HUT62036A - Process for producing bacillus thuringiensis cry iii c gene and protein toxic to coleoptera - Google Patents
Process for producing bacillus thuringiensis cry iii c gene and protein toxic to coleoptera Download PDFInfo
- Publication number
- HUT62036A HUT62036A HU9202984A HU298492A HUT62036A HU T62036 A HUT62036 A HU T62036A HU 9202984 A HU9202984 A HU 9202984A HU 298492 A HU298492 A HU 298492A HU T62036 A HUT62036 A HU T62036A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- gene
- strain
- cryiiic
- insecticidal
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 438
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 247
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 title claims description 27
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 title claims description 27
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title claims description 13
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 title claims description 7
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 title description 10
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 87
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 62
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 61
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 103
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 31
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 241000489975 Diabrotica Species 0.000 claims description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 3
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 2
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 62
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 59
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 44
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 33
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 33
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 29
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 26
- 241000489976 Diabrotica undecimpunctata howardi Species 0.000 description 25
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 19
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 16
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 15
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 15
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 12
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 11
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 10
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 10
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 9
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 9
- 101100049740 Mus musculus Wrnip1 gene Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 6
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 4
- 241000489973 Diabrotica undecimpunctata Species 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 4
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 241000902874 Agelastica alni Species 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241001152745 Cryptorhynchus lapathi Species 0.000 description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 241001675054 Plagiodera versicolora Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710191936 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 2
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000489972 Diabrotica barberi Species 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039385 Histone deacetylase 11 Human genes 0.000 description 2
- 108700038332 Histone deacetylase 11 Proteins 0.000 description 2
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 2
- 241000256626 Pterygota <winged insects> Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 241001143315 Xanthogaleruca luteola Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- -1 diethyl bromide Chemical compound 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000077 insect repellent Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 231100001224 moderate toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000254175 Anthonomus grandis Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000907223 Bruchinae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000282821 Hippopotamus Species 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000532856 Otiorhynchus sulcatus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000021579 juice concentrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000012053 oil suspension Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
ELJÁRÁS BACILLUS THÜRINGIENSIS CrylIIC GÉN ÉS FEDELESSZÁRNYÚ
ROVAROKRA TOXIKUS FEHÉRJE ELŐÁLLÍTÁSÁRA
ECOGEN INC., Langhorne, Pennsylvania,
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
Feltalálók: DONOVAN William P., Levittown, Pennsylvania
RUPAR Mark J., Wilmington, Delaware,
SLANEY. Annette C., Hamilton Square, New Jersey,
JOHNSON Timothy B., Langhorne, Pennsylvania
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
A bejelentés napja: 1991.03.18
Elsőbbsége: 1990.03.20 (496,568) AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US91/01786
A nemzetközi közzététel száma: WO 91/14778
A találmány olyan génnel foglalkozik, amely Bacillus thüringiensisből (amelyet a későbbiekben gyakran rövidítünk B.t.-vei) izolálható, és amely egy inszekticid hatású kristályos fehérjét kódol, amelyet CrylIIC-nek nevezünk. Foglalkozik továbbá a találmány a nevezett fehérjét tartalmazó inszekticid kompozíciókkal, valamint a nevezett génnel transz formált növényekkel. Ezek az inszekticid kompozíciók és transz formált növények toxikusak a Coleoptera (Fedelesszárnyúak) rendjébe tartozó rovarokra, és különösen toxikusak a Diabrotica nemzetségbe tartozó rovarokra.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány hátterét.
A B.t. gram-pozitív talajbaktérium; ez spórázása során olyan kristályos fehérjéket termel, amely fajlagosan toxikus a rovarok bizonyos rendjeire és fajaira. A B.t. több különböző törzséről mutatták ki, hogy termelnek inszekticid kristályos fehérjéket. Vannak kereskedelmi forgalomban inszekticid fehéjéket termelő B.t. törzseket tartalmazó kompozíciók; ezeket mint környezetvédelmileg elfogadható inszekticideket alkalmazzák, mivel ezek csak a speciális cél-rovar ellen igazán toxikusak, de ártalmatlanok a növényekre és más, nem célzott organizmusokra.
Már egy sor, kristályos fehérjéket kódoló gént klónoztak a B.t. számos törzséből. Ezzel kapcsolatban jó áttekintés olvasható az alábbi irodalmi helyen: Hotce H. és munkatársai: Microbiol. Rév. 53, 242-255(1 989). Bár ez az irodalmi hely ténylegesen nem tekinthető a technika
jelen bejelentés szempontjából, jó áttekintést nyújt a B.t.-bői kapott génekről és fehérjékről, valamint ezek felhasználásáról, biztosít egy jó nomenklatúrát és osztályozási rendszert a B.t. génekhez és fehérjékhez, továbbá kiterjedt bibliográfiát nyújt.
A B.t. kristályos fehérje a rovarban csak lenyelés után ak tív. Miután a rovar lenyelte, a középbélben levő alkálikus pH és proteolitikus enzimek szolubilizálják a kristályt, lehetővé téve, hogy a toxikus komponensek kiszabaduljanak. Ezek a toxikus komponensek elroncsolják a középbél sejtjeit, ezzel előidézik, hogy a rovar nem táplálkozik tovább, következésképpen elpusztul. A B.t. valóban hatékony és környezetileg biztonságos inszekticidnek bizonyult különböző rovar-kártevőkkel végzett eljárásokban.
Amint Hofte és munkatársai megjegyzik, az inszekticid B.t. törzsek többsége a Lepidoptera (Pikkelyesszárnyúak) rendjének rovarai ellen, vagyis a hernyó rovarok ellen aktív. Más B.t. törzsek a Diptera (Kétszárnyúak) rendje rovarjai ellen, vagyis legyek és szúnyogok ellen inszekticid aktivitásúak, vagy mind a pikkelyesszárnyú, mind a kétszárnyú rovarok ellen. Az elmúlt években beszámoltak néhány olyan kristályos fehérjét termelő B.t. törzsről, amely a Coleoptera (Fedelesszárnyúak) rend rovarjai, vagyis bogarak ellen inszekticid hatású.
A fedelesszárnyúakra toxikus B.t. törzs első izolálásáról Krieg A. és munkatársai számoltak be j^Krieg A. és munkatársai: Z. angew. Ént. 96 , 500-508 (1983); Krieg A. és munkatársai: Anz. Schaedlingkde, Pflanzenschutz, Umweltschutz 5 7, 145-150 ( 1984); Krieg A. és munkatársai: 4,766,203 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (kibocsátva 1988. augusztus 23-án)J. A törzsről, amelyet B.t. var. tenebrionisnak neveztek el, leírták, hogy toxikus az Agelastica alni (kék égerlevél-bogár) és Leptinotarsa decemlineata (burgonya kolorádóbogár) fedelesszárnyú rovarok lárvái ellen. A B.t. var. tenebrionis a leírás szerint olyan inszekticid kristályos fehérjét alakít ki, amely mintegy 65-70 kilodalton (kDa) hosszúságú ^4,766,203 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés; Bernhard K.: FEMS ί
• · ·
Microbiol. Lett. 3 3, 261 -265 (1986)^.
Sekar V. és munkatársai Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84
7036-7040 (1987)^J beszámolnak a B.t tenebrionis fedelesszárnyúakra toxikus kristályos fehérjéje génjének klónozásáról és jellem zéséről. A fehérje mérete, amint ez a gén méretéből kikövetkez tethető, 73 kDa , de az izolált fehérje elsősorban egy 65 kDa-os komponenst tartalmaz. Hofte és munkatársai [Nucleic Acids Research 15, 7183 (1987)J szintén leírják a B.t. tenebrionisból való klónozott gén DNS szekvenciáját, és ezen gén szekvenciája azonos azzal, amelyet Sekar és munkatársai írtak le (1987).
McPherson és munkatársai £ Bio/Technology 6^, 61 -66 ( 1 988)J is leírják a B.t. tenebrionis-ból való klónozott rovar-leküzdő gén
DNS szekvenciáját, és ez a szekvencia is azonos azzal, amelyet
Sekar és munkatársai leírtak (1987). Azokat az E. coli sejteket és Pseudomonas fluorescens sejteket, amelyek magukban foglalták a
| klónozott gént, | toxikusnak találták kolorádó burgonyabogár lárvái |
ellen.
| Herrnstadt | C. és munkatársai j^Bio/Texhnology 4, 305-308 (1986)^ |
| beszámoltak egy | fedelesszárnyúakra toxikus törzsről, amelyet B.t. |
var. san diego-nak neveznek; ez a törzs egy 64 kDa-os kristályos fehérjét termel, amely toxikus különböző fedelesszárnyú rovarok ellen: erős toxicitása van Pyrrhalta luteola (szilfalevél bogár) ellen; mérséklet toxicitása van Anthonomus grandis (gyapot magház zsizsik), Leptinotarsa decemlineata (kolorádó burgonyabogár), Otiorhynchus sulcatus (feketeszőlőzsizsik), Tenebrio molitor (sárga lisztféreg) és Haltica tombacina ellen; és gyenge toxicitása van Diabrotica undecimpunctata (nyugati pettyes uborkabogár) ellen.
A B.t. san diego klónozott fedelesszárnyú toxin gén DNS
szekvenciájáról Herrnstadt C. és munkatársai számolnak be ^Gene
57, 37-46 (1987), továbbá 4,771,131 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely 1988. szeptember 13-án került nyílvánoss
A B.t. san diego toxin-génjének szekvenciája azonos azzal, amelyet Sekar és munkatársai (1987) írtak le a B.t. tenebrionis klónozott fedelesszárnyú toxin génjére.
Krieg A. és munkatársai [^1. Appl. Ént. 104, 417-424 ( 1987)J beszámolnak arról, hogy a B.t. san diego törzs azonos a B.t. tenebrionis törzzsel; ez a megállapításuk különböző diagnosztikai vizsgálatokon alapul.
Egy másik új B.t. törzsről, amelyet EG2158-nak neveznek, számolnak be Donovan W.P. és munkatársai pMol. Gén. Génét. 214, 365-372 ( 1 988)J; ez egy 73 kDa-os kristályos fehérjét termel, amely inszekticid hatású fedelesszárnyú rovarokra. A B.t. EG2158ból való, toxint kódoló gént klónozták és szekvenciáját elemezték; ennek szekvenciája azonos azzal, amelyről Sekar és munkatársai számoltak be a B.t. tenebrionis fedelesszárnyú toxin génnél. Ezl a fedelesszárnyú t o x i Η γτ íi ö f t e és munkatársai Microbiol. Rév. 53, 242-255 (1989) CrylIIA génnek nevezték el.
A 4,797,279 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Karamata D. és munkatársai; nyilvánosságra került 1989. január 10-én) olyan hibrid B.t. mikroorganizmusokat ismertet, amelyek egy plazmidot tartalmaznak egy pikkelyesszárnyú toxin génnel bíró B.t. kurstakiból és egy plazmidot tartalmaznak egy fedelesszárnyú toxin génnel bíró B.t. tenebrionisból. Ez a hibrid B.t. olyan kristályos fehérjéket termel, amelyek rendelkeznek mind a B.t. kurstaki által termelt, mind a B.t. tenebrionis által termelt kristályos fehérje jellemzőivel.
» I • · · · · · ···· ·· ·· · ·· · · · ·· · ··
- 6 A Ο 303 379 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Mycogen Corporation; közrebocsátva 1989. február 15-én) egy új B.t. izolátumot ismertet, amely inszekticid aktivitású mind fedelesszárnyú, mind pikkelyesszárnyú rovarok ellen.
A 0 318 143 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Lubrizol Genetics, Inc.; a közrebocsátás dátuma 1989. május 31.) leírja a B.t. tenebrionisból származó, ép, részben módosított gén klónozását, jellemzését és szelektív kifejezését, valamint a klónozott gén átvitelét valamely gazdaorganizmusba, képessé téve a mikroorganizmust arra, hogy fedelesszárnyú rovarok elleni toxicitású fehérjét termeljen. A B.t. san diego rovarbiológiai vizsgálati adatai Herrnstadt és munkatársai fentebb tárgyalt összefoglaló munka jából Bio/Technology h_, 305-308 (1986)J reprodukálhatók. Az összefoglaló munka adatokat foglal magában egy másik forrásból, B.t. tenebrionisból is’a B.t. tenebrionisról leírják, hogy erős toxicitása van kolorádó burgonyabogár ellen, mérsékelt toxicitása van nyugati kukorica gyökér féreg (Diabrotica virgifera virgifera) ellen, és gyenge toxicitása van déli kukorica gyökérféreg (Diabrotica undecimpunctata) ellen.
A 0 324 254 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Imperial Chemical Industries PLC; nyilvánosságra került 1989. július 19-én) egy A30-nak nevezett új törzset ismertet, amelynek inszekticid aktivitása van fedelesszárnyú rovarok ellen.
A 0 328 383 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Mycogen Corporation; nyilvánosságra került 1989. augusztus 16-án) B.t. PS40D1 nevű új B.t. mikroorganizmust ismertet, amelynek inszekticid aktivitása van fedelesszárnyú rovarok ellen.
A 0 330 342 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Mycogen Corporation; nyilvánosságra került 1989. augusztus 30-án)
Itt «· · · · ·· · ··
- 7 B.t. PS86B1 nevű új B.t. mikroorganizmust ismertet, amelynek inszekticid aktivitása van fedelesszárnyú rovarok ellen.
Ez utóbbi négy publikáció nem tekinthető a technika állásába tartozónak a jelen találmány szempontjából.
A B.t. tenebrionist, ame lyről először Krieg A. és munkatársai számoltak be, Darmstadtban (Németország) vagy annak közelében fedezték fel; és úgy hisszük, hogy a B.t. san diego-t, amelyről Herrnstadt és munaktársai számoltak be, San Diegoban (Kalifornia) vagy annak közelében találták meg. A B.t. EG2158 törzset, amelyről Donovan és munkatársai számoltak be, egy gabonaföld pormintából izolálták Kansasban. Ebből látható, hogy különböző B.t. törzsek, amelyeket számos, erősen eltérő földrajzi helyről izoláltak, mind tartalmazzák a nyilvánvalóan azonos fedelesszárnyú toxin gént, a CrylIIA gént.
Úgy tűnik, hogy nincs beszámoló az irodalomban más új fedelesszárnyú toxin B.t. génről, csak arról az egyetlen B.t. génről, amelyet hét évvel ezelőtt B.t. tenebrionisban fedeztek fel.
Ezenkívül még a különböző B.t. törzsek között, amelyekről leírták, hogy fedelesszárnyú rovarok ellen inszekticid aktivitású kristályos fehérjékkel bírnak, egyről sem mutatták ki, hogy szignifikáns toxicitása lenne a Diabrotica (kukorica gyökérféreg) rovarnemzetség lárvái és felnőtt egyedei ellen; ebbe a nemzetségbe tartoznak a nyugati kukorica gyökérféreg (Diabrotica virgifera virgifera), a déli kukorica gyökérféreg (Diabrotica undecimpunctata howardi) és az északi kukorica gyökérféreg (Diabrotica barberi). A jelen találmány CrylIIC génje olyan fehérje toxint fejez ki, amelynek mennyiségileg kifejezhető inszekticid aktivitása van a Diabrotica rovarok ellen is más fedelesszárnyú rovarok kö zött.
- 8 Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.
A jelen találmány egyik szempontja szerint tisztított és izo Iáit fedelesszárnyú toxin génnel foglalkozik, amely az 1. ábrában bemutatott aminosavszekvenciát kódoló nukleotid bázis szekvenciával bír, ezt a továbbiakban CrylII génnek nevezzük. A CrylIIC gén az 1. ábrában bemutatott 14. és 1972. nukleotid bázisok közt található kódoló területre terjed ki.
A találmány egy másik szempontja szerint a CrylII gén által termelt inszekticid fehérjével foglalkozik. A CrylIIC fehérje olyan aminosav-szekvenciával bír, amely a CrylIIC gén 1. ábrán látható nukleotid-szekvenciájából, a 14. és 1972. bázisok közti területből kikövetkeztethető. A fehérje inszekticid aktivitást mutat a fedelesszárnyúak rendjének rovarjai ellen, elsősorban a kolorádó burgonyabogár ellen és a Diabrotica nemzetség rovarjai ellen.
A találmány egy még további szempontja szerint egy B.t. baktérium biológiailag tiszta tenyészeteivel foglalkozik; ez a baktérium az NRRL-nél van deponálva NRRL B-18533 számon, és a neve B.t. EG4961 törzs. A B.t. EG4961 törzs hordozza a CrylII gént és termeli a CrylIIC fehérjét. Más B.t. baktériumok, amelyek a CrylIIC gént hordozzák, biológiailag tiszta tenyészetei szintén e találmány oltalmi körén oelül vannak.
A találmány egy még további szempontja szerint oly«η inszekticid kompozíciókkal foglalkozik, amelyek - valamely agrotechnikailag elfogadható hordozóval kombinálva - vagy a CrylIIC fehérjét, vagy a CrylIIC fehérjét termelő B.t. törzs fermentációs tenyészetét tartalmazzák.
A találmány eljárással is foglalkozik fedelesszárnyú rovarok visszaszorítására olyan módon, hogy az ilyen rovarok gazda• ·· · · • ·· · · növényeihez a CrylIIC fehérjének vagy a CrylIIC fehérjét termelő B.t. törzs fermentációs tenyészetének inszekticid szempontból hatékony mennyiségét alkalmazzuk. Az eljárás sokféle fedelesszárnyú rovar ellen alkalmazható, közéjük értve pl. a kolorádó burgonyabogarat, az égerfalevél bogarat, az importált fűzfalevél bogarat és a kukorica gyökér férget.
A találmány egy még további szempontja szerint rekombináns plazmiddal foglalkozik, amely a CrylIIC gént tartalmazza; foglalkozik továbbá az ilyen rekombináns plazmiddal transz formált baktérium tiszta tenyészetével (amely baktérium előnyösen B.t.), valamint a CrylII génnel transzformált növényekkel.
A találmány egy további szempontja szerint egy fedelesszárnyúakra toxikus fehérjét tartalmazó inszekticid kompozíció fedelesszárnyú rovarok elleni inszekticid aktivitásának fokozására szolgáló eljárással foglalkozik, amely eljárás abból áll, hogy a CrylII fehérjét tartalmazó kompozícióhoz hozzáadunk vagy abba beépítünk egy Cryl fehérjét olyan hatékony mennyiségben, amely fokozza a kompozíció inszekticid aktivitását. A CrylII fehérjét ér. egy Cryl fehérjéqtartalmazó inszekticid kompozíció fokozott inszekticid aktivitást mutat a Coleoptera (Fedelesszárnyúak) rendje rovarjai ellen, különösen a kolorádó burgonyabogár és a kukorica gyökérféreg ellen.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a bejelentés ábráit.
