JP2019528457A - 代謝障害の治療に有用な化合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、上昇した血中グルコースレベル及び関連する代謝障害をもたらすことになる異常な又は調節不全の肝臓グルコース産生の阻害のための化合物を同定及び使用する方法を提供する。本発明は、グルカゴンがａＰ２と必要的結合複合体を形成し、それがグルカゴンＧ共役タンパク質受容体の活性化に必要であるという驚くべき発見に基づく。

Description

政府権利の声明
本発明は、国立衛生研究所から授与された契約番号ＤＫ０６４３６０及びＤＫ０９７１４５の下で、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月２７日に出願された米国仮出願第６２／３５５，１７５号の利益を主張する。本仮出願の全体を、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用する。
参照による援用
２０１７年６月２７日に作成され、サイズが６１キロバイトである、「１５０２０−０１７ＷＯ１＿ＳＥＱＩＤ＿ＴＸＴ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルの内容は、その全体を参照により本明細書に援用する。
発明の分野
本発明は、上昇した血中グルコースレベル及び関連する代謝障害をもたらす、異常な又は調節不全の肝臓グルコース産生を阻害するのに有用な化合物及びその化合物を同定する方法を提供する。
発明の背景
脂肪組織の増大によって特徴付けられる肥満は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び脂質異常症を含む疾患が集団的に発生するリスクを高め、これにより、心血管疾患（ＣＶＤ）による死亡率が高まる（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ（２００９年）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３７３、１０８３−１０９６； Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、（２０００年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ６、７７−８６）。肥満は、脂肪組織量の過剰な蓄積をもたらす食欲調節及び／又は代謝の複合的な内科的障害である。肥満は、重要な臨床上の問題であり、米国の成人人口の３分の１以上に影響を及ぼす西洋文化における流行的な疾患になりつつある。米国では９７００万人の成人が太り過ぎ又は肥満であると推定される。更に、肥満は、脳卒中、心筋梗塞、鬱血性心不全、冠動脈性心疾患、及び突然死による早死並びに罹患率及び死亡率の大幅な増加に繋がる。肥満治療の第一の目標は、過剰な体重を減らし、肥満が関連する罹患率及び死亡率を改善又は予防し、長期的な体重減少を維持することである。
糖尿病は、ホルモンインスリンを産生又はこれに応答する身体の能力が損なわれる疾患であり、これにより、炭水化物の代謝が異常になり、血液及び尿中のグルコースのレベルが上昇する。インスリンは、グルコースが細胞内へ移動するのを調節するホルモンである。糖尿病には、２つの異なる型がある。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の場合、膵臓は、インスリンを全くか、又は殆ど産生しない。約１２５万人のアメリカ人が、Ｔ１Ｄに罹患しており、推定４万人に、毎年、新たに診断が下される。インスリン非依存型糖尿病としても知られている２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は、身体がグルコースを代謝する方法に影響を及ぼす慢性的な症状である。２型糖尿病の場合、身体は、インスリンの作用に抵抗するか、又は正常なグルコースレベルを維持するのに十分なインスリンを産生しない。十分なインスリンがなければ、血中グルコースレベルは高いままである。約２７９０万人のアメリカ人、即ち、人口の９．３％は、Ｔ２Ｄに罹患している。糖尿病は、２０１０年に、米国での主な年間死亡原因の７番目を維持しており、６９，０７１の死亡診断書に、根底をなす死亡原因として糖尿病が挙げられており、２３４，０５１の死亡診断書の全てに、根底をなす又は一因となる死亡原因として糖尿病が挙げられている。糖尿病の合併症及び共存症には、低血糖症、高血糖症、高血圧症、脂質異常症、心血管疾患（ＣＶＤ）、心筋梗塞、脳卒中、失明及び網膜症、腎疾患、並びに切断術（ａｍｐｕｔａｔｉｏｎｓ）が含まれる。
低血糖症及び高血糖症の両方共、ヒト及び他の哺乳動物に有害であり得る。ヒトの体は、体の重要な機能、例えば、グルコースを専ら利用する脳を維持するように、低血糖に対抗する多くのホルモン応答を発展させてきた（Ｔｅｓｆａｙｅ Ｎ、Ｓｅａｑｕｉｓｔ ＥＲ.Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，２０１０年１１月；１２１２：１２−２８；Ｍａｒｔｙ Ｎ、Ｄａｌｌａｐｏｒｔａ Ｍ、Ｔｈｏｒｅｎｓ Ｂ．Ｂｒａｉｎ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｅｎｅｒｇｙ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２００７年８月１日；２２（４）：２４１-２５１；Ｅｉｇｌｅｒ Ｎ，Ｓａｃｃa Ｌ，Ｓｈｅｒｗｉｎ ＲＳ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ，Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ，ａｎｄ Ｃｏｒｔｉｓｏｌ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｏｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１９７９年１月１日；６３（１）：１１４-１２３）。これらのホルモン、例えば、グルカゴンの分泌の調節不全は、過剰な血中グルコースレベルに関連する代謝異常症の一因となる（Ｕｎｇｅｒ ＲＨ，Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ ＡＤ．Ｇｌｕｃａｇｏｎｏｃｅｎｔｒｉｃ ｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍａｋｅｏｖｅｒ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２年１月３日；１２２（１）：４-１２）。糖尿病を発症すると思われる高血糖は、腎臓障害、神経障害、心血管障害、及び網膜への障害又は足（ｆｅｅｔとｌｅｇｓ）への障害を含む重篤な合併症へと至り得る。糖尿病性神経障害は、長期の高血糖の結果であり得る。
過剰な血中グルコースレベルに関連する他の合併症には、過食症（頻繁な空腹感、特に著しい空腹感）、多渇症（頻繁な口渇、特に過度の口渇）、多尿症（尿量の増加（排尿頻度は増加しない）、かすみ目、疲労、創傷治癒不良又は創傷治癒障害（切り傷、擦り傷等）、足やかかとのヒリヒリ感、起立性機能障害（ｅｒｅｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）、再発性感染症、心臓不整脈、絶食時グルコース異常、耐糖能（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）異常、脂質異常症、肥満症、腎症、網膜症、白内障、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性ケトアシドーシス、高血糖高浸透圧症候群、周術期高血糖症、集中治療室の患者における高血糖、インスリン抵抗症候群、及び代謝症候群が含まれる。
慢性的な高血糖を含む過剰な血中グルコースレベルに対する現在の治療方法は、適切な食餌、定期的な運動及びインスリン又は他の薬剤、例えば、メトホルミンの組み合わせにより、可能な限り正常値に近い血中グルコースレベルを維持することを目指す。しかしながら、これらの方法にもかかわらず、過剰な血中グルコースレベルに関連する障害は、依然として主な世界的な健康問題である。
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（より悪性度の高い（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）形態の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む）もまた、肥満の広がりと同時に広がりの程度が高まっている（Ｓｏｗｅｒｓら、（２０１１年）Ｃａｒｄｉｏｒｅｎａｌ Ｍｅｄ．１：５−１２）。肥満及びＮＡＦＬＤの劇的な増加は、米国におけるフルクトースの消費量が過去３０年間に２倍以上なっていることから、大量の脂肪と糖（例えば、スクロース又はフルクトース）を含有する西洋の食餌（ＷＤ）の消費量に、部分的に起因していると考えられる（Ｂａｒｒｅｒａら、（２０１４年）Ｃｌｉｎ． Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ． １８：９１−１１２）。ＮＡＦＬＤは、アルコールを殆どか又は全く消費しない個体に発生する肝臓の大滴性脂肪変性によって特徴付けられる。ＮＡＦＬＤの組織学的範囲には、脂肪変性単独、脂肪肝、及び炎症の存在が含まれる。ＮＡＳＨは、理由は未だ完全には理解されていないが、肝臓における過剰な脂肪の蓄積によって特徴付けられる、より重篤な慢性肝疾患であり、硬変、肝細胞癌、最終的には肝不全及び死亡に至り得る進行性線維症に至る慢性的な炎症を誘発する（Ｂｒｕｎｔら、（１９９９年）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，９４：２４６７−２４７４；Ｂｒｕｎｔら、（２００１年）Ｓｅｍｉｎ．Ｋｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，２１：３−１６；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、（２０１２年）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１８：２３００−２３０８）。
ＮＡＳＨは、益々広がっており、今では、アメリカ人の２から５％に、そして世界の人々の２から３％に影響を及ぼしているけれども（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ−Ｔｅｔｒｉら、（２００５年） Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．, ３３０：３２６−３３５０）、その根底にある原因は依然として明確ではない。それは、中年及び太り過ぎ又は肥満の人に、最もよく生じる。ＮＡＳＨに罹患する多くの患者が、上昇した血中脂質（例えば、コレステロール及びトリグリセリド）、高インスリン血症、インスリン抵抗性を有しており、多くの被験体が、糖尿病又は前糖尿病に罹患している。全ての肥満の人や全ての糖尿病の被験体がＮＡＳＨに罹患しているわけではない。更に、ＮＡＳＨに罹患している一部の被験体は肥満ではなく、糖尿病ではなく、正常な血中コレステロール及び脂質を有している。ＮＡＳＨは、明確な危険因子がなくても発症する可能性があり、小児にも発症する可能性がある。従って、ＮＡＳＨは、肥満によってのみ発症するものではない。現在のところ、ＮＡＳＨに対する特定の治療法は存在しない。この疾患に罹患している人々に与えられる最も重要な推奨事項は、有酸素運動、食餌療法及び摂取行動、並びにその人々における減量である。
進歩は継続されてきたが、肥満とその医学的結果の根底にある分子メカニズム、及びその治療に対する新規なアプローチに関する更なる研究に対しては、未だ満たされていない必要性が依然としてある。同様に、糖尿病被験体及び非糖尿病被験体におけるＮＡＦＬＤを治療及び予防する新規な化合物及び方法を同定する差し迫った必要性が依然としてある。
本発明の目的は、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び糖尿病（Ｉ型及びＩＩ型）の一因となる上昇した血中グルコースレベルを治療する新規な化合物並びにそれらの使用及び組成物を同定することである。
発明の概要
本発明は、グルカゴンがその活性を、グルカゴンがタンパク質である脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質（ａＰ２）に結合している複合体を介して、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）上で発揮するという驚くべき発見に基づいている。本明細書で最初に記載するように、循環ａＰ２が、グルカゴンの必要的（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ）結合パートナーであり、肝臓におけるグルコース代謝関連作用を支えていることを発見した。このタンパク質複合体の発見により、グルコース代謝障害を調節するための新たな治療経路が提供される。
本明細書で最初に記載するように、循環ａＰ２は、細胞培養モデル及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の両方で、グルカゴンＧタンパク質共役受容体を介して、グルカゴンの作用を強め、グルカゴン／ａＰ２の複合体とグルカゴン受容体とが結合することによって、細胞内のｃＡＭＰを増加させるアデニル酸シクラーゼが活性化し、グリコーゲン分解を増加させ、そしてホスホエノールピルバートカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース−１，６−ビスホスファート（ＦＢＰａｓe−１）及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）を含むグルコネオゲネシス酵素の発現を増加させる。更に、グルカゴンシグナル伝達により、グリコーゲンホスホリラーゼが活性化し、グリコーゲンシンターゼが阻害される。これにより、肝臓でのグルコース産生及び血中グルコースレベルの上昇がもたらされる。
この驚くべき発見に基づいて、本明細書では、グルカゴンの必要的結合パートナーである脂肪細胞脂質結合タンパク質（ａＰ２）との複合体中の、グルカゴン受容体アゴニストであるグルカゴンの能力によって、グルカゴン受容体シグナル伝達が作動されるのを中和する化合物を同定する方法を提供する。更に、本明細書では、グルカゴンの必要的結合パートナーである脂肪細胞脂質結合タンパク質（ａＰ２）との複合体中の、グルカゴン受容体アゴニストであるグルカゴンが、グルカゴン受容体と結合して、これを作動させるのを阻害することによって、調節不全の又は異常な肝臓グルコース産生及び上昇した血中グルコースレベルに関連する疾患を治療するために、同定した化合物を使用する方法を提供する。
グルカゴン／ａＰ２複合体のこの基本的な発見の結果として、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の活性を中和することができる化合物（例えば、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する抗体）を同定し、設計する。一実施形態では、抗体は、ａＰ２又はグルカゴン単独よりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に選択的に結合する。一実施形態では、抗体は、ＧＣＧＲには結合しない。このような抗体は、グルカゴン受容体のグルカゴン／ａＰ２作動によって媒介される疾患の治療に有用である。
本発明の第１の態様では、グルカゴン／脂肪細胞結合タンパク質複合体（グルカゴン／ａＰ２）と結合することができる化合物を同定する方法であって、
ｉ． 前記化合物を、ａＰ２との複合体（グルカゴン／ａＰ２）中のグルカゴンに接触させること、そして
ｉｉ． 前記化合物が、グルカゴン／ａＰ２に結合するか否かを決定すること、
を含む、方法を提供する。
一実施形態では、アッセイは、細胞非存在下でインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）にて実施される。この方法には、更に、前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２、並びにＧＣＧＲを用いるアッセイに供すること、そしてグルカゴン／ａＰ２がＧＣＧＲに結合するか否かを決定することが含まれ、グルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲとの非結合は、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物の指標となる。別の実施形態では、該方法には、前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で細胞アッセイに供することが含まれ、該細胞アッセイには、ＧＣＧＲを発現する細胞の集団、及びＧＣＧＲの生物学的活性を測定することが含まれる。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、肝細胞である。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、ヒト細胞である。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、ヒト肝細胞細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌｓ）である。一実施形態では、前記化合物を、更に、競合結合アッセイに供して、ａＰ２及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する化合物を同定する。
本発明の第２の態様では、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を特定する方法であって、
ｉ． 前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はａＰ２との複合体（グルカゴン／ａＰ２）中のグルカゴンに接触させること、
ｉｉ． 前記化合物が、ａＰ２、グルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２に結合するか否かを決定すること、
ｉｉｉ． 前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２、並びにＧＣＧＲを用いるアッセイに供すること、そして
ｉｖ． グルカゴン／ａＰ２が、ＧＣＧＲに結合するか否かを決定すること、
を含み、
グルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲとの非結合が、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物の指標となる、方法を提供する。一実施形態では、アッセイは、細胞非存在下でインビトロにて実施される。該方法には、更に、前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で細胞アッセイに供し、該細胞アッセイには、ＧＣＧＲを発現する細胞の集団、及びＧＣＧＲの生物学的活性を測定することが含まれる。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、肝細胞である。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、ヒト細胞である。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、ヒト肝細胞細胞である。一実施形態では、前記化合物を、更に、競合結合アッセイに供して、ａＰ２及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する化合物を同定する。
本発明の第３の態様では、本明細書にて、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
ｉ． ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２をＧＣＧＲに、化合物の存在下で接触させること、
ｉｉ． ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２をＧＣＧＲに、化合物の非存在下で接触させること、そして
ｉｉｉ． 化合物の存在下でＧＣＧＲに結合したグルカゴン／ａＰ２の量を、化合物の非存在下でＧＣＧＲに結合したグルカゴン／ａＰ２の量と比較することを含み、
前記化合物の存在下でＧＣＧＲに結合したグルカゴン／αＰ２の量が減少していることが、ＧＣＧＲの作動を中和することができる化合物の指標となる、方法を提供する。一実施形態では、該アッセイは、細胞の非存在下でインビトロにて実施される。一実施形態では、化合物を、更に、競合結合アッセイに供して、ａＰ２及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する化合物を同定する。
グルカゴン／ａＰ２又はＧＣＧＲに結合したグルカゴン／ａＰ２への化合物の結合を測定又は同定する方法は、記載した例示的な実施形態に限定されない。利用することができる方法の例を、本明細書にて、そして以下に提供する実施例にて更に説明し、これには、ビオチン化グルカゴンとのａＰ２の直接的な相互作用を用いるバイオレイヤー干渉法（実施例１；図３Ａを参照）、１２５Ｉ−グルカゴンがビオチン化ａＰ２と相互作用するシンチレーション近接アッセイ（実施例１；図３Ｂ参照）、溶液内での結合事象から発生した熱を測定する等温滴定型熱量測定法（実施例１；図３Ｃ参照）及びマイクロスケール熱泳動法（実施例１及び図４ＡからＤを参照）が含まれる。
本発明の第４の態様では、本明細書にて、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
ｉ． ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２を、ＧＣＧＲを発現する細胞を含む第１の細胞アッセイに供すること、
ｉｉ． 前記第１の細胞アッセイでの前記細胞におけるＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること、
ｉｉｉ． ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２を、ＧＣＧＲを発現する細胞を含む第２の細胞アッセイに供するが、前記ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２を前記化合物の存在下で供すること、
ｉｖ． 前記第２の細胞アッセイでの前記細胞におけるＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること、そして
ｖ． 前記第１の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性を、前記第２の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性と比較することを含み、前記第１の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性に比べて、前記第２の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性が減少していることが、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する化合物の指標となる、方法を提供する。一実施形態では、該細胞集団には肝細胞が含まれる。一実施形態では、該細胞集団には、ヒト細胞が含まれる。一実施形態では、該細胞集団には、ヒト肝細胞が含まれる。一実施形態では、該化合物を、更に、競合結合アッセイに供して、ａＰ２及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する化合物を同定する。
本発明の第５の態様では、本明細書にて、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
ｉ．前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２並びにＧＣＧＲを発現する細胞を含む細胞集団の存在下で第１の細胞アッセイに供するが、前記化合物は一定の濃度で存在し、かつａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２は不飽和濃度で存在すること、
ｉｉ．前記第１の細胞アッセイでの前記細胞集団におけるＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること、
ｉｉｉ．前記化合物を、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２並びにＧＣＧＲを発現する細胞を含む細胞集団の存在下で第２の細胞アッセイに供するが、前記化合物は一定の濃度で存在し、かつａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２は飽和濃度で存在すること、
ｉｖ． 前記第２の細胞アッセイでの細胞集団におけるＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること、そして、
ｖ． 前記第１の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性を、前記第２の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性と比較することを含み、
前記第２の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性の減少よりも、前記第１の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性の減少がより大きいことが、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する化合物の指標となる、方法を提供する。一実施形態では、該細胞集団には、肝細胞が含まれる。一実施形態では、該細胞集団には、ヒト細胞が含まれる。一実施形態では、該細胞集団には、ヒト肝細胞が含まれる。
本発明の第６の態様では、本明細書にて、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
ｉ． 前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はａＰ２との複合体（グルカゴン／ａＰ２）中のグルカゴン並びにＧＣＧＲを発現する細胞を含む細胞集団の存在下で第１の細胞アッセイに供するが、前記化合物が一定の濃度で存在し、かつａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２が、第１の濃度で存在すること、
ｉｉ． 前記第１の細胞アッセイでの前記細胞集団におけるＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること、
ｉｉｉ． 前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はａＰ２との複合体（グルカゴン／ａＰ２）中のグルカゴン並びにＧＣＧＲを発現する細胞を含む細胞集団の存在下で一連の追加的な細胞アッセイに供するが、前記一連の追加的な細胞アッセイには、一定の濃度で存在する化合物、及び、前記第１の細胞アッセイと比較して、連続的に増加する濃度のａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２が含まれること、
ｉｖ． 前記一連の追加的な細胞アッセイでの前記細胞集団におけるＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること、そして、
ｖ． 前記第１の細胞アッセイにおける前記ＧＣＧＲの生物学的活性を、前記一連の追加的な細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性と比較することを含み、
前記一連の追加的な細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性の減少よりも、前記第１の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性の減少がより大きいことが、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する化合物の指標となる、方法を提供する。一実施形態では、該細胞集団には、肝細胞が含まれる。一実施形態では、該細胞集団には、ヒト細胞が含まれる。一実施形態では、該細胞集団には、ヒト肝細胞が含まれる。
第７の態様では、本明細書にて、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
ｉ． 前記化合物を、ａＰ２に接触させること、そして、
ｉｉ． 前記化合物が、配列番号１又は２のアミノ酸Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｇｌｕ６２及び／又はＬｙｓ８０にてａＰ２に結合するか否かを決定することを含み、
前記化合物が、配列番号１又は２のアミノ酸Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｇｌｕ６２及び／又はＬｙｓ８０にてａＰ２に結合することが、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物の指標となる、方法を提供する。一実施形態では、該アッセイは、細胞の非存在下でインビトロにて実施される。一実施形態では、該方法には更に、該化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で細胞アッセイに供することが含まれるが、該細胞アッセイには、ＧＣＧＲを発現する細胞集団、及びＧＣＧＲの生物学的活性を測定することが含まれる。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、肝細胞である。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、ヒト細胞である。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、ヒト肝細胞細胞である。
第８の態様では、本明細書にて、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
ｉ． 前記化合物を、グルカゴンと接触させること、そして
ｉｉ． 前記化合物が、配列番号８２のアミノ酸Ｐｈｅ２２、Ｖａｌ２３、Ｇｌｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｍｅｔ２７、Ａｓｎ２８、及び／又はＴｈｒ２９にてグルカゴンに結合するか否かを決定することを含み、
前記化合物が、配列番号８２のアミノ酸Ｐｈｅ２２、Ｖａｌ２３、Ｇｌｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｍｅｔ２７、Ａｓｎ２８、及び／又はＴｈｒ２９にてａＰ２に結合することが、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物の指標となる、方法を提供する。一実施形態では、アッセイは、細胞の非存在下でインビトロにて実施される。一実施形態では、該方法には更に、該化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で細胞アッセイに供することが含まれるが、該細胞アッセイには、ＧＣＧＲを発現する細胞集団、及びＧＣＧＲの生物学的活性を測定することが含まれる。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、肝細胞である。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、ヒト細胞である。一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団は、ヒト肝細胞細胞である。
本発明の第９の態様では、本明細書で、被験体におけるＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する方法であって、前記被験体に、グルカゴン／ａＰ２の能力によって、ＧＣＧＲに結合するのを中和する抗体を非限定的に含む化合物を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、化合物は、配列番号１又は２のアミノ酸Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｇｌｕ６２、及び／又はＬｙｓ８０にてａＰ２に結合することによって、ａＰ２との複合体を形成し、これにより、ＧＣＧＲに結合するグルカゴンの能力を中和する。一実施形態では、化合物は、配列番号８２のアミノ酸Ｐｈｅ２２、Ｖａｌ２３、Ｇｌｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｍｅｔ２７、Ａｓｎ２８、及び／又はＴｈｒ２９にてグルカゴンに結合することによって、ａＰ２との複合体を形成し、これにより、ＧＣＧＲに結合するグルカゴンの能力を中和する。
本発明の第１０の態様では、本明細書で、被験体におけるＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する方法であって、前記被験体に、形成するグルカゴン／ａＰ２の能力を阻害する抗体を非限定的に含む化合物を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合することによって、グルカゴン／ａＰ２の能力によって、ＧＣＧＲに結合するのを中和する。
本発明の第１１の態様では、本明細書で、被験体における肝臓グルコース産生を阻害する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する抗体を非限定的に含む化合物を投与することを含み、該化合物は、ＧＣＧＲに直接的には結合しない、方法を提供する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。一実施形態では、化合物はＧＣＧＲに結合しない。
本発明の第１２の態様では、本明細書で、被験体における肝臓の選択的なインスリン抵抗性を阻害する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する抗体を非限定的に含む化合物を投与することを含み、該化合物は、ＧＣＧＲに直接的には結合しない、方法を提供する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。一実施形態では、化合物はＧＣＧＲには結合しない。
本発明の第１３の態様では、本明細書にて、肝臓グルコース産生の調節不全によって媒介される障害を有する被験体を治療する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する抗体を非限定的に含む化合物を投与することを含み、該化合物は、ＧＣＧＲに直接的には結合しない、方法を提供する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２及び／又はグルカゴンに直接的には結合せず、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。それを必要とする宿主に投与する場合、グルカゴン／ａＰ２複合体とＧＣＧＲとの相互作用を標的とすることができる化合物を使用することにより、肝臓グルコース産生を減少させて、血中グルコースを減少させ、これにより、グルコースプロファイルの改善が得られる。一実施形態では、肝臓グルコース産生の調節不全によって媒介される障害は、食餌性肥満、糖尿病（１型及び２型の両方）、高血糖、糖尿病性ケトアシドーシス、高血糖高浸透圧症候群、心血管疾患、糖尿病性腎症又は腎不全、糖尿病性網膜症、絶食時グルコース異常、グルコース耐性異常、脂質異常症、肥満症、白内障、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒障害、周術期高血糖、集中治療室の患者における高血糖、インスリン抵抗症候群、代謝症候群、線維症（肺及び肝線維症を含む。）、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む。）から選択される。一実施形態では、障害は、食餌誘発性肥満、ＩＩ型糖尿病、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）から選択される。一実施形態では、障害は、肝細胞癌、硬変症、グルカゴノーマ、及び壊死性遊走性紅斑（ＮＭＥ）から選択される。
本発明の第１４の態様では、本明細書にて、肝臓の選択的なインスリン抵抗性によって媒介される障害を有する被験体を治療する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する抗体を非限定的に含む化合物を投与することを含み、該化合物はＧＣＧＲに直接的には結合しない、方法を提供する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２及び／又はグルカゴンに直接的には結合せず、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。一実施形態では、該障害は、ＩＩ型糖尿病である。
本発明の第１５の態様では、本明細書にて、被験体における血中グルコースレベルを低下させる方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する抗体を非限定的に含む化合物を投与することを含み、該化合物は、ＧＣＧＲに直接的には結合しない、方法を提供する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。一実施形態では、化合物は、ＧＣＧＲに結合しない。
一実施形態では、抗体、薬剤又はフラグメントは、例えば、１０−７Ｍよりも大きいＫｄを有する、ａＰ２の緩い結合剤である。
種々の実施形態では、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物は、以下の１つ以上によって作用する：即ち、（ｉ）細胞内ｃＡＭＰの増加をもたらすことになる細胞内シグナル伝達を通常では生じさせるようなグルカゴンＧタンパク質共役受容体へのグルカゴンの結合を、防止又は減少させること；（ｉｉ）細胞内ｃＡＭＰの増加をもたらすことになる細胞内シグナル伝達を通常では生じさせるようなグルカゴンＧタンパク質共役受容体へのａＰ２の結合を、防止又は減少させること；（ｉｉｉ）グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の能力によって、受容体に結合し、下流のシグナル伝達を活性化させるのを防止又は減少させること；（ｉｖ）グルカゴンが受容体に結合することができないように、グルカゴン受容体結合が減少するように、又は、有効な細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を妨げるように結合が変化するように、ａＰ２が、グルカゴンＧタンパク質共役受容体にアロステリックに結合し、かつ受容体の三次元構造を変化させるのを防止又は減少させること；（ｖ）有効な受容体媒介性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を妨げるように、グルカゴンが、グルカゴン／ａＰ２Ｇ共役受容体複合体に結合するのを防止又は減少させること；（ｖｉ）有効な受容体媒介性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を妨げるように、グルカゴン／ａＰ２複合体の形成を防止するか又は妨害すること；及び／又は（ｖｉｉ）グルカゴン／ａＰ２複合体が、グルカゴン受容体に有効に結合するのを妨げる構造的な変化を誘導することによって、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を改変させること。本明細書では、上記のいずれか１つ又は組み合わせを、「グルカゴン／ａＰ２複合体媒介性グルカゴン受容体の活性破壊」という。一実施形態では、化合物はＧＣＧＲには結合しない。
ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物は、グルカゴン／ａＰ２が、ＧＣＧＲに結合するのを防止するか、又はＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を破壊して、ＧＣＧＲの生物学的活性の減少をもたらすことになる任意の化合物であり得る。ＧＣＧＲの生物学的活性は、一般的に、ＧＣＧＲとその作動性結合パートナーであるグルカゴン／ａＰ２との間の相互作用から生じる任意の観察可能な効果をいう。生物学的活性は、ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合、ＧＣＧＲ媒介性細胞内シグナル伝達の検出；又は最終目的の生理学的効果の決定であり得る。代表的な、しかし非限定的な、グルカゴン／ａＰ２による作動性刺激の際のＧＣＧＲの生物学的活性の例には、非限定的に、本明細書で論じたシグナル伝達及びプロセスの調節、例えば、サイクリックＡＭＰ形成の阻害、肝臓グルコース産生の減少、グリコーゲン分解の減少、及びホスホエノールピルバートカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース１，６−ビスホスファート（ＦＢＰａｓe−１）、及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓe）を含む、グルコネオゲネシス酵素の発現の低下が含まれる。更に、グルカゴンシグナル伝達は、グリコーゲンホスホリラーゼを活性化し、グリコーゲンシンターゼを阻害する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２、グルカゴン、及び又はグルカゴン／ａＰ２に結合する小さい分子、リガンド、抗体、抗原結合剤、又は抗体フラグメントであり、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する。一実施形態では、化合物は、ａＰ２及び／又はグルカゴンに直接的には結合しないが、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。ＧＣＧＲの生物学的活性を検出するアッセイの例は、以下の実施例で更に例示され、ホスホエノールピルバートカルボキシナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース−１，６−ビスホスファート（ＦＢＰａｓｅ−１）、及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）を含むグルコネオゲネシス酵素の発現の減少（実施例１；図１Ａ及び図１Ｂ、図２Ａ、２Ｃ、及び２Ｄ参照）、肝臓グルコース産生の減少（実施例１、図１Ｃ参照）、グリコーゲン分解の減少(実施例１、図１Ｄ参照)、及びサイクリックＡＭＰ形成の阻害（実施例１、図１Ｅ及び１Ｆ参照）に関連するアッセイを含む。
この脂肪組織−膵臓−肝臓の軸は、例えば、糖尿病等の障害について見られるように、異常なグルカゴン活性又は調節不全のグルカゴンシグナル伝達、例えば、調節不全の肝臓グルコース産生及び上昇した血中グルコースレベルに関連する症状の治療に対して重要な意味を有する。グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とすることによって、グルカゴンによるグルカゴン受容体の活性化を調節することができること、肝臓グルコース産生を阻害することができること、そして肥満及び糖尿病のマウスモデルにおける血中グルコースレベルを正常化させることを発見した。更に、肝臓グルコース産生を減少させることによって、インスリンの逆調節（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）効果が更に高められる。一実施形態では、被験体、好ましくはヒトにおける過剰な血中グルコースレベルを低下させるために、循環グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを被験体に投与することによって、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体に、抗体又は抗体フラグメント等の抗原結合剤を結合させる。一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の形成は、ａＰ２抗体又は抗原結合剤によって破壊されるが、ここで、抗体は、グルカゴンとＡＰ２の複合体化を妨害する。一実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｐ及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／αＰ２複合体に優先的に結合する。一実施形態では、化合物はＧＣＧＲに結合しない。
上記の態様のいずれかにおける一実施形態では、抗体は、ａＰ２単独よりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に選択的に結合する。好ましく結合している抗体を同定するための方法は、当技術分野において一般的に知られている。一実施形態では、本明細書にて、ａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に選択的に結合する抗体を特定する方法であって、非ヒト動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、又はヤギに、異種グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体、例えば、ヒトグルカゴン／ａＰ２を、複合体の異種グルカゴン／ａＰ２に対する抗体を高めるために投与し、前記抗体を単離し、グルカゴン／ａＰ２及びａＰ２単独に対する結合親和性を測定する１つ以上の結合アッセイ、例えば、競合結合アッセイに前記抗体を供することを一般的に含み、ａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に好ましく結合する抗体を、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和するのに使用するために単離する、方法を提供する。一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２に好ましく結合している抗体には、ヒトグルカゴン／ａＰ２に特異的なＣＤＲ領域が含まれる。一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２に好ましく結合している抗体は、既知の方法に従ってヒト化される。抗体をヒト化することを含めて、抗体産生について記載する方法には、米国特許第７，２２３，３９２号、第６，０９０，３８２号、第５，８５９，２０５号、第６，０９０，３８２号、第６，０５４，２９７号、第６，８８１，５５７号、第６，２８４，４７１号、及び第７，０７０，７７５号が含まれる。
グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体によって媒介されるヒト等の宿主における障害の重症度を防止又は緩和する方法であって、循環グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメント、例えば、本明細書に記載した抗グルカゴン／ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤等のヒト化抗体を投与することを含み、これにより、グルカゴンの生物学的活性の減少又は緩和がもたらされる、方法を提供する。一実施形態では、ａＰ２及び／又はグルカゴン単独よりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。
記載した抗グルカゴン／ａＰ２抗体及び抗原結合剤を、それを必要とする宿主に有効量で投与することによる使用の非限定的な例には、以下の１つ又は組合せが含まれる。
（ｉ）絶食時血中グルコースレベルの低下、
（ｉｉ）肝臓グルコース産生の減少、
（ｉｉｉ）グルコース代謝の改善、
（ｉｖ）高インスリン血症の軽減、
（ｖ）肝臓脂肪変性の軽減、及び／又は
（ｖｉ）インスリン感受性の増加。
別の態様では、本明細書にて、更に、抗体、抗原結合剤、又は抗体フラグメントに結合したａＰ２との複合体におけるグルカゴンを含む組成物もまた提供する。一実施形態では、抗体、抗原結合剤、又は抗体フラグメントは、ヒトにおいて自然には生じない。一実施形態では、抗体に結合したグルカゴン／ａＰ２を単離する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１Ａから１Ｂは、実施例１に記載したように、グルカゴン（１００ｎＭ）及び組換えａＰ２（５０μｇ／ｍＬ）で同時に又は別々に刺激した１２週齢のオスＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスから単離した初代肝細胞におけるＧ６Ｐｃ（図１Ａ）及びＰｃｋ１（図１Ｂ）の正規化した相対的遺伝子発現を示す棒グラフである。実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。棒グラフは、平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）を表し、ｎ＝４から５／群、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓＰ＞０．０５である。複数の群の比較は、Ｔｕｋｅｙポストテスト補正を用いた一元配置（ｏｎｅ−ｗａｙ）ＡＮＯＶＡ統計を使用して行った。
図１Ｃは、上記（実施例１）のように、ａＰ２及び／又はグルカゴンで４時間、刺激した後、Ａｍｐｌｅｘレッドグルコースオキシダーゼを使用して、ピルビン酸塩（１μＭ）及び乳酸塩（２μＭ）を含み、血清及びグルコースを含まない培地中でアッセイした新規なグルコース産生を示す棒グラフである。実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。棒グラフは、平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）を表し、ｎ＝４から５／群、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓＰ＞０．０５である。複数の群の比較は、Ｔｕｋｅｙポストテスト補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ統計を使用して行った。
図１Ｄは、２４時間、刺激した後、シンチレーション計数によってアッセイしたグルコース放出を示す折れ線グラフである。ＨｅｐＧ２−Ｇ３Ａヒトヘパトーマ細胞株に、一晩、デキサメタゾン（１μＭ）とインスリン（１０μＭ）の存在下で、５ｍＭのグルコース及び１４Ｃ−Ｕ−グルコース（０．５ｕＣｉ／ウェル）を含むグリコーゲンを入れた（実施例１）。実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。棒グラフは、平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）を表し、ｎ＝４から５／群、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓＰ＞０．０５である。複数の群の比較は、Ｔｕｋｅｙポストテスト補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ統計を使用して行った。
