DE60116109T2

DE60116109T2 - In vitro Screening nach Liganden des Östrogenrezeptors

Info

Publication number: DE60116109T2
Application number: DE60116109T
Authority: DE
Inventors: Vladimir Patchev; Youriy Mitev; Siegmund Wolf; Gernot Langer
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2001-11-07
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2021-11-08
Also published as: EP1310799A1; JP3754647B2; US7166438B2; ATE313803T1; EP1310799B1; JP2003144192A; US20030087303A1; DE60116109D1; ES2253318T3

Description

Einführung
Die Erfindung betrifft ein In-vitro-Verfahren zur Detektion von Liganden und In-vitro-Screening nach Liganden des Östrogenrezeptors mit neurotropischen und minimal systemischen östrogenähnlichen Eigenschaften. Die Erfindung betrifft ferner eine In-vitro-Verwendung eines Steroid-Rezeptor-Coactivator-1 (SRC-1) zur Detektion von Liganden des Östrogenrezeptors mit definierten Eigenschaften.
Stand der Technik
Substanzen, die neurotropische Funktionen haben ohne andere östrogen-sensitive Organe zu beinträchtigen
Die internationale Patentanmeldung WO 99/42108 von PATCHEV et al. beschreibt Steroide als Medikation, um selektiv den Östrogenmangel im zentralen Nervensystem auszugleichen, ohne andere Organe oder Systeme zu beeinflussen. Solche Verbindungen (Liganden) haben selektive neurotropische Eigenschaften; sie beinträchtigen andere östrogensensitive Organe nicht. Der selektive neurotropische Effekt auf das Nervensystem wurde an Tiermodellen getestet.
Das gewünschte Wirkstoffprofil für die Behandlung von Östrogenmangelsymptomen im zentralen Nervensystem erfordert, dass diese Wirkstoffe auf östrogenabhängige Targetgene im Gehirn wirken, während sie nur geringe oder keine Wirkungen auf östrogensensitive Organe des Reproduktionssystems (z.B., Endometrium, Brust, Hypophyse) haben.
Östrogene haben eine große Anzahl von Wirkungen auf das zentrale Nervensystem (ZNS). Mentale Wirkungen von Östrogenen führen zur irreversiblen „Festverdrahtung" neuronaler Schaltungen, die verschiedene Aspekte der Gehirnfunktion bestimmen [V. K. Patchev and O. F. X. Almeida, Steroid hormone-dependent organization of neuroendocrine functions, R. G. Landes Company, Austin, 1999].
Im reifen Gehirn beeinflussen physiologische Östrogenlevel, abgeleitet von den Gonaden, die Steuerung der Reproduktionsfunktionen sowie von Gehirnaktivitäten, die nicht mit der Reproduktion und dem sexuellen Verhalten in Beziehung stehen, wie etwa Lernen, Auswendiglernen, Orientierung im Raum, Emotionalität und Verarbeitung von kognitiver Information [S. E. Alves and B. S. McEwen, Estrogen and brain function: Implications for aging and dementia; in M. Oettel and E. Schillinger, eds., Estrogens and Antiestrogens, Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 135/I, Springer, Berlin, Heidelberg, 1999, pp. 315–328]. Die meisten der neurotropischen Wirkungen von Östrogenen stehen mit der transkriptionalen Regulation von Targetgenen in Beziehung; diese Regulation wird durch die Aktivierung der Östrogenrezeptoren in unterschiedlichen neuronalen Regionen induziert.
Die Östrogenrezeptoren
Der Östrogenrezeptor (ER) existiert in zwei Isoformen, ERα und ERβ, deren Distribution und Ligandenbindung beschrieben wurde [V. GIGUERE et al. (1998) Estrogen receptor β: re-evaluation of estrogen and anti-estrogen signaling; Steroids Vol. 63, pp 335–339 and G. G. KUIPER et al. (1997) The novel estrogen receptor subtype: potential role in the cell- and promoter-specific actions of estrogens and anti-estrogens, FEBS Lett, Vol. 410: pp 87–90]. Der ligandenaktivierte Östrogenrezeptor bindet an spezifische DNA-Sequenzen, genannt Östrogen-Response-Elemente (ERE), in den Promotern der östrogenresponsiven Gene, und beeinflusst somit ihre Transkription als ein ligandenaktivierter Transkriptionsfaktor. Beide ER-Isoforme sind im Gehirn vorhanden und haben unterschiedliche, nicht immer überlappende, Distribution in diskreten und funktionell verschiedenen Gehirnregionen [P. J. Shughrue et al., Comparative distribution of estrogen receptor-a and -b mRNA in the rat central nervous system, J. Comp. Neurol., Vol. 388, pp. 507–525, 1997]. Bei der Bindung eines natürlichen oder synthetischen Liganden, und vor dem Andocken an EREs, um die Transkription von Targetgenen zu beeinflussen, kann der ER intrinsische Coaktivatoren- und Adapterproteine rekrutieren, die als Modulatoren (Verstärker oder Attenuatoren) der ER-vermittelten Targetgentranskription dienen.
Der Steroidrezeptor Coactivator-1
Der Steroidrezeptor Coactivator-1 (SRC-1) ist ein Mitglied einer Familie zellulärer Proteine, die als „Verstärker" der Transkription wirken, die durch nukleare Rezeptoren vermittelt ist, die durch die Ligandenbindung aktiviert werden [S. A. Onate et al., Sequence and characterization of a coactivator for the steroid hormone receptor superfamily, Science, vol. 270, pp. 1354–1357, 1995]. Die SRC-1-vermittelte Coaktivierung der Östrogen-Rezeptor-(ER)-kontrollierten Transkription erfordert die Anwesenheit von ER in agonistischer Konformation und beinhaltet die Rekrutierung zusätzlicher Mediatoren (z.B. CBP/p300). Es wurden jedoch auch autonome Aktivierungsdomänen identifiziert [D. Robyr et al., Nuclear hormone receptor coregulators in action: Diversity for shared tasks, Mol. Endocrinol., vol. 14, pp. 329–347, 2000].
