JP3754647B2

JP3754647B2 - エストロゲン受容体リガンドのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング

Info

Publication number: JP3754647B2
Application number: JP2001374287A
Authority: JP
Inventors: ウラディミールパチェフ; ユーリミーテフ; ジークムントヴォルフ; ゲーアノートランガー
Original assignee: シェーリングアーゲー
Priority date: 2001-11-07
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2006-03-15
Anticipated expiration: 2021-12-07
Also published as: EP1310799A1; DE60116109D1; DE60116109T2; US20030087303A1; US7166438B2; EP1310799B1; JP2003144192A; ATE313803T1; ES2253318T3

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リガンドのｉｎｖｉｔｒｏ検出方法、ならびに神経親和性および最小全身性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）エストロゲン様特性を有するエストロゲン受容体リガンドのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングに関する。
本発明は、さらに定義した特性を有するエストロゲン受容体リガンドを検出するためのステロイド受容体のコアクチベータ−１（ＳＲＣ−１）のｉｎｖｉｔｒｏ使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
他のエストロゲン感受性組織に影響を与えることのない、神経親和機能を有する物質
ＰＡＴＣＨＥＶらの国際公開公報ＷＯ９９／４２１０８号には、他の器官または系に影響を与えることなしに、中枢神経系でのエストロゲン欠乏を選択的に補充する薬剤としてステロイドが記載されている。そのような化合物（リガンド）は、選択的な神経親和特性を有しており、他のエストロゲン感受性の器官に影響を与えない。神経系に対する選択的な神経親和効果は、動物モデルで試験されている。
【０００３】
中枢神経系でのエストロゲン欠乏症候群の治療用薬剤の望ましい特性として、これらの薬剤が生殖系のエストロゲン感受性の組織（例えば、子宮内膜、乳房、下垂体）にほとんど影響を与えることなしに、または影響を与えることなしに、脳内のエストロゲン依存性の標的遺伝子に作用することが要求されている。
【０００４】
エストロゲンは、中枢神経系（ＣＮＳ）に多数の作用を有する。エストロゲンの内的作用は、脳機能のいくつかの側面を決定する神経回路の不可逆的なハード配線（ｈａｒｄｗｉｒｉｎｇ）を生じる［Ｖ．Ｋ．ＰａｔｃｈｅｖａｎｄＯ．Ｆ．Ｘ．Ａｌｍｅｉｄａ，Ｓｔｅｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｒ．Ｇ．ＬａｎｄｅｓＣｏｍｐａｎｙ，Ａｕｓｔｉｎ，１９９９］。
【０００５】
成体の脳において、生殖腺から導かれるエストロゲンの生理的レベルは、生殖機能に影響するとともに、学習、記憶、方向感覚、感情、認知情報の処理のような、生殖および性的行動と関連しない脳の活動に影響をおよぼす［Ｓ．Ｅ．ＡｌｖｅｓａｎｄＢ．Ｓ．ＭｃＥｗｅｎ，Ｅｓｔｒｏｇｅｎａｎｄｂｒａｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒａｇｉｎｇａｎｄｄｅｍｅｎｔｉａ；ｉｎＭ．ＯｅｔｔｅｌａｎｄＥ．Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｄｓ．，ＥｓｔｒｏｇｅｎｓａｎｄＡｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎｓ，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３５／ｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９９，ｐｐ．３１５−３２８］。エストロゲンの神経親和作用の大部分は、標的遺伝子の転写調節に関連し、この調節は、別の神経領域でのエストロゲン活性により誘導される。
【０００６】
エストロゲン受容体
エストロゲン受容体（ＥＲ）には２つの異性体、ＥＲαおよびＥＲβが存在する。それらの分布およびリガンド結合性については示されている［Ｖ．ＧＩＧＵＥＲＥｅｔａｌ．（１９９８）Ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ β：ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｅｓｔｒｏｇｅｎａｎｄａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇｅｎｓｉｇｎａｌｉｎｇ；ＳｔｅｒｏｉｄｓＶｏｌ．６３，ｐｐ．３３５−３３９ａｎｄＧ．Ｇ．ＫＵＩＰＥＲｅｔａｌ．（１９９７）Ｔｈｅｎｏｖｅｌｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｂｔｙｐｅ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｉｎｔｈｅｃｅｌｌ− ａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｏｎｓｏｆｅｓｔｒｏｇｅｎｓａｎｄａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，Ｖｏｌ．４１０：ｐｐ．８７−９０］。リガンドで活性化されるエストロゲン受容体は、エストロゲン感受性遺伝子プロモーターの、エストロゲン応答配列と呼ばれる特定のＤＮＡ配列と結合し、リガンドで活性化される転写因子として、それらの転写に影響をおよぼす。２つのＥＲ異性体は、いずれも脳内に存在しており、それぞれ別々の、機能的に異なる脳の領域で、必ずしもオーバーラップしない、異なった分布を有している［Ｐ．Ｊ．Ｓｈｕｇｈｒｕｅｅｔａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａａｎｄ −ｂｍＲＮＡｉｎｔｈｅｒａｔｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．３８８，ｐｐ．５０７−５２５，１９９７］。天然または合成のリガンドとの結合時、ＥＲは、ＥＲＥｓと結合して標的遺伝子の転写に影響を与える前に、ＥＲで媒介される標的遺伝子の転写モジュレーター（増幅器または減衰器）として作用する内因性のコアクチベーターおよびアダプタープロテインをリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔ）してもよい。
【０００７】
ステロイド受容体コアクチベーター１
ステロイド受容体コアクチベーター１（ＳＲＣ−１）は、リガンドの結合によって活性化される、核内受容体により媒体される転写の“増幅器”として作用する細胞タンパク質の一群に属している［Ｓ．Ａ．Ｏｎａｔｅｅｔａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｆｏｒｔｈｅｓｔｅｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７０，ｐｐ．１３５４−１３５７，１９９５］。エストロゲン受容体で調節される転写の、ＳＲＣ−１で媒介されるコアクチベーションは、アゴニストのコンホメーションにおけるＥＲの存在を必要とし、付加的な媒介物質（例えばＣＢＰ／ｐ３００）のリクルートを伴う。しかし、自律的な活性ドメインもまた、確認されている［Ｄ．Ｒｏｂｙｒｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅａｒｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎａｃｔｉｏｎ：Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒｓｈａｒｅｄｔａｓｋｓ，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．３２９−３４７，２０００］。
【０００８】
ＳＲＣ−１は、エストロゲン標的器官およびエストロゲン感受性腫瘍で、広範囲に発現している［ＢＥＲＮＳｅｔａｌ．（１９９８）ＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖａｌｕｅｏｆＳＲＣ−１ｆｏｒｔａｍｏｘｉｆｅｎｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｒｅｃｕｒｒｅｎｔｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．Ｔｒｅａｔ．Ｖｏｌ．４８，９７−９２，ｆｕｒｔｈｅｒＮＥＷＭＡＮＮｅｔａｌ．（２０００）Ｃｏｆａｃｔｏｒｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｌｉｇａｎｄ−ｂｏｕｎｄｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｄａｎｉｎｔｒｏｎ１ｅｎｈａｎｃｅｒｌｅａｄｓｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＲＢＢ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１９，４９０−４９７，ａｎｄＬＡＢＲＩＥｅｔａｌ．，（１９９９）ａｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＳＥＲＭａｃｔｉｎｇａｓｐｕｒｅａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｎｔｈｅｍａｍｍａｒｙｇｌａｎｄａｎｄｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ，Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．６９，５１−８４］。ＳＲＣ−１が遺伝子ターゲッティングによって不活性化された場合、エストロゲンに対する部分的な耐性が、子宮、前立腺、睾丸および乳腺のようないくつかの組織で検出される［ＸＵｅｔａｌ．［１９９８］Ｐａｒｔｉａｌｈｏｒｍｏｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｍｉｃｅｗｉｔｈｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１（ＳＲＣ−１）ｇｅｎｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７９，１９２２−１９２５］。しかし、ホモ接合ＳＲＣ−１ヌル突然変異体で、天然の表現型に比べて脳機能に変化が生じていることは証明されていない。これらの結果は、ＳＲＣ−１が、ＣＮＳにおいて、ＥＲに媒介される化学信号を調節する役割も果たしていない可能性を教示している。ＳＲＣ−１の２つの異性体、すなわちＳＲＣ−１ａおよびＳＲＣ−１ｅが、成体ラットの脳の異なる領域に分布していることが示されている［Ｏ．Ｃ．ＭＥＩＪＥＲ，Ｐ．Ｊ．ＳＴＥＥＮＢＥＲＧＥＮａｎｄＥ．Ｒ. ＤＥＫＬＯＥＴ（２０００）ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｉｏｎａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓＳＲＣ−１ａｎｄＳＲＣ−２ｉｎｂｒａｉｎａｎｄｐｉｔｕｉｔａｒｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４１，ｐｐ．２１９２−２１９９］。ＳＲＣ−１は、海馬、扁桃体、視床下部、基底核および等皮質を含む多くの脳領域で発現しており、認知情報の処理または生殖関連機能の調節のいずれかに関する別々の機能を果たす。それらがエストロゲン感受性であることは周知である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、生殖と関連しない脳機能を有するＣＮＳの領域でエストロゲン様作用を有するエストロゲン受容体リガンドを検出するためのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングを提供することである。同時にリガンドは、脳以外のエストロゲン標的器官に効果的であってはならない。そのようなＣＮＳ選択性のエストロゲン受容体リガンドは、エストロゲンの欠乏によって引き起こされるＣＮＳの機能障害の予防および治療に使用することができる。そのようなリガンドは、エストロゲン投与による子宮内膜および乳房への副作用、ならびに性腺分泌ホルモン分泌の神経内分泌調節における副作用を防止する。
【００１０】
【発明を解決するための手段】
本発明の課題は、以下の工程よりなる少なくとも２つの検定系を用いた選択および検出を含んだ、第１の態様の試験物質（リガンド）のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング方法により解決される。
（ｉ）第１の細胞検定系または組織検定系で、エストロゲンレセプター（ＥＲ）の活性により媒介され、ＥＲおよびＥＲに誘導されるレポーター遺伝子を含んだ前記細胞検定系または組織検定系での効力の検出によって測定される転写活性、を有するリガンドを選択し、前記リガンドは、１０ｎｍｏｌ／ｌ以下のＥＣ_50(ER)（最大有効リガンド濃度半値）を有する前記第１の検定系で効力を活性化し、それにより転写の活性化を検出する工程と、
（ii）第２の無細胞検定系または酵素検定系で、前記無細胞検定系または酵素検定系での相互作用の効力の検出により測定される、ＳＲＣ−１、場合によりおよびそのフラグメントと、前記ＥＲとの物理的化学的相互作用（リクルート）、を選択し、前記リガンドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ_50(ER+SRC)を有する前記第２の検定系で、前記ＥＲを活性化し、共に存在している前記ＳＲＣ−１、場合によりおよびそのフラグメントとの相互作用を誘導してＳＲＣ−１、場合によりおよびそのフラグメントと、ＥＲとの前記物理的化学的相互作用を検出する工程。
【００１１】
さらに、本発明の課題は、無細胞検定系または酵素検定系において、前記無細胞検定系または酵素検定系での相互作用の効力の検出により測定されるＳＲＣ−１、場合によりおよびそのフラグメントと、ＥＲとの物理的化学的相互作用（リクルート（ｒｅｃｒｕｉｔｅｍｅｎｔ））を選択することにより試験物質（リガンド）をｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングする方法で、前記リガンドは、既知のエストロゲンまたはエストロゲン活性を有するリガンドであり、前記リガンドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ_50(ER+SRC)を有する前記第２の検定系で、前記ＥＲを活性化し、共に存在しているＳＲＣ−１、場合によりおよびそのフラグメントとの相互作用を誘導して、ＳＲＣ−１、場合によりおよびそのフラグメントと、ＥＲとの前記物理的化学的相互作用を検出する、第２の態様の試験物質（リガンド）のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング方法により解決される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
定義
ｉｎｖｉｖｏ
“ｉｎｖｉｖｏ技術”は、手術または物理療法により、人体または動物の身体を治療する方法、および人体または動物の身体に対して実施される診断方法を表す。
【００１３】
ｉｎｖｉｔｒｏ
表現“ｉｎｖｉｔｒｏ”は、全てのｉｎｖｉｖｏ技術および上記した方法を除く。本願において、表現“ｉｎｖｉｔｒｏ”は、細胞培養、組織培養、器官の部分、器官、器官系および動物の身体、特に人体、の部分の切片、のような培養を表す。これらの試験片は、全て動物または人間の生体から取り出される。試験片は、動物（人間を含む）の生体に再び導入されない。好ましくは、表現“ｉｎｖｉｔｒｏ”は、生体の外部での、細胞、その部分、精製した成分またはホモジネートを用いる人工の系により特徴付けられる化学的な、および／または商業的な実験を表す。
【００１４】
リガンド
表現“リガンド”は、ＥＲとの結合時、ＳＲＣ−１をリクルートすることなしに、ＥＲと結合することができ、および／または中枢神経系組織において、選択的で、神経親和性のエストロゲン様作用を有し、生殖系の組織に副作用を与えない、あらゆる種類の天然発生または合成的に製造される化学物質を含む。本表現において、前記リガンドは前記試験物質である。
【００１５】
検出
エストロゲン感受性因子の遺伝子産物は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは酵素検定系のような、ＥＲＥ産物の関数が測定される様々な系で識別することができる。そのような方法は、ハンドブック類に記載されている。
【００１６】
細胞または組織の検定
本願において、この表現は、さらに細胞培養、組織培養、器官の部分、器官、器官の系統および動物の身体、特に人体、の部分の切片のような、培養を用いた検定を意味する。
【００１７】
転写活性およびその検出
転写活性は、対応する遺伝子のプロモーター領域への外的（薬剤）影響の結果によって生じる、定義されたタンパク質の変化をエンコードするｍＲＮＡ量の範囲を表す。
【００１８】
第２の検定系は、コアクチベーターのリクルート機構を基礎とし、転写には間接的にのみ基づいている。この場合におけるコアクチベーターのリクルートは、コアクチベーターが、より低い範囲まで欠乏している場合にのみ活性化される転写を刺激する。本発明において、発明の核心は、無細胞検定系または酵素検定系に関する記載であり、そこではコアクチベーターのリクルートが、転写そのものに関する結果を生じることなしに測定される。コアクチベーターＳＲＣ−１の存在する検定系が、明らかに転写における増加を導くという事実は、当業者に周知である。
【００１９】
そのようなＥＲで調節される転写の活性とコアクチベーターとの相関は、例えば１９９９年４月１５日に発行されたＣｕｍｍｉｎｇｓらの国際公開公報ＷＯ９９／１８１２４号に記載されている。より古い方法は、ＫＡＭＥＩらにより記載されている［ＣｅｌｌＶｏｌ．８５，ｐａｇｅｓ４０３−４１４］。そのような方法は、他の事項の中でも、融合タンパク質の構築、³²Ｐ標識タンパク質の調製、特殊発現ベクター、すなわち酵母２種ハイブリッド検定用、転写活性検定用の特殊発現ベクターの構築、多くのゲルの運動、抗体の増加を伴う。これらの方法は、核受容体とコアクチベーターとのリガンドに依存した結合において有利である。リガンドが存在しない場合に、核受容体と核受容体アクチベーターとの結合は起こらない。しかし、リガンドが存在する場合、そのような結合が起こり、蛍光標識核受容体と蛍光標識アクチベーターの間の共鳴蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出することができる。さらなるリガンドは、試薬に誘導される核受容体コアクチベーターの相互作用を防止する、または様々な程度に（または様々な用量で）中断する能力に基づいて識別することができる。核受容体またはそのリガンド結合ドメインは、上記した核受容体のリガンドの検出方法で使用される蛍光試薬で標識される。
【００２０】
効力
効力は、ＥＣ₅₀（このリガンドに結合する受容体により特異的に影響される標的パラメータの最大影響値の半値に必要とされる用量）により決定されるリガンド濃度の値である。効力は、主に個々のリガンドと、受容体との間の結合親和性および、化学信号伝達を変化させる可能性のある、受容体タンパク質におけるリガンドに誘導されるコンホメーション変化に依存する。
【００２１】
ＥＲの調節
ＥＲの調節は、従来技術に広く記載されている。
【００２２】
レポーター遺伝子
他の遺伝子または調節配列と、連鎖してまたは共役して、それら配列の活性を検出する遺伝子または遺伝子フラグメントである。レポーター遺伝子は、容易に検出することができる遺伝子産物を産生することが必要とされる。さらに、遺伝子産物は、これらの産物を発現する生体に対して有毒であってはならない。レポーター遺伝子については、ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５２，
ｐａｇｅｓ７０９−７１３（１９８７）に記載されている。さらなる方法は、ＨＡＲＲＩＳらの国際公開公報ＷＯ００／３７６８１号（２０００年６月２９日発行）、ＫＵＳＨＮＥＲらのＷＯ９９／１１７６０号（１９９９年３月１１日発行）に記載されており、これらは引用することにより本明細書の一部をなす。
【００２３】
転写
ＤＮＡを鋳型として用い、５’→３’方向のＲＮＡポリメラーゼを利用したＲＮＡ合成である。転写は、２本のＤＮＡ鎖のうちの１つのＤＮＡ配列を、１本鎖のＲＮＡ配列に伝達する工程である。
【００２４】
転写の活性
この用語は、ＥＲで調節される、またはＥＲに依存するレポーター遺伝子の活性における、リガンドが存在しない場合に観察される基礎転写速度を上回る増加をいう。
【００２５】
調節
分子はＥＲの転写速度に作用している。活性化は、全てのより速い転写速度を含む。減少は、転写速度の低下を表す。基礎転写速度は、リガンドが存在しない条件での値であり、その条件は、様々な検定系で比較することができる（ＥＲを含む少なくとも１つの検定系と、ＥＲとＳＲＣ−１とを含む他の検定系）。
【００２６】
無細胞系
無細胞系を得るために、細胞膜または細胞壁を破壊し、細胞の内部（サイトゾル）から、細胞膜の断片および細胞壁の断片を、部分的に、または完全に、例えば遠心分離により除去する。そのような細胞区画を含んだ有機成分は、無傷な細胞に特有の生化学相互作用の開始する能力を維持することができる。
【００２７】
酵素検定
酵素検定では、特定の基質を触媒するため、特定の酵素と、必要に応じて補助因子が使用される。基質および産物の濃度の変化が測定される。酵素検定は、通常、特別の酵素と基質のカスケードを含む。
【００２８】
コアクチベーターのリクルート
ＳＲＣ−１のリクルートとは、ＥＲおよびＳＲＣ−１間でのタンパク質−タンパク質相互作用における、ＥＲを活性化するリガンドが存在しない場合に測定される基礎相互作用速度を上回る増加をいう。
【００２９】
リクルート
ＳＲＣ−１のリクルートは、共に存在しているＥＲと、ＳＲＣ−１との間でのタンパク質−タンパク質相互作用による会合の度合の、ＥＲアゴニストの存在する場合と、存在しない場合との比較に関する。数値で表すと、リクルートは、試験系で共に発現したＥＲとＳＲＣ−１の間のタンパク質−タンパク質相互作用の有意な発生（ベースラインからの標準的なずれの２倍以上）に必要とされるＥＲアゴニストのモル濃度により定義される。ベースラインは、ＥＲアンタゴニストが添加されていない理想的な試験系で測定される相互作用により定義される。
【００３０】
発現フラグメントは、ＮＩＤ（核不活性化ドメイン（ｎｕｃｌｅａｒｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｄｏｍａｉｎ））１，２または３のみを表しており、それらについては定義されている［ＸｉｕＦｅｎＤｉｎｇ，ＣａｒｏｌＭ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＨａｎＭａ，ＨｅｎｇＨｏｎｇ，ＲｏｓａｌｉｅＭ．Ｕｈｔ，ＰｅｔｅｒＪ．ＫｕｓｈｎｅｒａｎｄＭｉｃｈａｅｌＲ．Ｓｔａｌｌｃｕｐ（１９９８）ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２（２）：３０２−３１３Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ１９９８ｂｙＴｈｅＥｎｄｏｃｒｉｎｅＳｏｃｉｅｔｙ；ＮｕｃｌｅａｒＲｅｃｅｐｔｏｒ−ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅｓｏｆＣｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄＲｅｃｅｐｔｏｒＩｎｔｅｒａｃｔｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ１（ＧＲＩＰ１）ａｎｄＳｔｅｒｏｉｄＲｅｃｅｐｔｏｒＣｏａｃｔｉｖａｔｏｒ１（ＳＲＣ−１）：ＭｕｌｔｉｐｌｅＭｏｔｉｆｓｗｉｔｈＤｉｆｆｅｒｅｎｔＢｉｎｄｉｎｇＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ］。
【００３１】
第１の態様の試験物質のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング方法において、検定系における（ｉ）および（ii）の順序は、変更可能である。好ましく使用される検定系において、第１の検定系は、最小の正の選択数または最小の作業に導く検定系である。リガンドのエストロゲン活性が既知である全ての場合において、ＥＲおよびコアクチベーターＳＲＣ−１の組み合わせを含んだ第２の検定系のみが実施される。
【００３２】
第１の態様の試験物質のスクリーニング方法において、（ｉ）および（ii）と記載した検定系の連続した使用は、好ましいリガンド、すなわち、検定系（ｉ）で最大転写活性の半値を生じさせるのに必要な用量と比べると、定義した濃度で検定系（ii）を測定した際に、ＳＲＣ−１相互作用をほとんど誘導しない化合物、の選択を与える。
【００３３】
第２の態様の試験物質のスクリーニング方法において、好ましくは、本発明による試験物質（リガンド）のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング方法において、前記リガンドは、エストロゲンであり、かつＥＲおよびＥＲに誘導されるレポーター遺伝子よりなる細胞検定系を転写により活性化し、
前記リガンドは、１０ｎｍｏｌ／ｌ以下のＥＣ_50(ER)（最大有効リガンド濃度の半値）で効力を活性化する。
【００３４】
【実施例】
（実施例１）
生後発育時のラットの脳でのＳＲＣ−１の発現における領域的な相違の定量化
雌雄のウィスターラットを、タイムプレグナントダム（ｔｉｍｅ−ｐｒｅｇｎａｎｔｄａｍ）から得た（ＭａｘＰｌａｎｃｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｓｙｃｈｉａｒｙ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。出生後最初の２４時間以内に、同腹子から６匹を選択した。選択された６匹のマウスは、管理された照明（明／暗：１２時間／１２時間；午前７時から午後７時まで照明点灯）、温度（２２〜２４℃）および湿度（６０％）条件下で飼育され、標準的な研究所の食餌および生水を自由に利用できるようにされていた。生後２２日目の離乳時に、ラットは雌親から分離され、性別により５つの群に分類された。生後３５日目から４５日目までの期間、毎日膣スミアを測定することで、膣口、および膣上皮における周期的な変化を調べることにより、雌の春季発動期をモニタした。
【００３５】
ラットは、生後以下の日数を経た時点で、断頭により犠牲にされた。
１日（生後２４時間以内、）、７日、４０〜４５日（雌で定義した春季発動期）、９０日（性的成熟）
春季発動期および性的成熟の雌は、発情間期に犠牲にされた。脳を頭蓋から取り出し（新生ラットのものを除く）、プレチルド（ｐｒｅｃｈｉｌｌｅｄ）イソペンタン中でスナップ凍結（ｓｎａｐｆｒｏｚｅｎ）させた。組織は切断するまで−８０℃で保存した。実験手順は、動物保護に関する地方の、および国の規則を遵守していた。
【００３６】
ヒトＳＲＣ−１Ａ（Ｕ９０６６１）のｂｐ１１２５−１７４３に相当するＡ６２２−ｂａｓｅｓＥｃｏＲｌフラグメントを精製し、ベクターｐＢＳ（ＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＰｒｏｄｕｃｔｓＧｍｂＨ；Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローンした。増幅、配列確認および適切な制限ヌクレアーゼを用いた線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ）によって、ｃＲＮＡが、アンチセンスプローブ用のポリメラーゼＴ３およびセンスプローブ用ポリメラーゼＴ７を用いたｉｎｖｉｔｒｏ転写により合成された。放射性の標識物質は、³⁵Ｓ−ＵＴＰおよび−ＣＴＰ（ＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＰｒｏｄｕｃｔｓＧｍｂＨ；Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。標識したｃＲＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールにより抽出し、Ｎｕｃｔｒａｐカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で精製した。使用したプローブの比活性は、１０⁶ｃｐｍ／μｌ超であった。内側視索前核（ＭＰＮ）および視床腹内側核（ＶＭＮ）を含んだ厚さ１５μｍの冠状凍結切片を、各々ブレグマレベル−０．５１ｍｍおよび−２．４５ｍｍの成体ラットの脳から得た［Ｌ．Ｗ．Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｂｒａｉｎｍａｐｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｒａｔｂｒａｉｎ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８］。春季発動期、幼形および新生のラットについて、連続した吻側尾側切片から関心のある２つの領域を選択した。ＶＭＮ切片は、また、海馬体の吻部と、扁桃核体を含んでいる。切片は、ゼラチンでコートされたスライドガラス上に載せられた。標準化されたプロトコルに従い、固定、易透化、³⁵Ｓ標識プローブとのハイブリダイゼーションおよび厳密な洗浄を実施した［Ｈ．Ｊ．Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃＲＮＡｉｎｒａｔｂｒａｉｎ：Ａｄｅｔａｉｌｅｄｐｒｏｔｏｃｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ．，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１４５−１５７，１９９０］。各年齢グループからの対照切片をセンスプローブでハイブリダイズすることにより、非特異的なハイブリダイゼーション信号がモニタされた。Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ βｍａｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に１４日間に露出してオートラジオグラフを作成した。
【００３７】
オートラジオグラフフィルムは、コンピュータ利用デンシトメトリー（ＮＩＨＩｍａｇｅ５．１；ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡ）で評価された。個々の個体からの２つの隣接する切片について、関心がある領域の吸光度測定（グレイレベル）を４回実施した（バックグラウンドを自動減算）。全ての年齢グループについて、同一の大きさの四角形（大脳皮質，ＭＰＮおよびＶＭＮ）またはストリップ（海馬部分体ＣＡ１）で測定を行い、年齢に関連する変化へのこれらの構造の大きさによる影響を防止した。個々の平均吸光度は、共に露出させた¹⁴Ｃ標準物質（ＡＲＣ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）の測定から得られた三次の多項式を用いて、比放射能信号（μＣｉ／ｇ（組織））を解析するのに使用された。グループ平均は、一方向の分散分析（ＡＮＯＶＡ）により比較された。そこでは、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓｔｅｓｔによる適切な、一組の比較が実施された。有意水準は、ｐ＜０．０５に予め設定された。
【００３８】
調査した解剖レベルにおいて、歯状回および海馬体のＣＡ部分体で、異なった、強い、固有のハイブリゼーション信号が確認された。内側視索の腹内側弓状核、帯状をした頭蓋側頭皮質および扁桃核は全て適度の信号強度を示していた。標識センスプローブを用いたインキュベーションは、いずれかの構造または年齢グループで固有のハイブリダイゼーション信号を与えることができなかった。
【００３９】
調査した全構造中、新生ラットの大脳皮質が、最も高いＳＲＣ−１ａコード化転写強度を示していた。出生後１週間以内に、信号強度に有意な低下が測定された。低下の傾向は、年齢の増加と共に継続し、成体でのレベルは、出生時に測定したレベルの約３０％であった。調査したいずれの年齢においても、脳皮質におけるＳＲＣ−１ａの発現は、性別による相違を示すことができなかった（表１参照）。
【００４０】

【００４１】
これらの結果は、認知活動にとってきわめて重要な大脳皮質における、ＥＲに媒介される信号の、共に存在するＳＲＣ−１による増幅が、年齢の増加と共に突然減少し、おそらく機能的な重要性を喪失することを示唆している。さらに、これらのデータは、初期の脳の発育（神経発育、ニューロンの成長およびシナプスの接続性を含む）が一度達成されると、ＳＲＣ−１の、活性化されたＥＲによるリクルートは、大脳皮質におけるエストロゲン作用においてほとんど役割を果たさないことを示唆している。この脳領域の機能的特異性（認知処理）に関して、ＳＲＣ−１のリクルートは、この脳機能へのエストロゲン作用の発現に対する有意な重要性を持たないと考えられる。
【００４２】
ＳＲＣ−１発現についての、反対方向の発育面での原動力が、ＥＲを十分に供給されており、エストロゲンによる生殖機能および性的機能の調節において重要性が高い視床腹内側核で確認された。出生時、ＶＭＮにおけるＳＲＣ−１ａハイブリダイゼーション信号は、雌雄いずれにおいても適度の強度である。生後第１週以内に、転写強度における有意な増加が記録されている。この構造体における最大信号強度は、雌雄いずれにおいても春季発動期頃に測定された（表２参照）。
【００４３】

【００４４】
これらの結果は、ＳＲＣ−１の存在と、おそらくそのリクルートが、ＥＲを介した、生殖関連の内分泌物の活性および挙動を調節する脳の領域における化学信号の伝達に必要な予備条件を表している。この結論は、ＶＭＮでのＳＲＣ−１の発現が、生命段階のうち、生殖系に劇的な変化が起こる段階、例えば春季発動期（表２の４０日のデータ参照）および発情周期中（表３）、に突然増加するという事実により確認される。
【００４５】

【００４６】
（実施例２）
活性化されたＥＲによるＳＲＣ−１リクルートを定量評価するための検定およびこの検定におけるＥＲリガンドの行動分化
本実施例で実施した検定では、エストロゲン活性により特徴付けられる化合物のみを使用した。エストロゲン活性を有する化合物を見い出すための検定法は開発され、開示されている。これらの検定は、当業者に周知の標準的な検定である。
【００４７】
本実施例では、ＥＲおよびコアクチベータ−ＳＲＣ−１のリクルートを調査するための検定を、ＧａｕｃｈａｏＺＨＯＨらの刊行物［Ｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｈａｖｅｄｉｓｔｉｎｃｔａｆｆｉｎｉｔｉｅｓｆｏｒｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ＭｏｌＥｎｄｏ，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１５９４−１６０４（特に１６０２頁）（１９９８）］に従って実施した。さらに、検定系は、Ｃｕｍｍｉｎｇｓらの国際公開公報ＷＯ／１８１２４に示されている。本検定では、同公報に示されたユーロピウムクリプテートの代わりに、ユーロピウムキレート、１ウェル当たりユーロピウム標識抗ＧＳＴ抗体１００ｎｇ、を使用した。標識された抗体は、Ｗａｌｌａｃ社（現ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）製である（ＬａｎｃｅＡｓｓａｙ用のＥｕ−Ｗ１０２４標識抗ＧＳＴ抗体、パーツ番号ＡＤ００６５）。
【００４８】
ＳＲＣ−１は、１ウェル当たり標識されたＳＲＣ−１が１７５ｎｇとなる濃度で使用した。
ＳＲＣ−１はこの検定系の全てのウェルで存在していた。
【００４９】
この検定系を用いて、以下の結果が得られた。
天然エストロゲン１７βエストラジオール［ｉ］を含んだ対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、１０^-9Ｍで、ＥＲとＳＲＣ−１との間の有意な相互作用を示した。
合成エストロゲン（ｅｎｔ−１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１７βジオール）［ii］，（３’，１５β−ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］−エストラ−１，３，５（１０），８−テトラエン−３，１７αジオール）［iii ］，（１５βアリル−エストラ−１，３，５，（１０）−トリエン−３，１７βジオール）［iv］および（１５β−プロピル−エストラ−１，３，５，（１０）−トリエン−３，１７βジオール）［ｖ］について、上記した系で比較試験を実施した。比較の結果を以下の表４に示した。
【００５０】
結果は、ＥＲに媒介される転写調節に関して、同様のアゴニスト活性を示す合成化合物が、ＥＲとの結合時に、共に存在しているＳＲＣ−１をリクルートする能力において有意な相違を示すことを証明していた。２つの検定系で得られた数値間での計算された比は、転写の調節において、異なるＳＲＣ−１との結合能を有するＥＲリガンドの識別を与える。選択的なニューロン特性を有するＥＲアゴニストは、検定系Ｉ（ＥＲ）および検定系II（ＥＲおよびコアクチベーターＳＲＣ−１のリクルート）で測定された数値間の比がより高い値を示している。
【００５１】
【表１】

【００５２】
（実施例３）
ＥＲ結合時、ＳＲＣ−１リクルートが発生しないことにより識別される、ＥＲリガンドによる選択的なニューロン活性の証明
実施例２に示した検定法を用いて、化合物３’１５β−ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テトラエン−３，１７αジオールを選択して、神経的作用および全身作用をさらに調査した。化合物は、天然ＥＲリガンド１７β−エストラジオール［ｉ］に対して、２５〜３０％の相対親和性でＥＲαおよびＥＲβと結合することが示された。さらに、化合物は、１０^-9ＭのＥＣ₅₀で、ｉｎｖｉｔｒｏのＥＲ誘導レポーター遺伝子の転写において測定可能な活性を示していた（１７β−エストラジオールは、１０^-10 ＭのＥＣ₅₀で示す）。
【００５３】
関心のある化合物と対照標準の１７β−エストラジオールを、卵巣切除された雌のラットに、異なる当量で、連続７日間皮下投与した。実験動物の認知行動における化合物の投与の効果は、積極的な回避行動の習得、強化および回復をモニタすることで評価した。実験動物を犠牲にした際、エストロゲン感受性の器官（子宮、胸腺、分泌器官）の体形測定評価を実施した。神経化学作用は、異なる量のＳＲＣ−１が供給された、異なる脳領域のＥＲに誘導されるＣＮＳ固有の遺伝子の転写を定量することで評価した。
【００５４】
要約すると、以下の結果が示された。
３’，１５β−ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テトラエン−３，１７α−ジオール［iii］が、末梢エストロゲン標的器官（子宮、胸腺、副腎）でエストロゲン様作用を誘導する能力は、ＥＲ結合時にＳＲＣ−１を強くリクルートさせる、天然エストロゲン１７β−エストラジオールのそれよりも数倍低い。
【００５５】
化合物３’１５β−ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テトラエン−３，１７α−ジオール［iii ］は、大脳皮質（ＳＲＣ−１の発現が少ない脳領域）で抗アポトーシスのエストロゲンで調節される遺伝子ｂｃｌ−２を刺激する度合が、１７β−エストラジオールを同一用量与えた場合に比べてより高い。
【００５６】
化合物３’１５β−ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テトラエン−３，１７α−ジオール［iii ］は、ＳＲＣ−１リッチでのオキシトシン受容体、および生殖関連の腹内側核の、エストロゲンに依存した発現を誘導する度合が、１７β−エストラジオールよりも有意に低い。
【００５７】
新たに習得した積極的な回避行動の保有により測定されるように、化合物３’１５β−ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テトラエン−３，１７α−ジオール［iii ］の行動面（認知面）への影響は、１７β−エストラジオールのそれと区別できない。しかし、この行動面への影響は、末梢のエストロゲン感受性器官におけるエストロゲンに依存した変化に関連していない。
【００５８】
上記要約した結果は、ＥＲに対して測定可能な親和性を示し、エストロゲン依存の遺伝子の転写調節に関して、ＥＲのアゴニストとして作用し、ｉｎｖｉｔｒｏのＥＲとの結合時に、ＳＲＣ−１のリクルートを発生させない化合物は、ｉｎｖｉｖｏの選択的な神経親和エストロゲンとして作用し、その一方で末梢のエストロゲン標的器官にはほとんど影響を与えないことを示唆している。
【００５９】
本発明に基づくｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング方法は、強いＳＲＣ−１のリクルートを同時に引き起こすことなく、ＥＲを介した、強い転写活性を発現する能力に基づく、固有の神経親和活性を有する天然または合成化合物を選択することができる。本発明に基づくスクリーニング方法は、動物実験を排除している。
【００６０】
そのようなリガンドの識別するための従来のｉｎｖｉｔｒｏ技術では、リガンドの全身的作用（例えばｕｔｅｒｏｔｒｏｐｉｃ）と神経的作用の間での分離を予測できない代用パラメータ（ニューロンプロセスの伸張、神経毒の影響時の生存のような）を使用している。エストロゲン関連のリガンドの選択的な神経作用に関する定義された基準は、従来技術では見つけられていない。リガンドの選択は、動物の使用を欠くことができない全身的作用および神経的作用間での比較に依存している。
【００６１】
本発明の明確な長所は、投与された動物または人間が雌性化されないリガンドを見つけるのに、動物実験をもはや必要としないことである。
【００６２】
従来技術においては、動物を用いた少なくとも１つの系が必要であった。本発明の進歩性は、従来技術と、脳の部位の相違、および発育年齢の相違のいずれにおいても、驚くほど異なったＳＲＣ−１の発現を示す本発明での検定結果との比較によって支持される。
【００６３】
皮質において、以下の点が明らかになっている。年齢の高い動物ほど、この脳の領域におけるＳＲＣ−１の存在量は少ない。したがって、エストロゲン受容体に媒介される神経保護および修復が、この脳の領域におけるＳＲＣ−１のリクルートおよびＥＲ信号の増幅を伴う可能性はほとんどない。
【００６４】
腹内側核においては、以下の点が明らかになっている。性的成熟の臨界段階および成体におけるＳＲＣ−１の存在量の増加は、このコアクチベーターが性的機能の調節に関連しているこの脳の領域でのＥＲシグナルを補助していることを示唆している。
この寿命を通して異なった発現は、従来技術では言及されていない。
【００６５】
ホモ接合のＳＲＣ−１ヌル突然変異体では、脳機能に明白な変化はない［ＸＵｅｔａｌ．（１９９８）Ｐａｒｔｉａｌｈｏｒｍｏｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｍｉｃｅｗｉｔｈｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１（ＳＲＣ−１）ｇｅｎｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７９，１９２２−１９２５］。これらの結果は、ＳＲＣ−１が、ＣＮＳでのＥＲに媒介される化学信号の調節にいかなる役割も果たしていないことを示唆している。
【００６６】
異なる脳領域の細胞におけるＳＲＣ−１の分布は示されている［Ｃ．ＭＥＩＪＥＲ，Ｐ．Ｊ．ＳＴＥＥＮＢＥＲＧＥＮａｎｄＥ．Ｒ．ＤＥＫＬＯＥＴ（２０００），Ｖｏｌ．１４１，ｐｐ．２１９２−２１９９］。これらの実験には同一年齢のラットのみが使用された。上記した文献の筆者は、脳におけるＳＲＣ−１発現の機能について示していない。試験結果は、脳におけるＳＲＣ−１の発現の有無のみを示している。発現速度は、定量的に測定されていない。この記載から、ＳＲＣ−１は、神経系のエストロゲン受容体による何らかの信号伝達を、領域特有の関係で媒体する可能性があると導くことはできない。ＭＥＩＪＥＲらの刊行物は、単に事実に基づくものであり、異なる脳領域でのＳＲＣ−１の発現の定量化を含んでおらず、またＥＲに媒介される信号との関係について結論を述べていない。
【００６７】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法は、脳皮質における神経変性の治療および予防に使用可能なリガンドを見つけるための高精度の技術的ツールを与える。本スクリーニング方法は、したがって年齢に関連する認知障害、情動障害、アルツハイマー病および脳虚血／脳卒中の治療および予防のための有用な方法である。
【００６８】
本発明のスクリーニング方法で得られたリガンドは、神経系の通常細胞機能の維持、およびこれらの機能の病的低下の予防および治療に使用することができる。

Claims

以下の工程よりなる、少なくとも２つの検定系を用いた選択および検出を含んだ、試験物質（リガンド）のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング方法。
（ｉ）第１の細胞検定系または組織検定系で、エストロゲンレセプター（ＥＲ）の活性により媒介され、ＥＲおよびＥＲに誘導されるレポーター遺伝子を含んだ前記細胞検定系または組織検定系での効力の検出によって測定される転写活性を有するリガンドを選択し、前記リガンドが、１０ｎｍｏｌ／ｌ以下のＥＣ₅₀(ER)（最大有効リガンド濃度の半値）を有する転写の活性化を検出する工程と、
（ii）第２の無細胞検定系または酵素検定系で、前記無細胞検定系または酵素検定系での相互作用の効力の検出により測定されるＳＲＣ−１と、前記ＥＲとの物理的化学的相互作用（リクルート）、を選択し、前記リガンドが、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ_50(ER+SRC)を有する、前記ＥＲを活性化して、共に存在している前記ＳＲＣ−１との相互作用を誘導して、ＳＲＣ−１と、ＥＲの前記物理的化学的相互作用を検出する工程。
無細胞検定系または酵素検定系において、前記無細胞検定系または酵素検定系での相互作用の効力の検出により測定される、ＳＲＣ−１と、ＥＲとの物理的化学的相互作用（リクルート）を選択することにより、試験物質（リガンド）をｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングする方法で、前記リガンドは、既知のエストロゲンまたはエストロゲン活性を有するリガンドであり、前記リガンドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ_50(ER+SRC)を有する第２の検定系で、前記ＥＲを活性化し、共に存在しているＳＲＣ−１との相互作用を誘導して、ＳＲＣ−１と、ＥＲとの前記物理的化学的相互作用を検出する、試験物質（リガンド）のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング方法。
前記リガンドは、エストロゲンであり、かつＥＲおよびＥＲに誘導されるレポーター遺伝子を含んだ細胞検定系を転写により活性化し、前記リガンドは、１０ｎｍｏｌ／ｌ以下のＥＣ_50(ER)（最大有効リガンド濃度半値）で効力を活性化する、請求項２に記載の試験物質（リガンド）のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング方法。