Az 1. ábra az 1-1 - 1-3 ábrarészekből áll és bemutatja a
CrylIIC gén nukleotid bázisszekvenciáját, valamint a CrylIIC fehérje kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját. A feltételezett riboszóma-kötőhelyet (RBS) jelezzük. Jelezzük a HindlII és BamHI restrikciós helyeket is.
A 2. ábra egy etidium-bromiddal festett agaróz gél fényképe;
- 10 ez a gél tartalmazza a B.t. EG2158, EG2838 és EG4961 törzsek méret szerint frakcionált natív plazmidjait. A 2. ábrán jobbra levő számok a B.t. EG4961 plazmidjainak hozzávetőleges méreteit jelzik megadaltonban (MDa).
A 3. ábra egy autoradiogram fényképe, amely radiogram úgy készült, hogy a 2. ábrán látható plazmidot átvittük nitrocellulóz szűrőre, a szűrőt hibridizáltuk radioaktívan jelzett, 2,4 kilobázisos (kb) CrylIIB vizsgáló mintával (próbával), és a szűrőt röntgenfilmen exponáltuk.
A 3. ábra jobb oldalán található szám jelzi a B.t. EG4961 törzs plazmidjának méretét MDa-ban; ez a plazmid hibridizál a CrylIIB vizsgáló mintával. Az f betű a 3. ábra jobb oldalán azokat a fragmentumokat jelzi, amelyek a CrylIIB-vel hibridizáló plazmid elbomlásából alakulnak ki.
A 4. ábra egy etidium-bromiddal festett agaróz gél fényképe; ez a gél a B.t. EG2158, EG2838 és EG4961 törzsek olyan DNS-eit tartalmazza, amelyek HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztve és elektroforézissel méret szerint frakcionálva voltak. A standard jelzésű csík méret-standardot jelent.
Az 5. ábra egy autoradiogram fényképe, amely autoradiogram úgy készült, hogy a 4. ábra DNS fragmentumait átvittük nitrocellulóz szűrőre, a szűrőt hibridizáltuk radioaktívan jelzett, 2,4 kilobázisos (kb) CrylIIB vizsgáló mintával (próbával), és a szűrőt röntgenfilmen exponáltuk.
Az 5. ábra jobb oldalán levő számok a B.t. EG4961 törzs olyan restrikciós fragmentumainak méreteit jelzik kb-ben, amelyek hibridizálnak a CrylIIB vizsgáló mintával. A standard jelzésű csík méret-standardot jelent.
* ·· • · * · • « · · · ·· · · · « · · *·
- 1 1 A 6. ábra egy Coomassie-vel festett nátrium-dodecil-szulfát (SDS) poliakrilamid gél fényképe, amely bemutatja a B.t. EG2158, EG2838 és EG4961 törzsekből szolubilizált kristályos fehérjéket. A 6. ábra jobb oldalán levő számok a B.t. EG4961 törzs által termelt kristályos fehérjék hozzávetőleges méretét jelzik kDa-ban.
A 7. ábra a pEG258 plazmid restrikciós térképét mutatja be. A CrylII gén elhelyezkedését és orientációját nyíl jelzi. A CryX génnek nevezett gén a pontozott vonallal jelzett területen belül helyezkedik el. Az Asp jelenti az Asp718 , a Bam jelenti a BamHI, a H3 jelenti a HindlII, és a P jelenti a PstI restrikciós enzimeket. Jelezve van egy 1 kb-s léptékmutató is.
A 8. ábra, igazodva a 7. ábrához és azzal azonos léptékeket alkalmazva a pEG260 plazmid restrikciós térképét mutatja be, amely egy 8,3 kb-s fragmentumot tartalmaz a B.t. EG4961 törzsből; a CrylIIC gént nyíl jelzi és a CryX gén a pontozott vonallal jelzett területen belül helyezkedik el. A 7. ábrához tartozó, restrikciós enzim rövidítéseken kívül az (RV/Asp) az EcoRV és Asp718 restrikciós helyek fúzióját jelenti, és az (RV/Pst) az I coRV és PstI restrikciós helyek fúzióját jelenti.
A 9. ábra, igazodva a 7. ábrához és annak léptékét alkalmazva, a pEG269 plazmid restrikciós térképét mutatja be, amely a nyíllal jelölt helyen tartalmazza a CrylII gént, mint a rekombináns E. coli EG7233 törzsből való DNS fragmentumának egy részét. A 7. ábrában bemutatott, pEG258-ra vonatkozóan alkalmazott rövidítések alkalmazandók erre az ábrára is. Ezen kívül az Sph az Sphl restrikciós helyet jelenti, és az S3A/Bam a SauIIIA és BamHI restrikciós helyek fúzióját jelenti.
• « ···* 9 9 · · · ·· ··· ·· · ··
A 10. ábra egy Coomassie-vel festett SDS-poliakrilamid gél fényképe. A gél az alábbi baktériumtörzsek által szintetizált fehérjék csíkjait mutatja be: E. coli EG7221 törzs (pUC18/Cry ); E. coli EG7218 törzs (pEG258/CryIIIC+ CryX+); B.t. EG7211 törzs (pEG220/Cry~); B.t. EG4961 törzs (CrylIIC+CryX+); B.t. EG7231 törzs (pEG269/CryIIIC+CryX_); és B.t. EG7220 törzs (pEG26O/CryIIIC+ CryX+). A számok a gél jobb oldalán az ezen törzsek által termelt kristályos fehérjék hozzávetőleges méreteit jelzik kDa-ban.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírás előnyös kiviteli módjait. Ezekben a példákban részletesen leírjuk a CrylIIC gén és a fedelesszárnyűakra toxikus CrylIIC kristályos fehérje izolálását és tisztítását, továbbá a CrylIIC fehérjét termelő új B.t. EG4961 törzs jellemzését. A példák bemutatják továbbá a B.t. EG4961 törzs és a CrylIIC kristályos fehérje alkalmazását inszekticid kompozíciókban és eljárásokban.
A példák bemutatják a CrylII fehérje inszekticid aktivitásának szinergikus fokozhatóságát Cryl fehérje hozzáadásával. így azok az inszekticid kompozíciók, amelyek együtt tartalmi!znak mind CrylII, mind Cryl fehérjéket, fokozott inszekticid aktivitással bírnak, elsősorban a kolorádó burgonyabogár és a déli kukorica gyökérféreg mind lárvái, mind felnőtt egyedei ellen, de más rovarok ellen is.
A jelen találmány CrylII típusú génje, a CrylIICgén, az 1. ábrában bemutatott nukleotid bázisszekvenciával bír. A CrylIICgén kódoló területe az 1. ábrában bemutatott szekvencia 14. bázishelyén levő nukleotidjától az 1972. bázishelyén levő nukleotidjáig terjed.
A CrylIIC gén kódoló terület nukleotid bázispárjainak összehasonlítására a technika állásához tartozó CrylIIA gén megfelelő • « · « • «*a ·« C· · «· ··· ·· · · ·
- 13 kódoló területével jelentős különbségeket jelez a két gén között. A CrylIIC gén csak 75 %-ban homológ (helyileg azonos) aCiylIIA génnel.
A CrylIIC gén kódoló terület nukleotid bázispárjainak összehasonlítása a nemrégiben felfedezett B.t. EG2838 törzsből (NRRL B-18603) kapott CrylIIB gén megfelelő kódoló területével azt jelzi, hogy a CrylIIC gén 96 %-ban homológ (helyileg azonos) a CrylIIB génnel.
A jelen találmány Cry111-tipusú fehérjéje, a CrylIIC fehérje, amelyet a CrylIIC gén kódol, az 1. ábrában bemutatott aminosavszekvenciával bír. Ebben a leírásban amikor CrylIIC fehérjére utalunk, az azonosan értendő kristályos fehérje-ként, fehérje toxin-ként, inszekticid fehérje-ként, stb., hacsak a szövegöszszefüggés mást nem jelez. A CrylIIC fehérje mérete a CrylIIC gén DNS szekvenciájából kikövetkeztetve 74,4 kDa.
A CrylIIB fehérje mérete a CrylIIB gén szekvenciájából kikövetkeztetve 74,2 kDa. A technika állásához tartozó CrylIIA fehérje, amelyet a CrylIIA gén kódol, 73,1 kDa következtetett mérettel bír.
A látszólagos méret-hasonlóság ellenére a CrylIIC fehérje aminosav-szekvenciájának összehasonlítása a technika állásához tartozó CrylIIA fehérje aminosav-szekvenciájával jelentős különbségeket mutat. A CrylIIC fehérje csak 69 %-ban homológ (helyileg azonos aminosavak) a CrylIIA fehérjével. A CrylIIC fehérje 94 Sóban homológ a CrylIIB fehérjével. A CrylIIC és CryB fehérjék nyilvánvaló homológiája ellenére azonban kimutatható, hogy a CrylIIC fehérje eltér a CrylIIB fehérjétől, amelyet alátámaszt jelentősen ♦ ·»<· « «· ·· ·«<· ·· • · «V i · • ··« «· · ♦ · ·· ···· · · ν · ··· ·· · ·· megnövelt inszekticid aktivitása a CrylIIB fehérjével összehasonlítva; ez vonatkozik a Coleoptera rend rovarjaira, de különösen a Diabrotica nemzetség rovarjaira. A CrylII fehérje az első B.t. fehérje, amely mennyiségileg mérhető inszekticid aktivitást mutat kukorica gyökérférgek ellen.
A jelen találmány szándéka szerint magában foglalja a CrylIIC gén azon mutánsait, valamint rekombináns vagy genetikailag manipulált származékait, amelyek fedelesszárnyúakra toxikus fehérjét termelnek a CrylIIC fehérjével lényegében azonos tulajdonságokkal.
A CrylIIC gén alkalmas DNS hibridizáló próbaként (vizsgáló mintaként) is, más B.t. törzsek hasonló vagy közeli rokon CrylIItípusú génjeinek felfedezéséhez. A CrylII gén vagy ennek részei vagy származékai jelezhetők pl. radioaktív jelzéssel hagyományos munkameneteket alkalmazva, hogy hibridizáló próbákat kapjunk. A jelzett DNS hibridizáló próbákat azután úgy használhatjuk fel, amint a későbbi példákban leírjuk.
A CrylIIC gént és a megfelelő inszekticid CrylIIC fehérjét először a B.t. EG4961 törzsben, egy új B.t. törzsben azonosítottuk. A B.t. EG4961 törzs plazmid-elrendezéseinek és más törzs-jellemzőinek összehasonlítása a nemrégiben felfedezett B.t. EG2838 törzs és a technika állásához tartozó B.t. EG2258 törzs megfelelő elrendezéseivel és jellemzőivel azt mutatja, hogy a három, fedelesszárnyúakra toxikus B.t. törzs határozottan különböző.
A CrylIIC gént egy sor mikroorganizmus gazdaszervezetbe vezethetjük be, a szakterületen jártas szakemberek számára jól ismert munkameneteket alkalmazva, a megfelelő gazdaszervezeteket olyan ·
··· • ·· ··
- 15 körülmények között transz formálva, amelyek lehetővé teszik a klónozott CrylIIC gén stabil fenntartását és kifejeződését. A megfelelő gazdaszervezetek között, amelyek lehetővé teszik, hogy a CrylIIC gén kifejeződjék és a CrylIIC fehérje termelődjék, találjuk a Bacillus thüringiensist, valamint más Bacterium fajtákat, pl. B. subtilist vagy B. megateriumot. Nyilvánvaló, hogy a CrylIIC gént tartalmazó, genetikailag módosított vagy manipulált mikroorganizmusok tartalmazhatnak más toxin géneket is, amelyek ugyanezekben a mikroorganizmusokban vannak jelen, és az is nyilvánvaló, hogy ezek a gének egyidejűleg termelhetnek a CrylIIC fehérjétől eltérő inszekticid kristályos fehérjéket is.
A jelen leírásban ismertetett Bacillus törzseket hagyományos növesztő tápközegeken és standard fermentációs technikákkal tenyészthetjük. A CrylII gént magában foglaló B.t. törzseket addig lehet fermentálni, amint ezt a példákban leírjuk, amíg a tenyésztett B.t. sejtek elérik növekedési ciklusuknak azt a stádiumát, amikor a CrylIIC kristályos fehérje képződik. Spórázó B.t. törzsekI nél a fermentációt tipikusan folytatjuk a spórázási stádium során, amikor a CrylIIC kristályos fehérje a spórákkal együtt képződik. A B.t. fermentációs tenyészetet azután általában centrifugálással, i
szűréssel vágy hasonló műveletekkel kezeljük, hogy elválasszuk a fermentlé CryC kristályos fehérjét tartalmazó szilárd részét a tenyészet vizes oldat részétől.
A jelen leírás példáiban szereplő B.t. törzsek spórázó (spóraképző vagy spóratestes) fajták, de a CrylIIC gén hasznosítható nem spórázó Bacillus törzsekben is, vagyis olyan törzsekben, amelyek kristályos fehérjét termelnek a nélkül, hogy spórát termelnének. Érthető tehát, hogy a CrylIIC gént tartalmazó B.t. törzsek fermentációs tenyészetei-re vonatkozó utalások a jelen leírás<•*>•4 « ·· ··«· ·· * · · « · · « ··· ·· · ν ♦ • · · * « * ·· « ·· ··· ·· · fc· bán szándékunk szerint vonatkoznak a spórázó B.t. tenyészetekre, vagyis a CrylII kristályos fehérjét és spórákat tartalmazó B.t. tenyészetekre, vegetatív stádiumuk során kristályos fehérjét termelő, spóraképző Bacillus törzsek tenyészeteire, de vonatkoznak a nem spóraképző, de CrylIIC gént tartalmazó Bacillus törzsek tenyészeteire is, amelyekben a tenyészet elérte azt a növekedési stádiumot, ahol a kristályos fehérje ténylegesen képződik.
A fermentléből elkülönített szilárd anyag elsősorban a CrylIIC kristályos fehérjéből és B.t. spórából áll, valamennyi sejttörmelékkel, ép sejtekkel és a fermentációs tápközeg bizonyos szilárd maradékaival. Ha szükséges, a kristályos fehérjét hagyományos eljárásokkal különíthetjük el a többi kinyert szilárd anyagtól, pl. szacharóz gradiens frakcionálással. Nagy mértékben tisztított CrylII fehérjét kaphatunk olyan módon, hogy a kinyert kristályos fehérjét szolubilizáljuk, majd a fehérjét az oldatból újból kicsapjuk.
A CrylIIC fehérje, amint korábban megjegyeztük, lehetséges inszekticid anyag fedelesszárnyú rovarok, pl. kolorádó burgonyabogár, égerfalevél bogár, importált fűzfalevél bogár, és hasonlók ellen. A CrylIIC fehérje, a CrylIIA és CrylIIB fehérjékkel ellentétben, mérhető inszekticid aktivitást mutat Diabrotica rovarok, pl. kukorica gyökérférgek, ellen, amelyekre más, egyébként fedelesszárny úakra toxikus B.t. kristályos fehérje viszonylag hatástalan. A CrylIIC fehérje használható aktív alkotórészként a fedelesszárnyú rovarok visszaszorítására alkalmas inszekticid kiszerelésekben, pl. a fentebb említett rovarok ellen hatásos kiszerelésekben. Az ilyen inszekticid kiszerelések vagy kompozíciók az aktív alkotórészen kívül általában tartalmaznak mezőgazdaságilag elfogadható hordozókat vagy adjuvánsokat is.
A CrylIIC fehérje alkalmazható az inszekticid kiszerelésekI ben izolált vagy tisztított formában is, ez pl. lehet a kristály maga. Egy másik eljárás szerint a CrylIIC fehérje jelen lehet a kinyert fermentációs szilárd anyag formájában, amelyet valamely
Bacillus törzs, pl. Bacillus thüringiensis törzs fermentálásával kapunk, vagy! olyan mikroorganizmus gazdaszervezet fermentálásával, amely hordozza a CrylII gént és képes termelni a CrylIIC fehérjét.
Az előnyös Bacillus gazdaszervezetek között találjuk a B.t. EG4961 törzset
EG4961 törzsből származó, genetikailag javított
B.t. törzseket. Az utóbbi B.t. törzseket plázmid kezelési és/vagy konjugációs technikákkal kaphatjuk meg; ezek tartalmazzák a B.t.
EG4961 törzsből való, natív CrylIIC gént hordozó plazmiiot. Alkal mazhatunk genetikailag manipulált vagy transzformált B.t. törzseket vagy más gazda-mikroorganizmusokat, amelyek a rekombináns DNS technikákkal klónozott CrylIIC gént tartalmazzák.
Az ilyen transzformánsokra példák lehetnek a B.t. EG7231 és
EG722O törzsek, amelyek mindegyike tartalmazza a klónozott CrylIIC gént egy rekombináns plazmidban.
A kinyert szilárd fermentációs maradék elsősorban a kristályos fehérjét
I tartalmazza, ^s (ha spórázó B.t. gazdaszervezetet alkalmazunk) a spórákat; jel len lehet sejttörmelék és szilárd fermentációs tápközeg-maradék is. A CrylIIC fehérjét tartalmazó szilárd fermentációs terméket megszáríthatjuk, ha szükséges, mielőtt beépítenénk az inszekticid kiszerelésbe.
A jelen találmány szerinti, aktív komponensként inszekticid CrylII fehérjét tartalmazó kiszereléseket és kompozíciókat inszekticidként hatékony mennyiségben alkalmazzuk; ez változhat olyan i
/ tényezőktől függően, mint pl. az adott elfojtandó fedelesszárnyú rovarok mibenléte, az adott kezelendő növény vagy termény mibenléte és az [inszekticidként aktív kompozíciók alkalmazási eljárása. Az inszekticid kiszerelés inszekticidként hatásos mennyisé- 18 gét alkalmazzuk a jelen találmány rovarok elfojtására szolgáló eljárásában.
Az inszekticid kompozíciókat úgy állítjuk elő, hogy az inszekticidként aktív komponenst valamely kívánt, mezőgazdaságilag elfogadható hordozóval együtt szereljük ki. A kiszerelt kompozíciók lehetnek por vagy szemcsés anyag formájában, vagy olajos (növényi vagy ásványi olajos) szuszpenzió formájában, vagy vizes szuszpenzió formájában, vagy olaj/víz emulzió formájában, vagy nedvesíthető por formájában, vagy kombinálva bármely más hordozó anyaggal, amely mezőgazdasági felhasználásra alkalmas. A megfelelő mezőgazdasági hordozók lehetnek szilárdak vagy folyékonyak; ezek a szakterületen jól ismertek. A mezőgazdaságilag elfogadható hordozó kifejezés körülöleli az összes adjuvánst, pl. az inért komponenseket, diszpergáló anyagokat, felületaktív anyagokat, ragasztóanyagokat, stb., amelyeket általában alkalmaznak az inszekticid-kiszerelési technológiájában; ezek jól ismertek az inszekticid kiszerelés területén jártas szakemberek számára.