図１Ｅは、ヒトＧＣＧＲ−ＧＦＰ及び４ｘｃＡＭＰ応答エレメントで安定的にトランスフェクトし、１０μｇ／ｍＬのａＰ２又は示した濃度のグルカゴン単独の存在下で刺激したＣＨＯ−Ｋ１における刺激の４時間後にアッセイしたルシフェラーゼ活性を示す折れ線グラフである（実施例１）。実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。棒グラフは、平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）を表し、ｎ＝４から５／群、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓＰ＞０．０５である。複数の群の比較は、Ｔｕｋｅｙポストテスト補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ統計を使用して行った。グラフは、データを、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示す。
図１Ｆは、ｃＡＭＰレポーターアデノウイルス（５Ｍ．Ｏ．Ｉ．）でインフェクトし、上記のように刺激した初代肝細胞における刺激の３時間後にアッセイしたルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。棒グラフは、平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）を表し、ｎ＝４から５／群、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓＰ＞０．０５である。複数の群の比較は、Ｔｕｋｅｙポストテスト補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ統計を使用して行った。グラフは、データを、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示す。
図２Ａは、一時的に、ＧＣＧＲ又はコントロールベクターの存在下でＧ６ＰＣプロモーター作動性ルシフェラーゼにてトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞のＧ６ＰＣポロモーター活性を示す棒グラフである。４時間の刺激後、分泌されたルシフェラーゼ活性を、培地からアッセイした。グラフは、データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。全ての実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。
図２Ｂは、バイオレイヤー干渉法を使用して測定した、ＧＣＧＲ結合反応速度、特に、ａＰ２の存在下又は非存在下でストレプトアビジンセンサーに固定したビオチングルカゴンに結合したＧＣＧＲ−ｅｃｄを示す棒グラフである。グラフは、データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。全ての実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。
図２Ｃから２Ｄは、ＧＣＧＲアロステリック阻害薬Ｌ−１６８，０４９（１００ｎＭ）の存在下又は非存在下でグルカゴン又はグルカゴン及びａＰ２で刺激した初代肝細胞におけるＧ６Ｐｃ（図２Ｃ）及びＰｃｋ１（図２Ｄ）の正規化した相対的な遺伝子発現を示す棒グラフである。棒グラフは、平均±ｓ．ｄ．を表し、ｎ＝４から５／群、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓＰ＞０．０５である。複数の群の比較は、Ｔｕｋｅｙポストテスト補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ統計を使用して行った。
２Ｅ及び２Ｆは、グルカゴン受容体のアロステリック阻害薬とプレインキュベートした細胞が、ａＰ２及びグルカゴンに応答する能力を失ったことを示す棒グラフである。
図３Ａは、バイオレイヤー干渉法を使用して、ストレプトアビジンプローブ上に固定したビオチングルカゴンに対する非標識ａＰ２の結合親和性（ｎｍ）を示す。２つの異なる濃度のａＰ２を、グルカゴン飽和プローブへの結合に使用し、次に、グローバルフィットモデルを使用して分析した。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図３Ｂは、ａＰ２に結合する１２５Ｉ−グルカゴン結合を示す折れ線グラフである。ビオチン化ａＰ２を、競合剤として様々な量の低温グルカゴンの存在下で１２５Ｉ標識グルカゴンと共にインキュベートした。シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）被覆プレートから放射された発光を読み取って、１部位の競合阻害薬モデルをカーブフィッティングに使用した。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。グラフはデータを平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。
図３Ｃは、等温滴定熱量測定実験における非標識ａＰ２及びグルカゴンの結合等温線からの結果を示す。時系列の、グルカゴンの各注入後に散逸した熱は、左側にある。右側では、これらの値を積分して結合曲線を生成する。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図３Ｄは、過剰の低温抗体（野生型血清）又は組換えａＰ２再構成（２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で、ａＰ２結合複合体をプルダウンするモノクローナル抗ａＰ２被覆磁気ビーズと共にインキュベートした野生型又はａＰ２欠失血清から単離した血清中のグルカゴン免疫反応性を示す棒グラフである。洗浄後、複合体を、グルカゴンシグナルを検出するためにＨＲＰ標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）モノクローナル−グルカゴン抗体と共にインキュベートした。棒グラフは平均±ｓ．ｄ．を表し、ｎ＝５／群、＊ｐ≦０．０５である。対のあるｔ検定を使用して群内の処置を比較し、複数の群の比較に一元配置の通常のＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ−ｗａｙ ｏｒｄｉｎａｒｙ ＡＮＯＶＡ）を使用した。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図３Ｅ及び３Ｆは、免疫沈降法を使用して、グルカゴン及びａＰ２が血清中で複合体として検出され得ることを示す棒グラフである。野生型血清とＣＡ３３とのプレインキュベーションは共免疫沈降を妨げる。
図３Ｇは、ＧＣＧＲ−ＥＣＤに対するａＰ２のリガンド結合曲線である。
図３Ｈは、グルカゴンに対するａＰ２のリガンド結合曲線である。
図３Ｉは、ＧＣＧＲ−ＥＣＤに対するグルカゴンのリガンド結合曲線である。
図３Ｊは、αＰ２及びグルカゴンのリガンド結合曲線におけるＣＡ３３の効果を示す。
図３Ｋは、野生型及びａＰ２欠失マウスにおけるグルカゴンの種々のトランケーションの結合を示すウェスタンブロットである
図３Ｌは、ビオチン化グルカゴンが野生型及びａＰ２欠失マウスにおける臓器溶解物からの内因性ａＰ２をプルダウンすることを示すウェスタンブロットである。
図４Ａは、増加する濃度のａＰ２の存在下での野生型及びＧＣＧＲ受容体欠失マウス由来のグルカゴン受容体に対するグルカゴンの結合曲線である。
図４Ｂから４Ｄは、ＧＣＧＲ受容体へのグルカゴン結合がインビボでａＰ２を必要とすることを示す棒グラフである。１２５Ｉ標識グルカゴンを、野生型、ａＰ２欠失、ＧＣＧＲ欠失、及び組換えａＰ２と組み合わせたａＰ２欠失にて、尾静脈に投与した。臓器を、投与の５分後に採取し、放射線を液体シンチレーションカウンターで計数した。
図４Ｂは、組み合わせた臓器の全てにおける１２５Ｉグルカゴン取り込みを示す棒グラフである。図４Ｃは、採取した特定の臓器における１２５Ｉグルカゴン取り込みを示す棒グラフである。
図４Ｄ及び４Ｅは、体重の関数としての単離した膜−ＳＰＡへのグルカゴンの１２５Ｉグルカゴン結合を示す棒グラフである。
図４Ｆは、ａＰ２がグルカゴンに結合するＧＣＧＲ−ＥＣＤ（細胞外ドメイン）を増加させることを示すウェスタンブロットである。
図４Ｇは、ＧＣＧＲへのａＰ２結合を示すウェスタンブロットである。
図４Ｈは、ペレット及び上清中のａＰ２シグナルを示す棒グラフである。
図４Ｉは、ａＰ２がグルカゴンへのＧＣＧＲ−ＥＣＤ結合を増加させることを示すウェスタンブロットである。
図５Ａは、マイクロスケール熱泳動実験から得られたＦＡＢＰ４とグルカゴンとの相互作用から決定された結合曲線である。
図５Ｂは、マイクロスケール熱泳動実験から得られたＧＣＧＲ−ＥＣＤとグルカゴンとの相互作用から決定された結合曲線である。
図５Ｃは、マイクロスケール熱泳動実験から得られたタグを有するＧＣＧＲ−ＥＣＤとｈＦＡＢＰ４との相互作用から決定された結合曲線である。
図５Ｄは、マイクロスケール熱泳動実験から得られたタグのないＧＣＧＲ−ＥＣＤとｈＦＡＢＰ４との相互作用から決定された結合曲線である。
図５Ｅは、ａＰ２とグルカゴンとの相互作用から決定された結合曲線である。
図６Ａは、ａＰ２及びグルカゴン結合の代表的なモデルであり、分子間の化学量論的関係が１対１であると仮定している。
図６Ｂは、グルカゴン分子当たりの複数のサブユニットのａＰ２の代表的なモデルである。
図６Ｃは、ａＰ２とグルカゴンとの間の可能性の高い相互作用部位をマッピングする予測サーバーを使用して生成されたモデルの頻度マッピングを示す。マップ上のより暗いスポットは、提示されたモデル間の相互作用の出現頻度がより高いことを表す。この分析から、最も可能性の高い相互作用部位は、第１αヘリックスの周り及び残基５７及び７６（２つのベータ−バレルループ）の周りのａＰ２クラスターに対する潜在的な結合部位を有するグルカゴンのＣ末端であることが分かる。この分析に使用した結晶構造は、グルカゴンについては１ＧＣＮであり、二量体ａＰ２については３Ｐ６Ｃ及び１ＬＩＣであった。
図７Ａは、グルコース負荷試験中の血糖（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す折れ線グラフである。試験は、合成グルカゴン（１６μｇ／ｋｇ）、ａＰ２（５０μｇ）又はその両方の組み合わせを投与する前に、４時間の食物中止（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）に供した１２週齢のオスの同腹仔野生型又はａＰ２欠失マウスで行った。グラフはデータを平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図７Ｂは、図７Ａからのグルカゴン耐性試験から決定された曲線下の面積を示す棒グラフである。Ｔｕｋｅｙ補正を用いた一元配置の通常のＡＮＯＶＡを複数の群の比較に使用した。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図７Ｃは、食後の状態に起因する如何なる差異をも防ぐために、図７Ａからのマウスにおける２４時間の絶食及び再摂食の３時間後に測定したグリコーゲンレベルを示す棒グラフである。棒グラフは、平均±ｓ．ｄ．を表し、ｎ＝４から５／群である。＊ｐ≦０．０５、ｎ．ｓ．は有意ではないことを表す。対のないｔ検定を使用して２つの群間の処置を比較した。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図７Ｄは、血液（プロメガ）からの蛍光発生基質を使用して測定した、図７ＡからのマウスにおけるＤＰＰ ＩＶ活性を示す棒グラフである。棒グラフは、平均±ｓ．ｄ．を表し、ｎ＝４から５／群である。＊ｐ≦０．０５、ｎ．ｓ．は有意ではないことを表す。対のないｔ検定を使用して、２つの群間の処置を比較した。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図７Ｅ肝臓を、図７Ｃに記載したのと同じ方法で採取し、ＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウェスタンブロットに供した。ウェスタンブロットから決定された正規化されたシグナル強度の棒グラフを下のパネルに示す。棒グラフは、平均±ｓ．ｄ．を表し、ｎ＝４から５／群である。＊ｐ≦０．０５、ｎ．ｓ．は有意ではないことを表す。対のないｔ検定を使用して、２つの群間の処置を比較した。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図７Ｆは、拘束され、膵臓の効果及び遺伝子型間の固有の差異を排除するソマトスタチン、並びに基礎レベルのインスリン（０．５ｍＵ／ｋｇ／分）、及び薬理学的用量のグルカゴン（１ｍｇ／ｋｇ／分）を注入された、頸静脈にカテーテルを挿入された野生型又はａＰ２欠失同腹仔マウスにおける血中グルコース（ｍｇ／ｄＬ）対時間（分）を示す折れ線グラフである。野生型マウスは、血糖値の上昇に伴ってグルカゴンに応答するが、一方、ａＰ２欠失マウスはそのようにはならなかった。この６０分の期間の終わりに、ａＰ２欠失マウスは、その正常血糖値を維持するために、グルコースの注入を必要としたが、一方、野生型マウスは、その血糖値が更に上昇した。グラフは、データを平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。全ての実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
図７Ｇは、ＰＢＳ、グルカゴン、又はグルカゴン及びａＰ２のいずれかで処置したａＰ２欠失及び野生型マウスのグルコース耐性を測定した折れ線グラフである。ｘ軸は時間であり、ｙ軸はｍｇ／ｄＬで測定したグルコース偏位である。
図７Ｈは、ＰＢＳ、グルカゴン、又はグルカゴン及びａＰ２のいずれかで処置したａＰ２欠失及び野生型マウスにおけるグルコースＡＵＣを測定した棒グラフである。ｘ軸は異なる処置計画であり、ｙ軸はＡＵＣである。
図７Ｉは、ａＰ２欠失マウスの肝臓のベースラインにおけるグリコーゲン含量を示す棒グラフである。ｘ軸は野生型及びａＰ２欠失マウスであり、ｙ軸はグリコーゲン（ｍｇ）／乾燥肝臓（ｍｇ）である。
図７Ｊは、ａＰ２欠失マウスの肝臓の安楽死時のグリコーゲン含量を示す棒グラフである。ｘ軸は野生型及びａＰ２欠失マウスであり、ｙ軸はグリコーゲン（ｍｇ）／乾燥肝臓（ｍｇ）である。
図７Ｋは、グルカゴン投与後の野生型及びａＰ２欠失マウスにおけるｃＡＭＰ測定値を示す折れ線グラフである。ｘ軸は、グルカゴン投与後の時間（分）であり、ｙ軸は、ＤＮＡ１μｇ当りのｃＡＭＰのｐｍｏｌである。
図８Ａは、拘束されて、高レベルのインスリン（３ｍＵ／ｋｇ／分）を注入された、意識のある、頸静脈にカテーテルを挿入されたａＰ２欠失マウスにおけるＨＧＰ（ｍｇ／ｋｇ／分）レベルを示す棒グラフである。ホルモンの逆調節効果を調べるために、その群に、ＰＢＳ、グルカゴン（１ｍｇ／ｋｇ／分）、ａＰ２及び基礎のグルカゴン（８μｇ／ｋｇ／分ａＰ２，０．１ｍｇ／ｋｇ／分）又は高レベルのグルカゴン及びａＰ２を一緒に注入した。高レベルのグルカゴン及びａＰ２の組み合わせ投与のみがインスリンの効果を妨害するように作用した（最後の群、肝臓グルコース産生の有意でない抑制によって示される）。ｎ＝６から９／群である。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓＰ＞０．０５である。クランプ条件下での複数の群のプ比較は、Ｔｕｋｅｙポストテスト補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ統計を使用して行った。群間の基礎条件及びクランプ条件を、Ｓｉｄａｋ補正を用いた繰り返しのある測定値の（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｓ）二元配置ＡＮＯＶＡ統計を使用して比較した。グラフはデータを平均±ｓ．ｅ．ｍとして示す。
図８Ｂは、生存マウスにおける膵臓クランプ実験の折れ線グラフである。グルカゴンの一定の注入下で、ａＰ２欠失マウスではグルカゴンに応答したグルコースの産生はない。ｘ軸はグルカゴン注入の時間であり、ｙ軸はｍｇ／ｄＬで測定された血中グルコースである。
図９Ａは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システムを使用した生体分子相互作用分析によって決定したヒト及びマウスａＰ２に対する抗ａＰ２モノクローナル抗体（ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＨ３）の結合親和性（Ｋｄ（Ｍ））を列挙する表である。
図９Ｂは、ビヒクル又は抗ａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＨ３を用いて処置した高脂肪の食餌（ＨＦＤ）における肥満マウスの週０（白抜き棒）又は４週（中実棒）の血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフである。血中グルコースレベルを、６時間の日中の食物中止後に測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。
図９Ｃは、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）中のグルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）対時間（分）を示す折れ線グラフである。試験は、ＨＦＤの肥満マウスについて２週間の処置後に行い、ビヒクル（ひし形）又は抗ａＰ２モノクローナル抗体（０．７５ｇ／ｋｇ グルコース）（ＣＡ３３；四角）（ＣＡ１５；三角）であり、＊ｐ＜０．０５である。
図１０Ａは、関連タンパク質ＦＡＢＰ３（灰色の棒）及びＦＡＢＰ５／Ｍａｌ１（薄灰色の棒）と比較したａＰ２（黒色の棒）に対する抗ａＰ２抗体ＣＡ３３及びＨ３についてのオクテット分析によって決定したシグナル相互作用（ｎｍ）の棒グラフである。
図１０Ｂは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって決定した、Ｈ３対ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、及びＣＡ２３の抗体交差遮断（ｃｒｏｓｓｂｌｏｃｋｉｎｇ）の表である。＋＋＝完全な遮断；＋＝部分的な遮断；−＝交差遮断グなし。
図１０Ｃは、水素−重水素交換質量分析法（ＨＤＸ）によって特定したＣＡ３３及びＨ３との相互作用に関与するａＰ２残基のエピトープ配列を示す。相互作用する残基には下線を付す。
図１０Ｄは、ａＰ２と共結晶化したＣＡ３３のＦａｂ及びａＰ２と共結晶化したＨ３のＦａｂの重ね合わせた画像である。
図１０Ｅは、ａＰ２上のＣＡ３３エピトープの高解像度マッピングである。両方の分子における相互作用する残基を示す。水素結合を破線で示す。ａＰ２におけるＫ１０の側鎖は、Ｙ９２のフェニル側鎖と疎水性相互作用を生じる。
図１０Ｆは、ＩｇＧコントロール抗体（丸）又はＣＡ３３抗体（四角）の存在下での、ａＰ２へのパリナリン酸（ｐａｒａｎａｒｉｃ ａｃｉｄ）結合（相対的な蛍光）対ｐＨを示す折れ線グラフである。
図１０Ｇは、例２で検討した１２５Ｉグルカゴン結合を示すグラフである。抗マウスＩｇＧ ＳＰＡビーズを、１２５Ｉグルカゴンを有する野生型又はａＰ２ノックアウトマウス由来の血清と共にインキュベートした。ｘ軸は、野生型及びａＰ２欠失マウスにおける異なる抗ａＰ２抗体のグルカゴン結合を、バックグラウンドＣＰＭを除去して示す。
図１０Ｈは、例２で検討した１２５Ｉグルカゴン結合を示すグラフである。抗マウスＩｇＧ ＳＰＡビーズを、１２５Ｉグルカゴンを有する野生型又はａＰ２ノックアウトマウス由来の血清と共にインキュベートした。ｘ軸は、野生型及びａＰ２欠失マウスにおける異なる抗ａＰ２抗体のグルカゴン結合をインプットのパーセンテージとして示す。
図１１Ａは、３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクルの処置前（白抜き棒）及びその後（中実棒）のＨＦＤ誘発性肥満ａＰ２−／−マウスにおける絶食時血中グルコース（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフである。
図１１Ｂは、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）の中のＨＦＤ誘発性肥満ａＰ２−／−マウスにおけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す折れ線グラフである。試験は、ａＰ２−／−マウスについて２週間のビヒクル（三角）又はＣＡ３３抗体処置（四角）後に実施した。
図１１Ｃは、３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置（ｎ＝１０のマウス／群）の前（白抜き棒）及び後（中実棒）のｏｂ／ｏｂマウスにおける絶食時血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフである。＊＊ｐ＜０．０１。
図１１Ｄは、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）中のｏｂ／ｏｂマウスにおけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）対時間（分）を示す折れ線グラフである。この試験は、ａＰ２−／−マウスについて２週間のビヒクル（三角）又はＣＡ３３抗体処置（四角）の後に行った。＊ｐ＜０．０５。
図１１Ｅは、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）中のｏｂ／ｏｂマウスにおけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）対時間（分）を示す折れ線グラフである。この試験は、ａＰ２−／−マウスについて３週間のビヒクル（三角）又はＣＡ３３抗体処置（四角）の後に行った。
図１１Ｆは、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）中のｏｂ／ｏｂマウスにおけるグルコースＡＵＣレベル対時間（分）を示す棒グラフである。この試験は、ａＰ２−／−マウスについて３週間のビヒクル（三角）又はＣＡ３３抗体処置（四角）の後に行った。
図１２Ａは、高脂肪食餌摂食マウスについて、高親和性抗体（ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３、及びＨ３）を使用した、２週間の選択的抗体処置対ビヒクルコントロール後に行なったグルコース負荷試験（ＧＴＴ）におけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）対時間（分）を示す線グラフである。
図１２Ｂは、高脂肪食餌摂食マウスについて、高親和性抗体（ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３、及びＨ３）を使用した、３週間の選択的抗体処置対ビヒクルコントロール後に行なったインスリン負荷試験（ＩＴＴ）におけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）対時間（分）を示す線グラフである。
図１２Ｃは、ａＰ２ノックアウトマウスに、グルカゴンと共に、ａＰ２投与をすることにより、グルカゴンの不応答性が救済され、ＣＡ３３及びａＰ２とのプレインキュベーションにより、それが妨げられることを示す線グラフである。
図１２Ｄは、ａＰ２ノックアウトマウスに、ａグルカゴンと共に、Ｐ２投与することにより、グルカゴンの不応答性が救済され、ＣＡ３３及びａＰ２とのプレインキュベーションにより、それが妨げられることを示す棒グラフである。
図１３は、抗ヒトグルカゴン／ａＰ２複合体ヒト化カッパ軽鎖可変領域抗体フラグメントを提供し、９０９配列はウサギ可変軽鎖配列であり、９０９ｇＬ１、ｇＬ１０、ｇＬ１３、ｇＬ５０、ｇＬ５４及びｇＬ５５配列はアクセプターフレームワークとしてＩＧＫＶ１−１７ヒト生殖細胞系列を使用した９０９可変軽鎖のヒト化グラフトである。ＣＤＲは太字／下線で表示され、適用可能なドナー残基は太字／斜体で表示され、強調されている：２Ｖ、３Ｖ、６３Ｋ及び７０Ｄ。システイン残基を除去するためのＣＤＲＬ３における突然変異は太字／下線で示されており、強調されている：９０Ａ。
図１４Ａは、抗ヒトグルカゴン／ａＰ２ヒト化重鎖可変領域抗体フラグメントを提供し、９０９配列はウサギ可変重鎖配列であり、９０９ｇＨ１、ｇＨ１４、ｇＨ１５、ｇＨ６１及びｇＨ６２配列はアクセプターフレームワークとしてＩＧＨＶ４−４ヒト生殖細胞系列を使用した９０９可変重鎖のヒト化グラフトである。ＣＤＲは太字／下線で示される。ベータシートストランドＤとＥとの間のループにおけるフレームワーク３内の２つの残基ギャップはｇＨ１で強調されている：７５及び７６。適用可能なドナー残基は太字／斜体で示され、強調されている：２３Ｔ、６７Ｆ、７１Ｋ、７２Ａ、７３Ｓ、７４Ｔ、７７Ｔ、７８Ｖ、７９Ｄ、８９Ｔ及び９１Ｆ。システイン残基を除去するためのＣＤＲＨ２における突然変異は太字／下線で示され、強調されている：５９Ｓ。潜在的なアスパルタート異性化部位を除去するためのＣＤＲＨ３における突然変異は太字／下線で示され、強調されている：９８Ｅ。Ｎ末端グルタミン残基はグルタミン酸と置き換えられ、太字で示され、強調されている：１Ｅ。
図１４Ｂは、本明細書では、グルカゴンに対するｃＡＭＰ応答によって示されるように、ＣＡ３３とのａＰ２のインキュベーションが、ａＰ２のグルカゴン増強効果をブロックすることを示す棒グラフである。ｘ軸は異なる抗ａＰ２抗体を含み、ｙ軸は発光である。
図１４Ｃは、本明細書では、グルカゴンに対するｃＡＭＰ応答によって示されるように、セリン突然変異体（Ｃ２Ｓ）はａＰ２の効果を減少させないことを示す棒グラフである。ｘ軸は野生型ａＰ２及びａＰ２突然変異体であり、ｙ軸は発光である。
図１５は、ビヒクル又は抗ａＰ２−グルカゴンモノクローナル抗体で処置した食餌誘発肥満のマウスにおけるグルカゴンチャレンジ試験中のグルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）対時間（分）を示す折れ線グラフである。
図１６は、グルカゴン、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、又はグルカゴンプラスｍＡｂへの結合ａＰ２の結合親和性（ｎｍ）対時間（秒）を示すグラフである。
図１７Ａから１７Ｂは、グルカゴンでの処理をすることなく、ａＰ２での処理の１５分後に、ＧＣＧＲ−ＧＦＰを発現するＵ２−ＯＳ細胞の生細胞顕微鏡画像である。グルカゴンでの処理を行わない場合、細胞へのａＰ２の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）は最小限であることが観察された（例６）。
図１７Ｃから１７Ｅは、グルカゴン及びａＰ２での処置の３０分後にＧＣＧＲを発現するＵ２−ＯＳ細胞の生細胞顕微鏡画像である。ＧＣＧ−ＧＦＰシグナル及びａＰ２シグナルの共局在化を白色で示す。ａＰ２の内在化は、グルカゴン刺激の存在下で非常に増加した（例６）。
図１７Ｆは、ａＰ２＋／＋及びａＰ２−／−細胞株由来の細胞の膵島領域の顕微鏡画像を比較するグラフである。画素数の差は、２種の細胞株の間で有意ではなかった。例７で検討したように、ａＰ２欠失はアルファ細胞過形成を引き起こさない。２種の細胞株はｘ軸上に示され、画素数はｙ軸上に示される。
図１７Ｇは、ａＰ２＋／＋及びａＰ２−／−細胞株由来の細胞におけるグルカゴン陽性染色の顕微鏡画像を比較するグラフである（例７）。画素数の差は、２種の細胞株の間で有意ではなかった。２種の細胞株はｘ軸上に示され、画素数はｙ軸上に示される。
図１７Ｈは、ａＰ２＋／＋及びａＰ２−／−細胞株由来の細胞におけるグルカゴン陽性染色及び膵島領域の顕微鏡画像を比較するグラフである（例７）。画素数の差は、２種の細胞株の間で有意ではなかった。２種の細胞株はｘ軸上に示され、画素数はｙ軸上に示される。
図１７Ｉは、例７で検討したように、ａＰ２＋／＋細胞株由来の細胞の生細胞顕微鏡画像である。
図１７Ｊは、ａＰ２−／−細胞株由来の細胞の生細胞顕微鏡画像である。ａＰ２＋／＋細胞株由来の細胞（図１７Ｉ）と比較して、ａＰ２−／−細胞は過形成を示さない（例７）。過形成は、ａＰ２欠失と区別できる特徴であるグルカゴン受容体の拮抗作用の結果である。
発明の詳細な説明
本発明は、グルカゴンが、必要的結合パートナーとしてのａＰ２と複合体を形成し、グルカゴン受容体を活性化させ、最終的に、肝臓グルコース産生を促進するという発見に基づいている。一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２複合体の能力によって、グルカゴン受容体に結合するのを変化させることにより、グルカゴンシグナル伝達活性を破壊し、過剰な肝臓グルコース産生を調節し、血中グルコースレベルを低下させる。このような発見により、被験体、例えば、ヒトの慢性的な上昇した血中グルコースレベルに取り組む新規な方法、及び慢性的な上昇した血中グルコースレベルに関連する障害を治療するのに有用な化合物を同定するための新規な方法を提供する。
この発見に基づいて、グルカゴン／ａＰ２複合体の能力によってグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）を作動させるのを妨害することができる化合物を同定するための方法を提供する。このような化合物は、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とすることによって、ヒト又は他の哺乳類動物におけるグルカゴンシグナル伝達活性を減少させることができる。一実施形態では、化合物は、抗体、抗体結合剤、又はフラグメントである。一実施形態では、化合物は、ａＰ２及び／又はグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する。一実施形態では、抗体、薬剤又はフラグメントは、例えば、１０−７Ｍよりも大きいＫｄを有する、ａＰ２の緩い結合剤である。
それを必要とする宿主に投与する場合、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントは、ａＰ２と結合するグルカゴンの活性を中和し、肝臓グルコース産生の低下、及び／又は血中グルコースレベルの低下、及び／又は慢性的な高血糖症の発生の減少をもたらす。従って、ａＰ２とグルカゴンの相互作用を標的とすることにより、非制限的に、糖尿病（１型及び２型の両方）、高血糖、糖尿病性ケトアシドーシス、高血糖高浸透圧症候群、心血管疾患、糖尿病性腎症又は腎不全、糖尿病性網膜症、絶食時グルコース異常、グルコース耐性異常、脂質異常症、肥満、白内障、脳卒中、創傷治癒障害、周術期高血糖、集中治療室の患者における高血糖及びインスリン抵抗症候群を含む血中グルコースレベルの増加と関連する代謝障害を治療することができる。特定の実施形態では、それを必要とする被験体に投与する場合、抗体又は抗原結合剤は、脂肪量、肝臓脂肪変性の減少、血清脂質プロファイルの改善、及び／又は被験体におけるアテローム性プラーク形成の減少又は維持に有用である。従って、本明細書に記載の抗体及び抗原結合剤は、非限定的に、糖尿病（１型及び２型の両方）、高血糖、肥満、脂肪肝疾患、又は脂質異常症を含む異常又は過剰な血中グルコースレベルをもたらす、調節不全グルカゴン活性に関連する代謝障害を治療するのに特に有用である。
従って、本発明は、少なくとも以下を提供する：
（ａ） 本明細書に記載した治療で使用するための、ＧＣＧＲに対するグルカゴン／ａＰ２の作動活性を調節し／これに影響を与え、好ましくは中和する化合物を同定するための方法。
（ｂ） 本明細書に記載したように、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメント、又はその記載したバリアント若しくはそのコンジュゲートを投与することによって、グルカゴン／ａＰ２複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす、グルカゴン受容体シグナル伝達活性を調節する方法。
（ｃ） 亢進したグルカゴン媒介性障害に罹患する被験体、特にヒトを治療する方法であって、前記被験体に抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメント、又はその記載したバリアント若しくはコンジュゲートを投与することによって、グルカゴン／ａＰ２複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす、方法。
（ｄ） 上昇した血中グルコースレベルを有する被験体、特にヒトを治療する方法であって、前記被験体に、抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメント、又はその記載したバリアント若しくはコンジュゲートを投与することによって、グルカゴン／ａＰ２複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす、方法。
（ｅ） 抗体、抗原結合剤、又は抗体フラグメントに結合したａＰ２との複合体中のグルカゴンを含む組成物。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
一般的な定義
他に定義されない限り、本明細書にて使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書にて挙げられている全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体を参照により援用する。矛盾する場合は、定義を含む本明細書によって支配する。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定することを意図していない。
文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本出願では、「又は」の使用は、他に記載がない限り、「及び／又は」を意味する。更に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の用語の使用は、限定的ではない。「要素」又は「構成要素」等の用語もまた、特に他に断りがない限り、１つの単位を含む要素及び構成要素と、２つ以上のサブユニットを含む要素及び構成要素との両方を包含する。
一般的に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及びそれらの技術は、当技術分野において周知のものであり、かつ一般的に使用されているものである。本発明の方法及び技術は、他に指示がない限り、一般的に、当技術分野で周知の、及び本明細書全体を通して引用され及び検討された様々な総論的な及びより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って行われる。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般的に達成されるか、又は本明細書に記載されるように、製造者の仕様書に従って実施され得る。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医薬及び製薬化学に関連して使用される命名法並びに実験手順及び技法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤、送達、及び患者の治療に使用される。
本発明を、より容易に理解するために、選択した用語を以下に定義する。
本明細書で使用される「宿主」、「被験体」又は「患者」という用語は、典型的にはヒト被験体を指し、特にヒト又はヒト化フレームワークがアクセプター構造として使用される場合を指す。別の宿主を治療する場合には、拒絶を回避するために、又はより適合性を高めるために、抗体又は抗原結合剤をその宿主に合わせて調整する必要があり得ることは、当業者に理解される。本発明にて、ＣＤＲをいかに使用し、それらを、ある範囲の宿主に対して望ましい送達及び機能のために、適切なフレームワーク又はペプチド配列にいかに組み入れるかは知られている。他の宿主には、他の哺乳動物又は脊椎動物種が含まれていてもよい。従って、「宿主」という用語は、或いは、マウス、サル、イヌ、ブタ、ウサギ、家畜化されたブタ科動物（ブタ及びイノシシ）、反芻動物、ウマ、家禽、ネコ科動物、ネズミ科動物、ウシ科動物、イヌ科動物等の動物を指していてもよく、必要な場合には、抗体又は抗原結合剤は、宿主との適合性のために適切に設計される。
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、ポリペプチドの用語と互換的に使用され、アミノ酸のポリマー鎖もまた指す。「ポリペプチド」という用語には、自然の又は人工のタンパク質、タンパク質フラグメント、及びタンパク質配列のポリペプチド類似体が含まれる。ポリペプチドは、モノマー又はポリマーであってもよい。
「ヒトａＰ２タンパク質」又は「ヒトＦＡＢＰ４／ａＰ２タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｂａｘａ，Ｃ．Ａ．、Ｓｈａ，Ｒ．Ｓ．、Ｂｕｅｌｔ，Ｍ．Ｋ．、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｊ．、Ｍａｔａｒｅｓｅ，Ｖ．，Ｃｈｉｎａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｌ．、Ｂｏｕｎｄｙ，Ｋ．Ｌ．、Ｂｅｒｎｌｏｈｒ，Ａ．によって、Ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ： ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：８６８３−８６９０、１９８９年に記載された、配列番号１によりコードされるタンパク質、及びその天然のバリアントを指す。
「マウスａＰ２タンパク質」又は「マウスＦＡＢ４Ｐ／ａＰ２タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、配列番号２によりコードされるタンパク質、及びその天然のバリアントを指す。マウスタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに番号Ｐ０４１１７の下で登録されている。
「抗原結合剤」には、本明細書中で使用する場合、一本鎖抗体（即ち、完全長重鎖及び軽鎖）；Ｆａｂ、改変型Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変型Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、例えば、ＷＯ２００１０９０１９０に記載された単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリボディ（ｔｏｒｉｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）及び上記のいずれかのエピトープ−抗原結合剤が含まれる（参照：例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ２（３）、２０９−２１７）。これらの抗体フラグメントを作製し、製造する方法は、当技術分野において周知である（参照：例えば、Ｖｅｒｍａら，１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１）。Ｆａｂ−Ｆｖ形式は、ＷＯ２００９／０４０５６２に初めて開示され、そのジスルフィド安定化型であるＦａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２に初めて開示された。本発明で使用するための他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。多価抗体には、多重特異性、例えば、二重特異性が含まれていてもよく、又は一重特異性であってもよい（参照：例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５）。後者の１つのそのような例は、ＷＯ９２／２２５８３に記載されたＴｒｉ−Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。
典型的なＦａｂ’分子には、重鎖と軽鎖の対が含まれており、該重鎖には、可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及び天然の若しくは改変されたヒンジ領域が含まれ、該軽鎖には、可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬが含まれる。
例えば、二量化のＦ（ａｂ’）２を構成するＦａｂ’の二量体は、本明細書に記載した天然のヒンジ配列又はその誘導体、又は合成のヒンジ配列を介してもよい。
「特異的結合」又は「特異的に結合する」の用語は、本明細書で使用する場合、抗体、タンパク質、又はペプチドと、第２の化学種との相互作用を参照して、その相互作用がその化学種上の特定の構造（例えば、以下に定義する「抗原決定基」又は「エピトープ」）の存在に依存すること、例えば、抗体が、タンパク質全体よりもむしろ、特定のタンパク質構造を認識し、これに結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識化された「Ａ」と抗体とを含有する反応系にエピトープＡ（又は遊離した、未標識のＡ）を含有する分子が存在することにより、抗体に結合した標識化されたＡの量が減少する。
「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖から構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又はａＰ２に特異的に結合させるＩｇ分子のエピトープ結合特性の少なくとも幾つかの部分を保持する、その任意の機能的フラグメント、突然変異体、バリアント、若しくは誘導体を広く指す。このような突然変異体、バリアント、又は誘導抗体の形式は、当技術分野で知られており、以下に記載される。その非限定的な実施形態を以下に説明する。抗体が分子と特異的に反応して、分子を抗体に結合させることができる場合、その抗体は、分子に「結合することができる」と言う。
「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用する場合、異なる抗体の混合物を含有する「ポリクローナル」抗体調製物とは対照的に、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体分子、又はＩｇ分子の少なくともその軽鎖エピトープ結合特性を保持するその任意の機能的フラグメント、突然変異体、バリアント、若しくは誘導体の調製物を指すことが意図される。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母又はリボソームディスプレイ等の幾つか既知の技術、並びにハイブリドーマ由来の抗体（例えば、標準的なＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７）等の、ハイブリドーマ技術により調製されるハイブリドーマにより分泌される抗体）により例示される古典的方法により作製することができる。
完全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、４つのドメイン−ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３（重鎖γ、α及びδ）か、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４（重鎖μ及びε）のいずれかから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）と、軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に更に細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成される。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであってもよい。
「抗体構築物」という用語は、本明細書で使用する場合、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに結合した本発明の１つ以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により結合した２つ以上のアミノ酸残基を含み、１つ以上の抗原結合部分を結合するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは、当技術分野で周知である（参照：例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメイン、例えば、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ定常ドメインを指す。重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当技術分野では知られている。
更に、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と、１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有的又は非共有的会合により形成される、より大きい免疫付着分子の一部であってもよい。このような免疫付着分子の例には、テトラマーｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら，（１９９５年）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ６：９３−１０１）、及び二価及びビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら，（１９９４年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体部分は、抗体全体に対する、それぞれパパイン又はペプシン消化等の従来の技術を使用して、抗体全体から調製することができる。更に、抗体、抗体部分及び免疫付着分子を、本明細書に記載した標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。
「ＣＤＲグラフト化抗体」という用語は、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬの１つ以上のＣＤＲ領域の配列が、別の種のＣＤＲ配列と置き換えられた抗体、例えば、１つ以上のヒトＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）がネズミ科動物のＣＤＲ配列と置き換えられたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。
「Ｋａｂａｔ番号付け」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当技術分野で認識されるこれらの用語は、抗体、又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変性である（即ち、超可変性である）アミノ酸残基を番号付けるシステムを指す（Ｋａｂａｔら、（１９７１年）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うアミノ酸位置３１から３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０から６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５から１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）の範囲にある。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１−９１７（１９８７年））従うと、ＣＤＲ−Ｈ１と同等のループは、残基２６から残基３２に延びている。従って、他に示さない限り、本明細書で用いられる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムと、Ｃｈｏｔｈｉａの位相ループ定義との組合せにより記載され、残基２６から３５を指すことが意図される。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲＬ１についてはアミノ酸２４位から３４位、ＣＤＲＬ２についてはアミノ酸５０位から５６位、及びＣＤＲＬ３についてはアミノ酸８９位から９７位の範囲にある。
本明細書で使用する場合、「アクセプター」及び「アクセプター抗体」という用語は、１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供する、又はコードする抗体又は核酸配列を指す。幾つかの実施形態では、「アクセプター」という用語は、定常領域（単数又は複数）を提供する、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。更に別の実施形態では、「アクセプター」という用語は、１つ以上のフレームワーク領域及び定常領域（単数又は複数）を提供する、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。特定の実施形態では、「アクセプター」という用語は、１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％を提供する、又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。この実施形態によれば、アクセプターには、ヒト抗体の１つ以上の特定の位置に存在しない少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有してもよい。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域（単数又は複数）を、例えば、生殖細胞系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体、又は市販の抗体）から誘導するか、又は得ることができる。
本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれには、３個のＣＤＲが存在し、重鎖ＣＤＲについてはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と称され、軽鎖ＣＤＲについてはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と称される。本明細書で使用する場合、「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域中に存在する３個のＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔにより記載されたシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７年）及び（１９９１年））は、抗体の任意の可変領域に適用可能な一義的な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３個のＣＤＲを定義する正確な残基境界もまた提供する。これらのＣＤＲを、ＫａｂａｔのＣＤＲと称することができる。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７年）及びＣｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７−８８３（１９８９年））は、ＫａｂａｔのＣＤＲ内のある特定のサブ部分が、アミノ酸配列レベルで大きな多様性を有するにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を採ることを見出した。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と称され、ここで、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖及び重鎖領域を指す。これらの領域は、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲと称することができ、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５年））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２（５）：７３２−４５（１９９６年））によって記載されている。更に他のＣＤＲ境界の定義は、上記のシステムの１つに厳密には従わなくてもよいが、特定の残基又は残基群又はＣＤＲ全体であっても、抗原結合に有意に影響しないという予測又は実験的知見を考慮して、それらを短縮又は延長することができるにも拘わらず、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するであろう。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを用いてもよいが、好ましい実施形態では、Ｋａｂａｔ若しくはＣｈｏｔｈｉａ、又はその混合により定義されたＣＤＲを使用する。
