WO2009141926A1 - 糖代謝・脂質代謝に作用する化合物の取得方法 - Google Patents

糖代謝・脂質代謝に作用する化合物の取得方法 Download PDF

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WO2009141926A1
WO2009141926A1 PCT/JP2008/071350 JP2008071350W WO2009141926A1 WO 2009141926 A1 WO2009141926 A1 WO 2009141926A1 JP 2008071350 W JP2008071350 W JP 2008071350W WO 2009141926 A1 WO2009141926 A1 WO 2009141926A1
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fxr
arid5b
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substance
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茂明 加藤
敦史 馬場
史明 大竹
一良 山岡
慎治 小林
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国立大学法人東京大学
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a compound effective against diabetes, hyperlipidemia, tissue fibrosis and the like. Specifically, the present invention relates to the use of FXR, PHF2, and ARID5B in vitro for screening the compounds.
  • Glucagon is a hormone that plays an important role in gluconeogenesis in order to maintain blood sugar levels during fasting. In diabetic patients, it has been suggested that blood glucagon levels increase and gluconeogenesis increases due to abnormal ⁇ -cell function (Spellman, CW (2007) J. Am. Osteopath. Assoc. 107, S1-S5), A glucagon receptor antagonist is a target that has long been expected as a novel therapeutic agent for diabetes.
  • FXR is one of the nuclear receptor type transcription factors with bile acid as an endogenous ligand
  • FXR is mainly expressed in the liver, intestine, kidney and adrenal gland, and has been shown to play an important role in regulating the expression of gluconeogenic genes and lipid metabolism genes (Bramlett, K. S. , S. Yao, et al. (2000). Mol Genet Metab 71 (4): 609-15; Goodwin, B., S. A. Jones, et al. (2000). Mol Cell 6 (3): Lu, T. T., M. Makishima, et al. (2000). Mol Cell 6 (3): 507-15.; Moschetta, A., Bookout AL, et al. (2004). Nature Medicine 10 (12): 1352-8.).
  • FXR farnesoid X receptor
  • lipoprotein metabolism and sugar metabolism Sinal, C. J., M. Tohkin, et al. (2000). Cell 102 (6): 1-731-44.
  • Savkur, R. S., K. S. Bramlett, et al. 2005 . Biochem Biophys Res Commun 329 (1): 391-6 .
  • glucagon receptor antagonists As described above, various studies have been conducted to develop a glucagon receptor antagonist as a therapeutic agent for diabetes. However, most of the glucagon receptor antagonists obtained so far are peptidic and have problems with oral absorption. Therefore, it is not used for diabetes treatment. In recent years, low molecular weight compounds that are non-peptidic and orally absorbable have been obtained, but compounds that function as effective glucagon receptor antagonists in diabetic patients have not been obtained so far. Targeted drug screening is not fully functioning.
  • FXR farnesoid X receptor
  • a reporter assay that is generally widely used is known.
  • Specific examples include FXR cDNA expression plasmids cloned from human liver, plasmids incorporating the promoter region of BSEP (bile salt export pump) gene downstream of FXR upstream of the firefly luciferase gene, and for correction
  • the Renilla luciferase expression plasmid is transfected into HepG2 cells, and the FXR agonistic activity of the test compound is measured (Patent Document 1: JP 2006-306800 A).
  • a compound obtained by a reporter assay system in which such FXR gene is forcibly expressed in cells such as HepG2 acts on FXR constantly in tissues expressing FXR. That is, FXR is originally a nuclear receptor that regulates the expression of various genes including lipid metabolism and gluconeogenesis. Therefore, the compound obtained by the reporter assay system may affect not only gene expression that improves the target disease state, but also gene expression related to side effects. Therefore, the main action and the side effect cannot be separated, which is not sufficient as a screening method for pharmaceutical products.
  • FXR agonists and antagonists other than bile acid derivatives that are endogenous ligands have not yet been put on the market.
  • histone acetylase SRC-1 (Makishima et al., 1999; Parks et al., 1999; Wang et al., 1999) , TRAP220 (Thyloid Hormone Receptor-associated Protein 220, Pineda Torra et al., 2004), histone arginine methylase PRMT1 (Rizzo et al., 2005), PRMT4 / CARM1 (Co-activator-associated Arginine al., 2004), PGC-1aoxi (Peroxisome Proliferator-activated Receptor-g Coactivator 1a, Zhang et al., 2004) etc. are known. Although these FXR transcriptional coupling factors have been reported to function as a single molecule, the function as an FXR transcriptional coupling factor complex for use as a screening method for pharmaceuticals and the expression regulation mechanism of target genes
  • steroid receptors such as PPAR ⁇ (Burns, KA., Et al. (2007) Biochim. Biophys. Acta. 1771, 952-960), ER and AR (Weigel, NL, et al. (2007) Nucl. Recept. Signal. 5, e0005) and transcription factors such as steroid receptor coactivators (Wu, RC., Et al. (2005) Endocr. Rev. 26, 393-399) are phosphorylated by the intracellular signal transduction system. It has been shown that transcriptional activity is regulated. However, regarding FXR, the expression control mechanism of the target gene through the intracellular signal transduction pathway has not been clarified. JP 2006-306800 JP
  • an object of the present invention is to solve the problems of the prior art and provide a novel screening method for pharmaceuticals with few such problems.
  • the present inventors focused on the PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex formation mechanism and the gene expression regulation mechanism by the PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex.
  • the present inventors have succeeded in developing a screening method for drugs with higher specificity based on a novel principle, and have completed the present invention. That is, the present invention is as follows. (1) Contact at least two proteins selected from the group consisting of PHF2, ARID5B and FXR in the presence of a test substance, detect the formation of a complex of these proteins, and detect the mutual relationship between the proteins from the obtained detection results.
  • a method for screening for a modulator comprising a step of selecting a substance that modulates the action.
  • At least two proteins selected from the group consisting of PHF2, ARID5B, and FXR are contacted in the presence of a test substance, the formation of a complex of these proteins is detected, and the gene via FXR is detected from the obtained detection results.
  • a method for screening a regulatory substance comprising a step of selecting a substance that regulates expression or glucagon signaling system.
  • the regulation comprising the steps of contacting PHF2 and protein kinase in the presence of a test substance, detecting phosphorylation of PHF2, and selecting a substance that regulates phosphorylation of PHF2 from the obtained detection result. Substance screening method.
  • a screening method for the modulator comprising: (5) The complex of PHF2 and ARID5B is brought into contact with the test substance, the methylation or demethylation of the ARID5B is detected, and the methylation or demethylation of the ARID5B is regulated from the obtained detection result.
  • a method for screening the modulator comprising the step of selecting a substance.
  • a complex of PHF2 and ARID5B is brought into contact with a test substance, methylation or demethylation of the ARID5B is detected, and gene expression via FXR or glucagon signaling system is regulated from the obtained detection results
  • a method for screening the modulator comprising a step of selecting a substance to be performed.
  • a complex of PHF2, ARID5B and FXR is brought into contact with a test substance, and the methylation or demethylation of histone acting on the complex is detected, and the methylation of the histone is obtained from the obtained detection result.
  • the screening method of the said modulating substance including the process of selecting the substance which modulates demethylation.
  • a complex of PHF2, ARID5B and FXR is brought into contact with a test substance, methylation or demethylation of histones acting on the complex is detected, and gene expression via FXR is obtained from the obtained detection results.
  • the screening method of the said regulatory substance including the process of selecting the substance which modulates a glucagon signaling system.
  • a complex of PHF2, ARID5B and FXR is brought into contact with a test substance, the transcriptional activity of the gene acting on the complex is detected, and a substance that regulates the transcriptional activity is selected from the obtained detection results
  • a method for screening the modulator comprising the step of: (10) A complex of PHF2, ARID5B and FXR is brought into contact with a test substance, the transcriptional activity of a gene acting on the complex is detected, and gene expression or glucagon signaling via FXR is obtained from the obtained detection result.
  • a method for screening a regulatory substance comprising a step of selecting a substance that regulates a system.
  • a demethylating agent comprising PHF2 or a complex of PHF2 and ARID5B.
  • At least one protein selected from the group consisting of PHF2, ARID5B and FXR is purified.
  • examples of the modulator include those having an affinity for at least one protein selected from the group consisting of PHF2, ARID5B and FXR, and inhibitors.
  • the contact may be performed, for example, under glucagon stimulation, and a cell that expresses and / or produces at least one protein selected from the group consisting of PHF2, ARID5B, and FXR, or cell preparation of the cell It can also be performed using objects.
  • examples of cells include liver-derived cells (hepatocytes, hepatic stellate cells, etc.), vascular endothelial cells, skeletal muscle cells, epithelial cells (gastrointestinal epithelial cells, etc.), fat cells, pancreatic ⁇ cells, pancreatic ⁇ cells, and the like. Examples thereof include at least one selected from the group consisting of bronchial epithelial cells.
  • the cell may be one into which at least one selected from the group consisting of a gene encoding PHF2, a gene encoding ARID5B, and a gene encoding FXR may be introduced.
  • the transcriptional activity is via FXR, and can be caused by overexpression of at least one protein selected from the group consisting of PHF2, ARID5B and FXR.
  • the detection of transcription activity can be performed in a cell that expresses and / or produces at least one protein selected from the group consisting of PHF2, ARID5B, and FXR, or a preparation of the cell.
  • transcription activity can be detected by a reporter gene assay system. Can be detected.
  • the cells used in this case are the group consisting of hepatocytes, hepatic stellate cells, vascular endothelial cells, skeletal muscle cells, gastrointestinal epithelial cells, fat cells, pancreatic ⁇ cells, pancreatic ⁇ cells, and bronchial epithelial cells as described above. At least one selected from the group consisting of a gene encoding PHF2, a gene encoding ARID5B, and a gene encoding FXR may be introduced.
  • PHF2 (a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial sequence thereof (b) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial sequence thereof, and having PHF activity.
  • ARID5B (c) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a partial sequence thereof
  • D a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a partial sequence thereof, and having ARID5B activity.
  • FXR (e) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or a partial sequence thereof (f) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or a partial sequence thereof, and having FXR activity.
  • the gene encoding PHF2, the gene encoding ARID5B, and the gene encoding FXR are the proteins (a) to (b), (c) to (d), and (e) to (f), respectively. Examples include the gene to be encoded. Examples of the gene encoding PHF2 include genes containing the following polynucleotides.
  • a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the base sequence of the coding region for amino acids, or a partial sequence thereof
  • a protein that hybridizes under stringent conditions to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the base sequence of the coding region for amino acids, or a sequence complementary thereto, and has PHF2 activity
  • Examples of the gene encoding ARID5B include the following genes containing the following polynucleotides.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, the nucleotide sequence of the coding region for amino acids, or a partial sequence thereof
  • a protein that hybridizes under stringent conditions to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, the base sequence of the coding region for amino acids, or a sequence complementary thereto, and has ARID5B activity
  • a gene encoding FXR include genes containing the following polynucleotides.
  • the present invention provides a method for screening a compound effective against diabetes, hyperlipidemia, tissue fibrosis and the like.
  • the present inventor has paid attention to the gene expression regulation mechanism by the PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex formed by glucagon stimulation, and has both the characteristics of an unprecedented glucagon receptor antagonist and the characteristics of an FXR agonist or antagonist, This has led to the development of a screening method for drugs with high specificity targeting the glucagon downstream signal.
  • agonists and antagonistic drugs that are simply screened using FXR as a target using the above-mentioned reporter assay are singular ligands for FXR, and thus act permanently on FXR, resulting in increased expression or suppressed expression. More types of genes. Increasing the types of genes that are up-regulated or suppressed in expression leads to increased side effects, making it difficult to regulate gene expression suitable for the treatment of the target disease state, and developing drugs that exhibit desirable profiles It was difficult.
  • the PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex according to the present invention is glucagon signal-dependent, if attention is paid to the complex, the utility of conventional agonists / antagonists of nuclear receptors, In addition to the usefulness of glucagon receptor antagonists, drugs that effectively inhibit or promote only FXR transcriptional activity using PHF2 / ARID5B as a transcription coupling factor (diabetes, hyperlipidemia, Screening for fibrosis and the like).
  • FXR promotes binding to the FXR target gene promoter by forming a transcriptional coupling factor complex with PHF2 and ARID5B in a fasting signal-dependent manner, including glucagon.
  • the PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex forms a complex in an FXR ligand-independent manner and promotes FXR transcriptional activity in a ligand-independent manner
  • PHF2 is phosphorylated via a downstream PKA signal such as glucagon signal, and this phosphorylation binds to the FXR target gene promoter of the PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex and activates FXR transcription Essential to
  • PHF2 is a histone demethylase, and when PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex is formed, PHF2 in the complex demethylates H9K9-Me2 to That expression is regulated, (5) Furthermore, PHF2 also demethylates ARID5B, a component of the FXR complex, and this demethylation of ARID5B is due to the binding of the PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex to the FXR target gene promote
  • FIG. 1 schematically shows a signal transduction pathway after glucagon binds to a receptor.
  • GPR G protein-coupled receptor
  • PKA protein kinase A
  • FIG. 1 (a) Activated PKA phosphorylates a protein called “PHF2” existing downstream
  • Phosphorylated PHF2 interacts and binds to a protein called “ARID5B” (FIG. 1 (b)), and ARID5B is demethylated by this phosphorylation (FIG. 1 (c)).
  • the PHF2 / ARID5B complex binds to a nuclear receptor transcription factor called “FXR” to form a PHF2 / ARID5B / FXR complex (FIG. 1 (d)).
  • FXR nuclear receptor transcription factor
  • FXRE FXR response element
  • FXRE histone
  • bile acid synthesis gene and gluconeogenic gene expression are activated by histone demethylation (FIG. 1 (f)).
  • the present invention can be used to screen for substances effective as drugs for diabetes, hyperlipidemia, tissue fibrosis, etc., using as an index the control of the glucagon signaling system from glucagon stimulation to gene expression.
  • the glucagon signaling system includes phosphorylation of PHF2 (Fig. 1 (a)), interaction between PHF2 and ARID5B (Fig. 1 (b)), methylation or demethylation of ARID5B (Fig. 1 (c)), Interaction between PHF2, ARID5B and FXR (FIG. 1 (d)), and methylation or demethylation of histone (histone H3K9) (FIG. 1 (e)) are performed. Therefore, a substance that regulates the interaction, phosphorylation, methylation or demethylation of any of these signal transduction systems is considered to be able to regulate gene expression, and is a target for screening of the present invention.
  • PEF2 in the present invention means Plant Homeodomain Finger protein 2.
  • ARID5B means AT rich interactive domain cantaining protein 5B.
  • FXR means farnesoid X receptor.
  • H9K9-Me2 means dimethylation modification of the 9th lysine residue (H3K9) of histone H3.
  • Interaction means that at least two of the components (PHF2, ARID5B and FXR) that form a complex in the glucagon signaling system come into contact and bind.
  • Modulation means promoting, suppressing or inhibiting the above-mentioned interaction, phosphorylation of PHF2, methylation or demethylation of ARID5B, or methylation or demethylation of histone (histone H3K9).
  • PHF2 phosphorylation of PHF2
  • ARID5B methylation or demethylation of ARID5B
  • histone H3K9 histone
  • the substance having the inhibition or inhibition action is diabetes, hyperlipidemia, tissue fibrosis, arteriosclerosis It can be used as a medicine for When regulation works in the direction of promotion (enhancement), the expression of bile acid synthesis gene and gluconeogenesis gene is promoted.
  • the substance having the promotion action is used in combination with intrahepatic cholestasis and bile acid adsorbent.
  • the screening method of the present invention includes a step of detecting the formation of a PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex in the presence of a test compound.
  • a test compound '' means that the test compound is in a condition where it can contact PHF2, ARID5B or FXR, or a complex thereof, and PHF2, ARID5B or FXR, or a complex thereof is Meaning either adding a test compound to the reaction system, or culturing with PHF2, ARID5B or FXR, or cells containing these complexes (including cells in which these genes have been incorporated so that they can be expressed) To do.
  • test compounds to be screened are not particularly limited, but compounds having affinity for PHF2, ARID5B or FXR are preferred. “Having affinity” means that a test compound binds to PHF2, ARID5B, or FXR with a specific dissociation constant.
  • test compound examples include a compound derived from a natural or synthetic low molecular compound library, an expression product (peptide, protein, etc.) of a gene library, a natural or synthetic oligonucleic acid, a natural or synthetic peptide library Derived from peptides, antibodies, bacteria-derived substances (substances released by metabolism from bacteria, etc.), microorganisms, plant cell extracts, animal cell extracts, culture solutions (culture supernatants of microorganisms, plant cells, animal cells, etc.) Examples include compounds, compounds in soil, compounds included in random phage peptide display libraries, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the test compound can be used after appropriate modification or mutation by chemical, physical or biochemical means. Further, the test compound may be a compound identified by a pharmacophore search or a structure comparison program using a computer. Furthermore, the candidate compound may form a salt or a hydrate.
  • the screening method of the present invention can be performed using cells that produce PHF2, ARID5B or FXR, or cell preparations of these cells, and at least one selected from PHF2, ARID5B and FXR has been purified. It is also possible to use the form.
  • Examples of the “cell preparation” include cell cultures, cultured cell disruptions, cytoplasm fractionated from cultured cells, organelles such as nuclei, and the like.
  • PHF2, ARID5B or FXR producing cells include liver-derived cells (eg, hepatocytes, hepatic stellate cells), vascular endothelial cells, skeletal muscle cells, epithelial cells (eg, gastrointestinal epithelial cells), adipocytes, pancreatic ⁇ Cells, pancreatic ⁇ cells, bronchial epithelial cells, and the like, and these cells may be expressed by introducing at least one of the PHF2 gene, the ARID5B gene, and the FXR gene.
  • Gene transfer methods are well known in the art and can be easily performed (Sambrook et al., Molecular® Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • the screening method of the present invention is a modification involving the formation mechanism of PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex induced by glucagon in the presence of a test compound, that is, phosphorylation of PHF2, methylation or demethylation of ARID5B. Or detecting the methylation or demethylation of histone (histone H3K9).
  • test compound that is, phosphorylation of PHF2, methylation or demethylation of ARID5B.
  • histone H3K9 histone
  • Examples of compounds to be screened include compounds that regulate the formation of PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex by glucagon stimulation, compounds that regulate phosphorylation of PHF2 by glucagon stimulation, or methyl of ARID5B by glucagon stimulation And the like.
  • the screening method of the present invention can be performed under treatment with glucagon (under glucagon stimulation) using cells that produce PHF2 and / or ARID5B, or cell preparations of these cells, and also in a purified form of PHF2.
  • ARID5B and cell lysates can be used to measure the modification level of PHF2 or ARID5B.
  • Examples of cells that produce PHF2 and / or ARID5B and cell lysates used for measurement include liver-derived cells, vascular endothelial cells, epithelial cells, adipocytes, skeletal muscle cells, etc.
  • PHF2 gene or ARID5B gene is introduced. And may be expressed.
  • the screening method of the present invention includes a step of detecting transcriptional activity by the PHF2 / ARID5B / FXR transcriptional conjugate complex in the presence of a test compound.
  • Examples of compounds to be screened include compounds that control the methylation or demethylation of H9K9-Me2 by PHF2 / ARID5B.
  • the above-mentioned PHF2 phosphorylation controlling substance and ARID5B methylation or demethylation controlling substance are also included.
  • the step of detecting FXR transcriptional activity can be measured using a reporter gene assay system using the promoter region of the FXR target gene and the expression level of the FXR target gene as an index.
  • Screening methods can be performed using cells that produce PHF2 and ARID5B.
  • Cells that produce PHF2 and ARID5B include liver-derived cells (hepatocytes, hepatic stellate cells, etc.), vascular endothelial cells, and skeletal muscle cells. And epithelial cells (gastrointestinal epithelial cells, etc.), adipocytes, pancreatic ⁇ cells, pancreatic ⁇ cells, bronchial epithelial cells, and the like.
  • the PHF2 gene or ARID5B gene may be introduced and expressed.
  • FXR target genes include SHP (small heterodimer partner) genes.
  • the step of detecting the transcriptional activity by the PHF2 / ARID5B / FXR transcriptional conjugate complex is to measure the transcriptional activity via FXR by overexpressing at least one of PHF2, ARID5B and FXR (preferably PHF2 and ARID5B). And detecting that the transcriptional activity is suppressed or enhanced.
  • transcription via FXR means transcription of a sequence recognized by FXR.
  • FXR transcription activity of the sequence recognized by FXR is promoted or suppressed. Therefore, promotion or suppression of transcriptional activity that is specifically generated by the formation of a complex by combining PHF2, ARID5B, and FXR is included in “transcription through FXR”.
  • By evaluating transcription of a DNA region containing such an FXR recognition sequence it is possible to evaluate whether transcription activity via FXR is enhanced or suppressed.
  • FXR-mediated transcriptional activity leaves the region necessary for receptor functions other than DNA-binding activity in FXR artificially, and other FXR DNA-binding regions, etc.
  • a transcriptional regulatory gene By substituting with a transcriptional regulatory gene to be used, it can be measured by a reporter gene assay system. Such a reporter gene assay system is preferable in that it can reduce the reaction that causes noise caused by FXR or each test compound.
  • other methods for measuring transcriptional activity via FXR include two-hybrid assay in mammalian cells (The Journal of Biological Chemistry, 274, 2376-32381, 1999) Two-hybrid assay in yeast cells. (Molecular Endocrinology, 11, 366-78, 1997) can be employed. Those skilled in the art can appropriately select these methods and construct a screening system using transcription activity as an index.
  • the screening method of the present invention can measure the regulation (inhibition or promotion) of transcriptional activity by a complex of PHF2, ARID5B, and FXR using a reporter gene assay system.
  • a reporter gene is a marker gene that is incorporated into DNA to examine the transcriptional activity of promoters and enhancers, and is not particularly limited as long as it can measure the expression level thereof. Those that can be quantified are preferred. Examples of such reporter genes include luciferase gene, CAT (chloramphenicol acetyltransferase) gene, ⁇ -Gal ( ⁇ -galactosidase) gene, hGH (secreted human growth hormone) gene, SEAP (human secreted alkaline phosphatase). Gene, GFP (green fluorescent protein) gene, and GUS ( ⁇ -glucuronidase) gene.
  • an assay using a reporter gene can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • a substrate and oxygen are given to a cell extract to cause a luminescence reaction, and the expression level of luciferase is evaluated by measuring the degree of luminescence.
  • the regulation of transcriptional activity via FXR can be evaluated.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for a disease associated with enhancement or suppression of FXR-mediated transcriptional activity by a complex of SHP2, ARID5B and FXR.
  • Diseases involved in FXR-mediated transcriptional activity by a complex composed of SHP2, ARID5B and FXR include, for example, type 2 diabetes, renal fibrosis, pulmonary fibrosis, cirrhosis, NASH, hyperlipidemia and the like It is done.
  • the FXR recognition sequence means a DNA sequence to which FXR binds, and more preferably a sequence to which FXR binds in a complex of PHF2, ARID5B and FXR.
  • FXR recognition sequence present in the promoter / enhancer region of human PPAR ⁇ : GATCCCGGTGTCCCATCGGTGACCTTGGACA (SEQ ID NO: 7) (Torra, IP., Et al. (2003) Mol. Endocrinol.
  • human SHP promoter Examples include FXR recognition sequences present in the region: CCTGGTACAGCCTGAGTTAATGACCTTGTTTATCC (SEQ ID NO: 11) (Goodwin, B., et al. (2000) Mol. Cell 6, 517-526).
  • the FXR recognition sequence is not limited to the above examples as long as the complex of FXR, PHF2, and ARID5B binds, and those skilled in the art can appropriately combine a partial sequence or a part of them. It is also possible to select mutated bases and other sequences.
  • a reagent for detecting the reporter gene product necessary reagents are selected from a substrate for detecting the reporter product, a cell fixing solution, a cell lysate, and a buffer for diluting the sample.
  • the reporter gene luciferase gene CAT (chloramphenicol acetyltransferase) gene, ⁇ -Gal ( ⁇ -galactosidase) gene, SEAP (human secreted alkaline phosphatase) gene, and GUS ( ⁇ -glucuronidase) gene
  • a substrate that reacts with each enzyme can be used as a substrate for detecting the reporter product. Substrates for each enzyme are provided by the reagent manufacturer.
  • the degree of reporter gene expression induction is measured by the reaction of the substrate, and can be measured by parameters such as radioactivity, color development, fluorescence, and luminescence depending on the type of substrate.
  • the reporter gene expression product is a protein, it can also be measured by immunological measurements such as EIA and ELISA, and reagents for this purpose can be appropriately selected and included by those skilled in the art. Is possible.
  • the expression of the reporter gene can also be measured with mRNA as a transcription product, and reagents such as primers, probes, and competitive probes can be appropriately selected and included by those skilled in the art.
  • the present invention provides a kit for use in the screening method of the present invention, comprising at least one protein selected from the group consisting of PHF2, ARID5B and FXR and / or a gene encoding the protein.
  • the kit of the present invention can appropriately include, as additional elements, gene product detection reagents, positive controls, negative controls, reaction vessels, filters for optical analysis, instructions describing assay protocols, and the like. These elements can be mixed in advance if necessary. Moreover, a preservative and preservative can be added to each element as needed.
  • kits for performing the screening methods such as the One-hybrid system in mammalian cells, the two-hybrid system, and the two-hybrid system in yeast can be considered.
  • a suitable shaped kit can be constructed.
  • the amino acid sequences and base sequences of PHF2, ARID5B and FXR are shown below.
  • the full-length sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3 can be used, or a coding region (translation region) for amino acids can also be used.
  • the translation region in SEQ ID NO: 1 is from 148 to 3438
  • the translation region in SEQ ID NO: 3 is from 27 to 3593
  • the translation region in SEQ ID NO: 5 is from 349 to 1767.
  • partial peptides of PHF2, ARID5B and FXR can also be used.
  • the partial peptide of PHF2 is, for example, the region from No. 1 to No. 364 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (encoded by the nucleotide sequence Nos. 148 to 1239 of SEQ ID No. 1), and the partial peptide of ARID5B is For example, the region from No. 319 to No. 678 of the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4 (encoded by No. 981 to No. 2060 of the base sequence shown in SEQ ID No. 3), FXR partial peptide is shown in, for example, SEQ ID No. 6 Of the amino acid sequence of No. 292 to No. 468 (encoded by the base sequence Nos. 1222 to 1752 of SEQ ID No. 5), but is not limited to these sequences, It is possible to select appropriately.
  • mutant forms of PHF2, ARID5B and FXR can be used.
  • “Mutant” means that each amino acid sequence of PHF2, ARID5B and FXR has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and each component or complex thereof Or a protein having at least 80% homology in the amino acid sequences of PHF2, ARID5B, and FXR and having activity as a constituent element or a complex thereof.
  • the variants of PHF2, ARID5B and FXR are about 80% or more, preferably 90% of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6, or the amino acid sequences of these partial peptides, respectively. More preferably, amino acid sequences having a homology of about 95% or more, more preferably about 98% or more, and having PHF2 activity, ARID5B activity and FXR activity, respectively, are mentioned.
  • Homology can be performed using a homology search site using the Internet.
  • homology searches such as FASTA, BLAST, and PSI-BLAST can be used in Japan DNA Data Bank (DDBJ).
  • DDBJ Japan DNA Data Bank
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 is deleted or inserted into one or a plurality of (for example, one or several) amino acids.
  • Examples of the amino acid sequence in which mutation such as substitution or addition, or a combination mutation thereof has occurred include amino acid sequences of proteins having PHF2 activity, ARID5B activity and FXR activity, respectively.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 or partial peptides thereof have been deleted.
  • Amino acid sequence (ii) Amino acid obtained by adding 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 or a partial peptide thereof Sequence, (iii) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or an amino acid having 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids inserted into these partial peptides 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the sequence, (iv) amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 or partial peptides thereof are other amino acids An amino acid sequence substituted with (v) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (i
  • PHF2 activity is the activities involved in the signal transduction pathway shown in FIG. 1 (signal transduction pathway after glucagon binds to the receptor), that is, glucagon signal, etc.
  • SEQ ID NO: 2, 4 or 6 It means that the protein has an activity of at least 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 90% or more, compared with the activity of the protein having the amino acid sequence shown in (1).
  • mutant DNA that can be used in the present invention, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or the coding region thereof, or a partial sequence thereof, or a sequence complementary to these sequences or partial sequences
  • a polynucleotide encoding a protein that hybridizes under stringent conditions and has PHF2 activity, ARID5B activity, and FXR activity respectively.
  • Such polynucleotides are known as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting, etc. using the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or a polynucleotide comprising these coding regions, or a fragment thereof as a probe.
  • the hybridization method can be used. For these methods, reference can be made to Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • stringent conditions include, for example, “2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.”, “2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, “1 ⁇ SSC, 0.1%
  • “2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”, “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, “0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, The conditions such as “65 ° C.” can be mentioned.
  • a person skilled in the art can appropriately set conditions such as DNA concentration, length of DNA, reaction time, etc. in addition to such conditions as salt concentration and temperature of the buffer.
  • the hybridizing polynucleotide is at least 50% or more, preferably 70%, more preferably the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a partial sequence thereof, or a base sequence complementary thereto.
  • examples thereof include a polynucleotide comprising a base sequence having 80%, more preferably 90% (for example, 95% or more, further 99% or more) identity.
  • Screening method (I) In the screening method (I) of the present invention, at least two proteins (factors or elements constituting a complex) selected from the group consisting of PHF2, ARID5B and FXR are contacted in the presence of a test substance,
  • the method includes a step of detecting formation of a complex and selecting a substance that regulates gene expression via FXR or glucagon signaling system from the obtained detection result.
  • a glucagon signal-dependent component FXR, PHF2, ARID5B
  • the system is capable of measuring the interaction (binding) between proteins, the target substance that regulates (promotes or suppresses) the interaction of PHF2, ARID5B and FXR.
  • Search is possible.
  • a measurement system a cell system or a cell-free system can be used, and ELISA, RIA, SPA method, BIACORE TM, fluorescence polarization method, Two-Hybrid® System, etc. can be adopted. It can also be carried out with PHF2, ARID5B and FXR partial peptides.
  • each partial peptide of PHF2, ARID5B and FXR can also be used as a fusion protein with tag or labeled protein / peptide such as FLAG-, HA-, His-, Fc portion of immunoglobulin-, GST-, GFP, etc. It is.
  • Eukaryotic organisms that retain in the nucleus an expression vector of a fusion protein of the above transcription activation domain and protein A, an expression vector of a fusion protein of the above DNA binding domain and protein B, and an appropriate reporter gene Prepare a host.
  • the reporter gene is constructed as an expression unit comprising a promoter region that is activated when both fusion proteins are combined and a reporter gene linked downstream of the promoter region.
  • transcription activation domain used in “Two-Hybrid System” examples include, for example, the transcription activation domain of GAL4 (Brent, R., Cell, 1985, 43: 729-736), [Bicoid], [c-Fos], [c-myc], [v-Myc], [B6], [B7], [B42] (Golemis, A. E., Mol. Cell Biol., 1992,12: 3006-3014), or [VP16] (CLONTECH, Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit).
  • DNA binding domains used in the ⁇ Two-Hybrid System '' include, for example, GAL4 (Giniger, E., Cell, 1985, 40: 767-774), p53 (Chumakov, P. M., Genetika, 1988, 24: 602-612), GCN4 (Hinnenbush, AG, Proc. Natl. Cad Acad. Sci., 1984, 81: 6442-6446), VP16 (Triezeneberg, S. J., Genes. Dev., 1988, 2: 718-729 ), ReloA (Nolan, G. P., Cell, 1991, 64: 961-969), Oct-1 (Strum, R. A., Genes.
  • the formation of a complex of PHF2 and ARID5B can be detected as an action in which the test compound enhances the binding of PHF2 and ARID5B quantitatively or kinetically.
  • Examples of systems for quantitatively analyzing the formation of FXR, PHF2 and ARID5B transcription coupling factor complexes include, for example, pull-down assay (Molecular And Cellular Biology, Oct. 2004, p. 8847-8861) and immunoprecipitation (The Journal of Biological Chemistry Vol. 276, Issue 31, 28835-28841, August 3, 2001).
  • pull-down assay Molecular And Cellular Biology, Oct. 2004, p. 8847-8861
  • immunoprecipitation The Journal of Biological Chemistry Vol. 276, Issue 31, 28835-28841, August 3, 2001.
  • a cell extract such as purified methylated ARID5B or purified FXR, or HepG2 with glucagon stimulation in the presence or absence of GST-phosphorylated PHF2 and a test compound, etc.
  • the GST protein used for this pull-down assay can be freely selected from PHF2, ARID5B and FXR.
  • the surface plasmon resonance method may be used as a kinetic analysis system for the bond between FXR, PHF2, and ARID5B (The Journal of Biological Chemistry Vol. 278, Issue 15, 13271- 13277, April 11, 2003).
  • phosphorylated PHF2 is immobilized on a sensor chip in a Biacore® (Biacore ⁇ AB) protein interaction analysis system.
  • Cell extracts such as purified methylated ARID5B or FXR, or HepG2 to which glucagon stimulation has been applied after reacting the sensor chip with the test compound or in the state where the test compound coexists on the sensor chip. To obtain a signal.
  • the protein immobilized on the sensor chip is not limited to the phosphorylated PHF2, and can be freely selected from PHF2, ARID5B, and FXR.
  • test substance when reacting both molecules, the test substance is used in the reaction system.
  • a compound that regulates gene expression via FXR and the glucagon signaling system can be obtained.
  • a cell system or a cell-free system can be used, and examples thereof include ELISA, RIA, SPA method, BIACORE (registered trademark), fluorescence polarization method, and Two-Hybrid® System. It can also be carried out with PHF2, ARID5B and FXR partial peptides (sequences as described above). Furthermore, each partial peptide of PHF2, ARID5B and FXR can also be used as a fusion protein with tags or labeled proteins / peptides such as FLAG-, HA-, His-, Fc portion of immunoglobulin, GST-, GFP. is there.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the state of enhanced binding between PHF2 and FXR or ARID5B is as follows: (1) BFP fluorescence when the excitation light of BFP expressed as a fusion protein is irradiated with excitation light (near 370-390 nm) It can be measured by measuring the decrease in the light intensity at a wavelength (near 435-485 nM) and / or the increase in the light intensity at (2) the fluorescence wavelength of GFP (near 515-555 nM).
  • the PHF2-GFP fusion protein and FXR-BFP or ARID5B-BFP fusion protein are expressed in the cell and the test compound is reacted, observation is performed using a fluorescence microscope, thereby allowing local localization in the cell. For example, it is possible to observe the binding between PHF2 and FXR or ARID5B in the nucleus, and it is also possible to measure the increase or decrease of the fluorescence intensity in combination with an image analyzer or the like.
  • FXR, PHF2, and ARID5B In a system that quantitatively analyzes the binding between FXR, PHF2, and ARID5B, it is possible to use cells that produce all of FXR, PHF2, and ARID5B, or cell preparations of the cells. However, it is also possible to use a product produced by purifying at least one of PHF2, FXR and ARID5B by gene expression or the like.
  • a method for producing FXR, PHF2 or ARID5B, FXR, PHF2 or ARID5B protein or a gene encoding a partial peptide of these proteins is appropriately contained in an expression vector.
  • a vector that has been incorporated in a shape suitable for expression create a transformant introduced into any of animal cells, plant cells, insect cells, yeast, microorganisms such as E. coli, and use the transformant.
  • a method for culturing can be exemplified.
  • a production method by cell-free protein synthesis typified by an in vitro translation reaction system can be employed.
  • a sequence that controls transcriptional regulation preferably SP6 promoter, T3 promoter, T7 promoter, etc. is added 5 ′ upstream of a gene encoding FXR, PHF2 or ARID5B protein, and the gene is transcribed in a cell or in vitro.
  • RNA molecules encoding FXR, PHF2 or ARID5B proteins and used cell extracts for in vitro transcription reactions prepared from wheat germ, E. coli, reticulocytes, etc. (Sawazaki et al. Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, 2003, Volume 48 p549-554).
  • Cell-free protein synthesis can also be performed using a commercially available kit. Examples of such kits include reagent kits PROTEIOS TM (Toyobo), TNT TM System (Promega), synthesizer PG-Mate TM (Toyobo), RTS (Roche Diagnostics) and the like.
  • Such a transformant or PHF2 or ARID5B produced by cell-free protein synthesis can be separated into various separation operations using the physical properties, chemical properties, etc., if desired [edited by Biochemical Data Book, Biochemical Society of Japan. II "1st edition, 1st edition, Tokyo Chemical Co., Ltd., published on June 23, 1980, p1175-1259; Arakawa, et al., Biochemistry (USA), December 16, 1986, Volume 25, No. 25, pages 8274-8277 ( 1986); Langley et al., European Journal of Biochemistry (Germany) published on March 2, 1987, Vol.163, No.2, p313-321 etc.] .
  • purification methods include normal reconstitution treatment, treatment with a protein precipitating agent (salting out method), centrifugation, osmotic shock method, ultrasonic disruption, ultrafiltration, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography. Examples thereof include various liquid chromatography such as affinity chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC), dialysis method, and combinations thereof.
  • affinity purification can be performed by desorption of the polypeptide and the antibody.
  • FXR, PHF2 or ARID5B may be prepared by transformant or cell-free protein synthesis so that FXR, PHF2 or ARID5B is fused with an affinity tag.
  • a method for separating and purifying ARID5B can be exemplified. If FXR, PHF2 or ARID5B is expressed in a form in which such an affinity tag is fused, affinity purification using this tag can be carried out.
  • affinity tag Glutathione-S-Transferase (GST), polyhistidine tag (His tag, Sisk, etc.) Journal of Virology (USA), February 1994, Vol. 68, No.
  • the aspect of the screening method (II) of the present invention is a substance that contacts PHF2 and protein kinase in the presence of a test substance, detects phosphorylation of PHF2, and controls the phosphorylation of PHF2 from the obtained detection result
  • the step of selecting is included. Further, in this embodiment, PHF2 and protein kinase are contacted in the presence of a test substance, phosphorylation of PHF2 is detected, and a substance that regulates gene expression or glucagon signaling system via FXR is obtained from the obtained detection result. Including a step of selecting.
  • the method of the present invention can be used to screen for a phosphorylation-regulating substance of PHF2, using phosphorylation of PHF2 by glucagon stimulation as an index.
  • PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complexation following phosphorylation can be used to screen for substances that affect the interaction of each component that forms the complex and the expression level of the target gene of FXR. It becomes possible. This aspect is based on the finding that phosphorylation of PHF2 is important for glucagon-stimulated FXR activation.
  • the method of the present invention for example, after stimulating cells such as HepG2 with glucagon in the presence or absence of a test compound, PHF2 is immunoprecipitated using a PHF2-specific antibody, and an anti-phosphorylated antibody is added.
  • Gene expression regulation by FXR can be predicted by quantifying the PHF2 phosphorylation state by the Western blotting method used.
  • SHP which is one of the target genes of FXR, which is useful for screening blood cholesterol lowering agents. It is expected to be.
  • Screening method (III) In the embodiment of the screening method (III) of the present invention, at least two proteins selected from the group consisting of PHF2, ARID5B and FXR are contacted in the presence of a test substance, and the complex of these proteins is brought into contact. Detecting the formation of the body, and selecting a substance that modulates the interaction of the protein from the detection results obtained.
  • the method of the present invention can be screened using an antigen-antibody reaction.
  • PHF2, ARID5B and FXR are expressed in cells, cultured with a test substance for a certain period of time, and then disrupted to prepare a cell lysate. Immunoprecipitation is performed with an antibody against one of the elements (molecules) of PHF2, ARID5B and FXR, and the other molecule contained in the precipitate is detected or quantified by an immunological method such as Western blotting. Thereby, it is possible to detect the influence of the test substance on each intermolecular interaction (PHF2-ARID5B, PHF2-FXR, ARID5B-FXR, PHF2-ARID5B-FXR).
  • Searching for substances that induce binding between molecules is facilitated by adding the test substance alone to the culture system, performing the above experiment, and comparing it with immunoprecipitates from cells that do not contain the test compound. To be achieved.
  • the substance that regulates (promotes, suppresses, or inhibits) the binding of each molecule is obtained by adding an appropriate test compound to the culture system and conducting the above experiment, and by performing immunoprecipitation from cells that do not contain the test compound. It is possible to search by comparing.
  • PHF2, ARID5B and FXR can be expressed and used as fusion proteins with tags or labeled proteins / peptides such as FLAG-, HA-, His-, Fc part of immunoglobulin-, GST-, GFP,
  • the antibody used for immunoprecipitation or immunological detection may be an antibody that recognizes these tags.
  • immunoprecipitation with an antibody it is possible to immobilize Ni or glutathione on a solid layer such as beads to supplement the target protein complex.
  • an antibody, Ni, glutathione, etc. that recognizes one protein molecule or fusion protein molecule of the complex is immobilized on an ELISA plate or bead, and PHF2-ARID5B, PHF2-FXR, Capture ARID5B-FXR or PHF2-ARID5B-FXR complex.
  • the element (target protein molecule) in the captured complex can be detected and quantified.
  • direct quantification using labeled antibodies such as enzymes and radioisotopes
  • indirect quantification using labeled secondary antibodies or labeled avidin using biotin-labeled antibodies.
  • the biotin-avidin method for quantification can be used. Also, if one protein molecule is expressed as a fusion protein with a fluorescent protein such as GFP, PHF2-ARID5B, PHF2-FXR, ARID5B-FXR, PHF2-ARID5B- After capturing the FXR complex, the interaction (binding state) of PHF2, ARID5B, and FXR can be evaluated by directly measuring the fluorescence activity.
  • a fluorescent protein such as GFP, PHF2-ARID5B, PHF2-FXR, ARID5B-FXR, PHF2-ARID5B-
  • Screening method (IV) The aspect of the screening method (IV) of the present invention is that the complex of PHF2, ARID5B and FXR is brought into contact with the test substance, and the methylation or demethylation of histone acting on the complex is detected. A step of selecting a substance that modulates the methylation or demethylation of the histone from the detection result obtained.
  • a complex of PHF2, ARID5B, and FXR is contacted with a test substance, and the methylation or demethylation of histone acting on the complex is detected, and FXR is detected from the obtained detection result. Selecting a substance that modulates mediated gene expression or the glucagon signaling system.
  • a chromatin fraction is obtained after stimulating cells such as HepG2 with glucagon in the presence or absence of the test compound. Thereafter, the demethylation state or methylation state of histone H3K9 is quantified by Western blotting using an anti-methylated histone antibody. As a result, it is possible to obtain a compound that controls gene expression via FXR and the glucagon signaling system.
  • the aspect of the screening method (V) of the present invention is to contact a complex of PHF2 and ARID5B with a test substance, detect methylation or demethylation of the ARID5B, and detect the ARID5B from the obtained detection results. Selecting a substance that modulates methylation or demethylation. Further, in this embodiment, a complex of PHF2 and ARID5B is contacted with a test substance, methylation or demethylation of the ARID5B is detected, and gene expression or glucagon signaling via FXR is obtained from the obtained detection result. Selecting a substance that modulates the system.
  • PHF2 regulates glucagon signal-dependent demethylation of ARID5B, binding of PHF2 / ARID5B / FXR transcription factor complex to FXR target gene promoter, and expression of FXR target gene cluster It is possible to screen for substances that regulate The present invention is based on the finding that demethylation of ARID5B by PHF2 is important for FXR activation by glucagon stimulation.
  • a cell lysate is obtained after stimulating cells such as HepG2 with glucagon in the presence or absence of the test compound. Thereafter, the demethylated state or methylated state of ARID5B is quantified by Western blotting using an anti-methylated lysine antibody. As a result, it is possible to obtain a compound that controls gene expression via FXR and the glucagon signaling system.
  • Screening method (VI) The aspect of the screening method (VI) of the present invention is that the complex of PHF2, ARID5B and FXR is brought into contact with the test substance, the transcriptional activity of the gene acting on the complex is detected, and the obtained detection result is used. Selecting a substance that modulates the transcription activity.
  • the method of the present invention can be screened by, for example, a reporter assay using cells expressing PHF2, ARID5B, and FXR.
  • transcription of a PHF2 / ARID5B / FXR transcriptional conjugate complex with a glucagon signal comprising the step of detecting a transcriptional activity of the test compound and the PHF2 / ARID5B / FXR transcriptional conjugate complex in the presence of the glucagon signal. It is possible to screen for compounds that suppress or promote the activity.
  • the purpose of the screening method of the present invention is to obtain a compound that inhibits or enhances the transcriptional activity by the PHF2 / ARID5B / FXR transcriptional conjugate complex in the presence of glucagon signal, and the transcriptional activity of the PHF2 / ARID5B / FXR transcriptional conjugate complex.
  • the form of the compound selected by the screening system of the present invention is as follows: a) PHF2 phosphorylation inhibitor or promoter, b) ARID5B methylation inhibitor Alternatively, promoters, c) H3K9 demethylation inhibitors or promoters, and d) FXR ligands that act only in the presence of glucagon signal.
  • Screening method (VII) The aspect of the screening method (VII) of the present invention is that the complex of PHF2, ARID5B and FXR is brought into contact with the test substance, the transcriptional activity of the gene acting on the complex is detected, and the detection result obtained is used. Selecting a substance that modulates FXR-mediated gene expression or glucagon signaling system.
  • the present invention it is possible to detect the expression level of PHF2 or ARID5B in cells using an immunological technique and screen for compounds that control the transcriptional activity of FXR.
  • the present invention is based on the finding that the presence of PHF2 and ARID5B is important for FXR activation by glucagon stimulation.
  • a cell lysate is obtained after stimulating cells such as HepG2 with glucagon in the presence or absence of the test compound.
  • the expression level of each protein is quantified with an anti-PHF2 antibody or anti-ARID5B.
  • an anti-PHF2 antibody or anti-ARID5B it is possible to obtain a compound that controls gene expression via FXR or a compound that controls the glucagon signaling system.
  • Western blotting, EIA, ELISA, etc. can be used as a method for quantifying the expression level.
  • the present invention provides a demethylating agent comprising PHF2 or a complex of PHF2 and ARID5B.
  • the present invention has been completed by finding that PHF acts as a histone demethylase.
  • the present invention has been completed based on the finding that the PHF2 / ARID5B complex exhibits histone demethylation activity by glucagon stimulation.
  • PHF2 or complex can be used as a reagent for demethylation.
  • the aspect used in the screening method of this invention is mentioned.
  • PHF2 can be allowed to act on histone H3K9-Me2 and the like, and it can be detected whether histone is demethylated by immunoblotting, radioimmunoassay or the like.
  • GST glutathione S transferase
  • His histidine tag
  • PGEX-4T-1 Promega vector (GST-FXR) incorporating a DNA sequence encoding the mouse FXR DE region (base sequence from 924 to 1738 of SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 12)) and a 6x histidine tag (DE) -His vector) was transformed into Rosetta2 (DE3) pLysS E. coli strain (Novagen, catalog number 71403-3).
  • E. coli After collecting E. coli, suspend it in LEW buffer (MACHREY-NAGEL; 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0.05% Tween20, 1 mM 2-mercaptoethanol, protease inhibitor cocktail, pH 8.0), and then concentrate Lysozyme to a final concentration of 1 It added to become mg / ml, and it incubated with rotator for 30 minutes. After crushing with a sonicator, the mixture was centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was collected.
  • LEW buffer 5 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0.05% Tween20, 1 mM 2-mercaptoethanol, protease inhibitor cocktail, pH 8.0
  • GST-His resin was prepared by the same operation using a pGEX-4T-1 vector that expresses only the GST • His tag to which the FXR DE region was not fused.
  • GST-His-resin and GST-FXR (DE) -His resin were subjected to SDS-PAGE and silver stained, bands were confirmed as shown in FIG.
  • a glutation solution (15 mM glutathion, 20 mM HEPES, 150 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 10% glycerol, 0.05% NP40, protease inhibitor cocktail, pH 8.3) was added and incubated for 30 minutes. The supernatant was recovered, the glutation solution was added again to resin, and the mixture was incubated in the same manner for 30 minutes. The eluate obtained by performing this operation three times was subjected to glycerol density gradient centrifugation with a 10 to 40% glycerol concentration gradient, and fractionated.
  • TCA solution (20% trichloroacetic acid, 80% acetone) was added to the purified sample solution, and the mixture was placed at ⁇ 20 ° C. for 2 hours, and then centrifuged at 12000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes. The supernatant was discarded, acetone was added to the pellet, and it was washed by centrifugation at 12000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes. After the pellet was dried, SDS-PAGE and silver staining were performed. As a result, an FXR mutual factor complex was detected in the vicinity of a molecular weight of about 500 kDa (fraction Nos. 11 and 12) (FIG. 3).
  • the electrophoresis gel was silver stained with SilverQuest (Invitrogen). The stained band was cut out and placed in a low retention tube. The gel was desilvered and washed 3 times with MQ, and then 100 ⁇ l of acetonitrile was added and left for 15 minutes. During that time, it was sometimes stirred. Thereafter, the supernatant was discarded and dried using a speed bag. To this, 50 ⁇ l of a reduction reaction solution (10 mM DTT, 100 mM NH 4 HCO 3 ) was added and incubated at 56 ° C. for 1 hour, and then the supernatant was discarded.
  • a reduction reaction solution (10 mM DTT, 100 mM NH 4 HCO 3
  • the liquid remaining in the gel was collected in a new low retention tube, 20 ⁇ l of 20 mM NH 4 HCO 3 solution was added to the gel and stirred at room temperature for 20 minutes, and then the liquid was collected. 20 ⁇ l of an extraction reaction solution (5% formic acid, 50% acetonitrile) was added to the gel and stirred at room temperature for 20 minutes, and then the liquid was recovered. This extraction operation was performed 4 times in total. In order to increase the extraction efficiency of the trypsin digestion product, the gel was subjected to an ultrasonic cleaner for about 5 seconds during the fourth extraction.
  • an extraction reaction solution 5% formic acid, 50% acetonitrile
  • a sample solution (0.1% trifluoroacetic acid, 1 mM n-octylglycoside, 10 mM ammonium phosphate) was added and dissolved while stirring.
  • the sample solution was placed on a matrix of MALDI-TOF / MS target (BRUKER DALTONICS) and then washed with a washing solution (0.1% trifluoroacetic acid, 10 mM ammonium phosphate).
  • glucagon-dependent intracellular PHF2 / ARID5B / FXR complex formation 293F cells were treated with glucagon, immunoprecipitated with anti-FXR antibody, and analyzed by Western blotting using anti-PHF2 antibody and anti-ARID5B antibody.
  • the primary antibody was prepared as follows. Anti-PHF2 antibodies are obtained by peptide affinity purification of collected sera after immunizing rabbits with three types of PHF2 mixed peptides (ERSVDVTDVTKQKDC (SEQ ID NO: 13), CKPKPVRDEYEYVSD (SEQ ID NO: 14), CAYKSDDSSDEGSLH (SEQ ID NO: 15)). did.
  • Anti-ARID5B antibodies are obtained by peptide affinity purification of collected sera after immunizing rabbits with three types of ARID5B mixed peptides (CDTPQGRNSDHGEDE (SEQ ID NO: 16), CTDQGSNSEKVAEEA (SEQ ID NO: 17), CEQTSKYPSRDMYRE (SEQ ID NO: 18)). did.
  • Primer sequences are as follows. PCR was performed according to a conventional method.
  • Escherichia coli was collected, suspended in PBS containing 10% glycerol, and then crushed with a sonicator. Thereafter, Triton-X®100 was added to a final concentration of 1% and incubated for 30 minutes with a rotator, and then centrifuged at 7500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected. Glutathion® Sepharose® 4B® (Amersham® Biosciences) was added thereto, incubated for 30 minutes with a rotator, and then washed 5 times with PBS containing 10% glycerol. As described above, GST-PHF2 (A), GST-PHF2 (B), GST-PHF2 (C) and protein resin were prepared.
  • human ARID5B ⁇ is divided into three amino acid sequence regions from the 1st to 318th positions (A region), 319 to 678th (B region), and 679 to 1190th (C region) counting from the N-terminus.
  • the primer was designed as described above, and after amplification by PCR, it was incorporated into the pGEX-4T-1 vector, GST-ARID5B ⁇ (A region, primer sequence D, d), GST-ARID5B ⁇ (B region, primer sequence E, e) and GST-ARID5B ⁇ (C region, primer sequence F, f) pGEX-4T-1 vector was obtained.
  • Primer sequences are as follows. D: 5'-ccggaattcatggcgccaaatcttaaggcagaccacg-3 '(SEQ ID NO: 25) d: 5'-ccgctcgagcctgcactcttcaccaatggcaa-3 '(SEQ ID NO: 26) E: 5'-cgcggatccgcagatgaacaagccttcttggtg-3 '(SEQ ID NO: 27) e: 5'-ccgctcgaggagcaggggcgtgtaattaagtcc-3 '(SEQ ID NO: 28) F: 5'-cgcggatcctactctaggggcaacccaggcatc-3 '(SEQ ID NO: 29) f: 5'-ccgctcgagctacagttttgtactggggtgcacggatg-3 '(SEQ ID NO:
  • human full-length FXR (SEQ ID NO: 5), human full-length PHF2 (SEQ ID NO: 1), and human full-length ARID5B (SEQ ID NO: 3) amplified using HepG2 cDNA as a template, respectively, FLAG-HA-pcDNA3 vector, Incorporated into HA-pcDNA3 vector and FLAG-His pcDNA3 vector, and using these vectors as templates, in vitro translation using TNT Coupled Reticulocyte Lysate System Kit (Promega), 35 S-Met labeled FXR, PHF2, or ARID5B protein was synthesized. These were mixed with the above-mentioned various GST fusion proteins resin and incubated on ice for 30 minutes.
  • SDS-PAGE loading buffer was added and boiled for 5 minutes. This was subjected to SDS-PAGE with 7.5% acrylamide gel, the gel after electrophoresis was dried, and analyzed with an imaging analyzer (BAS1500; Fuji Film).
  • FXR was combined with the region (A) containing the PHD2 PHD finger and JmjC domain of PHF2, and with the region (B) (C) containing the ARID domain on the C-terminal side of ARID5B (FIG. 6). Further, it was found that PHF2 and ARID5B were bound to each other at the C-terminal region (B) (C) of PHF2 and the N-terminal region (A) of ARID5B (FIG. 6).
  • luciferase activity was measured using Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) and TR717 Microplate Luminometer (Applied Biosystems). As a result, the promoting effect of FXR transcription activation ability by glucagon disappeared by H89 (PKA inhibitor) (FIG. 7).
  • the human SHP gene promoter (-23 to -312) region was amplified by PCR using a biotinylated primer, ethanol precipitated, dissolved in TE, and contacted with Avidin resin for 30 minutes at room temperature.
  • Primer sequences are as follows. 5'-tgagaccttggtgccctggtac-3 '(SEQ ID NO: 31) 5'-ttcccagctatctggccctc-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • SHP-promoter immobilized on Avidin resin was prepared by washing the sample after contact with TE three times.
  • 293F cells were transfected with ARID5B, PHF2 (WT), or a PKA phosphorylation site consensus sequence Ala substitution mutant: PHF2 (S4A) in the C-terminal region of PHF2, and this cell lysate after glucagon stimulation ABCD assay was performed by contacting SHP-promoter immobilized on avidin resin. That is, 293F cells were transfected with FLAG-ARID5B-His pcDNA3, HA-PHF2 pcDNA3, or HA-PHF2 (S4A) pcDNA3 and incubated for 2 hours in the presence of glucagon (200 nM) and MG132 (10 ⁇ 5 M). .
  • the medium was extracted, 1 ml of PBS was added, the cells were scraped, and collected in a 1.5 ml tube. After centrifuging at 3000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, 1 ml of TNE buffer was added to the cell pellet and pipetting was performed, and the cells were lysed by inverting the tube for 30 minutes with a rotator at 4 ° C. After centrifugation at 12000 rpm for 15 minutes, the supernatant was collected. To this, SHP-promoter DNA immobilized on Avidin resin was added and contacted while rotating the tube with a rotator for 30 minutes at 4 ° C. After washing the resin three times with TNE buffer, SDS-PAGE loading buffer was added and boiled, and Western blotting was performed using anti-PHF2 antibody and anti-ARID5B antibody.
  • the Ser residue in the PHF2 C-terminal region is phosphorylated by PKA present downstream of the glucagon signal, and this phosphorylation is caused by FXR activation by glucagon stimulation and the FXR target gene of the PHF2 / ARID5B complex. It was shown to be essential for promoter binding.
  • the cells were lysed while rotating the tube with a rotator for 30 minutes. After centrifugation at 12000 rpm for 15 minutes, the supernatant was collected, anti-FLAG M2 agarose resin (Sigma) was added thereto, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 4 hours with a rotator. Thereafter, the resin was washed 4 times with TNE buffer.
  • This FLAG-PHF2 immunoprecipitate and histone (Sigma, H9250) were mixed at a protein amount ratio of 1: 5, and histone demethylation buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 50 mM Fe (NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 -6H 2 O, 1 mM ⁇ -ketoglutalate, 2 mM ascorbate) was incubated at 37 ° C for 4 hours. Then, SDS-PAGE loading buffer was added and boiled.
  • the sample after boiling treatment was subjected to SDS-PAGE with 15% acrylamide gel and then blotted onto a PVDF membrane. This was blocked with PBS-T buffer containing 5% skim milk. This was incubated with a primary antibody diluted in PBS-T buffer at room temperature for 2 hours. Next, the PVDF membrane was washed 3 times with PBS-T buffer, and then incubated at room temperature for 1 hour with a secondary antibody (anti-rabbit immunoglobulin / HRP, Dako Cytomation) diluted in PBS-T buffer. Thereafter, the PVDF membrane was treated with Detection TM Reagent TM (Amersham TM Biosciences), and developed by contacting with an X-ray film for an appropriate time. As a result, it was shown that PHF2 demethylates histone H3K9-Me2 specifically (FIG. 9). It has not been known so far that PHF2 is a histone demethylase.
  • TNE buffer 1 ml was added to the cell pellet, pipetted, incubated for 30 minutes with a rotor, centrifuged at 12000 rpm for 15 minutes, and 500 ⁇ l of TNE buffer was added to the pellet.
  • a sonicator TOMY SEIKO, Handy Sonic model UR-20P
  • the sample after the boiling treatment was subjected to SDS-PAGE with a 15% acrylamide gel and then blotted onto a PVDF membrane. This was blocked with PBS-T buffer containing 5% skim milk.
  • histone H3 The following anti-Histone H3 antibody was used. histone H3; abcom, 1791, 1/2000 dilution
  • Glucagon-dependent detection of ARID5B demethylation 293F cells were transfected with FLAG-ARID5B or FLAG-ARID5B (K336A) in which lysine at position 336 was substituted with alanine, and HA-PHF2 vector, and then stimulated with glucagon Immunoprecipitation with anti-methylated lysine antibody was performed. This immunoprecipitation product was analyzed by Western blotting using an anti-FLAG antibody. As a result, it was found that ARID5B was methylated. The methylated band of ARID5B was attenuated by overexpression of PHF2 and stimulation with glucagon (FIG. 11, lanes 1-3). On the other hand, no methylated band was observed in the ARID5B K336A mutant (FIG. 11, lane 4).
  • the present invention specifically inhibits or promotes only FXR transcriptional activity using PHF2 / ARID5B as a transcription coupling factor in addition to the usefulness of conventional agonists and antagonists of nuclear receptors and the usefulness of glucagon receptor antagonists. Novel methods are provided for screening compounds that do. By using this, it can be expected that it will be possible to create a drug that is more effective and specific for diabetes, hyperlipidemia, fibrosis and the like.

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Abstract

【課題】PHF2、ARID5B若しくはFXR又はこれらの複合体の相互作用を調節する物質、あるいは、FXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質をスクリーニングする方法の提供。 【解決手段】PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも２つのタンパク質を被検物質の存在下で接触させ、これらのタンパク質の複合体の形成を検出し、得られる検出結果から当該タンパク質の相互作用を調節する物質を選択する工程、あるいは、前記検出結果から当該遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。

Description

糖代謝・脂質代謝に作用する化合物の取得方法
　本発明は、糖尿病、高脂血症、組織線維症等に対して有効な化合物をスクリーニングする方法に関する。詳細には、本発明は、該化合物をスクリーニングするためのFXR、PHF2、及びARID5Bのin vitro使用に関する。  
　グルカゴンは、絶食時に血糖値を維持するため糖新生に重要な役割を果たすホルモンである。糖尿病患者ではβ細胞の機能異常によって血中グルカゴン濃度が上昇し、糖新生が亢進することが示唆されており（Spellman, C.W. (2007) J. Am. Osteopath. Assoc. 107, S1-S5）、グルカゴンレセプターアンタゴニストは、新規糖尿病治療薬として古くから期待されてきたターゲットである。
　一方、FXRは、胆汁酸を内因性リガンドとする核内受容体型転写制御因子の一つであり(Forman, B. M., E. Goode, et al. (1995). Cell 81(5): 687-93., Makishima, M., A. Y. Okamoto, et al. (1999). Science 284(5418): 1362-5.；Parks, D. J., S. G. Blanchard, et al. (1999). Science 284(5418): 1365-8)、リガンド依存的に認識DNA配列に結合して、転写共役因子複合体をリクルートする。また、FXRは主として、肝臓、腸、腎臓、副腎に発現し、糖新生系遺伝子、脂質代謝系遺伝子等の発現調節に重要な役割を果たすことが明らかにされている(Bramlett, K. S., S. Yao, et al. (2000). Mol Genet Metab 71(4): 609-15.；Goodwin, B., S. A. Jones, et al. (2000). Mol Cell 6(3): 517-26.；Lu, T. T., M. Makishima, et al. (2000). Mol Cell 6(3): 507-15. ;Moschetta, A., Bookout AL, et al. (2004). Nature Medicine 10(12): 1352-8.)。さらに、近年、FXRはリポ蛋白質代謝や糖代謝にも関わることが示唆されている(Sinal, C. J., M. Tohkin, et al. (2000). Cell 102(6): 731-44.; Kast, H. R., B. Goodwin, et al. (2002). J Biol Chem 277(4): 2908-15.；Savkur, R. S., K. S. Bramlett, et al. (2005). Biochem Biophys Res Commun 329(1): 391-6.；Stayrook, K. R., K. S. Bramlett, et al. (2005). Endocrinology 146(3): 984-91.)。従って、FXRに作用する物質は、高脂血症や糖尿病等の病態を改善することができると期待されている。
　上記のように、グルカゴンレセプターアンタゴニストを糖尿病治療薬として開発するため種々の研究が行われてきたが、これまでに取得されたグルカゴンレセプターアンタゴニストの大部分は、ペプチド性であり経口吸収性に問題があるため糖尿病治療には用いられていない。また、近年、非ペプチド性で経口吸収性を示す低分子化合物が取得されているが、糖尿病患者において有効なグルカゴンレセプターアンタゴニストとして機能する化合物はこれまでのところ取得されておらず、グルカゴンレセプターを分子ターゲットとする医薬品スクリーニングは十分機能しているとは言えない状況である。
　一方、FXRも、脂質代謝、糖代謝に深く関与していることから、従来より、創薬分子ターゲットとして着目されており、そのアゴニスト又はアンタゴニストを医薬品として開発しようとする試みが幾つかなされている。
　そのための代表的な医薬品スクリーニング方法としては、一般的に広く用いられているレポーターアッセイが知られている。その具体的な一例としては、ヒト肝臓よりクローニングしたFXR cDNA発現プラスミド、FXRの下流遺伝子であるBSEP (bile salt export pump)遺伝子のプロモーター領域をホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだプラスミド、及び、補正用のウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドをHepG2細胞にトランスフェクトし、被検化合物のFXR作動性活性を測定するものである（特許文献１：特開2006-306800公報）。
　しかし、このようなFXR遺伝子をHepG2などの細胞に強制発現させたレポーターアッセイ系で取得された化合物は、FXRを発現する組織において、FXRに恒常的に作用すると考えられる。すなわち、本来、FXRは脂質代謝系、糖新生系を初めとする様々な遺伝子の発現を調節している核内レセプターである。そのため、上記レポーターアッセイ系で取得された化合物は、目的とする病態を改善させるような遺伝子発現のみならず、副作用に関連する遺伝子発現にも影響してしまう可能性が考えられる。従って、主作用と副作用との分離が得られず、医薬品のスクリーニング方法としては十分ではなかった。実際、生体内内因性リガンドである胆汁酸誘導体以外のFXRアゴニスト及びアンタゴニストは未だ上市されていない。
　また、リガンド依存的にFXR転写活性化能を促進する転写共役活性化因子として、ヒストンアセチル化酵素SRC-1 (Makishima et al., 1999; Parks et al., 1999; Wang et al., 1999)、TRAP220 (Thyloid Hormone Receptor-associated Protein 220、Pineda Torra et al., 2004)、ヒストンアルギニンメチル化酵素PRMT1 (Rizzo et al., 2005) 、PRMT4/CARM1 (Co-activator-associated Arginine Methyltransferase 1、Ananthanarayanan et al., 2004)、及びPGC-1a (Peroxisome Proliferator-activated Receptor-g Coactivator 1a、Zhang et al., 2004)  等が知られている。これらFXR転写共役因子は単一分子として機能する事が報告されているが、医薬品のスクリーニング方法として利用するための、FXR転写共役因子複合体としての機能、及び標的遺伝子群の発現調節機構は不明である。
　更に、近年、PPARγ (Burns, KA., et al. (2007) Biochim. Biophys. Acta. 1771, 952-960)、ER、ARなどのステロイドレセプター (Weigel, NL, et al. (2007) Nucl. Recept. Signal. 5, e0005)、及びステロイドレセプターコアクチベーター ( Wu, RC., et al. (2005) Endocr. Rev. 26, 393-399)などの転写因子が細胞内シグナル伝達系によってリン酸化を受け、転写活性が調節されていることが示されている。しかしながら、FXRに関しては、細胞内情報伝達経路を介した標的遺伝子の発現制御メカニズムについて明らかにされていない。
特開2006-306800公報
　そこで本発明は、従来技術の問題点を解消し、係る問題点の少ない医薬品の新規スクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記問題点を解決するため鋭意研究を重ねた結果、PHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体形成機構、及び、PHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体による遺伝子発現調節機構に着目した新規な原理に基づく、より特異性の高い医薬品のスクリーニング方法を開発することに成功し、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも２つのタンパク質を被検物質の存在下で接触させ、これらのタンパク質の複合体の形成を検出し、得られる検出結果から当該タンパク質の相互作用を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（２）PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも２つのタンパク質を被検物質の存在下で接触させ、これらのタンパク質の複合体の形成を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（３）PHF2とプロテインキナーゼとを被検物質の存在下で接触させ、PHF2のリン酸化を検出し、得られる検出結果から当該PHF2のリン酸化を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（４）PHF2とプロテインキナーゼとを被検物質の存在下で接触させ、PHF2のリン酸化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（５）PHF2とARID5Bとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果から当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（６）PHF2とARID5Bとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（７）PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用するヒストンのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果から当該ヒストンのメチル化又は脱メチル化を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（８）PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用するヒストンのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（９）PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用する遺伝子の転写活性を検出し、得られる検出結果から当該転写活性を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（１０）PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用する遺伝子の転写活性を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
（１１）PHF2、又はPHF2とARID5Bとの複合体を含む脱メチル化剤。
（１２）PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質及び/又は該タンパク質をコードする遺伝子を含む、上記（１）～（１０）のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
　本発明において、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質は、精製されたものであることが好ましい。
　また、本発明において、調節物質としては、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質に親和性を有するもの、あるいは阻害物質が挙げられる。
　さらに、本発明において、接触は、例えばグルカゴン刺激下に行われてもよく、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質を発現及び/又は産生する細胞、又は該細胞の細胞調製物を用いて行うこともできる。ここで、細胞としては、例えば肝臓由来細胞（肝細胞、肝星細胞等）、血管内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞（消化管上皮細胞等）、脂肪細胞、膵β細胞、膵α細胞及び気管支上皮細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種を例示することができる。また、細胞は、PHF2をコードする遺伝子、ARID5Bをコードする遺伝子及びFXRをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つが導入されたものであってもよい。
　さらに、本発明において、転写活性はFXRを介するものであり、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質を過剰発現させることにより生じさせることができる。転写活性の検出は、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質を発現及び/又は産生する細胞、又は該細胞の調製物において行うことができ、例えばレポーター遺伝子アッセイ系により転写活性を検出することができる。この場合に用いられる細胞としては、上記と同様、肝細胞、肝星細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、消化管上皮細胞、脂肪細胞、膵β細胞、膵α細胞及び気管支上皮細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられ、細胞は、PHF2をコードする遺伝子、ARID5Bをコードする遺伝子及びFXRをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つが導入されたものであってもよい。
　PHF2、ARID5B及びFXRのアミノ酸配列としては、例えば以下のものが挙げられる。
PHF2：
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその部分配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、PHF活性を有するタンパク質。
ARID5B：
(c) 配列番号４に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むタンパク質
(d) 配列番号４に示されるアミノ酸配列又はその部分配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ARID5B活性を有するタンパク質。
FXR：
(e) 配列番号６に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むタンパク質
(f) 配列番号６に示されるアミノ酸配列又はその部分配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、FXR活性を有するタンパク質。
　PHF2をコードする遺伝子、ARID5Bをコードする遺伝子及びFXRをコードする遺伝子としては、それぞれ、上記(a)～(b)、(c)～(d)、及び(e)～(f)のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
　また、PHF2をコードする遺伝子としては、例えば以下のポリヌクレオチドを含む遺伝子が挙げられる。
(g) 配列番号１に示す塩基配列、アミノ酸へのコード領域の塩基配列又はこれらの部分配列を含むポリヌクレオチド
(h) 配列番号１に示される塩基配列、アミノ酸へのコード領域の塩基配列又はこれらの部分配列に相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、PHF2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　ARID5Bをコードする遺伝子としては、例えば以下のポリヌクレオチドを含む遺伝子が挙げられる。
(i) 配列番号３に示す塩基配列、アミノ酸へのコード領域の塩基配列又はこれらの部分配列を含むポリヌクレオチド
(j) 配列番号３に示す塩基配列、アミノ酸へのコード領域の塩基配列又はこれらの部分配列に相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ARID5B活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　FXRをコードする遺伝子としては、例えば以下のポリヌクレオチドを含む遺伝子が挙げられる。
(k) 配列番号５に示す塩基配列、アミノ酸へのコード領域の塩基配列又はこれらの部分配列を含むポリヌクレオチド
(l) 配列番号５に示す塩基配列、アミノ酸へのコード領域の塩基配列又はこれらの部分配列に相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、FXR活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　本発明により、糖尿病、高脂血症、組織線維症等に対して有効な化合物をスクリーニングする方法が提供される。
　本発明者は、グルカゴン刺激によって形成されたPHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体による遺伝子発現調節機構に着目し、従来に無い、グルカゴンレセプターアンタゴニストの特徴とFXRアゴニスト又はアンタゴニストの特徴とを併せ持つとともに、グルカゴン下流シグナルを標的とした高い特異性を有する医薬品のスクリーニング方法を開発するに至ったものである。
　本発明によれば、糖尿病・高脂血症などの病態にのみ関連したFXRの標的遺伝子発現を調節することが可能であり、かつ、特異性の高い化合物をスクリーニングすることが可能な新規方法が提供される。
　すなわち、前述したレポーターアッセイを用いて、単にFXRを標的としてスクリーニングされたアゴニストやアンタゴニスト性医薬品は、FXRに対する単独リガンドであることからFXRに恒常的に作用し、発現亢進、若しくは、発現抑制を受ける遺伝子の種類が多くなる。発現亢進、発現抑制される遺伝子の種類が多くなるということは、副作用の増大につながるため、目的とする病態の治療に適した遺伝子発現調節が困難となり、望ましいプロファイルを示す医薬品を開発することが困難であった。これに対し、本発明に係る、PHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体はグルカゴンシグナル依存性であることから、当該複合体に着目すれば、従来の核内受容体のアゴニスト・アンタゴニストの有用性、及びグルカゴンレセプターアンタゴニストの有用性に加え、PHF2/ARID5Bを転写共役因子として用いているFXR転写活性のみを特異的に阻害ないし促進する、効果・特異性に優れた薬剤（糖尿病、高脂血症、線維症などが対象）のスクリーニングが可能となる。
グルカゴンがレセプターに結合した後のシグナル伝達経路を示す模式図である。 FXRの精製結果を示す図である。 GST-FXR(DE)-Hisと相互作用する因子の精製と同定結果を示す図である。 PHF2、ARID5B及びFXRが複合体を形成することを示す図である。 内在性のPHF2、ARID5B及びFXRがグルカゴン依存的に複合体を形成することを示す図である。 PHF2、ARID5B及びFXRの結合位置を示す図である。 グルカゴンシグナルによるPHF2のリン酸化を示す図である。 グルカゴンシグナルによるFXRの活性化を示す図である。 PHF2がヒストン脱メチル化酵素であることを示す図である。 PHF2/ARID5B複合体がグルカゴン依存的に脱メチル化することを示す図である。 PHF2/ARID5B複合体がグルカゴン依存的に脱メチル化することを示す図である。 PHF2/ARID5B複合体がグルカゴン依存的に脱メチル化することを示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2008年5月23日に出願された日本国特許出願（特願2008-135599号）及び2008年5月26日に出願された日本国出願（特願2008-137164号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
 
　本発明者は、肝臓由来細胞を用いた研究から、
(1) FXRは、グルカゴンを初めとする絶食シグナル依存的にPHF2、ARID5Bと転写共役因子複合体を形成することによって、FXR標的遺伝子プロモーターへの結合が促進されること、
(2) PHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体は、FXRリガンド非依存的に複合体を形成し、リガンド非依存的にFXR転写活性を促進すること、
(3) PHF2は、グルカゴンシグナルなどの下流に存在するPKAシグナルを介してリン酸化され、このリン酸化がPHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体のFXR標的遺伝子プロモーターへの結合、及びFXR転写活性化に必須であること、
(4) PHF2はヒストン脱メチル化酵素であり、PHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体を形成したときに、当該複合体中のPHF2がH9K9-Me2を脱メチル化することによってFXR標的遺伝子群の発現が調節されていること、
(5) 更にPHF2は、FXR複合体構成因子であるARID5Bも脱メチル化し、このARID5Bの脱メチル化は、PHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体のFXR標的遺伝子プロモーターへの結合、及びFXR転写活性化に必須であること、
を明らかにした。
　係る知見に基づき、スクリーニングの目的とする化合物の作用点をグルカゴンレセプターの下流シグナル経路に特定することが可能となった。
　まず、本発明によって明らかにされた、グルカゴンレセプターの下流シグナル経路の概要を以下に説明する。
　図１は、グルカゴンがレセプターに結合した後のシグナル伝達経路を模式的に示したものである。グルカゴンがGタンパク共役レセプター（GPR)に結合すると、プロテインキナーゼA（PKA)が活性化される（図１）。活性化PKAは、下流に存在する「PHF2」と呼ばれるタンパク質をリン酸化する（図１(a))。リン酸化されたPHF2は、「ARID5B」と呼ばれるタンパク質と相互作用して結合し（図１(b))、このリン酸化によりARID5Bが脱メチル化される（図１(c))。続いて、ARID5Bの脱メチル化により、PHF2/ARID5B複合体は「FXR」と呼ばれる核内受容体型転写制御因子に結合し、PHF2/ARID5B/FXR複合体を形成する（図１(d))。このPHF2/ARID5B/FXR複合体化によってFXRがゲノム上のFXRE（FXR response element）に結合し、ヒストン（ヒストンH3K9)の脱メチル化を引き起こす（図１(e))。そして最後に、ヒストンの脱メチル化によって胆汁酸合成遺伝子及び糖新生遺伝子発現が活性化される（図１(f))。
　本発明は、上記知見に基づき、グルカゴン刺激から始まり遺伝子発現に至るまでのグルカゴンシグナル伝達系の制御を指標として、糖尿病、高脂血症、組織線維症等に対する医薬として有効な物質をスクリーニングし得ることを見出した。グルカゴンシグナル伝達系には、PHF2のリン酸化（図１(a))、PHF2とARID5Bとの相互作用（図１(b))、ARID5Bのメチル化又は脱メチル化（図１(c))、PHF2とARID5BとFXRとの相互作用（図１(d))、ヒストン（ヒストンH3K9)のメチル化又は脱メチル化（図１(e))が行われる。従って、これらのシグナル伝達系のうちいずれかの相互作用、リン酸化又はメチル化若しくは脱メチル化を調節する物質は、遺伝子発現を調節できると考えられ、本発明のスクリーニングの対象となる。
　ここで、本発明において「PHF2」とは、Plant Homeodomain Finger protein 2を意味する。
　「ARID5B」とは、AT rich interactive domain cantaining protein 5Bを意味する。
　「FXR」とは、farnesoid X receptorを意味する。
　「H9K9-Me2」とは、ヒストンH3の9番目のリジン残基（H3K9）のジメチル化修飾を意味する。
　「相互作用」とは、グルカゴンシグナル伝達系において複合体を形成する各構成因子（PHF2、ARID5B及びFXR）の少なくとも２つが接触して結合することを意味する。
　「調節」とは、上記相互作用、PHF2のリン酸化、ARID5Bのメチル化若しくは脱メチル化、又はヒストン（ヒストンH3K9)のメチル化若しくは脱メチル化を、促進、抑制又は阻害することを意味する。調節が抑制又は阻害方向に働くと、胆汁酸合成遺伝子及び糖新生遺伝子等の発現が抑制されるため、当該抑制又は阻害作用を有する物質は、糖尿病、高脂血症、組織線維症、動脈硬化等に対する医薬品として使用することができる。調節が促進（亢進）方向に働くと、胆汁酸合成遺伝子及び糖新生遺伝子等の発現が促進されるため、当該促進作用を有する物質は、肝内胆汁うっ滞症、胆汁酸吸着剤との併用による高脂血・糖尿病治療、低血糖症等に対する医薬品として使用することができる（Cariou, B., et al. (2007) Trends. Pharmacol. Sci. 28, 236-243. ）。
　本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下において、PHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体の形成を検出する工程を含む。
　「被検化合物の存在下」とは、被検化合物がPHF2、ARID5B若しくはFXR、又はこれらの複合体に接触できる条件下であることを意味し、PHF2、ARID5B若しくはFXR、又はこれらの複合体を含む反応系に被検化合物を添加すること、PHF2、ARID5B若しくはFXR、又はこれらの複合体を含む細胞（発現可能にこれらの遺伝子が組み込まれた細胞を含む）とともに培養することのいずれをも意味する。
　スクリーニングの対象となる被検化合物の例としては、特に限定されるものではないが、PHF2、ARID5BまたはFXRに親和性を有する化合物であることが好ましい。
　「親和性を有する」とは、PHF2、ARID5B、若しくはFXRに対して、被検化合物が特定の解離定数を持って結合することを意味する。
　被検化合物としては、例えば、天然又は合成の低分子化合物ライブラリー由来の化合物、遺伝子ライブラリーの発現産物（ペプチド、タンパク質等）、天然又は合成のオリゴ核酸、天然又は合成のペプチドライブラリー由来のペプチド、抗体、細菌由来の物質（細菌から代謝により放出される物質等）、微生物、植物細胞抽出液、動物細胞抽出液、培養液（微生物、植物細胞、動物細胞等の培養上清）由来の化合物、土壌中の化合物、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリー等に含まれる化合物などが挙げられる。これらの化合物は新規化合物であっても公知化合物であってもよい。さらに、被検化合物は、化学的、物理的又は生化学的手段により、適当な修飾又は変異が施されたものを使用することも可能である。さらに、被検化合物は、ファーマコフォア検索、又はコンピューターを用いた構造比較プログラムにより同定される化合物であってもよい。さらに、候補化合物は塩や水和物を形成してもよい。
　本発明のスクリーニング方法は、PHF2、ARID5B若しくはFXRを産生する細胞、又はこれらの細胞の細胞調製物を用いて行うことができ、また、PHF2、ARID5B及びFXRから選ばれる少なくとも一つは精製された形態のものを使用することも可能である。「細胞調製物」としては、細胞の培養物、培養細胞の破砕物、培養細胞から分画された細胞質、核などのオルガネラなどが挙げられる。また、PHF2、ARID5B又はFXRを産生する細胞としては、肝臓由来細胞（例えば肝細胞、肝星細胞）、血管内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞（例えば消化管上皮細胞）、脂肪細胞、膵β細胞、膵α細胞及び気管支上皮細胞などが挙げられ、これらの細胞は、PHF2遺伝子、ARID5B遺伝子及びFXR遺伝子のうち少なくとも一つが導入されて発現しているものであってもよい。遺伝子の導入法は当分野で周知であり、容易に実施することができる（Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）。
　また、本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下において、グルカゴン刺激によるPHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体の形成機構に関連する修飾、すなわちPHF2のリン酸化、ARID5Bのメチル化又は脱メチル化、あるいはヒストン（ヒストンH3K9）のメチル化又は脱メチル化を検出する工程を含む。スクリーニングの対象となる化合物としては、例えば、グルカゴン刺激によるPHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体の形成を調節する化合物、グルカゴン刺激によるPHF2のリン酸化を調節する化合物、あるいは、グルカゴン刺激によるARID5Bのメチル化を制御する化合物などがあげられる。本発明のスクリーニング方法は、PHF2及び/又はARID5Bを産生する細胞、あるいはこれらの細胞の細胞調製物を用いてグルカゴン処理下（グルカゴン刺激下）で行うことができ、また、精製された形態のPHF2又はARID5Bと細胞の溶解物とを使用して、PHF2又はARID5Bの修飾レベルを測定することも可能である。PHF2及び/又はARID5Bを産生する細胞や測定に用いる細胞溶解物は、肝臓由来細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞などが挙げられ、また、PHF2遺伝子、またはARID5B遺伝子が導入されて発現しているものであってもよい。
　さらに、本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下において、PHF2/ARID5B/FXR転写共役複合体による転写活性を検出する工程を含む。スクリーニングの対象となる化合物の例としては、PHF2/ARID5BによるH9K9-Me2のメチル化又は脱メチル化を制御する化合物等があげられる。また、前述したPHF2リン酸化制御物質、ARID5Bのメチル化又は脱メチル化制御物質もこれに含まれる。
　FXR転写活性を検出する工程は、FXRの標的遺伝子のプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイ系、FXR標的遺伝子の発現量を指標として測定することが出来る。スクリーニング方法としては、PHF２及びARID5Bを産生する細胞を用いて行うことができ、PHF2及びARID5Bを産生する細胞としては、肝臓由来細胞（肝細胞、肝星細胞等）、血管内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞（消化管上皮細胞等）、脂肪細胞、膵β細胞、膵α細胞及び気管支上皮細胞などが挙げられる。またPHF2遺伝子、またはARID5B遺伝子が導入されて発現しているものであってもよい。ここで、FXR標的遺伝子の例としては、SHP（small heterodimer partner）遺伝子などが挙げられる。
　また、PHF2/ARID5B/FXR転写共役複合体による転写活性を検出する工程は、PHF2、ARID5B及びFXRのうち少なくとも１つ（好ましくはPHF2及びARID5B）を過剰発現させてFXRを介する転写活性を測定し、当該転写活性が抑制又は亢進されることを検出することを含む。
　本明細書において、「FXRを介する転写」とは、FXRが認識する配列の転写を意味する。FXRが活性化又は抑制化されることにより、FXRが認識する配列の転写活性が促進又は抑制する。従って、PHF2、ARID5B及びFXRが結合して複合体が形成されることにより特異的に生じる転写活性の促進又は抑制は、「FXRを介する転写」に含まれる。かかるFXR認識配列を含むDNA領域の転写を評価することにより、FXRを介する転写活性が亢進されたか、抑制されたかどうかを評価することができる。またFXRを介する転写活性は、FXRのうちDNA結合活性以外の受容体機能に必要な領域を人為的に残し、それ以外のFXRのDNA結合領域等を、GAL4 DNA結合ドメイン等の実験室的に用いられる転写調節遺伝子に置換することにより、レポーター遺伝子アッセイ系で測定することができる。かかるレポーター遺伝子アッセイ系は、FXRまたは被検化合物それぞれにより生じ得るノイズとなる反応を減少し得る点で好ましい。さらに、FXRを介する転写活性を測定するためのその他の方法として、哺乳類細胞でのTwo-hybridアッセイ法(The Journal Of Biological Chemistry，274, 2376-32381, 1999) 酵母細胞でのTwo-hybridアッセイ法(Molecular Endocrinology, 11, 366-78, 1997)などの方法を採用することができる。当業者であればこれらの方法を適宜選択して転写活性を指標としたスクリーニング系を構築することが可能である。
　さらに、本発明のスクリーニング方法は、前述の通り、PHF2と、ARID5Bと、FXRとの複合体による転写活性の調節（阻害又は促進）を、レポーター遺伝子アッセイ系で測定することができる。レポーター遺伝子とは、プロモーターやエンハンサーの転写活性などを調べるためにDNAへ組み込まれる目印用の遺伝子であり、その発現量を測定できる遺伝子であれば特に限定されず、一般的には検出が簡単で定量化可能なものが好ましい。かかるレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、CAT (クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子、β-Gal (β-ガラクトシダーゼ)遺伝子、ｈGH (分泌型ヒト成長ホルモン)遺伝子、SEAP (ヒト分泌型アルカリフォスファターゼ)遺伝子、GFP (グリーンフルオレッセントタンパク質)遺伝子、およびGUS (β－グルクロニダーゼ)遺伝子などがあげられる。
　レポーター遺伝子を使用するアッセイは、当業者であれば適宜実施することができる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用するアッセイは、細胞抽出液に基質と酸素を与えて発光反応を起こさせ、発光の度合いを測定してルシフェラーゼの発現量を評価する。これにより、FXRを介する転写活性の調節を評価することができる。
　さらに本発明は、SHP2とARID5BとFXRとの複合体による、FXRを介する転写活性の亢進又は抑制に関与する疾患の治療薬にも関する。該SHP2、ARID5B及びFXRから構成される複合体によるFXRを介する転写活性に関与する疾患としては、例えば、2型糖尿病、腎線維症、肺線維症、肝硬変、NASH、高脂血症等があげられる。
　ここで、FXR認識配列とは、FXRが結合するDNA配列を意味し、より好ましくはPHF2とARID5BとFXRとの複合体においてFXRが結合する配列である。このようなFXR認識部位の配列としては、ヒトPPARαのプロモーター／エンハンサー領域に存在するFXR認識配列：GATCCCGGTGTCCCATCGGTGACCTTGGACA（配列番号７） (Torra, IP., et al. (2003) Mol. Endocrinol. 17, 259-272)、ラットcholesterol 7α-hydroxylaseプロモーター領域における2箇所のFXR認識配列：TGGACTTAGTTCAAG（配列番号８）、TCAAGTTCAAG（配列番号９）(Antonio del Castillo-Olivares, et al. (2000) Nucleic. Acids. Res. 28, 3587-3593)、ヒトApo-CIIIプロモーター領域に存在するFXR認識配列：GGATGTTATCAGTGGGTCCAGAGGGCAAAATAG（配列番号１０） (Claudel, T., et al. (2003) Gastroenterology 125, 544-555)、ヒトSHPプロモーター領域に存在するFXR認識配列：CCTGGTACAGCCTGAGTTAATGACCTTGTTTATCC（配列番号１１） (Goodwin, B., et al. (2000) Mol. Cell 6, 517-526)などの塩基配列を含むものが例示される。
　但し、FXR認識配列は、FXRとPHF2とARID5Bとの複合体が結合する配列であれば上記に例示に限定されるものではなく、当業者であれば適宜それらの部分配列の組み合わせや一部の変異塩基の導入、また他の配列などを選択することも可能である。
　前記レポーター遺伝子の産物を検出するための試薬としては、レポーター産物を検出するための基質、細胞固定液、細胞溶解液、及び試料を希釈するための緩衝液などの中から必要なものが選択される。レポーター遺伝子ルシフェラーゼ遺伝子、CAT (クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子、β-Gal (β-ガラクトシダーゼ)遺伝子、SEAP (ヒト分泌型アルカリフォスファターゼ)遺伝子、およびGUS (β-グルクロニダーゼ)遺伝子を用いた場合には、レポーター産物を検出するための基質としてそれぞれの酵素と反応する基質を用いることができる。それぞれの酵素についての基質は、試薬メーカーから提供されている。この場合、レポーター遺伝子の発現誘導の程度は、基質の反応によって計測され、基質の種類に応じて放射能、発色、蛍光、発光などのパラメーターで測定することが可能である。またレポーター遺伝子の発現による産物がタンパク質の場合には、EIA法やELISA法などの免疫学的測定によっても計測が可能であり、そのための試薬については当業者であれば適宜選択して含めることが可能である。さらにレポーター遺伝子の発現を転写産物であるmRNAで測定することも可能であり、そのためのプライマー・プローブ・競合プローブなどの試薬については、当業者であれば適宜選択して含めることが可能である。
　本発明は、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質及び/又は該タンパク質をコードする遺伝子を含む、本発明のスクリーニング方法に使用するためのキットを提供する。
　本発明のキットには、付加的な要素として遺伝子産物検出用試薬、陽性対照、陰性対照、反応容器、光学的解析のためのフィルター、アッセイプロトコルを記載した指示書などを適宜含めることができる。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
　なお、当該スクリーニングを行うキットとしては、哺乳類細胞でのOne-hybridシステム、Two-hybridシステムや酵母のTwo-hybridシステムなどの方法も考えられ、当業者であればそれらの選択されたスクリーニング方法に適した形のキットを構築することができる。
　ここで、PHF2、ARID5B及びFXRのアミノ酸配列及び塩基配列を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明においては、配列番号１、２又は３に示される塩基配列の全長配列を使用することができ、あるいはアミノ酸へのコード領域（翻訳領域）を使用することもできる。例えば、配列番号１における翻訳領域は148～3438番であり、配列番号３における翻訳領域は、27～3593番であり、配列番号５における翻訳領域は、349～1767番である。また、本発明においてはPHF2、ARID5B及びFXRのそれぞれの部分ペプチドも使用することができる。
　PHF2の部分ペプチドは、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列の第1番～第364番の領域（配列番号１に示す塩基配列の148～1239番によりコードされる）、ARID5Bの部分ペプチドは、例えば配列番号4に示されるアミノ酸配列の第319番～第678番の領域（配列番号３に示す塩基配列の981～2060番によりコードされる）、FXRの部分ペプチドは、例えば配列番号6に示されるアミノ酸配列の第292番～第468番の領域（配列番号５に示す塩基配列の1222～1752番によりコードされる）のものが挙げられるが、これらの配列には限定されるものではなく、適宜選択することが可能である。
　さらに、本発明は、上記PHF2、ARID5B及びFXRの変異型を使用することもできる。「変異型」とは、PHF2、ARID5B及びFXRのそれぞれのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、それぞれの構成因子又はその複合体としての活性を有するタンパク質、あるいは、PHF2、ARID5B及びFXRのそれぞれのアミノ酸配列において少なくとも80％のホモロジーを有し、かつ、それぞれの構成因子又はその複合体としての活性を有するタンパク質を意味する。
例えば、PHF2、ARID5B及びFXRの変異型は、それぞれ、配列番号２、配列番号４、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列、又はこれらの部分ペプチドのアミノ酸配列と約80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは約95％以上、さらに好ましくは約98％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、それぞれPHF2活性、ARID5B活性及びFXR活性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
　ホモロジーは、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる。例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索が利用できる。また、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列の他、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば１個又は数個）のアミノ酸に欠失、挿入、置換若しくは付加等の変異、又はこれらの組み合わせ変異が生じたアミノ酸配列であって、それぞれPHF2活性、ARID5B活性及びFXR活性を有するタンパク質のアミノ酸配列が挙げられる。
　例えば、(i) 配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列又はそれらの部分ペプチド中の1～10個（好ましくは1～5個、さらに好ましくは1～3個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii) 配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列又はそれらの部分ペプチドに1～10個（好ましくは1～5個、さらに好ましくは1～3個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii) 配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列又はこれらの部分ペプチドに1～10個（好ましくは1～5個、さらに好ましくは1～3個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv) 配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列又はこれらの部分ペプチド中の1～10個（好ましくは1～5個、さらに好ましくは1～3個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(v) 上記(i)～(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
　ここで、「PHF2活性」、「ARID5B活性」及び「FXR活性」とは、図１に示すシグナル伝達経路（グルカゴンがレセプターに結合した後のシグナル伝達経路）に関与する活性、すなわち、グルカゴンシグナルなどの下流に存在するPKAシグナルを介してPHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体を形成し、FXR標的遺伝子プロモーターへに結合する活性、及び/又はFXR転写活性を意味し、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列のタンパク質の活性と比較して、少なくとも30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
　さらに、本発明において使用可能な変異型DNAとして、配列番号１、３又は５に示される塩基配列若しくはそのコード領域の配列、又はこれらの部分配列、あるいはこれらの配列又は部分配列に相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれPHF2活性、ARID5B活性及びFXR活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
　このようなポリヌクレオチドは、配列番号１、３若しくは５に示される塩基配列又はこれらのコード領域からなるポリヌクレオチド、あるいはそれらの断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により得ることができる。これらの方法については、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))を参照することができる。
　本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、DNA濃度、DNAの長さ、反応時間等の条件を適宜設定することができる。
　ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することができる。
　ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号１、３又は５に示される塩基配列又はその部分配列、あるいはそれらに相補的な塩基配列に対して、少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、さらに好ましくは90％(例えば、95％以上、さらには99％以上)の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　以下、本発明を実施の形態に即し詳細に説明する。
スクリーニング方法(I)
　本発明のスクリーニング方法(I)は、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも２つのタンパク質（複合体を構成する因子又はエレメント）を被検物質の存在下で接触させ、これらのタンパク質の複合体の形成を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含むものである。
　本発明者の見出した知見に基づき、グルカゴンシグナル依存的な構成因子（FXR、PHF2、ARID5B）による転写共役因子複合体の形成を調節して、FXR標的遺伝子プロモーターへの結合を制御することによって、FXRを介する遺伝子発現、又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する化合物を取得することができる。
　上記スクリーニング方法(I)の態様によれば、蛋白質間の相互作用（結合）を測定しうる系であれば、目的とするPHF2、ARID5B及びFXRの相互作用を調節（促進又は抑制）する物質の検索が可能である。そのような測定系としては、細胞系も無細胞系も可能であり、ELISA、RIA、SPA法、BIACORETM、蛍光偏光法、Two-Hybrid Systemなどを採用することができる。また、PHF2、ARID5B及びFXRのそれぞれの部分ペプチドであっても実施可能である。
　さらに、PHF2、ARID5B及びFXRのそれぞれの部分ペプチドはFLAG-、HA-、 His-、免疫グロブリンのFc部分-、GST-、GFP 等のtagないし標識蛋白/ペプチドとの融合蛋白質として用いることも可能である。  
　FXR、SHF2及びARID5Bのそれぞれの相互作用（結合）に影響を及ぼす物質のスクリーニングには「Two-Hybrid System」(Gyuris, J., Cell, 1993, 75: 791-803; Golemis, E. A., Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Sons, Inc.], 1996, Ch.20.0 and 20.1)を用いることが可能である。
　一般に、「Two-Hybrid System」を用いて蛋白質AとＢとの結合に影響を与える物質を検索する原理は概ね以下の通りである。
　上記の転写活性化ドメインと蛋白質Aとの融合蛋白の発現ベクター、上記DNA結合ドメインと蛋白質Bとの融合蛋白の発現ベクター、及び適当なレポーター遺伝子からなる発現ユニットを核内に保持する真核生物宿主を準備する。レポーター遺伝子は両融合蛋白質が結合した際に活性化されるプロモーター領域と該プロモーター領域の下流に連結したレポーター遺伝子とからなる発現ユニットとして構築される。該レポーター遺伝子の発現を検出し、発現量に影響を与える物質を選択することで蛋白質AとＢとの結合に影響を与える物質を検索することが可能である。
　「Two-Hybrid System」に用いる転写活性化ドメインとしては、例えば、GAL4の転写活性化ドメイン（Brent,R., Cell,1985, 43: 729-736）、[Bicoid], [c-Fos],[c-myc], [v-Myc], [B6], [B7], [B42](Golemis, A. E., Mol. Cell Biol., 1992,12:3006-3014)、または[VP16](CLONTECH社,Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit)などが挙げられる。また「Two-Hybrid System」に用いるDNA結合ドメインとしては、例えば、GAL4(Giniger, E., Cell, 1985, 40: 767-774)、p53(Chumakov, P. M., Genetika, 1988, 24: 602-612), GCN4(Hinnenbush, A.G., Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81: 6442-6446), VP16 (Triezeneberg, S. J., Genes. Dev., 1988, 2: 718-729)、ReloA (Nolan, G. P., Cell, 1991, 64: 961-969)、Oct-1 (Strum, R. A., Genes. Dev., 1988, 2: 1582-1599)、c-Myc (Watt, R., Nature, 1983, 303:725-728)、c-Jun(Angel, P., Cell, 1988, 55: 875-885)、MyoD (Write, W. E., Cell, 1989, 56: 607-617)などの転写因子において同定されているものが挙げられる。
　また、PHF2とARID5Bとの複合体の形成は、被検化合物がPHF2とARID5Bとの結合を量的または速度論的に亢進する作用として検出することができる。
　FXR、PHF2及びARID5B転写共役因子複合体の形成を量的に解析する系としては、例えば、プルダウンアッセイ（Molecular And Cellular Biology, Oct. 2004, p. 8847-8861）や免疫沈降法（The Journal of Biological Chemistry Vol. 276, Issue 31, 28835-28841, August 3, 2001）などの方法を用いることができる。例えばプルダウンアッセイにおいては、GST－リン酸化PHF2と被検化合物の存在下又は非存在下で、精製されたメチル化ARID5B又は精製されたFXR、或いは、グルカゴン刺激を加えたHepG2などの細胞抽出物などを反応させ、グルタチオン結合レジンを用いてGST－リン酸化PHF2を沈降させ、結合したARID5BまたはFXRをウエスタンブロティングなどの方法で検出することによって、リン酸化PHF2と結合したメチル化ARID５B又はFXRの量を検出することが可能である。このプルダウンアッセイに用いるGST化タンパクは、PHF2、ARID5B及びFXRの中から自由に選択することができる。
　FXRと、PHF2と、ARID5Bとの間の結合を速度論的に解析する系としては、例えば表面プラズモン共鳴法などを使う方法も挙げられる（The Journal of Biological Chemistry Vol. 278, Issue 15， 13271－13277, April 11, 2003）。この方法では、例えばBiacore（登録商標）（Biacore AB）タンパク質相互作用解析システムにおいてリン酸化PHF2をセンサーチップ上に固定化する。このセンサーチップと被検化合物とを反応させた後に、あるいは被検化合物をセンサーチップ上に共存させた状態で、精製されたメチル化ARID5B若しくはFXR、又はグルカゴン刺激を加えたHepG2などの細胞抽出物を反応させ、シグナルを得る。そして、得られたシグナルから、リン酸化PHF2と、FXRまたはARID5Bと間の結合速度・解離速度や、FXR又はARID5Bの結合量などを測定する。このセンサーチップに固定するタンパク質は、上記リン酸化PHF2に限定されるものではなく、PHF2、ARID5B及びFXRの中から自由に選択することができる。
　さらに、GST-FXR、GST-PHF2またはGST-ARID5B融合分子と、標識FXR、標識PHF2または標識ARID5Bとを用いたGST-プルダウン法を用い、両分子を反応させる際に、被検物質を反応系に加え、両分子の結合を修飾するか否かを測定することにより、FXRを介する遺伝子発現、グルカゴンシグナル伝達系を調節する化合物を取得することができる。なお、GST-プルダウン法に限らず、蛋白質間の相互作用（結合）を測定しうる系であれば、目的とするPHF2、ARID5B、FXRの相互作用を促進あるいは抑制する物質の検索は可能である。そのような測定系としては、細胞系も無細胞系も可能であり、ELISA、RIA、SPA法、BIACORE（登録商標）、蛍光偏光法、Two-Hybrid Systemなどが挙げられる。また、PHF2、ARID5B及びFXRのそれぞれの部分ペプチド（配列は前記の通り）であっても実施可能である。さらにPHF2、ARID5B及びFXRのそれぞれの部分ペプチドはFLAG-、HA-、 His-、免疫グロブリンのFc部分-、GST-、GFP 等のtagないし標識蛋白/ペプチドとの融合蛋白質として用いることも可能である。  
　FXRとPHF2とARID5Bと間の結合を検出するその他のスクリーニング系の例としては、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法が挙げられる（The Journal Of Biological Chemistry, Vol. 275，　Issue 52, 41114-41123, December 29, 2000）。例えば、PHF2と、FXR又はARID5Bとをそれぞれgreen fluorescent protein (GFP)およびblue fluorescent protein (BFP)との融合タンパク質として発現させ、それらの融合タンパク質が存在する状態で、被検化合物を反応させた時のPHF2とFXRまたはARID5Bとの結合を検出することができる。この場合、PHF2とFXRまたはARID5Bと間の結合が亢進した状態は、(1)融合タンパク質として発現しているBFPの励起波長（370-390 nm付近）の励起光を当てたときのBFPの蛍光波長（435-485 nM付近）の光強度の減少、および／または(2)GFPの蛍光波長（515-555 nM付近）の光強度の上昇を計測することによって測定することができる。
　また、PHF2-GFP融合タンパク質、及びFXR-BFPまたはARID5B-BFPの融合タンパク質が存在している状態で、被検化合物を反応させて所定時間が経過したときに、BFPの蛍光波長における光強度の減少、および／またはPHF2の蛍光波長での光強度の上昇を測定することによって、PHF2とFXRまたはARID5Bとの結合の速度を測定することも可能である。
　さらに、細胞内でPHF2-GFP融合タンパク質、およびFXR-BFPまたはARID5B-BFPの融合タンパク質を発現させ、被検化合物を反応させたときに、蛍光顕微鏡を用いて観察することによって、細胞内の局所、例えば核内においてのPHF2とFXRまたはARID5Bとの結合を観察することも可能であり、イメージアナライザーなどとの組み合わせによって、その蛍光強度の増減を測定することも可能である。
　FXR、PHF2及びARID5B間の結合を量的に解析する系においては、FXR、PHF2及びARID5Bの全てを産生する細胞または該細胞の細胞調製物を用いて行なうことが可能である。但し、PHF2、FXR及びARID5Bのうち少なくとも１つを遺伝子発現等により製造し、精製されたものを用いることも可能である。FXR、PHF2またはARID5Bを製造する方法としては、FXR、PHF2若しくはARID5Bのタンパク質又はこれらのタンパク質の部分ペプチドをコードする遺伝子（例えば前記配列番号を有する遺伝子）を適宜発現用ベクター内にそれらのタンパク質が発現するのに適した形状で組み込んだベクターを作製し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、大腸菌等の微生物などのいずれかに導入した形質転換体を作製して、その形質転換体を培養する方法が例示できる。また、インビトロ翻訳反応系に代表される無細胞系タンパク質合成による製造方法を採用することができる。例えば、FXR、PHF2またはARID5Bタンパク質をコードする遺伝子の５’上流に転写調節を制御する配列、好ましくはＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター等を付加し、その遺伝子を細胞内又はインビトロにおいて転写することでFXR、PHF2またはARID5Bタンパク質をコードするRNA分子を作製し、小麦胚芽、大腸菌、網状赤血球などから調製されたインビトロ転写反応用の細胞抽出物を用いる（澤崎等　蛋白質・核酸・酵素　2003年　48巻　p549－554）。無細胞系タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
　このような形質転換体または無細胞系タンパク合成により生産されたPHF2またはARID5Bは、所望によりその物理学的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作[日本生化学会編　「生化学データブックII」第１版第１刷、株式会社東京化学同人　1980年6月23日発行　ｐ1175～1259；Arakawa等　バイオケミストリー（Biochemistry）（USA）1986年12月16日発行25巻25号ｐ8274～8277 (1986); ラングレイ（Langley）等　ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Europian Journal of Biochemistry）（Germany）1987年3月2日発行　163巻2号　ｐ313～321等参照]により分離、精製することができる。精製方法としては、例えば通常の再構成処理、タンパク質沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外ろ過、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合わせ等を例示できる。前記ポリペプチドとのアフィニティーを利用する精製には、たとえば、前述の前記ポリペプチドと結合する抗体を用いることができ、該ポリペプチドと該抗体との脱着によりアフィニティ精製することができる。
　また、FXR、PHF2またはARID5Bを調製するその他の方法して、FXR、PHF2またはARID5Bがアフィニティータグを融合した形になるように形質転換体または無細胞系タンパク合成で産生させ、該FXR、PHF2またはARID5Bを分離、精製する方法を例示することができる。このようなアフィニティータグが融合した形でFXR、PHF2またはARID5Bを発現させれば、このタグを利用するアフィニティー精製を実施することが可能である。該アフィニティータグとしては、Glutathione-S-Transferase（GST）、ポリヒスチジンタグ（Hisタグ、シスク(Sisk)等　ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー（Journal of Virology）（USA）　1994年2月発行　68巻2号　ｐ766～775）およびＦＬＡＧタグ（ホップ（Hopp）等 バイオテクノロジー（Biotechnology）1988年発行 6巻 ｐ1204～1210）があげられる。これらの方法において、GSTを融合したタンパク質の場合は、グルタチオン固定化担体を用いることによって、GSTと該グルタチオン結合担体との吸着・脱着反応を用いて精製することができ、Hisタグ融合タンパク質の場合には、金属イオンキレート担体を用いることによってHisタグと該金属イオンキレート担体との吸着・脱着反応を用いて精製することができ、FLAGタグ融合タンパク質の場合には、抗FLAGタグ抗体の結合した担体を用いることによって、FLAGタグと該抗体の結合した担体との吸着・脱着反応により精製することができる。
スクリーニング法(II)
　本発明のスクリーニング法(II)の態様は、PHF2とプロテインキナーゼとを被検物質の存在下で接触させ、PHF2のリン酸化を検出し、得られる検出結果から当該PHF2のリン酸化を調節する物質を選択する工程を含む。また、本態様は、PHF2とプロテインキナーゼとを被検物質の存在下で接触させ、PHF2のリン酸化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む。
　本発明の方法により、グルカゴン刺激によるPHF2のリン酸化を指標として、PHF2のリン酸化調節物質をスクリーニングすることができる。また、リン酸化後に続くPHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体化により、複合体を形成するそれぞれの構成因子の相互作用、及び、FXRの標的遺伝子の発現量に影響を与える物質をスクリーニングすることが可能となる。この態様は、グルカゴン刺激によるFXR活性化にはPHF2のリン酸化が重要であるという知見に基づく。
　本発明の方法によれば、例えばHepG2などの細胞を被検化合物の存在下、または非存在下にてグルカゴンで刺激後、PHF2特異的抗体を用いてPHF2を免疫沈降し、抗リン酸化抗体を用いたウエスタンブロット法などによって、PHF2リン酸化状態を定量することでFXRによる遺伝子発現調節を予測することができる。その結果、例えば、リン酸化状態が抑制された場合には、FXRのターゲット遺伝子の一つであるSHPの発現低下を介して、胆汁酸合成が促進され、血中コレステロール低下剤のスクリーニングに有用であることが期待される。
　また、同様にPHF2のリン酸化状態を指標として、グルカゴンシグナル伝達系を調節する化合物を取得可能である。
スクリーニング法(III)
　本発明のスクリーニング法(III)の態様は、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも２つのタンパク質（複合体の構成因子）を被検物質の存在下で接触させ、これらのタンパク質の複合体の形成を検出し、得られる検出結果から当該タンパク質の相互作用を調節する物質を選択する工程を含む。
　本発明の方法は、抗原抗体反応を用いてスクリーニングすることが可能である。例えば、細胞内でPHF2、ARID5B及びFXRを発現させ、一定時間被検物質と共に培養した後、細胞を破砕して細胞溶解液を調製する。PHF2、ARID5B及びFXRのうちいずれかのエレメント（分子）に対する抗体で免疫沈降させ、沈殿中に含まれる他方の分子をウエスタンブロットなど免疫学的方法で検出ないし定量する。これにより、被検物質の各分子間相互作用（PHF2-ARID5B、PHF2-FXR、ARID5B-FXR、PHF2-ARID5B-FXR）に及ぼす影響を検出することが可能である。
　各分子間の結合を誘導する物質の検索は、上記培養系に被検物質を単独で添加し、上記実験を行い、被検化合物を含まない細胞からの免疫沈降物と比較することで、容易に達成される。また、各分子の結合を調節（促進又は抑制若しくは阻害）する物質は、適当な被検化合物を上記培養系に添加して上記実験を行い、被検化合物を含まない細胞からの免疫沈降物と比較することで検索することが可能である。
　PHF2、ARID5B及びFXRは、FLAG-、HA-、 His-、免疫グロブリンのFc部分-、GST-、GFP 等のtagないし標識蛋白/ペプチドとの融合蛋白として発現させて用いることも可能であり、その際免疫沈降あるいは免疫学的検出に用いる抗体はそれらtagを認識する抗体であってもかまわない。また、抗体による免疫沈降の代わりに、ビーズ等の固層にNiやグルタチオンを固定化して目的蛋白質複合体を補足することも可能である。さらに、目的蛋白質の検出にあたっては、融合させたtag/標識蛋白質/ペプチドの特性を利用して、その酵素活性や蛍光活性による検出も可能である。
　免疫沈降物ないし上記に述べた方法で得たPHF2-ARID5B、PHF2-FXR、ARID5B-FXR、PHF2-ARID5B-FXR複合体から、これらの複合体間で相互作用する構成因子を検出あるいは定量する際、当該構成因子は、SDS - ポリアクリルアミドゲル電気泳動により複合体より分離してウェスタンブロットにより検出することが出来る。また、ELISAやRIAによる定量も可能である。
　簡便な実験法として、ELISAプレートやビーズに、複合体の一方の蛋白質分子ないし融合蛋白質分子を認識する抗体、Ni、グルタチオン等を固定し、上記細胞溶解液中のPHF2-ARID5B、PHF2-FXR、ARID5B-FXR又はPHF2-ARID5B-FXR複合体を捕捉する。次に、複合体の他方の蛋白分子を認識する抗体等を用いて、捕捉された複合体中のエレメント（目的蛋白質分子）を検出・定量することが出来る。検出には、通常行われているごとく、酵素やラジオアイソトープ等の標識抗体を用いた直接定量法や、標識された２次抗体を用いた間接定量法、あるいはビオチン標識した抗体を用い標識アビジンにより定量するビオチン-アビジン法等を用いることが出来る。また、一方の蛋白質分子をGFP等の蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現させれば、他方の分子を認識する抗体等で固層にPHF2-ARID5B、PHF2-FXR、ARID5B-FXR、PHF2-ARID5B-FXR複合体を捕捉した後、直接蛍光活性を測定することでPHF2、ARID5B、FXRの相互作用（結合状態）を評価することが出来る。
スクリーニング方法（IV）
　本発明のスクリーニング法(IV) の態様は、PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用するヒストンのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果から当該ヒストンのメチル化又は脱メチル化を調節する物質を選択する工程を含む。また、本態様は、PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用するヒストンのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む。
　本発明の態様においては、PHF2によるグルカゴンシグナル依存的なヒストンH3K9-Me2の脱メチルを調節してFXR標的遺伝子群の発現を調節する物質のスクリーニングが可能である。本方法は、グルカゴン刺激によるFXR活性化にはPHF2によるヒストンH3K9の脱メチル化が重要であるという知見に基づく。
　例えば、HepG2などの細胞を被検化合物の存在下または非存在下にて、グルカゴンで刺激後、クロマチン画分を取得する。その後、抗メチル化ヒストン抗体を用いたウエスタンブロット法などによって、ヒストンH3K9の脱メチル化状態又はメチル化状態を定量する。これにより、FXRを介する遺伝子発現、グルカゴンシグナル伝達系を制御する化合物を取得することが可能である。
スクリーニング方法（V）
　本発明のスクリーニング法(V) の態様は、PHF2とARID5Bとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果から当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を調節する物質を選択する工程を含む。また、本態様は、PHF2とARID5Bとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む。
　本発明の態様によれば、PHF2によるグルカゴンシグナル依存的なARID5Bの脱メチル化を調節して、PHF2/ARID5B/FXR転写因子複合体のFXR標的遺伝子プロモーターへの結合、及びFXR標的遺伝子群の発現を調節する物質のスクリーニングが可能である。本発明は、グルカゴン刺激によるFXR活性化にはPHF2によるARID5Bの脱メチル化が重要であるという知見に基づく。
　例えば、HepG2などの細胞を被検化合物の存在下または非存在下にて、グルカゴンで刺激後、細胞溶解液を取得する。その後、抗メチル化リジン抗体を用いたウエスタンブロット法などによって、ARID5Bの脱メチル化状態又はメチル化状態を定量する。これにより、FXRを介する遺伝子発現、グルカゴンシグナル伝達系を制御する化合物を取得することが可能である。
スクリーニング方法（VI）
　本発明のスクリーニング方法（VI）の態様は、PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用する遺伝子の転写活性を検出し、得られる検出結果から当該転写活性を調節する物質を選択する工程を含む。本発明の方法は、PHF2、ARID5B、FXRを発現させた細胞を用い、例えばレポーターアッセイによってスクリーニングすることができる。
　本発明の態様においては、被検化合物、及びグルカゴンシグナル存在下でPHF2/ARID5B/FXR転写共役複合体による転写活性を検出する工程を含む、グルカゴンシグナルによるPHF2/ARID5B/FXR転写共役複合体の転写活性を抑制、又は促進する化合物のスクリーニングが可能である。本発明のスクリーニング方法の目的は、グルカゴンシグナル存在下におけるPHF2/ARID5B/FXR転写共役複合体による転写活性を阻害、または亢進する化合物の取得であり、PHF2/ARID5B/FXR転写共役複合体の転写活性がグルカゴンシグナルによるPHF2のリン酸化、ARID5Bのメチル化、およびH3K9脱メチル化に依存しているという知見に基づく。かかるグルカゴンシグナルの存在によりFXRを介する転写活性が亢進されるため、本発明のスクリーニング系によって選択される化合物の形態としては、a)PHF2リン酸化阻害剤もしくは促進剤、b)ARID5Bメチル化阻害剤もしくは促進剤、c)H3K9脱メチル化阻害剤もしくは促進剤、およびd)グルカゴンシグナル存在下においてのみ作用するFXRリガンドを挙げることができる。
　従来の方法では、非特異的にFXR制御遺伝子の発現を変化させる化合物が取得されてしまうのに対し、本方法は、PHF2、ARID5B及びFXRを用いるレポーターアッセイを行うため、上記a)、b)、c）、d)の化合物を一度にスクリーニングすることが可能である。
スクリーニング方法（VII）
　本発明のスクリーニング法(VII) の態様は、PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用する遺伝子の転写活性を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む。
　本発明の態様によれば、PHF2、またはARID5Bの細胞内における発現量を、免疫学的手法を用いて検出し、FXRの転写活性を制御する化合物のスクリーニングが可能である。本発明は、グルカゴン刺激によるFXR活性化にはPHF2とARID5Bの存在が重要であるという知見に基づく。
　例えば、HepG2などの細胞を被検化合物の存在下または非存在下にて、グルカゴンで刺激後、細胞溶解液を取得する。次に、抗PHF2抗体、または、抗ARID5Bによって各タンパク質の発現量を定量する。定量値に応じて、FXRを介する遺伝子発現を制御する化合物、あるいはグルカゴンシグナル伝達系を制御する化合物を取得することが可能である。発現量の定量法としては、ウエスタンブロット法、EIA法、ELISA法などを利用できる。
　本発明は、PHF2、又はPHF2とARID5Bとの複合体を含む脱メチル化剤を提供する。本発明は、PHFがヒストン脱メチル化酵素として作用することを見出すことにより完成されたものである。また、本発明は、PHF2/ARID5B複合体は、グルカゴン刺激によってヒストン脱メチル化活性を発揮するという知見に基づき完成されたものである。
　従って、上記PHF2又は複合体は、脱メチル化用試薬として使用することができる。具体的には、本発明のスクリーニング方法において使用される態様が挙げられる。例えば、PHF2をヒストンH3K9-Me2等に作用させ、イムノブロッティング、ラジオイムノアッセイ法等によりヒストンが脱メチル化されているかどうかを検出することができる。
　また、PHF2/ARID5B複合体を発現する細胞にグルカゴンを作用させ、イムノブロッティング、ラジオイムノアッセイ等によりヒストンが脱メチル化されているかどうかを検出することができる。
　以下、実施例を挙げてこの発明を詳細に説明するが、この発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。  
グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）・ヒスチジンタグ（His）融合FXR　DE領域を用いたタンパク質複合体精製
　まず、FXR相互作用因子複合体を精製するためのbaitとして用いるGST・Hisタグ融合FXRを大腸菌内に発現させた。マウスFXR DE領域をコードするDNA配列（配列番号５の924～1738番目の塩基配列（配列番号１２））、及び６ｘヒスチジンタグが組み込まれたpGEX-4T-1 (Promega社)ベクター （GST-FXR (DE)-His vector）をRosetta2 (DE3) pLysS大腸菌株(Novagen社、カタログ番号71403-3)にトランスフォーメーションした。この大腸菌株をLB (+Ampicillin)培地にて37 ℃で培養し、O.D.600 nm=0.4～0.5となった時点でIPTGを終濃度0.1 mMとなるように加え、27 ℃にて90分間培養した。以降の操作は4 ℃にて行った。
　大腸菌を集菌後、LEW buffer (MACHREY-NAGEL社; 50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、0.05 % Tween20、1 mM 2-mercaptoethanol、protease inhibitor cocktail、pH 8.0)に懸濁した後、Lysozymeを終濃度1 mg/mlとなるように加えて、rotatorにて30分間インキュベートした。ソニケーターにて破砕後、8000 rpmにて20分間遠心し、上清を回収した。この上清をProtino Ni-TED column (MACHREY-NAGEL社)にコンタクトし、columnをLEW bufferにて洗浄した後、Elution buffer (MACHREY-NAGEL社; 50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、250 mM imidazole、1 mM 2-mercaptoethanol、protease inhibitor cocktail、pH 8.0)にて溶出させた。これにGlutathion Sepharose 4B (Amersham Biosciences社)を加え、rotatorにて30 分間インキュベートした後、LEW bufferにて洗浄し、「GST-FXR (DE)-His resin」とした。対照として、FXR DE領域が融合していないGST・Hisタグのみを発現するpGEX-4T-1ベクターを用いて同様の操作をすることにより、「GST-His resin」を作製した。精製したGST-His resin、GST-FXR(DE)-His resinについてSDS-PAGEを行い、銀染色したところ、図２に示したようにバンドが確認された。
GST-FXR(DE)-Hisと相互作用する因子の精製と同定
　大量培養したHepG2細胞から取得した核抽出物227mgを遊離のGlutathion Sepharose 4B resinと1 時間コンタクトした後、遊離のresinを取り除き、GST-His resinと更に2 時間コンタクトすることにより、resin、GST又はHisと非特異的に結合するタンパクを除去した。フロースルーをFXRリガンドの存在下、GST-FXR (DE)-His resinと4 時間コンタクトした後、カラムを用いてresinをbuffer D (20 mM HEPES [pH 7.5]、150 mM KCl、0.2 mM EDTA、10 % glycerol、0.05 % NP40、protease inhibitor cocktail)にて3 回洗浄し、更にresinを1.5 mlチューブに移してバッチ法にて5 回洗浄した。これに、glutathion溶液(15 mM glutathion、20 mM HEPES、150 mM KCl、0.2 mM EDTA、10 % glycerol、0.05 % NP40、protease inhibitor cocktail、pH 8.3)を加えて30 分間インキュベートした。上清を回収し、resinに再度glutathion溶液を加えて同様に30 分間インキュベートした。この操作を3回行って得られた溶出液を10～40 % グリセロール濃度勾配のグリセロール密度勾配遠心法にかけて、フラクション分けした。次に、この精製サンプル溶液に対して等量のTCA溶液(20 % trichloroacetic acid、80 % acetone) を加えて、-20 ℃で2 時間置いた後、12000 rpm、4 ℃で30 分間遠心した。上清を捨て、ペレットにacetoneを加えて、12000 rpm、4 ℃で30 分間遠心し洗浄した。ペレットを乾燥させた後、SDS-PAGE、銀染色を行った結果、分子量約500 kDa付近（フラクションNo 11, 12）にFXR相互因子複合体を検出した（図３）。
　この500 kDaから成るFXR複合体の構成因子を同定するために、下記のようにMALDI-TOF/MSによる解析を行った。
　精製サンプルをSDS-PAGEにて展開後、泳動ゲルをSilverQuest (Invitrogen)により銀染色した。染色バンドを切り出し、low retention tubeに入れた。このゲルを脱銀処理し、MQで3 回洗浄した後、acetonitrileを100 μl加えて15 分間置いた。その間、時々攪拌した。その後、上清を捨て、スピードバックを用いて乾固させた。これに還元反応溶液(10 mM DTT、100 mM NH4HCO3)を50 μl加えて56 ℃にて1時間インキュベートした後上清を捨てた。これにアルキル化反応溶液(55 mM iodoacetamide、100 mM NH4HCO3)を加えて室温にて45 分間遮光で置いた。その間、時々攪拌した。上清を捨て、100 mM NH4HCO3溶液を100 μl加えて10 分間攪拌した後、上清を捨て、acetonitrile を100 μl加えて15 分間攪拌した。その後、上清を捨て、100 mM NH4HCO3溶液を100μl加えて15 分間攪拌し、上清を捨て、acetonitrile を100μl加えて15 分間攪拌した。その後、上清を捨て、スピードバックを用いて乾固させた。これにトリプシン溶液(25 ng/μl trypsin、50 mM NH4HCO3)を10μl入れて、15 分間室温で置いた後、50 mM NH4HCO3を10μl入れて、37 ℃で6 時間トリプシン消化を行った。ゲルに残っている液を新しいlow retention tubeに回収し、ゲルに20 mM NH4HCO3溶液を20μl入れて室温で20 分間攪拌した後、液を回収した。ゲルに抽出反応溶液(5 % formic acid、50 % acetonitrile)を20μl入れて室温で20 分間攪拌した後、液を回収した。この抽出操作を計4 回行った。トリプシン消化産物の抽出効率を上げる為に、4 回目の抽出時にゲルを超音波洗浄機に約5 秒間かけた。これをスピードバックにて乾燥させた後、サンプル溶解液(0.1 % trifluoroacetic acid、1 mM n-octylglycoside、10 ｍM ammonium phosphate)を3μl入れて攪拌しながら溶かした。このサンプル溶液を、MALDI-TOF/MS用のターゲット(BRUKER DALTONICS)のマトリクス上に載せた後、洗浄液(0.1 % trifluoroacetic acid、10 ｍM ammonium phosphate)にて洗浄した。これをMALDI-TOF型質量分析装置ultraflex TOF/TOF (BRUKER DALTONICS)により測定し、得られたデータをウェブ上のプログラム(MS-Fit; University of California -San Francisco Mass Spectrometry Facility)にて解析した。その結果、この500 kDaの複合体タンパクから、FXR及びRXRα(RXRαとは、retinoid X receptorを意味する）に加えて、PHF2、ARID5Bα及びARID5Bβを同定した(図４)。FXRにPHF2及びARID5Bsが結合することはこれまでに知られていない。
グルカゴン依存的な細胞内PHF2/ARID5B/FXR複合体形成の検出
　293F細胞をグルカゴンにて処理した後、抗FXR抗体により免疫沈降し、抗PHF2抗体及び抗ARID5B抗体を用いたWestern blottingにより解析した。一次抗体は以下のように作製した。抗PHF2抗体は、3種類のPHF2混合ペプチド(ERSVDVTDVTKQKDC（配列番号１３）、CKPKPVRDEYEYVSD（配列番号１４）、CAYKSDDSSDEGSLH（配列番号１５）)を抗原としてウサギに免疫後、採取した血清のペプチドアフィニティ精製によって取得した。抗ARID5B抗体は、3種類のARID5B混合ペプチド(CDTPQGRNSDHGEDE（配列番号１６）、CTDQGSNSEKVAEEA（配列番号１７）、CEQTSKYPSRDMYRE（配列番号１８）)を抗原としてウサギに免疫後、採取した血清のペプチドアフィニティ精製によって取得した。
　Western blottingの結果、293F細胞内において内在性のPHF2、ARID5B及びFXRがグルカゴン依存的に複合体を形成する事が分かった(図５)。また、グルカゴンの下流シグナルであるPKA活性化剤forskorin（陽性コントロール）によってもPHF2/ARID5B/FXR複合体が形成された。FXRがグルカゴンシグナル依存的にPHF2、ARID5Bと複合体を形成することはこれまでに知られていない。
PHF2、ARID5B、FXRの直接結合の検出
　PHF2、ARID5B、及びFXR同士のダイレクトな結合は、GST pull-down assayにより調べた。GST pull-down assayは下記のように行った。
　まず、ヒトPHF2をN末端から数えて１～364番目 （A領域、プライマーA、a）、367～747番目（B領域、プライマーB、b）、及び、750～1103番目（C領域、プライマーC、c）の3つのアミノ酸配列領域に分割されるようにプライマーを設計し、PCRにて増幅後、pGEX-4T-1ベクターに組み込み、GST-PHF2 (A)、GST-PHF2 (B)及びGST-PHF2 (C) pGEX-4T-1ベクターを取得した。
　プライマー配列は以下の通りである。なお、PCRは常法に従って実施した。
A：5’-cgcggatccatggcgacggtgcccgtgtactg-3’（配列番号１９）
a：5’-ccggaattcgggaaactgagtcaggctgccc-3’ （配列番号２０）
B：5’-cgcggatccgaaactgcgtgctggtacatgggg-3’ （配列番号２１）
b：5’-ccggaattcgggcttggtgtctgtgtcgatgtg-3’ （配列番号２２）
C：5’-cgcggatccaatgccagagtcaagaaggagagt-3’ （配列番号２３）
c：5’-ccggaattcttaaaggagtagtttcccgttccg-3’ （配列番号２４）
 
　これらをRosetta2 (DE3) pLysS大腸菌株(Novagen)にトランスフォーメーションし、LB (+Ampicillin)培地にて37 ℃で培養、O.D.600 nm=0.4～0.5となった時点でIPTGを終濃度0.1 mMとなるように加え、27 ℃にて90分間培養した。以降の操作は4 ℃にて行った。
　大腸菌を集菌後、10 % glycerol入りのPBSに懸濁した後、ソニケーターにより破砕した。その後、Triton-X 100を終濃度1 %となるように加え、rotatorにて30 分間インキュベートした後、7500 rpm、5 分間遠心し、上清を採取した。これにGlutathion Sepharose 4B (Amersham Biosciences)を加え、rotatorにて30 分間インキュベートした後、10 % glycerol入りのPBSにより5 回洗浄した。以上のようにして、GST-PHF2 (A) 、GST-PHF2 (B)、GST-PHF2 (C)及びタンパク質resinを作製した。 同様にして、ヒトARID5BβをN末端から数えて１～318番目 （A領域）、319～678番目（B領域）、及び、679～1190番目（C領域）の3つのアミノ酸配列領域に分割されるようにプライマーを設計し、PCRにて増幅後、pGEX-4T-1ベクターに組み込み、GST-ARID5Bβ (A領域、プライマー配列D、d)、GST-ARID5Bβ(B領域、プライマー配列E、e)及びGST-ARID5Bβ(C領域、プライマー配列F、f) pGEX-4T-1ベクターを取得した。
　プライマー配列は以下の通りである。
D：5’-ccggaattcatggcgccaaatcttaaaggcagaccacg-3’ （配列番号２５）
d：5’-ccgctcgagcctgcactcttcaccaatggcaa-3’ （配列番号２６）
E：5’-cgcggatccgcagatgaacaagccttcttggtg-3’ （配列番号２７）
e：5’-ccgctcgaggagcaggggcgtgtaattaagtcc-3’ （配列番号２８）
F：5’-cgcggatcctactctaggggcaacccaggcatc-3’ （配列番号２９）
f：5’-ccgctcgagctacagttttgtactggggtgcacggatg-3’ （配列番号３０）
 
　これらを用いて、PHF2と同様にして大腸菌によりGST-ARID5Bβ(A)、GST-ARID5Bβ(B)、及びGST-ARID5Bβ(C)タンパク質resinを取得した。
　更に、別途、HepG2 cDNAを鋳型として増幅させたヒト全長FXR（配列番号５）、ヒト全長PHF2（配列番号１）、及び、ヒト全長ARID5B（配列番号３）を、それぞれFLAG-HA-pcDNA3ベクター、HA-pcDNA3ベクター、及び、FLAG-His pcDNA3ベクターに組み込み、これらベクターをテンプレートとしてTNT Coupled Reticulocyte Lysate System Kit (Promega社)を用いたin vitro translationにより、35S-MetラベルされたFXR、PHF2、又は、ARID5Bタンパク質を合成した。これらを上述の各種GST融合タンパク質resinと混合して氷上で30 分間インキュベートした。NET-N+ bufferにて4 回洗浄した後、SDS-PAGE loading bufferを加えて5 分間煮沸処理した。これを7.5 %アクリルアミドゲルにてSDS-PAGEし、泳動後のゲルを乾燥させて、imaging analyzer (BAS1500; Fuji Film)にて解析した。
　その結果、FXRは、PHF2のPHD fingerとJmjC domainを含む領域(A)と結合し、また、ARID5BのC末側のARID domainを含む領域(B)(C)と結合した(図６)。また、PHF2とARID5Bは、PHF2のC末端領域(B)(C)と、ARID5BのN末端領域(A)で結合している事が分かった(図６)。
グルカゴンシグナルによるPHF2のリン酸化とグルカゴン依存的なFXR転写活性化測定方法
　293F細胞を12 well細胞培養プレートに播種後、1well当たりレポーター遺伝子(SHP promoter-tk-luc)：0.1μg、FLAG-FXR pcDNA3：0.1μgを、PolyFect Transfection Reagent (QIAGEN)を用いてトランスフェクションした。24 時間後にグルカゴン（200 nM）及びH89 (10-7 M)を含む培地に交換し、更に24 時間後に細胞を回収した。次に、Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega)、及びTR717 Microplate Luminometer (Applied Biosystems)を用いてルシフェラーゼ活性の測定を行った。その結果、グルカゴンによるFXR転写活性化能の促進作用がH89(PKA阻害剤）により消失した(図７)。
　ヒトSHP遺伝子プロモーター(-23～-312)領域を、ビオチン化させたプライマーを用いてPCRにて増幅した後、エタノール沈殿を行い、TEに溶かしてAvidin resinと室温で30 分間コンタクトさせた。
　プライマー配列は以下の通りである。
5’-tgagaccttggtgccctggtac-3’ （配列番号３１）
5’-ttcccagctatctggccctctc-3’ （配列番号３２）
 
　コンタクト後のサンプルをTEで3回洗浄する事により、Avidin　resinに固定化したSHP-promoterを調製した。
　また、293F細胞にARID5B、PHF2 (WT)又はPHF2のC末端領域に存在するPKAリン酸化部位のコンセンサス配列のAla置換変異体：PHF2 (S4A)をトランスフェクションし、グルカゴン刺激後、この細胞溶解液とavidin resinに固定化したSHP-promoterをコンタクトする事でABCD assayを行った。すなわち、293F細胞にFLAG-ARID5B-His pcDNA3、HA-PHF2 pcDNA3、またはHA-PHF2 (S4A) pcDNA3をトランスフェクションし、グルカゴン(200 nM)及びMG132 (10－5 M)存在下、2 時間インキュベーションした。その後、培地を抜き取り、PBS 1 mlを加えて細胞をかき取って、1.5 ml tubeに回収した。3000 rpm、5 分間遠心後に上清を捨て、細胞ペレットにTNE bufferを1 ml加えてピペッティングし、4 ℃にてrotatorにてtubeを30分間転倒混和しながら細胞を溶解させた。12000 rpmで15 分間遠心した後、上清を採取した。これにAvidin resinに固定化したSHP-promoter DNAを加え、4 ℃にて30 分間rotatorにてtubeを回転させながらコンタクトさせた。TNE bufferにて3 回resinを洗浄した後、SDS-PAGE loading bufferを加えて煮沸処理し、抗PHF2抗体及び抗ARID5B抗体を用いてWestern blottingを行った。
　その結果、PHF2未発現細胞ではPHF2/ARID5BによるSHP-promoter結合が見られなかったが、PHF2 (WT)を発現させるとPHF2/ARID5Bによるグルカゴン依存的なSHP-promoter結合が見られた(図８)。しかし、PKAによるリン酸化部位の変異体PHF2 (S4A)を発現させた細胞では、PHF2/ARID5BによるSHP-promoter結合が認められなかった(図８)。
　以上のことから、PHF2 C末端領域のSer残基は、グルカゴンシグナル下流に存在するPKAによりリン酸化され、このリン酸化は、グルカゴン刺激によるFXR活性化、及び、PHF2/ARID5B複合体のFXR標的遺伝子プロモーター結合に必須である事が示された。
PHF2の脱メチル化活性測定
　293F細胞に、FLAG-PHF2 pcDNA3、又はpcDNA3をトランスフェクションした後、約48 時間後に培地を吸い取り、PBS 1 mlを加えて細胞をかき取って、1.5 ml tubeに入れた。これを、3000 rpmで5 分間遠心した。その後、上清を捨て、細胞ペレットにTNE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.8]、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 % NP40、protease inhibitor cocktail)を1 ml加えてピペッティングし、4 ℃にて30 分間rotatorにてtubeを回転させながら細胞を溶解させた。12000 rpmで15 分間遠心した後、上清を採取し、これに、anti FLAG M2 agarose resin (Sigma)を加えて、4 ℃にて4 時間rotatorにてインキュベートした。その後、TNE bufferにて4 回resinを洗浄した。
　このFLAG-PHF２免疫沈降産物とヒストン (Sigma, H9250)をタンパク質量比1:5で混ぜ、histone demethylation buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl、50 mM Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O、1 mM α-ketoglutalate、2 mM ascorbate)中で、37 ℃にて4 時間インキュベートした。その後、SDS-PAGE loading bufferを加えて、煮沸処理した。
　煮沸処理後のサンプルを、15 %濃度のアクリルアミドゲルにてSDS-PAGEした後、PVDF膜にブロッティングした。これを5 %スキムミルク含有のPBS-T bufferにてブロッキングした。これを、PBS-T bufferに希釈した一次抗体で室温にて2 時間インキュベートした。次に、PVDF膜をPBS-T bufferにて3 回洗浄した後、PBS-T bufferに希釈した二次抗体(anti rabbit immunoglobulin/ HRP, Dako Cytomation)で室温にて1 時間インキュベートした。その後、PVDF膜をDetection Reagent (Amersham Biosciences)にて処理し、X線フィルムに適当時間コンタクトさせて現像した。その結果、PHF2がヒストンH3K9-Me2を特異的に脱メチル化することが示された(図９)。PHF2がヒストン脱メチル化酵素であることはこれまでに知られていない。
　使用した一次抗体を以下に示した。
histone H3K9-Me2 ; Upstate, ＃07-441, 1/1000 dilution
histone H3K9-Me3 ; Abcam, ＃8898-100, 1/1000 dilution
histone H3K27-Me2 ; Upstate, ＃07-452, 1/1000 dilution
histone H3K27-Me3 ; Upstate, ＃07-449, 1/1000 dilution
histone H3K36-Me2 ; Upstate, ＃07-369, 1/2000 dilution
histone H3K36-Me3 ; Abcam, ＃9050-100, 1/1000 dilution
グルカゴン依存的なPHF2/ARID5B複合体による脱メチル化活性測定
　293F細胞に、HA-PHF2 pcDNA3、FLAG-ARID5B-His pcDNA3をトランスフェクションし、48 時間後にグルカゴンを添加した。3 時間インキュベーションの後、培地を捨て、PBS 1mlを加えて細胞をかきとり、1.5 ml tubeに回収して3000 rpmで5 分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットにTNE bufferを1 ml加えてピペッティングし、30 分間rotaterにてインキュベート後、12000 rpmにて15 分間遠心し、ペレットにTNE bufferを500μl加えた。これをsonicator (TOMY SEIKO、Handy Sonic model UR-20P)を用いて、目盛7で15 秒間のソニックを計2 回行った後、SDS-PAGE loading bufferを加えて煮沸処理した。煮沸処理後のサンプルを、15 %濃度のアクリルアミドゲルにてSDS-PAGEした後、PVDF膜にブロッティングした。これを5 %スキムミルク含有のPBS-T bufferにてブロッキングした。これを、PBS-T bufferに希釈した一次抗体（実施例４で示した抗体と同じ）で室温にて2 時間インキュベートした。その後、PVDF膜をPBS-T bufferにて3 回洗浄した後、PBS-T bufferに希釈した二次抗体(anti rabbit immunoglobulin/ HRP, Dako Cytomation)で室温にて1 時間インキュベートした。その後、PVDF膜をDetection Reagent (Amersham Biosciences)にて処理し、X線フィルムに適当時間コンタクトさせて現像した。その結果、PHF2及びARIDのトランスフェクションによりヒストンH3K9のメチル化レベルが減少し、グルカゴン添加によりH3K9のメチル化レベルは更に減少した(図１０)。この事から、PHF2/ARID5Bはグルカゴン依存的にH3K9-Me2を脱メチル化する事が示された。PHF2/ARID5B複合体がグルカゴン刺激によってヒストン脱メチル化活性を発揮することはこれまでに知られていない。
　抗Histone H3抗体は下記のものを使用した。
histone H3 ; abcom, 1791, 1/2000 dilution
グルカゴン依存的なARID5Bの脱メチル化検出
　293F細胞に、FLAG-ARID5B、又は、336番目のリジンをアラニンに置換したFLAG-ARID5B (K336A)、及びHA-PHF2 vectorをトランスフェクションし、グルカゴン刺激した後、抗メチル化リジン抗体による免疫沈降を行った。この免疫沈降産物を、抗FLAG抗体を用いたWestern blottingにより解析した。その結果、ARID5Bがメチル化されていることが判った。このARID5Bのメチル化バンドはPHF2を過剰発現させてグルカゴン刺激することにより減弱した(図11, lane 1-3)。一方、ARID5B K336A変異体ではメチル化バンドが見られなかった(図11, lane 4)。
　また、FLAG-ARID5B、FLAG-ARID5B (K336A)及びHA-PHF2 vectorをトランスフェクションしグルカゴン添加した293F細胞溶解液を、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降した後、抗メチル化リジン抗体を用いたWestern blottingにより解析した。その結果、メチル化ARID5BのバンドはPHF2及びグルカゴン依存的に消失した(図12, lane 1-3)。一方、ARID5B K336Aではメチル化バンドが見られなかった(図12, lane 4)。
　以上の結果より、ARID5Bの336番目のリジンは細胞内においてメチル化され、PHF2及びグルカゴン依存的に脱メチル化される事が示された。
　本発明によって、従来の核内受容体のアゴニスト・アンタゴニストの有用性、及びグルカゴンレセプターアンタゴニストの有用性に加え、PHF2/ARID5Bを転写共役因子として用いているFXR転写活性のみを特異的に阻害ないし促進する化合物をスクリーニングするための新規な方法が提供される。これを用いて、糖尿病、高脂血症、線維症などを対象とする、より効果・特異性に優れた薬剤を創製することが可能となることが期待できる。
　配列番号１３～１８：合成ペプチド
　配列番号１９～３２：合成DNA

Claims (25)

  1. 　PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも２つのタンパク質を被検物質の存在下で接触させ、これらのタンパク質の複合体の形成を検出し、得られる検出結果から当該タンパク質の相互作用を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  2. 　PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも２つのタンパク質を被検物質の存在下で接触させ、これらのタンパク質の複合体の形成を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  3. 　PHF2とプロテインキナーゼとを被検物質の存在下で接触させ、PHF2のリン酸化を検出し、得られる検出結果から当該PHF2のリン酸化を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  4. 　PHF2とプロテインキナーゼとを被検物質の存在下で接触させ、PHF2のリン酸化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  5. 　PHF2とARID5Bとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果から当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  6. 　PHF2とARID5Bとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該ARID5Bのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  7. 　PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用するヒストンのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果から当該ヒストンのメチル化又は脱メチル化を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  8. 　PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用するヒストンのメチル化又は脱メチル化を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  9. 　PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用する遺伝子の転写活性を検出し、得られる検出結果から当該転写活性を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  10. 　PHF2とARID5BとFXRとの複合体と、被検物質とを接触させ、当該複合体が作用する遺伝子の転写活性を検出し、得られる検出結果からFXRを介する遺伝子発現又はグルカゴンシグナル伝達系を調節する物質を選択する工程を含む、前記調節物質のスクリーニング方法。
  11. 　PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質が精製されたものである請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　調節物質が、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質に親和性を有するものである請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　調節物質が阻害物質である請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　接触は、グルカゴン刺激下に行われるものである請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　接触は、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質を発現及び/又は産生する細胞、又は該細胞の細胞調製物を用いて行うものである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　細胞が、肝臓由来細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、脂肪細胞、膵β細胞、膵α細胞及び気管支上皮細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１５に記載の方法。
  17. 　細胞は、PHF2をコードする遺伝子、ARID5Bをコードする遺伝子及びFXRをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つが導入されたものである、請求項１５に記載の方法。
  18. 　転写活性は、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質を過剰発現させることにより生ずるものである請求項９又は１０に記載の方法。
  19. 　転写活性は、FXRを介するものである請求項９又は１０に記載の方法。
  20. 　転写活性の検出は、PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質を発現及び/又は産生する細胞、又は該細胞の調製物において行うものである請求項９又は１０に記載の方法。
  21. 　転写活性の検出は、レポーター遺伝子アッセイ系により行うものである、請求項９又は１０に記載の方法。
  22. 　細胞が、肝臓由来細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、脂肪細胞、膵β細胞、膵α細胞及び気管支上皮細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２０に記載の方法。
  23. 　細胞は、PHF2をコードする遺伝子、ARID5Bをコードする遺伝子及びFXRをコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つが導入されたものである、請求項２０に記載の方法。
  24. 　PHF2、又はPHF2とARID5Bとの複合体を含む脱メチル化剤。
  25. 　PHF2、ARID5B及びFXRからなる群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質及び/又は該タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法に使用するためのキット。
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