So
wurde beispielsweise das Sexualhormon 17β-Östradiol in Kläranlagenabläufen nachgewiesen.
Es ist also davon auszugehen, dass diese Stoffe in der Kläranlage
nicht vollständig
eliminiert werden und folglich in Oberflächengewässer gelangen können. Seit
den dreißiger
Jahren ist außerdem
bekannt, dass nicht-steroidale Chemikalien wie Eisphenol-A ähnlich wirken
können
wie die körpereigenen
weiblichen Sexualhormone des Menschen und aller Wirbeltiere. In
den sechziger Jahren wurde die östrogene
Aktivität
von Organochlorinsektiziden wie Methoxychlor und DDT sowie für einige
technische PCB-Mischungen entdeckt. Bis heute ist für mehr als
40 nicht-steroidale Chemikalien eine östrogenartige Wirkung in vitro
und zum Teil auch in vivo nachgewiesen. Daneben besitzen auch zahlreiche
Pflanzeninhaltsstoffe die Fähigkeit,
die Wirkung der weiblichen Sexualhormone nachzuahmen (Phytoöstrogene).
Östrogene
Substanzen in der Umwelt lassen sich in natürliche, synthetische und Xenoöstrogene
einteilen. Zu den natürlichen
Verbindungen zählen
endogene Östrogene,
von Menschen und Tieren gebildete Steroide (z.B. 17β-Östradiol, Östriol, Östron),
Phyto- und Mykoöstrogene
sowie von Pflanzen und Pilzen gebildete Verbindungen (Isoflavone).
Bei den natürlichen
Verbindungen handelt es sich um Östrogene,
die für
die Reproduktion und damit für
die Arterhaltung generell von Bedeutung sind. In die Umwelt gelangen
endogene Östrogene
in Form von im Körper
gebildeten inaktiven Metaboliten (Glucuronide, Sulfate) als konjugierte
Ausscheidungsprodukte über
den Ham. Dabei beträgt
die Menge je nach Zyklusphase der Frau zwischen 25 und 100 μg pro Tag.
Während
der Schwangerschaft erfolgt dann ein Anstieg auf täglich bis
zu 30 mg. Es wird vermutet, dass das Auftreten von freien endogenen Östrogenen
in der aquatischen Umwelt von einer Dekonjugation durch Bakterien
wie z.B. Escherichia coli herrührt.
Aber auch im menschlichen Körper
können
die Metabolite bereits gespalten und somit in ihre aktive Form zurückgeführt werden.
Eine weitere entscheidende Quelle für endogene Östrogene stellt die landwirtschaftliche
Tierhaltung von Rindern, Schweinen, Pferden und Schafen dar. Der
Eintrag in Grund- und Oberflächengewässer erfolgt
durch Ausbringung von Gülle
auf Äcker und
Felder.
So
konnte bei einem Versuch, der die Kläranlagenbedingungen simulieren
sollte, der Abbau von 17β-Östradiol
innerhalb von einer Woche über
das Zwischenprodukt Östron
nachgewiesen werden. Im Kläranlagenablauf
und in Oberflächengewässern aus
Nordrhein-Westfalen
und Hessen wurden nur die unwirksameren Metabolite Östron mit
einer Maximalkonzentration von 76 ng/l sowie Östriol mit bis zu 42 ng/l gefunden. Zur
Feststellung der östrogenen
Wirksamkeit dieser Wasserproben wurde der Hefezell-Assay eingesetzt.
Die natürlichen Östrogene
und allen voran 17β-Östradiol
wurden bereits mit nahezu allen bekannten in vivo- und in vitro-Testansätzen auf
ihre östrogene
Wirksamkeit überprüft. So bestätigten beispielsweise
1998 Studien, dass die in der Umwelt vorkommenden Konzentrationen
für eine
Induktion der Vitellogeninsynthese bei der männlichen Regenbogenforelle
ausreichend hoch sind (1–10
ng/l für
17β-Östradiol).
Normalerweise wird Vitellogenin, eine Vorstufe des Eidotterproteins,
lediglich von weiblichen, eierlegenden Vertebraten unter dem Einfluss
von Östrogenen
synthetisiert.
Synthetische Östrogene
sind z.B. Kontrazeptiva und Medikamente mit zielgerichteter hormoneller
und pharmakologischer Wirkung, die medizinisch bzw. veterinärmedizinisch
eingesetzt werden.
Das
synthetische Östrogen
Ethinylöstradiol
(EE2) zeigte in Kläranlagen
ein deutlich schlechteres Abbauverhalten als natürliche Östrogene. In einem Experiment
konnte gezeigt werden, dass 17β-Östradiol
mit einer Anfangskonzentration von 30 ng/l bereits nach 3 Tagen vollständig abgebaut
wurde. EE2 dagegen wurde erst nach 28 Tagen zu etwa 80%, Mestranol
im gleichen Zeitraum sogar nur zu 20% abgebaut. Letzteres wird durch
Abspaltung der Methylfunktion im Phenol-A-Ring in das stabilere
EE2 umgewandelt. Es zeigte sich zu dem, dass eine Eliminierung von
synthetischen Östrogenen
während
des Aufbereitungsprozesses in der Kläranlage vor allem durch Adsorption
an Klärschlamm
stattfindet.
Als
Xenoöstrogene
bezeichnet man strukturell unterschiedliche, von Menschen erzeugte
Chemikalien, welche das Verhalten des weiblichen Geschlechtshormons
17β-Östradiol
in Zellen der Zielorganismen nachahmen. In den letzten Jahren wurde
verstärkt
der Versuch unternommen, die Interaktionen zwischen den verschiedenen östrogen
wirkenden Industriechemikalien und den endokrinen Systemen von Mensch
und Tier zu untersuchen. Im folgenden werden exemplarisch aus der
Literatur bekannte Befunde einiger Xenoöstrogene vorgestellt.
Eisphenol-A
(BPA) besitzt zwar eine nur relativ geringe östrogene Aktivität, auf Grund
seiner sehr weiten Verbreitung in der Umwelt ist es in diesem Zusammenhang
jedoch nicht ohne weiteres vemachlässigbar. So wurden z.B. im
Abwasser von Kläranlagenabläufen des
Landes Baden-Württemberg
1999 mittlere Gehalte für
BPA von 38–126
ng/l gefunden, was auf einen kontinuierlichen Eintrag in das Abwasser
schließen
lässt.
Fenarimol
(a-(2-Chlorphenyl)-a-(4-chlorphynyl)-5-pyrimidinmetanol) wird als
prophylaktisch und kurativ wirkendes Blattfungizid eingesetzt. In
einer WWF-Studie aus dem Jahr 1997 wird es als Pestizid eingestuft, welches
Fortpflanzungsstörungen
und Beeinträchtigungen
des Hormonsystems verursacht. Nach im Auftrag der Landesanstalt
für Umweltschutz
Baden-Württemberg
1999/2000 vorgenommenen Untersuchungen erhielt man in Kläranlagenabläufen und
Oberflächengewässern 66
positive Fenarimolbefunde mit einem Maximalgehalt von 36,6 μg/l.
Nonylphenolpolyethoxylate
(NpnEO) sind zwar selbst weder stark toxisch noch östrogen
wirksam, sie werden jedoch beim mikrobiellen Abbau in der Kläranlage
zunächst
größtenteils
zu stabileren und östrogen wirksamen
Nonylphenolmonoethoxylaten und -diethoxylaten (NP1EO, NP2EO) abgebaut.
Unter anaeroben Bedingungen erfolgt vor allem ein Abbau zu 4-Nonylphenol
(4-NP). Die östrogene
Wirksamkeit von 4-NP wurde bei Versuchen mit menschlichen Brustkrebszelllinien
entdeckt. Alle genannten Substanzen führten bei einer Exposition
von 30 μg/l über 3 Wochen
bei männlichen
Regenbogenforellen zur Induktion der Vitellogenin-Synthese. In Kläranlagenabläufen in
Ditzingen (Baden-Württemberg)
wurde für
NP1EC ein Maximalgehalt von ca. 2,5 μg/l, sowie für 4-NP von ca. 1 μg/l gefunden.
Die östrogene
Wirksamkeit von DDT wurde bereits durch zahlreiche in vivo- und
in vitro-Testverfahren bestätigt. Auf
Grund ihrer geringen Wasserlöslichkeit
zeichnen sich Diphenylethane durch eine starke Akkumulationsfähigkeit
im Fettgewebe von Tieren und Menschen aus. Ebenso findet eine starke
Adsorption an Sediment-, Boden- und Schwebstoffpartikeln statt.
Bei Untersuchungen von Rhein, Neckar, Main, Donau und Inn konnten
von 1992 bis 1994 keine nennenswerten Konzentrationen von DDT und
Derivaten nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu traten bei weiteren
Untersuchungen von Elbe, Rhein, Sieg, Wupper, Spree, Elster und Havel
vereinzelt positive Befunde mit Spitzenwerten von 1400 ng/l auf,
was auf illegale punktuelle Einträge schließen lässt.
Bei Östrogenen
handelt es sich um lipophile Hormone. Lipophile Hormone binden reversibel
an spezifische Proteine (Carrier), von welchen sie über das
Blut zu ihrem Wirkort transportiert werden. Nach Trennung von ihrem
Carrier-Protein diffundieren lipophile Östrogene durch die Zellmembran
in das Zytoplasma der Zielzelle, wo sie an entsprechende intrazelluläre Hormonrezeptoren
(hormonbindende Proteine) binden und ihre physiologische Wirkung
auslösen.
Intrazelluläre Östrogen-Rezeptoren
wirken direkt auf die Transkription, d.h. auf die Kontrolle der
Genaktivität.
Durch die Bindung des Hormonmoleküls an seinen Rezeptor und die anschließende Dimerisierung
des Rezeptor-Hormon-Komplexes wird der Rezeptor transaktiviert,
d.h. seine Affinität
zu einer spezifischen DNA-Sequenz wird erhöht. Diese DNA-Sequenzen, die man
estrogene response elements (ERE) nennt, bestehen aus punktsymmetrischen
DNA-Segmenten (Palindromen), die als Verstärkerelemente die Transkription
und somit die Neusynthese von Proteinen regulieren.
Die
typischen östrogenen
Wirkungen von natürlichen Östrogenen
wie 17β-Östradiol
und seinen Abbauprodukten Östron
und Östriol
werden auf den klassischen Östrogenrezeptor
ERα (estrogen
receptor α)
zurückgeführt. Während ERα in den typischen Östrogen-Zielorganen, vor
allem der Uteruszelle vorkommt, findet sich der zweite bekannte Östrogenrezeptor,
ERβ (estrogen
receptor β),
auch in Prostata, Hoden und Eierstöcken sowie in eini gen Teilen
des Gehirns. Beide Rezeptortypen weisen eine hochgradige Homologie
hinsichtlich ihrer DNA- und Liganden-bindenden Domänen auf.
Auch in Bezug auf die Bindungseigenschaften zu ihrer DNA-Erkennungssequenz
(ERE), die Dimerisierung der Rezeptormonomere sowie die Affinität zu natürlichem 17β-Östradiol
verhalten sie sich sehr ähnlich.
Mittlerweile gibt es aber Hinweise auf unterschiedliche Funktionen
der beiden Rezeptoren. So zeigt ERβ beispielsweise eine erhöhte Bindungsaffinität zu den
Phytoöstrogenen
Coumestroll und Genistein sowie zu dem Xenoöstrogen Eisphenol-A, während die
Bindungsaffinität
zu Diethylstilbestrol geringer ist als bei ERα. Vermutlich spielen Sequenzunterschiede
in der aminoterminalen Region von ERα und ERβ hierbei eine entscheidende
Rolle.
Die
relative Wirkpotenz von östrogenen
Substanzen lässt
sich prinzipiell aus Ergebnissen von in vitro- und in vivo-Tests
abgeleiten. Alle Ansätze
zur Bestimmung der östrogenen
Wirkung basieren auf einer quantitativen Erfassung der Interaktion
der Wirksubstanzen mit den jeweiligen zellulären bzw. subzellulären Zellstrukturen.
In
vivo-Testverfahren zur Erfassung östrogener Effekte werden mit
Säugetieren,
Vögeln,
Reptilien und Fischen durchgeführt;
dabei werden unter anderem Veränderungen
der Vagina, des Uterus und der Ovarien untersucht. Solche in vivo-Tests
haben eine sehr hohe Aussagekraft, da sie die Reaktion des gesamten
Organismus auf Umwelteinflüsse
erfassen. Nachteilig sind jedoch die lange Testdauer, die erforderliche
apparative Ausstattung und der hohe Arbeitsaufwand. Die naturgemäß starke
Streuung der Messergebnisse durch den Unterschied zwischen den einzelnen
Testtieren erschwert zudem eine präzise Interpretation der Ergebnisse.
Bei
in vitro-Testansätzen
handelt es sich dagegen um suborganismische Testverfahren; sie verwenden subzelluläre und zelluläre Systeme
und stellen meist die schnellere und kostengünstigere Variante zur Bestimmung
der östrogenen
Aktivität
von Substanzen dar.
Der
ELRA-Test (enzyme-linked receptor assay) zählt zu den einfachsten und
mit einer Versuchsdauer von wenigen Stunden auch zu den schnellsten
subzellulären
Testsystemen. Er basiert auf dem Prinzip des indirekten kompetitiven
Enzymimmunoassays (ELISA). Dazu wird 17β-Östradiol mit Hilfe von BSA
auf einem Träger
immobilisiert und in einem ersten Schritt Östrogenrezeptoren eingesetzt.
Die östrogenwirkenden
Substanzen in der Probe konkurrieren dann mit dem immobilisierten
17β-Östradiol
um die freien Bindungsstellen des in Lösung befindlichen Östrogenrezeptors.
Schließlich
wird über
zwei Antikörperschritte
die Menge an Rezeptor quantifiziert, die am immobilisierten Beschichtungskonjugat
gebunden bleibt. Folglich verhält
sich die Menge des nachgewiesenen Rezeptors umgekehrt proportional
zur Menge der östrogen
wirkenden Substanz.
Noch
schneller ist der Nachweis des Östrogenrezeptor
mittels Fluoreszenzpolarisation. Sie ermöglicht eine direkte Messung
von östrogen
wirkenden Substanzen sogar bei Anwesenheit von freien Liganden.
Im Gegensatz zum ELRA-Test ist eine Abtrennung der ungebundenen
Liganden vor der Messung dazu nicht mehr notwendig. Gemessen wird
die Fähigkeit
einer östrogen
wirkenden Substanz, den fluoreszierenden Liganden durch Bindung
an den Östrogenrezeptor
aus dem Rezeptor-Liganden-Komplex zu verdrängen. Der Nachteil dieses Verfahrens
liegt in seiner geringeren Sensitivität. Das Bindungsassay mittels
Fluoreszenzpolarisation weist im Vergleich mit den übrigen zur
Verfügung
stehenden in vitro-Verfahren die geringste Sensitivität auf.
Ein
genereller Vorteil von zellgebundenen gegenüber den oben beschriebenen
subzellulären
(zellfreien) in vitro-Verfahren liegt darin, dass sie zusätzlich biologische
Vorgänge
wie beispielsweise die Membrandiffusion berücksichtigen.
Im
sogenannten E-Screen (estrogen screen) Assay wird die Zunahme der
Proliferationsrate menschlicher Krebszellen erfasst, welche aufgrund Östrogener
Einflüsse
verursacht wird. Dazu werden spezielle, durch Subklonierung entstandene
MCF-7-Subzelllinien verwendet, bei denen die Proliferation inhibiert
ist. Durch Zugabe von Östrogenen
kann diese Hemmung aufgehoben werden. Die zur Verfügung stehenden
Sublinien haben jedoch im Laufe der Zeit in zahlreichen Labors unter
unterschiedlichsten Selektionsbedingungen ihre biologischen Charakteristika,
d.h. auch ihre östrogene
Sensitivität,
verändert.
Ein direkter Vergleich zwischen den experimentellen Ergebnissen
aus unterschiedlichen Laboren ist somit nur bedingt möglich. Darüber hinaus
sind diese Tests sehr zeitaufwendig und stellen hohe Ansprüche an das
Personal.
Ein
weiteres, zellgebundenes Verfahren steht mit dem Hefezell-Assay
(yeast screen assay, YSE) zur Verfügung. Bei der bislang angewendeten
Form des Hefezell-Assays werden re kombinante Stämme von Saccharomyces cerevisiae
eingesetzt, welche das Gen für
den menschlichen Östrogenrezeptor
auf einen Expressionsplasmid tragen. Auf einem Reporterplasmid besitzen
die Hefestämme
eine Erkennungssequenz für
den östrogenen
Rezeptor, kombiniert mit einem Gen für das Enzym β-Galactosidase
(lacZ-Gen). Bindet eine östrogen
wirksame Substanz an den Hormonrezeptor, werden die Rezeptormoleküle transaktiviert,
so dass diese als Komplex an die auf dem Reporterplasmid lokalisierte
DNA-Erkennungssequenz
binden können.
Dies hat die Expression des lacZ-Gens und damit die Synthese von β-Galactosidase
zur Folge. Es gibt Hefezell-Assays, bei denen die Hefezellen das
Reportergenprodukt β-Galactosidase
direkt aus der Zelle ausschleusen können, sofern die Inkubationsdauer
der Versuchsansätze
ausreichend lang ist (ca. 4 Tage). Für andere Assays werden Hefezellen
verwendet, bei denen die β-Galactosidasemoleküle zunächst aus
dem Zellinnern durch Zellaufschluss freigesetzt werden müssen (Dauer
ca. 1 Tag). Bei beiden Methoden erfolgt die Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität nach Zugabe
weiterer, farbgebender Reagenzien photometrisch und dient als Maß für die östrogene
Aktivität
der Testsubstanzen. Genau wie beim ELRA-Test und der Fluoreszenzpolarisation
werden für
die Erfassung östrogener
Substanzen mit S. cerevisiae Mikrotiterplatten-fähige optische Messinstrumente
eingesetzt. Die Vorteile der Mikrotiterplatten-Leser liegen darin,
dass diese Geräte
im Vergleich zu mit Einzelküvetten
ausgestatteten Photometern eine erhebliche Beschleunigung des Messvorgangs und
eine Erhöhung
des Probendurchsatzes ermöglichen,
bei gleichzeitiger Verringerung des Probenvolumens und des Reagenzienverbrauchs.
Dennoch ist die gesamte Prozedur durch die lange Inkubationszeit
(4 Tage) bzw. den erforderlichen Zellausschluss vergleichbar langwierig
und aufwendig.
Die
von den verschiedenen Autoren ermittelten Testmittelpunkte IC50
für Östradiolstandards
liegen bei der Verwendung von Hefezell-Assays übereinstimmend in einer Größenordnung
von 1 nmol/l, was einer Konzentration von ca. 200–300 ng/l
entspricht. Die Sensitivität
des herkömmlichen
Hefezell-Assays ist somit vergleichbar mit der des E-Screen-Assays. Mit dem ELRA-Test
wurden ähnliche
Untersuchungsergebnisse erzielt. Der Bindungsassay mittels Fluoreszenzpolarisation
dagegen hat wie oben erwähnt
zwar den Vorteil, der in diesem Zusammenhang einfachste und am schnellsten
durchführbare
Test zu sein, er ist jedoch auch am wenigsten sensitiv.
Es
wäre insbesondere
im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung der Analyse sowohl von
Oberflächengewässern als
auch Abwässern
auf den Gehalt an Substanzen mit östrogener Wirkung, aber auch
unter ökonomischen
Gesichtspunkten wünschenswert,
ein zellgebundenes in vitro-Verfahren einzusetzen, welches schnell
und einfach durchführbar
ist.
Da
die Medianwerte für Östradiol
in deutschen Gewässern
im einstelligen ng/l-Bereich liegen, sollten die Verfahren neben
einer verbesserten Praktikabilität
darüber
hinaus ähnlich
sensitiv sein wie die im Stand der Technik bekannten Assays, möglichst
sogar sensitiver.
Für den Einsatz
in der Abwasser-Analyse wäre
weiterhin vorteilhaft, wenn die in dem Verfahren verwendeten Organismen
auch unter extremen Salz- und Temperaturbedingungen noch ausreichend
leistungsfähig
und sensitiv wären,
um zuverlässige
Aussagen über
das östrogene
Potential von Umweltproben zu liefern.
Der
vorliegenden Erfindung liegt demnach das technische Problem zugrunde,
ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von Substanzen mit östrogener
Wirkung zu ermöglichen.
Dieses
Problem wird erfindungsgemäß durch
rekombinante Hefezellen gelöst,
enthaltend:
ein Expressionsplasmid, enthaltend einen Promotor
in funktioneller Verbindung mit einem Östrogenrezeptor-Gen und
ein
Reporterplasmid, enthaltend einen induzierbaren Promotor, der mindestens
eine ERE-Sequenz umfasst, in funktioneller Verbindung mit einem
Fluoreszenzgen oder einem Gen, welches für ein sekretorisches Enzym kodiert,
als Reportergen,
wobei der durch das Östrogenrezeptor-Gen kodierte Östrogenrezeptor
durch eine Substanz mit östrogener Wirkung
transaktiviert wird und an die ERE-Sequenz des Reporterplasmids
bindet und so die Expression des Reportergens induziert.
Die
Art des Nachweises entspricht folglich einem ähnlichen Prinzip, wie es dem
herkömmlichen
Hefezell-Assay zugrunde liegt. Das erfindungsgemäße Reporterplasmid weist jedoch
wesentlich verbesserte Eigenschaften auf. Zunächst enthält es anstelle des herkömmlich verwendeten
lacZ-Gens ein Fluoreszenzgen oder ein Gen, welches für ein sekretorisches
Enzym kodiert, als Reportergen. Der Terminus „Fluoreszenzgen" bedeutet hierbei,
dass das Gen für
ein fluoreszierendes Protein kodiert. Die Verwendung eines fluoreszierenden
Proteins als Reportergenprodukt hat zahlreiche Vorteile. Da weder
ein Zellaufschluss zur Freisetzung des fluoreszierenden Proteins,
noch eine langwierige Inkubationszeit notwendig ist, kann die Expression
des Reportergens in den erfindungsgemäßen Hefezellen wesentlich einfacher
und schneller nachgewiesen werden. Die Messung der Fluoreszenz kann
direkt, d.h. intrazellulär
erfolgen. Wird ein Gen, welches für ein sekretorisches Enzym
kodiert, als Reportergen verwendet, kann das sezernierte Reportergenprodukt
innerhalb weniger Minuten (z.B. Glucoamylase nach ca. 10 min, Wartmann
et al. 2000) im Medium nachgewiesen werden. Die sekretorischen Proteine
werden dabei über
den Sekretionsweg der Zelle (ER – Golgi – cytoplasmatische Membran – Kultivierungsmedium)
nach außen
transportiert. Dazu befindet sich am 5'-Ende des Gens eine zur Sekretion benötigte Signalsequenz,
die ein Signalpeptid kodiert, welches für das Einschleusen des Proteins
ins ER verantwortlich ist (Bui et al., 1996). Ein Aufschluss der
Zellen zur Freisetzung des Genproduktes oder eine langwierige Inkubationszeit
entfallen.
Weiterhin
ist das Reportergen induzierbar, das bedeutet, die Expression des
Reportergens wird durch die Anwesenheit einer östrogen wirksamen Substanz
spezifisch aktiviert.
In
der folgenden Beschreibung werden die Begriffe „Substanz mit östrogener
Wirkung", "östrogen wirksame Substanz", „östrogen
artige Substanz" und „östrogen
aktive Substanz" analog
verwendet und beschreiben Substanzen, welche in den Hormonhaushalt
von Lebewesen eingreifen.
Der
Begriff „Gen" bezeichnet einen
DNA-Abschnitt, welcher für
ein Protein oder Peptid kodiert. Das Merkmal „in funktioneller Verbindung" weist darauf hin,
dass die einzelnen Komponenten, d.h. das Rezeptor- bzw. Reportergen
und ihre Regulationselemente, als Expressionskassetten jeweils aufeinander
abgestimmt sind, so dass z. B. die Expression des Rezeptor- bzw.
Reporterproteins unter der Kontrolle des funktionell verbundenen
Promotors optimiert werden kann.
Das „Expressionsplasmid" dient der Expression
eines Östrogenrezeptor-Gens.
Der dem Rezeptorgen vorgeschaltete Promotor ist dabei vorzugsweise
ein starker konstitutiver Promotor. Besonders bevorzugte Promotoren
sind TEF, AHS84 und ARFC3 (Rösel
et al., 1995; Stoltenburg et al., 1999; Wartmann et al., in press). Das „Reporterplasmid" enthält das Reportergen.
Beide Plasmide verfügen
weiterhin über
entsprechende wirtsspezifische Replikatoren und Selektionsmarker
(z.B. Auxotrophiemarker oder Resistenzmarker, s. Tab. 1).
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird als induzierbarer Promotor ein GAA (Glucoamylase)-Promotor
verwendet (Bui et al., 1996). Ein besonders bevorzugter GAA-Promotor
stammt aus dem Hefestamm Arxula adeninivorans LS3. Bei dem GAA-Promotor
handelt es sich um einen regulierbaren Promotor, der in Abhängigkeit
von der Kohlenstoffquelle aktiviert bzw. inhibiert wird. Dient als
Kohlenstoffquelle z.B. Maltose oder Stärke, liegt der Promotor in
seiner aktiven Form vor. Wird jedoch Glucose als Kohlenstoffquelle
verwendet, ist der Promotor fast vollständig reprimiert. Der GAA-Promotor
zeichnet sich durch eine sehr starke Aktivität nach seiner Induktion durch
Maltose und Stärke
aus.
Ein
weiterer bevorzugter induzierbarer Promotor ist ein AXDH (A. adeninvorans
Xylitoldehydrogenase) Promotor (PCT/EP01/05225). Prinzipiell ist
jedoch jeder induzierbare Promotor geeignet.
Erfindungsgemäß weist
der Promotor mindestens eine ERE-Sequenz auf. Als ERE-Sequenz (engl.: estrogene
response element) werden DNA-Sequenzen bezeichnet, die aus palindromischen
DNA-Segmenten bestehen und als Bindungsstelle für den Östrogenrezeptor-Ligand-Komplex
dienen. Als Verstärkerelemente regulieren
sie die Transkription und somit die Neusynthese von Proteinen.
Die
ERE-Sequenzen) wird bzw. werden derart in den Promotor integriert,
dass die Sequenz in der α-Helix
nach außen
zeigt und so für
den Östrogenrezeptor
erreichbar ist. Bevorzugte Integrationsstellen z.B. für den GAA-Promotor
sind die Positionen um –107, –150 und –203 der
SEQ. ID Nr. 1, besonders bevorzugt ist die Position um –107.
Vorzugsweise
werden die rekombinanten Hefezellen, welche den GAA-Promotor als
induzierbaren Promotor enthalten, in Hefeminimalmedium (HMM) mit
Glucose kultiviert. Da der GAA-Promotor bei Verwendung von Glucose
als alleiniger Kohlenstoffquelle normalerweise reprimiert ist, erfolgt
seine Aktivierung über die
Bindung des durch östrogen
wirksame Substanzen modifizierten Östrogenrezeptors an die ERE-Sequenz hochspezifisch
und selektiv. Die Expression des nachgeschalteten Reportergenes
erfolgt demnach ausschließlich
in Abhängigkeit
von der Konzentration östrogenartiger
Substanzen in dem Medium.
Weiterhin
enthält
der GAA-Promotor vorzugsweise zwei ERE-Sequenzen. Durch Integration
einer zweiten ERE-Sequenz wird die Promotoraktivität maximiert.
Die Integration der beiden ERE-Sequenzen erfolgt vorzugsweise an
den Positionen –107, –150 und –203 der
SEQ. ID Nr. 1, besonders bevorzugt ist Position –107. Die resultierende Sequenz
ist in SEQ ID Nr.2 dargestellt (s. auch 6).
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
sind die erfindungsgemäßen Hefezellen
Hefen der Gattung Arxula, besonders bevorzugt ist Arxula adeninivorans.
Die
Gattung Arxula zeichnet sich dadurch aus, dass sie besonders robust
ist. Salzkonzentrationen bis zu 20% sowie Temperaturen von bis zu
48°C verträgt sie schadlos.
Die Hefe ist entsprechend auch unter vergleichbar extremen Salz-
und Temperaturbedingungen noch ausreichend leistungsfähig und
sensitiv, um zuverlässige
Aussagen über
das östrogene
Potential von Umweltproben zu liefern.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Östrogenrezeptor-Gen
human, besonders bevorzugt sind die humanen Östrogenrezeptor-Gene hERα und hERβ (Kuiper
et al. 1997, Mosselman et al. 1996). Die bisher bekannten humanen Östrogenrezeptor-Gene
hERα und
hERβ unterscheiden
sich in ihren Bindungsaffinitäten
gegenüber
bestimmten östrogen
wirkenden Substanzen (siehe oben). Die zusätzliche Verwendung von hERβ verbessert
daher den Nachweis bestimmter Substanzen oder ermöglicht ihn
erstmals. Das Spektrum der nachweisbaren Substanzen kann somit entscheidend
erweitert werden.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird das als Reportergen verwendete Fluoreszenzgen ausgewählt aus
der Gruppe, welche die für
GFP, EYFP und DsRed kodierenden Gene umfasst. GFP (green fluorescent
protein) und EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) stammen
aus einer Qualle und DsRed (red fluorescent Protein) aus einer Koralle (Chalfie
et al. 1994, www.bdbiosciences.com/clontech, Gurskaya et al. 2001).
Die Reportergene können
von BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, bezogen werden. Die
genannten fluoreszierenden Proteine unterscheiden sich in ihrem
Emissions- und Extinktionsverhalten.
Besonders
bevorzugt ist das für
DsRed kodierende Gen, da langwelliges Licht absorbierendes DsRed-Protein
in seinem Emissions- und Extinktionsspektrum am weitesten von dem
Bereich entfernt ist, in dem auch Vitamine wie Riboflavin detektierbar
sind. Somit ist gewährleistet,
dass die Detektion der östrogen
wirksamen Substanzen spezifisch erfolgt.
Bei
dem als Reportergen verwendeten Gen, welches für ein sekretorisches Enzym
kodiert, handelt es sich vorzugsweise um Phytase-Gene; besonders
bevorzugt sind Phytase-Gene aus Aspergillus-Arten bzw. aus Ancula
adeninivorans (Mayer et aI. 1999, Sano et al. 1999). Weiterhin können Glucoamylasen,
Glucanasen und Xylosidasen als sekretorische Enzyme eingesetzt werden,
indem die entsprechenden Gene als Reportergene verwendet werden.
In
einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Nachweis von Substanzen mit östrogener
Wirkung in einer Probe, welches die folgenden Schritte umfasst:
- – Inkubieren
der erfindungsgemäßen Hefezellen
mit der zu untersuchenden Probe, und
- – Bestimmen
der Fluoreszenz-Emission oder der Aktivität des sekretorischen Enzyms
(für Assays
siehe Mayer et al. 1999, Sano et al. 1999).
Das
erfindungsgemäße Verfahren
unterscheidet sich von dem herkömmlichen
Hefezell-Assay,
welches lacZ als Reportergen verwendet, insofern als dass weder
der zusätzliche
Schritt zur Freisetzung des Reportergenproduktes durch Zellaufschluss
noch eine langwierige Inkubationszeit notwendig sind. Der Nachweis östrogen
wirksamer Substanzen erfolgt schnell und unkompliziert. Gegenüber dem
herkömmlichen
Hefezell-Assay ergibt sich eine wesentliche Zeitersparnis. Ferner
ist die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
weniger arbeitsintensiv.
Um
einen möglichst
hohen Probendurchsatz bei geringem Probenvolumen und Reagenzienverbrauch zu
ermöglichen,
werden vorzugsweise Mikrotiterplatten verwendet. Die Fluoreszenzmessung
bzw. die Messung der Enzymaktivität kann mit Hilfe von speziellen
Lese geräten
(Microtiter-Reader) erfolgen. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt
direkt, also intrazellulär.
Der Einsatz zusätzlicher,
farbgebender Substanzen entfällt. Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist demnach nicht nur schneller und kostengünstiger, sondern auch umweltfreundlicher,
da weniger Chemikalien notwendig sind.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die in dem Verfahren eingesetzten erfindungsgemäßen Hefezellen
frisch kultiviert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden in dem Verfahren konservierte Hefezellen eingesetzt. Besonders
bevorzugt sind lyophilisierte Hefezellen. In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung sind die in dem Verfahren eingesetzten Hefezellen
immobilisiert. Die Immobilisierung kann dabei z.B. mit PVA (Polyvinylalkohol),
PU (Polyuretan) oder PCS (Poly(carbamoyl)sulfonat) erfolgen.
In
einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen
Kit zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer
Probe, umfassend:
- – erfindungsgemäße Hefezellen
und
- – Detektions-
und Kontrollsubstanzen.
Als
Kontrollsubstanz kann u.a. eine östrogen
wirksame Referenzsubstanz in dem Kit enthalten sein. Die Art der
Detektionssubstanz wird abhängig
von dem verwendeten Enzym gewählt.
Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung einen Biosensor zum Nachweis
von Substanzen mit östrogener
Wirkung in einer Probe, umfassend:
- – die erfindungsgemäßen Hefezellen
und
- – einen
Transducer.
Der
Begriff „Biosensor" bezeichnet einen
Aufbau, in dem eine biologische Komponente (hier die erfindungsgemäßen Hefezellen)
unmittelbar mit einem Signalwandler, d.h. einem Transducer, verbunden
ist. „Biosensoren" wandeln die biochemische
Information eines Substrates in ein physikalisch quantifizierbares
Signal um, wobei durch die Wechselwirkung eines Analyten mit der
Biokomponente resultierende physikalische oder physikochemische
Veränderungen
durch einen Transducer meist in elektrische Signale umgewandelt
werden. Als Transducer kommen u.a. für Licht die Optrode, für elektroaktive
Substanzen amperometri sche oder potentiometrische Substanzen, für Wärme der
Thermistor und für
Masse der Piezokristall in Betracht (Riede) et al. 2003).
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Transducer ein optischer Transducer. Derartige Transducer
beruhen auf der Erfassung von Veränderungen optischer Eigenschaften,
wie beispielsweise der Fluoreszenz.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird ein elektrochemischer Transducer eingesetzt, der Veränderungen
elektroaktiver Substanzen (z.B. des Produktes, welches bei der Reaktion
des sekretorischen Enzyms entsteht) erfasst.
Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Hefezellen
gemäß der Erfindung zum
Nachweis von Substanzen mit östrogener
Wirkung in einer Probe. Dies können
beispielsweise Proben von Oberflächengewässern, aber
auch von Abwässern,
speziell aus der Industrie und Landwirtschaft, sein.
Die
nachfolgenden Figuren und Beispiele dienen der Erläuterung
der Erfindung.
Figuren
1: Konstruktion von A. adeniniviorans
G1211/pAL-ALEU2m-hERα.
Dazu wurde das mit AccIII linearisierte Plasmid pAL-ALEU2m-hERα in A. adeninivorans
G1211 transformiert. Die rekombinanten Hefezellen integrieren dieses
Plasmid in ihre chromosomale 25S rDNA Region.
2: Nachweis von rekombinantem
hERα in
A. adeninivorans G1211/pAL-ALEU2m-hERα.
Dazu wurde A. adeninivorans G1211 (1), G1211/pAL-ALEU2m-hERα (2,3,5)
und G1211/pAL-ALEU2m (4) für
48 h in Hefeminimalmedium (HMM) mit 2% Glucose kultiviert, die Zellen
vom Kultivierungsmedium getrennt und das intrazellulär lokalisierte
hERα mittels
Westernblot Analysen detektiert. Als Antikörper wurde ein käuflicher anti-hERα Antikörper eingesetzt.
3: Restriktions- und Genkarten
der Plasmide pYES2-GFP und pYES2-DsRed.
4: GFP- bzw. DsRed-Fluoreszenz
von rekombinanten S. cerevisiae Stämmen. Dazu wurden S. cerevisiae
SEY6210/pYES2-GFP und SEY6210/pYES2-DsRed in SD-Medium mit Galactose als C-Quelle kultiviert
und auf Fluoreszenz analysiert.
5: Schematische Darstellung
des Einbaus der ERE-Regionen in den GAA-Promotor.
6: DNA-Sequenz des GAA-107-ERE-ERE-Promoters
mit zwei ERE-Regionen an Position –107 (unterstrichen). Vgl.
SEQ ID Nr. 2.
7: Gen- und Restriktionskarten
der Plasmide pAL-HPH-GAA-Ds-Red, pAL-HPH-GAA-107-ERE-Ds-Red, pAL-HPH-GAA-107-ERE-ERE-Ds-Red
und pAL-HPH-GAA-107-ERE-ERE-ERE-Ds-Red.
8: Gen- und Restriktionskarten
der Plasmide pAL-HPH-GAA-150-ERE-Ds-Red, pAL-HPH-GAA-150-ERE-ERE-Ds-Red und pAL-HPH-GAA-150-ERE-ERE-ERE-Ds-Red.
9: Gen- und Restriktionskarten
der Plasmide pAL-HPH-GAA-203-ERE-Ds-Red, pAL-HPH-GAA-203-ERE-ERE-Ds-Red und pAL-HPH-GAA-203-ERE-ERE-ERE-Ds-Red.
10: Fluoreszenzanalyse von
A. adeninivorans G1211/pAL-ALEU2m-hERα-pAL-HPH-GAA-107-ERE-DsRed und A. adeninivorans
G1211/pAL-HPH-GAA-107-ERE-DsRed. Dazu wurden die rekombinanten Hefen
48h in HMM + 2% Glucose kultiviert und anschließend auf HMM + 2% Glucose (G),
HMM + 2% Maltose (M) bzw. HMM + 2% Glucose + 500 μg/l 17β-Estradiol
(E) überführt, alles
für weitere
24h kultiviert und anschließend
mikroskopisch analysiert.