A CrylIIC fehérjét és egy vagy több szilárd vagy folyékony adjuvánst tartalmazó kiszereléseket ismert módon készítjük el, pi · az inszekticidként aktív CrylIIC fehérje homogénre keverésével, egyesítésével és/vagy őrlésével a megfelelő adjuvánsokkal együtt, a hagyományos kiszerelési technikákat alkalmazva.
A CrylIIC fehérje és más, fedelesszárnyúakra toxikus fehérjék, pl. CrylIIB és CrylIIA alkalmazhatók valamely Cryl fehérjével kombinálva is, hogy nem várt, fokozott inszekticid aktivitást kapjunk valamely fedelesszárnyú rovar célpont ellen. A CrylIIC, CrylIIB és CrylIIA fehérjék fedelesszárnyúakra fajlagos aktivitása jelentősen fokozódik egy Cryl fehérje hozzáadásával vagy beépítésével valamely inszekticid kompozícióba, amely ilyen • ·
- 19 CrylII fehérjét tartalmaz. Ezt az eljárást arra használhatjuk, hogy szinergikus CrylII-Cryl fehérje inszekticid kompozíciókat készítsünk a megfelelő CrylII és Cryl fehérjék fizikai kombinálásával, vagy a megfelelő fehérjéket előállító B.t. törzsek kombinálásával. A szinergikus CrylII inszekticid kombinációkban való felhasználásra az előnyös fehérje a CrylA, és különösen a CrylA(c), bár úgy véljük, hogy más Cryl fehérjék is alkalmazhatók szinergikus kombinációkban. Meglepő módon azt tapasztalhatjuk, hogy a Cryl fehérje inszekticid hatékonysága pikkelyesszárnyú rovarok ellen nem fokozódik; vagyis - úgy tűnik - nincs olyan fordított szinergizmus a Cryl fehérjékkel, amelyet a CrylII kristályos fehérjék jelenléte okozna.
Ha szükséges, a CrylII (vagy CrylIIB) és Cryl fehérjék kombinációit a jelen találmány szerint in situ megkaphatjuk kombinált formában, a B.t. vagy más mikroorganizmus gazdaszervezetek tenyészeteiből, ha ezek olyan CrylII géneket és Cryl géneket hordoznak, amelyek képesek a megfelelő CrylII és Cryl fehérjék előállítására. Ilyen törzseket vagy gazdaszervezeteket kaphatunk plazmid-kezelő és/vagy konjugációs technikákkal; ezek lehetnek B.t. törzsek vagy más törzsek vagy gazda-mikroorganizmusok, amelyek klónozott CrylII és Cryl géneket kifejező rekombináns plazmidot tartalmaznak.
A kompozícióban jelen levő CrylII fehérje mennyiségével mintegy ekvivalens mennyiségű Cryl fehérje a fedelesszárnyúakra fajlagos inszekticid aktivitás jelentős fokozását biztosítja. Az 1:1 CryI:CryIII aránynál kisebb mennyiségű Cryl fehérje valószínűleg még szintén kielégítő szintű fokozást biztosít.
A jelen találmány szerinti inszekticid kompozíciókat a célzott fedelesszárnyú rovar környezetébe juttatjuk, általában a • · · * · ί - 20 védendő növény vagy gabona levélzetére hagyományos eljárásokkal, előnyösen permetezéssel. Más alkalmazási technikák, pl. beporzás, szórás, nedvesítés, talajinjektálás, magbevonás, palántabevonás vagy permetezés, vagy hasonló eljárások szintén megvalósíthatók és szükségesek lehetnek olyan rovarok esetében, amelyek gyökérvagy szár fertőzést okoznak. Ezek az alkalmazási munkamenetek jól ismertek a szakterületen.
A CrylIIC gént vagy valamely funkcionális ekvivalensét, amelyeket a továbbiakban majd gyakran nevezünk toxin gén-nek, sokféle mikroorganizmus gazdaszervezetbe vezethetjük be. A CrylIIC gén kifejezése inszekticid CrylIIC kristályos fehérje toxin termelését eredményezi. A megfelelő gazdaszervezetek között találjuk a B.t.-t és más Bacillus fajokat, pl. B. subtilist vagy B. megateriumot. Növényen vagy gyökéren honos mikroorganizmusokat is alkalmazhatunk gazdaszervezetként a CrylIIC génhez. Különböző, szakemberek számára jól ismert munkamenetek állnak rendelkezésre a CrylIIC gén bevezetésére a mikroorganizmus gazdaszervezetbe; ezek olyan körülményeket biztosítanak, amelyek lehetővé teszik a gén stabil fenntartását és kifejezését a létrejövő transzformánsokban.
A transzformánsokat, vagyis azokat a gazdaszervezeteket, amelyek egy rekombináns plazmidban magukban foglalnak egy klónozott gént, hagyományos eljárásokkal izolálhatjuk, általában olyan szelekciós technikát alkalmazva, amely csak azon gazda mikroorganizmusok növekedését teszi lehetővé, amely tartalmaz egy rekombináns plazmidot. A transzformánsokat azután megvizsgálhatjuk inszekticid aktivitásra. Az erre szolgáló eljárások is közismertek a szakterületen.
!
Egy termelés céljaira alkalmas gazdasejt kiválasztásában
különösen érdekes jellemzők lehetnek a gén bevezetésének egyszerűsége a gazdaszervezetbe, a kifejező rendszerek hozzáférhetősége, a CrylIIC inszekticid fehérje stabilitása a gazdaszervezetben, és a kiegészítő genetikai képességeinek jelenléte. Az inszekticid CrylIIC gént tartalmazó gazdasejteket bármely hagyományos tápközegben növeszthetjük, amelyben a CrylIIC gén kifejezése végbemegy és CrylIIC fehérje termelődik általában spórázás közben. A krisi tályos fehérjét tartalmazó spórázó sejteket azután hagyományos eljárásokkal( nyerhetjük ki, pl. centrifugálással vagy szűréssel.
A CrylIIC gént be is építhetjük valamely növénybe, amely képes kifejezni a gént és CrylIIC fehérjét termelni; ezen a módon a növény ellenállóbbá válik a rovarok támadására. A CrylII génnel bíró növényekkel kapcsolatos genetikai manipulációkat ügy végezhetjük el, hogy a gént tartalmazó kívánt DNS-t bevezetjük a növényi szövetekbe vagy sejtekbe, olyan formájú és eredetű DNS molekulákat alkalmazva, amelyek a növénygenetikai manipulációkban jártas szakemberek számára közismertek. A DNS bevezetésének növényi szövetekbe egyik példáját írja le a 0 289 479 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Monsanto Company; nyilvánosságra került 1988.; november 2-án).
A CrylIIC gént vagy egy CrylIIC fehérjét termelni képes módosított CrylIIC gént tartalmazó DNS-t bevezethetjük a növényi sejtekbe vagy szövetekbe közvetlenül is fertőző plazmidok (mint pl. az Agrobacterium tumefaciensből származó Ti plazmid), vírusok
I vagy mikroorganizmusok (mint pl. A. tumefaciens) alkalmazásával,
I lizoszómák vagy liposzómák alkalmazásával, mikroinjekeióval, mecha nikus eljárásokkal és egyéb technikákkal, amelyek ismertek azok számára, ak|.k a szakterületen járatosak.
Variációk alakíthatók ki a CrylIIC gén nukleotid bázis
- 22 szekvenciájában, mivel a gén által kódolt fehérjét képező különböző aminosavakat általában egynél több kodon is meghatározhatja, amint ez a szakterületen jártas szakemberek számára köztudott. Ezen kívül lehetnek bizonyos olyan variációk vagy csonkítások a CrylIIC nukleotid bázisszekvenciájának kódoló területén belül, amelyek lehetővé teszik a CrylIIC inszekticid fehérje funkcionálisan ekvivalens formái génjének kifejezését és ilyen fehérjék kialakítását. Ezeket a variációkat, amelyeket azok, akik a szakterületen jártasak, meg tudnak határozni fölösleges kísérletezés nélkül a jelen leírás ismerete alapján, úgy tekintjük, hogy belül vannak az igénypontokban lefektetett oltalmi körön, mivel teljesen egyenértékűek az igénypontokban pontosan igényelt tárgyakkal.
A jelen találmányt a továbbiakban részletesebben is leírjuk az alábbi speciális, de nem korlátozó jellegű példák segítségével. A példák olyan munkákon alapulnak, amelyet ténylegesen elvégeztünk a szakterületen ismert technikákra és kereskedelmi forgalomban levő berendezésekre támaszkodva.
Az új B.t. EG4961 törzset az alábbi 1. példában leírt munkamenet alapján izoláltuk.
1. példa
A B.t. EG4961 törzs izolálása
Gabonán levő porok mintáit szerezzük be különböző forrásokból az Egyesült Államokból és külföldről egyaránt, általában gabonatároló helyekről. A gabonán levő porok mintáit olyan módon kezeljük, hogy a port vizes pufferban szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 60°C hőmérsékleten 30 percen át melegítjük, hogy feldúsítsuk a rezisztens spóraképző Bacillus típusú baktériumokat, pl. a B.t.-t. A kezelt por-szuszpenziót vizes pufferban hígítjuk, és • ·
- 23 a hígításokat agar lemezeken szélesztjük, hogy az agar lemezek felületén a porból származó egyes baktériumok egyedi telepet képezzenek. A kinövés után az egyes telepek egy részét az agar lemezről átvisszük nitrocellulóz szűrőre. A szűrőt NaOH-val kezeljük, hogy a telepeket lizáljuk, és az egyes telepekből a DNS-t a szűrőre rögzítsük.
A telephibridizálási munkamenetben alkalmazott B.t.-hez új, módosított munkamenetet fejlesztünk ki, mivel az E. colinál alkalmazható standard technikákról megállapítható, hogy B.t.-hez nem alkalmasak. A fentebb leírt kezelésben speciális feltételek szükségesek annak biztosítására, hogy a B.t. telepek vegetatív növekedési stádiumban legyenek, és így fogékonyak legyenek az NaOHval végzett lizisre. Következésképpen miután az egyes telepek egy részét átvittük nitrocellulóz szűrőre, a szűrőt teleppel fölfelé egy 0,5 °í (t ömeg/1 é r f o ga t) glükózt tartalmazó agar tápközegre helyezzük. Az átvitt telepeket azután az agar-glükóz tápközegen 5 órán át hagyjuk növekedni 30°C hőmérsékleten. A 0,5 % glükóz alkalmazása az agar tápközegben, valamint az 5 órás, 30°C hőmérsékletű növekedőési ciklus kritikus annak biztosításában, hogy a B.t. telepek vegetatív stádiumban legyenek és így fogékonyak legyenek a lizisre.
Azoi vélemény ellenére, amelyet legalább egy kutató kifejtett, vagyis hogy egy meglevő, fedelesszárnyú toxin gén vizsgáló mintaként való alkalmazására tett kísérlet egy új, a déli kukorica gyökérféregre toxikus gén felfedezésére valószínűleg sikertelen lenne, egy klónozott fedelesszárnyú toxin gént alkalmazunk speciális vizsgáló mintaként, hogy találjunk további új és ritka, fedelesszárnyúakra toxikus B.t. törzseket a gabonáról nyert pormintákból .
• ·
A telephibridizálási munkamenetekben vizsgáló mintaként (próbaként) egy 2,9 kb-s HindlII DNS restrikciós fragmentumot alkalmazunk, amely tartalmazza a CrylIIA gént, amely régebben a B.t. EG2158 törzs CryC génjeként volt ismeretes; ezt Donovan és munkatársai írták le £Mo1. Gén. Génét. 214, 365-372 (1988/j.
A 2,9 kb-s HindlII CrylIIA DNS fragmentumot, amely tartal32 mázzá a teljes CrylIIA gént, radioaktívan jelezzük alfa-P dATPvel és Klenow-enzimmel standard eljárások szerint. A nitrocellulóz szűrőket, amelyek tartalmazzák a DNS-t az egyes lizált telepekből, 65°C hőmérsékleten inkubáljuk 16 órán át olyan pufferolt oldatban, amely tartalmazza a radioaktívan jelzett 2,9 kb-s HindlII CrylIIA DNS vizsgáló mintát; ekkor a telepekből való DNS hibridizál a radioaktívan jelzett CrylIIA vizsgáló mintából való DNS-sel. 65°C hibridizálási hőmérsékletet alkalmazunk annak biztosítására ? hogy a CrylIIA DNS vizsgáló minta csak azon telepekből való DNS-sel hibridizálódjék, amelyek a CrylIIA DNS vizsgáló mintához hasonló gént tartalmaznak.
A 2,9 kb-s CrylIIA vizsgáló minta különböző gabonán levő porok mintáiból több B.t. telephez is hibridizál. Ezen telepek vizsgálata meglepő módon azt tárja fel, hogy ezek nem tartalmaznak semmiféle CrylII típusú gént. Ezek a telepek viszont tartalmaznak Cryl típusú géneket. A Cryl típusú gének pikkelyesszárnyúakra toxikus, fedelesszárnyúakra nem toxikus kristályos fehérjéket kódúinak mintegy 130 kDa molekulatömeggel. A CrylIIA gén szekvenciájának számítógépes segítséggel végzett összehasonlítása számos Cryl típusú génnel feltárja, hogy a CrylIIA gén 3’-vége részlegesen homológ a Cryl típusú gének bizonyos részeivel. Ez a felfedezés alátámasztja azt a véleményt, hogy a CrylIIA gén νθ9ε
- 25 okozza, hogy a 2,9 kb-s CrylIIA vizsgáló minta hibridizál a Cryltípusú géneket tartalmazó B.t. telepekkel.
Abból a célból, hogy ezt a problémát megoldjuk, a 2,9 kb-s HindlII CrylIIA vizsgáló mintát Xbal enzimmel emésztjük és egy 2,0 kb-s HindlII-Xbal fragmentumot tisztítunk, amely a CrylIIA gént 3’ vége nélkül tartalmazza. A 2,0 kb-s HindlII-Xbal fragmentum tehát a 3’-csonkitott CrylIIA gént tartalmazza. Amikor a 2,0 kb-s fragmentumot alkalmazzuk a megismételt telephibridizációs kísérletekben, ez nem hibridizál a Cryl gént tartalmazó B.t. telepekkel.
Mintegy 48000 Bacillus-típusú telepet vizsgálunk át a gabonán levő, különböző helyekről származó pormintákból radioaktívan jelzett, 2,0 kb-s HindlII-Xbal CrylIIA vizsgáló mintával. Csak egyetlen olyan új B.t. törzset fedezünk fel egy illinoisi gabonán levő pormintából, amely fajlagosan hibridizál a CrylIIA vizsgáló mintához. Ezt az új törzset B.t. EG2838 törzsnek nevezzük el; ez az NRRL-nél NRRL B-18603 számon van deponálva.
Ezután további 50000 Bacillus típusú^ gabonán levő por eredetű telepet vizsgálunk át radioaktívan jelzett 2,0 kb-s HindlIIXbal CrylIIA vizsgáló mintával, de nem sikerül azonosítani egyetlen olyan új törzset sem, amely új CrylII típusú gént tartalmazna.
A B.t. EG2838 törzsről úgy találjuk, hogy inszekticidként aktív fedelesszárnyú rovarok, és ami figyelemreméltó, kolorádó burgonyabogár ellen. A B.t. EG2838-nak nincs jelentős inszekticid aktivitása a déli kukorica gyökérféregre. A B.t. EG2838
I törzsből izolálunk egy gént, amelyet CrylIIB génnek nevezünk, és meghatározzbk nukleotid báziszsekvenciáját. A CrylIIB gén egy ι
CrylIIB fehérjének nevezett kristályos fehérjét termel, amely • *·* • ·
- 26 ί
I
651 aminosavból áll, és következtetett mérete 74237 dalton. A technika állásához tartozó CrylIIA fehérje méretét korái»bán következtetés alapján 73116 daltonra becsülték (644 aminosav). A CrylIIB gén 75?ó-bán homológ a CrylIIA génnel, és a CrylIIB fehérje 68 %-ban homológ a CrylIIA fehérjével.
Mintegy 40000 Bacillus típusú telepet, amelyek 39, gabonán levő pormintából származnak a világ minden tájáról, vizsgálunk át a B.t. EG2838 törzsből kapott CrylIIB vizsgáló mintával. A CrylIIB vizsgáló mintát radioaktívan jelezzük olyan munkamenetet alkalmazva, amelyet az előzőekben a radioaktívan jelzett CrylIIA vizsgáló mintákkal kapcsolatban leírtunk. A radioaktívan jelzett CrylIIB vizsgáló minta a B.t. EG2838 törzsből származó 2,4 kb-s Sspl restrikciós fragmentumból áll. A fragmentum tartalmazza a B.t. EG2838 törzs teljes fedelesszárnyú toxin fehérjéjét kódoló CrylIIB gént. Végül találunk egy gabonán levő pormintából való új B.t. törzset, amely fajlagosan hibridizál a CrylIIB vizsgáló mintával. Ezt a törzset B.t. EG4961 törzsnek nevezzük.
Abból a célból, hogy jellemezzük a B.t. EG4961 törzset, számos vizsgálatot végzünk. A tanulmányok egyik sorozatát azért végezzük, hogy jellemezzük ennek ostor szerotípusát. További tanulmányokat azért végzünk, hogy meghatározzuk a B.t. EG4961 törzsben levő natív plazmidok méreteit, és megállapítsuk, hogy mely pluzmidok tartalmaznak olyan géneket, amelyek inszekticid kristályos fehérjéket kódolnak. . DNS folt elemzést végzünk abból a célból, hogy meghatározzuk: vajon a B.t. EG4961 törzs natív plazmidjainak valamelyike hibridizál-e a CrylIIB vizsgáló mintával. Az is érdekes, vajon a B.t. EG4961 törzs CrylIIB-vel hibridizáló DNS elemei egy egyedi, természetben előforduló plazmidban fordui_ » «** li · · · « ♦ · · · · · · ·· ··« ·« · ··
- 27 nak elő, vagy ezzel ellentétben egy többszörös plazmidban vagy kromoszomális DNS-ben fordulnak elő. Ezen kívül a B.t. EG4961 törzset tovább is értékeljük olyan módon, hogy jellemezzük az általa termelt kristályos fehérjét és mérjük a B.t. EG4961-gyel és kristályos fehérjéjével társult inszekticid aktivitást. A 2-6. példák azokra a munkamenetekre irányulnak, amelyek jellemzik a B.t. EG4961 törzset, és a 8.-12. példák a B.t. EG4961 törzs inszekticid aktivitására irányulnak.
