすることができる。植物をｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子で遺伝子操 作することは、遺伝子を含有する所望のＤＮＡを植物の組織または細胞の中に、 植物の遺伝子操作において当業者によく知られている種々の形態および由来のＤ ＮＡ分子を使用して、導入することによって達成することができる。植物の組織 の中にＤＮＡを導入する技術の１つの例は、欧州特許出願公開第０．２８９．４ ７９号、モンサンド・カンパニー（Ｍｏｎｓａｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　、１９ ８８　−年１１月２日発行、に記載されている。

ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子またはＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質を産生ずること ができる修飾されたｃｒｙｌＩＩｃ遺伝子を含有するＤＮＡは、植物の細胞また は組織の中に、感染性プラスミド、例えば、Ｔ１１アグロバクテリウム・ツメフ ァシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ウィル スまたはアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）のような微生物からのプラスミドにより、リソソームまたはリポソームを使用 して、機械的方法のマイクロインジェクンヨンによりおよび植物の操作において 当業者に知られている他の技術により、直接供給することができる。

（ｒｙｌＩＩｃ遺伝子のヌクレオチド塩基配列を変更することができる。なぜな ら、遺伝子によりエンコードされるタンパク賀を形成する槍々のアミノ酸は、通 常、当業者によく知られているように、１より多いコドンにより決定することが できるからである。そのうえ、遺伝子の発現およびＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ殺昆虫性 タンパク賀の機能的に同等の形態の産生を可能とする、ｃｒｙＩＩＩＣヌクレオ チド塩基配列の解読領域において、多少の変化または切頭は存在することができ る。本発明を参照して不都合な実験なしに決定することができる、これらの変化 は、詳しく特許請求した主題と完全に同等であるので、添付する請求の範囲の範 囲内に入ると考られる。

次の特定の非限定的実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。

実施例は、一般にこの分野において知られている技術に基づいて、商業的に入手 可能な装置を使用して、実際に実施された研究に関する。

新規なり、ｔ、菌株ＥＧ４９６１は、実施例１に記載する手順に従い分離された 。

実施例Ｉ Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の分離 作物のダストの試料は、米国および外国、典型的には穀類貯蔵設備を通して種々 の源から入手した。作物のダストの試料は、作物のダストを水性緩衝液の中に懸 濁させ、そしてこの懸濁液を６０℃３０分間加熱して、耐熱性胞子形成性バチル ス属（Ｂａａ　ｉ　１１　ｕｓ）型バクテリア、例えば、Ｂ、ｔ、を濃縮するこ とによって処理した。処理したダストの懸濁液を水性緩衝液中で希釈し、そして 希釈液を寒天板上に広げて、作物のダストからの各個々のバクテリアが寒天板の 表面上にコロニーに成長できるようにした。成長後、各コロニーの一部分を寒天 板からニトロセルロースのフィルターに移した。フィルターをＮａＯＨで処理し てコロニーを溶菌し、そして各コロニーからのＤＮＡをフィルター上に固定した 。

コロニーのハイブリダイゼーション手順において利用するＢ、ｔ、のコロニーと ともに使用するために、変更した処理手順を開発した。なぜなら、］：、ｃｏｌ ｉに適用可能な標準の技術はＢ、ｔ、で有効ではないことがわかったからである 。前述の処理において、Ｂ、ｔ、のコロニーが成長の栄養成長状態にあり、Ｎａ ＯＨを使用する溶菌に対して感受性であることを保証するために、特別の条件が 要求された。したがって、各コロニーの一部分をニトロセルロースのフィルター に移した後、フィルターをコロニー側を上にして、０．５％（Ｗ／ｖ）のグルコ ースを含有する培地上に配！した。次いで、移したコロニーを寒天−グルコース 培地上で３０℃において５時間成長させた。寒天培地中の０．５％のグルコース の使用および５時間の３０℃のサイクルは、Ｂ、ｔ、　コロニーが栄養成長状態 にあり、こうして溶菌に対して感受性であることを保証するために菫要であった 。

南トウモロコシ根負い虫に対して毒性である新規な遺伝子を発見するためのプロ ーブとして、存在する鞘翅目の毒素の遺伝子を使用する試みが不成功であろうと いう、少な（とも１人の研究者が発表した意見にかかわらず、クローニングした 鞘翅目の毒素の遺伝子を特異的プローブとして使用して、作物のダストの試料か ら、Ｂ、ｔ、の他の新規なかつ希な鞘翅目毒性菌株を発見した。

トノパン（Ｄｏｎｏｖａｎ）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ ィックス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　、２ユ」−１ｐｐ。

３６５−３７２　（１９８８）に記載され、Ｂｔ、菌株ＥＧ２１５８のＣｙＣ遺 伝子として以前に知られていた、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺伝子を含有する、２．９ ｋｂＯ：）Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　ＩのＤＮＡ制限断片を、コロニーのハイブリダイゼ ーション手順において使用した。

２．９ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩのｃｒｙｌｌＩＡのＤＮＡ断片は、全体のｃｒｙＩ 　Ｉ　ＩＡ遺伝子を含有し、アルファー”ＰｄＡＴＰおよびクレノー酵素で、標 準の方法により放射線標識した。各溶菌したコロニーからのＤＮＡを含有するニ トロセルロースのフィルターを、放射線標識した２、９ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ　 ｃｒｙＩＩＩＡ　ＤＮＡプローブを含有する緩衝化溶液中の６５℃において１６ 時間インキコベーションして、コロニーからのＤＮＡを放射線標識したｃｒｙＩ ＩＩＡプローブからのＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた。６５℃ハイブリ ダイゼーション温度を使用して、ｃｒｙＩＩＩＡ　ＤＮＡプローブに類似する遺 伝子を含有するコロニーからのＤＮＡのみに、ｃｒｙＩＩＩＡ　ＤＮＡプローブ がハイブリダイゼーションするようにした。

２．９ｋｂのＣｒ７ＩＩＩＡプローブは作物のダストの種々の試料からの多数の Ｂ、ｔ、コロニーとハイブリダイゼーションした。これらのコロニーの検査は、 予期せざることには、それらがｃｒｙｌｌｌ型遺伝子を含有しないことを明らか にした。これらのコロニーはｃｒｙＩ型遺伝子を含有しなかった。ｃｒｙＩ型遺 伝子は、はぼ１３０ｋＤａの分子量をもつ、鱗翅目毒性、鞘翅目無毒の結晶質タ ンパク質をエンコードする。ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子の配列といくつかのｃｒｙＩ 型遺伝子の配列との、コンピューターを使用する比較は、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺 伝子の３゛末端がｃｒｙｌ型遺伝子の一部分と部分的に相同性であることを明ら かにした。この発見は、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺伝子の３゛末端がｃｒｙｌ型遺伝 子を含有するＢ、ｔ、　コｏニーに２．９ｋｂのｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＡプローブを ハイブリダイゼーションさせていたという考えを支持した。

この問題を補正するために、２．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ　ｃｒｙｌＩＩＡプロ ーブを酵素ＸｂａＩで消化し、そしてその３ｅをもたないＣｒｙｌＩＩＡ遺伝子 を含有する２、０ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＸｂａＩ断片を精製した。２．Ｏ ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＸｂａＩ断片は３′切頭ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＡ遺伝子 を含有する。この２．０ｋｂの断片を反復したコロニーのハイブリダイゼーショ ン実験において使用したと赤、それはｃｒｙＩ遺伝子を含有するＢ、ｔ、　コロ ニーとハイブリダイゼーションしなかった。

種々の位置からの作物のダストの試料からのほぼ４８．０００のバチルス属（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ）型コロニーを、放射線標識した２、　０ｋｂ　・のＨｉｎｄＩ ＩＩ−ＸｂａＩ　ｃｒｙｌＩＩＡプローブでブロービングした。イリノイ州の作 物のダストの試料からのただ１つのみの新規なり。

１、［株が、ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＡプローブに特異的にハイブリダイゼーションす ることが発見された。その新規な菌株をＢ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８と表示し、こ れはＮＲＲＬに受け入れ番号ＮＲ，ＲＬ　Ｂ−１８６０３で受託された。

引き続いて、作物のダストの試料からの追加の５０．０００のバチルス属（Ｂａ ｃ　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）型コロニーを、また、放射線標識した２、０ｋｂのＨｉｎ ｄＩＩＩ−ＸｂａＴ　ｃｒｙｌｌｌＡプローブテスクリーニングしたが、新規な ｃｒｙｌｌｌ型遺伝子を含有する他の菌株の同定は不成功に終わった。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８は、鞘翅目の昆虫、顕著にはコロラドジャガイモ甲虫 に対して殺昆虫活性であることが発見された。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８は、南 トウモロコシ根負い虫に関して実質的な殺昆虫活性をもたなかった。ｃｒｙｌ　 Ｉ　ＩＢ遺伝子と表示する遺伝子がＢ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８から分離され、そ してそのヌクレオチド塩基配列を決定した。ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢは、７４，２３ ７ダルトンの推定されるサイズを有する６５１アミノ酸を含有する、Ｃｒｙｌ　 Ｉ　ＩＢタンパク賀と表示する結晶質タンパク賀をエンコードした。先行技術の ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＡタンパク質のサイズは７３．１１６ダルトン（６４４アミノ 酸）であると推定された。ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢ遺伝子はＣｒＹＩＩＩＡ遺伝子と ７５％の相同性であり、モしてＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＢタンパク質はＣｒｙｌｌＩＡ タンパク質と６８％の相同性である。

世界中の種々の位置からの３９の作物のダストの試料からのほぼ４０゜０００の バチルス属（Ｂａｃｉ　１１ｕｓ）型コロニーを、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８か ら得られたｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢプローブでスクリーニングした。ＣｒｙｌＩＩＢ プローブを、放射線標識したｃｒｙＩＩＩＡプローブに関して前述した手順を使 用して、放射線標識した。放射線標識したｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢプローブは、Ｂ、 ｔ、菌株ＥＧ２８３８からのＤＮＡからの２．４ｋｂの制限断片から成っていた 。この断片は、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８の鞘翅目の毒素のｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢ 遺伝子のための、完全なタンパク貫解読領域を含有する。究極的に、ｃｒｙＩＩ ＩＢプローブに特異的にハイブリダイゼーションする、作物のダストの試料から の新規なりｔ、菌株が発見された。この菌株をＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１と表示 する。