本明細書で使用する場合、「標準」残基の用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９０７（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２年）、両方とも参照により本明細書に援用する）により定義された特定の標準ＣＤＲ構造を定義するＣＤＲ又はフレームワーク中の残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａらによれば、多くの抗体のＣＤＲの重要な部分は、アミノ酸配列レベルでの大きな多様性にも拘わらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を有する。各標準構造により、主として、ループを形成するアミノ酸残基の連続的なセグメントのためのペプチド骨格ねじれ角のセットが特定される。
本明細書で使用する場合、「ドナー」及び「ドナー抗体」という用語は、１つ以上のＣＤＲを提供する抗体を指す。好ましい実施形態では、ドナー抗体は、フレームワーク領域が取得又は誘導される抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体の文脈では、「ドナー抗体」という用語は、１つ以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を指す。
本明細書で使用する場合、「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」という用語は、可変領域からＣＤＲを引いた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は種々のシステムによって決定することができるため、フレームワーク配列の意味は、対応する種々の解釈に供される。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２及びＬ３並びに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）もまた、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域を、各鎖上の４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ここで、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４と特定することなく、フレームワーク領域は、他のものによって称される場合、単一の自然に生じる免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲの組合せを表す。本明細書で使用する場合、ＦＲ（単数）は４つのサブ領域の１つを表し、ＦＲ（複数）はフレームワーク領域を構成する４つのサブ領域のうちの２つ以上を表す。
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、当技術分野で知られている。
本明細書で使用する場合、「生殖細胞系列抗体遺伝子」又は「遺伝子フラグメント」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝子再配列及び突然変異をもたらす成熟プロセスを受けていない非リンパ系細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す。例えば、Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００（２００２年）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０（２００１年）を参照されたい。本発明の様々な実施形態により提供される利点の１つとしては、生殖細胞系列抗体遺伝子が、成熟抗体遺伝子よりも、種の個体に特徴的な必須アミノ酸配列構造を保存する可能性が高いので、その種に治療的に使用した場合の外来起源に由来するものと認識される可能性は低いという認識を利用することである。
本明細書で使用する場合、「重要な」残基の用語は、抗体、特に、ヒト化抗体の結合特異性及び／又は親和性に、より多くの影響を有する可変領域内の、ある特定の残基を指す。重要な残基には、非限定的に、１つ以上の、以下のものが含まれる：即ち、ＣＤＲに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位（Ｎ−又はＯ−グリコシル化部位のいずれかであり得る）、稀な（ｒａｒｅ）残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、標準残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触残基、バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）ゾーン内の残基、及び可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａの定義と、第１の重鎖フレームワークのＫａｂａｔの定義との間で重複する領域中の残基である。
「ヒト化抗体」という用語は、一般的に、非ヒト種（例えば、ウサギ、マウス等）に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、そのＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒトのように」なるように、即ち、ヒト生殖細胞系列可変配列に、より類似するように変化した抗体を指す。１つの型のヒト化抗体は、ヒトＣＤＲ配列を非ヒトＶＨ及びＶＬ配列中に導入して、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置き換えた、ＣＤＲグラフト化抗体である。別の型のヒト化抗体は、少なくとも１つの非ヒトＣＤＲをヒトフレームワーク中に挿入した、ＣＤＲグラフト化抗体である。典型的には、本発明は後者に焦点を置いている。
特に、「ヒト化抗体」の用語は、本明細書で使用する場合、目的の抗原に免疫特異的に結合し、かつ、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又はそのバリアント、誘導体、類似体若しくはフラグメントである。本明細書で使用する場合、ＣＤＲの文脈における「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。一実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト抗体ＣＤＲと比較して、１つ以上（例えば、１、２、３又は４）のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を有するＣＤＲ領域を有する。更に、非ヒトＣＤＲを、既知の技術を使用して、より「ヒトのように」するか、又はヒトの身体と適合するように操作することができる。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（即ち、ドナー抗体）のものと一致し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）ｃ、Ｆｖ）の実質的に全てを含む。好ましくは、ヒト化抗体は、更に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部もまた含む。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖及び重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体は、更に、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４もまた含み得る。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。
ヒト化抗体を、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、並びに非限定的に、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、１より多いクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、特定の定常ドメインを、当技術分野で周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化するように選択することができる。
ヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列と正確に一致する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークを、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によって突然変異させて、その部位でのＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれかと正確に一致しないようにすることができる。しかしながら、好ましい実施形態では、このような突然変異は、広範囲には及ばないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、９８％又は９９％が、親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものと一致する。一実施形態では、１つ以上（例えば、１、２、３又は４）のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失が、親ＦＲ及びＣＤＲ配列と比較して、ヒト化抗体中に存在してもよい。本明細書で使用する場合、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書で使用する場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリーに最も頻繁に存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を指す（参照：例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ１９８７年）。免疫グロブリンのファミリーでは、コンセンサス配列中の各位置は、そのファミリーでその位置に最も頻繁に存在するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が等しく頻繁に存在する場合、いずれかがコンセンサス配列中に含まれ得る。
本明細書で使用する場合、「バーニア」ゾーンは、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９、参照により本明細書に援用する）により記載された、ＣＤＲ構造を調整し、抗原への適合を微調整することができるフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲの下に層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に対して影響し得る。
本明細書中で使用する場合、「中和」という用語は、化合物が、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の能力を特異的に妨害する場合の、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体活性の生物学的活性の無効化（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を指す。好ましくは、中和結合タンパク質、例えば、抗体は、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体への結合により、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の生物学的活性の中和をもたらす、結合タンパク質である。好ましくは、中和結合タンパク質は、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の生物学的活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、８０％、８５％、又はそれ以上低減させる。中和抗体によるグルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の生物学的活性の中和は、本明細書に記載したグルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体生物学的活性の１つ以上の指標を測定することによって評価することができる。
本明細書で使用する場合、「中和モノクローナル抗体」は、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体に結合すると、グルカゴン受容体を活性化するグルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の能力である、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体活性の生物学的活性を部分的に又は完全に阻害又は低減させることができる、抗体分子の調製物を指す。
「血中グルコースレベル」という用語は、血中グルコース濃度を意味するものとする。特定の実施形態では、血中グルコースレベルは、血漿グルコースレベルである。血漿グルコースは、例えば、Ｅｔｇｅｎら、（２０００年）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、４９（５）：６８４−６８８に従って決定することができ、又はＤ’Ｏｒａｚｉｏら、（２００６年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，４４（１２）：１４８６−１４９０に従って全血中グルコース濃度の変換から計算することができる。
「正常なグルコースレベル」という用語は、絶食レベルでは約１００ｍｇ／ｄＬ未満、及び食後２時間のレベルでは１４５ｍｇ／ｄＬ未満又はランダムグルコースでは１２５ｍｇ／ｄＬ未満のヒトの平均血漿グルコース値を指す。「上昇した血中グルコースレベル」又は「血中グルコースの上昇したレベル」という用語は、臨床的に不適切な基礎の及び食後の高血糖を示す被験体に見られるような、又は、絶食条件下で試験した場合に１００ｍｇ／ｄＬより高く、１時間で試験した場合に約２００ｍｇ／ｄＬより高い「血中グルコースの上昇したレベル」を有する経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ）での被験体に見られるような、上昇した血中グルコースレベルを意味するものとする。
本明細書で使用する場合、「減弱化」、「減弱化させる」等の用語は、上昇した血中グルコースレベルによって引き起こされた症状又は状態の重症度の軽減又は低減を指す。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基が含まれる。特定の実施形態では、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニル等の分子の化学的に活性な表面基が含まれ、特定の実施形態では、特異的三次元構造特性及び／又は特異的電荷特性を有してもよい。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
「Ｋｄ」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体と抗原との間の結合（会合及び解離）速度の尺度であり、抗体結合反応の固有の結合強度を決定する親和性（又は親和性定数）を指すことを意図している。
本明細書中で使用する場合、「グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する」という用語は、化合物が、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はＧＣＧＲ単独よりも、複合体のグルカゴン／ａＰ２に対して、より高い親和性を有することを意味する。例えば、グルカゴン／ａＰ２に対する化合物の親和性は、グルカゴン、ａＰ２、及び／又はＧＣＧＲ単独に対するその親和性よりも、約１から２のオーダー高い場合がある。従って、一実施形態では、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はＧＣＧＲよりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する化合物は、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はＧＣＧＲ単独に対するその結合親和性よりも１のオーダー高い親和性を有する。一実施形態では、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はＧＣＧＲよりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する化合物は、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はＧＣＧＲ単独に対するその結合親和性よりも、２のオーダー高い親和性を有する。一実施形態では、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はＧＣＧＲよりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する化合物は、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はＧＣＧＲ単独に対するその結合親和性よりも、３のオーダー高い親和性を有する。抗体、抗原結合剤又は抗体フラグメントの場合、親和性は、抗体とその抗原との間の平衡解離定数（ＫＤ）、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として測定することができる。ＫＤ及び親和性は反比例する。ＫＤ値は、抗体の濃度（特定の実験に必要な抗体の量）に関係し、ＫＤ値が低い（濃度が低い）程、抗体の親和性は高くなる。一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２複合体に対する化合物のＫＤ値は１０−７より低く、ａＰ２、グルカゴン、又はＧＣＧＲに対するＫＤ値は１０−７より高い。一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２に結合する化合物のＫＤ値は、約１０−１０と１０−８との間であり、一方、グルカゴン、ａＰ２、及び／又はＧＣＧＲに結合する化合物のＫＤ値は、１０−８より高い。一実施形態では、ａＰ２、グルカゴン、又はＧＣＧＲに結合する化合物のＫＤ値は、１０−７より高い。
「結晶」及び「結晶化した」という用語は、本明細書で使用する場合、結晶の形態で存在する、抗体、又はその抗原結合部分を指す。結晶は、非晶質固体状態又は液晶状態等の他の形態とは異なる、物質の固体状態の一形態である。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体等のタンパク質）、又は分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な、反復的な三次元配置から構成される。これらの三次元配置は、当分野でよく理解されている特定の数学的関係に従って配置される。結晶中で反復される基本単位、又はビルディングブロックは、非対称単位と呼ばれる。所与の、明確に定義された結晶学的対称性に一致する配置中での非対称単位の反復により、結晶の「単位胞」が得られる。全ての三次元における規則的並進による単位胞の反復により、結晶が得られる。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．及びＤｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ ｅａ．，ｐｐ．２０１−１６，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９９９年）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、障害又はその１つ以上の症状の重症度及び／又は持続時間を軽減又は改善し、障害の進行を妨げ、障害の軽減を生じさせ、障害と関連する１つ以上の症状の再発、発症、開始又は進行を防止し、障害を検出し、或いは別の治療（例えば、予防剤又は治療剤）の予防効果又は治療効果（単数若しくは複数）を増強又は改善するのに十分である治療の量を指す。
グルカゴン及びグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）
グルカゴンは、プロホルモン及びプロニューロペプチドの細胞内成熟に関与する神経内分泌特異的プロテアーゼであるプロホルモンコンバターゼ２（ＰＣ２）の細胞特異的発現によって、膵臓アルファ細胞でそのプレ−プロ−形態からプロセスを経て得られる２９アミノ酸ホルモンである（Ｆｕｒｕｔａら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２７１９７−２７２０２）。インビボでは、グルカゴンは、インスリン作用に対する主要な逆調節ホルモンである。絶食時には、グルカゴンの分泌は、グルコースレベルの低下に応答して増加する。グルカゴンの分泌の増加により、肝臓のグリコーゲン分解及び糖新生が促進されることによって、グルコース産生が刺激される（Ｄｕｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｒｉｃｈ（２００７年）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ２８：２５３−２８３）。従って、グルカゴンは、動物において正常なグルコースレベルを維持する際にインスリンの効果を平衡化させる。
グルカゴンアミノ酸配列は：
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号８２）
グルカゴンの生物学的効果は、特定の細胞表面受容体であるグルカゴン受容体の結合及びその後の活性化により媒介される。グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のセクレチンサブファミリー（ファミリーＢ）のメンバーである。ＧＰＣＲは、細胞外物質に結合し、典型的にはｃＡＭＰシグナル経路又はホスファチジルイノシトールシグナル経路のいずれかを活性化するＧタンパク質と呼ばれる細胞内分子にシグナルを伝達する、細胞膜に位置する７回膜貫通型受容体である。ヒトＧＣＧＲは、４７７アミノ酸配列ＧＰＣＲであり、ＧＣＧＲのアミノ酸配列は、種間で高度に保存されている（Ｍａｙｏら、（２００３年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．５５：１６７−１９４）。グルカゴン受容体は、肝臓（肝臓グルコース産生量(ｏｕｔｐｕｔ)を調節する）、腎臓、及び膵島β細胞（糖新生における役割をリフレクトする）、腸平滑筋、脳及び脂肪組織で主に発現する。肝臓のグルカゴン受容体の活性化により、アデニル酸シクラーゼの活性、及びホスホイノシトールの代謝回転が刺激されて、これに引き続いて肝臓グルコース産生のレベルの増加、細胞内ｃＡＭＰの増加、グリコーゲン分解の増加、及びホスホエノールピルバートカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース−１，６−ビスホスファート（ＦＢＰａｓｅ−１）及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）を含むグルコネオゲネシス酵素の発現の増加をもたらす。更に、グルカゴンシグナル伝達は、グリコーゲンホスホリラーゼを活性化し、グリコーゲンシンターゼを阻害する。研究から、グルカゴンの基礎レベルがより高いこと及び食後のグルカゴン分泌の抑制が欠如していることが、ヒトの糖尿病状態の一因であることが示されている（Ｍｕｌｌｅｒら、（１９７０年）ＮＥＪＭ２８３：１０９−１１５）。最近、糖尿病の表現型の原因は、インスリン欠乏よりもむしろ、過剰なグルカゴン活性であることが示唆されている（Ｕｎｇｅｒ ＲＨ、Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ ＡＤ．Ｇｌｕｃａｇｏｎｏｃｅｎｔｒｉｃ ｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍａｋｅｏｖｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２年１月３日；１２２（１）４−１２）。
脂肪細胞タンパク質２（ａＰ２）
脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）としても知られるヒト脂肪細胞脂質結合タンパク質（ａＰ２）は、脂質の輸送及び貯蔵に関与する細胞内脂質結合タンパク質のファミリーに属する（Ｂａｎｚｓｚａｋら（１９９４年）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．４５、８９−１５１）。ａＰ２タンパク質は、脂肪分解及び脂質生成に関与し、糖尿病、アテローム性動脈硬化症及び代謝症候群等の脂質及びエネルギー代謝の疾患において示されている。更に、ａＰ２は、代謝及び炎症応答系の統合においても示されている（Ｏｚｃａｎら、（２００６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３（５７９０）：１１３７−４０；Ｍａｋｏｗｓｋｉら、（２００５年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０（１３）：１２８８８−９５；及びＥｒｂａｙら、（２００９年）Ｎａｔ Ｍｅｄ．１５（１２）：１３８３−９１）。より最近では、ａＰ２は、ある特定の脂肪肉腫等のある特定の軟組織腫瘍において特異的に発現されることが示されている（Ｋａｓｈｉｍａら、（２０１３年）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．４６２，４６５−４７２）。
ａＰ２は、脂肪細胞中で高度に発現され、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）アゴニスト、インスリン、及び脂肪酸により調節される（Ｈｅｒｔｚｅｌら、（２０００年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１１，１７５−１８０；Ｈｕｎｔら、（１９８６年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３、３７８６−３７９０；Ｍｅｌｋｉら、（１９９３年）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４，１５２７−１５３４；Ｄｉｓｔｅｌら，（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，５９３７−５９４１）。ａＰ２欠失マウス（ＦＡＢＰ４−／−）における研究から、遺伝的又は食餌誘導性肥満と関連するインスリン耐性の発生に対する保護並びにＣ１６：１ｎ７−パルミトレアートのレベルが増加した脂肪組織における脂質プロファイルの改善、肝臓脂肪変性の減少、並びに肝臓グルコース産生及び末梢グルコース処理の制御の改善が示される（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌら、（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４，１３７７−１３７９；Ｕｙｓａｌら、（２０００年）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４１，３３８８−３３９６；Ｃａｏら、（２００８年）Ｃｅｌｌ １３４，９３３−９４４）。
更に、ａＰ２の遺伝的欠失又は薬理学的遮断によって、アポリポタンパク質Ｅ欠失（ＡｐｏＥ−／−）マウスモデルにおける初期と進行性の両方のアテローム性動脈硬化病変が減少する（Ｆｕｒｕｈａｓｈｉら、（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ，Ｊｕｎ２１；４４７（７１４７）：９５９−６５；Ｍａｋｏｗｓｋｉら，（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．７，６９９−７０５；Ｌａｙｎｅら、（２００１年）ＦＡＳＥＢ１５，２７３３−２７３５；Ｂｏｏｒｄら、（２００２年）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓ．Ｂｉｏ．２２，１６８６−１６９１）。更に、ａＰ２欠失は、アポリポタンパク質Ｅ欠失（ＡｐｏＥ−／−）マウスにおける初期及び進行性アテローム性動脈硬化症に対して顕著な保護をもたらす（Ｍａｋｏｗｓｋｉら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．７，６９９−７０５；Ｆｕら，（２０００年）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４１，２０１７−２０２３）。従って、ａＰ２は、前臨床モデルにおける代謝疾患の発生の多くの態様において重要な役割を果たす。
過去２０年で、ＦＡＢＰの一般的な及びａＰ２の特定の生物学的機能は、細胞内タンパク質としてのその作用によると主に考えられてきた。脂肪細胞中のａＰ２タンパク質の存在量は極端に高く、最大で総細胞タンパク質の数パーセントを占めるため（Ｃａｏら、（２０１３年）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１７（５）：７６８−７８）、伝統的なアプローチを用いたａＰ２を標的とする治療は挑戦的であり、前臨床モデルにおいて得られる見込まれる成功（Ｆｕｒｕｈａｓｈｉら，（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ４４７，９５９−９６５；Ｗｏｎら、（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔ．１３，１１５７−１１６４；Ｃａｉら、（２０１３年）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍ．Ｓｉｎｉｃａ３４，１３９７−１４０２；Ｈｏｏら、（２０１３年）Ｊ．ｏｆ Ｈｅｐａｔ．５８，３５８−３６４）は、臨床的な移行に向かってゆっくりと進行してきた。
細胞質中にそれが存在することに加えて、ａＰ２は、古典的ではない調節経路を介して脂肪組織から活発に分泌されることが最近示された（Ｃａｏら，（２０１３年）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１７（５），７６８−７７８；Ｅｒｔｕｎｃら，（２０１５年）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．５６，４２３−４２４）。分泌型のａＰ２は、新規なアディポカインとして作用し、絶食及び絶食関連シグナルに応答してマウスの肝臓グルコース産生及び全身のグルコース恒常性を調節する。血清ａＰ２レベルは、肥満マウスでは有意に上昇しており、循環ａＰ２を遮断することにより、食餌誘導性肥満を有するマウスのグルコース恒常性が改善される（Ｃａｏら，（２０１３年）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１７（５）：７６８−７８）。重要なことに、同じパターンが、肥満で、分泌されるａＰ２レベルが増加しており、複数の独立したヒトの研究で代謝疾患及び心血管疾患と強く関連しているヒト集団においてもまた観察される（Ｘｕら，（２００６年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，４０５−４１３；Ｙｏｏら，（２０１１年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．＆Ｍｅｔａｂ．９６，Ｅ４８８−４９２；ｖｏｎ Ｅｙｎａｔｔｅｎら，（２０１２年）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓ．Ｂｉｏ．３２，２３２７−２３３５；Ｓｕｈら，（２０１４年）Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏ．４９，９７９−９８５；Ｆｕｒｕｈａｓｈｉら，（２００９年）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ５８，１００２−１００７；Ｋａｅｓｓら（２０１２年）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．＆Ｍｅｔａｂ．９７，Ｅ１９４３−４７；Ｃａｂｒｅら，（２００７年）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１９５，ｅ１５０−１５８）。最後に、ａＰ２発現の減少をもたらすハプロ不全対立遺伝子（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｌｌｅｌｅ）を有するヒトは、糖尿病及び心血管疾患に対して保護される（Ｔｕｎｃｍａｎら，（２００６年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ１０３，６９７０−６９７５；Ｓａｋｓｉら、（２０１４年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７，５８８−５９８）。ハーバード大学の学長及びフェローへの、「Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａＰ２ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓａｍｅ（分泌型ａＰ２及びその阻害方法）」と題するＷＯ２０１０／１０２１７１及びハーバード大学の学長及びフェロー及びＵＣＢ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ ＳＰＲＬへの、「Ａｎｔｉ−ａＰ２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（代謝性障害を治療するための抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤）」と題するＷＯ２０１６／１７６６５６は、代謝障害を調節するために循環ａＰ２を標的とする抗体の使用について記載している。
脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）は、脂質結合タンパク質（ＬＢＰ）のスーパーファミリーのメンバーである。現在まで、９種の異なるＦＡＢＰが同定されており、それぞれ、相対的組織濃縮化を示すが、それは、即ち、Ｌ（肝臓）、Ｉ（腸）、Ｈ（筋肉及び心臓）、Ａ（脂肪細胞）、Ｅ（表皮）、Ｉｌ（回腸）、Ｂ（脳）、Ｍ（ミエリン）及びＴ（精巣）である。全てのＦＡＢＰファミリーメンバーの主な役割は、脂肪酸取込み及び細胞内輸送の調節である。全てのＦＡＢＰの構造は類似しており、これらのタンパク質を特徴付ける塩基性モチーフは、β−バレルであり、脂肪酸リガンド（単数）又はリガンド（複数）（例えば、脂肪酸、コレステロール、又はレチノイド）はその内部の水で満たされたキャビティで結合している。
ハーバード大学の学長及びフェローへの、「Ａｎｔｉ−ａＰ２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｇｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」と題する、ＷＯ２０１６／１７６６５６号は、糖尿病、肥満症、心血管疾患、脂肪肝疾患、及び／又は癌等の障害を治療する際に使用するためのａＰ２に特異的なモノクローナル抗体について記載している。
ヒトａＰ２タンパク質は、表１のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１３２個のアミノ酸からなる１４．７ｋＤａの細胞内及び細胞外（分泌型）脂質結合タンパク質である。ヒトａＰ２のｃＤＮＡ配列は、Ｂａｘａ，Ｃ．Ａ．，Ｓｈａ，Ｒ．Ｓ．，Ｂｕｅｌｔ，Ｍ．Ｋ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｊ．，Ｍａｔａｒｅｓｅ，Ｖ．，Ｃｈｉｎａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｌ．，Ｂｏｕｎｄｙ，Ｋ．Ｌ．，Ｂｅｒｎｌｏｈｒ，Ａ．Ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：８６８３−８６９０，１９８９年において以前に記載されており、配列番号５にて提供される。ヒトタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに番号Ｐ１５０９０の下で登録されている。
ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する化合物を同定する方法
本発明の一態様は、本明細書に記載した治療に使用するためのＧＣＧＲに対するグルカゴン／ａＰ２の作動活性を調節し／これに影響し、好ましくはこれを中和する化合物を同定する方法に関する。一実施形態では、化合物は、ＧＣＧＲと直接的に拮抗することなく、グルカゴン、ａＰ２、及び／又はグルカゴン／ａＰ２と相互作用する。本発明の化合物は、非限定的な例として、宿主細胞における適切な核酸配列の発現によって、若しくは合成有機化学（例えば、抗体、抗体フラグメント又は抗原結合剤）を使用して産生されるペプチド、又は当技術分野で周知の従来の合成有機化学を使用して生成される非ペプチドの小さい分子を含むことができる。同定アッセイは、多数の小さい分子の同定を同時に容易に行うために自動化することができる。
化合物を同定するために使用される方法は、細胞に基づいても又は無細胞であってもよい。一実施形態では、スクリーニングは無細胞であり、化合物をスクリーニングして、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２と相互作用又は結合する能力を測定する。例えば、化合物をａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２と接触させ、次に、アッセイを実施して、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２への化合物の結合を検出する。更なる実施形態では、化合物は、ＧＣＧＲの存在下でａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２と接触させることができ、そして、ＧＣＧＲへの前記グルカゴン／ａＰ２の結合を測定して、化合物の非存在下での前記グルカゴン／ａＰ２の結合と比較することができる。
化合物の結合を検出するためのアッセイは、例えば、ＭｃＦｅｄｒｉｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１３年）；Ｖｏｌ．２０（５）：６６７−６７３；Ｐｏｌｌａｒｄ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１０年）Ｖｏｌ．２１，４０６１−４０６７に記載されているように、当技術分野で周知であり、両方共、本明細書に、その全体を参照により援用する。
例えば、アッセイは、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２と試験される化合物との間の複合体の形成を測定するか、又はグルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲとの間の複合体の形成が、試験される化合物によって妨害される程度を試験することができる。従って、本発明は、化合物をＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２と接触させること、（ｉ）ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２と化合物との間の複合体が存在する場合、又は（ｉｉ）グルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲとの間の複合体が存在する場合についてアッセイすることを含む、化合物を同定する方法を提供する。このような競合結合アッセイでは、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２を標識化することができる。遊離しているグルカゴン／ａＰ２を、複合体中に存在するものから分離し、遊離している（即ち、複合体を形成していない）標識の量は、それぞれ、試験される化合物とａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２との結合の尺度であり、或いは、グルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲとの結合に対する妨害の尺度である。利用可能な競合結合アッセイの例には、ａＰ２とビオチン化グルカゴンとの直接的な相互作用によるバイオレイヤー干渉法（実施例１；図３ａ参照）、１２５Ｉ−グルカゴンがビオチン化ａＰ２と相互作用する、シンチレーション近接アッセイ（実施例１；図３ｂ参照）、溶液中での結合によって放出された熱を測定する等温滴定型熱量測定法（実施例１；図３ｃ参照）、及びマイクロスケール熱泳動（実施例１；図４Ａから４Ｄ参照）が含まれる。
ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物の同定は、追加的なアッセイ、例えば、細胞に基づく生物学的アッセイ又は無細胞のリン酸化アッセイにおいて更に確認することができる。該化合物が抗体又はそのフラグメントであり、このようなタンパク質をスクリーニングの間に使用することができる場合、結合したグルカゴン／ａＰ２：ＧＣＧＲ複合体又はグルカゴン／ａＰ２：化合物複合体の検出又は精製を容易にするための配列、例えば、ヒスチジン残基を含有する配列又はその連続的な配列（ポリ−Ｈｉｓ）、ｃ−Ｍｙｃ部分ペプチド（Ｍｙｃ−ｔａｇ）、ヘマグルチニン部分ペプチド（ＨＡ−ｔａｇ）、Ｆｌａｇ部分ペプチド（Ｆｌａｇ−タグ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ビオチン化、蛍光物質（フルオレセイン等）、Ｅｕキレート、発色団、発光団、酵素、又は放射性同位体（例えば、１２５Ｉ又はトリチウム）を用いた標識化、又は、固体相（例えば、容器又は担体）への結合を容易にするためのヒドロキシスクシンイミド残基、ビニルピリジン残基等を有する化合物の結合を、ａＰ２、ＧＣＧＲ、グルカゴン、又は化合物のアミノ末端、カルボキシ末端又は該アミノ酸配列の中間領域に導入することができる。
一実施形態では、本発明は、ＧＣＧＲを発現する真核細胞を利用し、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動に対して該化合物が有する生物学的効果を分析して、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法を提供する。このような細胞は、生存可能な形態又は固定形態のいずれかで、標準的な結合アッセイに使用することができる。例えば、アッセイは、化合物の存在下でグルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲとの間の複合体の形成を測定してもよく、グルカゴン／ａＰ２の存在下でＧＣＧＲの生物学的活性が化合物によって妨害される程度を調べてもよい。従って、本発明は、化合物とａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２を接触させること、及び（ｉ）グルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲとの間の複合体の存在について、又は（ｉｉ）ＧＣＧＲに対するグルカゴン／αＰ２作動の阻害について、ＧＣＧＲの生物学的効果を測定することによって、アッセイすることを含む、化合物を同定する方法を提供する。ＧＣＧＲの生物学的活性に対する化合物の影響は、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。このような活性アッセイでは、ＧＣＧＲの生物学的活性は、典型的には、レポーター系の提供によってモニターされる。例えば、これには、ＧＣＧＲ刺激の生物学的活性によって作用する程度に応じて検出可能なシグナルを発生させる天然の又は合成の物質を提供することが含まれ、それには、例えば、サイクリックＡＭＰ形成の測定、ホスホエノールピルバートカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース−１，６−ビスホスファート（ＦＢＰａｓｅ−１）、及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）を含むグルコネオゲネシス酵素の発現レベル、グリコーゲンホスホリラーゼ及びグリコーゲンシンターゼの測定、肝臓グルコース産生、並びにグリコーゲン分解が含まれる。
細胞に基づくアッセイには、ＧＣＧＲを内因的に又は組換え操作によって発現する細胞が含まれる。ＧＣＧＲは、発現する場合には、グルカゴン／ａＰ２の結合による刺激に対する測定可能な生物学的影響を引き出すことができる限り、単量体、二量体又は多量体の状態であり得る。ＧＣＧＲは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又はウサギ等の任意の生物に由来し得る。一実施形態では、発現されるＧＣＧＲは、ヒトの特性を有しており、内因性ヒトＧＣＧＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４７８７１（ＧＬＲ＿ＨＵＭＡＮ））に由来する。ＧＣＧＲは、自然界に存在する細胞又は組織から抽出されてもよく、遺伝子工学的手法によってそのサブユニットを発現する細胞又は組織から抽出されてもよい。ＧＣＧＲは、精製又は未精製であってよい。報告されたアミノ酸配列又は遺伝子の突然変異によって得られたバリアントアミノ酸配列を有する遺伝子工学的手法により作製されたＧＣＧＲを、実質的に活性を保持する限り、使用することができる。
一実施形態では、アッセイは無細胞アッセイであり、化合物を、液相中のａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２と接触させるか、又は或いは、ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２を固相（例えば、カラム）に固定して、次に、化合物と接触させる。例えば、ビオチン／ストレプトアビジンによって、ヒドロキシスクシンイミド基等の反応可能なアミノ基を使用することによって、ヒドラジン基等の表面上の反応性カルボキシル基を使用することによって、又はビニルピリジン基等の表面上のチオール基と反応可能な基を使用することによって、グルカゴン／ａＰ２を固相に固定させることができる。例えば、ポリスチレン樹脂又はガラスから構成される固相に静電引力又は分子間力を使用して結合させることによって、ａＰ２及び／又はグルカゴン／ａＰ２に付加されたアミノ酸配列に対する抗体（例えば、ポリＨｉｓ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、ＧＳＴ、若しくはＭＢＰ）を固定化することによって得られた固相にグルカゴン／ａＰ２を結合させることによって、表面に金属キレートを有する固相にポリＨｉｓに結合したグルカゴン／ａＰ２を結合させることによって、表面にグルタチオンを有する固相にＧＳＴに結合したグルカゴン／ａＰ２を結合させることによって、又は表面にマルトース等の糖を有する固相にＭＢＰに結合したグルカゴン／ａＰ２を結合させることによって、グルカゴン／ａＰ２を固相（カラム等）に固定させることができる。グルカゴン／ａＰ２はまた、別の一般的に知られている方法によっても固相に固定させることができる。
化合物とグルカゴン／ａＰ２との接触段階は、例えば、それらを含有する溶液を混合することによって行うことができる。或いは、例えば、グルカゴン／ａＰ２が（或いは、化合物が）、カラム、チューブ又はマルチウェルプレート等の固相に固定されている場合、結合していない化合物を含有する溶液を添加する。
ａＰ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２に結合することが見出された化合物は、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２結合を防止する能力を測定するために、無細胞アッセイで更に試験することができる。例えば、一実施形態では、ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合に対する化合物の阻害効果を評価するために、液相に含有された又は固相（カラム、容器、又は担体等）に固定されたグルカゴン／ａＰ２のＧＣＧＲとの結合を、それぞれ、化合物の存在下及び非存在下で測定して、化合物の添加による結合の変化を観察することができる。ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合は、それらを分離して又は分離せずに測定することができる。例えば、グルカゴン／ａＰ２、ＧＣＧＲ、及びＧＣＧＲに結合したグルカゴン／ａＰ２（グルカゴン／ａＰ２：ＧＣＧＲ）を、ゲルろ過法、アフィニティ樹脂、イオン交換樹脂等を使用するカラム法、遠心分離法、又は洗浄法によって分離することができる。例えば、ＧＣＧＲに結合したグルカゴン／ａＰ２の量、又はＧＣＧＲに結合していないグルカゴン／ａＰ２の量は、ゲル濾過法又はカラム法（アフィニティ樹脂、イオン交換樹脂等）によって、液相から、ＧＣＧＲに結合したグルカゴン／ａＰ２、ＧＣＧＲ、及び未結合のグルカゴン／ａＰ２を分離した後に測定することができる。固相（カラム、容器又は担体等）にグルカゴン／ａＰ２を固定している場合、固相（カラム、容器又は担体等）を、化合物の存在下又は非存在下の両方で、遠心分離、洗浄、分配分離、沈殿等によって、液相から分離することができる。この場合、結合量は、分離された固相（カラム、容器又は担体等）に結合しているＧＣＧＲの量を測定することによって直接的に、又は液相中に残存しているＧＣＧＲの量を測定することによって間接的に、化合物の存在下又は非存在下の両方にて得ることができる。液相中のＧＣＧＲは、ＧＣＧＲと特異的に反応可能なタンパク質又は抗体を使用する免疫沈降法、並びにゲルろ過法、アフィニティ樹脂、イオン交換樹脂等を使用するカラム法、遠心分離方法、又は洗浄方法によって分離することができる。グルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲの結合量は、分離したグルカゴン／ａＰ２又はＧＣＧＲの量を測定することによって直接的に、又は結合したグルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲを含有する画分から分離した画分に含有されるグルカゴン／ａＰ２又はＧＣＧＲの量を測定することによって間接的に得ることができる。