2. példa
A B.t. EG4961 törzs ostor szerotípusának jellemzése
B.t. típus-törzs ostor antitest reagensek sorozatát alkotjuk meg szerotipizálási vizsgálatokban való felhasználáshoz, közforgalomban levő B.t. típus-törzsek felhasználásával. B.t. HD1 kurstaki; 3ab szerotípus); HD2 (thüringiensis, 1. szerotípus); HD5 (kenyae, 4ac szerotípus); HD11 (aizawai, 7 szerotípus); HD12 (morrisoni, 8ab szerotípus) és HD3 (tolworthi, 9 szerotípus) típus-törzseket növesztünk folyékony tenyészetekben (rázatás nélkül) olyan körülmények között, hogy mozgó, vegetatív sejteket kapjunk. Az ostorszálakat a sejtekről Vortex-berendezésen lenyírjuk, a sejteket centrifugálással eltávolítjuk, és az ostorszálakat a felülúszóból 0,2 jVlm pórusméretű szűrőn kinyerjük. A tisztított ostorszál készítményeket nátrium dodecll szulfát poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elemezzük. Ezen B.t. típus-törzs ostorszál készítmények SDS-PAGE profiljai egy nagyobb fehérje-csíkot mutatnak minden egyes készítménynél a 20 és 35 kDA közti tartományban.
Ezeket a tisztított ostorszál készítményeket antitest termelésre alkalmazzuk egerekben standard munkameneteket követve. Az így létrejövő antiszérumokat átvizsgáljuk reakcióképességre standard antitest-közvetíte11 sejtagglutinációs vizsgálatban. Ebben a • · ·♦· • * · · · · · ······♦»··
- 28 i vizsgálatban' antiszérumok sorozathígításait készítjük el kerekfenekű, 96 üreges mikrolemezen. B.t. tipus-törzsek (vagy szerotipizálandó mintatörzsek) formaiinnal rögzített sejtszuszpenzióit adjuk az üregekhez és addig hagyjuk mozdulatlanul, amíg sejttömeg válik láthatóvá az üreg feneke körül. A vizsgálatokat vizuálisan értékeljük s^ejtagglutinálódásra a lemez fenekétől, nagyító tükröt alkalmazva. Azokat az antiszérumokat, amelyek a legerősebb fajlagos reakciót adják azon B.t. típustörzsek sejtjeivel, amelyekből származnak, ostor antitest reagensekként alkalmazzuk.
A B.t. EG2158 és B.t. EG4961 törzsekből származó sejteket külön-külön visszük be mintaként egy olyan sejtagglutinációs vizsgálatba, amely a hat B.t. típustörzsből való ostor antitest reagensek sorozatát alkalmazza. Az egyes B.t. típustörzsek sejtjei is szerepelnek a vizsgálatban kontrollként. Ezen vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a HD1, HD2, HD5, HD11, HD12 és HD13 B.t. típustörzsek sejtjei erősen és fajlagosan reagálnak megfelelő ostor antitest reagenseikkel. A B.t. EG2158 törzs sejtjei erősen és fajlagosan reagálnak a morrisoni (B.t. HD12 típustörzs) ostor antitest reagenssel, de a B.t. EG4961 törzs sejtjei nem reagálnak egyik antitest reagenssel sem. Ezek az eredmények megerősítik, hogy a B.t. EG2158 törzs a B.t. morrisoni törzs alfaja, és azt jelzik, hogy a B.t. EG4961 törzs nem tartozik a morrisoni, kurstaki, thüringiensis, kenyae, aizawai és tolworthi alfajok egyikébe sem.
. példa
Az EG4961 natív plazmidjainak méret szerinti frakcionálása és átvizsgálása CrylIIB vizsgáló mintával
A B.t. törzseket jellemezhetjük olyan módon, hogy plazmidja• · · · · · • ··· 4 4 4 44
4 4 4 4 44 •4 444 4« *44 ikat méret szerint frakciónáljuk azzal a jól ismert eljárással, amelyet agaróz gélelektroforézisnek neveznek. A munkamenet magábán foglalja a B.t. sejtek lizálását lizozimmal és SDS-sel, az ezen lizátumban levő plazmidok alávetését elektroforézisnek agaróz gélen, és a gél megfestését etidium-bromiddal, hogy láthatóvá tegyük a plazmidokat. A nagyobb plazmidok, amelyek lassabban mozognak a gélen,1 a gél tetején jelennek meg, és a kisebb plazmidok a gél alja irányában tűnnek fel.
A 2. ábrán látható agaróz gél azt mutatja, hogy a B.t. EG4961 törzs mintegy 150; 95; 70; 50; 5; és 1,5 MDa méretű plazmidokat tartalmaz, amint ezt a sötét vízszintes csíkok jelzik. A plazmidméreteket úgy becsüljük meg, hogy összehasonlítjuk ezeket az ismert méretű plazmidokkal (nem mutatjuk be). A 2. ábra azt is mutatja, hogy a fedelesszárnyúakra toxikus B.t. EG2838 törzs mintegy
100; 90; és 37 MDa méretű natív plazmidokat tartalmaz’. A 2. ábra azt is bemutatja, hogy a fedelesszárnyúakra toxikus B.t. EG2158 törzs mintegy 150; 105; 88; 72; és 35 MDa méretű natív plazmidokat tartalmaz. Ezen plazmidok némelyike, pl. a B.t. EG4961 B.t. törzs
150 éa
1,5 f(IDa-os plazmidja esetleg nem látható a fényképen, de ezek tényleges gélen jól láthatók. A 2. ábra azt demonstrálja, hogy
B.t. :EG4961 törzs natív plazmidjainak méretei eltérőek a
B.t.
tői.
EG2158és B.t. EG2838 törzsek natív plazmidjainak méreteiI
A 2. ábrában bemutatott plazmidokat foltképzés céljából agaróz gélről ^tvisszük nitrocellulóz szűrőre, Southern foltképzési technikáit alkalmazva £j. Molec. Bioi. 98, 503-51 7 (1975)J, és a szűrőt hibrLdizáljuk az előbbiekben leírtak szerint radioaktívan jelzett, 2,4 kb-s CrylIIB DNS vizsgáló mintával. Hibridizálás után a szűjőt röntgenfilmen exponáljuk. A röntgenfilm fényképét a
- 30 ι·* • · • · • « ···· · · ·· ··« ·« · ··
3. ábrában mutatjuk be, amely a besötétült foltokkal megmutatja, hogy a CrylIIB vizsgáló minta hibridizál a B.t. EG4961 törzs 93 MDa-os plazmidjával. Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a B.t. EG4961 törzs 95 MDa-os plazmidja tartalmaz egy olyan DNS szekvenciát, amely legalábbis részben homológ a CrylIIB génnel.
A 3. ábra azt is bemutatja, hogy a CrylIIB vizsgáló minta hibridizál, amint ez várható is, a B.t. EG2158 törzs 88 MDa-os plazmidjával és a B.t. EG2838 törzs 100 MDa-os plazmidjával. A B.t.
EG2158 törzs 88 MDa-os plazmidjáról már korábban is kimutatták, hogy tartalmazza a fedelesszárnyú toxin CrylIIA gént [^Donovan és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 214, 365-372 (1988 )J . Azt is meg határozták, hogy a B.t. EG2838 törzs 100 MDa-os plazmidja tartal mazza a fedelesszárnyú toxin CrylIIB gént.
A CrylIIB vizsgáló minta hibridizál DNS kisebb csíkjaihoz is a B.t. EG4961, B.t. EG2838 és B.t. EG2158 törzsek mindegyikében, amelyet f betűk jelölnek a 3. ábrában. A korábbi tapasztalatok jelezték, hogy a nagy B.t. plazmidok gyakran fragmentumokra törnek az elektroforézis során. Ezek a fragmentumok normálisan el mozdulnak a csíkok helyére; ezeket a 3. ábrán f betű jelöli. Ennek megfelelően a 3. ábrán f betűvel jelölt csíkok legvalószínűbben a B.t. EG4961 , B.t. EG2158 és B.t. EG2838 törzsek 95 MDa-os, 8<? MDa-os, illetve 100 MDa-os plazmidjainak fragmentálódásából erednek.
4. példa
A B.t. EG4961 törzsbő;. való DNS folt-elemzése
A B.t. EG4961 törzstől kivonunk mind kromoszomális, mind plazmid D!NS-t, majd Hindii! és EcoFíI restrikciós enzimekkel emésztjük ezeket. Az emésztett DNS-t méret szerint frakciónáljuk agaróz gélen végzett elektroforézissel, és a fragmentumokat éti31 dium-bromiddal végzett festéssel tesszük láthatóvá. A 4. ábra olyan festett agaróz gél fényképe, amely a B.t. EG4961 törzs méret szerint frakcionált HindlII és EcoRI restrikciós fragmentu mait tartalmazza. Összehasonlításként a fedelesszárnyúakra toxi kus B.t. EG2158 és B.t. EG2838 törzsekből való DNS-t is hasonló műveletnek vetjük alá. A standard-dal jelölt vonal az ismert méretű lambda DNS fragmentumokat tartalmazza, amelyek méret-standardként szolgálnak. A 4. ábra bemutatja, hogy a HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztett B.t. DNS különböző méretű DNS fragmentumok százait alakítja ki.
A 4. ábrában bemutatott DNS-t agaróz gélről nitrocellulóz szűrőre visszük át, és a szűrőt 65°C hőmérsékleten hibridizáljuk olyan pufferolt vizes oldatban, amely tartalmazza a radioaktívan jelzett, 2,4 kb-s CrylIIB DNS vizsgáló mintát. Hibridizálás után a szűrőt röntgenfilmen exponáljuk. Az 5. ábra a röntgenfilm fényképe, ahol a számok a jobb oldalon a B.t. EG4961 törzs CrylIIBvel hibridizáló fragmentumainak méretét jelzik kb-ban, ez összehasonlítással van meghatározva a HindlII-mal emésztett lambda DNS-sel, mint méret-markerral a standard-dal jelölt vonalban. Az 5. ábra bemutatja, hogy a B.t. EG4961 törzs HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztett DNS-e mintegy 3,8 kb-s és 2,4 kb-s, CrylIIBvel hibridizáló fragmer>tumokat alakít ki. Az 5. ábra azt is bemutatja, hogy a B.t. EG2838 törzs HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztett DNS-e mintegy 2,9 kb-s és 3,8 kb-s, CrylIIB-vel hibridizáló fragmentumokat alakít ki. Az 5. ábra még azt is bemutatja, hogy a B.t. EG2158:törzs CrylIIB-vel hibridizáló restrikciós DNS fragmentumainak íhozzávetőleges mérete 1,6 kb és 0,7 kb.
Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a B.t. EG4961 törzs i
olyan Cry111-tipusű gént tartalmaz, amely rokon a CrylIIB gén • · ·
- 32 ·· vizsgáló mintával. A B.t. EG4961 törzs CrylIIB-vel hibridizáló fragmentumai különböznek a B.t. EG2838 és B.t. EG2158 törzsek megfelelő fragmentumaitól. Ezek az eredmények és a későbbi példákban leírt további tanulmányok bizonyítják, hogy a B.t. EG4961 törzs CrylII-típusú génje nyilvánvalóan különbözik az EG2838 CrylIIB génjétől és az EG2158 CrylIIA génjétől. A B.t. EG4961 törzs CrylII típusú génjét CrylIIC-nek nevezzük el.
. példa
A B.t. EG4961 törzs kristályos fehérjéinek jellemzése
A B.t. EG4961 törzset DSMG spóráztató tápközegben növesztjük 30°C hőmérsékleten, amíg a spórázás és a sejt lízise végbemegy (3-4 napos növesztés). A DSMG tápközeg összetétele az alábbi: 25 mmól/1 K^HPO^; 25 mmól/1 ΚΗ^ΡΟ^; 0,5 mmól/1 03(Ν0^)2; 0,5 % (tömeg/térfogat) glükóz. A B.t. EG4961 törzs spórázó tenyészetét mikroszkóposán figyeljük, hogy tartalmaz-e szabadon lebegő, szabálytalan méretű kristályokat a B.t. spórák mellett. A tapasztalatok azt mutatják, hogy a B.t. kristályok általában olyan fehérjékből tevődnek össze, amelyek toxikusak lehetnek speciális rovarokra. A B.t. EG4961 törzs kristályainak megjelenése különbözik a B.t. EG2158 törzs lapos, négyszögietes (vagy romboid-alakú) kristályaitól, de részben emlékeztetnek a B.t. EG2838 törzs szabálytalan méretű kristályainak némelyikére.
A B.t. EG4961 törzs spórázó tenyészetéből a spórákat, kristályokat és lizált sejttörmelék-maradványokat centrifugálással kinyerjük. A centrifugált fermentációs tenyészet szilárd fázisából (amely kristályokat, spórákat és valamennyi sejttörmeléket tartalmaz) a kristályokat fajlagosan szolubilizáljuk olyan módon, hogy a szilárd anyagok keverékét szolubilizáló pufferban [^0,13 mól/1 trisz (pH 8,5) 2 % (tö meg/t é r f ogat) SDS, 5 % (térfogat/térfogat) • · · · < · ··«· ·· ··· ·······» * ·· ··· ·· · ··
- 33 2-merkapto-etanol, 10 ?ó (térfogat/térfogat) glicerin^ melegítjük 5 percen át. A szolubilizált kristályos fehérjéket méret szerint frakciónáljuk SDS-PAGE-val. A méret szerinti frakcionálás után a fehérjéket láthatóvá tesszük Coomassie festékkel végzett festéssel. A B.t. EG2158 és B.t. EG2838 törzsek tenyészeteit hasonló módon dolgozzuk fel összehasonlítás céljából.
A 6. ábra ezeknek az elemzéseknek az eredményeit mutatja be, ahol a jobb oldalon levő számok jelzik a B.t. E G 4 9 61 törzs által szintetizált· kristályos fehérjék méretét kDa-ban. A B.t. EG4961 spórákat és kristályokat tartalmazó, centrifugált fermentációs szilárd maradékból egy mintegy 70 kDa-os nagyobb fehérje és egy mintegy 30 kDa-os kisebb fehérje szolubilizálódik. A B.t. EG4961 mintegy 70 kDa-os fehérjéje méretben hasonlónak tűnik a B.t. EG2158 törzs fedelesszárnyúakra toxikus, mintegy 70 kDa-os kristályos fehérjéjéhez és a B.t. EG2838 törzs fedelesszárnyúakra toxikus, mintegy 70 kDa-os kristályos fehérjéjéhez. A B.t. EG4961 törzs mintegy 30 kDa-os kisebb kristályos fehérjéje méretben durván hasonlít a B.t. EG2158 törzs által termelt mintegy 31 kDa-os és 29 kDa-os kristályos fehérjékre és a B.t. EG2838 törzs által termelt mintegyl' 28 és 32 kDa-os kristályos fehérjékre. Nem ismeretes, hogy ezek a(kis fehérjék rokonai-e egymásnak.
A 4. példában leírt munkamenetet követve a további DNS folt elemzés feltárja, hogy a 2,4 kb-s CrylIIB DNS vizsgáló minta fajlagosan hibridizál a B.t. EG4961 törzs DNS-ének egy egyedi, 8,3 kb-s Asp718i-Pstl restrikciós fragmentumával. Ez az eredmény azt !
sugallja, hogy a 8,3 kb-s fragmentum tartalmazza a teljes CrylIIC i
gént. :
EG4961 törzs 8,3 kb-s Asp718-Pstl fragmentumát izoA B.t.
• · • *·· • .··. ···» .·♦ • ♦ · · · • · · · 4 · ·· *·· ·· *
- 34 láljuk és tanulmányokat végzünk a 8,3 kb-s Asp718-Pstl restrikciós fragmentumon annak igazolására, hogy a fragmentum tartalmaz egy CrylII típusú gént, továbbá a CrylIIC gén azonosítására és nukleotid bázisszekvenciájának meghatározására. Ezeket a munkameneteket a 6. példában írjuk le.
6. példa
A B.t. EG4961 törzs CrylIIC génjének klónozása és szekvenciaelemzésee
Az előző példában leírt 8,3 kb-s fragmentum klónozásához megalkotjuk a B.t. EG4961 törzs plazmid könyvtárát olyan módon, hogy a B.t. EG4961 törzsből való, méret szerint szelektált Asp 718-PstI restrikciós DNS fragmentumokat ligáljuk a jól ismert pUC18 E. coli vektorba. Ez a munkamenet az alábbi lépéseket foglalja magában: először kinyerjük a B.t. EG4961 törzsből a teljes DNS-t a sejt lizálásával, majd felgombolyífásával, ezután a teljes DNS-t emésztjük Asp718 és PstI restrikciós enzimekkel, az emésztett DNS-t elektroforézisnek vetjük alá agaróz gélen, a DNS egy 7 kb-9 kb méretű kiválasztott fragmentumát tartalmazó gélszeletet kimetsszük, és a méret szerint szelektált Asp718-Pstl restrikciós fragmentumokat elektroelucióval kinyerjük az agaróz gélszeletről. A kiválasztott fragmentumokat összekeverjük pUC18 E. coli plazmid vektorral, amelyet előzőleg Asp718-cal és Pstl-gyel emésztettünk. A pUC18 vektor hordozza az ampicillin rezisztencia gént (Amp ) és a vektor replikálódik E. coliban. T4 DNS ligázt és AlP-t adunk a B.t. EG4961 törzsből való DNS méret szerint szelektált restrikciós fragmentumainak és az emésztett pl)C18 vektornak a keverékéhez, hogy lehetővé tegyük a pUC18 vektor ligálódását a B.t. EG4961 törzs restrikciós fragmentumaival.
A plazmid könyvtárat azután E. coli sejtekbe transzformál• ··« • · t · ·· · · · • · ···· · · ♦ ' ·· ·♦· ·· · ··
- 35 juk, egy olyan organizmusba, amelyből hiányzik a szóban forgó gén. A transzformálást az alábbiak szerint végezzük. Ligálás után a DNS keveréket egy ampicillin-érzékeny E. coli gazdaszervezet, az E. coli HB101 törzs sejtjeivel inkubáljuk, amely sejteket előzőleg CaCl^-vel kezeltük, hogy a sejtek képesek legyenek felvenni a DNS-t. Az E. colit, elsősorban a HB101 törzset azért alkalmazzuk gazdaszervezetnek, mivel ezek a sejtek könnyen transzformálódnak rekombináns plazmidokkal, és mivel az E. coli HB101 törzs természetes formájában nem tartalmaz B.t. kristályos fehérje géneket. Mivel a pUC18 rezisztenciát hordoz ampicillinre, az összes gazdasejt, amely rekombináns plazmidot fogad be, ampicillin rezisztenssé válik. A rekombináns plazmidoknak kitevés után az E. coli gazdasejteket olyan agar tápközegre szélesztjük, amely ampicillint tartalmaz. Több ezer E. coli telep nő ki az ampicillint tartalmazó agaron azokból a sejtekből, amelyek valamely rekombináns plazmidot fogadtak be. Ezeket az E. coli telepeket azután nitrocellulóz szűrőkre visszük át foltképzésre a további vizsgálatokhoz.
