JP2001519525A - Ｆｒｅｔを用いる核内受容体リガンドに関するアッセイ - Google Patents
Ｆｒｅｔを用いる核内受容体リガンドに関するアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
蛍光標識された核内受容体またはリガンド結合ドメインと蛍光標識されたＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、ｐ３００、他の核内コアクチベーターまたはその結合部分との間のアゴニスト依存的蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することを含む、核内受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法を提供する。この方法は簡便であり迅速であり安価である。前記方法において使用するための、蛍光試薬で標識された核内受容体および核内受容体コアクチベーターも提供する。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、核内受容体の新規アゴニストおよびアンタゴニストを、そのような
受容体とＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）または他の核内受容体コアクチベー
ターとのアゴニスト依存的相互作用（この相互作用は蛍光共鳴エネルギー移動に
より検出される）を用いて同定する方法に関する。
受容体とＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）または他の核内受容体コアクチベー
ターとのアゴニスト依存的相互作用（この相互作用は蛍光共鳴エネルギー移動に
より検出される）を用いて同定する方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 核内受容体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体として遺伝子プロモーター中の
それらの対応ＤＮＡ要素に結合する、リガンドにより活性化される転写因子のス
ーパーファミリーである。１５０個を超えるメンバーを有する該スーパーファミ
リーは、いくつかのサブファミリー（例えば、ステロイド、レチノイド、甲状腺
ホルモンおよびペルオキシソーム増殖因子活性化［ＰＰＡＲ］サブファミリー）
に分けることができる。各サブファミリーは、個々の遺伝子にコードされるいく
つかのメンバー（例えば、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ）よりなり
うる。また、特定のＰＰＡＲ（例えば、ＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲγ２）の場
合のように、選択的ｍＲＮＡスプライシングがこれらの遺伝子の２以上のアイソ
フォームを与えることがある。該核内受容体スーパーファミリーは、哺乳類細胞
における多種多様な生理的機能（例えば、分化、増殖および代謝恒常性）に関与
している。特異的核内受容体の機能不全または発現の改変が疾患の病理発生に関
与していることが判明している。
それらの対応ＤＮＡ要素に結合する、リガンドにより活性化される転写因子のス
ーパーファミリーである。１５０個を超えるメンバーを有する該スーパーファミ
リーは、いくつかのサブファミリー（例えば、ステロイド、レチノイド、甲状腺
ホルモンおよびペルオキシソーム増殖因子活性化［ＰＰＡＲ］サブファミリー）
に分けることができる。各サブファミリーは、個々の遺伝子にコードされるいく
つかのメンバー（例えば、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ）よりなり
うる。また、特定のＰＰＡＲ（例えば、ＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲγ２）の場
合のように、選択的ｍＲＮＡスプライシングがこれらの遺伝子の２以上のアイソ
フォームを与えることがある。該核内受容体スーパーファミリーは、哺乳類細胞
における多種多様な生理的機能（例えば、分化、増殖および代謝恒常性）に関与
している。特異的核内受容体の機能不全または発現の改変が疾患の病理発生に関
与していることが判明している。
【０００３】 核内受容体のＰＰＡＲスーパーファミリーは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよび
ＰＰＡＲδの３つのメンバーよりなる。ＰＰＡＲαは、肝臓および腎臓内で高度
に発現される。ペルオキシソーム増殖因子（フィブラートなどの血中脂質低下薬
を含む）または中鎖および長鎖脂肪酸によるＰＰＡＲαの活性化は、アシル−Ｃ
ｏＡオキシダーゼおよびヒドラターゼ−デヒドロゲナーゼ（ペルオキシソームβ
−酸化に必要な酵素）ならびにシトクロムＰ４５０ ４Ａ６（脂肪酸ω−ヒドロ
キシラーゼに必要な酵素）の誘導を引き起こす。したがって、ＰＰＡＲαは、脂
質代謝の調節において重要な役割を有し、フィブラートなどの血中脂質低下性化
合物が効果を発揮するメカニズムの一部となる。ＰＰＡＲγは脂肪細胞内で優勢
に発現される。最近、プロスタグランジンＪ２の代謝産物である１５−デオキシ
−Ｄ１２，１４−プロスタグランジンＪ２が、ＰＰＡＲγの潜在的な生理的リガ
ンドであることが確認された。１５−デオキシ−Ｄ１２，１４−プロスタグラン
ジンＪ２による前脂肪細胞の処理または繊維芽細胞内でのＰＰＡＲγ２のレトロ
ウイルス発現は共に、脂肪細胞の分化を誘導した。これは、脂肪細胞分化および
脂質蓄積におけるＰＰＡＲγの役割を示すものである。抗糖尿病および脂質低下
インスリン感受性化合物（チアゾリジンジオンとして公知である）がＰＰＡＲγ
に対する高アフィニティーリガンドであるという証明は、糖尿病およびインスリ
ン抵抗性に関連した障害（例えば、肥満および心血管疾患）の治療におけるＰＰ
ＡＲγリガンドの広範な治療的役割を示唆している。
ＰＰＡＲδの３つのメンバーよりなる。ＰＰＡＲαは、肝臓および腎臓内で高度
に発現される。ペルオキシソーム増殖因子（フィブラートなどの血中脂質低下薬
を含む）または中鎖および長鎖脂肪酸によるＰＰＡＲαの活性化は、アシル−Ｃ
ｏＡオキシダーゼおよびヒドラターゼ−デヒドロゲナーゼ（ペルオキシソームβ
−酸化に必要な酵素）ならびにシトクロムＰ４５０ ４Ａ６（脂肪酸ω−ヒドロ
キシラーゼに必要な酵素）の誘導を引き起こす。したがって、ＰＰＡＲαは、脂
質代謝の調節において重要な役割を有し、フィブラートなどの血中脂質低下性化
合物が効果を発揮するメカニズムの一部となる。ＰＰＡＲγは脂肪細胞内で優勢
に発現される。最近、プロスタグランジンＪ２の代謝産物である１５−デオキシ
−Ｄ１２，１４−プロスタグランジンＪ２が、ＰＰＡＲγの潜在的な生理的リガ
ンドであることが確認された。１５−デオキシ−Ｄ１２，１４−プロスタグラン
ジンＪ２による前脂肪細胞の処理または繊維芽細胞内でのＰＰＡＲγ２のレトロ
ウイルス発現は共に、脂肪細胞の分化を誘導した。これは、脂肪細胞分化および
脂質蓄積におけるＰＰＡＲγの役割を示すものである。抗糖尿病および脂質低下
インスリン感受性化合物（チアゾリジンジオンとして公知である）がＰＰＡＲγ
に対する高アフィニティーリガンドであるという証明は、糖尿病およびインスリ
ン抵抗性に関連した障害（例えば、肥満および心血管疾患）の治療におけるＰＰ
ＡＲγリガンドの広範な治療的役割を示唆している。
【０００４】 核内受容体タンパク質は、中央のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびＣＯＯ
Ｈ末端のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含有する。ＤＢＤは、ホルモン応答
配列（ＨＲＥ）として公知の特異的プロモーター／エンハンサーＤＮＡ配列に該
受容体を標的化する高度に保存された２個のジンクフィンガーを含む。ＬＢＤは
、約２００〜３００アミノ酸長であり、ＤＢＤほど良くは保存されていない。Ｌ
ＢＤには、少なくとも３つの機能（二量体化、リガンド結合およびトランス活性
化）がある。トランス活性化機能は、該受容体の転写的に不活性な状態と転写的
に活性な状態との間の分子スイッチとみなすことができる。アゴニストであるリ
ガンドの結合は、該スイッチを不活性状態から活性状態に変換する。ＬＢＤのＣ
ＯＯＨ末端部分は、該スイッチに必要な活性化機能ドメイン（ＡＦ２）を含有す
る。
Ｈ末端のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含有する。ＤＢＤは、ホルモン応答
配列（ＨＲＥ）として公知の特異的プロモーター／エンハンサーＤＮＡ配列に該
受容体を標的化する高度に保存された２個のジンクフィンガーを含む。ＬＢＤは
、約２００〜３００アミノ酸長であり、ＤＢＤほど良くは保存されていない。Ｌ
ＢＤには、少なくとも３つの機能（二量体化、リガンド結合およびトランス活性
化）がある。トランス活性化機能は、該受容体の転写的に不活性な状態と転写的
に活性な状態との間の分子スイッチとみなすことができる。アゴニストであるリ
ガンドの結合は、該スイッチを不活性状態から活性状態に変換する。ＬＢＤのＣ
ＯＯＨ末端部分は、該スイッチに必要な活性化機能ドメイン（ＡＦ２）を含有す
る。
【０００５】 リガンド誘導性核内受容体分子スイッチは、核内受容体コアクチベーターのフ
ァミリーのメンバー（例えば、ＣＢＰ／ｐ３００、ＳＲＣ−１／ＮｃｏＡ−１、
ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ−１／ＮｃｏＡ−２およびｐ／ＣＩＰ）との相互作用により
媒介される。アゴニストがその対応受容体のＬＢＤに結合すると、受容体タンパ
ク質のコンホメーション変化により、コアクチベーター結合表面が生成し、該受
容体に対するコアクチベーターのリクルートおよびそれに続く転写活性化が生じ
る。核内受容体に対するアンタゴニストリガンドの結合は、必要なコンホメーシ
ョン変化を誘導せず、コアクチベーターのリクルートおよびそれに続く転写の誘
導を妨げる。コアクチベーターであるＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）および
ｐ３００は、元々はそれらが転写因子ＣＲＥＢと相互作用する能力に基づいて見
出された２つの密接に関連したタンパク質である。これらの２つのタンパク質は
、かなりのアミノ酸配列相同性を共有する。ＣＢＰは、核内受容体と基本（ｂａ
ｓｉｃ）転写装置との間に架橋を形成しうる（Ｋａｍｅｉら， １９９６， Ｃ
ｅｌｌ ８５：４０３−４１４； Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら， １９９６，
Ｎａｔｕｒｅ ３８３：９９−１０３； Ｈａｎｓｔｅｉｎら， １９９６，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５４０−
１１５４５； Ｈｅｅｒｙら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７３３−
７３６）。また、ＣＢＰは、局所的クロマチン再配列および更なる転写活性化を
引き起こしうる固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を含有する。あ
る種の核内受容体とＣＢＰとの間のリガンド−およびＡＦ２−依存的相互作用が
、インビトロプルダウン（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）アッセイお
よびファーウエスタンアッセイで示されている。この相互作用は、これらの核内
受容体に媒介される転写活性化に必要かつ十分である。したがって、該受容体の
転写機能を妨げるエストロゲン受容体（ＥＲ）のＡＦ２突然変異体は、ＣＢＰと
相互作用することができない。
ァミリーのメンバー（例えば、ＣＢＰ／ｐ３００、ＳＲＣ−１／ＮｃｏＡ−１、
ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ−１／ＮｃｏＡ−２およびｐ／ＣＩＰ）との相互作用により
媒介される。アゴニストがその対応受容体のＬＢＤに結合すると、受容体タンパ
ク質のコンホメーション変化により、コアクチベーター結合表面が生成し、該受
容体に対するコアクチベーターのリクルートおよびそれに続く転写活性化が生じ
る。核内受容体に対するアンタゴニストリガンドの結合は、必要なコンホメーシ
ョン変化を誘導せず、コアクチベーターのリクルートおよびそれに続く転写の誘
導を妨げる。コアクチベーターであるＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）および
ｐ３００は、元々はそれらが転写因子ＣＲＥＢと相互作用する能力に基づいて見
出された２つの密接に関連したタンパク質である。これらの２つのタンパク質は
、かなりのアミノ酸配列相同性を共有する。ＣＢＰは、核内受容体と基本（ｂａ
ｓｉｃ）転写装置との間に架橋を形成しうる（Ｋａｍｅｉら， １９９６， Ｃ
ｅｌｌ ８５：４０３−４１４； Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら， １９９６，
Ｎａｔｕｒｅ ３８３：９９−１０３； Ｈａｎｓｔｅｉｎら， １９９６，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５４０−
１１５４５； Ｈｅｅｒｙら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７３３−
７３６）。また、ＣＢＰは、局所的クロマチン再配列および更なる転写活性化を
引き起こしうる固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を含有する。あ
る種の核内受容体とＣＢＰとの間のリガンド−およびＡＦ２−依存的相互作用が
、インビトロプルダウン（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）アッセイお
よびファーウエスタンアッセイで示されている。この相互作用は、これらの核内
受容体に媒介される転写活性化に必要かつ十分である。したがって、該受容体の
転写機能を妨げるエストロゲン受容体（ＥＲ）のＡＦ２突然変異体は、ＣＢＰと
相互作用することができない。
【０００６】 ＣＢＰおよびｐ３００のＮ末端は、いくつかの核内受容体のリガンド結合ドメ
インと相互作用することが示されている（Ｋａｍｅｉら， １９９６， Ｃｅｌ
ｌ ８５：４０３−４１４； 以下、「Ｋａｍｅｉ」と称することとする）。Ｋ
ａｍｅｉは、いくつかの異なる方法を用いても核内受容体とＣＢＰおよびｐ３０
０との直接的な相互作用を示すことができなかった。
インと相互作用することが示されている（Ｋａｍｅｉら， １９９６， Ｃｅｌ
ｌ ８５：４０３−４１４； 以下、「Ｋａｍｅｉ」と称することとする）。Ｋ
ａｍｅｉは、いくつかの異なる方法を用いても核内受容体とＣＢＰおよびｐ３０
０との直接的な相互作用を示すことができなかった。
【０００７】 （１）Ｋａｍｅｉは、ＣＢＰのＮ末端の最初の１００アミノ酸のＧＳＴ融合タ
ンパク質を産生させた。これらの融合タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル上
で移動させ、メンブレンにトランスファーし、該メンブレンを核内受容体の３２ Ｐ標識リガンド結合ドメインにさらした。リガンドの存在下、該３２Ｐ標識リガ
ンド結合ドメインが、ＧＳＴ−ＣＢＰ融合タンパク質を含有するメンブレン上の
バンドに結合することが認められた点で、ＣＢＰと核内受容体断片との特異的結
合相互作用が検出された。
ンパク質を産生させた。これらの融合タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル上
で移動させ、メンブレンにトランスファーし、該メンブレンを核内受容体の３２ Ｐ標識リガンド結合ドメインにさらした。リガンドの存在下、該３２Ｐ標識リガ
ンド結合ドメインが、ＧＳＴ−ＣＢＰ融合タンパク質を含有するメンブレン上の
バンドに結合することが認められた点で、ＣＢＰと核内受容体断片との特異的結
合相互作用が検出された。
【０００８】 （２）また、Ｋａｍｅｉは酵母ツーハイブリッドシステムを用いた。ＬｅｘＡ
タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに融合した核内受容体のリガンド結合ドメイン
を、餌（ｂａｉｔ）として使用した。ｇａｌ４の転写活性化ドメインに融合した
ＣＢＰのアミノ末端ドメインを、餌食（ｐｒｅｙ）として使用した。リガンドの
存在下、ＣＢＰと核内受容体断片との間で特異的結合相互作用（インビボ、すな
わち酵母内で生じる）が認められた。
タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに融合した核内受容体のリガンド結合ドメイン
を、餌（ｂａｉｔ）として使用した。ｇａｌ４の転写活性化ドメインに融合した
ＣＢＰのアミノ末端ドメインを、餌食（ｐｒｅｙ）として使用した。リガンドの
存在下、ＣＢＰと核内受容体断片との間で特異的結合相互作用（インビボ、すな
わち酵母内で生じる）が認められた。
【０００９】 （３）Ｋａｍｅｉは、ＣＢＰと核内受容体とのリガンド誘導性結合をゲルシフ
トアッセイにより観察した。このアッセイは、リガンドの存在下、核内受容体が
、それらの標的認識配列を含有するオリゴヌクレオチドに結合するという観察に
基づく。そのような結合は、オリゴヌクレオチド単体より高い分子量を有する核
内受容体−リガンド−オリゴヌクレオチド複合体の形成を引き起こす。分子量に
おけるこの相違は、ポリアクリルアミドゲル上で移動させた場合の３２Ｐ標識オ