SRC-1 wird in Östrogen-Targetorganen und in Östrogensensitiven Tumoren in großem Umfang exprimiert [BERNS et al. (1998) Predictive value of SRC-1 for tamoxifen response of recurrent breast cancer, Breast Cancer Res. Treat. Vol. 48, 97–92, ferner NEWMANN et al. (2000) Cofactor competition between the ligand-bound estrogen receptor and an intron 1 enhancer leads to estrogen repression of ERBB2 expression in breast cancer, Oncogene, Vol 19, 490–497, und LABRIE et al., (1999) a third generation SERM acting as pure anti-estrogen in the mammary gland and endometrium, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. Vol 69, 51–84]. Wenn SRC-1 durch Gen-Targeting inaktiviert wird, kann zum Teil ein Widerstand gegenüber Östrogenen in verschiedenen Geweben, wie etwa Uterus, Prostata, Testis und Brustdrüse, detektiert werden [XU et al. [1998] Partial hormone resistance in mice with disruption of the steroid receptor coactivator-1 (SRC-1) gene, Science, Vol. 279, 1922–1925]. Homozygote SRC-1-Nullmutanten konnten jedoch keine Veränderungen bei den Gehirnfunktionen im Vergleich zum natürlichen Phänotyp nachweisen. Diese Ergebnisse lehren, dass SRC-1 möglicherweise keine Rolle bei der Modulierung der ER-vermittelten chemischen Signalgebung im ZNS spielt. Die Publikation von O. C. MEIJER, P. J. STEENBERGEN and E. R. DE KLOET (2000) Differential expression and regional distribution of steroid receptor coactivators SRC-1 and SRC-2 in brain and pituitary, Endocrinology, Vol. 141, pp 2192–2199, beschreibt zwei Isoforme von SRC-1, nämlich SRC-1a und SRC-1e, die in den Gehirnen ausgewachsener Ratten in unterschiedlichen Regionen verbreitet sind. SRC-1 ist in vielen Bereichen des Gehirns exprimiert, einschließlich Hippocampus, Amygdala, Hypothalamus, Basalganglien und Isocortex, die entweder im Hinblick auf die kognitive Verarbeitung oder die Regulation der reproduktionsbezogenen Funktionen unterschiedlichen Funktionen dienen, und für ihre Sensitivität gegenüber Östrogenen bekannt sind.
Die Publikation von Lascombe et al., Estrogenic activity assessment of environmental chemicals using in vitro assays: Identification of two new estrogenic compounds, Environmental Health Perspectives. vol. 108, pp. 621–629, 2000 beschreibt, dass Xenoestrogene, die in der Lage sind, sich über den ERalpha an einen Reporter zu binden und dessen Transkription zu aktivieren, nicht in der Lage sind, eine signifikante Interaktion zwischen dem ER und SRC-1 zu induzieren. Diese Befunde bestätigen nur die Ansicht, dass der Grad an Rekrutierung von SRC-1 durch den ligandengebundenen ER stark von konformationalen Veränderungen des ER abhängt, die durch das Ligandenmolekül spezifiziert sind. Diese Autoren implizieren jedoch die Nützlichkeit der Trennung zwischen der Ligandenaffinität für den ER und der resultierenden Rezeptormodifikation nicht, die für die Rekrutierung oder Abstoßung von SRC zur Identifikation der ER-Liganden mit selektiver neurotropischer Aktivität verantwortlich ist.
In Hanstein et al., Functional analysis of a novel estrogen receptor-beta-isoform, Molecular Endocrinology, vol. 13, pp. 129–137, 1999 wird darauf hingewiesen, dass das Isoform beta2 des ER nicht in der Lage ist, in eine Interaktion mit SRC-1 einzutreten. Die Publikation von Needham et al., Differential interaction of steroid hormone receptors with LXXLL motifs of SRC-1a depends on residues flanking the motif, vol. 72, pp. 35–46, 2000 zeigt, dass der ligandengebundene ERbeta2 genauso in der Lage ist, mit SRC-1 zu interagieren, wie auch andere bekannte Isoformen des ER. Diese Autoren haben jedoch gezeigt, dass diese Interaktion von einem der vier unterschiedlichen Motive in SRC-1 unterstützt wird, das Interaktionen dieses Proteins mit diversen nuklearen Rezeptoren zulässt. Angesichts dieser Befunde muss gefolgert werden, dass die Daten, über die in dieser Publikation berichtet wurde, aus der Verwendung eines experimentellen Systems resultierten, in dem das kritische ER-interagierende Motiv von SRC-1 nicht in gleicher Weise zugänglich ist.
Problem und Lösungen
Die Problemstellung der Erfindung ist es, ein In-vitro-Screening zur Detektion von Östrogenrezeptorliganden bereitzustellen, die östrogenähnliche Wirkungen in Bereichen des ZNS haben, deren Gehirnfunktionen nicht mit der Reproduktion in Beziehung stehen. Gleichzeitig sollten die Liganden in anderen Östrogentargetorganen als dem Gehirn nicht wirksam sein. Solche Östrogenrezeptorliganden, die ZNS-selektiv sind, können für die Prävention und die Therapie von Störungen des ZNS verwendet werden, die durch das Fehlen von Östrogen verursacht werden. Solche Liganden werden die Nebenwirkungen vermeiden, die die Östrogenverabreichung im Endometrium und der Brust und in der neuroendokrinen Steuerung der Gonadotropin-Sekretion hat.
Die Problemlösung der Erfindung wird erreicht durch ein Verfahren eines In-vitro-Screenings nach Östrogenrezeptor-(ER)-Liganden mit spezifischer neurotropischer Aktivität, einschließlich Wahl und Detektieren mittels aufeinander folgender Verwendung von mindestens zwei Testsystemen, die die folgenden Schritte umfassen:

(i) Verwendung eines ersten Zell- oder Gewebe-Assay-Systems, das ER und ein ER-gesteuertes Reportergen enthält, zur Detektion der Aktivierung der Transkription, die durch Detektieren der effektiven Konzentration des ER-Liganden, die für die halbmaximale transkriptionale Induktion des ER-abhängigen Reportergens (EC₅₀) erforderlich ist, bestimmt ist, und Wahl der Liganden-induzierenden Transkription und
(ii) Verwendung eines zweiten zellfreien oder enzymatischen Assay-Systems zur Bestimmung der physikalisch-chemischen Interaktion des Steroid-Rezeptor-Coaktivor-1 (SRC-1) oder seiner Fragmente NID-1, NID-2 oder NID-3 mit dem ER-Protein nach Bindung eines Liganden, der im ersten Assay-System ausgewählt wurde, die durch Detektieren der Dosis des ER-Liganden, die zum Auftreten erster signifikanter Anzeichen (mehr als das zweifache der Standardabweichung von der Basislinie) der physikalisch-chemischen Interaktion zwischen dem aktivierten ER und einer definierten Menge an SRC-1 oder eines Fragmentes davon bestimmt wird, wobei die Rekrutierung von SRC-1 oder seiner Fragmente sich auf die Erhöhung der Protein-Protein-Interaktion zwischen ER und SRC-1 oder seinen Fragmenten über die Basalinteraktionsrate, die in Abwesenheit eines ER-aktivierenden Liganden bestimmt wurde, bezieht,

Die Expressions-„Fragmente" stehen nur für NID 1, 2 oder 3 (Nuclear inactivating domains = Nuklear inaktivierende Domänen), SRC1a NR Box I 632-QTSHKLVQLLTTTAEQQ-648; SRC1a NR Box II 689-ERHKILHRLLQEGSPSD-705; SRC1a NR Box III 750-KDHLLRYLLDKDEKDL-766, die auch definiert werden in:
Xiu Fen Ding, Carol M. Anderson, Han Ma, Heng Hong, Rosalie M. Uht, Peter J. Kushner and Michael R. Stallcup (1998) in Molecular Endocrinology 12 (2): 302–313 Copyright^© 1998 by The Endocrine Society; Nuclear Receptor-Binding Sites of Coactivators Glucocorticoid Receptor Interacting Protein 1 (GRIP1) and Steroid Receptor Coactivator 1 (SRC-1): Multiple Motifs with Different Binding Specificities.
Die Sequenz des Assay-Systems unter (i) und (ii) ist veränderlich. Das Assay-System, das bevorzugt zuerst verwendet wird, ist ein Assay-System, das zu der geringsten Anzahl an positiver Auswahl oder zur geringsten Arbeit führt. In allen Fällen, in denen die Östrogenaktivität eines Liganden bekannt ist, muss nur das zweite Assay-System, das die Kombination von ER und dem Coaktivator SRC-1 beinhaltet, implementiert werden.
Die aufeinander folgende Verwendung der unter (i) und (ii) beschriebenen Assay-Systeme wird die Auswahl der bevorzugten Liganden ermöglichen, d.h. Verbindungen, die sehr wenig(e) SRC-1-Interaktion(en) erlauben, wenn sie im Assay-System (ii) bei einer definierten Konzentration im Vergleich zu der Dosis gemessen werden, die erforderlich ist, um die halbmaximale transkriptionale Aktivierung im Assay-System (i) zu produzieren.
Zusätzlich wird die Problemlösung erreicht durch ein Verfahren zum In-vitro-Screening nach ER-Liganden mit spezifischer neurotropischer Aktivität, einschließlich Wahl und Detektieren mittels aufeinander folgender Verwendung von mindestens Testsystemen, wie oben angegeben, in denen der Ligand in der Lage ist, die Transkription eines ER-abhängigen Reportergens in einer Dosis von gleich oder weniger 10 nM im ersten Assay-System zu induzieren und in dem die molare Konzentration des Liganden, die für das Auftreten einer signifikanten (mehr als die zweifache Standardabweichung von der Basislinie) Protein-Protein-Interaktion zwischen co-exprimiertem ER und SRC-1 oder einem seiner Fragmente NID-1, NID-2 oder NID-3 in einem Testsystem erforderlich ist, gleich oder größer 100 nM ist.
Definitionen
In vivo: „In-vivo-Techniken" steht für Verfahren zur Behandlung menschlicher oder tierischer Körper durch chirurgische Eingriffe oder Therapie und Diagnoseverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt wurden.
In vitro: Der Ausdruck „in vitro" schließt alle oben genannten In-vivo-Techniken und -Verfahren aus. Der Ausdruck in vitro meint in dieser Anmeldung außerdem Kulturen, wie etwa Zellkulturen, Gewebekulturen, Teile von Organen, Organe, Organsysteme und Schnitte von Teilen des tierischen, insbesondere des menschlichen Körpers. Alle diese Spezimen werden aus dem tierischen oder menschlichen Organismus entfernt. Das Spezimen wird nicht wieder in den tierischen (einschließlich menschlichen) Organismus eingeführt. Dem Ausdruck „in vitro", der für wissenschaftliche und/oder kommerzielle Versuche steht, gekennzeichnet durch ein künstliches System, das Zellen, Fraktionen davon, gereinigte Komponenten oder Homogenate außerhalb eines lebenden Organismus verwendet, wird der Vorzug gegeben.
Liganden: Der Ausdruck „Ligand" wird alle Arten von natürlich auftretenden oder synthetisch hergestellten chemischen Substanzen umfassen, die in der Lage sind, ER zu binden, und dabei SRC-1 bei der ER-Bindung nicht zu rekrutieren, und/oder eine selektive, neurotropische, östrogenähnliche Transkriptionswirkung im Gewebe des zentralen Nervensystems zu haben, und die keine biologischen Wirkungen auf die Gewebe des Reproduktionssystems haben. In diesem Texte ist der Ligand die Testsubstanz.
Detektion: Das Genprodukt des Östrogen-Response-Elements kann von verschiedenen Systemen, wie ELISA, RIA oder enzymatischen Assay-Systemen identifiziert werden, in denen die Funktion des Produkts des ERE gemessen wird. Solche Verfahren werden in Handbüchern beschrieben.
Zell- oder Gewebe-Assay: Dieser Ausdruck meint in dieser Anmeldung außerdem die Verwendung von Kulturen, wie etwa Zellkulturen, Gewebekulturen, Teile von Organen, Organe, Organsysteme und Schnitte von Teilen des tierischen, insbesondere des menschlichen, Körpers.
Transkriptionale Aktivität und deren Detektion: Transkriptionale Aktivität steht für den Grad, mit dem sich die Menge an mRNA, die ein definiertes Protein kodiert, als Ergebnis eines externen Einflusses (Wirkstoff) auf die Promoterregion des entsprechenden Gens verändert.
Das zweite Assay-System basiert auf dem Mechanismus der Coaktivator-Rekrutierung und nur indirekt auf Transkription. Die Coaktivator-Rekrutierung stimuliert in diesem Fall die Transkription, die nur in Abwesenheit eines Coaktivators auf einen niedrigeren Grad aktiviert werden kann. In dieser Erfindung ist der Kern der Erfindung die Beschreibung des zellfreien oder enzymatischen Assay-Systems, in dem die Coaktivator-Rekrutierung gemessen wird, ohne Ergebnisse zur Transkription selbst zu generieren. Der Fachmann ist mit der Tatsache vertraut, dass das Assay-System in Anwesenheit des Coaktivators SRC-1 selbstverständlich zu einem Anstieg der Transkription führt.
Eine solche Korrelation zwischen der Aktivierung der ER-modulierten Transkription und der Coaktivator-Rekrutierung wird zum Beispiel beschrieben in WO 99/18124 von Cummings et al., veröffentlicht am 15. April 1999. Ältere Verfahren werden in KAMEI et al. (1996) Cell Vol. 85, pages 403–414 beschrieben. Solche Verfahren beinhalten unter anderem die Konstruktion von Fusionsproteinen, die Herstellung von ³²P-markierten Proteinen, die Konstruktion spezialisierter Expressionsvektoren, d.h. für den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay und die transkriptionalen Aktivierungsassays, das Laufen vieler Gele und die Erhöhung von Antikörpern. Die Verfahren machen sich die ligandenabhängige Bindung der nuklearen Rezeptoren und Coaktivatoren zu Nutze. In Abwesenheit eines Liganden tritt keine Bindung zwischen dem nuklearen Rezeptor und dem nuklearen Rezeptor-Coaktivator auf. Wenn ein Ligand vorhanden ist, tritt eine solche Bindung jedoch auf, und kann durch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen einem fluoreszenzmarkierten nuklearen Rezeptor und einem fluoreszenzmarkierten nuklearen Rezeptor und einem fluoreszenzmarkierten Coaktivator detektiert werden. Weitere Liganden können auf Grund ihrer Fähigkeit, einem verschiedenen Grad (oder mit einer verschiedenen Potenz) der agensinduzierten Interaktion des nuklearen Rezeptor-Coaktivators vorzubeugen oder diese zu unterbrechen, identifiziert werden. Die nukleare Rezeptor- oder ligandenbindende Domäne davon wird für die Verwendung in den oben beschriebenen Verfahren zur Detektion von Liganden nuklearer Rezeptoren mit einem fluoreszierenden Reagens markiert.
Potenz: Die Potenz ist der Wert der Ligandenkonzentration, wie durch EC₅₀ (die für die halbmaximale Wirkung auf den Targetparameter erforderliche Dosis, die speziell durch eine Rezeptorbindung an diesen Liganden beeinflusst ist) bestimmt. Die Potenz hängt primär von der Affinität der Bindung zwischen individuellen Liganden und dem Rezeptor ab, sowie von den ligandeninduzierten konformationalen Veränderungen im Rezeptorprotein, die die Stärke der chemischen Signalübertragung verändern können.
Steuerung von ER: Die Steuerung von ER wird ausführlich im Abschnitt zum Stand der Technik beschrieben.
Reportergen: Gene oder Genfragmente, die mit anderen Genen oder Regulatorsequenzen verknüpft oder gekoppelt sind, um die Aktivität solcher Sequenzen zu detektieren. Reportergene müssen leicht detektierbare Genprodukte produzieren. Außerdem dürfen die Genprodukte für die Organismen, die diese Produkte exprimieren, nicht toxisch sein. Reportergene werden beschrieben in Methods in Enzymol. Vol 152, pages 709–713 (1987). Weitere Verfahren werden in WO 00/37681 von HARRIS et al. (veröffentlicht am 29. Juni 2000) und WO 99/11760 von KUSHNER et al. (veröffentlicht am 11. März 1999) beschrieben.
Transkription: RNA-Synthese mit Hilfe von RNA-Polymerase in der 5'→3'-Richtung unter Verwendung von DNA als Matrize. Die Transkription ist der Prozess der Übertragung der DNA-Sequenz von einer der zwei DNA-Stränge in eine Einzelstrang-RNA-Sequenz.
Aktivierung der Transkription: Dieser Begriff bezieht sich auf den Anstieg der ER-regulierten/-abhängigen Reportergenaktivität über der Basaltranskriptionsrate, die in Abwesenheit eines Liganden beobachtet wird.
Regulation: Ein Molekül mit einer Wirkung auf die Transkriptionsrate des ER. Die Aktivierung wird jede höhere Transkriptionsrate umfassen. Abnahme steht für eine Verringerung der Transkriptionsrate. Die Basaltranskriptionsrate ist der Wert unter Bedingungen der Abwesenheit eines Liganden, deren Bedingungen in den verschiedenen Assay-Systemen vergleichbar sind (wobei mindestens ein Assay-System den ER umfasst und das andere Assay-System den ER zusammen mit SRC-1 umfasst).
Zellfreies System: Um ein zellfreies System zu erhalten, werden die Zellmembranen oder Zellwände zerstört, und Zellmembranfragmente und Zellwandfragmente teilweise oder vollständig, zum Beispiel durch Zentrifugation, aus dem inneren Teil der Zellen (Zytosol), entfernt. Organische Komponenten, die in solchen Zellkompartimenten enthalten sind, können sich ihre Kapazität erhalten, biochemische Interaktionen einzugehen, die für die intakte Zelle charakteristisch sind.
Enzymatischer Assay: In enzymatischen Assays werden spezifische Enzyme und, falls notwendig, Cofaktoren verwendet, um spezifische Substrate zu katalysieren. Die Veränderungen der Konzentrationen der Substrate und Produkte werden gemessen. Die enzymatischen Assays umfassen normalerweise eine Kaskade spezieller Enzyme und Substrate.
Coaktivator-Rekrutierung: Die Rekrutierung von SRC-1 bezieht sich auf die Erhöhung der Protein-Protein-Interaktion zwischen ER und SRC-1 über die Basalinteraktionsrate, die in Abwesenheit eines ER-aktivierenden Liganden bestimmt wurde.
Rekrutierung: Die Rekrutierung von SRC-1 betrifft den Vergleich der Assoziationsgrade durch Protein-Protein-Interaktion zwischen co-präsenten ER und SRC-1 in Abwesenheit oder Anwesenheit eines ER-Agonisten. Numerisch wird die Rekrutierung durch die molare Konzentration eines ER-Agonisten definiert, die für das Auftreten einer signifikanten (mehr als die zweifache Standardabweichung von der Basislinie) Protein-Protein-Interaktion zwischen co-exprimiertem ER und SRC-1 in einem Testsystem erforderlich ist. Die Basislinie wird durch die Interaktion definiert, die in einem identischen Testsystem, dem kein ER-Antagonist zugefügt wurde, gemessen wird.
Vorteile:
Das auf der Erfindung basierende In-vitro-Screeningverfahren kann natürliche oder synthetische Verbindungen auswählen, die eine spezifische neurotropisch Aktivität haben, basierend auf ihrer Fähigkeit, eine starke transkriptionale Aktivierung durch den ER auszuüben, ohne die gleichzeitige starke Rekrutierung von SRC-1. Das auf der Erfindung basierende Screeningverfahren beugt Tierversuchen vor.
In-vitro-Technologien des Stands der Technik zur Identifikation solcher Liganden verwenden Surrogatparameter (wie etwa Elongation neuronaler Prozesse, Überleben neurotoxischer Einwirkung), die die Trennungen zwischen der systemischen (z.B. uterotropischen) und neurotropischen Wirksamkeit der Liganden nicht vorhersagen können. Ein definiertes Kriterium für die selektive neurotropische Wirksamkeit östrogen-bezogener Liganden fehlt auf dem Stand der Technik. Die Ligandenauswahl hängt von Vergleichen zwischen systemischen und neurotropischen Wirkungen ab, die die Verwendung von Tieren zwangsläufig erfordert.
Der offensichtliche Vorteil der Erfindung ist, dass Tierversuche für das Finden von Liganden, die das Tier oder die Person, die die Liganden nimmt, nicht femi niert, nicht länger notwendig sind.
Auf dem Stand der Technik war mindestens ein Assay-System, das Tiere verwendet, notwendig. Der erfinderische Schritt wird unterstützt von dem Vergleich des Stands der Technik und den Assayergebnissen der Erfindung, die überraschenderweise Differentialexpression von SRC-1 sowohl in verschiedenen Teilen des Gehirns als auch bei verschiedenen Altern der individuellen Entwicklung zeigen.
Im Cortex wurde folgendes festgestellt: Je älter das Tier ist, umso niedriger ist die SRC-1-Anwesenheit in dieser Gehirnregion. Somit ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass eine Östrogenrezeptor-vermittelte Neuroprotektion und Reparatur, die Rekrutierung von SRC-1 und die Verstärkung der ER-Signalgebung in dieser Gehirnregion einschließen.
Im ventromedialen Nukleus wurde folgendes festgestellt: Die zunehmende Anwesenheit von SRC-1 in kritischen Phasen der sexuellen Reifung und im Erwachsenenstadium weist darauf hin, dass dieser Coaktivator die ER-Signalgebung in dieser Gehirnregion in Verbindung mit der Steuerung der sexuellen Funktion unterstützt.
Diese Differentialexpression im Laufe des Lebens wurde auf dem Stand der Technik noch nicht erwähnt. Daher schafft das Screeningverfahren ein sensitives technisches Werkzeug zum Finden von Liganden, das für die Behandlung und Prävention der Neurodegeneration in der Großhirnrinde verwendet werden kann, und somit ein nützliches Verfahren für die Behandlung und Prävention von altersbedingten kognitiven Störungen, affektiven Störungen, Alzheimerkrankheiten und zerebraler Ischämien/Schlaganfall ist.
Die durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren gefundenen Liganden können zum Erhalt der normalen Zellfunktionen des Nervensystems und zur Vorbeugung und Behandlung einer pathologischen Verschlechterung dieser Funktionen verwendet werden.
Homozygote SRC-1-Nullmutanten weisen keine offensichtlichen Veränderungen der Gehirnfunktion auf. [XU et al. (1998) Partial hormone resistance in mice with disruption of the steroid receptor coactivator-1 (SRC-1) gene, Science, Vol. 279, 1922–1925]; Diese Ergebnisse weisen nicht darauf hin, dass SRC-1 eine Rolle bei der Modulation der ER-vermittelten chemischen Signalgebung im ZNS spielt.
C. MEIJER, P. J. STEENBERGEN and E. R. DE KLOET (2000), Vol. 141, pp 2192–2199, beschreiben die Distribution von SRC-1 in Zellen verschiedener Gehirnbereiche. Für diese Versuche wurden nur Ratten gleichen Alters verwendet. Die Funktion der SRC-1-Expression im Gehirn wird von den Autoren nicht gekennzeichnet. Die Testergebnisse offenbaren nur die Ab- oder Anwesenheit von SRC-1-Expression im Gehirn. Die Expressionsrate wurde nicht quantitativ gemessen. Aus dieser Beschreibung kann nicht abgeleitet werden, dass SRC-1 irgendeine Signalübertragung durch Östrogenrezeptoren im Nervensystem in einem regionenspezifischen Kontext modulieren kann. Die Publikation von MEIJER et al. ist beschreibend und beinhaltet wedder eine Quantifikation der Expression von SRC-1 in diskreten Gehirnregionen, noch diskutiert sie die Ergebnisse im Kontext der ER-vermittelten Signalgebung.
Beispiele
Beispiel 1:
Quantifizierung regionaler Differenzen in der SRC-1-Expression in Rattengehirn während der postnatalen Entwicklung
Männliche und weibliche Wistar-Ratten wurden von gleichzeitig schwangeren Muttertieren (Max-Planck-Institut für Psychiatrie, München, Deutschland) erhalten. Innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Geburt wurden die Würfe auf 6 Jungen aussortiert. Die Tiere wurden unter Bedingungen kontrollierter Beleuchtung (hell/dunkel im 12-Stunden-Rhythmus; Licht an zwischen 7:00 und 19:00 Uhr), Temperatur (22 bis 24°C) und Luftfeuchtigkeit (60 Prozent) untergebracht, und hatten freien Zugang zu Standardlaborfutter und Leitungswasser. Nach dem Abstillen im Alter von 22 Tagen wurden die Ratten von ihren Muttertieren getrennt und nach Geschlecht in Kolonien von je 5 Tieren gruppiert. Der Zeitpunkt der Pubertät der Weibchen wurde durch Überprüfung der Vaginalöffnung und dem Auftreten zyklischer Veränderungen im vaginalen Epithelgewebe überwacht, die durch tägliche Abstriche, die im Alter zwischen 35 und 45 Tagen entnommen wurden, bestimmt wurden.
Die Tiere wurden in den folgenden Altern durch Dekapitieren getötet: 1. Tag (innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt), 7. Tag, 40. bis 45. Tag (in der Pubertät, wie bei den Weibchen definiert) und 90. Tag (sexuelle Reife). Pubertierende und sexuell reife Weibchen wurden während dem Diöstrus getötet. Die Gehirne wurden aus dem Schädel entfernt (ausgenommen die der neugeborenen Ratten) und in vorgekühltem Isopentan schockgefroren. Das Gewebe wurde bei –80°C bis zur Sektionierung gelagert. Die Versuchsmethoden wurden unter Einhaltung der regionalen und nationalen Tierschutzbestimmungen durchgeführt.
Ein 622-Basen-EcoRI-Fragment, das dem bp 1125 bis 1743 der menschlichen SRC-1A cDNA (U90661) entspricht, wurde gereinigt und in den Vektor pBS (Stratagene GmbH; Heidelberg, Deutschland) kloniert. Nach Verstärkung, Sequenzbestätigung und Linearisierung mit geeigneten Restriktionsnukleasen, wurde cRNA durch In-vitro-Transkription unter Verwendung von T3- und T7-Polymerasen für Antisense- bzw. Sense-Sonden synthetisiert. Radioaktive Markierung wurde mit ³⁵S-UTP und -CTP (NEN Life Science Products GmbH; Köln, Deutschland) erhalten. Die markierte cRNA wurde durch Phenol-/Chloroform-/Isoamylalkohol extrahiert und auf Nuctrap-Säulen (Stratagene) gereinigt. Die spezifische Aktivität der verwendeten Sonden überstieg 10⁶ cpm/μl.
Kranzförmige Kryosektionen in einer Dicke von 15 μm, die den medialen präoptischen Nukleus (MPN) und den ventromedialen hypothalamischen Nukleus (VMN) enthielten, wurden aus den Gehirnen erwachsener Ratten erhalten, bei einem Bregmalevel von -0,51 bzw. -2,45 mm [L. W. Swanson, Brain maps: Structure of the rat brain; Elsevier, Amsterdam, 1998]. Bei pubertären, juvenilen und neugeborenen Tieren wurden Proben, die die zwei interessierenden Regionen enthielten, aus seriellen rostrokaudalen Schnitten ausgewählt. Die Schnitte des VMN enthielten auch den rostralen Teil der Hippocampusformation und des nuklearen Amygdalakomplexes. Die Schnitte wurden auf gelatinebeschichtete Objektträger aufgebracht. Die Fixierung, Permeabilisierung, Hybridisierung mit ³⁵S-markierten Sonden und Stringenzwäsche wurden gemäß einem standardisierten Protokoll [H. J. Whitfield et al., Optimization of cRNA probe in situ hybridization methodology for localization of glucocorticoid receptor mRNA in rat brain: A detailed protocol. Cell. Mol. Neurobiol., vol. 10, pp. 145–157, 1990] durchgeführt. Nicht spezifische Hybridisierungssignale wurden durch die Hybridisierung von Kontrollschnitten jeder Altersgruppe mit der Sense-Sonde überwacht. Autoradiogramme wurden durch die 14-tägige Exposition an Hyperfilm βmax (Amersham; Braunschweig, Deutschland) generiert.
Die Filmautoradiogramme wurden mittels computergestützter Densitometrie (NIH Image 5.1; National Institute of Mental Health, Bethesda, USA) bewertet. Es wurden vier Messungen der optischen Dichte (graues Level) des interessierenden Bereichs mit automatischer Hintergrundsubtraktion in zwei nebeneinander liegenden Schnitten von jedem Individuum ausgeführt. In allen Altersgruppen wurden die Signaldichten in Quadraten gemessen (Hirnrinde, MPN und VMN) oder Streifen (Hippocampus-Unterfeld CA1) von identischer Größe, um systematische Fehler, die aus den altersbedingten Veränderungen resultieren, in der Dimension dieser Strukturen zu vermeiden. Individuelle Durchschnittswerte der optischen Dichte wurden für die Berechnung der spezifischen Radioaktivität (μCi/g Gewebe) mittels einer Polynom-Gleichung dritter Ordnung verwendet, die aus Messungen von coexponierten ¹⁴C-Standards (ARC; St. Louis, USA) resultierten. Die Gruppenmittelwerte wurden mittels Einweg-ANOVA verglichen; wo es angebracht war, wurden paarweise Vergleiche mittels des Student-Neuman-Keuls-Tests ausgeführt. Das Signifikanzlevel wurde auf p < 0,05 voreingestellt.
Auf den untersuchten anatomischen Leveln, wurden unterschiedlich starke spezifische Hybridisierungssignale im Großhirn und den CA-Unterfeldern der Hippocampus-Formation festgestellt; die medialen präoptischen, ventromedialen Nuklei und der Nukleus arcuatus, der zinguläre, parietale und temporale Cortex und der nukleare Amygdalakomplex wiesen alle moderate Signalintensität auf. Die Inkubation mit einer markierten Sense-Sonde war nicht in der Lage, ein spezifisches Hybridisierungssignal in irgendeiner Struktur oder Altersgruppe bereitzustellen.
Unter allen erforschten Strukturen wies die Hirnrinde neugeborener Tiere die höchste Dichte an SRC-1a-kodierenden Transkripten auf. Innerhalb der ersten Woche nach der Geburt wurde eine signifikante Abnahme an Signalintensität gemessen; der absteigende Trend setzte sich mit steigendem Alter fort, und resultierte in Erwachsenenlevels von ungefähr 30 Prozent der Level, die bei der Geburt gemessen wurden. In jedem erforschten Alter war die SRC-1a-Expression im Gehirncortex nicht in der Lage Geschlechtsunterschiede (vgl. Tabelle I) aufzuweisen.
Tabelle I
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Verstärkung der ER-vermittelten Signalgebung durch co-präsentes SRC-1 in der Hirnrinde, einer Struktur, die für die kognitive Leistungsfähigkeit entscheidend ist, abrupt abnimmt und mit steigendem Alter möglicherweise an funktioneller Bedeutung verliert. Außerdem weisen diese Daten darauf hin, dass, sobald die Gehirnentwicklung (einschließlich Neurogenese, neuronales Wachstum und Synapsenkonnektivität) abgeschlossen ist, die Rekrutierung von SRC-1 durch aktivierte ER eine vernachlässigbare Rolle bei der Vermittlung östrogener Wirkungen in der Hirnsrinde spielt. Im Hinblick auf die funktionelle Spezifität dieses Gehirnbereichs (kognitive Verarbeitung), erscheint es unwahrscheinlich, dass die SRC-1-Rekrutierung eine signifikante Bedeutung für die Manifestation von Östrogenwirkungen auf diese Gehirnfunktion haben dürfte.
Eine entgegengesetzte Entwicklungsdynamik der SRC-1-Expression wurde im ventromedialen hypothalamischen Nukleus (VMN) festgestellt, einem Gehirnbereich, der reich mit ER ausgestattet, und für die Steuerung der Reproduktionsfunktionen und des sexuellen Verhaltens durch Östrogene von überragender Bedeutung ist. Bei der Geburt waren die SRC-1a-Hybridisierungssignale im VMN bei beiden Geschlechtern moderat. Innerhalb der ersten Woche nach der Geburt wurden signifikante Anstiege der Transkriptdichten dokumentiert und, bei beiden Geschlechtern wurden um die Pubertät herum Höchstwerte der Signalintensitäten in dieser Struktur gemessen (vgl. Tabelle II)
Tabelle II
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Anwesenheit und, möglicherweise, die Rekrutierung von SRC-1 eine notwendige Vorbedingung für die Übertragung chemischer Signale durch Aktivierung des ER in einer Gehirnregion darstellt, die die reproduktionsbezogene endokrine Aktivität und das Verhalten reguliert. Diese Schlussfolgerung wird durch die Tatsache erhärtet, dass die SRC-1-Expression im VMN in den Lebensabschnitten abrupt ansteigt, in denen dramatische Übergänge im Reproduktionssystem stattfinden, z.B., Pubertätsdaten (am 40. Tag in Tabelle II) und während des östrischen Zyklus (Table III).
Tabelle III
Beispiel 2:
Assay für die quantitative Bestimmung der SRC-1-Rekrutierung durch den aktivierten ER und Differentialverhalten von ER-Liganden in diesem Assay
Der in diesem Beispiel verwendet Assay verwendet nur Verbindungen, die durch Östrogenaktivität gekennzeichnet sind. Die Assays zum Finden der Östrogenverbindungen wurden bereits entwickelt und publiziert. Diese Assays sind Standardassays, die dem Fachmann bekannt sind.
Der in dem vorliegenden Beispiel verwendete Assay zur Erforschung der Rekrutierung des ER und Coaktivators SRC-1 wird gemäß der Publikation von Gauchao ZHOH et al. (1998) Nuclear receptors have distinct affinities for co-activators: Characterization by fluorescence resonance energy transfer, Mol Endo, Vol 12, Seiten 1594–1604, insbesondere auf Seite 1602, ausgeführt. Außerdem wird das Assay-System in WO/18124 von Cummings et al beschrieben. Anstelle des in der internationalen Patentanmeldung erwähnten Europium-Cryptat wurde Europium-chelat – 100 ng von mit Euriopium markiertem Anti-GST-Antikörper je Vertiefung – in den Assays verwendet. Der markierte Antikörper wurde von Wallac, jetzt Perkin Elmer Lifesciences, geliefert. (Eu-W1024-markierte Anti-GST-Antikörper für Lance-Assays, Part Number AD 0065).
Das SRC-1 wird in einer Konzentration von 175 ng SRC-1 mit HIS-Anhang je Vertiefung verwendet. SRC-1 ist in jeder Vertiefung dieses Assay-Systems vorhanden. Bei Verwendung dieses Assay-Systems können die folgenden Ergebnisse bestimmt werden:
Die Kontrolle, die das natürliche Östrogen 17β-Estradiol [i] enthält, zeigt eine signifikante Interaktion zwischen ER und SRC-1 bei 10^–9 M.
Die synthetischen Östrogene
(ent-1,3,5(10)-Estratrien-3,17β-diol) [ii],
(3',15β-Dihydrocycloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,,-17α-diol) [iii],
(15β-allyl-estra-1,3,5,(10)-trien-3,17β-diol) [iv] und
(15β-propyl-estra-1,3,5,(10)-trien-3,17β-diol) [v]
wurden in dem oben beschriebenen System einem Vergleichstest unterzogen. Die Ergebnisse des Vergleichs werden in der folgenden Tabelle IV präsentiert.
Die Ergebnisse weisen nach, dass synthetische Verbindungen, die eine ähnliche agonistische Aktivität in ER-vermittelter transkriptionaler Regulation aufweisen, im Hinblick auf ihre Fähigkeit co-präsentes SRC-1 bei der Bindung an den ER zu rekrutieren, substantielle Unterschiede zeigen. Die berechneten Vergleichzahlen der Quotienten-Werte, die in den zwei Assay-Systemen erhalten wurden, erlauben die Identifikation von ER-Liganden mit differentieller Fähigkeit, SRC-1 in transkriptionaler Regulation zu engagieren. ER-Agonisten mit selektiven neurotropischen Eigenschaften sind jene, die höhere Verhältniszahlen der Werte zeigen, die im Assay-System II (Rekrutierung des ER und Coaktivators SRC-1) und Assay-System I (ER) bestimmt wurden.
Tabelle IV
Beispiel 3:
Nachweis selektiver neurotropischer Aktivität durch ER-Liganden, die dadurch identifiziert werden, dass sie nicht in der Lage sind, SRC-1 bei der ER-Bindung zu rekrutieren
Unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Assays haben wir die Verbindung 3'-15β-Dihydrocycloprop[14,15]estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17α-diol [iii] für die weitere Untersuchung ihrer neurotropischen und systemischen Östrogenwirkungen ausgewählt. Die Verbindung zeigte eine Bindung an ERα and ERβ mit einer relativen Affinität von 25 bis 30 Prozent der Affinität des natürlichen ER-Liganden 17β-Estradiol [i]. Außerdem wurde für die Verbindung eine messbare Aktivierung der Transkription eines ER-induzierbaren Reportergens in vitro nachgewiesen, mit EC50 von 10^–9 M (17β-Estradiol wies EC50 von 10^–10 M auf).
Verschiedene Dosen der interessierenden Verbindung und des Referenz-17β-Estradiols wurden sieben aufeinander folgende Tage lang subkutan an weibliche Ratten verabreicht, denen die Eierstöcke entfernt worden waren. Die Wirkung der Verbindungen auf die kognitive Leistung der Versuchstiere wurde durch die Überwachung des Erwerbs, der Konsolidierung und des Abrufens von aktivem Vermeidungsverhalten evaluiert. Nach der Tötung wurde eine morphometrische Bewertung der östrogen-sensitiven Organe (Uterus, Thymus, Nebennieren) gemacht. Die neurochemischen Wirkungen wurden durch die Quantifizierung der Transkription der ER-induzierten ZNS-spezifischen Gene in verschiedenen Gehirnbereichen bewertet, die mit verschiedenen Mengen an SRC-1 ausgestattet sind.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Ergebnisse anzeigen, dass

– die Kapazität von 3',15β-Dihydrocyc loprop[14,15]estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17α-diol [iii], östrogenähnliche Wirkungen in peripheren Östrogentargetorganen (Uterus, Thymus, Nebennieren) zu induzieren, um mehrere Male niedriger ist, als die des natürlichen Östrogens 17β-Estradiol, das auch bei der ER-Bindung SRC-1 stark rekrutiert;
– die Verbindung 3',15β-Dihydrocycloprop[14,15]estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17α-diol [iii] die Transkription des antiapoptotischen östrogenregulierten Gens bcl-2 in der Hirnrinde (einem Gehirnbereich mit geringer SRC-1-Expression) auf einen höheren Grad stimuliert als es 17β-Estradiol tut, wenn es in gleicher Dosis gegeben wird;
– die Verbindung 3',15β-Dihydrocycloprop[14,15]estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17α-diol [iii] die östrogenabhängige Expression der Oxytocinrezeptoren im SRC-1-reichen und reproduktionsrelevanten ventromedialen Nukleus (VMN) auf einen signifikant niedrigeren Grad als 17β-Estradiol induziert;
– die verhaltensbezogenen (kognitiven) Wirkungen der Verbindung 3',15β-Dihydrocycloprop[14,15]estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17α-diol, wie anhand der Retention des neu erworbenen aktiven Vermeidungsverhaltens gemessen, von denen des 17β-Estradiols nicht zu unterscheiden sind [i]; diese verhaltensbezogene Wirksamkeit war jedoch nicht mit östrogenabhängigen Veränderungen in peripheren östrogen-sensitiven Organen verbunden.

Die oben zusammengefassten Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Verbindung, die

– eine messbare Affinität für den ER aufweist,
– im Hinblick auf die transkriptionale Regulation der östrogenabhängigen Gene als ein Agonist des ER wirkt, und
– nicht in der Lage ist, SRC-1 bei der Bindung an den ER in vitro zu rekrutieren, als ein selektives neurotropisches Östrogen in vivo wirkt, während es vernachlässigbar die peripheren Östrogentargetorgane beeinträchtigt.

Claims

Verfahren zum in vitro-Screening hinsichtlich Östrogenrezeptor (ER)-Liganden mit spezifischer neurotropischer Aktivität mittels aufeinanderfolgender Verwendung mindestens zweiter Testsysteme, umfassend i. Verwendung eines Zell- oder Gewebe-Assay-Systems, das ER und ein ER-gesteuertes Reportergen enthält, zur Detektion der Aktivierung der Transkription, die durch Detektieren der effektiven Konzentration des ER-Liganden, die für die halbmaximale transkriptionale Induktion des ER-abhängigen Repotergens (EC 50) erforderlich ist, bestimmt ist, und Wahl der Ligandeninduzierenden Transkription und ii. Verwendung eines zellfreien oder enzymatischen Assay-Systems zur Bestimmung der physikalisch-chemischen Interaktion des Steroid-Rezeptor-Coaktivator-1 (SRC-1) oder seiner Fragmente NID-1, NID-2 oder NID-3 mit dem ER-Protein nach Bindung eines Liganden, der im ersten Assay-System ausgewählt wurde, die durch Detektieren der Dosis des ER-Liganden, die zum Auftreten erster signifikanter Anzeichen (mehr als das zweifache der Standardabweichung von der Basislinie) der physikalisch-chemischen Interaktion zwischen dem aktivierten ER und einer definierten Menge an SRC-1 oder eines Fragmentes davon bestimmt wird, wobei die Rekrutierung von SRC-1 oder seiner Fragmente sich auf die Erhöhung der Protein-Protein-Interaktion zwischen ER und SRC-1 oder seinen Fragmenten über die Basalinteraktionsrate, die in Abwesenheit eines ER-aktivierenden Liganden bestimmt wurde, bezieht, wobei ER-Agonisten mit selektiven neurotropischen Eigenschaften diejenigen sind, die Werte von weniger oder gleich zehn nmol/l im Assay-System (i) und Werte von größer oder gleich 100 nmol/l im Assay-System (ii) zeigen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei a. der Ligand in der Lage ist, die Transkription eines ER-abhängigen Reportergens in einer Dosis von gleich oder weniger 10 nm im ersten Assay-System zu induzieren, und wobei b. die molare Konzentration des Liganden, die für das Auftreten einer signifikanten (mehr als die zweifache Standardabweichung von der Basislinie) Protein-Protein-Interaktion zwischen co-exprimiertem ER und SRC-1 oder einem seiner Fragmente NID-1, NID-2 oder NID-3 in einem Testsystem erforderlich ist, gleich oder größer als 100 nm ist.