A radioaktívan jelzett 2,4 kb-s CrylIIB gén vizsgáló mintát (próbát) alkalmazzuk azután vizsgáló mintaként olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik, hogy a vizsgáló minta fajlagosan kötődjék azokhoz a transzformált gazdasejt telepekhez, amelyek tartalmazzák a B.t. EG4961 törzsből való 8,3 kb-s Asp718-Pstl fragmentumot. 20 E. coli telep fajlagosan hibridizál a 2,4 kb-s CrylIIB vizsgáló mintával. Egy CrylIIB-vel hibridizáló telepet, amelyet E. elöli EG7218 törzsnek nevezzük el, tanulmányozunk tovább. Az E. (coli EG7218 törzs tartalmaz egy pEG258-nak nevezett rekombináns ι plazmidot, amely a pUC18-ból és a DNS 8,3 kb-s Asp718I
PstI restrikciós fragmentumából áll. A CrylIIB vizsgáló minta ··«* · n ··«···
9 9 9· · • 99·· ·· · ··
9 9 9 9 9 · ··· fajlagosan hibridizál a pEG258 8,3 kb-s fragmentumához. A pEG258 restrikciós térképét a 7. ábrán mutatjuk be.
A pEG258 8,3 kb-s fragmentuma 2,4 kb-s és 3,8 kb-s HindlII fragmentumokat tartalmaz, és tartalmaz egy 4,0 kb-s BamHI-Xbal fragmentumot, amely fajlagosan hibridizál a CrylIIB vizsgáló mintával. A 2,4 kb-s Hindin fragmentumot az M13mp18 DNS szekvenciáié vektorba szubklónozzuk. A 4,0 kb-s BamHI-Xbal fragmentumot az M13mp18 és M13mp19 DNS szekvenciáló vektorokba szubklónozzuk.
Az egyes szubklónozott DNS fragmentumok jelentős részének nukleotid bázisszekvenciáját meghatározzuk a standard Sanger didezoxi eljárással. Az egyes szubklónozott fragmentumoknál mindkét DNS szál szekvenciáját meghatározzuk, szekvencia-fajlagos 17-mer oligonukleotid primereket alkalmazva, hogy beindítsuk a DNS szekvenciáló reakciókat. A szekvenciaelemzés feltárja, hogy a 8,3 kb-s fragmentum tartalmaz egy nyitott leolvasó keretet és főleg: tartalmaz egy új CrylII típusú gént. Ez az új gén, amelyet CrylIICnek nevezünk, szignifikánsan különbözik a CrylIIA géntől. Amint a későbbiekben jelezzük, a CrylIIC gén világosan különbözik a CrylIIB géntől is.
A CrylIIC gén DNS szekvenciáját és a CrylIIC gén által kódolt CrylIIC fehérje következtetett aminosavszekvenciáját az 1. ábrában mutatjuk be. A CrylIICgén fehérjét kódoló részét meghatározva ez a 14. helyen levő nukleotidnál kezdődik és az 1972. helyen levő nukleotidnál végződik. A valószínű riboszóma kötő helyet az 1-A ábrában RBS-sel jelöljük. A CrylIIC gén által kódolt CrylIIC fehérje mérete, amint ezt a CrylIIC gén nyitott leolvasó keretéből következtetjük, 74393 dalton (651 aminosav). Meg kell jegyeznünk, hogy a CrylIIC fehérje látszólagos mérete SDS-PAGE-val meghatározva mintegy 70 kDa. Ennél fogva a CrylIIC fehérjére a leírás • · • *·· további részében általában úgy hivatkozunk, hogy mintegy 70 kDa méretű.
A technika állásához tartozó CrylIIA fehérje méretét korábbán következtetés alapján
73116 daltonnak becsülték (644 aminosav).
A CrylIIB fehérje méretét korábban 74237 daltonnak határozták meg (651 aminosav).
A DNS szekvenciaelemzés feltárja a BamHI és HindlII restrikciós helyek jelenlétét a CrylIIC génen belül (lásd az 1. és 2. ábrákat). Ezen restrikciós helyek elhelyezkedésének ismerete lehetővé teszi a CrylII gén elhelyezkedésének és orientációjának pontos meghatározását a 8,3 kb-s fragmentumon belül, amint ezt a 7.
ábrán nyíllal
Queen és jelöljük.
Korn számítógépes programmját alkalmazzuk ^Queen C.
Analysis of Biological Sequences on Small Computers (Biológiai szekvenciák elemzése kis számítógépeken), DNA J5,
421-436 ( 1 9 8 4) abból a célból, hogy összehasonlítsuk a CrylIIC gén szekvenciáját a CrylIIB és CrylIIA gének szekvenciáival, és összehasonlítsuk az ezeknek megfelelő CrylIIC, CrylIIB és CrylIIA következtetett fehérje-szekvenciákat.
A CrylIIC gén nukleotid bázis szekvenciája hely szerint 96 %bán azonos a
CrylIIB gén nukleotid bázis szekvenciájával, de hely szerint csak %-ban azonos a CrylIIA gén nukleotid báüis székvenciájával.
így bár a CrylIIC gén rokon a CrylIIB és CrylIIA génekkel, világos, hogy a CrylIIC gén eltér a CrylIIB géntől és jelentősen eltér a
CrylIIA géntől.
A CrylIIC fehérje következtetett aminosavszekvenciáját hely szerint vizsgálva 94 ?ó-ban azonosnak találjuk a CrylIIB fehérje következtetett aminosavszekvenciájával, de hely szerint vizsgál va csak 69 %-ban azonos a CrylIIA fehérje következtetett amino> ··· • · ·♦* •4 · · * • ♦ 4 ·4 fc • 4 944
- 38 savszekvenciájával. Ezek a különbségek az inszekticid aktivitásban levő különbségekkel együtt (amelyeket a későbbiekben írunk le) világosan mutatják, hogy a CrylIIC gén által kódolt CrylIIC fehérje a CrylIIB fehérjétől és a CrylIIA fehérjétől eltérő fehérje.
Ezen kívül - bár nem kívánunk semmiféle elmélethez kötődni a CrylIIC fehérje és a CrylIIB fehérje aminosavszekvenciáinak összehasonlítása alapján úgy véljük, hogy az alábbi aminosav gyökök játszhatnak jelentős szerepet a CrylIIC fehérje fokozott kukorica gyökérféreg toxicitásában: His9; His 231; Gln339; Phe352; Asn446; His449; Val450; Ser451; LysóOO, és Lys624 (a számok az aminosavak elfogadott rövidítései után az aminosavak elhelyezkedését jelzik az 1. ábrában bemutatott szekvenciában). Ezeket az aminosav-gyököket azért választottuk ki, mint valószínűleg fontosakat a kukorica levélféreg toxicitásban, mivel - számos más CrylII fehérje aminosavszekvenciájának tanulmányozása után - a jelzett helyeken levő aminosavak teljesen következetesen különböző aminosavakat mutatnak, mint amely aminosavakat a CryUIC fehérjénél jeleztünk.
7. példa
A klónozott CrylIIC gén kifejezése
Tanulmányokat végzünk abból a célból, hogy megvizsgáljuk a CrylIIC gén által történő CrylIIC fehérje termelését.
Az 1. táblázat foglalja össze az ezen munkamenetek során alkalmazott B.t. és E. coli törzsek, valamint plazmidok fontosabb jellemzőit. A + jel a megjelölt elem, aktivitás vagy funkció je— S Γ lenlétét jelzi, míg a jel ezek távollétét jelzi. Az és jelölések jelzik az érzékenységet (sensitivity), illetve a rezisztenciát (jcesistance) arra az antibiotikumra, amelyet e célra al·«·· · ·· ·· ···» · • · · · ♦ · • ··· ·· · · · ·· · · · · * · ·» ··· ·· » ··
- 39 kalmazun k. alábbi: Amp talmú); Te
A táblázatban alkalmazott rövidítések jelentése az (ampicilíin) ; Cm (kióramfenikol); Cry (kristály tari . ’ i
(tetracik^in).
( i
• · 4· « ··· ·· · ♦ · · ·· r ·· ··· ·· · • · • · ··
Törzs vagy plazmid
B. thüringiensis
HD73-26
EG7211
EG7220
EG7231
EG4961
E . coli
DH5$(
GM2163
EG7218
EG7221
EG7232
EG7233
Plazmidok pEG220 pUC18 pNN101
- 40I 1. TÁBLÁZAT i
Törzsek és plazmidok
Lényeges tulajdonságok j :
Cry , CmS pEG220(Cry )-t magában foglaló HD73-26 pEG260(CryIIIC+CryX+)-t magában foglaló HD73-26 pEG269(CryIIIC+CryX )-t magában foglaló HD73-26
CryIIIC+CryX — s
Cry , Amp
Cry, Amps pEG258(CryIIIC+CryX+)-t magában foglaló DH5(/.
pUC18(Cry )-t magában foglaló DH5OÁ pEG268(CryIIIC+CryX )-t magában foglaló DH5o( pEG269(Cry11IC + CryX” )-t magában foglaló
DH5oL
Γ Γ Γ—
Amp , Te , Cm , Cry Bacillus-E. coli ingázó vektor, amely pBR322-t tartalmaz pNN101 Sphl helyébe ligáivá p—
Amp , Cry E. coli vektor p p
Cm , Te , Cry Bacillus vektor
• ••V « *· ·· ·»·· ·* • · · · · • ··· ·· ·* • · ··
Törzs vagy plazmid
Plazmidok (folytatás ) pEG258 pEG260 pEG268 pEG269
1. TÁBLÁZAT (folytatás)
Törzsek és plazmidok
Lényeges tulajdonságok p + +
Amp , CrylIIC CryX E. coli rekombináns plazmid, amely a B.t. EG4961 törzs 8,3 kb-s Asp718-Pstl CryIIIC+CryX+ fragmentumából áll a pl)C18 Asp718-Pstl helyeibe ligáivá
Tcr, Cmr, CryIIIC+, CryX+ Bacillus rekombináns plazmid, amely a B.t. EG4961 törzs 8,3 kb-s Asp718-PstI CrylIIC+CryX+ fragmentumából áll, tompa véggel ligáivá a pNN101 EcoRV helyébe
Γ + Amp CrylIIC CryX E. coli rekombináns plazmid, amely a B.t. EG4961 törzs 5 kb-s
Sau3A fragmentumából áll a pBR322 BamHI helyébe ligáivá
Ampr(E. coli), Tcr és Cmr(B.t.), CryIIIC+
CryX rekombináns ingázó plazmid, amely pNN101-ből áll a pEG26B Sphl helyébe ligáivá
A 6. példában leírt klónozott 8,3 kb-s fragmentumot magában foglaló E. coli sejteket elemezzük, hogy meghatározzuk: vajon termelik-e a 70 kDa-os CrylIIC kristályos fehérjét.
A korábbi tapasztalatok azt mutatják, hogy a klónozott B.t. kristály gének gyengén fejeződnek ki E. coliban és erőteljesen fejeződnek ki B.t.-ben. A pEG258 rekombináns plazmid, amelyet a
6. példa szerint alkotunk meg, replikálódik E. coliban, viszont B.t.-ben nem. Abból a célból, hogy a klónozott CrylIIC gén magasszintű kifejeződését érjük el, a 8,3 kb-s CrylIIC fragmentumot átvisszük pEG258-ból a pNN101 plazmid vektorba (Tcr Cmr Cry ), amely képes replikálódni B.t.-ben.
A pEG258 plazmid konstrukciót izoláljuk E. coli EG7218 törzsből olyan módon, hogy lizozimmal és SDS-sel kezeljük, ezt követi a plazmid DNS etanolos kicsapása; ezekhez standard munkameneteket alkalmazunk. A pEG258 plazmid DNS-t azután E. coli GM2163 törzs transz formálására használjuk fel, amelyet a 6. példában korábban leírt módon kompetenssé tettünk a kalcium-kloridos munkamenet alkalmazásával. Az E. coli GM2163 törzs egy kristálynegatív (Cry ) és ampicillin-érzékeny (Amp ) törzs, amely Marinus M.G. és munkatársai eljárásával lett megalkotva [Marinus M.G. és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 192, 288-289 (1983)^.
A pEG258 plazmid konstrukciót ismét izoláljuk, ezúttal a transzformált E. coli GM2163 törzsből, a közvetlen korábbiakban leírt munkamenetet alkalmazva. Az izolált pEG258 plazmid DNS-t Asp718-cal és Pstl-gyel emésztjük. Az emésztett plazmidot agaróz gélen elektroforézisnek vetjük alá, és a 8,3 kb-s Asp718-Pstl CrylIIC fragmentumot elektroelucióval kinyerjük az agaróz gélről. A 8,3 kb-s fragmentumot tompa végűvé tesszük T4 polimeráz és
• · ι·. ··
- 43 dezoxinukleotid trifoszfátok alkalmazásával, betöltve az Asp718 és PstI végeket.
A tompa végűvé tett 8,3 kb-s fragmentumot összekeverjük a pNN101 Bacillus-vektorral, amelyet előzőleg EcoRV-tel emésztettünk. A keverékhez T4 DNS ligázt és ATP-t adunk, hogy lehetővé tegyük a tompa végű 8,3 kb-s fragmentum ligálódását a pNN101 vektor EcoRV helyére. A ligálás után a DNS keveréket B.t. HD73-26 sejtek szuszpenziójához adjuk. A B.t. HD73-26 törzs sejtjei kristály-negatívak (Cry ) és klóramfenikol-érzékenyek (Cms). Az elektroporációs technikát alkalmazva a keverékben levő B.t. HD73-26 törzs sejtjeit indukáljuk, hogy felvegyék azt a rekombináns plazmid konstrukciót, amely pNN101-ből és a ligáit 8,3 kb-s CrylIIC fragmentumból áll, és amely szintén jelen van a keverékben. így a rekombináns plazmidot elektroporációval transzformáljuk a B.t. HD73-26 törzsbe.
Az elektroporáció után a transzformált B.t. sejteket 5 ^g kloramfenikolt tartalmazó agar tápközegre szélesztjük és mintegy 16-18 órán át inkubáljuk 30°C hőmérsékleten. Azok a sejtek, amelyek felvették a pNN101 plazmidot, telepekké növekednek a klóramfenikol-agaron, míg azok a sejtek, amelyek nem adszorbeálták a plazmidot, nem nőnek ki. A Cm telepeket átvisszük nitrocellulózra, és átvizsgáljuk a radioaktívan jelzett CrylIIB génnel; egy olyan telepet tanulmányozunk tovább, amely fajlagosan hibridizál a CrylIIB vizsgáló mintával; ezt B.t. EG7220 törzsnek nevezzük.
Az EG7220 egy olyan, pEG260-nak nevezett plazmidot tartalmaz, amely a 8,3 kb-s CrylIIC fragmentumból áll beiktatva a pNN1O1 vektor EcoV helyébe. A pEG260 plazmid restrikciós térképét a 8. ábrában mutatjuk be.
A B.t. EG722O törzs sejtjeit olyan spóráztató tápközegben
növesztjük, amely tartalmaz klóramfenikolt (5 g/ml), a növesztést 23-25°C hőmérsékleten végezzük, amíg a spórázás és a sejt lízise végbemegy (3-4 nap). A mikroszkópos vizsgálat feltárja, hogy a B.t. EG7220 törzs tenyészete tartalmaz spórákat és szabadon lebegő, szabálytalan alakú kristályokat.
A B.t. EG7220 törzs spórázott fermentációs tenyészetéből a spórákat, kristályokat és sejttörmeléket centrifugálással nyerjük ki. A kristályokat a centrifugálási maradék keverék hőkezelésével szolubilizál juk szolubilizációs pufferban , 1 3 mól/1 trisz (pH 8,5); 2 % (tömeg/térfogat) SDS, 5 % (térfogat/térfogat) 2-merkapto-etanol, 10 % (térfogat/térfogat) glicerinJ, 100 C hőmérsékletet alkalmazva 5 percen át. Hőkezelés után a keveréket SDS-poliakrilamid gélre visszük fel és a keverékben levő fehérjéket méret szerint frakciónáljuk elektroforézissel. A méret szerinti frakcionálás után a fehérjéket Coomassie festékkel végzett festéssel láthatóvá tesszük. A Coomassie-vel festett gél fényképét a 10. áb rában mutatjuk be.
A 10. ábra azt mutatja meg, hogy a B.t. EG7220 törzs egy nagyobb, mintegy 70 kDa-os, és egy kisebb, mintegy 30 kDa-os fehérjét termel. Ezek a fehérjék, úgy tűnik, méret szerint azonosak a B.t. EG4961 törzs által termelt nagyobb, mintegy 70 kDa-os, és kisebb, mintegy 30 kDa-os fehérjékkel (10. ábra). Ez az eredmény azt demonstrálja , hogy a pEG260 8,3 kb-s fragmentuma két kris tályos fehérje gént tartalmaz: egyet a mintegy kDa-os fehérjéhez és egyet a mintegy 30 kDa-os fehérjéhez.
kódolt mintegy kDa-os fehérjét kódoló gén a
CrylIIC gén, és a fehérj e a CrylIIC fehérje.
A mintegy 30 kDa-os kristályos fehérjét kódoló gént CryX génnek, és a kódolt fehérjét CryX fehérjének nevezzük.
- 45 Ifc .
t i-' . ' .
?·.··
i..·'
Amint elvárjuk és a 10. ábrában bemutatjuk, egy izogén B.t. kontroll törzs, amelyet EG7211-nek nevezünk, és amely a B.t. HD73-26 törzsből áll és csak a pEG220 plazmid vektort tartalmazza, nem termeli sem a mintegy 70 kDa-os fehérjét, sem a mintegy 30 kDa-os fehérjét. A pEG220 plazmid ampicillin rezisztens, tetraciklin rezisztens, klóramfenikol rezisztens és kristály-negatíν E. coli-Bacillus ingázó vektor, amely pBR322-t tartalmaz a pNN101 Sphl helyére ligáivá .