Ｂ、ｔ、１株ＥＧ４９６１を特性決定するために、いくつかの研究を実施した。

１系列の研究を実施して、その鞭毛の血清型を特性決定した。

追加の研究を実施して、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１中の自然プラスミドのサイズ を決定し、そして殺昆虫性結晶質タンパク貢をエンコードする遺伝子をどのプラ スミドが含有するかを決定した。ＤＮＡのプロット分析を実施して、Ｂ、ｔ、菌 株ＥＧ４９６１の自然プラスミドのいずれかがｃｒｙｌｌＩＢプローブとハイブ リダイゼーションするかどうかを決定した。ＤＮＡ要素がＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９ ６１のＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢとハイブリダイゼーションするかどうかを単一の天然 に存在するプラスミドについて実施ごとは、多数のプラスミドまたは染色体のＤ ＮＡについて実施することと反対に、また、重要であった。さらに、Ｂ、ｔ、菌 株ＥＧ４９６１は、さらに、それが産生ずる結晶質タンパク質を特性決定し、モ してＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１およびその結晶質タンパク質に関連する殺昆虫活 性を測定することによって評価した。実施例２〜６はＢ、ｔ。

菌株ＥＧ４９６１を特性決定する手順に関し、そして実施例８〜Ｂ、ｔ。

菌株ＥＧ４９６１の殺昆虫活性に関する。

実施例２ Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の鞭毛の血清型特性決定Ｂ、ｔ、型鞭毛の抗体試薬の パネルを、血清型別研究において使用のために、一般に入手可能なり、ｔ、型菌 株を使用して構成した。Ｂ、ｔ。

型菌株ＨＤＩ　（ｋｕ　ｒ　ｓ　ｔ、　ａｋ　ｔ、血清型３ａｂ）　、ＨＤ２　 （ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、血清型ｌ）　、ＨＤ５　（ｋｅｎｙａｅ、血清 型４ａｃ）、ＨＤＩＩ　（ａｉｚａｗａｉ、血清型７）、ＭＤＩ２（ｍｏｒｒｉ ｓ　ｏｎ　ｉ、血清型８ａｂ）およびＭＤＩ３　（ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ、血清型 ９）を、液体培養（震盪せず）において、動き得る、栄養成長の細胞を産生条件 下に成長させた。鞭毛の断片を細胞から渦形成して剪断し、細胞を遠心により除 去し、モして鞭毛の断片を上澄み液から０．　２μｍの孔サイズのフィルター上 に集めた。精製した鞭毛断片の調製物をドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリル アミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。これらのＢ、ｔ、 型菌株の鞭毛断片の調製物についての５ＤＳ−ＰＡＧＥのプロフィルは、２０〜 ３５ｋＤａの範囲においてこれらの調製物の各々について大部分バンドを示した 。

これらの精製された鞭毛断片の調製物は、標準の手順に従いマウスにおける抗体 の産生のために使用した。このアッセイにおいて、抗血清の系統的希釈物を丸底 の９６ウエルのマイクロプレート中の調製した。Ｂ。

ｔ、型菌株（または血清型別すべき試料の菌株）のホルマリン固定した細胞懸濁 液をウェルに添加し、そしてｍ胞の塊がウェルの底付近Ｉこ可視となるまで、混 乱させずに放置した。アッセイは拡大鏡を使用してプレートの底からの細胞の凝 集について視的にスコアをつけた。細胞を誘導したＢ、ｔ、型菌株の細胞と最強 の特異的反応を与える抗血清を、鞭毛抗体試薬として使用した。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８およびＥＧ４９６１の各々からの細胞を、６つのＢ、 ｔ、型菌株からの鞭毛抗体試薬のパネルを使用する、細胞凝集のアッセイにおい て、試料として別々に久方した。各Ｂ、ｔ、型菌株の細胞を対照として含めた。

この研究の結果は、ＭＤＩ、ＨＤ２、ＨＤ５、ＨＤＩＩ、ＭＤＩ２およびＭＤＩ ３、Ｂ、ｔ、型菌株の細胞がそれらのそれぞれの鞭毛抗体試薬と強くかつ特異的 に反応することを示した。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８の細胞はｍｏｒｒｉｓｏｎｉ　（Ｂ、ｔ、型菌株ＨＤ １２）の鞭毛抗体試薬と強くかつ特異的に反応したが、Ｂ、ｔ、。

菌株ＥＧ４９６１からの細胞はいずれの抗体試薬とも反応しなかった。

これらの結果はＢ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８が亜種ｍｏｒｒｉｓｏｎｔＢ。

ｔ、菌株であることを確証し、そしてＢｔ、菌株ＥＧ４９６１は亜種ｍｏｒｒｉ ｓｏｎｉ、ｋｕｒｓｔａｋｉ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ。

ｋｅｎｙａｅ、ａ　ｉ　ｚａｗａ　ｉまたはｔｏｌｗｏｒｔｈｉでないことを示 す。

実施例３ ＥＧ４９６１の自然プラスミドのサイズ分画およびｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢのブロー ビングＢ、ｔ、菌株をアガロースゲルの電気泳動と呼ばれるよく知られた手　− 順により、サイズに従い分画することによって、Ｂ、ｔ、！！ｒ株を特性決定す ることができる。この手順はＢ、ｔ、細胞をリゾチームおよびＳＤＳで溶菌し、 アガロースゲルを通してリゼイトからプラスミドを電気泳動させ、そしてゲルを 臭化エチジウムで染色してプラスミドを可視化することを包含する。ゲルを通し てゆっくり動（、より大きいプラスミドはゲルの上部に現れ、そしてより小さい プラスミドはゲルの底に向かって現れる。

第２図におけるアガロースゲルは、水平のバンドにより示されるように、Ｂ、ｔ 、！ｉ株ＥＧ４９６１がほぼ１５０．９５．７０．５０．５および１．５ＭＤａ の自然プラスミドを含有することを示す。プラスミドのサイズは、既知のサイズ のプラスミド（図示せず）との比較により推定した。第２図は、さらに、鞘翅目 毒性Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８が約１００．９０および３７ＭＤａの自然プラス ミドを含有ことを示す。第２図は、また、Ｂ、ｔ、ＩＩ株ＥＧ２１５８が約１５ ０．１０５．８８．７２および３５ＭＤａの自然プラスミドを含有することを示 す。プラスミドのいくつか、例えば、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の１５０および １゜５ＭＤａのプラスミドおよびＢ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８の１５０ＭＤａのプ ラスミドはこの写真の中に可視ではないが、それらは実際のゲルにおいて可視で ある。第２図が実証するように、Ｂ、ｔ、！１株ＥＧ４９６１の自然プラスミド のサイズはＢ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８およびＥＧ２８３８の自然プラスミドのサ イズと異なる。

第２図に示すプラスミドをアガロースゲルからニトロセルロースのフィルターに 、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、ジャーナル・オブ・モレキュー　ラー・バイオ ロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｌ　９８、ｐｐ、５０３−５１７　（１９７５ ）のプロット技術により、移し、そしてフィルターを前述したように放射線標識 した２、４ｋｂのｃｒｙＩＩＩＢ　ＤＮＡのプローブとハイブリダイゼーション させた。ハイブリダイゼーション後、フィルターをＸ線フィルムに暴露した。Ｘ 線フィルムの写真を第３図に示し、これは暗くした区域によりｃｒｙＩＩＩＢプ ローブがＢ、ｔ。

菌株ＥＧ４９６１の９５ＭＤａのプラスミドにハイブリダイゼーションしたこと を示す。この結果が示すように、Ｂ、ｔ、ｉＩ株ＥＧ４９６１の９５ＭＤａのプ ラスミドはｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子に少な（とも部分的に相同性であるＤＮＡ配列 を含有する。また、第３図が示すように、ｃｒＹＩ　Ｉ　ＩＢプローブは、期待 するように、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８の８８ＭＤａのプラスミドおよびＢ、ｔ 、ＩＩ株ＥＧ２８３８の１００ＭＤａのプラスミドにハイブリダイゼーションし た。Ｂ、ｔ、ｉｌ１株ＥＧ２１５８の８８ＭＤａのプラスミドは、鞘翅目毒性ｃ ｒｙＩＩＩＡ遺伝子を含有することが従来示された［参照、トノパン（Ｄｏｎｏ ｖａｎ）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　、　メ２１４１、　ｐｐ、３６５−３７２　（１９８ ８）　コ　。

Ｂ、ｔ、　ｍ株ＥＧ２８３８の１００ＭＤａのプラスミドは鞘翅目毒性Ｃｒｙｌ 　Ｉ　ＩＢ遺伝子を含有することが決定された。

ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢプローブは、また、第３図において文字ｒｆ」で示す、Ｂ、 ｔ、ｍ株ＥＧ４９６１、ＥＧ２８３８およびＥＧ２１５８の各々ノ中のＤＮＡの 小さいバンドにハイブリダイゼーションした。従来の実験は、Ｂ、ｔ、のプラス ミドが電気泳動の間に断片にしばしば破壊することを示した。これらの断片は、 通常、第３図において文字ｒｆＪで示すバンドの位置に移動する。したがうて、 第３図において文字ｒｆＪで示すバンドは、それぞれ、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６ １、ＥＧ２８３８およびＥＧ２１５８の９５ＭＤａ、８８ＭＤａおよび］、ＯＯ ＭＤａの断片化により誘導された可能性が最も強い。