リゴヌクレオチドの位置のシフトにより検出される。Ｋａｍｅｉは、ＣＢＰの断
片（Ｎ末端の１００アミノ酸）が核内受容体−リガンド−オリゴヌクレオチド複
合体に結合しゲル上の該複合体の位置をより一層高い分子量の位置にシフトさせ
うることを見出した。
トアッセイにより観察した。このアッセイは、リガンドの存在下、核内受容体が
、それらの標的認識配列を含有するオリゴヌクレオチドに結合するという観察に
基づく。そのような結合は、オリゴヌクレオチド単体より高い分子量を有する核
内受容体−リガンド−オリゴヌクレオチド複合体の形成を引き起こす。分子量に
おけるこの相違は、ポリアクリルアミドゲル上で移動させた場合の３２Ｐ標識オ
リゴヌクレオチドの位置のシフトにより検出される。Ｋａｍｅｉは、ＣＢＰの断
片（Ｎ末端の１００アミノ酸）が核内受容体−リガンド−オリゴヌクレオチド複
合体に結合しゲル上の該複合体の位置をより一層高い分子量の位置にシフトさせ
うることを見出した。
【００１０】 （４）Ｋａｍｅｉは、リガンドの存在下、種々の細胞由来の抽出物中の核内受
容体に対する抗体を使用してＣＢＰを共免疫沈降させることができた。
容体に対する抗体を使用してＣＢＰを共免疫沈降させることができた。
【００１１】 （５）Ｋａｍｅｉは、転写活性化アッセイを用いて、核内受容体とＣＢＰとが
機能的に相互作用することを示すことができた。そのような転写活性化アッセイ
は、２つのタンパク質が、転写活性化を引き起こす経路に関与することを示しう
るが、これらのアッセイは、それらのタンパク質間の相互作用が直接的結合の１
つであることを証明するものではない。
機能的に相互作用することを示すことができた。そのような転写活性化アッセイ
は、２つのタンパク質が、転写活性化を引き起こす経路に関与することを示しう
るが、これらのアッセイは、それらのタンパク質間の相互作用が直接的結合の１
つであることを証明するものではない。
【００１２】 Ｋａｍｅｉは、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、グルココルチコイド受容体（
ＧＲ）、甲状腺ホルモン受容体（Ｔ３Ｒ）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）
とＣＢＰとの特異的結合相互作用を前記方法で示すことができた。また、Ｋａｍ
ｅｉは、ｐ３００のＮ末端とＲＡＲとの特異的結合を示している。しかしながら
、Ｋａｍｅｉは、ＣＢＰ、ｐ３００または他のいずれかの核内受容体コアクチベ
ーターとＰＰＡＲとの特異的結合は示していない。
ＧＲ）、甲状腺ホルモン受容体（Ｔ３Ｒ）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）
とＣＢＰとの特異的結合相互作用を前記方法で示すことができた。また、Ｋａｍ
ｅｉは、ｐ３００のＮ末端とＲＡＲとの特異的結合を示している。しかしながら
、Ｋａｍｅｉは、ＣＢＰ、ｐ３００または他のいずれかの核内受容体コアクチベ
ーターとＰＰＡＲとの特異的結合は示していない。
【００１３】 Ｋａｍｅｉが用いた方法に関して注目すべきことは、それらが非常に労力およ
び時間を要することである。そのような方法は、とりわけ、融合タンパク質の構
築、３２Ｐ標識タンパク質の調製、酵母ツーハイブリッドアッセイおよび転写活
性化アッセイ用の特殊発現ベクターの構築、多数のゲルにおける移動、および抗
体の産生を含む。これらのアッセイのほとんどは実施に数日間を要し、それらの
実施に必要な試薬の調製には数週間を要することがある。これらのアッセイで用
いる試薬は複雑であり、該アッセイを調製し実施するには長時間を要するため、
これらのアッセイは高価になりがちである。核内受容体とＣＢＰとの相互作用を
研究しているＫａｍｅｉ以外の研究者もまた、そのような面倒な方法に頼らざる
を得ないのが現状である（例えば、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら， １９９６，
Ｎａｔｕｒｅ ３８３：９９−１０３； Ｈａｎｓｔｅｉｎら， １９９６，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５４０−
１１５４５； Ｈｅｅｒｒｙら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７３３
−７３６を参照されたい）。
び時間を要することである。そのような方法は、とりわけ、融合タンパク質の構
築、３２Ｐ標識タンパク質の調製、酵母ツーハイブリッドアッセイおよび転写活
性化アッセイ用の特殊発現ベクターの構築、多数のゲルにおける移動、および抗
体の産生を含む。これらのアッセイのほとんどは実施に数日間を要し、それらの
実施に必要な試薬の調製には数週間を要することがある。これらのアッセイで用
いる試薬は複雑であり、該アッセイを調製し実施するには長時間を要するため、
これらのアッセイは高価になりがちである。核内受容体とＣＢＰとの相互作用を
研究しているＫａｍｅｉ以外の研究者もまた、そのような面倒な方法に頼らざる
を得ないのが現状である（例えば、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら， １９９６，
Ｎａｔｕｒｅ ３８３：９９−１０３； Ｈａｎｓｔｅｉｎら， １９９６，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５４０−
１１５４５； Ｈｅｅｒｒｙら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７３３
−７３６を参照されたい）。
【００１４】 Ｋａｍｅｉは、核内受容体の新規アゴニストまたはアンタゴニストを同定する
ために前記の方法を用いたのではない。Ｋａｍｅｉの主眼は、アゴニストでもア
ンタゴニストでもなく、核内受容体とＣＢＰとの相互作用にあった。アゴニスト
またはアンタゴニストを同定するためにＫａｍｅｉの方法を修飾することは可能
かもしれないが、そのような方法は著しい欠点を有するであろう。なぜなら、前
記のとおり、ＣＢＰおよびｐ３００と核内受容体との相互作用を研究するために
Ｋａｍｅｉが用いたアッセイはすべて、非常に労力を要し、遅く、高価だからで
ある。ステロイドホルモン、例えばエストロゲン、コルチゾール、プロゲステロ
ンおよび他の核内受容体アゴニスト、例えば甲状腺ホルモンおよび抗糖尿病チア
ゾリジンジオン化合物が治療上重要であるとすると、核内受容体に影響を及ぼす
潜在的な医薬化合物を同定するための改良されたハイスループットスクリーニン
グアッセイが必要とされていることは明らかである。歴史的には、治療的に有用
な核内受容体リガンド化合物は、モデル動物をスクリーニングすることにより同
定されてきたが、これは、Ｋａｍｅｉが用いた方法より一層労働集約的で時間が
かかるアプローチである。また、例えばＫａｍｅｉが用いたアプローチは、核内
受容体のアンタゴニストの同定には適していない。現在では、核内受容体のアン
タゴニストは重要な治療剤になりうると広く認識されている。そのような治療上
有用なアンタゴニストとしては、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェンおよ
びＲＵ−４８６が挙げられる。
ために前記の方法を用いたのではない。Ｋａｍｅｉの主眼は、アゴニストでもア
ンタゴニストでもなく、核内受容体とＣＢＰとの相互作用にあった。アゴニスト
またはアンタゴニストを同定するためにＫａｍｅｉの方法を修飾することは可能
かもしれないが、そのような方法は著しい欠点を有するであろう。なぜなら、前
記のとおり、ＣＢＰおよびｐ３００と核内受容体との相互作用を研究するために
Ｋａｍｅｉが用いたアッセイはすべて、非常に労力を要し、遅く、高価だからで
ある。ステロイドホルモン、例えばエストロゲン、コルチゾール、プロゲステロ
ンおよび他の核内受容体アゴニスト、例えば甲状腺ホルモンおよび抗糖尿病チア
ゾリジンジオン化合物が治療上重要であるとすると、核内受容体に影響を及ぼす
潜在的な医薬化合物を同定するための改良されたハイスループットスクリーニン
グアッセイが必要とされていることは明らかである。歴史的には、治療的に有用
な核内受容体リガンド化合物は、モデル動物をスクリーニングすることにより同
定されてきたが、これは、Ｋａｍｅｉが用いた方法より一層労働集約的で時間が
かかるアプローチである。また、例えばＫａｍｅｉが用いたアプローチは、核内
受容体のアンタゴニストの同定には適していない。現在では、核内受容体のアン
タゴニストは重要な治療剤になりうると広く認識されている。そのような治療上
有用なアンタゴニストとしては、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェンおよ
びＲＵ−４８６が挙げられる。
【００１５】 必要とされているのは、核内受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの両方
を同定し特徴づけるための、ハイスループットであり時間および労力を節約し非
放射性で安価で高い信頼性を有するアッセイである。そのようなアッセイを本発
明で提供する。
を同定し特徴づけるための、ハイスループットであり時間および労力を節約し非
放射性で安価で高い信頼性を有するアッセイである。そのようなアッセイを本発
明で提供する。
【００１６】 （発明の概要） 本発明は、核内受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの新規同定方法を提
供する。該方法は、核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアク
チベーターとのアゴニスト依存的結合を利用する。アゴニストの不存在下では、
核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとの結合
は生じない。しかしながら、アゴニストが存在すると、そのような結合が生じ、
蛍光的に標識された核内受容体と蛍光的に標識されたＣＢＰ、ｐ３００または他
の核内受容体コアクチベーターとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に
より該結合を検出することができる。アンタゴニストは、それが核内受容体とＣ
ＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとのアゴニスト誘導性相
互作用を妨げたり破壊する能力により同定することができる。核内受容体のアゴ
ニストおよびアンタゴニストを同定するための先行技術方法とは異なり、本発明
の方法は簡便であり、迅速であり、より安価である。
供する。該方法は、核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアク
チベーターとのアゴニスト依存的結合を利用する。アゴニストの不存在下では、
核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとの結合
は生じない。しかしながら、アゴニストが存在すると、そのような結合が生じ、
蛍光的に標識された核内受容体と蛍光的に標識されたＣＢＰ、ｐ３００または他
の核内受容体コアクチベーターとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に
より該結合を検出することができる。アンタゴニストは、それが核内受容体とＣ
ＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとのアゴニスト誘導性相
互作用を妨げたり破壊する能力により同定することができる。核内受容体のアゴ
ニストおよびアンタゴニストを同定するための先行技術方法とは異なり、本発明
の方法は簡便であり、迅速であり、より安価である。
【００１７】 本発明は、核内受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの前記同定方法にお
いて使用するための、蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合
ドメインを提供する。本発明はまた、蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００も
しくは他の核内受容体コアクチベーターまたはそれらの結合部分を提供する。
いて使用するための、蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合
ドメインを提供する。本発明はまた、蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００も
しくは他の核内受容体コアクチベーターまたはそれらの結合部分を提供する。
【００１８】 （発明の詳細な記載） 本発明の目的においては、 「アゴニスト」は、核内受容体とＣＢＰまたは他の核内受容体コアクチベータ
ーとの特異的結合相互作用が生じうるように核内受容体に結合する物質である。
ーとの特異的結合相互作用が生じうるように核内受容体に結合する物質である。
【００１９】 「アンタゴニスト」は、核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体
コアクチベーターとのアゴニスト誘導性特異的結合相互作用を妨げたり又は破壊
しうる物質である。
コアクチベーターとのアゴニスト誘導性特異的結合相互作用を妨げたり又は破壊
しうる物質である。
【００２０】 核内受容体の「リガンド」は、該核内受容体のアゴニストまたはアンタゴニス
トである。
トである。
【００２１】 「特異的結合相互作用」、「特異的結合」などは、核内受容体に結合した蛍光
試薬とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターに結合した蛍光
試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動の発生を引き起こす、核内受容体とＣＢＰ
、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとの結合を意味する。
試薬とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターに結合した蛍光
試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動の発生を引き起こす、核内受容体とＣＢＰ
、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとの結合を意味する。
【００２２】 ＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターに関する「結合部分
」は、核内受容体との特異的結合相互作用に十分なＣＢＰ、ｐ３００または他の
核内受容体コアクチベーターの部分である。
」は、核内受容体との特異的結合相互作用に十分なＣＢＰ、ｐ３００または他の
核内受容体コアクチベーターの部分である。
【００２３】 核内受容体に関する「リガンド結合ドメイン」は、核内受容体のアゴニストま
たはアンタゴニストに結合するのに十分な核内受容体の部分である。
たはアンタゴニストに結合するのに十分な核内受容体の部分である。
【００２４】 本発明は、核内受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの両方の同定および
特徴づけのための、ハイスループットで時間および労力を節約し非放射性で安価
で非常に信頼性のあるアッセイを提供する。全般的な実施形態において、本発明
は、ＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体結合タンパク質がコアクチベーター
であるいずれかの核内受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法を提
供する。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストは、核内受容体のリガンド
結合ドメインとＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとの結
合を誘導する又は妨げる能力により同定する。該核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００
または他の核内受容体コアクチベーターとの相互作用は、２つの蛍光試薬間の蛍
光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の発生を観察することによりモニターする。
一方の蛍光試薬を該核内受容体に結合させ、他方の蛍光試薬をＣＢＰ、ｐ３００
または他の核内受容体コアクチベーターに結合させる。核内受容体、ＣＢＰ、ｐ
３００または他の核内受容体コアクチベーターに対する蛍光試薬の結合は、共有
結合または非共有結合によるものであってもよい。
特徴づけのための、ハイスループットで時間および労力を節約し非放射性で安価
で非常に信頼性のあるアッセイを提供する。全般的な実施形態において、本発明
は、ＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体結合タンパク質がコアクチベーター
であるいずれかの核内受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法を提
供する。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストは、核内受容体のリガンド
結合ドメインとＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとの結