A CrylIIC gént és a CryX gént tartalmazó klónozott 8,3 kb-s fragmentumot magában foglaló E. coli sejteket abból a célból elemezzük, hogy meghatározzuk, vajon ezek termelnek-e mintegy 70 kDaos és mintegy 30 kDa-os kristályos fehérjéket. A pEG258-at magában foglaló, EG7218-nak nevezett E. coli sejteket növesztjük, amíg elérjük a késői stacionárius fázist, majd a sejteket centrifugálással kinyerjük. Az E. coli EG7218 törzs sejtjeit lizáljuk és a teljes sejtfehérjét szolubilizáljuk olyan módon, hogy a sejteket a fehérje-pufferban melegítjük. Az E. coli EG7218-ból szolubilizált fehérjék teljes mennyisége azonosnak tűnik az E. coli EG7221kontroll nek nevezett negat1vVtörzséből szolubilizált fehérjék teljes mennyiségével; ez a vektor csak a pUC18 plazmid vektort foglalja magában, amint ezt a 10. ábrában bemutatjuk. Ez az eredmény azt klónozott demonstrálja, hogy 3/T, 3 kb-s CrylIIC fragmentumot magában foglaló E. coli sejtek nagyon keveset termelnek (vagy egyáltalán nem termelnek) akár a mintegy 70 kDa-os, akár a mintegy 30 kDa-os kristályos fehérjéből.
Az alábbi munkameneteket alkalmazzuk a mintegy 70 kDa-os CrylIIC fehérje kinyeréséért felelős CrylIIC gén izolálására.
A B.t. EG4961 törzsből - amely tartalmazza a CrylIIC gént, de nem tartalmazza a CryX gént - való Sau3A fragmentumot klónoz-
/ι · '· · · · · · zuk, vizsgáló mintaként CrylIIB gént alkalmazva. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy részlegesen emésztjük Sau3A-val a B.t. EG4961-ből való DNS-t, az emésztett DNS-t elektroforézisnek vetjük alá agaróz gélen, és a 4 kb-9 kb közti méretű Sau3A fragmentumokat tartalmazó gélszeleteket kimetsszük. A Sau3A fragmentumokat elektroelucióval kinyerjük a gélszeletekből és összekeverjük pBR322 vektor plazmáddal, amelyet előzőleg emésztettünk BamHI-gyel. A Sau3A fragmentumokat pBR322 vektorba ligáljuk. A ligálási keveréket E. coli DH5^( törzs CaCl^-vel kezelt sejtjeivel inkubáljuk, hogy lehetővé váljék a sejtek számára a plazmid DNS felvétele.
Inkubálás után a sejteket ampicillint és LB tápközeget £.1 % (tömeg/térfogat) Difco tripton; 0,5 % (tömeg/térfogat) Difco élesztőkivonat; 0,5 % (tömeg/térfogat) NaCl (pH 7,0 )^J tartalmazó lemezekre szélesztjük azért, hogy kiválasszuk a plazmid DNS-t abp szorbeáló sejteket. Többszáz Amp transzformáns telepet viszünk át foltképzésre nitrocellulóz szűrőkre, és a szűrőket átvizsgáljuk radioaktívan jelzett CrylIIB vizsgáló mintával, amint ezt az 1. ábrában leírtuk. A vizsgáló minta számos telephez hibridizálés ezen telepek egyikének, amelyet EG7232-nek nevezünk, jellemzését írjuk le a továbbiakban. Az E. coli EG7232 törzs egy olyan plazmidot tartalmaz, amelyet pEG268-nak nevezünk, és pBR322-ből, továbbá egy mintegy 5 kb-s beiktatott Sau3A-BamHI DNS fragmentumból áll. A beiktattott DNS fajlagosan hibridizál a radioaktívan jelzett CrylIIB vizsgáló mintával.
Γ s
A pEG268 plazmid (Amp Te ) replikálódik E. coliban, de nem replikálódik B.t.-ben. Abból a célból, hogy a pEG268-nak olyan származékát kapjuk meg, amely B.t.-ben képes replikálódni, a pEG p 268-at SphI-gyel emésztjük, összekeverjük pNN101 (CmrTc ) Bacillus plazmiddal, amelyet előzőleg SphI-gyel emésztettünk, és a keveré-
két ligáljuk. A ligálási keveréket inkubáljuk CaCI^-vel kezelt E. coli sejtek szuszpenziójával, hogy lehetővé tegyük a sejtek számára a pNN101-gyel ligáit pEG268 plazmidból való DNS felvételét. Inkubálás után a sejteket LB tápközeget és tetracikiint tartalmazó agar lemezekre szélesztjük; több száz tetraciklin-rezisztens telep nő ki. Tetraciklin jelenlétében csak olyan sejtek képesek kinőni és telepet képezni, amelyek abszorbeáltak egy pEG268-at és pNN101-et tartalmazó plazmidot. Ezen Te telepek egyikét, amelyet EG7233-nak nevezünk, választjuk ki további jellemzésre és tanulmányozásra. Amint várható, az E. coli EG7233 törzsről úgy találjuk, hogy tartalmaz egy pEG269-nek nevezett plazmidot, amely pNN1O1-ből áll a pEG268 Sphl helyébe beiktatva. A pEG269 restrikciós térképét a 9. ábrán mutatjuk be.
A pEG269 plazmid konstrukciót izoláljuk az E. coli EG7233 törzsből olyan módon, hogy lizozimmal és SDS-sel kezeljük, és a plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk standard munkameneteket alkalmazva. A pEG269 plazmid DNS-t azután E. coli GM2163 törzs transzformálására használjuk fel standard munkameneteket alkalmazva, amint ezt az előzőekben leírtuk.
A pEG269 plazmid konstrukciót ismét izoláljuk, ezúttal a transz formált E. coli GM2163 törzsből. Az izolált pEG269 plazmid DNS-t hozzáadjuk a kristály-negatív, klóramfenikol-érzékeny B.t. HD73-26 törzs sejtjeinek szuszpenziójához, és a keveréken elektromos áramot vezetünk át úgy, hogy a pEG269 elektroporációval transz formálódjék a B.t. HD73-26 törzsbe. A sejteket LB tápközeget és klóramfenikolt tartalmazó agar lemezre szélesztjük; inkubálás után több száz Cm telep nő ki. Ezen Cm telepek egyikét, amelyet EG7231-nek nevezünk, választjuk ki további jellemzésre és vizsgálatra. Amint várható, a B.t. EG7231 törzsről úgy talál- 48 -
> *···· · ·· ·· ·♦·· ·· • · · · · · • ··· ·· · · • · · · · · · ·· ··· «· · ·· juk, hogy tartalmazza a pEG269-et.
A B.t. EG7231 törzs sejtjeit klóramfenikolt is tartalmazó DSMG tápközegben növesztjük 20-23°C hőmérsékleten 4 napon át. A mikroszkópos átvizsgálás azt mutatja, hogy a tenyészet a spórákon kívül tartalmaz olyan részecskéket is, amelyek B.t. kristályokra emlékeztetnek. A tenyészet szilárd maradékát, amely spórákat, kristályokat és sejttörmeléket foglal magában, centrifugálással kinyerjük, és vizes oldatban szuszpendáljuk 100 mg szilárd tenyészet-maradék/ml koncentrációban. Ezen szuszpenzió egy részét összekeverjük szolubilizáló pufferral 7^0,13 mól/1 trisz (pH 8,5); 2 % (tömeg/tér fogat) SDS; 5 ?ó (tér fogat/1érfogat) 2-merkapto-etanol ; 10 °í (térfogat/térfogat) glicerin^, 100°C hőmérsékleten 5 percen át melegítjük, és a keveréket elektroforézisnek vetjük alá SDS-po1iakri1amid gélen, hogy a fehérjéket méret szerint osztályozzuk. Méret szerinti frakcionálás után a fehérjéket láthatóvá tesszük a gél festésével Coomassie festékkel. A festett gél fényképét a 10. ábra foglalja magában.
A B.t. EG7231 törzs termel egy mintegy 70 kDa-os nagyobb fehérjét, amely méretben, úgy tűnik, azonos a B.t. EG4961 törzs mintegy 7o kDa-os CrylIIC fehérjéjével, amint ezt a 10. példa bemutatja. A B.t. EG7231 törzs nem termel semmiféle mérhető mennyiséget a mintegy 30 kDa-os kristályos fehérjéből (10. ábra). Ez az eredmény azt demonstrálja, hogy a mintegy 30 kDa-os kristályos fehérje CryX génje a 7. és 8. ábrákban pontozott vonallal jelzett területen belül helyezkedik el. Ezen kívül ez azt is mutatja, hogy a B.t. EG7231 törzs izolált formában tartalmazza a CrylIIC gént.
Az alábbi 8.-12. ábrákban leírjuk azokat a módokat, amelyekkel a B.t. EG4961 és a CrylIIC fehérje inszekticid aktivitását mérjük.
• ·
A B.t. EG4961 törzs és a CrylIIC fehérje inszekticid aktivitása összehasonlítva a B.t. EG215B és B.t. tenebrionis törzsek, valamint a CrylIIA fehérje aktivitásával
8. példa
Általános előkészítés és vizsgálati munkamenetek a biológiai inszekticid meghatározásához
Fermentácós koncentrátumok. B.t. EG4961 és B.t. EG2158 törzseket és B.t. tenebrionist (B.t.t.) növesztünk folyékony spóráztató tápközegben 30°C hőmérsékleten, amíg a spórázás és a lízis végbemegy. A tápközeg tartalmaz valamely fehérjeforr ást és szénhidrát-forrást, valamint ásványi sókat, amelyek általában használatosak a szakterületen. Az autoklávozás előtt a tápközeg pH-ját
7,5-re állítjuk be NaOH hozzáadásával. A fermentlevet centrifugálással koncentráljuk, és felhasználásig hűtve tartjuk.
Ahogyan itt használjuk, a CrylII kristályos fehérje olyan kristályos fehérjét jelent, amely mintegy 70 kDa méretű és amelyet a vizsgálandó B.t. EG4961 , B.t. EG2158 és B.t.t. törzsek tenyészeteiből nyerünk. A CrylII kristályos fehérjét a fermentációs tenyészet szilárd részeiből tisztítjuk szacharóz sűrűséggradiens alkalmazásával. Amikor szacharóz sűrűséggradienst alkalmazunk a spórázó B.t. fermentációs tenyészete komponenseinek elkülönítésére, a B.t. spórák üledéket képeznek a gradiens alján és a B.t. kristályok a gradiensnek mintegy közepén képeznek csíkot, így a szacharóz sűrűséggradiens lehetővé teszi B.t. kristályos fehérjék elkülönítését viszonylag tiszta formában a B.t. spóráktól és más szilárd fermentációs maradékoktól. Az elkülönített CralII kristályos fehérjéket felhasználásig 4°C hőmérsékleten tároljuk.
A CrylII kristályos fehérje mennyiségének becslését a bio-
lógiai vizsgálatnak alávetett mintákban standard SDS-PAGE technikákkal határozzuk meg. Az alábbi rovarokat vetjük alá a vizsgálatnak:
déli kukorica gyökérféreg (SCRW); Diabrotica undecimpunctata howardi nyugati kukorica gyökérféreg (WCRW); Diabrotica virgifera virgifera kolorádó burgonyabogár (CPB); Leptinotarsa decemlineata égerlevél bogár; Pyrrhalta luteola importált fűzfalevél bogár; Plagiodera versicolora
Két típusú biológiai vizsgálatot végzünk. Az egyik mesterséges étrendet alkalmaz, a másik viszont a levél-bemártást alkalmazza.
Mesterséges étrendet alkalmazó biológiai vizsgálatok
SCRW lárvák biológiai vizsgálatát végezzük egy mesterséges étrend felületi fertőzésével. A mesterséges étrend a Marrone és munkatársai által kidolgozott étrendhez hasonló · Econ. Entomol. 7 8 , 290-293 (1 9 8 5 )^J, de formaiin nincsen benne. Mindegyik biológiai vizsgálat 8 sorozathigitást alkalmaz, amelyek alikvotjait felvisszük az étrend felületére. Miután a higítószer (0,005 % Triton X-100 oldat) megszáradt, az első lárva stádiumú rovart az étrendre helyezzük és 28°C hőmérsékleten inkubáljuk. 32 lárvát vizsgálunk meg dózisonként. A mortalitást hét nap múlva értékeljük. A megismételt biológiai vizsgálati eredményeket probit elemzéshez összegyűjtjük jj)aum R.J.: Bull. Entomol. Soc. Am. 1 6 , .1015 1 (1970)J, a mortalitást korrigáljuk a kontroll pusztulásokhoz;
a kontroll a higítószer maga J^Abbott W.5.: J. Econ. Entomol. 18, 265-267. Az eredmények úgy értendők, mint az a CrylII kristályos fehérje/mm étrend-felület mennyiség, amely az LC^-et idézi elő, vagyis az a koncentráció, amely a vizsgált rovarok ,o-át elpusztítja. A 95 ?í-os konfidencia intervallumokat záró-
,-·. _.·««· · »4 «· a····· • a · ·· · a ·»**···· • a aaaa ·· ·· eaa ·· a ··
- 51jelben jelezzük.
Az első lárva állapotú WCRW rovarokat azonos mesterséges étrenden vizsgáljuk egyetlen dózisban. A mortalitást 48 óra múlva olvassuk le.
Az első lárva állapotú CPB rovarokat hasonló technikákkal vizsgáljuk azzal a kivétellel, hogy a mesterséges étrendhez a BioServe’s ^9380 rovardiéta helyettesítésére burgonyapelyhet alkalmazunk. A mortalitást három nap múlva értékeljük és nem hét nap múlva.
Levél-bemártásos biológiai vizsgálatok. Olyan rovarfajoknál vagy rovarnövekedési stádiumoknál, ahol megfelelő mesterséges étrend nem áll rendelkezésre, a biológiai vizsgálatokat úgy végezzük el, hogy a megfelelő természetes élelemanyagokat (leveleket) belemártjuk a vizsgálati anyag ismert kezelési koncentrációban levő vizes szuszpenziójába, ahol a víz 0,2 % Triton X-100 oldatot is tartalmaz. Miután a fölös anyagot leitattuk, a leveleket hagyjuk megszáradni. A 0,2 ?ó Triton X-100 oldatba mártott levelek szolgálnak nem kezelt kontrollként. 5 vagy 10 rovart zárunk be egy kezelt leveleket tartalmazó Petri-csészébe, és hagyjuk ezeket táplálkozni 48 órán át. Felnőtt SCRW-ket, felnőtt CPB-ket, felnőtt és lárva állpotú égerlevél bogarakat, valamint felnőtt és lárva állapotú importált fűzfalevél bogarakat vizsgálunk ilyen módon, megfelelő élelem-forrásokat alkalmazva.
Minden eltérést a fenti módszerektől megemlítünk a megfelelő adatoknál.
9. példa
CrylII fehérjék inszekticid aktivitása CPB lárvák, égerle vél bogarak és importált fűzfalevél bogár lárvák ellen
A B.t. EG4961 törzs aktivitásban . hasonló a korábban fej• · · · · · • ··· ♦· · · ♦ • · ··«· ·· ·· ««· ·· · ·· fedezett B.t. EG2158 törzshöz a CPB lárvákat illetően, amikor mesterséges étrenden vizsgálunk, amint ez a 2. táblázat adataiból látható.
«ϊ<«· «· 4« «··· ·· • · · · · * v 4·· ·· · · · « « · · · ·· • · ·»· *· · ··
2. TÁBLÁZAT
A B.t. EG4961 és B.t. EG2158 törzsek inszekticid aktivitása első lárva állapotú kolorádó burqonyaboqár lárvák ellen mesterséges étrendet alkalmazó biológiai vizsgálatokban
LC5o(95 % k.i.*) ng CryIII/mm^-ben
Minta típusa vizsgálatok száma EG4961 EG2 1 58
| Fermentlé kon- | 2 | 0,47 | 0,42 |
| centrátum | (0,39-0,57) | (0,35-0,50) |
Kontroll mortalitás
3,1 % * k.i.: 95 ?ó konfidencia intervallum a zárójelben
«·«« « ·« 99 «····<?
' · · · · * ff *»· #* ·· «ν * · · · * ♦ « ··· *· · ··
A levél-bemártásos biológiai vizsgálatok szintén azt demonstrálják, hogy a B.t. E G 4 9 61 törzs aktivitása a B.t. EG2158 és a B.t.t. törzs aktivitásához hasonló az égerlevél-bogár lárvák és felnőtt példányok, valamint az importált fűzfalevél-bogár lárvák ellen.
10. példa
A B.t. törzsek és CrylIII fehérjék inzekicid aktivitása SCRW lárvák ellen mesterséges étrendet alkalmazó biológiai vizsgálatban
Egyedül a B.t. EG4961 törzs mutat aktivitást az SCRW lárvák ellen a B.t. EG2158 és B.t.t. törzsekkel együtt végzett biológiai vizsgálatban mesterséges étrenden, amint ezt a 3. táblázat biológiai vizsgálati adatai bemutatják. A 3. táblázatban a Fermentációs koncentráció N—1 és Fermentációs koncentráció N—2 jelölések összehasonlítások, amelyek a B.t. EG4961 törzs különböző fermentációs koncentrációin alapulnak. Sem a B.t. EG2158 törzs, sem a B.t.t. törzs nem idéz elő 15 %-nál nagyobb mortalitást még a legmagasabb vizsgált dózisban sem. Ezzel ellentétben kapunk LC^g értékeket (vagyis egy adott dózisnál 50 % mortalitást) a B.t. EG4961 törzsnél (3. táblázat).
Amikor a B.t. EG4961 törzs tisztított CrylII kistályos fehérjéjét biológiai vizsgálatnak vetjük alá, a megfigyelt aktivitás csak alig kevesebb, mint amelyet a B.t. EG4961 fermentációs koncentrációival (amelyek spórákat és kristályokat tartalmaznak) kapunk. Ez az eredmény a CrylIIC kristályos fehérjét azonosítja a B.t. EG4961 törzsben levő toxikus szerként. A B.t. EG4961 törzs biológiai vizsgálatában (ahol használunk mind fermentációs sűrítményeket, mind tisztított kristályos fehérjét) túlélő lárvák rendkívül satnya növésűek, összehasonlítva a nem kezelt kontroll
·· · ·· • · · • · · ·
lárvákkal.
Amilyen csekély aktivitással bír a B.t. EG2158 törzs fermentációs koncentrátuma az SCRW lárvák ellen, az is elvész, amikor ennek tisztított CrylIIA kristályos fehérjéjét vizsgáljuk önmagában. Még akkor is, amikor a tisztított CrylIIA fehérje koncentrációja ötszörösénél is többre növekszik a CrylIIC kristályos fehérje megfelelő mennyiségénél, az SCRW aktivitás nincs jelen a CrylIIA fehérjénél. A B.t. EG2158 törzs mint fermentációs koncentrátum minimális aktivitása függhet a spórák jelenlététől a CrylIIA kristályos fehérjével együtt.