上記の方法では、溶液中に含有されるグルカゴン／ａＰ２：ＧＣＧＲ及びグルカゴン／ａＰ２：化合物の量は、例えば、ビオチン、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、又は化学発光部分で標識化されたグルカゴン／ａＰ２を使用して測定することができる。例えば、ビオチン標識グルカゴン／ａＰ２の量は、高い親和性でビオチンに結合することができるタンパク質（アビジン、ストレプトアビジン又はそのバリアントタンパク質（以下、アビジンと称する）等）を使用することによって測定することができ、アビジンは、容易に検出することができる放射性同位体、フルオロフォア、発光団、又は酵素で標識化されており、ビオチン標識化合物に結合する。放射性物質は、シンチレーションカウンター、ガンマカウンター、又はＧＭメーター等の一般的な放射線測定装置を使用して測定することができる。フルオロフォア、発色団、及び発光団は、それぞれ蛍光測定装置、吸光光度計、及び発光測定装置を使用して測定することができる。酵素標識化合物の量は、発色性、蛍光性、又は発光性化合物に酵素によって転化される化合物を使用して容易に測定することができる。
溶液中に含有される結合又は非結合のグルカゴン／ａＰ２の量は、以下のように測定することができる。例えば、ビオチン、蛍光性物質（フルオレセイン等）、Ｅｕキレート、発色団、発光団、又は放射性同位体（１２５Ｉ又はトリチウム等）で標識化されたグルカゴン／ａＰ２は、上記と同じ方法で測定することができる。ビオチン化グルカゴン／ａＰ２は、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、固相酵素イムノアッセイ（酵素結合イムノソルベントアッセイ：ＥＬＩＳＡ）、又はラジオイムノアッセイ等のサンドイッチアッセイによって、ストレプトアビジン等のタンパク質；グルカゴン／ａＰ２に対する抗体；ａＰ２に付加されたアミノ酸配列に対する抗体（ポリ−Ｈｉｓ、Ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ、ＧＳＴ、又はＭＢＰ等）；ポリ−Ｈｉｓ付加グルカゴン／ａＰ２に対する金属キレートを有する分子；ＧＳＴ付加グルカゴン／ａＰ２に対するグルタチオンを有する分子；ＭＢＰ付加グルカゴン／ａＰ２に対するマルトース等の糖を有する分子；等を使用して測定することができる。
より具体的な例では、Ｍｙｃ−タグ配列を有するグルカゴン／ａＰ２を、抗Ｍｙｃ抗体（マウス由来モノクローナル抗体）及び抗マウス免疫グロブリン抗体固定化ＳＰＡビーズの存在下で、化合物の存在下／非存在下にて、９６−マルチウェルプレートを使用して、トリチウム標識ＧＣＧＲと接触させ、一定時間後に、グルカゴン／ａＰ２とトリチウム標識ＧＣＧＲの結合量を、シンチレーションカウンターを使用して測定し、そして化合物の存在下／非存在下で得られたカウント値を比較することによって、ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合に対する化合物の阻害効果を測定する。
ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合に対する化合物の阻害活性を測定する方法は、特に限定されない。ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合に対する化合物の阻害活性を測定するために、例えば、グルカゴン／ａＰ２を固相に固定し；化合物の存在下又は非存在下でグルカゴン／ａＰ２をＧＣＧＲと接触させ；そして固相上のグルカゴン／ａＰ２に結合したＧＣＧＲの量を測定することによって、阻害活性を測定することができる。或いは、ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合に対する化合物の阻害活性を測定する方法には、ＧＣＧＲを固相に固定し；化合物の存在下又は非存在下でＧＣＧＲをグルカゴン／ａＰ２と接触させ；そして固相に結合したグルカゴン／ａＰ２の量を測定することが含まれる。ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合に対する化合物の阻害活性を測定する更なる代替法には、化合物の存在下又は非存在下でグルカゴン／ａＰ２をＧＣＧＲと接触させること；そしてグルカゴン／ａＰ２とＧＣＧＲの結合量を測定することが含まれる。例示の上記のいずれの方法においても、化合物存在下での接触より得られた結合量を、化合物非存在下での接触により得られた結合量と比較して、ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合に対する化合物の阻害活性を測定することができる。
一実施形態では、アッセイは、細胞に基づくアッセイであり、ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合に対する化合物の阻害活性を測定することによって化合物を同定する方法では、ＧＣＧＲを含有する細胞、組織、又はその抽出物を使用する。ＧＣＧＲを実質的に含有する細胞又は組織は、任意の生物から得ることができ、任意の細胞又は組織であってもよいが、ヒトの細胞又は組織を含む哺乳動物の細胞又は組織であると好ましい。その細胞又は組織は、ＧＣＧＲが内因的に発現されるか、又は遺伝子工学的手順によって発現されるものであってもよい。
一実施形態では、ＧＣＧＲを発現する細胞集団を、グルカゴン、ａＰ２、及び／又はグルカゴン／ａＰ２を含む溶液と接触させ、ＧＣＧＲの生物学的活性を、化合物の存在下及び非存在下で測定する。ＧＣＧＲの生物学的活性は、一般的に、ＧＣＧＲとそれを作動させる結合パートナーであるグルカゴン／ａＰ２との間の相互作用から生じる任意の観察可能な効果を指す。生物学的活性は、ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の結合、ＧＣＧＲが媒介する細胞内シグナル伝達の検出、又は終点の生理学的効果の決定であり得る。グルカゴン／ａＰ２による作動性刺激に対するＧＣＧＲの生物学的活性の代表的な、非限定的な例には、非限定的に、本明細書で検討したプロセス、例えば、サイクリックＡＭＰ形成の阻害、グリコーゲン分解の減少、ホスホエノールピルバートカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース−１，６−ビスホスファート（ＦＢＰａｓｅ−１）、及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）を含むグルコネオゲネシス酵素発現の減少、グリコーゲンホスホリラーゼの不活性化、及びグリコーゲンシンターゼ活性の増加のシグナル伝達及び調節が含まれる。一実施形態では、化合物は、Ｐ２、グルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２に結合し、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する小さい分子、リガンド、抗体、抗原結合剤、又は抗体フラグメントである。ＧＣＧＲ刺激の生物学的効果を測定する方法は、当技術分野で知られており、ＧＣＧＲの生物学的活性を検出するアッセイの非限定的な例は、以下の実施例にて更に例示するが、これには、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース−１，６−二リン酸（ＦＢＰａｓｅ−１）、及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）（参照：実施例１；図１Ａ及び１Ｂ；図２Ａ、２Ｃ及び２Ｄ）を含むグルコネオゲネシス酵素発現の減少、肝臓グルコース産生の減少（参照：実施例１；図１Ｃ）、グリコーゲン分解の減少（参照：実施例１；図１Ｄ）、及びサイクリックＡＭＰ形成の阻害（参照：実施例１；図１Ｅ及び１Ｆ）に関連するアッセイが含まれる。
非限定的な例示的な一例では、グルカゴン／ａＰ２、ＧＣＧＲ、及び／又は化合物の濃度を変化させて、細胞アッセイを行って、例えば、グルカゴン／ａＰ２がＧＣＧＲを作動させるのを妨害する化合物の能力の効力を確認する。例えば、上記第５の態様に記載した場合では、本発明の第５の態様の第１の細胞アッセイは、以下のように実施することができる。１当量の目的の化合物を、１当量のａＰ２及び１当量のグルカゴンの存在下でＧＣＧＲを発現する細胞の溶液に添加する。次に、ＧＣＧＲの活性を、本明細書に記載しているか又は当技術分野で知られている任意の方法を使用して測定する。典型的な実施形態では、目的の化合物の濃度は、細胞アッセイにおけるａＰ２及びグルカゴンの濃度と等しいか、又はそれより高い。一実施形態では、目的の化合物の濃度は、約１、２、３、４、５、１０、１５又は２０当量であり、ａＰ２及びグルカゴンの濃度は、約１当量である。目的の化合物の存在下でのＧＣＧＲの活性を測定する方法には、本明細書に記載している方法、及びＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｐｏｌｌａｒｄによる論文“Ａ Ｇｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ”ＭＢＯＣ；２０１０年；２１巻、Ｎｏ．２３ ４０６１に記載されている方法が含まれる。
非限定的な例示的な一例では、本発明の第５の態様の第２の細胞アッセイは、以下のように実施することができる。１当量の目的の化合物を、２０当量のａＰ２及び２０当量のグルカゴンの存在下でＧＣＧＲを発現する細胞の溶液に添加する。次に、ＧＣＧＲの活性を、本明細書に記載しているか又は当技術分野で知られている任意の方法を使用して測定する。典型的な実施形態では、目的の化合物の濃度は、細胞アッセイにおけるａＰ２及びグルカゴンの濃度よりも低い（即ち、ａＰ２及びグルカゴンは、目的の化合物に対して飽和している）。一実施形態では、ａＰ２及びグルカゴンの濃度は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０当量であり、目的の化合物の濃度は１当量である。
一実施形態で、グルカゴン及びａＰ２に対する目的の化合物の当量が不明である場合には、代わりに化合物の濃度を使用する。
非限定的な例示的な一例では、本発明の第６の態様の細胞アッセイは、以下のように実施することができる。０．５当量の目的の化合物を、１当量のａＰ２及び１当量のグルカゴンの存在下でＧＣＧＲを発現する細胞の溶液に添加する。次に、ＧＣＧＲの活性を、本明細書に記載しているか又は当技術分野で知られている任意の方法を使用して測定する。次に、目的の化合物の１当量、続いて１．５当量、２当量等を使用して、アッセイを連続的に繰り返す。一実施形態では、上記の手順は、化合物の最高濃度で開始し、最低濃度に達するまでそれを繰り返し希釈する連続的な希釈によって行なわれる。目的の化合物の存在下でのＧＣＧＲの活性を測定する方法には、本明細書に記載している方法、及びＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｐｏｌｌａｒｄによる論文“Ａ Ｇｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ”ＭＢＯＣ；２０１０年；２１巻、Ｎｏ．２３ ４０６１に記載されている方法が含まれる。一実施形態では、目的の化合物の濃度は、例えば、１００当量、１０当量、１当量、及び０．１当量の化合物のように、対数的に変化させる。別の実施形態で、化合物の当量が不明である場合、代わりに化合物の濃度を、例えば、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ及び１ｎＭの濃度のように変化させて使用することができる。
ａＰ２単独よりもグルカゴン／ａＰ２に選択的に結合する化合物、例えば、抗体を選択する方法もまた提供する。結合する抗体を、好ましく同定するための方法は、当分野で一般的に知られている。一実施形態では、ａＰ２よりもグルカゴン／ａＰ２に選択的に結合する抗体を同定する方法であって、複合体の異種グルカゴン／ａＰ２に対する抗体を高めるために、非ヒト動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット又はヤギに、異種グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体、例えば、ヒトグルカゴン／ａＰ２を投与すること、前記抗体を単離すること、前記抗体を、グルカゴン／ａＰ２及びａＰ２単独への結合親和性を測定する１つ以上の結合アッセイ、例えば、競合結合アッセイに供し、ａＰ２よりもグルカゴン／ａＰ２に好ましく結合する抗体を、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和するのに使用するために、単離することを一般的に含む、方法を提供する。例えば、グルカゴン／ａＰ２に対する抗体は、免疫学の分野の当業者に周知の標準的な手順によって達成されるハイブリドーマを使用して高めることができる。競合的阻害によるｍＡｂ特異性及び親和性を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８年）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、（１９９２年、１９９３年）並びにＭｕｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３年）に見出すことができ、これらを全体的に本明細書に参照により援用する。
融合パートナー細胞株、並びにハイブリドーマを融合、選択する方法及びｍＡｂをスクリーニングする方法は、当技術分野で周知である。グルカゴン／ａＰ２に特異的なｍＡｂは、マウスの腹腔に、抗体を分泌するハイブリドーマ又はトランスフェクトーマ細胞を注射し、適切な時間の後、高力価のｍＡｂを含有する腹水を採取し、そして、それからｍＡｂを単離することによって、大量に産生することができる。非ネズミハイブリドーマ（例えば、ラット又はヒト）を用いたｍＡｂのこのようなインビボ産生のために、ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、放射線照射又は無胸腺ヌードマウスにおいて増殖される。或いは、抗体は、ハイブリドーマ又はトランスフェクトーマ細胞をインビトロで培養し、分泌されたｍＡｂを細胞培養用培地から単離することによって、又は真核生物又は原核生物の細胞にて組換え操作によって、産生させることができる。
上記化合物を同定するための方法は、例示的であり、制限的ではないと考えられることに留意すべきである。
ａＰ２及び／又はグルカゴン／ａＰ２複合体を中和する化合物
本発明の一態様では、ＧＣＧＲシグナル伝達を調節する方法であって、グルカゴン／ａＰ２、グルカゴン、又はａＰ２を直接的に標的にし、ＧＣＧＲを刺激するグルカゴン／ａＰ２の能力を効果的に中和することによって、グルカゴン／ａＰ２複合体の形成又はグルカゴン／ａＰ２複合体とＧＣＧＲとの相互作用を阻害することによって、グルカゴン／ａＰ２によるＧＣＧＲの作動を中和する化合物を、被験体に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、化合物は、抗ａＰ２及び／又は抗グルカゴン／ａＰ２複合体抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤であり、例えば、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤を含む。一実施形態では、化合物は、ヒト化モノクローナル抗体又は抗原結合剤である。一実施形態では、抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤は、ａＰ２及びグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する。一実施形態では、抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤は、ａＰ２及びグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する。一実施形態では、抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤は、ＧＣＧＲには結合しない。
抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤を産生する方法は、当技術分野で知られている。例えば、ＵＳ２０１１／０１２９４６４を参照されたい。例えば、ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原及びアジュバント、例えば、ａＰ２、グルカゴン、又は好ましくはａＰ２との複合体のグルカゴン（グルカゴン／ａＰ２）を、複数の皮下（ｓｃ）注射又は腹腔内（ｉｐ）注射をすることによって、動物中で高められる。二官能性又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である。）を使用して、該関連抗原を、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシン阻害薬にコンジュゲートさせることは有用であり得る。
例えば、動物は、例えば、１００μｇ又は５μｇのタンパク質又はコンジュゲート（それぞれウサギ又はマウスについて）を３容量のＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントと組み合わせて、その溶液を複数の部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、その動物は、複数の部位に皮下注射することによって、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント中の、元の量の１／５から１／１０のペプチド又はコンジュゲートで追加免疫される。７から１４日後、動物から採血し、その血清を抗体力価についてアッセイする。力価が横ばい状態になるまで、動物を追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原ではあるが、異なるタンパク質に及び／又は異なる架橋試薬によってコンジュゲートされたコンジュゲートで追加免疫される。コンジュゲートはまた、タンパク質融合物として組換え細胞培養において作製することができる。また、ミョウバン（ａｌｕｍ）等の凝集剤は、免疫応答を高めるために好適に使用される。
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る自然に発生する可能性のある突然変異を除いては同一である、集団から得られる。従って、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の特徴を示しており、個別の抗体の混合物ではない。
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒらの、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５年）に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができるか、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。ハイブリドーマ法では、ハムスター等のマウス又は他の適切な宿主動物を、本明細書で上記のように免疫化して、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することができるリンパ球を誘発させる。或いは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次に、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を使用して、リンパ球をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９から１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。
こうして調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する１種以上の物質を含有している適切な培養用培地に播種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマの培養用培地には、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンが含まれ（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を防止する。
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルでの産生を支え、ＨＡＴ培地等の培地に感受性を有する細胞である。これらの中で、好ましいミエローマ細胞株は、米国メリーランド州ロックビルのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞、及び米国カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの等のマウスミエローマ株である。更に、ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生について（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４年）；及びＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７年））に記載されている。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養用培地を、抗原に特異的なモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって又はインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎらによるＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０年）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを、限界希釈法によってサブクローニングし、標準的方法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。この目的に適した培養用培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。更に、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の抗体精製手順によって、培養用培地、腹水又は血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離した後、ＤＮＡを、発現ベクターに入れ、次に、宿主細胞、例えば、そうでなければ抗体タンパク質を産生しない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させる。抗体をコードするＤＮＡのバクテリア中での組換体の発現に関する総説論文には、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌuｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０：１５１−１８８（１９９２）が含まれる。
更なる実施形態では、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４（１９９０年）に記載されている技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１年）及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１年）には、それぞれ、ファージライブラリーを使用する、ネズミ及びヒト抗体の単離について記載されている。その後の刊行物には、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２年））、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための手段としての組み合わせ感染（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３年））について記載されている。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替技術である。
ＤＮＡはまた、例えば、相同性ネズミ配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１（１９８４年））、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって改変させることもできる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置換されるか、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位及び異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ２価抗体が作製される。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、それに導入された、非ヒトである供給源からの１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、典型的には「インポート」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的に、ヒト抗体の対応する配列と超可変領域配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８年））に従って行なわれる。従って、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかの超可変領域残基及び可能な場合には幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類動物抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。所謂「最良適合」方法によれば、げっ歯類動物抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。そして、げっ歯類動物のそれに最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６（１９９３年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１（１９８７年））。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域が使用される。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３年））。
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持して、ヒト化されることが更に重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的なヒト化生成物の分析プロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元コンフォメーション構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際の残基の可能性のある役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原（単数又は複数）に対する増加した親和性等の所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及びインポート配列から選択して組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を与えることに直接的にかつ最も実質的に関与する。ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の様々な形態が企図される。例えば、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、免疫コンジュゲートを生成するために、１種以上の細胞傷害性薬剤（単数又は複数）と任意選択的にコンジュゲートした、Ｆａｂ等の抗体フラグメントであり得る。或いは、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、完全なＩｇＧ１抗体等の完全な抗体であってもよい。
ヒト化の代わりに、ヒト抗体を作製することができる。例えば、今日では、内在性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを免疫化の際に産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系列突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際、ヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３年）；並びに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号及び第５，５４５，８０７号を参照されたい。
或いは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３（１９９０年））を使用して、ヒト抗体及び抗体フラグメントを、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロで産生することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄ等の繊維状ファージのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかに、インフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体フラグメントとしてディスプレイされる。繊維状粒子には、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーが含有されているので、抗体の機能性特性に基づく選択はまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。従って、ファージは、Ｂ細胞の性質の幾つかを模倣する。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで実施することができる。そのためには、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｅｖｉｎ Ｓ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４−５７１（１９９３年）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源を、ファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１年）では、免疫化マウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さなランダムな組み合わせライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、本質的に、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１年）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３年）に記載されている技術に従って、単離することができる。更に、米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号もまた参照されたい。
上で検討したように、ヒト抗体はまた、インビトロで活性化Ｂ細胞によって生成することもできる（参照：米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号）。
抗体フラグメントの産生のための様々な技術が開発されている。伝統的に、これらのフラグメントは、完全な抗体のタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって誘導された（参照：例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２４：１０７−１１７（１９９２年）；及びＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５年））。しかしながら、これらのフラグメントは、現在では、組換え宿主細胞によって直接的に産生することができる。例えば、抗体フラグメントは、上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。或いは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、大腸菌から直接的に回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２年））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、選択される抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｉｎｔｉｂｏｄｙ）」であってもよい。このような線状抗体フラグメントは、単一特異性又は二重特異性であり得る。
抗体を生成させるための技術は、上に記載している。更に、例えば、ａＰ２及び／又はグルカゴン／及び／又はＧＣＧＲよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体への優先的な結合等、特定の生物学的特徴を有する抗体を選択することができる。
ＧＣＧＲ受容体のグルカゴン／αＰ２作動を阻害する抗体を同定するために、ＧＣＧＲを発現する細胞に結合するグルカゴン／αＰ２リガンドに対する抗体の能力を測定することができる。例えば、ＧＣＧＲ受容体を天然に発現するか又は発現するようにトランスフェクトした細胞を、抗体とインキュベートし、次に標識グルカゴン／ａＰ２に曝露することができる。次に、ＧＣＧＲへの結合をブロックする抗グルカゴン／ａＰ２抗体の能力を評価することができる。
例えば、抗グルカゴン／αＰ２モノクローナル抗体による肝細胞におけるＧＣＧＲへのグルカゴン／αＰ２結合の阻害は、２４ウェルプレートフォーマットで氷上で単層肝細胞培養を使用して行うことができる。抗グルカゴン／ａＰ２モノクローナル抗体を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートすることができる。次に、１２５Ｉ標識グルカゴン又はａＰ２又はグルカゴン／ａＰ２を添加することができ、インキュベーションを４から１６時間続けることができる。用量応答曲線を作成し、目的の抗体についてＩＣ５０値を計算することができる。一実施形態では、ＧＣＧＲ受容体のリガンド活性をブロックする抗体は、このアッセイでは約５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下の、肝細胞へのグルカゴン／αＰ２結合を阻害するＩＣ５０を有する。抗体がＦａｂフラグメント等の抗体フラグメントである場合、このアッセイでは肝細胞でのＧＣＧＲへのグルカゴン／αＰ２結合を阻害するＩＣ５０は、例えば、約１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下であり得る。
或いは、又追加的に、グルカゴン／ａＰ２リガンド刺激性ｃＡＭＰ産生をＧＣＧＲを介してブロックする抗グルカゴン／ａＰ２抗体の能力を評価することができる。例えば、ＧＣＧＲを内因的に発現する細胞又はＧＣＧＲを発現するようにトランスフェクトされた細胞を、抗体とインキュベートし、次に、グルカゴン／ａＰ２リガンド依存性ｃＡＭＰ活性についてアッセイすることができる。
一実施形態では、投与される抗体及びフラグメントには、軽鎖又は可変領域を有する軽鎖フラグメントが含まれ、前記可変領域には、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から独立的に選択される１、２又は３個のＣＤＲが含まれる。或いは、１個以上の、開示されかつ選択されたＣＤＲを、本明細書に更に記載するように、抗体又は抗原結合剤の特性に悪影響を与えず、又はそれを改善する１個以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸）の置換によって変化させることができる。一実施形態では、選択されたＣＤＲ（単数又は複数）を、ヒト免疫グロブリンフレームワークに入れる。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを更に改変するか、又は変化させて、グラフト化ＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
本発明の一態様では、抗体又は抗原結合剤を、抗体が表２に提供されるＣＤＲ領域の少なくとも１個又は複数を含んでいる被験体に投与する。
一態様では、グルカゴン／ａＰ２を中和する抗体又は抗原結合フラグメントは、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１（ＱＡＳＥＤＩＳＲＹＬＶ）（配列番号７）、ＣＤＲＬ１バリアント１（ＳＶＳＳＳＩＳＳＳＮＬＨ）（配列番号２２）、ＣＤＲＬ２（ＫＡＳＴＬＡＳ）（配列番号８）、ＣＤＲＬ２バリアント１（ＧＴＳＮＬＡＳ）（配列番号２３）、ＣＤＲＬ３（ＱＣＴＹＧＴＹＡＧＳＦＦＹＳ）（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（ＱＡＴＹＧＴＹＡＧＳＦＦＹＳ）（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（ＱＱＴＹＧＴＹＡＧＳＦＦＹＳ）（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（ＱＨＴＹＧＴＹＡＧＳＦＦＹＳ）（配列番号１２）、ＣＤＲＬ３バリアント４（ＱＱＡＳＨＹＰＬＴ）（配列番号１３）、又はＣＤＲＬ３バリアント５（ＱＱＷＳＨＹＰＬＴ）（配列番号２４）から独立的に選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、軽鎖を含むモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントである。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３（配列番号９）を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）を含む軽鎖可変領域を含み、抗体が約１０−７Ｍ以上のＫｄを有する。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ１バリアント１（配列番号２２）、ＣＤＲＬ２バリアント１（配列番号２３）、及びＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＨＲ１バリアント１（ＧＹＴＦＴＳＮＡＩＴ）（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２バリアント２（ＤＩＳＰＧＳＧＳＴＴＮＮＥＫＦＫＳ）（配列番号１８）を、そして一実施形態では、更に、ＣＤＲＨ３バリアント２（ＬＲＧＦＹＤＹＦＤＦ）（配列番号２１）を含む重鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、及びＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含み、約１０−７Ｍ以上のＫｄを有する。一実施形態では、上で同定したＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワークにグラフト化させる。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）ゾーン内で更に改変又は変化させて、グラフト化ＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持させる。
一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、又はＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％相同性であるアミノ酸配列から独立的に選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、軽鎖を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、約１０−７Ｍ以上のＫｄを有する。一実施形態では、上で同定したＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワークにグラフト化させる。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内で更に改変又は変化させて、グラフト化ＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持させる。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、又はＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）と比較して、１個以上（例えば、１、２、３又は４個）のアミノ酸の置換、付加、又は欠失を有するアミノ酸配列から独立的に選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、軽鎖を含む。
一態様では、抗体又は抗原結合剤は、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、又はＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）から選択される１、２、又は３個のＣＤＲ、及びＣＤＲＨ１（ＧＦＳＬＳＴＹＹＭＳ）（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ１バリアント２（ＧＹＴＦＴＳＮＷＩＴ）（配列番号２５）、ＣＤＲＨ２（ＩＩＹＰＳＧＳＴＹＣＡＳＷＡＫＧ）（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（ＩＩＹＰＳＧＳＴＹＳＡＳＷＡＫＧ）（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＲＨ２バリアント３（ＤＩＹＰＧＳＧＳＴＴＮＮＥＫＦＫＳ）（配列番号２６）、ＣＤＨＲ３（ＰＤＮＤＧＴＳＧＹＬＳＧＦＧＬ）（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（ＰＤＮＥＧＴＳＧＹＬＳＧＦＧＬ）（配列番号２０）、ＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）、又はＣＤＲＨ３バリアント３（ＬＲＧＹＹＤＹＦＤＦＷ）（配列番号２７）から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、軽鎖を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、及びＣＤＲＨ３バリアント３（配列番号２７）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、及びＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、約１０−７Ｍ以上のＫｄを有する。一実施形態では、上で同定したＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワークにグラフト化する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内で更に改変又は変化させて、グラフト化ＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＨＲ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、又はＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含み、かつ約１０−７Ｍ以上のＫｄを有する。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、及びＣＤＨＲ３（配列番号１９）を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、及びＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）を含む。一実施形態では、抗体は、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）及びＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）を含む。一実施形態では、抗体は、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、及びＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、及びＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）を含む。一実施形態では、上で同定したＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワークにグラフト化する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内で更に改変又は変化させて、グラフト化ＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＨＲ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、又はＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）と比較して、１個以上（例えば、１、２、３又は４個）のアミノ酸の置換、付加、又は欠失を有するアミノ酸配列から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む。
一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、可変ドメインが、ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＨＲ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、又はＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）と、少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％相同性であるアミノ酸配列から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、重鎖を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、約１０−７Ｍ以上のＫｄを有する。一実施形態では、上で同定したＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワークにグラフト化する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内で更に改変又は変化させて、グラフト化ＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
以下に更に記載されるように、ＣＤＲを変化又は改変させて、改善された結合親和性を提供し、異なる骨格にグラフト化した場合の結合親和性の喪失を最小化し、又はＣＤＲとハイブリッドフレームワークとの望ましくない相互作用を減少させることができる。
本発明の一態様では、投与のための抗体及びフラグメントは、ヒト化される。
ＣＤＲグラフト化抗体の構築は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２３９４００に一般的に記載されており（これを、本明細書に援用する。）、これには、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲを、長いオリゴヌクレオチドを使用して、部位特異的変異導入によってヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域にグラフト化する、方法が開示されている。ＣＤＲは、抗体の抗原結合特異性を決定し、可変ドメインのフレームワーク領域に担持された相対的に短いペプチド配列である。
ヒト可変重鎖及び軽鎖生殖細胞系列サブファミリー分類を、Ｋａｂａｔの生殖細胞系列サブグループ指定から誘導することができる：即ち、特定のＶＨ配列についてはＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６若しくはＶＨ７並びにフレームワーク４に関する特定の可変重鎖連結基については、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、及びＪＨ６；フレームワーク１、２及び３に関する特定のＶＬカッパ配列についてはＶＫ１、ＶＫ２、ＶＫ３、ＶＫ４、ＶＫ５若しくはＶＫ６、並びにフレームワーク４に関する特定のカッパ連結基についてはＪＫ１、ＪＫ２、ＪＫ３、ＪＫ４、若しくはＪＫ５；又はフレームワーク１、２及び３に関する特定のＶＬラムダ配列についてはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、若しくはＶＬ１０、並びにフレームワーク４に関する特定のラムダ連結基については、ＪＬ１、ＪＬ２、ＪＬ３、若しくはＪＬ７。
軽鎖の一般的なフレームワークは、ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４及びＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４−ＣＬ、並びにその変形から選択される構造を含み、ここで、ＣＤＲ領域は、配列番号７から１３から選択される少なくとも１つの可変軽鎖ＣＤＲから選択され、フレームワーク領域は、免疫グロブリンカッパ軽鎖可変フレームワーク領域、又は免疫グロブリンラムダ軽鎖可変フレームワーク領域のいずれかから選択され、そして、免疫グロブリン軽鎖定常領域は、フレームワーク領域がカッパ軽鎖可変フレームワーク領域である場合はカッパ軽鎖定常領域、又はフレームワーク領域がラムダ軽鎖可変フレームワーク領域である場合はラムダ軽鎖定常領域のいずれかから選択される。