合を誘導する又は妨げる能力により同定する。該核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００
または他の核内受容体コアクチベーターとの相互作用は、２つの蛍光試薬間の蛍
光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の発生を観察することによりモニターする。
一方の蛍光試薬を該核内受容体に結合させ、他方の蛍光試薬をＣＢＰ、ｐ３００
または他の核内受容体コアクチベーターに結合させる。核内受容体、ＣＢＰ、ｐ
３００または他の核内受容体コアクチベーターに対する蛍光試薬の結合は、共有
結合または非共有結合によるものであってもよい。
【００２５】 本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用する。ＦＲＥＴは、分
子間の長距離双極子−双極子カップリングにより、励起したエネルギー供与蛍光
試薬から受容蛍光試薬へエネルギーが移動する過程である。ＦＲＥＴは、典型的
には、約１０ｅ〜１００ｅの距離にわたって生じ、また、供与試薬の発光スペク
トルおよび受容試薬の吸収スペクトルが適度に重複すること並びに該供与体の量
子収率および該受容体の吸収係数が十分に高いことを必要とする。さらに、該供
与および受容蛍光試薬の遷移双極子が、お互いに対して適切に配向されなければ
ならない。ＦＲＥＴおよび生物系に対するその応用の概説としては、Ｃｌｅｇｇ
， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ６：１０３−１１０を参照されたい。
子間の長距離双極子−双極子カップリングにより、励起したエネルギー供与蛍光
試薬から受容蛍光試薬へエネルギーが移動する過程である。ＦＲＥＴは、典型的
には、約１０ｅ〜１００ｅの距離にわたって生じ、また、供与試薬の発光スペク
トルおよび受容試薬の吸収スペクトルが適度に重複すること並びに該供与体の量
子収率および該受容体の吸収係数が十分に高いことを必要とする。さらに、該供
与および受容蛍光試薬の遷移双極子が、お互いに対して適切に配向されなければ
ならない。ＦＲＥＴおよび生物系に対するその応用の概説としては、Ｃｌｅｇｇ
， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ６：１０３−１１０を参照されたい。
【００２６】 本発明は、第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ドメ
イン、および第２蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容
体コアクチベーターまたはその結合部分を使用する。第２蛍光試薬は、（ａ）励
起状態のエネルギーを第１蛍光試薬に供与するか又は（ｂ）励起状態のエネルギ
ーを第１蛍光試薬から受容することによりエネルギー移動を受けうる発蛍光団を
含む。すなわち、本発明では、第１または第２蛍光試薬が、ＦＲＥＴ中に供与体
または受容体となりうる。
イン、および第２蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容
体コアクチベーターまたはその結合部分を使用する。第２蛍光試薬は、（ａ）励
起状態のエネルギーを第１蛍光試薬に供与するか又は（ｂ）励起状態のエネルギ
ーを第１蛍光試薬から受容することによりエネルギー移動を受けうる発蛍光団を
含む。すなわち、本発明では、第１または第２蛍光試薬が、ＦＲＥＴ中に供与体
または受容体となりうる。
【００２７】 第１および第２蛍光試薬は、互いに分光的に相補的である。このことは、それ
らのスペクトル特性が、励起状態のエネルギーの移動をそれらの間で生じさせう
るようなものであることを意味する。ＦＲＥＴは、第１および第２蛍光試薬間の
距離に非常に敏感である。例えば、ＦＲＥＴは、第１および第２蛍光試薬間の距
離の６乗に反比例する。アゴニストの不存在下では、該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインに結合した第１蛍光試薬は、ＣＢＰ、ｐ３００または他の核
内受容体コアクチベーターまたはそれらの結合部分に結合した第２蛍光試薬に接
近しないであろう。したがって、ＦＲＥＴは全く観察されないか、または非常に
僅かしか観察されないであろう。しかしながら、アゴニストの存在下では、該核
内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとの相互作
用が生じ、それにより第１蛍光試薬と第２蛍光試薬とが接近し、ＦＲＥＴの発生
および観察が可能となるであろう。
らのスペクトル特性が、励起状態のエネルギーの移動をそれらの間で生じさせう
るようなものであることを意味する。ＦＲＥＴは、第１および第２蛍光試薬間の
距離に非常に敏感である。例えば、ＦＲＥＴは、第１および第２蛍光試薬間の距
離の６乗に反比例する。アゴニストの不存在下では、該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインに結合した第１蛍光試薬は、ＣＢＰ、ｐ３００または他の核
内受容体コアクチベーターまたはそれらの結合部分に結合した第２蛍光試薬に接
近しないであろう。したがって、ＦＲＥＴは全く観察されないか、または非常に
僅かしか観察されないであろう。しかしながら、アゴニストの存在下では、該核
内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチベーターとの相互作
用が生じ、それにより第１蛍光試薬と第２蛍光試薬とが接近し、ＦＲＥＴの発生
および観察が可能となるであろう。
【００２８】 したがって、本発明は、 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ドメイ
ン、 （ｂ）第２蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体
コアクチベーターまたはその結合部分、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインとＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体コアクチベータ
ーまたはその結合部分との結合が生じる条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法を提供する。
ン、 （ｂ）第２蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体
コアクチベーターまたはその結合部分、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインとＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体コアクチベータ
ーまたはその結合部分との結合が生じる条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法を提供する。
【００２９】 特定の実施形態においては、該核内受容体は、ステロイド受容体、甲状腺ホル
モン受容体、レチノイン酸受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レ
チノイドＸ受容体、グルココルチコイド受容体、ビタミンＤ受容体および「オー
ファン核内受容体」（例えば、ＬＸＲ、ＦＸＲなど）よりなる群から選ばれる。
モン受容体、レチノイン酸受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レ
チノイドＸ受容体、グルココルチコイド受容体、ビタミンＤ受容体および「オー
ファン核内受容体」（例えば、ＬＸＲ、ＦＸＲなど）よりなる群から選ばれる。
【００３０】 特定の実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは
完全長核内受容体である。もう１つの実施形態においては、該核内受容体または
そのリガンド結合ドメインは核内受容体のリガンド結合ドメインである。もう１
つの実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは核内
受容体のＡＦ−２部位を含む。
完全長核内受容体である。もう１つの実施形態においては、該核内受容体または
そのリガンド結合ドメインは核内受容体のリガンド結合ドメインである。もう１
つの実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは核内
受容体のＡＦ−２部位を含む。
【００３１】 特定の実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは
完全長ＰＰＡＲである。もう１つの実施形態においては、該核内受容体またはそ
のリガンド結合ドメインはＰＰＡＲのリガンド結合ドメインである。もう１つの
実施形態においては、該ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ１、ＰＰＡＲγ２
およびＰＰＡＲδよりなる群から選ばれる。もう１つの実施形態においては、該
ＰＰＡＲのリガンド結合ドメインはヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸残基１７６〜４
７８を含有する。
完全長ＰＰＡＲである。もう１つの実施形態においては、該核内受容体またはそ
のリガンド結合ドメインはＰＰＡＲのリガンド結合ドメインである。もう１つの
実施形態においては、該ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ１、ＰＰＡＲγ２
およびＰＰＡＲδよりなる群から選ばれる。もう１つの実施形態においては、該
ＰＰＡＲのリガンド結合ドメインはヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸残基１７６〜４
７８を含有する。
【００３２】 特定の実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは
ヒトＲＡＲαのアミノ酸１４３〜４６２を含有する。もう１つの実施形態におい
ては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインはラットＴ３Ｒα１のアミ
ノ酸１２２〜４１０を含有する。もう１つの実施形態においては、該核内受容体
またはそのリガンド結合ドメインはマウスＲＸＲγのアミノ酸２２７〜４６３を
含有する。もう１つの実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結
合ドメインはヒトＥＲのアミノ酸２５１〜５９５を含有する。
ヒトＲＡＲαのアミノ酸１４３〜４６２を含有する。もう１つの実施形態におい
ては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインはラットＴ３Ｒα１のアミ
ノ酸１２２〜４１０を含有する。もう１つの実施形態においては、該核内受容体
またはそのリガンド結合ドメインはマウスＲＸＲγのアミノ酸２２７〜４６３を
含有する。もう１つの実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結
合ドメインはヒトＥＲのアミノ酸２５１〜５９５を含有する。
【００３３】 特定の実施形態においては、前記方法はマウスまたはヒト完全長ＣＢＰを使用
する。他の実施形態においては、該方法はヒトＣＢＰのアミノ酸残基１〜１１３
を使用する。もう１つの実施形態においては、該方法はヒトＣＢＰのアミノ酸残
基１〜４５３を使用する。
する。他の実施形態においては、該方法はヒトＣＢＰのアミノ酸残基１〜１１３
を使用する。もう１つの実施形態においては、該方法はヒトＣＢＰのアミノ酸残
基１〜４５３を使用する。
【００３４】 前記方法を行なう条件は、タンパク質−タンパク質相互作用の研究のために当
技術分野において典型的に用いられる条件、例えば、生理的ｐＨ、塩条件（例え
ば、ＰＢＳなどの通常用いられるバッファーにより表されるもの）、約４℃〜約
５５℃の温度である。通常用いられる非イオン界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０
（登録商標）、サルコシル、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標））を、所望
により存在させてもよい。ユウロピウムクリプテートを蛍光試薬として使用する
場合には、反応は、少なくとも２００ｍＭの濃度のＫＦを含有すべきである。
技術分野において典型的に用いられる条件、例えば、生理的ｐＨ、塩条件（例え
ば、ＰＢＳなどの通常用いられるバッファーにより表されるもの）、約４℃〜約
５５℃の温度である。通常用いられる非イオン界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０
（登録商標）、サルコシル、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標））を、所望
により存在させてもよい。ユウロピウムクリプテートを蛍光試薬として使用する
場合には、反応は、少なくとも２００ｍＭの濃度のＫＦを含有すべきである。
【００３５】 Ｈｅｅｒｙら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７３３−７３６は、核
内受容体と種々の核内受容体コアクチベーターとの相互作用が、アミノ酸配列Ｌ
ＸＸＬＬ（Ｌはロイシンであり、Ｘは任意のアミノ酸を表す）を有する該核内受
容体コアクチベーター内の短いアミノ酸配列により媒介されることを示した。し
たがって、本発明は、核内受容体コアクチベーターの結合部分がアミノ酸配列Ｌ
ＸＸＬＬを含有する場合には、そのような核内受容体コアクチベーターの結合部
分で実施することができる。したがって、本発明は、 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ドメイ
ン、 （ｂ）核内受容体コアクチベーターの結合部分（該結合部分はアミノ酸配列
ＬＸＸＬＬを含有し、該結合部分は第２蛍光試薬で標識されている）、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインと該核内受容体コアクチベーターの結合部分との結合が生じ
る条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法を含む。
内受容体と種々の核内受容体コアクチベーターとの相互作用が、アミノ酸配列Ｌ
ＸＸＬＬ（Ｌはロイシンであり、Ｘは任意のアミノ酸を表す）を有する該核内受
容体コアクチベーター内の短いアミノ酸配列により媒介されることを示した。し
たがって、本発明は、核内受容体コアクチベーターの結合部分がアミノ酸配列Ｌ
ＸＸＬＬを含有する場合には、そのような核内受容体コアクチベーターの結合部
分で実施することができる。したがって、本発明は、 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ドメイ
ン、 （ｂ）核内受容体コアクチベーターの結合部分（該結合部分はアミノ酸配列
ＬＸＸＬＬを含有し、該結合部分は第２蛍光試薬で標識されている）、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインと該核内受容体コアクチベーターの結合部分との結合が生じ
る条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法を含む。
【００３６】 特定の実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターは、ヒトＲＩＰ−
１４０、ヒトＳＲＣ−１、マウスＴＩＦ−２、ヒトまたはマウスＣＢＰ、ヒトま
たはマウスｐ３００、マウスＴＩＦ−１およびヒトＴＲＩＰタンパク質よりなる
群から選ばれる。
１４０、ヒトＳＲＣ−１、マウスＴＩＦ−２、ヒトまたはマウスＣＢＰ、ヒトま
たはマウスｐ３００、マウスＴＩＦ−１およびヒトＴＲＩＰタンパク質よりなる
群から選ばれる。
【００３７】 特定の実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトＲＩＰ−１
４０であり、該結合部分は、２０〜２９、１３２〜１３９、１８４〜１９２、２
６６〜２７３、３７９〜３８７、４９６〜５０６、７１２〜７１９、８１８〜８
２５、９３５〜９４４および９３５〜９４２よりなる群から選ばれるヒトＲＩＰ
−１４０のアミノ酸の連続的伸長を含む。
４０であり、該結合部分は、２０〜２９、１３２〜１３９、１８４〜１９２、２
６６〜２７３、３７９〜３８７、４９６〜５０６、７１２〜７１９、８１８〜８
２５、９３５〜９４４および９３５〜９４２よりなる群から選ばれるヒトＲＩＰ
−１４０のアミノ酸の連続的伸長を含む。
【００３８】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトＳＲＣ
−１であり、該結合部分は、４５〜５３、６３２〜６４０、６８９〜６９６、７
４８〜７５５および１４３４〜１４４１よりなる群から選ばれるヒトＳＲＣ−１
のアミノ酸の連続的伸長を含む。
−１であり、該結合部分は、４５〜５３、６３２〜６４０、６８９〜６９６、７
４８〜７５５および１４３４〜１４４１よりなる群から選ばれるヒトＳＲＣ−１
のアミノ酸の連続的伸長を含む。
【００３９】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはマウスＴＩ
Ｆ−２であり、該結合部分は、６４０〜６５０、６８９〜６９９および７４４〜
７５４位よりなる群から選ばれるマウスＴＩＦ−２のアミノ酸の連続的伸長を含
む。