3. TÁBLÁZAT
AB.t. EG4961 törzs inszekticid aktivitása SCRW lárvák ellen mesterséges étrendet alkalmazó biológiai vizsgálatban
LC^„(95 % k.i.) ng CryIII/mm2-ben vizsgálatok
| Minta típusa | száma | EG4961 | EG2158 | B . t. t. t |
| Fermentációs | 4 | 170(139-213) | 14 °ó pusztulás nem vizs- | |
| koncentráció N—1 | Lc 1000 | gáltuk | ||
| Kontroll morta- | ||||
| litás N-1 | 9,4 % | |||
| F ermentációs | 4 | 206(161-273) | nem vizs- 15 | % pusztulás |
| koncentráció N—2 | gáltuk | (Lc 1000) | ||
| Kontroll morta- | ||||
| litás N—2 | 8,6 % | |||
| Tisztított fehér- | 4 | 645(521-819) | 3 °í> pusztulás | nem vizs- |
| je kristályos | (Lc 5000) | gáltuk |
8,3
Kontroll mortalitás o/ /0
A B.t. EG4961 fermentációs koncentrátumot WCRW lárvák ellen egyetlen dózisnál vizsgáló biológiai vizsgálatok - amelyeket mesterséges étrenden végzünk - az SCRW lárváknál megfigyelthez hasonló mortalitást mutatnak ki. Akárcsak az SCRW lárváknál, a B.t.t. kicsiny, de a kontrolinál nagyobb mortalitást alakít ki.
11. példa
A B.t. EG4961, B.t. EG2158 és B.t.t. törzsek inszekticid aktivitása felnőtt SCRW és felnőtt CPB ellen levél-bemártásos biológiai vizsgálatban
Az SCRW lárvák elleni egyedi aktivitásán kívül a B.t. EG4961 törzs egyedi inszekticid aktivitást mutat mind az SCRW, mind a CPB felnőtt stádiumé rovarjai ellen (4. táblázat), amelyekre a B.t. EG2158 vagy a B.t.t. törzsek viszonylag hatástalanok. A rovar-biológiai vizsgálatok adatai ezekből a tanulmányokból a 4. táblázatban láthatók.
4. TÁBLÁZAT
A B.t. EG4961, B.t. EG2158 és B.t.t. törzsek inszekticid aktivitása felnőtt SCRW és Felnőtt CPB ellen levél-bemártásos biológiai vizsgálatban % pusztulás 48 óra után
Törzs/jg CrylII/ml SCRW CPB
| EG4961 | 2800 | 50 | 100 |
| 1400 | 37,5 | 98 | |
| 700 | 25 | 95 | |
| 350 | 10 | 70 | |
| EG2158 | . 4350 | - | - |
| 2175 | - | 0 | |
| 1088 | - | 10 | |
| 544 | - | - | |
| B.t.t. | 2250 | 0 | 0 |
| 1 1 25 | 10 | 5 | |
| 563 | 0 | 0 | |
| Kontroll mortalitás | 0 | 0 |
(-) azt jelzi, hogy nem vizsgáltuk
12. példa
A klónozott CrylIIC gén inszekticid aktivitása
B.t. EG4961 törzset és rekombináns B.t. EG7231 törzset - amely tartalmazza a B.t. EG4961 törzsből való CrylIIC gént és a 7. példában van leírva - növesztünk folyékony spóráztató tápközegben, majd centrifugálással koncentráljuk, amint ezt általában leírtuk az 5.-7. példákban. Mindkét koncentrátumot biológiai vizsgálatnak vetjük alá SCRW lárvák és CPB lárvák ellen mesterséges étrendet alkalmazva, az előzőekben leírt technikát alkalmazva, de három dózissal nyolc dózis helyett és (CPB-nél) dózisonként 16 CPB lárvával 32 helyett. Az 5. táblázatban bemutatott eredmények azt demonstrálják, hogy a B.t. EG7231 törzs olyan CrylIIC kristályos fehérjét termel, amely toxicitásban egyenlő azzal, amely a B.t. EG4961 törzsben található. A kristály-negatív, spórázó B.t. EG7211 törzset, amelyet a B.t. EG7231 törzs megalkotásához alkalmaztunk, vizsgáljuk, mint további kontrollt; ez nem bizonyul aktívnak. Ez a biológiai vizsgálat azt igazolja, hogy a CrylIIC gén termeli a fedelesszárnyúakra aktív kristályos fehérjét a B.t. EG4961 törzsben.
• ·
5. TÁBLÁZAT
B.t. EG7231 és B.t. EG4961 törzsek aktivitása 5CRW lárvák és CPB lárvák ellen mesterséges étrendet alkalmazó biológiai vizsgálatban
LC5Qnq CryIII/mm2(95 % k.i.)
| Törzs | SCRW | CPB |
| EG7231 | 359 (238-593) | 0.23 (0.05-0.49) |
| EG4961 | 421 (253-1086) | 0.32 (0.19-0.50) |
| EG7211 | 9 T 4 % pusztulás | 12,5 % pusztulás |
| Kontroll | 6j25 % pusztulás | 3,125 % pusztulás |
Az alábbi 13. példa olyan tanulmányokra vonatkozik, amelyekben a CrylII fehérjék inszekticid aktivitása fedelesszárnyú rovarok ellen kimutathatóan fokozódik, amikor a CrylII fehérjét valamely Cryl fehérjével kombináljuk. A CrylA(c) fehérje kristályok nem toxikusak fedelesszárnyú rovarok ellen, ismeretes viszont ró luk, hogy számos pikkelyesszárnyú rovarfaj ellen aktívak.
13. példa
A CrylII fehérje inszekticid aktivitásának szinergikus fokozása Cryl fehérje hozzáadásával
Egy rekombináns B.t. törzset, a B.t. EG1269-et, amely csak CrylA(c) fehérje kristályokat termel, növesztünk folyékony spóráztató tápközegen általában az előzőekben, az 5.-7. példákban leírt technikákat alkalmazva. A rekombináns B.t. EG1269 törzset úgy alkotjuk meg, hogy a pEG157 plazmidot bevezetjük B.t. HD73-26 törzsbe. A pEG157 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pEG87-ből (B.t. HD263-6 törzs) való CrylA(c) gént szubklónozzuk a pEG147 ingázó vektorba. A CrylA(c) fehérje kristályokat Renografin gradienssel tisztítjuk és mennyiségi meghatározásnak vetjük alá a korábban említett SDS-PAGE eljárást alkalmazva. Ezen Cryl kristályok azonos mennyiségét adjuk CrylIIC kristályokhoz, és a kristályos fehérje keveréket biológiai vizsgálatnak vetjük alá SCRW lárvák ellen mesterséges étrendet alkalmazva. A CrylIIC-Cryl fehérje keverék szignifikánsan toxikusabb, mint a CrylIIC kristályok önmagukban, amelyet a 6. táblázatban található adatok világosan jeleznek.
• ·
·«·· ·♦· • · • · ·· ··· ν' ·
6. TÁBLÁZAT
CrylIIC és CrylA(c) kristályos fehérjék keverékének inszekticid aktivitása: SCRW lárvák ellen mesterséges étrendet alkalmazó biológiai vizsgálatban
Kezelés Vizsgálatok száma
CrylIIC kristályok2
CrylIIC kristályok +2
CrylA(c) kristályok
CrylA(c) kristályok2
Kontroll mortalitás
LC50 ng CryIIIC/mm2(95% k.i.)
1180 (810-2000)
309 (220-500)
5 f 6% pusztulás 571 ng/mm -nél
6;25% • ·
Abból a célból, hogy biztosítsuk a köz számára az anyagok hozzáférhetőségét, amely feltétele annak, hogy a jelen bejelentésre szabadalmat kapjunk, deponáltuk az alábbi mikroorganizmusokat még a jelen bejelentés benyújtása előtt az alábbi deponálási helyen: ARS Patent Collection, Agricultural Research Culture Collection, Northern Régiónál Research Laboratory (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61064. A deponált törzsek listáját a 7. táblázat tartalmazza.
. ···· · -·9 9..
•··· •· · ····· • · • · ·· • · • · • · ··
7. TÁBLÁZAT
| Baktérium törzsek | NRRL | deponálási szám | A deponálás dátuma |
| B, thürinqiensis | EG2158 | B-18213 | 1987 április 29 |
| B. thürinqiensis | HD73-26 | B-18508 | 1989 június 12 |
| B. thürinqiensis | EG4961 | B-18533 | 1989 szeptember 13 |
| B. thürinqiensis | EG2838 | B-18603 | 1990 február 8 |
| B. thürinqiensis | EG7231 | B-18627 | 1990 február 28 |
| E. coli EG7218 | B-18534 | 1989 szeptember 13 |
··«· ·.··
κ >.·.
·· ···
Ezek a mikroorganizmusok a Budapesti Szerződés a Mikroorganizmusok Deponálásának Nemzetközi Elismeréséről Szabadalmi Eljárás Céljaira (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganismus fór the Purposes o f Patent Procedure) előírásai szerint lettek deponálva. Minden korlátozás, amely ezen deponált mikroorganizmusnak a köz számára való hozzáférhetőségét akadályozza, véglegesen és visszavonhatatlanul eltűnik akkor, amikor az ezen bejelentésen alapuló USA szabadalmat megadják.
A jelen találmánynak más kiviteli módjai is lehetnek a nélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől és lényeges jellemzőitől. Ennek megfelelően a találmány oltalmi körét az ez után következő igénypontok szabják meg és nem az előzőekben leírt kiviteli példák.
Az alábbiakban mellékletként bemutatjuk magyar fordításban azt a deponálási iratot, amelyet a PCT International Services Divisionhoz benyújtottunk. A mellékletben megnevezett oldal- és sorszámok az eredeti angol szövegre vonatkoznak.
PCT bejelentések útmutatója - I. kötet - M3 függelék
M3 FÜGGELÉK
Nemzetközi bejelentés száma: PCT/
MIKROORGANIZMUSOK
A leírás 4. oldalának 27. sorában utalás található mikroor ganizmussal kapcsolatban szükséges kiegészítő lap.
A. A DEPONÁLÁSI ANYAG AZONOSÍTÁSA:
További deponált anyagok vannak egy kiegészítő lapon
A deponáló intézmény neve:
American Research Culture Collection (NRRL)
A deponáló intézmény címe ( beleértve a postai kódszámot és az államot is)
1815 N. University Street
Peoria, Illinois 61604, Amerikai Egyesült Államok
| A deponálás dátuma: | A deponálási szám: |
| lásd a függeléket | lásd a függeléket |
B. TOVÁBBI UTALÁSOK ( maradjon üresen, ha nem kell alkalmazni) Ez az információ folytatódhat egy külön függelék oldalon fZJ
Azokkal a megjelölésekkel kapcsolatban, amelyben egy európai szabadalmat kérnek, a deponált mikroorganizmus mintájának rendelkezésre bocsátása mindaddig, amíg az európai szabadalom megadását nem publikálják, vagy addig az időpontig, amíg a bejelentést elutasítják vagy visszavonják, vagy visszavontnak tekintik, csak olyan szakértő számára történhet, akit a mintát kérő személy megnevez ^Európai Szabadalmi Szerződés (EPC) 28(4) szabályj.
C. MEGJELÖLT ÁLLAMOK, AMELYEKNÉL MEGJEGYZÉSEKET TESZNEK (ha a megjegyzések nem minden megjelölt államra vonatkoznak)
D. A MEGJEGYZÉSEK KÜLÖNBÖZŐ KELLÉKEI (hagyjuk üresen, ha nem szük- séges)
Az alább felsorolt megjegyzéseket később továbbítani kell a
Nemzetközi Irodánakmeg a megjegyzések általános termé szetét (pl. Deponálási szám)
··«· · ·· • ··· • · · ·· ··· «· ·*·· ··
Ε· U Ezt a lapot megkaptuk a nemzetközi bejelentéssel együtt, amikor benyújtották ellenőrzésre a befogadó Hivatalhoz aláírás, pecsét (felhatalmazott hivatalnok) A benyújtás dátuma (a bejelentő részéről) a Nemzetközi
Irodába ................. történt (felhatalmazott hivatalnok)
PCT/RO/134 formanyomtatvány (1981 január)
KIEGÉSZÍTÉS a PCT/R0/T34-HEZ
A MIKROORGANIZMUS ROVAT FOLYTATÁSA
| 8. | oldal | 8 . | sor | |
| 9. | oldal | 28. | sor | |
| 12. | oldal | 6. | és 8. | sor |
| 42 . | oldal | , 5. | sor | (mind az eredeti angol elsőbbségi irat sző |
vege szerint)
AZ A ROVAT (DEPONÁLT ANYAG AZONOSÍTÁSA) FOLYTATÁSA
Az alábbi mikroorganizmusokat deponáltuk az A rovatban említett deponálási intézményben az alábbi lista szerinti dátumokon: Baktériumtörzs NRRL deponálási szám A deponálás dátuma
| 8. | thüringiensis | EG2158 | B-18213 | 1987. | április 29 |
| B. | thüringiensis | HD73-26 | B-18508 | 1 989. | június 12 |
| B. | thüringiensis | EG4961 | B-18533 | 1989. | szeptember 13 |
| B. thüringiensis EG2838 | B-18603 | 1990. | február 8 |
| B. thüringiensis EG7231 | B-18627 | 1990. | február 28 |
| E. coli EG7218 | B-18534 | 1989. | szeptember 13 |
| **B. thüringiensis EG7231 | B-186Z7N | 1990. | április 17 |
| Meg kell jegyeznünk, hogy | az NRRL B-18627 | eredeti | deponálásának |
mintáját nem találták azonosnak azzal, amelyet az Ecogen Inc eredetileg deponált. E miatt ugyanazon mikroorganizmus - amelyet az Ecogen Inc.-nél EG7231-nek neveztek el - új példányát küldték el az NRRL-hez új deponálásként, ahol ez NRRL B-18627N deponálási számot kapta.
Claims (4)
1. vagy 2. igénypont szerinti gén termeli.
5. ) Biológiailag tiszta baktériumtenyészet azzal jellemezve, hogy ez a 3. igénypont szerinti rekombináns plazmiddal transzformált baktérium tenyészete.
6. ) Az 5. igénypont szerinti baktérium azzal jellemezve, hogy ez Bacillus thüringiensis.
7. ) A 6. igénypont szerinti Bacillus thüringiensis baktérium azzal jellemezve, hogy ez az NRRL-nél NRRL B-18627 számon deponált baktérium.
8. ) Inszekticid kompozíció azzal jellemezve, hogy valamely 4. igénypont szerinti fehérjét és valamely mezőgazdaságilag elfogadható hordozót tartalmaz.
9. ) Inszekticid kompozíció azzal jellemezve, hogy valamely 5. igénypont szerinti baktériumot, ilyen baktérium által termelt, fedelesszárnyúakra toxikus fehérjét és valamely mezőgazdaságilag elfogadható hordozót tartalmaz.
10. ) Növény azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont sze- 70 -
9··· • ♦ • · • ·* • -99» • 9» ,-. ···»
99 * « · · *· • « • · «· rinti génnel van transzformálva.
11. ) A 2. igénypont szerinti CrylIIC gén azzal jellemezve, hogy a gén vagy egy része jelezve van hibridizáló vizsgáló mintaként való felhasználáshoz.
12. ) Bacillus thüringiensis baktérium biológiailag tiszta tenyészete azzal jellemezve, hogy ez az NRRL-nél NRRL B-18533 számon deponált baktérium tenyészete.
13. ) Fedelesszárnyúakra toxikus fehérje azzal jellemezve, hogy a
12. igénypont szerinti Bacillus thüringiensis baktériummal van előállítva és aminosavszekvenciája az 1. ábrában bemutatott.
14. ) Inszekticid kompozíció azzal jellemezve, hogy egy 13. igénypont szerinti, fedelesszárnyúakra toxikus fehérjét tartalmaz valamely mezőgazdaságilag elfogadható hordozóval kombinálva.
15. ) A 14. igénypont szerinti inszekticid kompozíció azzal jellemezve, hogy a fedelesszárnyúakra toxikus fehérjét egy Bacillus thüringiensis baktérium tartalmazza.
16. ) Eljárás fedelesszárnyú rovarok visszaszorítására azzal jellemezve, hogy az ilyen rovarok gazdanövényére valamely 4. igénypont szerinti, fedelesszárnyúakra toxikus fehérje inszekticid szempontból hatékony mennyiségét visszük fel.
17. ) A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fedelesszárnyúakra toxikus fehérje Bacillus thüringiensisben található .
18. ) A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a Diabrotica nemzetség rovarjainak visszaszorítására szolgál.
19. ) Eljárás fedelesszárnyú rovarok visszaszorítására azzal jellemezve, hogy az ilyen rovarok gazdanövényére valamely 13. igénypont szerinti, fedelesszárnyúakra toxikus fehérje inszekticid szempontból hatékony mennyiségét visszük fel.
....... ··, ···:
<· ··· ··
20. ) A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fedelesszárnyúakra toxikus fehérje Bacillus thüringiensisben található.
21. ) A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a Diabrotica nemzetség rovarjainak visszaszorítására szolgál.
22. ) Eljárás egy fedelesszárnyúakra toxikus fehérjét tartalmazó inszekticid kompozíció inszekticid aktivitásának fokozására azzal jellemezve, hogy egy CrylII fehérjét tartalmazó inszekticid kompozícióba olyan mennyiségű Cryl fehérjét építünk be, amely hatékony a kompozíció fedelesszárnyű rovarok elleni aktivitásának fokozására.
jellemezve, hogy a kompozíció a Diabrotica nemzetség rovarjai ellen mutat fokozott inszekticid aktivitást.
28.) Inszekticid kompozíció fedelesszárnyú rovarok ellen azzal jellemezve, hogy tartalmaz valamely 13. igénypont szerinti, fedelesszárny úakra toxikus fehérjét és valamely Cryl fehérjét, ahol a Cryl fehérje olyan mennyiségben van jelen, amely hatékony a kompozíció fedelesszárnyú rovarok elleni inszekticid aktivitásának fokozására.
29.) A 28. igénypont szerinti kompozíció azzal jellemezve, hogy a Cryl fehérje CrylA fehérje.
30. ) A 28. igénypont szerinti kompozíció azzal jellemezve, hogy a Cryl fehérje CrylA(c) fehérje.
31. ) A 28. igénypont szerinti kompozíció azzal jellemezve, hogy a fedelesszárnyúakra toxikus fehérje és a Cryl fehérje hozzávetőlegesen azonos mennyiségben van jelen.
ML
1. ábrában bemutatott aminosavszekvenciát kódoló nukleotid bázisszekvenciával bír.
1.) Tisztított és izolált CrylIIC gén azzal jellemezve, hogy az
2. ) Az 1. igénypont szerinti tisztított és izolált CrylIIC gén azzal jellemezve, hogy a gén kódoló területe az 1. ábrában bemutatott nukleotid bázisszekvencia 14. nukleotid bázisától az 1972. nukleotid bázisáig terjed.
3. ) Rekombináns plazmid azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti gént tartalmazza.