一実施形態では、本明細書で企図される重鎖領域の一般的なフレームワークは、ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４、ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１、ＩｇＧ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＤＨ２並びにＩｇＭ及びＩｇＥ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ＣＨ２、ＩｇＧ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＩｇＭ及びＩｇＥ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、並びにＩｇＭ及びＩｇＥ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４、そして、その変形から選択される構造を含み、ここで、ＣＤＲ領域は、配列番号１４から２１から選択される少なくとも１つの可変重鎖ＣＤＲから選択され、フレームワーク領域は、重鎖可変フレームワーク領域、及び重鎖定常領域から選択される。ＩｇＡ及びＩｇＭクラスは、それぞれ、ＩｇＭ又はＩｇＡの２つのモノマー単位を互いに連結するように働く、連結ポリペプチドを更に含むことができる。ＩｇＭの場合、Ｊ鎖連結ダイマーは、ＩｇＭペンタマーのための核形成単位であり、ＩｇＡの場合、それはより大きいポリマーを誘導する。
投与のための抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特定の実施形態では、抗体分子が治療的使用を意図され、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。或いは、抗体分子が治療目的を意図され、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。
一実施形態では、投与される抗体は、配列番号２８から３６又は３７から４０（以下の表３）から選択される可変軽鎖を含む。一実施形態では、投与される抗体は、配列番号４１から５１（以下の表４）から選択される可変重鎖を含む。一実施形態では、投与される抗体は、配列番号２８から３６又は４８７から４９０から選択される可変軽鎖及び／又は配列番号４１から５１から選択される可変重鎖又は配列番号２８から３６、３７から４０に８０％以上（例えば、関連する配列、例えば、可変ドメイン配列、ＣＤＲ配列又はＣＤＲを含まない可変ドメイン配列の一部又は全部にわたって、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）類似しているか又は同一である抗体配列及び／又は配列番号４１から５１から選択される可変重鎖を含む。




実施形態では、投与される抗体分子は、配列番号２９、３１、３７、３８、３３、又は３５から選択される軽鎖可変領域及び配列番号４２、４４、４６、４８、又は５０から選択される重鎖可変領域を含むＦａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントである。
一実施形態では、本開示の抗体分子は、軽鎖の場合、配列番号２９、３１、３７、３８、３３、又は３５に、そして、重鎖の場合、配列番号４２、４４、４６、４８、又は５０に示される可変領域を含む完全長ＩｇＧ１抗体である。
一実施形態では、本開示の抗体分子は、軽鎖の場合、配列番号２９、３１、３７、３８、３３、又は３５に、そして、重鎖の場合、配列番号４２、４４、４６、４８、又は５０に示される可変領域を含む完全長ＩｇＧ４抗体である。
一実施形態では、本開示の抗体分子は、軽鎖の場合、配列番号２９、３１、３７、３８、３３、又は３５に、そして、重鎖の場合、配列番号４２、４４、４６、４８、又は５０に示される可変領域を含む完全長ＩｇＧ４Ｐ抗体である。
一実施形態では、投与される融合タンパク質は、例えば、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）のペアリングとして、２つのドメイン抗体を含み、これらは、任意選択的に、ジスルフィド結合によって連結される。
投与される抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃＦＡｂ、ｄＦｖ、単一ドメイン軽鎖抗体、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチド等を含むことができる。
ＧＣＧＲ作動に関連する障害を治療する方法
肝臓（肝臓でのグルコース産生量（ｏｕｔｐｕｔ）を調節している）、腎臓、及び膵島β細胞（糖新生における役割をリフレクトしている）、腸平滑筋、脳、及び脂肪組織におけるグルカゴン／ａＰ２複合体（グルカゴン／ａＰ２）によるＧＣＧＲの作動を中和するための方法を提供する。グルカゴン／ａＰ２複合体は、ＧＣＧＲを作動させることによって肝臓グルコース産生を誘導するのに重要な役割を果たしているため、ＧＣＧＲ作動の完全又は部分的な中和により、調節不全のＧＣＧＲ刺激に関連してその根底をなす症状及び障害の重症度を調節することができる。一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２複合体の形成又はＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２複合体の能力を妨害する化合物を、過剰又は調節不全のＧＣＧＲ刺激に関連してその根底をなす症状及び障害を有する被験体に投与する。一実施形態では、本明細書に記載したモノクローナル抗体は、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和するために使用される。
抗グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体ヒト化抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを含む、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントは、非制限的に、糖尿病（Ｉ型及びＩＩ型）、肥満症、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、代謝障害、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、線維症、硬変症、肝細胞癌、インスリン抵抗性、脂質異常症、高血糖、高グルカン血症（ｈｙｐｅｒｇｌｕｃａｎｅｍｉａ）、高インスリン血症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ）を含む、慢性的な上昇した血中グルコースレベルに至る、調節不全のグルカゴンシグナル伝達を伴う代謝障害の治療に有用である。例えば、本明細書に記載した抗グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントは、低結合親和性にて分泌されたａＰ２及び／又はグルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体に結合することができ、それを必要とする宿主に投与する場合、宿主の、グルカゴン受容体活性を中和し、絶食時の血中グルコースレベルをより低下させ、全身のグルコース代謝を改善し、全身のインスリン感受性の高め、脂肪量を減少させ、肝臓脂肪変性を改善し、血清脂質プロフィールを改善し、及び／又はアテローム性プラーク形成減少させる。
本発明の一態様では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することによって、宿主の血中の過剰なグルコースの異常なレベルに至る、調節不全のグルカゴン活性によって引き起こされる疾患又は障害を治療する方法を提供する。一実施形態では、障害は、代謝障害である。一実施形態では、一実施形態では、糖尿病である。一実施形態では、障害はＩ型糖尿病である。一実施形態では、障害はＩＩ型糖尿病である。一実施形態では、障害は高血糖症である。一実施形態では、障害は肥満である。一実施形態では、障害は脂質異常症である。一実施形態では、障害は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。一実施形態では、障害は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。
糖尿病
糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）は、世界で最も一般的な代謝疾患である。米国では、毎日、１７００人が新規糖尿病患者と診断されており、糖尿病に罹患する１６００万人の米国人のうちの少なくとも３分の１がそれに気付いていない。糖尿病は、成人における失明、腎不全、及び下肢切断の主因であり、心血管疾患及び脳卒中の主要な危険因子である。
本発明の一態様では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを宿主に投与することによって、糖尿病を治療する方法を提供する。一実施形態では、障害はＩ型糖尿病である。一実施形態では、障害はＩＩ型糖尿病である。
Ｉ型糖尿病は、膵臓ベータ細胞の自己免疫的破壊から生じ、インスリン欠乏を引き起こす。ＩＩ型又は非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、９０％を超える症例を占めており、末梢組織、特に、骨格筋及び脂肪細胞におけるグルコース取込みにおけるインスリン作用への抵抗性、肝臓グルコース産生を阻害するインスリン作用の障害、並びにインスリン分泌の調節不全を特徴とする。
本発明の一実施形態では、本明細書にて、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを、インスリンと組み合わせて、又は交代して宿主に投与することによって、宿主のＩ型糖尿病を治療する方法を提供する。本発明の一実施形態では、本明細書にて、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを、合成インスリン類似体と組み合わせて、又は交代して宿主に投与することによって、宿主のＩ型糖尿病を治療する方法を提供する。
ＩＩ型糖尿病を有する一部の人々は、食事及び運動のみでその目標血糖値を達成することができるが、多くは糖尿病薬物治療又はインスリン治療も必要とする。本発明の一実施形態では、本明細書にて、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを宿主に投与することによって、宿主のＩＩ型糖尿病を治療する方法を提供する。一実施形態では、本明細書にて、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを宿主に投与することによって、糖尿病に関連する疾患又は症状を治療する方法を提供する。糖尿病に関連する疾患又は症状には、非限定的に、高血糖、高インスリン血症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ）、高脂血症、インスリン抵抗性、グルコース代謝障害、肥満症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、白内障、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、糖尿病性神経障害、起立性機能障害、月経前症候群、血管再狭窄及び潰瘍性大腸炎が含まれ得る。更に、糖尿病に関連する疾患及び症状には、非限定的に、冠動脈心疾患、高血圧、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、皮膚及び結合組織障害、足潰瘍、代謝性アシドーシス、関節炎、骨粗鬆症、及び特に、耐糖能障害の症状が含まれる。
体重の障害
本発明の一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することによって、宿主のグルカゴン活性の調節不全に起因する肥満を治療する方法を提供する。肥満は、最も一般的な体重障害であり、西側の世界では推定で３０から５０％の中年の集団が罹患している。
本発明の一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することによって、宿主の肥満を治療する方法を提供する。一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することによって、宿主のグルカゴン活性の調節不全に起因する体重増加を低減又は阻害する方法を提供する。
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）
グルカゴンの調節不全及び慢性高血糖症によって引き起こされる非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝臓炎症、硬変症及び肝不全等の脂肪肝及び脂肪肝に起因する症状の発症を治療及び予防のための組成物及び方法が必要とされている。本発明の一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することによって、宿主のＮＡＦＬＤを治療する方法を提供する。
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の進行した形態であり、過剰なアルコール消費には起因しない肝臓脂肪変性の蓄積を指す。ＮＡＳＨは、脂肪の蓄積と同時に、肝臓の炎症を特徴とする肝臓疾患である。ＮＡＳＨはまた、糖尿病及び肥満の人々において頻繁に見られ、代謝症候群に関連する。ＮＡＳＨは、比較的良性の非アルコール性脂肪肝疾患の進行性の形態であり、その場合には、ゆっくりと悪化して肝臓に線維症の蓄積を引き起こし、肝硬変に至る可能性がある（Ｓｍｉｔｈら、（２０１１年）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．、４８（３）：９７−１１３に概説されている。）。現在、ＮＡＳＨの承認された治療法は存在しない。
本発明の一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することによって、宿主のＮＡＳＨを治療する方法を提供する。
グルカゴノーマ及び壊死性遊走性紅斑
グルカゴノーマは、膵臓のアルファ細胞の稀な腫瘍であり、ホルモングルカゴンの過剰産生に至る。グルカゴノーマの主要な生理学的作用は、ペプチドホルモングルカゴンの過剰産生である。壊死性遊走性紅斑（ＮＭＥ）は、グルカゴノーマに罹患する患者にて観察される古典的な症状であり、７０％の症例において問題として表れている（ｖａｎ Ｂｅｅｋら、（２００４年１１月）「Ｔｈｅ ｇｌｕｃａｇｏｎｏｍａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｎｅｃｒｏｌｙｔｉｃ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｅｒｙｔｈｅｍａ：ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ」。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１（５）：５３１−７）。関連ＮＭＥは、下腹部、臀部、会陰及び鼠径部を含む、より大きな摩擦及び圧迫を受ける領域に亘って紅斑性水疱及び腫脹が広がることを特徴とする。
本発明の一実施形態では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することによって、宿主のグルカゴノーマ及び／又は壊死性遊走性紅斑（ＮＭＥ）を治療する方法を提供する。一実施形態では、抗体又は抗体結合剤は、軽鎖又は可変領域を有する軽鎖フラグメントを含有し、前記可変領域には、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９から独立的に選択される１、２、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。別の実施形態では、被験体に投与される抗体又は抗原結合剤には、軽鎖又は可変領域を有する軽鎖フラグメントが含まれ、前記可変領域には、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４から独立的に選択される１、２、又は３個のＣＤＲが含まれる。更に別の実施形態では、投与される抗体又は抗体結合剤には、軽鎖又は可変領域を有する軽鎖フラグメントが含まれ、前記可変領域には、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４から独立的に選択される１、２又は３個のＣＤＲが含まれる。一実施形態では、被験体に投与される抗体又は抗体結合剤には、軽鎖又は可変領域を有する軽鎖フラグメントが含まれ、前記可変領域には、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４から選択される少なくとも１個のＣＤＲが含まれる。或いは、本明細書に更に記載されるように、開示し、選択したＣＤＲの１個以上を、抗体又は抗原結合剤の特性に悪影響を及ぼさないか、又はそれを改善する１個以上のアミノ酸の置換によって、変更することができる。一実施形態では、選択したＣＤＲ（単数又は複数）は、ヒト免疫グロブリンフレームワークに配置される。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークは、グラフト化ＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持するために、更に改変又は変更される。一実施形態では、投与される抗体又は抗体結合剤は、ヒトａＰ２について１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。
一実施形態では、被験体に投与される抗体又は抗体結合剤には、配列番号７から１３又は配列番号２２から２４から選択される少なくとも１個のＣＤＲ、及びＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ１バリアント２（配列番号２５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＲＨ２バリアント３（配列番号２６）、ＣＤＲＨ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、ＣＤＨＲ３バリアント２（配列番号２１）又はＣＤＲＨ３バリアント３（配列番号２７）から選択される少なくとも１個のＣＤＲが含まれ、ＣＤＲ配列は、ヒト免疫グロブリンフレームワークにグラフト化される。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークは、グラフト化ＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持するために、更に改変又は変更される。
特定の実施形態では、投与される抗体又は抗体結合剤には、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号２９）、軽鎖配列９０９ｇＬ１ ＶＬ＋ＣＬ（配列番号３０）、
軽鎖可変配列９０９ｇＬ１０（配列番号３１）、軽鎖配列９０９ｇＬ１０ ＶＬ＋ＣＬ（配列番号３２）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ１３（配列番号３７）、軽鎖配列９０９ｇＬ１３ ＶＬ＋ＣＬ（配列番号３９）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ５０（配列番号３８）、
軽鎖配列９０９ｇＬ５０ ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４０）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ５４（配列番号３３）、軽鎖配列９０９ｇＬ５４ ＶＬ＋ＣＬ（配列番号３４）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ５５（配列番号３５）又は軽鎖配列９０９ｇＬ５５ ＶＬ＋ＣＬ（配列番号３６）が含まれる。
他の実施形態では、投与される抗体又は抗原結合剤には、９０９ｇＬ１（配列番号２９）、９０９ｇ１０（配列番号３１）、９０９ｇＬ１３（配列番号３７）、９０９ｇＬ５０（配列番号３８）、９０９ｇＬ５４（配列番号３３）、又は９０９ｇＬ５５（配列番号３５）から選択される軽鎖可変配列、及び９０９ｇＨ１（配列番号４２）、９０９ｇＨ１４（配列番号４４）、９０９ｇＨ１５（配列番号４６）、９０９ｇＨ６１（配列番号４８）又は９０９ｇＨ６２（配列番号５０）から選択される重鎖可変配列が含まれる。例えば、抗体又は抗原結合剤には、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号２９）及び重鎖可変配列９０９ｇＨ１（配列番号４２）が含まれ得る。
代謝障害
本発明の一態様では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することによって、グルカゴン活性の調節不全によって媒介される宿主の代謝障害を治療する方法を提供する。代謝障害には、被験体における代謝（即ち、生体プロセス及び活動にエネルギーが供給される生細胞内の化学変化）の異常によって引き起こされるか、又はこれによって特徴付けられる障害、疾患又は症状が含まれる。代謝障害には、高血糖に関連する疾患、障害又は症状が含まれる。代謝障害は、細胞増殖、成長、分化又は移動、恒常性の細胞調節、細胞間又は細胞内の通信等の細胞機能；肝機能、腎機能又は脂肪細胞機能等の組織機能；ホルモン応答（例えば、グルカゴン応答）等の生体の全身応答に悪影響を及ぼす可能性がある。代謝障害の例には、肥満症、糖尿病、過食症、内分泌異常、トリグリセリド貯蔵疾患、Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｌ症候群、Ｌａｕｒｅｎｃｅ−Ｍｏｏｎ症候群、Ｐｒａｄｅｒ−Ｌａｂｈａｒｔ−Ｗｉｌｌｉ症候群、及び脂質代謝障害が含まれる。
グルカゴン受容体媒介性障害の重症度を軽減する方法
グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、治療的有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを、宿主に投与することによって、宿主、典型的には、ヒトの血液中の過剰なグルコースの異常なレベルに至るグルカゴン活性の調節不全によって引き起こされる疾患又は障害を予防又は治療する方法を提供する。抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントは、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の生物学的活性を、部分的に又は完全に阻害又は低減するのに十分な投与量で投与される。
一態様では、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメトを投与することによって、宿主のグルカゴン媒介性障害の重症度を予防又は軽減する方法を提供し、これにより、グルカゴンの生物学的活性の低下又は低減、並びに調節不全のグルカゴンの関連生物学的作用の低減、例えば、絶食時血中グルコースレベル、脂肪量レベル、肝臓グルコース産生、脂肪細胞脂肪分解、高インスリン血症、及び／又は肝臓脂肪変性の低減がもたらされる。一実施形態では、グルカゴンの生物学的活性の低減により、インスリン感受性、グルコース代謝の増加、及び／又は膵島β細胞の死、機能不全、又は欠失の予防がもたらされる。
本発明の他の態様では、
絶食時血中グルコースレベルを低下させる；
脂肪量レベルを低下させる；
肝臓グルコース産生を減少させる；
脂肪細胞の脂肪分解を減少させる；
高インスリン血症を軽減させる；
肝臓脂肪変性を軽減させる；
グルコース代謝を増加させる；
インスリン感受性を増加させる；
β細胞死、機能不全、又は欠失を予防する；及び／又は
宿主の循環分泌ａＰ２レベルを決定する；
方法であって、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを、それを必要とする宿主、典型的にはヒトに投与することを含む、方法を提供する。
併用治療
ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を妨害することができる化合物を使用して、過剰なＧＣＧＲ作動によって媒介される根本的な障害を治療することができる。一実施形態では、該化合物は、それを必要とする被験体に、追加的な活性成分と組み合わせて又は交代で投与される。
幾つかの実施形態では、本明細書にて、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を妨害することができる化合物を、被験体に、別の治療剤と共に投与する、組み合わせ治療を利用する方法を提供する。本発明の化合物と組み合わせて投与することができ、別々に又は同じ医薬組成物中で投与することができる追加的な治療剤の例には、非限定的に、以下のものが含まれる：
（ａ）抗糖尿病剤、例えば、（１）ＰＰＡＲγアゴニスト、例えば、グリタゾン（例えば、シグリタゾン；ダルグリタゾン；エングリタゾン；イソクリタゾン（ＭＣＣ−５５５）；ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ）；ロシグリタゾン（ＡＶＡＮＤＩＡ）；トログリタゾン；リボグリタゾン、ＢＲＬ４９６５３；ＣＬＸ−０９２１；５−ＢＴＺＤ，ＧＷ−０２０７，ＬＧ−１００６４１，Ｒ４８３，及びＬＹ−３００５１２等、並びに国際特許出願ＷＯ９７／１０８１３，９７／２７８５７，９７／２８１１５，９７／２８１３７，９７／２７８４７，０３／０００６８５，及び０３／０２７１１２に開示された化合物、更に、ＳＰＰＡＲＭＳ（選択的ＰＰＡＲガンマモジュレーター）、例えば、Ｔ１３１（アムジェン）、ＦＫ６１４（フジサワ）、ネトグリタゾン、及びメタグリダセン；（２）ビグアニド、例えば、ブホルミン；メトホルミン；及びフェンホルミン等；（３）タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害薬、例えば、ＩＳＩＳ １１３７１５、Ａ−４０１６７４、Ａ−３６４５０４、ＩＤＤ−３、ＩＤＤ２８４６、ＫＰ−４００４６、ＫＲ６１６３９、ＭＣ５２４４５、ＭＣ５２４５３、Ｃ７、ＯＣ−０６００６２、ＯＣ−８６８３９、ＯＣ２９７９６、ＴＴＰ−２７７ＢＣ１、並びに国際特許出願ＷＯ０４／０４１７９９、０４／０５０６４６、０２／２６７０７、０２／２６７４３、０４／０９２１４６、０３／０４８１４０、０４／０８９９１８、０３／００２５６９、０４／０６５３８７、０４／１２７５７０、及び米国特許ＵＳ２００４／１６７１８３に開示されたこれらの薬剤；（４）スルホニルウレア、例えば、アセトヘキサミド；クロルプロパミド；ジアビネース；グリベンクラミド；グリピジド；グリブリド；グリメピリド；グリクラジド；グリペンチド；グリキドン；グリソールアミド；トラザミド；及びトルブタミド等；（５）メグリチニド、例えば、レパグリニド、メチグリニド（ＧＬＵＦＡＳＴ）及びナテグリニド等；（６）アルファグルコシドヒドロラーゼ阻害薬、例えば、アカルボース；アディポシン；カミリグボース；エミグリタート；ミグリトール；ボグリボース；プラジミシン−Ｑ；サルボスタチン；ＣＫＤ−７１１；ＭＤＬ−２５，６３７；ＭＤＬ−７３，９４５；及びＭＯＲ１４等；（７）アルファ−アミラーゼ阻害薬、例えば、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）、トレスタチン、及びＡｌ−３６８８等；（８）インスリン分泌促進剤、例えば、リノグリリドナテグリニド、ミチグリニド（ＧＬＵＦＡＳＴ）、ＩＤ１１０１Ａ−４１６６等；（９）脂肪酸酸化防止剤、例えば、クロモキシル及びエトモキシル等；（１０）Ａ２アンタゴニスト、例えば、ミダグリゾール；イサグリドール；デリグリドール；イダゾキサン；エファロキサン（ｅａｒｏｘａｎ）；及びフルパロキサン等；（１１）インスリン又はインスリン模倣薬、例えば、ビオタ、ＬＰ−１００、ノバラピド、インスリンデテミル、インスリンリスプロ、インスリングラルギン、イヌリンデグルデク、インスリン亜鉛懸濁液（レンテ及びウルトラレンテ）；Ｌｙｓ−Ｐｒｏインスリン、ＧＬＰ−１（１７−３６）、ＧＬＰ−１（７３−７）（インスリントロピン）；ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２）エキセナチド／エキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４、エキセナチドＬＡＲ、リナグルチド、ＡＶＥ００１０、ＣＪＣ１１３１、ＢＩＭ５１０７７、ＣＳ８７２、ＴＨ０３１８、ＢＡＹ−６９４３２６、ＧＰ０１０、ＡＬＢＵＧＯＮ（アルブミンに融合したＧＬＰ−１）、ＨＧＸ−００７（Ｅｐａｃアゴニスト）、Ｓ−２３５２１、及びＷＯ０４／０２２００４、ＷＯ０４／３７８５９等に開示されている化合物；（１２）非チアゾリジンジオン類、例えば、ＪＴ−５０１、及びファルグリタザル（ＧＷ−２５７０／ＧＩ−２６２５７９）等；（１３）ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、例えば、ＡＶＥ０８４７、ＣＬＸ−０９４０、ＧＷ−１５３６、ＧＷ１９２９、ＧＷ−２４３３、ＫＲＰ−２９７、Ｌ−７９６４４９、ＬＢＭ６４２、ＬＲ−９０、ＬＹ５１０９１９、ＭＫ−０７６７、ＯＮＯ５１２９、ＳＢ２１９９９４、ＴＡＫ−５５９、ＴＡＫ−６５４、６７７９５４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、Ｅ−３０３０（Ｅｉｓａｉ）、ＬＹ５１０９２９（Ｌｉｌｌｙ）、ＡＫ１０９（Ａｓａｈｉ）、ＤＲＦ２６５５（Ｄｒ．Ｒｅｄｄｙ）、ＤＲＦ８３５１（Ｄｒ．Ｒｅｄｄｙ）、ＭＣ３００２（Ｍａｘｏｃｏｒｅ）、ＴＹ５１５０１（ＴｏａＥｉｙｏ）、アレグリタザル、ファルグリタザル、ナベグリタザル、ムラグリタザル、ペリグリタザル、テサグリタザル（ＧＡＬＩＤＡ）、レグリタザル（ＪＴ−５０１）、チグリタザル、及び国際特許出願ＷＯ９９／１６７５８、ＷＯ９９／１９３１３、ＷＯ９９／２０６１４、ＷＯ９９／３８８５０、ＷＯ００／２３４１５、ＷＯ００／２３４１７、ＷＯ００／２３４４５、ＷＯ００／５０４１４、ＷＯ０１／００５７９、ＷＯ０１／７９１５０、ＷＯ０２／０６２７９９、ＷＯ０３／０３３４８１、ＷＯ０３／０３３４５０、ＷＯ０３／０３３４５３に開示されているもの；及び
（１４）インスリン、インスリン模倣薬及び他のインスリン感作薬；（１５）ＶＰＡＣ２受容体アゴニスト；（１６）ＧＬＫモジュレーター、例えば、ＰＳＮ１０５、ＲＯ２８１６７５、ＲＯ２７４３７５、及び国際特許出願ＷＯ０３／０１５７７４、ＷＯ０３／０００２６２、ＷＯ０３／０５５４８２、ＷＯ０４／０４６１３９、ＷＯ０４／０４５６１４、ＷＯ０４／０６３１７９、ＷＯ０４／０６３１９４、ＷＯ０４／０５０６４５等に開示されているもの；（１７）レチノイドモジュレーター、例えば、ＷＯ０３／０００２４９に開示されているもの；（１８）ＧＳＫ３ベータ／ＧＳＫ３阻害薬、例えば、４−［２−（２−ブロモフェニル）−４−（４−フルオロフェニル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）ピリジン、ＣＴ２１０２２、ＣＴ２００２６、ＣＴ−９８０２３、ＳＢ−２１６７６３、ＳＢ４１０１１１、ＳＢ−６７５２３６、ＣＰ−７０９４９、ＸＤ４２４１及び国際特許出願ＷＯ０３／０３７８６９、０３／０３８７７、０３／０３７８９１、０３／０２４４４７、０５／０００１９２、０５／０１９２１８等に開示されているこれらの化合物；
（１９）グリコーゲンホスホリラーゼ（ＨＧＬＰａ）阻害薬、例えば、ＡＶＥ５６８８、ＰＳＮ３５７、ＧＰｉ−８７９、国際特許出願ＷＯ０３／０３７８６４、ＷＯ０３／０９１２１３、ＷＯ０４／０９２１５８、ＷＯ０５／０１３９７５、ＷＯ０５／０１１３９８１、米国特許ＵＳ２００４／０２２０２２９、及び日本国特許ＪＰ２００４−１９６７０２等に開示されているもの；（２０）ＡＴＰ消費（ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）プロモーター、例えば、ＷＯ０３／００７９９０に開示されたもの；（２１）ＰＰＡＲγアゴニストとメトホルミンの一定の組み合わせ、例えば、ＡＶＡＮＤＡＭＥＴ；（２２）ＰＰＡＲパンアゴニスト、例えば、ＧＳＫ６７７９５４；（２３）ＧＰＲ４０（Ｇタンパク質共役受容体４０）ＳＮＯＲＦ５５とも称される、例えば、ＢＧ７００、及びＷＯ ０４／０４１２６６、０４／０２２５５１、０３／０９９７９３に開示されているもの；（２４）ＧＰＲ１１９（Ｇタンパク質共役受容体１１９、ＲＵＰ３；ＳＮＯＲＦ２５とも称される）、例えば、ＲＵＰ３、ＨＧＰＲＢＭＹ２６、ＰＦＩ００７、ＳＮＯＲＦ２５；（２５）アデノシン受容体２Ｂアンタゴニスト、例えば、ＡＴＬ−６１８、ＡＴ１−８０２、Ｅ３０８０等；（２６）カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害薬、例えば、ＳＴ１３２７及びＳＴ１３２６等；（２７）フルクトース１，６−ビスホスホハターゼ阻害薬、例えば、ＣＳ−９１７、ＭＢ７８０３等；（２８）グルカゴンアンタゴニスト、例えば、ＡＴ７７０７７、ＢＡＹ６９４３２６、ＧＷ４１２３Ｘ、ＮＮ２５０１、及びＷＯ０３／０６４４０４、ＷＯ０５／００７８１、ＵＳ２００４／０２０９９２８、ＵＳ２００４／０２９９４３に開示されているもの；（３０）グルコース−６−ホスファーゼ阻害薬；（３１）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）阻害薬；（３２）ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）活性化剤；（３３）ＲＸＲアゴニスト、例えば、ＭＣ１０３６、ＣＳ０００１８、ＪＮＪ１０１６６８０６、及びＷＯ０４／０８９９１６、米国特許第６，７５９，５４６号等に開示されているもの；（３４）ＳＧＬＴ阻害薬、例えば、ＡＶＥ２２６８、ＫＧＴ１２５１、Ｔ１０９５／ＲＷＪ３９４７１８；（３５）ＢＬＸ−１００２；（３６）アルファグルコシダーゼ阻害薬；（３７）グルカゴン受容体アゴニスト；（３８）グルコキナーゼ活性化剤；（３９）ＧＩＰ−１；（４０）インスリン分泌促進薬；（４１）ＧＰＲ−４０アゴニスト、例えば、ＴＡＫ−８７５、５−［４−［［（１Ｒ）−４−［６−（３−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ）−２−メチルピリジン−３−イル］−２，３−ジヒドロー１Ｈ−インデン−１−イル］オキシ］フェニル］−イソチアゾール−３−オール１−オキシド、５−（４−（（３−（２，６−ジメチル−４−（３−（メチルスルホニル）プロポキシ）−フェニル）フェニル）−メトキシ）フェニル）イソ、５−（４−（（３−（２−メチル−６−（３−ヒドロキシプロポキシル）ピリジン−３−イル）−２−メチルフェニル）メトキシ）フェニル）イソチアゾール−３−オール１−オキシド、及び５−［４−［［３−［４−（３−アミノプロポキシ）−２，６−ジメチルフェニル］フェニル］メトキシ］フェニル］イソチアゾール−３−オール１−オキシド）、及び国際特許出願ＷＯ１１／０７８３７１に開示されているもの；（４２）ＳＧＬＴ−２阻害薬、例えば、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、トホグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、ルセオグリフロジン（ＴＳ−０７１）、エルツグリフロジン（ＰＦ−０４９７１７２９）、及びレモグリフロジン；及び（４３）ＳＧＬＴ−２阻害薬、例えば、ＬＸ４２１１；
（ｂ）抗脂質異常症剤、例えば、（１）脂質降下薬、例えば、コレスチラミン、コレセベレラン（ｃｏｌｅｓｅｖｅｌｅｍ）、コレスチポール、架橋デキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体；Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標）；ＬｏＣｈｏｌｅｓｔ（登録商標）；及びＱｕｅｓｔｒａｎ（登録商標）等；（２）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、例えば、アトルバスタチン、イタバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン（ＺＤ−４５２２）及び他のスタチン、特にシンバスタチン；（３）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ阻害薬；（４）コレステロール吸収阻害薬、例えば、ＦＭＶＰ４（Ｆｏｒｂｅｓ Ｍｅｄｉ−Ｔｅｃｈ）、ＫＴ６−９７１（Ｋｏｔｏｂｕｋｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＦＭ−ＶＡ１２（Ｆｏｒｂｅｓ Ｍｅｄｉ−Ｔｅｃｈ）、ＦＭ−ＶＰ−２４（Ｆｏｒｂｅｓ Ｍｅｄｉ−Ｔｅｃｈ）、スタノールエステル、ベータ−シトステロール、ステロールグリコシド、例えば、チケシド（ｔｉｑｕｅｓｉｄｅ）；及びアゼチジノン、例えば、エゼチミブ、並びに国際特許出願ＷＯ０４／００５２４７等に開示されているもの；（５）アシル補酵素Ａ−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害薬、例えば、アバシミベ、エフルシミベ、パクチミベ（ＫＹ５０５）、ＳＭＰ７９７（スミトモ）、ＳＭ３２５０４（スミトモ）、及び国際特許出願ＷＯ０３／０９１２１６に開示されているもの等；（６）ＣＥＴＰ阻害薬、例えば、アナセトラピブ、ＪＴＴ７０５（日本たばこ）、トルセトラピブ、ＣＰ５３２，６３２、ＢＡＹ６３−２１４９（Ｂａｙｅｒ）、ＳＣ５９１、ＳＣ７９５等；（７）スクアレンシンセターゼ阻害薬；（８）抗酸化剤、例えば、プロブコール（ｐｒｏｂｕｃｏｌ）等；（９）ＰＰＡＲαアゴニスト、例えば、ベクロフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、エトフィブラート、フェノフィブラート、ゲムカベン及びゲムフィブロジル、ＧＷ７６４７、ＢＭ１７０７４４（Ｋｏｗａ）、ＬＹ５１８６７４（Ｌｉｌｌｙ）、ＧＷ５９０７３５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、ＫＲＰ−１０１（Ｋｙｏｒｉｎ）、ＤＲＦ１０９４５（Ｄｒ．Ｒｅｄｄｙ）、ＮＳ−２２０／Ｒ１５９３（Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｉｎｙａｋｕ／Ｒｏｃｈｅ）、ＳＴ１９２９（Ｓｉｇｍａ Ｔａｕ）ＭＣ３００１／ＭＣ３００４（ＭａｘｏＣｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ゲムカベンカルシウム、他のフィブリン酸誘導体、例えば、Ａｔｒｏｍｉｄ（登録商標）、Ｌｏｐｉｄ（登録商標）、及び米国特許６，５４８，５３８に開示されているもの等；（１０）ＦＸＲ受容体モジュレーター、例えば、ＧＷ４０６４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、ＳＲ１０３９１２、ＱＲＸ４０１、ＬＮ−６６９１（Ｌｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及び国際特許出願ＷＯ０２／０６４１２５、ＷＯ０４／０４５５１１に開示されているもの等；（１１）ＬＸＲ受容体モジュレーター、例えば、ＧＷ３９６５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、Ｔ９０１３１３７、及びＸＴＣＯ１７９６２８（Ｘ−Ｃｅｐｔｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｓａｎｙｏ）、及び国際特許出願ＷＯ０３／０３１４０８、ＷＯ０３／０６３７９６、ＷＯ０４／０７２０４１に開示されているもの等；（１２）リポタンパク質合成阻害薬、例えば、ナイアシン；（１３）レニンアンジオテンシン系阻害薬；（１４）ＰＰＡＲδ部分アゴニスト、例えば、ＷＯ０３／０２４３９５に開示されているもの等；（１５）胆汁酸再吸収阻害薬、例えば、ＢＡＲＩ１４５３、ＳＣ４３５、ＰＨＡ３８４６４０、Ｓ８９２１、ＡＺＤ７７０６等；及び胆汁酸封鎖剤（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒａｎｔｓ）、例えば、コレセベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ／ＣＨＯＬＥＳＴＡＧＥＬ）、コレスチポール、コレスチラミン、及び架橋デキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体；（１６）ＰＰＡＲδアゴニスト、例えば、ＧＷ５０１５１６（Ｌｉｇａｎｄ，ＧＳＫ）、ＧＷ５９０７３５、ＧＷ−０７４２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、Ｔ６５９（Ａｍｇｅｎ／Ｔｕｌａｒｉｋ）、ＬＹ９３４（Ｌｉｌｌｙ）、ＮＮＣ６１００５０（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、並びに国際特許出願ＷＯ９７／２８１４９、ＷＯ０１／７９１９７、ＷＯ０２／１４２９１、ＷＯ０２／４６１５４、ＷＯ０２／４６１７６、ＷＯ０２／０７６９５７、ＷＯ０３／０１６２９１、ＷＯ０３／０３３４９３、ＷＯ０３／０３５６０３、ＷＯ０３／０７２１００、ＷＯ０３／０９７６０７、ＷＯ０４／００５２５３、ＷＯ０４／００７４３９、及び日本国特許ＪＰ１０２３７０４９に開示されているもの等；（１７）トリグリセリド合成阻害薬；（１８）ミクロソームトリグリセリド輸送（ＭＴＰ）阻害薬、例えば、インプリタピド、ＬＡＢ６８７、ＪＴＴ１３０（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、ＣＰ３４６０８６、及びＷＯ０３／０７２５３２に開示されているもの等；（１９）転写モジュレーター；（２０）スクアレンエポキシダーゼ阻害薬；（２１）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体誘導薬；（２２）血小板凝集阻害薬；（２３）５−ＬＯ又はＦＬＡＰ阻害薬；及び（２４）ナイアシン受容体アゴニスト、例えば、ＨＭ７４Ａ受容体アゴニスト；（２５）ＰＰＡＲモジュレーター、例えば、ＷＯ０１／２５１８１、ＷＯ０１／７９１５０、ＷＯ０２／７９１６２、ＷＯ０２／０８１４２８、ＷＯ０３／０１６２６５、ＷＯ０３／０３３４５３に開示されているもの等；（２６）ナイアシン結合クロム、例えば、ＷＯ０３／０３９５３５に開示されているもの；（２７）置換酸誘導体、例えば、ＷＯ０３／０４０１１４に開示されているもの；（２８）注入ＨＤＬ、例えば、ＬＵＶ／ＥＴＣ−５８８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＰＯ−Ａ１ Ｍｉｌａｎｏ／ＥＴＣ２１６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＥＴＣ−６４２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩＳＩＳ３０１０１２、Ｄ４Ｆ（Ｂｒｕｉｎ Ｐｈａｒｍａ）、合成三量体ＡｐｏＡ１、泡沫細胞を標的とするＢｉｏｒａｌ Ａｐｏ Ａ１等；（２９）ＩＢＡＴ阻害薬、例えば、ＢＡＲＩ１４３／ＨＭＲ１４５Ａ／ＨＭＲ１４５３（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＰＨＡ３８４６４０Ｅ（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｓ８９２１（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）ＡＺＤ７８０６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＫ１０５（Ａｓａｈ Ｋａｓｅｉ）等；（３０）Ｌｐ−ＰＬＡ４阻害薬、例えば、ＳＢ４８０８４８（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、６５９０３２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、６７７１１６（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）等；（３１）脂質組成物に影響を及ぼす他の薬剤、例えば、ＥＴＣ１００１／ＥＳＰ３１０１５（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＥＳＰ−５５０１６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＧＩ１０６７（ＡｔｈｅｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＡＣ３０５６（Ａｍｙｌｉｎ）、ＡＺＤ４６１９（ＡｓｔｒＺｅｎｅｃａ）；及び
（ｃ）抗高血圧症剤、例えば、（１）利尿剤、例えば、チアジド、例えば、クロルタリドン、クロロチアジド（ｃｈｌｏｒｔｈｉａｚｉｄｅ）、ジクロロフェナミド、ヒドロフルメチアジド、インダパミド、及びヒドロクロロチアジド；ループ利尿剤、例えば、ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、及びトルセミド；カリウム保持性利尿薬（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｐａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、例えば、アミロリド、及びトリアムテレン；及びアルドステロンアンタゴニスト、例えば、スピロノラクトン、エプレレノン（ｅｐｉｒｅｎｏｎｅ）等；（２）ベータアドレナリン遮断薬、例えば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、エスモロール、インデノロール、メタプロロール、ナドロール、ネビボロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、ソタロール、テルタトロール、チリソロール、及びチモロール等；（３）カルシウムチャンネル遮断薬、例えば、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、ベプリジル、シナルジピン、クレビジピン、ジルチアゼム、エホニジピン、フェロジピン、ガロパミル、イスラジピン、ラシジピン、レミルジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン（ｎｉｍｏｄｅｐｉｎｅ）、ニソルジピン、ニトレンジピン、マニジピン、プラニジピン、及びベラパミル等；（４）アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、例えば、ベナゼプリル；カプトプリル；シラザプリル；デラプリル；エナラプリル；フォシノプリル；イミダプリル；ロシノプリル；モエキシプリル；キナプリル；キナプリラト；ラミプリル；ペリンドプリル；ペリンドプリル（ｐｅｒｉｎｄｒｏｐｒｉｌ）；キナプリル（ｑｕａｎｉｐｒｉｌ）；スピラプリル；テノカプリル；トランドラプリル、及びゾフェノプリル等；（５）中性エンドペプチダーゼ阻害薬、例えば、オマパトリラト、カンドキサトリル（ｃａｄｏｘａｔｒｉｌ）及びエカドトリル、フォシドトリル、サムパトリラト、ＡＶＥ７６８８、ＥＲ４０３０等；
（６）エンドセリンアンタゴニスト、例えば、テゾセンタン、Ａ３０８１６５、及びＹＭ６２８９９等;（７）血管拡張剤、ヒドララジン、クロニジン、ミノキシジル、及びニコチニルアルコール、ニコチン酸又はその塩等；（８）アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、例えば、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、プラトサルタン、タソサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びＥＸＰ−３１３７、ＦＩ６８２８Ｋ、及びＲＮＨ６２７０等；（９）α／βアドレナリン遮断薬、例えば、ニプラジロール、アロチノロール及びアモスラロール等；（１０）アルファ１遮断薬、例えば、テラゾシン、ウラピジル、プラゾシン、ブナゾシン、トリマゾシン、ドキサゾシン、ナフトピジル、インドラミン、ＷＨＩＰ１６４、及びＸＥＮ０１０等；（１１）アルファ２アゴニスト、例えば、ロフェキシジン、チアメニジン、モキソニジン、リルメニジン及びグアノベンズ等；（１２）アルドステロン阻害薬等；（１３）アンジオポエチン−２−結合剤、例えば国際特許出願ＷＯ０３／０３０８３３に開示されているもの；及び
（ｄ）抗肥満薬、例えば、（１）５ＨＴ（セロトニン）輸送体阻害薬、例えば、パロキセチン、フルオキセチン、フェンフルラミン、フルボキサミン、セルトラリン、及びイミプラミン、並びに国際特許出願ＷＯ０３／００６６３に開示されているもの、そしてセロトニン／ノルアドレナリン再取り込み阻害薬、例えば、シブトラミン（ＭＥＲＩＤＩＡ／ＲＥＤＵＣＴＩＬ）及びドーパミン取り込み阻害薬／ノルエピネフリン（Ｎｏｒｅｐｅｎｅｐｈｒｉｎｅ）取り込み阻害薬、例えば、塩酸ラダファキシン、３５３１６２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）等；（２）ＮＥ（ノルエピネフリン）輸送体阻害薬、例えば、ＧＷ３２０６５９、デスピラミン、タルスプラム、及びノミフェンシン；（３）ＣＢ１（カンナビノイド−１受容体）アンタゴニスト／インバースアゴニスト、例えば、リモナバント（ＡＣＣＯＭＰＬＩＡ Ｓａｎｏｆｉ Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）、ＳＲ−１４７７７８（Ｓａｎｏｆｉ Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）、ＡＶＥ１６２５（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＢＡＹ６５−２５２０（Ｂａｙｅｒ）、ＳＬＶ３１９（Ｓｏｌｖａｙ）、ＳＬＶ３２６（Ｓｏｌｖａｙ）、ＣＰ９４５５９８（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｅ−６７７６（Ｅｓｔｅｖｅ）、０１６９１（Ｏｒｇａｎｉｘ）、ＯＲＧ１４４８１（Ｏｒｇａｎｏｎ）、ＶＥＲ２４３４３（Ｖｅｒｎａｌｉｓ）、ＮＥＳＳ０３２７（Ｕｎｉｖ ｏｆ Ｓａｓｓａｒｉ／Ｕｎｉｖ ｏｆ Ｃａｇｌｉａｒｉ）、及び米国特許Ｕ．Ｓ．４，９７３，５８７、５，０１３，８３７、５，０８１，１２２、５，１１２，８２０、５，２９２，７３６、５，５３２，２３７、５，６２４，９４１、６，０２８，０８４，及び６，５０９，３６７；並びに国際特許出願ＷＯ９６／３３１５９、ＷＯ９７／２９０７９、ＷＯ９８／３１２２７、ＷＯ９８／３３７６５、ＷＯ９８／３７０６１、ＷＯ９８／４１５１９、ＷＯ９８／４３６３５、ＷＯ９８／４３６３６、ＷＯ９９／０２４９９、ＷＯ００／１０９６７、ＷＯ００／１０９６８、ＷＯ０１／０９１２０、ＷＯ０１／５８８６９、ＷＯ０１／６４６３２、ＷＯ０１／６４６３３、ＷＯ０１／６４６３４、ＷＯ０１／７０７００、ＷＯ０１／９６３３０、ＷＯ０２／０７６９４９、ＷＯ０３／００６００７、ＷＯ０３／００７８８７、ＷＯ０３／０２０２１７、ＷＯ０３／０２６６４７、ＷＯ０３／０２６６４８、ＷＯ０３／０２７０６９、ＷＯ０３／０２７０７６、ＷＯ０３／０２７１１４、ＷＯ０３／０３７３３２、ＷＯ０３／０４０１０７、ＷＯ０４／０９６７６３、ＷＯ０４／１１１０３９、ＷＯ０４／１１１０３３、ＷＯ０４／１１１０３４、ＷＯ０４／１１１０３８、ＷＯ０４／０１３１２０、ＷＯ０５／０００３０１、ＷＯ０５／０１６２８６、ＷＯ０５／０６６１２６及び欧州特許ＥＰ−６５８５４６等に開示されたもの；（４）グレリンアゴニスト／アンタゴニスト、例えば、ＢＶＴ８１−９７（ＢｉｏＶｉｔｒｕｍ）、ＲＣ１２９１（Ｒｅｊｕｖｅｎｏｎ）、ＳＲＤ−０４６７７（スミトモ）、非アシル化グレリン（Ｔｈｅｒａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び国際特許出願ＷＯ０１／８７３３５、ＷＯ０２／０８２５０、ＷＯ０５／０１２３３１に開示されたもの等；（５）Ｈ３（ヒスタミンＨ３）アンタゴニスト／インバースアゴニスト、例えば、チオペラミド、３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピルＮ−（４−ペンテニル）カルバマート）、クロベンプロピット、ヨードフェンプロピット（ｉｏｄｏｐｈｅｎｐｒｏｐｉｔ）、イモプロキシファン、ＧＴ２３９４（Ｇｌｉａｔｅｃｈ）、及びＡ３３１４４０、並びに国際特許出願ＷＯ０２／１５９０５に開示されているもの；そしてＯ−［３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパノール］カルバマート（Ｋｉｅｃ−Ｋｏｎｏｎｏｗｉｃｚ、Ｋ．ら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５５：３４９−５５（２０００年））、ピペリジン含有ヒスタミンＨ３受容体アンタゴニスト（Ｌａｚｅｗｓｋａ、Ｄ．ら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５６：９２７−３２（２００１年））、ベンゾフェノン誘導体及び関連化合物（Ｓａｓｓｅ、Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）３３４：４５−５２（２００１年））、置換Ｎ−フェニルカルバマート（Ｒｅｉｄｅｍｅｉｓｔｅｒ、Ｓ．ら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５５：８３−６（２０００年））、並びにプロキシファン誘導体（Ｓａｓｓｅ、Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：３３３５−４３（２０００年））及びヒスタミンＨ３受容体モジュレーター、例えば、国際特許出願ＷＯ０３／０２４９２８及びＷＯ０３／０２４９２９に開示されているもの；（６）メラニン凝集ホルモン１受容体（ＭＣＨ１Ｒ）アンタゴニスト、例えば、Ｔ−２２６２９６（Ｔａｋｅｄａ）、Ｔ７１（Ｔａｋｅｄａ／Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧＮ−６０８４５０、ＡＭＧＮ−５０３７９６（Ａｍｇｅｎ）、８５６４６４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、Ａ２２４９４０（Ａｂｂｏｔｔ）、Ａ７９８（Ａｂｂｏｔｔ）、ＡＴＣ０１７５／ＡＲ２２４３４９（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＧＷ８０３４３０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＢＩ−１Ａ（Ｎｅｕｒｏｃｒｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＮＧＸ−１（Ｎｅｕｒｏｇｅｎ）、ＳＮＰ−７９４１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ）、ＳＮＡＰ９８４７（Ｓｙｎａｐｔｉｃ）、Ｔ−２２６２９３（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、ＴＰＩ−１３６１−１７（Ｓａｉｔａｍａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｒｖｉｎｅ）、及び国際特許出願ＷＯ０１／２１１６９、ＷＯ０１／８２９２５、ＷＯ０１／８７８３４、ＷＯ０２／０５１８０９、ＷＯ０２／０６２４５、ＷＯ０２／０７６９２９、ＷＯ０２／０７６９４７、ＷＯ０２／０４４３３、ＷＯ０２／５１８０９、ＷＯ０２／０８３１３４、ＷＯ０２／０９４７９９、ＷＯ０３／００４０２７、ＷＯ０３／１３５７４、ＷＯ０３／１５７６９、ＷＯ０３／０２８６４１、ＷＯ０３／０３５６２４、ＷＯ０３／０３３４７６、ＷＯ０３／０３３４８０、ＷＯ０４／００４６１１、ＷＯ０４／００４７２６、ＷＯ０４／０１１４３８、ＷＯ０４／０２８４５９、ＷＯ０４／０３４７０２、ＷＯ０４／０３９７６４、ＷＯ０４／０５２８４８、ＷＯ０４／０８７６８０、及び日本国特許出願ＪＰ１３２２６２６９、ＪＰ１４３７０５９、ＪＰ２００４３１５５１１に開示されているもの等；（７）ＭＣＨ２Ｒ（メラニン凝集ホルモン２Ｒ）アゴニスト／アンタゴニスト；（８）ＮＰＹ１（神経ペプチドＹ Ｙ１）アンタゴニスト、例えば、ＢＭＳ２０５７４９、ＢＩＢＰ３２２６、Ｊ−１１５８１４、ＢＩＢＯ３３０４、ＬＹ−３５７８９７、ＣＰ−６７１９０６、及びＧＩ−２６４８７９Ａ；並びに米国特許６，００１，８３６；及び国際特許出願ＷＯ９６／１４３０７、ＷＯ０１／２３３８７、ＷＯ９９／５１６００、ＷＯ０１／８５６９０、ＷＯ０１／８５０９８、ＷＯ０１／８５１７３、及びＷＯ０１／８９５２８に開示されているもの；（９）ＮＰＹ５(神経ペプチドＹ Ｙ５)アンタゴニスト、例えば、１５２，８０４、Ｓ２３６７（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、Ｅ−６９９９（Ｅｓｔｅｖｅ）、ＧＷ−５６９１８０Ａ、ＧＷ−５９４８８４Ａ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、ＧＷ−５８７０８１Ｘ、ＧＷ−５４８１１８Ｘ；ＦＲ２３５，２０８；ＦＲ２２６９２８、ＦＲ２４０６６２、ＦＲ２５２３８４；１２２９Ｕ９１、ＧＩ−２６４８７９Ａ、ＣＧＰ７１６８３Ａ、Ｃ−７５（Ｆａｓｇｅｎ）ＬＹ−３７７８９７、ＬＹ３６６３７７、ＰＤ−１６０１７０、ＳＲ−１２０５６２Ａ、ＳＲ−１２０８１９Ａ、Ｓ２３６７（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、ＪＣＦ−１０４、及びＨ４０９／２２；並びに米国特許６，１４０，３５４、６，１９１，１６０、６，２５８，８３７、６，３１３，２９８、６，３２６，３７５、６，３２９，３９５、６，３３５，３４５、６，３３７，３３２、６，３２９，３９５、及び６，３４０，６８３；及び欧州特許ＥＰ−０１０１０６９１、ＥＰ−０１０４４９７０、及びＦＲ２５２３８４；及びＰＣＴ公開ＷＯ９７／１９６８２、ＷＯ９７／２０８２０、ＷＯ９７／２０８２１、ＷＯ９７／２０８２２、ＷＯ９７／２０８２３、ＷＯ９８／２７０６３、ＷＯ００／１０７４０９、ＷＯ００／１８５７１４、ＷＯ００／１８５７３０、ＷＯ００／６４８８０、ＷＯ００／６８１９７、ＷＯ００／６９８４９、ＷＯ０１／０９１２０、ＷＯ０１／１４３７６、ＷＯ０１／８５７１４、ＷＯ０１／８５７３０、ＷＯ０１／０７４０９、ＷＯ０１／０２３７９、ＷＯ０１／０２３７９、ＷＯ０１／２３３８８、ＷＯ０１／２３３８９、ＷＯ０１／４４２０１、ＷＯ０１／６２７３７、ＷＯ０１／６２７３８、ＷＯ０１／０９１２０、ＷＯ０２／２０４８８、ＷＯ０２／２２５９２、ＷＯ０２／４８１５２、ＷＯ０２／４９６４８、ＷＯ０２／０５１８０６、ＷＯ０２／０９４７８９、ＷＯ０３／００９８４５、ＷＯ０３／０１４０８３、ＷＯ０３／０２２８４９、ＷＯ０３／０２８７２６、ＷＯ０５／０１４５９２、ＷＯ０５／０１４９３；そしてＮｏｒｍａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：４２８８−４３１２（２０００年）に開示されているそれらの化合物；（１０）レプチン、例えば、組換えヒトレプチン（ＰＥＧ−ＯＢ、Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）及び組換えメチオニルヒトレプチン（Ａｍｇｅｎ）等；（１１）レプチン誘導体、例えば、米国特許Ｕ．Ｓ．５，５５２，５２４；５，５５２，５２３；５，５５２，５２２；５，５２１，２８３；並びに国際特許出願ＷＯ９６／２３５１３；ＷＯ９６／２３５１４；ＷＯ９６／２３５１５；ＷＯ９６／２３５１６；ＷＯ９６／２３５１７；ＷＯ９６／２３５１８；ＷＯ９６／２３５１９；及びＷＯ９６／２３５２０に開示されているもの；（１２）オピオイドアンタゴニスト、例えば、ナルメフェン（Ｒｅｖｅｘ（登録商標））、３−メトキシナルトレキソン、ナロキソン、及びナルトレキソン；及び国際特許出願ＷＯ００／２１５０９に開示されたもの；（１３）オレキシンアンタゴニスト、例えば、ＳＢ−３３４８６７−Ａ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）；及び国際特許出願ＷＯ０１／９６３０２、０１／６８６０９、０２／４４１７２、０２／５１２３２、０２／５１８３８、０２／０８９８００、０２／０９０３５５、０３／０２３５６１、０３／０３２９９１、０３／０３７８４７、０４／００４７３３、０４／０２６８６６、０４／０４１７９１、０４／０８５４０３に開示されているもの等；（１４）ＢＲＳ３（ボンベシン受容体サブタイプ３）アゴニスト；（１５）ＣＣＫ−Ａ（コレシストキニン−Ａ）アゴニスト、例えば、ＡＲ−Ｒ１５８４９、ＧＩ１８１７７１、ＪＭＶ−１８０、Ａ−７１３７８、Ａ−７１６２３、ＰＤ１７０２９２、ＰＤ１４９１６４、ＳＲ１４６１３１、ＳＲ１２５１８０、ブタビンジド、及び米国特許Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．５，７３９，１０６号に開示されているもの；（１６）ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、例えば、ＧＩ−１８１７７１（Ｇｌａｘｏ−ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＳＲ１４６１３１（Ｓａｎｏｆｉ Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）；ブタビンジド；及びＰＤ１７０，２９２、ＰＤ１４９１６４（Ｐｆｉｚｅｒ）；（１７）ＣＮＴＦ誘導体、例えば、アキソキン（ａｘｏｋｉｎｅ）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；及び国際特許出願ＷＯ９４／０９１３４、ＷＯ９８／２２１２８、及びＷＯ９９／４３８１３に開示されているもの；（１８）ＧＨＳ（成長ホルモン分泌促進因子受容体）アゴニスト、例えば、ＮＮ７０３、ヘキサレリン、ＭＫ−０６７７、ＳＭ−１３０６８６、ＣＰ−４２４，３９１、Ｌ−６９２，４２９、及びＬ−１６３，２５５、並びに米国特許Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．６，３５８，９５１号、米国特許出願２００２／０４９１９６及び２００２／０２２６３７；国際特許出願ＷＯ０１／５６５９２、及びＷＯ０２／３２８８８に開示されているもの；（１９）５ＨＴ２ｃ（セロトニン受容体２ｃ）アゴニスト、例えば、ＡＰＤ３５４６／ＡＲ１０Ａ（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＴＨ８８６５１（Ａｔｈｅｒｓｙｓ）、ＡＴＨ８８７４０（Ａｔｈｅｒｓｙｓ）

、ＢＶＴ９３３（Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍ／ＧＳＫ）、ＤＰＣＡ３７２１５（ＢＭＳ）、ＩＫ２６４；ＬＹ４４８１００（Ｌｉｌｌｙ）、ＰＮＵ２２３９４；ＷＡＹ４７０（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ６２９（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ１６１５０３（Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍ）、Ｒ−１０６５、ＶＲ１０６５（Ｖｅｒｎａｌｉｓ／Ｒｏｃｈｅ）、ＹＭ３４８；並びに米国特許Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．３，９１４，２５０；及びＰＣＴ公開０１／６６５４８、０２／３６５９６、０２／４８１２４、０２／１０１６９、０２／４４１５２、０２／５１８４４、０２／４０４５６、０２／４０４５７、０３／０５７６９８、０５／０００８４９に開示されているもの等；（２０）Ｍｃ３ｒ（メラノコルチン３受容体）アゴニスト；（２１）Ｍｃ４ｒ（メラノコルチン４受容体）アゴニスト、例えば、ＣＨＩＲ８６０３６（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＣＨＩＲ９１５（Ｃｈｉｒｏｎ）；ＭＥ−１０１４２（Ｍｅｌａｃｕｒｅ）、ＭＥ−１０１４５（Ｍｅｌａｃｕｒｅ）、ＨＳ−１３１（Ｍｅｌａｃｕｒｅ）、ＮＢＩ７２４３２（Ｎｅｕｒｏｃｒｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＮＮＣ７０−６１９（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＴＴＰ２４３５（Ｔｒａｎｓｔｅｃｈ）並びにＰＣＴ公開ＷＯ９９／６４００２、００／７４６７９、０１／９９１７５２、０１／１２５１９２、０１／５２８８０、０１／７４８４４、０１／７０７０８、０１／７０３３７、０１／９１７５２、０１／０１０８４２、０２／０５９０９５、０２／０５９１０７、０２／０５９１０８、０２／０５９１１７、０２／０６２７６６、０２／０６９０９５、０２／１２１６６、０２／１１７１５、０２／１２１７８、０２／１５９０９、０２／３８５４４、０２／０６８３８７、０２／０６８３８８、０２／０６７８６９、０２／０８１４３０、０３／０６６０４、０３／００７９４９、０３／００９８４７、０３／００９８５０、０３／０１３５０９、０３／０３１４１０、０３／０９４９１８、０４／０２８４５３、０４／０４８３４５、０４／０５０６１０、０４／０７５８２３、０４／０８３２０８、０４／０８９９５１、０５／０００３３９、及び欧州特許ＥＰ１４６００６９、及び米国特許ＵＳ２００５０４９２６９、及び日本国特許ＪＰ２００５０４２８３９に開示されているもの等；（２２）モノアミン再取り込み阻害薬、例えば、シブトラトミン（Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標）／Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標））及びその塩、並びに米国特許Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．４，７４６，６８０、４，８０６，５７０、及び５，４３６，２７２、及び米国特許公開２００２／０００６９６４号、及び国際特許出願ＷＯ０１／２７０６８及びＷＯ０１／６２３４１に開示されているもの；（２３）セロトニン再取り込み阻害薬、例えば、デクスフェンフルラミン、フルオキセチン、及び米国特許Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．６，３６５，６３３、及び国際特許出願ＷＯ０１／２７０６０、及びＷＯ０１／１６２３４１に開示されているもの；（２４）ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）アゴニスト；（２５）トピラマート（Ｔｏｐｉｍａｘ（登録商標））；（２６）フィトファーム（ｐｈｙｔｏｐｈａｒｍ）化合物５７（ＣＰ６４４，６７３）；（２７）ＡＣＣ２（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−２）阻害薬；（２８）β３（ベータアドレナリン受容体３）アゴニスト、例えば、ラフェベルグロン（ｒａｆｅｂｅｒｇｒｏｎ）／ＡＤ９６７７／ＴＡＫ６７７（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ／Ｔａｋｅｄａ）、ＣＬ−３１６，２４３、ＳＢ４１８７９０、ＢＲＬ−３７３４４、Ｌ−７９６５６８、ＢＭＳ−１９６０８５、ＢＲＬ−３５１３５Ａ、ＣＧＰ１２１７７Ａ、ＢＴＡ−２４３、ＧＲＣ１０８７（Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＧＷ４２７３５３（ソラベグロン（ｓｏｌａｂｅｇｒｏｎ）塩酸塩）、トレカドリン（Ｔｒｅｃａｄｒｉｎｅ）、Ｚｅｎｅｃａ Ｄ７１１４、Ｎ−５９８４（Ｎｉｓｓｈｉｎ Ｋｙｏｒｉｎ）、ＬＹ−３７７６０４（Ｌｉｌｌｙ）、ＫＴ０７９２４（Ｋｉｓｓｅｉ）、ＳＲ５９１１９Ａ、及び米国特許Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．５，７０５，５１５、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．５，４５１，６７７；及び国際特許出願ＷＯ９４／１８１６１、ＷＯ９５／２９１５９、ＷＯ９７／４６５５６、ＷＯ９８／０４５２６、ＷＯ９８／３２７５３、ＷＯ０１／７４７８２、ＷＯ０２／３２８９７、ＷＯ０３／０１４１１３、ＷＯ０３／０１６２７６、ＷＯ０３／０１６３０７、ＷＯ０３／０２４９４８、ＷＯ０３／０２４９５３、ＷＯ０３／０３７８８１、ＷＯ０４／１０８６７４に開示されているもの等；（２９）ＤＧＡＴ１（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）阻害薬；（３０）ＤＧＡＴ２（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２）阻害薬；（３１）ＦＡＳ（脂肪酸シンターゼ）阻害薬、例えば、セルレニン及びＣ７５；（３２）ＰＤＥ（ホスホジエステラーゼ）阻害薬、例えば、テオフィリン、ペントキシフィリン、ザプリナスト、シルデナフィル、アムリノン、ミルリノン、シロスタミド、ロリプラム、及びシロミラスト、並びに国際特許出願ＷＯ０３／０３７４３２、ＷＯ０３／０３７８９９に記載されているもの；（３３）甲状腺ホルモンβアゴニスト、例えば、ＫＢ−２６１１（ＫａｒｏＢｉｏＢＭＳ）、並びに国際特許出願ＷＯ０２／１５８４５；及び日本国特許出願ＪＰ２０００２５６１９０に開示されたもの；（３４）ＵＣＰ−１（脱共役タンパク質１）、２又は３活性化因子、例えば、フィタン酸、４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（ΤΤΝΡΒ）、及びレチノイン酸；及び国際特許出願ＷＯ９９／００１２３に開示されているもの；（３５）アシル−エストロゲン、例えば、ｄｅｌ Ｍａｒ−Ｇｒａｓａ、Ｍ．ら、Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９：２０２−９（２００１年）に開示されているオレオイル−エストロン；（３６）グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、例えば、ＣＰ４７２５５５（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＫＢ３３０５、及び国際特許出願ＷＯ０４／０００８６９、ＷＯ０４／０７５８６４に開示されているもの等；（３７）１１βＨＳＤ−１（１１−ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型）阻害薬、例えば、ＬＹ−２５２３１９９、ＢＶＴ３４９８（ＡＭＧ３３１）、ＢＶＴ２７３３、３−（１−アダマンチル）−４−エチル−５−（エチルチオ）−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、３−（１−アダマンチル）−５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、３−アダマンタニル−４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，３ａ−デカヒドロ−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］［１１］アヌレン、及び国際特許出願ＷＯ０１／９００９１、０１／９００９０、０１／９００９２、０２／０７２０８４、０４／０１１４１０、０４／０３３４２７、０４／０４１２６４、０４／０２７０４７、０４／０５６７４４、０４／０６５３５１、０４／０８９４１５、０４／０３７２５１に開示されているもの等；
（３８）ＳＣＤ−１（ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１）阻害薬；（３９）ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−４）阻害薬、例えば、イソロイシンチアゾリジド、バリンピロリジド、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ）、オマリグリプチン、サキサグリプチン、アログリプチン、リナグリプチン、ＮＶＰ−ＤＰＰ７２８、ＬＡＦ２３７（ビルダグリプチン）、Ｐ９３／０１、ＴＳＬ２２５、ＴＭＣ−２Ａ／２Ｂ／２Ｃ、ＦＥ９９９０１１、Ｐ９３１０／Ｋ３６４、ＶＩＰ０１７７、ＳＤＺ２７４−４４４、ＧＳＫ８２３０９３、Ｅ３０２４、ＳＹＲ３２２、ＴＳ０２１、ＳＳＲ１６２３６９、ＧＲＣ８２００、Ｋ５７９、ＮＮ７２０１、ＣＲ１４０２３、ＰＨＸ１００４、ＰＨＸ１１４９、ＰＴ−６３０、ＳＫ−０４０３；並びに国際特許出願ＷＯ０２／０８３１２８、ＷＯ０２／０６２７６４、ＷＯ０２／１４２７１、ＷＯ０３／０００１８０、ＷＯ０３／０００１８１、ＷＯ０３／０００２５０、ＷＯ０３／００２５３０、ＷＯ０３／００２５３１、ＷＯ０３／００２５５３、ＷＯ０３／００２５９３、ＷＯ０３／００４４９８、ＷＯ０３／００４４９６、ＷＯ０３／００５７６６、ＷＯ０３／０１７９３６、ＷＯ０３／０２４９４２、ＷＯ０３／０２４９６５、ＷＯ０３／０３３５２４、ＷＯ０３／０５５８８１、ＷＯ０３／０５７１４４、ＷＯ０３／０３７３２７、ＷＯ０４／０４１７９５、ＷＯ０４／０７１４５４、ＷＯ０４／０２１４８７０、ＷＯ０４／０４１２７３、ＷＯ０４／０４１８２０、ＷＯ０４／０５０６５８、ＷＯ０４／０４６１０６、ＷＯ０４／０６７５０９、ＷＯ０４／０４８５３２、ＷＯ０４／０９９１８５、ＷＯ０４／１０８７３０、ＷＯ０５／００９９５６、ＷＯ０４／０９８０６、ＷＯ０５／０２３７６２、ＵＳ２００５／０４３２９２、及び欧州特許ＥＰ１２５８４７６；に開示されている化合物；（４０）リパーゼ阻害薬、例えば、テトラヒドロリプスタチン（ｏｒｌｉｓｔａｔ／ＸＥＮＩＣＡＬ）、ＡＴＬ９６２（Ａｌｉｚｙｍｅ／Ｔａｋｅｄａ）、ＧＴ３８９２５５（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｐｅｐｔｉｍｍｕｎｅ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ＷＲ１３３９、ＲＨＣ８０２６７、リプスタチン、テアサポニン、及びジエチルウンベリフェリルホスファート、ＦＬ−３８６、ＷＡＹ−１２１８９８、Ｂａｙ−Ｎ−３１７６、バリラクトン、エステラシン、エベラクトンＡ、エベラクトンＢ、及びＲＨＣ８０２６７、並びに国際特許出願ＷＯ０１／７７０９４、ＷＯ０４／１１１００４、及び米国特許Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．４，５９８，０８９、４，４５２，８１３、５，５１２，５６５、５，３９１，５７１、５，６０２，１５１、４，４０５，６４４、４，１８９，４３８、及び４，２４２，４５３に開示されているもの等；（４１）脂肪酸輸送体阻害薬；（４２）ジカルボキシラート輸送体阻害薬；（４３）グルコース輸送体阻害薬；及び（４４）ホスファート輸送体阻害薬；（４５）食欲抑制の二環式化合物、例えば、１４２６（Ａｖｅｎｔｉｓ）及び１９５４（Ａｖｅｎｔｉｓ）、並びに国際特許出願ＷＯ００／１８７４９、ＷＯ０１／３２６３８、ＷＯ０１／６２７４６、ＷＯ０１／６２７４７及びＷＯ０３／０１５７６９に開示されている化合物；（４６）ペプチドＹＹ及びＰＹＹアゴニスト、例えば、ＰＹＹ３３６（Ｎａｓｔｅｃｈ／Ｍｅｒｃｋ）、ＡＣ１６２３５２（ＩＣ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ／Ｃｕｒｉｓ／Ａｍｙｌｉｎ）、ＴＭ３０３３５／ＴＭ３０３３８（７ＴＭ Ｐｈａｒｍａ）、ＰＹＹ３３６（Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｔｅｈｃｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ペプチドＹＹ３−３６、国際特許出願ＷＯ０３／０２６５９１、０４／０８９２７９に開示されているもの等；（４７）脂質代謝モジュレーター、例えば、マスリン酸、エリトロジオール、ウルソル酸ウバオール、ベツリン酸、ベツリン等、及び国際特許出願ＷＯ０３／０１１２６７に開示されている化合物；（４８）転写因子モジュレーター、例えば、国際特許出願ＷＯ０３／０２６５７６に開示されているもの；（４９）Ｍｃ５ｒ（メラノコルチン５受容体）モジュレーター、例えば、国際特許出願ＷＯ９７／１９９５２、ＷＯ００／１５８２６、ＷＯ００／１５７９０、ＵＳ２００３００９２０４１に開示されているもの等；（５０）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；（５１）Ｍｃ１ｒ（メラノコルチン１受容体モジュレーター、例えば、ＬＫ−１８４（Ｐｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）等；（５２）５ＨＴ６アンタゴニスト、例えば、ＢＶＴ７４３１６（ＢｉｏＶｉｔｒｕｍ）、ＢＶＴ５１８２ｃ（ＢｉｏＶｉｔｒｕｍ）、Ｅ−６７９５（Ｅｓｔｅｖｅ）、Ｅ−６８１４（Ｅｓｔｅｖｅ）、ＳＢ３９９８８５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、ＳＢ２７１０４６（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、ＲＯ−０４６７９０（Ｒｏｃｈｅ）等；（５３）脂肪酸輸送タンパク質４（ＦＡＴＰ４）；（５４）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害薬、例えば、ＣＰ６４０１８６、ＣＰ６１０４３１、ＣＰ６４０１８８（Ｐｆｉｚｅｒ）；（５５）Ｃ末端成長ホルモンフラグメント、例えば、ＡＯＤ９６０４（Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖ／Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）等；（５６）オキシントモジュリン；（５７）神経ペプチドＦＦ受容体アンタゴニスト、例えば、国際特許出願ＷＯ０４／０８３２１８に開示されているもの等；（５８）アミリンアゴニスト、例えば、シムリン（Ｓｙｍｌｉｎ）／プラムリンチド／ＡＣ１３７（Ａｍｙｌｉｎ）；（５９）フーディア（Ｈｏｏｄｉａ）及びトリコカウロン抽出物；（６０）ＢＶＴ７４７１３及び他の腸脂質食欲抑制物質；（６１）ドーパミンアゴニスト、例えば、ブプロピオン（ＷＥＬＬＢＵＴＲＩＮ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）；（６２）ゾニサミド（ＺＯＮＥＧＲＡＮ／Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ／Ｅｌａｎ）等；及び
（ｅ）本発明の化合物との併用に適した食欲抑制剤には、非限定的に、アミノレックス、アンフェクロラール、アンフェタミン、ベンズフェタミン、クロルフェンテルミン、クロベンゾレックス、クロホレックス、クロミノレックス、クロルテルミン、シクレキセドリン、デクスフェンフルラミン、デキストロアンフェタミン、ジエチルプロピオン、ジフェメトキシジン、Ｎ−エチルアンフェタミン、フェンブトラザート、フェンフルラミン、フェニソレックス、フェンプロポレックス、フルドレックス、フルミノレックス、フルフリルメチルアンフェタミン、レバンフェタミン、レボファセトペラン、マジンドール、メフェノレックス、メタンフェプラモン、メタンフェタミン、ノルプソイドエフェドリン、ペントレックス、フェンジメトラジン、フェンメトラジン、フェンテルミン、フェニルプロパノールアミン、ピシロレックス及びシブトラミン；並びに薬学的に許容可能なそれらの塩が含まれる。特に適したクラスの食欲抑制剤は、ハロゲン化アンフェタミン誘導体であり、これには、クロルフェンテルミン、クロホレックス、クロルテルミン、デクスフェンフルラミン、フェンフルラミン、ピシロレックス及びシブトラミン；並びに、薬学的に許容可能なそれらの塩が含まれる。本発明の化合物と併用される特定のハロゲン化アンフェタミン誘導体には、フェンフルラミン及びデクスフェンフルラミン、及びその薬学的に許容可能なそれらの塩が含まれる；
（ｆ）ＣＢ１（カンナビノイド−１受容体）アンタゴニスト／インバースアゴニスト、例えば、リモナバン（Ａｃｏｍｐｌｉａ；Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＲ−１４７７７８（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＲ−１４１７１６（Ｓａｎｏｆｉ）、ＢＡＹ６５−２５２０（Ｂａｙｅｒ）、及びＳＬＶ３１９（Ｓｏｌｖａｙ）、及び特許公報米国特許４，９７３，５８７、５，０１３，８３７、５，０８１，１２２、５，１１２，８２０、５，２９２，７３６、５，５３２，２３７、５，６２４，９４１、６，０２８，０８４、６，５０９，３６７、６，５０９，３６７、国際特許出願ＷＯ９６／３３１５９、ＷＯ９７／２９０７９、ＷＯ９８／３１２２７、ＷＯ９８／３３７６５、ＷＯ９８／３７０６１、ＷＯ９８／４１５１９、ＷＯ９８／４３６３５、ＷＯ９８／４３６３６、ＷＯ９９／０２４９９、ＷＯ００／１０９６７、ＷＯ００／１０９６８、ＷＯ０１／０９１２０、ＷＯ０１／５８８６９、ＷＯ０１／６４６３２、ＷＯ０１／６４６３３、ＷＯ０１／６４６３４、ＷＯ０１／７０７００、ＷＯ０１／９６３３０、ＷＯ０２／０７６９４９、ＷＯ０３／００６００７、ＷＯ０３／００７８８７、ＷＯ０３／０２０２１７、ＷＯ０３／０２６６４７、ＷＯ０３／０２６６４８、ＷＯ０３／０２７０６９、ＷＯ０３／０２７０７６、ＷＯ０３／０２７１１４、ＷＯ０３／０３７３３２、ＷＯ０３／０４０１０７、ＷＯ０３／０８６９４０、ＷＯ０３／０８４９４３及び欧州特許ＥＰ６５８５４６に開示されているもの；
（ｇ）ＣＢ１受容体アンタゴニスト、例えば、１，５−ジアリールピラゾール類似体、例えば、リモナバン（ＳＲ１４１７１６、Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標）、Ｂｅｔｈｉｎ（登録商標）、Ｍｏｎａｓｌｉｍ（登録商標）、Ｒｅｍｏｎａｂｅｎｔ（登録商標）、Ｒｉｏｂａｎｔ（登録商標）、Ｓｌｉｍｏｎａ（登録商標）、Ｒｉｍｏｓｌｉｍ（登録商標）、Ｚｉｍｕｌｔｉ（登録商標）及びＲｉｏｍｏｎｔ（登録商標））、スリナバン（ＳＲ１４７７７８）及びＡＭ２５１；３，４−ジアリールピラゾリン、例えば、ＳＬＶ−３１９（イビピナバン）；４，５−ジアリールイミダゾール；１，５−ジアリールピロール−３−カルボキサミド、ジアリール−ピラゾールの二環式誘導体及びイミダゾール、例えば、ＣＰ−９４５，５９８（オテナバン）；メチルスルホンアミドアゼチジン誘導体；ＴＭ３８８３７；ベータ−ラクタムカンナビノイドモジュレーター；ベンゾフラン誘導体。ＣＢ１受容体アンタゴニストは、１，５−ジアリールピラゾール類似体、例えば、リモナバン（ＳＲ１４１７１６、Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標）、Ｂｅｔｈｉｎ（登録商標）、Ｍｏｎａｓｌｉｍ（登録商標）、Ｒｅｍｏｎａｂｅｎｔ（登録商標）、Ｒｉｏｂａｎｔ（登録商標）、Ｓｌｉｍｏｎａ（登録商標）、Ｒｉｍｏｓｌｉｍ（登録商標）、Ｚｉｍｕｌｔｉ（登録商標）及びＲｉｏｍｏｎｔ（登録商標））、スリナバン（ＳＲ１４７７７８）及びＡＭ２５１；３，４−ジアリールピラゾリン、例えば、ＳＬＶ−３１９（イビピナバン）；４，５−ジアリールイミダゾール；１，５−ジアリールピロール−３−カルボキサミド、ジアリール−ピラゾールの二環式誘導体及びイミダゾール、例えば、ＣＰ−９４５，５９８（オテナバン）；メチルスルホンアミドアゼチジン誘導体；ＴＭ３８８３７；ベータ−ラクタムカンナビノイドモジュレーター；及びベンゾフラン誘導体を含むことができ、又は除外することができる。
医薬組成物
病的状態の治療及び／又は予防に有用な化合物であって、グルカゴン／ａＰ２複合体がＧＣＧＲを作動させるのを阻害する化合物、例えば、小さい分子、リガンド、抗体、抗原結合剤、又は抗体結合フラグメントを薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体の１つ以上と組み合わせて、該化合物を含む医薬組成物として、有効量で投与することができる。通常、該組成物は、通常は薬学的に許容可能な担体を含む滅菌した医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を更に含むことができる。
ＧＣＧＲのグルカゴン／αＰ２複合体作動を破壊する化合物は、医薬組成物中で唯一の活性成分であってもよく、又は他の成分を含む他の活性成分を伴ってもよい。
該医薬組成物は、治療的有効量の、ＧＣＧＲのグルカゴン／αＰ複合体作動を妨害する化合物を適切に含む。本明細書中で使用する場合、「治療的有効量」という用語は、標的の疾患又は症状を治療、改善又は予防する、又はＧＣＧＲによって媒介される検出可能な治療効果又は予防効果を示すような方法で、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２複合体作動を阻害するのに必要な治療薬剤の量を指す。任意の適切な化合物に対する治療的有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかで最初に見積もることができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次に、このような情報を使用して、ヒトでの有用な用量及び投与経路を決定することができる。
従って、本開示は、本明細書に記載の用途のいずれかのための、有効量の化合物又は薬学的に許容可能な塩を、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、唯一の活性薬剤として化合物又は塩を含有することができ、又は別の実施形態では、該化合物及び少なくとも１種の追加的な活性薬剤を含有することができる。
投与される用量は、勿論、既知の要因、例えば、特定の薬剤の薬力学的特徴、その投与の様式及び経路；レシピエントの年齢、健康状態、及び体重；症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果に応じて変わる。特定の実施形態では、医薬組成物は、単位剤形中に、約０．１ｍｇから約２０００ｍｇ、約１０ｍｇから約１０００ｍｇ、約１００ｍｇから約８００ｍｇ、又は約２００ｍｇから約６００ｍｇの活性化合物、及び任意選択的に、約０．１ｍｇから約２０００ｍｇ、約１０ｍｇから約１０００ｍｇ、約１００ｍｇから約８００ｍｇ、又は約２００ｍｇから約６００ｍｇの追加的な活性薬剤を含有する剤形である。例としては、少なくとも０．１、１、５、１０、２５、５０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、又は７５０ｍｇの活性化合物又はその塩を含む剤形である。非限定的な例として、ヒト又は動物におけるＧＣＧＲ媒介性病状の治療は、本発明の抗グルカゴン／αＰ２モノクローナル抗体を１日の投与量としては０．１から１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日当り、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｋｇで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日に少なくとも１回、或いは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０週に少なくとも１回で、或いはこれらの任意の組み合わせで、単一回にて又は２４、１２、８、６、４、若しくは２時間毎に分割して投与して、或いはこれらの組み合わせで提供することができる。
医薬組成物はまた、あるモル比で該活性化合物と追加的な活性薬剤とを含むことができる。例えば、医薬組成物は、約０．５：１、約１：１、約２：１、約３：１又は約１．５：１から約４：１のモル比の抗炎症剤又は免疫抑制剤を含有することができる。本明細書に開示した化合物は、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入又はスプレーにより、舌下的に、眼のインプラントを含むインプラントを介して、経皮的に、口腔内投与によって、直腸的に、点眼剤として、眼内注射を含む注射、静脈内、大動脈内、頭蓋内、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、腹腔内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経鼻、舌下、若しくは直腸により、又は他の手段によって、従来の薬学的に許容可能な担体を含有する投薬単位製剤で投与することができる。
医薬組成物は、任意の薬学的に有用な形態として、例えば、エアロゾル、クリーム、ゲル、ピル、注射又は注入溶液、カプセル、錠剤、シロップ、経皮パッチ、皮下パッチ、乾燥粉末、吸入形態として、医薬デバイスにて、坐剤、頬又は舌下の製剤、非経口製剤、又は点眼剤として処方することができる。錠剤及びカプセル等の幾つかの剤形は、適切な量の活性成分、例えば、所望の目的を達成するのに有効な量を含有する適切なサイズの単位用量に細分される。
担体には、賦形剤及び希釈剤が含まれ、また、担体は、治療される患者への投与に適したものにするために、純度は十分に高く、かつ毒性は十分に低くなければならない。担体は不活性であってもよいし、それ自体が薬学的有益性を有していてもよい。化合物と組み合わせて使用される担体の量は、化合物の単位用量当たり、投与に実用的な量の物質を提供することで十分である。
担体の種類には、非制限的に、結合剤、緩衝剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、香料、流動化剤、滑沢剤、防腐剤、安定剤、界面活性剤、打錠剤、及び湿潤剤が含まれる。幾つかの担体は、複数の種類に列挙されていてもよく、例えば、植物油は、幾つかの製剤では潤滑油として、また、他の製剤では希釈剤として使用することができる。典型的な薬学的に許容可能な担体には、糖、デンプン、セルロース、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、及び植物油が含まれる。本発明の化合物の活性を実質的に妨害しない、任意選択的な活性薬剤を、医薬組成物に含ませることができる。
医薬組成物／配合物（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は、経口投与のために製剤化することができる。これらの組成物は、所望の結果を達成する任意の量の活性化合物、例えば、０．１から９９重量％（ｗｔ％）の化合物、通常は少なくとも約５重量％の化合物を含有することができる。幾つかの実施形態では、約２５重量％から約５０重量％又は約５重量％から約７５重量％の化合物を含有する。
直腸投与に適した製剤は、典型的には、単位用量坐剤として提示される。これらは、活性化合物を１つ以上の従来の固体担体、例えば、カカオバターと混合し、次に、得られた混合物を成形することによって調製することができる。
皮膚への局所的な塗布に適した製剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又は油の形態を採る。使用することができる担体には、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮エンハンサー、及びそれらの２つ以上の組み合わせが含まれる。
経皮投与に適した製剤は、長期間に亘りレシピエントの表皮と密接に接触したままになるように適合された別個のパッチとして提示することができる。経皮投与に適した製剤はまた、イオントフォレシス（参照：例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３（６）：３１８（１９８６年））によって送達することもでき、典型的には、活性化合物の任意選択的な緩衝水溶液の形態を採る。一実施形態では、マイクロニードルパッチ又はデバイスが、生物学的組織、特に皮膚を横切って又はその中に薬物を送達するために提供される。マイクロニードルパッチ又はデバイスは、臨床的に関連する速度で、皮膚又は他の組織障壁を横切って又はその中に、組織への損傷、痛み又は刺激を最小限にするか又は全く有さずに、薬物送達を可能にする。
肺への投与に適した製剤は、広範囲の受動呼吸駆動及び能動駆動の単一／複数の用量の乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）によって送達することができる。呼吸用送達に最も一般的に使用されるデバイスには、ネブライザー、定量吸入器、及び乾燥粉末吸入器が含まれる。ジェットネブライザー、超音波ネブライザー、及び振動メッシュネブライザーを含む幾つかの種類のネブライザーを利用可能である。適切な肺送達デバイスの選択は、薬物の性質及びその製剤、作用部位、及び肺の病態生理等のパラメータ、１用量当り、所定量の本発明の活性薬剤を含有する投与（ｏｓｅ）形態に依存する。
有利には、インビボでのＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動のレベルを、本開示に従ってＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を妨害する化合物の逐次投与量での投与によって、適切に低減させたレベルに維持することができる。
組成物は、患者に個別に投与することができ、又は他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次的に、又は別々に）投与することができる。
一実施形態では、化合物は連続的に投与され、例えば、化合物は、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、又は第４，５９６，５５６号に開示されたデバイス等の、無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用なインプラント及びモジュールの例には、制御された速度で薬剤を分注するための埋込み可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して医薬を投与するための治療用デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な輸注速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流量埋込み可能な注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬物（ｏｓｍｏｔｉｃ ｄｒｕｇ）送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。多くの他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールが知られている。
慢性高血糖症に至るグルカゴン活性の調節不全及び血中グルコースレベルの上昇は、糖尿病等の多くの代謝性疾患の病理に関与している。
実施例１：循環ａＰ２は、グルカゴンと直接的に相互作用し、グルカゴンの生物学的活性に必要である
材料
全てのＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド合成は、ＩＤＴ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって行った。Ｌ−１６９，０４７（Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ＩＩ）は、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。他の全ての試薬及び化学薬品は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、特記のない限り、受け取ったままで使用した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）測定
ビオチン−グルカゴンに対するａＰ２の結合親和性を、ＢＬＩｔｚ Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙシステム（ＢＬＩ、Ｆｏｒｔeｂｉｏ Ｉｎｃ．）によって２５℃で測定した。バイオレイヤー干渉法は、溶液中のリガンドが、バイオセンサプローブ上に固定化された標的に結合し、見掛けのＫｄが得られる際の、光の干渉パターンの変化を測定する。簡単に説明すると、ストレプトアビジンＢＬＩＴｚ Ｄｉｐ及びＲｅａｄＴＭ−キネティックバイオセンサープローブ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．）に、ＰＢＳ緩衝液中、２０μｇ／ｍＬのビオチン化グルカゴンを入れ、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ中で３０秒間ベースラインの読み取りを行った。ａＰ２についての会合段階の読み取りを、ＰＢＳ中３．４μＭ及び３４μＭの濃度で２００秒間行い、続いて同じ緩衝液中で３００秒間、解離段階で行った。解離定数を、応答のグローバルカーブフィッティングによって得て、ｋｏｎ値及びｋｏｆｆ値を得て、次にそれを使用して、Ｋｄａｐｐを計算した。擬似負荷プローブと相互作用するａＰ２のバックグラウンド結合（見かけの親和性）は、アルブミン負荷プローブへの結合の２％未満であり、全結合からバックグラウンドの結合を差し引いた。
シンチレーション近接アッセイ
ａＰ２を、Ｐｉｅｒｃｅアミン反応性ビオチン化キットを使用してビオチン化した。１２５Ｉ標識グルカゴン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、ストレプトアビジン被覆フラッシュプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にて、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ オレイン酸、５％グリセロールＰＢＳ緩衝液中で１時間インキュベートした後、ＢｅｔａＬｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
プラスミド及びウイルス構築物
ヒトグルカゴン受容体−ＧＦＰ構築物を、Ｏｒｉｇｅｎｅから購入した。ｃＡＭＰ応答エレメントルシフェラーゼ構築物は、ｎａｎｏ−Ｌｕｃの最小基礎（ｍｉｎｉｍａｌ ｂａｓａｌ）レポーターの近接部位でクローン化されたｃＡＭＰ応答エレメントの４つのタンデムリピートの増幅によってクローン化した。初代肝細胞のｃＡＭＰ−ＬＵＣアデノウイルスは、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＧＣＧＲ細胞外ドメインを、ｐＦａｓｔＢａｃシャトルベクター内にクローニングした。クローニングの間に、ヘキサヒスチジン（ｈｅｘａｈｉｓｔａｄｉｎｅ）とＷＥＬＱプロテアーゼ部位をタンパク質精製のために添加した。ネズミａＰ２遺伝子を、精製を容易にするために、ヘキサヒスチジン（ｈｅｘａｈｉｓｔａｄｉｎｅ）タグ及びＴＥＶプロテアーゼ部位の後にてｐｅｔ２１＋ベクター内にクローニングした。
ＲＮＡ抽出及び定量的ＰＣＲ
ＲＮＡを、製造者の指示書を使用して、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出し、定量的ＰＣＲを、以前に公表されたプライマー配列（Ｃａｏら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１３年５月７日；１７（５）：７６８−７７８）を使用して行なった。
動物と細胞
動物は、動物保護のための連邦、州、地方、及びＮＩＨのガイドラインに基づき、ＵＳＤＡが検査したハーバード動物施設（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）にて世話をした。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（１０から１２週）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ＨｅｐＧ２−Ｃ３Ａ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。細胞を完全培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏ））及びＭＥＭピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）中で培養した。初代肝細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離し、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウム及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で培養した。ＣＨＯ／Ｋ１細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２及び５％Ｃｏｓｍｉｃ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。全ての培地サプリメントは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからであった。
細胞トランスフェクション、安定的な細胞株の生成とウイルス感染
プラスミドを、製造業者の指示書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、トランスフェクトした。一過的にトランスフェクトした細胞を、安定的な細胞株の生成のために適用可能な適切な選択抗生物質中で増殖させた。選択培地で３継代後、単一細胞コロニーを採取し、検証後実験のために増加させた。
統計分析
全てのプロットは、平均値を示し、エラーバーは、折れ線グラフのＳＥＭを表し、棒グラフのＳＤを表す。２つの群の平均値の比較は、別段の指示がない限り、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して行った。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのポストテストを使用して、＞２群を比較した。単一の動物から複数の測定値を得て、標準的な反復測定試験を行なった。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１、ｎｓ．別段の指示がない限り、「有意ではない」。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ６．０（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して行った。
ａＰ２は、グルカゴン作用の糖新生プログラミングを相乗的に活性化する
主に、グルカゴン、エピネフリン、コルチゾール、及び成長ホルモンのような低血糖の拮抗ホルモンは、相乗的に作用し、分泌のための共通のベータ−アドレナリン刺激を共有することが十分に確立されている（Ｂｏｌｌｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．１９８２年７月；３１（７）：６４１−６４７）。ベータ−アドレナリン活性化後の脂肪分解シグナルがこの相乗的活性に寄与する（Ｓｏｕｚａら、Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ １９９４年１２月；２７（１２）：２８８３−２８８７）が、脂質の注入の場合はそのようにはならない（Ｈａｙｗｏｏｄら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００９年７月；２９７（１）：Ｅ５０−５６；及びＡｎｔｏｎｉａｄｅｓら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ、１９６７年３月；２８９（７４９０）：６０２−６０４）ことが指摘されており、従って、脂肪組織由来因子は、これらの影響を緩和する可能性を示唆している。循環ａＰ２レベルは、ベータ−アドレナリンシグナル伝達によって調節され（Ｃａｏら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１３年５月７日；１７（５）：７６８−７７８）、肝臓グルコース産生に関与する（Ｃａｏら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１３年５月７日；１７（５）：７６８−７７８）ので、ａＰ２がグルカゴンと相乗的に作用して、肝臓グルコース産生を活性化するという仮説を試験した。
この仮説を直接的に試験するために、単離した初代肝細胞における主要なインスリン拮抗ホルモンであるグルカゴンの効果、及びａＰ２とグルカゴンの併用効果を最初に調べた（図１Ａ及び１Ｂ）。この設定では、グルカゴンにａＰ２を添加すると、グルカゴン単独の場合を超えて、糖新生遺伝子の発現が更に増加した。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、このことは、糖新生成プログラミングにおいてａＰ２が相乗的役割を果たすことを支持している。この糖新生遺伝子発現はまた、初代肝細胞における肝臓グルコース産生（図１Ｃ）及び肝臓癌細胞株におけるグリコーゲン分解（図１Ｄ）が、グルカゴンと相乗作用するａＰ２によって増加する機能アッセイとも一致している。このプロセスに関与する下流シグナル伝達事象を更に調べ、グルカゴン作用に対するａＰ２の効果を研究するために、ｃＡＭＰレポーター系を発現するヒトグルカゴン受容体をＣＨＯ−Ｋ１細胞に構築した。図１Ｅから分かるように、ａＰ２の添加により、グルカゴンの効果が１より大きいオーダーで増加する（Ｌｏｇ１０ＥＣ５０グルカゴン −８．２１５±０．１５５６；グルカゴン＋ａＰ２ −９．６９８±０．１４４８ Ｍ±Ｓ．Ｅ．Ｍ）。この観察はまた、ｃＡＭＰ活性を、アデノウイルス媒介ｃＡＭＰレポータールシフェラーゼを使用してアッセイする場合の初代肝細胞における結果とも一致する（図１Ｆ）。
ａＰ２は、グルカゴン受容体のアロステリックエンハンサーである。
ａＰ２の能力によって、グルカゴンのシグナル伝達及び代謝作用が増強されることを得て、ａＰ２がグルカゴン受容体の活性化において上流での役割を有するか否かを決定するための更なる研究を行った。Ｇ６Ｐｃプロモーター駆動レポーターアッセイを利用した。図２Ａに示すように、Ｇ６Ｐｃプロモーター活性に対するａＰ２及びグルカゴンの相乗作用は、レポータープラスミドがグルカゴン受容体と同時にトランスフェクトされた場合にのみ存在する。ａＰ２が、グルカゴンに対するアロステリックエンハンサーとして、その受容体上で作用することができるかどうかを、バキュロウイルス発現系を使用して試験した。ＧＣＧＲの細胞外ドメインを発現させ（ＧＣＧＲ−ｅｃｄ）（Ｗｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２０１３年６月；８９（２）：２３２−２４０）、ＧＣＧＲ−ｅｃｄに対するグルカゴン結合キネティクスにおけるａＰ２の効果を、ＢＬＩＴＺバイオレイヤー干渉法システムを使用して調べた。ａＰ２の添加により、ＧＣＧＲ−ｅｃｄへのグルカゴンの会合速度を有意に増加させ、かつ解離速度を有意に低下させ（図２Ｂ）、これにより、解離定数が１のオーダー低下した（Ｋｄａｐｐグルカゴン１．７６ｅ−００７Ｍ；Ｋｄａｐｐグルカゴン＋ａＰ２ ５．４１ｅ−００８Ｍ）。これらの結果は、インビトロでｃＡＭＰ活性について観察された効果と一致する。いずれの理論にも拘束されることは望まないが、このことから、ａＰ２の存在下でグルカゴン作用の活性が増加するという直接的な証拠が得られる（図１Ｅ）。グルカゴン作用のアロステリックモジュレーターとしてのａＰ２の役割を更に理解するために、グルカゴン受容体のアロステリック阻害薬Ｌ−１６８，０４９（Ｃａｓｃｉｅｒｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９年３月２６日；２７４（１３）：８６９４−８６９７）を、ａＰ２の作用を阻害するそれの能力について評価した。Ｌ−１６８，０４９の添加により、グルカゴン受容体上でのグルカゴンの作用に対するａＰ２の相乗効果が軽減した（図２Ｃ及び２Ｄ）。Ｌ−１６８，０４９の添加はまた、ａＰ２及びグルカゴンへの応答能力も失わせた。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、このことは、ａＰ２がグルカゴン受容体のアロステリック部位に結合している可能性があることを示唆する（図２Ｅ及び２Ｆ）。
ａＰ２はグルカゴンと直接的に相互作用する
ａＰ２がグルカゴン作用を増加させるメカニズムを理解するために、ａＰ２及びグルカゴンの物理的相互作用の可能性を調べた。一連の結合アッセイを利用した。先ず、バイオレイヤー干渉法を使用して、ビオチン化グルカゴンとａＰ２の直接的な相互作用を実証した（図３Ａ）。次に、１２５Ｉ−グルカゴンがビオチン化ａＰ２と相互作用する、シンチレーション近接アッセイを使用した（図３Ｂ）。これらの相補的なタグ付きタンパク質を使用して、同様の親和性を得た（それぞれ、Ｋｄａｐｐ２．３４μＭ及び２．６２μＭ）。タグがない系でこのタンパク質−ペプチド相互作用を更に調べるために、等温滴定型熱量測定法を、溶液中の結合事象から遊離した熱を測定するゴールドスタンダード結合アッセイとして利用した。このアプローチにより、グルカゴン／ａＰ２の直接結合が明らかになった（図３Ｃ）。これらの測定値はまた、前記した結合研究とも一致している。この相互作用の生理学的関連性に取り組むために、内因性複合体を循環からプルダウンすることを最初に試みた。抗ａＰ２抗体被覆磁性ビーズとのインキュベーション後、ＨＲＰ標識抗グルカゴン抗体を使用して、グルカゴンシグナルを、野生型マウスの血清中で検出した（図３Ｄ、３Ｅ、及び３Ｆ）。ａＰ２の非存在下（ａＰ２−／−血清又は抗体欠失野生型血清）では、最少量のグルカゴンシグナルが存在した（非特異的結合シグナルと区別できない）。ａＰ２−／−血清に組換えａＰ２を添加することにより、抗ａＰ２抗体によってリカバーされるグルカゴンシグナルは顕著に高められたが、統計学的有意性には達しなかった。これらの結果は、野生型及びａＰ２−／−血清中のグルカゴンの各レベル（それぞれ１８９±２０、２１０±４１ｐｇ／ｍＬ）とは無関係であった。更に、ビオチン化グルカゴンを、野生型及びａＰ２−／−血清から内因性ａＰ２をプルダウンするための餌として使用した（図３Ｍ）。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、また共に考慮して、これらの結果は、グルカゴンに結合するａＰ２の能力が生理学的関連性を有し、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体が自然に生じることを示している。熱泳動を使用して生体分子の相互作用分析を可能にするマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）により、追加的なインビボでのアダプタータンパク質の欠如が確認された。分子間の結合に起因する分子の性質（例えば、分子の大きさ、電荷、及び溶媒和エントロピー）の変化は、分子の熱泳動を変化させる。ＭＳＴにより、分子を表面に固定化することなく、溶液中で直接的に相互作用を測定することによって、分子の熱泳動運動に基づいた分子間の結合親和性を測定することができる。ＭＳＴを使用して、グルカゴンへのａＰ２結合（約２１４ｎＭのＫｄ）、グルカゴン受容体へのグルカゴン結合（約３６．７ｎＭのＫｄ）、及びグルカゴン受容体へのａＰ２結合（約１５．４から約１２０ｎＭのＫｄ）が分かった（図５Ａ−ＥＤ）。
相互作用の可能性のある残基の出発点を得るために、バイオインフォマティクスツールを使用して、点突然変異の設計を助けた。完全に不偏な予測をするために、幾つかの予測アルゴリズムを採用して（Ｐｉｅｒｃｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１４年３月１２日；Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００７年８月１日；６８（２）：５０３−５１５；Ｃｏｍｅａｕら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００４年１月１日、２０日（１）：４５−５０頁、及びＪｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｒｃｉａら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１３年７月１日；、２９（１３）：１６９８−１６９９頁）、可能性のある予測パターンの全てを得た。更に、ａＰ２の複数の結晶学的構造が報告されているので（ＬａＬｏｎｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９４年４月２６日；３３（１６）：４８８５−４８９５）、ａＰ２及びグルカゴンの複数の化学量論比の可能性もまた調査に含まれた。タンパク質−タンパク質ドッキングのためのアルゴリズムが異なると、三次構造を予測する効率が異なるので（Ｊａｎｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ。２００３年７月１日；５２（１）：２−９）、既知の結合パートナーを有するグルカゴンとａＰ２の既知の構造を検証した。予測に使用した３つのサーバー全てが、ＲＭＳＤが９９．７％以上の信頼性でグルカゴンへのａＰ２の結合を予測したことが分かり、サーバーによる予測から、実測した相互作用に可能な限り近い結果が得られることが示唆された。３つのサーバー間で生成された約１４，０００の予測と２つの可能な相互作用比について、ＣＯＮＳ−ＣＯＣＯＭＡＰＳ（Ｖａｎｇｏｎｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１１年８月２７日；ｂｔｒ４８４）サーバーを使用して、可能性のある相互作用部位の分布頻度をマッピングした（図６Ｃ）。第１のαヘリックス及びＰｈｅ５７部位は、相互作用の可能性な部位として同定した。相互作用の可能性のある部位を更に解明するために、３点突然変異を有する三重突然変異体ａＰ２（Ｎ５９、Ｅ６１、及びＫ７９）を作製した。結合曲線を、ヒトａＰ２、グルカゴンを有する突然変異体ａＰ２及び抗ａＰ２抗体を使用して得た。この突然変異タンパク質は、オクテット系で測定した場合、結合親和性がより低いことが示された（図３Ｇから３Ｊ）。更に、グルカゴンタンパク質をトランケートして、野生型及びａＰ２−／−マウスの両方でａＰ２への結合を試験した。これらの実験から、グルカゴンの残基２２から２９がａＰ２との結合に重要であることが示された（図３Ｌ）。
ＧＣＧＲにグルカゴンが結合する際のａＰ２の役割を解明するために、野生型及びＧＣＧＲ欠失（ＧＣＧＲｆｌ／ｆｌ−Ａｌｂ Ｃｒｅ）マウス肝臓由来の濃縮された原形質膜画分を、分画遠心分離によって単離した。原形質膜を、一定の濃度（２０ｎＭ）のビオチン化グルカゴン及び増加する量のａＰ２と共にインキュベートした。次に、原形質膜及び＋／−ａＰ２及びグルカゴンを、コムギ胚芽凝集素被覆プレート中でインキュベートし、広範に洗浄して未結合タンパク質を除去した。ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを使用して、グルカゴンを検出した（図４Ａ）。ＧＣＧＲ受容体にグルカゴンが結合するにはインビボでａＰ２が必要であることを示すために、１２５Ｉ標識グルカゴンを、野生型、ａＰ２−／−（組換えａＰ２あり及びなし）及びＧＣＧＲｆｌ／ｆｌ−Ａｌｂ Ｃｒｅマウスの門脈を介して投与した。動物を安楽死させ、投与の５分後に冷たいＰＢＳで５分間経心腔的に灌流した。該器官を灌流の終わりに摘出し、ダイジェストし、放射能を液体シンチレーションカウンターで計数した（図４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、及び４Ｅ）。図４Ｆに示すように、ａＰ２はグルカゴンへのＧＣＧＲ．ｅｃｄ結合を増加させる。プルダウン実験もまた完了した。ａＰ２を、ＧＣＧＲをベイトとして使用してプルダウンした。野生型マウス由来の肝臓を溶解緩衝液中でホモジェネートし、組換えａＰ２（１０μｇ）、グルカゴン（１μｇ）、及び磁気ビーズに結合したＧＣＧＲ抗体と共に一晩インキュベートした。遠心分離後、ペレット及び上清中のａＰ２、グルカゴン及びグルカゴン＋ａＰ２シグナルを測定した（図４Ｇ及び４Ｈ）。次に、ビオチン化グルカゴンをベイトとして使用してＧＣＧＲをプルダウンした。野生型マウス由来の肝臓を溶解緩衝液中でホモジェネートし、組換えａＰ２（１０ｕｇ）、ビオチン−グルカゴン（１ｕｇ）、及びニュートラアビジン結合磁性ビーズと共に一晩インキュベートした。ＧＣＧＲシグナルを測定し、ａＰ２で有意に高いことが示された（図４Ｉ）。
ａＰ２はインビボでのグルカゴン作用に必要である
グルカゴンを、ａＰ２欠失及び野生型マウスに注射し、それらの血糖をグルカゴン作用の尺度として追跡した（Ｇｅｌｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００３年２月４日；１００（３）：１４３８−１４４３）。意外にも、ａＰ２欠失動物は、グルカゴン及びａＰ２単独投与に対して殆ど応答しない、から全く応答しなかったが、ａＰ２ノックアウトマウスへのグルカゴン及び組換えａＰ２の同時の注射は、グルカゴン応答性を回復することができた（図７Ａ、７Ｂ）。図７Ｇ及び７Ｈは、ＰＢＳ、グルカゴン、又はグルカゴン及びａＰ２のいずれかで処置したａＰ２ノックアウト及び野生型マウスのグルコース耐性試験を示す。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、これは、ａＰ２ノックアウトマウスが、ａＰ２の添加を伴うグルカゴン処置に対してのみ応答することを示す。グルカゴンシグナル伝達又はグリコーゲン含量が固有欠失である場合を除いて、ａＰ２−／−マウスの肝臓では、ベースラインの肝臓グリコーゲン含量及びグルカゴン受容体の発現における差は観察されなかった（図７Ｃ、７Ｅ及び７Ｉ）。図７Ｊは、安楽死の際に残っているグリコーゲンを示す。ベースラインの測定値と比較する場合、図７Ｇに見られるグルコース偏位は、グリコーゲン分解によるものである。更に、グルカゴン投与後、循環グルカゴンレベルは、ａＰ２−ＫＯマウス（未発表の結果）におけるグルカゴン作用の欠如に対する説明としての、グルカゴンの急速分解又は生物学的利用能の低下を除いて、ＷＴ及びａＰ２−ＫＯマウスの両方で超生理学的レベルに達した。更に、プライマリーグルカゴンペプチダーゼであるＤＰＰ４の活性（Ｈｉｎｋｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２０００年２月１１日； ２７５（６）：３８２７−３８３４）は、ａＰ２−ＫＯマウスの血清では増加せず、更に急速な分解のシナリオは排除された（図７Ｄ）。更に、膵臓クランプ条件下でのグルカゴンの薬理学的用量を、頸静脈カテーテルを介して基礎のインスリンレベルで注入した（図７Ｆ）。これらの条件下で、野生型動物は、ベースラインで血糖値が上昇したにもかかわらず、非応答性ａＰ２欠失同腹子と比較して、血中グルコースレベルの増加が一定であった。いずれの理論にも拘束されることを望まず、またそれらを考慮して、これらの結果により、ａＰ２欠失マウスで観察されたグルカゴン低応答性に対するもっともらしいメカニズムとして、肝不全が排除される。
最後に、ａＰ２欠失のバックグラウンドでのグルカゴン、ａＰ２、並びにグルカゴン及びａＰ２の逆調節活性を測定するために、高インスリン血症−膵臓クランプ研究を行った（図８Ａ）。この設定では、ビヒクル投与と比較して、グルカゴン又はａＰ２単独での肝臓グルコース産生の有意な増強は見られなかったが、ａＰ２及びグルカゴンを同時に投与すると、インシュリンに対する逆調節応答が完全に回復した。更に、グルカゴンを一定に注入した場合であっても、ａＰ２欠失マウスではグルカゴンに応答してのグルコース産生は起こらず、このことは、ａＰ２がインビボでのグルカゴン作用に必要であることを示している（図８Ｂ）。
実施例２：分泌されたａＰ２／グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を標的とする例証的なモノクローナル抗体の調製。
動物
動物の世話及び実験手順は、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会からの承認を得て実施した。オスのマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するレプチン欠失（ｏｂ／ｏｂ）及び食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウス）は、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、１２時間の明／暗周期で飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するＤＩＯマウスを、処置を開始する前に高脂肪の食餌（６０％ｋｃａｌの脂肪、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｄ１２４９２ｉ）で１２から１５週間飼育したが、クランプ研究では、それらのマウスを２０週間ＨＦＤで飼育した。レプチン欠失（ｏｂ／ｏｂ）マウスを、通常の食餌（ＲＤ、ＰｉｃｏＬａｂ ５０５８ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ）で飼育した。使用した動物は、食餌モデルでは１８から３１週齢で、ｏｂ／ｏｂモデルでは９から１２週齢であった。本文中に特に記載がない限り、全ての実験で、各群に少なくとも７匹のマウスを使用した。マウスを、３から５週の間、１週間に２回の皮下注射によって、１５０μｌのＰＢＳ（ビヒクル）又は１５０μｌのＰＢＳ中の、１匹のマウス当たり１．５ｍｇ（約３３ｍｇ／ｋｇ）の抗ａＰ２モノクローナル抗体で処置した。処置の前後に、６時間の日中の食餌中止の後、血液試料を尾から採取した。給餌状態における体重を毎週測定した。６時間の食餌中止の後又は１６時間の一晩絶食の後、血中グルコースレベルを毎週測定した。２週間の処置の後、グルコース耐性試験を腹腔内グルコース注射（ＤＩＯについて０．７５ｇ／ｋｇ、ｏｂ／ｏｂマウスについて０．５ｇ／ｋｇ）によって実施した。３週間の処置の後、インスリン耐性試験を腹腔内インスリン注射（０．７５ＩＵ／ｋｇ）によってＤＩＯマウスにおいて実施した。５週間の処置の後、高インスリン血症−正常血糖クランプ実験を前記したようにＤＩＯマウスにおいて実施した（Ｆｕｒｕｈａｓｈｉら、（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ４４７，９５９−９６５；Ｍａｅｄａら、（２００５年）Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ１，１０７−１１９）。
代謝ケージ（Ｏｘｙｍａｘ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及び二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ；ＰＩＸＩｍｕｓ）による全身脂肪測定を前記したように実施した。
抗ａＰ２／グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体抗体の産生及び投与
ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＣＡ３３（ウサギＡｂ９０９）を産生し、ＵＣＢによって精製した。ニュージーランド白ウサギを、組換えヒト及びマウスａＰ２（社内において大腸菌内で生成した：それぞれ受託番号ＣＡＧ３３１８４．１及びＣＡＪ１８５９７．１）を含有する混合物で免疫化した。脾細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び骨髄を、免疫化したウサギから採取し、続いて−８０℃にて保存した。免疫化した動物由来のＢ細胞培養物を、Ｚｕｂｌｅｒらによって記載されている方法（“Ｍｕｔａｎｔ ＥＬ−４ｔｈｙｍｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ”，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１３４，３６６２−３６６８（１９８５年））と同様の方法を使用して調製した。７日のインキュベーションの後、抗原特異的抗体含有ウェルを、Ｓｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に固定したビオチン化マウス又はヒトａＰ２及びヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ホモジニアス蛍光結合免疫吸着アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を使用して同定した。目的のウェルからの抗原特異的Ｂ細胞を同定し、単離し、及び回収するために、蛍光焦点法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｆｏｃｉ ｍｅｔｈｏｄ）を使用した（Ｃｌａｒｇｏら、（２０１４年）ｍＡｂｓ６，１４３−１５９）。この方法には、陽性ウェルからのＢ細胞を採取すること、ビオチン化マウス及びヒトａＰ２で被覆した常磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とヤギ抗ウサギＦｃフラグメント特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とを混合することが含まれた。３７℃にて１時間の静的インキュベーションの後、抗原特異的Ｂ細胞を、そのＢ細胞周囲の蛍光ハロ（ｈａｌｏ）の存在により特定することができた。個々の抗原特異的抗体分泌Ｂ細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０顕微鏡を使用して観察し、エッペンドルフマイクロマニピュレーターを用いて採取し、ＰＣＲチューブ内に沈着させた。これらの単一Ｂ細胞由来の可変領域遺伝子を、重及び軽鎖可変領域に特異的であるプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって回収した。３’及び５’末端に制限部位を組み込み、様々な発現ベクター内での可変領域；マウスγ１ ＩｇＧ、マウスＦａｂ、ウサギγ１ ＩｇＧ（ＶＨ）又はマウスカッパ及びウサギカッパ（ＶＬ）のクローニングを可能にするネステッド２°ＰＣＲを用いて、２ラウンドのＰＣＲを実施した。重及び軽鎖構築物を、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ−２９３細胞内にトランスフェクトし、組換え抗体を６ウェルプレート内に発現させた。５日の発現の後、上清を採取し、抗体を、ＢｉａＣｏｒｅシステムを使用して生体分子相互作用分析によって更なるスクリーニングに供して、親和性及びエピトープビニング（ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎ）を決定した。
マウス抗ａＰ２モノクローナル抗体Ｈ３は、Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって産生された。４から６週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６ ａＰ２−／−マウスを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中に懸濁し、等体積の完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で乳化した完全長ヒトａＰ２／ＦＡＢＰ４−Ｇｓｔ組換えタンパク質の注射によって免疫化した。脾臓を、免疫化したマウスから採取し、細胞懸濁液を調製し、ＰＢＳで洗浄した。脾臓細胞をカウントし、重及び軽鎖免疫グロブリンのいずれも分泌できない（Ｋｅａｒｎｅｙら、（１９７９年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１２３、１５４８−１５５０）ＳＰ２／０ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ８−００６、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）と、２：１の脾臓：ミエローマ比にて混合した。細胞を、標準的な手順（Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６、４９５−４９７）に従って、ＨＡＴ選択培地中、１２個の９６ウェル組織培養プレートにてポリエチレングリコール１４５０（ＡＴＣＣ）と融合した。融合後の１０から２１日の間に、ハイブリドーマコロニーが見えるようになり、培養上清を採取し、次に、ｓｔｒｅｐ−Ｈｉｓ−ヒト−ａＰ２／ＦＡＢＰ４でのウェスタンブロットによってスクリーニングした。１７個の選択した陽性ウェルの二次スクリーニングを、５０μｌ／ウェルの、ｓｔｒｅｐ−Ｈｉｓ−ヒト−ａＰ２／ＦＡＢＰ４又は無関係のＧｓｔタンパク質の２μｇ／ｍｌ溶液（０．１μｇ／ウェル）で被覆し、４℃（４ｏＣ）にて一晩インキュベートした高タンパク質結合９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を使用して行った。陽性ハイブリドーマを、限界希釈によってサブクローニングし、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。上清融合物を、Ｉｓｏｓｔｒｉｐキット（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてアイソタイプを判別した（ｉｓｏｔｙｐｅｄ）。
ラージスケール一過性トランスフェクションを、ＵＣＢが所有しているＣＨＯＳＸＥ細胞株及びエレクトロポレーション発現プラットフォームを使用して実施した。細胞を、３７℃にて８％ＣＯ２を補充したシェーカーインキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、スイス）中にて、１４０ｒｐｍにて２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤＣＨＯ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）中で対数増殖期に維持した。トランスフェクションの前に、細胞数及び生存率を、ＣＥＤＥＸ細胞計数器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ ＡＧ．Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、ドイツ）を使用して決定し、２×１０８細胞／ｍｌを１０分間１４００ｒｐｍにて遠心分離した。ペレット化した細胞を、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＭａｘＣｙｔｅ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で洗浄し、更に１０分間再び回転させ（ｒｅｓｐｕｎ）、ペレットを新鮮な緩衝液中で２×１０８細胞／ｍｌにて再懸濁した。次に、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（登録商標）を使用して精製したプラスミドＤＮＡを、４００μｇ／ｍｌにて添加した。ＭＡｘｃｙｔｅ ＳＴＸ（登録商標）フローエレクトロポレーション機器を使用したエレクトロポレーション後、細胞を、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ及び抗生物質である抗有糸分裂（ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ）溶液を含有するＰｒｏＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中でトランスフェクトし、２５ｒｐｍの振動によって波動が誘導される、３７℃にて５％ＣＯ２の、Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒプラットフォームセットに置いたウェーブバッグ（Ｃｅｌｌ Ｂａｇ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で培養した。
トランスフェクションの２４時間後、ボーラス供給物を添加し、温度を３２℃に低下させ、培養期間（１２から１４日間）、維持した。４日目に、３ｍＭの酪酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｒｙｒａｔｅ）（ｎ−ＢＵＴＲＩＣ ＡＣＩＤナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ Ｂ−５８８７）を培養物に添加した。１４日目に、培養物を、３０分間４０００ｒｐｍにて遠心分離し、保たれている上清を、０．２２μｍのＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、続いて０．２２μｍのＧａｍｍａゴールドフィルターによって濾過した。マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現するＣＨＯＳＸＥ採取物を、ＮａＣｌの添加（４Ｍまで）によって調整した。試料を、１５ｍｌ／分にて、０．１Ｍのグリシン＋４ＭのＮａＣｌ ｐＨ８．５で平衡化したプロテインＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ充填カラム（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れた。試料を、０．１Ｍのグリシン＋４ＭのＮａＣｌ ｐＨ８．５で洗浄し、追加的な洗浄ステップを０．１５ＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ９で実施した。Ａ２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度ピークを、０．１Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ３．４溶出緩衝液を使用して、カラムからの溶出の間に収集し、次に、２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５の添加によって、ｐＨ７．４に中和した。次に、プロテインＡからのｍＡｂプールを、ミニセット（ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ）Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎデバイスを使用して、適切な体積に濃縮し、その後、ＨｉＬｏａｄ ＸＫ ５０／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取用グレードゲル濾過カラム（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で更に精製した。次に、収集した画分をモノマーピークについて分析的ゲル濾過技術によって分析し、清浄なモノマー画分を最終的な生成物としてプールした。次に、最終的な生成物試料を、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びに最終的な純度の確認のために分析的ゲル濾過によって特徴付けた。更に、試料を試験し、エンドトキシン測定のためのＬＡＬアッセイ法を使用して、エンドトキシンについて陰性であることを見出した。試験した全てのｍＡｂについての最終的な緩衝液はＰＢＳであった。インビボ分析の場合、精製した抗体を生理食水中で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、高脂肪の食餌のｏｂ／ｏｂ及びＷＴマウスに、１匹のマウス当たり１．５ｍｇ（３３ｍｇ／ｋｇ）の用量で注射した。
抗体親和性の測定
ａＰ２（以下に記載したように大腸菌内で組換えにより生成した）に結合する抗ａＰ２の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、生体分子相互作用分析によって決定した。１０ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ５緩衝液中のＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ，Ｉｎｃ．）を、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、４５００から６０００の間の応答単位（ＲＵ）の捕捉レベルにアミンカップリング化学によってＣＭ５センサーチップに固定した。抗ａＰ２ ＩｇＧを、ランニング緩衝液中で１から１０μｇ／ｍｌの間に希釈した。固定した抗マウスＩｇＧ、Ｆｃによる捕捉のために、１０μｌ／分にて抗ａＰ２ ＩｇＧの６０秒の注入を行ない、次に、ａＰ２を、３０μ／分で１８０秒間、捕捉した抗ａＰ２に対して、２５ｎＭから３．１３ｎＭまで滴定し、続いて３００秒の解離を行なった。表面を、１０μｌ／分にて、２×６０秒、４０ｍＭのＨＣｌ及び１×３０秒、５ｍＭのＮａＯＨによって再生した。データを、極大の（ｌｏｃａｌ）Ｒｍａｘで１：１の結合モデルを使用するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン１．０）を使用して分析した。ＣＡ３３の場合、固定した抗マウスＩｇＧ、Ｆｃによる捕捉のために、１０μｌ／分にて抗体の６０秒の注入行い、次に、ａＰ２を、３０μｌ／分で１８０秒間、捕捉した抗ａＰ２に対して、４０μＭから０．６２５μＭまで滴定し、続いて３００秒の解離を行なった。表面を、１０μ／分にて、１×６０秒、４０ｍＭのＨＣｌ、１×３０秒、５ｍＭのＮａＯＨ及び１×６０秒、４０ｍＭのＨＣｌによって再生した。定常状態フィッティングを使用して親和性の値を決定した。
抗体交差遮断
アッセイは、マウスａＰ２を、捕捉したウサギ抗ａＰ２ ＩｇＧに対するマウス抗ａＰ２ ＩｇＧの存在下又は非存在下で注入することによって実施した。生体分子相互作用分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を使用して実施した。抗ａＰ２ウサギＩｇＧの一過性の上清を、１０μ／分の流速及び６０秒の注入を行ない、固定した抗ウサギＦｃ表面（１つのフローセル当たり１つの上清）に捕捉させ、２００ＲＵを超える応答レベルを得た。次に、１００ｎＭ、０ｎＭにてマウスａＰ２又は１００ｎＭにてマウスａＰ２、及び５００ｎＭにてマウス抗ａＰ２ ＩｇＧを１２０秒間通過させ、続いて１２０秒の解離を行なった。表面を、２×６０秒、４０ｍＭのＨＣｌ及び１×３０秒、５ｍＭのＮａＯＨで再生した。
ＦＡＢＰ交差反応性
組換えヒトタンパク質ａＰ２（大腸菌内でＵＣＢにて生成した（以下の方法を参照のこと））、ｈＦＡＢＰ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）及びｈＦＡＢＰ５／ｈＭａｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を、５倍モル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてビオチン化し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して未結合のビオチンから精製した。全ての結合研究は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）を使用して２５℃にて実施した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）、ｐＨ７．４中での１２０秒のベースラインステップ後、Ｄｉｐ及びＲｅａｄＴＭストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）に、６０ｎｍにて９０秒間、ビオチン化した組換えｈａＰ２、ｈＦＡＢＰ３又はｈＦＡＢＰ５／ｈＭａｌ１を入れた。ＰＢＳ−Ｔ中での６０秒の安定化ステップ後、各ＦＡＢＰを入れたバイオセンサーを、８００ｎＭにてモノクローナル抗体の試料に移し、会合を５分間測定した。次に、バイオセンサーを５分間、ＰＢＳ−Ｔに戻して解離を測定した。抗体の非特異的結合を、入れていないバイオセンサーチップを使用してモニターした。最大会合結合（即ち、シグナルがプラトーになった際）からバックグラウンド結合を差し引いて、各抗体／ＦＡＢＰの組合せについてプロットした。
ａＰ２発現及び精製
大腸菌内での発現のために最適化したマウス（又はヒト）ａＰ２ ｃＤＮＡは、ＤＮＡ ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）から購入し、インフレームＮ末端１０Ｈｉｓ−タグ、続いてタバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位を含有する改変したｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に直接サブクローニングした。タンパク質を大腸菌株ＢＬ２１ＤＥ３内で発現させ、以下のように精製した。典型的に、細胞を、ＥＤＴＡ非含有のコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルタブレト（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｈｉｌｌ）を補充した大腸菌培養物１リットル当たり５０ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））中で、冷却した細胞破壊器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．）を用いて溶解した。次に、溶解物を高速遠心分離（６００００ｇ、３０分、４℃）によって清浄化した。１００ｍｌの清浄化した溶解物当たり４ｍｌ／Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、４℃にて１時間回転させた。ビーズを、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合したＴｒｉ−Ｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、タンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液中で溶出した。４から１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）ゲル電気泳動によって判断した目的のタンパク質を含有する画分を透析して、イミダゾールを除去し、１００ｍｇのタンパク質当たり１ｍｇの割合にてＴＥＶプロテアーゼで処理した。４℃にて一晩のインキュベーションの後、試料をＴｒｉ−Ｃｏｒｎカラム内のＮｉ／ＮＴＡビーズに再び通した。未標識の（即ちＴＥＶ切断型）ａＰ２タンパク質はビーズと結合せず、カラムフロースルー中に集められた。タンパク質を濃縮し、ＰＢＳ、１ｍＭのＤＴＴ中で予め平衡化したＳ７５ ２６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れた。ピーク画分をプールし、５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次に、このタンパク質の６ｍｌを抽出し、２：１の比にてアセトニトリルで沈殿させて、全ての脂質を除去した。１６０００ｇにて１５分間の遠心分離後、アセトニトリル＋緩衝液を元の脂質含量の分析のために除去した。次に、変性タンパク質のペレットを、６ｍｌの６ＭのＧｕＨＣｌ ＰＢＳ＋２μＭのパルミチン酸（５：１の比のパルミチン酸対ａＰ２）中に再懸濁し、次に、４℃にて２０時間、５ＬのＰＢＳに対して２回透析し、リフォールディングさせた。沈殿物を除去するための遠心分離（１６０００ｇ、１５分）の後、ＰＢＳ中のＳ７５ ２６／２０カラムを使用して、タンパク質をゲル濾過して、凝集物を除去した。ピーク画分をプールし、１３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
ａＰ２結晶学
精製したマウスａＰ２を、以下のようにＣＡ３３及びＨ３ Ｆａｂ（従来の方法によってＵＣＢにて生成した）と複合体化した。複合体は、１３ｍｇ／ｍｌにて０．５ｍｌのａＰ２を、２１．８ｍｇ／ｍｌにて０．８ｍｌのＣＡ３３ Ｆａｂ又は１３．６ｍｇ／ｍｌにて１．２６ｍｌのＨ３ Ｆａｂのいずれかと混合することによって作製した（１．２：１のａＰ２：Ｆａｂのモル比）。タンパク質を室温にて３０分間インキュベートし、次に、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ＋５％のグリセロール中でＳ７５ １６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流した。ピーク画分をプールし、結晶学のために１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
シッティングドロップ結晶化実験を、市販のスクリーニングキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して設定した。回折品質の結晶を、一次結晶化スクリーニングにて、結晶化条件を最適化する必要性なく、直接的に得た。ａＰ２／ＣＡ３３複合体の場合、ウェル溶液は、０．１ＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、０．２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１６％のＰＥＧ ４Ｋ及び１０％のイソプロパノールを含有した。ａＰ２／Ｈ３複合体の場合、ウェル溶液は、０．１ＭのＭＥＳ ｐＨ５．５、０．１５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２４％のＰＥＧ ４Ｋを含有した。データは、ｉ０２（λ＝０．９７９４９）でＤｉａｍｏｎｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎにて収集し、ａＰ２／ＣＡ３３の場合は２．９Åデータセット及びａＰ２／Ｈ３の場合は２．３Åデータセットを得た。構造は、ＡＰ２及びＦａｂドメイン開始モデルを有するＰｈａｓｅｒ（４４）（ＣＣＰ４）を使用して、分子置換によって決定した。２つの複合体は、ａＰ２／ＣＡ３３の場合は非対称ユニットであり、ａＰ２／Ｈ３の場合は１つであることを見出した。精密化及びモデル構築のサイクルを、ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら、（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ２、２７２８−２７３３）及びｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙら、（２００４年）Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ６０，２１２６−２１３２）（ＣＣＰ４）を使用して、全ての精密化統計値が両方のモデルに対して収束するまで実施した。上記のエピトープ情報を、ａＰ２／Ｆａｂ接触面で４Å距離内の原子を考慮することによって導き出した。データ収集及び精密化統計値を、以下に示す。括弧内の値は、高解像度シェルを指す。
高インスリン血症−正常血糖クランプ研究及び肝臓生化学的アッセイ
高インスリン血症−正常血糖クランプ（Ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉｃ−ｅｕｇｌｙｃｅｍｉｃ ｃｌａｍｐｓ）を、報告されている手順（Ｃａｏら、（２０１３年）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１７，７６８−７７８）を改変して実施した。具体的には、マウスを５時間、絶食させた後に固定し、５ｍＵ／ｋｇ／分でインスリンを注入した。血液試料を、血漿グルコース濃度の即時測定のために１０分間隔で採取し、２５％のグルコースを、速度を変えて注入して、血漿グルコースを基礎濃度に維持した。ベースラインの全身グルコース処理を、［３−３Ｈ］−グルコース（０．０５μＣｉ／分）の持続的な注入により判断した。この後に、インスリン刺激による全身グルコース処理を決定し、それにより［３−３Ｈ］−グルコースを、０．１μＣｉ／分で注入した。
肝臓内の総脂質を、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒプロトコル（Ｂｌｉｇｈら，（１９５９年）Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｐｈｙｓ．３７，９１１−９１７）に従って抽出し、比色法を、製造業者の指示書（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って、市販のキットによって、トリグリセリド含量測定に使用した。グルコネオゲネシス酵素Ｐｃｋ１活性を、報告されている方法（Ｐｅｔｒｅｓｃｕら，（１９７９年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６，２７９−２８１）を改変して測定した。グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）活性を、Ｓｉｇｍａプロトコル［ＥＣ３．１．３．９］を改変して測定した。簡潔に述べると、肝臓を、２５０ｍＭのスクロース、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ及びＥＤＴＡを含有する溶解緩衝液中でホモジェナイズした。溶解物を１５分間、フルスピードで遠心分離し、上清（主に細胞質）を単離した。次に、ミクロソーム画分を、細胞質試料の超遠心分離によって単離した。ミクロソームタンパク質濃度を、市販のＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。２００ｍＭのグルコース−６−リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ中でプレインキュベートした。１５０μｇのミクロソームタンパク質又は段階希釈の組換えＧ６Ｐａｓｅを添加し、３７℃で２０分間、その溶液中でインキュベートした。次に、２０％のＴＣＡを添加し、混合し、室温で５分間インキュベートした。試料を、フルスピードで４℃にて１０分間、遠心分離し、上清を別のＵＶプレートに移した。発色試薬を添加し、６６０ｎｍでの吸光度を測定し、段階希釈の組換えグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）酵素で調製した標準曲線に標準化した。
血漿ａＰ２、ｍａｌ１、ＦＡＢＰ３、アディポネクチン、グルカゴン、及びインスリンＥＬＩＳＡ
血液を、６時間の日中の食餌中止の後又は１６時間の一晩の食餌中止の後、尾部採血よってマウスから採取した。終末（ｔｅｒｍｉｎａｌ）血液試料を心臓穿刺によって採取、又は尾静脈から採取した。試料を４℃にて１５分間３，０００ｒｐｍにて微量遠心分離器で回転させた。血漿ａＰ２（Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ Ｒ＆Ｄ）、ｍａｌ１（Ｃｉｒｃｕｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ Ｍａｌ１ ＥＬＩＳＡ、ＣｙｃＬｅｘ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、日本）、ＦＡＢＰ３（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）グルカゴン、アディポネクチン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）及びインスリン（インスリン−マウス超高感度ＥＬＩＳＡ、Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）の測定を、製造業者の指示書に従って実施した。
定量的リアルタイムＰＣＲ分析
組織を、６時間の日中の食餌中止の後に採取し、直ちに凍結し、−８０℃で保存した。ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して単離した。第１ストランドｃＤＮＡ合成のために、０．５から１ｎｇのＲＮＡ及び５×ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用した（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｕｓ、ＣＡ）。定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して実施し、試料を、ＶｉｉＡ７ ＰＣＲ機械（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して分析した。Ｑ−ＰＣＲに使用したプライマーは以下の通りであった：
統計的分析
結果を平均±ＳＥＭとして示す。統計的有意性は、反復測定ＡＮＯＶＡ又はスチューデントのｔ検定によって決定した。＊はｐ＜０．０５での有意性を示し、＊＊はｐ＜０．０１での有意性を示す。
抗ａＰ２／グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体モノクローナル抗体の開発及びスクリーニング
肥満は、循環ａＰ２レベルの増加に関連し、これは、肝臓グルコース産生の上昇並びに末梢グルコース処理の低減及びインスリン耐性、２型糖尿病の特徴の原因となる。従って、血清ａＰ２を中和すること、又は、グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体がグルカゴン受容体を活性化するのを破壊することは、糖尿病及び可能な場合は他の代謝疾患を治療するための効果的なアプローチとなる。
ヒト及びマウスａＰ２ペプチドに対して高めたマウス及びウサギ−マウスハイブリッドモノクローナル抗体を産生し、スクリーニングした。Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用した生体分子相互作用分析による結合親和性の評価によって、マイクロモルから低ナノモルの範囲まで、これらの抗体に対する広範な親和性が実証された（図９Ａ）。興味深いことに、ＣＡ３３はまた、絶食時血中グルコースも有意に減少させた（図９Ｂ）が、試験した他の抗体は血糖を改善しなかった。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、このことは、ＣＡ３３がＨＦＤに関連するインスリン抵抗性を低下させ、グルコース代謝を改善することを示す。グルコース代謝の全身的改善を、グルコース耐性試験（ＧＴＴ）を使用して、更に検証した。ＣＡ３３治療により、グルコース耐性が有意に改善された（図９Ｃ）が、他の抗体は、グルコース耐性を改善せず、グルコース処理曲線はビヒクルと比較して差異がなかった（図１２Ａ）。更に、ＣＡ３３治療のみが、インスリン耐性試験において実証されたようにインスリン感受性を著しく改善したが、試験した他の抗体はビヒクルと同様であった（図１２Ｂ）。追加的に、グルカゴンを有するａＰ２ノックアウトマウスへのａＰ２投与は、グルカゴン不応答性を救済し、ａＰ２を伴うＣＡ３３とのプレインキュベーションはそれを防止する（図１２Ｃ及び１２Ｄ）。いずれの理論にも拘束されることを望まず、またこれらを考慮して、これらの結果により、ＣＡ３３が抗糖尿病特性を独特に有することが実証された。
ＣＡ３３はａＰ２／グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を中和する低親和性抗体である
ＣＡ３３を、その特有の治療特性をより良く理解するために更に特徴付けた。オクテット結合（ｏｃｔｅｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ）アッセイでは、試験した抗体の全ては、ａＰ２との飽和可能な結合を実証した。関連するタンパク質ＦＡＢＰ３との相互作用は測定可能ではあるが低く（ａＰ２／ＦＡＢＰ４相互作用の約２５％）、コントロールＩｇＧ（図１０Ａ）に類似したＭａｌ１／ＦＡＢＰ５とはほんの僅かな相互作用があった。
標的部位の特徴付けを開始するための交差遮断実験では、本発明者らは、ＣＡ３３はａＰ２に対して無効なマウス抗体Ｈ３の結合を部分的に遮断したが、Ｈ３結合はハイブリッド抗体ＣＡ１３及びＣＡ１５によって完全に遮断されたことを見出した（図１０Ｂ）。更なる分析では、例えば、Ｐａｎｄｉｔら、（２０１２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．Ｍａｒ；２５（３）：１１４−２４（参照により本明細書に援用する）に記載されているように、水素重水素交換質量分析実験に基づいたエピトープの同定により、Ｈ３について同定したエピトープと部分的に重複している、残基９から１７、２０から２８及び１１８から１３２上のａＰ２の第１のアルファヘリックス及び第１のベータシートとのＣＡ３３の相互作用が示された（図１０Ｃ）。次に、ａＰ２と共にＣＡ３３及びＨ３のＦａｂフラグメントを共結晶化した（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｉｚｅｄ）（図１０Ｄ）。結晶の分析により、ＣＡ３３が、二次構造エレメントベータ１及びベータ１０並びにアルファ２とベータ２及びベータ３とベータ４を連結するランダムコイル領域にわたって広がっているエピトープと結合し、ａＰ２アミノ酸５７Ｔ、３８Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１０Ｋ及び１３０Ｅを含むことが示された（図１０Ｅ）。ＣＡ３３によるＨ３の部分的遮断にも関わらず、本発明者らは、それらのエピトープの直接的な重複が実際にはないことを観察した。代わりに、ａＰ２ Ｐｈｅ５８周囲の領域の有意な移動は、競合実験では、他方の抗体によって一方の抗体の結合を部分的に遮断することができる。加えて、ＣＡ３３ Ｆａｂの低親和性は、結晶構造によって説明することができる。稀に、ＣＡ３３の重鎖の１つのアミノ酸のみがａＰ２と接触し、多数の接点は軽鎖を介している（図１０Ｄ及び１０Ｅ）。対照的に、Ｈ３−ａＰ２接点は、より普通であり、両方のＦａｂ鎖がａＰ２と相互作用する。この構造はまた、ＣＡ３３がβ−バレル（１４Ｓから３７Ａ）の「蓋」に結合しないことも示し、Ｅ１５、Ｎ１６及びＦ１７を含有する「ヒンジ」又は結合ポケットへの脂質の接近を制御すると仮定されている。加えて、ａＰ２との脂質結合（パリナリン酸（ｐａｒａｎａｒｉｃ ａｃｉｄ））は、ＣＡ３３の存在によって実質的に変化しないことが見出された（図１０Ｆ）。Ｈ３は「蓋」と直接的に結合するが、活性は限定されている。脂質と結合したａＰ２又は脂質と結合していないａＰ２とＣＡ３３との結合もまた、生化学的分析（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して試験した。ＣＡ３３は、脂質結合ａＰ２及び脂質非結合ａＰ２の両方と、以下の親和性で結合する：

更に、抗マウスＩｇＧ ＳＰＡビーズを、１２５Ｉグルカゴンを有する野生型又はａＰ２ノックアウトマウス由来の血清と共にインキュベートしたところ、ａＰ２が１２５Ｉグルカゴンと、生理学的に関連する状態／動物血清にて相互作用することが示された（図１０Ｇ及び１０Ｈ）。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、これらの結果により、ＣＡ３３活性がａＰ２脂質結合とは無関係であり得ることが示唆される。
ａＰ２に対するＣＡ３３の比較的低い親和性を考慮して、オフターゲット効果を試験した。ＨＦＤを給餌したａＰ２−／−マウスにおけるＣＡ３３治療の効果を試験した。これらの実験では、抗体治療は、このモデルにおいて体重又は絶食時グルコースのいかなる変化も誘導することができなかった（図１１Ａ）。更に、ＣＡ３３は、肥満ａＰ２−／−マウスのグルコース耐性に影響を与えず（図１１Ｂ）、抗体の効果がａＰ２を標的にすることに起因することが明確に実証された。
最後に、重度の遺伝的肥満の第２のモデルにおけるＣＡ３３の効果及びレプチン欠失ｏｂ／ｏｂマウスを使用したインスリン耐性を試験した。驚くべきことに、ｏｂ／ｏｂマウスの高血糖は、コントロールと比較してＣＡ３３治療マウスにおいて正常化された（図１１Ｃ）。正常なグルコース及びより低いインスリンレベルから、ａＰ２を中和すると、グルコース代謝が改善されることが示唆される。実際に、外因性グルコースの投与後、ＣＡ３３で治療したｏｂ／ｏｂマウスもまた、極めて重度の肥満の存在にも関わらず、ビヒクルで治療したマウスと比較して、有意に改善したグルコース耐性を示した（図１１Ｄ）。ＣＡ３３治療は、３週間の処置後にｏｂ／ｏｂマウスのグルカゴン応答を鈍らせ（図１１Ｅ及び１１Ｆ）、グルカゴンの作用を防止することによって、ａＰ２欠失を模倣することも示された。
実施例３：ＣＡ３３のヒト化
ウサギ抗体９０９（ＣＡ３３）を、ウサギＣＤＲ／マウスフレームワークハイブリッド抗体Ｖ領域ＣＤＲ由来のＣＤＲをヒト生殖細胞系列抗体Ｖ領域フレームワークにグラフト化することによってヒト化した。抗体の活性を回復させるために、ウサギ／マウスハイブリッドＶ領域由来の複数のフレームワーク残基もまた、ヒト化配列中に保持した。これらの残基を、Ａｄａｉｒら（１９９１年）（Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＷＯ９１／０９９６７）によって概説されているプロトコルを使用して選択した。ウサギ／マウスハイブリッド抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖細胞系列（アクセプター）Ｖ領域配列とのアラインメントを、設計されたヒト化配列と一緒に、図１３（ＶＬ）及び図１４（ＶＨ）に示す。ドナーからアクセプター配列に移植したＣＤＲは、組み合わせたＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義を使用したＣＤＲＨ１（参照：Ａｄａｉｒら，１９９１ Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ＷＯ９１／０９９６７）を除いて、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら，１９８７年）によって定義されている通りである。
複数のバリアント重鎖及び軽鎖Ｖ領域配列をコードする遺伝子を設計し、ＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃによる自動化合成手法によって構築した。重鎖及び軽鎖の両方のＶ領域の更なるバリアントを、場合によっては、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を改変又は不対システイン残基を除去するＣＤＲ内の突然変異を含む、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入により、ＶＨ及びＶＫ遺伝子を改変することによって作製した。これらの遺伝子を、哺乳動物細胞中でヒト化９０９ ＩｇＧ４Ｐ（ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐを含有するヒトＩｇＧ４、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年、３０（１）：１０５−８）抗体の発現を可能にするようにベクター内にクローニングした。バリアントヒト化抗体鎖及びその組合せを発現させ、親抗体と関連するそれらの有効性、それらの生物物理学的特性及び下流プロセシングについての適合性について評価し、重鎖及び軽鎖グラフトの選択へと導いた。
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１−１７（Ａ３０）とＪＫ４ Ｊ領域を、抗体９０９軽鎖ＣＤＲについてのアクセプターとして選択した。グラフトｇＬ１（配列番号２９）、ｇＬ１０（配列番号３１）、ｇＬ５４（配列番号３３）及びｇＬ５５（配列番号３５）の軽鎖フレームワーク残基は全て、残基２、３、６３及び７０（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子由来であり、それぞれ、ドナー残基バリン（２Ｖ）、バリン（３Ｖ）、リシン（６３Ｋ）及びアスパラギン酸（７０Ｄ）を保持した。残基２、３、６３及び７０の保持は、ヒト化抗体の完全な有効性に必須であった。ｇＬ１０グラフト、ｇＬ５４グラフト及びｇＬ５５グラフトのＣＤＲＬ３における残基９０をそれぞれ、システイン（９０Ｃ）からセリン（９０Ｓ）、グルタミン（９０Ｑ）及びヒスチジン（Ｈ９０）残基へと突然変異させ、それによりｇＬ１０、ｇＬ５４及びｇＬ５５配列から不対システイン残基を除去した。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ４−４とＪＨ４ Ｊ領域を、抗体９０９の重鎖ＣＤＲについてのアクセプターとして選択した。多くのウサギ抗体と同様に、抗体９０９のＶＨ遺伝子は、選択されたヒトアクセプターよりも短い。ヒトアクセプター配列と整列させると、抗体９０９由来のＶＨ領域のフレームワーク１（配列番号４１）は、ヒト化抗体に保持される、Ｎ末端残基を欠失している（図１４Ａ）。９０９ウサギＶＨ領域のフレームワーク３もまた、ベータシートストランドＤとＥとの間のループにおいて２つの残基（７５及び７６）を欠失している：グラフトｇＨ１（配列番号４２）では、フレームワーク３におけるギャップが保存されるが、グラフトｇＨ１４（配列番号４４）、ｇＨ１５（配列番号４６）、ｇＨ６１（配列番号４８）及びｇＨ６２（配列番号５０）では、ギャップは、選択されたヒトアクセプター配列由来の対応する残基（リシン７５、７５Ｋ；アスパラギン７６、７６Ｎ）で満たされる（図１４Ａ）。グラフトｇＨ１及びｇＨ１５における重鎖フレームワーク残基の全ては、残基２３、６７、７１、７２、７３、７４、７７、７８、７９、８９及び９１（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子由来であり、それぞれ、ドナー残基トレオニン（２３Ｔ）、フェニルアラニン（６７Ｆ）、リシン（７１Ｋ）、アラニン（７２Ａ）、セリン（７３Ｓ）、トレオニン（７４Ｔ）、トレオニン（７７Ｔ）、バリン（７８Ｖ）、アスパラギン酸（７９Ｄ）、トレオニン（８９Ｔ）及びフェニルアラニン（９１Ｆ）を保持した。グラフトｇＨ１４における重鎖フレームワーク残基は、残基６７、７１、７２、７３、７４、７７、７８、７９、８９及び９１（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に由来し、それぞれ、ドナー残基トレオニン（２３Ｔ）、フェニルアラニン（６７Ｆ）、リシン（７１Ｋ）、アラニン（７２Ａ）、セリン（７３Ｓ）、トレオニン（７４Ｔ）、トレオニン（７７Ｔ）、バリン（７８Ｖ）、アスパラギン酸（７９Ｄ）、トレオニン（８９Ｔ）及びフェニルアラニン（９１Ｆ）を保持した。グラフトｇＨ６１及びｇＨ６２における重鎖フレームワーク残基は、残基７１、７３及び７８（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子由来であり、それぞれ、ドナー残基リシン（７１Ｋ）、セリン（７３Ｓ）及びバリン（７８Ｖ）を保持した。ヒトフレームワークの１位におけるグルタミン残基を、均質な生成物の発現及び精製を提供するために、グルタミン酸（１Ｅ）と置き換えた：抗体及び抗体フラグメントのＮ末端におけるグルタミンのピログルタマートへの変換は、広範に報告されている。ｇＨ１５グラフト及びｇＨ６２グラフトのＣＤＲＨ２（配列番号１９）における残基５９を、システイン（５９Ｃ）からセリン（５９Ｓ）残基へ突然変異させ、それによりｇＨ１５配列から不対システイン残基を除去した。グラフトｇＨ１５及びグラフトｇＨ６２のＣＤＲＨ３（配列番号２０）における残基９８を、アスパラギン酸（９８Ｄ）からグルタミン酸（９８Ｅ）残基へ突然変異させ、それによりｇＨ１５配列から潜在的なアスパラギン酸異性化部位を除去した。
哺乳動物細胞におけるヒト化Ａｂ９０９の発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトＣ−カッパ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡ配列に結合させて、隣接軽鎖遺伝子を作製した。ヒト化重鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐ（Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年，３０（１）：１０５−８）を有するヒトガンマ−４重鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列に結合させて、隣接重鎖遺伝子を作製した。重鎖及び軽鎖遺伝子を、哺乳動物発現ベクター１２３５−ｐＧＬ３ａ（１）−ＳＲＨａ（３）−ＳＲＬａ（３）−ＤＨＦＲ（３）にクローニングした（Ｃｅｌｌｃａ ＧｍｂＨ）。
抗ａＰ２抗体阻害によって影響を受ける下流シグナル伝達事象を更に調べるために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で構築されたヒトグルカゴン受容体発現ｃＡＭＰレポーターシステムを利用した。図１４Ｂは、ヒトＧＣＧＲ−ＧＦＰ及び４ｘｃＡＭＰ応答エレメントで安定にトランスフェクトされ、１μｇ／ｍｌのａＰ２、２５ｎＭのグルカゴン、及び２０μｇ／ｍｌのＣＡ３３及びＣＡ１５の存在下で刺激されたＣＨＯ−Ｋ１における刺激の４時間後にアッセイされたルシフェラーゼ活性に対するａＰ２阻害の影響を示す。図１４Ｃは、ａＰ２中のシステイン残基をセリンに突然変異させることは、ルシフェラーゼ活性に影響せず、図１４Ｂに見られる効果がシステイン誘導二量体化に起因しないことを示す。
実施例４：グルカゴン応答に対するａＰ２中和のインビボ効果
循環ａＰ２の中和により、食餌誘発性肥満を有するマウスにおけるグルカゴン作用の低下がもたらされる。マウスに、実験前の２０週間、高脂肪の食餌を与えた。２０週目から開始して、マウスに、ビヒクル又は抗ａＰ２ ｍＡｂを、３３ｍｇ／ｋｇの用量で、１週間に２回を３週間、腹腔内注射により注射した。３週間の終わりに、グルカゴンチャレンジ試験を行い、マウスに、昼間の４時間の絶食後に１５０μｇ／ｋｇのグルカゴンを注射した。抗ａＰ２ ｍＡｂで処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスよりも、グルカゴン注射に対する応答が有意に低かった（図１５）。従って、循環ａＰ２を中和することは、グルカゴン活性を低下させるための有効なアプローチである。
実施例５：ＣＡ３３は、グルカゴン／ａＰ２複合体と結合することができる
結合親和性研究を、Ｂｌｉｔｚ機器（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使用して行った。ビオチン化ａＰ２をストレプトアビジンプローブに結合させた。次に、結合させたａＰ２の結合親和性を、グルカゴン、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＣＡ３３）、又はグルカゴンプラスｍＡｂの溶液中で試験した（図１６）。グルカゴンは単独でａＰ２への結合を示し、モノクローナル抗体はグルカゴン／ａＰ２複合体への強力な結合を示す。いずれの理論にも拘束させることを望まないが、グルカゴン／ａＰ２複合体へのこのモノクローナル抗体の結合は、モノクローナル抗体の抗糖尿病効果及びグルカゴン作用を低下させる能力の重要な要素である可能性がある。
実施例６．グルカゴン治療はａＰ２内在化を改善する
生細胞イメージングは、ａＰ２処理又はａＰ２＋グルカゴン処理のいずれかに曝露した後に、ＧＣＧＲ−ＧＦＰでトランスフェクトしたＵ２−ＯＳ細胞について行った。図１７Ａ及び図１７Ｂに示されるように、細胞がグルカゴンで処理されなかった場合、細胞へのａＰ２の最小限の内在化が観察された。細胞をグルカゴンで刺激すると（図１７Ｃから１７Ｅ）、ａＰ２の内在化は大幅に増加した。ＧＣＧＲ−ＧＦＰシグナル及びａＰ２シグナルの共局在化は、写真中に白く示されている。
実施例７．ａＰ２欠失はグルカゴン受容体拮抗作用とは異なる
グルカゴン受容体拮抗作用の明確な特徴は、アルファ細胞過形成であるが、ａＰ２欠失は、図１７Ｆから１７Ｊに示すようにアルファ細胞過形成を引き起こさない。ａＰ２＋／＋細胞株及びａＰ２−／−細胞株からの細胞の顕微鏡画像並びにピクセルで測定したａＰ２＋／＋細胞株及びａＰ２−／−細胞株からの細胞の膵島面積に有意な相違はなかった。グルカゴンについて染色した場合、２つの細胞株の画像もまた、有意な相違がなかった。２つの細胞の画像を図１７Ｉ（ａＰ２＋／＋細胞株）及び図１７Ｊ（ａＰ２−／−細胞株）に示す。
この明細書は、本発明の実施形態を参照して説明されている。しかしながら、当業者であれば、以下の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変及び変更を行うことができることを理解する。従って、本明細書は、限定的な意味ではなく例示的な意味で考慮されるべきであり、そのような改変は全て本発明の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (90)

  1. グルカゴン／脂肪細胞結合タンパク質複合体（グルカゴン／ａＰ２）に結合することができる化合物を同定する方法であって、
    ｉ． 前記化合物をａＰ２との複合体（グルカゴン／ａＰ２）中のグルカゴンと接触させること；そして、
    ｉｉ． 前記化合物がグルカゴン／ａＰ２に結合するか否かを決定すること、
    を含む方法。
  2. ｉ． 化合物をａＰ２及びグルカゴン、及び／又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で、細胞アッセイに導入し、前記細胞アッセイが、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）を発現する細胞の集団を含むこと、そして、
    ｉｉ． 前記ＧＣＧＲの生物学的活性を測定すること、
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. ＧＣＧＲを発現する細胞集団が肝細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. ＧＣＧＲを発現する細胞集団がヒト細胞である請求項２又は３に記載の方法。
  5. ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
    ｉ． 化合物をａＰ２及びグルカゴン、又はａＰ２との複合体（グルカゴン／ａＰ２）中のグルカゴンと接触させること；
    ｉｉ． 前記化合物がａＰ２、グルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２に結合するか否かを決定すること；
    ｉｉｉ． 前記化合物をａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２、及びＧＣＧＲを用いるアッセイに導入すること、そして、
    ｉｖ． グルカゴン／ａＰ２が、ＧＣＧＲに結合するか否かを決定すること、
    を含み、
    ＧＣＧＲへのグルカゴン／ａＰ２の非結合が、ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物の指標となる、方法。
  6. ｉ． 化合物をａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で、細胞アッセイに導入し、前記細胞アッセイが、ＧＣＧＲを発現する細胞の集団を含むこと、そして、
    ｉｉ． 前記ＧＣＧＲの生物学的活性を測定すること、
    を更に含む、請求項５に記載の方法。
  7. ＧＣＧＲを発現する細胞集団が肝細胞である請求項６に記載の方法。
  8. ＧＣＧＲを発現する細胞集団がヒト細胞である請求項６又は７に記載の方法。
  9. ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
    ｉ． ａＰ２及びグルカゴン又はグルカゴン／ａＰ２を、化合物の存在下で、ＧＣＧＲと接触させること；
    ｉｉ． ａＰ２及びグルカゴン又はグルカゴン／ａＰ２を、化合物の非存在下で、ＧＣＧＲと接触させること；そして、
    ｉｉｉ． 前記化合物の存在下でＧＣＧＲに結合したグルカゴン／ａＰ２の量を、前記化合物の非存在下でＧＣＧＲに結合したグルカゴン／ａＰ２の量と比較すること；
    を含み、
    前記化合物の存在下でＧＣＧＲに結合するグルカゴン／ａＰ２の量の減少が、ＧＣＧＲ作動を中和することができる化合物の指標となる、方法。
  10. ｉ． 化合物をａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で、細胞アッセイに導入し、前記細胞アッセイが、ＧＣＧＲを発現する細胞の集団を含むこと、そして、
    ｉｉ． 前記ＧＣＧＲの生物学的活性を測定すること、
    を更に含む、請求項９に記載の方法。
  11. ＧＣＧＲを発現する細胞集団が肝細胞である請求項１０に記載の方法。
  12. ＧＣＧＲを発現する細胞集団がヒト細胞である請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
    ｉ． ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２を、ＧＣＧＲを発現する細胞を含む第１の細胞アッセイに導入すること；
    ｉｉ． 前記第１の細胞アッセイにおける前記細胞中のＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること；
    ｉｉｉ． ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２を、ＧＣＧＲを発現する細胞を含む第２の細胞アッセイに導入すること、ここで、前記ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２を、前記化合物の存在下で導入すること；
    ｉｖ． 前記第２の細胞アッセイにおける前記細胞中のＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること；そして、
    ｖ．前記第１の細胞アッセイにおける前記ＧＣＧＲの生物学的活性を、前記第２の細胞アッセイにおける前記ＧＣＧＲの生物学的活性と比較すること；
    を含み、
    前記第１のアッセイにおける前記ＧＣＧＲの生物学的活性と比較した、前記第２のアッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性の減少がＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する化合物の指標となる、方法。
  14. ＧＣＧＲを発現する細胞集団が肝細胞である請求項１３に記載の方法。
  15. ＧＣＧＲを発現する細胞集団がヒト細胞である請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
    ｉ． 前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２、並びにＧＣＧＲを発現する細胞を含む細胞集団の存在下で、第１の細胞アッセイに導入すること、ここで、前記化合物は、一定の濃度で存在し、かつａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２は、不飽和の濃度で存在すること；
    ｉｉ． 前記第１の細胞アッセイにおける前記細胞集団中のＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること；
    ｉｉｉ． 前記化合物を、ａＰ２、グルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２、及びＧＣＧＲを発現する細胞を含む細胞集団の存在下で、第２の細胞アッセイに導入すること、ここで、前記化合物は、一定の濃度で存在し、かつａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２は、飽和した濃度で存在すること；
    ｉｖ． 前記第２の細胞アッセイにおける前記細胞集団中のＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること；そして
    ｖ． 前記第１の細胞アッセイにおける前記ＧＣＧＲの生物学的活性を、前記第２の細胞アッセイにおける前記ＧＣＧＲの生物学的活性と比較すること；
    を含み、
    前記第２のアッセイにおける（前記）ＧＣＧＲの生物学的活性の減少よりも、前記第１のアッセイにおける（前記）ＧＣＧＲの生物学的活性の減少の方が大きいことがＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する化合物の指標となる、方法。
  17. ＧＣＧＲを発現する細胞集団が肝細胞である請求項１６に記載の方法。
  18. ＧＣＧＲを発現する細胞集団がヒト細胞である請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
    ｉ． 前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２、並びにＧＣＧＲを発現する細胞を含む細胞集団の存在下で、第１の細胞アッセイに導入すること、ここで、前記化合物が一定の濃度で存在し、かつａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２が第１の濃度で存在すること；
    ｉｉ． 前記第１の細胞アッセイにおける前記細胞集団中のＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること；
    ｉｉｉ． 前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２並びにＧＣＧＲを発現する細胞を含む細胞集団の存在下で、一連の追加的な細胞アッセイに導入すること、ここで、前記一連の追加的な細胞アッセイが一定の濃度で存在する前記化合物、並びに前記第１の細胞アッセイと比較して逐次増加する濃度でａＰ２、グルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２を含むこと；
    ｉｖ． 前記一連の追加的な細胞アッセイにおける前記細胞集団中のＧＣＧＲの生物学的活性を決定すること；そして、
    ｖ．前記第１の細胞アッセイにおける前記ＧＣＧＲの生物学的活性を、前記一連の追加的な細胞アッセイにおける前記ＧＣＧＲの生物学的活性と比較すること、
    を含み、
    前記一連の追加的な細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性の減少よりも、前記第１の細胞アッセイにおけるＧＣＧＲの生物学的活性の減少の方がより大きいことがＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する化合物の指標となる、方法。
  20. ＧＣＧＲを発現する細胞集団が肝細胞である請求項１９に記載の方法。
  21. ＧＣＧＲを発現する細胞集団がヒト細胞である請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
    ｉ． 前記化合物をａＰ２に接触させること；そして、
    ｉｉ． 前記化合物が配列番号１又は配列番号２の酸Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｇｌｕ６２又はＬｙｓ８０にてａＰ２に結合するか否かを決定すること；
    を含み、
    配列番号１又は配列番号２のアミノ酸Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｇｌｕ６２又はＬｙｓ８０における、ａＰ２への前記化合物の前記結合がＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物の指標となる、方法。
  23. ｉ． 前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で細胞アッセイに導入し、前記細胞アッセイがＧＣＧＲを発現する細胞の集団を含むこと；そして、
    ｉｉ． 前記ＧＣＧＲの生物学的活性を測定すること、
    を更に含む、請求項２２に記載の方法。
  24. ＧＣＧＲを発現する細胞集団が肝細胞である請求項２３に記載の方法。
  25. ＧＣＧＲを発現する細胞集団がヒト細胞である請求項２３又は２４に記載の方法。
  26. 被験体におけるＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する方法であって、前記被験体に、前記グルカゴン／ａＰ２の能力によって、ＧＣＧＲに結合するのを中和する化合物を投与することを含み、前記化合物がａＰ２よりもグルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  27. 化合物が抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤である請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. 被験体におけるＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和する方法であって、前記被験体に、形成するグルカゴン／ａＰ２の能力を阻害する抗体を非制限的に含む化合物を投与することを含む、方法。
  29. 化合物が抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤である請求項２８に記載の方法。
  30. 被験体における肝臓グルコース産生を阻害する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する化合物を投与することを含み、前記化合物がＧＣＧＲに直接的には結合せず、かつ前記化合物がａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  31. 化合物が抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤である請求項３０に記載の方法。
  32. 被験体における肝臓選択的インスリン抵抗性を阻害する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する化合物を投与することを含み、前記化合物がＧＣＧＲに直接的には結合せず、かつ前記化合物がａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  33. 化合物が抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤である請求項３２に記載の方法。
  34. 肝臓グルコース産生の調節不全によって媒介される障害を有する被験体を治療する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する抗体を非制限的に含む化合物を投与することを含み、前記化合物がＧＣＧＲに直接的には結合せず、かつ前記化合物がａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  35. 化合物が抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤である請求項３４に記載の方法。
  36. 障害が１型糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｙｐｅ １）、２型糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｙｐｅ ２）、高血糖（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、糖尿病性ケトアシドーシス（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｋｅｔｏａｃｉｄｏｓｉｓ）、高血糖高浸透圧症候群（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、糖尿病性腎症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）又は腎不全（ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、絶食時グルコース異常（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｆａｓｔｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ）、耐糖能異常（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、肥満症（ｏｂｅｓｉｔｙ）、白内障（ｃａｔａｒａｃｔｓ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、創傷治癒障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ）、高血糖（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、周術期高血糖（ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、インスリン抵抗症候群（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（ＮＡＳＨ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硬変症（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎｏｍａ）、及び壊死性遊走性紅斑（Ｎｅｃｒｏｌｙｔｉｃ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｅｒｙｔｈｅｍａ）（ＮＭＥ）から選択される、請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 肝臓選択的インスリン抵抗性によって媒介される障害を有する被験体を治療する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する化合物を投与することを含み、前記化合物がＧＣＧＲに直接的には結合せず、かつａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  38. 化合物が抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤である請求項３７に記載の方法。
  39. 障害がＩＩ型糖尿病である請求項３７又は３８に記載の方法。
  40. 被験体の脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）を調節する方法であって、前記被験体に、ＧＣＧＲを作動させるグルカゴン／ａＰ２の能力を中和する化合物を投与することを含み、前記化合物がＧＣＧＲに直接的には結合しない、方法。
  41. 化合物が抗体、抗体フラグメント、又は抗原結合剤である請求項４０に記載の方法。
  42. 被験体のグルカゴンシグナル伝達活性を調節する方法であって、前記被験体に、グルカゴン／ａＰ２複合体媒介性ＧＣＧＲ活性破壊を引き起こす抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することを含む、方法。
  43. 被験体がヒトである請求項４２に記載の方法。
  44. 破壊が細胞内ｃＡＭＰの増加をもたらすことになる細胞内シグナル伝達を通常は引き起こすようなＧＣＧＲへのグルカゴンの結合を、防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項４２に記載の方法。
  45. 破壊が細胞内ｃＡＭＰの増加をもたらすことになる細胞内シグナル伝達を通常は引き起こすようなＧＣＧＲへのａＰ２の結合を、防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項４２に記載の方法。
  46. 破壊が前記グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体の能力によって、前記受容体への細胞内シグナル伝達可能な結合が達成されるのを防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項４２に記載の方法。
  47. 破壊がグルカゴンがＧＣＧＲに結合することができないように、ＧＣＧＲ結合が減少するように、又は、有効な細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を妨げるように前記結合が変化するように、ａＰ２がＧＣＧＲにアロステリックに結合し、かつ前記受容体の三次元コンフォメーションを変化させるのを防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項４２に記載の方法。
  48. 破壊が有効な受容体媒介性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を防止するように、グルカゴンがグルカゴン／ａＰ２−ＧＣＧＲ複合体に結合するのを防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項４２に記載の方法。
  49. 破壊が有効な受容体媒介性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を防止するように、前記グルカゴン／ａＰ２複合体の形成を防止又は妨害することによって引き起こされる、請求項４２に記載の方法。
  50. 破壊がグルカゴン／ａＰ２複合体がＧＣＧＲに効果的に結合するのを防止するコンフォメーション変化を誘導することによって、前記グルカゴン／ａＰ２タンパク質複合体を改変することによって引き起こされる、請求項４２に記載の方法。
  51. 化合物がａＰ２よりもグルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する、請求項２６から５０のいずれかに記載の方法。
  52. 被験体がヒトである請求項２６から５０のいずれかに記載の方法。
  53. 被験体におけるグルカゴンシグナル伝達活性を調節する方法であって、前記被験体に、ａＰ２−グルカゴン複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することを含む、方法。
  54. 被験体がヒトである請求項５３に記載の方法。
  55. 破壊が細胞内ｃＡＭＰの増加をもたらすことになる細胞内シグナル伝達を通常は引き起こすような前記グルカゴンＧタンパク質共役受容体へのグルカゴンの前記結合を防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
  56. 破壊が細胞内ｃＡＭＰの増加をもたらすことになる細胞内シグナル伝達を通常は引き起こすような前記グルカゴンＧタンパク質共役受容体へのａＰ２の前記結合を防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
  57. 破壊が前記ａＰ２グルカゴンタンパク質複合体の能力によって、前記受容体への細胞内シグナル伝達可能な結合が達成されるのを防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
  58. 破壊がグルカゴンが前記受容体に結合することができないように、グルカゴン受容体結合が減少するように、又は、有効な細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を防止するように前記結合が変化するように、ａＰ２が前記グルカゴンＧタンパク質共役受容体にアロステリックに結合し、かつ前記受容体の三次元コンフォメーションを変化させるのを防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
  59. 破壊が有効な受容体媒介性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を防止するように、グルカゴンがａＰ２−グルカゴンＧ共役受容体複合体に結合するのを防止又は減少させることによって引き起こされる、請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
  60. 破壊が有効な受容体媒介性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を防止するように、前記ａＰ２グルカゴン複合体の形成を防止又は妨害することによって引き起こされる、請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
  61. 破壊が前記ａＰ２−グルカゴン複合体が前記グルカゴン受容体に有効に結合するのを防止するコンフォメーション変化を誘導することによって、前記ａＰ２−グルカゴンタンパク質複合体を改変することによって引き起こされる、請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
  62. 抗体がａＰ２及びグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合するモノクローナル抗体である請求項５３から６１のいずれかに記載の方法。
  63. グルカゴノーマに罹患する被験体を治療する方法であって、
    （ａ） ＣＤＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列、又はＣＤＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列から独立して選択される１、２、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ）を含む軽鎖可変領域であって、
    前記ＣＤＲ−Ｌ１領域の前記アミノ酸配列が配列番号７であり、
    前記ＣＤＲ−Ｌ２領域の前記アミノ酸配列が配列番号８であり、そして
    前記ＣＤＲ−Ｌ３領域の前記アミノ酸配列が配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２から選択される、領域；並びに
    （ｂ） ＣＤＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列、又はＣＤＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列から独立して選択される１、２、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ）を含む重鎖可変領域であって、
    前記ＣＤＲ−Ｈ１領域の前記アミノ酸配列が配列番号１４であり、
    前記ＣＤＲ−Ｈ２領域の前記アミノ酸配列が配列番号１６又は配列番号１７であり、そして、
    前記ＣＤＲ−Ｈ３領域の前記アミノ酸配列が配列番号１９又は配列番号２０から選択される、領域；
    を含む、有効量の抗体又は抗原結合剤を前記被験体に投与することを含む、方法。
  64. 上昇した血中グルコースレベルに関連する障害を治療するためにグルカゴン受容体を活性化するグルカゴンの能力を調節する方法であって、上昇した血中グルコースレベルを有する被験体に、ａＰ２−グルカゴン複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することを含み、前記抗体、抗原結合剤、又は抗体結合フラグメントがＰ２Ｐ及びグルカゴンよりも、グルカゴン／ａＰ２複合体に優先的に結合する、方法。
  65. 被験体がヒトである請求項６４に記載の方法。
  66. 抗体がモノクローナル抗体である請求項６４又は６５に記載の方法。
  67. 上昇した血中グルコースレベルに関連する前記障害が代謝障害である請求項６４から６６のいずれかに記載の方法。
  68. 代謝障害が１型糖尿病、２型糖尿病、高血糖、糖尿病性ケトアシドーシス、高血糖高浸透圧症候群、心血管疾患、糖尿病性腎症又は腎不全、糖尿病性網膜症、絶食時グルコース異常、耐糖能異常、脂質異常症、肥満症、白内障、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒障害、周術期高血糖、集中治療室の患者における高血糖、インスリン抵抗症候群、代謝症候群、及び脂肪肝疾患（ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群より選択される、請求項６４から６７のいずれかに記載の方法。
  69. 絶食時血中グルコースレベルを低下させる方法であって、上昇した絶食時血中グルコースレベルを有する被験体に、ａＰ２−グルカゴン複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することを含み、前記抗体、抗原結合剤、又は抗体結合フラグメントがａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  70. 被験体がヒトである請求項６９に記載の方法。
  71. 抗体がモノクローナル抗体である請求項６９から７０のいずれかに記載の方法。
  72. 高インスリン血症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ）を低減させる方法であって、高インスリン血症に罹患する被験体に、ａＰ２−グルカゴン複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することを含み、前記抗体、抗原結合剤、又は抗体結合フラグメントがａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  73. 被験体がヒトである請求項７２に記載の方法。
  74. 抗体がモノクローナル抗体である請求項７２から７３のいずれかに記載の方法。
  75. 肝臓脂肪変性(ｌｉｖｅｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ)を低減させる方法であって、肝臓脂肪変性を有する被験体に、ａＰ２−グルカゴン複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす、有効量の抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することを含み、前記抗体、抗原結合剤、又は抗体結合フラグメントがａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  76. 被験体がヒトである請求項７５に記載の方法。
  77. 抗体がモノクローナル抗体である請求項７５から７６のいずれかに記載の方法。
  78. 被験体のインスリン感受性を増加させる方法であって、前記被験体に、ａＰ２−グルカゴン複合体媒介性Ｇタンパク質共役受容体活性破壊を引き起こす、抗体、抗原結合剤又は抗体結合フラグメントを投与することを含み、前記抗体、抗原結合剤、又は抗体結合フラグメントがａＰ２よりも、グルカゴン／ａＰ２に優先的に結合する、方法。
  79. 被験体がヒトである請求項７８に記載の方法。
  80. 抗体がモノクローナル抗体である請求項７８から７９のいずれかに記載の方法。
  81. 壊死性遊走性紅斑（ＮＭＥ）に罹患する被験体を治療する方法であって、
    （ａ） ＣＤＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列、又はＣＤＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列から独立して選択される１、２、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ）を含む軽鎖可変領域であって、
    前記ＣＤＲ−Ｌ１領域の前記アミノ酸配列が配列番号７であり、
    前記ＣＤＲ−Ｌ２領域の前記アミノ酸配列が配列番号８であり、そして
    前記ＣＤＲ−Ｌ３領域の前記アミノ酸配列が配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２から選択される、領域；並びに
    （ｂ） ＣＤＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列、又はＣＤＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列から独立して選択される１、２、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ）を含む重鎖可変領域であって、
    前記ＣＤＲ−Ｈ１領域の前記アミノ酸配列が配列番号１４であり、
    前記ＣＤＲ−Ｈ２領域の前記アミノ酸配列が配列番号１６又は配列番号１７であり、そして、
    前記ＣＤＲ−Ｈ３領域の前記アミノ酸配列が配列番号１９又は配列番号２０から選択される、領域；
    を含む、有効量の抗体又は抗原結合剤を前記被験体に投与することを含む、方法。
  82. 方法が前記化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で細胞アッセイに導入すること、ここで、前記細胞アッセイがＧＣＧＲを発現する細胞の集団を含むこと、そして、ＧＣＧＲの前記生物活性を測定すること、を更に含む、請求項２２に記載の方法。
  83. ＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物を同定する方法であって、
    ｉ． 前記化合物をグルカゴンと接触させること；並びに、
    ｉｉ． 前記化合物が配列番号８２のＰｈｅ２２、Ｖａｌ２３、Ｇｌｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｍｅｔ２７、Ａｓｎ２８、及びＴｈｒ２９から選択されるアミノ酸にてグルカゴンに結合するか否かを決定すること；
    を含み、
    配列番号８２のアミノ酸Ｐｈｅ２２、Ｖａｌ２３、Ｇｌｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｍｅｔ２７、Ａｓｎ２８、若しくはＴｈｒ２９又はそれらの組み合わせにおける、ａＰ２への前記化合物の前記結合がＧＣＧＲのグルカゴン／ａＰ２作動を中和することができる化合物の指標となる、方法。
  84. 化合物を、ａＰ２及びグルカゴン、又はグルカゴン／ａＰ２の存在下で細胞アッセイに導入すること、ここで、前記細胞アッセイがＧＣＧＲを発現する細胞の集団を含むこと、そして、前記ＧＣＧＲの生物学的活性を測定すること、を更に含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 被験体がヒトである請求項６３に記載の方法。
  86. 化合物がＧＣＧＲには結合しない、請求項２２から６２及び６４から８０のいずれかに記載の方法。
  87. 方法が細胞の非存在下で、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行なわれる、請求項１、５、９、２２、及び８３のいずれかに記載の方法。
  88. 抗体、抗原結合剤、又は抗体フラグメントに結合したａＰ２との複合体中のグルカゴンを含む組成物。
  89. 抗体、抗原結合剤、又は抗体フラグメントがヒトに自然には生じない、請求項８８に記載の組成物。
  90. 抗体、抗原結合剤、又は抗体フラグメントに結合した前記グルカゴン／ａＰ２が単離される、請求項８８又は８９に記載の組成物。
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