Ｆ−２であり、該結合部分は、６４０〜６５０、６８９〜６９９および７４４〜
７５４位よりなる群から選ばれるマウスＴＩＦ−２のアミノ酸の連続的伸長を含
む。
【００４０】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトまたは
マウスＣＢＰであり、該結合部分は、６８〜７８および３５６〜３６６位よりな
る群から選ばれるヒトまたはマウスＣＢＰのアミノ酸の連続的伸長を含む。
マウスＣＢＰであり、該結合部分は、６８〜７８および３５６〜３６６位よりな
る群から選ばれるヒトまたはマウスＣＢＰのアミノ酸の連続的伸長を含む。
【００４１】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトまたは
マウスｐ３００であり、該結合部分は、８０〜９０および３４１〜３５１位より
なる群から選ばれるヒトまたはマウスｐ３００のアミノ酸の連続的伸長を含む。
マウスｐ３００であり、該結合部分は、８０〜９０および３４１〜３５１位より
なる群から選ばれるヒトまたはマウスｐ３００のアミノ酸の連続的伸長を含む。
【００４２】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはマウスＴＩ
Ｆ−１であり、該結合部分は、７２２〜７３２位を含有するマウスＴＩＦ−１の
アミノ酸の連続的伸長を含む。
Ｆ−１であり、該結合部分は、７２２〜７３２位を含有するマウスＴＩＦ−１の
アミノ酸の連続的伸長を含む。
【００４３】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトＴＲＩ
Ｐ２であり、該結合部分は、２３〜３３位を含有するヒトＴＲＩＰ２のアミノ酸
の連続的伸長を含む。
Ｐ２であり、該結合部分は、２３〜３３位を含有するヒトＴＲＩＰ２のアミノ酸
の連続的伸長を含む。
【００４４】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトＴＲＩ
Ｐ３であり、該結合部分は、９７〜１０７位を含有するヒトＴＲＩＰ３のアミノ
酸の連続的伸長を含む。
Ｐ３であり、該結合部分は、９７〜１０７位を含有するヒトＴＲＩＰ３のアミノ
酸の連続的伸長を含む。
【００４５】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトＴＲＩ
Ｐ４であり、該結合部分は、３６〜４６位を含有するヒトＴＲＩＰ４のアミノ酸
の連続的伸長を含む。
Ｐ４であり、該結合部分は、３６〜４６位を含有するヒトＴＲＩＰ４のアミノ酸
の連続的伸長を含む。
【００４６】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトＴＲＩ
Ｐ５であり、該結合部分は、２６〜３６位を含有するヒトＴＲＩＰ５のアミノ酸
の連続的伸長を含む。
Ｐ５であり、該結合部分は、２６〜３６位を含有するヒトＴＲＩＰ５のアミノ酸
の連続的伸長を含む。
【００４７】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトＴＲＩ
Ｐ８であり、該結合部分は、３６〜４６位を含有するヒトＴＲＩＰ８のアミノ酸
の連続的伸長を含む。
Ｐ８であり、該結合部分は、３６〜４６位を含有するヒトＴＲＩＰ８のアミノ酸
の連続的伸長を含む。
【００４８】 もう１つの実施形態においては、該核内受容体コアクチベーターはヒトＴＲＩ
Ｐ９であり、該結合部分は、７３〜８３、２５６〜２６６および２８８〜２９８
よりなる群から選ばれるヒトＴＲＩＰ９のアミノ酸の連続的伸長を含む。
Ｐ９であり、該結合部分は、７３〜８３、２５６〜２６６および２８８〜２９８
よりなる群から選ばれるヒトＴＲＩＰ９のアミノ酸の連続的伸長を含む。
【００４９】 核内受容体コアクチベーターのアミノ酸配列に関しては、Ｙａｏら， １９９
６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１０
６２６−１０６３１ （ＳＲＣ−１）； Ｏ§ａｔｅら， １９９５， Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７０：１３５４−１３５７ （ＳＲＣ−１）； Ｃａｖａｉｌｌｅ
ｓら， １９９５， ＥＭＢＯ Ｊ． １４：３７４１−３７５１ （ＲＩＰ−
１４０）； Ｖｏｅｇｅｌら， １９９６， ＥＭＢＯ Ｊ． １５：１０１−
１０８ （ＴＩＦ−２）； Ｋｗｏｋら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７０
：２２３−２２６ （ＣＢＰ）； Ａｒｉａｓら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ
３７０：２２６−２２９ （ＣＢＰ）； Ｅｃｋｎｅｒら， １９９４， Ｇ
ｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：８６９−８８４ （ｐ３００）； Ｌｅ Ｄｏｕａｒ
ｉｎら， １９９５， ＥＭＢＯ Ｊ １４：２０２０−２０３３ （ＴＩＦ−
１）； Ｌｅｅら， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７４：９１−９４ （ＴＲ
ＩＰタンパク質）を参照されたい。
６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１０
６２６−１０６３１ （ＳＲＣ−１）； Ｏ§ａｔｅら， １９９５， Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７０：１３５４−１３５７ （ＳＲＣ−１）； Ｃａｖａｉｌｌｅ
ｓら， １９９５， ＥＭＢＯ Ｊ． １４：３７４１−３７５１ （ＲＩＰ−
１４０）； Ｖｏｅｇｅｌら， １９９６， ＥＭＢＯ Ｊ． １５：１０１−
１０８ （ＴＩＦ−２）； Ｋｗｏｋら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７０
：２２３−２２６ （ＣＢＰ）； Ａｒｉａｓら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ
３７０：２２６−２２９ （ＣＢＰ）； Ｅｃｋｎｅｒら， １９９４， Ｇ
ｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：８６９−８８４ （ｐ３００）； Ｌｅ Ｄｏｕａｒ
ｉｎら， １９９５， ＥＭＢＯ Ｊ １４：２０２０−２０３３ （ＴＩＦ−
１）； Ｌｅｅら， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７４：９１−９４ （ＴＲ
ＩＰタンパク質）を参照されたい。
【００５０】 前記の本発明の特定の実施形態はすべて、より全般的な方法（これもまた本発
明の一部である）の特定の実施形態である。その全般的な方法は、 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ドメイ
ン、 （ｂ）アミノ酸配列ＬＸＸＬＬを含有し第２蛍光試薬で標識されているポリ
ペプチド、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインと該ポリペプチドとの結合が生じる条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法である。
明の一部である）の特定の実施形態である。その全般的な方法は、 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ドメイ
ン、 （ｂ）アミノ酸配列ＬＸＸＬＬを含有し第２蛍光試薬で標識されているポリ
ペプチド、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインと該ポリペプチドとの結合が生じる条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法である。
【００５１】 特定の実施形態においては、アミノ酸配列ＬＸＸＬＬは該ポリペプチドのαヘ
リックス部分内に存在する。もう１つの実施形態においては、アミノ酸配列ＬＸ
ＸＬＬが該ポリペプチドのαヘリックス部分内に存在し、該ロイシンが疎水面を
形成する。
リックス部分内に存在する。もう１つの実施形態においては、アミノ酸配列ＬＸ
ＸＬＬが該ポリペプチドのαヘリックス部分内に存在し、該ロイシンが疎水面を
形成する。
【００５２】 本発明は、核内受容体のアンタゴニストの同定方法を提供する。そのような方
法は、該アンタゴニストが核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体
コアクチベーターとのアゴニスト誘導性結合の発生を妨げる又はそれが生じた後
そのような結合を破壊する能力に基づく。したがって、本発明は、 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ドメイ
ン、 （ｂ）第２蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体
コアクチベーターまたはその結合部分、 （ｃ）該核内受容体のアゴニスト、および （ｄ）該核内受容体のアンタゴニストであると疑われる物質 を、該物質の不存在下で該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインとＣＢＰ
、ｐ３００もしくは他の核内受容体コアクチベーターまたはその結合部分との結
合が生じる条件下で供給し、 （ｅ）該物質が存在する場合の該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍
光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定し、該物質が存在しない場合の該第１
蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間のＦＲＥＴを測定することを含んでなる、核内
受容体のアンタゴニストの同定方法であって、該物質が該核内受容体のアンタゴ
ニストであることが、該物質が存在する場合のＦＲＥＴの減少により示されるこ
とを特徴とする方法を提供する。
法は、該アンタゴニストが核内受容体とＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体
コアクチベーターとのアゴニスト誘導性結合の発生を妨げる又はそれが生じた後
そのような結合を破壊する能力に基づく。したがって、本発明は、 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ドメイ
ン、 （ｂ）第２蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体
コアクチベーターまたはその結合部分、 （ｃ）該核内受容体のアゴニスト、および （ｄ）該核内受容体のアンタゴニストであると疑われる物質 を、該物質の不存在下で該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインとＣＢＰ
、ｐ３００もしくは他の核内受容体コアクチベーターまたはその結合部分との結
合が生じる条件下で供給し、 （ｅ）該物質が存在する場合の該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍
光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定し、該物質が存在しない場合の該第１
蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間のＦＲＥＴを測定することを含んでなる、核内
受容体のアンタゴニストの同定方法であって、該物質が該核内受容体のアンタゴ
ニストであることが、該物質が存在する場合のＦＲＥＴの減少により示されるこ
とを特徴とする方法を提供する。
【００５３】 特定の実施形態においては、該核内受容体は、ステロイド受容体、甲状腺ホル
モン受容体、レチノイン酸受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レ
チノイドＸ受容体、グルココルチコイド受容体、ビタミンＤ受容体および「オー
ファン核内受容体」（例えば、ＬＸＲ、ＦＸＲなど）よりなる群から選ばれる。
モン受容体、レチノイン酸受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レ
チノイドＸ受容体、グルココルチコイド受容体、ビタミンＤ受容体および「オー
ファン核内受容体」（例えば、ＬＸＲ、ＦＸＲなど）よりなる群から選ばれる。
【００５４】 特定の実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは
完全長核内受容体である。もう１つの実施形態においては、該核内受容体または
そのリガンド結合ドメインは核内受容体のリガンド結合ドメインである。もう１
つの実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは核内
受容体のＡＦ−２部位である。
完全長核内受容体である。もう１つの実施形態においては、該核内受容体または
そのリガンド結合ドメインは核内受容体のリガンド結合ドメインである。もう１
つの実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは核内
受容体のＡＦ−２部位である。
【００５５】 特定の実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは
完全長ＰＰＡＲである。もう１つの実施形態においては、該核内受容体またはそ
のリガンド結合ドメインはＰＰＡＲのリガンド結合ドメインである。もう１つの
実施形態においては、該ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ
よりなる群から選ばれる。もう１つの実施形態においては、該ＰＰＡＲのリガン
ド結合ドメインはヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸残基１７６〜４７８を含有する。
完全長ＰＰＡＲである。もう１つの実施形態においては、該核内受容体またはそ
のリガンド結合ドメインはＰＰＡＲのリガンド結合ドメインである。もう１つの
実施形態においては、該ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ
よりなる群から選ばれる。もう１つの実施形態においては、該ＰＰＡＲのリガン
ド結合ドメインはヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸残基１７６〜４７８を含有する。
【００５６】 特定の実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは
ヒトＲＡＲαのアミノ酸１４３〜４６２を含有する。もう１つの実施形態におい
ては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインはラットＴ３Ｒα１のアミ
ノ酸１２２〜４１０を含有する。もう１つの実施形態においては、該核内受容体
またはそのリガンド結合ドメインはマウスＲＸＲγのアミノ酸２２７〜４６３を
含有する。もう１つの実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結
合ドメインはヒトＥＲのアミノ酸２５１〜５９５を含有する。
ヒトＲＡＲαのアミノ酸１４３〜４６２を含有する。もう１つの実施形態におい
ては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインはラットＴ３Ｒα１のアミ
ノ酸１２２〜４１０を含有する。もう１つの実施形態においては、該核内受容体
またはそのリガンド結合ドメインはマウスＲＸＲγのアミノ酸２２７〜４６３を
含有する。もう１つの実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結
合ドメインはヒトＥＲのアミノ酸２５１〜５９５を含有する。
【００５７】 特定の実施形態においては、前記方法はマウスまたはヒト完全長ＣＢＰを使用
する。他の実施形態においては、該方法はヒトＣＢＰのアミノ酸残基１〜１１３
を使用する。もう１つの実施形態においては、該方法はヒトＣＢＰのアミノ酸残
基１〜４５３を使用する。
する。他の実施形態においては、該方法はヒトＣＢＰのアミノ酸残基１〜１１３
を使用する。もう１つの実施形態においては、該方法はヒトＣＢＰのアミノ酸残
基１〜４５３を使用する。
【００５８】 前記方法を行なう条件は、タンパク質−タンパク質相互作用の研究のために当
技術分野において典型的に用いられる条件、例えば、生理的ｐＨ、塩条件（例え
ば、ＰＢＳなどの通常用いられるバッファーにより表されるもの）、約４℃〜約
５５℃の温度である。通常用いられる非イオン界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０
（登録商標）、サルコシル、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標））を、所望
により存在させてもよい。ユウロピウムクリプテートを蛍光試薬として使用する
場合には、反応は、少なくとも２００ｍＭの濃度のＫＦを含有すべきである。
技術分野において典型的に用いられる条件、例えば、生理的ｐＨ、塩条件（例え
ば、ＰＢＳなどの通常用いられるバッファーにより表されるもの）、約４℃〜約
５５℃の温度である。通常用いられる非イオン界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０
（登録商標）、サルコシル、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標））を、所望
により存在させてもよい。ユウロピウムクリプテートを蛍光試薬として使用する
場合には、反応は、少なくとも２００ｍＭの濃度のＫＦを含有すべきである。
【００５９】 原理的には、（ａ）供与体の吸収波長における刺激後の供与蛍光試薬の発光の
減少、および／または（ｂ）供与体の吸収波長における刺激後の受容試薬の発光
の増加をモニターすることにより、ＦＲＥＴを測定することが可能であろう。実
際には、ＦＲＥＴは、発光の比率化（ｒａｔｉｏｉｎｇ）により、より効果的に
測定される。発光の比率化により、供与体による発光に対する受容体による発光
の比率の変化をモニターする。この比率の増加は、エネルギーが供与体から受容
体へ移動していること、およびそれによりＦＲＥＴが生じていることを意味する
。発光の比率は、レーザー走査共焦点顕微鏡を使用することにより測定すること
ができる。発光の比率化は、好ましくは、サンプルからの発光をダイクロイック
ミラーで分裂させ、２つの波長帯（供与体および受容体の発光波長に対応する）
を２つの検出器で同時に測定することにより行なう。あるいは、単一の検出器で
各波長において連続的に発光をサンプル化することができる（適当なフィルター
を使用する）。いずれの場合も、ＦＲＥＴを測定するこれらの及び他の方法は、
当技術分野でよく知られている。
減少、および／または（ｂ）供与体の吸収波長における刺激後の受容試薬の発光
の増加をモニターすることにより、ＦＲＥＴを測定することが可能であろう。実
際には、ＦＲＥＴは、発光の比率化（ｒａｔｉｏｉｎｇ）により、より効果的に
測定される。発光の比率化により、供与体による発光に対する受容体による発光
の比率の変化をモニターする。この比率の増加は、エネルギーが供与体から受容
体へ移動していること、およびそれによりＦＲＥＴが生じていることを意味する
。発光の比率は、レーザー走査共焦点顕微鏡を使用することにより測定すること
ができる。発光の比率化は、好ましくは、サンプルからの発光をダイクロイック
ミラーで分裂させ、２つの波長帯（供与体および受容体の発光波長に対応する）
を２つの検出器で同時に測定することにより行なう。あるいは、単一の検出器で
各波長において連続的に発光をサンプル化することができる（適当なフィルター
を使用する）。いずれの場合も、ＦＲＥＴを測定するこれらの及び他の方法は、
当技術分野でよく知られている。
【００６０】 本発明の実施においては種々の供与および受容蛍光試薬を使用することができ
るが、本発明の好ましい実施形態は、供与試薬として蛍光試薬のクリプテートを
使用する。マクロポリ環状リガンドの分子内空孔内へ基質が包接されると、クリ
プテートが形成する。該マクロポリ環状リガンドは、溶媒および他の溶質分子と
の相互作用から該基質を遮蔽する。該基質が蛍光試薬である場合には、クリプテ
ートの形成は、該遊離試薬の分光特性とは著しく異なる該試薬の分光特性を与え
うる。
るが、本発明の好ましい実施形態は、供与試薬として蛍光試薬のクリプテートを
使用する。マクロポリ環状リガンドの分子内空孔内へ基質が包接されると、クリ
プテートが形成する。該マクロポリ環状リガンドは、溶媒および他の溶質分子と
の相互作用から該基質を遮蔽する。該基質が蛍光試薬である場合には、クリプテ
ートの形成は、該遊離試薬の分光特性とは著しく異なる該試薬の分光特性を与え
うる。
【００６１】 本発明は、供与蛍光試薬としてユウロピウム（ＥｕＩＩＩ）またはテルビウム
（ＴｂＩＩＩ）クリプテートを使用することを含む。そのようなＥｕＩＩＩまた
はＴｂＩＩＩクリプテート、およびそれらの形成方法は、当技術分野でよく知ら
れている。例えば、Ａｌｐｈａら， １９８７， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．
Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ２６：２６６−２６７； Ｍａｔｈｉｓ， １
９９５， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４１：１３９１−１３９７を参照されたい
。ユウロピウムクリプテートは、光吸収体としてビピリジン基を含有するマクロ
ポリ環状リガンドの分子内空孔内へのユウロピウムイオンの包接により形成され
る。ユウロピウムクリプテートがフッ化物イオンと共に溶液中に存在する場合に
は、該ユウロピウムクリプテート蛍光の全遮蔽が生じる。ユウロピウムクリプテ
ートの分子構造を以下に示す。
（ＴｂＩＩＩ）クリプテートを使用することを含む。そのようなＥｕＩＩＩまた
はＴｂＩＩＩクリプテート、およびそれらの形成方法は、当技術分野でよく知ら
れている。例えば、Ａｌｐｈａら， １９８７， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．
Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ２６：２６６−２６７； Ｍａｔｈｉｓ， １
９９５， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４１：１３９１−１３９７を参照されたい
。ユウロピウムクリプテートは、光吸収体としてビピリジン基を含有するマクロ
ポリ環状リガンドの分子内空孔内へのユウロピウムイオンの包接により形成され
る。ユウロピウムクリプテートがフッ化物イオンと共に溶液中に存在する場合に
は、該ユウロピウムクリプテート蛍光の全遮蔽が生じる。ユウロピウムクリプテ
ートの分子構造を以下に示す。
【００６２】
【化１】
【００６３】 ユウロピウムクリプテートは、よく知られたヘテロ二官能性試薬の使用により
タンパク質にコンジュゲート化することができる（例えば、国際特許出願ＷＯ
８９／０５８１３； Ｐｒａｔら， １９９１， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ
． １９５：２８３−２８９； Ｌｏｐｅｚら， １９９３， Ｃｌｉｎ． Ｃ
ｈｅｍ． ３９：１９６−２０１を参照されたい）。
タンパク質にコンジュゲート化することができる（例えば、国際特許出願ＷＯ
８９／０５８１３； Ｐｒａｔら， １９９１， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ
． １９５：２８３−２８９； Ｌｏｐｅｚら， １９９３， Ｃｌｉｎ． Ｃ
ｈｅｍ． ３９：１９６−２０１を参照されたい）。
【００６４】 本発明は、受容蛍光試薬としてＸＬ６６５を使用することを含む。ＸＬ６６５
はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）の架橋誘導体である。ＡＰＣは、藻類の光収集
系に由来するポルフィリン含有タンパク質である（Ｋｒｏｎｉｃｋ， １９８６
， Ｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ９２：１−１３）。ＸＬ６６５は、
約６２０ｎｍに最大吸収を、６６５ｎｍに最大発光を有する。本発明のいくつか
の実施形態においては、ＸＬ６６５をストレプトアビジンで標識して、該ストレ
プトアビジン標識ＸＬ６６５をビオチン標識物質（例えば、ＣＢＰまたは核内受
容体のリガンド結合ドメイン）に結合させる。ＸＬ６５５のストレプトアビジン
標識、およびＣＢＰまたは核内受容体のリガンド結合ドメインのビオチン標識は
、よく知られた方法で行なうことができる。
はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）の架橋誘導体である。ＡＰＣは、藻類の光収集
系に由来するポルフィリン含有タンパク質である（Ｋｒｏｎｉｃｋ， １９８６
， Ｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ９２：１−１３）。ＸＬ６６５は、
約６２０ｎｍに最大吸収を、６６５ｎｍに最大発光を有する。本発明のいくつか
の実施形態においては、ＸＬ６６５をストレプトアビジンで標識して、該ストレ
プトアビジン標識ＸＬ６６５をビオチン標識物質（例えば、ＣＢＰまたは核内受
容体のリガンド結合ドメイン）に結合させる。ＸＬ６５５のストレプトアビジン
標識、およびＣＢＰまたは核内受容体のリガンド結合ドメインのビオチン標識は
、よく知られた方法で行なうことができる。
【００６５】 本発明の好ましい実施形態においては、受容蛍光試薬としてのＸＬ６６５を、
供与蛍光試薬としてのユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）と一緒にする。
ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）は、３３７ｎｍで光を吸収し６２０ｎ
ｍで発光する大きなストークスシフトを有する。したがって、ユウロピウムクリ
プテート（Ｅｕ３＋Ｋ）の最大発光は、ＸＬ６６５の最大吸収と重複する。ユウ
ロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）は大きな一過性シフトを有し、光子の吸収
と放出との間の時間は約１ミリ秒である。これは好都合なことである。なぜなら
、生物学的サンプル中のほとんどのバックグラウンド蛍光シグナルは短寿命だか
らである。したがって、長い蛍光寿命を有するユウロピウムクリプテートなどの
蛍光試薬の使用は、バックグラウンド干渉の減少につながる時間分解検出を可能
にする。
供与蛍光試薬としてのユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）と一緒にする。
ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）は、３３７ｎｍで光を吸収し６２０ｎ
ｍで発光する大きなストークスシフトを有する。したがって、ユウロピウムクリ
プテート（Ｅｕ３＋Ｋ）の最大発光は、ＸＬ６６５の最大吸収と重複する。ユウ
ロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）は大きな一過性シフトを有し、光子の吸収
と放出との間の時間は約１ミリ秒である。これは好都合なことである。なぜなら
、生物学的サンプル中のほとんどのバックグラウンド蛍光シグナルは短寿命だか
らである。したがって、長い蛍光寿命を有するユウロピウムクリプテートなどの
蛍光試薬の使用は、バックグラウンド干渉の減少につながる時間分解検出を可能
にする。
【００６６】 ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）のスペクトル的および時間的特性は
、蛍光バックグラウンドを実質的に与えず、したがって、この蛍光試薬を使用す
るアッセイは、「混合および読取り（ｍｉｘ ａｎｄ ｒｅａｄ）」モードで行
なうことが可能であり、ハイスループットスクリーニング手段としてのその使用
を著しく促進する。ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）およびＸＬ６６５
を使用する実施形態の場合には、測定装置は３３７ｎｍでサンプルに照射し、６
２０ｎｍ（Ｂカウント、ユウロピウムの蛍光）および６６５ｎｍ（Ａカウント、
ＸＬ６６５の蛍光）の２つの波長で蛍光出力を測定する。蛍光共鳴エネルギー移
動の程度は、これらの２つの値の間の比率として評価する。典型的には、この比
率を１０，０００倍して自然数を得る。
、蛍光バックグラウンドを実質的に与えず、したがって、この蛍光試薬を使用す
るアッセイは、「混合および読取り（ｍｉｘ ａｎｄ ｒｅａｄ）」モードで行
なうことが可能であり、ハイスループットスクリーニング手段としてのその使用
を著しく促進する。ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）およびＸＬ６６５
を使用する実施形態の場合には、測定装置は３３７ｎｍでサンプルに照射し、６
２０ｎｍ（Ｂカウント、ユウロピウムの蛍光）および６６５ｎｍ（Ａカウント、
ＸＬ６６５の蛍光）の２つの波長で蛍光出力を測定する。蛍光共鳴エネルギー移
動の程度は、これらの２つの値の間の比率として評価する。典型的には、この比
率を１０，０００倍して自然数を得る。
【００６７】 他のＦＲＥＴ供与体−受容体ペアも本発明の実施に適している。例えば、以下
の供与体−受容体ペアを使用することができる：ダンシル／フルオレセイン、フ
ルオレセイン／ローダミン、トリプトファン／アミノクマリン。
の供与体−受容体ペアを使用することができる：ダンシル／フルオレセイン、フ
ルオレセイン／ローダミン、トリプトファン／アミノクマリン。
【００６８】 本発明は、核内受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する前記方法
で使用するための、蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ド
メインを提供する。本発明はまた、蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もし
くは他の核内受容体コアクチベーターまたはその結合部分を提供する。
で使用するための、蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合ド
メインを提供する。本発明はまた、蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もし
くは他の核内受容体コアクチベーターまたはその結合部分を提供する。
【００６９】 特定の実施形態においては、該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインは
、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰ
ＰＡＲδのリガンド結合ドメイン、およびヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸残基１７
６〜４７８よりなる群から選ばれ、該蛍光試薬は、ＸＬ６６５およびユウロピウ
ムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりなる群から選ばれる。
、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰ
ＰＡＲδのリガンド結合ドメイン、およびヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸残基１７
６〜４７８よりなる群から選ばれ、該蛍光試薬は、ＸＬ６６５およびユウロピウ
ムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりなる群から選ばれる。
【００７０】 特定の実施形態においては、ＣＢＰ、ｐ３００または他の核内受容体コアクチ
ベーターを、ＸＬ６６５およびユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりな
る群から選ばれる蛍光試薬で標識する。
ベーターを、ＸＬ６６５およびユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりな
る群から選ばれる蛍光試薬で標識する。
【００７１】 以下の非限定的な実施例により、本発明を更に例示する。
【００７２】 実施例１ヒトＣＢＰおよびＰＰＡＲタンパク質のクローニング、発現および精製 ヒトＣＢＰがアゴニスト依存的にＰＰＡＲと相互作用しうるか否かを試験する
ために、本発明者らは、ＮＨ２−末端のアミノ酸１〜１１３（ｈＣＢＰ１−１１
３）およびヒトＣＢＰのアミノ酸１〜４５３（ｈＣＢＰ１−４５３）をコードす
るヒトｃＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングした
。ヒトＣＢＰのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｂｏｒｒｏｗら， １９９６，
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １４：３３−４１およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号
Ｕ４７７４１に開示されている。
ために、本発明者らは、ＮＨ２−末端のアミノ酸１〜１１３（ｈＣＢＰ１−１１
３）およびヒトＣＢＰのアミノ酸１〜４５３（ｈＣＢＰ１−４５３）をコードす
るヒトｃＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングした
。ヒトＣＢＰのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｂｏｒｒｏｗら， １９９６，
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １４：３３−４１およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号
Ｕ４７７４１に開示されている。
【００７３】 ｈＣＢＰ１−１１３用に使用したプライマーは、５’−ＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣ
ＡＡＧＣＣＡＴＧ ＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧ−３’（配列番
号９）および５’−ＣＡＣＡＡＡＧＣ ＴＴＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴ
ＧＴＴＣＧＧ−３’（配列番号１０）であった。これらのプライマーは０．９ｋ
ｂのＤＮＡ断片を増幅すると予想された。
ＡＡＧＣＣＡＴＧ ＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧ−３’（配列番
号９）および５’−ＣＡＣＡＡＡＧＣ ＴＴＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴ
ＧＴＴＣＧＧ−３’（配列番号１０）であった。これらのプライマーは０．９ｋ
ｂのＤＮＡ断片を増幅すると予想された。
【００７４】 ｈＣＢＰ１−４５３用のプライマーは、５’−ＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣ
ＣＡＴＧＧＣＴ ＧＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧ−３’（配列番号９）お
よび５’−ＣＴＣＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴ ＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＧＣＴＧ
ＧＡＧＡＴＣＣ−３’（配列番号１１）であった。これらのプライマーは１．５
ｋｂのＤＮＡ断片を増幅すると予想された。
ＣＡＴＧＧＣＴ ＧＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧ−３’（配列番号９）お
よび５’−ＣＴＣＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴ ＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＧＣＴＧ
ＧＡＧＡＴＣＣ−３’（配列番号１１）であった。これらのプライマーは１．５
ｋｂのＤＮＡ断片を増幅すると予想された。
【００７５】 該ＰＣＲ反応用の鋳型は、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ， Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＃ＩＳ ９３７２２７）であった。もちろん、
ＣＢＰを発現する組織からの任意のヒトｃＤＮＡライブラリーを使用することが
可能であったであろう。該ＰＣＲにより０．９ｋｂおよび１．５ｋｂのＤＮＡ断
片を増幅し、それらを制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＩＩベクター中に連結した。増幅された断片が、ヒトＣＢＰの公開されてい
る対応核酸配列と同一であることを、ＤＮＡ配列決定分析により確認した。
ｅｎｅ， Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＃ＩＳ ９３７２２７）であった。もちろん、
ＣＢＰを発現する組織からの任意のヒトｃＤＮＡライブラリーを使用することが
可能であったであろう。該ＰＣＲにより０．９ｋｂおよび１．５ｋｂのＤＮＡ断
片を増幅し、それらを制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＩＩベクター中に連結した。増幅された断片が、ヒトＣＢＰの公開されてい
る対応核酸配列と同一であることを、ＤＮＡ配列決定分析により確認した。
【００７６】 当業者であれば、ヒトＣＢＰをコードするｃＤＮＡの他の部分を適当なｃＤＮ
Ａライブラリーから増幅しクローニングするために、前記のヒトＣＢＰの公的に
入手可能な配列に基づき、他のプライマーを容易に同定し調製することが可能で
あろう。ヒトＣＢＰのそのような部分が得られたら、ｈＣＢＰ１−１１３および
ｈＣＢＰ１−４５３に関して本明細書に記載されているものと同様にして、それ
らを本発明方法において使用することが可能であろう。ヒトＣＢＰのアミノ酸配
列を図７Ａに示し、ヒトＣＢＰをコードするｃＤＮＡの核酸配列を図７Ｂに示す
。
Ａライブラリーから増幅しクローニングするために、前記のヒトＣＢＰの公的に
入手可能な配列に基づき、他のプライマーを容易に同定し調製することが可能で
あろう。ヒトＣＢＰのそのような部分が得られたら、ｈＣＢＰ１−１１３および
ｈＣＢＰ１−４５３に関して本明細書に記載されているものと同様にして、それ
らを本発明方法において使用することが可能であろう。ヒトＣＢＰのアミノ酸配
列を図７Ａに示し、ヒトＣＢＰをコードするｃＤＮＡの核酸配列を図７Ｂに示す
。
【００７７】 該ＰＣＲ断片にコードされるポリペプチドを発現させるために、該ポリペプチ
ドおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合タンパク質をコ
ードするベクターを構築し、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内で発現させた。該ＰＣ
Ｒ断片を発現ベクターｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中にサ
ブクローニングして、ｐＧＥＸｈＣＢＰ１−１１３およびｐＧＥＸｈＣＢＰ１−
４５３を得た。ｐＧＥＸｈＣＢＰ１−１１３およびｐＧＥＸｈＣＢＰ１−４５３
を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のＤＨ５α株（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中にトランス
フェクトし、ｐＧＥＸｈＣＢＰ１−１１３またはｐＧＥＸｈＣＢＰ１−４５３を
保持する細菌を、ＬＢ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中でＯＤ６００＝０．７〜１
．０の密度まで培養し、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド）を０
．２ｍＭの最終濃度まで加えることにより該ＧＳＴ−ＣＢＰ融合タンパク質を過
剰発現するように誘導した。ＩＰＴＧで誘導された培養を更に室温で２〜５時間
増殖させた。該細胞を、５０００ｇで１０分間の遠心分離により収穫した。グル
タチオンセファロースビーズを使用するＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈの
方法に従い、ＧＳＴ−ＣＢＰ融合タンパク質の精製に該細胞ペレットを使用した
。ｈＣＢＰ１−１１３およびｈＣＢＰ１−４５３タンパク質を、対応するＧＳＴ
融合タンパク質をトロンビンで切断することにより得た。ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動分析は、ｐＧＥＸｈＣＢＰ１−１１３からの調製物が、１２
ｋｄおよび１０ｋｄの見掛け分子量を有する２つのポリペプチドバンドを与える
ことを示した。該１２ｋｄバンドはｈＣＢＰ１−１１３の予想されるサイズであ
り、該１０ｋｄバンドは、十中八九、未成熟翻訳終結産物であろう。ｐＧＥＸｈ
ＣＢＰ１−４５０からの調製物は、予想される５０ｋｄのサイズを有する単一の
バンドを与えた。
ドおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合タンパク質をコ
ードするベクターを構築し、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内で発現させた。該ＰＣ
Ｒ断片を発現ベクターｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中にサ
ブクローニングして、ｐＧＥＸｈＣＢＰ１−１１３およびｐＧＥＸｈＣＢＰ１−
４５３を得た。ｐＧＥＸｈＣＢＰ１−１１３およびｐＧＥＸｈＣＢＰ１−４５３
を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のＤＨ５α株（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中にトランス
フェクトし、ｐＧＥＸｈＣＢＰ１−１１３またはｐＧＥＸｈＣＢＰ１−４５３を
保持する細菌を、ＬＢ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中でＯＤ６００＝０．７〜１
．０の密度まで培養し、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド）を０
．２ｍＭの最終濃度まで加えることにより該ＧＳＴ−ＣＢＰ融合タンパク質を過
剰発現するように誘導した。ＩＰＴＧで誘導された培養を更に室温で２〜５時間
増殖させた。該細胞を、５０００ｇで１０分間の遠心分離により収穫した。グル
タチオンセファロースビーズを使用するＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈの
方法に従い、ＧＳＴ−ＣＢＰ融合タンパク質の精製に該細胞ペレットを使用した
。ｈＣＢＰ１−１１３およびｈＣＢＰ１−４５３タンパク質を、対応するＧＳＴ
融合タンパク質をトロンビンで切断することにより得た。ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動分析は、ｐＧＥＸｈＣＢＰ１−１１３からの調製物が、１２
ｋｄおよび１０ｋｄの見掛け分子量を有する２つのポリペプチドバンドを与える
ことを示した。該１２ｋｄバンドはｈＣＢＰ１−１１３の予想されるサイズであ
り、該１０ｋｄバンドは、十中八九、未成熟翻訳終結産物であろう。ｐＧＥＸｈ
ＣＢＰ１−４５０からの調製物は、予想される５０ｋｄのサイズを有する単一の
バンドを与えた。
【００７８】 完全長ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ１をコードするｃＤＮＡをｐＧＥＸベクタ
ー中にサブクローニングして、ＧＳＴ−ＰＰＡＲαおよびＧＳＴ−ＰＰＡＲγ１
融合タンパク質を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内で産生させた。ＰＰＡＲγ１をヒ
ト脂肪細胞ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら，
１９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．
２２４：４３１−４３７を参照されたい）。ヒトＰＰＡＲγ１リガンド結合ドメ
イン（ＰＰＡＲγ１ＬＢＤ； ＰＰＡＲγ１のアミノ酸１７６−４７８）をコー
ドするｃＤＮＡを、Ｘｈｏ Ｉ（該ＬＢＤのＮ末端に位置する部位）／Ｘｂａ
Ｉ（ｐＳＧ５ベクター中に位置する部位）断片として、修飾ｐＳＧ５ベクターか
らサブクローニングした。該Ｘｂａ Ｉ部位をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端化した。該ＬＢＤを含有する１．１ｋｂの断片をアガロースゲルから精製し
、Ｘｈｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化されたｐＧＥＸ−ＫＧ（Ｇｕａｎお
よびＤｉｘｏｎ， １９９１， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９２：２６２−
２６７を参照されたい）（該Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端化されている）中に連結した。ＧＳＴ−ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤおよび
ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤ（ＧＳＴから切断遊離した該リガンド結合ドメイン）の産
生のために、この構築物を使用した。ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲ
γ１ＬＢＤの過剰発現および精製は、ＣＢＰに関して前記したとおりに行なった
。
ー中にサブクローニングして、ＧＳＴ−ＰＰＡＲαおよびＧＳＴ−ＰＰＡＲγ１
融合タンパク質を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内で産生させた。ＰＰＡＲγ１をヒ
ト脂肪細胞ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら，
１９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．
２２４：４３１−４３７を参照されたい）。ヒトＰＰＡＲγ１リガンド結合ドメ
イン（ＰＰＡＲγ１ＬＢＤ； ＰＰＡＲγ１のアミノ酸１７６−４７８）をコー
ドするｃＤＮＡを、Ｘｈｏ Ｉ（該ＬＢＤのＮ末端に位置する部位）／Ｘｂａ
Ｉ（ｐＳＧ５ベクター中に位置する部位）断片として、修飾ｐＳＧ５ベクターか
らサブクローニングした。該Ｘｂａ Ｉ部位をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端化した。該ＬＢＤを含有する１．１ｋｂの断片をアガロースゲルから精製し
、Ｘｈｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化されたｐＧＥＸ−ＫＧ（Ｇｕａｎお
よびＤｉｘｏｎ， １９９１， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９２：２６２−
２６７を参照されたい）（該Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端化されている）中に連結した。ＧＳＴ−ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤおよび
ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤ（ＧＳＴから切断遊離した該リガンド結合ドメイン）の産
生のために、この構築物を使用した。ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲ
γ１ＬＢＤの過剰発現および精製は、ＣＢＰに関して前記したとおりに行なった
。
【００７９】 ヒトＰＰＡＲαのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｓｃｈｍｉｄｔら， １９９
２， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ６：１６３４−１６４１およびＧｅ
ｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０７５９２に開示されている。図８Ａおよび８Ｂを参照さ
れたい。
２， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ６：１６３４−１６４１およびＧｅ
ｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０７５９２に開示されている。図８Ａおよび８Ｂを参照さ
れたい。
【００８０】 ヒトＰＰＡＲγ１のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｇｒｅｅｎｅら， １９９
５， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． ４：２８１−２９９； Ｑｉら， １９９５，
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：１８１７−１８２５； Ｅｌｂｒｅ
ｃｈｔら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃ
ｏｍｍ． ２２４：４３１−４３７およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ４０９０４
に開示されている。図９Ａおよび９Ｂを参照されたい。ヒトＰＰＡＲγ２は、２
３アミノ酸のアミノ末端の付加以外はヒトＰＰＡＲγ１と同じアミノ酸を含有す
る（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２２４：４３１−４３７）。したがって、ヒトＰＰＡ
Ｒγ２のリガンド結合ドメインのアミノ酸配列とヒトＰＰＡＲγ１のリガンド結
合ドメインのアミノ酸配列とでは、アミノ酸の番号づけにおいては異なっている
が（ヒトＰＰＡＲγ１では１７６〜４７８、ヒトＰＰＡＲγ２では２００〜５０
２）、配列は同一である。
５， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． ４：２８１−２９９； Ｑｉら， １９９５，
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：１８１７−１８２５； Ｅｌｂｒｅ
ｃｈｔら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃ
ｏｍｍ． ２２４：４３１−４３７およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ４０９０４
に開示されている。図９Ａおよび９Ｂを参照されたい。ヒトＰＰＡＲγ２は、２
３アミノ酸のアミノ末端の付加以外はヒトＰＰＡＲγ１と同じアミノ酸を含有す
る（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２２４：４３１−４３７）。したがって、ヒトＰＰＡ
Ｒγ２のリガンド結合ドメインのアミノ酸配列とヒトＰＰＡＲγ１のリガンド結
合ドメインのアミノ酸配列とでは、アミノ酸の番号づけにおいては異なっている
が（ヒトＰＰＡＲγ１では１７６〜４７８、ヒトＰＰＡＲγ２では２００〜５０
２）、配列は同一である。
【００８１】 ヒトＰＰＡＲδのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｓｈｅｒら， １９９３，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：５５９８−５６０４およびＧｅｎＢａｎｋ受
託番号Ｌ０２９３２に開示されている。図１０Ａ〜Ｃを参照されたい。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：５５９８−５６０４およびＧｅｎＢａｎｋ受
託番号Ｌ０２９３２に開示されている。図１０Ａ〜Ｃを参照されたい。
【００８２】 実施例２ＰＰＡＲおよびｈＣＢＰ断片間の相互作用 まず、ｈＣＢＰ１−１１３およびｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤを使用して実験を行な
った。ＰＩＥＲＣＥが示している方法に従い、ビオチン：ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤ
の比が３：１となるように、精製ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤをスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ
−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ）でビオチン化した。精製ｈＣＢＰ１−１１３を、図
１に例示している方法によりユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）で直接標
識した。ビオチンで標識されたｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤ、Ｅｕ３＋Ｋで標識された
ｈＣＢＰ１−１１３、およびストレプトアビジンで標識されたＸＬ６６５（ＰＡ
ＣＫＡＲＤからのＳＡ−ＸＬ６６５）を、１μＭの公知ＰＰＡＲγアゴニスト（
ＢＲＬ４９６５３またはＡＤ５０７５）の存在下または不存在下、一緒にインキ
ュベートした。
った。ＰＩＥＲＣＥが示している方法に従い、ビオチン：ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤ
の比が３：１となるように、精製ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤをスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ
−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ）でビオチン化した。精製ｈＣＢＰ１−１１３を、図
１に例示している方法によりユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）で直接標
識した。ビオチンで標識されたｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤ、Ｅｕ３＋Ｋで標識された
ｈＣＢＰ１−１１３、およびストレプトアビジンで標識されたＸＬ６６５（ＰＡ
ＣＫＡＲＤからのＳＡ−ＸＬ６６５）を、１μＭの公知ＰＰＡＲγアゴニスト（
ＢＲＬ４９６５３またはＡＤ５０７５）の存在下または不存在下、一緒にインキ
ュベートした。
【００８３】 したがって、この実験方法は、供与体として作用するユウロピウムクリプテー
ト（Ｅｕ３＋Ｋ）および受容体として作用するＸＬ６６５の蛍光試薬ペアを使用
する。ｈＣＢＰ１−１１３はユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）で直接標
識し、ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤは、ビオチン−ストレプトアビジン連結を用いてＸ
Ｌ６６５で間接的に標識した。ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）の最大
発光は、ＸＬ６６５の最大吸収と重複する。したがって、ユウロピウムクリプテ
ート（Ｅｕ３＋Ｋ）とＸＬ６６５とが接近しており該サンプルに３３７ｎｍ（ユ
ウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）の最大吸収）の光を照射した場合、ユウ
ロピウムクリプテート（Ｅｕ＋Ｋ）とＸＬ６６５との間でＦＲＥＴが生じうる。
このＦＲＥＴは、６６５ｎｍにおけるＸＬ６６５による発光の増加として現れる
。図２は、この実験（表１の実験）で用いる方法の概要を示す。アゴニストがｈ
ＰＰＡＲγ１ＬＢＤに結合すると、ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤとｈＣＢＰ１−１１３
との間で特異的相互作用が生じ、ＦＲＥＴが生じるのに十分な程度にユウロピウ
ムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）とＸＬ６６５とが接近する。アゴニストの不存在
下では、ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤとｈＣＢＰ１−１１３との間で相互作用が生じな
いため、ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ＋Ｋ）とＸＬ６６５とが接近せず、Ｆ
ＲＥＴは生じない。ＦＲＥＴが生じると、ＸＬ６６５の最大発光（６６５ｎｍ）
においてサンプルが放出する光の量は、ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ
）の最大発光（６２０ｎｍ）においてサンプルが放出する光の量に対して相関的
に増加する。したがって、アゴニストであると疑われる物質の存在下および不存
在下での６２０ｎｍにおける発光に対する６６５ｎｍにおける発光の比率の測定
は、その物質が実際にアゴニストであるか否かの判定を可能にする。該物質がア
ゴニストであれば、該物質の存在下での６２０ｎｍにおける発光に対する６６５
ｎｍにおける発光の比率の増加が観察されるであろう。
ト（Ｅｕ３＋Ｋ）および受容体として作用するＸＬ６６５の蛍光試薬ペアを使用
する。ｈＣＢＰ１−１１３はユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）で直接標
識し、ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤは、ビオチン−ストレプトアビジン連結を用いてＸ
Ｌ６６５で間接的に標識した。ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）の最大
発光は、ＸＬ６６５の最大吸収と重複する。したがって、ユウロピウムクリプテ
ート（Ｅｕ３＋Ｋ）とＸＬ６６５とが接近しており該サンプルに３３７ｎｍ（ユ
ウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）の最大吸収）の光を照射した場合、ユウ
ロピウムクリプテート（Ｅｕ＋Ｋ）とＸＬ６６５との間でＦＲＥＴが生じうる。
このＦＲＥＴは、６６５ｎｍにおけるＸＬ６６５による発光の増加として現れる
。図２は、この実験（表１の実験）で用いる方法の概要を示す。アゴニストがｈ
ＰＰＡＲγ１ＬＢＤに結合すると、ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤとｈＣＢＰ１−１１３
との間で特異的相互作用が生じ、ＦＲＥＴが生じるのに十分な程度にユウロピウ
ムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）とＸＬ６６５とが接近する。アゴニストの不存在
下では、ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤとｈＣＢＰ１−１１３との間で相互作用が生じな
いため、ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ＋Ｋ）とＸＬ６６５とが接近せず、Ｆ
ＲＥＴは生じない。ＦＲＥＴが生じると、ＸＬ６６５の最大発光（６６５ｎｍ）
においてサンプルが放出する光の量は、ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ
）の最大発光（６２０ｎｍ）においてサンプルが放出する光の量に対して相関的
に増加する。したがって、アゴニストであると疑われる物質の存在下および不存
在下での６２０ｎｍにおける発光に対する６６５ｎｍにおける発光の比率の測定
は、その物質が実際にアゴニストであるか否かの判定を可能にする。該物質がア
ゴニストであれば、該物質の存在下での６２０ｎｍにおける発光に対する６６５
ｎｍにおける発光の比率の増加が観察されるであろう。
【００８４】 反応はマイクロタイタープレート中で行なった。反応条件は以下のとおりであ
った。反応バッファー（５００ｍＭ ＫＦ、０．１％ウシ血清アルブミンＢＳＡ
を含有するＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ、後記を参照されたい）の適当な容量（合計
２５０μｌ）を各ウェルに加え、ついでリガンド（最終濃度１μＭのＢＲＬ４９
６５３またはＡＤ５０７５）および０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
またはビヒクル対照（０．１％ＤＭＳＯ）、Ｅｕ３＋Ｋ標識ｈＣＢＰ（１００ｎ
Ｍ）、ビオチン−ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤ（１００ｎＭ）およびストレプトアビジ
ン標識ＸＬ６６５（１００ｎＭ）を適当なウェルに加えた。混合後、２００μｌ
の反応混合物を新たなウェルに移した。該プレートを蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）に関して直接測定するか、またはシーリングテープ（ＰＡＣＫＡＲＤ
）で覆って蒸発を防ぎ、ＦＲＥＴの測定前に室温で２４時間までインキュベート
した。
った。反応バッファー（５００ｍＭ ＫＦ、０．１％ウシ血清アルブミンＢＳＡ
を含有するＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ、後記を参照されたい）の適当な容量（合計
２５０μｌ）を各ウェルに加え、ついでリガンド（最終濃度１μＭのＢＲＬ４９
６５３またはＡＤ５０７５）および０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
またはビヒクル対照（０．１％ＤＭＳＯ）、Ｅｕ３＋Ｋ標識ｈＣＢＰ（１００ｎ
Ｍ）、ビオチン−ｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤ（１００ｎＭ）およびストレプトアビジ
ン標識ＸＬ６６５（１００ｎＭ）を適当なウェルに加えた。混合後、２００μｌ
の反応混合物を新たなウェルに移した。該プレートを蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）に関して直接測定するか、またはシーリングテープ（ＰＡＣＫＡＲＤ
）で覆って蒸発を防ぎ、ＦＲＥＴの測定前に室温で２４時間までインキュベート
した。
【００８５】 この実験および後記の他の実験の結果は、以下のとおりの比率を与えた。
【００８６】
【表１】
【００８７】 表１の実験は、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ， ２．７ｍＭ ＫＣｌ， ４
．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４， １．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４， ｐＨ７．４）を使
用して行なった。ＡＤ５０７５の存在下で認められた、より大きな発光比率は、
ｈＣＢＰ１−１１３とｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤとの間の特異的相互作用がアゴニス
トＡＤ５０７５の存在下で生じたことを示している。ＦＲＥＴが生じていること
は明らかであったが、シグナル−ノイズ比は小さかった。表１の実験２では、Ｐ
ＢＳの代わりに、０．０５％ ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）を含有す
るＨＥＰＥＳバッファー（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エ
タンスルホン酸， １００ｍＭ， ｐＨ７．０）を使用し、改善されたシグナル
−ノイズ比を得た。
．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４， １．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４， ｐＨ７．４）を使
用して行なった。ＡＤ５０７５の存在下で認められた、より大きな発光比率は、
ｈＣＢＰ１−１１３とｈＰＰＡＲγ１ＬＢＤとの間の特異的相互作用がアゴニス
トＡＤ５０７５の存在下で生じたことを示している。ＦＲＥＴが生じていること
は明らかであったが、シグナル−ノイズ比は小さかった。表１の実験２では、Ｐ
ＢＳの代わりに、０．０５％ ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）を含有す
るＨＥＰＥＳバッファー（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エ
タンスルホン酸， １００ｍＭ， ｐＨ７．０）を使用し、改善されたシグナル
−ノイズ比を得た。
【００８８】 より一層良好なシグナル−ノイズ比を得るために、実験３では前記方法を若干
変更した。実験３では、ＳＡ−ＸＬ６６５（５００ｎＭ）、ビオチン標識ｈＰＰ
ＡＲγ１ＬＢＤ（１００ｎＭ）、ＧＳＴ−ｈＣＢＰ１−１１３およびＥｕ３＋Ｋ
標識抗ＧＳＴ抗体（２．５μｌ）を、０．０５％ ＮＰ４０を含有するＨＥＰＥ
Ｓバッファー中、ＡＤ５０７５（１μＭ）の存在下または不存在下でインキュベ
ートした。２倍のシグナル−ノイズ比を得た。図３は、実験３で用いる方法の概
要を示す。
変更した。実験３では、ＳＡ−ＸＬ６６５（５００ｎＭ）、ビオチン標識ｈＰＰ
ＡＲγ１ＬＢＤ（１００ｎＭ）、ＧＳＴ−ｈＣＢＰ１−１１３およびＥｕ３＋Ｋ
標識抗ＧＳＴ抗体（２．５μｌ）を、０．０５％ ＮＰ４０を含有するＨＥＰＥ
Ｓバッファー中、ＡＤ５０７５（１μＭ）の存在下または不存在下でインキュベ
ートした。２倍のシグナル−ノイズ比を得た。図３は、実験３で用いる方法の概
要を示す。
【００８９】 該抗ＧＳＴ抗体は、以下に要約される方法に従いＥｕ３＋Ｋで標識されたＰｈ
ａｒｍａｃｉａ（カタログ番号２７−４５７７−０１）からのＧＳＴに対するヤ
ギ抗体であった。
ａｒｍａｃｉａ（カタログ番号２７−４５７７−０１）からのＧＳＴに対するヤ
ギ抗体であった。
【００９０】
【化２】
【００９１】 シグナル−ノイズ比を更に改善するために、一連の実験を行なった。表１の実
験４は、それらの努力から得られた結果を例証するものである。より長いｈＣＢ
Ｐ断片をコードするｃＤＮＡをクローニングし、発現させて、ｈＣＢＰ１−４５
３を得た。ｈＣＢＰ１−４５３をビオチン化した。ビオチン標識ｈＣＢＰ１−４
５３（２５ｎＭ）、ＳＡ−ＸＬ６６５（１００ｎＭ）、ＧＳＴ−ｈＰＰＡＲγ１
ＬＢＤ（１ｎＭ）およびＥｕ３＋Ｋ標識抗ＧＳＴ抗体（２ｎＭ）を、１μＭ Ａ
Ｄ５０７５の存在下または不存在下で一緒に混合した。界面活性剤を、０．０５
％ ＮＰ４０から０．５％ ＣＨＡＰＳ（３−｛［３−コラミドプロピル］ジメ
チル−アンモニオール｝−１−プロパンスルホナート）に変更した。３〜４倍の
シグナル−ノイズ比が得られた。図４は、実験４および同様の実験で用いた方法
を示す。
験４は、それらの努力から得られた結果を例証するものである。より長いｈＣＢ
Ｐ断片をコードするｃＤＮＡをクローニングし、発現させて、ｈＣＢＰ１−４５
３を得た。ｈＣＢＰ１−４５３をビオチン化した。ビオチン標識ｈＣＢＰ１−４
５３（２５ｎＭ）、ＳＡ−ＸＬ６６５（１００ｎＭ）、ＧＳＴ−ｈＰＰＡＲγ１
ＬＢＤ（１ｎＭ）およびＥｕ３＋Ｋ標識抗ＧＳＴ抗体（２ｎＭ）を、１μＭ Ａ
Ｄ５０７５の存在下または不存在下で一緒に混合した。界面活性剤を、０．０５
％ ＮＰ４０から０．５％ ＣＨＡＰＳ（３−｛［３−コラミドプロピル］ジメ
チル−アンモニオール｝−１−プロパンスルホナート）に変更した。３〜４倍の
シグナル−ノイズ比が得られた。図４は、実験４および同様の実験で用いた方法
を示す。
【００９２】 前記アッセイからの結果と、ＰＰＡＲγのアゴニストであることが知られてい
る選ばれた抗糖尿病インスリン増感剤のインビトロ結合および転写活性化アッセ
イからの既に報告されている結果（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら， １９９６， Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２２４：４３１−４３７）との
間の相関性を、それらの公知ＰＰＡＲγアゴニストを前記アッセイにおいて滴定
し、そのようにして得られたＥＣ５０を、該公知アゴニストの結合または転写活
性化アッセイにおける効力に関する既に記載されている値と比較することにより
分析した。結果を図５に示す。図５から、以下のＥＣ５０を導き出すことができ
る： ＡＤ５０７５＝８ｎＭ ＢＲＬ４９６５３＝５３ｎＭ トログリタゾン＝６４６ｎＭ ピオグリタゾン＝８９０ｎＭ
る選ばれた抗糖尿病インスリン増感剤のインビトロ結合および転写活性化アッセ
イからの既に報告されている結果（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら， １９９６， Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２２４：４３１−４３７）との
間の相関性を、それらの公知ＰＰＡＲγアゴニストを前記アッセイにおいて滴定
し、そのようにして得られたＥＣ５０を、該公知アゴニストの結合または転写活
性化アッセイにおける効力に関する既に記載されている値と比較することにより
分析した。結果を図５に示す。図５から、以下のＥＣ５０を導き出すことができ
る： ＡＤ５０７５＝８ｎＭ ＢＲＬ４９６５３＝５３ｎＭ トログリタゾン＝６４６ｎＭ ピオグリタゾン＝８９０ｎＭ
【００９３】 前記アッセイで得られたこれらのＥＣ５０は、インビトロ結合および転写活性
化研究（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２２４：４３１−４３７）で得られた値と厳密に一致する
。
化研究（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２２４：４３１−４３７）で得られた値と厳密に一致する
。
【００９４】 また、核内受容体とコアクチベーターとの相互作用を、例えばその相互作用の
結合定数を測定することにより特徴づけるために、前記アッセイを用いることが
できる。図６は、そのような応用の一例を示す。飽和量のＰＰＡＲγアゴニスト
（１０μＭ ＢＲＬ４９６５３）を使用した。非ビオチン化ｈＣＢＰ１−４５３
をその濃度を増加させながら使用して、ビオチン−ｈＣＢＰ−ＰＰＡＲγ１ＬＢ
Ｄ複合体を滴定し、蛍光エネルギー移動を減少させた。図６に例示する結果から
、ｈＣＢＰ１−４５３とＰＰＡＲγ１ＬＢＤとの相互作用に関する３００ｎＭの
Ｋｄを導き出すことができ、このＫｄ（３００ｎＭ）は、ＣＢＰとＰＰＡＲγと
のアフィニティーの尺度となる。
結合定数を測定することにより特徴づけるために、前記アッセイを用いることが
できる。図６は、そのような応用の一例を示す。飽和量のＰＰＡＲγアゴニスト
（１０μＭ ＢＲＬ４９６５３）を使用した。非ビオチン化ｈＣＢＰ１−４５３
をその濃度を増加させながら使用して、ビオチン−ｈＣＢＰ−ＰＰＡＲγ１ＬＢ
Ｄ複合体を滴定し、蛍光エネルギー移動を減少させた。図６に例示する結果から
、ｈＣＢＰ１−４５３とＰＰＡＲγ１ＬＢＤとの相互作用に関する３００ｎＭの
Ｋｄを導き出すことができ、このＫｄ（３００ｎＭ）は、ＣＢＰとＰＰＡＲγと
のアフィニティーの尺度となる。
【００９５】 本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものでは
ない。実際に、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、以上の記
載から当業者に明らかであろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲の範囲内
に含まれると意図される。
ない。実際に、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、以上の記
載から当業者に明らかであろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲の範囲内
に含まれると意図される。
【００９６】 本明細書には種々の刊行物が引用されているが、それらの開示の全体を参照に
より本明細書に組入れるものとする。
より本明細書に組入れるものとする。
【配列表】
【図１】 タンパク質またはポリペプチドをユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）で
蛍光標識する方法を例示する。
蛍光標識する方法を例示する。
【図２】 表１の実験１および２の方法を例示する。
【図３】 表１の実験３の方法を例示する。
【図４】 表１の実験４の方法を例示する。
【図５】 ４つの公知ＰＰＡＲγアゴニストと共に本発明の方法を用いた研究の結果を示
す。−−〇−−＝ＡＤ５０７５、−−□−−＝ピオグリタゾン、−−×−−＝ト
ログリタゾン、−−◇−−＝ＢＲＬ４９６５３。
す。−−〇−−＝ＡＤ５０７５、−−□−−＝ピオグリタゾン、−−×−−＝ト
ログリタゾン、−−◇−−＝ＢＲＬ４９６５３。
【図６】 ｈＣＢＰとＰＰＡＲγ１ＬＢＤとの相互作用の結合定数の測定を示す。
【図７Ａ】 ヒトＣＢＰのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図７Ｂ】 ヒトＣＢＰをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
オープンリーディングフレームは７６〜１２９０位に存在する。
オープンリーディングフレームは７６〜１２９０位に存在する。
【図８Ａ】 ヒトＰＰＡＲαのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図８Ｂ】 ヒトＰＰＡＲαをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）を示
す。オープンリーディングフレームは２１７〜１６２３位に存在する。
す。オープンリーディングフレームは２１７〜１６２３位に存在する。
【図９Ａ】 ヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図９Ｂ】 ヒトＰＰＡＲγ１をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を
示す。オープンリーディングフレームは１７３〜１６０９位に存在する。
示す。オープンリーディングフレームは１７３〜１６０９位に存在する。
【図１０Ａ】 ヒトＰＰＡＲδのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図１０Ｂ】 ヒトＰＰＡＲδをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）を示
す。オープンリーディングフレームは３３８〜１６６３位に存在する。
す。オープンリーディングフレームは３３８〜１６６３位に存在する。
【図１０Ｃ】 ヒトＰＰＡＲδをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハーミーズ，ジエフリイ・デイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 モラー，デイビツド・イー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 チヨウ，カオチヤオ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126
Claims (27)
- 【請求項１】 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガ
ンド結合ドメイン、 （ｂ）第２蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体
コアクチベーターまたはその結合部分、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインとＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体コアクチベータ
ーまたはその結合部分との結合が生じる条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、ステロイ
ド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、ペルオキシソーム増殖
因子活性化受容体、レチノイドＸ受容体、グルココルチコイド受容体、ビタミン
Ｄ受容体、ＬＸＲおよびＦＸＲよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法
。 - 【請求項３】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、完全長核
内受容体、核内受容体のリガンド結合ドメイン、および核内受容体のＡＦ−２部
位よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが核内受容体
のＡＦ−２部位を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、完全長Ｐ
ＰＡＲ、ＰＰＡＲのリガンド結合ドメイン、ヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸残基１
７６〜４７８よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、ＰＰＡＲ
α、ＰＰＡＲγ１、ＰＰＡＲγ２およびＰＰＡＲδよりなる群から選ばれる、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、ヒトＲＡ
Ｒαのアミノ酸１４３〜４６２、ラットＴ３Ｒα１のアミノ酸１２２〜４１０、
マウスＲＸＲγのアミノ酸２２７〜４６３およびヒトＥＲのアミノ酸２５１〜５
９５よりなる群から選ばれるリガンド結合ドメインを含む、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項８】 ＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体コアクチベーター
またはその結合部分が、完全長ヒトＣＢＰ、完全長マウスＣＢＰ、ヒトＣＢＰの
アミノ酸残基１〜１１３、およびヒトＣＢＰのアミノ酸残基１〜４５３よりなる
群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 該第１蛍光試薬が、ＸＬ６６５およびユウロピウムクリプテ
ート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 該第２蛍光試薬が、ＸＬ６６５およびユウロピウムクリプ
テート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメイン、 （ｂ）核内受容体コアクチベーターの結合部分（該結合部分はアミノ酸配列
ＬＸＸＬＬを含有し、該結合部分は第２蛍光試薬で標識されている）、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインと該核内受容体コアクチベーターの結合部分との結合が生じ
る条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 該核内受容体コアクチベーターの結合部分が、ヒトＲＩＰ
−１４０、ヒトＳＲＣ−１、マウスＴＩＦ−２、ヒトまたはマウスＣＢＰ、ヒト
またはマウスｐ３００、マウスＴＩＦ−１およびヒトＴＲＩＰタンパク質よりな
る群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメイン、 （ｂ）アミノ酸配列ＬＸＸＬＬを含有し第２蛍光試薬で標識されているポリ
ペプチド、および （ｃ）該核内受容体のアゴニストであると疑われる物質 を、該物質が該核内受容体のアゴニストである場合に該核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメインと該ポリペプチドとの結合が生じる条件下で供給し、 （ｄ）該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）を測定することを含んでなる、核内受容体のアゴニストの同定方法で
あって、該物質が該核内受容体のアゴニストであることがＦＲＥＴの発生により
示されることを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 （ａ）第１蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリ
ガンド結合ドメイン、 （ｂ）第２蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体
コアクチベーターまたはその結合部分、 （ｃ）該核内受容体のアゴニスト、および （ｄ）該核内受容体のアンタゴニストであると疑われる物質 を、該物質の不存在下で該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインとＣＢＰ
、ｐ３００もしくは他の核内受容体コアクチベーターまたはその結合部分との結
合が生じる条件下で供給し、 （ｄ）該物質が存在する場合の該第１蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間の蛍
光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定し、該物質が存在しない場合の該第１
蛍光試薬と該第２蛍光試薬との間のＦＲＥＴを測定することを含んでなる、核内
受容体のアンタゴニストの同定方法であって、該物質が該核内受容体のアンタゴ
ニストであることが、該物質が存在する場合のＦＲＥＴの減少により示されるこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項１５】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、ステロ
イド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、ペルオキシソーム増
殖因子活性化受容体、レチノイドＸ受容体、グルココルチコイド受容体、ビタミ
ンＤ受容体、ＬＸＲおよびＦＸＲよりなる群から選ばれる、請求項１４に記載の
方法。 - 【請求項１６】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、完全長
核内受容体、核内受容体のリガンド結合ドメイン、および核内受容体のＡＦ−２
部位よりなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが核内受容
体のＡＦ−２部位を含む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１８】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、完全長
ＰＰＡＲ、ＰＰＡＲのリガンド結合ドメイン、ヒトＰＰＡＲγ１のアミノ酸残基
１７６〜４７８よりなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１９】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、ＰＰＡ
Ｒα、ＰＰＡＲγ１、ＰＰＡＲγ２およびＰＰＡＲδよりなる群から選ばれる、
請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２０】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、ヒトＲ
ＡＲαのアミノ酸１４３〜４６２、ラットＴ３Ｒα１のアミノ酸１２２〜４１０
、マウスＲＸＲγのアミノ酸２２７〜４６３およびヒトＥＲのアミノ酸２５１〜
５９５よりなる群から選ばれるリガンド結合ドメインを含む、請求項１４に記載
の方法。 - 【請求項２１】 ＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内受容体コアクチベータ
ーまたはその結合部分が、完全長ＣＢＰ、ヒトＣＢＰのアミノ酸残基１〜１１３
、およびヒトＣＢＰのアミノ酸残基１〜４５３よりなる群から選ばれる、請求項
１４に記載の方法。 - 【請求項２２】 該第１蛍光試薬が、ＸＬ６６５およびユウロピウムクリプ
テート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２３】 該第２蛍光試薬が、ＸＬ６６５およびユウロピウムクリプ
テート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２４】 蛍光試薬で標識された核内受容体またはそのリガンド結合
ドメイン。 - 【請求項２５】 該核内受容体またはそのリガンド結合ドメインが、ＰＰＡ
Ｒα、ＰＰＡＲγ１、ＰＰＡＲγ２、ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ
１、ＰＰＡＲγ２またはＰＰＡＲδのリガンド結合ドメインならびにヒトＰＰＡ
Ｒγ１のアミノ酸残基１７６〜４７８よりなる群から選ばれ、該蛍光試薬が、Ｘ
Ｌ６６５およびユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋Ｋ）よりなる群から選ばれ
る、請求項２４に記載の核内受容体またはそのリガンド結合ドメイン。 - 【請求項２６】 蛍光試薬で標識されたＣＢＰ、ｐ３００もしくは他の核内
受容体コアクチベーターまたはその結合部分。 - 【請求項２７】 該蛍光試薬が、ＸＬ６６５およびユウロピウムクリプテー
ト（Ｅｕ３＋Ｋ）よりなる群から選ばれる、請求項２６に記載のＣＢＰ、ｐ３０
０もしくは他の核内受容体コアクチベーターまたはその結合部分。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6138597P | 1997-10-07 | 1997-10-07 | |
| US60/061,385 | 1997-10-07 | ||
| PCT/US1998/021049 WO1999018124A1 (en) | 1997-10-07 | 1998-10-06 | Assays for nuclear receptor ligands using fret |
Publications (2)
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