4. ) Fedelesszárnyúakra toxikus fehérje azzal jellemezve, hogy az
-4 i oJqV Oj-L cioJL·
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/496,568 US5187091A (en) | 1990-03-20 | 1990-03-20 | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT62036A true HUT62036A (en) | 1993-03-29 |
Family
ID=23973206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202984A HUT62036A (en) | 1990-03-20 | 1991-03-18 | Process for producing bacillus thuringiensis cry iii c gene and protein toxic to coleoptera |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5187091A (hu) |
| EP (2) | EP0606110A1 (hu) |
| JP (1) | JP3078576B2 (hu) |
| KR (1) | KR930700664A (hu) |
| AT (1) | ATE125569T1 (hu) |
| AU (1) | AU645080B2 (hu) |
| CA (1) | CA2078571C (hu) |
| DE (1) | DE69111600T2 (hu) |
| ES (1) | ES2077223T3 (hu) |
| HU (1) | HUT62036A (hu) |
| NZ (1) | NZ237404A (hu) |
| PL (1) | PL165919B1 (hu) |
| RU (1) | RU2106409C1 (hu) |
| WO (1) | WO1991014778A2 (hu) |
Families Citing this family (96)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5187091A (en) * | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
| US5632987A (en) * | 1992-12-31 | 1997-05-27 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis toxins active against corn rootworm larvae |
| AU649785B2 (en) * | 1991-01-31 | 1994-06-02 | Monsanto Technology Llc | Bacillus thuringiensis cryIIIC(b) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
| US5264364A (en) * | 1991-01-31 | 1993-11-23 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryIIIc(B) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
| TW261517B (hu) * | 1991-11-29 | 1995-11-01 | Mitsubishi Shozi Kk | |
| AU5987794A (en) * | 1992-12-31 | 1994-08-15 | Mycogen Corporation | Novel (bacillus thuringiensis) toxins active against corn rootworm larvae |
| AU7102494A (en) * | 1993-06-10 | 1995-01-03 | Ecogen Inc. | (bacillus thuringiensis) strains capable of producing large amonts of insecticidal crystal proteins |
| US5441884A (en) * | 1993-07-08 | 1995-08-15 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis transposon TN5401 |
| US5843744A (en) * | 1993-07-08 | 1998-12-01 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis Tn5401 proteins |
| US5369027A (en) * | 1993-07-12 | 1994-11-29 | Plant Genetic Systems, N.V. | Bacillus thuringiensis strains toxic to diabrotica species |
| US5527883A (en) * | 1994-05-06 | 1996-06-18 | Mycogen Corporation | Delta-endotoxin expression in pseudomonas fluorescens |
| US5508264A (en) * | 1994-12-06 | 1996-04-16 | Mycogen Corporation | Pesticidal compositions |
| WO1997013402A1 (en) * | 1995-10-13 | 1997-04-17 | Dow Agrosciences Llc | Modified bacillus thuringiensis gene for lepidopteran control in plants |
| US6063756A (en) | 1996-09-24 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor |
| US6093695A (en) * | 1996-09-26 | 2000-07-25 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP |
| US6110668A (en) * | 1996-10-07 | 2000-08-29 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Gene synthesis method |
| CN1255143A (zh) | 1997-05-09 | 2000-05-31 | 阿格拉奎斯特公司 | 控制植物疾病和黄瓜十二星叶甲的芽孢杆菌新型菌株 |
| US6103228A (en) | 1997-05-09 | 2000-08-15 | Agraquest, Inc. | Compositions and methods for controlling plant pests |
| US7087420B1 (en) | 1997-07-17 | 2006-08-08 | Cambia | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| US6391547B1 (en) * | 1997-09-09 | 2002-05-21 | Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| US5906818A (en) * | 1997-08-22 | 1999-05-25 | Agraquest, Inc. | Bacillus mycoides strain for controlling corn rootworm |
| US6027723A (en) * | 1997-08-22 | 2000-02-22 | Agraquest, Inc. | Rhodococcus globerulus strain for controlling corn rootworm |
| US6015553A (en) * | 1997-08-22 | 2000-01-18 | Agraquest, Inc. | Bacillus subtilis strain for controlling insect and nematode pests |
| US6001637A (en) * | 1997-08-22 | 1999-12-14 | Agraquest, Inc. | Bacillus pumilus strain for controlling corn rootworm, nematode and armyworm infestations |
| AU2001399A (en) * | 1997-12-18 | 1999-07-05 | Ecogen Inc. | Insect-resistant transgenic plants and methods for improving delta-endotoxin activity against target insects |
| US6077824A (en) * | 1997-12-18 | 2000-06-20 | Ecogen, Inc. | Methods for improving the activity of δ-endotoxins against insect pests |
| US6023013A (en) * | 1997-12-18 | 2000-02-08 | Monsanto Company | Insect-resistant transgenic plants |
| US6063597A (en) * | 1997-12-18 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects |
| US6060594A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-09 | Ecogen, Inc. | Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins |
| CZ302074B6 (cs) * | 1998-08-19 | 2010-09-29 | Monsanto Technology Llc | Rostlinné expresní vektory, transformované rostlinné bunky a zpusob pro zlepšení genové exprese v rostlinách |
| TR200201742T2 (tr) | 1999-03-30 | 2002-11-21 | Agraquest, Inc. | Bitki hastalıklarının kontrol edilmesi için bacıllus pumılus soyu |
| US6245551B1 (en) | 1999-03-30 | 2001-06-12 | Agraquest, Inc. | Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi |
| US6501009B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
| AU2001238152A1 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-20 | University Of Connecticut | Insecticidal compounds and methods for selection thereof |
| US7279547B2 (en) * | 2000-02-10 | 2007-10-09 | University Of Connecticut | Insecticidal compounds and methods for selection thereof |
| WO2001087940A2 (en) * | 2000-05-15 | 2001-11-22 | Monsanto Technology Llc | Polypeptide composionns toxic to anthonomus insects, and use thereof |
| EP1307098A4 (en) * | 2000-08-11 | 2004-06-16 | Univ California | PROCEDURE TO BLOCK RESISTANCE TO Bt TOXINS IN INSECTS AND NEMATODES |
| US6593273B2 (en) | 2000-10-06 | 2003-07-15 | Monsanto Technology Llc | Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with pesticide |
| US6586365B2 (en) | 2000-10-06 | 2003-07-01 | Monsanto Technology, Llc | Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with clothianidin pesticide |
| US8080496B2 (en) | 2000-10-06 | 2011-12-20 | Syngenta Crop Protection, Inc. | Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with thiamethoxam pesticide |
| DE60336549D1 (de) * | 2002-05-10 | 2011-05-12 | Council Scient Ind Res | Hepatoprotektor aktivität von 2'-p-hydroxybenzoylmussaenosidsäure |
| AU2003254099A1 (en) * | 2002-07-29 | 2004-02-16 | Monsanto Technology, Llc | Corn event pv-zmir13 (mon863) plants and compositions and methods for detection thereof |
| US8309516B2 (en) * | 2007-03-28 | 2012-11-13 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
| SI2334177T1 (sl) | 2008-10-01 | 2016-08-31 | Vestaron Corporation | Peptidna toksinska formulacija |
| EP2440663A1 (en) | 2009-06-09 | 2012-04-18 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Early endosperm promoter and methods of use |
| WO2011041256A2 (en) * | 2009-10-02 | 2011-04-07 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
| CN102597244B (zh) | 2009-10-26 | 2014-07-23 | 先锋国际良种公司 | 胚珠体细胞特异性启动子及应用方法 |
| WO2013096818A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11268 |
| US9204603B2 (en) | 2011-12-21 | 2015-12-08 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety S05-11482 |
| US20130180008A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi Bred International Inc | Ovule Specific Promoter and Methods of Use |
| WO2013103365A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pollen preferred promoters and methods of use |
| US11692016B2 (en) | 2012-03-09 | 2023-07-04 | Vestaron Corporation | High gene expression yeast strain |
| EP2822963A2 (en) | 2012-03-09 | 2015-01-14 | Vestaron Corporation | Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides |
| WO2014059155A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Guard cell promoters and uses thereof |
| US9713332B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-07-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Glyphosate application for weed control in Brassica |
| MX369750B (es) | 2013-03-14 | 2019-11-20 | Pioneer Hi Bred Int | Composiciones y metodos para controlar plagas de insectos. |
| EP2971000A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-23 | Pioneer Hi Bred Int | PHI-4 POLYPEPTIDES AND METHOD FOR THEIR USE |
| US10006045B2 (en) | 2013-08-16 | 2018-06-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA3175967A1 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA2939156A1 (en) | 2014-02-07 | 2015-08-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2015120270A1 (en) | 2014-02-07 | 2015-08-13 | Pioneer Hi Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA2955828A1 (en) | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ubiquitin promoters and introns and methods of use |
| WO2016044092A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Pioneer Hi Bred International Inc | Compositions and methods to control insect pests |
| CN113372421A (zh) | 2014-10-16 | 2021-09-10 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| RU2745322C2 (ru) | 2014-12-12 | 2021-03-23 | Зингента Партисипейшнс Аг | Композиции и способы контроля вредителей растений |
| US20170359965A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-12-21 | E I Du Pont De Nemours And Company | Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability |
| CN116333064A (zh) | 2015-05-19 | 2023-06-27 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| US10647995B2 (en) | 2015-06-16 | 2020-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| US11198709B2 (en) | 2015-08-06 | 2021-12-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| CA2992488A1 (en) | 2015-08-28 | 2017-03-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ochrobactrum-mediated transformation of plants |
| EP4257694A3 (en) | 2015-12-22 | 2023-12-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
| CA3021391A1 (en) | 2016-04-19 | 2017-10-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
| MX2018013249A (es) | 2016-05-04 | 2019-02-13 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos para sus usos. |
| US20190185867A1 (en) | 2016-06-16 | 2019-06-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| CN116334123A (zh) | 2016-06-24 | 2023-06-27 | 先锋国际良种公司 | 植物调节元件及其使用方法 |
| US11155829B2 (en) | 2016-07-01 | 2021-10-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| WO2018013333A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| MX2019004648A (es) | 2016-10-21 | 2019-05-23 | Vestaron Corp | Peptidos escindibles y proteinas insecticidas y nematicidas que los comprenden. |
| US11021716B2 (en) | 2016-11-01 | 2021-06-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA3044404A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2018118811A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2018140214A1 (en) | 2017-01-24 | 2018-08-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nematicidal protein from pseudomonas |
| US20190390219A1 (en) | 2017-02-08 | 2019-12-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| CN110621780B (zh) | 2017-05-11 | 2024-03-19 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| BR112020006045A2 (pt) | 2017-09-25 | 2020-10-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta, semente da planta, método para produzir uma planta transgênica, planta transgênica, semente da planta transgênica, método para aprimorar a eficiência de maturação de embrião somático e método para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica |
| US20200165626A1 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize |
| WO2019169150A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant health assay |
| BR112020023800A2 (pt) | 2018-05-22 | 2021-02-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | elementos reguladores de planta e métodos de uso dos mesmos |
| WO2020005933A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for selecting transformed plants |
| AU2019332792A1 (en) | 2018-08-29 | 2021-01-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| AU2019369415A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-03-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for Ochrobactrum-mediated plant transformation |
| TW202142114A (zh) | 2020-02-04 | 2021-11-16 | 美商陶氏農業科學公司 | 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關之方法 |
| US20230235352A1 (en) | 2020-07-14 | 2023-07-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA3189603A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-01-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| TW202345696A (zh) | 2022-05-18 | 2023-12-01 | 美商科迪華農業科技有限責任公司 | 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關的方法 |
| WO2024020360A1 (en) | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Pairwise Plants Services, Inc. | Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc' |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3346138A1 (de) * | 1983-12-21 | 1985-07-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bacillus thuringiensis var. tenebrionis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhaeltliches praeparat bzw. toxin sowie deren verwendung zur bekaempfung von coleoptera |
| US4695455A (en) * | 1985-01-22 | 1987-09-22 | Mycogen Corporation | Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes |
| US4771131A (en) * | 1985-08-16 | 1988-09-13 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles of the order Coleoptera |
| GB8526774D0 (en) * | 1985-10-30 | 1985-12-04 | Sandoz Ltd | Bacillus thuringiensis hybrids |
| DE3713946A1 (de) * | 1987-04-25 | 1988-11-10 | Basf Ag | Verfahren zur gewinnung von insektenpathogenen proteinen und mikroorganismen des typs bacillus thuringiensis |
| TR27832A (tr) * | 1987-04-29 | 1995-08-31 | Monsanto Co | Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler. |
| US5024837A (en) * | 1987-05-06 | 1991-06-18 | Donovan William P | Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use |
| US5080897A (en) * | 1987-05-08 | 1992-01-14 | Ecogen Inc. | Novel bacillus thuringiensis strains, and related insecticidal compositions |
| US4910016A (en) * | 1987-08-03 | 1990-03-20 | Mycogen Corporation | Novel Bacillus thuringiensis isolate |
| NZ226442A (en) * | 1987-10-13 | 1991-08-27 | Lubrizol Genetics Inc | Anti-coleopteran toxin and gene |
| GB8800652D0 (en) * | 1988-01-13 | 1988-02-10 | Ici Plc | Bacterial strain |
| US4999192A (en) * | 1988-02-12 | 1991-03-12 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate |
| US4966765A (en) * | 1988-02-23 | 1990-10-30 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolate |
| US4996155A (en) * | 1988-03-04 | 1991-02-26 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin |
| US5055293A (en) * | 1988-03-09 | 1991-10-08 | Purdue Research Foundation | Biological pesticide |
| EP0382990A1 (en) * | 1989-02-15 | 1990-08-22 | Plant Genetic Systems, N.V. | Strains of bacillus thuringiensis |
| GB8910624D0 (en) * | 1989-05-09 | 1989-06-21 | Ici Plc | Bacterial strains |
| SK562990A3 (en) * | 1989-11-17 | 2001-02-12 | Novo Nordisk As | Mutant of bacillus thuringiensis deposited as subsp. tenebrionis dsm 5480, method for the preparation thereof and pesticide containing the same |
| US5187091A (en) * | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
| WO1991016433A1 (en) * | 1990-04-26 | 1991-10-31 | Plant Genetic Systems N.V. | New bacillus thuringiensis strains and their genes encoding insecticidal toxins |
| AU649785B2 (en) * | 1991-01-31 | 1994-06-02 | Monsanto Technology Llc | Bacillus thuringiensis cryIIIC(b) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
-
1990
- 1990-03-20 US US07/496,568 patent/US5187091A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-03-12 NZ NZ237404A patent/NZ237404A/en unknown
- 1991-03-18 RU SU5053184A patent/RU2106409C1/ru active
- 1991-03-18 WO PCT/US1991/001786 patent/WO1991014778A2/en active IP Right Grant
- 1991-03-18 JP JP03506608A patent/JP3078576B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-18 DE DE69111600T patent/DE69111600T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-18 KR KR1019920702265A patent/KR930700664A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-03-18 AT AT91907293T patent/ATE125569T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-03-18 EP EP94102819A patent/EP0606110A1/en not_active Withdrawn
- 1991-03-18 AU AU75552/91A patent/AU645080B2/en not_active Expired
- 1991-03-18 HU HU9202984A patent/HUT62036A/hu unknown
- 1991-03-18 CA CA002078571A patent/CA2078571C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-18 EP EP91907293A patent/EP0522036B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-18 ES ES91907293T patent/ES2077223T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-20 PL PL91289512A patent/PL165919B1/pl unknown
-
1992
- 1992-09-24 US US07/950,352 patent/US5382429A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0522036A1 (en) | 1993-01-13 |
| US5382429A (en) | 1995-01-17 |
| JP3078576B2 (ja) | 2000-08-21 |
| CA2078571C (en) | 2004-06-01 |
| PL165919B1 (pl) | 1995-03-31 |
| ES2077223T3 (es) | 1995-11-16 |
| CA2078571A1 (en) | 1991-09-21 |
| PL289512A1 (en) | 1991-12-16 |
| NZ237404A (en) | 1992-06-25 |
| US5187091A (en) | 1993-02-16 |
| ATE125569T1 (de) | 1995-08-15 |
| DE69111600D1 (en) | 1995-08-31 |
| EP0522036B1 (en) | 1995-07-26 |
| JPH05505109A (ja) | 1993-08-05 |
| AU7555291A (en) | 1991-10-21 |
| KR930700664A (ko) | 1993-03-15 |
| RU2106409C1 (ru) | 1998-03-10 |
| DE69111600T2 (de) | 1996-02-29 |
| WO1991014778A2 (en) | 1991-10-03 |
| WO1991014778A3 (en) | 1991-12-12 |
| AU645080B2 (en) | 1994-01-06 |
| EP0606110A1 (en) | 1994-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT62036A (en) | Process for producing bacillus thuringiensis cry iii c gene and protein toxic to coleoptera | |
| Aronson et al. | Bacillus thuringiensis and related insect pathogens | |
| US5322687A (en) | Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects | |
| EP0602064B1 (en) | Novel microorganism and insecticide | |
| US5378625A (en) | Bacillus thuringiensis cryIIIC, (b) protein toxic to coleopteran insects | |
| JPH02501439A (ja) | 甲虫類活性微生物、関連する殺虫剤組成物およびそれらの産生および使用の方法 | |
| AU608855B2 (en) | Novel bacillus thuringiensis strains, method for their isolation and related insecticidal compositions | |
| US5073632A (en) | CryIIB crystal protein gene from Bacillus thuringiensis | |
| JP2531913B2 (ja) | バシルス チュリンギエンシス（Ｂａｓｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） ｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）毒素遺伝子及び甲虫類昆虫に毒性のタンパク質 | |
| JP4608059B2 (ja) | 殺虫活性を有する蛋白質、その蛋白質をコードするｄｎａ、有害生物防除剤及び防除方法。 | |
| US5356623A (en) | Bacillus thuringiensis cryET1 toxin gene and protein toxic to lepidopteran insects | |
| AU1372792A (en) | Novel (bacillus thuringiensis) isolates | |
| EP0585396A1 (en) | NOVEL $i(BACILLUS THURINGIENSIS) ISOLATES ACTIVE AGAINST HYMENOPTERAN PESTS AND GENES ENCODING HYMENOPTERAN-ACTIVE TOXINS | |
| CA2325831C (en) | Bacillus thuringiensis cryiiic gene and protein toxic to coleopteran insects | |
| WO1992020802A2 (en) | Novel bacillus thuringiensis isolates active against hymenopteran pests and genes encoding hymenopteran-active toxins | |
| Al‐Momani et al. | Molecular characterization of local Bacillus thuringiensis strains recovered from Northern Jordan | |
| WO1993003619A1 (en) | Multi-targeted bacillus thuringiensis bioinsecticide | |
| AU668687C (en) | Novel (bacillus thuringiensis) isolates active against hymenopteran pests and genes encoding hymenopteran-active toxins | |
| WO1994028724A1 (en) | Bacillus thuringiensis strains capable of producing large amonts of insecticidal crystal proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |