JPH02501439A - 甲虫類活性微生物、関連する殺虫剤組成物およびそれらの産生および使用の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

甲虫類活性微生物、関連す５殺虫剤組成物およびそれらの産生および使本発明は 、少なくとも甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）目の昆虫に対して殺虫活性を有す る、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ ｉｓ）菌株の生物学的に純粋な培養物に関する０本発明は、また、甲虫類昆虫に 対する生物学的殺虫剤として有用な、結晶質タンパク質毒素に関する。毒素はこ のバチルス・スリンギエヱ＞２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ ｓ）の菌株により天然に産生される０本発明は、また、ここでｃｒｙＣと呼ぶ遺 伝子の種々の微生物において発現およびｃｒｙＣ遺伝子で形質転換された微生物 に関し、前記遺伝子は甲虫類活性の毒素の遺伝情報を指定しかつ種々の微生物お よび毒素それ自体組み込んだ関連する新規な殺虫剤組成物の遺伝情報を指定する 。 ２．０　及盟立！皇 ２、　１　商業的農薬ニ一般的考察 毎年、世界の商業的重要な農作物の有意な部分は昆虫および他の有害生物（ｐｅ ｓｔ）の蔓延により損失されている。これらの有害生物により生ずる損害は、商 業的に重要な植物のすべての領域、例えば、食物、繊維材料および種々の家庭の 植物、−及び、そして経済的損害は数１００万ドルになる。こうして、このよう な蔓延から作物の保護はきわめて重要である。 広いスペクトルの農薬（ｐｅｓｔｉｃｉａｅｓ）は作物の保護に最も普通に使用 されるいるが、これらの薬剤の熱分Ｎｉ１の使用は植物の自然の防御因子の破壊 に導くことがある。さらに、それらの活性の広いスペクトルのＩ；めに、化学的 農薬は非標的有機体、例えば、有益な昆虫および破壊的有害生物の寄生体を破壊 することがある。これらは、また、動物およびヒトに対してしばしば有害であり 、こうして、適用するとき、環境的危険を与える。 さらに、昆虫および他の有機体は、これらの農薬に反復して暴露するとき、これ らの農薬に対してしばしば抵抗性を発現する。農薬の実用性を減少することに加 えて、小さい有害生物の抵抗性系統は有益な寄生有機体の減少のために主要な蔓 延の問題となりうる。 これは広いスペクトルの農薬を使用するとき直面する主要な問題である。必要と するものは、活性のより狭いスペクトルと、延長しＩ；期間にわたってその活性 を維持する能力を兼備する生物分解性農薬、すなわち、それに対する抵抗がまっ たくないにしても、非常により遅い農薬である。 ２．２　生物学的農薬 生物農薬（ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ）は、またパイオラシＢナル（ｂｉｏｒ ａｔｉｏｎａｌｓ）と呼ばれ、天然に産出する病原体を使用して、昆虫、菌・か び、および農作物の雑草の蔓延を抑制する。このような物質は、バクテリアの成 長培地の存在または不存在下に、蔓延す因子に対して毒性の物質（例えば、毒素 ）を産生ずるバクテリウムからなることができる。このようなバクテリアは、標 準の適用方法により植物に直接適用することができ、化学的農薬に比較して、典 型的には非有機体に、および全体として環境にそれほど有害でない。 有害生物の抑制の生物学的方法の使用は、菌・かびの病気がカイコにおいて発見 されたとき、最初に１８９５年に示唆された。しかしながら、生物学的有害生物 の抑制が最初に達成されたのは、乳化病のバチルス・ポピリアエ（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）の胞子を使用してマメコガネを抑制した１９４０年 であった。バチルス・スリンギエン＆Ｘ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）（以後、互換的にｒ１３．ｔ、ＪまたはｒＢｔＪと呼ぶ）という名 前のバクテリウム、すなわち、幼虫および他の昆虫に対して致死的な毒素を産生 ずるバクテリア、は現在量も広く使用されている生物農薬である。１９６０年代 の終わりにおいて、ＨＤ−１，であるＢ、ｔ、の高度に毒性の菌株は生物農薬の 商業的使用の段階を設定した。 ｎｇｉｅｎｓｉｓ）およびデルタ−エンドトキシン微生物である。その胞子形成 期の間、Ｂ、ｔ、はグロトキシン（ｐｒ。 ｔｏｘｉｎｓ）またはデルタ−エンドトキシン（ｄｅ　Ｉ　ｔ　ａ−ｅｎｄ。 ｔｏｘｉｎｓ）を形成する。これらの毒素はＢ、ｔ、ｉｎｎバラ子ｎ。 結晶質封入体としてまたは胞子殻の一部分として蓄積する。種々の感受性昆虫、 例えば、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）およびジブテラ（Ｄｉｐｔｅｒａ） の目における昆虫に対するＢ、ｔ、の病原性は、本質的にこのパラ胞子の結晶の ためであり、この結晶は胞子形成の時にＢ。

【、細胞の乾燥重量の２０％を越えることがある。 パラ胞子の結晶は摂取後にのみ活性である。例えば、鱗翅類の昆虫により摂取後 、アルカリ性ｐＨおよび中腸内のタンパク質分解酵素は結晶を活性化して毒性成 分を放出させる。これらの毒性成分は中腸の細胞を毒して、昆虫の食物摂取を停 止させ、究極的に死亡させる。事実、Ｂ。 ｔ、は、鱗翅類の有害生物を処理するとき、有効かつ環境的安全な殺虫剤である ことが明らかとなった。 異なる菌株のＢ、ｔ、は血清学的に異なるパラ胞子の結晶を生成することが報告 された。しかしながら、Ｂ、ｔ、菌株の多くにより生成される主要な結晶の形態 の１つは、Ｐ−１として知られている形態である。 Ｐ−１は、約１３０．０００ダルトンの分子量を有し、そして、また、胞子膜中 に存在することができる。パラ胞子結晶Ｐ−１の遺伝子および他のタンパク質結 晶のほとんどの成長培地は、Ｂ、ｔ、中に変化する大きさの異なるプラスミドの 多数のうちの１つ上に存在することが発見された。 甲虫類ｒｘＢ、ｔ、の最初のｆ離は、１９８３年に報告された［Ａ。 Ｋｒｉｅｇ　ａｔ　ａｌ、（１９８３）Ｚ、ｓ４ａｎｇ、Ｅｎｔ、９５．５００ −５０８　（１９８３）；　Ｉｂ１ｄ、（１９８４）Ａｎｚ、５ｃｈａｅｄ　ｌ 　ｉｎｇｓｋｄｅ、ｐｆ　Ｉａｎｚｅｎｓｃｈｕｔｚ、Ｕｍｗｅ　］ｔｓｃｈｕ ｔｚ　５７．１４５−１５ＯＬこの菌株は６８および５０ｋＤａ［Ｋ、Ｂｅｒｎ ｈａｒｄ　ＦＥＮＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、３３．２６１−２６５　 （１９８６）］。この菌株はバチルス・ヱリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｖａ　ｒ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎ ｉｓ）と表示された。鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）８よび糸角類（Ｎｅｍ ａｔｏｃｅｒａ）の幼虫は、この菌株の胞子および結晶に対して感受性ないこと が報告された。マイコゲン・コーポレーシヨン（Ｍｙｃｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、） （カルフォルニア州すンジエゴ）により報告された同様な菌株は、６４ｋＤａの タンパク質［Ｃ，Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　４．３０５−３０８　（１９８６）］。 ２．５　デルタ−エンドトキシン遺伝子のクローニングＢ、ｔ、毒素遺伝子は典 型的にはプラスミド上に存在し、そしてそれらの産生物は有効な殺虫剤であるこ とが証明され、産生物は、結晶の形態でであるとき、あるいは胞子の形成と関連 するとき、容易に分離され、それらは多くの科学的研究の、とくに遺伝子の分離 およびクローニングの手ｇ４を二関する、主題であった。 Ｐ−１の遺伝情報を指定する遺伝子はＢ、ｔ、亜種クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋ ｉ）菌株ＨＤ−１−Ｄｉｐｅ＋から分離され、そしてＥ、ｃｏｌｉ中でクローニ ングおよび発現された［５ｃｈｎｅｐｆ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４，４６７ ．０３６号］、タンパク質存在、ｐ−１’：は鱗翅類昆虫［スズメガ科のガ（ｔ ｏｂａｃｃｏ　ｈｏｒｎｗｏｒｍ）の幼虫］に対して毒性であることが決定され Ｉ；。プロモーター領域のヌクレオチド配列およびＰ−１のための結晶質タンパ ク質の解読領域の一部分は、また、決定された［Ｈ，Ｐ、Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ 、、ジャーナル−オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、）、Ｖｏｌ、２５８、Ｎｏ、３、ｐｐ−１９６０−１９６７（１９８３）］ 。 この遺伝子の全体のヌクレオチド配列は、また、決定され、そしてそれ自体のデ ルタ−エンドトキシンタンパク質は形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ菌株中で発現さ れた［Ｍ、Ｊ、Ａｄａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、Ｖｏｌ、３６ 、Ｉ）Ｐ、２９８−３００　（１９８５）およびＰＣＴ出！ＩＰＣＴ／ＵＳ５８ １０１６６５、Ｂ、ｔ、結晶タンパク質遺伝子毒素セグメント（Ｂ、ｔ、Ｃｒｙ ｓｔａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｏｘｉｎ　Ｓｅｇｍｅｎｔ）　、（１ ９８５）　コ　。 他のデルタ−エンドトキシンの形態の遺伝子は、また、Ｅ、ｃｏｌｉ中でクロー ニングおよび発現されＩ；。Ｂ、ｔ、ｖａｒ、イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌ ｅｎｓｉｓ）は、Ｅ、ｃｏｌ＋ベクター中に挿入された。２６．０００ダルトン のポリペプチドは、このベクターで形質転換したｌｌ：、ｃｏｌｉにより合成さ れた。このポリペプチドはジプレラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）（力）目に対して致死的 であることが示された。［Ｅ。 Ｓ、Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｖｏｌ、１７５．２、ｐｐ。 ３７７−３８２．１９８４］。この結晶タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子 のヌクレオチド配列は、また、生ずるタンパク質配列とともに決定された［Ｃ， Ｗａａｌｗｉｊｋ　ｅｔ　ａｌ、、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、Ｖｏｗ、１３、Ｎｏ。 ２２、ｐｐ−８２０７８２１７（１９８５）］。１３０ｋＤａの結晶タンパク質 をエンコードする他のＢ、ｔ、Ｖａｒ、イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓ ｉｓ）遺伝子は、クローニングされそしてバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）を形質転換するために使用された。バチルス・メガテリ ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ前記封入体はヤブカ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ）の 幼虫に対してであることが決定された［Ｖ、５ｅｋａｒ　ｅｔ　ａｌｏ、遺伝子 （Ｇｅｎｅ）　、Ｖｏ　１．３３、ｐｐ、１５１−１５８　（１９８５）］。 他のデルタ−エンドトキシンタンパク質の結晶は、Ｂ、ｔ、亜種ソッ）（ｓｏｔ ｔｏ）から誘導された。この結晶質タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子は、 ベクター中でクローニングされ、次いで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ中で発現さ れた。この遺伝子は１４４．０００ダルトンのペプチド（９３４アミノ酸残基） の遺伝情報を指定する。この遺伝子のヌクレオチド配列および対応するタンパク 質のアミノ酸配列（ＤＮＡ配列から推定された）は報告された。ＬＹ、５ｈｉｂ ａｎｏ　ｅｔａｌ、、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、Ｖｏｌ、ｐｐ、２４３−２５１　（ １９８５）〕。 また、他の主要なデルタ−エンドトキシンタンパク質はＢ、ｔ、いくつかの亜種 により産生されることが認識された。［Ｔ、Ｙａｍａｍｏ　ｔＯ、バイオケミカ ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）、Ｖｏｌ、１０３、Ｎ００２、ｐｐ 、４１４−４２１　（１９８１）；Ｔ。 Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、アーチーブスーオプ・バイオケミストリー・ アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　ａｎｃｌ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、Ｖｏｌ、２２７、Ｎｏ、ｌ、ｐｐ、 ２３３−２４１　（１９８３）］。この］デルターエンドトキシはＰ−２として 同定され、そしてＢ、ｔ、Ｖａｒ、クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）（ＨＤ−１ ）から分離された。このデルタ−エンドトキシンはほぼ６５．０００の分子量を 有し、モして鱗翅類および甲虫類の昆虫に対して毒性であることが知られている 。対照的に、ｐ−１は鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目のみに対して活性で ある。 今日まで、希な甲虫類活性有機体は分離されてきているが、雪素タンパク質およ びそれの遺伝情報を指定する遺伝子は精製および配列決定されてきていない。こ の事実は、Ｂ、ｔ、以外の有機体において、この独特に活性なデルタ−エンドト キシンタンパク質を発するのための手段の提供を不可能にする。甲虫類活性タン パク質毒素の遺伝情報を指定するクローニングした遺伝子の入手可能性は、他の デルタ−エンドトキシンを含有しない異種有機体中のこのタンパク質の増大した 産生を可能とするであろう。 ３．０　発明の要約 本発明は、甲虫類目の昆虫に対して殺虫活性を有する、バチルス・スリンギエン シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株の生物学的に純粋 な培養物に関する。本発明は、また、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のある菌株により産生された、甲虫類活 性なデルタ−エンドトキシン、このタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子のた めのＤＮＡ配列およびこのタンパク質組み込んだ新規な殺虫剤および／まｔ；は それを産生ずる有機体に関する。さらに詳しくは、本発明は、甲虫類活性デルタ −エンドトキシンの遺伝情報を指定するｃｒｙＣ遺伝子で微生物をクローニング および形質転換することに関する。さらに、本発明は、甲虫類毒素の遺伝情報を 指定する遺伝子で非胞子形成微生物を形質転換することを可能とするとき有用で あり、こうしてそれは微生物の成長の事実上すべての段階の間に産生され、これ により、胞子形成段階の間のみの産生に限定されない。 したがって、本発明の目的は、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）目の昆虫に対し て殺虫活性を有する、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃ。 １１１ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株の生物学的に純粋な培養物を提 供することである。本発明の追加の目的は、ここでｃｒｙｃと呼ぶ分離された遺 伝子により産生された、均質な甲虫類活性タンパク質を提供することである。こ のタンパク質は、クローニングしたｃｒｙＣ遺伝子で、胞子形成または非胞子形 成の微生物、例えば、バチルス・Ｚガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔ ｅｒｊｕｍ）または大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）またはＢ、ｔ、の異なる菌株を形質 転換する方法により産生ずることができる。この方法は、適当な宿主およびベク ターの選択により、デルターエンドトキシンの高い収率可能とし、こうしてその 実質的に均質な調製物、すなわち、他のデルターエンドトキシンの変異型を含ま ない、調製物を誘導することが可能である。甲虫類活性タンパク質および／まＩ ；は形質転換した宿主は、種々の殺虫剤組成物において利用することができる。 本発明の他の目的は、ｃｒｙＣ遺伝子で形質転換されＩ；、自然Ｂ、ｔ。 宿主以外の、有機体を提供することである。この外来の形質転換された宿主は、 より所望のおよび／または選択的培養条件下に、甲虫類活性なデルタ−エンドト キシンの産生を可能とする。 本発明の追加の目的は、自然に存在しない二重の活性、すなわち、鱗菌株を提供 することである。 本発明の他の追加の目的は、種々のバチルス・スリンギエンシス（旦子の存在を 検出するために有用なりＮＡプローブを提供することである。 このＤＮＡプローブは、まｔ；、甲虫類活性タンパク質と共通の相同性を共有す るタンパク質の遺伝情報を指定する関連する遺伝子の可能な存在について、Ｂ、 ｔ、の種々の菌株のスクリーニングおよびこれらの関連とするｃｒｙｃ遺伝子で 形質転換した有機体で、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）目の昆虫を抑制する方 法を提供することである。 また、本発明の目的は、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および甲虫類（Ｃｏ ｌｅｏｐｔｅｒａ）の両者の目の昆虫に対して活性であり、野生において未知で ある、トランスコンシュガント（ｔｒａｎｓｃｏｎおよび甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐ ｔｅｒａ）の両者の目における昆虫を抑制する方法を提供することである。 ４、【図面の簡単な説明】 第１図は、菌株ＥＧ２１５８により産生された結晶の型および微生物内のそれら の外観を示す。 第２図は、ＨＤ−１およびＥＣ２１５８のそれぞれのプラスミドの列を示すゲル 電気泳動の写真である。 第３図は、甲虫類および鱗翅類活性毒素のプラスミドを収容するトランスコンシ ュガントのそれぞれのプラスミドの列を示すゲル電気泳動の写真である。 第４図は、ＥＣ２１５８からの結晶質タンパク質とＦ−１結晶を産生ずる他の菌 株との比較を示すゲル電気泳動の写真である。 第５図は、５（Ａ）、５　（Ａ″）および５　（Ｂ”）から構成されている。５ （Ａ）はＲ−１およびＦ−１の結晶タンパク質のゲル電気泳動の写真である。５ 　（Ａ’　）および５（Ｂ″）は、また、ＥＣ２１５８およびＥＣ２１５８の誘 導体における７７および７１　ｋＤａのタンパク質の異なる産生を示す、ゲル電 気泳動の写真である。 第９図は、６　（Ａ）および６（Ｂ）から構成されており、それらの両者はゲル 電気泳動の写真であり、ＥＣ２１５８からの８８Ｍｄのプラスミドを有するトラ ンスコンシュガント菌株中の７１ｋＤａタンパク質の産生を示すゲル電気泳動の 写真である。 第７図は、クローニングしたｃｒｙＣ遺伝子を含有する、組み換えプラスミドｐ ＥＧ２１２およびｐＥＧ２１３の制限地図である。ｃｒｙＣ遺伝子の転写の位置 および方向は大きい矢印により示されている。 第８図は、ｃｒｙＣ遺伝子のＤＮＡ配列（構造の毒素タンパク質の遺伝情報を指 定するヌクレオチド５６９〜２５００および「停止」シグナルの遺伝情報を指定 するヌクレオチド２５０１〜２５０３を包含する）およびまたｃｒｙｃ遺伝子に よりエンコードされる甲虫類毒素のアミノ酸配列（ヌクレオチド５６９〜２５０ ０）を示す。 第９図は、９ａおよび９ｂから構成されている。９ａは臭化エチジウであり、あ る種の菌株はいくつかの自然プラスミドを含有することが示される。９ｂは放射 線標識しクローニングしｆ：、ｃｒｙｃ遺伝子を９ａに示すプラスミドとハイブ リダイゼーシヨンさせることによって作られた、オートラジオダラムの写真であ る。９ｂが示すように、クローニングしたｃｒｙＣ遺伝子は甲虫類毒素の菌株Ｅ Ｇ２１５８中の８８ＭＤａのプラスミドにもっばらハイブリダイゼーションした が、甲虫類に対して毒性でない菌株である、菌株ＨＤＩ中のプラスミドのいずれ にもハイブリダイゼーションしなかった。 第１０図は、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルの写真であり、クローニングした ｃｒｙＣ遺伝子を収容するバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｅｕｓ　ｍｅｇ ａｔｅｒｉｕｍ）の組み換え宿主菌株（ＥＧ１３１４）が、真性の甲虫類（ｃｒ ｙ）毒素のそれに類似する大きさを有するタンパク質を大量に合成することを示 す。 ５、ＣＩ　発明の説明 一般に、本発明は、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の目の昆虫に対する殺虫活 性を有する、新しく分離しＩ；バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を提供する。 この菌株の生物学的に純粋な培養物は、ＮＲＲＬに受託された。後述のバイオア ッセイはこの菌株の甲虫類活性を確証した。したがって、このＢ、ｔ、の菌株は 、甲虫類の昆虫に対して有用な殺虫剤組成における活性成分の少なくとも１つと して使用するために好ましい。 本発明は、さらに、鱗翅類および甲虫類の両者の昆虫に対する殺虫活性ｎａｖｘ ）ランスコンシュガント誘導バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を提供する。 Ｂ、ｔ、におけるこの二重の活性は野生において未知である。したがって、この 二重の活性を有するＢｔ菌株は、甲虫類および鱗翅類の両者の昆虫に対して有用 な殺虫剤組成における活性成分の少なくとも１つとして使用するために好ましい 。 さらに、本発明は、一般に、工程： （ａ）甲虫類活性毒素のタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子により与えられ た甲虫類の昆虫に対する殺虫活性を有するバチルス・７．’Ｊ＞ギエンシス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を準備し、前記遺伝子はプ ラスミド上に位置し、前記バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は、鱗翅類の昆虫に対する殺虫活性を有する他 のバチルス・スリンギエンシＸ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ ｓ）菌株と接合に好適な条件下に混合されており、そして （ｂ）工程（ａ）の培養混合物から、鱗翅類および甲虫類の両者の昆虫に対する 活性を有するトランスコンシュガント（ｔ　ｒａｎｓｃｏｎ　Ｊｕｇａｎｔ）を 分離する、 からなる、甲虫類および鱗翅類の両者の昆虫に対する殺虫活性を有するこの方法 は、好ましい実施態様において、また、中間の菌株を利用して、甲虫類または鱗 翅類の毒素をコード（ｃ　ｏ　ｄ　ｅ）するプラスミドを他の中間の受容体菌株 に転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）するか、あるいは直接、既に少なくとも１つの他の 毒素をエンコードするプラスミドを含有するであろう、究極的に所望のトランス コンシュガントの宿主に転移する。 前述の一般的方法は、甲虫類昆虫に対する活性を有する工程（ａ）のつの遺伝子 により与えられたＶｔＳ類昆虫に対する活性をさらに有し、これにより工程（ｂ ）の前記トランスコンシュガントは少なくとも３つの毒素遺伝子により与えられ た鱗翅類および甲虫類活性を有する、実施態様を包含する。 前述の一般的方法は、さらに、工程（ａ）の前記バチルス・スリンギエンシス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株が、１より多い毒素遺伝 子により与えられた鱗翅類昆虫に対する活性を有し、これにより工程（ｂ）の前 記トランスコンシュガントは少なくとも３つの毒素遺伝子により与えられた鱗翅 類および甲虫類活性を有する、実施態様を包含する。 例えば、本発明の実施において、甲虫類活性を有するバチルス・旦ンギエンシス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株をまず中間受容体のバ チルス（βａｃｉｌｌｕｓ）菌株と混合し、これにより中間受容体のバチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）！株は甲虫類（Ｃ。 １ｅｏｐｔｅｒａ）に対する殺虫活性を与えるプラスミドを接合により獲得しく 接合により）、次いで前記トランスコンシュガント菌株を鱗翅類活性を有する前 記バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）と接合に好適な条件下に混合し、これにより鱗翅類活性を有する前記バチルス ・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は 前記トランスコンシュガント菌株から甲虫類活性を与えるプラスミドを接合によ り獲得する。 本発明は、また、第８図に示すＤＮＡヌクレオチド配列からなるｚ＜ｆを提供す る。この遺伝子（ヌクレオチドの鎖がお互いの相補的塩基配列を有する、二本鎖 ＤＮＡからなる）は、甲虫類活性毒素のアミノ酸配列を有するタンパク質（また は、また、ここで同等にポリペプチド使用する）の遺伝情報を指定し、前記アミ ノ酸配列は第８図に示されている。 クローニングした遺伝子によりエンコードされる甲虫類活性毒素は、甲虫類昆虫 に対する殺虫活性を有する。 甲虫類活性タンパク質を産生ずる方法は、また、本発明により提供される。この 産生方法において、ｃｒｙＣ遺伝子はクローニングベクターまたはプラスミド中 に挿入され、次いでプラスミドを利用して選択した微生物を形質転換する。 クローニングベクターは、ここに記載するように、一般にこの分野において知ら れており、商業的に入手可能である。特定のプラスミドの選択は当業者の技量の 範凹内であり、そして選択の事項であろう。本発明における使用に適当なプラス ミドは、例えば、Ｂ、ｔ、から誘導したｐＢＲ３２２、およびバチルス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の微生物、 好ましくはノ（チルレス−）ガブリラム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉ ｕｍ）である。本発明とともに使用するために適当な微生物は、胞子形成および 非胞子形成の微生物の両者、例えば、Ｅ、ｃｏｌＬ　Ｂ、Ｌ、、およびバチルス ・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である・利用する 微生物は、また、この分野において知られており、そして一般に入手可能である 。本発明の実施における使用のための特定の微生物の選択は、また、個人の好み の問題である。本発明の好ましい実施態様において、微生物はバチルス・メガテ リウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）からなるであろう。 一般に、甲虫類活性毒素のタンパク質は、形質転換した有機体により産生され、 後に第８図に示すよう１なアミノ酸配列を有する均質な調製物に精製される。さ らに詳しくは、このタンパク質は微生物をｃｒｙＣ遺伝子を含有するプラスミド により形質転換し、形質転換した微生物を成長させ、こうしてｃｒｙＣ遺伝子に よりエンコードされるタンパク質は微生物において発現され、そしてこのタンパ ク質を有機体から標準のタンパク質精製技術で抽出することによって産生ずるこ とができる。また、タンパク質を形質転換した微生物から分離しないが、この有 機体、発現された甲虫類活性タンパク質を包含する、を殺虫剤化合物としである いは殺虫剤組成中で利用することは、本発明の範囲内に入る。 本発明は、また、Ｂ、ｔ、甲虫類活性毒素および適当な担体の混合からなる、甲 虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）に対して使用する新規な殺虫剤を提供する。毒素 は有機体中に含有させるか、あるいは胞子と関連させることができるか、あるい は均質なタンパク質調製物であるか、あるいは胞子と培養した形質転換有機体と の混合物中に存在することができる。毒素は、また、非胞子形成微生物または胞 子形成微生物、例えば、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ ｔｅｒｉｕｍ）またはＢ、ｔ、中に含有させることができる。適当な担体は、当 業者に知られているある数の固体または液体のいずれの１つであることもできる 。 本発明は、また、ｃｒｙＣ遺伝子およびこの遺伝子で形質転換された特定の有機 体を包含する組み換えベクターまたはプラスミドからなる。 さらに、本発明は、また、甲虫順活性デルターエンドトキシンの遺伝情報を指定 する遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。 本発明のこれらの面のすべては、下に詳述し、そして以下の実施例において例示 されている。 ＥＣ２１５８は、カンサス（Ｋａｎｓａｓ）からの大豆粒ダスト（ｄｕｓｔ）か ら分離したＢ、ｔ、菌株（受託されかつ生物学的に純粋な培養物として維持され ている）である。ＥＣ２１５８は胞子形成の間２つのタイプの細胞内封入体（ｉ ｎｃｌｕｓｉｏｎ）を産生ずる（第１図）：多少菱形の結晶（以後Ｒ１と呼ぶ） および平らなダイヤモンド形の結晶（以後Ｆｌと呼ぶ）。下の実施例に記載する バイオアッセイが示すように、ＥＣ２１５８の胞子形成した培養物（胞子、Ｒ１ およびＦｌの結晶の混合物から成る）はコロラドハムシ（以後、ＣＰＢと互換的 に呼ぶ）、レズチノタルサ・デセンリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅ ｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）（Ｓａｙ）の幼虫に対して毒性であるが、いつつかの種 の鱗翅類（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎ工など）の幼虫に対して無毒であった 。 ＥＣ２１５８＋１、はぼ３５．７２．８８．１０５おＪ：び１５ｏメガダルトン （Ｍｄ）の大きさの５プラスミドの独特のプラスミドの列（第２図）を含有する 。 下表１は、どのプラスミドが特定の毒素の遺伝情報を指定するかを記載する。 １５０Ｍｄのグラスミドの損失はＣＰＢに対する毒性に影響を及ぼさないでＦｌ 結晶の産生を排除するが、３５Ｍｄのプラスミドの損失はＲ１またはＦｌの産生 または毒性に影響をもたなかった（表ＩＩ）。 （ＥＣ２１５８の菌株およびその突然変異体、およびすべてのＢ、ｔ。 およびＢ、ｃｅｒｅｕｓ菌株は次のようにしてバイオアッセイのために増殖した ：胞子を５０ｍ＜＋の無菌のフラスコ内の５ｍＲのＭ２７ブロス中に接種した。 Ｍ２７は次の成分から構成されている：３３ミリモルのＨＰＯ，−およびＨ！Ｐ Ｏ，−のアニオンの各々：９８ミリモルのに″：０゜１７％のペプトン；０．１ ％の牛肉エキス；１５０ミリモルのＮａＣｌ　；５．５ミリモルのグルコース： ３３０ｐｍのＭｇ”、　２３０　ｐ　ｍのＣａ＋＋、および１７μｍのＭｎ的（ 塩化物塩として添加した）。（ここで使用するとき、文字「μ」は測定および量 の用語の一部として使用するとき添字「マイクロ」と同義である。）培養物を３ ０°Ｃにおいて１ｉｆｆｉＬながら３日間インキュベーションし、その時胞子形 成および結晶の形成が完結した。５μａの無菌の１−オクタツールを泡消剤とし て添加し、そして培養物を無菌のプラスチック管に移し、密閉し、そして５℃に おいて貯蔵した。） ＢＴで処理したジャガイモの葉のディスク上の第１齢のコロラドハムシの致死率 およびそれによる葉の消費 生存数／１０　葉の消費 員珪　２４時間　４８時間　％ （対照）１０　１０　９０ １ＥＧ２１５８　１０　２　１０ ２　ＥＣ２１５８ （−１５０Ｍｄ；　１０　１　１５ （Ｆｌ）） ＥＣ２１５８を混合培養においてＢ、ｔ、またはＢ、ｃｅｒｅｕｓの他の菌株と ともに増殖させたとき、１０５および８８Ｍｄのプラスミドは、接合により、他 の菌株中に転移された。Ｉ　Ｏ５Ｍｄのプラスミドを獲得したＢ、ｔ、またはＢ 、ｃｅｒｑｕｓは検出可能に変更しなかった（すなわち、ｌ　Ｏ５Ｍｄのプラス ミドは転移可能であるが、そうでなけれが隠されている）。したがって、８８Ｍ ｄのプラスミドは転移可能であり、モしてＲ１結晶をエンコードし、そしてＲ１ 産生体であるトランスコンシュガントの菌株を生ずる。いくつかのＲ１産生性ト ランスコンシュガントのプラスミドの列は、第３図に示されている。 収容するトランスコンジカント ＨＤ７３−２６−４６　８８（ＥＣ２１５８）　ＣＰＢＨＤ７３−２６−５０　 ８８　（ＥＣ２１５８）　ＣＰＢ４４　（ＨＤ−２６３）　ＬＥＰ ＨＤ７３−２６−５４　８８　ｏ：ｃ２１ｓ８）　ＣＰＥＪ６１（ＨＤ−６１７ ）　ＬＥＰ ＨＤ７３−２６−５６　８８　（ＥＣ２１５８）　ＣＰＢ５０　（ＨＤ−７８） 　ＬＥＰ ５４　（ＨＤ−２）　ＬＥＰ ７５　（ＨＤ−２ン　ＬＥＰ ＢＣ５６９−１−１５８８（ＥＣ２１５８）　ＣＰＢ６８　（ＨＤ−５３６）　 ＵＮＫ ＨＤＩ−１０−１８８（Ｅｆ：、２１５８）　ＣＰＢＨＤ２６３−８−５　８８ 　（ＥＣ２１５８）　ＣＰＢ６０（ＨＤ−２６３）　ＬＥＰ ８８Ｍｄのプラスミドを３つのＢ、ｔ、のバックグラウンド（ＨＤ−７３、ＨＤ −１およびＨＤ−２６３）およびＢ、ｃｅｒｅｕ３源の１つ（ＢＣ−５６９）の 受容体中に入れた。８８Ｍｄのプラスミドは、鱗翅類（Ｐ　１）毒素結晶をエン コードする毒素プラスミド、例えば、ＨＤ−２６３からの４４Ｍｄの毒素プラス ミドなど（参照、第３図および表ＩＩＩ）と同時に存在することが示されｔ：。 Ｒ１結晶を産生するトランスコンシュガントは、ＥＣ２１５８Ｃ表ＩＶＳＡおよ びＢ）と同様にｃｐＢに対して毒性であり、そしてまた鱗翅類幼虫に対して毒性 であった（表Ｖ％へおよびＢ）。 Ａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓによるジャガイモの葉上の 第１齢のコロラドハムシ幼虫の死亡率およびそれによる葉の消費 おおよその 蔑膣　素因Ｉ　生存数、／］０　ム臆間　竪叩麗　集の消費（％）（対照）　１ ０　９　８０ ＨＤ７３−２６−４６　菱形＋＝８８中　＜ＥＣ２１５８５０５ＨＤ７３−２６ −４７　菱形中：８８＋、１０５　＜ＥＣ２１５８６３５ＨＤ７３−２６−４８ 　０ｓｐ、菱形＋：ｓａ”　＜ＥＣ２１５８４２５ＨＤ７３−２６−４９　０ｓ ｐ、菱形＋：８８”　１０５　＜ＥＣ２１５８１０５ＨＤ７３−２６−５０　２ 形“１円Ｍ″：８８”　１０５　＜ＥＣ２１５８５０５４４”　（ＨＤ２６３ ＲＡ）に対する鮮翅類活性をもつトランスコンジガットの活性供与体 液体培地　菌　株　プラスミド　シＺ晩　試験の数　巴μ覗ＭＢ９６　ＥＣ２６ ３−８−７３４４＋＜ＥＣ２７９２４５３１４，２ＡＫ３　ＥＣ２６３−８−６ ５０”＜ＥＣ７３２５２３２０，４ＡＫ４　ＥＣ２６３−８−７４６”＜ＨＤ１ ２２Ａ　２６０　４　２０．５ＡＫ５　ＥＣ２６３−８−８５０”＜ＥＣ１１９ ２３８３１３，３ＡＫ６　ＥＣ２６３−８−９５０十　＜ＥＣ７８２３３４１１ ，２ＡＫ７　ＥＣ２６３−８−１０６６＋＜ＥＣ５８８２４７４２７，４ＡＫ８ 　ＥＣ２６３−８−１１５４，５２＜ＨＤ２０６Ａ　２５８　４　８．８ＡＫ９ 　ＥＣ２６３−８−１２［４７］”＜ＮＢ−０３２７８６−１ｃ　２５８　４　 １０．１すべての菌株式はＥＣ２１５８からの８８”Ｍｄのプラスミドならびに ＨＤ−２６３に対して自然の６０”ＭｄのＰｌ毒素プラスミドを有する。 Ｂ、ＥＣ２６３−８−５種々の甲虫類に対する活性Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　Ｖｉｒ ｅｓｃｅｎｓ　２５　６０　２８　８０Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ　３７７　 ３０　４１９　７０シ翌並胆Ｌｅｘｉｇｕａ　３７７　１０　４１９　８０投与 量は、表面処理として、ナトグラムの結晶タンパク質／規定食力Ｒ１およびＰＩ の両者の毒素を含有するトランスコンシュガントは、ＣＰＢおよび鱗翅類の両者 の幼虫に対して毒性であることが示された。それらの産生は下に詳述する。 ＰＡＧＥ上で展開したＥＣ２１５８結晶、Ｒ１よびＦｌからのタンパク質は、７ ７．７１および３１ｋＤａであると決定された（蓼照、第４図）。Ｒ１結晶は４ モルのＮａＢｒ中に可溶性であり（第５（Ａ）図）（ｒＮａＢｒ　５ｕｐＪ）、 Ｆｌ結晶を残しｆ−、（第５（Ａ）図ｒＮａＢｒ　ｐｐｔ」）、これは７７ｋＤ ａおよび７１ｋＤａのタンパク質のＲ１結晶への帰属を可能とした。再結晶化Ｒ １タンパク質はＣＰＢ幼虫に対して毒性であった。ある種の培地および菌株のバ ックグラウンドにおいて、７１ｋＤａのタンパク質はもっばら産生される（第５ 　（Ａ’　）８よび（Ｂ′）図）。第５図は、同−培地上のＥＣ２１５８の誘導 体中の７７および７１ｋＤａの異なる産生（Ａｏ）および異なる培地上の１つの 誘導体（マイナスＦｌ）による異なる産生を示す。３２ｋＤａの余分のバンド（ Ｆｌよう上）は、多分Ｒ１のタンパク質分解断片である。 ＥＣ２１５８からの８８Ｍｄプラスミドは他のＢ、ｔ、のバックグラウンドに移 したとき（供与体源としてＥＣ２１５８培養物を使用する）、７１　ｋＤａのタ ンパク質が産生された（第６図）。これらの菌株はまたＣＰＢに対して毒性であ る。クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）ｊ；よびＢ。 ｃｅｒｅｕｓにおける甲虫類毒素（Ｒ１）の発現は、他の毒素プラスミドの存在 下に減少しない。甲虫類毒素のプラスミドの存在は、他の（例えば、鱗Ｓ類の） 毒素の産生を阻害せず、また条件のプラスミドによる毒素の産生を誘発しない。 好ましい実施態様において、胞子はＥＣ２１５８または甲虫類毒素のプラスミド を収容する他の菌株に含めて、最大の殺虫活性を達成すべきである。これらはは もとの菌株の胞子であるか、あるいは他の菌株からの胞子であることができる。 サザンブロッティングの実験は、Ｐｉ（鱗翅類）毒素の遺伝子と相同性の０．７ キロ塩基のＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片はＥＣ２１５８におけるＤＮＡ配列にハイブ リダイゼーションしない。 ５．２　甲虫類および鱗翅類の活性を有するトランスコンシュガント本発明の好 ましい実施態様において、鱗翅類および甲虫類の両者に対きる。今日まで、この 二重の活性を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は野生において未知である。 概説しかつ前述したように、本発明は、また、工程：な条件下に混合し、そして （ｂ）工程（ａ）の培養混合物から、鱗翅類および甲虫類の両者の昆虫に対する 活性を有するトランスコンシュガント（ｔ　ｒａｎｓｃｏｎ　ｊｕｇａｎｔ）を 分離する、 からなる、甲虫類および鱗翅類の両者の昆虫に対する殺虫活性を有する好ましい 実施態様におけるこの方法は、まｆ−１中間菌株（毒素をエンコードするプラス ミドをもたない）を利用して、甲虫類または鱗翅類の毒素をエンコードするプラ スミドを、他の中間受容体菌株に転移させるか、あるいは究極敵に所望のトラン スコンシュガント宿主（これは、好ましくは、既に、少なくとも１つの他の毒素 をエンコードするプラスミドを含有する）に直接転移させる。 さらに詳しくは、これらのトランスコンシュガント菌株は、すべて、次の手順に より発生させることができる。 ＢＴ菌株、例えば、ＥＣ，２１５８は、それを受容体菌株、例えば、ＥＣ７３− ２６と一緒に増殖させることによって供与体として使用する。 すべてのプラスミドの転移は、供与体および受容体の菌株の胞子をＭ２７グロス （またはＢ、しの増殖に適当な他の培地）中に接種し、そして菌株を３０℃にお いておだやかに震盪しながら６時間以上増殖させることによって実施する。その 後、受容体のコロニーをストレプトマイシン含有平板（ＥＣ７３−２６の場合に おいて、これはストレプトマイシンに対して抵抗性である）を使用することによ って選択するか、あるいはランダムスクリーニングにより同定する。ある場合に おいて、Ｍ２７ブロス以外の栄養培地を使用することができる。このようにして 、ＥＣ２１５８プラスミドからのプラスミドを獲得したトランスコンジュガント がつくられる。次いで、トランスコンシュガントは、それを鱗翅類（Ｌｅｐｉｄ ｏｐｔｅｒａ）に対する毒素を有する菌株と一緒に増殖ことによって供与体とし て使用する。生ずるトランスコンシュガントは、ＥＧ２１５８からの３３十Ｍｄ のプラスミドを獲得し、これは甲虫＊（Ｃ。 １ｅｏｐｔｅｒａ）毒素の遺伝子を含む（プラスミドの列のゲル電気泳動により 確証された）。 ＥＧ２１５８の８８−Ｍｄの甲虫類毒素プラスミドは、ＨＤ２６３−８（自然鱗 翅類毒素プラスミドを含有する受容体ＢＴ菌株、大きさ６０Ｍｄ）中に転移して 、トランスコンシュガントＨＤ２６３−８−５　（ＥＧ２４２１）を産生じ、こ れは鱗！！１類（Ｐ　ｌ）および甲虫類（菱形）の両者の毒素結晶を生成する。 同様な方法において、ＨＤ２７９の４４−Ｍｄの鱗翅類毒素プラスミドを結晶の 自然菌株ＨＤ７３−２６に転移して、トランスコンシュガントＨＤ７３−２６− ７３を産生ずる。次いで、ＨＤ２６３−８−５を受容体として使用し、そしてＨ Ｄ７３−２６−７３を供与体として使用する。生ずるトランスコンシュガント、 ＨＤ２６３−８−７３　（ＥＧ２４２４）およびは、中間の供与体菌株ＨＤ７３ −２６−７３を経て、ＨＤ−２７９の４４−Ｍｄ（Ｐｌ）毒素プラスミドを獲得 する。ＨＤ２６３−８−７３　（ＥＧ２４２４）は３つの毒素プラスミドを含有 する一菌株ＥＧ２１５８からの８８−Ｍｄの甲女類毒素のプラスミド、および、 それぞれ、ＨＤ２６３−８およびＨＤ−２７９からの６０および４４Ｍｄの鱗翅 類毒素プラスミド。生ずる菌株（ＥＧ２４２４）は、出発菌株ＥＧ２１５８、Ｈ Ｄ２６３−８およびＨＤ−２７９と異なり、甲虫類（表ＩＶＢ）および鱗翅類（ 表ＶＡ）の両者に対して活性である。さらに、鱗翅類に対するこの菌株の活性（ Ｐｉ毒素の量）は、菌株ＨＤ２６３−８−５のそれより大きい。 ５．３　組み換えＤＮＡ技術および遺伝子の発現一般に、本発明の寅施において 使用した組み換えＤＮＡ技術は、特異的ＤＮＡ配列をＤＮＡベヒクル（プラスミ ドまたはベクター）中に挿入して、宿主細胞中で複製することができるキメラＤ ＮＡ分子を形成することを包含する。挿入されたＤＮＡ配列は受容体に対して典 型的には外来である、すなわち、挿入されたＤＮＡ配列およびＤＮＡベクターは 性質が遺伝情報を交換しない有機体から誘導されるか、あるいは挿入ＤＮＡ配列 は完全にまたは部分的に合成的につくられることができる。近年、組み換えＤＮ Ａ分子を構成することができるいくつかの一般滴方法が開発されｔ；。例えば、 米国特許第４．２３７．２２４号（ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒ）は、結合とし て知られている制限酵素および方法を使用して、このような組み換えプラスミド を産生ずることを記載している。 次いで、これらのプラスミドを、形質転換により単細胞の有機体中に導入し、そ の中で複製する。そこに記載されている一般的応用のため、米国特許第４．２３ ７．２２４号をこの明細書中に引用によってここに加える。 この構成に使用される方法に無関係に、組み換えＤＮＡ分子は宿主細胞と適合性 でなくてはならない、すなわち、宿主細胞中で自律的に複製することができなく てはならない。組み換えＤＮＡ分子は、また、マーカー機能を有し、この機能に より組み換えＤＮＡ分子により形質転換される宿主ｍ胞を選択することができる 。さらに、適切な複製、転写および翻訳のシグナルのすべてが正しく配置されて いる場合、外来遺伝子は形質転換された細胞およびそれらの子孫において発現さ れるであろう。 これらの異なる遺伝シグナルおよび処理の事象は、遺伝子の発現、すなわち、Ｄ ＮＡの転写およびメツセンジャーＲＮＡの翻訳の多くのレベルを制御する。ＤＮ Ａの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指令し、これにより転写を促進するＤ ＮＡ配列の存在に依存する。 原核細胞中のメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の翻訳は、適切な原核細胞の シグナルに依存する。原核細胞、例えば、Ｂ、ｔ、中のｍＲＮＡの効率よい翻訳 は、ｍＲＮＡ上のリポソーム結合部位を要求する。この配列は短いヌクレオチド 配列であり、出発コドン（Ａ　Ｕ　Ｇ）の前に位置し、これはタンパク質のアミ ノ末端のメチオニンをエンコードする。 リポソーム結合部位は１６５　ＲＮＡ（リポソームＲＮＡ）の３″末端に対して 相補的であり、そして多分ｍＲＮＡとの二重らせん化によりリポソームへのｍＲ ＮＡへの結合を促進して、リポソームの正しい位置決定を可能とする［Ｒｏｂｅ ｒｔｓおよびＬａｕｅｒ％　１９７９、メソッズ・インーｘンジモロジー（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。 ｇｙＬ旦８：４７３］。 特定の遺伝子のクローニングのために広く使用されている１つの方法は、組み換 えプラスミドの「ライブラリー」を調製することである。組み換えプラスミドの 各々はプラスミドベクター（これは通常それを収容する細胞に抗生物質の抵抗性 を付与する）十遺伝子を含有する有機体である供与体有機体からのＤＮＡ断片か ら構成されている。プラスミドのライブラリーは、普通に、プラスミドベクター および供与体有機体からの完全なりＮＡの両者を制限酵素で消化し、酵素を不活 性化し、そしてＤＮＡ混合物を結合することによって調製される。結合されたＤ ＮＡはプラスミドのライブラリーである。このプラスミドのライブラリーの重要 な特徴は、それが多くの異なる組み換えプラスミドを含有することである。この ライブラリー中の組み換えプラスミドの少なくとも１つのは、問題の遺伝子が存 在する供与体有機体からのＤＮＡ断片を含有する可能性がもっとも強い。プラス ミドライブラリーを、遺伝子を含有しない宿主有機体の細胞中に形質転換する。 宿主細胞を選択的固体培地上に広げ、この培地は通常抗生物質を含有し、組み換 えプラスミドを含有する、形質転換された細胞のみをコロニーに成長させる。個 々の形質転換された宿主のコロニーを、供与体有機体からの遺伝子の獲得につい て試験する。 宿主コロニーにおいて、獲得された遺伝子は組み換えプラスミド上に支持される 。 遺伝子の獲得について試験する最も直接的な方法の１つは、遺伝子特異的ハイブ リダイゼーシヨンプローブを使用することである。相同性ＤＮＡ断片の特性は、 それらの断片がハイブリダイゼーシヨンの間にお互いに緊密に結合することであ る。典型的には、放射線標識したＤＮＡプローブをハイブリダイゼーシヨンの間 に使用して、遺伝子へのグローブの結合を容易に監視できるようにする。 分子生物学の最近の進歩は、遺伝子特異的プローブとして合成オリゴヌクレオチ ドを使用することである。オリゴヌクレオチドの使用のための基準は、すべての 生物学的系において、特定のヌクレオチド配列がアミノ酸の正確な配列をエンコ ードすることである。逆に、アミノ酸配列が特定のタンパク質について知られて いるとき、そのタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列は、正確ではない が、推定することができる。実際には、問題の遺伝子の産生物である、タンパク 質の部分的アミノ酸配列は化学的方法により決定される。タンパク質のアミノ酸 配列に基づいて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが合成され、これは 、変化する程度に、遺伝子に対して相同性である。正確な相同性は保証されない 。なぜなら、あるタンパク質のアミノ酸配列についての知識はそのタンパク質を エンコードする遺伝子のヌクレオチド配列にいての正確な知識を与えないからで ある。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチドプローブと遺伝子との間の相同 性は正確でなくてさえ、ハイブリダイゼーシ１ンの条件はオリゴヌクレオチドプ ローブを遺伝子に特異的に結合させるであろう。 そして甲虫類の毒素の部分的アミノ酸配列を決定した。ｃｒｙＣ遺伝子特異的オ リゴヌクレオチドプローブを甲虫類タンパク質のアミノ酸配列に基づいて合成し た。オリゴヌクレオチドを放射線標識し、そしてハイプリダイゼーシ覆ンの実験 において使用して、供与体Ｂ、ｔ、菌株からのｃｒｙＣ遺伝子を支持する組み換 えプラスミドを収容する、形質転換された宿主のコロニーを同定した。 ５．４　バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ ｎｓｉｓ）撹拌ＥＧ２１５８からのｃｒｙｃ毒素遺伝子のクローニング さらに詳しくは、本発明のｃｒｙＣ毒素遺伝子をクローニングするために、Ｂ、 ｔ、菌株ＥＣ２１５８の細胞を０２培地（１％のグルコース、０．２％のペプト ン、０．５％のＮＺ　アミン　Ａ、０．２％の酵母エキス、１５ミリモルの（Ｎ Ｈ，）、ＳＯ，，２３ミリモルのＫＨ，ＰＯい２７ミリモル（７）Ｋ２ＨＰＯい 　ｌ　ミ！Ｊモル（７）ＭｇＳＯａ　・７Ｈ，０１６００μモルのＣａＣ１２， １７μモルのｚｎＳＯ６・７Ｈ２Ｏ１１７μモルのＣｕＳｏ４・５Ｈ２０，２μ モルのＦｅ５０．・７ＨｚＯ）中で３０℃においてＴ７２（時間）まで増殖させ 、そして胞子＋結晶を遠心により収穫しＩ；。胞子／結晶の沈澱を１モルのＮａ Ｃｌで数回洗浄し、次いで脱イオン水数回洗浄した。毒素タンパク質を胞子／結 晶調製物を５％のベーターメルカプトエタノール、２％のＮａＤｏｄｅＳＯ４， ６０ミリモルのトリスｐＨ６，８，１０％のグリセロール中で７０°Ｃにおいて ７分間インキュベージコンすることによって可溶化し、そして胞子を遠心により 除去した。上澄み液をＮａＤｏｄｅＳＯ，を含有するポリアクリルアミドゲルの 電気泳動にかけて、タンパク質を分離した。ゲルをクーマツシー（Ｃｏｏｍａｓ ｓｉｅ）染料で染色し、そして甲虫類活性タンパク質を含有するゲルのスライス をカミソリの刃で切断しｔ；。均質な甲虫類活性タンパク質の調製物をゲルのス ライスから電気溶離し、アセトンで沈澱させた後、甲虫類活性タンパク質のＮＨ ２−末端アミノ酸配列をアナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）気相配列決定装置（４７０Ａ型）で実施しｔ；自動化エドマ ン分解により決定し、そしてデュポンＺｏｒｂａｘＣ１８カラムでヘラレット− パラカード（Ｈｅｗｌｅ　ｔ　ｔ−Ｐａｃｋｅ　ｒｄ）ＨＰＬＣ（１０９０型） で１０４０ダイオード列の検出器により分析した。７１ｋＤＡのＮＨよ＝末端ア ミノ酸配列は、次のとおりであると決定された：ＮＨｘ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＡＬ Ａ　ＬＥＵ　ＴＨＲＳＥＲ５ＥＲＴＨＲＡＳＰ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＩＬ Ｅ　ＧＬＮ　ＬＹＳＧＬＹ　ＩＬＥ　ＳＥＲＶＡＬ　ＩＬＥ　ＡＳＰ　ＬＥＬＩ 　ＬＥＵ７１　ｋＤａの甲虫類毒素のエドマン配列決定はＮＨ，−末端のメチオ ニン残基を明らかにしなかったことは、意味あることである。７１ｋＤａの甲虫 類毒素は約７７ｋＤａのより大きい前駆体タンパク質の処理された形態であると 、われわれは信する。これの証拠は次のとおりである。 ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で時々、７７ｋＤａのタンパク質が７１ｋＤ ａのタンパク質に加えて菌株ＥＧ２１５８の細胞抽出物から見られた。細胞の抽 出物を７０℃ではなく５５℃においてインキュベーションすると、７７ｋＤａの タンパク質は見られなかった。５５°Ｃにおいて、Ｂ、ｔ、プロテアーゼは完全 に不活性化されなかったであろう。プロテアーゼ活性は多分７７ｋＤａタンパク 質の７１ｋＤａの形態への処理に起因する。ＮＨ２−末端のメチオニン残基が７ １　ｋＤａタンパク質において見られなかったので、Ｂ、ｔ、に固有のプロテア ーゼは、７７ｋＤａタンパク質から、はぼ５ｋＤａまたは５０アミノ酸を切り放 して、７１　ｋＤａの処理されたタンパク質を生成する。 ５．５　ｃｒｙｃ遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブ甲虫類活性タンパ ク質のＮＨ２−末端のアミノａ１〜２２をエンコードするオリゴヌクレオチドプ ローブを、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、）のＤＮＡ合成装置（３８０Ａ）で合成した。コドンの同義性（ある種のア ミノ酸の各々はいくつかのわずかに異なるコドンによりエンコードされる）のた め、合成オリゴヌクレオチドの配列はｃｒｙＣ遺伝子の実際のＮＨ２−末端配列 と異なることが認識された。しかしながら、Ｂ、ｔ、のゲノムが前にクローニン グしかつ配列決定したＢ、ｔ、遺伝子のための６８％のＡ＋Ｔおよびコドンの使 用の情報であるという事実を、ｃｒｙＣ遺伝子の実際の配列と一致する最も高い 確率を有するオリゴヌクレオチドプローブの設計において使用しＩ；。このオリ ゴヌクレオチドグローブは、ｃｒｙＣ遺伝子のＮＨ２−末端領域にのみ結合する ように設計した。ｃｒｙｃ遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの配列は、 次のとおりであった＝５’　−ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＴＣ Ａ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　ＡＡ Ａ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＡ　ＧＴＡ　ＡＴＴ　ＧＡ−３’ここにおけ るｃｒｙＣ遺伝子のもとの分離を可能とするために、このＤＮＡプローブは、ま た、本発明の他の好ましい実施態様からなる。このＤＮＡプローブは、Ｂ、ｔ− 菌株のスクリーニングを可能として、ＣｒｙＣ遺伝子（または可能ならば関連す る遺伝子）が自然に存在するかどうか、あるいは特定の形質転換された有機体が ｃｒｙＣ遺伝子を含むかどうかを決定することができる。このようにして、また 、そのＢ、ｔ。 の菌株の殺虫活性を推定することができる。また、本発明の範囲において、この プローブはその遺伝子のより小さいか、あるいはより大きいオリゴヌクレオチド また他の領域からなることができる。このプローブは、あるかずのこの分野にお いて知られている技術（例えば、放射線標識または酵素標識）により、後述する ように標識することができる。 オリゴヌクレオチドグローブを使用して、ｃｒｙＣ遺伝子の少なくともＮＨ２− 末端解読領域を含有する、Ｂ、ｔ、ＤＮＡの制限断片の大きさを決定した。この 決定のため、甲虫類毒性菌株である菌株ＥＧ２１５８をＤＮＡ源として使用した 。Ｂ、ｔ、菌株ＨＤ−１，すなわち、特許の菌株ＨＤ−１から直接誘導した単一 のコロニー分離物（Ｕ、Ｓ、Ｄ。 Ａ、テキサス州ブラウンスビレ）を対照として使用した。 ＬＢ培地中で３０℃において中央対数期に細胞を増殖させた後、ＤＮＡを供与体 菌株ＥＧ２１５８から分離した。細胞を遠心により収穫し、５０ミリモルのトリ ス−ＨＣｌ、１０ミリモルのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　ｓ　ｌ　ｍ　ｇ　／　”ａのリゾ チーム中に再懸濁し、そして３７℃において６０分間インキュベーションした。 細胞をＮａＤｏｄｅＳＯａの０．２％の最終濃度への添加により溶菌しｔ；。細 胞のリゼイトを等しい体積のフェノールで２回およびクロロホルム／イソアミル アルコール（２４／ｌ）で１回抽出した。ｌ／体積の３モルの酢酸ナトリウムお よび２体積のＥｔＯＨをリゼイトに添加し、そしてＤＮＡをガラス棒で巻き取っ て抽出した。巻き取ったＤＮＡを６６％のＥｔＯＨで５分間およびジエチルエー テル中で１分間ソーキングした。巻き取ったＤＮＡを空気乾燥し、そして脱イオ ン水中に再懸濁した。 ハイブリダイゼーション実験は、供与体菌株の各々からの合計ＤＮＡをＨｉｎｄ ｌｌＩ制限酵素で消化し、消化したＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動し、そし てＤＮＡを７ガロースゲルからニトロセルロースのフィルターにサザンプ０７ト 技術（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、９８：５０３−５１７．１９７８）により移 した。ニトロセルロースのフィルターを３２℃において１６時間３ＸＳＳＣ溶液 （ＩＸｓｓｃ−０，１５モルのＮａＣ１１０，Ｏｌ　５モルのクエン酸ナトリウ ム）、０．１％のＮａＤｏｄｅＳＯａ、２００　ｐ　ｇ／ｍＱのヘパリン、ＩＯ Ｘデンハルト溶液（ＩＸ＝０．０２％ｎｏウシ血清アルブミン１０．０２％のＦ ｉｃｏｌｌｌｏ、０２％のポリビニル−ピロリドン）（ガンマ−Ｐ３２−ＡＴＰ およびＴ４キナーゼで放射線標識したｃｒｙＣ遺伝子特異的オリゴヌクレオチド プローブのほぼｌｐｇを含有する）中でインキュベーションした。ハイブリダイ ゼーション後、ニトロセルロースのフィルター上３ＸＳＳＣ，０，１％のＮａＤ ｏｄｅＳＯ４で４７℃において１時間洗浄し、そしてフィルターをＸ線フィルム に露出した。生ずるオートラジオグラムにより、オリゴヌクレオチドプローブは ＥＧ２１５８からの２゜６Ｋｂの単一のＨ４ｎｄｌｌｌ断片に特異的にハイブリ ダイゼーションしたが、甲虫類毒素陰性対照ＨＤＩ−１からの断片にハイブリダ イゼーションしなかった。 ｃｒｙＣ濃縮プラスミドのライブラリーを、ＥＧ２１５８完全ＤＮＡをＨｉｎｄ ｌｌｌで消化し、消化したをアガロースゲル上で電気泳動させ、そしてほぼ２． ０−３．Ｏｋｂの大きさの範囲のＨｉｎｄｌ　ｌ　ｌＤＮＡ断片を含有するゲル スライスを切除することによって構成した。２゜０〜３．Ｏｋｂの大きさの範囲 のＥＧ２１５８のＨｉｎｄｌｌｌ断片をアガロースゲルのスライスから電気溶離 し、フェノール＋クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させ、そしてＨｉｎｄ ｌｌｌで消化しかつアルカリ性ホスファターゼで処理しただプラスミドｐＢＲ３ ２２のＨｉｎｄ１１１部位中に結合しｔ；。アルカリ性ホスファターゼは、ｐＢ Ｒ３２２＋ＥＧ２１５８ＤＮＡのＨｉｎｄｌｌｌ断片から成る組み換えプラスミ ドが形成される可能性を大きく増加した。生ずる結合混合物は、菌株ＥＧ２１５ ８からのｃｒｙｃ毒素遺伝子について濃縮された組み換えプラスミドのライブラ リーから成っていた。 ５．７　ｃｒｙｃ遺伝子を含有する２、６ｋｂのＨｉｎｄｌ１１部位断片のコロ ニーハイブリダイゼーションおよび分離ｃ　ｒｙＣ遺伝子が濃縮したプラスミド のライブラリーを、Ｅ、ｃｏｌｉ、ＨＢＩＯＩのアンピシリン感受性宿主の菌株 ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　 ＬａｂｏｒｉｅＳ）、ミゾリー州ベセスダ］中に、ＣａＣ］、の手順により、形 質転換した。Ｅ、ｃｏ］ｉ菌株ＨＢ　Ｉ　Ｏｌは甲虫類毒素のプラスミドを合成 せず、したがって、ｃｒｙＣ遺伝子を含有することが期待されない。Ｅ。 ｃｏｌｔは、これらの細胞が容易に組み換えプラスミドで形質転換されるので、 宿主菌株として使用した。組み換えプラスミドを獲得しｔ；すべての宿主細胞は アンピシリン抵抗性となった。組み換えプラスミドへの暴露後、Ｅ、ｃｏｌｉ宿 主細胞をアンピシリン含有固体培地上に広げ、そして組み換えプラスミドを収容 する細胞はコロニーに増殖することができた。個々のアンピシリン抵抗性宿主コ ロニーは、ｐＢＲ３２２＋供与体菌株ＨｉｎｄｌＩＩからのＨｉｎｄｌＩＩ断片 から構成された組み換えプラスミドの多くの同一コピーを収容するであろうこと が期待されｔ；。 はぼ２０００の個々のアンピシリン抵抗性コロニーをニトロセルロースのフィル ター上にブロッティングした。コロニーのレプリカを後述する後の使用のために 取っておいた。コロニー中に含有される組み換えプラスミドは、コロニーをＮａ ＯＨおいたＮＨ４アセテートで処理して、ニトロセルロースのフィルターへ結合 させた。生ずるニトロセルロースのフィルターは組み換えプラスミドの列を含有 し、それらの各々は他の組み換えプラスミドと物理学的に分離された。ニトロセ ルロースのフィルターは、３ＸＳＳＣ，２００ｍｇ／ｍｆｆのヘパリン、０．１ ％のＮａＤｏｄｅＳＯい　ＩＯＸデンハルト溶液および、放射線標識したほぼｌ ｐｇのｃｒｙＣ遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの溶液中で１６時間ハ イブリダイゼーションした。フィルターを４７℃において１時間３ｘｓｓｃ、０ ．Ｉ％ｎｏＮａＤｏｄｅｓｏ、中で洗浄し、そしてＸ線フィルムに露出した。生 ずるオートラジオグラムにより、オリゴヌクレオチドプローブはニトロセルロー スのフィルター上の１２の異なる位置にハイブリダイゼーションしたことが示さ れた。 オートラジオグラムをコロニーのレプリカと整列させることによって、組み換え プラスミドがオリゴヌクレオチドプローブと明らかにハイブリダイゼーションし た、１２のコロニーを同定することができた。 プラスミドを１２のコロニーの各々から抽出した。プラスミドをＨｉｎｄｌｌｌ で消化し、そしてアガロースゲルで電気泳動した。プラスミドをアガロースゲル からニトロセルロースのフィルターへ、サザンブロッティングにより移した。ニ トロセルロースのフィルターを放射線標識したオリゴヌクレオチドプローブとハ イブリダイゼーシヨンさせ、そしてＸ線フィルム！：露出した。生ずるオートラ ジオグラムが示すようｊ二、オリゴヌクレオチドプローブは１２の組み換えプラ スミドの１つのみに含有される２、６１ｃｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片ともっばらハ イブリダイゼーションした。この組み換えプラスミドは、ｐＥ２１２と表示し、 ３２２十菌株ＥＧ２１５８からの２．６ｋｂのＨｉｎｄｌｌ！インサートから成 っており、これをそれ以上の実験のために選択した。ｐＢＲ３２２を収容するも とのＥ、ｃｏ１ｉコロに一をＥＧ１１３１３と表示した。 クローニングした２、６ｋｂのＩ（ｉｎｄｌｌｌ断片は、ｃｒｙＣ遺伝子の少な くともＮＨ２−末端解読領域を含有すると思われた。この断片上のｃｒｙＣ遺伝 子の存在は、ＤＮＡ配列決定を使用して、甲虫類毒素のＮＨ２−末端をエンコー ドする、クローニングした２、６ｋｂの断片中の領域についてサーチして評価し た。２ｋｂより大きいＤＮＡ断片を配列決定することは時間を消費するので、ｃ ｒｙＣ遺伝子のＮＨ，−末端解読領域を含有することが期待される、２．６ｋｂ の断片内のＤＮＡのより小さい断片を同定することが必要であった。フィルター と放射線標識したオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによ り、プローブはｐＨ２１２からのＤＮＡの１．ＯｋｂのＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ制 限断片に特異的にハイブリダイゼーションすることが明らかにされた。したがっ て、１．０ｋｂのＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ断片はｃｒｙＣ遺伝子の少なくともＮＨ ２−末端の解読領域を含有するすることが期待された。 １、Ｏｋｂの断片をｐＨ２１２からＤＮＡ配列決定ベクターｍｐ１８およびｍｐ １９［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃ ｈ　Ｌａｂｏｒｉｅｓ）、ミゾリー州ベセスダ〕中にサブクローニングした。１ ．Ｏｋｂの断片のＤＮＡ配列決定により、それは、下に記載するわずかのアミノ 酸の例外をもって、７０ｋＤａの甲虫類毒素のＮＨ２−末端アミノ酸をエンコー ドするＤＮＡの領域を含有することが明らかにされた。これが結論的に実証する ように、供与体菌株ＥＧ２１５８からのクローニングした２、６ｋｂのＨｉｎｄ ｌｌｌ断片はｃｒｙＣ遺伝子を含有しｌ；。 ５．９　クローニングしたｃｒｙＣ遺伝子のＤＮＡ配烈プラスミドｐＥ２１２を 含有した、クローニングしｔ：２．６ｋｂの■４ｉｎｃｌＩＩＩ断片の制限地図 を、第７図に示す。大きい矢印は、全体の甲虫類毒素をエンコードすると推定さ れた、はぼ２．０ｋｂの領域を示す。ｃｒｙＣ遺伝子の完全配列を決定するｌ； めに、プラスミドｐＨ２１２中の全体の２．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を配列 決定ベクターのｍｐ１８およびｍｐ１９中にサブクローニングした。第８図が示 すように、２．６ｋｂのＨ４ｎｄｌｌｌ断片のＤＮＡ配列は、第７図にプラスミ ドｐＥ２１２として示す、ｃｒｙＣ遺伝子から上流のＨｉｎｄｌ１１部位におい て最初のヌクレオチドで開始する。ヌクレオチド５６９（第８図）において、長 いオープンリーディングフレーム（タンパク質解読領域）はＮＨ２−末端のメチ オニンコドンで開始することが発見された。メチオニンのコドンより前に、ヌク レオチド５５７にリポソーム結合部位（ＧＧＡＧＧＡ）が存在する。ヌクレオチ ド７２８において、ＮＨ２−４端メチオニンコドンから５３下流で、７１ｋｂの 甲虫類毒素のＮＨ２−末端の解読領域は開始する。この領域はいくつかのアスパ ルテートおよびスレオニンの残基をエンコードし、これらの残基は、それぞれ、 スレオニンおよびアスパルテートの残基であると、順次のエドマン分解（ｄｅｇ ｒａｄａｔｉｏｎ）により決定された（参照、ヌクレオチド７２８で開始するｃ ｒｙＣ遺伝子の解読領域をもつ７１ｋＤａのタンパク質のＮＨ２−末端の配列） 。これらの食い違いは、タンパク質のＮＨ２−末端のアミノ酸配列の正確な決定 が困難であるためである。 第８図に示すように、７１ｋＤａのタンパク質のためのＮＨ２−末端解読領域は 、ＮＨ２＝末端のメチオニンコドンから５３アミノ酸残基だけ下流において始ま る。５３アミノ酸はほぼ５ｋＤａであり、これは正確には７１ｋＤａのタンパク 質およびその推定された７７ｋＤａの前駆体との間の大きさの差である。したが って、クローニングしたｃｒｙＣ遺伝子のＤＮＡ配列決定が明瞭に示すように、 この遺伝子は引き続いてタンパク質分解的に処理して５ｋＤａだけより小さいタ ンパク質（７１ｋＤａ）を生ずる、タンパク質（７７ｋＤａ）をエンフードする 。 クローニングしたＤＮＡ配列の１つの利点は、それを使用して特徴づけされてい ないＤＮＡ試料中の、関連するＤＮＡ配列同定することができるということであ る。ｃｒｙｃ遺伝子の場合において、クローニングした遺伝子を使用してＢ、ｔ 、の菌株中のｃｒｙｃ遺伝子の存在を検出することが今回可能となった。 クローニングしたｃｒｙｃ遺伝子を使用して、自然Ｂ、ｔ、宿主菌株中のｃｒｙ ｃ遺伝子の存在および位置検出することができるどうかを決定するために、次の 手順を実施した。Ｂ、ｔ、菌株ＨＤＩ−１およびＥＧ２１５８をエフハルト（Ｅ ｃｋｈａｒｄｔ、Ｔ、（１９７８）Ｐｌａｓｍｉｄ　１　：　５８４−５８８） の手順に従って溶菌し、そしてリゼイトをアガロースゲルの電気泳動にかけた。 分離したプラスミドをアガロースゲルからニトロセルロースのフィルターにサザ ンプロツテイングにより移しｆ−、この手順により、特定の菌株中に含有される プラスミドのすべてのプラスミドを大きさで分離することができた。ニトロセル ロースのフィルターを放射線標識した２、６ｋｂのＨｉｎｄｌｌ　Ｉ　（ｃｒｙ Ｃ遺伝子）の断片とハイブリダイゼーションさせた。ニトロセルロースのフィル ターのオートラジオグラフィーにより、ｃｒｙＣ遺伝子断片は甲虫類毒素産生菌 株ＥＧ２１５８中のほぼ８８ＭＤａの１つのプラスミドの断片にもっばらハイブ リダイゼーションした（第９図）。クローニングしたｃ　ｒｙＣ遺伝子は、甲虫 類毒素の自然菌株ＨＤｌ−１中のプラスミドのいずれにもハイブリダイゼーショ ンしなかった。したがって、この実験が実証するように、クローニングしたｃｒ ｙＣ遺伝子を直接の方法で使用して、Ｂ、ｔ、菌株中のｃｒｙｃ遺伝子を含有す る自然プラスミドを同定することができる。クローニングしたｃｒｙｃ遺伝子と のＤＮＡのハイブリダイゼーションは、Ｂ、ｔ、の菌株中に存在する多数のこの ようなプラスミドの中からｃｒｙＣ遺伝子を支持する単一のプラスミドの直接の 同定を可能とする。 ５．１１　異種微生物中にべのｃｒｙＣ遺伝子の形質転ｃｒｙＣ遺伝子は任意の 適当なプラスミド中に挿入し、次いでこれを利用して適当な微生物を形質転換す ることができる。明らかに本発明において、Ｂ、ｔ、以外の微生物、すなわち、 一般に、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）属の有機体、をｃｒｙｃ遺伝子の組み込みにより形質転換することができる。 本発明における使用に、有機体バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍ ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が好ましい。 そのように形質転換した有機体は、好ましくは、Ｂ、ｔ、の自然宿主菌株におい て産生されるこの毒素の量をかなり蹴える量で、甲虫類（Ｃｏ１ｅｏｐｔｅｒａ ）活性毒素を産生ずるであろう。この形質転換された有機体により産生された甲 虫類活性青票は、好ましくは、その有機体Ｊ二より産生された唯一のデルタ−エ ンドトキシンである。このようにして、有機体それ自体は単独でか、あるいは殺 虫剤組成の一部分として利用することができる。甲虫類活性毒素は、好ましくは 、その有機体により産生された唯一のデルタ−エンドトキシンであるので、この 分野において知られて方法、例えば、レッグラフイン（Ｒｅｎｏｇｒａｆ　ｉｎ ）密度勾配により、他の細胞材料から甲虫類活性青票を精製する直接の方また、 本発明の領域内において、ｃｒｙＣ遺伝子（第８図）を植物中に直接挿入し、こ うして植物それ自体がｃｒｙＣ甲虫類活性毒素を産生ずるようにする。 植物の遺伝子操作は、ｃｒｙＣ遺伝子を含有する所望のＤＮＡを植物組織または 細胞中に、種々の形態および由来のＤＮＡ分子使用して導入することによって達 成することができる。これらは、次のものを包含するが、これらに限定されない ：天然に産出する植物ベクターから誘導されたＤＮＡ分子、例えば、アゴバクテ リウム・ツメファシェンス（Ａｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓ）または植物のｉｉ体からのＴｉプラスミド、例えば、ＤＮＡウィルス、例え ば、カリアラブアワーのモザイク病（ＣａＭＶ）、およびゲミニウイルス（Ｇｅ ｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ）、ＲＮＡウィルス、ピロイドから誘導されたＤＮＡ分 子：不安定な植物ゲノム成分から誘導されたＤＮＡ分子、例えば、細胞器官中の 染色体外ＤＮＡ要素（例えば、葉緑体およびミドフンドリア）、まｔ；は核的に エンコードされ、制御された要素；安定な植物成長培地成分からのＤＮＡ分子（ 例えば、複製起源および導入されたＤＮＡを細胞器官または核成長培地中に統合 させ、正常に複製させ、自律的に複製させ、細胞の分割および植物の性的増殖の 間凝集させる他のＤＮＡ配列）。 ｃｒｙＣ遺伝子を含有するＤＮＡは、感染性プラスミド、例えば、Ｔｉプラスミ ド、ウィルスまたは微生物、例えば、Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、　リポソー ムの使用、機械的ｍｆによりミクロ注入および全体の染色体または染色体断片に より、植物の細胞または組織中に直接供給することができる。 ５．１３　甲虫類活性毒素を組み込んだ産生物および配合物ｃｒｙＣ遺伝子によ りエンコードされる甲虫類デルタ−エンドトキシンは、甲虫類昆虫に対する活性 を有する効力のある殺虫剤化合物である。 したがって、本発明の範囲内において、このタンパク質毒素を殺虫剤（活性成分 ）として単独で、好ましくは均質なまたは純粋な形態でかつ第８図のアミノ酸配 列を有する形態で、あるいはＢ、ｔ、菌株ＥＧ２１５８とまたはクローニングし たｃｒｙＣ遺伝子を発現する形質転換した微生物と関連させて、あるいはＢ、ｔ 、）ランスコンシュガントまたは他の形質転換されたｃｒｙＣ遺伝子遺伝子タン パ土質産生物毒素含有形成性微生物と胞子などとの混合物で、利用する。 少なくともｃｒｙＣタンパク質毒素全毒素する本発明の組成は、適当な甲虫類（ または鱗翅類）の生息場所に殺虫的に有効量で適用し、前記量は因子、例えば、 制御すべき特定の甲虫類（または二重の活性のトランスコンシュガントを使用す る場合、また鱗翅類）の昆虫、処理すべき特定の植物および殺虫活性な組成を適 用する方法に依存する。 本発明の方法により保護される標的作物（甲虫類およびｗ４！！Ｉ類の潜在的生 息場所）は、例えば、次の植物の種からなる：穀類（例えば、コムギ、オオムギ 、ライ、オート麦、イネ、モロキシおよび関連する作物）、ビート、マメ科植物 、油の植物（例えば、ポピー、オリーブおよびヒマワリ）、キュウリ植物、Ｖ＆ 雄の植物、柑橘類、野菜、落葉性樹木および針葉樹。 好ましい殺虫剤配合物は、ＥＧ２１５８単独またはその突然変異体、組み換え体 または遺伝子操作した誘導体を有効量でまたは甲虫類活性毒素単独でまたは他の 有機体（すなわち、形質転換した有機体またはトランスコンシュガント）中に組 み込むか、あるいはそれと関連させて、所望の担体と混合することによって調製 する。配合物はダストとしてまたは油（植物性または鉱物性）または水中の懸濁 液、湿潤性または農業の用途に適当な他の材料中において、適当な担体アジュバ ントを使用して投与することができる。適当な担体は、固体または液状であり、 そして配合技術において本来使用されている物質、例えば、天然または再生の鉱 物性物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、増粘剤、結合剤または肥料に相当することが できる。 一般に、好ましい組成は、通常０．１〜９９％、１〜５０％の殺虫剤微生物、例 えば、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｊｅｎ ｓｊｓ）またはそれと他の活性成分との組み合わせ、１〜９９．９％の固体また は液体のアジュバント、および０〜２５％、好ましい０．１〜２０％の界面活性 剤を含有する。 固体または液体のアジュバントを含有する配合物は、既知の方法において、例え ば、活性成分を増量剤、例えば、溶媒、固体担体、およびある場合において、表 面活性化合物（界面活性剤）と均質に混合および／または粉砕することによって 調製される。 適当な液状担体は、植物性油、例えば、ヤシ油または大豆油、鉱油または水であ る。例えば、ダストおよび分散性粉末のために使用する固体の担体は、通常天然 の鉱物繊維、例えば、方解石、タルク、カオリンまＩ；はアタパルジャイトであ る。物理学的性質を改良するために、また高度に分散しｔ；ケイ酸または高度に 分散した吸収性ポリマーを添加することが可能である。適当な粉砕した吸着性担 体は多孔質のタイプ、例えば、軽石、破壊煉瓦、セブライトまたはベントナイト である。適当な非吸着性担体はケイ酸塩または砂のような材料である。さらに、 多数の予備造粒した材料または無機または有機の混合物、例えば、二重にドロマ イトまたは粉砕した植物残留物を使用することができる。 配合すべき活性成分の性質に依存して、適当な表面活性化合物はすぐれた乳化性 、分散性および湿潤性を有する非イオン性、陽イオン性および／または陰イオン 性である。用語「界面活性剤」は、また、界面活性剤の混合物からなるとして理 解されるであろう。 適当な陰イオン性界面活性剤は、水溶性の石鹸および水溶性の表面活性化合物で あることができる。 適当な石鹸は高級脂肪＊（Ｃ＋。−０１，）のアルカリ金属塩、アルカリ土類金 属塩または非置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸、ま たは、例えば、ヤシ油またはタロウ油がら得ることができる天然の脂肪酸の混合 物のナトリウム塩またはカリウム塩である。さらに安定な界面活性剤は、また、 脂肪酸のメチルタウリン塩ならびに変性および未変性のリン脂質である。 しかしながら、より頻繁に、いわゆる合成界面活性剤、ことに脂肪族スルホネー ト、脂肪族サル−エート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキル アリールスルホネートを使用する。 脂肪族スルホネートまたはサルフェートは、通常、アルカリ金属塩、アルカリ土 類金属塩または非置換アンモニウム塩の形態であり、そして一般にドデシル硫酸 のｃｓ　Ｃ２！アルキルエステル、ナトリウムまたはカリウム塩、あるいは脂肪 酸から得られｔ；アルコールサルフェートの混合物である。これらの化合物は、 また、脂肪族アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸エステルおよび スルホン酸の塩類の混合物からなる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、 好ましくは、２つのスルホン酸基および１つの脂肪酸基（約８〜２２個の炭素原 子を含有する）を含有する。アルキルアリールスルホネートの例は、ドデシルベ ンゼンスルホン厳、ジブチナ７タレンスルホン酸、まｔ二はす７タレンスルホン 酸／ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノー ルアミン塩である。また、対応するホスフェート、例えば、ｐ−ノニルフェノー ルと４〜１４モルのエチレンオキシドリン酸エステルの塩との付加物のリン酸エ ステルの塩類は適当である。 非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ポリグリコールエーテル銹導体または脂 肪族または環式脂肪族のアルコールまたは飽和または不飽和の脂肪酸およびアル キルフェノールであり、前記誘導体は３〜１０のグリコールエーテル基および（ 脂肪族）炭化水素部分中に８〜２０個の炭素原子およびアルキルフェノールのア ルキル部分中に６〜１８個の炭素原子を含有する。 他の適当な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドとアルキプロピレン グリコール、エチレン・７アミノポリプロピレングリコールとの水溶性付加物で あり、そしてアルキルポリプロピレングリコールは１〜１０個の炭素原子をアル キル鎖中に含有し、前記付加物は２０〜２５０のエチレングリコールエーテル基 および１０〜１００プロピレングリコールエーテル基を含有する。 非イオン性界面活性剤の代表的例は、ノニルフェノールポリニドキシエタノール 、ヤシ油、グリコールエーテノ呟ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物 、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、エチレングリコールおよびオ クチルフェノキシエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソルビタンの 脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートは、ま た、適当な非イオン性界面活性剤である。 カチオン性界面活性剤は、好ましくは、置換基として、少なくとも１つのＣ，Ｃ ！！アルキル残基および、それ以上の置換基として、低級非置換またはハロゲン 化アルキルベンジル、またはヒドロキシル化低級アルキルベンジル残基を含有す る、第四アンモニウム塩である。！類はｆましくはハライド、メチルサルフェー トまたはエチルサルフェートの形態、例えば、ステアリルトリメチルアンモニウ ムクロライドである。 ６．０　ス臭遭 Ｂ、ｔ、、形質転換したまたは形質転換しないバチルス・メガテリウム（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）および形質転換したＥ。 ｃｏｌｉの殺虫活性は、昆虫に与える試験規定食中に種々の量のこれらの有機体 を含めることによって決定した。飼料供給後、昆虫の致死率を測定した。 詳しくは、これらのバイオアッセイは、液体培地または固体寒天基本培地中で２ 日間３０℃において、微生物静止期に増殖することを包含した。プラスミドを収 容するＥ、ｃｏｌｉについて、培地は４０μｇ　／　ｍａのアンピシリンを含有 するＬＢであった。プラスミドを収容するバチルス・メガテリウム（Ｂ、ｍｅｇ ａｔｅｒｉｕｍ）について、培地はｌＯμｇ／ｍＱのテトラサイクリンを含有す るＤＳであった。微生物を固体培地からスパチュラで引っ掻くことによって収穫 した。収穫したバクテリアの湿潤重量を決定し、そしてバクテリアの細胞を脱イ オン水中に既知濃度に再懸濁した。１００μｇのバクテリア細胞の懸濁液を、飼 料供給カップ中の３ｍｆｆの固体寒天基本人工規定食に局所的に適用した。 規定食の上表面積は６００ｍｍ！であった。１匹のコロラド／％ムシ（ＣＰＢ） の新生幼虫を飼料カップの各々に入れ、そして致死率のスコアを７日後に付けた 。 ６、　１　施例１−バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅａｔｅｒ ｉｕｍ）中のｃｒｙＣ遺伝子の形質転換この実施例の目的は、クローニングした ｃｒｙＣ遺伝子がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株中で発現されるかどうかを 決定することであった。 プラスミドｐＥ２１２　（ｃ　ｒｙＣ遺伝子を含有する）は、グラム陰性菌株、 例えば、Ｅ、ｃｏｌｉにおいてのみ複製するであろう。バチルス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）菌株においてクローニングしたｃｒｙＣ遺伝子の発現を試験するために、 まず、ｃｒｙｃ遺伝子を含有しかつバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中で複製する ことができる組み換えプラスミドを構成することが必要であった。ｃｒｙＣ遺伝 子を含有するバチルス（Ｂａｃｉｌ　１ｕｓ）−Ｅ、ｃｏｔ　ｉ　ｒシャトルベ クター」を構成した。用語「シャトルベクター」は、プラスミドがバチルス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ）＆よびＥ、ｃｏｌｉの両者中で複製することができることを示 す。Ｅ、ｃｏｌｉ−バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のシャトルベクターは、バチ ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プラスミドｐＢｃ１６（テトラサイクリン抵抗性）を Ｓｐｈ　１消化し、消化したプラスミドをｐＥＧ２１２のＳｐｈ　１位中に結合 し、モしてＥ、ｃｏｌｉをアンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性に形質転 換することによって構成しｔ；。 １つのテトラサイクリンおよびアンピシリン抵抗性のＥ、ｃｏｌｉ形質転換体は プラスミド（ｐＥＧ２１３と表示する）を収容し、このプラスミドはｐＥＧ２１ ２のＳｐｈ　１部位（アンピシリン抵抗性）中に挿入され？：ｐＢＣ１６から構 成されていた（第７図）。箱形の区域はプラスミドベクターのＤＮＡを示す。開 いた箱はｐＢＲ３２２（Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉの複製）および交差ハツチングしだ箱 はｐＢｃＩ６　（バチルス（Ｂａｃｉ１１ｕ５）の複製）を示す。水平線はｃｒ ｙＣ遺伝子からのクローニングしたＤＮＡである。大きい矢印はｃｒｙｃ遺伝子 の解読領域を示す。 ｐＥＧ２１３をバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉ ｕｍ）中に形質転換しくＡＴＣＣＮｏ、３５９８５）そしてｐＥＧ２１３を収容 する１つのテトラサイクリン抵抗性形質転換体（受は入れ番号ＥＧｌ１３１４） はそれ以上の研究のために選択した。 この実施例は、クローニングしたｃｒｙＣ遺伝子が組み換え体バチルス・メガテ リウム（Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）菌株ＥＧ１１３１４（ｐＥＧ２１３）中で 発現されるかどうかを決定した。遺伝子の発現は、ＮＨｐｏｄｅＳＯ４／ポリア クリルアミドゲルの電気泳動により測定した。 一般に、技術は細胞リゼイトの調製物、ＮａＤｏｄｅＳＯ，／ポリアクリルアミ ドゲルを通す細胞リゼイトの電気泳動およびタンノくり質を可視化するｔ：めの ゲルの染色を１含した。 詳しくは、技術は次のようにして突流した：バチルス・メガテリウム（Ｂ、ｍｅ ｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞を１０ｍｇ／ｍ（＋のトテラサイクリンを含有するＤＳ 板五で４８時間３０℃において増殖させた。）（チルス・スリンギエンシス（Ｂ 、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株ＥＧ２１５８を、ＤＳ板がテトラサイクリ ンを含有しない以外、バチルス・メガテリウム（Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）と 同様に増殖させた。この期間後、はとんどすべての細胞は満足な静止発育期に入 った。細胞をスパチュラで収穫し、そして脱イオン水中に再懸濁した。細胞懸濁 の一部分をｌ：２体積二体積に予熱した（７０℃）ゲル装入緩衝液（５％のベー ターメルカプトエタノール、２％のＮａＤｏｄｅＳＯ＊、６０ミリモルのトリス 　ｐＨ６，８，１０％のグリセロール）と混合し、そして７０°Ｃｌこおいて７ 分間インキュベーションした。懸濁液を短時間遠心し、遠心後、上澄み液ＮａＤ ｏｄｅＳＯ，／ポリアクリルアミドゲル上に直ちに装入し、そして上澄み液中の タンパク質をラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）ジャーナル・オプ・モレキュラー・バ イオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、８０　：　５７６−５９９）に従いゲ ル電気泳動により再溶解した。ゲル中のタンパク質をゲルのクーマツシー（Ｃｏ ｏｍａｓｓｉｅ）色素による染色により可視化した。 第１０図は、前述のようにして調製したＮａＤｏｄｅＳＯ，／ポリアクリルアミ ドゲルの写真である。第１θ図における標識した５ＴＮＤは、タンパク質の分子 量の標準を含有した。ゲルの右への数字は、タンノ（り質の大きさをキロダルト ン（ｋＤａ）で示す。ＥＣ２１５８と表示したレーンはそのＢ、ｔ、菌株の抽出 ４Ｊを含有した。甲虫類毒素タンパク質に相当する主要なタンパク質は、矢印に より示されている。ＣＲＹと表示するレーンは、精製した甲虫類毒素タンパク質 の一部分を含有した。 甲虫類毒素タンパク質は、前述したように精製した。 第１Ｏ図におけるＥＣ１３１１およびＥＣ１３１４と表示するレーンは、それぞ れ、ｐＢｃ１６およびｐＥＧ２１３　（ｃ　ｒｙＣ）を収容する、これらのバチ ルス・メガテリウム（Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）菌株を含有した。レーンＥＧ １３１１およびＥＣ１３１４を比較すると示されるように、菌株ＥＧ１３１４　 （ｐＥＧ２１３）は、大きさが甲虫類毒素タンパク質のそれに相当する主要なタ ンパク質を含有した。このタンパク質は菌株ＥＧ１３１１　（ｐＢｃ１６）の抽 出物中に存在しなかった。 これが突圧するように、クローニングしたｃｒｙＣ遺伝子を収容するバチルス・ メガテリウム（Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）は、甲虫類毒素タンパク質を高いレ ベルで合成した。さらに、光学顕微鏡下で見るとき、菌株ＥＧ１３１４の細胞は 、結晶毒素について特徴手きな相−ブライト（ｂｒｉｇｈｔ）タンパク質封入体 を含有するように思われた。 ６．２　バチルス・メガテリウム（Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）中のクローニン グしたｃｒｙＣ遺伝子の発現産生物のバイオアラ旦 ベーターメルカプトエタノール菌株ＥＧ１３１４　（ｐＥＧ２１３−ｃｒｙＣ） を、コロラドハムシ（ＣＰ　Ｂ）に対する毒性について試験した。 菌株ＥＧ１３１１　（ｐｃＢ１６陰性の対照）およびＥＧＩ　３１４をＩＯμｇ ／ｍＱのテトラサイクリンを含有する固体ＤＳ培地上で３０℃において増殖させ ることによって、細胞懸濁を調製した。細胞をスパチュラで収穫し、そして細胞 を脱イオン水中に再懸濁させた。 バクテリア細胞の懸濁液を、飼料供給カップ中の３ｍＱの固体の寒天−基本人工 規定食に局所的に適用した。１つのＣＰＢの新生幼虫を１つのカップにつき添加 し、そして死亡率のスコアを７日後に付けｔ；（表Ｖｌ）。 投与−ｍｇ細胞／ｍＱ　ＣＰＨの幼虫 死亡数／合計 ＥＣ１１３１１（ｐＢｃ１６ 一対照）−０，ｍｇ／カップ　３１５０ＥＧ１１３１４　（ｐＥＧ２１３ −ｃｒｙｃ）　Ｏ−２ｍｇ／カップ　４９１５０７．０　微生物の受託 作したｃｒｙｃ遺伝子の微生物の例は、ノくチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）および ユシエリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属からのものである。 本発明における好ましい使用は、有機体／（チルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）であるＯさらｌこ、まｔ二、次のノ（チルレス ・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチ ルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびＥ、ｃ ｏｌｉ菌株は、本発明における使用に好ましくかつ列挙したプラスミドが農業研 究培養収集所（ＮＲＲＬ）（イリノイ州ペオリア）に受託されかつ次の受け入れ 番号を割り当てられた：Ｂ、ｔｈｕｒｉ ＥＣ２１５８いくつかの天然に産出する、Ｂ−１８２１３８８−Ｍｄ甲虫類毒素 のプラス ミドを包含する ＥＣ２４２］　いくつかの天然に産出するブラ　Ｂ−１８２１２（ＨＤ２６３− 　スミド、６０−Ｍｄの鱗翅類毒８−５）　素プラスミド、ならびに８８−Ｍｄ のＥＣ２１５８からの毒素 プラスミドを包含する ＥＣ２４２４いくつかの天然に産出するプラ　Ｂ−１８２１４（ＨＤ−２６３− スミド、６０−Ｍｄの鱗翅類毒８−７３）　素プラスミド、＋ＥＧ２１５８から の８８−Ｍｄ毒毒素クラス ミおよびＨＤ−２７９からの４４ −Ｍ（＋の鱗翅類毒素プラスミドを 包含する Ｂ、ｍｅｇａｔｅ ｒｉｕｍ菌株　プラスミド　受は入れ番号ＥＧ１３１４　ｐＥＧ２１３　Ｂ−１ ８２１０Ｅ、ｃｏｌｉ　プラスミド　受は入れ番号ＥＧ１３１３　ｐＥＧ２１２ 　Ｂ−１８２２本発明は受託された菌株に限定されない。なぜなら、受託された 実施態様の各々は本発明の１つの面の単一の冷時であるからである。事実、ここ に示しかつ記載したものに加えて種々の変更が上の説明および添付図面を参照し て当業者に明らかとなるからである。 ＦＩＧ、　１ 甲虫類毒性 旦・正四狐■＄ 源　：　大豆粒ダスト、カンサス 表現型　＝　２結晶／胞子のう １、菱形結晶　（Ｒ−１） 平面図　側面図 ２、　平らなダイヤモンド形結晶　（Ｆ−１）平面図　側面図 Ｇ２１５８ 毒性エ　コロラドハムシ幼虫 鱗翅類に対して無毒 ＨＤ−１及びＥＧ２１５８ のプラスミドの列 ＦＩＧ、　２ ８８Ｍｄの甲虫類毒素のプラスミドを収容するいくつかのトランスコンシュガン トのプラスミドの列ＦＩＧ、３ 産生ずる他の菌株との比較。 矢印はＥＧ２１５８よりつくられたタンパク質を示す。 ＮＢ数は新しいバチルス（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　Ｉｕｓ）分離物を示す。 ＦＩ（３ＵＲＥ　７ −ｙｃ　ＦＩＧ、８−ｔ ””　ｉｓｏ　１６０　ｘｒｏ　１都 ：ＣＧＣＡＣＴＣ７ＡＣＣＴＣＡＡＡＴ９．ＣＴＴＡＴ　ｃＴＡＡＣＴＡＴＡＧ 人ＡＴＣＡＣＡＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴ’ｒ’ａＡＪiＡ− ＦＩＧ、８−２ ＦＩＧ、８−３ Ｆｉｇ、９ ９０　９ｂ Ｆｉｇ、　１０ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年１１月６（ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１４９５ ２、発明の名称 甲虫類活性微生物、関連する殺虫剤組成物およびそれらの産生および使用の方法 ３、特許出願人 名称　エコジエン・インコーボレーチツド４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９８９年６月３０日 ６、添付書類の目録 （１）　補正書の写しく翻訳文）　１通らの産生物は有効な殺虫剤であることが 証明され、産生物は、結晶の形態でであるとき、あるいは胞子の形成と関連する とき、容易に分離され、それらは多くの科学的研究の、とくに遺伝子の分離およ びクローニングの手順に関する、主題であった。 Ｐ−１の遺伝情報を指定する遺伝子はＢ、ｔ、亜種クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋ ｉ）菌株ＨＤ−１−Ｄｉｐｅｌから分離され、モしてＥ、ｃｏｌｉ中でクローニ ングおよび発現された［５ｃｈｎｅｐｆ　ｅｔ　ａ１９、米国特許第４，４６７ ．０３６号］。タンパク質存在、Ｐ−１、は鱗翅類昆虫［スズメガ科のガ（ｔｏ ｂａｃｃｏ　ｈｏｒｎｗｏｒｍ）の幼虫］に対して毒性であることが決定された 。プロモーター領域のヌクレオチド配列およびＰ−１のための結晶質タンパク質 の解読領域の一部分は、また、決定された［Ｈ，Ｐ、Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａ＋、、 ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ 。 ）、Ｖｏｌ、２５８、Ｎ００３、ｐｐ、１９６０−１９６７　（１９８３）］。 この遺伝子の全体のヌクレオチド配列は、また、決定され、そしてそれ自体のデ ルタ−エンドトキシンタンパク質は形質転換されたＥ、ｃｏ１ｉ菌株中で発現さ れた［Ｍ、Ｊ、Ａｄａｎｇ　ｅｔ　ａ＋、、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、　Ｖｏｌ、　 ３６、ｐｐ、２８９−３００（１９８５）およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ　５８ １０　ｌ　６６５、Ｂ、ｔ、結晶タンパク質遺伝子毒素セグメント（Ｂ、ｔ−Ｃ ｒｙｓｔａｌ　ＰｒｏｔｅｉｎＧｅｎｅ　Ｔｏｘｉｎ　Ｓｅｇｍｅｎｔ）、（１ ９８５）］。 他のデルタ−エンドトキシンの形態の遺伝子は、また、Ｅ、ｃｏｌｉ中でクロー ニングおよび発現された。ｆ３．ｔ、ｖａｒ、イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌ ｅｎｓｉｓ）は、Ｅ、ｃｏｌｉベクター中に挿入された。２６，０００ダルトン のポリ、ペプチドは、このベクターで形質転換したＥ、ｃｏｌｉにより合成され た。このポリペプチドはジプレラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）（力）目に対して致死的で あることが示された。　［Ｅ。 Ｓ、Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｖｏｌ、１７５．２、ｐｐ。 ３７７−３８２．１９８４’］。この結晶タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝 子のヌクレオチド配列は、また、生ずるタンパク質配列とともに決定された［Ｃ ，Ｗａａｌｗｉｊｋ　ｅｔ　ａｌ、、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、Ｖｏｌ、１３、Ｎｏ。 ２２、ｐｐ、８２０７−８２１７　（１９８５）］、１３０ｋＤａの結晶タンパ ク質をエンコードする他のＢ、ｔ、Ｖａｒ、イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅ ｎｓｉｓ）遺伝子は、クローニングされそしてバチルス・メガテリウム（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）を形質転換するために使用された。バチルス・メガ テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅ　ｇａ　ｔ　ｅ　ｒ　ｉ　ｕｍ）およびバチル ス・スブチリス（Ｂａａ　ｉ　ｌ　ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の両者は、胞子 形成の間結晶質封入体を発現し。 前記封入体はヤブカ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔ　ｉ）の幼虫に対してであるこ とが決定された［Ｖ、５ｅｋａｒ　ｅｔ　ａｌ、、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、Ｖｏｌ 、３３、ｐｐ、１５１−１５８　（１９８５）］。 他のデルタ−エンドトキシンタンパク質の結晶は、Ｂ、ｔ、亜種ソット（ｓｏｔ ｔｏ）から誘導された。この結晶質タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子は、 ベクター中でクローニングされ、次いで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ中で発現さ れた。この遺伝子はｌｉ４．０００ダルトンのペプチド（９３４アミノ酸残基） の遺伝情報を指定する。この遺伝子のヌクレオチド配列および対応するタンパク 質のアミノ酸配列（ＤＮＡ配列から推定された）は報告された。［Ｙ、５ｈｉｂ ａｎｏ　ｅｔａ１９、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、Ｖｏｌ、　ｐｐ、２４３　２５１　 （１９８５）］。 まｔ：、他の主要なデルタ−エンドトキシンタンパク質はＢ、しいくつかの亜種 により産生されることが認識された。（Ｔ、Ｙａｍａｍｏ　ｔＯ、バイオケミカ ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）、Ｖｏｌ、１０３、Ｎｏ、　２、ｐ ｐ、４１４−４２１　（１９８１）；Ｔ。 Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、アーチーブス・オブ・バイオケミストリー・ アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、Ｖｏｌ、２２７、Ｎり、ｌ、ｐｐ、２ ２３−２４１　（１９８３）］。このデルターユエントキシンはＰ−２として同 定され、そしてＢ、ｔ、Ｖａｒ、クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）（ＨＤ−１） から分離された。このデルタ−エンドトキシンはほぼ６５．０００の分子量を有 し、モして鱗翅類および甲虫類の昆虫に対して毒性であることが知られている。 対照的に、Ｐ−１は鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目のみに対して活性であ る。 今日まで、肴な甲虫類活性有機体は分離されてきているが、毒素タンパク質およ びそれの遺伝情報を指定する遺伝子は精製および配列決定されてきていない。こ の事寅は、Ｂ、ｔ、以外の有機体において、この独特に活性なデルタ−エンドト キシンタンパク質を発するのための手段の提供を不可能にする。甲虫類活性タン パク質毒素の遺伝情報を指定するギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を準備し、前記遺伝子はプラスミド上に位置し、前記バチ ルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌 株は、鱗翅類の昆虫に対する殺虫活性を有する他のバチルス・スリンギエンシス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株と接合に好適な条件下 に混合されており、そして （ｂ）工程（ａ）の培養混合物から、鱗翅類および甲虫類の両者の昆虫に対する 活性を有するトランスコンシュガント（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）を分離 する、 からなる、甲虫類および鱗翅類の両者の昆虫に対する殺虫活性を有するバチルス ・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を産生 する方法を提供する。 この方法は、好ましい実施態様において、また、中間の菌株を利用して、甲虫類 または鱗翅類の毒素をコード（ｃ　ｏ　ｄ　ｅ）するプラスミドを他の中間の受 容体菌株に転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）するか、あるいは直接、既に少なくとも１ つの他の毒素をエンコードするプラスミドを含有するであろう、究極的に所望の トランスコンシュガントの宿主に転移する。 前述の一般的方法は、甲虫類昆虫に対する活性を有する工程（ａ）のバチルス・ スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株が、 鱗翅類活性毒素の遺伝情報を指定する少なくとも１つの遺伝子により与えられた 鱗翅類昆虫に対する活性をさらに有し、これにより工程（ｂ）の前記トランスコ ンシュガントは少なくとも３つの毒素遺伝子により与えられた鱗翅類および甲虫 類活性を有する、実施態様を包含する。 ５．６　ｃｒｙｃ遺伝子のための濃縮しずこプラスミドライブラリーの構オリゴ ヌクレオチドプローブを使用して、ｃｒｙｃ遺伝子の少なくともＮＨ２−末端解 読領域を含有する、Ｂ、ｔ、ＤＮＡの制限断片の大きさを決定した。この決定の ため、甲虫類毒性菌株である菌株ＥＧ２１５８をＤＮＡ源として使用した。Ｂ、 ｔ、菌株ＨＤ−１，すなわち、親菌株ＨＤ−１から直接誘導した単一のコロニー 分離物（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ。 テキサス州ブラウンスビレ）を対照として使用した。 ＬＢ培地中で３０℃において中央対数期に細胞を増殖させた後、ＤＮＡを供与体 菌株ＥＧ２１５８から分離した。細胞を遠心により収穫し、５０ミリモルのトリ ス−ＨＣｌ、１０ミリモルのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍａのリゾチーム中に再懸濁し 、そして３７℃において６０分間インキュベージタンした。細胞をＮａＤｏｄｅ Ｓｏ４の０．２％の最終濃度への添加により溶菌した。細胞のリゼイトを等しい 体積の７エノールで２回およびクロロホルム／イソアミルアルコール（２４／１ ）で１回抽出し。 た。ｌ／体積の３モルの酢酸ナトリウムおよび２体積のＥｔＯＨをリゼイトに添 加し、そしてＤＮＡをガラス捧で巻き取って抽出した。巻き取り？−ＤＮＡを６ ６％のＥｔＯＨで５分間およびジエチルエーテル中で１分間ソーキングした０巻 き取ったＤＮＡを空気乾燥し、そして脱イオン水中に再懸濁した。 ハイブリダイゼーシ１ン実験は、供与体菌株の各々からの合計ＤＮＡをＨｉｎｄ ｌｒｌ制限酵素で消化し、消化したＤＮＡをアガａ−スゲルで電気泳動し、そし てＤＮＡをアガロースゲルからニトロセルロースのフィルターにサザンブＯ−／ ト技術（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、９８：５０３−５１７．１９７８）により 移した。ニトロセルロースのフィルターｔ−３２°ｃにＢいて１６時間３ＸＳＳ Ｃ溶液（ＩＸｓｓｃ−０，１５好ましい殺虫剤配合物は、ＥＣ２１５８単独また はその突然変異体、組み換え体または遺伝子操作した誘導体を有効量でまたは甲 虫類活性毒素単独でまたは他の有機体（すなわち、形質転換した有機体またはト ランスコンシュガント）中に組み込むか、あるいはそれと関連させて、所望の担 体と混合することによって調製する。配合物はダストとしてまたは油（植物性ま たは鉱物性）または水中の懸濁液、湿潤性または農業の用途に適当な他の材料中 において、適当な担体アジュバントを使用して投与することができる。適当な担 体は、固体または液状であり、そして配合技術において本来使用されている物質 、例えば、天然または再生の鉱物性物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、増粘剤、結合 剤または肥料に相当することができる。 一般に、好ましい組成は、通常Ｌ　１〜９９％、１〜５０％の殺虫剤微生物、例 えば、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ）またはそれと他の活性成分との組み合わせ、１〜９９．９％の固体また は液体のアジュバント、および０〜２５％、好ましい０．１〜２０％の界面活性 剤を含有する。 固体または液体のアジュバントを含有する配合物は、既知の方法において、例え ば、活性成分を増量剤、例えば、溶媒、固体担体、およびある場合において、表 面活性化合物（界面活性剤）と均質に混合および／または粉砕することによって 調製される。 適当な液状担体は、植物性油、例えば、ヤシ油または大豆油、鉱油または水であ る。例えば、ダストおよび分散性粉末のために使用する固体の担体は、通常天然 の鉱物繊維、例えば、方解石、タルク、カオリンまたはアタパルジャイトである 。物理学的性質を改良するために、また高度に分散しＩ：ケイ酸または高度に分 散した吸収性ポリマーを添加することが可能である。適当な粉砕した吸着性担体 は多孔質のタイプ、例えば、軽石、破壊煉瓦、セピオライトまたはベントナイト である。適当な非吸着性担体はケイ酸塩または砂のような材料である。さらに、 多数の予備造粒した材料または無機または有機の混合物、例えば、ことにドロマ イトまたは粉砕した植物残留物を使用することができる。 配合すべき活性成分の性質に依存して、適当な表面活性化合物はすぐれた乳化性 、分散性および湿潤性を有する非イオン性、陽イオン性および／まｔ；は陰イオ ン性である。用語「界面活性剤」は、また、界面活性剤の混合物からなるとして 理解されるであろう。 適当な陰イオン性界面活性剤は、水溶性の石鹸および水溶性の表面活性化合物で あることができる。 適当な石鹸は高級脂肪酸（Ｃ＋。−０８１）のアルカリ金属塩、アルカリ土類金 属塩または非置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸、ま たは、例えば、ヤシ油またはタロウ油から得ることができる天然の脂肪酸の混合 物のナトリウム塩またはカリウム塩である。さらに安定な界面活性剤は、また、 脂肪酸のメチルタウリン塩ならびに変性および未変性のリン脂質である。 しかしながら、より頻繁に、いわゆる合成界面活性剤、ことに脂肪族スルホネー ト、脂肪族サルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキル アリールスルホネートを使用する。 脂肪族スルホネートまたはサルフェートは、通常、アルカリ金属塩、アルカリ土 類金属塩または非置換アンモニウム塩の形態であり、そして一般ｊこドデシル硫 厳のｃｓ　ｃｚｘアルキルエステル、ナトリウムまたはカリウム塩、あるいは脂 肪酸から得られたアルコールサルフェートの混合物である。これらの化合物は、 また、脂肪族アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸エステルおよび スルホン酸の塩類の混合物からなる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、 好ましくは、２つのスルホン酸基および１つの脂肪酸基（約８〜２２個の炭素原 子を含有する）を含有する。アルキルアリールスルホネートの例は、ドデシルベ ンゼンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、またはす７タレンスルホン 酸／ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウムまｔ；はトリエタノ ールアミン塩である。まｔ：、対応するホスフェート、例えば、ｐ−ノニルフェ ノールと４〜１４モルのエチレンオキシドリン酸エステルの塩との付加物のリン 酸エステルの塩類は適当である。 非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ポリグリコールエーテル誘導体または脂 肪族または環式脂肪族のアルコールまたは飽和または不飽和の脂肪酸およびアル キルフェノールであり、前記誘導体は３〜１０のグリコールエーテル基および（ 脂肪族）炭化水素部分中に８〜２０個の炭素原子およびアルキルフェノールのア ルキル部分中に６〜１８１ｍ！（７）炭。 素原子を含有する。 他の適当な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドとアルキルプロピレ ングリコール、エチレンジアミノポリプロピレングリコールとの水溶性付加物で あり、そしてアルキルポリプロピレングリコールは１〜１０個の炭素原子をアル キル鎖中に含有し、前記付加物は２０〜２５０のエチレングリコールエーテル基 および１０〜１００プロピレングリコールエーテル基を含有する。 非イオン性界面活性剤の代表的例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノール 、ヤシ油、グリコールエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物 、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、エチレングリコールおよびオ クチルフェノキシエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソルビタンの 脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートは、ま た、適当な非イオン性界面活性剤である。 ｐＥＧ２１３をバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉ ｕｍ）中に形質転換しくＡＴＣＣＮｏ、３５９８５）そしてｐＥＧ２１３を収容 する１つのテトラサイクリン抵抗性形質転換体（受は入れ番号ＥＧｌ１３１４） はそれ以上の研究のために選択した。 この実施例は、クローニングしたｃｒｙｃ遺伝子が組み換え体バチルス・メガテ リウム（Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）菌株ＥＧＩ　１３１４　ＣｐＥＧ２１３） 中で発現されるかどうかを決定した。遺伝子の発現は、ＮａＤｏｄｅｓＯ＋／ポ リアクリルアミドゲルの電気泳動により測定した。 一般に、技術は細胞リゼイトの調製物、Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　ｅ　Ｓ　Ｏ４／ポ リアクリルアミドゲルを通す細胞リゼイトの電気泳動およびタンパク質を可視化 するためのゲルの染色を包含した。 詳しくは、技術は次のようにして突施した：バチルス・メガテリウム（Ｂ、ｍｅ ｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞を１０ｍｇ／ｒ＋Ｊのトテラサイクリンを含有するＤＳ 板上で４８時間３０℃において増殖させた。バチルス・スリンギエンシス（Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株ＥＧ２１５８を、ＤＳ板がテトラサイクリン を含有しない以外、バチルス・メガテリウム（Ｂ、　ｍｅ　ｇａ　ｔ　ｅ　ｒ　 ｉ　ｕｍ）と同様に増殖させた。この期間後、はとんどすべての細胞は満足な静 止発育期に入った。細胞をスパチュラで収穫し、そして脱イオン水中に再懸濁し た。細胞懸濁の一部分を１：２体積二体積に予熱した（７０℃）ゲル装入緩衝液 （５％のベーターメルカプトエタノール、２％のＮａＤｏｄｅＳＯい６０ミリモ ルのトリス　ｐＨ６，訳　１０％のグリセロール）と混合し、そして７０℃にお いて７分間インキュベーションした。懸濁液を短時間遠心し、遠心後、上澄み液 ＮａＤｏｄｅＳＯ，／ポリアクリルアミドゲル上に直ちに装入し、そして上澄み 液中のタンパク質をラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）ジャーナル・オブ・モレキュラ ー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、８０：５７５−５９９）に従い ゲル電気泳動により再溶解した。ゲル中のタンパク質をゲルのクーマツシー（Ｃ Ｏｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ）　色素による染色により可視化した。 第１Ｏ図は、前述のようにして調製したＮａＤｏｄｅＳＯｍ／ポリアクリルアミ ドゲルの写真である。第１０図における標識した５ＴＮＤは、タンパク質の分子 量の標準を含有した。 バクテリア細胞の懸濁液を、飼料供給カップ中の３ｍＱの固体の寒天−基本人工 規定食に局所的に適用した。１つのＣＰＢの新生幼虫を１つのカップにつき添加 し、そして死亡率のスコアを７日後に付けた（表Ｖｌ）。 投与−ｍｇ細胞／ｍ１２ＣＰ　Ｂの幼虫死亡数／合計 ＥＧ］１３１１　（ｐＢｃ１６ 一対照）−０，ｍｇ／カップ　３１５０ＥＧＩ　１３１４　（ｐＥＧ２１３ −ｃｒｙＣ）　０．２ｍｇ／カップ　４９１５０広範な種類の胞子形成および非 胞子形成の両者の微生物は前述したようにｃｒｙＣ遺伝子で形質転換したことは 、本発明の範囲内である。操作したｃｒｙｃ遺伝子の微生物の例は、バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属からのも のである。 本発明における好ましい使用は、有機体バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。さらに、また、次のバチルス・スリンギ エンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガ テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびＥ、ｃｏｌｉ医株 は、本発明における使用に好ましくかつ列挙したプラスミドが農業研究培養収集 所（ＮＲＲＬ）（イリノイ州ペオリア）に受託されかつ次の受け入れ番号を割り 当てられた：請求の範囲 １、甲虫類活性のエンドトキシンを獲得したプラスミドＩこより産生する、鱗翅 類および甲虫類の昆虫に対する殺虫活性を有するタンパク質エンドトキシンを産 生するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ）バクテリウム０２、甲虫類活性のエンドトキシンは甲虫類エンドトキシ ンをエンコードするプラスミドにより産生され、前記プラスミドはＮＲＲＬに受 託され、そして受け入れ番号Ｂ−１８２１３を割り当てられた、バチルス・スリ ンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株ＥＧ２１ ５８の特性である、請求の範囲第１項記載のバチルス・スリンギエンシス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）。 ３、プラスミドは約８８ＭＤａの大きさである、請求の範囲第２項記載のバチル ス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）。 ４、バクテリウムはバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）種りルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）である、請求の範囲第り 項記載のバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ ｎｓｉｓ）−５、バクテリウムはＮＲＲＬに受託されており、そして受け入れ番 号Ｂ−１８２１２を割り当てられているか、あるいはその突然変異体、組み換え 体または遺伝子操作誘導体である、請求の範囲第１記載のバチルス・スリンギエ ンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉＳ）バクテリウム。 ６、バクテリウムはＮＲＲＬに受託されており、そして受け入れ番号Ｂ−１８２ １４を割り当てられているか、あるいはその突然変異体、組み換え体または遺伝 子操作誘導体である、請求の範囲第１記載のバチルス・スリンギエンシス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉＳ）バクテリウム。 ７、請求の範囲第１項記載のＢｔバクテリアおよび農学的に許容されうる担体の 混合物からなる、甲虫類および鱗翅類の昆虫を抑制するだめの殺虫剤。 ８、請求の範囲第５項記載のＢｔバクテリアおよび農学的に許容されうる担体の 混合物からなる、甲虫類および鱗翅類の昆虫を抑制するための殺虫剤。 ９、請求の範囲第６項記載のＢｔバクテリアおよび農学的に許容されうる担体の 混合物からなる、甲虫類および鱗翅類の昆虫を抑制するための殺虫剤。 １０、　工程二 少なくとも１つの鱗翅類毒素をエンコードするプラスミドを含有するが、甲虫類 活性毒素をエンコードするプラスミドを有さないことを特徴とする、バチルス・ スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）受容体菌 株を準備し、ＮＲＲＬに受託され、そして受け入れ番号Ｂ−１８２１３を割り当 てられた、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）菌株ＥＧ２１５ｇの特性である甲虫類毒素をエンコードするプラス ミドを有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ）供与体菌株を準備し、前記２つのバチルス・スリンギエンシス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒ　ｉｎｇｉｅｎｓ　ｉ　ｓ）菌株を、プラスミドの 接合転移（ｃｏｎｊｕｇａｔ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）を誘発する条件下にきわめて 接近させて導入して、甲虫類毒素をエンコードするプラスミドの前記受容体菌株 中への転移を実施し、そして 鱗翅類および甲虫類に対する殺虫活性を有するタンパク質エンドトキシンを産生 する、トランスコンシュガン）　（ｔ　ｒａｎｓｃｏｎ　ｊｕｇａｎｔ）のバチ ルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌 株を分離および回収する、からなる、鱗翅類および甲虫類の昆虫に対する殺虫活 性を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉＳ）バクテリウムを産生ずる方法。 １１、工程： 転移可能な鱗翅類毒素をエンコードするプラスミドを有する第２バチルス・スリ ンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）供与体菌株を 準備し、 第２バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ ｉｓ）供与体菌株を、プラスミドの接合転移を誘発する条件下に前記トランスコ ンシュガントのバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ）菌株にきわめて接近させて導入して、鱗翅類毒素をエンコード するプラスミドの前記第２供与体菌株からトランスコンシュガント菌株中への転 移を実施し、そして多数の鱗翅類毒素をエンフードするプラスミドを含有しかつ 鱗翅類および甲虫類の昆虫に対する殺虫活性を有する、トランスコンシュガント のバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ ｓ）菌株を回収する、 をさらに含む、請求の範囲第１Ｏ項記載の方法。 １２、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ）供与体菌株はＥＧ２１５８であり、ＮＲＲＬに受託されておりそして受 け入れ番号Ｂ−１８２１３が割り当てられている、請求の範囲第１Ｏ項記載の方 法。 １３、ＮＲＲＬに受託されており、そして受け入れ番号Ｂ−１８２１３を割り当 てられているバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ）バクテリウム、あるいはその突然変異体、組み換え体または遺伝 子操作誘導体。 １４、請求の範囲第１３項記載のＢｔバクテリアおよび農学的に許容されうる担 体の混合物を含有する、甲虫類の昆虫を抑制するための殺虫剤。 手続補正書 平成１年１１月１８日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０　ｌ　４９５ ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　エコジエン・インコーホレーテッド４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　なし ６、補正の対象 「請求の範囲」の欄 ７、補正の内容 別紙記載の通り「請求の範囲」の欄を 「　１、甲虫類活性のエンドトキシンを獲得したプラスミドにより産生ずること を特徴とする、鱗翅類および甲虫類の昆虫に対する殺虫活性を有す２、甲虫類活 性のエンドトキシンは甲虫類エンドトキシンをエンコードするプラスミドにより 産生され、前記プラスミドはＮＲＲＬに寄託され、そして受け入れ番号Ｂ−１８ ２１３を割り当てら２１５８の特性である、ことを特徴とする請求の範囲第１項 記載のバチルス・スリンギエンシス３、プラスミドは約８８ＭＤａの大きさであ るｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ａ ５、バタテリウムはＮＲＲＬに寄託されており、そして受け入れ番号Ｂ−１８２ １２を割り当てられているか、あるいはその突然変異体、組み換え体または遺伝 子操作誘導体であることを特徴とす６、バタテリウムはＮＲＲＬに寄託されてお り、そして受け入れ番号Ｂ−１８２１４を割り当てられているか、あるいはその 突然変異体、組み換え体または遺伝子操作誘導体であることを特徴とすｎ５ｉｓ ）バタテリウム。 ７、請求の範囲第１項記載のバチルス・スリンれうる担体の混合物を含有するこ とを特徴とする、甲虫類および鱗翅類の昆虫を抑制するための殺虫剤。 れうる担体の混合物を含有することを特徴とする、甲虫類および鱗翅類の昆虫を 抑制するための殺虫剤。 れうる担体の混合物を含有することを特徴とする、甲虫類および鱗翅類の昆虫を 抑制するための殺虫剤。 １０、工程： 少なくとも１つの鱗翅類毒素をエンコードするプラスミドを含有するが、甲虫類 活性毒素をエンコードするプラスミドを有さないことを特徴とすを準備し、 ＮＲＲＬに寄託され、そして受け入れ番号Ｂ−虫類毒素をエンコードするプラス ミドを有するが−し、 前記２つのバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）菌株を、プラスミドの接合転移（ｃｏｎｊｕｇａｌｔｒａｎｓｆｅ ｒ）を誘発する条件下にきわめて接近させて導入して、甲虫類毒素をエンコード するプラスミドの前記受容体菌株中への転移を実施し、そして 鱗翅類および甲虫類に対する殺虫活性を有するタンパク質エンドトキシンを産生 する、トランスコンシュガント（ｔ　ｒａｎｓｃｏｎ　ｊｕｇａｎｔ）よび回収 する、 を特徴とする、鱗翅類および甲虫類の昆虫に対す転移可能な鱗翅類毒素をエンコ ードするプラス供与体菌株を準備し、 株を、プラスミドの接合転移を誘発する条件下にギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ｔｈｕｒｉｎｇて、鱗翅類毒素をエンコードするプラスミドの前記第２供与体 菌株からトランスコンシュガント菌株中への転移を実施し、そして 多数の鱗翅類毒素をエンコードするプラスミドを含有しかつ鱗翅類および甲虫類 の昆虫に対するをさらに特徴とする、請求の範囲第１Ｏ項記載の菌株はＥＧ２１ ５８であり、ＮＲＲＬに寄託されておりそして受け入れ番号Ｂ−１８２１３が割 り当てられていることを特徴とする請求の範囲第１Ｏ項記載の方法。 １３、ＮＲＲＬに寄託されており、そして受けチルス・スリンギエンシス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バタテリウム、あるいはその突然変 異体、組み換え体または遺伝子操作誘導体。 ｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリアおよび農学的に許容されうる担体の混合物を含有 することを特徴とする、甲虫類の昆虫を抑制するための殺虫剤。」国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第８図のヌクレオチド５６９〜２５００のＤＮＡ配列またはその一部分また は誘導を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ）デルターェンドトキシンの遺伝子。 ２、前記遺伝子は第８図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝情報を指定す る、請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ３、前記タンパク質は殺虫活性を有する、請求の範囲第２項記載の遺伝子。 ４、前記殺虫活性は甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）に対して有効である、請求 の範囲第３項記載の遺伝子。 ５、前記ＤＮＡ配列は組み換えプラスミド中に挿入されている、請求の範囲第１ 項記載の遺伝子。 ６、前記プラスミドは、前記ＤＮＡ配列の挿入後、微生物の少なくとも２つの異 なる種のＤＮＡから構成されている、請求の範囲第５項記載の遺伝子。 ７、前記プラスミドは、前記ＤＮＡ配列の挿入後、微生物の同一種の少なくとも ２つの異なる亜種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第５項記載の遺 伝子。 ８、前記ＤＮＡ配列はその自然プロモーターＤＮＡ配列に組み込まれている、請 求の範囲第１項記載の遺伝子。 ９、前記ＤＮＡ配列は外来プロモーターＤＮＡ配列に組み込まれている、請求の 範囲第１項記載の遺伝子。 １０、第８図のアミノ酸配列またはその一部分または誘導体を有するタンパク質 。 １１、前記タンパク質は殺虫活性を有する、請求の範囲第１０項記載のタンパク 質。 １２、前記殺虫活性は甲虫類に対して有効である、請求の範囲第１１項記載のタ ンパク質。 １３、前記タンパク質は、工程： ａ）微生物を第８図のヌクレオチド５６９〜２５０３の遺伝子で形質転換し、 ｂ）前記形質転換した微生物を成長させ、これにより工程ａ）の遺伝子によりエ ンコードされるタンパク質を前記微生物において発現させ、そして ｃ）工程ｂ）において発現されたタンパク質を前記有機体から抽出および分離す る、 からなる方法によって産生される、請求の範囲第１０項記載のタンパク質。 １４、工程ａ）の前記遺伝子はプラスミド上に位置する、請求の範囲第１３項記 載のタンパク質。 １５、前記プラスミドは、前記遺伝子を含むとき、微生物の少なくとも２つの異 なる種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第１４項記載のタンパク質 。 １６、前記プラスミドは、前記遺伝子を含むとき、微生物の少なくとも２つの異 なる亜種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第１４項記載のタンパク 質。 １７、前記タンパク質は非胞子形成微生物において発現される、請求の範囲第１ ３項記載のタンパク質。 １８、遺伝子はその自然プロモーターにより制御される、請求の範囲第１５およ び１６項記載のタンパク質。 １９、遺伝子は外来プロモーターにより制御される、請求の範囲第１５および１ ６項記載のタンパク質。 ２０、前記タンパク質は胞子形成微生物において発現される、請求の範囲第１９ 項記載のタンパク質。 ２１、タンパク質は前記微生物の非胞子形成発育期の間に発現される、請求の範 囲第１８項記載のタンパク質。 ２２、前記タンパク質は前記微生物の溶菌により工程ｃ）において抽出される、 請求の範囲第１３項記載のタンパク質。 ２３、前記タンパク質は実質的に純粋な形態である、請求の範囲第１０項記載の タンパク質。 ２４、工程： ａ）第８図のヌクレオチド５６９〜２５０３のＤＮＡ配列を有する前記デルター エンドトキシンの遺伝子をプラスミド中に挿入し、ｂ）微生物を工程ａ）のプラ スミドで形質転換し、そしてｃ）工程ｂ）の形質転換された微生物を成長させ、 これにより前記デルターエンドトキシンを前記微生物中で発現される、からなる 、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）デルターエンドトキシンを産生する方法。 ２５、前記遺伝子は第８図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝情報を指定 する、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６、前記プラスミドは、前記デルターエンドトキシン遺伝子の挿入後、微生物 の少なくとも２つの異なる種のＤＮＡから構成されている、請求の範囲第２４項 記載の遺伝子。 ２７、前記プラスミドは、前記デルターエンドトキシン遺伝子の挿入後、微生物 の同一種の少なくとも２つの異なる亜種のＤＮＡから構成されている、請求の範 囲第２４項記載の方法。 ２８、前記ＤＮＡ配列はその自然プロモーターＤＮＡ配列に組み込まれている、 請求の範囲第２４項記載の方法。 ２９、前記ＤＮＡ配列は外来プロモーターＤＮＡ配列にに組み込まれている、請 求の範囲第２４項記載の方法。 ３０、前記微生物は非胞子形成微生物である、請求の範囲第２４項記載の方法。 ３１、前記微生物は胞子形成微生物である、請求の範囲第２４項記載の方法。 ３２、デルターエンドトキシンは前記微生物の非胞子形成発育期の間に発現され る、請求の範囲第３０項記載の方法。 ３３、前記デルターエンドトキシンは前記微生物の溶菌により微生物から抽出さ れる、請求の範囲第２４項記載の方法。 ３４、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ）デルターエンドトキシンおよび適当な担体の混合からなる、甲虫類に対 する使用に適当な殺虫剤。 ３５、前記デルターエンドトキシンはバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の胞子に関連する、請求の範囲第３４項記 載の殺虫剤。 ３６、デルターエンドトキシンは均質な調製物である、請求の範囲第３４項記載 の殺虫剤。 ３７、デルターエンドトキシンはバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子および培養したバチルス・スリンギエンシ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）有機体の混合物中に含有さ れている、請求の範囲第３４項記載の殺虫剤。 ３８、デルターエンドトキシンは非胞子形成微生物に関連する、請求の範囲第３ ４項記載の殺虫剤。 ３９、デルターエンドトキシンは胞子形成微生物に関連する、請求の範囲第３４ 項記載の殺虫剤。 ４０、担体は液状担体である、請求の範囲第３４項記載の殺虫剤。 ４１、液状担体は１種または２種以上の界面活性剤を含有する、請求の範囲第４ ０項記載の殺虫剤。 ４２、担体は固体の担体である、請求の範囲第３４項記載の殺虫剤。 ４３、固体の担体は、方解石、タルク、カオリン、アタパルジャイト、ケイ酸塩 、砂、ドロマイト、および植物残留物の粉砕物から成る群より選択される、請求 の範囲第４２項記載の殺虫剤。 ４４、固体の担体は造粒した吸着性担体である、請求の範囲第４２項記載の殺虫 剤。 ４５、造粒した吸着性担体は、軽石、破壊煉瓦、海泡石、およびベントナイトか ら成る群より選択される、請求の範囲第４４項記載の殺虫剤。 ４６、界面活性剤をさらに含む、請求の範囲第４４項記載の殺虫剤。 ４７、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する組み換えベクタ４８、請求 の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する非胞子形成微生物。 ４９、前記微生物はＥ．ｃｏｌｉである、請求の範囲第４８項記載の非胞子形成 微生物。 ５０、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する胞子微生物。 ５１、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ ｉｓ）およびシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）から成る群より 選択される請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する微生物。 ５２、ＮＲＲＬに受託されかつ受け入れ番号Ｂ−１８２１１を割り当てられた大 腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）パクテリウム、またはその突然変異体 、組み換え体、または遺伝子操作誘導体。 ５３、ＮＲＲＬに受託されかつ受け入れ番号Ｂ−１８２１０を割り当てられたバ チルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）パクテリウム 、またはその突然変異体、組み換え体、または遺伝子操作誘導体。 ５４、ＮＲＲＬに受託されかつ受け入れ番号Ｂ−１８２１３を割り当てられたバ チルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）パ クテリウム、またはその突然変異体、組み換え体、または遺伝子操作誘導体。 ５５、配列： ５′−ＧＡＴＧＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＴ ＧＴＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡ−３′ま たはその誘導体 からなる甲虫類活性デルターエンドトキシンの遺伝情報を指定する遺伝子のため のオリゴヌクレオチドプローブ。 ５６、前記プローブは標識されている、請求の範囲第５５項記載のオリゴヌクレ オチドプローブ。 ５７、前記プローブは放射線標識で標識されている、請求の範囲第５６項記載の オリゴヌクレオチドプローブ。 ５８、前記ＤＮＡまたはその一部分または誘導体は標識されている、請求の範囲 第１項記載のＤＮＡ配列から構成された甲虫類毒素遺伝子特異的プローブ。 ５９、前記ＤＮＡまたはその一部分または誘導体は放射線標識で標識されている 、請求の範囲第５８項記載のプローブ。 ６０、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列で形質転換された植物。 ６１、前記植物は第８図のデルターエンドトキシンまたはその一部分を産生する 、請求の範囲第６０項記載の植物。 ６２、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ）から成る群より選択される昆虫に対する活性を有するバチルス・スリンギエン シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリア。 ６３、前記バクテリアはＮＲＲＬに受託されており、そして受け入れ番号Ｂ−１ ８２１２を割り当てられているか、あるいはその突然変異体、組み換え体または 遺伝子操作誘導体である、請求の範囲第６２項記載のバチルス・スリンギエンシ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリア。 ６４、前記バクテリアはＮＲＲＬに受託されており、そして受け入れ番号Ｂ−１ ８２１４を割り当てられているか、あるいはその突然変異体、組み換え体または 遺伝子操作誘導体である、請求の範囲第６２項記載のバチルス・スリンギエンシ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリア。 ６５、甲虫類（ＣｏｌｅｏＰｔｅｒａ）の生息場所に有効量の請求の範囲第５４ 項記載のバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ）を適用することからなる、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）目の昆虫を 抑制する方法。 ６６、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ）の生息場所に有効量の請求の範囲第６２項記載のバチルス・スリンギエンシス （Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を適用することからなる、鱗 翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の目の 昆虫を抑制する方法。 ６７、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の生息場所に有効量の請求の範囲第５２ 項記載の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を適用することからなる、 甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）目の昆虫を抑制する方法。 ６８、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の生息場所に有効量の請求の範囲第５３ 項記載のバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を 適用することからなる、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）目の昆虫を抑制する方 法。 ６９、工程： （ａ）甲虫類活性毒素のタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子により与えられ た甲虫類の昆虫に対する殺虫活性を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を準備し、前記遺伝子はプラスミ ド上に位置し、前記バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は、鱗翅類の昆虫に対する殺虫活性を有する他のバチル ス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株と 接合に好適な条件下に混合されており、そして （ｂ）工程（ａ）の培養混合物から、鱗翅類および甲虫類の両者の昆虫に対する 活性を有するトランスコンジュガント（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）を分離 する、 からなる、甲虫類および鱗翅類の両者の昆虫に対する殺虫活性を有するバチルス ・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を産生す る方法。 ７０、甲虫類活性を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株をまず中間受容体のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）菌株と混合し、これにより中間受容体のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株は 甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）に対する殺虫活性を与えるプラスミドを接合に より獲得し、次いで前記トランスコンジュガント菌株を鱗翅類活性を有する前記 バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） と接台に好適な条件下に混合し、これにより鱗翅類活性を有する前記バチルス・ スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は前記 トランスコンジュガント菌株から甲虫類活性を与えるプラスミドを獲得する、こ とをさらに含む請求の範囲第６９項記載の方法。 ７１、甲虫類昆虫に対する活性を有する工程（ａ）のバチルス・スリンギエンシ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は、鱗翅類活性毒素の 遺伝情報を指定する少なくとも１つの遺伝子により与えられた鱗翅類昆虫に対す る活性をさらに有し、これにより工程（ｂ）の前記トランスコンジュガントは少 なくとも３つの毒素遺伝子により与えられた鱗翅類および甲虫類活性を有する、 請求の範囲第６９項記載の方法。 ７２、工程（ａ）の前記バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は、１より多い毒素遺伝子により与えられた鱗翅類 昆虫に対する活性を有し、これにより工程（ｂ）の前記トランスコンジュガント は少なくとも３つの毒素遺伝子により与えられた鱗翅類および甲虫類活性を有す る、請求の範囲第６９項記載の方法。