実施例４ Ｂ、ｔ、！Ｉ株ＥＧ４９６１からのＤＮＡのプロット分析染色体のプラスミドの ＤＮＡおよびＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１からのプラスミドのＤＮＡの両者を抽出 し、そしてＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ＋ＥｃｏＲＩの制限酵素で消化した。消化したＤ ＮＡをアガロースゲルを通す電気泳動によりサイズ分画し、そして断片を臭化エ チジウムの染色により可視化した。第４図は染色したアガロースゲルの写真であ り、このゲルはＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のサイズ分画したＨｉｎｄｌｌｌおよ びＥｃｏＲＩの制限断片を含有する。比較のため、鞘翅目毒性Ｂ、ｔ、！ＩＮ株 ＥＧ２１５８およびＥＧ２８３８からのＤＮＡを同一の方法でプロセシングした 。ｒｓｔｎｄＪと標識するレーンは、サイズ標準として働く、既知のサイズのラ ムダＤＮＡ断片を含有する。第４図が示すようＩ：、Ｈｉｎｄｌ　ｌ　Ｉ＋Ｅｃ ｏＲＩ消化したＢ、ｔ、ＤＮＡは、数百の種々のサイズのＤＮＡ断片を生ずる。

第４図に示すＤＮＡをアガロースゲルからニトロセルロースのフィルターに移し 、そしてこのフィルターを放射線標識した２、５ｋｂのｃｒｙＩＩＩＢ　ＤＮＡ プローブを含有する緩衝化水溶液中で６５℃においてハイブリダイゼーションさ せた。ハイブリダイゼーション後、フィルターをＸ線フィルムに暴露した。第５ 図はＸ線フィルムの写真であり、ここで右に対する数は、ｒｓｔｎｄＪど標識し たレーンにおいてサイズのマーカーとしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したうムダＤＮ Ａとの比較により決定した、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢと ハイブリダイゼーションする断片のサイズ（ｋ　ｂ）を示す。第５図が示すよう に、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ＋ＥｃｏＲＩ消化したＤＮ Ａは、はぼ３．８ｋｂおよび２．４ｋｂのｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢとハイブリダイゼ ーションする断片を生ずる。また、第５図が示すように、Ｂ、ｔ。

菌株ＥＧ２８３８のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ＋ＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡは、はぼ２ ．９ｋｂおよび３．８ｋｂのｃｒｙｌｌＩＢとハイブリダイゼーションする断片 を生ずる。さらに、第５図が示すように、Ｂ、ｔ、ｌ１株ＥＧ２１５８のｃｒｙ ｌ　Ｉ　ＩＢとハイブリダイゼーションする制限ＤＮＡ断片の概算のサイズは１ ．６ｋｂおよび０．７ｋｂである。

これらの結果が示唆するように、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１はｃｒｙ１１１Ｂ遺 伝子のプローブに関係するｃｒｙＩＩＩ型遺伝子を含有する。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢとハイブリダイゼーシｇンする 断片はＢ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８およびＥＧ２１５８の断片と異なる。これらの 結果および下の実施例に記載するそれ以上の研究は、Ｂ。

ｔ、菌株ＥＧ４９６１のｃｒｙｌｌＩ型遺伝子がＥＧ２８３８のｃｒｙ１１１Ｂ 遺伝子およびＥＧ２１５８のｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＡ遺伝子と明瞭に異なることを確 証する。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のｃｒｙＩ　Ｉ　Ｉ型遺伝子をｃｒｙＩ　Ｉ 　ＩＣと表示した。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１をＤＳＭＧ胞子形成培地中で３０℃におい　−て、胞 子形成および細胞の溶菌が起こるまで（３〜４日間の成長）成長させた。ＤＳＭ Ｇ培地は、０．４％（ｗ／ｖ）のディフコ（Ｄｉｆｃｏ）栄養フロス、２５ミリ モルのに宜ＨＰｏ４．２５ミリモルのＫＨ２ＰＯ４，０，５ミリモルのＣａ　（ ＮＯｘ）　ｘ、０．５ミリモルのＭｇ　Ｓ　０４．１ＯａモルのＦｅ５Ｏａ、１ ＯａモルのＭｎＣ１，および０．　５％（ｗ／ｖ）のグルコースである。Ｂ、ｔ 、菌株ＥＧ４９６１の胞子形成した培養物は、顕微鏡検査により観察すると、Ｂ ｔ、菌株に加えて、自由に浮く、不規則の形状の結晶を含有した。実験において 、Ｂ、ｔ、の結晶は通常特定の昆虫に対して毒性であることがあるタンパク質か ら構成されていることが示された。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の結晶の外観は、 Ｂ、ｔ。

菌株ＥＧ２１５８の平らな、規則的な（または菱形の）結晶と異なったが、Ｂ、 ｔ、菌株ＥＧ２８３８の不規則な形状の結晶のあるものに部分的に類似した。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の胞子形成した培養物からの胞子、結晶おを可溶化緩 衝液（０，１３モルのトリスｐＨ８，５，２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、５％（Ｖ／ Ｖ）の２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）中で１０ ０℃に５分間加熱することによって、遠心した発酵培養の固体（結晶、胞子およ び多少の細胞破片を含有する）から結晶を可溶化した。可溶化した結晶質タンパ ク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分画した。サイズ分画後、タンパク質をク ーマツシー色素で染色することによって可視化した。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８ およびＥＧ２８３８の培養物を、比較の目的で、同一方法でプロセシングした。

第６図はこれらの分析の結果を示し、ここで右に対する数はＢ、ｔ。

菌株ＥＧ４９６１により合成された結晶質タンパク質のサイズ（ｋＤａ）を示す 。はぼ７０ｋＤａの主要なタンパク質およびほぼ３０ｋＤａの少量のタンパク質 が、遠心したＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の胞子および結晶を含有する発酵固体か ら可溶化された。Ｂｔ、菌株ＥＧ４９６１のほぼ７０ｋＤａのタンパク質は、Ｂ 、ｔ、菌株ＥＧ２１５８のほぼ７０ｋＤａの鞘翅目毒性結晶質タンパク質および Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８はぼ７０ｋＤａの鞘翅目毒性結晶質タンパク質とサイ ズが類似するように思われる。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のほぼ３０ｋＤａの少 量の結晶質タンパク質は、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８により産生されたほぼ３１ ｋＤａおよび２９ｋＤａの結晶質タンパク質およびＢ、ｔ、菌株ＥＧ２８３８に より産生されたほぼ２８ｋＤａおよび３２ｋＤａの結晶質タンパク質におおよそ 類似する。これらの小さいタンパク質が互いに関係するするかどうかは知られて いない。

実施例４の手順後、それ以上のＤＮＡのプロット分析において、２゜４ｋｂのｃ ｒｙｌｌｌＢ　ＤＮＡプローブはＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のＤＮＡの単一の８ ．３ｋｂのＡｓｐ７１８−Ｐｓ　ｔ　Ｉ制限断片に特異的にハイブリダイゼーシ ヨンすることが明らかにされた。この結果がが示唆するように、８．３ｋｂの断 片は完全なｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子を含有した。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の８．３ｋｂのＡｓｐ７１８−ＰｓｔＩ断片を分離し 、そしてこのＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の８．３ｋｂのＡｓｐ７１８−ＰｓｔＩ 制限断片について研究を実施して、断片がｃｒｙｌＩＩ型遺伝子を含有すること を確証し、モしてｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子のヌクレオチド塩基配列を同定および決 定した。この手順は実施例６に記載されている。

前の実施例に記載する８、３ｋｂの断片をクローニングするために、Ｂ、ｔ、菌 株ＥＧ４９６１からのサイズ選択したＤＮＡのＡｓｐ７１８−ＰｓｔＩ制限断片 をよく知られたＥ、ｃｏｌｉのベクターｐ１８の中に結合することによって、Ｂ 、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のプラスミドのライブラリーを構成した。この手順は、 まず細胞の溶菌および引き続くスプーリングによりＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１か ら全体のＤＮＡを取り、次いで全体のＤＮＡをＡｓｐ７１８およびＰｓｔｌの両 者の制限酵素で二重消化し、ＤＮＡ断片したＤＮＡをアガロースゲルを通して電 気泳動させ、ＤＮＡの７ｋｂ−９ｋｂの選択した断片を含有するゲルのスライス を切除し、そしてアガロースゲルのスライスからサイズ選択したＡｓｐ７１８− ＰｓｔＩ制限断片を電気溶離することを包含する。選択した断片を、また、Ａｓ ｐ７１８およびＰｓｔＩで消化した、Ｅ、ｃｏｌｉのプラスミドベクターｐＵｃ １８と混合した。ｐＵＣ１８ベクターは、アンピシリン抵抗性（Ａｍｐ’）の遺 伝子を有し、そしてこのベクターはＥ、ｃｏｌｉ中で複製する。Ｔ４　ＤＮＡリ ガーゼおよびＡＴＰを、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１および消化したｐＵｃ１８ベ クターからのＤＮＡのサイズ選択した制限断片の混合物に添加して、ｐＵｃ１８ ベクターをＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１の制限断片と結合させた。

次いで、プラスミドのライブラリーをＥ、ｃｏｌｉ細胞、すなわち、問題の遺伝 子を欠如する宿主の有機体、の中に、次のようにして形質転換した。結合後、Ｄ ＮＡ混合物を、ＣａＣ１，で処理して細胞がＤＮＡを吸収するようにさせた、ア ンピシリン感受性Ｅ、ｃｏｌｉ宿主菌株、Ｅ、ｃｏ１ｉ薗株Ｈ菌株ＯＩとインキ ュベーションした。Ｅ、ｃｏｌｉ１詳しくは菌株ＨＢＩＯＩを宿主菌株として使 用した。なぜなら、これらの細胞は組み換えプラスミドで容易に形質転換され、 そしてＥ、ｃｏｌｉ薗株Ｈ菌株ＯＩはＢ、ｔ、の結晶質タンパク質を自然に含有 しないからである。ｐＵｃ１８はアンピシリン抵抗性を付与するので、組み換え プラスミドを獲得するすべての宿主細胞はアンピシリン抵抗性となるであろう。

組み換えプラスミドに対して暴露後、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞をアンピシリンを含 有する寒天培地の上に広げた。数千のＥ、ｃｏｌｉのコロニーは、組み換えプラ スミドを収容した細胞から、アンピシリンを含有する寒天の上で成長した。次い で、これらのＥ、ｅｏｌｉのコロニーを引き続くブロービングのためにニトロセ ルロースのフィルター上にブロッティングした。

次いで、放射線標識した２、４ｋｂのｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子のプローブを、Ｂ、 ｔ、菌株ＥＧ４９６１からのＤＮＡの８．３ｋｂのＡｓｐ７１８−Ｐｓｔｌ断片 を含有する形質転換された宿主のコロニーにプローブが特異的にハイブリダイゼ ーションできる条件下に、ＤＮＡプローブとして使用した。１つのｃｒｙＩ　Ｉ 　ＩＢとハイブリダイゼーションするコロニー、Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＥＧ７２１８ と表示する、をさらに研究した。Ｅ、ｃｏ１ｉ菌株ＥＧ７２１８は、ｐＵｃ１８ ＋ＤＮＡの８．３ｋｂのＡｓｐ７１８−Ｐｓ　ｔ　Ｉ制限断片から成る、ｐＥＧ ２５８と表示する、組み換えプラスミドを含有した。ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢプロー ブはｐＥＧ　−２５８の８．３ｋｂの断片に特異的にハイブリダイゼーションし た。ｐＥＧ２５８の制限地図を第７図に示す。

ｐＥＧ２５８の８．３ｋｂの断片は、２．４ｋｂおよび３．８ｋｂのＨｉｎｄｌ 　Ｉ　Ｉ断片、およびｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢプローブと特異的にハイブリダイゼー ションした４、０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を含有した。２．４ｋｂのＨ ｉｎｄＩＩＩ断片をＤＮＡ配列決定ベクターＭ１３ｍｐ１８の中にサブクローニ ングした。４．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片をＤＮＡ配列決定ベクターＭ １３ｍｐ１８およびＭｌ　３ｍｐ　Ｌ９の中にサブクローニングした。

各サブクローニングしたＤＮＡ断片の実質的な部分のヌクレオチド塩基配列を、 標準のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ法を使用して決定した。各サブクロ ーニングした断片について、両者のＤＮＡ鎖は配列特異的１７マーのオリゴヌク レオチドのプライマーを使用してＤＮＡの配列決定反応を開始することによって 配列決定した。配列決定において、８．３ｋｂの断片はオーブンリーディングフ レームおよび、と（に、新規なｃｒｙＩＩＩ型遺伝子を含有することが明らかに された。この新規な遺伝子、ｅｒｙＩＩＩｃと表示する、は、ｃｒｙＩ　Ｉ　Ｉ Ａ遺伝子と有意に異なる。下に示すように、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子は、また 、ｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子と明瞭に異なる。

ｃｒｙｌｌｌｃ遺伝子のＤＮＡ配列およびｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子によりエンコー ドされるＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質の推定されたアミノ酸配列は第１図に示 されている。ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ遺伝子のタンパク質解読部分は、位置１４にお いて開始しそして位置１９７２において終わるヌクレオチドにより定められる。

確からしいリポソーム結合部位を第１−１図ｎ１ｒＲＢＳＪとして示す。ｃｒｙ Ｉ　Ｉ　ＩＣ遺伝子によりエンコードされるＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＣタンパク質のサ イズは、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子のオーブンリーディングフレームから推定す るとき、７４．３９３ダルトン（６５１アミノ酸）である。ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ タンパク質の見掛けのサイズは、５ＤＳ−ＰＡＧＥから決定して、はぼ７０ｋＤ ａであることに注意すべきである。したがって、ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質 はこの明細書の中でほぼ７０ｋＤａのサイズであると言及されるであろう。

先行技術のＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＡタンパク質のサイズは、７３．１１６ダルトン（ ６４４アミノ酸）であると従来推定された。ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢタンパク質のサ イズは、７４，２３７ダルトン（６５１アミノ酸）であると従来推定された。

ＤＮＡの配列決定は、ｃｒｙｌｌＩｃ遺伝子内のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩ Ｉの制限部位を明らかにした（参照、第１−２図）。これらのＭ限部位の位置の 知識は、第７図に矢印で示すように、８．３ｋｂの断片内にｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ 遺伝子の位置および向きの正確な決定を可能とした。

クイーン（Ｑｕｅｅｎ）およびコーン（Ｋｏｒｎ）のコンピュータープログラム ［Ｃ，クイーン（Ｑｕｅｅｎ）およびり、Ｊ、コーン（Ｋ。

ｒｎ）、「小型コンピューターによる生物学的配列の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　 ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｎ　Ｓｍａｌｌ　Ｃｏｍ ｐｕｔｅｒｓ）Ｊ、ＤＮＡ、３、ｐｐ、４２１−４３６（１９８４）］を使用し て、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子の配列をｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子およびｃｒｙＩ　 Ｉ　ＩＡ遺伝子の配列と比較し、そしてそれらのそれぞれのＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ ，Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢおよびＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＡタンパク質の推定されたアミノ 酸配列を比較した。

ｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子のヌクレオチド塩基配列は、ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＢ遺伝子の ヌクレオチド塩基配列と９６％が位置的に同一であり、そしてＣｒｙＩ　Ｉ　Ｉ Ａ遺伝子のヌクレオチド塩基配列とわずかに７５％が位置的に同一であった。こ うして、ｃｒｙＩ　Ｉ　ｒｃ遺伝子はｃｒｙｌＩＩＢ遺伝子およびｃｒｙＩ　Ｉ 　ＩＡ遺伝子に関係するが、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子はｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＢ遺 伝子と区別され、モしてｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＡ遺伝子と実質的に異なることが明ら かである。

ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質の推定されたアミノ酸配列は、ＣｒｙＩＩＩＢタ ンパク質の推定されたアミノ酸配列と９４％が位置的に同一であるが、ＣｒｙＩ 　Ｉ　ＩＡタンパク貫の推定されたアミノ酸配列にわずかに６９％が位置的に同 一であることが発見された。これらの差は、後述するように殺昆虫活性の差と一 緒に、ｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ遺伝子によりエンコードされるＣｒｙＩＩＪＣタンパ ク質がＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢタンパク質またはＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＡタンパク質と異 なるタンパク質であることを明瞭に示す。

そのうえ、いかなる理論にも拘束されたくないが、ＣｒｙＩＩＩＣタンパク質お よびＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＢタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、次のアミノ酸残 基はＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質の増強されたトウモロコシの根食い虫の毒性 について意味をもちつると１しられ、ここでアミノ酸について受け入れられた略 号の後の数は第１図に示す硫酸中のアミノ酸の位置を示ｆ　：　Ｈｉ　ｓ　９、 Ｈｉｓ２３１、Ｃ１ｎ３３９、Ｐｈｅ３５２、Ａｓｎ４４６、Ｈｉｓ４４９、Ｖ ａ１４５０．５ｅｒ４５１、Ｌ７Ｓ６００およびＬ）’５６２４．これらのアミ ノ酸残基はＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質のトウモロコシの根食い虫の毒性につ いて確からしい意味をもつので選択した。なぜなら、い（つかの他のＣｒｙＩ　 Ｉ　Ｉタンパク質のアミノ酸配列の研究後、示した位！におけるアミノ酸は、Ｃ ｒｙｌｌＩＣタンパク質について示すアミノ酸と異なるアミノ酸をかなり首尾一 貫して示したからである。

実施例７ クローニングしたｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子の発現ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ遺伝子による ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質の産生を決定するために、研究を実施した。

表１は、これらの手順の間に使用したＢ、ｔ　およびＥ、ｃｏｌｉの菌株および プラスミドの関係する特性を要約する。プラス（っは表示する要素、活性または 機能の存在を示し、そしてマイナスＣ）はそれらの不存在を示す。表示１および ′は、各々と一緒に使用する抗生物賀に対する、それぞれ、感受性および抵抗性 を示す。この表において使用する略号は次の意味を有する：Ａｍｐ（アンピシリ ン）；Ｃｍ（クロランフェニコール）；Ｃｒｙ　（クリスタリフェラス）；Ｔｃ （テトラサイクＨＤ７３−２６　Ｃｒｙ−、ｃｍ” ＥＧ７２１１　ｐＥＧ２２０ｔ−収容ｔ　ルＨＤ７３−２６（ＣｒｙっＥＧ７２ ２０　ｐＥＧ２６０を収容するＨＤ７３−２６（ｃｒｙＩＩＩＣ”　ｃｒｙＸっ ＥＧ７２３１　ｐＥＧ２６９を収容するＨＤ７３−２６（ｃｒｙＩＩＩＣ”　ｃ ｒｙＸ−）ＥＧ４９６１　ｃｒｙＩＩＩＣ”　ｃｒｙＸ’Ｌ（其 ＤＨ５α　ｃｒｙ−、＾厘ｐ“ ＧＭ２１６３　ｃｒｙ−、＾■ｐ″ ＥＧ７２１８　ｐＥＧ２５ｇを収容するＤＨ５ａ　（ｃｒｙＩＩＩＣ’″ｃｒｙ ＸっＥＧ７２２１　ｐＥ１ｇヲ収容ｔ　ルＤＨ５ａ　（Ｃｒｙ−）ＥＧ７２３２ 　ｐＥＧ２６８を収容するＤＨ５ａ　（ｃｒｙＩＩ工Ｃ″ｃｒｙ１つＥＧ７２３ ３　ｐＥＧ２６９を収容するＤＨ５α（ｃｒｙＩＩＩｃ”　ｃｒｙＸっプラスミ ド ｐＥＧ２２０　ｐ）ｆＮｌ（１１旬５ｐｈＩＮ位の中に結合したｐＢＲ３２２か ら成る＾叩１、Ｔｃ’、Ｃ＋＋’、Ｃｒｙ＼Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｅ、ｃｏｌｉの シャトルベクター ｐ［ＩＣｌ３　Ａｍｐ”、Ｃｒｙ−１Ｅ、Ｃｏ１１ベクターｐＮＮ１０１　Ｃｍ ’、　Ｔｃ’、　Ｃｒｙ−１ｈｃｉｌｌｕｓ−ベクターｐＥＧ２５８ｐＵｃＩ８ ｅＡｓｐ７１ｇ−Ｐｓｔ１部位の中に結合されたＢ、ｔ。

菌株ＥＧ４９６１の８．３ｋｂのＡ　Ｓ　９７１ｇ　−ＰｓｔＩｃｒｙＩＩＩｃ ”″ｃｒｙＸ＋断片から成るＡｍｐ’、ｃｒｙＩＩＩｃ”ｃｒｙＸ“　Ｅ、ｃｏ ｌｉの組み換えプラスミドｐＥＧ２６０　ｐＮＮＩｏｌのＥｃｏＲＶｇ位の中に 平滑結合されたＢ、　ｔ、ｌＩ株ＥＧ４９６１の８．３ｋｂのＡｓｐ７１８−Ｐ ｓｔＩ　ｃｒｙＩＩＩｃ”　ｃｒｙＸ◆断片から成るＴｃ’、Ｃｍ’、ｃｒｙＩ ＩＩＣ”　ｃｒｙＸ”　Ｂａｃｉｌｌｕｓの組み換えプラスミド ｐＥＧ２６８　ｐＢＲ３２２ｔｒＢａｍＨ１部位の中に結合されたＢ、　ｔ、！ ＩＩ株ＥＧ４９６１の５ｋｂｅＳａｕ３Ａ断片から成るＡ＋１１ｐ’　ｃｒｙＩ ＩＩＣ”　ｃｒｙＸ−Ｅ、ｃｏｌｉの組み換えプラスミド ｐＥＧ２６９　ｐＥＧ２６８の５ｐｈＩ部位の中に結合されたｐＮＮｌｏｌから 成る、Ａｍｐ’（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、Ｔｃ’およびＣｍ’（Ｂ、　ｔ、　）、ｃ ｒｙｌＩＩｃ”　ｃｒｙＸ−１組み換えシャトルプラスミド 実施例６に記載するクローニングした８、３ｋｂの断片を収容するＥ。

ｃｏｌｉ細胞を分析して、それらが７０ｋＤａのＣｒｙｌＩＩＣ結晶質タンパク 質を産生かどうかを決定した。

実験において、クローニングしたＢ、ｔ、の結晶買遺伝子はＥ、ｃ。

１１において劣った発現され、モしてＢ、ｔ、において高度に発現されることが 示された。実施例６に記載するようにして構成した組み換えプラスミドｐＥＧ２ ５８は、Ｅ、ｃｏｌｉの中で複製するが、Ｂ、ｔ、　ｆ７）中で複製しないであ ろう。クローニングされたｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子の高いレベルの発現を達成する ために、８．３ｋｂのｃｒｙＩＩＩｃ断片を、ｐＥＧ２５８から、Ｂ、ｔ、の中 で複製することができるプラスミドのベクターｐＮＮ１０１　（Ｔｃ’Ｃｍ’Ｃ ｒｙ−）に転移した。

プラスミドの構成体ｐＥＧ２５８を、Ｅ、ｃｏｌｉ薗株Ｅ菌株２１８発酵槽、リ ゾチーム／ＳＤＳ処理、引き続くプラスミドＤＮＡのエタノール沈澱により、す べて標準手順を使用して、分離した。次いで、ｐＥ０２５８プラスミドＤＮＡを 使用して、実施例６に前述した塩化カルシウムの手順により受容能力をもたせた Ｅ、Ｃｏ１１菌株ＧＭ２１６３の細胞を形質転換した。Ｅ、ｃｏｌｔ薗株Ｇ菌株 １６３は、結晶陰性（Ｃｒｙ−）およびアンピシリン感受性（Ａｍｐ’）であり 、Ｍ、Ｇ、マリヌス（Ｍａ　ｒ　ｉ　ｎｕ　ｓ）ら、モレキュラー・アンド・ジ ェネラル・ジェネティックス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　、１９２、ｐ ｐ、２８８−２８９　（１９８３）の手順により構成した。

プラスミド構成体ｐＥＧ２５８を、再び、形質転換されたＥ、ｃｏｌｉＩＩ株Ｇ Ｍ２１６３から、ちょうど記載した手順を使用して分離した。

分離されたｐＥＧ２５８プラスミドＤＮＡをＡｓｐ７１８およびＰｓｔＩで消化 した。消化したプラスミドをアガロースゲルを通して電気泳動させ、そして８． ３ｋｂのＡｓｐ７１８−Ｐｓｔｌ　ｃｒｙＩＩＩｃ断片をアガロースゲルから電 気溶離した。８．３ｋｂの断片をＴ４ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド トリホスフェートを使用して平滑末端として、Ａｓｐ７１８およびＰｓｔｌ末端 をフィルインした。

平滑末端の８．３ｋｂの断片を、ＥｃｏＲＶで消化したバチルス属（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ）のベクターｐＮＮ１０１と混合した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびＡＴ Ｐをこの混合物に添加して、８．３ｋｂの断片を平滑末端として、ｐＮＮ１０１ ベクターのＥｃｏＲＶの中に結合した。結合後、ＤＮＡ混合物をＢ、ｔ、菌株Ｈ Ｄ７３−２６細胞の懸濁液に添加した。Ｂ、ｔ、菌株ＨＤ７３−２６の細胞は結 晶陰性（Ｃｒｙっでありそしてクロランフェニコール感受性（Ｃｍ’）である。

エレクトロポレイシコンの技術を使用して、混合物中のＢ、ｔ、！ｉｔ株ＨＤ７ ３−２６の細胞を誘導して、ｐＮＮＩＯＩおよび、また、この混合物の中に存在 する結合された８、３ｋｂ０）ｃｒｙＩＩＩＣ断片を吸収させた。こうして、組 み換えプラスミドはＢ、ｔ−菌株ＨＤ７３−２６の中にエレクトロボレイシ目ン により形質転換された。

エレクトロポレイション後、形質転換されたＢ、ｔ、細胞を５μｇのクロランフ ェニコールを含有する寒天培地上に広げ、そして３０℃において約１６〜１８時 間インキュベーションした。プラスミドｐＮＮ１０１を吸収した細胞はクロラン フェニコールの寒天培地上でコロニーに成長するが、プラスミドを吸収しなかっ た細胞は成長しないであろう。Ｃｍ′コロニーをニトロセルロース上に移し、次 いで放射線標識したｃｒｙｒ　Ｉ　ＩＢ遺伝子でブロービングし、モしてｃｒｙ ＩＩＩＢプローブに特異的にハイブリダイゼーションしたＢ、ｔ、菌株ＥＧ７２ ２０と表示する１つのコロニーをさらに研究した。

ＥＧ７２２０は、ｐＮＮ１０１ベクターのＥｃｏＲＶの中に挿入された８、３ｋ ｂのｅｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ断片から成る、ｐＥＧ２６０と表示するＢ、ｔ、　！Ｉ 株ＥＧ７２２０をクロランフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含有する胞子形成培 地中で、胞子形成および細胞の溶菌が起こるまで（３〜４日）成長させた。顕微 鏡検査は、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ７２２０の培養物が胞子および自由に浮く不規則の 形状の結晶を含有することを明らかにした。

Ｂ、ｔ、！ＩＩ株ＥＧ７２２０の胞子形成した発酵培養物からの胞子、結晶およ び細胞破片を遠心により収穫した。遠心した発酵の固体の混合物を可溶化緩衝液 （０，１，３モルのトリスｐＨ８，５，２％（ｗ／ｖ）（Ｆ）−８ＤＳ、５％（ Ｖ／Ｖ）の２−メルカプトエタノール、１０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロール）中で １００℃に５分間加熱することによって、結晶を可溶化し７た。加熱後、この混 合物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用し、そしてこの混合物中のタンパ ク質を電気泳動によりガイズ分画した。サイズ分画後、タンパク質をクーマツシ ー色素下染色することによって可視化した。クーマツシー染色したゲルの写真を 第１０図に示す。

第】０図カ示スように、Ｂ　ｔ　菌株ＥＧ７２２０はほぼ７０ｋＤａの主要なタ ンパク質およびほぼ３０ｋＤａの少量のタンパク質を産生じた。これらのタンパ ク質はＢ、ｔ、ｌ！株ＥＧ４９６１のほぼ７０ｋＤａのタンパク質およびほぼ３ ０ｋＤａの少量の結晶賞タンパク質あとサイズが同一であるように思われた（第 １０図）。この結果が実証するように、ｐＥＧ２６０の８．３ｋｂの断片は２つ の結晶質タンパク質の遺伝子を含有する：はぼ７０ｋＤａのタンパク質の遺伝子 およびほぼ３０ｋＤａのタンパク質の遺伝子。

はぼ７０ｋＤａタンパク質をエンコードする遺伝子はｃｒｙＩＩＩｃ遺伝子であ り、そしてエンコードされるタンパク質はＣｒｙｒ　Ｉ　ＩＣタンパク質である 。はぼ３０ｋＤａの結晶賀タンパク質をエンコードする遺伝子はｅｒｙＸと表示 し、そしてエンコードされるタンパク質はＣｒ７Ｘと表示した。

期待するようにかつ第１０図に示すように、Ｂ、ｔ、菌株ＨＤ７３〜３６から戚 りそしてプラスミドベクターｐ　Ｅ　Ｇ　２６０のみを収容する、ＥＧ７２１１ ど表示する、Ｂ７　ｔ　の同質遺伝子の対照菌株は、はぼ７０ｋＤａのタンパク 質およびほぼ３０ｋＤａのタンパク質のいずれをも産生じなかった。ｐＥＧ２２ ０は、ｐ　Ｎ　Ｎ　ｉ、　０　］のＳｐｈＩＭ位の中に結合されたｐＢＲ３２２ のアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン抵抗性、クロランフェニコール抵抗性 および結晶陰性のＥ、ｃｏｌｉ−ＨａｃｉｌｌｕｓｉＩ株のシャトルベクターで ある。

Ｃ□−ｙｌ　Ｉ　ＩＣ遺伝子およびｃｒｙＸ遺伝子を含有するりｒ−７・−ニン グされた８、３ｋｂの断片を有するＥ、Ｃｏ１１細胞を分析して、それらがほぼ ７０ｋＤａのタンパク質およびほぼ３０ｋＤａのタンパク質を産生ずるかどうか を決定した。ＥＧ７２１８と表示する、ｐＥＧ２５８を有するＥ、ｃｏｌｉ細胞 を、後期の定常期に成長させ、そして細胞を遠心により収穫した。Ｅ、ｃｏｌｉ 菌株ＥＧ７２１８細胞を溶菌し、モし。

Ｃ全体の細胞タンパク質をタンパク質緩衝液中で加熱するＪ２によつて可溶化し 、た。Ｅ、ｃｏｌｉＥＧ７２１８細胞から可溶化したタ：７バク質の補体は、第 １０図に示すＪ、うにプラスミドベクターｐＬｌｃ　１８のみを収容する、ＥＧ ７２２１と表示する、Ｅ、ｃｏｌｉの陰せの対照菌株から可溶仕ルたタンパク質 の補体と同一であるように思われた。この結果が実証するよう５７：、クローニ ングした８、３ｋｂのｃｒｙｌＩＩｃ断片を収容するＥ、ｅｏｌｉ細胞は、はぼ ７０ｋＤａまたはほぼ３０ｋＤａの結晶質タンパク質を産生ずる場合でも、非常 にわずかのそれを産生ずる。

次の手順を使用して、はぼ７０ｋｄｓのＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンノくり質の産生 の原因となる、ｅｒｙＩＩＩｃ遺伝子を分離した。

ｅｒｙＩＩＩｃ遺伝子を含有するが、ｃｒｙＸ遺伝子を含有しない、Ｂ、ｔ、！ ｉ株ＥＧ４９６］からのＤＮＡの５ａｕ３Ａ断片を、プローブとしてｃｒｙＴＩ ＩＢ遺伝子を使用することによってクローニングした。

これは次のようにして達成した：Ｂ、ｔ、ｌ！ｉ株ＥＧ４９６１からのＤＮＡｔ −８ａｕ３Ａで消化し、消化したＤＮＡをアガロースゲルを通して電気泳動させ 、モして４ｋｂ−９ｋｂのＳ　ａ、　ｕ　３　Ａ断片を含有するゲルのスライス を切除し、た。５ａｕ３Ａ断片をゲルのスライスから電気溶離し、モしてＢａｍ ＨＩで消化したプラスミドｐＢＲ３２２ベクターと混合した。５ａｕ３Ａ断片を ｐＢＲ３２２ベクターと結合した。結合混合物をＥ、ｅｏｌｉ菌株ＤＨαのＣａ 　Ｃ］、　１処理した細胞とインキュベーションして、細胞がプラスミドのＤＮ Ａを吸収できるようにした。

インキュベーション後、細胞をアンピシリンおよびＬＢ培地（１％（Ｗ／Ｖ）の ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）トリプトファン、０．５％（ｗ／ｖ）のディフコ（Ｄｉ ｆｃｏ）酵母エキス、０．５％（Ｗ／Ｖ）のＮａＣＬｐＨ７，Ｏ）を含有する寒 天板上にプレイティングして、プラスミドＤＮＡを畷収した細胞について選択し た。数百のＡｍｐ’形質転換体のコロニ、−をニートロセルロースのフィルター 上Ｉこブロッティングし、そしてフィルターを放射線標識したｃｒｙＩＩＩＢプ ローブ″ｃ買施例１に前述したようにプロービングした。いくつかのコロニーに ノーイブリダグゼーンヨンしたプローブおよびＥＧ７２３２と表示する、これら のコロニーの１つの特性決定をさらにここに記載する。Ｅ、ｅｏｌｉ薗株Ｅ菌株 ２３２は、ｐＢＲ３２２＋はぼ５ｋｂの挿入されたＳ　ａ　ｕ　３Ａ−Ｂ　ａｍ Ｈ■のＤ　Ｎ　Ａ断片から成る、ｐＥＧ２６８と表示する、プラスミドを含有し た。挿入されたＤＮＡ断片は、放射線標識したｅｒｙＩ　Ｉ　ＩＢ遺伝子に特異 的にハイブリダイゼーションした。

プラスミドｐＥＧ２６８　（Ａｍｐ’Ｔｅ’）はＥ、ｃｏｌｉ中で複製するが、 Ｂｔ、中で複製しないであろう。Ｂ、ｔ、中で複製することができたｐＥ０２６ ８の誘導体を得るために、ｐＥＧ２６８を５ｐｈＩで消化し１、また、５ｐｈＩ で消化したバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のプラスミドｐＮＮ１０１　（ＣＭ ’Ｔｃ’）と混合し、そしてこの混合物を結合した。配位子混合物をＣａＣ１， 処理し、たＥ、ｅｏｌｉｉｌ胞の懸濁液とインキュベーションして、ｐＮＮｌｏ ｌと結合したｐＥＧ２６８プラスミドからのＤＮＡを細胞に吸収させた。インキ ュベーション後、細胞をＬＢ培地およびテトラサイクリンを含有する寒天板上で 成長させ、そして数百のテトラサイクリン抵抗性コロニーが成長した。ｐＥＧ２ ６８およびｐＮＮｌｏｌから成るプラスミドを吸収した細胞のみはテトラサイク リンの存在下に成長し、そしてコロニーを形成することができるであろう。これ らのＴｃ’コロニーの１つ、ＥＧ７２３３と表示する、の特性決定をそれ以上の 研究のために選択した。期待するように、Ｅ。

ｃｏｌｉｌ１株ＥＧ７２３３は、ｐＥＧ２６８の５ｐｈＩ部位の中に挿入された ｐＮＮｌｏｌから成る、ｐＥＧ２６９と表示する、プラスミドを含有することが 発見された。ｐＥＧ２６９の制限地図を第９図に示す。

プラスミド構成体ｐＥＧ２６９を、Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＥＧ７２３３から、リゾチ ーム／ＳＤＳ処理および引き続くプラスミドＤＮＡのエタノール沈澱により、す べての標準の手順を使用して分離した。次いで、ｐＥＧ２６９プラスミドＤＮＡ を使用して、塩化カルシウムの手順により受容能力を与えられたＩ：、ｃｏｌｉ 菌株ＧＭ２１６３の細胞を、すべて前述したように、形質転換した。

プラスミド構成体ｐＥＧ２６９は、再び、形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ菌株ＧＭ ２１６３から分離した。分離されたｐＥ０２６９プラスミドＤＮＡを、結晶陰性 の、クロランフェニコール感受性のＢ、ｔ、菌株ＨＤ７３−２６の細胞の懸濁液 に添加し、そして電流をこの混合物に通過　〜させ、こうしてｐＥＧ２６９をＢ 、ｔ、菌株ＨＤ７３−２６の中にエレクトロボレイシヨンすることによって形質 転換した。細胞をＬＢ培地およびクロランフェニコールを含有する寒天板上にプ レイティングしそして、インキュベーション後、数百のＣｍ’コロニーが成長し た。これらのコロニーの１つ、ＥＧ７２３１と表示する、の特性決定を研究のた めに選択した。期待するように、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ７２３１はｐＥＧ２６９を含 有することが発見された。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ７２３１の細胞を、クロランフェニコールを含有するＤＳＭＧ 培地中で２０〜２３℃において４日間成長させた。顕微鏡検査において、培養物 は、胞子に加えて、Ｂ、ｔ、の結晶に類似する粒子を含有することが示された。

胞子、結晶および細胞の破片を含む培養固体を遠心により収穫し、そして水溶液 の中に１００ｍｇの培養固体／ｍ１の濃度で懸濁させた。この懸濁液の一部分を 可溶化緩衝液（０，１３モルのトリスｐＨ８，５，２％ｗ／ｖのＳＤＳ、５％ｖ ／ｖ（Ｄ２−１にカプトエタノール、１０％Ｖ　／　Ｖのグリセロール）と混合 し、１００℃に５分間加熱し、そしてこの混合物を５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲルを通して電気泳動させてタンパク質をサイズ分画した。サイズ分画後、ゲル をクーマツシー色素で染色することによってタンパク質を可視化した。染色した ゲルの写真を第１０図に示す。

Ｂ、ｔ、ＩＦｉＥＧ７２３１は、第１０図に示すように、Ｂ、ｔ、！Ｉ株ＥＧ４ ９６１が産生するほぼ７０ｋＤａのＣｒｙＩＩＩＣタンパク質にサイズが同一で あると思われる、はぼ７０ｋＤａの主要なタンパク質を産生した。Ｂ、ｔ、菌株 ＥＧ７２３１はほぼ３０ｋＤａの結晶質タンパク質の検出可能な量を産生じなか った（第１０図）。この結果が実証するように、はぼ３０ｋＤａの結晶質タンパ ク質のｃｒｙＸ遺伝子は、第７図および第８図において点線で示す領域内に位置 する。さらに、これが示すように、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ７２３１は分離された形態 でｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子を含有する。

次の実施例８〜１２は、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１およびＣｒｙＩＩＩＣタンパ ク質の殺昆虫活性を決定した方法を記載する。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１およびＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質とＢ、ｔ。

菌株ＥＧ２１５８、Ｂ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓおよびＣｒｙＩＩ実施例８ 一般的調製物および殺昆虫性のバイオアッセイの試験手順発酵−ａ總物。Ｂ、ｔ 、！ＩＩ株ＥＧ４９６１およびＥＧ２１５ｇおよびＢ。

ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ　（ｒＢ、ｔ、ｔ、Ｊ）を液体胞子形成培地中で３ ０℃において、胞子形成および溶菌が起こるまで、成長させた。

この培地はタンパク質源、炭水化物源、および鉱物塩類を含有し、そしてこの分 野において典型的なものである。ＮａＯＨｗｏ添加してこの培地をｐ）（’７． ５に調節した後、オートクレーブ処理した。発酵ブロスを遠心により濃縮し、そ して使用するまで冷蔵した。

ここで使用するとき、ｒＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＪ結晶買タンパク質は、試験するＢ、 ｔ、菌株ＥＧ４９６１およびＢ、ｔ、ｔ、の各々の培養物から得られたほぼ７０ ｋＤａの結晶質タンパク質を表示する。ＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質を発酵培 養固体からスクロース密度勾配を使用して精製した。

スクロース密度勾配を使用して、胞子形成したＢ、ｔ、の発酵培養物の成分を分 離するとき、Ｂ、ｔ、の胞子は勾配の下部において沈澱物を形成し、モしてＢ、 ｔ、の結晶は勾配のほぼ中央部においてバンドを形成する。こうして、スクロー ス密度勾配はＢ、ｔ、の結晶質タンパク質を、比較的純粋な形態で、Ｂ、ｔ、の 胞子および他の発酵培養固体から分離することを可能とする。分離されたＣｒｙ Ｉ　Ｉ　ＩＣタンパク質は使用するまで４℃において貯蔵した。

すべての試料のバイオアッセイにおけるＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＣタンパク質の定量は 、標準の５ＤＳ−ＰＡＧＥ技術により決定した。次の昆虫を試験した： 南トウモロコシ根負い虫（ＳＣＲＷ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍ ｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ：西トウモＯ）シの根食い虫（ＷＣＲＷ）、 Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ；コロラドジ ャガイモ甲虫（ＣＰＢ）、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔ ａ： ニレの葉の甲虫、Ｐｙｒｒｈａｌｔａ　１ｕｔｅｏｌａ；輸入されたヤナギの葉 の甲虫、Ｐｌａｇｉｏｄｅｒａ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒａ。

２つの型のバイオアッセイを実施し、一方は人工的食物を使用し、そして他方は 葉の浸漬を使用した。

人工的食物のバイオアッセイ。５ＣＲＷの幼虫を、マロン（Ｍａｒｒｏｎｅ）ら 、ジャーナル・オブ・エコノミカル・エンドモロジー（Ｊ。

Ｅｃｏｎ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、）、７ユ、ｐｐ、２９０−２９３　（１９８５）に 類似する人工的食物の表面汚染を経て、ホルマリンを使用しないで、バイオアッ セイした。各バイオアッセイは８つの系統的水性希釈物から成り、アリコートを 食物の表面に適用した。希釈物（水性の０．００５％のトリトン（Ｔｒ　ｉ　ｔ ｏｎ”Ｘ−１００溶液）が乾燥した後、最初の中間形態の幼虫を食物上に配蓋し 、そして２８℃においてインキュベージコンした。３２匹の幼虫を投与量当たり に試験した。致死率を７日後に記録した。反復実験したバイオアッセイからのデ ータをプロビットのアッセイのためにプールし［Ｒ，Ｊ、ダウム（Ｄａｕｍ）、 ブレチン・オブ・エントモロジカル・ンサイアティ・オブ・アメリカ（Ｂｕｌｌ 、Ｅｎｔｏｍｏｌ、Ｓｏｃ、Ａｍ、）、１６、Ｉ）ｌ）、１０−１５　（１９７ ０）］致死率を対照の死について補正し、対照は希釈物のみであった［Ｗ、Ｓ、 アボット（Ａｂｂｏｔｔ）、ジャーナル・オブ・エコノミカル・エンドモロジー （Ｊ、Ｅｅｏｎ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、）、１旦、ｐｐ、２６５−２６７　（１９２ ５）］　。結果はＬＣｓｓ、すなわち、試験昆虫の５０％の殺す濃度、を生ずる 食物の表面の１ｍｍ！当たりのｑｒｙ１１１Ｃタンパク質の量で報告する。９５ ％の信頼区間を括弧内に報告する。

最初の中間形態のＷＣＲＷの幼虫を同一の人工的食物で１回の投与で試験した。

致死率を４８時間で読んだ。

最初の中間形態のＣＰＨの幼虫を同様な技術を使用して試験ｌまたが、ただしジ ャガイモのフレークを添加し７たバイオサーブ（ＢｉｏＳｅｒｖｅ）の＄９３８ ０の昆虫の食物を人工的食物の代わりに使用した。致死率は７日の代わりに３日 に記録した。

票の浸漬のバイオアッセイ。適当な人工的食物が入手可能でない昆虫　−の種ま たは段階のために、適当な自然食物材料（葉）を水性０．２％のトリトンＸ−１ ００溶液の中に懸濁した既知の処理濃度の液体の中に浸漬することによって、バ イオアッセイを実施した。道側の物質を滴り落とした後、謬を乾燥させた。０゜ ２％のト１１トンＸ−４００の中に浸漬した葉を未処理対照として使用した。５ または１０匹の甲虫を処理した葉を含むベトリ皿の中に拘束し０、そして４８時 間の間食べさせた。５ＣＲＷの成虫、ＣＰＨの成虫、＝１．ノの葉の甲虫の幼虫 および成虫、および輸入されたヤナギの葉の甲虫の幼虫および成虫をこの方法１ ：′おいて適当な食物源を使用し２て試験１，７た。

上の方法から逸脱は認められ、適当なデータが得られる。

実施例９ 一タが示すように、従来発見されたＢ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８に、ＣＰＢ幼虫に 対する活性が類似する。

表２ ＊９５％の信頼区間は括弧内に記載する。

Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１は、表３中のデータが示すように、人工的食物のパイ オアッせイにおいてＢ、ｔ　菌株ＥＧ２］５８およびＢ、ｔｔ、と比較して、５ ＣＲＷに対して独特の活性を有する。大３１−、おい下「発酵濃厚物＃１」およ び「発酵濃厚物＃２」とｍ：ｉする比較は、Ｂ１　菌株ＥＧ４９６１の異なる発 酵濃厚物に基づ（。Ｂ、ｔ、！ｌｉ株ＥＧ２１５８またはＢ、ｔ、ｔ　のいずれ も、試験した最高の投与量において１５％を越える致死率を引き起こさなかった 。対照的に、ＬＣ，、値（すなわち、特定した投与量において５０％の致死率） はＢ、ｔ　菌株ＥＧ４９６１について得られた（表３）。

Ｂ、ｔ、ｌＩＩ株ＥＧ４９６１の精製したＣｒｙＩＩＩＣタンパク質をバ、イオ ア・・／セイしたとき、観測された活性はＢ、↑　菌株ＥＧ４９６１の発酵濃厚 物（胞子および結晶を含有する）で得られたよりほんのわずかに低かった。この 結果は、ＣｒｙｌＩＩＣタンパク質をＢ、ｔ、ａ株ＥＧ４９６Ｕにおける毒性因 子とし５て量定Ｌ５た。Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１のバイオアッセイにおいて生 き残る幼虫（発酵濃厚物および精製した結晶質タンパク質の両者）は、未処理対 照の幼虫と比較して、成長が極端に止められた。

どれだけわずかの活性をＢ、ｔ、ＩＩ株ＥＧ２１５８の発酵濃厚物が５ＣＲＷ幼 虫に対してを有したとしても、６その精製したＣｒｙＩＩＩＡタンパク質を単独 でア・ｔセイしたとき、その活性は失われた。精製したＣｒｙｌｌｌＡタンパク 質の濃に＠Ｃｒｙ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｃタンパク質の対応する量の５倍に増加してさ え、５ＣＲＷ活性はＣｒｙＩ　Ｉ　ＩＡタンパク質について存在しなかった。発 酵濃厚物としてＢ、ｔ、ＩＩ株ＥＧ２１５８の最小活性は、Ｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ タンパク質と一緒の胞子の存在に依存するであろう。

精製したタンパク質の結晶　４　６４５　（５２）−８１９）　３％の死亡　試 験せず＠　５０００ Ｂ、ｔ　菌株ＥＧ４９６１の発酵濃厚物を】っの投与量でＷＣＲＷに対して試験 する人工的食物のバイオアッセイは、５ＣＲＷ幼虫で観測された致死率に類似す る致死率を生じた。５ＣＲＷ幼虫を使用するときのように、Ｂ、ｔ、ｔ、は対照 より大きいわずかの致死率を生じた。

５ＣＲＷ幼虫に対するその独特の活性に加えて、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１は、 また、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８またはＢ、ｔ、ｔ、により影響を比較的受けな い、５ＣＲＷおよびＣＰＢの両者の成虫の段階に対して、独特の殺昆虫活性を示 す（表４）。これらの研究からの昆虫のバイオアッセイのデータを表４に示す。

４８時間における死亡％ 菌株　ｃｒｙＩＩＩのｆｉｇ／Ｉｌｌ　５ＣＲＷ　−ＣＰＢΣＧ２１５８　４３ ５０　−　一 対照の致死率　ｏ　。

（−）ダッシュは試験せずを示す。

実施例１２ クローニングしたｃｒｙＩ　Ｉ　Ｉ遺伝子の殺昆虫活性Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６ １および、Ｂ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１からクローニングしたｃｒｙＩ　Ｉ　ＩＣ 遺伝子を含有しそして実施例７に記載する、組み換えＢ、ｔ、菌株ＥＧ７２３１ を、実施例５〜実施例７に一般に記載するように、液体胞子形成培地上で成長さ せそして遠心により遠心した。両者の濃厚物を５ＣＲＷの幼虫およびＣＰＢの幼 虫に対して人工的食物で、前述の技術を使用するが、８つの代わりに３つの投与 量および（ＣＰＨについて）３２匹の代わりに１６匹のＣＰＨの幼虫／投与量を 使用してバイオアッセイした。表５に記載する結果が実証するように、Ｂ、ｔ、 菌株ＥＧ７２３１はＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１において発見される毒性に等しい 毒性のＣｒｙｌ　Ｉ　ＩＣタンパク質を産生ずる。Ｂ。

ｔ、Ｗ株ＥＧ７２３１をつくるために使用した、結晶陰性の、胞子形成性Ｂ、ｔ 、ｌ１株ＥＧ７２１１を追加の対照として使用し、そしてこれは活性ではなかっ た。このバイオアッセイが評価するように、ｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子は鞘翅目活性 の結晶質タンパク質をＢ、ｔ、菌株ＥＧ４９６１において産生する。

表５ 菌　５ＣＲＷ　ＣＰＢ 次の実施例１３は、鞘翅目の昆虫に対するＣｒｙｌ　Ｉ　Ｉタンパク質の殺昆虫 活性がＣｒｙＩタンパク賀とＣｒｙＩ　Ｉ　Ｉタンパク質との組み合わせにより 実証されるように増強される、研究に関する。ＣｒｙＩＡ　（ｃ）タンパク質の 結晶は鞘翅目の昆虫に対して毒性ではないが、鱗翅目の昆虫の多数の種に対して 活性であることが知られている。

ＣｒｙｌＡ　（ｃ）タンパク質の結晶のみを産生ずる、組み換えＢ、ｔ。

菌株、ＥＧ１２６９、を、液体胞子形成培地上で、実施例５〜７に一般に前述し た技術を使用して成長させた。組み換えＢ、ｔ、菌株ＥＧ１２６９は、プラスミ ドｐＥＧ１５７をＢ、ｔ、菌株ＨＤ７３−２６の中に導入することによって構成 した。プラスミドｐＥＧ１５７は、ｐＥＧ８７　（Ｂ、ｔ、菌株ＨＤ２６３−６ ）からのｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝テをシャトルベクターのｐＥＧ１４７の中にサブ クローニングすることによって作った。ＣｒｙＩＡ（Ｃ）タンパク質の結晶をレ ッグラフイン（Ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ）の勾配により精製し、そして前述の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ法を使用して精製した。等しい量のこれらのＣｒｙＩ結晶をＣｒｙ ＩＩＩＣ結晶に添加し、そしてこの結晶質タンパク質の混合物を人工的食物で５ ＣＲＷ幼虫に対してバイオアッセイした。ｃｒｙｒ　Ｉ　ＩＣ−ＣｒｙＩタンパ ク質の混合物は、表６のデータにより示されように、ＣｒｙｌＩＩ結晶単独より 有意にいっそう毒性であった。

表６ ＣｒｙＩＩＩＣ結晶　２　１１１１０　（１１１０−２０００）ＣｒｙＩＡ（ｃ ）結晶　２　１５．０　の死亡　５フｌ　ｒＩｑ／ｗｎ２対照の致死率　６．２ ５％ この出願に対する特許の発行のとき興味を抱（一般の人々に対するこれらの材料 の入手可能性を保証するために、次の微生物の寄託をこの出願の前に、下表７に 示すように、次の機関においてなした：ＡＲ５特許コレクション、農学的研究の 菌株保存機関、ノザン・リサーチ・カルチャー・ラボラトリ−［ＡＲ３Ｐａｔｅ ｎｔ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ。

１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　（ＮＲＲＬ）　、イリノイ州６１０６４、ペオリア、ノニスユニバシティス トリート１８１５コ。

表７゜ Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ　ｉｅｎｓｉｇ　ＥＧ２１５１１　ｎ−１ａｚ１：ｓ　１９８ ７年４月２９８Ｂ−ｔｈｕｒｉｎ　ｉｅｎｇｉｓ　ＥＤフコ−２６ｍ−１ｓｓｏ ａ　１９８９年６月１２日Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ　１ａｎｓ＋ｉｓｓΣＧ４９６１　 Ｂ−１５１５３３１９８９年９月１３日Ｂ−ｔｈｕｒｉｎ　１ａｎｓｉｓ　ＥＧ ２１ｉ１３Ｂ　Ｂ−ｕ６０３　１９９０年２月８日Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ　ｉｅｎｇ ｉｓ　！（ニア２コｌ　Ｂ−１８６２７１９９０年２月２８日Ｅ、蝿ΣＧ７２ユ ”　Ｂ−１８５３４１ｇ　Ｂ　ｇ年９月１３日これらの微生物の寄託は、「特許 手続きの目的の微生物の寄託の国際的認識についてのブダペスト条約」の規定に 従いなされた。これらの微生物の公衆への入手可能性についてのすべての制限は 、この出ｌｉｔ二基づ（米国特許が発行されたとき、最終的に除去されるであろ う。

本発明はその精神または必須の寄与から逸脱しな０で他の特定の形態で具体化す ることができ、したがって１、本発明の範囲を示すとして、前の明細書よりむし ろ、添付する請求の範囲を参照すべきである。

ＦｚＧｕＲｔ　１ａ ＦｘＧｕｉＥｌｃ ＦｘｅｕＲｔ　ｉｍ ωロー　ＣＤ■− １，１″１１″ｌ＋１１−　−　ψ ＦＩＧ、　４　ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、１０ 要約 精製されそして分離されたｃｒｙｌ　Ｉ　ＩＣ型遺伝子は新規なり、を菌株から 得られた。この遺伝子は第１図に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド塩 基配列を有する。この遺伝子により生産された７４゜４ｋＤａタンパク質は、ジ アブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｊｃａ）ＩＩのコロラド（Ｃｏｌｏｒａｄｏ）ジャ ガイモの甲虫および昆虫を包含する、鞘翅目の昆虫に対して毒性である。

補正嘗の写しくｌ］訳文）提出嘗　（特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド塩基配列を有する、精 製されそして分離されたｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子。 ２、遺伝子は第１図に示すヌクレオチド塩基配列中のヌクレオチド塩基１４−１ ９７２から延びる解読領域を有する、上記第１項記載の精製されそして分離され たｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子。 ３、上記第１または２項記載の遺伝子を含有する組み換えプラスミド。 ４、上記第１または２項記載の遺伝子により生産された、鞘翅目毒性タンパク質 。 ５、上記第３項記載の組み換えプラスミドで形質転換されたバクテリアの生物学 的に純粋な培養物。 ６、バクテリアはバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ）である、上記第５項記載のバクテリア。 ７、ＮＲＲＬに受託され、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６２７の受け入れ番号を有する、 上記第６項記載のバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓ　ｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリア。 ８、上記第４項記載のタンパク質および農学的に許容されうる担体からなる殺昆 虫組成物。 ９、上記第５項記載のバクテリア、このようなバクテリアにより生産された鞘翅 目毒タンパク質、および農学的に許容されうる担体からなる殺昆虫組成物。 １０、上記第１または２項記載の遺伝子で形質転換された植物。 １１、遺伝子またはその一部分がハイブリダイゼーションプローブとしての使用 のために標識されている、上記第２項記載のｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子。 １２、ＮＲＲＬに受託され、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８５３３の受け入れ番号を有する バチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）バクテリアの生物学的に純粋な培養物。 １３、上記第１２項記載のバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓ　ｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリアにより作られそして第１図に示すアミノ 酸配列を有することを特徴とする、鞘翅目毒性タンパク質。 １４、上記第１３項記載の鞘翅目毒性タンパク質および農学的に許容されうる担 体からなる殺昆虫組成物。 １５、鞘翅目毒性タンパク質はバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓ 　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリアの中に含有されている、上記第１４ 項記載の殺昆虫組成物。 １６、鞘翅目の昆虫の宿主植物に殺昆虫的に有効量の上記第４項記載の鞘翅目毒 性タンパク質を適用することからなる、鞘翅目の昆虫を抑制する方法。 １７、鞘翅目毒性タンパク質はバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓ 　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリアの中に含有されている、上記第１６ 項記載の方法。 １８、昆虫はジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）属である、上記第１６項記 載の方法。 １９、鞘翅目の昆虫の宿主植物に殺昆虫的に有効量の上記第１３項記載の鞘翅目 毒性タンパク質を適用することからなる、鞘翅目の昆虫を抑制する方法。 ２０、鞘翅目毒性タンパク質はバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓ 　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリアの中に含有されている、上記第１９ 項記載の方法。 ２１、昆虫はジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）属である、上記第１９項記 載の方法。 ２２、ＣｒｙＩＩＩタンパク質を含有する殺昆虫組成物の中に、鞘翅目の昆虫に 対する前記組成物の殺昆虫活性を増強するために有効量のＣｒｙＩタンパク質を 混入することからなる、鞘翅目毒性タンパク質を含有する殺昆虫組成物の殺昆虫 活性を増強する方法。 ２３、ＣｒｙＩ１Ｉタンパク賃はＣｒｙＩＩＩＣタンパク質である、上記第２２ 項記載の方法。 ２４、ＣｒｙＩタンパク質はＣｒｙＩＡタンパク質である、上記第２３項記載の 方法。 ２５、ＣｒｙＩタンパク質はＣｒｙＩＡ（ｃ）タンパク質である、上記第２３項 記載の方法。 ２６、ＣｒｙＩＩＩタンパク質およびＣｒｙＩタンパク質はほぼ等しい量で存在 する、上記第２２項記載の方法。 ２７、組成物はジアブロチカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）属の昆虫に対する殺昆虫 活性が増強されている、上記第２２〜２６項のいずれかに記載の方法。 ２８、上記第１３項記載の鞘翅目毒性タンパク質およびＣｒｙＩタンパク質から なり、ＣｒｙＩタンパク質は鞘翅目の昆虫に対する組成物の殺昆虫活性を増強す るために有効な量で存在する、鞘翅目の昆虫に対して有用な殺昆虫組成物。 ２９、ＣｒｙＩタンパク質はＣｒｙＩＡタンパク質である、上記第２８項記載の 組成物。 ３０、ＣｒｙＩタンパク質はＣｒｙＩＡ（ｃ）タンパク質である、上記第２８項 記載の組成物。 ３１、鞘翅目毒性タンパク質およびＣｒｙＩタンパク質はほぼ等しい量で存在す る、上記第２８項記載の方法。